Nuevas alternativas terapéuticas para el tratamiento de infecciones por adenovirus: síntesis y evaluación de pequeñas moléculas antivirales

NUEVAS ALTERNATIVAS TERAPÉUTICAS PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES POR ADENOVIRUS: SÍNTESIS Y EVALUACIÓN DE PEQUEÑAS MOLÉCULAS ANTIVIRALES TESIS DOCTORAL de PABLO MARTÍNEZ AGUADO 12/10/2016 El Prof. Jerónimo Pachón Díaz, Catedrático de Medicina de la Universidad de Sevilla, el Dr. Javier Sánchez Céspedes, Doctor en Biología, adscrito al Departamento de Medicina de la Universidad de Sevilla y la Dra. Margarita Luisa Vega Holm, Doctora en Farmacia, adscrita al Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica de la Universidad de Sevilla, CERTIFICAN: Que el trabajo de investigación que lleva por título “Nuevas alternativas terapéuticas para el tratamiento de infecciones por adenovirus: síntesis y evaluación de pequeñas moléculas antivirales” ha sido realizado bajo su dirección por el Licenciado en Biología Don Pablo Martínez Aguado, y reúne las condiciones necesarias para ser leído y defendido como Tesis Doctoral para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Para que conste a los efectos oportunos, expiden el presente certificado en Sevilla a 12 de octubre de 2016. Jerónimo Pachón Díaz Javier Sánchez Céspedes Margarita Vega Holm ÍNDICE I. ABSTRACT ........................................................................................................................... 21 II. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 24 1. Adenovirus ............................................................................................................................ 25 1.1. Clasificación y estructura del HAdV ................................................................... 25 1.2. Organización del genoma del HAdV................................................................... 27 1.3. Ciclo de infección del HAdV .................................................................................. 29 2. Impacto clínico y tratamiento de las infecciones por adenovirus ................... 31 2.1. Distribución y transmisión del HAdV ................................................................ 31 2.2. Impacto clínico ........................................................................................................... 32 Infecciones en pacientes inmunocompetentes .................................... 32 Infecciones en pacientes inmunodeprimidos ....................................... 34 3. Perspectivas en el descubrimiento y desarrollo de antivirales ........................ 36 3.1. Artículo I. Antiadenovirus drug discovery: potential targets and evaluation methodologies .................................................................................................... 36 3.2. Antivirales derivados de piperazina .................................................................. 45 3.3. Inhibidores dirigidos a la AVP.............................................................................. 47 III. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................... 50 IV. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ............................................................................................. 54 V. RESULTADOS .................................................................................................................... 58 1. Cribado y caracterización de moléculas con actividad anti-HAdV .................. 59 1.1. Artículo II. New 4-acyl-1-phenylaminocarbonyl-2-phenylpiperazine derivatives as potential inhibitors of adenovirus infection. Synthesis, biological evaluation and structure-activity relationships. .................................... 59 1.2. Resultados adicionales ............................................................................................ 80 Ensayo de inhibición de la polimerasa de phi29 (φ29) mediante PCR cuantitativa .................................................................................................................. 80 2. Desarrollo de inhibidores de la AVP de la proteasa de adenovirus (AVP) ... 82 2.1. Síntesis y evaluación de nuevos inhibidores específicos de la AVP: inmunofluorescencia indirecta. ......................................................................................... 82 Resultados .......................................................................................................... 85 2.1.1.1. Análisis del impacto de los compuestos evaluados en la expresión de los genes tempranos (E4orf3) y tardíos (proteínas estructurales) de HAdV ............................................................................................... 85 2.1.1.2. Análisis de la intensidad de la citoqueratina celular .................... 89 2.2. Caracterización estructural de la AVP: Obtención de las estructuras cristalinas de los complejos de AVP-pVIc y AVP-pVIc-ADN ................................... 91 Obtención de los complejos AVP-pVIc .................................................... 91 Cristalización y obtención de datos mediante rayos-X ..................... 92 Solución de la estructura y refinamiento ............................................... 93 Obtención de los complejos AVP-pVIc-ADN .......................................... 95 VI. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 99 1. Caracterización estructural de los compuestos: espectroscopía de resonancia magnética nuclear .............................................................................................. 101 1.1. Primera generación de compuestos ................................................................ 101 1.2. Segunda generación de compuestos ................................................................ 104 1.3. Tercera generación de compuestos ................................................................. 107 1.4. Potenciales inhibidores específicos de la AVP ............................................. 110 2. Inhibición de la infección de HAdV por los derivados de 4-Acil-1- fenilaminocarbonil-2-fenilpiperazina ................................................................................ 112 2.1. Primera generación ................................................................................................ 112 2.2. Segunda generación ............................................................................................... 113 2.3. Tercera generación................................................................................................. 114 3. Impacto en la entrada de HAdV .................................................................................. 116 4. Impacto en la replicación de HAdV ............................................................................ 118 5. Impacto en la replicación de HCMV ........................................................................... 119 6. Evaluación de la inhibición de los compuestos derivados de 2- fenilpiperazina sobre la polimerasa de phi29 (φ29) ................................................... 119 7. Evaluación de nuevos inhibidores específicos de la proteasa del HAdV (AVP): síntesis y determinación estructural ................................................................... 120 7.1. Análisis de la expresión de los genes tempranos y tardíos de HAdV .. 122 7.2. Efecto de los compuestos sobre la degradación de la red de citoqueratina celular ............................................................................................................ 123 8. Cristalización de la estructura del complejo AVP-pVIc-ADN ........................... 124 VII. CONCLUSIONS ............................................................................................................. 128 VIII. ANEXO ......................................................................................................................... 132 1. Relación de productos sintetizados........................................................................... 133 1.1. Derivados de 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2-metilpiperazina: primera generación (10-26) ............................................................................................................... 133 1.2. Derivados de 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2-metilpiperazina: segunda generación (27-41) ............................................................................................................... 135 1.3. Derivados de 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2-fenilpiperazina: tercera generación (46-65) ............................................................................................................... 137 1.4. Derivados de 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2-fenilpiperazina: potenciales inhibidores específicos de la AVP (68-72) .......................................... 139 2. Materiales y métodos ...................................................................................................... 140 2.1. Síntesis y evaluación de nuevos inhibidores específicos de la AVP: inmunofluorescencia indirecta ........................................................................................ 140 Librerías de compuestos............................................................................. 140 2.1.1.1. Procedimiento general 4. Reacción de N-acilación quimioselectiva de las 2-fenilpiperazinas (66, 67). ........................................ 140 2.1.1.2. Procedimiento general 5. Síntesis de los urea derivados (68-71) 142 2.1.1.3. Procedimiento general 6. Síntesis del disulfonamida derivado 72 144 Células y virus ................................................................................................. 145 Anticuerpos ...................................................................................................... 146 Técnica de inmunofluorescencia indirecta .......................................... 146 Microscopía ...................................................................................................... 147 Análisis estadístico........................................................................................ 149 2.1.6.1. Expresión génica de genes tempranos y tardíos ......................... 149 2.1.6.2. Estudio de la intensidad relativa de citoqueratina 18 celular 149 2.1.6.3. Correlación entre la expresión de los genes tempranos y tardíos 149 2.2. Caracterización estructural de la AVP: Obtención de las estructura cristalinas de los complejos de AVP-pVIc y AVP-pVIc-ADN ................................. 150 Expresión y purificación de la AVP ......................................................... 150 2.2.1.1. Expresión de la AVP ................................................................................ 150 2.2.1.2. Purificación de la AVP ............................................................................ 150 2.3. Método de difusión por vapor: gota sentada ................................................ 152 3. Composición química de los búffers fabricados empleados en los ensayos para la obtención de los complejos cristalinos AVP-pVIc y AVP-pVIc-ADN ........ 154 3.1. Búffer HPLS1 ............................................................................................................. 154 3.2. Búffer HPLS2 ............................................................................................................. 156 3.3. Búffer PEG INFAC .................................................................................................... 158 4. Espectros de RMN ............................................................................................................ 160 4.1. Compuestos seleccionados 46, 59, 60, 63, 64 y 65 derivados de 4-acil- 1-fenilaminocarbonil-2-fenilpiperazina ....................................................................... 160 4.2. Inhibidores potenciales específicos de la AVP derivados de 4-acil-1- fenilaminocarbonil-2-fenilpiperazina (compuestos 68-72). ................................ 166 IX. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 172 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Especies, tipos y tropismos tisulares de HAdV. Adaptada de T. Lion, 2014. .................................................................................................................................................................. 25 Tabla 2. Porcentaje de inhibición de la actividad de los compuestos 46, 59, 60, 63, 64 y 65 a 50 µM sobre la ADN polimerasa de Φ29 comparados con un control en presencia de DMSO. ......................................................................................................................... 81 Tabla 3. Datos de difracción de rayos-X y estadísticas de refinamiento. ................... 94 Tabla 4. Datos de 1H RMN (500 MHZ, DMSO-d6) para los compuestos 10-26. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en ppm. ........................................................ 102 Tabla 5. Datos de 13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) para los compuestos 10-26. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en ppm. ........................................................ 103 Tabla 6. Datos de 1H RMN (500 MHZ, DMSO-d6) para los compuestos 27-41. