Seguimiento de células en vídeos obtenidos mediante microscopio y la técnica de contraste de fase para la estimación del tiempo medio de paso entre estados celulares

Equation Chapter 1 Section 1 Proyecto Fin de Carrera Ingeniería de Telecomunicación Dpto. Teoría de la Señal y Comunicaciones Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Seguimiento de células en vídeos obtenidos mediante microscopio y la técnica de contraste de fase para la estimación del tiempo medio de paso entre estados celulares. Autor: María García Valverde Tutoras: Irene Fondón García y Auxiliadora Sarmiento Vega Sevilla, 2020 iii Proyecto Fin de Carrera Ingeniería de Telecomunicación Seguimiento de células en vídeos obtenidos mediante microscopio y la técnica de contraste de fase para la estimación del tiempo medio de paso entre estados celulares. Autor: María García Valverde Tutoras: Irene Fondón García Profesora Titular de Universidad Auxiliadora Sarmiento Vega Profesora Contratada Doctora Dpto. de Teoría de la Señal y Comunicaciones Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2020 v Proyecto Fin de Carrera: Seguimiento de células en vídeos obtenidos mediante microscopio y la técnica de contraste de fase para la estimación del tiempo medio de paso entre estados celulares. Autor: María García Valverde Tutoras: Irene Fondón García y Auxiliadora Sarmiento Vega. El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2020 El Secretario del Tribunal vii A mis abuelos ix Agradecimientos Después de dedicar la mayor parte de mis horas de vida a este proyecto en los últimos meses, hoy es el día. Ha sido un largo periodo de aprendizaje tanto a nivel profesional, personal, laboral como mental. Me gustaría agradecer a todas aquellas personas presentes a lo largo de mi vida estudiantil, han creído en mí, tanto en los momentos fáciles como en los más complicados. En primer lugar, agradezco a mis compañeros de la carrera haberme apoyado y ayudado cuando más lo necesitaba. A mi familia por tener tanta paciencia a lo largo de estos años, especialmente en época de exámenes. Por último, darles las gracias a mis tutoras Irene Fondón García y Auxiliadora Sarmiento Vega que me han ayudado en este proceso. Es cierto, no ha sido nada fácil, ni mucho menos, pero gracias a ellos, ha parecido un tanto menos complejo. Me han ayudado a superarme, a cumplir expectativas siempre buscando la constante mejora, premisa que me seguiré aplicando a lo largo de mi vida profesional y personal. Sevilla, 2020 Extracción de Características ....................................................................................................... 27 Seguimiento ................................................................................................................................ 28 3.4.1 Clasificación de Técnicas de Seguimiento ........................................................................................................... 28 3.4.1.1 Técnicas de Seguimiento de siluetas ......................................................................................................... 28 3.4.1.2 Técnicas de Seguimiento del núcleo ......................................................................................................... 28 3.4.1.3 Técnicas de seguimiento de puntos .......................................................................................................... 29 3.4.2 Filtro de Kalman .................................................................................................................................................... 29 Tiempo celular............................................................................................................................. 31 4 Resultados .............................................................................................................................. 33 Segmentación y extracción de características ............................................................................. 33 Seguimiento de células ................................................................................................................ 57 Tiempo de ciclo celular ................................................................................................................ 61 5 Conclusiones y líneas futuras .................................................................................................. 63 Referencias .................................................................................................................................... 64 xvii ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 . Enfermedades Asociadas a la Desregulación de la Apoptosis [9]. 3 Tabla 2 . Conjunto de cadenas válidas para la función regionprops [21]. 27 Tabla 3.- Porcentaje de error en la segmentación 33 Tabla 4.- Centros detectados en el vídeo sin fondo (Método 1) tras segmentación. 41 Tabla 5.- Centros detectados en el vídeo sin fondo (Método 2) tras segmentación 49 Tabla 6.- Centros detectados en el vídeo sin fondo (Método 3) tras segmentación 56 Tabla 7.- Porcentaje de acierto en el número de células detectadas por frame 57 Tabla 8.- Número de células detectadas por frame 61 Tabla 9.- Tiempo de ciclo celular 62 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1-1. Estados Celulares [6] 2 Figura 1-2. Tipos de muerte celular [8] 3 Figura 1-3. Ejemplo Apoptosis en los frames 237, 241, 249 y 273 del vídeo. 4 Figura 1-4. Ejemplo Necrosis en los frames 210, 224, 233 y 260 del vídeo. 4 Figura 2-1. Muestra obtenida con microscopio de campo claro [12] 12 Figura 2-2. Microscopio de fluorescencia; (a) Funcionamiento, (b) Resultado [13] 13 Figura 2-3. Reconstrucciones 3D utilizando microscopía confocal [11] 13 Figura 2-4. Muestra obtenida con microscopio de campo oscuro [11] 14 Figura 2-5. Muestra obtenida con microscopio de contraste por interferencia diferencial. Nótese el aspecto tridimensional [11]. 15 Figura 2-6. Célula sin coloración en la cual la parte con más espesor corresponde a la zona del núcleo C, el citoplasma a la zona delgada periférica B y el portaobjeto o solución acuosa circundante A. Existen diferentes índices de refracción entre A, B y C los cuales son invisibles al ojo humano. Las ondas que atraviesan una zona más espesa se retrasan y cambian de fase en relación a las ondas que atraviesan una región más delgada. El contraste de fases hace visible esas diferencias al traducirlas en cambios de intensidad [11]. 15 Figura 2-7. Diagrama para el microscopio de contraste de fases. [11] 16 Figura 2-8. Frame 127 del vídeo 16 Figura 3-1. Etapas involucradas en el procesamiento de imágenes. 17 Figura 3-2. Esquema del desarrollo del algoritmo. 18 Figura 3-3. Eliminación del fondo utilizando el Filtro de Entropía: (a)ImagenOriginal; (b)ImagenFiltrada; (c) xix ImagenBinaria; (d) ImagenResultado 19 Figura 3-4. Diagrama método Filtro de Entropía 19 Figura 3-5. Eliminación de Fondo utilizando Combinación de Gradientes: (a) ImagenSuavizada; (b) ImagenCombinaciónGradientes; (c) ImagenBinaria; (d) ImagenResultado 20 Figura 3-6 Diagrama método Combinación de Gradientes 21 Figura 3-7. Wavelet Toolbox Matlab 22 Figura 3-8. Proceso de descomposición Wavelet [16] . 22 Figura 3-9. Etapas de filtrado jerárquico del árbol de descomposición de la Transformada Wavelet [16]. 23 Figura 3-10. Familias de Funciones Wavelet más usadas [16]. 24 Figura 3-11. Eliminación del fondo utilizando Tranfosrmada Wavelet: (a)ImagenOriginal; (b) ImagenResultado 24 Figura 3-12. Segmentación del frame 100: (a)ImagenOriginal; (b) Imagen sin fondo método de la Entropía; (c) Conversión binaria; (d) Eliminación de objetos por área; (e) Operación morfológica de dilatado; (f) Eliminación de objetos por excentricidad 26 Figura 3-13. Extracción Características Frame 100: (a) Imagen sin fondo método de la Entropía; (b) Características de la Imagen sin fondo método de la Entropía 27 Figura 3-14. Clasificación de Técnicas de Seguimiento 28 Figura 3-15 Tiempo Celular 31 Figura 3-16 Esquema del procedimiento completo 32 Figura 4-1 Número de células detectadas por frame 57 Figura 4-2 Imágenes resultado utilizando el método de sustracción de fondo 2; (a) Frame 104, (b) Frame 105, (c) Frame 106, (d) Frame 107, (e) Frame 108, (f) Frame 109 58 Figura 4-3 Imágenes resultado utilizando el método de sustracción de fondo 3; (a) Frame 76, (b) Imagen 77, (c) Frame 85 59 Figura 4-4 Imágenes resultado utilizando el método de sustracción de fondo 1; (a) Frame 366, (b) Imagen 370, (c) Frame 375 60 34 1 INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA CELULAR a revolución tecnológica ha provocado grandes progresos en diferentes ámbitos de nuestra vida, especialmente, durante los últimos años han surgido grandes avances en medicina y en la prestación de servicios de atención médica. A modo de ejemplo, podemos hacer referencia al desarrollo de sistemas de atención sanitaria basados en la tecnología, capaces de proporcionar una amplia gama de diagnósticos efectivos y tratamientos terapéuticos [1]. Dentro de los múltiples campos de aplicación de las nuevas tecnologías en el progreso humano, haremos hincapié en la biología celular o bioquímica celular. Esta disciplina es la encargada del estudio de las células en lo que respecta a las