Determinación y análisis comparativo de subpoblaciones linfocitarias tipo b , según el procesamiento de la muestra utilizado (sangre periférica), en población sana.

Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA -DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA- “DETERMINACIÓN Y ANÁLISIS COMPARATIVO DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS TIPO B POR CITOMETRÍA DE FLUJO, SEGÚN EL TIPO DE PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA UTILIZADO (SANGRE PERIFÉRICA), EN POBLACIÓN SANA” Tesis presentada para la obtención del grado de Doctor por Alejandro Muñoz Jiménez. Directores: Dr. Fernando Sáenz López de Rueda, Dr. José Luis Marenco de la Fuente y Dr. André Ballesteros Tato. Tutor: Dr. Rogelio Garrido Teruel. Sevilla, a 12 Septiembre del 2013. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 2 AGRADECIMIENTOS ABREVIATURAS ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN. 11 1.1. Aplicaciones de la citometría de flujo. 12 1.2. Historia de la citometría de flujo. 13 1.3. Características generales de los citómetros de flujo. 16 1.3.1. El sistema óptico. 1.3.2. Fuentes de luz. 1.3.3. Detectores. 1.3.4. Cámaras de flujo. 1.3.5. Sistema de inyección de la muestra. 1.3.6. Componente electrónico. 1.4. Prestaciones de los citómetros. 20 1.5. Consideraciones sobre determinados aspectos de los citómetros de flujo. Los citómetros de flujo separadores. 21 1.6. Procesamiento de las muestras. 24 1.6.1. Preparación de suspensiones celulares/nucleares para citometría de flujo. 1.6.2. Enriquecimiento celular. 1.7. Fluorocromos para la citometría de flujo. 24 1.7.1. Técnicas inmunofluorescentes. 1.7.2. Fluorocromos que se unen no covalentemente a estructuras celulares. 1.7.3. Marcadores fluorescentes que son sensibles al microambiente que les rodea. 1.8. Standards y controles. 28 1.8.1. Standards (patrones de normalidad). 1.8.2. Controles. 1.9. Procesamiento de los datos. El análisis de datos en citometría de flujo. 32 1.10. Técnicas inmunofluorescentes. 34 1.10.1. Incremento de la señal/ruido. 1.10.1.1. Aumento de la señal fluorescente. 1.10.1.2. Disminución del background y ruido. 1.11. Estudio citométrico en el análisis de linfocitos B. 38 1.11.1. Linfopoyesis del linfocito B. 1.11.2. The Freiburg, París and EUROClass Classifications. 1.11.3. Clasificación B mature (Bm). Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 3 2. HIPOTESIS Y OBJETIVOS. 46 2.1. Hipótesis de trabajo. 2.2. Objetivos. 3. MATERIALES Y MÉTODOS. 48 3.1. Materiales utilizados. 48 3.1.1. Solución lisante BD FACS (Concentrada 10X). 48 3.1.1.1. Uso propuesto. 3.1.1.2. Resumen y explicación. 3.1.1.3. Principios del procedimiento. 3.1.1.4. Reactivo. 3.1.1.4.1. Reactivo suministrado. 3.1.1.4.2. Preocupaciones. 3.1.1.4.3. Intrucciones para diluir. 3.1.1.5. Instrumento. 3.1.1.6. Obtención y preparación de muestras. 3.1.1.7. Preparación de las muestras. 3.1.1.8. Limitaciones. 3.1.1.9. Características de rendimiento. 3.1.1.9.1. Precisión. 3.1.1.9.2. Recuperación de globulos blancos. 3.1.1.9.3. Lisis de glóbulos rojos. 3.1.2. Fijador: Formaldehído al 5%. 54 3.1.2.1. Propiedades químicas. 3.1.2.1.1. Solución de formaldehído. 3.1.2.2. Protocolo de preparación de formaldehído al 5%. 3.1.3. Facs Flow (PBS). 58 3.1.4. Sc-Antimouse compensation estándar. 59 3.1.5. FACs Canto II (ocho colores). 60 3.1.6. Reactivos/Fluorocromos utilizados. Marcadores de linfocitos B para la inmunofenotipificación. 61 3.1.6.1. Inmunoglobulina D. 61 3.1.6.1.1. Descripción general. 3.1.6.1.1.1. Propiedades físico-químicas. 3.1.6.1.1.2. Papel en la respuesta inmune. 3.1.6.1.1.3. Niveles de IgD sérica en diversas enfermedades. 3.1.6.1.1.3.1. Infecciones. 3.1.6.1.1.3.2. Inmunodeficiencias. 3.1.6.1.1.3.3. Enfermedades autoinmunes y alérgicas. 3.1.6.1.1.3.4. Otras condiciones. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 4 3.1.6.1.1.3.5. IgD monoclonal. 3.1.6.1.2. Características del fluorocromo (PE mouse anti-human IgD) 3.1.6.2. CD19. 68 3.1.6.2.1. Descripción general. 3.1.6.2.2. Características del fluorocromo (APC-Cy™7 Mouse Anti- Human CD19). 3.1.6.3. CD38. 69 3.1.6.3.1. Descripción general. 3.1.6.3.2. Características del fluorocromo (PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD38). 3.1.6.4. CD 27. 72 3.1.6.4.1. Descripción general. 3.1.6.4.2. Características del fluorocromo (anti-Human CD27 APC). 3.1.6.5. CD 3. 73 3.1.6.5.1. Descripción general. 3.1.6.5.2. Características del fluorocromo (Pacific Blue™ Mouse Anti-Human CD3). 3.2. Sujetos. 75 3.2.1. Sujetos del estudio. 3.2.2. Criterios de inclusión. 3.2.3. Criterios de exclusión. 3.2.3.1. Padecer alguna de las siguientes causas de linfocitosis. 3.2.3.2. Padecer alguna de las siguientes causas de linfopenia. 3.3. Protocolo de estudio. Variables consideradas. 84 3.3.1. Descripción de protocolos. 84 3.3.1.1. Extracción de muestras. 84 3.3.1.2. Procesamiento de la muestra. 85 3.3.1.2.1. Procedimiento 1 (SF). 85 3.3.1.2.2. Procedimiento 2 (FM). 86 3.3.1.2.3. Procedimiento 3 (Lysis). 87 3.3.1.2.4. Procedimiento 4 (SF24h). 88 3.3.1.2.5. Diagrama aclaratorio. 89 3.3.1.3. Procesamiento en el citómetro. 89 3.3.1.3.1. Calibración del equipo. 3.3.1.3.2. Control de calidad de detectores con perlas multicolor. 3.3.1.4. Análisis de resultados. 91 3.3.2. Variables consideradas. 92 3.4. Metodología estadística. 97 3.4.1. Tamaño muestral. 97 3.4.2. Análisis estadístico. 97 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 5 3.4.3. Concordancia. Coeficiente de Correlación Intraclase (CCI) y método de Bland y Altman. 98 3.4.4. Coeficiente de confianza interna o alfa de Cronbach. 102 4. RESULTADOS. 104 4.1. Análisis descriptivo. 104 4.1.1. Estudio de subpoblaciones linfocitarias tipo B. 104 4.1.2. Estudio de intensidad de fluorescencia de los distintos fluorocromos en cada una de las subpoblaciones linfocitarias tipo B. 109 4.2. Estadística inferencial. 118 4.2.1. Estudio de subpoblaciones linfocitarias tipo B. 118 4.2.2. Estudio de intensidad de fluorescencia de los distintos fluorocromos en cada una de las subpoblaciones linfocitarias tipo B. 123 5. DISCUSIÓN. 135 5.1. Punto inicial. Ideas preliminares. 135 5.2. Discusión. En cuanto a las subpoblaciones linfocitarias. 140 5.3. Discusión. En cuanto a la intensidad de fluorescencia de los fluorocromos. 146 5.3.1. Intensidad de fluorescencia de IgD y CD27. Clasificación EUROClass. 146 5.3.2. Intensidad de fluorescencia de IgD y CD38. Clasificación B mature. 150 6. CONCLUSIONES. 155 7. RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL. 156 7.1. Introducción 7.2. Hipótesis y objetivos. 7.3. Material y métodos. 7.4. Resultados. 7.5. Conclusiones. 8. BIBLIOGRAFÍA. 159 9. ANEXOS. 165 9.1. ANEXO I 166 9.2. ANEXO II 217 9.3. ANEXO III 268 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 6 AGRADECIMIENTOS En estas líneas que siguen, quisiera agradecer a todo el grupo de personas que han contribuido a la ejecución de esta tesis, pasando por mi hogar, el laboratorio, la Facultad y mi lugar de trabajo: mi querido servicio de Reumatología del H. U. Virgen de Valme (Sevilla). Quiero agradecer a los doctores D. José Luis Marenco de la Fuente, “mi maestro” y Jefe de Servicio de Reumatología del Hospital Universitario Virgen de Valme (Sevilla), a D. Fernando Sáenz López de Rueda, profesor Titular de Traumatología y Ortopedia del Departamento de Cirugía de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla y Jefe de Servicio de Cirugía Ortopédica y Traumatología del Hospital Universitario Virgen Macarena (Sevilla) y al Dr. en biología André Ballesteros Tato, perteneciente al Troy Laboratory, del Strong Memorial Hospital of Rochester University (N.Y, USA). A todos ellos, le agradezco su dedicación, apoyo y consejos en la dirección de la presente tesis. A Elides Marín, jefa de técnicos en laboratorio del Strong Memorial Hospital of Rochester University y especialmente al Dr. Ignacio Sanz, actualmente director del Emory’s Lowance Center for Human Immunology, quién hizo posible mi estancia en Rochester, prestándome toda su ayuda no sólo científica, sino también personal. A mi mujer y toda mi familia, especialmente mi madre, por ser el estímulo cotidiano para ir rellenando estas líneas. Y por último, dedicar este trabajo a mi amigo ya fallecido D. Juan José Roldán Rodríguez, quién desde su ternura innata e inteligencia bondadosa, me llevó a lugares donde ningún otro ser humano perfecto, fue capaz de alojarme. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 7 ABREVIATURAS.  ADN: ácido desoxirribonucleico.  ANOVA: análisis de la varianza.  ANS: anilino-naftalina-sulfato.  AR: Artritis Reumatoide.  ARN: ácido ribonucleico.  BD: biosciences.  Bm: B mature.  Br: background relativo.  Br: background relativo.  CCI: coeficiente de correlación intraclase.  CMF: citometría de flujo.  CV: coeficiente de variación.  CVr: coeficiente de variación robusto.  DN: doble negativas.  EBV: Epstein-Barr Virus.  EBV: virus de Epstein-Barr.  EDTA: ácido etilendiaminotetraacético.  FACS: fluorescence-activated cell sorter.  FITC: isotiocianato de fluoresceína.  FL1: primera fluorescencia.  FL2: segunda fluorescencia.  FSC: forward scatter.  GL: grados de libertad.  Hz: herzios.  Ig: inmunoglobulina.  IL: interleukina.  IRA: insuficiencia renal aguda.  IRC: insuficiencia renal crónica.  LES: lupus eritematoso sistémico.  LISTA: list mode.  MFI: media de fluorescencia.  Min: minutos.  ml: mililitro.  N: número de sujetos.  Nm: nanómetro.  PBMC: peripheral blood mononuclear cells.  PCP: pneumocystis carinii.  PE: ficoeritrina.  PG: pre-germinal.  PMT: fotomultiplicador.  PreGC: pre germinal cell.  PTT: púrpura trombótica trombocitopénica. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 8  Qr: eficiencia relativa de detección de fluorescencia.  Qr: eficiencia relativa de detección de fluorescencia.  R.p.m: revoluciones por minuto.  r: coeficiente de correlación intraclase.  RDL: recuento diferencial leucocitario.  SC: compensación estándar.  SIDA: síndrome de inmunodeficiencia adquirida.  SSC: side scatter.  TBC: tuberculosis.  TNF: factor de necrosis tumoral.  VIH: virus de la inmunodeficiencia humana.  WB: whole blood.  WBL: lysed whole blood. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 9 1. INTRODUCCIÓN. La citometría de flujo (CMF) se inició en la década de los 60 como un importante avance en el proceso de contar y medir el tamaño de partículas o células en poblaciones no homogéneas. Se define como citómetro de flujo al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de células y organelas celulares (partículas biológicas) que fluyen en una suspensión celular. Los sorters tienen las mismas prestaciones y posibilidades que los citómetros de flujo pero con la capacidad adicional de separar partículas selectivamente de la suspensión líquida (Tabla 1). CONCEPTO DE INMUNOFLUORESCENCIA: el término inmunofluorescencia se usa para describir las técnicas en que se emplea un fluorocromo para marcar un anticuerpo. Ya en 1941, Coons1 informó de la aplicación de esta técnica para localizar antígenos y anticuerpos en secciones de tejido. El descubrimiento de los anticuerpos monoclonales por Kohler y Milstein2 en 1975, incrementó dramáticamente el uso de la inmunofluorescencia para la identificación de antígenos de superficie celular.2 La fluorescencia ha sido usada para visualizar ciertas moléculas y estructuras por medio de la microscopia óptica durante muchos años. Esta ha encontrado una Tabla 1: parámetros medibles por citometría de flujo. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 16 Ruido de fondo (background): Se debe eliminar la luz que no sea la emitida o dispersada por las células. Hay que tener en cuenta la llamada luz dispersada de Raman (inelástica) por el agua que pasa de ser de 488 a 529/584 nm y no se puede eliminar por filtros. Para suprimir la luminiscencia de ruido se utilizan un pinhole. Filtros: Se usan para eliminar y separar la luz recogida. Debe tener: (1) alta transmisión dentro de su banda de paso, (2) banda de paso limitada y estrecha, (3) baja autofluorescencia, (4) buena estabilidad y resistencia a la luz. Hay de dos tipos: (1) coloreados o de absorción: se usan como filtros de paso largo o "long pass", absorben la luz, y (2) de interferencia o dicroicos: reflejan la luz que tiene una longitud de onda superior o inferior a la que dejan pasar. No absorben la luz, sólo la reflejan. 1. 3. 2. FUENTES DE LUZ. Existen láseres sintonizables o de emisión fija. Pueden ser refrigerados por agua o aire (menor potencia). Los más empleados son los de Argón o Kriptón. Actualmente cada vez más se emplean los láseres de Argón de baja intensidad (10-15 mW) refrigerados por aire y que pueden ser usados en la mayor parte de aplicaciones citométricas. También se pueden usar lámparas de arco de Mercurio o Xenón, pero su emisión decrece con el tiempo y son menos estables. Las ventajas más importantes de los citómetros con láser frente a los de lámpara son: mejor rendimiento para FITC, posibilidad de iluminación con dos o más láseres, y posibilidad de sorter celular. 1. 3. 3. DETECTORES. Existen dos tipos de detectores de la luz: los fotomultiplicadores y los fotodetectores diodos o de estado-sólido. Fotomultiplicadores (PMT): se usan para la detección de la señal de fluorescencia y luz dispersada a 90 grados. Tienen una buena ratio señal/ruido, aunque se eficiencia cuántica es baja. Hay dos tipos diferentes que se llaman end-on y sidewindow, la diferencia radica que el side-window tiene mayor rendimiento cuántico para las longitudes de onda que se usan en citometría pero la alineación es crítica. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 17 Fotodetectores diodos: se usan para detectar la dispersión frontal de la luz. Son muy resistentes y eficientes (señales fuertes), pero tiene una baja ratio señal/ruido lo que los hace poco útiles para señales débiles. 1. 3. 4. CÁMARAS DE FLUJO: Son muy diferentes según sea la fuente de iluminación de aparato. Citómetros con fuente de iluminación láser: Se basan en la cámara de flujo descrita por Crosland-Taylor (enfoque hidrodinámico). Hay dos tipos: las cerradas y las abiertas (detección en "chorro en aire"). Las cámaras cerradas consiguen flujos laminares con velocidades de flujo inferiores y producen menos ruido lumínico, en cambio no permiten una fácil eliminación de los coágulos o suciedad. Citometros con fuente de iluminación de arco: hay varios sistemas, ya sean abiertos o cerrados. Generalmente los sistemas son más complejos que los de los citómetros basados en la iluminación tipo láser. Imagen 4: boquilla de un citómetro de flujo. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 18 1. 3. 5. SISTEMAS DE INYECCIÓN DE LA MUESTRA. Es muy importante que la velocidad sea constante (la velocidad óptima depende de la aplicación). Hay dos sistemas: (1) por presión, y (2) por inyección isovolumétrica por jeringa (permite velocidades inferiores de flujo y contar las células). 1. 3. 6. COMPONENTE ELECTRÓNICO. Los pulsos detectados por los fotodetectores pasan a un amplificador y después son convertidos de señal analógica a digital. Se pueden efectuar amplificaciones lineales a 256 canales (8 bits), 1024 canales (10 bits) o bien logarítmicas (3 ó 4 décadas). Existe la posibilidad de seleccionar un umbral de señal (las señales inferiores al umbral son desechadas). Después del procesamiento informático de la señal se obtienen histogramas mono o biparamétricos. 1. 4. PRESTACIONES DE LOS CITÓMETROS. Se evalúan en función de varios parámetros: 1.- Sensibilidad: cantidad mínima de moléculas de un fluorocromo determinado que pueden ser medidas con cierta precisión (resolución), para la luz dispersada, es el tamaño menor o índice de refracción que puede ser medido con cierta precisión. Depende de muchos factores, incluso del fluorocromo. Se puede decir que la sensibilidad aumenta si se disminuye la velocidad de flujo (paso) manteniendo constante el diámetro del flujo interno (muestra). 2.- Resolución (expresado como coeficiente de variación): es la reproductibilidad de la señal producida por idénticas células o partículas. 3.- Velocidad de medida: es la velocidad media máxima a la que las células pueden ser medidas sin exceder una frecuencia determinada de coincidencias (dos células detectadas como una sola). En los citómetros láser oscila alrededor de 5.000 células/segundo. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 19 1. 5. CONSIDERACIONES SOBRE DETERMINADOS ASPECTOS DE LOS CITÓMETROS DE FLUJO. LOS CITÓMETROS DE FLUJO SEPARADORES. Propiedades hidrodinámicas de las cámaras de flujo de los citómetros de flujo: todos los citómetros de flujo comparten un aspecto común: las partículas son obligadas a fluir hacia una región sensible donde se miden sus propiedades o características. En los citómetros se necesita que las partículas fluyan con una trayectoria bien definida en el seno de un fluido de arrastre, que sea estrecha y estable; es decir que se requiere la presencia de un flujo laminar en la cámara de flujo (el flujo laminar se caracteriza por la no mezcla de las líneas de flujo del sistema; es decir que en un tubo en el que fluye un líquido en régimen laminar si se introduce un colorante, éste fluye por el sistema como una línea más o menos estrecha sin mezclarse con el líquido circundante). En 1883 Reynolds describió las características del flujo laminar y el número que lleva su nombre. Principio Coulter. Medición de tamaño por resistencia eléctrica: Coulter describió en los años 50 un método para contar y medir el tamaño celular. Las partículas suspendidas en un electrólito pasan a través de un agujero estrecho y corto, la resistencia eléctrica de las partículas y el medio debe ser suficientemente diferente. Una corriente constante se mantiene a través del orificio por dos electrodos, uno a cada lado. Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza al electrólito y produce un cambio en la resistencia eléctrica del sistema. Se demuestra que los pulsos son directamente proporcionales al tamaño de la partícula. Algunos citómetros incorporan éste principio para contar y medir el volumen celular. Dispersión de la luz y citometría: la dispersión de la luz es un fenómeno complejo que tiene importantes usos en citometría, particularmente en discriminación celular. Se emplea la luz dispersada a 90 grados que es función de la estructura celular (diferencia de índices de refracción en la célula) y la luz dispersada a bajo grado (0,5 - 2/10/15 grados) que es función del tamaño celular. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 20 También se ha empleado la luz polarizada para diferenciar varios tipos de leucocitos, o la dispersión multiángulo. Electrónica y procesamiento de la señal: es un aspecto muy importante, sobre todo para el proceso de sorting. Actualmente se encuentran disponibles un gran número de programas informáticos para el estudio de las señales medidas por los citómetros. Separación (sorter) por citometría de flujo de partículas biológicas: los citómetros de flujo sorters separan células individualizadas en función de características determinadas cuando han pasado (fluyendo) por uno o más mecanismos detectores. Tienen menor potencia que las técnicas de separación masiva (centrifugación, etc...), pero permiten separaciones que estas técnicas no consiguen. Ahora se puede hacer separación magnética semejante al sorter. Los sorters se caracterizan por:  Recuperación (recovery): porcentaje de partículas sorteadas recogidas en el colector del total de partículas activadas por el sorter.  Pureza (purity): porcentaje de partículas sorteadas recogidas que cumplen los criterios seleccionados en función del total sorteado.  