Caracterización espectroscópica y aromática de vinagres españoles con denominación de origen protegida

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACI A DEPARTAME NTO DE NUT RICIÓ N Y BROM ATOLOGÍA, TOXICO LOGÍA Y MEDICINA LEGAL CARACTERIZACIÓN ES PECTROS CÓPICA Y ARO MÁTICA DE VINAGRES ESP AÑOLES C ON DENO MINACIÓN DE O RIGEN PROTEGIDA Memoria presentada para optar el Título de Doctor por la Universidad de Sevilla con la mención de “Doctor Internacional” por la licenciada ROCÍO RÍOS REINA DIRECTORES Raquel Mª Callejón Fernández Diego Luis García González José Manuel Amigo Rubio Sevilla, 2019 AGRA DECIMIEN TOS Rocío Ríos Reina ag radece al a la a yuda econó mica y logística pre stada por la s siguientes instituciones gracias a la cu al ha sido podido d esarrollar esta Tesis d octoral: - Minis te rio de Educació n, Cultura y Depo rte del Gobie rno de España por la co ncesión de l Contrato Pre - doctoral para la Formación de Profesorad o Universitario (FPU) conv oca tor ia 20 14. - Minis te rio de E ducació n, Cultura y D eporte de l Gobierno de Es paña po r la co ncesión de la ayuda a la m ovilidad pa ra la realizaci ón de la estan cia breve en la Univ ersidad de Módena y Reggio E milia, Italia, conv.2016. - Ministerio de Ciencias, Inn ovac ión y Universidades del Gobierno d e España por l a concesión de la ayuda a la m ovilidad para la realización de la estancia brev e en la Universidad de Copenhag ue, Dinamarca , c onv. 20 17. - Consejería de Economía, I nnovación Y Ciencia. Secr etaria General d e Universida des , In vestig aci ón y Tec nol ogí a Junta de Andal ucía, a través del pr oyecto de Ex celenc ia AGR - 1601. Asimismo, esta tesis ha podido llevarse a cabo gracias a las muestr as y material propo rc ionado po r los Co nsejos Reguladores de las D enominaciones de Orig en Protegidas españolas Vinagre de Jerez , Vinagre d e C ondado de H uelva y Vinagre de M ontilla - Moril es y sus bodegas adscritas, así c omo por la c olaboración de Bodega s Robl es, produc tora de vinos y vinagres de la Denominación Origen Montilla - Moriles . La doctoranda también agradece al Dpto. de Ciencia Química y Ge ología de la Universidad de Módena y R egio Emilia (Italia) y al Dpto. de Ci encias de l os Alimentos, Calida d y Tecn o lo gí a de la Univ ersidad de C openhagu e (Dinamarca) por la acogida r ecibida e n las estancia s predoctorales realizadas, a sí como al Dpto. d e Química An alítica de la Universidad de Sevilla, a los Servicios Generales de l a Universidad de Se villa (CITIUS) y al Instituto de la Grasa (CSIC) p or las instalaciones y servicios prestados. AGRA DECIMIEN TOS PERS ONALES No pued o cr eerme haber ll egado a es te m oment o… To do empezó en ma yo de 2014, cuando por obra del des tino o po r algo que no llego a com prende r , la Dra. Raquel Callej ón, en ese ento nces profe sora del máste r que cursaba , y actu almente mi direct ora de t esis, co mentó algo sobre un pr oyec to de vi nagres durante una de las clas es y yo en ese mome nto lo v i claro , se me despertaron las ganas de investigar . Y desd e e nton ce s h e p asado más d e 5 añ os e n el Departamento de Nutrición y Br omatología de la F acultad de Farmacia, facultad que p or cierto me ha visto crec er.. . En primer lugar, y co mo no podía ser de otro modo, quiero agrade cer de corazón a mi s director es de t esis , Raquel Mª Callejón Fernández, Di ego Luis García González y José Man uel Amigo Rubi o. Los tres hac éis u n equi po p erfec to. R aquel, gracias por haber confiado en mí acept ándom e desde ese prime r día, po r tu pacie ncia, apoyo , compre nsión, po r estar ahí en todo m omen to de es ta tesis , tant o e n lo s bue nos como e n l o s m alo s, po r b us c ar t o do lo me jo r p a ra mí, y, en resumen, por ser co mo mi segund a herman a mayor, o como algu nos d ecían, por ser mi “mama” en el trabaj o. Eres la principal respo nsable d e que haya empezado, rea lizado y terminado esta tesis. Dieg o, gracias por tod os tus c ons ej os, p or tu en orme paciencia y por ense ñarme tanto s conoci mientos tanto cien tíficos como de cualquier índole. Y J o sé, gracias p or aco germe en Cope nhague , por a yudarme al lí cuan do la cosa se ponía difícil, por en señarme todo lo que sé de quimio metría, y p or esos m omentos de ch arlas, café y cervezas, que no to do s t ie n en la sue rte de pode rlo hac er con uno de sus dire ctor es de tesi s. Espero que un dí a mi réis atr ás y os sintáis tan orgullosos d e vuestra doctorand a com o yo me sient o de mis direct ores. Po r supuesto , doy las gracias a todos mis compañe ros del depart amento , todos los que han est ado y los que están. Gracias a las doctoras Ana Mª Tro ncoso y Mª Carmen García Parrilla, por darme la oportunidad de comenzar esta carrera científica integrándome e n su grupo de investigación , por sus consejo s y su apoyo . Continuando po r lo s q u e y a no e st á n e n el dep artamento, gracias a J osé Luís, mi pepel u, compañero de coche , de mil cotill eos y dudas , a Ru th y M ª Antoni a, porque fuisteis la s primera s “becaria s” que esta bais a hí cuando l legué, gracias por recib irm e y a cog erme , por tantas c omidas y ratos que pasamos. Gracias al resto de mis compañer os que han est ado conmigo desde e l inicio hast a ho y. Especi al agradecimient o la Dra. Mª L ourdes Morales , po r compartir su valiosa exp eriencia , por su ap oyo y po r su ayud a siempre que s e la he pedid o, así como p or tant os m ome n tos di vert id os vivid os fuera del laboratorio. A Ana Belén por su apoy o y po r los momentos de d e speje en ta nta s ÍNDICE 3 1.4.2. M é to dos para el análisis se nsorial ......................................................................... 55 1.4.2. 1. Olor y sabor ................................................................................................ . 5 6 1.4.2. 2. Color ............................................................................................................ 56 1.4.3. M étodos para el análisis fis icoquímico .................................................................. 5 7 1.4.3. 1. Técnicas cromatográficas ............................................................................ 59 1.4.3. 1.1. Determinación d e compue stos volátiles y aromas .......................... 59 1.4.3. 1.1.1. Técnicas de extracción .................................................... 5 9 1.4.3. 1.1.1. 1. Extracción en e s pacio en cabeza dinám ico (DHS) ................................ 61 1.4.3. 1.1.1. 2. Microextracción en fase sólida en es pacio e n cabeza estátic o (HS - SPME ) ............................................................................... 61 1.4.3. 1.1.1. 3. Extracción p or s orci ón en esp aci o en ca beza est ático (HSSE) .................................................................................................. 62 1.4.3. 1.1.2. Cromatografía de ga ses - e spectrom etría de masas (GC - MS) ................................................................ 63 1.4.3. 1.1.3. C romatografía de gases a coplada con olfatometría (GC - O) ....................................................... 64 1.4.3. 2. Técnicas espectroscópicas .......................................................................... 69 1.4.3. 2.1. Espec troscopía de infrarrojo medi o (M IR) ...................................... 6 9 1.4.3. 2.2. Espectroscopía de infrarrojo cercano (NIR) ..................................... 71 1.4.3. 2.3. Espectroscopía de fluorescencia multidimensional (EF M) ................................................................................................ 72 ......................................................................................................... 1.4.3. 2.4. Espect roscopía de u ltravioleta - visible (UV - vis) ............................... 74 1.4.3. 2.5. Espect roscopia de resonan cia magnética n uclear (RMN) ............................................................................................... 74 1.5. QU IMIO METR ÍA .......................................................................... 7 6 1.5.1. P re - pro c e s a do y norma lizació n de los datos ......................................................... 79 1.5.1. 1. Variable aleatoria normal tipificada (SN V, Standard Normal Variate) ........................................................................................................ 79 1.5.1. 2. Suaviza do ( SMT, Smoothi ng) ...................................................................... 80 1.5.1. 3. Corrección de la línea base (baseline correction) ....................................... 80 1.5.1. 4. Centrado en la media (MC, me an centering) .............................................. 80 1.5.1. 5. Escalado y autoescalad o (scaling and autoscaling ) ..................................... 8 1 ÍNDICE 4 1.5.2. M é todos no s uperv isados , exploratori os o de rec on ocimien t o de patro nes ................................................................................................................. 8 2 1.5.2. 1. Análisis de component es principales (PCA) ................................................ 82 1.5.3. M étodos se mi - superv isados , méto dos de de scomposició n de múltiples vías, o mét odos de resolución múltiple (N - w ay method s) .................... 84 1.5.3. 1. Análisis paralelo de fac tores (PARAFAC) ..................................................... 84 1.5.3. 2. R esolución multivaria nt e de c urvas (M C R) ................................................. 8 5 1.5.4. M éto dos supe rvisados ........................................................................................... 88 1.5.4. 1. Métodos de regresi ón o calibración linear ................................................. 88 1.5.4. 1.1. Reg resi ón de m ínimos cuadrad os parciales (PLS) ........................... 88 1.5.4. 1.2. Reg resi ón de m ínimos cuadrad os parciales de múltiples vías (N - PLS) ...................................................................................... 89 1.5.4. 2. Métodos de clasificac ión ............................................................................. 90 1.5.4. 2.1. Modelado suave inde pendiente por analogí a de clas es (SIMCA) ............................................................................................ 90 1.5.4. 2.2. Análisis discriminant e sobre mí nim o s c uadrad os p arciales (P LS - DA) ............................................................................ 91 1.5.4. 2.3. Análisis discriminant e N - PLS (N PL S - DA) .......................................... 92 1.5.4. 2.4. Máquina de vectores de soport e (SVM) .......................................... 9 2 1.5.4. 2.5. Modelo de clasifi cación jerárqu ica (HCM ) ....................................... 93 1.5.5. T écni cas de fus ión de da tos ................................................................................... 95 1.5.6. Método de r emu estr eo - bootst rapping ................................................................ . 98 2. JUSTIFICA CIÓN Y OBJ ET I VOS .............. ............. ........ 101 3. MATERIAL ES Y MÉTODOS ....................... .............. .. 109 1.6. MUEST RA S ...................................................................................................... 112 1.7. MAT ERIA LES, INST RUMENT ACI ÓN Y P ROCE DIMI ENTOS AN ALÍT IC OS ................. 115 1.7.1. Análisis es pectroscópico ....................................................................................... 115 1.7.1. 1. Espectroscopía de infrarroj o medio con Transfor mada de Fourier y cristal de Reflac tancia total at enuada (ATR - FT I R ) ....................... 1 15 1.7.1. 2. Espec trosco pía de Infrarrojo cercano (NIR) ................................................ 116 1.7.1. 3. Espectroscopía de fluorescencia multidimensional (EFM) ......................... 