propiedades, estructura, funciones, orgánulos, su interacción con el ambiente y su ciclo vital [2]. Los estudios realizados en esta rama de conocimiento, han aumentado considerablemente gracias al uso de herramientas avanzadas, ya que juegan un papel importante en la medicina regenerativa y enfermedades como el cáncer [3]. La invención del microscopio óptico posibilitó observar estructuras nunca vistas por el ser humano, las células. Gracias a los avances en microscopía, tema que trataremos en otro apartado, se consiguieron estudiar dichas estructuras con más detalle. A continuación, explicaremos, de forma resumida, qué es una célula, cuáles son sus componentes, funciones y estados, con la finalidad de indicar cuál es el estado celular presentado en el vídeo utilizado para el desarrollo de este trabajo. Componentes de una Célula La célula es la unidad fundamental de los organismos vivos, de tamaño microscópico, capaz de reproducción independiente, formada por un citoplasma y un núcleo rodeados por una membrana. Existen una gran variedad de células, por su complejidad se pueden dividir en: • Célula procariota: No tienen núcleo, por ejemplo, las bacterias. • Célula eucariota: Poseen núcleo, en el cual se encuentran el material genético, por ejemplo, los vegetales, animales y humanos. [4] Todas las células eucariotas tienen tres estructuras básicas: • Membrana plasmática: Es la cubierta que envuelve y delimita a la célula separándola del medio externo, permitiendo la entrada y salida de moléculas. L Locura es hacer lo mismo una y otra vez esperando obtener resultados diferentes. -Albert Einstein- Introducción a la biología celular 2 • Citoplasma: Región celular comprendida entre la membrana plasmática y el núcleo, que contiene una diversidad de orgánulos celulares que desempeñan diferentes funciones. • Núcleo: Es la estructura más destacada de la célula eucariota, contiene la mayor parte del material genético celular. [5] Ciclo celular El ciclo celular es el conjunto de sucesos que ocurren durante el crecimiento de la célula, conocido como interfase y la división en células hijas, conocido como mitosis. En la Figura 1, se muestran cuáles son las etapas del ciclo celular: • Fase G1. Es el periodo que abarca desde que una célula nace hasta que comienza la siguiente fase. Durante ésta la célula comprueba las condiciones externas e internas y decide si continuar con el ciclo celular o no. Si hay correcta dotación de elementos celulares tras la división, una segregación correcta de los cromosomas, etcétera, la proliferación va a continuar, la célula crece de tamaño y se preparará para entrar en la fase “S”. La mayoría de las células de un organismo pluricelular adulto no se dividen constantemente, detienen su ciclo celular temporal o permanentemente en la fase G1. Detener el ciclo celular supone que la célula se va a diferenciar, o quedar quiescente, o sufrir un periodo de senescencia ,o morir por apoptosis o necrosis. [6] Cuando la célula queda detenida en fase “G1” en forma quiescente se dice que está en la fase “G0”. Algunos tipos celulares pueden retomar el ciclo celular a partir de los estados de quiescencia y de célula diferenciada, y volver a la fase “G1”. [6] • Fase S: Se producen dos sucesos importantes, la replicación del ADN y la duplicación de los centrosomas en las células animales. • Fase G2: Se acumulan progresivamente aquellas moléculas cuyas actividades serán necesarias durante la siguiente fase “M”. Se consideran como un estado transitorio, en el que se determina si hubo errores durante la replicación del ADN o si se ha producido su duplicación completa. Si se dan errores la célula no entrará en fase “M” y el ciclo celular se detendrá hasta que los daños sean reparados o el ADN sea completamente copiado. [6] • Fase M: Es la del ciclo celular donde se produce la división de una célula en dos hijas, conocido como mitosis. [6] Figura 1-1. Estados Celulares [6] 3 3 Células Identificadas en el vídeo El vídeo ha sido proporcionado por Paula Sampaio Neri, responsable del servicio de microscopía de la Universidad do Minho. El vídeo está compuesto por imágenes de fibroblastos en contraste de fase, consta de 875 frames y su duración es de 4,3750 segundos. El fibroblasto es el tipo más abundante del tejido conectivo. Desempeñan multitud de funciones, la más conocida es la capacidad de sintetizar y mantener todos los precursores de los componentes de la matriz extracelular: fibras de colágeno, reticulares y elásticas. Otra función característica está relacionada con la organización estructural del tejido al que pertenecen. Por ejemplo, los fibroblastos dirigen la formación de la epidermis durante el desarrollo embrionario. También gracias a su capacidad de síntesis y mantenimiento de la matriz extracelular, intervienen activamente en la cicatrización de heridas. [7] Esta versatilidad hace al fibroblasto una célula fácilmente manipulable en el laboratorio, es muy útil en investigación. Estados Celulares identificados en el video. Las células que aparecen el en vídeo, detienen el ciclo celular en la fase G1. La muerte de las células en los tejidos humanos y en otros organismos multicelulares, es un hecho normal, no implica la alteración de funciones. Como se puede observar en la Figura 2, existen dos modos de muerte celular. Una es la que se produce como consecuencia de una lesión celular masiva conocida como necrosis, mientras que otras mueren a través de un mecanismo más refinado, no inflamatorio, dependiente de la energía celular, llamado apoptosis. Figura 1-2. Tipos de muerte celular [8] La apoptosis es un proceso genéticamente programado, que puede volverse dañino si no está controlado. La desregulación de la apoptosis está asociada a enfermedades como cáncer, neurodegeneración, autoinmunidad, miocardiopatías y otras alteraciones, como las que se muestran en la Tabla 1 [9]. Tabla 1 . Enfermedades Asociadas a la Desregulación de la Apoptosis [9]. Excesiva apoptosis Deficiente apoptosis Enfermedades degenerativas nerviosas Síndrome linfoproliferativo autoinmune (Parkinson, Alzheimer, Huntington) Enfermedad de Graves Introducción a la biología celular 4 Anemia aplástica Linfoma Tiroiditis de Hashimoto Leucemia Lupus eritematoso Tumores sólidos Esclerosis múltiple Osteoporosis Diabetes tipo I Defectos de desarrollo Colitis ulcerosa Defectos de desarrollo En la figura 2, se muestran los cambios celulares que se producen durante la apoptosis son una retracción o encogimiento de la célula, el citoplasma se vuelve más denso y los orgánulos más empaquetados. Posteriormente hay protrusiones y plegamientos de la membrana de modo que la célula se divide en porciones independientes denominados cuerpos apoptóticos, pero siempre rodeados de la membrana plasmática. [9] Figura 1-3. Ejemplo Apoptosis en los frames 237, 241, 249 y 273 del vídeo. Por otra parte, en la Figura 3 tenemos un ejemplo de necrosis, es una muerte celular debida a daños celulares producidos por agentes externos tales como la temperatura, presión, tóxicos…. La diferencia con la apoptosis es que la necrosis es un proceso descontrolado y pasivo que conlleva la rotura de membrana plasmática y liberación del contenido celular. [9] Figura 1-4. Ejemplo Necrosis en los frames 210, 224, 233 y 260 del vídeo. 34 2 MICROSCOPÍA CELULAR e define la microscopía como el conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visibles los objetos de estudio que por su pequeñez están fuera del rango de resolución del ojo normal. En la medicina se usan la microscopía especialmente para analizar tejidos, células, componentes sanguíneos y microorganismos [10]. En esta sección se describen las técnicas de microscopía más comunes con el fin de caracterizar la utilizada para el desarrollo de este trabajo, para ello nos hemos basado en [11], [12] y [13]. Técnicas de microscopía Las células son muy pequeñas y complejas, lo que dificulta la observación de su estructura y comprensión de su funcionamiento. Para optimizar el estudio es necesario tener en cuenta tres elementos: • La muestra celular utilizada, que es el objeto de estudio. • Fuente de ilumación. • Sistema óptico. Dependiendo de la composición de la muestra celular, células vivas o fijas, se definirán diferentes técnicas de visualización y tipos de instrumentos. El microscopio de campo claro, también llamado microscopio común, utiliza la luz y un sistema de lentes para magnificar imágenes. Normalmente es necesario añadir algún tinte para distinguir especímenes debido a la transparencia de la muestra celular, Figura 2-1. Estos productos químicos dañan las células lo que supone un problema para analizar el comportamiento de células vivas. S La inspiración existe, pero tiene que encontrarte trabajando. -Pablo Picasso- Algoritmo implementado 18 18 4. Representación y descripción. A la salida del proceso anterior habitualmente se tienen los datos de píxel en bruto, que constituyen bien el contorno de una región o bien todos los puntos de una región determinada. Consiste en extraer rasgos con alguna información cuantitativa de interés o que sean fundamentales para diferenciar una clase de objetos de otra. 5. Reconocimiento e interpretación. El reconocimiento es el proceso que asigna una etiqueta a un objeto basándose en la