Eficiencia: porcentaje de partículas activadas para sorter en función del total de partículas que cumplirían los requisitos que fluyen. La aplicación general de los sorters es la separación de subpoblaciones definidas por análisis citométrico. Tipos de sorters: a. Sorters neumáticos: Emplean jeringas, energía acústica,... para desviar el flujo líquido durante algunos milisegundos y con él la célula seleccionada. Son sistemas cerrados que son seguros en cuanto a Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 21 contaminación y evaporación, son poco complicados, baratos y adaptables. En contraposición su velocidad es muy baja. Existe algún aparato comercial que emplea este sistema de separación. b. Sorters de deflexión electrostática: Son complejos y necesitan de un gran soporte tecnológico e informático. Funcionan de un modo similar a las impresoras por chorro de tinta, y son los de mayor difusión. Son los más empleados. El primero fue descrito por Fulwyler (1965), y Bonner, en 1972, el primero en aplicar el sorter en función de señales fluorescentes. El transductor para la formación de gotas es un cristal piezoeléctrico acoplado al vibrador; la energía que se usa en muy baja y no causa daño celular. El proceso de la ruptura del flujo es función de la velocidad de oscilación y del diámetro del orificio de sorter. Debe existir un dispositivo para visualizar la formación de las gotas (cámara estroboscópica), compensación de carga de las gotas, detector de coincidencias y abortador de sorter. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 22 c. Sorters de alta velocidad: Pueden reducir de 5 a 8 veces el tiempo necesario de sorter. Un sorter convencional produce 20-40.000 gotas/segundo y procesa alrededor de 2-3.000 partículas/segundo; el los sorters de alta velocidad se producen 200.000 gotas/segundo y se pueden procesar 16.000 partículas cada segundo, esto produce un descenso en la eficiencia. El aumento de la velocidad se consigue disminuyendo el diámetro del orificio de sorter, aumentando la frecuencia de vibración (220 Hz) y la velocidad del flujo (50 metros/segundo); ésta situación en las cámaras de flujo convencionales conduciría a la pérdida del flujo laminar pero en los sorters de alta velocidad se mantiene con diseños especiales de las cámaras, y con trayectos de alineamiento e interacción luz-célula muy cortos. 1. 6. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS. Debido a las especiales características de los citómetros de flujo, la muestra a analizar debe encontrarse en forma de suspensión monodispersa. Hay muestras como la sangre periférica, médula ósea u otros fluidos biológicos, que precisan de un mínimo procesamiento; en cambio los tumores sólidos o las muestras parafinadas necesitan de una disgregación más o menos intensa (mecánica, enzimática, etc.). En ocasiones puede ser conveniente o necesario enriquecer la concentración celular en la muestra antes de su procesamiento por citometría, ya sea para obtener una concentración celular adecuada para la incubación con los reactivos, o para acelerar el proceso de sorting. 1. 6.1. PREPARACIÓN DE SUSPENSIONES CELULARES/NUCLEARES PARA CITOMETRÍA DE FLUJO. Un factor limitante común en citometría de flujo es la disponibilidad de una suspensión celular, para estudiar sus características y relacionar o extrapolar sus resultados a fenómenos "in vivo". Para ello la suspensión celular debe cumplir una serie de requisitos: (1) representatividad del tejido, (2) suspensiones celulares de alta Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 23 calidad, con pocos agregados y bajo coeficiente de variación (CV), (3) preservación de las características celulares, y (4) suficiente muestra celular. Disgregación de material fresco (células): cuando el tejido es sólido se emplean métodos mecánicos o enzimáticos basados en tripsina, proteasas, colagenasas, hialuronidasas, DNAasa o cocktails de ellas. Todos estos procedimientos tienen limitaciones (alteración de las características celulares o antígenos de membrana) y varía su efectividad según el tipo de tejido. Si queremos analizar en inmunofenotipo de superficie debemos emplear sólo métodos mecánicos o asegurarnos que los antígenos celulares no son destruidos por el procedimiento. Disgregación de material fresco (núcleos): la preparación de suspensiones nucleares es una alternativa para el análisis del ADN. Vindelow fue el primero en desarrollar un buen método. Es importante hacer notar que los métodos líticos no conducen a una disminución del número de mitosis puesto que éstas se retienen (comprobado por microscopía) por puentes intercromosómicos. Disgregación de material parafinado: procedimientos basados en el método desarrollado por Hedley en 1983. Sirve para muestras archivadas con más de 10 años de antigüedad. En un 10-15 % de casos se obtienen CV superiores al 10 % que no permiten el análisis del ciclo celular. Se obtienen histogramas casi idénticos si el tumor es procesado en fresco o después de parafinización, si no hay pérdida celular selectiva durante el procesamiento; además los índices de ADN son casi idénticos y sólo se advierte una disminución del porcentaje de aneuploidías en tumores con índices de ADN muy bajos (por el aumento del CV de los picos). Se pueden procesar y estudiar las muestras con patrones internos de ploidía (hematíes de pollo), pero en los tumores suele quedar algo de población normal residual y es mejor emplear estas células como control de diploidía de ADN. Para analizar los histogramas de ADN hace falta software especial (discriminación de ruido continuo por núcleos cortados, aproximación matemática para el cálculo de las fases). Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 24 1. 6. 2. ENRIQUECIMIENTO CELULAR. Existen diversos métodos de separación y enriquecimiento celular basados en las características físicas, químicas y funcionales de las células. Los más empleados son los basados en el tamaño y densidad celular (centrifugación). El enriquecimiento previo en citometría beneficia sobre todo al sorting. Suponiendo igual pureza, tiempo muerto y generación de gotas, si se aumenta la riqueza celular de las partículas a sortear en la suspensión celular se aumenta el flujo de partículas seleccionadas, aumentándose el número de eventos procesados y activados, y por lo tanto la velocidad de sorter. Para una concentración de células a sortear de 0,1 que se aumenta a 0,8 se aumenta la velocidad de sorter en 44 veces. 1. 7. FLUOROCROMOS PARA CITOMETRÍA DE FLUJO. Los fluorocromos ofrecen un método sensible para obtener información acerca de la estructura, función y vitalidad de las células. Hay dos modos de uso: (1) unión covalente del fluorocromo a moléculas que se unen específicamente a componentes celulares, y (2) fluorocromos que varían sus características en función del microambiente que les rodea. Imagen 5: principales fluorocromos, color de emisión, excitación y emisión máxima. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 25 Las propiedades ideales de un fluorocromo son: (1) alto coeficiente de extinción a la longitud de onda de excitación (probabilidad de absorber la luz), (2) alto rendimiento cuántico (emisión de luz), (3) elevada fotoestabilidad, (4) corto estado de exitación. Si el fluorocromo va a estar unido a algo, éste ser insensible a cambios de pH, polaridad y microambiente. Recordar que a longitudes de onda inferiores a 500 nm se produce una alta autofluorescencia celular debido a las flavinas. 1. 7. 1.- TÉCNICAS INMUNOFLOURESCENTES Marcadores fluorescentes de unión covalente: Son fluorocromos que reaccionan y se usan para marcar proteínas, lípidos, o bien otras moléculas biológicas. Deben ser suficientemente selectivos y reactivos. Se emplean cromóforos con grupos isotiocianato, clorotrirzinil, y ésteres de succinimida, por su capacidad de unión. El fluorocromo más empleado es la FLUORESCEINA. Otros que se han descrito y empleado son: rodamina, Texas red, cianinas (láseres diodos), etc., pero el más famoso es la FICOERITRINA (ficobiliproteína) por su gran absorción, rendimiento y fotoestabilidad; además se puede excitar a 488 nm pero emite más allá del espectro de la fluoresceína permitiendo el doble análisis con un solo láser. Avances recientes son el uso de sondas de ADN unidas a fluoresceína, y los anticuerpos anti-bromodeoxiuridina para el estudio del ciclo celular. Actualmente se ha generalizado el estudio multiparamétrico de antígenos celulares con el empleo simultáneo de 3 y 4 anticuerpos conjugados cada uno con fluorocromos con diferente longitud de emisión (FITC; R-PE, PerCP, AFC, tándems de fluorocromos,…). 1. 7. 2. FLUOROCROMOS QUE SE UNEN NO COVALENTEMENTE A ESTRUCTURAS CELULARES. Son fluorocromos que debido e su especial composición molecular se unen a determinados componentes celulares.  Marcadores del contenido en ADN y ARN: Según el tipo son más o menos específicos para el ADN, ARN, o determinadas bases. Se emplean Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 32 análisis paramétrico se emplean métodos matemáticos, y en el caso del ADN se asemejan los picos a gaussianas volumétricas. Dada la gran información que manejan se necesitan ordenadores muy potentes. En el análisis multiparamétrico la principal dificultad es la limitación humana de poder manejar cómodamente y de forma comprensible información relativa a más de tres variables simultáneamente. Se necesitan modelos matemáticos de componentes principales, agrupación y clasificación para analizar la compleja información. La información se representa en forma de múltiples histogramas mono/biparamétricos, cubos tridimensionales, y matrices de datos. 1. 10. TÉCNICAS INMUNOFLUORESCENTES, INMUNOFENOTIPAJE: Durante el proceso de diferenciación y maduración celular se expresan genes que son necesarios para el correcto desarrollo y función celular. Algunos de los productos específicos del gen se expresan en la superficie celular, mientras que otros son intracelulares. Ello permite caracterizar subpoblaciones celulares. La respuesta inmune se desencadena cuando una sustancia extraña (antígeno) entra en el organismo. Una parte de los linfocitos B se estimulan y secretan proteínas llamadas inmunoglobulinas (anticuerpos) que neutralizan las sustancias extrañas. Un linfocito B sólo sintetiza un solo tipo de inmunoglobulina. Las pruebas inmunológicas se han visto ayudadas por el desarrollo de la tecnología de los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos tienen dos terminaciones: una responsable de la especificidad (Fab), y otra región constante (Fc). Tienen una exquisita especificidad y pueden distinguir entre pequeñas diferencias de estructuras tridimensionales. Imagen 7: estructura de un anticuerpo. Se pueden observar las dos terminaciones: extremo variable y constante. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 33 El fluorocromo que se conjuga al anticuerpo actúa como un simple marcador con el que se pueden marcar distintos anticuerpos (facilita la estandarización del sistema óptico del citómetro). La unión del anticuerpo a la célula no la mata, lo cual permite establecer sorters para posterior caracterización funcional o bioquímica en función de marcadores celulares de superficie. Factores limitantes que deben ser tenidos en consideración es que la frecuencia relativa de las células condiciona la estrategia de marcaje para su búsqueda; otra es la elevada diferencia de expresión en la superficie celular de los antígenos (incluso en poblaciones clonadas). La estrategia también depende de lo precisos que deban ser los resultados. 1. 10. 1. INCREMENTO DE LA SEÑAL/RUIDO. Para conseguir lecturas precisas hay que procurar aumentar la razón entre la señal específica y el ruido de fondo que enmascara los resultados. Se describen a continuación diversos procedimientos para mejorar la lectura de los métodos inmunofluorescentes. 1. 10. 1. 1. AUMENTO DE LA SEÑAL FLUORESCENTE. a. Antisueros: es la mezcla de inmunoglobulinas que quedan en la sangre después de dejarla coagular; es por lo tanto una mezcla de anticuerpos heterólogos. Son necesarios antígenos puros para inmunizar y el suero necesita de repetidas purificaciones para que sea suficientemente específico. Tienen la ventaja frente a los anticuerpos monoclonales que son heterogéneos y pueden reconocer diferentes partes de la molécula del antígeno, y el resultado final es que producen una señal fuerte de fluorescencia. b. Anticuerpos monoclonales: puestos a punto mediante la tecnología de los hibridomas en los que células inmunocompetentes contra antígenos conocidos se fusionan con células mielomatosas. Los clonas resultantes producen cantidades de anticuerpo monoclonal que puede ser purificada y obtenido indefinidamente. La Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 34 ventaja es que no se necesita de antígenos puros para inmunizar puesto que se seleccionan células determinadas y el anticuerpo es muy específico (se elige el mejor, más específico, más fácil de conjugar con el fluorocromo, etc.). c. Tinción inmunofluorescente: se pueden usar técnicas directas (poco background pero fluorescencia débil) o indirectas (aumenta el background pero aumenta la fluorescencia por amplificación de la unión). Para reducir el marcaje inespecífico por receptores Fc se pueden emplear fragmentos F(ab´)2 o la técnica de la streptavidina-biotina. d. Selección del fluorocromo: el espectro de absorción del fluorocromo debe ser cercano al espectro de emisión de la fuente de luz; el coeficiente de extinción (probabilidad de absorber la luz) debe ser alto (PE >> FITC), recordar que puede ser modificado al unir el fluorocromo al anticuerpo; el rendimiento cuántico (probabilidad de emitir fotones al absorber luz) debe ser alto (PE > FITC), y el espectro de emisión debe ser diferente al de emisión para separar la señal, y diferente del segundo fluorocromo si se desea hacer doble marcaje. Es importante el tamaño del conjugado, sobre todo con la ficoeritrina, puesto que puede hacer insoluble al complejo PE-AcMo, y también es importante el número de moléculas unidas al anticuerpo, porque si aumenta, aumenta la fluorescencia, hasta que por proximidad se produce artefactuación de la emisión o del espectro. Varios fluorocromos se han usado mayoritariamente en citometría:  Fluoresceína (FITC): se excita bien a 488 nm, su rendimiento cuántico es de 0,5.  Tetrametilrodamina y derivados: está siendo reemplazado por la ficoeritrina ya que no se excita bien con láseres iónicos.  Ficoeritrina (PE): hay dos tipos: B y R. Mejor la R que la B porque se excita mejor a 488 nm. Ideal para el doble marcaje con fluoresceína. Es de difícil conjugación con los anticuerpos.  Otros: PerCP, Cy5, y otros, como: Texas red con un pico de absorción a 596 nm, y aloficocianina que absorbe a 650 y emite a 660: para triple y cuádruple marcaje con varios láseres. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 35 1. 10. 1. 2. DISMINUCIÓN DEL BACKGROUND Y RUIDO. El factor limitante de las técnicas de inmunofluorescencia no suele radicar en el equipo sino en la muestra: marcaje inespecífico y autofluorescencia. Background (marcaje inespecífico): se puede reducir utilizando sólo la parte F(ab´)2 de los anticuerpos, evitar células muertas que captan al anticuerpo de modo inespecífico (o discriminar con ioduro de propidio); procesamiento de controles negativos y selección de señal inespecífica, corrección informática de solapamiento espectral en doble marcaje. Hay que tener en cuenta el proceso de transferencia de energía cuando se marca con dos fluorocromos (muy cercanos en el espacio). Autofluorescencia: la cantidad de autofluorescencia depende del tipo celular y de su estado de activación, y se atribuye a las flavinas y otras coenzimas. Depende también de la longitud de onda del láser (disminuye al aumentar la longitud de onda). También hay que eliminar el ruido producido por el aparato con filtros ópticos eficientes y compensación de color. Otras técnicas para aumentar la señal/ruido: aumentar la frecuencia relativa de las células deseadas en una población heterogénea mejora su discriminación del restante de células: ello se puede conseguir purificando las células antes de su procesamiento por citometría (lisis de los hematíes centrifugación, etc.) o bien con análisis multiparamétrico (emplear dispersión frontal y lateral de luz para diferenciar a los linfocitos, la resistencia eléctrica para discriminar en función de tamaño, ioduro de propidio para eliminar las células muertas, etc..). Almacenamiento de las muestras: las partículas o células deben ser analizadas inmediatamente después del marcaje inmunofenotípico o deben ser fijadas. Las células vivas se deben guardar en medios de cultivo y con un 0,1 % de NaH3 en hielo (4 grados) para evitar cambios en las condiciones biológicas. Si se puede (no se precisa viabilidad celular) las células se pueden fijar en un 1 % de paraformaldehido en PBS y guardar a 4 grados en oscuro, con lo que no disminuye la fluorescencia ni cambian las características de dispersión de la luz y se puede demorar la lectura varios días. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 36 1. 11. ESTUDIO CITOMÉTRICO EN EL ANÁLISIS DE LINFOCITOS B. 1. 11. 1. LINFOPOYESIS DEL LINFOCITOS B Los linfocitos B derivan también de una célula germinal linfoide pluripotente y adquieren su competencia inmunológica, en el hombre, en la médula ósea y otros equivalentes de la bursa de Fabricio de las aves, como el hígado fetal, y posiblemente, la placenta. Antes de llegar al estadio de célula pre-B, los precursores más inmaduros de célula B, denominados linfocitos pre-pre-B, pueden ser identificadas fenotípicamente mediante anticuerpos monoclonales. Estas células expresan antígeno HLA-DR y son positivas a los antígenos CD 19, CD 24, CD 10, así como a la enzima TdT. No poseen Igs, pero sí reordenamiento genético respecto del patrón de la línea germinal. El linfocito pre-B presenta todavía TdT y el antígeno Cd 10. Además expresa los antígenos HLA-DR, CD 19, CD 24 y aparecen los CD20 y CD 22. En cuanto a la expresión de las Inmunoglobulinas, este estadio es el primero en el que se pueden identificar cadenas pesadas m en el interior del citoplasma en ausencia de cadenas ligeras y de Ig de membrana. A medida que la maduración progresa, se pierde el CD 10, se reordenan los genes de las cadenas ligeras que se transcriben y se sintetiza y ensamblan. La célula pasa a expresar Ig M de superficie, denominándose linfocito B inmaduro. Poco después, pasa a linfocito B maduro que sintetiza también Ig D y sigue expresando los antígenos de membrana CD 19 y CD 24. También son positivos para el CD 20, CD 22 y CD 21. El CD 21 reconoce un epitopo del receptor del complemento CR 2, que a su vez constituye el receptor para el virus de Epstein-Barr. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 37 Los linfocitos maduros pasan de la médula ósea a la sangre periférica y se dirigen a los órganos linfáticos periféricos para ubicarse en los folículos linfoides. Aquí bajo un estímulo antigénico adecuado, se activan y proliferan formando el centro germinal en el interior del folículo linfoide. Los linfocitos B constituyen la minoría del pool linfocitario circulante (10%-20%), afincándose en los órganos linfáticos periféricos en las zonas B-dependientes.9 El linfocito sin memoria inmunológica de la sangre periférica procede directamente de la stem-cell, y que bajo un estímulo antigénico adecuado podría transformarse en las células centrofoliculares, haciéndose, hoy en día, sinónimo para muchos autores el término de centroblasto pequeño y el de linfoblasto. Más comprometida resulta la ubicación del prolinfocito. El prolinfocito posee un fenotipo de membrana diferente al linfocito de la leucemia linfática crónica B. La inmunoglobulina de superficie se halla en alta concentración, lo que origina una intensa fluorescencia. Igualmente con relativa frecuencia se detecta en su interior inmunoglobulina citoplasmática, careciendo prácticamente de capacidad para formar rosetas M. Todo ello sugiere que el prolinfocito representa un estadio madurativo más avanzado que el linfocito B, aunque el término de prolinfocito hiciera pensar que se trata de una célula precursora. Con todo, la mayoría de autores lo ubican fuera del folículo linfoide, muy próximo en su evolución ontogénica al tricoleucocito. La Imagen 7: representación esquemática del proceso de maduración de los linfocitos B con indicación de los marcadores de diferenciación presentes en cada etapa madurativa. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 38 participación del prolinfocito en diversas entidades que parten de zonas externas al folículo linfoide como la leucemia linfática crónica y la tricoleucemia (tricoleucemia variante), parecen favorecer tal hipótesis.9 El linfocito B activado incrementa la expresión de las inmunoglobulinas de superficie y de algunos antgenos de membrana, como el HLA-DR, CD 19 y CD 20, mientras que otros disminuyen o desaparecen como el CD 24, CD 22 y CD 21. En este momento de activación y proliferación, aparecen en la membrana nuevas moléculas que no se detectan en el estado de reposo, como son el CD 23, el receptor para la transferrina y el receptor para la interleucina 2 o CD 25, y en ocasiones el CD 10. En este estadio el linfocito B pierde la Ig D, disminuye la intensidad de la expresión de la Ig M y además, puede expresar Ig G o Ig A. Las células hendidas han recibido numerosas denominaciones: cleaved cells, germinocitos, células linfoides pequeñas y centrocitos en la clasificación de Kiel. Se caracterizan por poseer un citoplasma muy escaso e hialino en la variedad pequeña, y algo más extenso, con discreta insinuación de su basofilia, en la variedad grande. El núcleo tiene una cromatina condensada, sin nucleolos visibles a nivel óptico, en la variedad pequeña y con nucleolos visibles en la forma grande, semejando una célula blástica. Ambas subvariedades ofrecen como rasgo característico una hendidura, única o múltiple, que sólo puede iniciarse o llegar a ser tan profunda que segmente al núcleo. A veces, la incisuración es doble y simétrica, confiriéndole un aspecto riederiforme. Citoquímicamente las células hendidas se caracterizan por ser fosfatasa ácida negativas, beta-glucuronidasa negativas o sólo débilmente positivas. Las células centrofoliculares no hendidas han sido denominadas: non cleaved cells, germinoblastos, células linfoides grandes, células centrofoliculares grandes y centroblastos por el grupo de kiel. Morfológicamente son de tamaño superior a las células hendidas de gran tamaño; el núcleo es redondeado, de cromatina laxa y nucleolada. El citoplasma, moderadamente amplio, destaca por su notable pironinofilia. A medida que progresa en su estimulación aumenta de tamaño (células no hendidas grandes) hasta llegar a ser, en ocasiones, cuatro veces mayor que el linfocito normal en estado quiescente. Paralelamente al crecimiento nuclear aumenta Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 39 el grado de basofilia citoplasmática, así como la inmadurez nuclear, observándose múltiples nucleolos apuestos frecuentemente a la membrana nuclear. Citoquímicamente las células no hendidas están dotadas de escasa actividad de hidrolasa ácida. Es de destacar su gran actividad mitótica, a diferencia de las células hendidas. Los linfocitos B que han seguido el proceso de estimulación y transformación en el centro del folículo linfoide hasta el estadio de células no hendidas de gran tamaño, salen del centro del folículo y se sitúan en los cordones medulares, donde siguen aumentando de tamaño hasta transformarse en inmunoblastos, también denominados grandes células pironinófilas. Los inmunoblastos pueden seguir el proceso de estimulación hasta las células plasmáticas secretoras de inmunoglobulinas, en cuyo caso expresan el CD 23, o bien regresar al estado quiescente del pequeño linfocito B con memoria inmunológica, con expresión de CD 40 y demás características fenotípicas indistinguibles del linfocito B maduro, aunque en su membrana ya no expresarán Ig D sino Ig G o Ig M e Ig G o Ig A y poseen actividad de ATPasa y de 5´nucleotidasa. Estos linfocitos pasan a integrarse al reservorio de linfocitos B recirculantes del manto o corona. El inmunoblasto es una célula de gran tamaño (20- 30 m m) con un amplio núcleo central. En ocasiones el núcleo adopta una posición algo excéntrica indicativa de una cierta diferenciación plasmocitoide. La cromatina nuclear es extremadamente laxa, con numerosos nucleolos que no suelen estar en contacto con la membrana nuclear. El citoplasma, moderadamente extenso, se caracteriza por su intensa basofilia y pironinofilia (gran célula pironinófila). Citoquímicamente los inmunoblastos denotan escasa actividad de hidrolasas ácidas. Las células plasmáticas, secretoras de inmunoglobulinas, representan el estadio final de la transformación antigénica del pequeño linfocito B. En este estadio las inmunoglobulinas (Ig), en lugar de expresarse en la membrana, pasan a ser secretadas y pueden ser fácilmente detectadas en el citoplasma. La célula plasmática expresa el CD 38 y se localizan en los cordones medulares de los ganglios linfáticos, bazo, timo, médula ósea, piel e intestino. En procesos reactivos pueden pasar a la sangre periférica. La célula plasmática tiene un tamaño de 12 a 15 mm, y forma ovalada. El Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 40 núcleo, casi siempre excéntrico, posee una cromatina condensada en fuertes cúmulos cuya disposición radial adopta el aspecto morfológico "en rueda de carro"; el eje mayor del núcleo forma un ángulo recto con el eje mayor de la célula, lo cual es muy característico. El citoplasma es abundante e intensamente basófilo en toda su extensión, excepto en la zona centrosómica de la célula donde adquiere una tonalidad blanquecina (arcoplasma de configuración semilunar y situación paranuclear). Está desprovisto de granulación, pudiendo contener algunas vacuolas o bien cuerpos de Russell, que son inclusiones de 2 o 3 m m, de color rosa claro o incoloras, y que corresponden a inclusiones inmunoglobulínicas. La célula de Mott corresponde a una célula plasmática con gran cantidad de estas inclusiones, que la convierten en una especie de mórula. En ocasiones, las inclusiones inmunoglobulínicas adoptan una estructura cristalina. El citoplasma de la célula plasmática puede adoptar una coloración rojo-violácea, aspecto denominado "flameado", y que es debido a la presencia de gran cantidad de glicoproteinas acumuladas en los sacos ergastoplásmicos. La excentricidad del núcleo y la intensa basofilia citoplasmática permiten la fácil identificación de este tipo celular. 1. 11. 2. THE FREIBURG, PARIS AND EUROCLASS CLASSIFICATIONS. Para cuantificar los linfocitos B totales se utiliza el marcador CD19. Por otro lado, en los linfocitos B activados se pierde la expresión de las moléculas CD21, CD22 y CD24, hay un incremento en la expresión de moléculas HLA-DR y de receptores de linfocinas (por ejemplo el receptor de la IL-2) y aparecen marcadores nuevos, como el CD23, ausente en linfocitos B en reposo. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 41 La clasificación propuesta por los grupos científicos de Freiburg (Alemania) y París (the Freiburg, Paris and EUROClass Classifications) se basa en la cuantificación de las subpoblaciones de los linfocitos B de memoria en sangre periférica, identificadas mediante citometría de flujo, utilizando como marcadores anticuerpos anti-IgD y CD27.10-12 La molécula CD27 pertenece a la familia de los genes del receptor de factor de necrosis tumoral (TNF). Se expresa en un subgrupo de linfocitos B en sangre y ganglios linfáticos y en la superficie de los linfocitos T circulantes. En el curso del desarrollo del linfocito B virgen o naive (linfocito B IgD+, IgM+) que sale de médula ósea y sigue su proceso de maduración y diferenciación a célula plasmática, o linfocito B de memoria, en los tejidos secundarios, la mayoría de los linfocito pierda la expresión de IgD e IgM de su superficie. En la sangre periférica humana, los linfocitos B que expresan CD27 (linfocitos CD 27+) se subdividen en al menos dos grupos: a) Unswitched Memory: células que mantienen la expresión de Ig D e Ig M (linfocitos CD27+ IgD+ IgM+) y b) Switched Memory: células que no (linfocitos CD27+IgM-IgD-). Los linfocitos B CD27+ IgD- IgM- Imágen 8: desarrollo del linfocito B a lo largo de la médula ósea y órganos linfoides. En la parte inferior se pueden observar los marcadores de superficie que podemos encontrar en cada una de las subpoblaciones expresadas; necesarios para distinguir en el citómetro cada una de estas subpoblaciones (Imagen cedida por Dr. Iñaki Sanz). Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 48 3. 1. 1. 5. INSTRUMENTO. La solución lisante FACS está diseñado para citómetros de flujo que tengan el sistema informático y el software adecuados. Los citómetros de flujo deben poder detectar la dispersión frontal (FSC) y lateral (SSC) de la luz. 3. 1. 1. 6. OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS. Extraer la muestra asépticamente por punción venosa22,23 en un tubo estéril VACUTAINER® de recolección de sangre con K3 EDTA (tapa color lila). Se deben seguir las instrucciones del fabricante sobre la cantidad mínima de sangre que debe ser conseguida. Almacenar la sangre anticoagulada a temperatura ambiente (20º a 25ºC) hasta que esté lista para la tinción y la lisis. Consultar las instrucciones sobre restricciones de almacenamiento antes de la tinción en los folletos de instrucciones de los reactivos correspondientes. 3. 1. 1. 7. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS. Las muestras de sangre se tiñen siguiendo las instrucciones específicas de cada reactivo que aparecen en el folleto respectivo. Los glóbulos rojos se lisan siguiendo las instrucciones de utilización de la solución lisante FACS diluida (1X). Se debe tener cuidado de proteger los tubos de la luz directa. El procedimiento de debe llevar a cabo a temperatura ambiente (20º a 25ºC). 3. 1. 1. 8. LIMITACIONES. Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos normales de referencia para cada parámetro del reactivo que pueda ser afectado por la técnica de preparación o por la edad y el sexo del paciente. La raza del paciente también puede tener influencia,24 sin embargo no hay suficientes datos para asegurarlo. Cuando se establece un rango de referencia se deben conocer el sexo, la edad, las características clínicas y la raza de las personas. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 49 La solución lisante FACS está diseñada específicamente para usarse con los citómetros de flujo de la marca FACS de BD. EDTA es el anticoagulante de elección. La lisis puede ser incompleta en las muestras que contienen glóbulos rojos nucleados ya que la solución lisante FACS no los lisa. Esto también puede ocurrir cuando se analizan muestras de pacientes con ciertos trastornos hematológicos en los cuales los glóbulos rojos son difíciles de lisar como pueden ser la mielofibrosis, la anemia de células falciformes, la talasemia y la esferocitosis.19 Cuando se utilizan reactivos monoclonales que reaccionan con las inmunoglobulinas del suero, las muestras de sangre se deben lavar antes de la tinción y la lisis con una solución salina tamponada con fosfato 1X o suero fisiológico. 25 Un anticuerpo monoclonal frente a un antígeno de superficie de la célula que está: a) liberado en el plasma (por ejemplo, el receptor IL-2) o b) ocupado por componentes plasmáticos (por ejemplo, receptores de complemento) puede dar una intensidad de tinción reducida cuando el análisis se hace con métodos que utilizan sangre entera lisada. 3. 1. 1. 9. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO. 3. 1. 1. 9. 1. PRECISIÓN. Se obtuvieron muestras de 17 donantes normales y 61 con anormalidades en dos centros clínicos para procesarlas con el reactivo TriTEST (CD3/CD4/CD45). Tres alícuotas de cada muestra se tiñeron, lisaron y analizaron en citómetros de flujo FACScan. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 50 En otro centro clínico se evaluó la reproducibilidad intra-muestra del reactivo Simultest (CD3/CD4). Las determinaciones se hicieron en muestras de sangres de seis sujetos normales y cuatro pacientes (VIH y trasplante renal). Se prepararon dos alícuotas de la misma muestra de sangre con el panel de reactivos Simulteest IMK para linfocitos y cada alícuota se analizó dos veces en el mismo citómetro de flujo FACScan. 3. 1. 1. 9.2. RECUPERACION DE GLÓBULOS BLANCOS. Cinco muestras de sangre se trataron con la solución lisante FACS, se lavaron y analizaron para evaluar la recuperación de glóbulos blancos usando el analizador hematológico clínico ELT-1500™®. Cuando se comparó con el recuento total de glóbulos blancos, el promedio de recuperación después de utilizar la solución lisante fue del 92%. GL: grados de libertad: el número de observaciones, menos el número de medias, multiplicado por el número de sujetos (n). GL: grados de libertad: el número de observaciones, menos el número de medias, multiplicado por el número de sujetos (n). Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 51 3. 1. 1. 9.3. LISIS DE LOS GLÓBULOS ROJOS. Cinco muestras de sangre se trataron con la solución lisante FACS, se lavaron y analizaron para evaluar la presencia de glóbulos rojos residuales usando el analizador hematológico clínico ELT-1500™®. No se detectaron glóbulos rojos residuales. 3. 1. 2. FIJADOR: FORMALDEHÍDO AL 5%. 3. 1. 2. 1. PROPIEDADES QUÍMICAS. El formaldehído, HCHO, también conocido como formalina, formol, aldehído fórmico, metanal, es el primer miembro de las series de los adehídos alifáticos. Es uno de los químicos orgánicos más importantes utilizado hoy en día en una gran cantidad de actividades y aplicaciones, sobre todo para la fijación de muestras (ver imagen 11). A la temperatura ordinaria el formaldehído es un gas incoloro, inflamable, de olor muy irritante. Es soluble en el agua y los disolventes orgánicos usuales, pero insoluble en el éter de petróleo. En la práctica, este compuesto se suministra bajo la forma de soluciones acuosas a concentraciones diversas (37-50% en peso). Son líquidos incoloros, de olor picante, miscibles con agua. Contienen alcohol metílico (hasta un 15 %) y trazas de ácido fórmico y ácido acético. Imagen 11: estructura bioquímica de formaldehído. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 52 Algunas de sus características, son:  Peso molecular 30.03  Punto de fusión - 92oC  Punto de ebullición (760 mm Hg) -19.5 oC  Densidad (20 oC) 1.09 (g/cm3)  Densidad de vapor 1.075  Tensión de vapor - 88 oC 10 mm - 70.6 oC 40 mm - 57.3 oC C 100 mm - 33 oC 400 mm  Límite de explosividad (%vol) en aire  Límite inferior 7%  Límite superior 73%  Temperatura de auto ignición 300-430 oC. Puesto que el formaldehído puro es un gas a las temperaturas ordinarias y no puede manejarse fácilmente en ese estado, se comercializa principalmente en forma de solución acuosa (por lo general con 37% de HCHO en peso) y del polímero sólido hidratado, para-formaldehído (CH2O)n.H2O. El formaldehído es un compuesto extremadamente reactivo. Se polimeriza muy fácilmente, incluso en frío, dando polímeros insolubles que enturbian las soluciones acuosas. Para evitar este inconveniente se les añaden estabilizantes, particularmente alcohol metílico. Los oxidantes reaccionan enérgicamente con el formol. La mayoría de las reacciones de oxidación conducen a la formación de ácido fórmico, y la oxidación completa da lugar a anhídrido carbónico y agua. A pesar de su fuerte reactividad, es un compuesto relativamente estable. El calor no lo descompone sensiblemente más que por encima de 300ºC, con formación de Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 53 óxido de carbono e hidrógeno. Esta descomposición está favorecida por ciertos catalizadores 3. 1. 2. 1. 1. SOLUCIÓN DE FORMALDEHÍDO Las propiedades del formaldehído acuoso dependen de que en el estado disuelto esté polimerizado e hidratado. Puesto que suele manejarse como solución la composición y las propiedades del sistema formaldehído-agua tiene especial importancia. El formaldehído disuelto es esencialmente una mezcla en equilibrio. Sin embargo, el espectro de absorción ultravioleta indica que hay pequeñas cantidades del monómero no hidratado en algunas condiciones de temperatura y concentración. Ese estado de equilibrio depende de la concentración y temperatura. En concentraciones del 2% o menos el formaldehído está prácticamente de glicol metilénico, en concentraciones mayores, la solución contiene proporciones crecientes de polímeros hidratados, y aumenta el grado de polimerización al aumentar la concentración del formaldehído disuelto. La rapidez con que se alcanza el equilibrio, después de un cambio de temperatura o concentración, es pequeña a temperaturas bajas y exige más de dos días a 0ºC. Las soluciones concentradas (más de 30% de HCHO) tienen que conservarse calientes si se quiere evitar la precipitación. Los alcoholes, como el metanol aumentan la estabilidad de la solución, por la formación de hemiacetales. La presión parcial del formaldehído en equilibrio con la solución es baja y es una función de la concentración del glicol de la concentración del glicol metilénico más que del contenido total del formaldehído. Las moléculas de formaldehído están en un grado considerables asociadas al estado gaseoso y la presión parcial del gas puede considerarse cono la presión de descomposición del hidrato disuelto. Estos factores explican el hecho de que las soluciones de formaldehído pueden concentrarse por evaporación al vacío a temperatura baja, mientras que la destilación a presión y temperatura elevada hace Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 54 posible obtener destilados concentrados partiendo de soluciones diluidas. Por destilación a presiones ordinarias sin rectificación, el residuo en el destilador está siempre algo más concentrado que la solución destilada. La condensación fraccionada de los vapores de solución en ebullición da como resultado un aumento de formaldehído en el vapor no condensado, ya que el agua es el componente menos volátil de la mezcla. El formaldehído monomérico físicamente disuelto (CH2O) está solo presente en soluciones acuosas a concentraciones de hasta el 0,1% en peso. Las soluciones de formaldehído en agua contienen formaldehído en la forma de glicoles (Oligómeros del metilenglicol) de acuerdo a la siguiente reacción de polimerización: HOCH2OH + n CH2O HO(CH2O)n+1H El formaldehído es sumamente activo y se combina químicamente con casi todos los tipos de compuestos orgánicos, con excepciones de las parafinas. Puede emplearse en forma de monómero anhídro, solución o polímeros con resultados equivalentes. Por reducción el formaldehído se convierte en metanol, la oxidación da ácido fórmico o gas carbónico. La reacción de Cannizzaro en solución acuosa da ácido fórmico y metanol en proporción equimolares: 2 HCHO + H2O HCOOH + CH3OH Esta reacción es acelerada por los álcalis que explica el aumento gradual en la acidez de las soluciones comerciales en almacenamiento prolongado. El formaldehído reacciona consigo mismo en condensación del tipo de aldol para dar los hidroxialdehídos inferiores, hidroxicetonas y hexosas. Esta reacción es autocatalítica y es favorecida por condiciones alcalinas. El general, las principales reacciones químicas del formaldehído con otros compuestos implican la formación de derivados de metilol o metileno. Las Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 55 policondensaciones conducen a la formación de resinas de peso molecular elevado en las cuales las moléculas del otro reactivo están enlazadas por los grupos metilenos. Los catalizadores alcalinos favorecen la formación de derivados del metilol, mientras que los ácidos suelen favorecer la producción de metileno. Los derivados del metilol son probablemente los productos primarios de la reacción, pero en muchos casos son muy activos y sufren reacciones de condensación para formar derivados metilénicos incluso en condiciones alcalinas. Con catalizadores ácidos, el formaldehído y los alcoholes, los glicoles y los compuestos alifáticos polihidroxilados reaccionan para dar formales (éteres de metileno), mientras que en condiciones neutras o alcalinas se producen hemiacetales inestables. El formaldehído reacciona con los halogenuros de hidrógeno y los alcoholes para dar éteres a-halométicos. El fenol y muchos sustituidos forman compuestos del metilol (alcoholes fenólicos), que sufren una policondensación para dar resinas de fenol - formaldehído. El grupo metilol entra en las posiciones orto y para sobre el núcleo bencénico; si estas posiciones están bloqueadas no pueden producirse las condensaciones nucleares ordinarias. Los catalizadores ácidos conducen a una policondensación inmediata y en general no permiten el aislamiento de los derivados del metilol sencillos, que es a menudo posible se emplea álcalis. El amoníaco y las aminas se condensan fácilmente con el formaldehído para dar derivados de metilenos sencillos o cíclicos, pero las aminas terciarias no reaccionan. La reacción de Mannich implica la condensación de amoníaco, una amina primaria o una amina secundaria, por lo general en forma de clorohidrato con formaldehído y un compuesto que posee uno o varios átomos activos de hidrógeno. Cuando se calienta el formaldehído con aminas o sales de amonio en condiciones ácidas, se reducen los productos primarios de metilaminas: Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 56 NH4Cl + 2 HCHO CH3NH2.HCl + HCOOH CH3NH2.HCl + 2 HCHO (CH3)2NH.HCl + HCOOH (CH3)2NH.HCl + 2 HCHO (CH3)3N.HCl + HCOOH Las amidas dan derivados de metilol relativamente estables en condiciones alcalinas. Las metilureas o ureas por condensación producen resinas de ureaformaldehído. La melamina reacciona de manera análoga a la urea y da derivados de polimetilol y resinas. Los hidrocarburos no saturados y aromáticos reaccionan con el formaldehído en presencia de ácidos fuertes. La reacción con oleofinas suele dar como resultado la formación de 1,3-glicol o un alcohol no saturado en forma de éster o formal. 