Determinación de compuestos bioactivos en subproductos de vinificación

TRABAJO DE FIN DE GRADO GRADO EN FARMACIA Determinación de compuestos bioactivos en subproductos de vinificación Autor: Jesús de la Escalera Rodríguez Tutora: María José Jara Palacios Departamento: Química Analítica Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla. 1 de febrero de 2021 1 Resumen. En este trabajo se ha evaluado la extracción de compuestos fenólicos presentes en las distintas partes del orujo (semilla, hollejo y raspón), principal subproducto de la vinificación, de la variedad de uva Zalema, mediante una extracción sólido-líquido convencional a temperatura ambiente. Se han utilizado tres disolventes diferentes (agua, etanol y una mezcla al 50 % agua/etanol) para comparar su rendimiento de extracción y las características de los extractos fenólicos obtenidos. Se ha determinado su contenido fenólico total (TPC), mediante el ensayo de Folin-Ciocalteu, y la concentración de determinados compuestos de manera individual, mediante UHPLC. También se han evaluado algunas actividades biológicas de los extractos en ensayos in vitro. La actividad antioxidante se ha determinado mediante la capacidad para neutralizar el radical DPPH frente al antioxidante estándar Trolox. La actividad anticolinesterasa se ha determinado por el método de Ellman. La mezcla de agua y etanol al 50 % resultó ser el disolvente con mayor capacidad de extracción respecto al TPC en los tres subproductos y para la mayoría de los compuestos individuales, con alguna excepción como el ácido gálico en semilla, que se extrajo mejor con agua. La semilla se situó como el subproducto con mayor TPC, seguido del raspón y, por último, del hollejo (9829,86, 3745,77 y 2797,67 mg GAE/100 g, respectivamente, en agua/etanol). La semilla destacó por su elevado contenido de flavanoles (en el extracto de agua/etanol: epicatequina 40,02, catequina 33,04 y procianidina B1 29,36 mg/100 g) y de ácido gálico (41,45 mg/100 g en agua). El hollejo presentó la mayor cantidad de flavonoles (quercetina-3-O-glucósido 48,85 mg/100 g en el extracto agua/etanol). El raspón presentó cantidades elevadas, pero inferiores a la semilla o el hollejo, para todos los grupos fenólicos (procianidina B1 28,33 y quercetina-3-O- glucósido 45,05 mg/100 g en agua/etanol). La actividad antioxidante de los extractos siguió una correlación lineal con su TPC, con la excepción de los extractos hidroalcohólicos de hollejo y raspón. El raspón presentó una actividad antioxidante menor a la del hollejo (28,10 frente a 34,96 mmol TE/100 g), probablemente debido al mayor contenido en flavonoles del hollejo. El extracto de semilla con agua/etanol mostró la mayor actividad (50,44 mmol TE/100 g). La actividad anticolinesterasa se midió con una concentración de 2,5 mg/mL en todos los extractos. Los mayores porcentajes de inhibición se alcanzaron con los extractos de etanol y agua/etanol de semilla (53,9 y 48,9 %) y los extractos en agua/etanol de raspón y hollejo (45,2 y 39,9 %, respectivamente). Los resultados indicaron que los subproductos de vinificación de uva blanca son una buena fuente de compuestos fenólicos con elevada actividad antioxidante y de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa. Palabras clave: subproductos de vinificación, compuestos fenólicos, antioxidante, colinesterasa. 2 Abstract. In the present work, extraction of phenolic compounds found in the different parts of the grape pomace (seeds, skins and stalks), the main wine-making by-product, from grape variety Zalema, has been carried out by means of a conventional solid-liquid extraction at room temperature. Three different solvents (water, ethanol and 50% water/ethanol mixture) have been used to compare the extraction yield and the characteristics of the extracts. Later, its total phenolic content (TPC) has been determined through Folin-Ciocalteu assay, and the concentration of certain individual compounds, by UHPLC. Some biological activities have also been evaluated in in vitro tests. Antioxidant capacity has been determined by the ability of the extracts to scavenge DPPH radical against the standard antioxidant Trolox. Anticholinesterase activity has been measured by the Ellman’s method. Water/ethanol mixture turned out to be the solvent with the highest extraction efficacy with respect to TPC in the three by-products and for most of the individual compounds, with some exceptions like gallic acid in the seeds, which was better extracted with water. The seed was ranked as the by-product with the highest TPC in its three extracts, followed by the stalk and, finally, the skin (9829.86, 3745.77 and 2797.67 mg GAE/100 g, respectively, in water/ethanol). The seed stood out for its high content of flavanols (in the water / ethanol extract: epicatechin 40.02, catechin 33.04 and procyanidin B1 29.36 mg/100 g) and gallic acid (41.45 mg/100 g in water). The skins presented the highest amount of flavonols (quercetin-3-O-glucoside 48.85 mg/100 g in the water/ethanol extract). The stalk showed high amounts, but lower than the seed or the skin, for all phenolic groups (procyanidin B1 28.33 and quercetin-3-O-glucoside 45.05 mg/100 g in water/ethanol). The antioxidant activity of the extracts followed a linear correlation with their TPC, except for the hydroalcoholic extracts of skin and stalk. The latter, despite presenting higher TPC, obtained a lower antioxidant activity (28.10 vs 34.96 mmol TE/100 g), probably due to the higher flavonol content of the skin. The seed extract in water/ethanol showed the highest activity (50.44 mmol TE/100 g). The anticholinesterase activity was measured with the extracts standardized at a concentration of 2.5 mg/mL. The highest percentages of inhibition were achieved with the ethanol and water/ethanol seed extracts (53.9 and 48.9 %) and the water/ethanol extracts from stalk and skin (45.2 and 39.9 %). Results indicated that white wine-making by-products are a good source of phenolic compounds with high antioxidant power and ability to inhibit the enzyme acetylcholinesterase. Keywords: wine-making by-product, phenolic compounds, antioxidant, cholinesterase 3 Índice 1. Introducción ........................................................................................................................... 