información proporcionada por sus descriptores. Durante el desarrollo de nuestro algoritmo hemos seguido los pasos clásicos mencionados en el capítulo 3 sobre el procesamiento de imágenes digitales. Primero, se realiza el preprocesado que se basa en la eliminación del fondo de cada imagen. Para ello se han desarrollado tres métodos diferentes con el fin de obtener un mejor resultado en el seguimiento y estimación del tiempo. Los métodos desarrollados para dicho fin están basados en: • Transformada Wavelet. • Filtro de Entropía. • Combinación de Gradientes. Segundo, se realiza la segmentación de las células de cada imagen a través de operaciones comunes para todos los frames preprocesados obtenidos del apartado anterior. Esto nos permitirá obtener información de la ubicación de cada célula que es esencial para el seguimiento. A continuación, se extraen las características más relevantes para el desarrollo un método de seguimiento de cada una de las células a lo largo del vídeo. Finalmente, tras el seguimiento de las células se calcula el tiempo de ciclo celular con el fin de realizar una comparación entre los métodos utilizados. Figura 3-2. Esquema del desarrollo del algoritmo. Preprocesamiento El principal objetivo es procesar una imagen de forma que resulte más adecuada que la original para una aplicación específica. Como hemos comentado en apartados anteriores, en una primera instancia los resultados en el seguimiento y estimación del tiempo no eran favorables para nuestra aplicación, por lo que optamos por someter a los videos a diferentes preprocesamientos basados en la extracción del fondo. Para los siguientes apartados vamos a presentar el resultado de los diferentes métodos aplicados en el frame 1 del vídeo. 3.1.1 Método 1: Eliminación del fondo utilizando el Filtro de Entropía El Toolbox de Procesamiento de Imágenes de Matlab incluye varias funciones de análisis de textura que permite filtrar una imagen utilizando medidas estadísticas como el rango, desviación estándar y la entropía, que es una medida estadística de aleatoriedad. Estas estadísticas logran caracterizar la textura de una imagen al proporcionar Preprocesamiento. •Filtro de Entropía. •Transformada Wavelet. •Combinación de Gradientes. Segmentación •Binarización. •Dilatación. •Eliminación de objetos por área. •Eliminación de objetos por excentricidad. Extracción de características. •Centroides. •Cajas contenedoras. Seguimiento •Filto de Kalman. 19 19 información sobre la variabilidad local de los valores de intensidad de los píxeles de una imagen. (a) (b) (c) (d) Figura 3-3. Eliminación del fondo utilizando el Filtro de Entropía: (a)ImagenOriginal; (b)ImagenFiltrada; (c) ImagenBinaria; (d) ImagenResultado En el paso 1 de la figura 3-4, se ha utilizado la función predefinida entropyfilt() la cual define una vecindad alrededor del píxel de interés y calcula la entropía para esa vecindad. Figura 3-4. Diagrama método Filtro de Entropía Sea ℎ(𝑖) el histograma, que es el número de ocurrencias del nivel de gris 𝑖 en la imagen y 𝑝(𝑖) la función de probabilidad muestreal, definida como el cociente del histograma y la dimensión de la imagen. Siendo I el número total de grises, M el número total de filas y N de columnas, la entropía viene dada por: p(i)=h(i) M∙N ( 3.1.1-1) Paso 1: ImagenFiltrada = entropyfilt(ImagenOriginal, ones(15));. Paso 2: ImagenBinaria = uint8(ImagenFiltrada > 6.2); Paso 3: ImagenBinaria = imfill(ImagenBinaria, 'holes'); Paso 4 :ImagenResultado=(1/255)*double(Imagen.*ImagenBinaria); Algoritmo implementado 20 20 Entropía = -∑p(i) I-1 0 ∙ log(p(i)) ( 3.1.1-2) Una vez generada la Imagen de Filtrada, el objetivo es obtener una máscara para la textura del fondo. El umbral elegido es el valor de intensidad de los píxeles a lo largo del límite entre las texturas, como se indica en el paso 2. Al no estar conectadas todas las regiones de la máscara, para el paso 3 se utiliza la función imfill() para rellenar los huecos generados. Por último, se aplica la plantilla a la imagen original para conseguir la imagen sin fondo Figura 3.3 (d). Este procedimiento se aplica en todo los frames del vídeo. Veremos en apartados posteriores cómo influye en el seguimiento la información celular seleccionada por este método. 3.1.2 Método 2: Eliminación de Fondo utilizando Combinación de Gradientes. Los bordes de una imagen se pueden definir como transiciones entre dos regiones de niveles de gris significativamente distintos, muestran información sobre las fronteras de los objetos y puede ser utilizada para segmentar la información útil de la imagen. (a) (b) (c) (d) Figura 3-5. Eliminación de Fondo utilizando Combinación de Gradientes: (a) ImagenSuavizada; (b) ImagenCombinaciónGradientes; (c) ImagenBinaria; (d) ImagenResultado El ruido de los frames es aleatorio, para homogeneizar la imagen se ha utilizado el filtro de la mediana. Los píxeles de la nueva imagen se generan calculando la mediana del conjunto de píxeles del entorno de vecindad del píxel correspondiente. Como se puede observar en la Figura 3-6 (a), conseguimos homogeneizar los píxeles 21 21 de intensidad muy diferente. Figura 3-6 Diagrama método Combinación de Gradientes En el paso 1 de la figura 3-5 se ha utilizado la función de Matlab Medfilt2(), a la imagen de entrada se le aplica el filtro con una vecindad 3X3 por defecto. Una vez obtenida la imagen suavizada, procedemos al cálculo de gradientes. La derivada de una señal contínua proporciona las variaciones locales con respecto a la variable, de forma que el valor de la derivada es mayor cuanto más rápidas sean estas variaciones. En el caso bidimensional discreto, las distintas aproximaciones del operador gradiente se basan en diferencias entre los niveles de grises de la imagen. La derivada parcial fx(x,y) puede aproximarse por la diferencia de píxeles adyacentes de la misma fila, igual para la derivada parcial fy(x,y) respecto a los píxeles de la misma columna [15]. El gradiente de cada fila y columna se obtiene mediante la convolución de la imagen con unas determinadas máscaras. Los operadores más utilizados son los de Roberts, Prewitt , Sobel y Frei-chen. La máscara elegida ha sido la de Sobel. Siendo I la imagen suavizada, se definen los gradientes: Gx =(-1 0 1 -2 0 2 -1 0 1)*I Gy =(-1 -2 -1 000 121)*I ( 3.1.2-1) En cada punto de la imagen se combinan los resultados anteriores para obtener la magnitud del gradiente mediante la siguiente ecuación, paso 2 figura 3-5: G =√Gx2+ Gy2 ( 3.1.2-2) El resultado de la operación es una imagen binaria del mismo tamaño que la imagen original en la cual, “1” significa que ha detectado un borde y “0” es que no lo ha detectado. No se obtienen secciones diferenciadas, se realizan una serie de operaciones morfológicas para mejorar el resultado, utilizando las funciones imfill(), imdilate() y bwareafilt(); se puede observar el resultado en la Figura 3.6 (c). Por último, se aplica la plantilla a la imagen original para conseguir la imagen sin fondo Figura 3.6 (d). Este procedimiento se aplica en todo los frames del vídeo. Veremos en apartados posteriores cómo influye en el seguimiento la información celular seleccionada por este método. Paso 1: ImagenSuavizada = medfilt2(ImagenOriginal). Paso 2: ImagenGradiente = edge(ImagenSuavizada,'sobel'); Paso 3: ImagenGradiente = imfill(ImagenGradiente, 'holes'); Paso 4: s=strel('disk',3); Paso 5: ImagenBinaria = imdilate(ImagenGradiente ,s); Paso 6: ImagenBinaria = bwareafilt(ImagenBinaria,[150 500000]); Paso 7: ImagenBinaria= imfill (ImagenBinaria, 'holes'); Paso 7: ImagenResultado=(1/255)*double(ImagenOriginal.*ImagenBinaria); Algoritmo implementado 22 22 3.1.3 Método 3: Eliminación de Fondo utilizando la Transformada Wavelet. Las wavelets se caracterizan por ser una herramienta útil para afrontar problemas fundamentales en el tratamieno de imágenes. Entre ellos la reducción del ruido, la compresión o la detección de determinados objetos en cierto tipo de imágenes. Wavelet Toolbox de Matlab proporciona funciones y aplicaciones para analizar y sintetizar señales e imágenes, para nuestro propósito se ha utilizado la aplicación basada en la Transformada Wavelet Discreta (DWT) destinada al tratamiento de imágenes. Para el desarrollo de este apartado hemos recopilado información de [16]. Figura 3-7. Wavelet Toolbox Matlab La Transformada permite aplicar diferente interés en los contenidos de alta y baja frecuencia de las señales. Por lo que, los coeficientes Wavelet resultantes de la descomposición podrán clasificarse, tal y como se muestra en la figura 3-8, en: • Coeficientes de detalle (alta frecuencia). • Coeficientes de aproximación (baja frecuencia). Figura 3-8. Proceso de descomposición Wavelet [16] . Se implementa mediante un árbol jerárquico de filtrado, organizado en etapas denominadas “niveles de descomposición”. Cada etapa consta a su vez de dos fases: un filtrado de alta frecuencia y otro de baja frecuencia. De cada uno de ellos tras un diezmado, se obtienen los coeficientes de detalle y los de aproximación respectimamente. El diezmado consiste en descartar una de cada dos muestras, escogiendo muestras intercaladas. Se implementa mediante un árbol jerárquico de filtrado, organizado en etapas denominadas “niveles de descomposición”. Cada etapa consta a su vez de dos fases: un filtrado de alta frecuencia y otro de baja frecuencia. De cada uno de ellos tras un diezmado, se obtienen los coeficientes de detalle y los de aproximación respectimamente. El diezmado consiste en descartar una de cada dos muestras, escogiendo muestras intercaladas. El árbol se compone pasando a la siguiente etapa los coeficientes de aproximación obtenidos, y así sucesivamente, como se observa en la siguiente figura. 