3. 1. 3. BUFFER FOSFATO SALINO. SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADA POR FOSFATOS (PBS) La Solución Salina Amortiguada por Fosfatos (PBS) constituye una solución amortiguadora de pH comúnmente empleada para procedimientos bioquímicos. Su osmolaridad y concentración de iones (Cl-, Na+ y K+) es muy semejante a la del líquido extracelular de los mamíferos. Esta solución se prepara a partir de Cloruro de Sodio, Fosfato de Sodio y, en algunas formulaciones, con Fosfato de Potasio. Esta solución es isotónica y no-tóxica para las células de los mamíferos. El PBS se emplea como vehículo neutro para células, ya que no modifica el perfil de expresión y funcionamiento celular normal. Esta solución es empleada comúnmente para lavar células a través de centrifugación. El PBS puede ser empleado como diluyente para métodos de desecación de biomoléculas, ya que las moléculas de agua presentes en el PBS se adhieren alrededor de la biomolécula permitiendo inmovilizarla a una superficie sólida. Esta monocapa de agua evita que la biomolécula sea desnaturalizada (o sufra modificaciones conformacionales) en el proceso de desecación. Los amortiguadores a base de carbonatos también son empleados para este procedimiento, aunque con menor éxito. El PBS también es empleado como referencia espectral para Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 57 procedimientos de elipsometría por absorción proteica. El PBS puede ser complementado con aditivos para procedimientos específicos. La adición de EDTA, por ejemplo, permite disgregar células cuando estas forman agregados. La incorporación de Zinc, no obstante, no es recomendada ya que provoca la precipitación de otras sales constituyentes. En el campo de la citometría, el PBS se usa frecuentemente para el mantenimiento celular in vitro de periodos breves, pero si esto es para un periodo más largo es conveniente que contenga alguna proteína (HBSS o HEPES) para el mantenimiento del pH durante varias horas. 3. 1. 4. SC ANTI-MOUSE COMPENSATION STANDARD. La validez de nuestras conclusiones depende de la pureza del resultado ya que el tiempo sólo depende de la eficiencia del sorting. Se producen más gotas vacías que con células y generalmente se sortean tres gotas por evento activado. Para calcular el retardo se hacen pruebas hasta conseguir la mejor recuperación (mínimo del 95 %). Si se desea mirar también la pureza se usan bolas de dos colores (SC ANTI-MOUSE COMPENSATION STANDARD en nuestro caso) y se establece una ventana de sorter sobre unas de ellas. Cuando el número de células a sortear debe ser preciso se pueden mezclar bolas con la muestra y calcular el porcentaje de recuperación de ellas, sabiendo éste (que se cuenta durante la separación) se asume que es el mismo que para las células, y se calcula el número total de eventos a procesar para conseguir el número total de células deseadas. La monitorización en tiempo real de la velocidad de adquisición puede proporcionar información continuada de que no hay problemas en el correcto funcionamiento del citómetro. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 64 3. 1. 6. 1. 1. 3. 4. OTRAS CONDICIONES. Las concentraciones promedio de IgD en suero en fumadores de cigarro fue el doble que los no fumadores. Los niveles de IgD se normalizaron al dejar de fumar. La razón del incremento de IgD en fumadores no se conoce; la causa pudiera deberse a las infecciones que ocurren en estos individuos debido a la influencia de las sustancias presentes en el humo del tabaco.54 Un aumento de IgD en suero se demostró en pacientes con la enfermedad de Hodgkin varios meses después de la esplenectomía.55 Se encontró una correlación con el tipo histológico en pacientes depleccionados de linfocitos que tenían niveles extremadamente altos de IgD; pacientes en tratamiento tenían valores significativamente más bajos que los pacientes sin tratamiento.56 Se observó una disminución de IgD en suero después de la radioterapia, pero no después de la quimioterapia en pacientes con linfoma. En niños con Kwashiorkor se encontró una disminución de la concentración de IgD en suero, en pacientes con síndrome de Behcet, y en la vasculitis retinal idiopática.57 La concentración promedio de IgD en suero en un grupo de niños con púrpura de Schoenlein- Henöch fue significativamente mayor que en el suero de niños sanos.58 Los valores de IgD sérica fueron significativamente más elevados en pacientes con obstrucción pulmonar crónica que en individuos sanos.59 Valores elevados de IgD en suero se encontraron en pacientes con hiperparatiroidismo.40 En un grupo de pacientes con tumores en el sistema nervioso central se encontró un aumento de los niveles de IgD en suero, así como bandas oligonales de IgD en fluido espinal, lo cual sugiere que la producción de IgD en estos pacientes ocurre independientemente que la de IgG.41 Valores altos de IgD en suero fueron reportados en pacientes con aortitis y con cirrosis hepática. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 65 3. 1. 6. 1. 1. 3. 5. IgD MONOCLONAL. La medición de IgD en suero es más importante para el diagnóstico y monitoreo de gammapatías monoclonales malignas (mieloma IgD y enfermedades de cadenas pesadas). El mieloma IgD representa alrededor del 1,2 % de los mielomas múltiples.60 Tiene un curso agresivo con complicaciones extramedulares, amiloidosis, linfoadenopatía, esplenomegalia, anemia severa, proteinuria de Bence Jones y una corta supervivencia.61 El componente M que representa la IgD monoclonal, se observa en el 60 % de las electroforesis de proteínas de pacientes con mieloma IgD; el resto presenta patrones normales.62 Existe una variabilidad antigénica entre la IgD monoclonal probablemente debido a variantes alotípicas.63 Se ha demostrado IgD monoclonal con actividad de anticuerpo contra triglicéridos en pacientes con hiperlipidemia, así como IgD monoclonal con actividad de piroglobulina.64 Se han reportado pacientes con presencia de IgD monoclonal de significado indeterminado.65 3. 1. 6. 1. 2. CARACTERÍSTICAS DEL FLUOROCROMO (PE MOUSE ANTI-HUMAN Ig D). Número de catálogo: 555779 Marca: BD Pharmingen™ Nombre: IgD Tamaño: 100 test. Status regulador: RUO Clon: IA6-2 Formato: PE Isotipo: IgG2a, κ Imagen 13: imagen de células mononucleares de sangre periférica, estudiada por un citómetro tipor FACs Calibur (Ig D/CD19) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 66 Tamaño molecular: ninguno. Reactividad: humana. Aplicaciones: test de citometría de flujo. 3. 1. 6. 2. CD 19. 3. 1. 6. 2. 1. DESCRIPCIÓN GENERAL. Las células dendríticas foliculares también expresan esta molécula. La CD19, junto con CD21, CD81, Leu13, y el CMH de clase II, forman un complejo multimolecular que se asocia con el BCR. El señalamiento a través de CD19 induce la fosforilación de la tirosina, el flujo de calcio y la proliferación de los linfocitos B. 7 CD19 es una proteína codificada por un gen localizado en el cromosoma 16p11.2. 19 Tiene un peso de 95 kDa; se expresa en células de linaje B a excepción de las células plasmáticas66. CD19 forma parte del correceptor de los linfocitos B (LB) junto con CD21 y CD81 (TAPA-1). Este complejo es de vital importancia en la activación de los LB pues son capaces de transducir señales secundarias para la activación de estos por medio de la unión de CD21 a C3d, que recubre algunos antígenos (Ag) luego de la activación del complemento. CD19 cumple junto con CD21 y CD81 un papel importante en la activación de LB pues ayuda a la transducción de señales secundarias que disminuyen el umbral de activación gracias a la capacidad de CD19 para unirse a varias proteínas que participan en varias vías de señalización favoreciendo la activación de factores de transcripción.67 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 67 3. 1. 6. 2.2. CARACTERÍSTICAS DEL FLUOROCROMO (APC-Cy™7 Mouse Anti-Human CD19). Número de catálogo: 557791 Marca: BD Pharmingen™ Nombre: CD19 Tamaño: 100 test Status regulador: RUO Clon: SJ25C1 Formato: APC Isotipo: Mouse IgG1, ƙ Tamaño molecular: ninguno. Reactividad: humana. Aplicaciones: test de citometría de flujo. 3. 1. 6. 3. CD 38. 3. 1. 6. 3. 1. DESCRIPCIÓN GENERAL. Se conoce que los linfocitos B, productores de los anticuerpos, no sólo reciben la información a través de su receptor para el antígeno (abreviado como BC-R), sino también de otras moléculas de la membrana celular, conocidas como correceptores. Una de estas moléculas correceptoras es el CD38. Hasta hace algunos años se pensaba que el linfocito B que salía de la médula ósea ya estaba maduro, pero no es así; la célula sale inmadura de la médula ósea y completa su proceso de maduración en el bazo. A estas células que no están completamente maduras se les conoce como transicionales y se clasifican en 2 tipos: las células transicionales 1, que son aquellas recién llegadas al bazo, provenientes de la Imagen 14: Patrón de fluorescencia de linfocitos de sangre periférica humana normal teñidos con APC- Cy™7 Mouse Anti-Human CD19. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 68 médula ósea y las transicionales 2, que son la penúltima etapa de maduración del linfocito B y que se encuentran únicamente en el bazo.68 La molécula CD38 está presente durante casi todo el desarrollo de los linfocitos B y su expresión se modifica durante la maduración de éstos; así, la expresión aumenta en los linfocitos B transicionales 2 para disminuir nuevamente en las células maduras. Una prueba de la importancia de CD38 en la maduración de los linfocitos B se obtuvo del estudio de ratones deficientes en esta proteína, que mostraron un retraso en la maduración de los linfocitos B. También, las células transicionales 2, expresan casi 3 veces más CD38 que las transicionales 1 y la expresión de dicha molécula disminuye en las células maduras.69 Las células transicionales y maduras han sido purificadas por citometría de flujo (FACS), observándose que las células transicionales 1 no proliferan al estímulo con anti-CD38, mientras que las transicionales 2 lo hacen vigorosamente. Las células transicionales 1, no sólo no proliferan al estímulo con anti-CD38, sino que además mueren más rápidamente. También se ha estudiado su contenido en DNA, después de 12 y 24 horas de cultivo. En medio de cultivo, las células transicionales 1 mueren, y al estimularlas con anti-CD38, un mayor número de ellas entra en proceso de muerte celular programada, también conocido como apoptosis. El resultado es más dramático después de 24 horas de cultivo, donde alrededor de un 10 por ciento de linfocitos transicionales 1, cultivados únicamente en medio, se encuentran en apoptosis, en contraste con aquellas estimuladas a través del CD38, donde casi la mitad se encuentra en este proceso de muerte celular programada.70 Un linfocito B inmaduro, que reconoce un antígeno propio (autoantígeno) debe ser eliminado. No es conveniente que este linfocito llegue a madurar porque comenzaría a producir anticuerpos contra nuestro propio organismo. El encuentro de este linfocito (todavía inmaduro) con su antígeno, provoca su eliminación (muerte por apoptosis) o induce un estado de anergia (falta de respuesta). CD38 parece ayudar en este proceso, seleccionando negativamente a las células inmaduras y llevándolas a apoptosis. Así, el BCR y CD38 trabajan conjuntamente para promover una selección negativa más eficiente de células indeseables.71 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 69 En cuanto a la diferenciación de las células transicionales 2, al ser activadas con anti-CD38, se ha observado que a las 48 horas, prácticamente todos los linfocitos transicionales 2 se diferenciaron, en contraste con el medio de cultivo, donde prácticamente ninguna célula lo hizo. Por tanto, el anti-CD38 induce la maduración de los linfocitos B transicionales 2.72 Por tanto, CD38 se comunica y participa conjuntamente en la selección de las células transicionales 1 para llevarlas a apoptosis y en la selección de las transicionales 2 para llevarlas a proliferación y maduración. 3. 1. 6. 3. 2. CARACTERÍSTICAS DEL FLUOROCROMO (PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti- Human CD38). Número de catálogo: 551400 Marca: BD Pharmingen™ Nombre: CD38 Tamaño: 100 test Status regulador: RUO Clon: HIT2 Formato: PerCP-Cy 5.5 Isotipo: Mouse IgG1, ƙ Tamaño molecular: ninguno. Reactividad: humana. Aplicaciones: test de citometría de flujo. Imagen 15: Patrón de fluorescencia de linfocitos de sangre periférica humana normal, teñidos con PerCP- Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD38. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 70 3. 1. 6. 4. CD 27. 3. 1. 6. 4. 1. DESCRIPCIÓN GENERAL. Es un antígeno de membrana de los linfocitos T, que también puede encontrarse en forma soluble, como sCD27, en el sobrenadante de los medios donde se cultivan los linfocitos o en los líquidos biológicos de personas sanas. El CD27 pertenece a la familia de receptores que incluyen: los receptores I y II para TNF (TNFRI y TNFRII), los receptores de los factores de crecimiento de los nervios, el antígeno CD40 de los linfocitos B y el antígeno Fas.73 Todas las proteínas de esta familia tienen una participación importante en el crecimiento, la diferenciación y la sobrevida de una gran cantidad de células. El CD 27 sólo se encuentra sobre la membrana de células linfoides, T o B y de las células NK.74 Sin embargo, se le considera un marcador de los linfocitos T que se expresa preferentemente en la membrana de las subpoblaciones de linfocitos T CD4+, TCR CD3high, CD45RA+, CD45RO- y CD27+. Una vez activados, los linfocitos T se convierten en células CD45RO+RA-, las cuales parecen tener relación con la conservación de la memoria inmunológica y pueden continuar expresando CD27, pero ya en una cantidad mucho menor. Más bien, después de activados producen una forma soluble del mismo antígeno o sCD27. El ligando para el CD27 que expresan los linfocitos T “vírgenes” s el antígeno CD70 que puede estar presente sobre la membrana de los linfocitos B. Se considera que la unión CD27-CD70 representa una señal coestimuladora que es crítica para activar los linfocitos T. Asimismo, CD27 participa en la síntesis de anticuerpos cuya producción depende de la colaboración de linfocitos T. 3. 1. 6. 4. 2. CARACTERÍSTICAS DEL FLUOROCROMO (Anti-Human CD 27 APC). Número de catálogo: 17-027973 Marca: Bioscience™ Nombre: CD 27. También conocido como TNFRSF7. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 71 Tamaño: 100 tests Status regulador: RUO Clon: 0323 Formato: APC Tamaño molecular: ninguno. Reactividad: humana. Aplicaciones: test de citometría de flujo. 3. 1. 6. 5. CD 3. 3. 1. 6. 5. 1. DESCRIPCIÓN GENERAL. El antígeno CD3 comprende un complejo proteico que se codifica en el brazo corto del cromosoma 11 y es de gran importancia en la transducción de señales en los linfocitos T. El CD3 está compuesto por tres cadenas polipeptídicas designadas como γ, δ, ε y ζ no polimórficas, que se unen para formar los heterodímeros CD3γε, CD3δε y adicionalmente a estas cadenas se une el homodímero CD3ζζ.75 Los heterodímeros poseen segmentos peptídicos de 5 - 10 aminoácidos (aa) ricos en cisteína76 que desempeñan un papel importante en la transducción de señales.77 Su peso molecular es de γ: 25-28; δ: 20, ε:20 kDa y su naturaleza bioquímica lo encuadra dentro de la familia de las inmunoglobulinas. Su función biológica en la célula es: intervenir en la transducción de señales, expresión del TCR en la superficie de la célula y asociación a este último receptor. Se expresa específicamente en timocitos y células T.3 Imagen 16: imagen de células mononucleares de sangre periférica, estudiada por un citómetro tipo FACs Calibur (Ig D/CD27) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 72 3. 1. 6. 5. 2. CARACTERÍSTICAS DEL FLUOROCROMO (Pacific Blue™ Mouse Anti- Human CD3). Número de catálogo: 558124 Marca: BD Pharmingen™ Nombre: CD3 Tamaño: 100 test (0.1mg) Status regulador: RUO Clon: SP34-2 Formato: Pacific Blue Isotipo: IgG1, ƛ Tamaño molecular: ninguno Reactividad: Baboon, Cynomolgus, Rhesus Aplicaciones: test de citometría de flujo. Imagen 17: patrón de fluorescencia de linfocitos de sangre periférica humana normal teñidos Pacific Blue™ Mouse Anti-Human CD3. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 73 3. 2. SUJETOS. 3. 2. 1. SUJETOS DEL ESTUDIO. Se estudiaron 50 sujetos sanos donantes de sangre, a los que se le realizó extracción sanguínea por vía venosa periférica. 3. 2. 2. CRITERIOS DE INCLUSIÓN. - Aceptación y firma del consentimiento informado por escrito del paciente. - Ambos sexos. - Edad entre 18-65 años. - Analítica general (bioquímica, orina y hemograma), análisis de autoinmunidad (FR, anti-CCP, HLA B27, ANAs, Anti-DNA, ENAs, ANCAs y ECA) junto con serología normal. 3. 2. 3. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN. 3. 2. 3. 1. PADECER ALGUNA DE LAS SIGUIENTES CAUSAS DE LINFOCITOSIS.17,18 Electromagnético, física, traumatismo, causas radiactivas Agotamiento por calor Trastornos infecciosos (agente específico) Enfermedades virales Gripe Linfocitosis infecciosa aguda Neumonía viral Hepatitis viral Eritema infeccioso Fiebre tifoidea Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 80 Síndrome de Job (Síndrome de hiper IgE) Trastornos genéticos, familiares, hereditarios Ataxia telangiectasia Síndrome de Wiskott-Aldrich Síndrome de inmunodeficiencia combinada grave Anatómico, cuerpo extraño, trastornos estructurales Fístula en el conducto torácico Obstrucción del conducto torácico Ruptura del conducto torácico Pericarditis constrictiva crónica Trastornos vegetativos, autonómicos, endócrinos Enfermedad de Cushing Miastenia grave Hipergastrinemia Referencia a sistema de órganos Insuficiencia renal aguda (IRA) Insuficiencia renal crónica (uremia/azoemia) Inmunodeficiencia común variable Fisiopatológico Alteración de la inmunidad mediada por células Trastornos de linfocitos T Defecto inmunitario de linfocitos T helpers Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 81 Drogas Administración de medicamento antimetabolitos Corticoesteroides Toxicidad por litio Clorambucil Litio Quimioterapia Cushing secundario Globulina antilinfocítica Envenenamiento orgánico (intoxicación) Insuficiencia renal tóxica Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 82 3. 3. PROTOCOLO DE ESTUDIO. VARIABLES CONSIDERADAS. 3. 3. 1. DESCRIPCIÓN DE PROTOCOLOS. 3. 3. 1. 1. EXTRACCIÓN DE MUESTRAS. Se obtuvieron 5 ml de sangre anticoagulada con EDTA de todos los sujetos estudiados. La flebotomía, en todos los casos se efectuó entre las 7:00h y las 9:00h, de la mañana. La cuenta de leucocitos se realizó del tubo con anticoagulante EDTA en un Technicon H-1, para obtener los valores absolutos y relativos de linfocitos para cada participante, constatándose la ausencia de leucopenia y/o linfocitosis. Posteriormente, se realizó a todas muestras frotis sanguíneo para el análisis morfológico de las células hemáticas y realización del recuento diferencial linfocitario (RDL). El transporte de las muestras desde el lugar de extracción hacia el laboratorio, se realizó en nevera portátil cerrada en un tiempo siempre menor de 10 minutos desde el momento de extracción. 3. 3. 1. 2. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA. Las muestras siempre fueron procesadas en el citómetro por la misma persona (D. Alejandro Muñoz Jiménez, médico del Servicio de Reumatología del H. U. Virgen de Valme, Sevilla) según los procedimientos que se expresan a continuación. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 83 3. 3. 1. 