1 17 1.7.1. 3.1. Determinación d e huella dig ital o perfil espectr oscóp ico ............................................................................... 117 ÍNDICE 5 1.7.1. 3.2. Determinación d e la prese ncia o concentración de caramelo de mosto .......................................................................... 1 18 1.7.1. 4. Resonancia magnética nuclear de protone s ( 1 H- RMN) .............................. 119 1.7.1. 5. Espec trosco pía de u ltravioleta - visible (UV - vis) ........................................... 120 1.7.2. Análisis crom atográfico: GC - MS, GC - MS - O .......................................................... 122 1.7.2. 1. Extracci ón p or s orci ón en esp acio en cabeza es tátic o (HSSE) .................... 123 1.7.2. 2. Extracción por espacio de cabeza dinámic o (DHS) ..................................... 123 1.7.2. 3. Microextracción en fase sólida en e spacio de cabeza (HS - SP M E) .......................................................................................................... 1 23 1.7.2. 4. Extr acción Líqui do - L íquido (EL L) ................................................................ . 123 1.7.3. Análisis sensor ial ........................................................................... 126 1.7.3. 1. Pruebas descripti vas ................................................................................... 127 1.7.3. 2. Pruebas de ordenación ............................................................................... 1 28 1.7.3. 3. Pruebas triangulares ................................................................................... 129 1.7.4. Análisis iso tópico 13 C/ 12 C y 18 O/ 16 O ........................................................................ 129 1.7.5. Análisis quim iométrico de los dato s ...................................................................... 131 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................... .............. .. 133 BLOQUE I : CAR ACTER IZAC IÓN Y CLAS IF ICAC IÓ N ESPE CTR OSCÓ PICA DE LOS VINAGRES DE V INO ESPA ÑO LES CO N DOP ................................................................... 1 35  CAPÍTULO I. Técnicas de es pectroscopía vibracional ............................................... 136 • Artí culo 1 .................................................................................................... 1 42 • Artí culo 2 .................................................................................................... 1 52  CAPÍTULO II. Espectroscopía de fluorescenc ia multidimensional (EFM) ................. 16 8 • Ar tí culo 3 .................................................................................................... 1 74 • Artí culo 4 .................................................................................................... 1 88  CAPÍTULO III. F usi ón de dato s espec troscó picos ( FTI R, NIR, EFM, RMN ) ................ 208 • Artí culo 5 .................................................................................................... 2 12  CAPÍTULO IV. Espectr osc opía de u ltravioleta - visible (UV - vis) ................................ . 232 • Artí culo 6 .................................................................................................... 2 36 BLOQ UE II: C AR ACTE RIZ AC IÓN IS OTÓ PI CA .................................................................... 2 51  CAPÍTULO V. E studio de la huella dactilar del isótopo C – O pa ra vinagres de vino esp añoles con difer entes procedencias g eográficas. .................. 2 52 • Artí culo 7 .................................................................................................... 2 56 ÍNDICE 6 BLOQUE II I : CARA CTER IZAC IÓN Y CLAS IFICAC IÓ N SENS OR IAL D E LOS VINAGRES DE V INO ESPA ÑO LES CO N DOP .................................................................... 2 67  CAPÍTULO VI : Caracterización del perfil volátil de vinagres de vino españo le s con DOP ................................................................................................ . 2 68  Artí culo 8 .................................................................................................... 2 74  Artí culo 9 .................................................................................................... 2 98  CAPÍTULO V II : Caracterización del perfil aromático d e los vinagre s de vino es pañoles co n DOP .......................................................................................... 3 28  Artí culo 10 .................................................................................................. 3 32 BLOQUE IV : DESAR ROLL O DE UN A HERR AM IENT A INFO RMÁ TICA P AR A LA AUTE N TIF ICAC IÓ N Y CLAS IFICA CIÓ N RÁ P ID A DE VI NA GRES. ......................................... 3 79  CAPÍTULO VII: VinegarScan .............................................................. ......... 3 80 5. D ISC USI Ó N GE NE RAL ........................ ............... ..... 393 5.1. FO RTALEZ AS DE LAS T ÉCN ICAS EST UDI ADAS E N LA CAR ACTER IZA CIÓN D E VIN AGRES Y ANÁ LISIS CR ÍTIC O DE SUS POT ENCIA LES A PLICA CIONE S Y DEBILIDAD ES ............................................................................................................... 396 6. CONCLU SIONES/CONCLU SIONS ..... ............. ............. . 4 15 7. BIBILIO GRAF ÍA ............ ............. .............. ............. 427 8. ANEXO S .............. ............. .............. .............. ...... 4 45  Anexo I : Capítulo de libro : Vinegar, In FOODINTEGRIT Y HAN DBOOK. A gu i de to fo od au thenti city i ssue s and analytical s olutions (Callejón, Rí os - R e i n a, Moral es, & Tron c oso, 2018 ) ................................................................................... 4 50  Anexo II : Capítulo de libro : Fraud, quality and m ethods for characterization and authentication of v inegars, in "Advances in Vine gar Production ” ( Ríos - Reina et al., 2018 ). .................................................................................................. 4 74  Anexo III: C apítulo de lib ro : Chemometrics And F ood Traceability , in Comprehe nsive Fo odomics (C aballero, R íos -R eina & A migo 2019 ) ................................................. 50 2 ÍNDICE 7 ÍNDI CE DE FI GURA S Figura 1. A cetificador de F rings. A, bomba de carga; B, airead or y m otor; C, dispositivo para determin ación de alcohol residual; D, válvula entrada agua refrigeración; E, termostato regu lador; F, rotám etro; G, serpentín de refrigeración; H, entrada de aire; I, salida de gases; J, d ispositivo antie spuma. Fuente : ( Polo, Sa nchez - Lue ng o, 199 1). ................................................................................. 32 Fig ura 2 . Esquema de una cuba de pro ducció n de vinagre por el método de cultivo superficial Orleans y pila d e toneles p ara la acetificación p or dicho mé todo en una fábri ca de vinagre. Fuent e: (Po lo, Sa nchez - Lueng o, 19 91). ........................ 33 Figura 3. Zonas geográficas de producción amparadas bajo las denominaciones de origen protegidas de vinagres de vino. ............................................................................ 3 7 Figura 4. Sello de la DO P “Vinagre de Jerez” . .................................................................................................................................... 39 ............................................................................................................................................... Figura 5. E squema del sist ema de enve jecim iento de “criade ras y solera”. ........................ 39 Figura 6. Es quema de las categorías establecidas para la DOP “Vinagre d e Jerez” . .................................................................................................................................... 40 Figura 7. Sello de la DOP “Vinagre del C ondado de Hue lva”. ............................................... 41 Figura 8. Esquema de las categorías establ ecidas para la DOP “Vinagre del Conda do de Huel va”. ............................................................................................................ 43 Fig ura 9 . Sello de la D OP “Vinagre de Montilla - Moriles”. .................................................... 4 5 Figura 10. Esque ma de las cat egorías establecid as para la DOP “Vinagr e de Montilla - Moriles”. ................................................................................................................. 4 5 Figura 11 . E tapas del pr ocedimiento an alítico dirigido y no dirigido para la caracterización, autentificación y clasificación de vina gres. Figura adaptada del capítulo de libro: Ríos - Reina et al., 2018. Fra ud, quality and m ethod s for characterization and authentication of vinegars, BOOK "Advances in Vinegar Pro ductio n" (ANEX O II). ........................................................................................................ 58 Figura 12 . Esque ma d e la s tres técnica s de extra cci ón más utiliz adas en el análisis de vinagres de vin o. .................................................................................................. 62 Figura 1 3. Esquema de un análisis por cromatografía de gases acoplado a detector olfatométrico. ......................................................................................................... 66 Figura 14 . Esquema del an álisis por ATR - FTIR de u na muestr a de Vi nagr e. ......................... 70 Figura 15 . Ejemplo de matriz de excitaci ón - emis ión (EEM ) de una muestra de vinagre. .................................................................................................................................. 73 ÍNDICE 8 Figura 1 6. Esquema de los p rincipales métodos quimiométricos aplicados en el contexto de la auten tificación, caracterización y clasificación en los vinagr es de vino. Capítulo de libro Caballero, Ríos - Reina & Amigo. Comprehens ive Foodomics , 2019 (ANEXO III) . ................................................................................................ 7 8 Figura 1 7. Es quema de l pre - procesado por centrado en la media o mean cent er. ............................................................................................................................................... 81 Figura 18 . Esquem a del pre - procesado por Autoescala do o Atuoscaling. ........................... 82 Figura 19 . Representaci ón esquemática d e la descomposición por PARAFAC de una matriz de excitaci ón - emisión de fluorescencia multidimensional. ................................ 84 Figura 20 . Ejemplo de re solución de un pic o cromatográfico mediante la aplicación de MCR. ................................................................................................................ 87 Figura 21. E squema d e tres tipos de clasificación jerárquica: a ) Flat classification approach, b) Local classifier per nod e, c) L ocal classifier per parent n ode. Lo s círculos representan las clases o grupos y los cuadrad os rojos representan: a ) los últimos nod os predich os; b) clasificad ores binarios; y c) l os clasificadores mult i - clase. ............................................................................................................................ 94 Figura 22 . Ejemplo esquemáti co de una fusión de datos anal ítico s de nive l bajo. ............................................................................................................................................... 96 Figura 23 . Ejemplo esquemático de fusión d e datos de niv el medio . .................................. 97 Figura 24 . Ejemplo esquemático de fusión d e datos de niv el alto . ...................................... 