23 23 Figura 3-9. Etapas de filtrado jerárquico del árbol de descomposición de la Transformada Wavelet [16]. A la salida i de cada etapa i se obtienen los coeficientes de aproximación, 𝐴𝑖, y los coeficientes de detalle, 𝐷𝑖. La entraba de la siguiente etapa (𝑖+1) son los coeficientes de aproximación de la etapa anterior, 𝐴𝑖. Todos los coeficientes, se almacenanen el vector de coeficientes de la siguiente manera: Vector de Coeficientes = [AM,DM, DM-1,…,D3,D2,D1] ( 3.1.3-1) A partir de la información contenida en los coeficientes Wavelet, se puede llevar a cabo la recontrucción de la señal original mediante un procesamiento con una estructura de filtros de espectro en cuadratura. 3.1.3.1 Familias de Funciones Wavelet La tranformada Wavelet se basa en una función, que se escogerá de entre multiples opciones denominada función Wavelet madre, la señal se descompondrá en base a esta función. Las funciones Wavelet se distribuyen en familias, que comparten ciertas características, y la correcta elección de la función condicionará la correcta u óptima transformación [17]. No se puede afirmar que exista una función Wavelet óptima, sino que en cada caso particular, existirá una función Wavelet mejor adaptada a la señal de interés [18]. Algunas de las familias de funciones más usadas son: • Haar: Se caracteriza por ser simétrica de duración finita, es ortogonal y su implementación sencilla. La discontinuidad de las onduletas Haar, representada en la Figura 3-10 (a), presenta una desventaja para su aplicación. • Daubechies: A diferencia de la anterior, es asimétrica (salvo la Daubechies de primer grado, que coincide con Haar) y tiene duración finita de longitud 2𝑁 – 1 (siendo N el orden). • Sombrero Mejicano: Es simétrica, tiene duración infinita y no es ortogonal. Pertenece a la familia de wavelets de Gauss, creada a partir de las derivadas de la función de densidad de probabilidad de la distribución de Gauss, Figura 3-10 (c) . • Morlet: Es simétrica, compleja, tiene duración infinita y no es ortogonal. • Meyer: Es simétrica, tiene duración infinita y es ortogonal. Algoritmo implementado 24 24 (a) (b) (c) (d) (e) Figura 3-10. Familias de Funciones Wavelet más usadas [16]. En nuestro caso, nos queremos quedar con los detalles de los frames que se corresponden con las células. Utilizando la herramienta comentada en este apartado se han probado diferentes funciones wavelet junto a la modificación de los coeficientes de alta y baja frecuencia. El mejor resultado, que se muestra en la figura 3-11, se ha obtenido gracias a la función de Daubichies nivel 2, sin modificar los coeficientes de alta frecuencia y sí los de baja, para conseguir eliminar el fondo. Este procedimiento se aplica en todo los frames del vídeo. Veremos en apartados posteriores cómo influye en el seguimiento la información celular seleccionada por este método. (a) (b) Figura 3-11. Eliminación del fondo utilizando Tranfosrmada Wavelet: (a)ImagenOriginal; (b) ImagenResultado 25 25 Segmentación En este proceso se inicia un análisis de la imagen para dividirla en sus partes constituyentes u objetos dependiendo de la aplicación a desarrollar [19]. Se ha realizado la segmentación de las células de cada imagen a través de operaciones comunes para todos los frames sin fondo obtenidos en el apartado anterior. La segmentación tendrá como objetivo distinguir la ubicación de las células. Es el paso previo para poder extraer las características la célula, por tanto, es lo más importante en esta aplicación para tener un exitoso resultado. Aplicaremos, sobre las imagenes sin fondo, una serie de operaciones, basadas en un código de segmentación proporcionado por las tutoras adaptado a nuestro fin, se puede observar el resultado de las mismas en la figura 3-12 : 1. Conversión binaria. La hemos realizado a través de la técnica de umbralización. Consiste en establecer un umbral tal que, todos los niveles de gris por encima de él se consideren blancos y todos los que queden por debajo serán negros, obteniendo como resultado una imagen binaria en la que los píxeles marcados con 1 (blanco) corresponden a los objetos de interés. La elección de este umbral ha sido de forma experimental tras realizar pruebas sucesivas en varias imágenes del video. Optamos por aplicar el valor 0.85 que nos proporciona un buen resultado para todas las imágenes, pero como podemos ver en la Figura 3-12 (c), han sido detectadas regiones de la imagen que no nos interesan, así que aplicaremos algunas operaciones antes de dar por finalizada la segmentación. 2. Eliminación de objetos por área. Observamos una cantidad de objetos pequeños detectados que no forman parte de las células que nos interesan, por lo que limpiamos la imagen para dejar solamente aquellos objetos con área comprendida entre 400 y 1500. 3. Operación morfológica de dilatación. La morfología es un amplio conjunto de operaciones de procesamiento de imagen que procesan imágenes basadas en formas. En una operación morfológica, cada píxel de la imagen se ajusta en función del valor de otros píxeles de su vecindad. Al elegir el tamaño y la forma de la vecindad, puede construir una operación morfológica que sea sensible a formas específicas en la imagen de entrada [20]. Siendo A una imagen binaria, B una matriz que hace plantilla se definen dos operaciones: o Dilatación de A por B es el resultado del elemento central de B cuando al menos algún elemento B está incluido dentro del conjunto A. Cuando no ocurre, el resultado de la dilatación es el conjunto vacío. Se concibe como una expansión de la imagen original, se expresa de la forma: g = A ⊕ B ( 3.1.3-1) o Erosión de A por B es el conjunto de los puntos alcanzados por el centro de B para los cuales todos los puntos de B están contenidos en A. Se concibe como una reducción de la imagen original, se expresa de la forma: g = A Ɵ B ( 3.1.3-2) Algoritmo implementado 26 26 En nuestro caso para el dilatado hemos utilizado como plantilla un disco de radio 4, ya que nos interesan los elementos circulares. El resultado lo podemos ver en la Figura 3-12 (e). 4. Eliminación de objetos por excentricidad. Aún quedan algunos objetos en la imagen binaria que no cumplen nuestro objetivo. Para mantener en la imagen las células de interés, utilizamos la excentricidad. La excentricidad (Ɛ) mide el grado de desviación con respecto a una circunferencia por tanto una circunferencia tiene Ɛ = 0, mientras que en una parábola Ɛ=1. Las células siempre tendrán un valor comprendido entre 0 y 1, es decir, 0<Ɛ<1. Tras la comprobación de varios valores umbral de la excentricidad, comprobamos que con el intervalo 0<Ɛ<0.79 se detectan la mayoría de células en todas las imágenes de los videos sin fondo. (a) (b) (c) (d) (e) (f) Figura 3-12. Segmentación del frame 100: (a)ImagenOriginal; (b) Imagen sin fondo método de la Entropía; (c) Conversión binaria; (d) Eliminación de objetos por área; (e) Operación morfológica de dilatado; (f) Eliminación de objetos por excentricidad 27 27 Extracción de Características En este apartado nos centramos en la extracción de características de los objetos obtenidos tras la segmentación. Las características principales que queremos obtener son los valores de los centroides y las cajas contenedoras. Son esenciales para realizar un correcto seguimiento ya que proporcionan información sobre la ubicación de las células. Basándonos en [21] se ha utilizado la función regionporps de Matlab, que es muy útil para el procesamiento morfológico de una imagen binaria. STATS = regionprops(L,properties) ( 3.1.3-1) Mide un conjunto de propiedades para cada región etiquetada en la matriz de etiquetas L, en nuestro caso se corresponde con la imagen binaria, Figura 3-12 (f). Los elementos enteros positivos L corresponden a diferentes regiones. Por ejemplo, el conjunto de elementos de L igual a 1 corresponde a la región 1; el conjunto de elementos de L igual a 2 corresponde a la región 2; y así sucesivamente. El valor de retorno STATS, es una matriz de estructura de longitud max(L(:)). Los campos de la matriz denotan diferentes medidas para cada región, según lo especificado por properties. Properties puede ser una lista de cadenas separadas por comas. La siguiente tabla enumera el conjunto de cadenas válidas. Tabla 2 . Conjunto de cadenas válidas para la función regionprops [21]. Area EquivDiameter MajorAxisLength BoundingBox EulerNumber MinorAxisLength Centroid Extrema Orientation ConvexArea Extent PixelIdxList ConvexHull FilledArea PixelList ConvexImage FilledImage Solidity Eccentricity Image SubarrayIdx La figura 3-13 (b) muestra el resultado de la extracción de las carácterísticas en nuestra aplicación. Como se ha indicado previamente, hemos utilizado las propiedades ‘Centroid’ para detectar el centro de las células y ‘BoundingBox’ para detectar el rectángulo más