2. 1. PROCEDIMIENTO 1 (SF) 1. Del tubo con anticoagulante EDTA se tomaron 50 µl de sangre total a los que se agregaron los siguientes fluorocromos en las dosis que se expresan en la tabla 2. 2. Incubación a 15 min a temperatura ambiente (22ºC) en condiciones de absoluta oscuridad. 3. Tras completarse este periodo, se añaden 2 ml de solución lisante BD FACs (concentrada 10x) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 4. Incubación durante unos 10 min a temperatura ambiente (22ºC) en condiciones de absoluta oscuridad. 5. Centrifugación a 1.500 r.p.m, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente (22ºC), con aceleración y desaceleración máxima. 6. Decantación manual e individual de sobrenadante. 7. Se añaden 2 ml de FACs Flow (PBS) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 8. Centrifugación a 1.500 r.p.m, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente (22ºC), con aceleración y desaceleración máxima. 9. Decantación manual e individual de sobrenadante. 10. Se añaden 100µl de FACs Flow (PBS) y resuspendemos (con dilutor mecánico). Tabla 2: nombre, formato y dosis de los 5 fluorocromos utilizados en el experimento. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 84 11. Se pasa la muestra por el citómetro, en no más de unos 10-20 minutos en todos los casos. 3. 3. 1. 2. 2. PROCEDIMIENTO 2 (FM). 1. Del tubo con anticoagulante EDTA se tomaron 50 µl de sangre total a los que se agregaron los siguientes fluorocromos en las dosis que se expresan en la tabla 2. 2. Incubación a 15 minutos a temperatura ambiente (22ºC) en condiciones de absoluta oscuridad. 3. Tras completarse este periodo, se añaden 2 ml de solución lisante BD FACs (concentrada 10x) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 4. Incubación durante unos 10 minutos a temperatura ambiente (22ºC) en condiciones de absoluta oscuridad. 5. Centrifugación a 1.500 r.p.m, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente (22ºC), con aceleración y desaceleración máxima. 6. Decantación manual e individual de sobrenadante. 7. Se añaden 2 ml de FACs Flow (PBS) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 8. Centrifugación a 1.500 r.p.m, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente (22ºC), con aceleración y desaceleración máxima. 9. Decantación manual e individual de sobrenadante. 10. Se añaden 100µl de formaldehído al 5% y resuspendemos (con dilutor mecánico). 11. La muestra se pasa inmediatamente a un refrigerador a una temperatura de unos 4ºC. 12. Tras 24h, se pasa la muestra por el citómetro, en no más de unos 10-20 minutos en todos los casos. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 85 3. 3. 1. 2. 3. PROCEDIMIENTO 3 (Lysis). 1. Del tubo con anticoagulante EDTA se tomaron 50 µl de sangre total a los que se agregaron los siguientes fluorocromos en las dosis que se expresan en la tabla 2. 2. Incubación a 15 minutos a temperatura ambiente (22ºC) en condiciones de absoluta oscuridad. 3. Tras completarse este periodo, se añaden 2 ml de solución lisante BD FACs (concentrada 10x) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 4. La muestra se pasa inmediatamente a un refrigerador a una temperatura de unos 4ºC. 5. Tras 24h, centrifugación a 1.500 r.p.m, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente (22ºC), con aceleración y desaceleración máxima. 6. Decantación manual e individual de sobrenadante. 7. Se añaden 2 ml de FACs Flow (PBS) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 8. Centrifugación a 1.500 r.p.m, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente (22ºC), con aceleración y desaceleración máxima. 9. Decantación manual e individual de sobrenadante. 10. Se añaden 100µl de FACs Flow (PBS) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 11. Se pasa la muestra por el citómetro, en no más de unos 10-20 minutos en todos los casos. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 86 3. 3. 1. 2. 4. PROCEDIMIENTO 4 (SF24h). La muestra se mantiene durante unas 24 horas, a temperatura ambiente y en condiciones de absoluta oscuridad. Después se completa el siguiente procedimiento: 1. Del tubo con anticoagulante EDTA se tomaron 50 µl de sangre total a los que se agregaron los siguientes fluorocromos en las dosis que se expresan en la tabla 2. 2. Incubación a 15 minutos a temperatura ambiente (22ºC) en condiciones de absoluta oscuridad. 3. Tras completarse este periodo, se añaden 2 ml de solución lisante BD FACs (concentrada 10x) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 4. Incubación durante unos 10 minutos a temperatura ambiente (22ºC) en condiciones de absoluta oscuridad. 5. Centrifugación a 1.500 r.p.m, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente (22ºC), con aceleración y desaceleración máxima. 6. Decantación manual e individual de sobrenadante. 7. Se añaden 2 ml de FACs Flow (PBS) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 8. Centrifugación a 1.500 r.p.m, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente (22ºC), con aceleración y desaceleración máxima. 9. Decantación manual e individual de sobrenadante. 10. Se añaden 100µl de FACs Flow (PBS) y resuspendemos (con dilutor mecánico). 11. Se pasa la muestra por el citómetro, en no más de unos 10-20 minutos en todos los casos. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 87 3. 3. 1. 2. 5. DIAGRAMA ACLARATORIO. 3. 3. 1. 3. PROCESAMIENTO EN EL CITÓMETRO. Las muestras siempre fueron procesadas en el citómetro por la misma persona (Dª Elides Marín, Labs Manager, Rhematology, Allergy and Immunology Unit laboratory; Strong Memorial Hospital of Rochester, New York, USA) según los procedimientos que se expresan a continuación. Todas las alícuotas de sangre fueron analizadas en un citómetro de flujo FACs Canto II, a 22ºC y en condiciones de absoluta oscuridad. 3. 3. 1. 3. 1. CALIBRACIÓN DEL EQUIPO. Previo a la adquisición de muestras en el citómetro, cada día el citómetro fue compensado en su voltaje utilizando para ello los distintos fluorocromos procesados, no sobre la propia sangre sino utilizando SC Anti-mouse Compensation Standard® según el protocolo de preparación que se presenta a continuación: Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 88 1. 100µl de FACs Buffer en un tubo. 2. Añadimos 1µl de cada uno de los fluorocromos utilizados (CD3, CD27, CD38, CD19 e IgD) en tubos distintos y posteriormente, el resto de pasos se realiza sobre cada uno de ellos. 3. Añadimos dos gotas de SC Anti-mouse Compensation Standard®. 4. Incubamos durante 15 minutos, en un refrigerador a 4ºC. 5. Añadimos 0,5ml de Facs Buffer. 6. Centrifugación a 3.000rpm, durante 5 minutos a una temperatura de 22ºC. 7. Se decanta el sobrenadante. 8. Añadimos 150µl de FACs Buffer. Esta calibración tiene como finalidad maximizar la resolución y establecer el ruido de fondo para descartarlo de los ensayos realizados, establecer un nivel base (línea base) para la detección de fluorescencia, permitiendo la apropiada discriminación de poblaciones positivas y negativas con la menor interferencia y la mejor reproducibilidad de los resultados. Para establecer la línea de base el software determina la Intensidad media de fluorescencia (MFI) y el coeficiente de variación robusto (CVr) para las diferentes perlas en todos los detectores y posteriormente se emplean algoritmos para determinar la MFI y el tamaño para diferenciar la señal de cada tipo de perla (bright, mid, dim). Es a partir de estos datos que el software es capaz de calcular el background relativo (Br) y la eficiencia relativa de detección de fluorescencia (Qr), la desviación estándar del ruido electrónico y la configuración para la mejor resolución de poblaciones en todos los detectores. Una vez se establece la línea de base se debe realizar -y así lo hicimosdiariamente el control de funcionamiento con las mismas muestras de SC Anti-mouse Compensation Standard, para estar alerta de posibles desviaciones del valor basal establecido. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 89 3. 3. 1. 3. 2. CONTROL DE CALIDAD DE DETECTORES CON PERLAS MULTICOLOR. Adicionalmente a la calibración y el control diario es necesario realizar procedimientos para comprobar la alineación de cada laser respecto a la celda de flujo. Para esto se emplearon perlas multicolores Rainbow Beads (Sphero). Estas perlas son partículas fluorescentes de diámetro determinado marcadas con una mezcla fluorocromos que se excitan en un rango entre 365 y 650nm y que emiten fluorescencia en un espectro compatible con casi cualquier fluorocromo que se pueda emplear en inmunofenotipificación. Durante este proceso de comprobación de la alineación las partículas deben generar un pulso con una máxima amplitud y el menor valor para el ancho posible; posteriormente se genera un histograma que debe ser lo más alto y estrecho posible y con un CV menor a 5%.78 3. 3. 1. 4. ANÁLISIS DE RESULTADOS. Las muestras siempre fueron procesadas en el citómetro por la misma persona (Dr. André Ballesteros Tato, Research, Troy´s Laboratory; Strong Memorial Hospital of Rochester, New York, USA). El análisis de resultados se realizó con el uso del programa informático llamado FlowJo®, programa especialmente diseñado para el análisis de los datos obtenidos en el citómetro. Además de manejar análisis de datos immunophenotyping fácilmente, FlowJo también tiene plataformas especiales del análisis de datos: Ciclo celular, cinética (flujo del calcio), proliferación (CFSE), comparación estadística de muestras, calibración (cuantificación), y remuneración. FlowJo provee los gráficos y las tablas de la publicación. Puede diseñar las disposiciones gráficas y tabulares, con el control total sobre las fuentes, los colores, y los estilos de los gráficos. Una de las características más significativas de FlowJo es su capacidad de gran alcance del análisis de la hornada. El copiado de cualquier análisis (puertas, Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 96 que revela la relación existente entre la diferencia de las dos medidas y la magnitud promedio de las mismas, además de buscar cualquier tendencia sistemática e identificar posibles outliers. Si las diferencias detectadas en el 1,96*SD) no son clínicamente importantes entonces los dos métodos son intercambiables. El análisis de los datos se realizó con el programa IBM SPSS 19.0 para Windows. 3. 4. 3. CONCORDANCIA. COEFICIENTE DE CORRELACIÓN INTRACLASE Y MÉTODO DE BLAND Y ALTMAN. Las técnicas de análisis de la concordancia dependen del tipo de variable a estudiar. El índice estadístico más utilizado, para el caso de variables cualitativas, es el coeficiente kappa.2 Si las variables son cuantitativas, se utiliza habitualmente el coeficiente de correlación intraclase.1 El concepto básico subyacente del coeficiente de correlación intraclase fue introducido originalmente por Fisher como una formulación especial de la r de Pearson, basándose en un modelo de análisis de la varianza.1 Las dificultades para interpretar desde el punto de vista clínico los valores de este coeficiente y otras desventajas metodológicas han hecho que algunos autores propongan métodos alternativos para estudiar la concordancia de este tipo de variables. Así, Bland y Altman (1995)79 proponen un método gráfico y muy sencillo, basado en el análisis de las diferencias individuales, que permite determinar los límites de concordancia y visualizar de forma gráfica las discrepancias observadas. Recientemente, otros métodos de análisis de concordancia han sido propuestos.3 Para el caso de variables cuantitativas, es frecuente que el análisis de la concordancia se aborde mediante técnicas estadísticas inapropiadas. Con frecuencia ha sido utilizado el cálculo del coeficiente de correlación de lineal (r) de Pearson como índice de concordancia. Sin embargo, ésta no resulta una medida adecuada del grado de acuerdo entre dos mediciones, ya que si dos instrumentos miden sistemáticamente cantidades diferentes uno del otro, la correlación puede ser perfecta (r=1), a pesar de que la concordancia sea nula. No se debe olvidar que el coeficiente de correlación de Pearson no proporciona información sobre el acuerdo observado, y solamente mide la Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 97 asociación lineal entre dos variables.7 Así mismo, al calcularse a partir de los pares ordenados de mediciones, si varía el orden también cambia el valor del coeficiente,7 mientras que un cambio en las escalas de medida no afecta a la correlación pero sí afecta a la concordancia. A su vez, debemos mencionar que la idea de que si el coeficiente de correlación entre dos medidas es significativamente diferente de cero la fiabilidad es buena, es incorrecto. El coeficiente de correlación lineal puede ser muy pequeño y resultar significativo si el tamaño muestral es suficientemente grande. Por último, tampoco la comparación de medias mediante un test t de Student con datos apareados es una técnica adecuada para este tipo de análisis. Desde el punto de vista matemático, el índice más apropiado para cuantificar la concordancia entre diferentes mediciones de una variable numérica es el llamado coeficiente de correlación intraclase (CCI).71 Dicho coeficiente estima el promedio de las correlaciones entre todas las posibles ordenaciones de los pares de observaciones disponibles y, por lo tanto, evita el problema de la dependencia del orden del coeficiente de correlación. Así mismo, extiende su uso al caso en el que se disponga de más de dos observaciones por sujeto. Por todo ello, ha sido el método que hemos utilizado para el estudio de correlación entre los distintos procesamientos de muestra –sangre periféricade cara a su uso en la citometría de flujo para el estudio de subpoblaciones linfocitarias tipo B. Sin embargo, una de las principales limitaciones del CCI es la dificultad de su cálculo, ya que debe ser estimado de distintas formas dependiendo del diseño del estudio.80 La forma de cálculo más habitual se basa en un modelo de análisis de la varianza (ANOVA) con medidas repetidas. La idea es que la variabilidad total de las mediciones se puede descomponer en dos componentes: la variabilidad debida a las diferencias entre los distintos sujetos y la debida a las diferencias entre las medidas para cada sujeto. Esta última, a su vez, depende de la variabilidad entre observaciones y una variabilidad residual o aleatoria asociada al error que conlleva toda medición. El CCI se define entonces como la proporción de la variabilidad total que se debe a la variabilidad de los sujetos. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 98 En la actualidad el valor del CCI puede obtenerse de modo directo con algunos programas informáticos como el SPSS. Otra forma sencilla de obtener el valor del CCI es a partir de una tabla ANOVA para medidas repetidas. Como toda proporción, los valores del CCI pueden oscilar entre 0 y 1, de modo que la máxima concordancia posible corresponde a un valor de CCI=1. En este caso, toda la variabilidad observada se explicaría por las diferencias entre sujetos y no por las diferencias entre los métodos de medición o los diferentes observadores. Por otro lado, el valor CCI=0 se obtiene cuando la concordancia observada es igual a la que se esperaría que ocurriera sólo por azar. A la hora de interpretar los valores del CCI, toda clasificación es subjetiva, si bien resulta útil disponer de una clasificación como la que proponen otros autores (Tabla 3). Hasta ahora, se ha presentado la forma más habitual de cálculo del CCI. Para su cálculo en otras situaciones, así como para la obtención de intervalos de confianza, puede recurrirse a referencias más especializadas.8 A pesar de ser la medida de concordancia más adecuada par el caso de variables numéricas, el CCI presenta ciertas limitaciones. Junto a la dificultad inherente a su cálculo, el hecho de que se trate de una prueba paramétrica limita su uso al caso en el que se verifiquen las hipótesis necesarias. A saber: variables distribuidas según una normal, igualdad de varianzas e independencia entre los errores de cada observador. Así mismo, el valor del CCI depende en gran medida de la variabilidad de los valores observados: cuanto más homogénea sea la muestra estudiada, más bajo Tabla 3: valoración de la concordancia según los valores del Coeficiente de Correlación Intraclase (CCI). Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 99 tenderá a ser el valor del CCI. Pero quizás lo que más ha limitado la difusión del uso del CCI en la literatura médica es la carencia de interpretación clínica, que ha propiciado la aparición de otros métodos de análisis, mucho más intuitivo y fácilmente interpretables, como es el caso del análisis de las diferencias individuales: método de Bland y Altman. Un sencillo procedimiento gráfico para evaluar la concordancia entre dos sistemas de medida es el propuesto por Bland y Altman.79 Proponen un método sencillo a partir del análisis de las diferencias individuales que proporciona información complementaria al coeficiente de correlación intraclase. La diferencia de los resultados entre ambos métodos se representa en el eje de ordenadas y, su promedio, en el de abscisas. Lo ideal sería representar las diferencias observadas en relación con el verdadero valor de la variable de interés, lo que puede hacerse cuando uno de los métodos puede considerarse como el estándar de referencia (se estaría en una situación de evaluación de la validez de una prueba o medida). Sin embargo, cuando se evalúa la concordancia, se asume que ninguno de los métodos puede considerarse de referencia y se utiliza la media de ambos métodos como la mejor estimación disponible, así con el análisis de las diferencias frente a esta estimación puede decirse que se evalúa la repetibilidad. Si la concordancia fuera perfecta, los puntos se situarían exactamente sobre la línea correspondiente a la diferencia igual a 0. Este gráfico también permite observar si la magnitud de las diferencias entre los métodos en el eje Y es similar para todos los valores de la variable (representados por los promedios de ambas mediciones en el eje X), o si las diferencias entre los métodos son mayores a medida que aumenta el valor de la variable. Si las diferencias no varían según los valores de la variable, pueden analizarse las diferencias individuales: su media aritmética estima el sesgo relativo (diferencia sistemática entre ambos métodos) y su desviación estándar, el error aleatorio. Los límites del intervalo de dos desviaciones estándar alrededor de la media de las diferencias pueden considerarse como los límites de concordancia entre ambas mediciones, ya que este intervalo incluye el 95% de las diferencias observadas. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 100 El método de Bland y Altman se centra en la valoración de la magnitud de la diferencia, ya que permite determinar los límites de concordancia observados. Estos valores deben compararse con los límites de concordancia establecidos previamente al inicio del estudio, que dependerán de la utilidad que se quiera dar a la medida. Este método considera la concordancia más como un concepto clínico que como uno estadístico. De esta forma, la determinación de la magnitud de las diferencias y su visualización gráfica facilitan su interpretación clínica y hacen que este método sea muy atractivo para los profesionales sanitarios. 3.4.4. COEFICIENTE DE CONFIANZA INTERNA O ALFA DE CRONBACH. Se trata de un índice de consistencia interna que toma valores entre 0 y 1 y que sirve para comprobar si el instrumento que se está evaluando recopila información defectuosa y por tanto nos llevaría a conclusiones equivocadas o si se trata de un instrumento fiable que hace mediciones estables y consistentes. Alfa es por tanto un coeficiente de correlación al cuadrado que, a grandes rasgos, mide la homogeneidad de los ítems promediando todas las correlaciones entre todos los ítems para ver que, efectivamente, se parecen. Su interpretación será que, cuanto más se acerque el índice al extremo 1, mejor es la fiabilidad, considerando una fiabilidad respetable a partir de 0,80. La confiabilidad de una medición o de un instrumento, según el propósito de la primera y ciertas características del segundo, puede tomar varias formas o expresiones al ser medida o estimada: coeficientes de precisión, estabilidad, equivalencia, homogeneidad o consistencia interna, pero el denominador común es que todos son básicamente expresados como diversos coeficientes de correlación. La descripción resultante de los ítems o reactivos es resumida con el término homogeneidad, la cual es el grado en que una prueba o instrumento mide un solo factor, es decir, el grado en que los reactivos en una escala son unifactoriales. Más precisamente, el coeficiente de consistencia interna dependerá directamente de las correlaciones entre los ítems o reactivos, esto es, del grado en que los ítems midan la Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 101 misma variable. Mientras más homogéneos sean los ítems, mayor será el valor de la consistencia interna para un número dado de ítems. 