5 1.1. Compuestos bioactivos .................................................................................................. 6 1.2. Subproductos de vinificación ......................................................................................... 7 1.3. Compuestos fenólicos en subproductos de vinificación .............................................. 10 1.3.1. Compuestos fenólicos .................................................................................... 10 ▪ Clasificación según su estructura química ............................................ 10 ▪ Actividades biológicas ........................................................................... 11 1.3.2. Factores de variabilidad en la composición fenólica de subproductos ......... 13 1.3.3. Metodología analítica .................................................................................... 15 ▪ Tratamiento de la materia prima .......................................................... 15 ▪ Extracción fenólica ................................................................................ 15 ▪ Metodología de determinación fenólica .............................................. 16 ▪ Metodología de evaluación de la actividad antioxidante ..................... 17 2. Objetivos del TFG y plan de trabajo ..................................................................................... 17 3. Metodología ......................................................................................................................... 18 3.1. Materiales, equipos y reactivos .................................................................................. 18 3.2. Muestras ..................................................................................................................... 19 3.3. Extracción fenólica ....................................................................................................... 19 3.4. Contenido fenólico total (TPC) ..................................................................................... 20 3.5. Determinación de compuestos fenólicos individuales ................................................ 21 3.6. Evaluación de la actividad antioxidante ...................................................................... 21 3.7. Evaluación de la actividad anticolinesterasa ............................................................... 22 3.8. Análisis estadístico ....................................................................................................... 22 4. Resultados y discusión ......................................................................................................... 23 4.1. Contenido fenólico total (TPC) ..................................................................................... 23 4.2. Determinación de compuestos fenólicos individuales ................................................ 23 4.3. Evaluación de la actividad antioxidante ....................................................................... 28 4.4. Evaluación de la actividad anticolinesterasa ............................................................... 29 5. Conclusiones ........................................................................................................................ 31 Bibliografía ........................................................................................................................... 32 5 1. Introducción. La vid (Vitis vinifera L.) es una de las plantas más cultivadas alrededor del mundo, cuyo fruto, la uva, se utiliza en la elaboración de una de las bebidas alcohólicas más consumidas, el vino. En el año 2018, se obtuvieron 77,8 millones de toneladas de uva en todo el mundo, de los que el 57 % fueron destinadas a la vinificación, con un volumen total de 292 millones de hectolitros de vino producido. España es el país que alberga la mayor superficie mundial de viñedo, con casi un millón de hectáreas destinadas a este cultivo, lo que representa el 13 % de la superficie total. Más del 95% de la uva cosechada en este país se utiliza para obtener vino, con una producción de 44,4 millones de hectolitros en el año 2018 (OIV, 2019). En la Unión Europea se produce el 65 % del vino a nivel mundial, con Italia, Francia y España a la cabeza. Es una actividad cultural y económica de gran peso en la UE, con un mercado que mueve miles de millones de euros y que no deja de crecer año tras año (Eurostat Comext, 2018). La industria agroalimentaria es responsable de generar un importante y perjudicial impacto ecológico y la industria vitivinícola, por extensión, también tiene su parte de contribución al problema. Este sector se caracteriza por la estacionalidad, ya que la mayor parte de su actividad se lleva a cabo durante el periodo de vendimia. En consecuencia, se producen enormes cantidades de residuos en un plazo muy corto de tiempo, lo cual dificulta una gestión adecuada de estos. Debido a los elevados costes de gestión, una buena parte de los residuos acaban siendo incinerados, depositados en vertederos o esparcidos por el terreno, especialmente aquellos provenientes de pequeñas explotaciones (Christ y Burritt, 2013; Ruggieri et al., 2009). Los residuos vitivinícolas tienen un elevado impacto en la calidad del suelo cuando son depositados sin tratamiento previo, debido, a su pH ácido y a la elevada presencia de compuestos fenólicos, que presentan propiedades fitotóxicas y antimicrobianas (Bustamante et al., 2008). La legislación española (Ley 22/2011, de 28 de Julio, de Residuos y Suelos Contaminados, 2011) obliga a la industria a adoptar medidas para reducir al máximo