pequeño que contiene a la región. (a) (b) Figura 3-13. Extracción Características Frame 100: (a) Imagen sin fondo método de la Entropía; (b) Características de la Imagen sin fondo método de la Entropía Resultados 34 34 Ground Truth Método 1 X Y X Y Frame 1 - Frame 1 - 286 813 283,972 808,63 Frame 11 - Frame 11 - 289 797 290,001 797,61 Frame 21 - Frame 21 - 124 135 124,432 134,12 294 790 296,024 783,69 Frame 31 - Frame 31 - 122 131 124,737 128,6 320 739 318,478 739,25 Frame 41 - Frame 41 - 126 127 - - 324 739 323,286 736,79 Frame 51 - Frame 51 - 127 133 128,499 132,35 328 735 323,989 734,96 705 91 701,32 89,035 1192 261 1194,915 258 Frame 61 - Frame 61 - 134 129 134,409 127,42 - - 328,043 731,34 383 507 385,032 511,49 696 89 698,404 88,205 1194 265 1193,815 259,95 Frame 71 - Frame 71 - 130 123 130,623 119,05 328 729 324,433 725,03 391 515 390,67 513,92 570 721 570,583 722,58 - - 697,685 87,743 1200 269 1196,834 268,97 Frame 81 - Frame 81 - 30 167 - - 101 555 106,538 553,36 130 121 128,001 119,33 150 783 146,978 776,98 - - 330,993 716,41 391 503 390,877 504,16 570 723 569,834 721,87 696 89 703,384 93,072 1202 273 1200,601 270,9 Frame 91 - Frame 91 - 30 165 28,714 164,1 Ground Truth Método 1 X Y X Y 105 555 105,706 552,4 126 115 128,49 118,14 154 773 - - 338 709 337,827 709,51 391 499 389,73 500,2 582 729 - - 690 81 - - 1216 275 - - Frame 101 - Frame 101 - - - 26,773 163,8 103 551 103,777 552,14 119 119 119,658 115,29 154 775 151,271 773,8 168 349 167,194 349,38 328 711 334,316 713,15 393 489 393,197 490,68 570 731 565,921 731,97 696 91 698,067 92,281 1226 275 1223,475 280,49 Frame 111 - Frame 111 - - - 27,885 164,85 105 551 105,457 552,05 118 117 120,295 116,36 150 773 151,306 773,27 172 351 172,308 347,17 332 705 333,379 707,71 395 501 396,366 501,28 564 741 559,57 740,43 702 89 702,816 88,268 1228 283 1228,206 283,65 Frame 121 Frame 121 - 107 553 104,707 552,72 111 119 111,166 116,76 152 771 175,052 349,42 173 347 329,838 707,68 332 705 382,877 520,3 383 521 548,526 745,84 554 751 701,36 91,624 1232 293 1231,45 289,96 Frame 131 - Frame 131 - - - 26,942 164,96 101 547 106,617 117,42 107 117 151,095 775,66 35 35 Ground Truth Método 1 X Y X Y 154 775 175,048 346,94 178 347 331,614 704,67 379 533 378,653 530,24 556 747 - - 705 91 703,581 93,634 1230 293 1230,037 290,46 Frame 141 - Frame 141 - 93 117 91,007 114,31 107 555 105,676 552,78 152 777 150,635 774,47 173 345 174,006 345,45 338 697 337,837 695,39 377 531 378,633 529,32 536 751 530,98 749,48 705 93 706,348 93,734 1226 291 1226,202 290,48 Frame 151 - Frame 151 - - - 31,904 158,34 78 113 75,834 112,27 109 557 106,714 554,7 152 775 150,669 774,56 173 345 173,722 346,68 341 695 344,544 692,89 373 529 374,776 527,97 516 755 514,535 749,61 711 97 709,301 96,685 1222 291 1222,242 288,67 Frame 161 Frame 161 - 32 163 31,557 158,44 66 113 64,88 115,3 109 559 107,545 553,46 150 773 151,551 774,23 173 347 173,908 345,68 345 693 348,743 691,24 366 525 364,55 524,88 511 753 512,173 752,17 710 99 711,008 98,107 1220 289 1219,529 286,89 Frame 171 - Frame 171 - - - 30,988 158,27 58 117 55,606 117,03 105 557 107,542 552,5 152 775 150,125 774,87 176 349 174,983 349,17 349 693 356,703 526,57 Ground Truth Método 1 X Y X Y 357 527 352,773 691,14 509 753 508,194 753,65 716 103 714,568 99,902 1220 287 1217,967 285,55 Frame 181 Frame 181 - 28 123 24,288 119,92 105 555 29,507 158,51 152 773 107,002 552,8 180 349 151,031 773,54 340 531 342,773 529,26 347 703 351,34 696,15 505 757 503,824 751,64 716 107 712,435 102,54 1214 285 1215,733 287,69 Frame 191 Frame 191 - 107 551 27,75 157,84 150 775 107,01 552,45 180 351 176,446 348,96 340 529 339,675 528,5 347 705 349,584 700,8 499 757 - - 718 101 712,415 103,4 1212 289 1209,446 290,15 Frame 201 Frame 201 - 105 555 30,07 157,36 148 775 107,265 553,02 181 349 177,468 349,78 345 709 348,622 530,69 347 533 348,194 706,2 498 759 497,472 755,88 1202 287 1203,61 290,04 1276 95 - - Frame 211 Frame 211 - 107 553 29,585 156,86 152 773 106,864 553,36 181 347 150,379 772,96 334 521 333,32 519,62 345 717 345,926 708,36 495 759 494,737 755,94 1206 297 1203,081 297,44 1276 89 1275,311 89,43 Frame 221 Frame 221 - 107 555 29,652 156,27 180 349 107,368 553,07 334 501 177,63 348,46 Resultados 36 36 Ground Truth Método 1 X Y X Y 351 707 340,237 501,25 495 757 353,202 706,55 1108 899 494,247 755,52 1208 301 1204,191 297,42 Frame 231 Frame 231 - 107 555 27,956 154,97 180 351 108,185 553,17 341 509 179,1 351,25 353 715 340,478 509,28 495 755 493,212 753,83 1110 891 1109,268 891,76 1206 303 1205,368 303,5 Frame 241 Frame 241 - 107 553 30,169 152,59 173 349 106,085 554,35 326 519 176,149 348,83 349 719 324,629 518,22 489 751 351,797 723,61 1114 897 491,706 750,06 1210 303 1207,318 304,72 1270 823 1267,237 819,32 Frame 251 Frame 251 - - - 28,027 154,13 105 553 106,026 553,47 180 349 175,356 347,6 288 513 287,549 510 351 735 350,937 736,41 495 751 493,203 748,2 1216 315 1212,775 313,03 1266 819 1268,895 816,05 Frame 261 Frame 261 - - - 28,402 153,01 105 557 106,008 553,1 178 347 177,865 348,25 290 513 288,798 512,63 351 39 347,04 745,48 498 753 493,091 746,66 1220 321 1218,524 319,13 1270 821 1272,172 821,51 Frame 271 Frame 271 - - - 29,205 157,82 105 553 107,544 552,78 184 349 182,104 348,96 - - 301,1 522,83 Ground Truth Método 1 X Y X Y 345 33 346,237 750,6 - - 347,483 33,284 495 747 493,038 746,48 1224 331 1225,384 329,06 1268 811 1269,227 810,94 Frame 281 Frame 281 - 109 555 24,599 161,39 180 351 106,854 553,16 320 511 181,619 348,29 343 35 339,388 35,965 495 749 493,176 744,7 1230 343 1232,141 341,07 1270 817 1268,084 812,69 Frame 291 Frame 291 - 36 165 33,757 160,17 107 553 106,456 553,93 181 349 182,828 347,16 336 37 334,024 38,003 495 743 - - 1238 351 1240,402 347,61 1266 813 1266,067 811,62 Frame 301 Frame 301 - 48 157 46,353 154,65 107 555 107,306 552,59 184 349 185,397 348,18 330 41 331,269 39,131 398 907 396,85 904,2 498 745 495,406 742,54 947 547 948,031 548,78 1238 351 1238,429 351,53 Frame 311 Frame 311 - 111 553 108,432 552,87 192 347 186,53 347,1 324 45 321,5 42,508 398 909 398,102 903,83 493 739 496,03 742,15 548 21 541,556 25,722 630 257 632,316 255,17 969 543 966,434 539,17 1234 353 1238,447 351,74 1332 357 - - Frame 321 Frame 321 - 123 553 125,615 550,51 188 349 186,866 347,1 37 37 Ground Truth Método 1 X Y X Y 316 43 313,079 44,978 389 903 393,157 897,87 495 745 496,251 737,55 532 25 534,869 26,179 628 271 626,809 272,92 971 535 974,004 534,48 1234 357 1236,351 357,54 1350 365 1344,476 364,99 Frame 331 Frame 331 - 144 555 141,303 548 186 345 304,385 48,392 308 49 336,423 496,83 401 889 391,868 885,18 499 739 499,123 742,42 532 23 529,947 28,719 626 287 627,9 285,68 975 537 973,251 537,84 1242 367 1241,143 357,94 1342 359 1341,832 362,54 Frame 341 Frame 341 - 150 545 148,998 543,81 189 345 190,547 346,82 296 53 297,867 51,155 - - 344,468 494,45 411 865 498,979 739,12 528 31 526,007 31,263 630 293 628,911 292,58 975 543 974,324 539,29 1244 363 1242,672 361,6 1340 379 1338,574 380,14 Frame 351 Frame 351 - 30 109 24,53 108,24 138 547 136,667 543,63 192 341 189,032 343,66 296 51 297,652 51,995 417 851 501,707 738,29 524 27 520,498 30,28 969 543 971,456 538,99 1242 371 1245,133 365,12 1344 393 - - Frame 361 - Frame 361 - 30 117 29,578 111,57 118 551 116,091 550,74 189 345 189,184 344,39 292 55 291,595 53,454 Ground Truth Método 1 X Y X Y 414 859 400,59 865 511 733 508,581 735,39 522 27 522,867 30,205 969 539 970,399 538,87 1256 371 - - 1332 393 1334,973 388,63 Frame 371 Frame 371 - 32 111 36,003 115,52 119 549 113,237 551,36 188 351 188,621 349,79 284 55 285,1 55,607 366 523 413,223 871,1 417 875 505,08 734,09 526 33 523,15 30,525 963 547 967,485 546,63 1348 427 - - Frame 381 Frame 381 - 44 111 45,425 114,06 109 553 106,019 553,08 196 373 199,235 373,95 272 57 270,908 56,863 359 533 365,042 532,33 419 849 425,637 846,63 - - 508,19 733,34 526 29 524,065 32,087 963 555 964,185 554,07 Frame 391 Frame 391 - 52 115 52,335 114,94 107 555 104,835 554,68 196 375 196,835 374 262 57 263,63 57,06 359 547 363,07 540,95 421 857 423,322 855,91 - - 509,496 714,78 528 31 523,993 33,552 969 563 967,607 560,03 Frame 401 Frame 401 - 54 117 58,454 113,84 109 555 105,619 554,27 197 371 198,912 370,59 255 57 256,906 57,876 430 865 428,904 866,39 - - 500,964 707,57 524 33 521,859 33,427 975 567 972,283 564,65 Resultados 38 38 Ground Truth Método 1 X Y X Y Frame 411 Frame 411 - 105 553 59,827 112,45 180 363 105,604 553,56 254 57 178,157 361,45 373 543 253,109 57,048 430 871 436,666 869,45 - - 502,593 698,18 524 31 522,963 33,018 977 571 974,745 566,55 Frame 421 Frame 421 - 109 553 60,985 108,94 166 361 166,458 359,83 250 59 249,173 57,231 369 521 364,671 518,68 435 873 437,136 870,68 498 697 - - 522 33 521,187 33,757 969 575 970,109 571,57 Frame 431 Frame 431 - 64 105 64,475 108,46 107 551 106,76 549,88 152 371 148,428 369,29 250 61 249,529 58,447 443 867 442,123 864,74 518 35 518,458 33,27 969 581 968,39 577,3 1358 423 - - Frame 441 Frame 441 - 66 107 67,811 105,43 101 543 96,111 548,46 146 379 151,427 375,54 250 61 250,006 60,576 449 847 - - 522 33 519,866 34,919 969 581 966,28 582,38 1356 419 - - Frame 451 Frame 451 - 76 101 73,695 98,962 252 63 99,24 544 451 851 251,1 62,748 511 21 451,734 847,57 576 367 - - 963 583 965,244 581,25 1356 421 - - Ground Truth Método 