81 Mientras que el conocimiento del grado de validez de un instrumento permite usar significativamente los datos obtenidos con él, el conocimiento de su confiabilidad permite usar los datos correctamente.81 Desde esta perspectiva práctica, muchas previsiones deben tomarse al momento de estimar e interpretar un coeficiente de consistencia interna. En este espacio nos ocuparemos de sólo dos de ellas. Primeramente, es oportuno destacar, y ya algo se ha dejado ver al respecto, que de manera “natural” el coeficiente de consistencia interna alfa de Cronbach expresa el grado en que los ítems miden la misma variable: homogeneidad. De tal manera que su utilidad original se orienta a calcular la confiabilidad de un instrumento cuyos ítems o reactivos conformen un único dominio, esto es, una variable o rasgo único. De esta manera, si su instrumento consta de o mide varias variables, es decir, tiene implícitamente subinstrumentos o subpruebas individuales, la recomendación es disponer de medidas de confiabilidad para cada subprueba. Más específicamente, los resultados del estudio deben reportar tantos alfa como subpruebas y variables o rasgos se tengan. El usuario de los resultados compuestos o combinados de un instrumento heterogéneo, debe ejecutar siempre verificaciones para ver si se dan estimaciones de confiabilidad para cada subprueba.81 En segundo lugar, se requiere comentar respecto a cómo interpretar un valor específico de alfa, esto es, cuál es el nivel satisfactorio de fiabilidad. Como regla general, las confiabilidades no deben ser inferiores a 0.80. 81 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 102 4. RESULTADOS. 4. 1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO. 4. 1. 1. ESTUDIO DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS TIPO B. En nuestra serie de 50 pacientes, 25 (25%) eran hombres y 25 (25%) pacientes eran mujeres. De ellos, el 95% eran de raza caucásica y 5% negra. Tabla 4: se expresan la media, desviación típica, valores máximo y mínimo, mediana y los percentiles 25 y 75% de cada una de las supoblaciones linfocitarias tipo B estudiadas (CD19, Naive, DN, Unswitched Memory, Switched Memory, Bm1, Bm2, Bm3 y 4, PreGC, late Bm5 y early Bm5) según cada uno de los 4 procesamientos de muestras utilizados en nuestro estudio. Supoblación Linf./ Procedimiento empleado N Media Desv. típ. Mínimo Máximo Percentiles(*) Válidos Perdidos 25 Mediana 75 CD19_SF 50 0 11,7512 4,74546 1,54 18,70 6,7375 13,1500 16,2500 CD19_FM 50 0 11,1974 4,36453 5,03 19,00 6,1750 12,0000 14,6250 CD19_Lysis 50 0 12,2374 4,55786 5,69 19,00 7,1800 13,0000 15,8750 CD19_SF24h 50 0 12,8552 4,72680 5,88 22,90 7,9700 13,3500 17,2000 Naive_SF 50 0 70,4680 8,06174 52,90 84,10 62,7250 73,7000 76,2250 Naive_FM 49 1 70,0000 9,97597 49,60 84,30 61,1000 74,9000 77,8500 Naive_Lysis 50 0 71,2000 8,45777 51,20 82,70 65,6250 74,2000 77,4500 Naive_SF24h 50 0 75,0700 9,86284 56,80 89,90 66,3500 75,9000 84,8500 DN_SF 50 0 4,0524 2,08289 ,72 9,73 1,9325 4,6550 5,4725 DN_FM 49 1 3,6339 1,54542 ,90 6,23 1,9000 3,9000 4,9550 DN_Lysis 50 0 3,6080 2,05701 ,62 9,68 1,7950 3,6650 4,7600 DN_SF24h 50 0 4,2076 2,34651 ,78 10,40 2,1925 3,5850 6,2575 UnswitchedMemory_SF 50 0 9,6474 5,32935 2,40 21,30 5,0200 10,0500 13,3750 UnswitchedMemory_FM 49 1 10,4280 6,95470 2,42 27,40 4,6050 9,7300 11,5000 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 103 UnswitchedMemory_Lysis 50 0 10,4214 6,00892 2,66 24,30 5,5800 9,5200 14,3000 UnswitchedMemory_SF24h 50 0 7,6118 5,11955 1,51 17,50 2,6550 6,6700 13,5250 SwitchedMemoryPB_SF 50 0 11,3804 4,61939 4,40 23,30 7,5450 11,0000 15,2750 SwitchedMemoryPB_FM 49 1 12,0104 5,13754 5,24 26,30 8,3850 11,4000 14,1500 SwitchedMemoryPB_Lysis 50 0 10,9432 4,41331 4,57 22,90 7,6825 10,8000 13,2000 SwitchedMemoryPB_SF24h 50 0 9,1532 5,38829 1,50 21,50 4,7300 7,8350 11,8000 Bm1_SF 50 0 6,9810 6,66850 ,52 29,70 3,3075 5,1000 9,0150 Bm1_FM 46 4 6,9580 6,79995 2,18 31,00 3,1225 4,3250 8,4775 Bm1_Lysis 47 3 7,0511 6,06869 1,85 30,10 3,4900 5,5800 7,9400 Bm1_SF24h 46 4 7,9509 7,41965 2,04 34,00 4,1025 5,3900 9,4225 Bm2_SF 50 0 73,9640 8,14403 57,60 87,30 67,7000 73,0500 82,3250 Bm2_FM 46 4 72,4543 5,79930 55,80 84,30 69,4000 72,0500 76,4250 Bm2_Lysis 47 3 72,4447 5,76533 57,70 83,70 68,7000 71,5000 76,6000 Bm2_SF24h 46 4 74,1065 7,10532 54,40 83,90 70,7500 75,0000 79,9750 Bm3y4_SF 50 0 ,5654 ,52387 ,00 2,77 ,2328 ,4380 ,7683 Bm3y4_FM 46 4 ,4838 ,40394 ,00 2,06 ,2628 ,3485 ,5965 Bm3y4_Lysis 47 3 ,5014 ,31577 ,00 1,27 ,3110 ,3920 ,7030 Bm3y4_SF24h 46 4 ,2434 ,29096 ,00 1,59 ,0579 ,1660 ,3380 PreGC_SF 50 0 2,9274 1,57481 1,09 6,08 1,4100 2,8900 3,9275 PreGC_FM 46 4 3,7659 1,85521 1,09 6,87 1,8825 3,6900 5,8000 PreGC_Lysis 47 3 3,7352 1,80837 ,98 7,01 1,9000 3,7400 5,5500 PreGC_SF24h 46 4 3,0364 1,55066 ,88 5,59 1,4525 3,4650 4,3900 LateBm5_SF 50 0 2,9516 1,84443 ,83 7,90 1,4550 2,5000 3,9100 LateBm5_FM 46 4 3,8141 1,79190 ,66 6,65 2,1950 3,6300 5,6550 LateBm5_Lysis 47 3 3,3452 1,46630 ,89 6,37 1,9100 3,4900 4,6300 LateBm5_SF24h 46 4 2,9965 1,54420 ,83 5,87 1,6175 2,8700 4,1775 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 104 EarlyBm5_SF 50 0 9,3420 4,84178 1,98 24,00 5,2300 10,1100 12,4500 EarlyBm5_FM 46 4 9,4278 3,97933 4,27 18,40 5,4675 10,1000 12,4250 EarlyBm5_Lysis 47 3 9,8519 4,52968 4,47 23,60 5,6700 9,7600 13,3000 EarlyBm5_SF24h 46 4 8,4352 3,20883 4,34 14,60 5,7700 7,0300 11,0000 *Distribución simétrica. **Procedimiento 1: SF; Procedimiento 2: FM; Procedimiento 3: Lysis; Procedimiento 4: SF24h. Tabla 5: se expresan las diferencias encontradas en el recuento de subpoblaciones de linfocitos B (CD19, Naive, DN, Unswitched Memory, Switched Memory, Bm1, Bm2, Bm3 y 4, PreGC, late Bm5 y early Bm5) cuando se comparan los procesamientos de la muestra FM, Lysis y SF24h con el procesamiento “gold standard” (SF). N Media Desv. típ. Mínimo Máximo Percentiles(*) Válidos Perdidos 25 Mediana 75 CD19.SF_FM 50 0 ,5538 1,62517 -3,85 6,45 -,3275 ,6250 1,3000 CD19.SF_LYSIS 50 0 -,4862 1,18211 -4,50 2,10 -1,1250 -,2900 ,1200 CD19.SF_SF24H 50 0 -1,1040 2,30218 -5,62 5,40 -2,8250 -1,2650 ,2275 Naive.SF_FM 49 1 ,3796 4,61537 -14,80 9,80 -2,1500 ,3000 3,4500 Naive.SF_LYSIS 50 0 -,7320 3,53798 -9,00 5,70 -3,1250 ,1500 1,5250 Naive.SF_SF24H 50 0 -4,6020 8,21411 -24,10 18,50 -10,6500 -3,8500 -,2750 DN.SF_FM 49 1 ,4675 1,31635 -1,40 5,84 -,4350 ,3400 1,3700 DN.SF_LYSIS 50 0 ,4443 1,53564 -4,65 3,98 -,2508 ,5250 1,2825 DN.SF_SF24H 50 0 -,1552 2,05779 -5,28 6,03 -1,2850 -,3200 ,9225 UnswitchedMemory.SF_FM 49 1 -,9000 2,56757 -9,30 2,18 -1,6950 -,0500 ,8950 UnswitchedMemory.SF_ LYSIS 50 0 -,7740 1,95282 -6,00 3,02 -1,9550 -,4250 ,6000 UnswitchedMemory.SF_ SF24H 50 0 2,0356 3,15783 -9,83 7,90 ,9500 2,6750 3,5475 SwitchedMemoryPB.SF_FM 49 1 -,4912 3,16064 -12,97 5,40 -1,2050 ,0600 1,1400 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 105 SwitchedMemoryPB.SF_ LYSIS 50 0 ,4372 1,81836 -4,29 5,00 -,5625 ,3550 1,3700 SwitchedMemoryPB.SF_ SF24H 50 0 2,2272 5,08345 -16,43 12,65 ,5700 2,5850 4,5575 Bm1.SF_FM 46 4 ,2568 1,74708 -2,63 7,38 -1,1000 ,1250 1,4775 Bm1.SF_LYSIS 47 3 ,1566 1,71160 -5,07 4,00 -1,1100 ,0300 1,6000 Bm1.SF_SF24H 46 4 -,6139 1,38989 -5,50 1,65 -1,2625 -,7150 ,3150 Bm2.SF_FM 46 4 1,5043 5,24646 -17,00 13,30 -1,2000 ,5500 3,9250 Bm2.SF_LYSIS 47 3 1,3915 4,72348 -6,70 11,60 -1,9000 ,4000 4,3000 Bm2.SF_SF24H 46 4 -,4870 6,05408 -20,00 15,90 -3,5000 -,4500 2,6000 Bm3y4.SF_FM 46 4 ,1027 ,48472 -1,09 1,24 -,1885 ,0565 ,3692 Bm3y4.SF_LYSIS 47 3 ,0933 ,45811 -,70 1,67 -,2700 ,0460 ,3520 Bm3y4.SF_SF24H 46 4 ,3584 ,41357 -,39 1,84 ,0657 ,3380 ,5782 PreGC.SF_FM 46 4 -,7550 ,90457 -3,08 2,01 -1,0425 -,6250 -,2500 PreGC.SF_LYSIS 47 3 -,7584 ,99355 -3,14 1,18 -1,3400 -,5800 -,2000 PreGC.SF_SF24H 46 4 -,1270 ,77393 -1,96 1,31 -,5800 -,1250 ,4918 LateBm5.SF_FM 46 4 -,8893 2,18474 -5,72 4,33 -1,9075 -,6350 ,5975 LateBm5.SF_LYSIS 47 3 -,3956 2,06076 -5,08 2,94 -1,9800 ,1400 1,0200 LateBm5.SF_SF24H 46 4 -,0042 1,77014 -4,95 3,10 -,3925 ,1850 1,0250 EarlyBm5.SF_FM 46 4 -,4387 2,54660 -3,80 12,30 -1,9500 -,5500 ,3550 EarlyBm5.SF_LYSIS 47 3 -,6966 2,31031 -6,80 8,20 -2,4400 -,6000 ,4000 EarlyBm5.SF_SF24H 46 4 ,8491 3,94570 -4,60 17,68 -1,4050 ,1850 1,8125 *Distribución asimétrica. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 112 CD38BM1_LYSIS 47 3 204,4894 55,94674 102,00 374,00 164,0000 206,0000 226,0000 CD38BM1_SF24h 46 4 184,1130 45,95017 87,00 285,00 161,7500 183,0000 205,2500 CD38BM2_SF 49 1 2456,714 477,77605 1771,00 3429,00 2118,500 2334,000 2753,500 CD38BM2_FM 46 4 2571,695 467,30228 1774,00 3381,00 2144,500 2454,500 3081,250 CD38BM2_Lysis 47 3 2626,000 483,20227 1826,00 3475,00 2157,000 2628,000 3074,000 CD38BM2_SF24h 46 4 2457,956 458,11473 1762,00 3287,00 2053,500 2388,500 2877,750 CD38BM2P_SF 49 1 11790,46 1202,3013 9185,00 15462,0 10800,50 11651,00 12467,00 CD38BM2P_FM 46 4 11718,00 909,80264 9270,00 15080,0 11141,00 11681,00 12276,50 CD38BM2P_Lysis 47 3 11659,57 1047,2647 9671,00 14068,0 10798,00 11637,00 12352,00 CD38BM2P_SF24h 46 4 11311,80 853,21996 9740,00 13672,0 10650,00 11303,50 11896,25 CD38BM3y4_SF 49 1 28245,08 16781,985 11628,0 74795,0 17389,50 22266,00 30522,50 CD38BM3y4_FM 46 4 22190,82 13401,746 6689,00 67782,0 15397,25 18960,00 23963,25 CD38BM3y4_Lysis 46 4 24785,60 16364,547 7626,00 76555,0 15418,50 18877,50 26192,50 CD38BM3y4_SF24h 45 5 17288,84 6755,0093 6875,00 31021,0 12279,00 14798,00 22670,50 CD38EarlyBM5_SF 49 1 2162,857 261,81609 1617,00 2551,00 2051,000 2189,000 2355,000 CD38EarlyBM5_FM 46 4 2187,826 300,17701 1648,00 2659,00 1866,250 2307,500 2416,250 CD38EarlyBM5_Lysis 47 3 2218,255 298,36791 1559,00 2881,00 2031,000 2235,000 2469,000 CD38EarlyBM5_SF24h 46 4 2116,782 285,43152 1599,00 2582,00 1895,250 2152,000 2342,000 CD38LateBM5_SF 49 1 161,5265 37,37726 79,80 281,00 138,0000 149,0000 183,0000 CD38LateBM5_FM 46 4 178,2609 43,13155 108,00 302,00 145,0000 176,0000 199,7500 CD38LateBM5_Lysis 47 3 177,5830 36,97837 76,00 255,00 152,0000 175,0000 211,0000 CD38LateBM5_SF24h 46 4 179,0652 34,31644 118,00 252,00 150,7500 172,0000 208,0000 *Distribución asimétrica. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 113 Tabla 14: se expresan las diferencias encontradas en la intensidad de fluorescencia del fluorocromo IgD cuando se comparan los procesamientos de la muestra FM, Lysis y SF24h con el procesamiento “gold standard” (SF), clasificados según las subpoblaciones linfocitarias (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5). N Media Desv. típ. Mínimo Máximo Percentiles(*) Válidos Perdidos 25 Mediana 75 IgDBM1_SF 49 1 9203,449 6056,6256 2225,00 23735,0 3339,500 7853,000 12760,00 IgDBM1_FM 46 4 9513,934 6334,3692 2373,00 26503,0 3038,000 8335,500 12697,75 IgDBM1_Lysis 47 3 9939,872 7009,3611 2265,00 27327,0 2715,000 8766,000 12987,00 IgDBM1_SF24h 46 4 8595,587 5775,3080 2086,00 23797,0 4884,000 7839,000 9983,250 IgDBM2_SF 49 1 14519,53 11538,139 1974,00 38138,0 3463,000 10782,00 22342,00 IgDBM2_FM 46 4 14442,60 11319,857 2143,00 39850,0 2307,250 10925,50 21728,75 IgDBM2_Lysis 47 3 14565,12 11196,452 1986,00 38818,0 2464,000 10863,00 21780,00 IgDBM2_SF24h 46 4 12160,58 9465,1902 1934,00 32516,0 5848,500 10345,00 13711,50 IgDBM2P_SF 49 1 17607,26 14159,257 2153,00 44933,0 4097,000 12059,00 26189,00 IgDBM2P_FM 46 4 18924,78 14764,088 2120,00 46649,0 2731,000 13493,00 29854,25 IgDBM2P_Lysis 47 3 18747,78 14830,896 2223,00 47197,0 3517,000 12745,00 28940,00 IgDBM2P_SF24h 46 4 15552,69 12404,309 2047,00 41120,0 5943,250 12334,00 22123,25 IgDBM3y4_SF 49 1 166,9939 134,17870 22,10 514,00 88,7000 106,0000 176,0000 IgDBM3y4_FM 46 4 190,2087 198,33748 14,80 998,00 65,8250 101,5000 216,2500 IgDBM3y4_Lysis 46 4 221,2567 187,06140 3,91 697,00 103,7500 153,0000 304,2500 IgDBM3y4_SF24h 45 5 257,2267 217,16948 15,70 880,00 93,6000 148,0000 445,0000 IgDEarlyBM5_SF 49 1 168,1449 127,72793 61,80 455,00 89,4000 107,0000 200,5000 IgDEarlyBM5_FM 45 5 177,3800 128,94556 63,70 455,00 86,5500 110,0000 227,0000 IgDEarlyBM5_Lysis 47 3 182,1702 131,47119 67,10 480,00 93,1000 128,0000 216,0000 IgDEarlyBM5_SF24h 46 4 170,0717 123,80871 55,00 457,00 96,8000 113,5000 210,7500 IgDLateBM5_SF 49 1 103,7061 35,92814 22,20 239,00 82,0000 96,1000 119,0000 IgDLateBM5_FM 46 4 101,4413 28,69049 60,40 176,00 79,2250 103,0000 119,5000 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 114 IgDLateBM5_Lysis 47 3 111,2957 29,08119 47,30 162,00 92,2000 114,0000 134,0000 IgDLateBM5_SF24h 46 4 111,4478 28,21790 61,00 182,00 91,2000 106,0000 134,2500 *Distribución asimétrica. Tabla 15: se expresan las diferencias encontradas en la intensidad de fluorescencia del fluorocromo CD38 cuando se comparan los procesamientos de la muestra FM, Lysis y SF24h con el procesamiento “gold standard” (SF), clasificados según las subpoblaciones linfocitarias (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5). N Media Desv. típ. Mínimo Máximo Percentiles(*) Válidos Perdidos 25 Mediana 75 CD38BM1.SF_FM 45 5 -4,7333 53,55600 -134,00 209,00 -29,5000 -6,0000 27,5000 CD38BM1.SF_LYSIS 46 4 -7,1957 59,80027 -189,00 179,00 -28,2500 -7,0000 16,5000 CD38BM1.SF_SF24H 45 5 14,1733 54,54390 -94,00 298,00 -12,0000 9,0000 37,5000 CD38BM2.SF_FM 45 5 -113,6000 215,36559 -542,00 449,00 -234,5000 -46,0000 12,5000 CD38BM2.SF_LYSIS 46 4 -173,4130 197,66386 -615,00 82,00 -333,7500 -131,0000 -16,0000 CD38BM2.SF_SF24H 45 5 -23,5556 186,31102 -482,00 263,00 -158,0000 30,0000 111,5000 CD38BM2P.SF_FM 45 5 134,3556 1208,4278 -4382,00 2961,00 -443,0000 142,0000 641,0000 CD38BM2P.SF_LYSIS 46 4 191,8043 1099,0864 -2621,00 3659,00 -322,0000 164,5000 793,0000 CD38BM2P.SF_SF24H 45 5 553,8889 1156,9590 -1671,00 4314,00 -176,0000 477,0000 1074,500 CD38BM3y4.SF_FM 45 5 6618,866 16852,197 -23565,0 64940,0 -3286,000 2683,000 11227,00 CD38BM3y4.SF_LYSIS 45 5 3711,222 15223,516 -16978,0 63426,0 -3282,500 892,0000 5784,000 CD38BM3y4.SF_SF24H 44 6 12151,95 16394,800 -11538,0 58615,0 2761,500 6698,500 14607,00 CD38EarlyBM5.SF_FM 45 5 -33,5333 231,99663 -569,00 899,00 -144,0000 -57,0000 42,5000 CD38EarlyBM5.SF_LYSIS 46 4 -64,4348 203,54095 -618,00 441,00 -172,5000 -83,0000 42,2500 CD38EarlyBM5.SF_SF24H 45 5 27,6000 164,89368 -257,00 449,00 -86,5000 -4,0000 128,5000 CD38LateBM5.SF_FM 45 5 -20,9156 53,56154 -146,00 104,00 -54,5000 -10,0000 9,5000 CD38LateBM5.SF_LYSIS 46 4 -20,2087 42,29295 -156,20 72,00 -43,2500 -17,5000 6,4000 CD38LateBM5.SF_SF24H 45 5 -21,6489 37,64128 -94,00 67,00 -52,5000 -22,0000 2,5000 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 115 *Distribución asimétrica. Tabla 16: se expresan las diferencias encontradas en la intensidad de fluorescencia del fluorocromo IgD cuando se comparan los procesamientos de la muestra FM, Lysis y SF24h con el procesamiento “gold standard” (SF), clasificados según las subpoblaciones linfocitarias (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5). N Media Desv. típ. Mínimo Máximo Percentiles(*) Válidos Perdidos 25 Mediana 75 IgDBM1.SF_FM 45 5 -377,7333 1292,4258 -5086,00 3529,00 -914,5000 -180,0000 134,0000 IgDBM1.SF_LYSIS 46 4 -678,0217 1603,3038 -6589,00 1892,00 -924,2500 -109,0000 157,5000 IgDBM1.SF_SF24H 45 5 801,4222 1996,6219 -4011,00 6847,00 77,0000 451,0000 1246,000 IgDBM2.SF_FM 45 5 31,4000 1342,3693 -2880,00 2625,00 -584,0000 150,0000 1026,500 IgDBM2.SF_LYSIS 46 4 61,5870 1136,1799 -2433,00 2982,00 -553,0000 -44,5000 888,0000 IgDBM2.SF_SF24H 45 5 2721,888 3182,2848 -1104,00 11170,0 225,0000 1397,000 5288,500 IgDBM2P.SF_FM 45 5 -1130,066 3162,8339 -12783,0 4541,00 -2035,500 -321,0000 506,0000 IgDBM2P.SF_LYSIS 46 4 -754,7609 2867,7130 -11323,0 4564,00 -2201,750 -345,5000 373,0000 IgDBM2P.SF_SF24H 45 5 2733,088 3299,6647 -2241,00 9652,00 164,5000 1449,000 5539,000 IgDBM3y4.SF_FM 45 5 -21,7711 162,66543 -975,90 128,70 -50,0500 7,0000 41,0000 IgDBM3y4.SF_LYSIS 45 5 -53,4358 139,99664 -650,90 91,60 -68,4500 -40,0000 14,1500 IgDBM3y4.SF_SF24H 44 6 -78,9318 156,68488 -668,00 95,40 -113,1500 -46,7000 8,6000 IgDEarlyBM5.SF_FM 44 6 -2,5364 34,57686 -143,50 80,60 -18,7500 ,3500 20,9000 IgDEarlyBM5.SF_LYSIS 46 4 -12,0022 35,58006 -115,20 76,60 -30,8000 -12,9500 13,2500 IgDEarlyBM5.SF_SF24H 45 5 -5,2333 23,46102 -55,00 47,50 -24,4000 -4,0000 8,7000 IgDLateBM5.SF_FM 45 5 1,7800 25,43778 -81,70 66,00 -10,9000 2,0000 17,6500 IgDLateBM5.SF_LYSIS 46 4 -9,1739 28,67113 -63,70 55,00 -29,3500 -8,0000 12,0000 IgDLateBM5.SF_SF24H 45 5 -10,0422 27,41574 -70,60 98,00 -27,8500 -15,0000 4,0500 *Distribución asimétrica. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 116 4.2. ESTADÍSTICA INFERENCIAL. 4.2.1. ESTUDIO DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS TIPO B. Tabla 17: se observan los valores de Alfa de Cronbach y el coeficiente de correlación intraclase (con su nivel de significación añadido), de cada una de las subpoblaciones linfocitarias estudiadas (DN, Naive, Unswitched memory, Switched memory, Bm1, Bm2, Bm3y4, PreGC, LateBm5 y EarlyBm5) cuando se comparan los distintos procesamientos de muestras (FM, Lysis y SF24h) con el procesamiento designado como “gold standard” (SF). Alfa de Cronbach Coeficiente de Correlación Intraclase Sig. Naive.SF_FM 0,931 0,932 0,00 Naive.SF_Lysis 0,952 0,951 0,00 Naive.SF_SF24H 0,738 0,685 0,00 DN.SF_FM 0,851 0,838 0,00 DN.SF_LYSIS 0,84 0,832 0,00 DN.SF_SF24H 0,726 0,729 0,00 UnswitchedMemory.SF_FM 0,955 0,951 0,00 UnswitchedMemory.SF_LYSIS 0,97 0,966 0,00 UnswitchedMemory.SF_SF24H 0,9 0,865 0,00 SwitchedMemoryPB.SF_FM 0,882 0,881 0,00 SwitchedMemoryPB.SF_LYSIS 0,958 0,956 0,00 SwitchedMemoryPB.SF_SF24H 0,655 0,618 0,00 Bm1.SF_FM 0,983 0,983 0,00 Bm1.SF_LYSIS 0,982 0,982 0,00 Bm1.SF_SF24H 0,99 0,989 0,00 Bm2.SF_FM 0,842 0,834 0,00 Bm2.SF_LYSIS 0,874 0,867 0,00 Bm2.SF_SF24H 0,813 0,815 0,00 Bm3y4.SF_FM 0,638 0,633 0,00 Bm3y4.SF_LYSIS 0,613 0,608 0,001 Bm3y4.SF_SF24H 0,694 0,567 0,00 PreGC.SF_FM 0,925 0,881 0,00 PreGC.SF_LYSIS 0,906 0,86 0,00 PreGC.SF_SF24H 0,932 0,932 0,00 LateBm5.SF_FM 0,469 0,435 0,018 LateBm5.SF_LYSIS 0,417 0,413 0,00 LateBm5.SF_SF24H 0,646 0,651 0,00 EarlyBm5.SF_FM 0,91 0,909 0,00 EarlyBm5.SF_LYSIS 0,937 0,933 0,00 EarlyBm5.SF_SF24H 0,706 0,701 0,00 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 117 Tabla 18: se observan resaltados en negrilla y desplazado hacia la izquierda de la celda, los valores del coeficiente de correlación intraclase más alto para cada una de las subpoblaciones linfocitarias (DN, Naive, Unswitched memory, Switched memory, Bm1, Bm2, Bm3y4, PreGC, LateBm5 y EarlyBm5) agrupados según el procesamiento de muestra utilizado.. Coeficiente de Correlación intraclase Sig. Naive.SF_FM 0,932 0,00 Naive.SF_Lysis 0,951 0,00 Naive.SF_SF24H 0,685 0,00 DN.SF_FM 0,838 0,00 DN.SF_LYSIS 0,832 0,00 DN.SF_SF24H 0,729 0,00 UnswitchedMemory.SF_FM 0,951 0,00 UnswitchedMemory.SF_LYSIS 0,966 0,00 UnswitchedMemory.SF_SF24H 0,865 0,00 SwitchedMemoryPB.SF_FM 0,881 0,00 SwitchedMemoryPB.SF_LYSIS 0,956 0,00 SwitchedMemoryPB.SF_SF24H 0,618 0,00 Bm1.SF_FM 0,983 0,00 Bm1.SF_LYSIS 0,982 0,00 Bm1.SF_SF24H 0,989 0,00 Bm2.SF_FM 0,834 0,00 Bm2.SF_LYSIS 0,867 0,00 Bm2.SF_SF24H 0,815 0,00 Bm3y4.SF_FM 0,633 0,00 Bm3y4.SF_LYSIS 0,608 0,001 Bm3y4.SF_SF24H 0,567 0,00 PreGC.SF_FM 0,881 0,00 PreGC.SF_LYSIS 0,86 0,00 PreGC.SF_SF24H 0,932 0,00 LateBm5.SF_FM 0,435 0,018 LateBm5.SF_LYSIS 0,413 0,00 LateBm5.SF_SF24H 0,651 0,00 EarlyBm5.SF_FM 0,909 0,00 EarlyBm5.SF_LYSIS 0,933 0,00 EarlyBm5.SF_SF24H 0,701 0,00 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 118 Gráfico 1: En el eje de ordenadas se representa el coeficiente de correlación. En el eje de abscisas se representan las distintas subpoblaciones linfocitarias tipo B (Naive, DN, Unswichted memory y Switched memory) cuando se comparan los procedimientos en estudio (FM, Lysis y SF24h) con la prueba “gold standard” (Sangre Fresca representada con las siglas SF). Gráfico 2: En el eje de ordenadas se representa el coeficiente de correlación. En el eje de abscisas se representan las distintas subpoblaciones linfocitarias tipo B (Bm1, Bm2, Bm3y4, PreGC, LateBM5 y EarlyBM5) cuando se comparan los procedimientos en estudio (FM, Lysis y SF24h) con la prueba “gold standard” (Sangre Fresca representada con la sigla SF). 