la producción de residuos y a prepararlos para la reutilización y el reciclaje. Con ello, la citada ley define el concepto de subproducto como “sustancia u objeto obtenida de manera integrante en un proceso de producción, cuyo principal objetivo no es la producción de dicha sustancia, y que se tiene la seguridad de que será utilizado ulteriormente sin tener impactos adversos en la salud humana o el medio ambiente ”. Asimismo, define la valorización de residuos como “aquellas operaciones destinadas a otorgar al residuo una finalidad útil en la economía, al sustituir a otros materiales que de otro modo se hubiesen empleado para dicha utilidad, y dándole valor a una sustancia que, de no ser por dicha operación, hubiese sido desechada ”. Estos conceptos se engloban en 6 el marco de la economía circular o bioeconomía, un modelo productivo basado en optimizar el uso y a alargar y cerrar los ciclos de vida de los recursos y materiales utilizados para proveer bienes y servicios en todos los sectores económicos de un modo ecológicamente sostenible (Wohlgemuth et al., 2021). Actualmente, la implementación de este modelo económico es una de las mayores prioridades de los organismos públicos a nivel internacional (Comisión Europea, 2019; ONU, 2015). Se han investigado numerosas opciones para la valorización económica de los subproductos de la vinificación. Una de las más prometedoras, y que va creciendo cada año, es la recuperación de compuestos bioactivos, por sus numerosas aplicaciones en las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética (Fontana et al., 2013). Desde hace unas décadas se habla de los efectos saludables del vino y sus componentes químicos, principalmente los compuestos fenólicos. Hoy en día existe una extensa literatura sobre estos compuestos y su relación con la salud humana, que será tratada en el presente trabajo. Este tema cobra una gran relevancia por la creciente concienciación de la ciudadanía sobre la importancia de la alimentación saludable y el respeto al medio ambiente, y la influencia que ello tiene en el comportamiento de los consumidores (Barber et al., 2009). Ambas cuestiones suponen un valor añadido al producto, y así lo demuestra el interés de las bodegas y asociaciones de viticultores por las certificaciones oficiales de viñedos y vinos ecológicos (di Vita et al., 2019); de la industria alimentaria en el etiquetado de alimentos como orgánicos, sin aditivos, con propiedades funcionales, etc. (Moons et al., 2018; Oraman, 2014); o de la industria farmacéutica y cosmética en la elaboración de productos naturales o a base de plantas (Patra et al., 2018). En este trabajo se obtendrán extractos ricos en compuestos bioactivos mediante métodos de extracción ecológicos, sencillos y de bajo coste a partir de subproductos de vinificación de la variedad de uva Zalema, de gran importancia en la región de la Denominación de Origen del Condado de Huelva. Posteriormente, se determinará su composición química y se evaluarán sus propiedades bioactivas, concretamente la actividad antioxidante y anticolinesterasa. 1.1. Compuestos bioactivos. Un compuesto bioactivo se define como cualquier compuesto químico obtenido de fuentes vegetales, animales o microbiológicas que presentan una actividad biológica en el organismo que lo consume y repercute favorablemente en su salud. Presentan una gran diversidad 7 estructural y funcional. La gran mayoría de ellos no aportan ningún valor nutricional esencial, ya que no participan directamente en el metabolismo energético y estructural. A pesar de ello, tienen una gran relevancia en la alimentación por sus propiedades. Aunque existen algunos péptidos, glúcidos y lípidos con actividad biológica propia, el grueso de estos compuestos corresponde a fitoquímicos, productos del metabolismo secundario de las plantas (Fernandes et al., 2018; Patil et al., 2009). Estos metabolitos pueden tener funciones muy diferentes en las plantas, muchas de ellas aún desconocidas. Gran parte de ellas son mecanismos de interacción con el entorno, ya sea como atrayente de animales e insectos (colores, esencias, etc.), protección frente a herbívoros, parásitos y microorganismos (sabores desagradables, toxinas, etc.), protección frente a la radiación solar y la oxidación o mediadores de procesos alelopáticos, es decir, de relación con otras plantas. Según su estructura, y rutas biosintéticas, se distinguen 3 grandes grupos: compuestos fenólicos, alcaloides y terpenoides. Dentro de cada uno existe una gran variedad de subgrupos y compuestos, así como diversas propiedades biológicas y aplicaciones: principios activos de medicamentos, fitosanitarios, herbicidas, insecticidas, aditivos alimentarios, cosméticos, perfumes y un largo etcétera (Ávalos y Pérez-Urria, 2009). Por lo general, estos compuestos se producen en una cantidad muy pequeña y con una gran variabilidad. Algunos compuestos son muy comunes en el reino vegetal y otros están restringidos a determinadas familias, especies e incluso a variedades concretas. También influyen otros factores como, por ejemplo, las condiciones ambientales, el grado de maduración de la planta y otros procesos fisiológicos y patológicos. 