97 Figura 25 . Diagrama de fl ujo de los objetivos a realiz ar en la p resent e T esis Doctoral. ................................................................................................................................ 108 Fig ura 2 6. Imágen es del e quipo utilizado para el análisi s de la s muestras p or ATR - FTIR. ............................................................................................................................... 115 Fig ura 2 7. Imágen es del eq uipo NIR y cube tas utilizadas para el análisis d e las mue stras de v inagre de v ino . ................................................................................................ 116 Fig ura 2 8. Imágenes del equipo de espec tros copía de fluo resce ncia y cubeta utilizados en el presente trabajo de tesis. ............................................................................ 117 Fig ura 2 9. Esquema de la metodología u tilizada para el análisis del cara melo de mosto por EFM. Se muestran las dis tintas adiciones de realizada s a una m ue st ra de vinagre de vin o Crianza, así como las botellas c orrespondientes al caramel o de mosto y vinagre de vino (izquierda) y el equipo de fluor escencia utilizado (derecha). .............................................................................................................................. 119 Figura 30 . Material y equip o utilizado para el análisis de los vinag r es d e vin o p o r 1 H- RMN. ................................................................................................................................ . 1 20 Figura 31 . Procedimien to esquematizado, material y equipos utilizados para el análisis de los vinagres de vino por espectr oscopía UV - vis. ................................................. 121 ÍNDICE 9 Fig ura 3 2. Esquema del p rocedimiento seguido en el análisis cromatográfico (GC- MS y G C- MS - O) por las diferentes técnicas d e extracción. ............................................ 1 24 Figura 3 3. Equipo d e GC 6 890 Agilent u tilizado para el análisis cr omatográfico (GC- MS y GC -O- MS) de las muestras de vinagre d e vino. a) Estación de extracción o brazo automático de muestreo, b) H orno y espectr ómetro d e masas; c) ODP o nariz olfatométrica. .................................................................................... 126 Fig ura 3 4. Imágenes de distintos análisis sens oriales realizados con difer entes fines. ...................................................................................................................................... 1 27 Fig ura 3 5. Ficha d e cata usad a en pruebas descripti vas. ...................................................... 128 Fig ura 3 6. Modelo d e ficha de cata para p ruebas de ord enación. ....................................... 128 Fig ura 3 7. Fichas d e cata para p ruebas triangulares. ........................................................... 1 29 Figura 38 . Equipos utiliza dos para el análisis d e isótopos estables de las mue stras de vinagre de vino del presente t rabajo. .............................................................. 130 Figura 39 . Es quema del modelo jerárquico realizado para el desarrollo de la herramienta o software, ig ual al del capítulo IV. .................................................................. 3 84 Figura 4 0. Instalación med iante extracción del archivo com primid o en la carpeta C:// . .......................................................................................................................... 3 86 Figura 41 . Carpetas y ar chivos presentes en la u bicación del ordenad or “C://VinegarScan” tras la c orrecta instalación del s oftware. ............................................... 3 87 Figura 42 . Ejemplo d e h oja Excel con esp ectro UV - vis y el modo de gu ardarlo en format o “tex to .txt ”. ............................................................................................................. 3 88 Figura 43 . Pantalla inicial del softwar e VinegarScan. ........................................................... 389 Figura 44 . Barra de estado de Windo ws con el ic ono de VinegarScan. ................................ 389 Figura 45 . Ejem pl o d e es pec tr o UV - vis a cargar p or el software. ......................................... 390 Figura 46 . Pantallas del software VinegarS can una vez cargado el esp ectro (imagen superior) y una vez realizado el an álisis al pulsar el b otón Start (i magen inferior). ................................................................................................................................ 3 90 Figura 47. P osibilidades d e color y relleno de la rep resentación gráfica d e la botella de vinagre resu ltante del análisis. ............................................................................. 3 91 Figura 48 . Pantalla final d el software, e n la que el botón Sta rt se inac tiva . ......................... 391 Figura 4 9. Esquema resumen del plan de t rabajo pa ra el logro de los obje tivos de la p resen te Tesi s D octor al. ............................................................................................... 400 ÍNDICE 10 ÍNDICE DE TABLAS Tabl a 1. Clasificación de l os vinagres según sustra to, nombre y región o país de produc ció n y dis tribuc ión. ..................................................................................................... 30 Tabl a 2. Características an alíticas específicas de los vinagres protegidos bajo la DOP Vinagre de Jerez segú n su reglamentaci ón específica (BOJA 15 /10, 2008a). ............................................................................................................................................... 38 Tabl a 3 . Características ana líticas específicas de los vinagres pro t e gi do s b aj o la DOP “ Vinagr e del Condado de Huelva” se gún su regla men tació n específ ica (BO JA 15 /1 0, 20 08 b). ............................................................................................................ 42 Tabl a 4. Características an alíticas específicas de los vinagres protegidos bajo la DOP “Vinagre de M ontilla - Moriles” según su reglamentación específic a (BOJA 03/1 1, 20 08). ......................................................................................................................... 44 Tabl a 5. Métodos oficialmente reconocidos por la O rganiz ación Internacional de la viña y el vino (OIV ) para probar la auten ticidad del vinagre de vino. N ota: Tabla adaptada d el capítu lo de libro: Río s - Reina et al., (2018). Vinegar. FOOD INTEGRI TY Handbo ok. https:/ /doi .org/10 .32741/fi hb. (ANEX O I) . ............................. 53 Tabl a 6. Resumen d el total de muestras de vinagr e de vin o analizadas en el presente trabajo de tesis por distintas técnicas analíticas. .................................................. 113 Tabl a 7. Alg oritmos y metodologías utilizadas en los distintos c apítulos qu e componen la pres ente me moria d e tesis . ............................................................................. 131 Tabl a 8. Técnicas y caract erísticas, ventajas e inconvenientes en su u so para la caracterización de vinagres de vino esp añoles con DO P ...................................................... 4 02 Tabl a 9. Caracterización de las muestras de vinagre d e vino de la DOP Vinagre de Jerez mediante las dist intas técnicas analíticas empleada s en la pr esent e tesis doctoral ......................................................................................................................... 4 08 Tabl a 10. Caracterización d e las muestras de vinagre d e vino de la DOP Vinagre de Montilla - Moriles me dian te las distintas técnicas an alíticas empleada s e n l a presen te tesi s do ctora l .......................................................................................................... 4 10 Tabl a 11. Carac terización d e las muestras d e vinagre de vino de la DOP Vin agre de l Co ndado de Huelv a med iante las distintas técnicas analíticas e mpleada s e n la presente tesis doctoral ...................................................................................................... 4 12 11 ABREVIATURAS ABREVIATU RAS °C Grado centígrado 13 C- RMN Reso nanc ia magnética nu clear de carbono 13 1 H- RMN Reso nanc ia magnéti ca nuclea r de proto nes 3- AFC Pruebas de elecci ón forzada de tres alternati vas 5- HMF 5- hydroxymethylfurfural a.C. Antes de crist o AEDA Aroma extract dilution anal ysis ANOVA Análisis de varianza ASTM Sociedad Americana para Pruebas y Materiales ATR Accesorio de reflectancia t otal atenuada BOJA Boletín Oficial Junta de An dalucía C Conda do de Huel va Cab Inten sidad de colo r por croma CHARM Combi ned hedo nic arom a response mea sureme nt CIS Inye ctor con e nfo que cr iogénic o cm Centím etros CR Crianza DHS Extracción por espacio de c abeza dinámico DOP Den ominac ión de ori gen prot egida DVB / Car boxe n/PD MS Divinilbenceno / Carboxen/ polidimetilsiloxano EEM Matriz de excitación - emi s ió n EFM Espectroscopía de fluoresc encia multidimensional ELL Ext racc ión Líq uido - L íquido ELL Extracción líquido - líqui do FD Fusió n de dato s FID Detector iónico de llama FTIR Espectroscopia de trans misión de infrarrojo c on transformada de Fourier GC Cromatografía de gases GC- MS Cromatografía de gases - e spectrometría de masas GC- MS -O Cromatografía de gases - e spectrometría de masas acoplad o a olfatometría GC-O Cromatografía de gases a coplada c on olfatometría GR Gran R eser va HCM Modelo d e clasifi cación jerárquica HPLC Cromatografía líquida de al ta resolución HSE Extracci ón p or espa cio de c abeza estáti co HSQC Espe ctros de cohere ncia cuántica única h eteronucl ear 1 H- 13 C HSSE Extracción por sorción en espacio en cabeza estático HS - SPME Mic roextrac ción e n fase sólida e n espa cio de cabe za IGP Indicación geográfica pr otegida IR Infrarrojo ABREVIATURAS 12 IS Estándar interno ISO Inter national Or ganization for St andardizati on J Jerez kg kilogramo L Litro LCN Local clas sifie r per node LCPN Local clas sifi er per parent node LVs Variables latentes MC Mean cent ering MCR Reso luc ión de curv as múltiples MCR - ALS Resolución Multivariante de Curvas - Mínimos Cuadrados Alternos MF Frecuencia modificada mg Miligramo MHz Megahercios MIR Espectroscopía de infrarrojo medio mL Mililitro MM Montilla - Moriles mm Milímetros MS Espectr ometría de masas MSD Detect or de espe ctr os de masas NIF Nasal Impact Frecue ncy NIR Espectroscopía de infrarrojo c ercano NIR Espectroscopía de infrarrojo cercano nm Nanóme tros N- PLS Mínimos cuadrados parciales de múltiples vías N- PLS - DA Análisis discriminante N - PLS OAV Valor de actividad aromá tica OENO Oenology OIV Organización Internacional d e la viña y el vino OSH Hiperpl ano d e separa ción óptimo PARAFAC Par allel fact or Analysis PCA Análisis de componentes p rincipales P- Co m d im Pr edictive - Common C omponents and S pecific Weights Analys is PCs Compo nentes princ ipale s PLS Regresión de míni mos cuadrados parciales PLS - DA Análisis Discriminante s obre M ínimos Cuadrad os Parciales ppm Partes por millón PX Pedr o Ximén ez R 2 Coeficiente de deter minación o regresión RE Reser va s Segundo s SBSE Stir Bar S orptive Extract ion SIMCA Mo delado s uave indepe ndiente por analogía de clase s SMT Smoo thing SO Solera RESUMEN 19 especiadas para la categorí a Ped ro Ximénez; y Vinagre de Co ndado de Huelva mos tró un m ayo r porcentaje de odorantes d e impacto resp onsables de aro mas quím ico s , punzant e s y afrutado s . Los resultad os o btenido s son sin duda d e gran i nter és ya que se ha demo strado que lo s vinagres de vi no es pañ oles c on D OP mu est ra n unas características químicas y organolépticas que le otorgan una calidad diferencial con respecto a otr os vinagres, y que ha cen posible su autentificaci ón y clasificación