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Bm1.SF_FM Bm1.SF_LYSIS Bm1.SF_SF24H Bm2.SF_FM Bm2.SF_LYSIS Bm2.SF_SF24H Bm3y4.SF_FM Bm3y4.SF_LYSIS Bm3y4.SF_SF24H PreGC.SF_FM PreGC.SF_LYSIS PreGC.SF_SF24H LateBm5.SF_FM LateBm5.SF_LYSIS LateBm5.SF_SF24H EarlyBm5.SF_FM EarlyBm5.SF_LYSIS EarlyBm5.SF_SF24H Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 119 Tabla 19: se observa el coeficiente de correlación intraclase, ordenado de mayor a menor, incluyendo las subpoblaciones linfocitarias (Clasificación EuroClass y Bmature). De este modo, se ha resaltado con fondo gris, aquellos estudios que han alcanzado un resultado >0,9 lo cual indica una correlación MUY BUENA. Por otro lado, en verde, se han resultado los resultados que han obtenido una correlación BUENA (coeficiente de correlación intraclase comprendido entre 0,71- 0,90). Coeficiente de Correlación intraclase Sig. Bm1.SF_SF24H 0,989 0,00 Bm1.SF_FM 0,983 0,00 Bm1.SF_LYSIS 0,982 0,00 UnswitchedMemory.SF_LYSIS 0,966 0,00 SwitchedMemoryPB.SF_LYSIS 0,956 0,00 Naive.SF_Lysis 0,951 0,00 UnswitchedMemory.SF_FM 0,951 0,00 EarlyBm5.SF_LYSIS 0,933 0,00 Naive.SF_FM 0,932 0,00 PreGC.SF_SF24H 0,932 0,00 EarlyBm5.SF_FM 0,909 0,00 SwitchedMemoryPB.SF_FM 0,881 0,00 PreGC.SF_FM 0,881 0,00 Bm2.SF_LYSIS 0,867 0,00 UnswitchedMemory.SF_SF24H 0,865 0,00 PreGC.SF_LYSIS 0,86 0,00 DN.SF_FM 0,838 0,00 Bm2.SF_FM 0,834 0,00 DN.SF_LYSIS 0,832 0,00 Bm2.SF_SF24H 0,815 0,00 DN.SF_SF24H 0,729 0,00 EarlyBm5.SF_SF24H 0,701 0,00 Naive.SF_SF24H 0,685 0,00 LateBm5.SF_SF24H 0,651 0,00 Bm3y4.SF_FM 0,633 0,00 SwitchedMemoryPB.SF_SF24H 0,618 0,00 Bm3y4.SF_LYSIS 0,608 0,001 Bm3y4.SF_SF24H 0,567 0,00 LateBm5.SF_FM 0,435 0,018 LateBm5.SF_LYSIS 0,413 0,00 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 120 Tabla 20: se observan los valores de Alfa de Cronbach y el coeficiente de correlación intraclase (con su nivel de significación añadido), de las subpoblaciones linfocitarias tipo B según la Clasificación EuroClass, la Clasificación Bmature y sumando los resultados de ambas clasificaciones (EuroClass + Bmature), cuando se comparan los distintos procesamientos de muestras (FM, Lysis y SF24h) con el procesamiento designado como “gold standard” (SF). Alfa de Cronbach Coeficiente de Correlación Intraclase Sig. Clasif. Euroclass.SF_FM 0,997 0,997 0 Clasif. Euroclass.SF_Lysis 0,998 0,998 0 Clasif. Euroclass.SF_SF24h 0,99 0,99 0 Clasif. Bmature.SF_FM 0,997 0,997 0 Clasif. Bmature.SF_Lysis 0,998 0,998 0 Clasif. Bmature.SF_SF24h 0,996 0,996 0 Clasif. Euroclass+Bmature.SF_FM 0,997 0,997 0 Clasif. Euroclass+Bmature.SF_Lysis 0,998 0,998 0 Clasif. Euroclass+Bmature.SF_SF24h 0,993 0,993 0 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 121 4.2.2. ESTUDIO DE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA DE LOS DISTINTOS FLUOROCROMOS EN CADA UNA DE LAS SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS TIPO B. Tabla 21: se observan los valores de Alfa de Cronbach, matriz de correlación interelementos y el coeficiente de correlación intraclase (con su nivel de significación añadido), de las intensidades de los fluorocromos CD19, IgD y CD27 en cada una de las subpoblaciones linfocitarias estudiadas (DN, Naive, Unswitched memory y Switched memory) cuando se comparan los distintos procesamientos de muestras (FM, Lysis y SF24h) con el procesamiento designado como “gold standard” (SF). Alfa de Cronbach Coeficiente de Correlación Intraclase Sig. CD19.SF_FM 0,601 0,498 0,001 CD19.SF_LYSIS 0,586 0,477 0,002 CD19.SF_SF24H 0,651 0,654 0 IgD.DN.SF_FM 0,08 0,079 0 IgD.DN.SF_LYSIS 0,09 0,081 0,375 IgD.DN.SF_SF24H 0,451 0,449 0,024 IgD.Naive.SF_FM 0,99 0,99 0 IgD.Naive.SF_LYSIS 0,998 0,998 0 IgD.Naive.SF_SF24H 0,976 0,958 0 IgD.Unswitched.SF_FM 0,982 0,982 0 IgD.Unswitched.SF_LYSIS 0,989 0,988 0 IgD.Unswitched.SF_SF24H 0,96 0,948 0 IgD.Switched.SF_FM 0,811 0,813 0 IgD.Switched.SF_LYSIS 0,604 0,589 0,001 IgD.Switched.SF_SF24H 0,535 0,535 0,006 CD27.DN.SF_FM 0,175 0,176 0,261 CD27.DN.SF_LYSIS 0,005 0,005 0,494 CD27.DN.SF_SF24H 0,651 0,645 0 CD27.Naive.SF_FM 0,785 0,78 0 CD27.Naive.SF_LYSIS 0,892 0,789 0 CD27.Naive.SF_SF24H 0,565 0,248 0,003 CD27.Unswitched.SF_FM 0,897 0,898 0 CD27.Unswitched.SF_LYSIS 0,903 0,889 0 CD27.Unswitched.SF_SF24H 0,93 0,832 0 CD27.Switched.SF_FM 0,745 0,739 0 CD27.Switched.SF_Lysis 0,797 0,796 0 CD27.Switched.SF_SF24H 0,685 0,458 0 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 128 CD38.BM1.SF_LYSIS 0,541 0,005 CD38.BM1.SF_SF24H 0,521 0,007 CD38.BM2P.SF_FM 0,511 0,01 CD38.LateBM5.SF_24H 0,488 0,004 CD38.BM2P.SF_24H 0,485 0,007 CD38.LateBM5.SF_LYSIS 0,39 0,029 CD38.BM3y4.SF_24H 0,278 0,067 CD38.LateBM5.SF_FM 0,081 0,377 Tabla 27: se observan los valores de Alfa de Cronbach, matriz de correlación interelementos y el coeficiente de correlación intraclase (con su nivel de significación añadido), de la intensidad del fluorocromo IgD en cada una de las subpoblaciones linfocitarias estudiadas (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5) cuando se comparan los distintos procesamientos de muestras (FM, Lysis y SF24h) con el procesamiento designado como “gold standard” (SF). Alfa de cronbach Coeficiente de Correlación intraclase Sig. IgD.BM1.SF_FM 0,989 0,989 0 IgD.BM1.SF_LYSIS 0,985 0,983 0 IgD.BM1.SF_SF24H 0,971 0,967 0 IgD.BM2.SF_FM 0,997 0,997 0 IgD.BM2.SF_LYSIS 0,998 0,998 0 IgD.BM2.SF_SF24H 0,977 0,962 0 IgD.BM2P.SF_FM 0,988 0,987 0 IgD.BM2P.SF_LYSIS 0,99 0,99 0 IgD.BM2P.SF_24H 0,985 0,975 0 IgD.BM3y4.SF_FM 0,712 0,713 0 IgD.BM3y4.SF_LYSIS 0,783 0,763 0 IgD.BM3y4.SF_24H 0,726 0,683 0 IgD.EarlyBM5.SF_FM 0,982 0,983 0 IgD.EarlyBM5.SF_LYSIS 0,981 0,98 0 IgD.EarlyBM5.SF_24H 0,991 0,991 0 IgD.LateBM5.SF_FM 0,752 0,755 0 IgD.LateBM5.SF_LYSIS 0,668 0,651 0 IgD.LateBM5.SF_24H 0,69 0,667 0 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 129 Tabla 28: se observa, resaltado en negrilla y desplazado hacia la izquierda de la celda, el valor del coeficiente de correlación intraclase más alto para la intensidad del fluorocromo IgD, distribuidos según las subpoblaciones linfocitarias (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5) agrupados según el procesamiento de muestra utilizado. Coeficiente de Correlación intraclase Sig. IgD.BM1.SF_FM 0,989 0 IgD.BM1.SF_LYSIS 0,983 0 IgD.BM1.SF_SF24H 0,967 0 IgD.BM2.SF_FM 0,997 0 IgD.BM2.SF_LYSIS 0,998 0 IgD.BM2.SF_SF24H 0,962 0 IgD.BM2P.SF_FM 0,987 0 IgD.BM2P.SF_LYSIS 0,99 0 IgD.BM2P.SF_24H 0,975 0 IgD.BM3y4.SF_FM 0,713 0 IgD.BM3y4.SF_LYSIS 0,763 0 IgD.BM3y4.SF_24H 0,683 0 IgD.EarlyBM5.SF_FM 0,983 0 IgD.EarlyBM5.SF_LYSIS 0,98 0 IgD.EarlyBM5.SF_24H 0,991 0 IgD.LateBM5.SF_FM 0,755 0 IgD.LateBM5.SF_LYSIS 0,651 0 IgD.LateBM5.SF_24H 0,667 0 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 130 Gráfico 6: En el eje de ordenadas se representa el coeficiente de correlación. En el eje de abscisas se representan la intensidad de fluorescencia del fluorocromo IgD en las distintas subpoblaciones linfocitarias tipo B (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5) cuando se comparan los procedimientos en estudio (FM, Lysis y SF24h) con la prueba “gold standard” (Sangre Fresca representada con las siglas SF). Tabla 29: se observa el coeficiente de correlación intraclase, ordenado de mayor a menor, en el estudio de la intensidad de fluorescencia de IgD, en las 6 subpoblaciones linfocitarias que la definen (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5 Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5). De este modo, se ha resaltado con fondo gris, aquellos estudios que han alcanzado un resultado >0,9 lo cual indica una correlación MUY BUENA. Por otro lado, en verde, se han resaltado los estudios que han obtenido una correlación BUENA (coeficiente de correlación intraclase comprendido entre 0,71-0,90). Coeficiente de Correlación intraclase Sig. IgD.BM1.SF_FM 0,998 0 IgD.BM1.SF_LYSIS 0,997 0 IgD.BM1.SF_SF24H 0,991 0 IgD.BM2.SF_FM 0,99 0 IgD.BM2.SF_LYSIS 0,989 0 IgD.BM2.SF_SF24H 0,987 0 IgD.BM2P.SF_FM 0,983 0 IgD.BM2P.SF_LYSIS 0,983 0 IgD.BM2P.SF_24H 0,98 0 IgD.BM3y4.SF_FM 0,975 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 IgD.BM1.SF_FM IgD.BM1.SF_LYSIS IgD.BM1.SF_SF24H IgD.BM2.SF_FM IgD.BM2.SF_LYSIS IgD.BM2.SF_SF24H IgD.BM2P.SF_FM IgD.BM2P.SF_LYSIS IgD.BM2P.SF_24H IgD.BM3y4.SF_FM IgD.BM3y4.SF_LYSIS IgD.BM3y4.SF_24H IgD.EarlyBM5.SF_FM IgD.EarlyBM5.SF_LYSIS IgD.EarlyBM5.SF_24H IgD.LateBM5.SF_FM IgD.LateBM5.SF_LYSIS IgD.LateBM5.SF_24H Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 131 IgD.BM3y4.SF_LYSIS 0,967 0 IgD.BM3y4.SF_24H 0,962 0 IgD.EarlyBM5.SF_FM 0,763 0 IgD.EarlyBM5.SF_LYSIS 0,755 0 IgD.EarlyBM5.SF_24H 0,713 0 IgD.LateBM5.SF_FM 0,683 0 IgD.LateBM5.SF_LYSIS 0,667 0 IgD.LateBM5.SF_24H 0,651 0 Tabla 30: se observan los valores de Alfa de Cronbach y el coeficiente de correlación intraclase (con su nivel de significación añadido), de la intensidad de fluorescencia de los fluorocromos IgD, CD27 y ambos unidos (IgD/CD27), para la determinación de las subpoblaciones linfocitarias tipo B según la Clasificación EuroClass, cuando se comparan los distintos procesamientos de muestras (FM, Lysis y SF24h) con el procesamiento designado como “gold standard” (SF). Alfa de Cronbach Coeficiente de Correlación intraclase Sig. IgD.Euroclass.SF_FM 0,994 0,994 0 IgD.Euroclass.SF_Lysis 0,999 0,998 0 IgD.Euroclass.SF_24h 0,98 0,977 0 CD27.Euroclass.SF_FM 0,989 0,989 0 CD27.Euroclass.SF_Lysis 0,992 0,991 0 CD27.Euroclass.SF_24h 0,997 0,967 0 IgD/CD27.Euroclass.SF_FM 0,994 0,994 0 IgD/CD27.Euroclass.SF_Lysis 0,998 0,998 0 IgD/CD27.Euroclass.SF_24h 0,98 0,978 0 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 132 Tabla 31: se observan los valores de Alfa de Cronbach y el coeficiente de correlación intraclase (con su nivel de significación añadido), de la intensidad de fluorescencia de los fluorocromos IgD, CD38 y ambos unidos (IgD/CD38), para la determinación de las subpoblaciones linfocitarias tipo B según la Clasificación Bmature, cuando se comparan los distintos procesamientos de muestras (FM, Lysis y SF24h) con el procesamiento designado como “gold standard” (SF). Alfa de Cronbach coeficiente de Correlación intraclase Sig. CD38.Bmature.SF_FM 0,883 0,881 0 CD38.Bmature.SF_Lysis 0,923 0,922 0 CD38.Bmature.SF_24h 0,817 0,677 0 IgD.Bmature.SF_FM 0,995 0,995 0 IgD.Bmature.SF_Lysis 0,996 0,996 0 IgD.Bmature.SF_24h 0,986 0,984 0 CD38/IgD.Bmature.SF_FM 0,939 0,939 0 CD38/IgD.Bmature.SF_Lysis 0,958 0,958 0 CD38/IgD.Bmature.SF_24h 0,908 0,902 0 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 133 5. DISCUSIÓN. 5.1. IDEAS PRELIMINARES EN LA DISCUSIÓN. La medición es un proceso inherente tanto a la práctica como a la investigación clínica. Mientras que algunas variables son relativamente sencillas de medir (como el peso o la tensión arterial) otras comportan cierto grado de subjetividad que hace especialmente difícil su medición, como la intensidad del dolor o el concepto de calidad de vida. En cualquier caso, el proceso de medición conlleva siempre algún grado de error. Existen factores asociados a los individuos, al observador o al instrumento de medida que pueden influir en la variación de las mediciones.4,5 En la medida de la temperatura corporal, por ejemplo, pueden aparecer errores en el registro debidos tanto al estado del paciente, como a defectos en el termómetro utilizado o a la objetividad del observador. La medición es un proceso inherente tanto a la práctica como a la investigación clínica. En el caso de la citometría de flujo, son muchos los factores que pueden intervenir en el desarrollo de algún tipo de error, debido fundamentalmente a que se trata de una técnica compleja sujeta a numerosos pasos, todos ellos con varias o múltiples posibilidades. Es una técnica con fuertes aplicaciones en los laboratorios de investigación, pero con algunas dificultades actuales para su aplicación en la práctica clínica habitual. Los procesamientos de muestra utilizados (en sangre periférica) pueden variar según la experiencia y los protocolos de los distintos grupos, debido fundamentalmente a los tiempos y sustancias/fluorocromos empleadas. Así pues, en este estudio se ha contemplado 4 procesamientos de muestras que no han sido elegidos al azar, sino que han sido los recomendados por el grupo de investigación del Dr. Ignacio Sanz de la Unidad de Reumatología, Inmunología y Alergia del Strong Memorial Hospital (Rochester, N.Y), actualmente perteneciente al grupo de Inmunología de la Universidad de Emory. De entre estos 4 procedimientos, el primero de ellos (denominado como SF) ha sido considerado como el método Gold Standard, dado que está sujeto a escasas modificaciones. En este caso las posibilidades de alterar las propiedades citométricas de la muestra sanguínea son mínimas; la sangre es Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 134 inmediatamente procesada para su valoración en el citómetro de flujo, tras escasos minutos después de su extracción. Los otros tres procedimientos que han sido estudiados (SF24h, FM y Lysis) no son más que variaciones realizadas sobre el método anterior, ajustadas a las posibles complicaciones que de la práctica clínica habitual pueden originarse. Estos 3 procesamientos intentan, por tanto, demorar temporalmente el estudio de estas muestras, para de este modo estar más adaptadas a la práctica clínica habitual.82 No en pocos casos, los resultados obtenidos por citometría no han sido validados, debido a que los protocolos utilizados han provocado, de algún modo, variaciones en los resultados finales. En general, La partículas o células deben ser analizadas inmediatamente después del marcaje inmunofenotípico o deben ser fijadas. La fijación se realiza durante un tiempo mínimo de 1 h en presencia de paraformaldehído. No obstante, es importante tener en cuenta que la distribución de los parámetros de dispersión frontal (FS) y ortogonal (SC) de la luz cambia durante el proceso de fijación, ya que el proceso de entrecruzamiento de proteínas provoca cambios en la forma y granularidad de las células. Otra cosa, es considerar que la superficie celular se vea modificada. En este estudio, los fluorocromos utilizados son de superficie celular, por lo cual no existen datos que hagan pensar que la fijación provoque cambios en este sentido.82 Incluso, técnicas como la congelación han sido validadas para conseguir muestras sanguíneas estables, que puedan ser estudiadas incluso días más tardes. 82 No obstante, este procedimiento es muy discutido en la actualidad, dado que existen estudios que aseguran alteraciones en la superficie de la membrana celular, y por ende, alteraciones en los marcadores de superficie. 83 En la mayoría de los estudios realizados hasta el momento se ha utilizado un paraformaldehído del 1%2,84, mientras que en este estudio el porcentaje de paraformaldehído ha sido del 5%. Sue Chow et al.85 desarrolló un estudio muy interesante, en el que comparó la influencia de dos concentraciones de paraformaldehído (2% vs 4%) en la expresión de marcadores de superficie leucocitaria. Se observó que los datos de expresión de estos marcadores y la intensidad de autofluorescencia de los fluorocromos, era mayor con el uso de paraformaldehído al Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 135 4%. La posibilidad de realizar estudios para establecer qué diferencias ocasionan las diferentes concentraciones de este fijador, puede motivar la ejecución de otros estudios en un futuro, entendiendo que la horquilla porcentual en estas concentraciones oscila en la mayoría de los estudio entre el 1-5%. En general, se recomienda que las muestras destinadas a su estudio citométrico deberían de ser transportadas y procesadas de forma inmediata después de la flebotomía.86 87 Una de las más cuestiones más extendidas es cuánto tiempo puede permanecer una muestra hasta ser procesada en el citómetro. En este sentido la literatura es limitada con escasa publicaciones y escasa referencias en las guías. Entre 24-36h (a temperatura ambiente) no parece existir cambios significativos en la antigenicidad. Estudios comprendidos entre las 48-72h, sólo son estables si se añaden medios celulares tales como RPMI-1640 o la solución de McCoy´s y almacenadas a 4oC.87 Más allá de 72h, la antigenicidad de la muestra se vería muy mermada y no resulta muy recomendable. La temperatura también parece tener gran importancia de cara a la conservación de las muestras. Se recomienda que la temperatura de la habitación esté comprendida entre los 16o-28oC. Concretamente los 16oC es la temperatura más adecuada para el mantenimiento de estas muestras. 88 No existen datos concluyentes sobre la dicotomía entre el almacenaje de la muestra a temperatura ambiente vs en frigorífico a 2o-8oC. 88-90 En ningún caso las temperaturas >37oC y la refrigeración por debajo de los 2oC han sido aceptadas para el almacenamiento de las muestras.87 Son tantas las variables que se suman al proceso de preparación de estas muestras, que incluso el uso de EDTA (anticoagulante) ha sido motivo de estudio en otras publicaciones.89,90 En general su uso está fuertemente extendido y recomendado.87 Sólo algunas excepciones se deben tener en cuenta. Si la muestra va a demorarse más de 24h su estudio en el citómetro, parece que el EDTA se relaciona con algunas alteraciones en la expresión de determinados antígenos (Ej: CD11b en la superficie de los neutrófilos)88,90 y fomenta la agregación plaquetaria, con lo cual no se aconseja su uso para el estudio de megacariocitos.89 Por el contrario, no existen datos que informen que el tubo de EDTA origine alguna alteración citológica de cara al Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 136 estudio de subpoblaciones linfocitarias en sangre periférica, de ahí el uso en los distintos procesamientos de muestras de este estudio. Así pues, bien es conocido que, si los inicios de la citometría de flujo estuvieron en clara asociación con la investigación biomédica,91 en la actualidad es una técnica cada vez más empleada en la práctica clínica habitual, sobre todo, en los campos de la hematología y enfermedades infecciosas.92,93 Esto ha provocado, que frente a la rigidez de actuación al que están sometidos los ensayos clínicos y el resto de situaciones relacionadas con la investigación biomédica, la inclusión de la citometría de flujo en la práctica clínica habitual ha originado que estos protocolos estén sujetos a la variabilidad situacional del día a día en el ejercicio esta práctica. Con todo esto, han sido muchos los grupos de investigación que se han dedicado a protocolizar de una forma más real los procesamientos de estas muestras y el estudio de subpoblaciones linfocitarias en el citómetro.94,95 Cualquier estudio clínico debe garantizar la calidad de sus mediciones, no sólo porque condicionará en gran medida la validez de sus conclusiones, sino por la importancia de las decisiones clínicas que se apoyen en esa investigación.96 La calidad de una medida depende tanto de su validez como de su fiabilidad.4,97 Mientras que la validez expresa el grado en el que realmente se mide el fenómeno de interés, la fiabilidad indica hasta qué punto se obtienen los mismos valores al efectuar la medición en más de una ocasión, bajo condiciones similares. El que una medida sea muy precisa no implica, sin embargo, que sea necesariamente válida. Así, si se realizan dos medidas consecutivas de la presión arterial de un paciente con un esfigmomanómetro mal calibrado los valores obtenidos seguramente serán parecidos, aunque totalmente inexactos. En los estudios que tratan de evaluar la validez de una medida se comparan sus resultados con los obtenidos mediante una prueba de referencia (gold standard) que se sabe válida y fiable para la medición del fenómeno de interés.33 En nuestro estudio, el procedimiento número 1 expresado como SF ha sido elegido como “gold standard”. Es este procesamiento el que ocasiona menos alteraciones en la superficie celular y, por ende, el que aporta mejores resultados para el estudio citométrico. No se debe Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 137 olvidar, que los fluorocromos que se han utilizados son moléculas cuyo receptor se halla en la superficie de la membrana celular, con lo cual la viabilidad e integridad de la misma es necesaria para que la interacción receptor/fluorocromo sea el más adecuado.98,99 Cualquier situación ambiental, cronológica o material que altere esta estructura provocaría alteraciones en la determinación citométrica. Por otra parte, para la definición de otras subpoblaciones son necesarios otros fluorocromos cuyo objetivo molecular no está en la superficie celular y sí en el interior de la misma (citoplasma, superficie nuclear, núcleo,…) siendo necesarios otros procesamientos distintos a los aquí reflejados. 