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en ppm. ........................................................ 105 Tabla 7. Datos de 13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) para los compuestos 27-41. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en ppm. ........................................................ 106 Tabla 8. Datos de 1H RMN (500 MHZ, DMSO-d6) para los compuestos 47-65. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en ppm. a Espectro adquirido empleando CDCl3 como disolvente. ......................................................................................... 108 Figura 22. Espectros de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 63. ...................... 163 Figura 23. Espectros de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 64. ...................... 164 Figura 24. Espectros de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 65. ...................... 165 Figura 25. Espectros de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 68. ...................... 166 Figura 26. Espectros de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 69. ...................... 167 Figura 27. Espectros de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 70. ...................... 168 Figura 28. Espectros de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 71. ...................... 169 Figura 29. Espectros de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto 72. ...................... 170 ABREVIATURAS 13C-RMN Resonancia magnética nuclear de carbono 13 1H-RMN Resonancia magnética nuclear de protones 293 Las células embrionarias de riñón humano Å Angstrom A549 Células humanas de epitelio alveolar basal ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Ácido ribonucleico ARNm ARN mensajero ASU Unidad asimétrica AVP Proteasa del adenovirus CAR Receptor de coxsackie-adenovirus CC50 Concentración citotóxica 50 CDCl3 Cloroformo deuterado CMX001 Hexadeciloxipropil-cidofovir COSY Espectroscopía de correlación DAPI 4 ',6-diamino-2-fenilindol DBP Proteína de unión a ADN DMSO Dimetilsulfóxido DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado DTT Ditiotreitol EM Espectrometría de masas GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GFP Proteína fluorescente verde HAdV Adenovirus Humano HAdVpol Polimerasa de adenovirus HCMV Citomegalovirus humano HRMS Espectometría de masas de alta resolución HSQC Espectroscopía de correlación heteronuclear simple IC50 Concentración inhibitoria 50 IPTG isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido Kd Constante de disociación MHz Megahercios MOI Multiplicidad de infección MPD 2-Metil-2,4-pentanediol NAC Neumonía adquirida en la comunidad pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa PDB Banco de datos de proteínas PEG Polietilenglicol PML Proteína promielocítica de la leucemia ppm Partes por millón pTP Precursor de la proteína terminal pVIc Péptido de la región C-terminal de la proteína precursora pVI qPCR PCR en tiempo real cuantitativa SAR Relación estructura-actividad SI Índice de selectividad TCID50 Dosis infectiva media en cultivo celular TOS Trasplante de órgano sólido TOS Receptor de trasplante de órgano sólido TPH Trasplante de progenitores hematopoyéticos TPH Receptor de trasplante de progenitor hematopoyético VHC Virus de la hepatitis C VIH Virus de la inmunodeficiencia humana δ Desplazamiento químico φ29 Bacteriófago φ29 I. ABSTRACT I. ABSTRACT 22 In immunocompetent individuals, human adenovirus (HAdV) infections are mostly self-limiting; however, in immunocompromised patients, such as solid-organ transplant (TOS) or hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients, HAdV infections are the cause of high morbidity and mortality; in fact, HAdV has the highest reported increase in incidence of any virus in transplantation recipients in recent years, especially in pediatric units. In addition, with the advances in molecular diagnosis techniques, HAdV has been increasingly found to be involved in sporadic cases and outbreaks of severe community-acquired pneumonia (CAP) in healthy adults. Since there are no currently approved antiviral drugs to specifically treat HAdV infections, here we report the synthesis, biological evaluation, and structure−activity relationships of a new library of small molecules as the first step in the development of a specific drug to treat infections by HAdV. Based on the fact that piperazine derivatives had previously proved their utility as an effective source of antiviral compounds with different mechanisms of action, we synthesize by a short and high yielded methodology, three generations of new 4-acyl-1-phenylaminocarbonyl-2-methylpiperazine and 4-acyl-1- phenylaminocarbonyl-2-phenylpiperazine derivatives, comprising a total of 52 compounds. By using the biological evaluation and structure-activity relationships, we have identified six phenylpiperazine derivatives that significantly inhibited HAdV infection. These six compounds showed the capacity to block HAdV and human cytomegalovirus (HCMV) replication at low micromolar concentration, with little or no cytotoxicity and targeting different phases of their life cycle, providing potential candidates for the development of a new family of antiviral drugs for the treatment of infections by DNA viruses. II. INTRODUCCIÓN II. INTRODUCCIÓN 25 1. Adenovirus 1.1. Clasificación y estructura del HAdV El adenovirus humano (HAdV) es un virus sin envuelta, perteneciente a la familia Adenoviridae y género Mastadenovirus. Este género se divide en más de 60 tipos clasificados en siete subgrupos o especies (de la A a la G) basadas en sus características biológicas, inmunológicas y bioquímicas [1] (tabla 1). Los primeros 51 tipos fueron identificados mediante análisis de serotipo, mientras que las técnicas de secuenciación de genoma completo y análisis bioinformático han permitido la identificación de nuevas especies (HAdV-G) y tipos 52-67. En la tabla 1 se muestran así mismo las preferencias en cuanto a tropismo tisular de las diferentes familias. La especie A está relacionada principalmente con el tracto gastrointestinal [2], mientras que los subgrupos B y C son más comunes en enfermedades del aparato respiratorio [3]. HAdV-D es el mayor causante de conjuntivitis [4,5], y el HAdV-E está asociado a infecciones oculares y respiratorias, aunque en mayor medida produce conjuntivitis [6]. Finalmente, las especies F y G son agentes causantes de gastroenteritis [2,7,8]. En humanos, el HAdV-36 se ha asociado con la obesidad, y existen estudios que sugieren que los HAdV tienen un papel relevante en el desarrollo de la misma [9,10]. Tabla 1. Especies, tipos y tropismos tisulares de HAdV. Adaptada de T. Lion, 2014. Especies Tipos (serotipos/genotipos) Tropismo A 12, 18, 31, 61 Entérico y respiratorio B 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55, 66 Respiratorio, ocular y renal C 1, 2, 5, 6, 57 Respiratorio, ocular, hepático y linfoide D 8–10, 13, 15, 17, 19, 20, 22–30, 32, 33, 36– 39, 42–49, 51, 53, 54, 56, 58-60, 63-67 Ocular y entérico E 4 Respiratorio y ocular F 40, 41 Entérico G 52 Entérico II. INTRODUCCIÓN 32 desinfección en las unidades de transplantes y cuidados intensivos es fundamental para evitar la transmisión del HAdV en pacientes inmunosuprimidos. Debido a la estabilidad que presentan estos virus y su fácil transmisión, se han descrito importantes brotes de infección en hospitales, guarderías, y entre la población militar [53-55]. El período de incubación del virus es relativamente corto, aunque puede ir de 2 días hasta 14 semanas [1]. 2.2. Impacto clínico El HAdV se ha considerado durante muchos años el agente causal de enfermedades que iban desde infecciones respiratorias y oculares agudas a enfermedades gastrointestinales más severas, pero en cualquiera de los casos nunca se le asociaba a sintomatologías clínicas graves [56]. Sin embargo, hoy sabemos que el HAdV es una de las causas más comunes de enfermedades víricas asociadas con el trasplante, presentando además una elevada morbilidad y mortalidad [1,2]. Además, el uso cada vez más generalizado de nuevas técnicas moleculares de diagnóstico han permitido identificar al HAdV como agente causal en numerosos casos aislados y brotes de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) en individuos inmunocompetentes [57-59]. Infecciones en pacientes inmunocompetentes Las infecciones causadas por HAdV en pacientes inmunocompetentes suelen ser autolimitadas, de carácter leve y cursar de manera asintomática, sin embargo, cada vez con más frecuencia se reportan en la literatura científica casos de infecciones respiratorias graves por HAdV , en algunos casos con resultados fatales para el paciente [60,61]. Los brotes epidémicos en individuos inmunocompetentes suelen ocurrir durante los meses de invierno y primavera, mientras que en pacientes inmunocomprometidos ocurren durante todo el año. La mayoría de las infecciones ocurren durante los primeros 5 años de vida, con un pico de incidencia a los 2 años [62,63], debido a la inmadurez de la respuesta inmune de tipo humoral. II. INTRODUCCIÓN 33 La mayoría de infecciones respiratorias están asociadas a especies C de HAdV y en niños suponen un 15% de todas las infecciones que ocurren en el tracto respiratorio superior y el 5% en el inferior [62]. En general, estas infecciones respiratorias no revisten gravedad, sin embargo se dan casos, especialmente en individuos jóvenes donde pueden requerir el ingreso en unidades de cuidados intensivos [64], la utilización de ventilación mecánica asistida [64,65], o de soporte vital extracorpóreo [66]. También se han documentado casos de infecciones por HAdV en adultos inmunocompetentes, especialmente en el personal militar [67]. Actualmente existe una vacuna para el personal militar estadounidense en forma de tabletas que previene las enfermedades respiratorias causadas por los tipos 4 y 7 de HAdV (especies E y B respectivamente) la cual presenta una eficacia del 99,3% [68]. Por otro lado, desde hace una década y gracias al desarrollo de modernas técnicas en biología molecular, se ha detectado un aumento de los casos graves de NAC en adultos sanos causada principalmente por los tipos 3, 7, 11 y 14 de HAdV-B [57]. Los HAdV representan el 3% de las NAC, y más del 60% de los pacientes en los que se produce la enfermedad, necesitan intubación y ventilación mecánica [69]. Las tasas de mortalidad se sitúan en torno al 24% [70], pese a que en algunos casos la administración temprana de cidofovir se ha relacionado con mejorías sintomáticas de la enfermedad [71]. En niños, las infecciones gastrointestinales producidas por los tipos 40 y 41 de HAdV-F, son responsables de entre el 5-15% de las diarreas agudas [72]. Una de las infecciones más contagiosas son las queratoconjuntivitis producidas por los HAdV-D, que pueden resultar en una disminución de la capacidad visual de los pacientes afectados [73]. A pesar de la inmunidad adquirida por la mayoría de adultos frente a múltiples tipos de HAdV, existen evidencias de infecciones latentes en los sistemas linfáticos, gastrointestinal y urinario [74-76]. Estas infecciones permiten la detección de los virus en las heces y orina después de una infección aguda e incluso en casos de infecciones asintomáticas. Un requisito indispensable para el desarrollo de infecciones persistentes por HAdV es evadir al sistema inmune hospedador mediante diversos mecanismos. Entre II. INTRODUCCIÓN 34 estos se incluye la inhibición de la apoptosis en las células infectadas, anular las respuestas al interferón y el factor de necrosis tumoral, la prevención de la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I, y el bloqueo de las respuestas inmunes celular y adaptativa [77-80]. Infecciones en pacientes inmunodeprimidos Las enfermedades más graves producidas por HAdV son sin duda las que afectan a los pacientes inmunodeprimidos, en los cuales la infección representa una seria amenaza para la supervivencia. Las deficiencias en el sistema inmune pueden estar causadas por deficiencias manifestadas desde la infancia (inmunodeficiencias primarias o congénitas) o al empleo de medicación inmunosupresora en el caso de pacientes receptores de trasplantes de progenitores hematopoyéticos (TPH) o de órgano sólido (TOS). En el caso de las inmunodeficiencias congénitas, particularmente en las inmunodeficiencias combinadas severas (SCID) son frecuentes las infecciones pulmonares graves y recurrentes causadas por HAdV, e incluso enfermedades letales diseminadas [81], con tasas de mortalidad de hasta el 55% [2]. Hoy en día, los TPH y TOS han aumentado espectacularmente debido a los avances de las terapias inmunosupresoras, esenciales para la prevención de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en receptores de TPH, así como del rechazo en TOS. Además de las dificultades relacionadas con la funcionalidad o el rechazo del órgano trasplantado, un problema importante después del trasplante es el desarrollo de infecciones virales, entre las cuales HAdV destaca como el virus que ha registrado el mayor incremento en su incidencia, sobre todo en las unidades pediátricas [2]. Diferentes estudios han puesto de manifiesto en los últimos años el creciente impacto de las infecciones por HAdV (principalmente de las familias B y C) en estos pacientes inmunocomprometidos [56,82-84]. En el caso de los TOS la enfermedad está relacionada con el tipo de trasplante. De esta manera pacientes trasplantados de pulmón, hígado, riñón o intestino delgado pueden manifestar neumonía, hepatitis, nefritis, cistitis hemorrágica, enteritis y enfermedad diseminada [85]. II. INTRODUCCIÓN 35 Los pacientes pediátricos receptores de TOS presentan una mayor incidencia y gravedad en las enfermedades producidas por HAdV que en adultos [86]. En trasplantes de hígado pediátricos, la incidencia de la infección varía del 4 al 10%, con tasas de mortalidad de un 53% [2]. Las infecciones en estos pacientes están asociadas a los serotipos 1, 2 y 5 de las especies C de HAdV. Los trasplantes renales presentan un 12% de incidencia y una tasa de mortalidad del 18% [87]. Estas infecciones están asociadas a especies B de HAdV que provocan como síntomas principales cistitis hemorrágica y nefritis [87]. En los trasplantes de corazón y pulmón se detecta al HAdV en el 7 y 50% de los pacientes pediátricos, presentando un cuadro clínico caracterizado por vasculopatía coronaria, bronquiolitis o pérdidas del injerto [88]. La tasa de infección en el caso de trasplante intestinal o multivisceral se encuentra entre el 4 y 57% y en estos pacientes es frecuente encontrar casos de enfermedad diseminada por HAdV [1,89]. Las infecciones por HAdV son frecuentes y están bien caracterizadas en el receptor de TPH. Se manifiestan con un espectro clínico variado incluyendo neumonía, colitis, hepatitis, cistitis hemorrágica, nefritis túbulo-intersticial y encefalitis, pudiendo causar enfermedad diseminada con frecuencia fatal. La enfermedad diseminada por HAdV se observa en 10-20% de los casos, con tasas de mortalidad asociadas superiores al 50% [85]. La infección por HAdV puede ocurrir en cualquier momento después del trasplante, aunque numerosos estudios señalan una mayor incidencia durante los 100 primeros días después del TPH en adultos, mientras que suele ser más precoz (<30 días) en pacientes pediátricos [1,85,90]. En pacientes pediátricos receptores de TPH alogénico se registran tasas de infección del 3-47% y mortalidades superiores al 50% que dependen de diversos factores como la edad, el régimen de condicionamiento, el método diagnóstico y la naturaleza del estudio realizado (prospectivo o retrospectivo) [85,91,92]. Las tasas de infección en adultos suelen ser inferiores, del 3% al 15% [1,92]. Tanto en pacientes adultos como pediátricos receptores de TPH alogénico, un aumento de la carga viral de HAdV en sangre periférica (determinada mediante PCR cuantitativa), y a pesar del tratamiento antiviral, se asocia a tasas de mortalidad cercanas al 100% [93]. II. INTRODUCCIÓN 36 3. Perspectivas en el descubrimiento y desarrollo de antivirales 3.1. Artículo I. Antiadenovirus drug discovery: potential targets and evaluation methodologies II. INTRODUCCIÓN 37 II. INTRODUCCIÓN 38 II. INTRODUCCIÓN 39 II. INTRODUCCIÓN 40 II. INTRODUCCIÓN 41 II. INTRODUCCIÓN 48 Mediante el diseño de compuestos basados en la estructuras cristalinas de estas dianas, ha podido generarse el compuesto líder NSC37249 que se une mediante inhibición competitiva (Ki 0,43 μM) de manera simultánea al sitio activo y la zona de unión a pVIc [120]. Además, gran parte de los diseños de los inhibidores dirigidos a la interacción con el centro activo de la proteasa incorporan centros electrofílicos en una estructura capaz de reconocer el centro activo del enzima para que puedan establecer enlaces covalentes de reversibilidad variable con el residuo de azufre de la cisteína 122 del centro catalítico de la AVP [120,122,123]. En este sentido, el cribado de librerías de compuestos mediante estudios in silico ha permitido identificar el compuesto 2,4,5,7-tetranitro-9-fluorenona que se une irreversiblemente a la AVP, mediante la sustitución de un grupo nitro del inhibidor por el residuo cisteína 122 en centro activo de la enzima, mediante una reacción de sustitución aromática nucleofílica [121]. Aunque la estructura cristalina del complejo AVP-pVIc ha sido resuelta, no ha sido posible obtener aún la estructura cristalizada de AVP-ADN, pVIc- ADN o del trímero AVP-pVIc-ADN [115]. La estructura resuelta de AVP-pVIc ha permitido caracterizar ampliamente el complejo desde el punto de vista estructural, además de conocer las interacciones entre residuos específicos en cada dominio. Sin embargo, para poder comprender el funcionamiento de la AVP a nivel molecular, son necesarias las estructuras de AVP, pVIc, AVP-pVIc, y pVI unidas a ADN, así como los complejos AVP-pVIc en presencia de sustratos con y sin ADN. Así, estos complejos proporcionaran información a nivel estructural de cómo el ADN aumenta la actividad de la AVP, la estructura, mecanismos y aminoácidos implicados en el deslizamiento sobre el ADN, además de ampliar el conocimiento del sitio activo de la AVP. III. JUSTIFICACIÓN III. JUSTIFICACIÓN 51 El HAdV es un patógeno oportunista común raramente relacionado con sintomatología grave en individuos inmunocompetentes. Sin embargo, en pacientes immunocomprometidos como los receptores de trasplantes de órgano sólido o de progenitores hematopoyéticos, y gracias en parte a la implementación de nuevos y más potentes tratamientos inmunosupresores, las infecciones por HAdV han experimentado un aumento en su incidencia, presentando además elevada morbilidad y mortalidad. Además, los avances en las técnicas moleculares de diagnóstico y su cada vez más extendido uso, han permitido identificar a HAdV como un agente causal de casos esporádicos y brotes de NAC en individuos sanos. A pesar de la situación actual, no existe un tratamiento específico aprobado por las Autoridades Sanitarias para el tratamiento de infecciones por HAdV, y no hay un consenso sobre la elección de un medicamento para el tratamiento. Los antivirales de amplio espectro disponibles en la clínica (cidofovir, ribavirina, inmunoglobulinas o ganciclovir) siguen siendo utilizados para tratar las infecciones por HAdV, pero con alta variabilidad con respecto a su eficacia y seguridad. El cidofovir, el fármaco de elección entre los disponibles, es un antiviral de amplio espectro frente a virus de ADN, pero presenta alta nefrotoxicidad asociada y baja biodisponibilidad, además Gilead, la empresa encargada de su producción anunció en 2014 que suspendía su producción por existir mejores opciones para el tratamiento de la retinitis por cytomegalovirus (HCMV), la indicación para la que fue aprobado inicialmente. Ante estas circunstancias, la síntesis química de pequeños compuestos con actividad antiviral potente, seleccionadas de librerías químicas grandes y diversas, ha ganado cada vez más atención. El desarrollo de protocolos para la rápida obtención de resultados en ensayos celulares e in vitro de una gran cantidad de nuevas moléculas, permite el descubrimiento y optimización de nuevos antivirales. En este contexto, se han identificado diferentes librerías de compuestos derivados de la piperazina que han demostrado ser una fuente efectiva para la generación de compuestos antivirales con diversos mecanismos de acción. Estudios realizados por nuestro grupo demuestran que III. JUSTIFICACIÓN 52 diferentes librerías de derivados de 2-piperazinona presentan actividad antiviral frente a HAdV a muy bajas concentraciones micromolares y una baja o nula citoxicidad asociada. El mecanismo principal de acción de los compuestos más activos pertenecientes a estas librerías tiene como diana de acción el proceso de replicación del ADN del HAdV. La optimización de estos compuestos podrían servir para generar una molécula líder para el desarrollo de un antiviral específico para el tratamiento de infecciones por HAdV. Además, este compuesto supondrían una herramienta de gran valor para dilucidar los complejos eventos involucrados en el proceso de replicación del ADN de HAdV, lo cual a su vez podría ser de utilidad para mejorar el uso que se hace del HAdV como vector terapéutico. IV. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS IV. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 55 1. Las hipótesis de este estudio son: 1.1. La actividad anti-HAdV mostrada por compuestos derivados de 2- piperazinona podría optimizarse mediante la generación de variaciones estructurales en torno a un núcleo central de piperazina. 1.2. El diseño y la síntesis de nuevos agentes antivirales derivados de la piperazina y dirigidos específicamente frente a la proteasa del HAdV, suponen una alternativa terapéutica de gran interés dada la implicación de esta proteína en pasos fundamentales del ciclo replicativo del virus. 2. Objetivos 2.1. Objetivo general El objetivo general del presente proyecto se centra en el diseño, síntesis, evaluación y optimización de nuevos compuestos con una estructura central de piperazina con elevada potencia anti-HAdV y una baja o nula citotoxicidad. 2.2. Objetivos específicos: a) Síntesis, caracterización estructural y evaluación biológica de una quimioteca de derivados de piperazina con potencial actividad anti-HAdV. b) Establecer las relaciones estructura-actividad de los nuevos compuestos sintetizados. c) Caracterización del mecanismo de acción de los compuestos activos obtenidos como un primer paso en el desarrollo de un nuevo y específico antiviral frente al HAdV. IV. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 56 d) Determinación del complejo ternario que conforma la proteasa activa del HAdV para comprender su regulación enzimática a nivel atómico. e) Síntesis, caracterización estructural y evaluación de nuevos inhibidores capaces de interaccionar e inhibir a la proteasa de HAdV. V. RESULTADOS 64 V. RESULTADOS 65 V. RESULTADOS 66 V. RESULTADOS 67 V. RESULTADOS 68 V. RESULTADOS 69 V. RESULTADOS 70 V. RESULTADOS 71 V. RESULTADOS 72 V. RESULTADOS 73 V. RESULTADOS 80 1.2. Resultados adicionales Ensayo de inhibición de la polimerasa de phi29 (φ29) mediante PCR cuantitativa La actividad de amplio espectro mostrada por los compuestos 46, 59, 60, 63, 64 y 65, sugiere un posible mecanismo de acción sobre una diana proteica específica que podría ser celular o viral. Para estudiar una posible diana viral, analizamos si la presencia de los compuestos afectaba a la actividad in vitro de la DNA polimerasa del bacteriófago φ29, una ADN polimerasa con una elevada homología respecto de las de HAdV y HCMV que de hecho pertenecen a la misma familia de ADN polimerasas. Para llevar a cabo este ensayo se procedió a la purificación de ADN viral procedente de un lisado de HAdV5-wt con el QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación se realizó la amplificación de las muestras de ADN viral previamente purificado (10 ng) en presencia de los compuestos a una concentración de 50 µM o la misma cantidad de DMSO por triplicado y de acuerdo con el protocolo del kit illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification (GE Healthcare Life Sciences). De esta manera, si los compuestos ejercen un efecto inhibidor sobre la actividad de la polimerasa de φ29, se observaría una disminución en la cantidad de productos amplificados por la misma, que podríamos cuantificar posteriormente. Para poder cuantificar los productos amplificados, se realizó una PCR a tiempo real cuantitativa, y se diseñaron cebadores TaqMan y sondas para una región del hexón de HAdV5-wt con el GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design software (GenScript). Las secuencias de los oligonucleótidos fueron AQ1: 5'-GCC ACG GTG GGG TTT CTA AAC TT -3 '; AQ2: 5'-GCC CCA GTG GTC TTA CAT GCA CAT -3 '; y AP: 6-FAM-5'-TGC ACC AGA CCC GGG CTC AGG TAC TCC GA-3'-TAMRA. La mezcla de reactivos para PCR a tiempo real cuantitativa consistía en 2 μL del ADN purificado, los cebadores AQ1 y AQ2 a una concentración de 200 nM cada uno, y la sonda AP a una concentración de 10 μM en un volumen total de 12,5 μL más 12,5 μL de KAPA V. RESULTADOS 81 PROBE FAST qPCR Master Mix (KAPA Biosystems). El protocolo para esta PCR fue de 95ºC durante 3 min seguido de 40 ciclos a 95ºC durante 10s y 60ºC durante 30 segundos. Todos los ensayos se realizaron en un termociclador C1000 ThermalCycler (BioRad). Los resultados representan la media ± SD de las muestras por triplicado de tres experimentos independientes. Después de analizar cada una de las muestras por triplicado, la presencia de los compuestos 59, 64 y 65 a una concentración de 50 μM inhibieron de manera significativa la actividad in vitro de la ADN polimerasa de φ29 en más de un 50% (tabla 2). Sin embargo, los compuestos 46, 60 y 63 no mostraron una inhibición significativa de la actividad de la polimerasa de φ29 cuando se compararon con el control tratado con el mismo volumen de DMSO. Concretamente, la presencia del compuesto 46 no provocó efecto inhibitorio alguno sobre la actividad de la polimerasa, mientras que los compuestos 60 y 63 la inhibieron menos de un 10%. Compuesto % Inhibición actividad Φ29 Polimerasa 46 0 59 77,52±0,39 60 2,77±0,31 63 8,61±1,99 64 64±1,54 65 82,96±0,36 Tabla 2. Porcentaje de inhibición de la actividad de los compuestos 46, 59, 60, 63, 64 y 65 a 50 µM sobre la ADN polimerasa de Φ29 comparados con un control en presencia de DMSO. V. RESULTADOS 82 2. Desarrollo de inhibidores de la AVP de la proteasa de adenovirus (AVP) 2.1. Síntesis y evaluación de nuevos inhibidores