p or diferentes técnicas analíticas. Además, se ha d emo st rado que es posible diferenciar inclu so los vinagres d e entre las tres DOPs y de sus ca tegorías, a p esar de ser producidos de manera muy si milar mediante métodos tradici onales, y en regiones geográficas muy próximas, lo que dificulta su diferenciación, p ero a su v ez les da m ayor valor a los resultados obtenidos e n esta Tesis D octoral. As imismo , el co n ocimient o g enerad o a tra vé s de la caracterización realiz ada de cada una de las muestras por numerosas técn icas analíticas, tanto a nivel espectral como a nivel aromá tico, permitirá dar un valor añadido a l a producción y comercialización de es tos v inagres es pañoles co n DO P . Por ot ro lado , se ha demostrado la capacidad de au tentificación y clasificación de l os vinagres de vino e spañoles c on DOP mediante técnicas espectroscópicas en c ombinación con té cnicas quimi ométricas , con la venta ja de que son técnicas rápidas, económicas y que n o requieren apenas de manipulación de muestra, lo cual supone una v entaja importante frent e a las técnicas analíticas que se utiliza ba n tradi cio nalmente como métodos de cont rol. Esta Tesis Doctoral ha dado lugar a 1 0 trabajos de investigaci ón, 9 de ello s publicados en revistas indexadas con alto índice de impac to , y 3 de ellos galardonados con el “Premio a la publicación científica del mes de la Fa cultad de Farmacia ”. Además, los resu ltados han dado lugar a 15 comunicaci ones a c ongresos internaci onales y a 3 capítul os de libr o. Asi mismo , la presen te Tesis Doct oral ha generado un software informático, que ha sido inscrito en el Registro de P ro pieda d I ntel ectual de la US , el cual ha causad o gran interé s en los Consejos Regula dores y sistemas de auditorías as ociados, así co mo a bodeg ueros, que podrán poner esto s avances en práctica como métodos de control de su s vinagr es. Además, l os conocimien tos g e ne r ad o s en esta Tesis Do ctoral podrán ser aplicados a otros ali mentos españ oles con DOP com o v ino s, ac e it e s, qu es o s o ja mó n , co n objet o de ob tene r modelos de cla sific ación robusto s, c apaces incluso de detectar mues tras adulteradas. SUMMA RY 20 SUMMA RY Foo d aut h entication inv olves the control of a wide range of phy sicochemical and sensor y parameters, which have b een commonly anal ysed by r o bus t analyt ical tech niques , whic h are also expensi ve and laborious, and requi r e sample han dling and trained personne l for thei r use . In addit ion, the compo unds that might be quantifi ed to ensure t he authentic ity of a product are nume rous and a re cont inuo usly changing d ue to the greate r sophi stic ation of the adulteration methods . C onsequen tly, th ere is a gr owing ne ed t o l ook fo r r apid, simple , cheap, ro bust a nd effective analytical m etho ds that d o not req uire sample handli ng, cap able o f authe ntica ting food, classifying them and d etecting adulterati ons or frauds. F or this pu rpose, spec troscopic tec hniques , com bined with che mome tric technique s, have prove n to be usef ul too ls for t he characteriza tion and aut hentica tio n of food pro ducts , as well as for the detection of po ssible adulterations or frauds. Nowadays, one of the food products tha t are b eing affected b y frau d s and counterf eitin g , which there fore req uire th eir auth en tica tion, are thos e that ar e pr o tected under a Protect ed D esignation of Origin (PDO). A mong the prod ucts covere d under a PDO, t he w i ne vinegar is found . T here are thre e recognized wine vin egar PDOs i n Sp a in : "Vi na gre de J erez ", "Vinagre del Condado d e Huelva", and "Vin agre de Montilla - Moriles", all thre e being p roduced in so uthe rn Spain, in And alusia. These PDO wine vinegars have a che mical, aromatic and sensorial complexity, originated and influenc ed by t he raw m ateri al, the prod uction metho d, the compo unds fo rmed duri ng the f ermentat ion, and i n some case s, tho se produced during t he period of time i n which they are a ged in woo den barrels. T here fore, one o f the main parameters neede d fo r determin ing th ese v inegars ’ quality and fo r diffe rentiat ing them f rom others and betwe en each other, is the study of th eir volatile, aromatic an d sensory pr ofile s , whic h had not been do ne to date w ith the thre e Spa nish PDO wine vinegars . In thi s context, th e pres ent Doct oral Th esis en titl ed "Sp ectrosc opic an d ar omati c characterization of Spanish vinegars with protected designation of origin" has, as one of its main objectives, to offer a new analytical meth odology that allows the characterization an d authe ntic ation o f the Spa nish wine vinega rs with PDO, produc ts highly r ecognized i n t he Medite rranea n diet, to en su re that th e cons umer r eceives a p roduct with f ull se curi ty in ter ms of safety, origin, production met ho ds, PDO and category, using a n economic, f ast and simple co n t ro l method t o serve as an alternative to traditional methods. T o achieve this objective , spec trosco pic te chniqu es a r e p r o po s e d to be u se d , in com binat ion wi th chemo metric techniq ues, becau se they a re n on - destructive, s ensitive, rapid and r elatively l ow cost techniques 21 SUMMA RY that ha v e de mons trated their c ompeti tiv eness in the fi eld of foo d chara cteriza ti o n a nd classification . Thus , in t his D octo ral The sis, Spanish PDO w ine vinegars were analysed using medium and near infrared spectroscopy (ATR - FTIR and NIR) , m ultid imensio nal fluor escence spectr oscopy (EFM), ultraviolet - vis ible spectrosco py (UV - Vi s) and pr o t o n n ucle ar magnetic reso nance ( 1 H- NMR). I n additi on, they w ere analysed by stable carbon and oxygen isotopes in order to ensur e th eir a uth enticity and to de tect fraud s . On the other ha nd, the Doctoral Thes is project also aims t o perf orm an aro matic characterization of these PDO win e vinegars by determining their volatile, ar omatic and s ensorial profiles b y gas chr omatography - mass spectr ometr y (GC - MS), olfactometri c (GC- MS - O) an d sens ory analysis, respectively, a s well as the determination of v olatile and ar omatic compounds that could be conside red markers of qual ity and a uthenti city of ea ch P DO. Th e Do cto ral Thesi s pr oject cu l mina tes with the devel opment of a so ft w a re ba sed o n the best c lassific ation model obtai ned in combinatio n with multivariate analysis methods, which ca n be able to ac h i ev e th e afore men tion ed obj ecti ves. Th e aims of this Doctoral Thesis are framed within a general objective of the vinegar indu str y tha t is foc used on o btaining c omprehe nsiv e traceability pro cedures, increas ing c ons umer c onfi dence and str ength ening t he com pet itive ness of companies i n an incr easi ng ly competitive agri - fo o d indust ry . Regarding the chara cterization and spectroscopic au th entica tion, it is worth me ntioning cert ain resul ts obtaine d by the diffe rent spect roscopi c techniques studied. Thus, the anal ysi s of the PD O w ine v ine gars by medi um (ATR - FTI R) and ne ar (N IR) infrared allowed a differentiation of th e categ o ries within ea ch P DO, although go od classification models could not be obtained ( correct classification for some categ ories a ro und 58 %) . On the ot her hand, the mult idimen sio nal fluores cence spec trosco py (EF M) allowe d a g ood PDO and cat egory classification (around 90% of correct classification), as well as it all ow ed the detecti on and quantification of the additi on of grape - must cara mel to th ese vinegar s, being studied fo r the first time. Furthermore , th e analysis of these PDO wine vinegars by 1 H- NMR allow ed the identification of certain compounds resp onsible for the difference between PDO s regardless of the c ategory to whic h the wine vi negars bel onge d. In order to find the best classification model , a fusion of spectroscopic data was also perf or med. The data fusion models obtained improved the classification, pr oviding a mo re efficient differentiation, than th e m odels based on singl e methods . On the other hand, sta ble isotope s analysis of carbon (δ 13 C ) a n d o x y g e n ( δ 18 O ) s ho wed that th e anal ysed s ampl es were not adulte rated, as well as allowed the differe ntiation of th e wine vinegars according to the Spanish g eographical origin, differentiat ing wine vinegars fro m SUMMA RY 22 the no rt h fr om t ho se of t he so uth o f Spain, and even differentiating the three PDO s fr om e a ch other. However, within all the classification models dev eloped by th e different spectroscopic tec hniques studied up to date , t hose o btai ned by U V - vis sp ectroscopy , by means of a portable equipm ent , are worth high lighted . This technique is one of th e simples t, fast est and mos t economical spectros copic tec hnique studie d in t his proje ct, and m o reo v e r, it provide d the best classification models, and even al lowed the dev elop ment of a hierarchical classification m ode l that w as ab le t o diff eren tia te: the m etho d of produc tion of a w ine vinegar, traditional or fast, or what is the sa me, vinegars with PDO from vinega rs without PDO; the agin g time or the categories; different PDOs of wine vinegars; as well as the different categories within each PDO . In addit io n , as it was a portable e quipm ent, it bri ngs a high possib ility to be implemented i n wineries or control agenc ies in the fut ure . Due to the excell ent r esults obt ained by this tec hnique, to geth er with all the ad vantages above m entio ned, the re sults were used to build a software tool called "Vineg arScan", achieving wit h i t the last objecti ve of this Do ctoral Thesis. On the other hand, with respect to the aromatic characterization of the Spanish PDO wine vinegars, first ly, a com p arati ve stud y of the mo st used ex tracti on tech niqu es f or th is typ e of fo o d m atrix was carri ed out, which allowed to sel ect the e xtr acti on technique h eadspa ce sorpti ve ex tracti on (HSSE ) as the most appr opriate extraction technique f or the analysis of thes e PDO wine vinegars , b ecause it extrac ted a gr eater n umber of c omp ounds, all owed a be tter diffe rent iation of t he PDOs and ca tego ries a nd had m ore adv anta ges than t he othe r te chniques studied . Once the e xtrac tion t echn ique was s elec ted , all th e sample s were a naly s e d by HSSE - GC- MS, obtaining a goo d differentiation and classificat ion of the three PDOs and their categ ories according to the volatile profile, as well as all owing the selection of som e volatile markers responsible for this differe ntiation. Furt hermor e , t he study of the aroma o f these v inegars was also carried out by GC - MS - O and sensory analysis which also all owed a differentiation of the PDOs, allowing the selection of some impa ct ar omas a nd key sen sory a ttrib utes res po n s ib l e fo r the differentiation. Thus, in g eneral ter ms, w ine vinegars from the Vinagre de Jer ez P DO showed a higher percentage of green and herba ceous impact odorants, with sweet, spicy an d liqueu r notes for their Pedro Ximénez category; Vinagre de Montilla - Moriles PDO s howed a highe r pe rcentage of impact odorants responsible for a butter - lactic - chees e aroma , with sw eet, to asted and spi cy nu ances fo r the Pedro Ximé nez categor y; and Vi nagre de Condado de Huelva showed a hig her per centage of che mical, pungent and fru ity impact odorants . 