1.2. Subproductos de vinificación. La industria vitivinícola se encarga del cultivo de la vid (Vitis vinifera L.) y de la producción del vino, generando una gran cantidad de residuos y subproductos a lo largo de todo el proceso. La vinificación se define como el conjunto de operaciones llevadas a cabo para convertir el mosto, o zumo de la uva, en vino. Durante la vinificación se generan subproductos como el orujo, los lodos de aguas residuales y las lías o heces del vino. Cada uno de ellos se obtiene en diferentes fases del proceso, como muestra la Fig. 1. Los lodos son residuos semisólidos generados a partir de las aguas residuales procedentes de labores de limpieza. Aunque contienen ciertas cantidades de alcohol o tartratos, su extracción es poco rentable, por lo que son residuos de poco valor y de cuya gestión suelen encargarse 14 La composición de los diferentes elementos vegetales también varía de manera considerable. En el caso del orujo, se consideran tres elementos diferenciados: raspones, semillas y hollejos. La mayor cantidad de compuestos fenólicos totales se encuentran en la semilla, en la que abundan los flavan-3-oles (catequina, epicatequina y procianidinas) y los ácidos fenólicos (gálico y protocatéquico). El contenido fenólico total más bajo se encontraría en el hollejo, aunque es en él donde se encuentra la mayor cantidad de flavonoles, principalmente en forma de 3-O- glucósidos, rutósidos, glucurónidos y otros (de quercetina, kaempferol, miricetina, etc.). En el hollejo también hay flavan-3-oles, en cantidad muy inferior a los flavonoles, y ácidos fenólicos. Además, en la piel de uvas tintas se encuentran elevadas cantidades de antocianinas, que no se detectan en otras partes del orujo ni en la uva blanca. Los compuestos fenólicos más abundantes en los raspones son las proantocianidinas, o taninos condensados, seguido de flavanoles y ácidos fenólicos. También contienen flavonoles, en cantidad algo menor al hollejo. Los taninos pueden hallarse en todo el orujo, aunque su contenido y grado de polimerización varía considerablemente entre sus partes. El mayor contenido de taninos se encuentra en los hollejos, así como el mayor grado de polimerización, con una media de 28 monómeros pero que puede incluso superar las 80 unidades de flavanoles. Mientras tanto, el grado de polimerización medio en raspones se encuentra en 9 y en las semillas en 11 unidades. Los ácidos fenólicos también presentan una distribución particular. En la semilla abundan los derivados hidroxibenzoicos, como los galatos o ácido protocatéquico, y no se detectan derivados hidroxicinámicos. En cambio, en el hollejo sí encontramos estos últimos, como los ácidos cutárico y caftárico (Hogervorst et al., 2017; Jara-Palacios et al., 2014; Jara-Palacios et al., 2020; Lavelli et al., 2017; Spigno et al., 2017; Teixeira et al., 2014; Xia et al., 2010). Respecto al suelo, destacan el nivel hídrico, de pH y de nutrientes (nitrógeno, fósforo, potasio) y la relación de la planta con la microbiota de la rizosfera, que le permite aumentar la disponibilidad de estos nutrientes (Torres et al., 2018). Diversos estudios apuntan a que un ligero déficit hídrico durante la etapa de maduración del fruto acelera dicho proceso y aumenta la producción de compuestos fenólicos (Castellarin et al., 2007). El clima tiene una gran influencia en la calidad de la uva. Los principales factores son la temperatura, la radiación solar y la pluviosidad, los cuales se ven muy afectados por aspectos geográficos como la latitud y la altitud. La radiación solar durante la época de maduración aumenta la cantidad de fenoles totales, aunque una excesiva exposición solar y las altas temperaturas pueden provocar la aparición de quemaduras o la degradación del fruto y, por tanto, pérdida de calidad. Las condiciones climáticas a lo largo del año son la principal causa de los cambios que se dan en las características 15 de los vinos de una cosecha a otra, aunque se planten las mismas variedades y se realicen las mismas prácticas agrícolas (Downey et al., 2006; Šebela et al., 2017; van Leeuwen et al., 2004). 1.3.3. Metodología analítica. ▪ Tratamiento de la materia prima: Son operaciones enfocadas a la mejora de la gestión de los subproductos, la conservación de sus componentes, la homogenización de la muestra y el incremento de la capacidad de extracción de estos compuestos (Drosou et al., 2015; Fontana et al., 2013; Hogervorst et al., 2017). Esto se consigue, generalmente, por medio del secado, la molienda y la congelación. La retirada de su alto contenido acuoso desactiva los mecanismos enzimáticos de degradación, impide su contaminación microbiana y reduce significativamente el peso y volumen de los subproductos, facilitando su manejo.. La molienda o pulverización aumenta la capacidad de extracción por parte de los disolventes, al romper la matriz lignocelulósica que atrapa los compuestos y aumentar la superficie de contacto sólido-líquido, y homogeniza la muestra. Otros ejemplos de procedimientos menos convencionales que pueden mejorar el rendimiento de la extracción son la previa digestión enzimática (celulasas, pectinasas) o el uso de agentes químicos (alcalinización), entre otros (Álvarez et al., 2017; Bao et al., 2020; el Achkar et al., 2018). ▪ Extracción fenólica: El método más común es la extracción sólido-líquido, es decir, por medio de disolventes. La elección del disolvente, y su cantidad, y las condiciones experimentales como la temperatura, el pH, el tiempo o la agitación determinarán el rendimiento de la extracción. Los compuestos fenólicos tienen una naturaleza polar, por lo que su solubilidad en agua es bastante elevada. No obstante, la combinación del agua con otros disolventes (metanol, etanol, acetona, acetato de etilo, etc.) puede mejorar el rendimiento del proceso, al aumentar la cantidad extraída y reducir el tiempo. El metanol es el que presenta mejores resultados en la extracción de flavan-3-oles y la acetona para las procianidinas. Sin embargo, el uso de estos disolventes está limitado en favor del etanol, que es más económico y también obtiene buenas extracciones, sin presentar los efectos perjudiciales para el organismo y el medio ambiente de los otros compuestos (Fontana et al., 2013; Ignat et al., 2011). Además, con el etanol se maximiza la extracción del contenido fenólico total, siendo la mezcla de agua y etanol al 50 % la más eficiente (Bucić-Kojić et al., 2009). Otros parámetros importantes son la temperatura y el pH. A mayor temperatura, se obtiene una mejor y más rápida extracción de compuestos fenólicos totales, pero una alta temperatura 16 durante un largo periodo puede afectar a la estabilidad de estos compuestos y, en consecuencia, reducir