específicos de la AVP: inmunofluorescencia indirecta. El objetivo de este estudio fue diseñar, sintetizar y evaluar pequeñas moléculas con actividad anti-HAdV dirigidas específicamente a la AVP. Se ha demostrado que en la fase tardía de la infección de HAdV, la AVP escinde a la citoqueratina 18, lo que conduce a la destrucción de la red de citoqueratina y en última instancia, a la lisis de la célula hospedadora y consecuente liberación de la progenie viral. El fenómeno de degradación de la citoqueratina 18 puede observarse mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta en la célula huésped infectadas por HAdV. A las 24 horas postinfección, la destrucción parcial de la red de citoqueratina da lugar a estructuras con forma esférica dispersas por todo el citoplasma, mientras que a las 36 horas la destrucción es completa (Figura 5). Figura 5. Análisis de inmunofluorescencia con marcaje específico de anticuerpos contra la citoqueratina 18 en células HeLa sanas (a), e infectadas con HAdV a las 24 (b) y 36 horas postinfección (c). Adaptado de Chen P. et al., 1993. Mediante un ensayo de inmunofluorescencia indirecta y marcaje específico con un anticuerpo anti-citoqueratina 18 nos propusimos evaluar el potencial efecto inhibidor de dos librerías de compuestos de la actividad de la AVP en células HeLa infectadas por HAdV. V. RESULTADOS 83 Para medir el efecto inhibitorio sobre la AVP de los compuestos se pretendía desarrollar un método cuantitativo basado en la cuantificación del punteado característico que se observa a consecuencia de la destrucción de la red de citoqueratina por la AVP a partir de las 24 postinfección. En primer lugar, para poder establecer este método cuantitativo automatizado, se infectaron células HeLa con HAdV, se marcaron con anticuerpos específicos anticitoqueratina 18 y las células se fijaron y procesaron a distintos tiempos (0h, 24, 30, 32, 34 y 36 horas) con objeto de seleccionar la hora postinfección donde mejor se observase el fenómeno mediante inmunofluorescencia indirecta. Al analizar los resultados de este ensayo, cabía esperar que todas las células infectadas presentasen a partir de las 24 horas postinfección las estructuras globulares dispersas por la degradación de la citoqueratina, pero solo estaban presentes en algunas células a los distintos tiempos. Por tanto, no pudo establecerse un método cuantitativo a partir de la observación de estas estructuras. Sin embargo, la intensidad de la tinción de citoqueratina 18 disminuye a medida que progresa la infección en las células, y por consiguiente estos niveles de intensidad podrían ser analizados y cuantificados mediante inmunofluorescencia indirecta. A la vista de estos resultados, y descartado el método de cuantificación a partir de los patrones de degradación de la citoqueratina, se decidieron estudiar los efectos sobre la degradación de la red de citoqueratina causada por la AVP, mediante inmunofluorescencia indirecta, dirigiendo anticuerpos contra la citoqueratina 18 celular, y estudiando los cambios producidos en la intensidad de la fluorescencia de estos anticuerpos en presencia de librerías de compuestos anti-HAdV. Además se usaron otros anticuerpos para la detección de la intensidad de proteínas virales de expresión temprana (E4orf3) y tardía (proteínas de la cápsida de HAdV5 de HAdV, para caracterizar en mayor profundidad los mecanismos de inhibición de los distintos compuestos y relacionarlos con una posible inhibición de la AVP. La figura 6 muestra un ejemplo del marcaje con los anticuerpos contra los genes tempranos (E4orf3), V. RESULTADOS 84 tardíos (proteínas tardías) y la citoqueratina 18 celular para la detección de inmunofluorescencia en células infectadas y sanas. Es importante destacar la disminución que se observa en la intensidad de la tinción de citoqueratina 18 celular (verde) en las células infectadas respecto a las no infectadas a causa de la destrucción de red de citoqueratina por la infección de HAdV. Figura 6. Ejemplo de marcaje en células HeLa sanas (a) e infectadas con dl309 (b) tratadas con DMSO con anticuerpos dirigidos contra citoqueratina 18 celular (verde), y E4orf3 (rojo) y proteínas tardías (verde) de HAdV. Los núcleos se definieron con la tinción DAPI (azul). Conviene destacar, que estos experimentos consisten en aproximaciones experimentales para evaluar de manera indirecta los potenciales mecanismos de acción de los compuestos derivados de piperazina a través de los cuales podrían inhibir la actividad de la AVP. En el apartado 2.1. de la sección Anexo se detallan los compuestos estudiados y los materiales y métodos empleados en este ensayo. V. RESULTADOS 85 Resultados 2.1.1.1. Análisis del impacto de los compuestos evaluados en la expresión de los genes tempranos (E4orf3) y tardíos (proteínas estructurales) de HAdV El principal objetivo de ese experimento fue estudiar si la presencia de los compuestos con actividad anti-HAdV generaba modificaciones en la expresión de los genes virales tempranos y tardíos de células infectadas por dl309 tras 28 horas de infección. Para el estudio de los genes de la región temprana de HAdV se seleccionaron anticuerpos dirigidos contra la proteína E4orf3, involucrada en procesos fundamentales para el desarrollo de la infección como el procesamiento y transporte del ARN viral desde el núcleo, la detención de la síntesis de proteínas celulares o la neutralización de la respuesta celular a daños producidos en el ADN durante la infección. Para la detección de proteínas de expresión tardía de HAdV se dirigieron anticuerpos contra proteínas estructurales de la cápsida de HAdV5, incluyendo el hexón, las fibras y pentonas. La figura 7 muestra los cambios en la intensidad media de los valores de la fluorescencia de E4orf3 para las muestras tratadas con los distintos compuestos a una concentración de 50 μM respecto a las tratadas con el mismo volumen de DMSO. V. RESULTADOS 86 Figura 7. Diagrama de cajas y bigotes mostrando el porcentaje respecto a las muestras tratadas con DMSO de la intensidad media de fluorescencia de la proteína de expresión temprana E4orf3 en células HeLa infectadas con dl309 y tratadas con 50μM de cada uno de los compuestos. Las cajas muestran los valores de la mediana de la intensidad de fluorescencia (línea sólida horizontal), los percentiles 25 y 50 (línea externa) y las observaciones máximas y mínimas (bigotes). '**' p < 0,01, '*' p < 0,05 '.' p < 0,1 vs. DMSO. Ninguno de los compuestos estudiados en este ensayo reduce de manera significativa (>50%) la intensidad media de la expresión los genes tempranos del virus. Sólo los compuestos 68 y 72 generaron una reducción significativa del 35% en la intensidad de E4orf3. Por tanto, en términos generales, ninguno de estos compuestos parece ejercer su efecto anti-HAdV, al menos de manera significativa mediante una inhibición en la expresión de estas proteínas de la región temprana de HAdV. En este mismo ensayo se emplearon anticuerpos dirigidos contra las proteínas estructurales que conforman la cápsida de HAdV para analizar los V. RESULTADOS 87 niveles de expresión de proteínas tardías en presencia de los compuestos (Figura 8). Cinco de los compuestos evaluados (32, 54, 60, 68 y 72) mostraron disminuciones significativas de la fluorescencia de las proteínas tardías que iban del 77% al 81%. Figura 8. Diagrama de cajas y bigotes mostrando el porcentaje respecto a las muestras tratadas con DMSO de la intensidad media de fluorescencia de las proteínas virales de expresión tardía (proteínas de la cápsida) en células HeLa infectadas con dl309 y tratadas con 50μM de cada uno de los compuestos. Las cajas muestran los valores de la mediana de la intensidad de fluorescencia (línea sólida horizontal), los percentiles 25 y 50 (línea externa) y las observaciones máximas y mínimas (bigotes). '**' p < 0,01, '.' p < 0,1 vs. DMSO. Para determinar si alguno de los compuestos reducía de manera selectiva la expresión de proteínas virales tardías comparada con la de las proteínas tempranas, se realizó un análisis de correlación entre los niveles de expresión de E4orf3 y las proteínas de la cápsida (coeficiente de correlación de Spearman). La figura 9 muestra los valores logarítmicos de la intensidad media V. RESULTADOS 88 de fluorescencia para cada caso en presencia de los compuestos o la misma cantidad de DMSO. Este ensayo muestra que los compuestos DMSO, 34, 35, 36, 46, 49, 57, 58, 59, 64, 68, 69, 71 y 72 presentan una correlación estadística significativa entre los niveles de expresión de los genes tempranos y tardíos, y por tanto este resultado sugiere que no modifican selectivamente la expresión de las genes virales tardíos. Figura 9. Análisis de correlación de Spearman entre los niveles de expresión de E4orf3 y las proteínas tardías de la cápsida de HAdV. Se muestran los valores logarítmicos de la intensidad media de fluorescencia para las proteínas tempranas y tardías en presencia de los compuestos o la misma cantidad de DMSO. Los límites del eje x se modificaron para dar cabida a todo el rango de expresión E4ORF3 (valores del eje x). Los límites del eje y se fijaron para permitir la comparación directa de la expresión génica tardía (valores del eje y) entre los paneles. Se V. RESULTADOS 89 empleó una línea curva continua para el test de correlación. “ns” indica ausencia de correlación entre ambas variables. Los compuestos 13, 32, 54, 60, 63, 65, y 70 no mantienen esta correlación. Los compuestos 32, 54 y 60 ya habían mostrado una reducción significativa de la expresión de genes tardíos, por tanto esto podría justificar su selectividad al inhibir la expresión de las proteínas de la cápsida de HAdV. Como se observa en la misma figura, la reducción en la intensidad de la fluorescencia específica de genes tardíos causada por el compuesto 65 es más moderada. Pese a mostrar una falta de correlación entre los parámetros estudiados, los compuestos 13 y 70 presentan unos niveles elevados en la intensidad del marcaje de las proteínas tardías de HAdV. Este resultado sugiere dos posibilidades: i) La primera sería que estos dos compuestos incrementaran la expresión de los genes tardíos; ii) y la segunda sería que aceleraran la fase de inactivación de la expresión génica temprana sin afectar la expresión génica tardía. 2.1.1.2. Análisis de la intensidad de la citoqueratina celular En la fase tardía de la infección, la citoqueratina 18 es degradada por la acción de la AVP, para la que presenta dos secuencias de corte específicas, lo que conduce a la destrucción de la red de citoqueratina celular. El objetivo de este experimento fue estudiar si existía un efecto protector que redujese la degradación en la red de citoqueratina celular causada por la AVP en células infectadas y tratadas con los diferentes compuestos. Para este ensayo se analizó el efecto de los compuestos derivados de fenilpiperazina que ya habían mostrado una mayor actividad anti-HAdV (46, 59, 60, 63, 64 y 65) y aquellos diseñados específicamente para interaccionar con la AVP e inhibir su actividad (68, 69, 70, 71 y 72). Para obtener esta información se representó el ratio de la intensidad relativa de la citoqueratina 18 de las células infectadas respecto a las no infectadas y tratadas con cada uno de los compuestos (Figura 10). La banda azul muestra la reducción causada en la intensidad relativa de V. RESULTADOS 96 Para obtener las estructuras formadas por AVP-pVIc-ADN, el proceso consistió en añadir de manera independiente los dúplex de ADN de distintos tamaños a los complejos de AVP-pVIc formados durante las previas 24h y dejar incubar durante 2 horas a 4ºC. Para los ensayos de cristalización, se empleó el método de difusión por vapor en placas de 24 pocillos y el equipo robotizado Crystal Griphon con los mismos buffers usados previamente en los ensayos de cristalización de AVP-pVIc. Desafortunadamente, ninguna de las condiciones empleadas permitió la obtención de la estructura cristalina del trímero, pero se obtuvieron formaciones conocidas como “clusters” y “agujas” que indican que una optimización de las condiciones del ensayo podrían mejorar el crecimiento de los cristales. La presencia de dúplex de ADN de 12 pb y el empleo del buffer que contenía 0,1 M de citrato sódico pH 6,4, 1,7 M de acetato sódico, 1 mM de DTT y 10 mg/ml del complejo AVP-pVIc, igualmente usado para obtener cristales del complejo AVP-pVIc a 4ºC de temperatura, fueron los factores determinantes que permitieron observar estas estructuras (Figura 13). Figura 13. Obtención de “agujas” de los complejos AVP-pVIc-ADN tras 24h de incubación a 4ºC en presencia de nucleótidos de 12 pb y el búffer en un medio que contenía 0,1 M de citrato sódico pH 6,4, 1,7 M de acetato sódico, 1 mM de DTT y 10 mg/ml del complejo AVP-pVIc. V. RESULTADOS 97 En un intento de obtener información de las estructuras denominadas “agujas”, éstas se estudiaron empleando de un generador-detector de rayos-X. La naturaleza de estas formaciones no permitió la obtención de información que revelara datos concernientes a la estructura de los mismos, lo que indica que las condiciones particulares empleadas en este método de difusión por vapor deben optimizarse. Generalmente en estas circunstancias una ligera reducción en la cantidad de proteína y/o precipitante son determinantes para que se desbloquee la fase