23 SUMMA RY The r esults obtain ed are u nd oubtedly of grea t int ere st sinc e it has been demo nst ra ted that Spanish PD O wine vi negars show some ch emical and organoleptic char acteristics that prov ide them a differential quality with respect to other vinegars, and that make possible their authentication and classification by differ ent analytical techniques. In ad dit ion, it h as been show n tha t it i s possible to di fferenti ate e ven th e vi negar s from the th r ee P DOs and th eir cate gorie s, des pite bei ng pro duced by tra ditiona l met hods in a v ery similar way, and in ver y close geographical regions, which makes their differentiation mo re di fficult, but in turn, i t gi ves greater value to the r esults obtained in this Doctoral Thesis. In addition, the knowledge genera ted thr ough th e c har acter ization of eac h of the samples by numerous a nalyti cal tec hniques , both at spectrally and aromatic level s , will give added valu e to the producti on and marketing of these Spanish PDO w in e vinegars. Lik ewise, the ability to auth enticate and classif y Spanish P DO wine vinegar s ha s been demonstra ted by means of spect roscopic techn iques i n combination with che mometrics, with the ad vantage t hat they are fast, econ omical techn iques that do not requi re j ust sample handling, whic h it is an impo rtant a dvantage over the an a lyt i c al tec hniques that were tradition ally used as cont rol methods. This Doctoral Thesis has giv en rise to 10 res earch work s, 9 of them published in in dex ed journals with high impact i ndex, and 3 of them awarded with the "Sci entific Publication Prize of the month of the Facu lty of Pharmacy ". In additio n, the resul ts have led to 15 comm unicat ions to international conferences and 3 book chapters. In addition, this Doct oral Thesis has generated a computer softwar e, whic h has been r egister ed in th e Intelle ctual Prop ert y Regi stry of the US, which has caused great int erest in the Regulatory B oards and associated audit syste ms, as well as winemakers, who may put thes e advances in practice as con tr ol methods of their o wn vinegars. In addition, the knowledge g enerated in this Doctoral Thes is ca n b e appli ed to other Spanish f oo d pro ducts with PDO such as win es, oils, cheeses or ham, in order to obtain robust classification mo dels, bei ng ev en abl e to detect adu lterated sa mples. SUMMARY 24 25 26 1. INTR ODUC CI ÓN INTRO DUCT IO N INTRODUC CIÓN 27 28 INTRODUC CIÓN 1.1. EL V INAGRE El vinagre se define, según la última reglamentaci ón técnico - sanitaria de 2 01 2 (BOE -A- 2012 - 55 29, 2012 ) , c omo “ lí quido apto par a el consum o humano r esult ante de la d oble ferment ación alcohólica y acé tica de pr oductos de origen agrario ”. Por lo t ant o , el vinagre es, de forma resu mida, un líqu ido apto para el consumo human o, que co ntiene una ca ntidad específica de ácido acétic o y agua. El vinagr e es uno de los product os fermentados más an ti guos del m undo , remont ándose su historia a alrededor del año 2000 a .C. , e l cual ha sido co nside rado durante mucho t iempo com o un subpro ducto de m enor v alo r entre los productos alim entarios fermentado s (Solieri & Giudici, 2009) . A pesar de n o tener valor nutricional, s u carácter ácido debido al alto contenid o en ácido acétic o (hasta la descripción del ácido sulfú rico, fue el á cido más fu erte con ocido), facilitó su us o como cons ervant e de alimentos gracias a su activ idad antimicr obiana (Frias, Martinez - Villaluenga, & Peñas, 2017; Mur ooka & Yamshita, 200 8) . E n la act ualida d, el vinagre es un prod ucto impresc indibl e en los hogares de todo el mundo , siendo ampliamente u tilizado como conservante, agente saborizant e y en a lguno s países , incl uso como una bebi da salud able. Est o hace que su demand a esté en cr ecimi ent o. Ade más , el cre cimiento de las p oblacio nes, e l aume nto de lo s ingresos dispo nible s, el a umento de la co nciencia de salud entre los con sumi dores y la indu stria de ali mentos y bebidas son los prin cipales factor es que es tán impul sando el mercado del vinagre . El interés por cocinar comidas gourmet y étnicas h a aumentado entre mu chos consumidores, lo que ha llevad o a la venta d e varios ad erezos, la mayoría de los cual es utilizan vinagre como uno de l os ingredientes cla ve. Adem ás , a unque el vinagre se consume principalment e en la industria de alimentos y b ebidas, también encuentr a aplicaciones e n la industria d e la salud y la li mpieza. E n gener al, el consumo de vinagre, al igual que ocurre con otras b ebidas ferment adas, est á asociado a un determinado patr ó n die tético c on intens as co nnota ciones cult urales y geográficas . As í, e n los países mediterráneos, la may oría del vinagre se usa directamente o se agrega a la s ensaladas o a ve getales crudos o co cidos, sie nd o directa la apreciaci ón de las características organolépticas de l vinagre, y, por tanto , l os vinagres de “ calidad” está n estrecha men te r elaci onad os con es tos p atr ones d e c onsum o. P or el con trar io, en otros p a íse s, la mayoría del vinagre se u tiliza para marinar, escabechar o como par te de salsas, y el impact o organoléptico , y po r ta nto sus cualid ades, son meno s evi dentes. E sta s diferenci as en consumo tam bién vie nen acom pañadas de dif eren cias en la prod ucció n se gún la región o el país, dando lugar a diferentes tip os de vinagres ( Garcia - Parrilla, Torija, M as, Cerezo, & Troncoso, 2016) . INTRODUC CIÓN 35 Por otr o lad o, tres pr ogramas de la UE sobre indicac iones geográficas y especi a lidades tradicionales, conocidos como D enominación de Orige n Protegida (DOP), Indicaci ón Geográfica Protegida (IGP) y Especialidad Tradicional Garantiza da (TSG), se encargan de p romover y proteger los n ombres de los productos agrícolas y alimentos de calidad d iferenciada. Los productos registrados bajo cualquiera de estas tres ind icaciones s e marcan con el logotipo correspondiente para ayudar a su identificación y diferenciación d el resto. Estos están re cogidos en el Reglamento nº 1151/2012 del Parlamento Europeo y del Co nsejo d el 21 de no vi embre de 2012 sobre los regímen es de calidad de los producto s agrícolas y aliment arios (Regulation EU 1151, 2012) , el cual es aplicado en la UE, aunque s e está expandie ndo gr adualmen te a nivel internacional mediante acuerdos bilat erales. Respecto a los vinagres, actualm ente hay cinco DOP: tres de Espa ña (Vin agre de Jer ez, Vi nagre de Condado de Hue lva y V inagre de Montilla - Moriles) y dos d e Italia ( A ceto Balsa mico Tradizionale de Modena y Ac eto Balsamic o Tradizional e di Reggio E milia ). Además, exist e otro tipo de vinagre italiano denominado “ Ac e to B a lsa m ic o di Mo dena ” que es tá registrado como una IGP. 36 INTRODUC CIÓN 1.1.3. VINAG RE S DE VIN O TR ADICION AL E S: DEN OMI NAC IO NES DE ORI GE N PROTE GI DAS Entre los vinagres de vino tradicionales, c on denominación de origen protegida, este trabajo de tesis se centra en los v inagres españoles con DOP: Vinagre de Jerez, el Vinagre de Conda do de Huelva y el más reciente mente añadido a las DOP, el Vinag re de Montilla - Moriles . Estos v inagres son de pro ducció n es pañola, y más c oncret amente, su pro ducci ón se ce ntra en Andalucí a . De sde tiempos in memoriales, Andalucía ha pr oducido excelentes y afa mados v inos y vinagres, sin los cuale s no se ent endería buena parte de la identidad y la cultura d e esta regi ón . Ya hace 20 00 años, la Bética era la primera p rovincia product ora de vino d el imperio ro mano. A la historia del vino ha estado unido ineludiblemente el vina gre; prim ero, como un acc ident e en el pro ceso de vinific ación, hasta conv ertirs e posteri orme nte en un pro ducto con p erso nali dad propia y muy apreciad o en todo el mundo, que posee múltiples aplicaci ones culinarias. Precisamente, la singularidad y las características únic as de los vinos y vinagres andalu ces han dado lugar al rec onocimiento de tr es DOP s: Vinagre de Jerez, rec onocida en 1 995, Vinagre del Conda do de Huelv a , reconocida en 2002, y la DOP Vinagre de M ontilla - Moriles , reconocida en 2008. Est a s tres denominacio nes andaluza s de vina gres est án estrechamente vi nculadas a las d enom inacio nes de o rigen pro tegi do de vinos de igu al nombre geográfico. La zona geográfica de cad a una de e stas DOP de v ino proporciona la mat eria prima que necesitan s us resp ectiv os vinagres, compartiendo Consejo Re gulado r y enmarca las regiones coloreadas en la Figura 3 . La Zo na de Producci ón del Vinag re de Jerez o zona geográfica delimitada en la q ue se encue ntra n los viñe dos ins crit os d e los que pro cede la uva para la elaboración de los vinos de partida enmarca los terre nos marcados en amarillo en la Figura 3 , situados en los términos municipales de Jerez de la Front era, El Pu erto de Santa María, Sanlúc ar d e Barrameda, Trebujena, Chipiona, Rota, Puerto Real y Chiclana de l a Fronter a . La Zo na de P roducció n que ac oge la DOP Vinagre del Condado de Huelva engl oban la zona geográfica marcad a en rojo en la Figura 3 , en el que se encuen tran los términos munic ipale s de Almonte, Beas, Bollullos Par del C ondado, Bonares, Ch ucena, Gibr aleón, Hinojos , La Palma del Condad o, Lu cena del Puerto, Manzanilla, Moguer, Niebla, Pal os de la Fr ontera, Roc iana de l Condad o, San Juan de l P u erto, Trigueros, Villalba del Alcor y Villarrasa , ext endié ndose por la llanura del ba jo Guadalquiv ir lindando con el Parque Nac ional de Doña na. Por otro lad o, la Zona de P roducción del Vinag re de Montilla - Moriles se enmar ca en el denominado Valle del Gua d alquivir, señalado en ma rrón en la Figura 3 , e l cu al engloba los INTRODUC CIÓN 37 términos municipales de M ontilla, Moriles, Do ña Mencía, Montalbán, Mo nturque, Nueva Carteya, Puente Genil, Aguilar d e la Frontera, Baena, Cabra, Castro del Río , Espejo , Fernán Nuñez, La Rambla, Lucena, Monte mayor, Santaella, además de la localidad de Córdoba, d elimitada al norte p or el Canal d el Guadalmellato. Otra singularidad de los vinagres andaluces es su envejecimiento m ediante el tradicional si st ema de “ criaderas y sol era ” , que l es proporciona u nas características organo lépticas únicas y les abre un a gran varie dad de posibilidades de maridaje más allá del ade rezo cotidiano. E l reconocimiento de estos vinagres com o DOP ha apo rtado un clar o valor añadido a los vinagres originarios de es tas zon as productoras, constituyendo una herramienta c lave para ser competitivos en los merca dos internacionales y p ara diversificar la produc ción vitivinícola. Figura 3 . Zonas g eográfic as de producción ampar adas bajo las de nominaci ones de origen protegidas de vin agres de vino. 38 INTRODUC CIÓN 1.1.3.1. Vinagre de Jerez El Vina gre de Jer ez es el producto resul tante de la fermenta ción acéti ca d e vin os apt os elaborados en la “ Zo na de P ro ducc ión ” establecida , producido y envej ecido median te prácticas tradicionales y que reúne las características organolépticas y analíticas esp ecíficas que s e desc riben e n la Tabl a 2 . Tabl a 2 . Caract erísti cas analí tic as especí fic as de los vi nagres pr otegi dos bajo la DOP Vinag re de Jerez s egún su r eglamentac ión es pecífic a (BO JA 15 /1 0, 20 08a ) . Conteni do Límites Excepci ones/es pecificaci ones Alcohol resi dual ≤ 3% en volu men Excepto en los vinagres al Ped ro Ximénez o al M oscate l , en l o s que no debe supera r el 4% en volu men Acidez tot al en acétic o ≥ 70 g /L Except o en vinagr es al Pedr o Ximénez o al Moscatel, que podrá superar los 6 0 g/L y e n Gran Reserva, con acidez total míni ma de 80 g/L Extracto seco ≥ 1 , 30 g / L y grado ac ético Excepto en la cat egoría Gran Rese rv a co n un m í nim o de 2, 30 g/L y grado acético Ceni zas Entre 2 y 7 g / L Excepto la categoría Gran Reser va que d ebe ten er en tr e 4 y 8 g/ L Sulfat os ≤ 3,50 g /L Materi as reduc toras de los vi nos utiliz ad os En las categorías al Pedro Ximénez o al Moscatel un