la eficacia de la extracción y del poder antioxidante del extracto (Fontana et al., 2017; Spigno et al., 2007). El pH ácido también favorece la extracción, usándose en concentraciones entre el 0.1 y el 1 % de HCl (Vatai et al., 2009). Se han estudiado multitud de técnicas complementarias para favorecer la cinética de extracción. Las más valoradas son: la extracción asistida por ultrasonidos, por microondas, descargas eléctricas de alto voltaje, calentamiento óhmico, inyección de disolventes a altas presiones y temperatura o la extracción con fluidos supercríticos (Barba et al., 2016; Fontana et al., 2017; Maroun et al., 2017). El fluido supercrítico por excelencia es el CO2, dado su bajo punto crítico, que permite realizar la extracción a temperaturas entre 30 y 40 °C, y porque no deja rastros en el extracto al evaporarse a presión atmosférica. El CO2 es una sustancia apolar, por lo que necesita la adición de cosolventes, como el etanol, para extraer los compuestos fenólicos de manera eficiente (Fontana et al., 2017; Ignat et al., 2011; Vatai et al., 2009). ▪ Metodología de determinación fenólica: El análisis del contenido fenólico tiene varias consideraciones. En primer lugar, está la determinación del contenido fenólico total (TPC). El método de elección es el ensayo Folin- Ciocalteu, basado en la reducción de un reactivo compuesto por fosfotungstato y fosfomolibdato y la determinación colorimétrica del producto azul resultante, a una longitud de onda de 760-765 nm. El resultado de la prueba se expresa en equivalentes de ácido gálico (GAE). Es un ensayo sencillo y reproducible, pero presenta ciertas limitaciones, ya que el reactivo interacciona con otras especies químicas oxidables como azúcares reductores, ácido ascórbico o aminoácidos aromáticos, así como con proteínas (Malta y Liu, 2014; Singleton et al., 1999). La determinación individual de compuestos concretos se lleva a cabo por medio de la cromatografía líquida de alta eficacia o resolución (HPLC, High Performance Liquid Chromatography). Es un método con una alta sensibilidad y especificidad, basado en el diferente tiempo de retención de cada compuesto en una columna cromatográfica a alta presión. Con un detector y un software que transforme los datos de señal, el ordenador elabora un cromatograma, en el que cada pico representa un compuesto, y su cantidad es directamente proporcional al área bajo la curva del pico. Para identificar cada compuesto, debe compararse con el tiempo de retención de compuestos estándares puros, lo que limita el análisis por la enorme variedad de compuestos fenólicos en la muestra y la disponibilidad comercial de los reactivos. La combinación de la cromatografía con la espectrometría de masas ofrece unos resultados excepcionales (Fontana et al., 2013; Jara-Palacios et al., 2014; Malta y Liu, 2014). 17 ▪ Metodología de evaluación de la actividad antioxidante: Existen numerosos métodos para evaluar la capacidad antioxidante de los extractos. El método DPPH toma su nombre del reactivo usado, 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo, un radical libre relativamente estable con una banda de absorción a 515-517 nm que desaparece al ser neutralizado por una sustancia antioxidante (Brand-Williams et al., 1995). Hay otros métodos que usan diferentes reactivos pero que comparten el mismo fundamento: ABTS, por ácido 2,2’- azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico); FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power), que usa un complejo férrico de 2,4,6-tripiridil-S-triazina (TPTZ); TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential), en el que el reactivo es el dihidrocloruro de 2,2’-azobis(2-amidinopropano) (AAPH). El ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) también utiliza AAPH acompañado de fluoresceína, y la detección se lleva a cabo por fluorimetría. En todos estos ensayos se utiliza como control positivo el reactivo Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico), un análogo hidrosoluble de tocoferoles, que también posee una elevada capacidad antioxidante. Por ello, el resultado de la actividad antioxidante se expresa en equivalentes de Trolox (TE). Estos ensayos in vitro presentan la ventaja de ser sencillos, de bajo coste y de alta reproducibilidad, pero no reflejan la capacidad antioxidante in vivo, debido a las limitaciones ya mencionadas, como la biodisponibilidad y el metabolismo de estos compuestos en el organismo, o la interferencia de otros componentes celulares. Para ello, se requiere la utilización de otros métodos, como cultivos celulares, tejidos ex vivo o, directamente, en ensayos clínicos (Badarinath et al., 2010; Brand-Williams et al., 1995; Malta y Liu, 2014). 2. Objetivos del TFG y plan de trabajo. El objetivo de este Trabajo Fin de Grado es la obtención de extractos fenólicos con propiedades bioactivas a partir de subproductos de vinificación, mediante el uso de disolventes inocuos. Para ello, se han propuesto los siguientes objetivos específicos: - Obtener extractos fenólicos a partir de los constituyentes del orujo: semillas, hollejos y raspones. La extracción se realizará mediante una extracción sólido-líquido convencional, con tres disolventes (agua, etanol y mezcla de agua y etanol al 50 %) , a temperatura ambiente, con agitación y durante un tiempo predeterminado. Se valorará la influencia del disolvente en la composición y la actividad biológica de los extractos. 18 - Caracterizar químicamente los extractos. En primer lugar, se realizará una determinación del contenido fenólico total, mediante el método de Folin-Ciocalteu. A continuación, los extractos se analizarán por medio de una cromatografía líquida de alta resolución (UHPLC), para la determinación fenólica cualitativa y cuantitativa de los compuestos individuales. - Evaluarla actividad biológica de los extractos. Por una parte, se determinará la actividad antioxidante de cada extracto, por medio del ensayo DPPH. Por otra parte, se valorará la actividad anticolinesterasa mediante ensayos in vitro de la capacidad de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa (AChE). 