1 X Y X Y Frame 461 Frame 461 - 89 93 89,5 95,289 255 63 256,499 61,047 - - 432,813 988,85 457 839 456,643 840,73 590 337 535,252 650,75 963 585 589,839 340,11 1354 429 965,02 583,45 Frame 471 Frame 471 - 95 99 98,62 94,535 264 63 262,817 62,241 465 833 437,389 976,1 590 351 461,742 832,37 967 583 589,573 346 1360 425 966,65 579,81 Frame 481 Frame 481 - - - 108,826 92,156 268 61 267,879 60,727 465 811 441,253 975,32 588 355 469,801 809,57 971 581 586,555 353,64 1364 431 972,185 577,57 Frame 491 Frame 491 - 118 91 107,592 504,36 272 61 118,564 90,007 359 1007 270,664 58,978 456 15 441,986 971,06 469 811 471,955 810,28 586 349 586,696 348,08 983 561 982,994 562,97 1360 437 - - Frame 501 Frame 501 - 134 91 132,097 88,357 268 55 270,961 54,921 375 999 450,069 968,58 456 29 458,774 26,244 472 815 474,917 815 588 361 587,137 361,14 993 557 991,6 553,73 1358 431 - - Frame 511 Frame 511 - 140 89 111,241 507,33 274 59 138,147 86,524 379 997 274,636 55,344 39 39 Ground Truth Método 1 X Y X Y 457 21 446,091 968,51 461 759 463,605 755,15 592 363 589,357 364,47 989 555 988,82 553,73 Frame 521 Frame 521 - 113 503 115,251 502 146 87 142,636 85,949 382 993 279,111 56,413 456 751 458,601 748,08 459 19 - - 588 381 - - 997 551 - - Frame 531 Frame 531 - 118 509 117,449 507,76 150 87 149,186 84,657 385 991 274,306 51,082 463 21 465,456 764,53 465 767 - - 1366 439 - - Frame 541 Frame 541 - 113 501 115,019 500,49 156 89 153,999 83,806 349 29 278,21 50,102 379 999 - - 457 15 468,179 961,89 477 795 478,293 793,81 1360 439 - - Frame 551 Frame 551 - 109 337 - - 111 503 111,256 504,9 160 85 159,881 82,166 379 999 - - 441 11 - - 479 815 482,395 813,76 1360 439 - - Frame 561 Frame 561 - 99 335 - - 107 505 109,171 502,14 164 85 161,941 82,017 282 55 - - 377 999 342,726 34,68 491 823 489,145 823,45 1362 435 - - Frame 571 Frame 571 - 105 339 - - Ground Truth Método 1 X Y X Y 109 501 111,261 500,12 164 85 164,316 82,615 286 51 285,578 50,621 343 39 342,932 36,461 373 1011 - - 488 837 487,624 834,6 1362 425 - - Frame 581 Frame 581 - 118 501 123,026 500,19 164 87 162,715 83,65 - - 293,622 49,28 351 41 343,598 39,199 499 847 494,864 847,35 1366 419 - - Frame 591 Frame 591 - 130 497 126,869 495,36 168 87 167,735 83,691 - - 298,364 46,499 488 851 347,779 38,369 1366 415 491,73 858,19 Frame 601 Frame 601 - 134 495 127,961 491,08 164 87 166,606 85,019 489 853 348,324 38,026 1360 417 491,594 857,62 Frame 611 Frame 611 - 164 85 131,053 488,82 377 1005 165,489 82,667 489 845 345,789 39,888 600 279 489,685 843,7 1362 413 595,803 280,63 - - 620,059 605,63 Frame 621 Frame 621 - 138 489 170,7 81,84 172 89 - - 379 1001 - - 495 841 491,904 841,67 594 301 591,532 305,73 1358 411 619,875 606,6 Frame 631 Frame 631 - 140 483 168,94 77,487 172 79 451,289 995,85 377 1001 497,454 837,52 499 835 583,36 310,44 1362 423 618,615 605,26 Resultados 40 40 Ground Truth Método 1 X Y X Y Frame 641 Frame 641 - 78 363 - - 377 999 - - 509 839 502,749 838,33 1362 445 577,076 309,16 Frame 651 Frame 651 - 84 341 - - 176 77 - - 379 995 503,22 849,93 507 855 574,758 310,06 1226 137 1230,613 133,7 1360 451 - - Frame 661 Frame 661 - 87 321 309,586 45,2 308 53 506,965 856,9 383 1009 576,208 304,15 511 855 618,115 605,48 1226 129 1225,561 130,85 1356 455 1351,966 458,71 Frame 671 Frame 671 - 91 315 90,77 311,02 302 47 - - 387 1003 - - 520 865 513,398 869,29 574 295 - - 1164 539 1156,851 538,55 1222 129 1222,487 130,43 1344 467 1343,138 469,82 Frame 681 Frame 681 - 99 307 98,002 308,89 - - 169,113 75,765 - - 511,077 884,88 - - 590,137 282,32 1158 537 1154,032 538,06 1218 131 1218,31 130,53 1334 481 1331,529 479,26 Frame 691 Frame 691 - 89 307 169,985 73,126 306 43 327,4 29,6 377 1003 1149,396 535,09 1154 535 1211,481 132,04 1214 133 1322,528 490,57 Frame 701 Frame 701 - 382 993 171,144 73,238 Ground Truth Método 1 X Y X Y - - 593,658 257,66 1154 533 1146,636 532,57 - - 1209,87 129,59 - - 1326,027 490,97 Frame 711 Frame 711 - 306 41 322,659 26,406 - - 526,31 883,01 1150 533 1143,875 534,74 1204 129 1207,886 128,38 1312 503 1314,628 502,05 Frame 721 Frame 721 - - - 172,926 75,705 1148 531 1144,505 531,03 1204 133 1204,154 128,85 1316 509 1314,449 508,85 Frame 731 Frame 731 - - - 591,383 250,08 1136 515 1135,128 515,3 1196 133 1198,151 132,13 1314 511 1313,566 513,42 Frame 741 Frame 741 - 1198 129 - - 1308 517 1311,337 515,72 Frame 751 Frame 751 - 184 77 318,35 34,641 1196 129 - - 1320 521 1311,91 520,41 Frame 761 Frame 761 - 1324 517 519,826 895,61 - - 1316,43 518,29 Frame 771 Frame 771 - 1314 527 1315,245 524,7 Frame 781 Frame 781 - 1310 529 299,485 45,171 - - 501,509 912,79 - - 949,378 558,93 Frame 791 Frame 791 - 316 41 303,249 43,999 501 907 499,652 915,06 1346 555 1323,18 547,46 Frame 801 Frame 801 - 379 985 300,466 42,59 - - 507,807 912,88 Frame 811 Frame 811 - 41 41 Ground Truth Método 1 X Y X Y 302 43 511,77 912,55 391 985 - - 1320 537 - - Frame 821 Frame 821 - 387 987 304,728 40,227 - - 514,888 916,2 1308 525 1306,456 532,52 Frame 831 Frame 831 - - - 204,444 78,673 389 973 302,313 37,257 1308 527 516,553 917,19 Frame 841 Frame 841 - - - 304,585 40,705 526 909 519,6 915,66 1292 517 1297,769 518,6 Ground Truth Método 1 X Y X Y Frame 851 Frame 851 - 218 77 213,958 77,035 - - 301,287 40,965 524 917 521,148 916,81 1286 513 1287,319 509,67 Frame 861 Frame 861 - 214 79 216,052 76,427 - - 298,843 37,438 522 919 521,436 921,07 1292 499 1293,199 499,35 Frame 871 Frame 871 - 218 81 217,255 77,47 534 917 297,659 36,427 1286 481 529,675 922,74 - - 1288,794 491,43 Tabla 4.- Centros detectados en el vídeo sin fondo (Método 1) tras segmentación. Ground Truth Método 2 X Y X Y Frame 1 - Frame 1 - 286 813 283,78 808,779 Frame 11 - Frame 11 - 289 797 290 798 Frame 21 - Frame 21 - 124 135 124,367 134,032 294 790 295,86 783,819 Frame 31 - Frame 31 - 122 131 124,717 128,533 320 739 318,399 739,405 Frame 41 - Frame 41 - 126 127 129,354 128,824 324 739 324,343 736,688 Frame 51 - Frame 51 - 127 133 128,428 132,25 328 735 324,268 735,338 705 91 701,167 89,175 1192 261 - - Frame 61 - Frame 61 - 134 129 134,444 127,302 - - 327,875 731,385 383 507 384,984 511,971 696 89 698,389 88,48 1194 265 1193,572 259,82 Ground Truth Método 2 X Y X Y Frame 71 - Frame 71 - 130 123 130,575 118,895 328 729 324,608 724,951 391 515 390,582 513,894 570 721 570,503 722,482 - - 697,666 87,909 1200 269 1196,868 268,76 Frame 81 - Frame 81 - 30 167 - - 101 555 106,539 553,65 130 121 127,798 119,552 150 783 146,793 777,059 - - 331,007 716,23 391 503 391,102 504,314 570 723 569,903 722,142 696 89 703,411 92,875 1202 273 1200,52 270,787 Frame 91 - Frame 91 - 30 165 28,636 163,863 105 555 105,797 552,781 126 115 128,479 118,043 154 773 151,861 774,55 338 709 337,944 709,796 391 499 389,966 500,081 Resultados 42 42 Ground Truth Método 2 X Y X Y 582 729 - - 690 81 - - 1216 275 1213,537 274,054 Frame 101 - Frame 101 - - - 26,834 163,821 103 551 104,122 552,172 119 119 119,5 115,306 154 775 151,603 774,071 168 349 167,511 349,3 328 711 334,391 713,231 393 489 392,915 491,493 570 731 565,755 732,116 696 91 698,135 92,401 1226 275 1223,688 280,518 Frame 111 - Frame 111 - - - 27,76 164,793 105 551 105,426 552,232 118 117 120,117 116,272 150 773 151,534 773,338 172 351 172,363 347,484 332 705 333,544 707,719 395 501 396,242 501,146 564 741 559,687 740,473 702 89 702,673 88,427 1228 283 1228,21 283,485 Frame 121 Frame 121 - 107 553 104,96 552,899 111 119 111,182 116,628 152 771 151,514 773,844 173 347 174,913 349,482 332 705 329,889 707,69 383 521 383,413 520,455 554 751 547,933 745,755 - - 700,946 90,925 1232 293 1231,4 289,83 Frame 131 - Frame 131 - - - 26,769 164,883 101 547 105,091 552,21 107 117 106,714 117,399 154 775 151,358 775,81 178 347 174,98 346,863 379 533 331,495 704,732 556 747 378,572 530,103 705 91 703,467 93,505 Ground Truth Método 2 X Y X Y 1230 293 1230,175 290,362 Frame 141 - Frame 141 - 93 117 91,11 114,444 107 555 105,946 553,118 152 777 151,104 774,621 173 345 173,855 345,792 338 697 337,973 695,897 377 531 378,6 529,347 536 751 531,047 749,402 705 93 706,248 93,794 1226 291 1226,124 290,503 Frame 151 - Frame 151 - - - 31,98 158,356 78 113 76,303 112,156 109 557 106,91 554,617 152 775 150,679 774,952 173 345 173,74 346,841 341 695 344,526 692,907 373 529 374,854 528,233 516 755 514,806 749,859 711 97 709,387 96,736 1222 291 1222,229 288,666 Frame 161 Frame 161 - 32 163 31,421 158,452 66 113 65,31 115,35 109 559 107,703 553,587 150 773 151,985 774,61 173 347 173,892 345,833 345 693 348,908 691,194 366 525 364,615 524,877 511 753 512,252 752,13 710 99 711,066 98,241 1220 289 1219,442 286,934 Frame 171 - Frame 171 - - - 30,948 158,177 58 117 55,621 117,121 105 557 107,432 552,607 152 775 150,268 774,892 176 349 175,011 349,212 349 693 356,828 526,539 357 527 352,893 691,166 509 753 508,136 753,521 716 103 714,597 99,818 1220 287 1217,813 285,531 43 43 Ground Truth Método 2 X Y X Y Frame 181 Frame 181 - - - 24,403 119,931 28 123 29,735 158,573 105 555 107,071 552,851 152 773 150,843 773,573 180 349 175,5 348,386 340 531 342,835 529,178 347 703 351,387 696,15 505 757 503,913 752,115 716 107 712,437 102,572 1214 285 1215,762 287,684 Frame 191 Frame 191 - - - 27,783 157,64 107 551 107,162 552,491 150 775 151,712 772,797 180 351 176,305 348,914 340 529 339,769 528,428 347 705 349,811 700,8 499 757 499,74 755,452 718 