míni mo de 60 g /L La materia p rima para la obtención d e los vinagre s de J ere z son los denominado s “vinos apto s”, que son aquell os vinos procede n tes de b odegas sit uadas en la “ Zona de Pro ducción de Vi nagre ” , que coinci de con la z ona de producció n corres pondient e a las Denominaci ones de Origen “ Jerez - Xér ès - Sherry» y «Ma nzanilla — Sanlúcar de Barrameda” . Estos v inos pue den se r l os vinos del año expedidos a su grad uación alcohólica volumé trica natural o l os vinos criado s que hay an cum plido con l os perí odos de envej ecim iento pr omedio mínimo estable cido s e n sus correspondientes Pliegos de Condiciones. Las variedades de u va auto rizadas para elaborar los vinos usados para producir el Vi nagre de Jerez so n la Pa lomino de Jerez, Palomino Fino, Mo sc at el y Pedro Ximénez, t odas ellas blancas. De todas ellas, l a Palomino es la varie dad más característica del Marco d e Jerez, con más del 95% de la superficie . INTRODUC CIÓN 39 Para su producción, tras la desnaturalización del v ino ap to en el m omento de su entrada en la bodega y su posterior acetificación, s e proc ede a su en vejeci mient o. Todos los vinagres ampa rados bajo esta denom inación t ienen que te ner al menos un per io do d e env ej eci m iento igual o superior a seis meses en el caso del envejecimiento por el sistema de “criaderas y solera” ( Figura 5 ). En e l sistema de “criaderas y solera ” tiene lugar la a cetificación y el en vejecimiento d e forma simultánea. Consta de un número indeterminado de botas de madera agrupadas en filas horiz ontales o escalas (entre 3 o cinc o), llamándose “solera” la fila que qu eda a ras de s ue lo , mientras que a la inm ediatamente superi or a ella se l e llama “primera criadera ”, a la siguiente “segunda criadera” y así sucesiva m ente. El en vejeci mi ento va de men or a mayor, siendo la fil a “solera” la que contiene los vinagres más en vejecidos y de la cual se obtien e el vinagre elaborado. Una vez sacad o una ci erta cantidad de vin agre de es t a “s o le r a ” (menor a un tercio de la b ota), se r epon e con conten id o de la “ prim e ra criadera ” ( Fig ura 5 ). El volum en de v inagre Figura 4 . Sello de la DOP “Vinagre de Jerez” . Figura 5 . Esquema del sistema de en vejecimien to de “criaderas y solera” . 40 INTRODUC CIÓN extraído de la “primera criadera” se repone a su vez, con vinagre d e la “ segunda c riadera ” , y a s í sucesiva men te. La extracción de vinagre s e denomina “saca” y la adición del mismo “rocío”. Estas “sacas” y “roc íos” son realizados normalmente tres o cua tro veces al año. Segú n los period o s de envejeci m ient o a los q ue s on sometid os los vinagr es d e la DO P Vinagre de Jerez, qu e son aproximados d ebido a l as características d el env ejecimiento en soleras, se distinguen las diferen tes c at egorías que se recog en en la Figura 6 . Adicionalmente, est a denomina ción inc luye dos tipos de Vinagre s de Jerez semi - dulc es, en función del vino de la vari edad co rrespo ndiente que se util ice en su producció n: V inagre de Jere z al Pedro Ximé nez y Vinagre de Jerez al Moscatel. Éstas, a su vez, pueden som eters e a un proceso de envejeci miento, y corresponder a cualqu iera de las categ orías de envej ecimiento descritas. Figura 6 . Esq ue ma de las categorías establecidas para la DOP “ Vinagr e de J erez ”. DOP VINAG RE DE JEREZ En v ejecidos Vinagre de Je rez vinagre sometido a un enve jecimiento mínimo de 6 mese s Vinagre de Jere z R eser va vinagre sometido a un enve jecimiento mínimo de 2 años Vinagre de Jere z Gr an R eser va vinagre sometido a un enve jecimiento mínimo de 10 años Semi - dulce s Vinagre de Jere z al Pedr o Ximénez vinagre al que se le adiciona vinos del tipo Pedr o Ximéne z durante la crian za Vinagre de Jere z al M o s cat e l vinagre al que se le adiciona vinos del tipo Pedro Mo scatel durante la crianza INTRODUC CIÓN 41 1.1.3.2. Vinagre de l Condado de Huelva El Vinagre del Condad o de Huelva es u n vinagre de vin o, procedente de la fer mentación acética de un vino certificado por el Consejo Regulad or de la Denominac ión de Origen “Co ndado de Huel va” . Para la elaboración del vinagre amparado bajo esta denominación , la materia prima debe ser un vin o bla nco o ge neros o de la Denominación de Origen Protegida “ Condado de Huelv a " , cuya zona de pro ducc ión coinci de exactame nte co n la zona geográfica de la DOP Vinagre del C ondad o de Huelva , y cuyas característic as son debidas a la variedad autó c to na Zalema , propia y exclusiva d e la zona geográfica delimitada . Por t ant o, dicho v ino uti li z a do proviene exclusivamente d e la misma ár ea geográfica de finida para el vinagre . Figura 7 . Sello de la DOP “Vinagre del Cond ado de Hu elv a ”. Respecto a las características s ensoriales de estos vin agres amparados baj o la DOP Vinagre del Condado de Huelva, present an color es y aromas que van desde el am arillo pálido o ámbar c on arom as acé ticos co n toque s de vino en los men os en veje cid os , al color caoba y n o t as aromáticas de hig os secos, pasas y madera en los más e nvejecidos . Los val ores r esul tantes de l examen analítico de los vinagres protegidos deberán estar incluidos dentro de los siguientes límites recogidos en la Tabla 3 . 42 INTRODUC CIÓN Tabl a 3 . C arac teríst icas analí ticas es pecífic as de los vinag res prot egidos baj o la DOP “ Vinagr e de l C ondado de Huelv a ” según s u regl amentaci ón específ ica (BOJ A 1 5/10 , 2 008b ) . Conteni do Límites Alcohol resi dual ≤ 0,5% vol. en vinagre sin e nvejecer ≤ 3% vol. en la ca tegoría Vi nagre Viejo Acidez tot al en acétic o ≥ 70 g/ L Extr ac to s eco s olubl e ≥ 1,30 g /L y g ra do acé t ic o Ceni zas Entre 1 y 7 g /L Ac etoí na ≥ 100 m g/L Prolin a ≥ 300 m g/L Merc uri o ≤ 0,05 ppm Arséni co ≤ 0,5 p p m Plom o ≤ 0,5 p p m Cobre y Zinc 10 mg /L Hierro ≤ 10 m g/ L Sulfat os ≤ 2 g/ L Cloruro s ≤ 1 g/ L Cl aridad (L*) ≥ 93% Intens idad de c olor por croma (C ab) ≥ 20 unidade s Lo s vinagre s produc idos en el Condad o de Huel va se engloban e n do s tipos ( Figura 8 ) . Un primer tipo, que procede de la fer mentación acética de un vino blanco o gener oso de la D OP “ Conda do de Hue lva ” media nte e l méto do indus trial de fermentación sumergida , siendo la única de las 3 DOP que comercia liza vinagres de vino sin en vejecer ; y un se gundo tipo, denom inado Vinagre Viejo, que se elabora a partir del Vinagre del Condado de Huelva que, a s u ve z, depen diend o del tie mpo y del métod o uti lizad o par a el envej ecimi ent o se distingue n tres subtipos, Vinagre Vi ejo Sol era , Vinagre Vie jo R es e rv a y Vinag re Vie jo Añada . De estos últimos, los vinagres So lera y Reserva s on obtenidos por el envejecimient o tradicional de “criaderas y solera ”, an teri orment e des crito para la D OP Vinagre de Jerez, per o con la s ing ularidad de que dur ante t odo el envejeci miento hasta la “ s ac a ” se adiciona a los vinagres con el tipo de vino Genero so o Gen eros o de Lico r de la Denominación de Origen Con da do de Huelva , mejorando el buqué de l vin a gr e po r f o rm a c ió n de é steres y nutriend o a las bacterias acéticas del alcohol procedente de estos vin os, de forma que n o degraden el ácido acético ya for mado. INTRODUC CIÓN 43 El Vinagre Viejo Añada, a diferencia de Vinagre Viejo Solera y Vinagre Viejo Reserva, se envej ece de f orma está tic a por el tradicional método de “Añadas” dur ant e un perio do mí nimo de envej eci mient o de trein ta y seis meses. Aqu í se deja el vinagre en env ejecimi e nto de for ma estática en las botas , pudiendo a diciona r sólo vino Gener oso o Generoso de lico r durante el proces o de env ejeci mien to. Est os vin agre s pr o ce den de vinos de una sola añada, ya que no se realizan mezclas, y las características son intrínse cas de la añada en cuesti ón. Figura 8 . Esquema de las categorías es ta blecidas para la D OP “ Vinagre de l Conda do d e Huel va ”. DOP VI NA GR E DEL CONDADO DE HUE L V A Vinag re Conda do de Huelv a vinagre sin envej ecer , con un r esidual en alcohol de proce dencia del vino utilizado no superior al 0 ,5 % vol. Vinagres Viejos en vejecidos por sis tema de "criader as y soler a" Vinagre Viejo Conda do de Huelva Soler a vina gre sometido a un enve jecimiento mínimo de 6 meses Vinagre Viejo Conda do de Huelv a R eser va vinagr e som etido a un envejeci mient o mínimo de 2 años en vejecido por el sist ema de "añadas" Vinagre Viejo Conda do de Huelva Añada vinagr e som etido a un envejeci mient o mínimo de 3 años 44 INTRODUC CIÓN 1.1.3.3. Vinagr e d e Montilla - Mor iles El “ Vin agre de Montilla - Moriles ” es un vinagre de vino obte nido exclusi vam ente de l a fermentación acética de vi nos de crianza certificado d e la DOP “Montilla - Moriles” , es de c ir , que provienen de la zona amparad a por la DOP, o en s u c aso, un v inagr e procede nte de v inagre de vino obtenido de la fermentación acética de vino certificado de la DOP “ Mo ntilla - Moriles” c o n adición de mostos igualmente c ertificados de di cha denomi nación v ínic a, y someti do a envej ecimien to. En 2008, por O rden de la Consejería de Agricul tura y Pesca (B OJ A 03/ 11, 2008 ) se em i t ió un a d e ci s ió n favorable en relación c on la solicitud de insc ripci ón de la De nomina ción de Origen Protegida “Vina gre de M ontilla - Moriles” , que cuenta con pro tección naci onal desde el añ o 2009, siendo la última D OP de vinagre de vino española aceptada. Las caracterí sticas analíticas de l os vinagres protegidos baj o es ta denomina ció n son las recogidas en la siguient e Tabla 4. Cara cterísticas analíticas esp ecíficas de los vinagres pro tegidos bajo la DOP “ Vinagre d e Montilla - Moriles Tabla 4 . Tabl a 4 . C arac teríst icas analí ticas es pecífic as de los vinag res prot egidos baj o la DOP “ Vinagre de Montil la - Mor ile s ” seg ún su reglam entación es pecíf ica (B OJA 03/ 11 , 20 08 ) . Conteni do Míni mo o máximo Excepci ones Alcohol resi dual ≤ 3% vo l. Acidez tot al en acétic o ≥ 60 g/ L Extr ac to s eco s olu ble ≥ 1,30 g /L y g ra do acé t ic o Ceni zas Entre 2 y 7 g /L En lo s vinagre s dulc es entre 3 y 14 g /L Ac etoí na ≥ 100 m g/L Azúca res red ucto res ≥ 70 g /L en v inagres dul ces L a materia prima para la elaboración del “Vinagre d e Montilla - Moriles” es el vino certificado por la DO P de vino “Mo ntilla - Moriles”. Los tipos de vino utilizados son Fino, Amontillado, Oloroso y P edro Ximénez, con contenido alcohólico superior o igual al 15% vol. L as varieda des de uva u tili zadas, segú n el caso, so n las variedades “Pedro Ximénez” o “Moscatel”. Los vina gr es con env ejeci mien to pr esen tan c olores que van d esd e el a m barin o h asta el color caoba casi azabache, con aromas suaves de ácid o acético evo luc ionado s con tona lidades de madera de roble. Tienen un sabor equilibrado y sua v e . INTRODUC CIÓN 51 envejecimiento y l os proced imientos tradicionales, para p roteger a l os consumid ores y ev it ar compe tencia s deslea les ( Ca llejón et al., 2018) . 1.3.6. PROBLEMAS Y FRAUDES REL ACION ADOS CO N LA A DI CIÓN DE CAR AME L O D E MO S TO La adición de cara melo de mosto en ciertos vinagres d e vino está p ermitida con el fin d e unificar e c olor final del vinagre. Sin embarg o, también p odría utilizarse p ara simular el color d e un vina gre e nvejecido s in que haya s i do envejecid o en absol uto, cu ando su reglam ento marca la obligación de serlo, o haber sido envej e cido po r un me no r perí odo d e tiemp o , lo cual abarata cos tes, pero tam bién reduce en gran medida su calid ad final (We rner & R oßmann, 20 15) . Es ta práctica inapropiada podría afectar especialm ente a las DOP de vi nagre de v ino esp añol e n l a s que lo s perio dos de envej e cimiento están claramente definidos (Ríos -R eina et al., 2018) . 