de nucleación en la que está detenido el experimento, además de mantener una baja temperatura en todo el proceso (4ºC). VI. DISCUSIÓN VI. DISCUSIÓN 100 Durante las últimas 2 décadas, los HAdV se han convertido en un importante patógeno en individuos inmunocomprometidos y especialmente en el entorno de los trasplantes. Aunque los síntomas más comunes de infecciones por HAdV en pacientes sanos están relacionados con infecciones como faringitis, otitis media, bronquiolitis, gastroenteritis y queratoconjuntivitis severa, entre el 50% y 80% de los pacientes pediátricos receptores de TPH desarrollan serias complicaciones como cistitis y enteritis hemorrágicas, y en ciertos casos encefalitis, neumonitis, hepatitis, nefritis o insuficiencia multiorgánica con resultado de muerte [2,83]. Actualmente, aunque son varios los compuestos que han demostrado eficacia in vitro frente a los HAdV, no existe una terapia antiviral específica aprobada por las autoridades sanitarias para su tratamiento. Se están realizando ensayos clínicos con compuestos prometedores, como el caso del brincidofivir (hexadeciloxipropil-cidofovir, conocido como CMX001), pero aún deben conocerse los resultados del ensayo clínico para la evaluación de su eficacia y seguridad en el tratamiento de infecciones por HAdV que actualmente se encuentra en la fase III (ClinicalTrials.gov; identificador: NCT02087306). El cidofovir, con una efectividad razonable frente a las infecciones por HAdV, tiene un uso limitado solo para casos graves dado el alto riesgo de nefrotoxicidad asociada [130]. Además, desde 2014 Gilead, la empresa encargada de su producción y comercialización, anunció el cese en su comercialización por existir mejores alternativas para el tratamiento de la retinitis por HCMV, la indicación para la que fue aprobada. De manera ocasional también se han empleado ribavirina y ganciclovir pero los datos clínicos disponibles sobre la eficacia de estas fármacos son insuficientes. Por tanto, debido al impacto clínico de las infecciones por HAdV, resulta necesaria la búsqueda de nuevos compuestos seguros y eficaces para combatir las infecciones producidas por este virus. En el trabajo desarrollado en esta tesis se ha comprobado que la síntesis de una nueva generación de compuestos derivados de 2-fenilpiperazina presenta una inhibición significativa y de amplio espectro de la replicación del ADN de HAdV y HCMV. Además según los resultados biológicos obtenidos, VI. DISCUSIÓN 101 dos de estos compuestos suponen un punto de partida en el desarrollo de compuestos que inhiben específicamente la AVP. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral serán discutidos en detalle a continuación. 1. Caracterización estructural de los compuestos: espectroscopía de resonancia magnética nuclear La caracterización estructural de las nuevas sustancias obtenidas se ha realizado por sus espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas (EM) (tanto de baja como de alta resolución) fundamentalmente en base a la aplicación de diversas experiencias de RMN (DEPT, COSY, HSQC), que permiten asignar las señales que aparecen en sus espectros de 1H-RMN y 13C-RMN. 1.1. Primera generación de compuestos En las Tablas 4 y 5 se presentan los datos de las señales más características de 1H-RMN y 13C-RMN de los compuestos 10-26. En los espectros de 1H-RMN de los compuestos 10-26 además de las señales de los protones aromáticos (en el rango de 7-8 ppm) presentes en todos los compuestos, destacamos la del protón de la función urea, la del metino del anillo de piperazina, la de los tres protones del grupo metoxilo, la del grupo terc-butilo, y la del metilo del anillo de piperazina. La tabla 4 recoge los datos de desplazamiento químico para estas señales (). VI. DISCUSIÓN 102 Tabla 4. Datos de 1H RMN (500 MHZ, DMSO-d6) para los compuestos 10-26. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en ppm. En todos los compuestos la señal del metino del anillo común de piperazina, se encuentra en torno a 4,0-4,5 ppm, salvo en los compuestos 12, 17 y 22 (tioureas) en los que aparece a campo ligeramente más bajo, en torno a 5 ppm. En los compuestos con una función urea en el nitrógeno 1 de la piperazina se aprecia el protón del NH en torno a 9,0-8,5 ppm. La presencia del grupo metoxilo en el anillo aromático se confirma con el singulete a 3,8-3,7 ppm, que integra para tres protones (compuestos 11, 14, 16, 19, 21, 24 y 26). En todos los compuestos aparece la señal del metilo en posición 2 del anillo de piperazina en torno a 1,14 ppm. Compuesto NH (urea) CH (anillo piperazina) OCH3 C(CH3)3 CH3 (anillo piperazina) 10 - 3,95-3,88 - 1,44 1,18 11 - 4,35-4,28 3,82 1,43 1,15 12 9,42 5,14-5,05 - 1,44 1,21 13 8,15-8,12 4,43-4.35 - 1,45 1,25 14 8,01 4,35-4,29 3,73 1,45 1,11 15 - 4,38-4,13 - 1,24 1,17 16 - 4,41-4,31 3,82 1,24 1,14 17 9,77 5,15-5,05 - 1,25 1,10 18 8,80 4,47-4,38 - 1,26 1,14 19 8,11 4,40-4,32 3,73 1,26 1,10 20 - 4,40-4,22 - - 1,20 21 - 4,35-4,28 3,82 - 1.15 22 7,95-7,92 5,16 - - 1,25 23 8,20 4,47-4,44 - - 1,17 24 8,20 4,38 3,73 - 1,13 25 9,23 4,47 - - 1,16 26 8,39 4,4-4,3 3,70 - 1,13 VI. DISCUSIÓN 103 En los espectros de 13C-RMN de los compuestos 10-26 son características las señales de los dos grupos carbonilo presentes en estos compuestos, sobre el nitrógeno 1 (urea/tiourea o amida) y el nitrógeno 4 (amida), la del carbono cuaternario del grupo terc-butilo así como los metilo de dicho grupo, la del grupo metoxilo sobre el anillo aromático y la del metilo en el anillo de piperazina. La tabla 5 recoge los datos de desplazamiento químico para estas señales (). Tabla 5. Datos de 13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) para los compuestos 10-26. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en ppm. Compuesto C=O (N1) C=O (N4) C(CH3)3 OCH3 CH (anillo piperazina) C(CH3)3 CH3 (anillo piperazina) 10 168,3 151,4 79,8 - 47,9 28,6 15,7 11 160,8 155,1 79,8 55,9 48,2 28,5 15,6 12 181,3 154,5 79,6 - 51,8 27,9 14,7 13 155,3 154,3 79,7 - 47,3 28,6 15,6 14 156,0 155,5 79,5 55,8 46,9 28,6 15,4 15 177,1 168,1 51,1 - 48,8 28,7 15,8 16 177,1 168,3 51,5 55,8 48,4 27,4 15,9 17 182,3 154,5 52,5 - 48,2 28,6 15,6 18 176,9 154,4 51,3 - 48,2 28,6 15,7 19 177,7 155,7 51,1 55,9 48,4 28,7 15,6 20 171,2 156,8 - - 47,9 - 15,9 21 171,2 155,1 - 55,9 47,8 - 15,6 22 182,7 155,3 - - 52,4 - 15,6 23 166,0 154,5 - - 47,9 - 15,6 24 170,8 155,8 - 55,9 47,1 - 15,5 25 159,5 154,1 - - 46,9 - 15,4 26 155,9 155,3 - 55,7 47,2 15,4 VI. DISCUSIÓN 104 En la Tabla 5 se observa que todos los compuestos presentan en torno a 155 ppm la señal atribuida al carbonilo amídico en el nitrógeno 4 de la piperazina. La señal que aparece a mayor desplazamiento químico (160-170 ppm) se atribuye al carbonilo en el nitrógeno 1, que está en algunos compuestos como una amida y en otros como urea, de ahí el rango de ppm. Los compuestos con grupo terc-butoxilo en 4 (10-14) presentan a 80 ppm la señal correspondiente al carbono cuaternario, mientras que en los compuestos con un grupo pivaloil en 4 (15-19) la señal de ese carbono cuaternario aparece en torno a 51 ppm. En todos estos compuestos la señal atribuida a los metilo de dichos grupos terc-butilo se observa a 28 ppm. Ninguna de estas señales se aprecia en los compuestos 20-26, benzoil o benzofurano-2-carbonil derivados. A 56 ppm se aprecia la señal del grupo metoxilo en el anillo aromático. Señales presentes en todos los compuestos son la del metino del anillo de piperazina (en torno a 48 ppm) y la del metilo en posición 2 de dicho anillo, sobre 15 ppm. 1.2. Segunda generación de compuestos En las Tablas 6 y 7 se presentan los datos de las señales más características de 1H-RMN y 13C-RMN de los compuestos 27-41. En los espectros de 1H-RMN de los compuestos 27-41 además de las señales de los protones aromáticos (en el rango de 7-8 ppm) presentes en todos los compuestos, destacamos la del protón de la función urea, la del grupo metino del anillo de piperazina, la del grupo terc-butilo, y la del metilo del anillo de piperazina. La tabla 6 recoge los datos de desplazamiento químico para estas señales (). VI. DISCUSIÓN 105 Tabla 6. Datos de 1H RMN (500 MHZ, DMSO-d6) para los compuestos 27-41. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en ppm. En todos los compuestos se aprecia la señal del protón de la función urea en el nitrógeno 1 sobre 8-9 ppm y la señal del grupo metino del anillo común de piperazina se encuentra en torno a 4,4 ppm. Los compuestos 27-31, terc-butoxi derivados presentan la señal de los tres metilos del grupo terc-butilo como un singulete a 1,4 ppm que integra para nueve protones. El compuesto 40, el único con un grupo metoxilo en el anillo aromático, presenta a 3,79 ppm un singulete que integra para tres protones. En los espectros de 13C-RMN de los compuestos 27-41 son características las señales de los dos grupos carbonilo presentes en estos compuestos, la del carbono cuaternario del grupo terc-butilo, la del metino de la Compuesto NH (urea) CH (anillo piperazina) C(CH3)3 CH3 (anillo piperazina) 27 8,60 4,29 1,40 1,09 28 8,86 4,30 1,40 1,08 29 9,29 4,29 1,44 1,08 30 8,41 4,33 1,44 1,15 31 8,91 4,36 1,44 1,11 32 8,65 4,43 - 1,14 33 8,91 4,45 - 1,15 34 9,02 4,42 - 1,12 35 8,59 4,42 - 1,14 36 9,37 4,40 - 1,19 37 8,38 4,40 - 1,19 38 8,25 4,40 - 1.19 39 8,40 4,38 - 1,15 40 8,15 4,38 - 1,15 41 8,54 4,44 - 1,14 VI. DISCUSIÓN 112 2. Inhibición de la infección de HAdV por los derivados de 4-Acil-1- fenilaminocarbonil-2-fenilpiperazina En el campo de la química médica, los derivados de piperazina han demostrado ser compuestos que presentan importantes propiedades antivirales [94,101,131-133]. Estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación pusieron de manifiesto que el compuesto 2, derivado de una librería 2-piperazinona, presentaba una importante actividad anti-HAdV y toxicidad reducida, cuyo mecanismo de acción estaba dirigido a la inhibición de la replicación del ADN viral [108]. A partir de esta molécula precursora se inició un proceso de optimización mediante modificaciones estructurales para obtener tres nuevas generaciones de compuestos derivados de 4-acil-1- fenilaminocarbonil-2-metilpiperazina y 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2- fenilpiperazina. Atendiendo a la estructura del compuesto 2, los ensayos de relación estructura-actividad confirmaron que su alta actividad antiviral estaba relacionada con la presencia de un anillo central de 2-piperazinona conjuntamente con un radical de 2-benzofuranilo acilando al nitrógeno 4 y un grupo etilo en posición 6 del anillo de 2-piperazinona. En este contexto, de los seis compuestos derivados de piperazina identificados en esta tesis como los que presentan mayor actividad anti-HAdV, cinco poseen el radical 2- benzofuranilo acilando el nitrógeno 4 de la piperazina. En concordancia con estudios previos, la presencia de este grupo aumenta la actividad antiviral de diversos compuestos de manera considerable y sin afectar a la toxicidad [94,131]. Sin embargo, aunque la presencia de un grupo etilo en los derivados de 2-piperazinona había demostrado presentar mayor actividad frente a HAdV que sustituyentes 2-feniletilo, ningún derivado con grupos metilo o fenilo se habían ensayado previamente [108]. 2.1. Primera generación Para la síntesis de la primera generación de compuestos se empleó el precursor 2-metilpiperazina. Se escogió como esqueleto central común a nuestros análogos la 2-metilpiperazina porque se trata de un residuo presente VI. DISCUSIÓN 113 en nuevos compuestos que actualmente se están evaluando frente a otros tipos de virus como puede ser el caso del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) [134] o de fiebres hemorrágicas tropicales [135], por poseer en la posición contigua al nitrógeno un grupo metilo (el compuesto líder 2 posee un grupo etilo) y por tratarse de un producto comercial y asequible. Los resultados obtenidos en esta generación mostraron que los cuatro compuestos más activos (12, 13, 22 y 25) son los que poseen un grupo urea o tiourea unidos al nitrógeno 1 con un grupo electrón-atrayente (NO2), y el grupo acilo unido al otro nitrógeno es un uretano o 2-benzofuranilo. La incorporación del grupo carbonilo al nitrógeno 1 en esta primera generación se realiza mediante funciones amida y urea / tiourea, con objeto de evaluar qué función orgánica resultaba crítica para la actividad biológica, observándose que los compuestos más activos poseían una función urea o tiourea. De los compuestos más activos, los productos 12 y 22 tuvieron que descartarse como modelo para la síntesis de la segunda generación de compuestos dada la citotoxicidad asociada al grupo tiourea. Varios estudios reflejan también la citotoxicidad que producen diversos compuestos orgánicos con funciones tioureas sobre diferentes líneas celulares derivadas de tumores humanos [136-139]. Sin embargo, la preparación y evaluación de estos productos se fundamentó en que varios productos derivados de tioureas han demostrado ser potentes inhibidores de la familia de los herpervirus, virus de doble cadena de ADN al igual que HAdV [140-142]. 