101 712,423 103,211 1212 289 1209,436 290,16 Frame 201 Frame 201 - 105 555 30,148 157,314 148 775 107,283 553,188 181 349 150,89 773,535 345 709 177,368 349,7 347 533 348,812 530,574 498 759 348,135 706,265 1202 287 497,546 755,824 1276 95 1203,594 290,104 Frame 211 Frame 211 - - - 29,574 156,879 107 553 107,006 553,149 152 773 150,447 772,963 181 347 177,912 349,517 334 521 332,987 519,513 345 717 345,97 708,36 495 759 494,766 755,873 1206 297 1203,113 297,421 1276 89 1275,308 89,41 Frame 221 Frame 221 - 107 555 29,806 156,176 180 349 107,633 553,129 334 501 177,612 348,352 351 707 340,234 501,033 Ground Truth Método 2 X Y X Y 495 757 353,168 706,401 1108 899 494,342 755,416 1208 301 1204,196 297,38 Frame 231 Frame 231 - 107 555 28,007 154,887 180 351 108,132 553,21 341 509 179,16 351,075 353 715 340,463 509,112 495 755 493,055 753,587 1110 891 1108,759 891,534 1206 303 1205,346 303,457 Frame 241 Frame 241 - 107 553 30,138 152,54 173 349 106,271 554,208 326 519 176,102 348,271 349 719 324,565 518,146 489 751 351,423 723,683 1114 897 491,969 749,969 1210 303 1207,314 304,771 1270 823 1266,971 819,442 Frame 251 Frame 251 - - - 28,079 153,865 105 553 106,274 553,386 180 349 175,273 347,334 288 513 287,722 510,112 351 735 351,016 736,382 495 751 493,213 748,135 1216 315 1212,725 313,124 1266 819 1268,878 816,202 Frame 261 Frame 261 - - - 28,358 152,924 105 557 106,047 553,069 178 347 177,865 348,104 290 513 288,89 512,539 351 39 347,183 745,495 498 753 493,209 746,565 1220 321 1218,488 319,118 1270 821 1271,898 821,684 Frame 271 Frame 271 - - - 29,286 157,729 105 553 107,666 552,864 184 349 182,155 348,763 - - 300,942 522,636 345 33 346,275 750,497 - - 347,576 33,196 Resultados 50 50 Ground Truth Método 3 X Y X Y - - 26,252 164,397 107 553 104,289 552,138 111 119 110,989 116,012 152 771 150,71 773,435 173 347 174,344 348,588 332 705 329,608 707,181 383 521 382,492 519,587 554 751 548,607 745,538 - - 699,098 89,306 1232 293 1231,149 289,267 Frame 131 - Frame 131 - - - 26,663 164,146 101 547 104,476 551,706 107 117 105,866 116,649 154 775 150,756 775,152 178 347 174,262 346,18 - - 331,576 704,168 379 533 377,695 529,401 556 747 549,233 744,401 705 91 703,08 92,974 1230 293 1229,616 289,85 Frame 141 - Frame 141 - 93 117 89,967 113,819 107 555 105,34 552,174 152 777 150,126 774,007 173 345 173,283 344,993 338 697 337,118 695,118 377 531 377,81 528,994 536 751 531,37 749,393 705 93 705,679 93,406 1226 291 1225,818 290,15 Frame 151 - Frame 151 - 78 113 75,606 111,903 109 557 106,221 554,12 152 775 150,343 774,289 173 345 173,133 346,037 341 695 344,468 692,435 373 529 373,977 527,444 516 755 515,286 750,282 711 97 708,791 96,123 1222 291 1221,778 288,293 Frame 161 Frame 161 - 32 163 30,894 157,751 66 113 64,396 114,775 Ground Truth Método 3 X Y X Y 109 559 107,025 552,968 150 773 151,326 773,999 173 347 173,416 345,039 345 693 348,077 691,167 366 525 364,063 524,46 511 753 511,96 751,797 710 99 710,632 97,758 1220 289 1218,829 286,435 Frame 171 - Frame 171 - - - 30,667 157,421 58 117 54,378 116,6 105 557 106,77 552,147 152 775 149,837 774,155 176 349 174,232 348,393 349 693 356,062 525,938 357 527 351,946 690,719 509 753 507,616 752,882 716 103 714,374 99,374 1220 287 1217,237 284,798 Frame 181 Frame 181 - 28 123 23,679 119,376 105 555 106,226 552,122 152 773 150,385 773,123 180 349 175,119 347,755 340 531 342,095 528,85 347 703 350,346 696,162 505 757 503,324 751,471 716 107 712,314 102,185 1214 285 1215,286 287,078 Frame 191 Frame 191 - - - 27,583 157,251 107 551 106,526 551,946 150 775 151,177 772,188 180 351 175,606 348,118 340 529 338,792 528,216 347 705 348,477 700,094 499 757 499,382 754,602 718 101 711,959 102,917 1212 289 1208,862 289,716 Frame 201 Frame 201 - 105 555 29,607 156,868 148 775 106,704 552,631 181 349 150,253 772,987 345 709 176,749 348,712 51 51 Ground Truth Método 3 X Y X Y 347 533 347,738 530,754 498 759 346,951 706,281 1202 287 497,015 755,309 1276 95 1203,27 289,65 Frame 211 Frame 211 - - - 29,345 156,435 107 553 106,279 552,508 152 773 149,965 772,663 181 347 177,424 348,622 334 521 332,571 519,116 345 717 345,789 708,742 495 759 494,237 755,348 1206 297 1202,677 297,023 1276 89 - - Frame 221 Frame 221 - 107 555 29,493 155,823 180 349 106,79 552,412 334 501 176,918 347,576 351 707 339,608 500,362 495 757 351,066 705,135 1108 899 493,617 754,913 1208 301 1203,879 296,871 Frame 231 Frame 231 - 107 555 107,739 552,496 180 351 178,653 350,186 341 509 340,102 508,347 353 715 350,691 713,065 495 755 492,97 752,896 1110 891 1108,722 891,388 1206 303 1205,065 302,973 Frame 241 Frame 241 - 107 553 105,765 553,924 173 349 175,527 347,765 326 519 324,005 517,674 349 719 350,85 723,628 489 751 491,386 749,48 1114 897 - - 1210 303 1207,028 304,275 1270 823 1267,063 818,924 Frame 251 Frame 251 - - - 28,042 153,478 105 553 105,542 552,752 180 349 174,605 346,552 288 513 287,025 509,88 351 735 349,52 736,457 Ground Truth Método 3 X Y X Y 495 751 492,758 747,73 1216 315 1212,6 312,389 1266 819 1268,603 815,842 Frame 261 Frame 261 - - - 28,268 152,552 105 557 105,402 552,553 178 347 177,205 347,391 290 513 288,408 511,045 - - 345,529 746,863 351 39 359,91 37,182 498 753 492,898 746,147 1220 321 1218,472 318,423 1270 821 1271,634 820,874 Frame 271 Frame 271 - - - 28,75 157,295 105 553 107,151 552,27 184 349 181,638 347,952 - - 300,789 523,445 345 33 346,872 32,705 - - 345,787 749,982 495 747 492,653 745,94 1224 331 1224,77 328,84 1268 811 1268,993 810,427 Frame 281 Frame 281 - - - 9,68 80,795 109 555 24,301 160,7 180 351 106,493 552,47 320 511 181,074 347,495 343 35 339,298 35,5 495 749 493,018 744,28 1230 343 1231,739 339,662 1270 817 1267,776 812,396 Frame 291 Frame 291 - 36 165 12,88 100,024 107 553 106,079 553,227 181 349 182,273 346,492 336 37 333,556 37,372 495 743 493,175 743,796 1238 351 1239,909 346,729 1266 813 1265,835 811,223 Frame 301 Frame 301 - - - 10,893 98,429 48 157 46,235 154,174 107 555 106,901 552,156 184 349 184,933 347,461 Resultados 52 52 Ground Truth Método 3 X Y X Y 330 41 330,72 38,575 398 907 396,295 903,62 498 745 495,187 741,866 947 547 946,912 548,355 1238 351 1237,887 350,803 Frame 311 Frame 311 - 111 553 107,813 552,263 192 347 186,028 346,052 324 45 320,939 41,816 398 909 397,141 903,244 493 739 495,029 742,773 548 21 540,86 21,675 630 257 - - 969 543 965,905 538,501 1234 353 1238,021 351,242 1332 357 - - Frame 321 Frame 321 - 123 553 125,214 549,961 188 349 186,525 346,23 316 43 312,465 44,302 389 903 392,653 897,475 495 745 495,647 737,41 532 25 534,346 25,535 628 271 626,33 272,37 971 535 973,933 534,023 1234 357 1235,958 356,811 1350 365 1344,216 364,59 Frame 331 Frame 331 - 144 555 13,538 109,601 186 345 140,674 547,33 308 49 185,707 345,707 - - 303,733 47,653 401 889 391,416 885,245 499 739 498,288 741,673 532 23 529,215 27,678 626 287 627,681 285,063 975 537 973,156 537,508 1242 367 1240,685 357,341 1342 359 1342,217 362,424 Frame 341 Frame 341 - - - 20,024 107,859 150 545 148,847 542,97 189 345 190,045 346,115 296 53 297,302 50,455 Ground Truth Método 3 X Y X Y - - 344,094 494,198 411 865 499,716 738,367 528 31 525,239 30,519 630 293 628,621 292,096 975 543 974,187 538,984 1244 363 1242,735 361,137 1340 379 1337,818 378,565 Frame 351 Frame 351 - 30 109 23,969 107,263 138 547 136,806 542,18 192 341 188,455 342,767 296 51 296,811 51,266 417 851 501,385 737,416 524 27 520,176 29,725 969 543 971,12 538,399 1242 371 1245,163 364,865 1344 393 - - Frame 361 - Frame 361 - 30 117 28,753 111,04 118 551 116,366 549,17 189 345 188,529 343,683 292 55 291,138 52,756 414 859 400,035 864,359 511 733 508,545 735,384 522 27 522,471 29,36 969 539 969,992 538,42 1256 371 1258,563 373,884 1332 393 1333,204 389,112 Frame 371 Frame 371 - 32 111 35,286 114,83 119 549 113,522 549,932 188 351 188,122 348,911 284 55 284,311 54,929 366 523 413,172 869,829 417 875 504,664 733,534 526 33 522,632 29,911 963 547 967,006 546,212 1348 427 - - Frame 381 Frame 381 - 44 111 44,734 113,617 109 553 105,682 552,493 196 373 198,498 373,277 272 57 270,31 56,258 359 533 362,732 532,534 53 53 Ground Truth Método 3 X Y X Y 419 849 424,271 846,936 - - 508,65 732,815 526 29 523,531 31,476 963 555 964,088 553,439 Frame 391 Frame 391 - 52 115 51,629 114,773 107 555 107,687 552,636 196 375 196,165 373,411 262 57 263,001 56,376 359 547 361,939 542,239 421 857 422,959 854,99 - - 509,101 714,066 528 31 523,633 32,558 969 563 967,384 559,306 Frame 401 Frame 401 - 54 117 57,54 113,521 109 555 107,098 552,866 197 371 198,266 369,688 255 57 255,996 57,275 - - 362,595 543,285 430 865 428,045 866,455 524 33 521,292 32,687 975 567 972,101 564,128 Frame 411 Frame 411 - - - 58,917 112,32 105 553 107,898 552,106 180 363 177,286 361,104 254 57 252,41 56,613 373 543 371,205 541,116 430 871 435,678 868,985 524 31 522,534 32,314 977 571 974,724 566,127 Frame 421 Frame 421 - - - 60,262 108,697 109 553 110,131 552,406 166 361 165,64 359,263 250 59 248,49 56,857 369 521 365,045 518,562 435 873 436,243 870,416 498 697 502,707 692,404 522 33 520,658 33,181 969 575 970,005 571,58 Frame 431 Frame 431 - 64 105 63,718 107,801 107 551 107,606 548,472 Ground Truth Método 3 X Y X Y 152 371 147,969 368,721 250 61 248,717 57,867 443 867 441,165 864,499 518 35 518,02 32,526 969 581 968,198 576,847 1358 423 1358,837 423,483 - - 1365,295 