1.4. MÉT ODO S P ARA L A C ARACT E RIZAC IÓ N, CL AS IF ICAC IÓ N Y AUTE NTI FI CACIÓ N DE V INAGR ES DE VI NO Hoy en día, la creciente diversidad de vinagres en el mercad o y la creci ente de man da de vina gres y condi mentos de c alidad han cread o la necesidad de cara cterizarlos, esta ble ciendo parámetros específic os y proporcionando un control d e calidad adecuad o para defender su ident idad (Cerezo e t al., 2008; Liu et al., 2008; Marrufo - Curtido et al., 20 12) . Ad em á s , d ebido a lo anterior, estos pr oductos se están convirtiend o en objetivos mayores par a el fraude y requieren nuevas herramien tas para combatir la falsificación o el etiquetado incorrecto. Y m ás relevancia tiene todo esto en aquellos vinagres de vin o protegidos po r una DOP , donde más allá del cumplimiento de ci ertos parámetros y detalles, el client e desea tener garantía de que la diferencia de prec io se d e be a que l os estándares de calidad s on más elevad os . Por ello , l a caracterización del vinagr e persig ue el objeti v o de proteger a los consumid ores contra la c omercialización de pr oductos de calidad inf erior a la declarada en su descripció n, así como de defe nder a l os p roductores q ue apli can la s buena s práctic as de aquel los que e jer cen una competencia desleal. Por l o t anto, el vinagre , como todos los demás pro ductos alimentario , debe cumplir con las esp ecificaciones de calidad y debe lle var una etiqueta q ue describa fielmente el p roducto. Y para controlar todo el lo se neces ita n s oluc io nes instrument ales que sean fiables , que puedan evalu ar los requisitos de calidad a partir de parámetros o bjetivos y que puedan garantizar la veracid ad de la infor mación declarada en la etiqueta. E s decir, se necesita n proc edimie ntos de autentificación robustos y eficaces. 52 INTRODUC CIÓN 1.4.1. MÉTOD OS OFICIALE S Para evaluar la calidad y autenticidad de los vinagres, varios país es han estab lecido métodos y rangos acep tables o val ores de guía p ara evaluar algunos pará metros de l vinagre, basado s en los resu ltados obtenid os en el análisi s de un gran núme ro de muest ras auténti cas. L as directivas naci onales e interna cionales actuale s incluyen mét odos diseñados para la identificación de vinagre de vino y, e n general, para el control de l a autentici dad. En esta secci ón, se describen los métodos reconocidos oficialmente que se utilizan regular mente para los vinagres de vin o ( Tabla 5 ). Debido a la gran div ersidad de tipos de vinagr e pr oducidos a partir d e dif erentes materias primas y por diferentes pr ocesos de producción, exi sten en el mercad o numerosos vinagres con diferentes calidad es. Esto co nlleva a una crecie nte nec esidad de i nvestiga r métodos analíticos fiables que puedan d eterm inar la calidad y el origen. Ade más de evaluar la aute ntici dad de un vinagre, esto s métodos deben ser capaces de d etectar posibles adulteraciones y fraudes. En general, además de l os métodos oficiales, existen metodologías alternativas que se puede n agrupar en do s tipos: análi sis sensoriales y análisis fisi coquímicos. INTRODUC CIÓN 53 Tabl a 5 . Métodos ofic ialmente r ec onoci dos por l a Organizaci ón Inter nacional de la vi ña y el vino ( OIV) par a probar la aut enti cidad del v i nagre de vino. Not a: Tabla adaptada del capítulo de libro: Ríos - Reina et al., (2018). Vinegar. FOODINTEG RITY Handbook. https: //do i.o rg/ 10.32 74 1/fih b . (ANE XO I). MÉTO D O REFER ENCI A TÉCNICA OBJETIVO Determinación del contenido de acidez total OENO 52/2000 Neutra lizaci ón de ácidos por solución alcalin a Cum plir requi sitos l egales (de finicion es, DOP, IGP ...) Determinación del con tenido de acidez total fij a OENO 53/2000 Neutra lización de ácido s no v olátiles por soluc ión alcalin a Cum plir requi sitos l egales (de finicion es, DOP, IGP ...) Determinación del contenido en acidez vol átil OENO 54/2000 Diferencia en tre ac idez to tal y a cidez fija , en gr a mo s de ácido acético po r litro Cum plir requi sitos l egales (de finicion es, DOP, IGP ...) Detección y cuantifi cación de ácido acéti co de síntesi s OENO 55/2000 Extra cción d el áci do acético con sos a, medid a d e la radioa ctividad por cent elleo líq uid o , transformado en bence no Autenti ficación : V alores de 14 C menor es a lo s cara cterísti c os del año de produc ción s ignif ica: mez cla con p roductos de años más re cien te s , o adición de ác ido a cético sintéti co Determinación del contenido en al cohol resi dual OENO 56/2000 Destilació n, ox idación del etan ol por K 2 Cr 2 O 7 y valoración del ex ceso con F eSO 4 y NH 4 Cumplir r equ i sit os l eg ale s (d efinici one s, DOP, IGP ...) Determinación del contenido en extracto seco tota l OENO 57/2000 Evaporación, s ec ado en hor no y pes ada D etec ción d e frau des: adición de agua o una solución acuo sa de ácido ac ético ( valor m uy bajo) o adición de susta ncias no volátile s (valor muy alto) . Base de datos ne cesaria Determinación del contenido en cenizas OENO 58/2000 Incinera ción d el extracto d el v inagre hasta com bustió n complet a del c arbono Detec ció n d e fr au des : adició n de agua o un ácido acético acuoso ( valo r es muy bajo s ) o adición de sustan cias n o volátile s ( valores m uy altos ). Base de datos n ecesaria Determinación del contenido en sus tanci as re ducto ras no volát i les OENO 59/2000 Evapor ación d e sustancias vol átiles, hid rólisi s clorhíd rica, ox idación por solu ción a lcalina de Cu en exceso con titula c ión por yodome tría de i ones de Cu Detec ció n d e frau des : ad ición d e sustancia s no volá tiles Determina ción del contenido en dió xid o de azuf re OENO 60/2000 OENO 13/2008 Titulación y od omét r ica d irect a (SO 2 libre ) y doble hidró lisis alcal ina (SO 2 co mbin ad o) Contro lar el nivel de SO2 y verifica r el cu mp limi en to d e normas y r equis itos Determinación del conteni do en ácido ascórbico t otal OENO 61/2000 Oxidaci ón del ácid o ascórbico por yod o, precipitación , s eparac ión por cromatog rafía de pelí cula delgada y d eter mina ción col ori métrica a 500 n m Detección de uso tecn ológi co frau dulent o Determinación del contenido en clorur os OENO 62/2000 Titulación pot enciom étrica de iones Cl con nitrato de plata e n ambi ente ácido Det ección de l aum ento f raudule nto d el extra cto s eco mediante la a dición de Na Cl Determinación del contenido en sulfa tos OENO 63/2000 Precipitació n de sul f atos con cloruro de bario, s ecado, calcinaci ón y p esada Detec ció n d e frau des c on o bj et o d e au menta r el ex tra cto sec o 54 INTRODUC CIÓN Determinación del contenido en cobre , zinc y hi erro OENO 64 - 65 - 66/2000 Medi da dire cta por e spectrofotometría de abs orción atómica Contam inaci ón por materi ales de contacto durante l a fabricació n , y el propi o conte nido de l vi no de par tida . Un conte nido ex ces ivo pue de c ausar alt eraci ones g ra ves en el color Determinación del contenido en plo mo OENO 67/2000 Medida d irecta por esp ect ro metr ía d e absorción atómica sin l lama (atomizaci ón electrotér mica) . C ontaminación de los materiale s de contacto durante s u fabricació n, y el plomo del p ropio vino de parti da Determinación del contenido en merc urio OENO 68/2000 Mineraliza ción, reducción por MnO 4 − y me dida por e spectrometr ía de absorc ión atómica (v apor frío) Problema s toxico lógico s Determinación del contenido en acetoína OENO 69/2000 Neutra lización a pH 7 con Ca (OH) 2 . Medi ción d irecta por cromatog rafía de g ases (GC) Autenti ficación : d et ermin aci ó n d e la calid ad y el origen media nt e el conteni do de ac etoína e n vina gre s de vino (e ntre 100 mg/L y 400 mg/ L) Determinación del metanol, de los al cohole s supe riores y acetato de etil o OENO 70/2000 Neutralizac ión a pH 7 con N aO H . Med ición a través de GC de vo látile s como etanol, propan -1- ol, butan -2- ol, butan -1- ol y 2 - metilbut an -1- ol y 3- metil bu tan -1- ol Cues tiones organolé pticas y p osible mente toxicol ógica s Autentif icación por SN IF - RMN y otros métodos is otópicos OENO 71/2000 Extra cción d el ácido acét ico con é ter. Purificaci ón y d etermin aci ón de su pu reza. Medició n de la r elación ²H /H a tra vés d e ²H - RMN Detec ció n d e frau de s sob r e pr esen cia d e ácido ac ético sintético y d etec ció n d e la a dición de alcoh ol de plant as con metab oli smo C4 (azúcar de la caña) o C3 (rem olacha) Detección del á cido acético de sínt esis p or la d eterminación de la radi oacti vida d β d el 14 C del ácido acéti co por centel leo líqu ido OENO 12/2006 Extra cción d el ácido acét ico del vinagr e. Valo r de emisi ón β d el 14 C comparado con e l promedi o de las emisiones β de l 14 C en el etanol en v inos genuinos de cosecha tard ía Det ección de fraudes sobre la adi ción de ácido ac ético sintético y c ontrol del año de e laboración de l os vinos c rudos D eterminación de la relación isot óp ica 13 C/ 12 C del ác ido acético por espectr ometría de masas iso tó pic as OIV - OENO 510 - 2013 Proporción de i sótopos 13 C/ 12 C de ácid o acético p or espectrome tría de masas de isótopos ( IRMS) Detec ció n d e fr au des sob re el origen botánico del ácido acético y r evelaci ón de la ad i ción d e ácido ac ético sin tétic o. Determina ción d e la adició n de az úcar d e cañ a. D eterminación de la relación isot óp ica 18 O/ 16 O del agua en el vi nag re de vi no por espectrometría de m asas isot óp ica s OIV - OENO 511/2013 Relación isot ópica d e 18 O/ 16 O de agua p or IRMS Detec ció n d e f raudes so br e la pro ducció n de vinagres a p ar tir de uv as f rescas o de uv as sec as con adic ión de a gua Dete rmina ción de la dis tribuc ión de 2 H en el áci do acético mediante RMN OIV - OENO 527 - 2015 1 H- NMR y 2 H- SNI F - NMR Det ección de fraudes s obre e l orige n botánic o de l ácido acético y rev elación d e la adi ción de ácid o acético sin tético INTRODUC CIÓN 55 1.4.2. M ÉTOD OS PAR A EL AN ÁLI SIS SE NS OR IAL Debido a que la calidad de un vinagre se asocia principalmente a su aroma, la evaluación sensorial es e l primer m ét odo a tener en cuenta. El anál isis sensorial ha demostra do ser una herramienta eficaz , s im p le y fiable para evaluar y apr eciar la calidad del vinagre desde el pu nto de vista del pr oductor, inve stigador o c onsumidor ( Tesfaye et al., 2010) . Sin emba rgo, el análisis sensorial en el caso del vinagre es part icula rmente arduo d ebido al sabo r ác id o y ol or punzante del pro duct o como c onsecuenc ia de l ácido ac éti co que cont ribuy e de fo rma in t e ns a a la sensación general. Por lo tanto, la metodología sensorial apropiada debe estar clarament e definida y los atributos utiliz ados en el análisis discrimin ante o descriptivo deben ser precis os y bien reconocidos por el pa nel ( Tesfaye et al., 2010) . La caracterización sensorial con el fin de controlar la calidad del vinagre de v ino ha s ido ampliamente utilizada d urante m uchos año s ( Callej ón, Morales, Silva F erreira, & Tr oncoso, 2008; Charles et al., 2000; González - Viñas, Sal vador, & Cabezudo , 1996; Hill mann et al., 2012 ; Lalou et al., 2015; Tesfaye, García - Parrilla, 2002 ) . Así, Gerbi e t al. ( 1997) realizaron un análisi s sensorial de vinag re s de di feren tes fu ent es m ostrando la capacidad del análisis sensorial pa ra d ifere ncia r v inagres de alcohol y vinagres de manzan a de l os vinagres de vino en base a só lo siete parámetros sensoriales (Gerbi, Zeppa, Antonelli, & Carnacini, 1997) . Algunos a ño s más tarde, Tesfaye e t al. ( 2002) desarrollar on una evaluaci ón sensorial de los vinagres de vin o de l a DOP d e Jerez según los cambio s que ocurriero n durante el e nvejecim ient o. Este estudio mostró claramente que tan to la intensidad d el ar oma como la calidad aument aban con el envej ecimien to y se podía percibir a nivel sensorial (M orales, Tesfaye, García - Parrilla, Casas, & Tron cos o, 2002 ) . Morales et al. (2006) también estudiaron la importancia del perfil sens oria l de los vinagres de vin o producidos por el env ejecimiento acelerado en co mparación con l os elabo rados por un método tradicional y, por lo tant o, la capacidad de dif erenciar un vinagre "rápi do" d e u n vinagre de vino de alta calidad a nivel s ensorial ( Morales et al., 20 06) . Gran parte de las investigaciones tradicionales sobre el co ntrol de la calidad del vinagre se han basado en una serie de análisis sens oriales. Además, en algun os vinagres, co mo e s e l c a so del vinagre balsámico tradicional de Módena , su cont rol de cali dad se basa pr i ncipalm ente en el análisis de sus propiedades sensoriales. El análisis sensorial del v inagre se puede realizar mediante análisis olfativo y gustativo, así como mediante la determinaci ón de otros parámetros como la viscosidad y el color. 