3. Metodología. 3.1. Materiales, equipos y reactivos. - Metanol y etanol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania). - Carbonato de sodio (Na2CO3) (VWR, Leuven, Bélgica). - Reactivo de Folin-Ciocalteu (VWR, Leuven, Bélgica). - Ácido fórmico y acetonitrilo para HPLC (Panreac, Barcelona, España). - Estándares para HPLC: ácido gálico, ácido protocatéquico, catequina, epicatequina y 3-O- rutinósido de quercetina se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Madrid, España); 3-O-glucósidos de quercetina y kaempferol de Extrasynthese (Genay, Francia). - DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania). - Estándar Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) de Acros Organics (Geel, Alemania). - Reactivo de Ellman (o DTNB, 5-5’-ditiobis-[ácido 2-nitrobenzoico]), yoduro de acetiltiocolina (ATCI), galantamina y la enzima acetilcolinesterasa (AChE, EC 3.1.1.7, tipo VI-S, de anguila eléctrica) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). - Espectrofotómetro UV-Vis Agilent ® 8453 (Agilent Technologies, Palo Alto, EE. UU.). - Cromatógrafo Agilent 1290 (Agilent Technologies, Palo Alto, EE. UU.) equipado con un detector de matriz de diodos. La columna usada fue una C18 Eclipse Plus 120, con medidas de 50 x 2.1 mm y un tamaño de poros de 1.8 µm. - Liofilizador. - Agitador Vortex IKA Genios 3 (IKA®, Staufen, Alemania). - pH-metro CRISON GLP 21 (Crison Instruments, S.A., Barcelona, España). - Cubeta de vidrio de 10 mm de camino óptico. 19 - Cubetas desechables de plástico de 10 mm de camino óptico. - Micropipetas Eppendorf. - Matraces aforados de 10, 25, 50, 100, 500 y 1000 mL. 3.2. Muestras. Las muestras de subproductos de vinificación corresponden a orujo de uva blanca de la variedad de uva Zalema, suministrada por una bodega perteneciente a la Denominación de Origen Condado de Huelva. Los distintos elementos del orujo fueron separados manualmente, obteniendo tres tipos de muestras independientes: semillas, hollejos y raspones, tal como se muestra en la Fig. 3. Figura 3. Muestra fresca de orujo de vinificación (A) y sus distintas partes separadas: semillas (B), hollejos (C) y raspones (D). Las muestras se sometieron al siguiente pretratamiento: se lavaron con agua destilada, se liofilizaron durante 24 horas y se molieron hasta obtener un polvo fino y homogéneo, como se muestra en la imagen de la Fig. 4. 3.3. Extracción fenólica. Los extractos fenólicos se obtuvieron mediante una extracción sólido-líquido convencional, según el método propuesto por Jara-Palacios et al. (Jara-Palacios et al., 2020). Para cada muestra, se partió de una cantidad de 5 g de materia seca y molida, a los que se añadieron 50 mL de disolvente a temperatura ambiente (18-20 °C). El proceso se realizó con 3 disolventes 20 diferentes: agua, etanol y mezcla al 50 % de agua/etanol y las muestras se pusieron en agitación magnética durante una hora, obteniéndose las mezclas correspondientes (Fig. 4). Las disoluciones obtenidas se centrifugaron a una fuerza de 4190 g durante 15 minutos. Se recogió el sobrenadante y el sedimento sólido de la muestra se suspendió de nuevo, repitiendo dos ciclos idénticos más. Los sobrenadantes de cada muestra se unieron, obteniendo extractos de 150 mL por muestra y disolvente. Finalmente, cada extracto fue desecado por evaporación a presión reducida, mediante un evaporador rotativo, y almacenado a -20 °C para su correcta conservación hasta el momento del análisis, en el que serían resuspendidos con una cantidad de disolvente necesaria para alcanzar una concentración del orden de 50 mg/mL. Figura 4. Muestras de semillas, hollejos y raspones liofilizadas, homogeneizadas y pesadas, y muestras tras adición de disolventes y agitación. 3.4. Contenido fenólico total (TPC). El análisis del contenido total de compuestos fenólicos se llevó a cabo a través del ensayo de Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi, 1965), aunque con ciertos cambios (Jara-Palacios et al., 2014). Para cada extracto, se partió de una alícuota de 0,25 mL, a las que se añadieron 1,25 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu y 3,75 mL de disolución de carbonato de sodio (Na2CO3) al 20 %. La mezcla fue diluida y homogeneizada con agua destilada hasta un volumen final de 25 mL y se dejó reposar durante 120 minutos, antes de proceder a la medida de la absorbancia. La absorbancia se midió a 765 nm en el espectrofotómetro. Cada muestra se analizó por triplicado. La recta de calibrado se elaboró con un estándar de ácido gálico y el resultado del TPC se expresó en mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramos de muestra (mg GAE/100 g muestra). 21 3.5. Determinación de compuestos fenólicos individuales. El análisis se llevó a cabo mediante UHPLC (Ultra-High Performance Liquid Chromatography) en fase reversa, en un cromatógrafo configurado para medir señales entre 200 y 770 nm. Como disolvente, se usaron ácido fórmico al 0,01 % en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B). Las condiciones del proceso se establecieron conforme al protocolo propuesto por Jara- Palacios (Jara-Palacios et al., 2018): 0–5 min, 5 % lineal B; 5–20 min, 50 % lineal B; 20–25 min, 100 % lineal A. El flujo de disolvente se estableció a una tasa 0.8 mL/min y la temperatura de la columna a 25 °C. Alícuotas de 2 mL de los extractos fenólicos fueron concentradas hasta desecación, resuspendidas en 1 mL de disolvente A y filtradas a través de una membrana con poros de 0.45 µm de diámetro. El volumen inyectado en el cromatógrafo fue de 1 µL. Previamente al análisis de las muestras, se elaboraron las curvas de calibración con estándares y se establecieron los límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ). Otros compuestos fueron identificados previamente por espectrometría de masas y/o datos bibliográficos de tiempo de retención y señales en el espectro UV-visible: ácido gálico, catequina, epicatequina, procianidinas B1 y B2, 3-O-glucósidos de quercetina, kaempferol e isoramnetina, 3-O-rutinósido de quercetina, 3-O-galactósido de kaempferol y 3-O-galatos de procianidina B2, en forma de trímero y tetrámero. La identificación de los compuestos fenólicos se realizó mediante los tiempos de retención de los picos del cromatograma y la cuantificación mediante el cálculo del área bajo la curva de los picos resueltos a 280 nm para flavanoles y ácidos fenólicos y a 370 nm para flavonoles. Cada muestra se analizó por triplicado y los resultados se expresan como cantidad del compuesto fenólico en mg /100 g muestra. 