98,99 Cuando el objetivo se centra en la fiabilidad de una medición, se repite el proceso de medida para evaluar la concordancia entre las distintas mediciones. En un estudio de la fiabilidad pueden valorarse los siguientes aspectos: 1. Repetibilidad: indica hasta qué punto un instrumento proporciona resultados similares cuando se aplica a una misma persona en más de una ocasión, pero en idénticas condiciones. 2. Concordancia intraobservador: tiene por objetivo evaluar el grado de consistencia al efectuar la medición de un observador consigo mismo. 3. Concordancia interobservador: se refiere a la consistencia entre dos observadores distintos cuando evalúan una misma medida en un mismo individuo. 4. Concordancia entre métodos de medición: cuando existen diferentes métodos de medida para un mismo fenómeno, es interesante estudiar hasta qué punto los resultados obtenidos con ambos instrumentos son equivalentes. La concordancia entre métodos es de sumo interés en la práctica clínica habitual.9,16,100,101 La concordancia entre mediciones puede alterarse no sólo por la variabilidad de los observadores, sino por la variabilidad del instrumento de medida, por el propio proceso a medir si se realiza en momentos y/o métodos diferentes. Por todo ello, son necesarios estudios como este que intenten estudiar el grado de Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 144 5. 3. EN CUANTO A LA INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA DE LOS FLUOROCROMOS. En un segundo plano, se decidió estudiar la intensidad de fluorescencia de los distintos fluorocromos utilizados en este estudio y cómo varían según el protocolo empleado. El propósito del análisis del inmunofenotipado en la serie linfocítica es la identificación y enumeración de estas subpoblaciones linfocitarias. La determinación de la intensidad de fluorescencia puede añadir información biológica relevante, dado que esta intensidad está directamente relacionada con los niveles de expresión antigénica. A su vez, por tanto, esta información puede tener implicaciones directas sobre el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de determinadas condiciones patológicas.105 Los resultados obtenidos no deben ser extendidos a todos los fluorocromos empleados en el campo de la citometría de flujo, ni tan siquiera a los fluorocromos utilizados en este estudio, entendidos desde su concepto más genérico. Los resultados han de ser, por tanto, aplicables sólo y exclusivamente a los productos comerciales que se han empleado en este estudio, ya que existe constancia de la variabilidad en la intensidad de fluorescencia, dependiendo de la marca comercial utilizada. Es importante pues, dejar constancia que los fluorocromos utilizados han sido: PE MOUSE ANTI-HUMAN Ig D, APC-Cy™7 Mouse Anti-Human CD19, PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti- Human CD38, Anti-Human CD 27 APC Y Pacific Blue™ Mouse Anti-Human CD3. 5.3.1. INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA DE IgD Y CD27. CLASIFICACIÓN EUROCLASS. Si tomamos la siguiente tabla (tabla 22), en la que se evalúan los dos fluorocromos necesarios para la obtención de la clasificación de Euroclass: Ig D y CD27, podemos sacar algunas conclusiones. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 145 Tabla 22: se observa resaltado en negrilla y desplazado hacia la izquierda de la celda, el valor del coeficiente de correlación intraclase más alto para cada uno de los fluorocromos estudiados (CD 19, IgD y CD27) distribuidos según las subpoblaciones linfocitarias (DN, Naive, Unswitched memory y Switched memory) agrupados según el procesamiento de muestra utilizado. Coeficiente de Correlación intraclase Sig. IgD.DN.SF_FM 0,079 0,00 IgD.DN.SF_LYSIS 0,081 0,375 IgD.DN.SF_SF24H 0,449 0,024 IgD.Naive.SF_FM 0,99 0,00 IgD.Naive.SF_LYSIS 0,998 0,00 IgD.Naive.SF_SF24H 0,958 0,00 IgD.Unswitched.SF_FM 0,982 0,00 IgD.Unswitched.SF_LYSIS 0,988 0,00 IgD.Unswitched.SF_SF24H 0,948 0,00 IgD.Switched.SF_FM 0,813 0,00 IgD.Switched.SF_LYSIS 0,589 0,001 IgD.Switched.SF_SF24H 0,535 0,006 CD27.DN.SF_FM 0,176 0,261 CD27.DN.SF_LYSIS 0,005 0,494 CD27.DN.SF_SF24H 0,645 0,00 CD27.Naive.SF_FM 0,78 0,00 CD27.Naive.SF_LYSIS 0,789 0,00 CD27.Naive.SF_SF24H 0,248 0,003 CD27.Unswitched.SF_FM 0,898 0,00 CD27.Unswitched.SF_LYSIS 0,889 0,00 CD27.Unswitched.SF_SF24H 0,832 0,00 CD27.Switched.SF_FM 0,739 0,00 CD27.Switched.SF_LYSIS 0,796 0,00 CD27.Switched.SF_SF24H 0,458 0,00 En ella se puede observar que apenas 6 determinaciones presentan un CCI superior a 0,9. Estas son: IgD Naive SF_FM, IgD Naive SF_Lysis, Ig D Naïve SF_SF24h, Ig D Unswitched SF_FM, IgD Unswitched SF_Lysis e IgD Unswitched SF_SF24h. En ningún caso se observa que CD27 alcance una correlación muy buena (> 0,9). No obstante, en la mayoría de los casos, tanto para CD27 como para IgD, los CCI están comprendidos entre 0,7-0,9, indicando una correlación buena. Por otra parte, se observa que CD27 en la subpoblación DN (valor máximo de CCI es 0,645) e IgD en DN (valor máximo de CCI es 0,449), presentan en todos los procedimientos utilizados una correlación moderada o pobre. Es importante tener en cuenta que esta subpoblación (Double Negative –DN-) se obtiene gracias a la falta de fijación de IgD y CD27 en su superficie, de ahí su nombre (doblemente negativa para Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 146 los dos fluorocromos utilizados). Con lo cual, esta falta de correlación está determinada por este hecho y no tanto por la fluorescencia de los fluorocromos. En la gráfica 3 aplicado sólo para IgD, este dato puede observarse de un modo más gráfico. Son las subpoblaciones de ambos extremos (DN y Switched Memory) las que peor correlación obtienen, coincidiendo con las subpoblaciones definidas por la falta de fluorescencia en el citómetro: DN (IgD- CD27-) y Switched Memory (IgD- CD27+). En cambio las centrales, aquellas que están definidas por una positividad de fluorescencia en su análisis citométrico (Unswitched Memory IgD+ CD27+ y Naive IgD+ CD27-), tienen una correlación buena y muy buena. Con lo cual, se puede determinar que el fluorocromo IgD tiene una óptima correlación en la intensidad de fluorescencia según los distintos proceso en estudio. Gráfico 3: en el eje de ordenadas se representa el coeficiente de correlación. En el eje de abscisas se representan la intensidad de fluorescencia del fluorocromo IgD en las distintas subpoblaciones linfocitarias tipo B (Naive, DN, Unswichted memory y Switched memory) cuando se comparan los procedimientos en estudio (FM, Lysis y SF24h) con la prueba “gold standard” (Sangre Fresca representada con las siglas SF). En la gráfica 4 aplicado sólo para CD27, ocurre de forma similar lo observado en IgD. Son las subpoblaciones definidas por una positividad de fluorescencia en su análisis citométrico (Unswitched Memory IgD+ CD27+ y Switched Memory IgD- CD27+), las que tienen una correlación buena y muy buena. Con lo cual, se puede determinar que el fluorocromo CD27 tiene una óptima correlación en la intensidad de fluorescencia según los distintos proceso en estudio (0,7-0,9). 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 147 Sólo cabría destacar que CD27 disminuye su intensidad de fluorescencia de forma importante (CCI de 0,458) en la subpoblación Switched Memory cuando el procesamiento de la sangre se demora unas 24h (Procedimiento denominado SF24h). Gráfico 4: en el eje de ordenadas se representa el coeficiente de correlación. En el eje de abscisas se representan la intensidad de fluorescencia del fluorocromo CD27 en las distintas subpoblaciones linfocitarias tipo B (Naive, DN, Unswichted memory y Switched memory) cuando se comparan los procedimientos en estudio (FM, Lysis y SF24h) con la prueba “gold standard” (Sangre Fresca representada con las siglas SF). Sirva esta figura para ilustrar lo comentado líneas atrás. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 148 5.3.2. INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA DE Ig D Y CD38. CLASIFICACIÓN B mature. Centrados ahora en la clasificación B mature, concretamente en el fluorocromo CD38 (tabla 25) se observa como sólo las subpoblaciones Bm2 y Early Bm5 superan un CCI >0,9 (correlación muy buena). Son late Bm5 y Bm1 las que peores CCI obtienen (en ambos casos menor de 0,7), lo que corresponde con una correlación muy pobre. Tabla 25: se observa, resaltado en negrilla y desplazado hacia la izquierda de la celda, el valor del coeficiente de correlación intraclase más alto para la intensidad del fluorocromo CD38, distribuidos según las subpoblaciones linfocitarias (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5) agrupados según el procesamiento de muestra utilizado. Coeficiente de Correlación intraclase Sig. CD38.BM1.SF_FM 0,559 0,004 CD38.BM1.SF_LYSIS 0,541 0,005 CD38.BM1.SF_SF24H 0,521 0,007 CD38.BM2.SF_FM 0,935 0 CD38.BM2.SF_LYSIS 0,927 0 CD38.BM2.SF_SF24H 0,959 0 CD38.BM2P.SF_FM 0,511 0,01 CD38.BM2P.SF_LYSIS 0,673 0 CD38.BM2P.SF_24H 0,485 0,007 CD38.BM3y4.SF_FM 0,552 0,002 CD38.BM3y4.SF_LYSIS 0,737 0 CD38.BM3y4.SF_24H 0,278 0,067 CD38.EarlyBM5.SF_FM 0,805 0 CD38.EarlyBM5.SF_LYSIS 0,843 0 CD38.EarlyBM5.SF_24H 0,9 0 CD38.LateBM5.SF_FM 0,081 0,377 CD38.LateBM5.SF_LYSIS 0,39 0,029 CD38.LateBM5.SF_24H 0,488 0,004 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 149 Esto puede contemplarse de forma más gráfica en la siguiente ilustración (gráfico 5). Mantenemos por tanto el mismo discurso que para IgD y CD27 en la clasificación EUROClass. La positividad de fluorescencia del CD38 propia de estas dos subpoblaciones: Early Bm5 IgD-CD38+ (mayor de 0,8 de CCI en todos los procedimientos) y Bm2 IgD+ CD38+ (mayor de 0,9 de CCI en todos los procedimientos), se correlaciona con el alto grado de correlación en los resultados de la intensidad de fluorescencia (ver gráfico 5; cuadros en rojo). No obstante, existe una discrepancia respecto a lo que hemos comentado. Las subpoblaciones Bm3/Bm4 (IgD- CD38++) y Bm2´ (IgD+ CD38++) son definidas por una mayor positividad para el CD38. Sin embargo, su CCI en ambos casos está en torno a 0,6-0,7 (correlación moderada). Esto se debe a que estas subpoblaciones son muy escasas en la población humana sana, de ahí que las posibilidades de establecer fuertes procesos de correlación no sea posible; por ello algunos de estos datos no son estadísticamente significativos (p<0,01). La subpoblación Bm2´ tiene una media de representación de un 2,98%. Por su parte, los centroblastos Bm3 y centrocitos Bm4 son aún más escasos y no suelen superar la representación del 0,2-0,3% del total de subpoblaciones.15 Gráfico 5: En el eje de ordenadas se representa el coeficiente de correlación. En el eje de abscisas se representan la intensidad de fluorescencia del fluorocromo CD38 en las distintas subpoblaciones linfocitarias tipo B (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5) cuando se comparan los procedimientos en estudio (FM, Lysis y SF24h) con la prueba “gold standard” (Sangre Fresca representada con las siglas SF). 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 CD38.BM1.SF_FM CD38.BM1.SF_LYSIS CD38.BM1.SF_SF24H CD38.BM2.SF_FM CD38.BM2.SF_LYSIS CD38.BM2.SF_SF24H CD38.BM2P.SF_FM CD38.BM2P.SF_LYSIS CD38.BM2P.SF_24H CD38.BM3y4.SF_FM CD38.BM3y4.SF_LYSIS CD38.BM3y4.SF_24H CD38.EarlyBM5.SF_FM CD38.EarlyBM5.SF_LY… CD38.EarlyBM5.SF_24H CD38.LateBM5.SF_FM CD38.LateBM5.SF_LY… CD38.LateBM5.SF_24H Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 150 En relación a IgD, no hay cambios en cuanto al discurso que se sigue hasta ahora. Su intensidad de fluorescencia tiene una buena correlación en todos los procesamientos de muestra utilizados, dado que los CCI superan el 0,9, para con las subpoblaciones linfocitarias IgD+: Bm1, Bm2 y Bm2´. Por el contrario, las supoblaciones definidas por IgD- (Early Bm5 y Late Bm5) sus CCI son más discretos, debido a que la intensidad de fluorescencia no está presente, por ser subpoblaciones muy pobres en marcadores de superficie para este fluorocromo. Tabla 27: se observan los valores de Alfa de Cronbach, matriz de correlación interelementos y el coeficiente de correlación intraclase (con su nivel de significación añadido), de la intensidad del fluorocromo IgD en cada una de las subpoblaciones linfocitarias estudiadas (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5) cuando se comparan los distintos procesamientos de muestras (FM, Lysis y SF24h) con el procesamiento designado como “gold standard” (SF). Alfa de cronbach Coeficiente de Correlación intraclase Sig. IgD.BM1.SF_FM 0,989 0,989 0 IgD.BM1.SF_LYSIS 0,985 0,983 0 IgD.BM1.SF_SF24H 0,971 0,967 0 IgD.BM2.SF_FM 0,997 0,997 0 IgD.BM2.SF_LYSIS 0,998 0,998 0 IgD.BM2.SF_SF24H 0,977 0,962 0 IgD.BM2P.SF_FM 0,988 0,987 0 IgD.BM2P.SF_LYSIS 0,99 0,99 0 IgD.BM2P.SF_24H 0,985 0,975 0 IgD.BM3y4.SF_FM 0,712 0,713 0 IgD.BM3y4.SF_LYSIS 0,783 0,763 0 IgD.BM3y4.SF_24H 0,726 0,683 0 IgD.EarlyBM5.SF_FM 0,982 0,983 0 IgD.EarlyBM5.SF_LYSIS 0,981 0,98 0 IgD.EarlyBM5.SF_24H 0,991 0,991 0 IgD.LateBM5.SF_FM 0,752 0,755 0 IgD.LateBM5.SF_LYSIS 0,668 0,651 0 IgD.LateBM5.SF_24H 0,69 0,667 0 Gráfico 6: En el eje de ordenadas se representa el coeficiente de correlación. En el eje de abscisas se representan la intensidad de fluorescencia del fluorocromo IgD en las distintas subpoblaciones linfocitarias tipo B (Bm1, Bm2, Bm2p, Bm3y4, EarlyBm5 y LateBm5) cuando se comparan los procedimientos en estudio (FM, Lysis y SF24h) con la prueba “gold standard” (Sangre Fresca representada con las siglas SF). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 151 Sirva esta figura para ilustrar lo comentado líneas atrás. Finalmente, se han fusionado todos los resultados de las distintas subpoblaciones linfocitarias, agrupadas según las dos clasificaciones linfocitarias estudiadas: (1) Clasificación Euroclass (con IgD y CD27) y B mature (con IgD y CD38), observándose como en todos los casos, excepto el fluorocromo CD38 en la clasificación B mature, según los procesamientos de muestras FM y 24h (donde se obtuvo un CCI de 0,883 y 0,817, respectivamente), la correlación es muy buena (CCI>0,9). Por todo ello, podemos concluir que LA INTENSIDAD DE SEÑAL NO SE VE AFECTADA EN NINGUNO DE LOS TRES PROCESAMIENTOS DE MUESTRA UTILIZADOS, CON UN CCI MAYOR DE 0,9; LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON CADA UNO DE ESTOS PROCESAMIENTOS SERÍAN MUY FIABLES Y SIMILARES A LOS OBTENIDOS EN LA PRUEBA “GOLD STANDARD” (MUESTRA SANGUÍNEA PROCESADA A LOS POCOS MINUTOS DE SU EXTRACCIÓN). Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 152 Tabla 30: se observan los valores de Alfa de Cronbach y el coeficiente de correlación intraclase (con su nivel de significación añadido), de la intensidad de fluorescencia de los fluorocromos IgD, CD27 y ambos unidos (IgD/CD27), para la determinación de las subpoblaciones linfocitarias tipo B según la Clasificación EuroClass, cuando se comparan los distintos procesamientos de muestras (FM, Lysis y SF24h) con el procesamiento designado como “gold standard” (SF). Alfa de Cronbach Coeficiente de Correlación intraclase Sig. IgD.Euroclass.SF_FM 0,994 0,994 0 IgD.Euroclass.SF_Lysis 0,999 0,998 0 IgD.Euroclass.SF_24h 0,98 0,977 0 CD27.Euroclass.SF_FM 0,989 0,989 0 CD27.Euroclass.SF_Lysis 0,992 0,991 0 CD27.Euroclass.SF_24h 0,997 0,967 0 IgD/CD27.Euroclass.SF_FM 0,994 0,994 0 IgD/CD27.Euroclass.SF_Lysis 0,998 0,998 0 IgD/CD27.Euroclass.SF_24h 0,98 0,978 0 Tabla 31: se observan los valores de Alfa de Cronbach y el coeficiente de correlación intraclase (con su nivel de significación añadido), de la intensidad de fluorescencia de los fluorocromos IgD, CD38 y ambos unidos (IgD/CD38), para la determinación de las subpoblaciones linfocitarias tipo B según la Clasificación Bmature, cuando se comparan los distintos procesamientos de muestras (FM, Lysis y SF24h) con el procesamiento designado como “gold standard” (SF). Alfa de Cronbach coeficiente de Correlación intraclase Sig. CD38.Bmature.SF_FM 0,883 0,881 0 CD38.Bmature.SF_Lysis 0,923 0,922 0 CD38.Bmature.SF_24h 0,817 0,677 0 IgD.Bmature.SF_FM 0,995 0,995 0 IgD.Bmature.SF_Lysis 0,996 0,996 0 IgD.Bmature.SF_24h 0,986 0,984 0 CD38/IgD.Bmature.SF_FM 0,939 0,939 0 CD38/IgD.Bmature.SF_Lysis 0,958 0,958 0 CD38/IgD.Bmature.SF_24h 0,908 0,902 0 Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 153 6. CONCLUSIONES. 1. El porcentaje de marcadores expresados en la superficie celular (necesarias para la tipificación de las subpoblaciones linfocitarias) no se ve afectada por el tipo de procesamiento de muestra utilizado: SF, SF24h, FM y Lysis. 2. La intensidad de fluorescencia de los fluorocromos utilizados no se ve afectada en ninguno de estos procedimientos. 3. Los resultados finales de expresión de marcadores de superficie no se ven influenciados por la combinación de los fluorocromos utilizados. 4. Como excepción de lo anterior, se podría observar mínimas modificaciones de algunas subpoblaciones con preparaciones concretas, que se recogen en el anexo III. Los gráficos de Bland y Altman para cada una de las subpoblaciones linfocitarias, cuando se comparan los 3 procedimientos en estudio respecto al “gold estándar”, proporcionan una herramienta para ver si los resultados se correlacionan en cada una de las situaciones mencionadas. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 256 SUJETO 41 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 257 SUJETO 42 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 258 SUJETO 43 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 259 SUJETO 44 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 260 SUJETO 45 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 261 SUJETO 46 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 262 SUJETO 47 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 263 SUJETO 48 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 264 SUJETO 49 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 265 SUJETO 50 (Clasificación IgD/CD38) Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 272 6. BM 2. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 273 7. BM 3 y 4. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 274 8. PRE GERMINAL CELL (PRE-GC). Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 275 9. LATE BM5. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 276 10. EARLY BM5. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 277 1. INTENSIDAD CD19. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 278 2. INTENSIDAD DE IgD EN DOBLE NEGATIVAS. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 279 3. INTENSIDAD DE IgD EN NAIVE. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 280 4. INTENSIDAD DE IgD EN UNSWITCHED MEMORY. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 281 5. INTENSIDAD DE IgD EN SWITCHED MEMORY. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 288 3. INTENSIDAD DE CD38 EN Bm2p. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 289 4. INTENSIDAD DE CD38 EN Bm3y4. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 290 5. INTENSIDAD DE CD38 EN EarlyBM5. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 291 6. INTENSIDAD DE CD38 EN LateBM5. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 292 1. INTENSIDAD DE IgD EN BM1. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 293 2. INTENSIDAD DE IgD EN BM2. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 294 3. INTENSIDAD DE IgD EN BM2p. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 295 4. INTENSIDAD DE IgD EN BM3y4. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 296 5. INTENSIDAD DE IgD EN EarlyBM5. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla Alejandro Muñoz Jiménez 297 6. INTENSIDAD DE IgD EN LateBM5.