2.2. Segunda generación Basado en la información obtenida de la librería de la primera generación de inhibidores derivados de metilpiperazina, se concluyó que para la actividad de los compuestos la presencia de un grupo uretano o 2-benzofuranilo en el nitrógeno 1 eran preferibles, así como una función urea portando un anillo de fenilo con grupos electrón-atrayentes. Por tanto en la segunda generación de compuestos se estudiaría el efecto en la actividad de distintos sustituyentes electrón-atrayentes en el anillo de fenilo de la función urea así como su posición manteniendo el grupo terc-butoxilo o 2-benzofuranilo acilando el nitrógeno 1. Los compuestos más activos de esta generación mostraron VI. DISCUSIÓN 114 porcentajes de inhibición de la formación de placas de HAdV5 entre el 91 y 100% con distintos grupos electrón-atrayentes. En un intento por generar terc-butoxicarbonil derivados que aumentaran la actividad del compuesto 13 (primera generación) se ensayaron distintas posiciones y grupos electrón-atrayentes sobre el anillo fenilo. Desgraciadamente, ninguno de los sustituyentes Cl, CF3 o NO2 (posición orto-) mejoraron su actividad antiviral. Por otro lado, los compuestos 30 y 31 mostraron una potente actividad antiviral, a la que sin embargo iba también asociada una elevada citotoxicidad. Es importante mencionar que ambos poseen un anillo de fenilo disustituido (Cl y CF3). En este sentido, algunos trabajos muestran como la disustitución del grupo fenilo de la región C-terminal del compuesto está relacionado con una ausencia total de actividad anti-HAdV y elevada citotoxicidad frente a diferentes tipos celulares [143,144]. Los ensayos sobre los compuestos derivados de 2-benzofuranilo demostraron que la presencia de sustituyentes sobre el anillo de fenilo es fundamental para que los compuestos presenten actividad antiviral (el compuesto 41 con el anillo de fenilo sin sustituir no es activo). Además, de entre los grupos electrón-atrayentes ensayados, la presencia de un grupo F en posición paramostró el mejor resultado de actividad antiviral con reducida citotoxicidad (compuesto 35). El compuesto 36 se sintetizó en un intento de obtener un análogo al 25 (primera generación) mediante el cambio en el patrón de sustitución del anillo de fenilo, de posición para (compuesto 25) a orto- en el compuesto 36, obteniéndose un compuesto con similar actividad y con CC50 aumentada (de 51,1 a 202,6 µM). Para otros grupos electrón atrayentes (F, Br) localizados en posición ortono se detectó actividad anti-HAdV significativa (compuestos 37 y 38). 2.3. Tercera generación Para sintetizar los compuestos de la tercera generación de inhibidores se preservaron las características estructurales de los compuestos más activos de VI. DISCUSIÓN 115 la segunda generación (grupo terc-butoxilo o 2-benzofuranilo acilando al nitrógeno 4 y un anillo de fenilo con grupos electrón atrayentes unido a una función urea sobre el nitrógeno 1) y se procedió a modificar el último punto de variabilidad estructural en nuestro esqueleto general, el sustituyente en posición 2 del anillo de piperazina. De esta forma se sintetizaron los compuestos de la tercera generación, con un fenilo en posición 2 del anillo empleando 2-fenilpiperazina como producto de partida. En general, los compuestos obtenidos tras esta tercera ronda de optimización presentaron una alta actividad antiviral, ya que tan sólo 2 de los 20 que constituyen la familia dieron un porcentaje de inhibición < 70%. Entre los derivados de terc-butoxilo (compuestos 46-55) sólo el compuesto 46 (grupo NO2 en para-) mostró alta actividad (96%) en ausencia de citotoxicidad (CC50 161 M); mientras que los grupos Cl, CF3, F, y CN en esa posición no aumentaron significativamente la actividad (compuestos 47-50), siendo algunos citotóxicos (Cl y CF3). Cuando el grupo 2-benzofuranil está presente, los valores de actividad de los compuestos con el anillo de fenilo parasustituido fueron, en general, mayores que los análogos terc-butoxil derivados. En este sentido, cabe destacar la síntesis del NO2 derivado como un nuevo compuesto activo (59) y con mayor actividad antiviral (del 96 al 100% de inhibición) que el compuesto 46. Además, los Cl y CN derivados (60 y 63), presentaron una alta actividad antiviral y una notable disminución de la citotoxicidad respecto a los análogos derivados de terc-butoxilo (47 y 50). Los derivados CF3 y F (61 y 62) aumentaron la actividad anti-HAdV de los productos 48 y 49 (análogos tercbutoxi derivados), sin embargo todavía muestran una citotoxicidad significativa por lo que no fueron seleccionados. El orto-NO2 derivado (64) resultó muy activo y no citotóxico, mejorando este último aspecto respecto al compuesto 51 (terc-butoxi derivado) que presentaba ligera citotoxicidad: Además el 2- benzofuranil derivado disustituido 65 fue preparado como análogo del 52 presentando también alta actividad inhibitoria pero en este caso, baja citotoxicidad. VI. DISCUSIÓN 116 El conjunto de resultados expuestos hasta el momento indican que para los derivados de 2-fenilpiperazina, la presencia de un grupo 2-benzofuranilo aumenta la actividad antiviral, y en algunos sustituyentes (NO2, Cl y CN en posición para-, NO2 en posición orto-, y Cl y CF3 en el anillo de fenilo disustituido) aumenta la CC50, produciendo compuestos más activos y menos citotóxicos. En base a lo anteriormente expuesto se seleccionaron para la caracterización en detalle de su mecanismo de acción las 2-fenilpiperazinas 46, 59, 60, 63, 64 y 65 por ser las más activas en función de su actividad antiviral en ensayo en placa y su baja citotoxicidad. 3. Impacto en la entrada de HAdV El proceso de entrada de los HAdV al interior celular requiere atravesar la membrana plasmática mediante su inclusión en endosomas, la liberación de la partícula viral al citoplasma celular seguida de su transporte por medio del sistema microtubular hasta la envuelta nuclear, y en última instancia liberar el ADN viral al núcleo celular a través del complejo del poro nuclear [40]. Algunos investigadores han demostrado que el desarrollo de inhibidores derivados de piperazina pueden bloquear el proceso de entrada de virus en la célula hospedadora. En el caso del VIH se observa que actúan como antagonistas de los correceptores CCR5 celulares, e impiden la entrada del virus a la célula [145,146]. En otros casos como en el de los arenavirus la actividad antiviral de estos compuestos se asocia al bloqueo del proceso de fusión de membranas, necesario durante la entrada al hospedador [135]. Por tanto, ya que el acceso del HAdV a la célula consiste en una sucesión de eventos altamente coordinados, mediante los ensayos realizados en este proyecto pudimos analizar si algunos de los compuestos estudiados interferían en alguno de estos procesos, lo que se detectaría como una disminución de la expresión de GFP asociada a HAdV5 en el núcleo celular. VI. DISCUSIÓN 117 Los resultados del ensayo de entrada obtenidos en este trabajo indican que el tratamiento con las 2-fenilpiperazinas inhibe la expresión del transgen de HAdV5-GFP de manera significativa a diferentes niveles dependiendo del compuesto, pero esta determinación no nos proporciona información acerca de su posible mecanismo de acción. De igual manera, la molécula precursora 2 inhibía la expresión del transgen GFP, pero diversos experimentos demostraron que no interfería en los procesos de unión a los receptores celulares, internalización de la partícula viral o la disrupción del endosoma [108]. Los porcentajes de inhibición de los ensayos de entrada de las tres generaciones obtenidas en este trabajo varían notablemente según las características particulares de cada compuesto, y pese a que informan sobre la capacidad de los compuestos de inhibir la infección a una elevada multiplicidad de infección, los ensayos de cuantificación de formación de placas de infección de HAdV proporcionaron mayor información sobre el impacto de la actividad anti-HAdV de los compuestos, ya que a diferencia del ensayo de entrada, en estos experimentos, los HAdV pueden completar su ciclo infectivo y generar nuevas partículas víricas durante siete días. Después del escape endosomal mediado por la proteína VI, las cápsidas de HAdV parcialmente desensambladas son transportadas a la membrana nuclear mediante la red microtubular [147]. En ese momento, el genoma del HAdV se importa al núcleo junto a la proteína VII, a través del complejo del poro nuclear [148]. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que ninguna de las 6 fenilpiperazinas inhibía el proceso de entrada del virus hasta la liberación del ADN viral al núcleo de la célula, ya que tras una infección sincronizada, el ADN de HAdV en todas las condiciones ensayadas se acumulaba en el núcleo de la célula hospedadora al mismo nivel que los controles no tratados. Por consiguiente, nuestros resultados indican que estamos midiendo de manera específica el ADN de HAdV que ha alcanzado el núcleo y que los compuestos no alteran ninguna de las etapas previas que conducen a su acceso al núcleo celular. Sin embargo, como ocurría con el compuesto 2 no podemos excluir la posibilidad de que los compuestos VI. DISCUSIÓN 118 restrinjan la llegada del genoma del virus a la localización nuclear adecuada o que de alguna manera interfieran la cromatización del mismo [36], paso fundamental para iniciar los procesos posteriores implicados en la replicación viral. 4. Impacto en la replicación de HAdV Existen diversos antivirales como maribavir entre otros, que interfieren en distintas etapas del ciclo replicativo en virus de ADN [149-152]. En el caso de HAdV, a través del cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas se ha identificado el compuesto A3, cuya acción interrumpe la biosíntesis de pirimidina, necesaria para generar el uracilo que resulta esencial para la replicación viral [153]. En el presente trabajo se observó que los compuestos 46, 59, 60, 63 y 64 inhibían claramente la replicación del ADN de HAdV5 y no afectaban a la transcripción del gen temprano E1A de HAdV5 a las 6 horas postinfección. Previamente a la replicación del ADN de HAdV, ocurre la transcripción del gen E1A mediante la RNA polimerasa II celular en el promotor E1A [154]. La proteína E1A promueve su propia transcripción, necesaria para la expresión de los genes tempranos E1B, E2, E3 y E4 en diferentes promotores para que ocurra la replicación del ADN de HAdV. La disminución significativa en la producción de nuevas partículas virales (reducción de la progenie viral) en presencia de los 6 derivados de 2- fenilpiperazina refuerzan los resultados obtenidos sobre efecto inhibitorio que causan los compuestos en la replicación del HAdV. Además, el efecto antiviral de estos derivados no parece ser específico de la especie C de HAdV (HAdV 5), ya que presentaban unos valores de inhibición en ensayo en placa similares a los obtenidos en la infección causada por las especies B de HAdV (HAdV 16) e incluso superiores en el caso de otra especie de virus ADN diferente como es el HCMV. VI. DISCUSIÓN 119 5. Impacto en la replicación de HCMV Dado que otros compuestos como los análogos de nucleótidos y nucleósidos (ej. Cidofovir) han demostrado tener una amplia actividad contra múltiples virus de doble cadena de ADN incluyendo HCMV y HAdV, mediante la inhibición de las ADN polimerasas [2], analizamos la posibilidad de que los compuestos bloquearan la replicación del ADN de HCMV. Los resultaros evidenciaron una potente inhibición de la replicación de HCMV en presencia de los 6 derivados de fenilpiperazina, lo que sugiere que poseen un mecanismo de acción de amplio espectro que puede tener como diana una proteína específica que podría ser viral o celular. El compuesto 65 parece no afectar a la replicación del ADN de HAdV5 ni la transcripción de ARNm, pero ha mostrado una importante inhibición de la replicación de HCMV; por tanto su mecanismo de acción frente al HAdV debería estar implicado en etapas posteriores del ciclo replicativo, como la síntesis de proteínas estructurales, ensamblaje del virión o liberación de nuevas partículas virales. 6. Evaluación de la inhibición de los compuestos derivados de 2- fenilpiperazina sobre la polimerasa de phi29 (φ29) Para estudiar una posible diana viral del mecanismo de amplio espectro manifestado por los compuestos, estudiamos si la presencia de los mismos afectaba la actividad in vitro de la ADN polimerasa del fago φ29, una ADN polimerasa que presenta una alta homología comparada con las de HAdV y HCMV [155]. Estas tres polimerasas pertenecen a la familia B de polimerasas de ADN, que emplean la proteína pTP como iniciador de la replicación [156]. En este trabajo, la presencia de los compuestos 59, 64 y 65 disminuyó la actividad in vitro de la ADN polimerasa de φ29. Dado que los compuestos 59 y 64 ejercían una marcada inhibición de la replicación de HAdV su mecanismo de acción parece estar involucrado en la inhibición directa de la actividad de la polimerasas de HAdV y HCMV, dada la alta homología estructural y funcional VI. DISCUSIÓN 120 con la de φ29. Estos resultados contrastan con los obtenidos para los compuestos 46, 60 y 63 ya que aunque impiden la replicación de HAdV y HCMV, no bloquearon significativamente la actividad de la polimerasa de φ29. Por consiguiente, estos compuestos podrían interaccionar con otras proteínas virales esenciales relacionadas con el proceso de replicación, tales como la pTP o la DBP [35]. Sorprendentemente, el compuesto 65, que ha demostrado inhibir únicamente la replicación de ADN de HCMV, afecta a la actividad de la ADN polimerasa de φ29. Las ADN polimerasas de HCMV, HAdV y φ29 comparten homología de secuencias de aminoácidos conservados en diversas regiones, entre las que se encuentra el centro catalítico de la enzima, aunque la organización estructural de estos residuos varía considerablemente de unas ADN polimerasas a otras [157,158]. Esta variación en la disposición de los aminoácidos en el sitio activo de la enzima, y la presencia de dos sustituyentes sobre el grupo fenilo del compuesto 65 podría suponer una unión específica del mismo a las ADN polimerasas de HCMV y φ29, y no así a la del HAdV. Por otra parte, Ying B. et al., demostraron en un estudio con la ADN polimerasa purificada del HAdV5 (HAdVpol), que parte del efecto anti-HAdV del ganciclovir residía en inhibir la incorporación de aminoácidos en la fase de elongación de la HAdVpol, y por tanto su actividad [159]. Este ensayo podría servir para caracterizar en mayor profundidad los resultados obtenidos en esta tesis mediante un estudio directo del efecto inhibidor de los compuestos de 2- fenilpiperazina sobre la HAdVpol. 