3.6. Evaluación de la actividad antioxidante. La actividad antioxidante in vitro de los extractos fue determinada mediante el ensayo DPPH, en el que se compara la capacidad de estos para neutralizar el radical libre DPPH frente al estándar Trolox, siguiendo los métodos establecidos (Brand-Williams et al., 1995; Soler-Rivas et al., 2000), aunque con algunas modificaciones (Jara-Palacios et al., 2018). Primero, los extractos iniciales fueron descongelados, homogeneizados y diluidos a una concentración adecuada en comparación con el estándar Trolox. El reactivo DPPH se encuentra en una disolución de metanol a una concentración 90 µM. Se añadieron volúmenes de 300 µL, sobre una alícuota de 30 µL de cada extracto, con una cantidad análoga del estándar Trolox y una disolución hidrometanólica al 80 %, que haría las veces de blanco. Las mezclas se diluyeron con 570 µL de metanol y se dejó que transcurra la reacción durante 30 minutos para, una vez pasado el tiempo, 22 medir la absorbancia a 515 nm. Cada muestra se analizó por cuadruplicado. El resultado se obtiene en equivalentes de Trolox (TE) por gramo de extracto y se recalcula para representarlo como mmol TE/100 g muestra. 3.7. Evaluación de la actividad anticolinesterasa. Se determinó la capacidad de los extractos para inhibir la enzima AChE (acetilcolinesterasa) mediante un ensayo in vitro basado en el método propuesto por Ellman (Ellman et al., 1961), con ciertas modificaciones más actuales (Chattipakorn et al., 2007; Costa et al., 2011). Es un método colorimétrico que consta de dos reacciones. En primer lugar, la reacción enzimática, en la que el sustrato es hidrolizado. Dicho sustrato es el yoduro de acetiltiocolina (ATCI). A continuación, el producto (tiocolina) reacciona con el reactivo de Ellman, el 5,5’-ditiobis-[ácido 2-nitrobenzoico], o DTNB, formando ácido 5-tio-2-nitrobenzoico, un compuesto de color amarillo con máximo de absorbancia a 405-420 nm. La medida colorimétrica se llevó a cabo en un espectrofotómetro. Cada muestra se analizó por triplicado. En los pocillos se elaboró la siguiente mezcla: 3 mM DTNB, 15 mM ATCI, 100 mM de tampón fosfato (pH=8) y, por último, los extractos fenólicos diluidos a una concentración de 2.5 mg/mL, que en el pocillo serían 250 µg/mL. Además, la reacción se valoró con un inhibidor estándar, galantamina, y en ausencia de inhibidores, rellenando con una disolución buffer a modo de blanco y para calcular el porcentaje de inhibición de los extractos fenólicos. A continuación, para disparar la reacción, se añadió el extracto enzimático de AChE. La absorbancia fue medida a 405 nm a tiempo cero y tras 5 minutos de reacción. La actividad anticolinesterasa se calculó como porcentaje de la velocidad enzimática sin inhibición y se expresó como porcentaje de inhibición. 3.8. Análisis estadístico. Todos los cálculos estadísticos se realizaron por medio del software Statistica v8.0, presentando los resultados como la media ± SD (desviación estándar). Se ha aplicado el Análisis Múltiple de la Varianza para establecer la existencia o no de diferencias significativas entre grupos (S0, S1 y S2), mediante el análisis de las medias de cada uno de los grupos. Las diferencias estadísticamente significativas se determinaron mediante el test de rangos múltiples de Tukey (p < 0,05). 23 4. Resultados y discusión. 4.1. Contenido fenólico total (TPC). El contenido fenólico total de cada extracto se muestra en la Tabla 1, según el subproducto de vinificación y el disolvente. Se hallaron diferencias significativas (p < 0,05) para todos los subproductos en función de los diferentes disolventes. Con los tres disolventes, los extractos de la semilla mostraron la mayor cantidad de compuestos fenólicos, seguido de los extractos de raspón y, en tercer lugar, de hollejo. Tabla 1. Contenido fenólico total en los extractos de subproductos de vinificación para tres disolventes diferentes (agua, etanol y agua/etanol al 50 %). Resultados obtenidos mediante el ensayo de Folin-Ciocalteu y expresados en mg GAE/100 g muestra. Cada valor representa la media ± SD (n = 3). Las diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre los distintos extractos de cada subproduto se muestran con diferentes letras junto al resultado. Para los tres subproductos, la mezcla de agua y etanol al 50 % mostró los mejores resultados, con una cantidad para semillas, raspón y hollejo de 9829,86, 3745,77 y 2797,67 mg GAE/100 g, respectivamente. Los extractos de agua y etanol no siguieron la misma tendencia. El hollejo y el raspón mostraron un mayor TPC en el extracto de agua que en el de etanol (584,20 frente a 198,44 mg GAE/100 g para el hollejo y 831,71 frente a 402,14 mg GAE/100 g para el raspón), mientras que el extracto etanólico de la semilla mostró mayor cantidad de fenoles totales que el extracto acuoso (5473,78 y 1382,99 mg GAE/100 g, respectivamente). 