477,957 Frame 441 Frame 441 - 66 107 67,101 105,259 101 543 94,565 548,264 146 379 151,233 374,735 250 61 249,341 59,876 449 847 449,886 843,102 522 33 519,561 34,03 969 581 966,269 581,761 - - 1331,494 9,467 1356 419 1356,305 417,034 Frame 451 Frame 451 - 76 101 73,07 98,609 - - 100,898 542,742 252 63 250,535 62,176 451 851 424,012 1002,89 511 21 451,297 848,762 576 367 510,675 18,749 963 583 965,163 580,619 1356 421 1357,05 418,579 Frame 461 Frame 461 - 89 93 88,942 95,117 - - 99,365 542,756 255 63 255,607 60,389 457 839 433,438 988,421 - - 456,326 840,766 590 337 535,109 649,769 - - 588,882 341,341 963 585 964,876 582,884 1354 429 1358,881 424,762 Frame 471 Frame 471 - 95 99 89,25 533,228 264 63 98,022 94,253 - - 262,194 61,434 465 833 460,823 832,155 590 351 588,891 346,168 967 583 966,468 579,187 1360 425 1360,326 424,537 Frame 481 Frame 481 - Resultados 54 54 Ground Truth Método 3 X Y X Y - - 108,052 91,649 268 61 267,238 59,96 465 811 469,106 809,471 588 355 586,052 353,302 971 581 971,904 576,985 1364 431 1362,499 430,091 Frame 491 Frame 491 - - - 118,063 89,732 118 91 269,952 58,45 272 61 365,135 1002,33 359 1007 442,03 971,862 456 15 458,191 15,364 469 811 471,163 809,885 586 349 585,513 348,006 983 561 982,83 562,528 1360 437 1361,651 433,561 Frame 501 Frame 501 - - - 108,263 505,342 134 91 131,214 87,876 268 55 270,732 54,636 375 999 379,188 997,123 456 29 457,989 25,56 472 815 473,619 814,281 588 361 586,552 360,56 993 557 991,344 553,239 1358 431 1362,152 432,037 Frame 511 Frame 511 - - - 110,359 506,453 140 89 137,485 86,282 274 59 274,252 54,834 379 997 381,571 995,615 457 21 457,009 18,622 461 759 461,453 757,139 592 363 588,858 363,75 989 555 989,117 554,133 - - 1363,677 434,007 Frame 521 Frame 521 - 113 503 112,5 503,887 146 87 141,644 85,573 382 993 382,426 993,942 456 751 457,495 748,015 459 19 459,852 16,881 588 381 1363,023 436,337 997 551 - - Ground Truth Método 3 X Y X Y Frame 531 Frame 531 - 118 509 115,651 507,073 150 87 148,468 84,347 - - 274,054 49,791 385 991 383,115 992,499 463 21 460,31 14,652 465 767 465,33 765,056 1366 439 1361,368 436,33 Frame 541 Frame 541 - 113 501 114,287 500,21 156 89 153,423 82,995 349 29 277,501 49,492 379 999 380,595 994,669 457 15 457,294 12,994 477 795 477,874 793,627 1360 439 1360,311 436,227 Frame 551 Frame 551 - 109 337 - - 111 503 110,152 504,526 160 85 159,34 81,887 379 999 381,539 994,503 441 11 441,458 12,519 479 815 481,983 813,455 1360 439 1360,813 437,285 Frame 561 Frame 561 - 99 335 - - 107 505 107,488 502,457 164 85 161,263 81,853 282 55 277,973 50,147 377 999 377,742 998,469 491 823 488,633 823,081 1362 435 1361,641 432,155 Frame 571 Frame 571 - 105 339 - - 109 501 109,323 499,438 164 85 163,358 82,298 286 51 284,302 50,452 343 39 - - 373 1011 375,385 1000,95 488 837 487,414 834,138 1362 425 1362,071 427,102 Frame 581 Frame 581 - 118 501 120,3 500,182 164 87 161,893 83,457 55 55 Ground Truth Método 3 X Y X Y - - - - 351 41 - - 499 847 493,907 846,208 1366 419 1363,888 421,258 Frame 591 Frame 591 - 130 497 126,122 495,503 168 87 166,951 82,946 - - - - 488 851 490,122 858,146 1366 415 1363,289 419,53 Frame 601 Frame 601 - 134 495 126,744 491,975 164 87 165,918 84,483 489 853 489,825 855,093 1360 417 1363,427 414,988 Frame 611 Frame 611 - - - 129,987 486,982 164 85 164,866 82,136 377 1005 385,491 1000,58 489 845 487,342 843,214 - - 595,9 280,464 600 279 619,552 604,874 1362 413 1362,075 410,631 Frame 621 Frame 621 - 138 489 170,11 81,411 172 89 381,982 999,694 379 1001 491,591 838,897 495 841 590,783 304,807 594 301 619,418 605,954 1358 411 1356,504 410,32 Frame 631 Frame 631 - 140 483 168,111 76,909 172 79 380,869 999,678 377 1001 496,854 836,355 499 835 579,969 310,109 - - 618,492 605,399 1362 423 1360,533 424,525 Frame 641 Frame 641 - 78 363 382,797 999,067 377 999 501,385 837,079 509 839 576,46 308,601 - - 618,219 606,706 1362 445 1362,716 438,616 Frame 651 Frame 651 - 84 341 384,089 999,57 Ground Truth Método 3 X Y X Y 176 77 501,382 848,283 379 995 574,211 310,863 507 855 618,698 606,048 1226 137 1230,178 133,515 1360 451 1359,42 450,486 Frame 661 Frame 661 - 87 321 304,832 45,558 308 53 382,24 1001,94 383 1009 507,097 854,631 511 855 573,673 304,232 - - 617,508 605,367 1226 129 1224,518 130,078 1356 455 1351,647 457,637 Frame 671 Frame 671 - 91 315 90,147 310,197 302 47 304,063 45,939 387 1003 383,94 1001,64 520 865 513,24 867,068 574 295 575,552 294,899 - - 618,587 605,247 1164 539 1156,665 537,969 1222 129 1222,203 129,65 1344 467 1342,767 468,622 Frame 681 Frame 681 - 99 307 97,866 308,099 - - 380,573 1003,36 - - 510,78 882,073 - - 588,059 282,831 1158 537 1154,315 537,436 1218 131 1216,987 130,518 1334 481 1329,955 477,068 Frame 691 Frame 691 - 89 307 - - - - 169,542 72,943 306 43 328,744 28,446 377 1003 378,712 1001,19 - - 515,137 879,701 - - 590,551 270,385 1154 535 1149,469 534,578 1214 133 1210,918 131,76 - - 1321,905 490,51 Frame 701 Frame 701 - - - 322,469 26,392 382 993 380,178 995,389 - - 593,399 257,177 Resultados 56 56 Ground Truth Método 3 X Y X Y 1154 533 1146,314 531,813 - - 1209,528 129,44 - - 1325,581 492,319 Frame 711 Frame 711 - 306 41 322,212 26,188 1150 533 1143,52 534,093 1204 129 1207,067 127,701 1312 503 1312,907 503,154 Frame 721 Frame 721 - - - 172,254 75,318 - - 322,54 22,024 - - 527,889 883,894 - - 596,247 246,467 1148 531 1144,336 530,175 1204 133 1203,646 128,294 1316 509 1312,451 507,872 Frame 731 Frame 731 - - - 321,762 23,158 - - 533,05 883,091 - - 590,7 249,587 1136 515 1133,759 513,368 1196 133 1196,972 131,204 1314 511 1312,752 513,13 Frame 741 Frame 741 - - - 317,886 29,363 1198 129 532,824 883,901 1308 517 1310,546 515,307 Frame 751 Frame 751 - 184 77 317,726 34,18 1196 129 525,164 891,586 1320 521 1311,318 519,878 Frame 761 Frame 761 - - - 317,329 37,128 - - 518,921 895,655 1324 517 1315,258 518,398 Frame 771 Frame 771 - - - 315,434 37,354 - - 510,071 902,158 1314 527 1314,48 524,957 Frame 781 Frame 781 - Ground Truth Método 3 X Y X Y - - 306,504 44,181 - - 502,245 911,867 - - 949,024 558,459 1310 529 1309,187 529,616 Frame 791 Frame 791 - 316 41 304,606 44,25 501 907 500,469 913,599 1346 555 - - Frame 801 Frame 801 - 379 985 301,502 42,3 - - 508,195 911,279 Frame 811 Frame 811 - 302 43 299,844 40,844 391 985 513,341 911,358 1320 537 513,341 911,358 Frame 821 Frame 821 - 387 987 305,345 40,925 1308 525 514,607 915,407 Frame 831 Frame 831 - 389 973 516,64 916,87 1308 527 - - Frame 841 Frame 841 - - - 305,525 42,147 - - 519,165 914,719 526 909 1297,1 518,273 1292 517 1322,169 555,684 Frame 851 Frame 851 - 218 77 - - - - 521,066 915,994 524 917 1286,75 509,088 1286 513 1317,097 555,178 Frame 861 Frame 861 - 214 79 215,542 76,182 522 919 521,994 919,23 1292 499 1292,783 498,841 1292 499 1315,371 548,735 Frame 871 Frame 871 - 218 81 299,217 34,983 - - 530,022 921,316 1286 481 1288,528 490,945 Tabla 6.- Centros detectados en el vídeo sin fondo (Método 3) tras segmentación 57 57 Seguimiento de células Se ha realizado una comparativa entre los diferentes métodos para deteminar el número de células detectadas en cada frame, tomando muestras cada 10 frames, respecto a la Ground Truth la cual se ha obtenido manualmente. La Figura 4-1 representa los valores obtenidos en la tabla 7. Figura 4-1 Número de células detectadas por frame Se puede observar que la gráfica que más se aproxima a la verdad de referencia se obtiene con el vídeo que utiliza la Combinación de Gradientes para la sustracción del fondo, consiguiendo un 86.36% de acierto. Acierto Método 1: Filtro de Entropía 68.18% Método 2: Combinación de Gradientes 86.36% Método 3: Transformada Wavelet 81.82% Tabla 7.- Porcentaje de acierto en el número de células detectadas por frame Deducimos de estos resultados, que el algoritmo es eficaz para el objetivo del trabajo. Vemos una muestra de los resultados en la Figura 4-2 y la Figura 4-3. Hemos escogido franjas del vídeo, con 6 imágenes consecutivas la primera, de forma que se pueda apreciar el seguimiento. (a) (b) 0 2 4 6 8 10 12 031 61 91 121151181211241271301331361391421451481511541571601631661691721751781811841871 Células Detectadas Frames GT Método 1 Método 2 Método 3 Resultados 58 58 (c) (d) (e) (f) Figura 4-2 Imágenes resultado utilizando el método de sustracción de fondo 2; (a) Frame 104, (b) Frame 105, (c) Frame 106, (d) Frame 107, (e) Frame 108, (f) Frame 109 En la Figura 4-3, podemos comprobar un seguimiento correcto, aunque a partir de (b) podemos observar como una de las células centrales, con identificador 4, sigue siendo reconocida después de haber desaparecido. De hecho, en la etiqueta aparece la palabra predicted, lo que quiere decir que no existe detección durante la segmentación, pero el filtro del Kalman la incluye en su predicción. (a) 59 59 (b) (c) Figura 4-3 Imágenes resultado utilizando el método de sustracción de fondo 3; (a) Frame 76, (b) Imagen 77, (c) Frame 85 Por otro lado, existe otro fenómeno que se muestra en la Figura 4-4, y es la pérdida de seguimiento de una célula que estaba siendo detectada por que sale de la pantalla o se vuelve muy pequeña. El método más vulnerable a este problema es el 1, como se indica en la Tabla 7. Esto no perjudica en los resultados ya que no se tienen en cuenta en el cómputo de todos los tiempos y la media. (a) Referencias 66 66 67 67