7. Evaluación de nuevos inhibidores específicos de la proteasa del HAdV (AVP): síntesis y determinación estructural La AVP es una proteasa de cisteína de 23 kDa que se activa dentro del virión en formación [115,129], de tal manera que puede procesar múltiples copias de las proteínas precursoras empleadas en el ensamblaje del virus [24]. Sólo entonces las partículas víricas son infecciosas. Por tanto, se trata de una VI. DISCUSIÓN 121 proteína esencial y necesaria para la formación de virus maduros y que representa una importante diana terapéutica, puesto que no posee proteínas homólogas en humanos [160]. En este trabajo nos propusimos el diseño de inhibidores selectivos de la AVP ya que pueden suponer un tratamiento efectivo contra las infecciones causadas por HAdV. Gran parte del diseño de este tipo de inhibidores se ha centrado en considerar la necesidad de que posean un centro electrofílico que pueda formar enlaces covalentes con el centro activo de la proteasa [122,123]. Además, este centro electrofílico debería estar contenido en un esqueleto capaz de reconocer el centro activo del enzima. El diseño de los compuestos de este trabajo con potencial actividad contra la AVP se centró en tres características principales: i) La primera es que varios investigadores han demostrado que diversos compuestos derivados de piperazina pueden inhibir selectivamente la actividad de proteasas de cisteína de diversos patógenos e incluso revertir la enfermedad que causan [161-163]. Por ello decidimos emplear como material de partida el esqueleto central de 2- fenilpiperazina, dada la potencia antiviral que ha demostrado frente a HAdV; ii) En segundo lugar es importante tener en cuenta que la presencia de grupos electrofílicos en estos compuestos pueden favorecer la interacción con el centro activo de la enzima, generalmente mediante enlaces covalentes de reversibilidad variable con el residuo de azufre de la cisteína 122 del centro catalítico de la AVP [120]. Los compuestos generados en este trabajo poseen dos tipos de centros electrofílicos buscando favorecer esas interacciones, principalmente en forma de grupo cetona, ya que se ha demostrado su importancia en la estructura de inhibidores irreversibles de las proteasas de cisteína [164-166]; iii) Por último, se generó diversidad química en la estructura de los compuestos mediante la incorporación de diferentes grupos funcionales en los nitrógenos 1 y 4 de la 2-fenilpiperazina. Entre estos se incluían otros grupos con centros electrofílicos además del grupo cetona, como grupos acilo ,-insaturados para intentar incrementar las interacciones del centro catalítico de la proteasa y también grupos isocianatos con sustituyentes del tipo electrónatrayentes que habían demostrado una elevada potencia anti-HAdV. VII. CONCLUSIONS VII. CONCLUSIONS 129 1) For 2-phenylpiperazine derivatives the presence of a benzofuran-2- carbonyl group contributes to increase the antiviral activity. 2) All compounds possessing a di-substituted phenyl ring showed high cytotoxicity, except for 2-phenylpiperazine derivatives having a benzofuran-2-carbonyl group. 3) For 4-acyl-1-phenylaminocarbonyl-2-phenylpiperazine derivatives the substitution of phenyl ring with electron-withdrawing NO2, Cl and CN at the paraposition, NO2 at the ortoposition, and both Cl and CF3 increases the antiviral activity and the CC50, leading to more potent and safer compounds. 4) For benzofuran-2-carbonyl derivatives, the presence of substituents on the phenyl ring is needed for antiviral activity. 5) 2-Phenylpiperazines 46, 59, 60, 63, and 64 have proven to be significant and broad-spectrum inhibitors of DNA replication both in HAdV (families C and B) and HCMV. 6) 2-phenylpiperazine 65 has demonstrated significant broad antiviral activity against HAdV and HCMV, but its inhibitory activity must take place later after DNA replication. 7) 2-Phenylpiperazines 46, 59, 60, 63, 64 and 65 showed overall reductions in the viral progeny for HAdV5 and HAdV16 respect to the reductions obtained with molecule 2, which justify the work carried out to optimize the anti-HAdV activity of this compound 2. 8) Based on the inhibition of HAdV and HCMV DNA replication and the φ29 polymerase based assay, compounds 59 and 64 block HAdV replication targeting the HAdV DNA polymerase. VII. CONCLUSIONS 130 9) The crystal structure of AVP-pVIc complex was determined at high resolution (2,1 Å) providing a good structure foundation for future drug discovery developments. 10) The obtained structures in the AVP-pVIc-DNA crystallization complex assays, with a 12-mer DNA strand, suggests that there could be DNA in the crystals and that this particular length of DNA is important for crystal packing and formation. 11) 2-Phenylpiperazines 70 and 71 show brighter cytokeratin staining in the infected cells than in the non-infected cell and they have no effect on early or late gene expression, representing clear candidates to specifically target the AVP. VIII. ANEXO VIII. ANEXO 133 1. Relación de productos sintetizados 1.1. Derivados de 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2-metilpiperazina: primera generación (10-26) Nº NOMBRE QUÍMICO ESTRUCTURA 10 4-terc-Butoxicarbonil-2-metil-1-(4- nitrobenzoil)piperazina 11 4-terc-Butoxicarbonil-2-metil-1-(4- metoxibenzoil)piperazina 12 4-terc-Butoxicarbonil-2-metil-1- [(4- nitrofenil)aminotiocarbonil]piperaz ina 13 4-terc-Butoxicarbonil-2-metil-1- [(4- nitrofenil)aminocarbonil]piperazin a 14 4-terc-Butoxicarbonil-2-metil-1- [(4-metoxifenil)aminocarbonil]- piperazina 15 2-Metil-1-(4-nitrobenzoil)-4- pivaloilpiperazina 16 2-Metil-1-(4-Metoxibenzoil)-4- pivaloilpiperazina 17 2-Metil-1-[(4- nitrofenil)aminotiocarbonil]-4- pivaloilpiperazina 18 2-Metil-1-[(4- nitrofenil)aminocarbonil]-4- pivaloilpiperazina VIII. ANEXO 134 Nº NOMBRE QUÍMICO ESTRUCTURA 19 2-Metil-1-[(4- Metoxifenil)aminocarbonil]-4- pivaloilpiperazina 20 4-Benzoil-2-metil-1-(4- nitrobenzoil)piperazina 21 4-Benzoil-2-metil-1-(4- metoxibenzoil)piperazina 22 4-Benzoil-2-metil-1-[(4- nitrofenil)aminotiocarbonil]piperaz ina 23 4-Benzoil-2-metil-1-[(4- nitrofenil)aminocarbonil]piperazin a 24 4-Benzoil-1-[(4- metoxifenil)aminocarbonil]-2- metilpiperazina 25 4-(Benzofurano-2-carbonil)-2- metil-1-[(4- nitrofenil)aminocarbonil]piperazin a 26 4-(Benzofurano-2-carbonil)-1-[(4- metoxifenil)aminocarbonil]-2- metilpiperazina Tabla 12. Primera generación derivados de 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2-metilpiperazina (compuestos 10-26). VIII. ANEXO 135 1.2. Derivados de 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2-metilpiperazina: segunda generación (27-41) Nº NOMBRE QUÍMICO ESTRUCTURA 27 4-terc-Butoxicarbonil-1-[(4- clorofenil)aminocarbonil]-2- metilpiperazina 28 4-terc-Butoxicarbonil-2-metil-1- [(4- trifluorometilfenil)aminocarbonil]pi perazina 29 4-terc-Butoxicarbonil-2-metil-1- [(2- nitrofenil)aminocarbonil]piperazin a 30 4-terc-Butoxicarbonil-1-[(2-cloro- 5-trifluormetilfenil)aminocarbonil]- 2-metilpiperazina 31 4-terc-Butoxicarbonil-1-[(4-cloro- 3-trifluormetilfenil)aminocarbonil]- 2-metilpiperazina 32 4-(Benzofurano-2-carbonil)-1-[(4- clorofenil)aminocarbonil]-2- metilpiperazina 33 4-(Benzofurano-2-carbonil)-2- metil-1-[(4- trifluormetilfenil)aminocarbonil]pip erazina 34 4-(Benzofurano-2-carbonil)-1-[(4- cianofenil)aminocarbonil]-2- metilpiperazina 35 4-(Benzofurano-2-carbonil)-1-[(4- fluorfenil)aminocarbonil]-2- metilpiperazina VIII. ANEXO 136 Nº NOMBRE QUÍMICO ESTRUCTURA 36 4-(Benzofurano-2-carbonil)-2- metil-1-[(2- nitrofenil)aminocarbonil]piperazin a 37 4-(Benzofurano-2-carbonil)-1-[(2- fluorfenil)aminocarbonil]-2- metilpiperazina 38 4-(Benzofurano-2-carbonil)-1-[(2- bromofenil)aminocarbonil]-2- metilpiperazina 39 4-(Benzofurano-2-carbonil)-1- [(2,4-difluorfenil)aminocarbonil]-2- metilpiperazina 40 4-(Benzofurano-2-carbonil)-2- metil-1-[(2- metoxifenil)aminocarbonil] piperazina 41 4-(Benzofurano-2-carbonil)-1- (fenilaminocarbonil)-2- metilpiperazina Tabla 13. Segunda generación derivados de 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2-metilpiperazina (compuestos 27-41). VIII. ANEXO 137 1.3. Derivados de 4-acil-1-fenilaminocarbonil-2-fenilpiperazina: tercera generación (46-65) Nº NOMBRE QUÍMICO ESTRUCTURA 46 4-terc-Butoxicarbonil-2-fenil-1-[(4- nitrofenil)aminocarbonil] piperazina 47 4-terc-Butoxicarbonil-2-fenil-1-[(4- clorofenil)aminocarbonil] piperazina 48 4-terc-Butoxicarbonil-2-fenil-1-[(4- trifluormetilfenil) aminocarbonil]piperazina 49 4-terc-Butoxicarbonil-2-fenil-1-[(4- fluorofenil)aminocarbonil] piperazina 50 4-terc-Butoxicarbonil-1-[(4- cianofenil)aminocarbonil]-2- fenilpiperazina 51 4-terc-Butoxicarbonil-2-fenil-1-[(2- nitrofenil)aminocarbonil] piperazina 52 4-terc-Butoxicarbonil-1-[(2-cloro- 5-trifluormetilfenil)aminocarbonil]- 2-fenilpiperazina 53 4-terc-Butoxicarbonil-1-[(4-cloro- 3-trifluormetilfenil) aminocarbonil]-2-fenilpiperazina 54 4-terc-Butoxicarbonil-2-fenil-1-[(4- metoxifenil)aminocarbonil]- piperazina 55 4-terc-Butoxicarbonil-2-fenil-1-[(4- metilfenil)aminocarbonil]- piperazina 56 2-Fenil-1-[(4- Nitrofenil)aminocarbonil]-4- pivaloilpiperazina VIII. ANEXO 144 4-(2-(1H-indol-3-il)-2-oxoacetil)-N-(2-cloro-5-(trifluorometil)fenil)-2 fenilpiperazina-1-carboxamida (71) El producto se obtuvo como un sólido y se purificó por cromatografía en columna usando hexano-acetato de etilo (1:1) como eluyente. (117 mg, 60% rendimeinto). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)  12,26, 12,17 (2d, J = 2,13 Hz, 1H), 8,62 (s, 1H), 8,30-7,10 (m, 13H), 5,68 (sa, 1H), 5,07-4,96 (m , 1H), 4,24- 3,81 (m, 2H), 3,73-3,40 (m, 2H); 3,11-3,01 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)  185,6, 185,3, 166,7, 166,2, 154,7, 154,5, 145,1, 138,5, 138,1, 137,5, 137,3, 136,8, 136,4, 130,5, 130,4, 128,7, 128,3, 127,4, 127,3, 126,7, 126,3, 124,9, 124,7, 123,6, 123,5, 122,6, 122,5, 120,9, 120,8, 113,0, 112,6, 112,5, 54,8, 53,7, 47,9, 44,9, 42,5, 41,2, 36,2, 28,2, 24,2. HRMS (m/z): calcd. para C28H22ClF3N4O3Na 577,1225 M+Na+; encontrado 577,1206. 2.1.1.3. Procedimiento general 6. Síntesis del disulfonamida derivado 72 A una disolución del compuesto 66 (0,35 mmol) en diclorometano seco (10 ml) a 0 ºC, se le añade el correspondiente reactivo (0,68 mmol) y piridina (0.7 mmol). La reacción se deja estar durante 24 horas (hasta que la cromatografía en capa fina indica que todo el producto de partida ha reaccionado). La mezcla de reacción se procesa evaporando a sequedad. El producto se purifica por cromatografía en columna. (E)-4-cinamil-3-fenil-1-(piperidin-1-ilsulfonil)piperazina (72) El producto se obtuvo como un sólido y se purificó por cromatografía en columna usando diclorometano-metanol (20:1) como eluyente. (100 mg, 65% rendimiento). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)  7,75-7,04 (m, 12H), 5,00 (sa, 1H), 4,89-4,55 (m , 1H), 4,24-4,11 (m, 1H), 4,00-3,92 (m, 3H); 3,21-3,01 (m, 5H), 1,64-1,39 (m, 5H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)  164,9, 141,9, 141,7, 138,6, 135,0, 130,5, 129,6, 128,7, 128,3, 128,0, 127,2, 126,9, 117,8, 57,3, VIII. ANEXO 145 56,7, 48,2, 46,5, 44,4, 43,5, 41,7, 25,0, 23,1. HRMS (m/z): calcd. para C24H29N3O3SNa 462,1822 M+Na+; encontrado 462,1813. Figura 15. Síntesis de los nuevos derivados de 2-fenilpiperazina 68-72. Células y virus La línea celular HeLa se obtuvo del American Type Culture Collection (ATCC). Las células se mantuvieron en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies/Thermo Fisher), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Omega Scientific), 10 mM de HEPES (Sigma-Aldrich), 4 mM de L-glutamina (Lonza), 100 unidades/ml de penicilina (Lonza), 100 µg/ml de estreptomicina (Lonza), y 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (Sigma- Aldrich). Para los ensayos de inmunofluorescencia se empleó la cepa fenotípicamente salvaje dl309 de HAdV5 obtenido del ATCC. El virus contiene 66, 67 i: monoamida 1 eq, isocianato o isotiocianato 1.2 eq, diclorometano N N Ph O Ph 68, R1 = H, R2 = COCH3, R3 = H 69, R1 = Cl, R2 = H, R3 = CF3 NH OR2 R1 R3 i 70, R1 = H, R2 = COCH3, R3 = H 71, R1 = Cl, R2 = H, R3 = CF3 NNH Ph O Ph 66 iN N Ph O Ph S O O N i: monoamida 1 eq,haluro de sulfonilo 1.5 eq, piridina 1.5, diclorometano 72 Productos finales N N Ph O O HN NH OR2 R1 R3 VIII. ANEXO 146 varias deleciones y una sustitución en la región E3B, pero presenta las características salvajes en las células en cultivo [182]. Anticuerpos Se empleó un cóctel de tres anticuerpos primarios. El primero fue un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra el péptido de citoqueratina 18 celular (clon KS-B17,2, Sigma-Aldrich) usado a una dilución 1:200. Los otros dos anticuerpos eran específicos de adenovirus, y eran el anticuerpo monoclonal 6A11 de rata dirigido contra la proteína de expresión temprana E4Orf3 [183] de HAdV5 procedente del sobrenadante de un cultivo de hybridoma y usado a una dilución 1:250, y un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra suero de HAdV5 [184] (teniendo como dianas las proteínas de la cápsida de HAdV5, incluyendo el hexón, las fibras y pentonas) usado a una dilución at 1:2000. La mezcla de anticuerpos secundarios empleados fueron anti-ratón, anti-rata y anti-conejo del tipo IgG conjugados a fluorocromos Alexa Fluor 488 (AF488), Alexa Fluor 546 (AF546) y Alexa Fluor 647 (AF647) de Invitrogen usados a 2 μg/ml. Técnica de inmunofluorescencia indirecta Para este ensayo se sembraron 1x105 células HeLa en placas de 24 pocillos y se infectaron con la cepa dl309 (25 pv/célula). A las 5 horas tras el inicio de la infección se añadieron los distintos inhibidores a las células infectadas a una concentración de 50 μM o el mismo volumen de DMSO por triplicado. Pasadas 28 horas tras la infección de procedió a la fijación de las células infectadas e inmunomarcaje con los anticuerpos anti-citoqueratina 18, anti-E4orf3 y suero anti-HAdV5 como se detalla a continuación. En primer lugar las células se lavaron dos veces con buffer fosfato salino (PBS), se fijaron con paraformaldehido al 4% durante 30 minutos, y permeabilizaron durante 5 minutos con 0,2% de Triton X-100 en PBS a VIII. ANEXO 147 temperatura ambiente. A continuación se realizaron 3 lavados con Buffer Trissalino con albúmina de suero bovino (BSA), glicina, y Tween 20 (TBS-BGT: 0,137 M NaCl, 0,003 M KCl, 0,025 M Tris-Cl [pH 8,0], 0,0015 M MgCl2, 0,5% BSA, 0,1% glicina, 0,05% Tween 20, 0,02% azida sódica). Posteriormente las células se incubaron con el cóctel de los tres anticuerpos primarios diluidos en TBS-BGT suplementado con el 5% de suero normal de cabra (Invitrogen). Las muestras se incubaron con un volumen de 100 l/pocillo y un tiempo de 90 min para los anticuerpos primarios, y de 30 minutos para los anticuerpos secundarios y con 3 lavados con TBS-BGT entre ambos. Finalmente, las muestras fueron montadas con 100 l/pocillo de ProLong Gold mounting medium (Invitrogen) que contenía 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para el marcaje del núcleo celular. Microscopía Las microfotografías se obtuvieron mediante epifluorescencia estándar en un microscopio invertido Nikon TE300. Todos las microfotografías se captaron con un objetivo de inmersión en aceite a una magnificación de 60x. Las imágenes se adquirieron en el equipo Nikon TE300 con una cámara digital Retiga de 12 bits (QImaging). Los núcleos fueron identificados y segmentados para delimitar los bordes celulares. La Figura 16 muestra un ejemplo del algoritmo empleado para la segmentación del núcleo y citoplasma para el ensayo de fluorescencia cuantitativa en células HeLa sanas e infectadas con dl309. VIII. ANEXO 148 Las intensidades de fluorescencia media para cada fluoróforo y en cada muestra se guardaron y analizaron con el software EBImage bajo el control del programa R (versión 3.2.2). Se mantuvieron unos valores fijos de exposición para evitar que ésta fuera insuficiente o una sobreexposición de las muestras. Se asignó un color (rojo, verde o azul) apropiado a cada fluoróforo. Todas las figuras se montaron con el editor open-source vector graphics Inkscape (version 0.48) y el editor raster graphics GIMP (version 2.8.4.). Se fotografiaron entre 3 y 12 campos de células en cada pocillo. Cada campo fotográfico tenía entre 5 y 30 células con una mediana de 12 células. La expresión de los genes se midió como el Log10 de la fluorescencia total en cada célula. Para comparar la expresión de los genes respecto a las células tratadas con DMSO, los valores de la intensidad media de fluorescencia se calcularon como el Log10 para cada célula y tipo de tratamiento en un único campo fotográfico. Para comparar los niveles relativos de los niveles de expresión de los genes tempranos y tardíos, la intensidad de fluorescencia se analizó a nivel de células individuales. (a) (b) Figura 16. Ejemplo del algoritmo empleado para la segmentación del núcleo y citoplasma para el ensayo de fluorescencia quantitativa en células HeLa sanas (a) e infectadas con dl309 (b). Los núcleos se definieron con la tinción DAPI (azul, bordes marcados en amarillo). Los bordes citoplasmáticos se definieron por la la tinción de citoqueratina 18 en (a), y por la combinación de citoqueratina 18 y proteínas tardías del virus en (b) (verde, bordes marcados en magenta). VIII. ANEXO 149 Análisis estadístico 2.1.6.1. Expresión génica de genes tempranos y tardíos Para determinar si los valores trasformados en logarítmicos eran normales, se aplicó el test de Shapiro Wilk a la intensidad de la fluorescencia media para cada tipo de tratamiento. Después, para comparar la varianza entre grupos para los niveles de expresión de genes tempranos y tardíos, se empleó el test de Games-Howell. Para todas las comparaciones se empleó una prueba estadística bilateral donde valores de la p menores de 0,05 se consideraron significativos. Las diferencias significativas se muestran en las figuras con los siguientes símbolos: '***' p < 0,001, '**' p < 0,01, '*' p < 0,05 '.' p < 0,1. 2.1.6.2. Estudio de la intensidad relativa de citoqueratina 18 celular Se empleó el test de la t de Student para determinar si la intensidad de citoqueratina 18 era menor en las células infectadas comparadas con las no infectadas en presencia de cada compuesto. A los valores de la p obtenidos se les aplicó el método de corrección de Bonferroni. Los valores de la p>0,05 indicados con “*” muestran aquellos compuestos que previenen la reducción en la intensidad de citoqueratina 18 a consecuencia de la infección de HAdV. 2.1.6.3. Correlación entre la expresión de los genes tempranos y tardíos La correlación entre la expresión de ambos genes se determinó mediante el método de Spearman a través de la función test de correlación del paquete psych del programa R. El valor de la p está asociado a los test cuya correlación es cero. Este valor se ajustó con el método de Holms para comparaciones múltiples. Los valores no se consideraron correlacionados cuando la p>0,05. VIII. ANEXO 150 2.2. Caracterización estructural de la AVP: Obtención de las estructura cristalinas de los complejos de AVP-pVIc y AVP-pVIc-ADN Expresión y purificación de la AVP 2.2.1.1. Expresión de la AVP El gen de la proteinasa de adenovirus, el gen para la proteína AVP de 23-KDa, se clonó en el vector de expresión pT7AD23k8 y se introdujo en la cepa de E. coli BL21 (DE3) bajo el control del sistema de expresión T7. Se empleó un stock de glicerol para dejar crecer durante toda la noche un cultivo en medio TB (1% Bacto-Triptona y 0,5% NaCl) suplementado con 50 mg/ml de amplicilina, y se empleó con una dilución 1:200 para sembrar 4 litros de medio M9-TBY (0,1% de NH4Cl, 0,3% de KH2PO4, 0,6% de Na2HPO2, 0,4% de glucosa, 1 mM MgSO4, 0,1% de levadura, 1% Bacto-Triptona, y 0,5% de NaCl) suplementado con 50 mg/ml de ampicilina. Los cultivos crecieron en agitación a 30ºC hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600) se encontró entre 0,5 y 0,6. En ese momento, los cultivos fueron inducidos mediante la adición de 0,1 mM de IPTG, y se dejaron crecer durante 8-16 horas. Se comprobó mediante electroforesis SDS-PAGE que a las 8 horas, la mayor parte de las proteínas celulares correspondían a la AVP. Entonces, se recogieron las células mediante centrifugación a 5000g durante 10 minutos y se conservaron los pellets celulares a -20ªC. 2.2.1.2. Purificación de la AVP El siguiente paso consistió en la purificación de la AVP, y para ello debían lisarse las células que habían expresado el péptido, y a continuación emplear distintas columnas cromatográficas para obtener una purificación de la proteína de alto rendimiento y homogénea. Partiendo de un pellet proveniente de 3 litros de bacterias celulares, éste se resuspendió en 150 ml (0,05 del volumen) de 50mM Tris (pH 8,0), 0.05% VIII. ANEXO 151 (v/v) de Triton X-100, 15 mM de NaCl, y 5 mM de β-mercaptoetanol. Las células se lisaron mediante incubación durante 45 minutos a 4ºC con lisozima blanca de huevo a una concentración de 100 mg/ml seguido de tres ciclos de congelación/ descongelación. Se digirió el ADN mediante la adición de 50 mg/ml de DNasa y 5 mM de MgCl2, seguido de una incubación de 45 minutos a 4ºC. La suspensión resultante se sometió a 3 ciclos de 30 segundos de sonicación. Esta fracción se denominó lisado. El lisado se clarificó mediante centrifugación a 10000 x g durante 10 minutos. Esta fracción llamada sobrenadante se cargó en una columna TSKDEAE de 2,5 x 25 cm equilibrada en 50mM de Tris (pH 8,0), 15 mM de NaCl, y 5 mM de β-mercaptoetanol. Posteriormente se lavó la columna con 300 ml del buffer de equilibrio. Se identificaron mediante SDS-PAGE las fracciones que contenían AVP y se recolectaron y nombraron como DEAE FT. La fracción de DEAE FT se sub-fraccionó en una columna de flujo rápido de S-Sefarosa equilibrada en 50 mM de Tris (pH 8,0), 15 mM de NaCl, y 1 mM de DTT. Después de cargar la columna, ésta se lavó con 200 ml de 50 mM de Tris (pH 8,0), 15 mM de NaCl, y 1 mM de DTT para retirar el Triton X-100. Entonces, se aplicó un gradiente lineal de 150 ml de 15–400 mM de NaCl en 50 mM de Tris (pH 8,0) a la columna. Las fracciones que contenían AVP se identificaron, mezclaron y nombraron como SSEPH. La AVP eluyó de esta columna a una fuerza iónica de 0,1M de NaCl. La fracción de SSEPH se introdujo en una columna quelante de sefarosa cargada con zinc de 1,6 x 3,5 cm. La carga de zinc se llevó a cabo mediante un lavado de la resina con 0,05 M de EDTA y 1 M de NaCl, seguido de un lavado con agua para retirar el EDTA, y a continuación un lavado con 0,2 M de ZnCl2 en 5 mM de HCl. Luego se equilibró la columna en 25 mM de HEPES (pH 8,0) y 0,1 M de NaCl. La columna se cargó con la fracción de SSEPH y se lavó con el buffer de equilibrio hasta que la OD280 nm fue ≤ de 0,02. Entonces se aplicaron a la columna una serie de soluciones, cada una conteniendo 25 mM de HEPES (pH 8,0) y los siguientes constituyentes: 1 M de NaCl; 0,1 M de NaCl; 35 mM de imidazol y 0,1 M de NaCl; 0,1 M de NaCl; 35 mM de imidazol y VIII. ANEXO 152 0,1 M NaCl; 0,1 M de NaCl; 35 mM de imidazol y 0,1 M de NaCl; y 0,1 M de NaCl. La AVP se eluyó en 25 mM de HEPES (pH 8,0), 0,1 M de NaCl, y 0,01 M de EDTA. Finalmente se realizó una diálisis con 20 mM de HEPES (pH 8,0), 5 mM de NaCl, y 0,1 mM de EDTA. Finalmente se obtuvieron 4 ml de enzima purificada (Figura 17) a una concentración de 4,9 mg/ml que se guardó a - 20ºC. Figura 17. Purificacion de la AVP de adenovirus. Se observan las muestras de los lisados de bacteria inducida con IPTG para expresar AVP (línea a), el sobrenadante del lisado centrifugado a 10000 x g (línea b), la fracción recogida de la etapa de la columna cromatográfica DEAE (línea c), la actividad de la fracción de la columna de S-Sefarosa (línea d), la AVP purificada a través de la columna de zinc-iminodiacético (línea e), y los marcadores moleculares (línea f) fueron separados por SDS-PAGE y teñidos con Coomassie azul brillante. Adaptada de Mangel WF. y col., 1995. 2.3. Método de difusión por vapor: gota sentada El método de vapor por difusión es una técnica en la que modificando las concentraciones de los agentes precipitantes y la concentración de proteína de manera simultánea puede conseguirse el estado de supersaturación [185]. Dentro de este método, uno de los más empleados es el de la gota sentada, donde una gota que contiene la proteína se asienta sobre una superficie determinada (Figura 18a). VIII. ANEXO 153 En este caso se desarrolla un gradiente de concentración entre la gota que contiene a la proteína y el líquido presente en un reservorio inferior, de tal manera que la concentración del agente precipitante siempre es mayor en el reservorio que la gota. Lo que ocurre es que esta situación permite que se evapore el agua de la gota, disminuyendo su volumen e incrementando la concentración de la proteína y el precipitante. En algún punto, la concentración de la proteína debería alcanzar un estado de supersaturación y si el resto de parámetros, los cuales son importantes para la cristalización, tales como el pH, temperatura, aditivos etc., son óptimos, la proteína puede cristalizar. La cristalización de las proteínas comienza la fase de nucleación y cristalización rápida, por consiguiente la concentración de la proteína disminuye y entra en la fase de saturación donde ocurre el crecimiento y formación de las estructuras cristalinas completas en un ambiente metaestable (Figura 18b). Figura 18. Método de la gota sentada (a) (Adaptado de www.wikipedia.es) y proceso de formación de cristales de proteínas (b) (Adaptado de Russo Krauss I. y col., 2013).