4.2. Determinación de compuestos fenólicos individuales. Los compuestos fenólicos presentes en mayor cantidad en los subproductos de vinificación pertenecen, principalmente, a tres grupos: ácidos fenólicos, flavanoles y flavonoles. En este trabajo, aunque existen muchos más compuestos presentes, se seleccionaron los 8 más representativos: los ácidos fenólicos gálico y protocatéquico; los flavanoles catequina, epicatequina y procianidina B1; y los flavonoles quercetina-3-O-rutinósido, quercetina-3-O- glucósido y kaempferol-3-O-glucósido. Estos compuestos fueron cuantificados en todos los extractos para valorar las diferencias existentes entre los distintos subproductos y la influencia del disolvente en el perfil fenólico obtenido. Los resultados se muestran por separado para la semilla, el hollejo y el raspón en las Tablas 2, 3 y 4, respectivamente. Agua Etanol Agua/Etanol Semilla 1382,99 ± 52,55 a 5473,78 ± 670,01 b 9829,86 ± 715,42 c Hollejo 584,20 ± 19,89 a 198,44 ± 7,60 b 2797,67 ± 161,67 c Raspón 831,71 ± 23,39 a 402,14 ± 1,32 b 3745,77 ± 172,86 c 30 inhibición del hollejo fueron los más reducidos, siendo el mayor el del extracto de agua/etanol, seguido del de agua y el de etanol (39,9, 25,1 y 19,6%). En la literatura se pueden encontrar diversos estudios que atribuyen esta actividad a determinados compuestos fenólicos y productos vegetales, pero existe poca información sobre la uva y los subproductos de vinificación, especialmente de variedades de uva blanca. Los resultados mostrados en este trabajo concuerdan con otras investigaciones en el tema, e incluso muestran una actividad mayor que subproductos de otras variedades tintas (Jara-Palacios et al., 2020; Tkacz et al., 2019). Figura 5. Actividad anticolinesterasa de los extractos de subproductos de vinificación para tres disolventes diferentes (agua, etanol y agua/etanol al 50%). Resultados obtenidos mediante ensayo in vitro y expresados como porcentaje de inhibición. Cada valor representa la media ± SD (n=3). Para cada subproducto, las diferencias estadísticamente significativas entre los distintos extractos se muestran con diferentes letras junto al resultado. La estandarización de la concentración de los extractos elimina los efectos del TPC en la correlación de la actividad biológica. Se entiende, por tanto, que las diferencias en los resultados se deben exclusivamente al perfil fenólico de cada extracto y a las diferentes capacidades de cada compuesto para inhibir la enzima AChE. Comparando con los resultados de HPLC de los diferentes extractos, no parece indicar que ningún compuesto concreto sea responsable de dichas diferencias. Se necesitarán estudios más completos que involucren a más compuestos y que determinen la actividad anticolinesterasa de cada uno de ellos por separado y a diferentes concentraciones. No obstante, estos resultados demuestran que los extractos ricos en diversos grupos y compuestos fenólicos presentan actividad anticolinesterasa. La galantamina, un alcaloide natural inhibidor de la AChE, fue usado como control positivo del ensayo, obteniendo un porcentaje de inhibición del 55,9%, aunque en otros estudios dicho porcentaje alcanza valores cercanos al 70% (Costa et al., 2013). Este compuesto ha sido probado 31 para el tratamiento del Alzheimer. Aunque mostró efectos positivos, su uso no se ha extendido demasiado porque no solucionaba los efectos adversos típicos de los anticolinesterásicos clásicos (Loy y Schneider, 2006). La elevada actividad anticolinesterasa de los compuestos fenólicos presentes en los subproductos de vinificación podría aprovecharse para investigaciones futuras en el ámbito clínico. 5. Conclusiones. En este trabajo se han evaluado los componentes del orujo (semillas, hollejos y raspones), principal subproducto de la vinificación, de la variedad de uva Zalema como fuente de compuestos fenólicos con actividad biológica. La extracción de dichos compuestos se ha llevado a cabo mediante un método sencillo, una extracción sólido-líquido convencional, y de bajo impacto ecológico, con disolventes inocuos (agua, etanol y mezcla de agua y etanol al 50 %) a temperatura ambiente. A partir de los resultados, se formulan las siguientes conclusiones: Primera. La mezcla de agua y etanol proporciona el mejor rendimiento de extracción para los tres tipos de muestras, tanto para el contenido fenólico total como para la mayoría de los compuestos fenólicos individuales. Segunda. La semilla destaca como la mejor fuente de compuestos fenólicos a nivel general y, en particular, de flavanoles (catequina, epicatequina y procianidinas) y de ácido gálico. Le sigue el raspón en contenido total, con cantidades moderadas de todos los grupos fenólicos determinados. El hollejo presenta el contenido fenólico más reducido, pero destaca por poseer la mayor cantidad de flavonoles (quercetina-3-O-glucósido, principalmente). Tercera. La actividad antioxidante de los extractos, determinada por su capacidad para neutralizar al radical libre DPPH, sigue una correlación lineal con el contenido fenólico total, con algunas desviaciones debidas a la diferente composición de los extractos. La mayor actividad antioxidante se encontró en los extractos en agua/etanol y en etanol de la semilla, seguido de los extractos en agua/etanol de hollejo y raspón. Cuarta. Los extractos fenólicos inhiben a la enzima acetilcolinesterasa. Se necesitan más estudios para determinar la capacidad inhibitoria de cada compuesto y a qué concentraciones son activos. De los extractos evaluados, los que inhiben en mayor medida esta enzima son, en orden descendente, los extractos en etanol de semilla y en agua/etanol de semilla, raspón y hollejo. 32 Bibliografía. Afanas’ev, I. B., Dcrozhko, A. I., Brodskii, A. v., Kostyuk, V. A., & Potapovitch, A. I. (1989). Chelating and free radical scavenging mechanisms of inhibitory action of rutin and quercetin in lipid peroxidation. Biochemical Pharmacology, 38(11), 1763– 1769. https://doi.org/10.1016/0006-2952(89)90410-3 Álvarez, A., Poejo, J., Matias, A. A., Duarte, C. M. M., Cocero, M. J., & Mato, R. B. (2017). Microwave pretreatment to improve extraction efficiency and polyphenol extract richness from grape pomace. Effect on antioxidant bioactivity. 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