56 INTRODUC CIÓN 1.4.2.1. Olo r y s abo r Para analizar el sabor y el olo r de los vinagres de v i no , exist en dif eren tes p rot ocol os , pudiéndo se realizar análi sis gustativ os y olfativos . A nivel gusta tivo, exi sten diferen tes metodologías entre las cuales se encuent ra la de preparar el v i n ag re de la fo r m a q ue s e as emej a má s al procedim iento habi tual de consumo , usan do hojas de lechuga como matriz a la que se le adiciona vinagre (Gonzá l ez - Viñas et al., 1996) o diluyendo el vina gre con agua fría o caliente . Otro método consiste en la evaluación dire cta del sab or y aroma del vinagre tal y como es , usando tazas opacas para evitar influencias de c olor, si end o este el análisis s ensorial habi tual realizado en las b odegas de vinagre (Tesfay e, García - Parrilla , 200 2) . Dentr o de l os diferen tes ti po s de análisis sensorial d e las cara cterísticas olfativas , lo s más utilizado s son la p rueba descripti va, útil para determinar el p erfil sensorial de las muestras, y la prueba discri minatoria, que incluy e una amplia ga ma de pruebas como la p rueba triangula r (IS O.41 20, 1983 ) , pruebas de comparación paread as (I SO. 549 5, 1983 ) , y l as prueba s de preferencia o h edó nicas. Esto s método s requie ren un panel se n so ri al entrenad o y unos atributos defini dos , concr etos y adecuado s . 1.4.2.2. Color El color es un o de los parámetros más imp ortantes utilizados por l os consumidores par a evaluar la calidad de un producto aliment ario . Al gunos es tudios centrados en lo s vinagres de vino h an de scrito una re lación entre al gunos compuest os y un colo r más o scuro , como la presencia de melanoidina o de produc tos de la de gradació n de los azúcares y reac ciones de Maillard (Solier i & Giudici, 2009) . Un color más o scuro también se ha rel a c io na do con un p eríodo de envejecimiento más largo en vinagre s de vin o y vi nagre balsámico tradiciona l de Módena. Algunas técnicas como la esp ectrofotometría UV - Visible, la fluorescencia d e emisión - exci taci ón o las t écnicas colorim étricas de trans misión se están utilizando para analizar el col o r , obteniénd ose resu ltados satisfactorio s (De la Haba, Arias, Ramírez, López, & S ánchez, 2014; Palacios, Valcarcel, Car o, & Perez, 2 002; Zhu, Ji, Eum, & Zud e, 2009). Sin e mbargo, el c olor podr ía modificarse fácilmente c on el us o de car amelo de uva u otros adit ivos , no habiéndose aún establecido oficialmente ningún métod o para evaluar y c ontrolar este pará metro ( Callej ón et al. , 2 018) . INTRODUC CIÓN 57 1.4.3. M ÉTOD OS PAR A EL AN ÁLI SIS FIS ICOQUÍMIC O El otro tipo de técnicas para estudiar en el campo de la caracterización y autentifi cación son aquellas que analizan las características fisicoquímicas de los vinagres. Aunque el aná lisis sensorial juega un papel im portante en la a ceptabilidad del vinagre desde el punto de vista del con sumi dor, y es el método que tradicionalmente se ha utilizad o, se necesitan metodologías más rápidas y ob jetiv as como so n los méto dos instrumental es, para garantizar l a calidad final y comprobar el c um p l i m iento de lo s requisitos legales ( Callejón et al., 2 018) . E stas técnicas fisicoquími cas se pueden agrupar , a s u ve z, de acuerdo con dos estrategias: la primera c onsiste en aquellas t écnicas capaces de analizar un o o más co mponentes específicos que p odrían ser marcadores de u n vinagre específic o (métodos dirig idos o “targe ted” ), mientras que l a otra estrategia está formada por técnicas que in tentan obtener l a "huella dactilar " o “fingerprin t” (mé todos no diri gidos o “unt argete d”) , o perfil de un vi nagre analizado por una téc nic a y lue go cons truyendo m odelo s de clasificación media nte el u so de herramie ntas quimiométri cas ( Cocchi e t al ., 200 4) . La Figura 1 1 muestra l as etapas q ue conforman ambas estrateg ia s para el an álisis de vinagre. Con respecto a la primera estrategia, los métodos convencionales amplia mente utilizados para caracterizar y au tenticar vinagr es mediante el anál isis de uno o v ari os marcadores incluyen a l os métodos ofi ciales ant eriormente mencionad os, así como la determinación de ciert os aminoácidos, de subpro ductos de la fermentaci ón de acetobacter o sust anci as derivadas de materias primas , y, en algu nos v inagres , d e l os c ompu estos f enól ic os derivados del e nvejecimiento en madera. La determinación y c uantificac ión de estos compuestos se han re alizado mediante met odologías tales como la cromatografía de gases - espectr ometrí a de m asas ( GC - MS) ( Plessi, Bertelli, & Migliett a, 2006) , la cromatografía líquida de alt o rendi miento ( HPLC - MS) ( C allejón, Torija, Mas, Mo rales, & T ronc oso, 2 010 ; Cer ezo et al ., 2008 ; Tesfaye, Morales, García - Parrilla, & Troncoso, 2002) , o mét od os en zimá ti c os (Verzelloni, Tagliazucchi, & C onte , 2 007) . La principal fortaleza de la s egunda estrategia, la cual se basa en la determ inac ión de un perfil o huella dactilar, consiste en tener en cu enta tanto la contribución individual com o la s interacc iones de los difer e ntes comp onentes pres ent es e n el vinagre, es decir , la c omplejidad total de la matriz ali mentaria ( Coc chi e t al. , 2004 ) . En este ca so, las metodologías estudiadas que permiten el desarrollo de esta estrat egia son po r ejemplo técnic as espect roscópicas , como la espectr oscop í a de infrarrojo medio y cer cano (MIR, NIR) (De la Haba et al., 20 14; Guerrero, 58 INTRODUC CIÓN Mejías, Marín, Lovillo, & Barr oso, 2010 ; Y. Zh ao, Zhang, Zha o, Zhang, & Liu, 2011) , espectr oscop í a de fluor escencia ( Callej ón, Amigo, Pairo, Ga rmón, et al., 2 012) y re so n a nc i a magnética nuclear (RMN) (F otaki s, Kok kot o u, Z ou mp oul akis , & Z er vou , 2 013; Pap o tti et al ., 2015) ; e incluso análisis n o dirigido por GC - MS (Casale, Armanino, Casolino, Oliv eros, & Forina, 2006a ) estudiand o el perfil volátil total de un a muestra. Figura 11 . E tapas del procedimien to analítico dirigido y no diri gido para la caracterización, autentific ación y c lasificación d e vinagres. Fig ura ada pta da del capítu lo de libro: Ríos - Rein a et al., 2018. Fraud, quality a nd met hods for cha racterization an d aut henti cati on o f vi negar s , BOOK "Adv ance s i n Vine gar Pro duc ti on" (ANE XO II). INTRODUC CIÓN 59 1.4.3.1. Técn ica s crom atográfi cas Las técnicas cromatográfic as han sido aplicadas am p liam ente y durant e mucho tiem po para determinar ciertos compuestos de l vinagre que prese ntan uti lidad para su caracteriza c ió n , clasifica ción o detec ción de adult era cio nes en los vina gres. A co ntinuac ión, se de scri ben y discut en brev emente l as técnica s emp leadas en la pre sente memoria de te sis. 1.4.3.1.1. Determin ación de compuestos volátiles y a romas 1.4.3.1.1.1. Técnicas de extracció n Desde un punt o de vista analítico, el aroma del vinagre e stá formad o por una complej a fracción de compuestos con u n amplio rango de volatilidades, polaridades y con centraciones (Blanch , Tabera, Sanz, H erraiz , & Reglero, 1992 ). Por eso, aunque la cro matografía de gas es (GC ) , o en concr eto la c romatografía de gases - espectro metría de masas (GC - MS) , es la técnica má s utilizada para analizar la c omposición volátil del vina gre de vino, cuent a con la des ve ntaja de necesitar normalmente un p aso de extracción antes del análisis (Hantao et al., 2012; Marín, Zalacain, De Miguel, Al onso, & Salinas, 2005) , fundame n talmen te pa ra p oder det ermin ar aquell os compue stos mino ritarios presentes en bajas co ncentrac io nes. Las técnicas de extracción de los compuest os volátiles del vinagre están basad as en distintas propiedades físico - q uímicas como son la vola tilidad, la solubilidad en las distintas fases orgánicas inmiscibles c on la matriz y la cap acidad para ser ads orbidos selectiva mente sobre ciertos materiales. Dentro de las técnicas que h an sido aplicadas para la extracci ón del aroma del v inagre de vino cabe destacar: e xt ra cción por espacio de cabeza estático (HSE) ( Ferrer - Gimen ez & Clotet - B allus, 1979) , e xtracción l íquido - líquid o (E LL ) ( Callejón et al., 2008; Callejón, Morales, T roncoso, & Silva Ferreira, 2008) , e xtracción en fase sólida (SPE) ( Moral es, Benitez , & Tron cos o, 200 4) , m icroextracción en fase sólida (S PM E) (Na t e ra M ar ı  n, Castro Mej ı  as, de Val me Garc ı  a M oreno, Garc ı  a Rowe , & G ar c ı  a Ba r ro so , 20 0 2 ) y e xtracción por absorción c on barras magnéticas agitadoras o “S tir Bar Sorp tive Extraction” (SBSE) ( Callejó n, González, Tronc oso, & Morales, 2008; Marrufo - Curtido et al., 201 2) o e xtracción en espacio de cabeza dinámic o (D HS) (Manzini et al., 2011) . A pesar de la gran variedad de té cnicas de mu estreo que se han empleado para extraer y c oncentrar los co mpuestos volátiles de los vinagres de vino, este paso pre vio al análisis todavía sigue siend o un problema no bi en resuelto debido a la g ran varied ad de vinagres de vino y las diferencias y limitaciones de las distintas técnicas de muestr eo (Castro Mejías, Natera Marín, De Valme G arcía Moreno, & García Ba rroso, 2002; Guerrero, Ma rín, Mejías, & Barroso, 2006). De hecho, no todas las técnicas de muestreo serán igualmente adecuadas para 60 INTRODUC CIÓN la diferenciac ión y car acter ización de una s muestras d e vinag r e u otra s. Y en es te cont exto, aún faltan estudios sobre las diferencias que se producen en el perfil volátil obtenido por diferentes técnicas de extracción, sin haberse finalmente descrito cu á l es la más adecuada para el c aso del vinagre de vino. Entre las principales limitaciones de estas técnicas e ncontramos que algunas de ellas requie ren dem asiado tiempo , implican una gran m anipulac ión de la muestra lo que puede conducir a distint os tipos d e error, así como el empleo de disolve ntes orgánico s (como por ej emp lo en la E LL o SPE). Otras tienen baja reproducibil idad , o bien pue den producir a lte racione s de los volátiles originales cuando se su pera n d ete rminadas te mperat uras formándo se n uevos compue stos , e inc luso da nd o lugar a una fracción de aroma d eterminada que n o se a representativa de la muestra, como por ejemplo ocurre co n la HSE (Núñez & Maars e, 1 986) . P o r ello, los métodos que inc luya n una mínima manipulación de la muestra y present en una elevada reproducibilidad , a se r p o sib l e mediante un procedimi ento automatizado, d arían lug ar a valore s de co nce ntración co n mayo r ex actitud y más aj us t a dos a l aroma real de un vinagr e (Guerrero et al., 2006; Marrufo - Curtido et al., 2012; Pizarro, Esteban - Díe z, Sáe nz - Gonzá lez, & Go nzále z - Sáiz, 2008) . Po r este moti vo, e n los ú ltimos añ os las técnicas más e mpleadas para la deter minació n del perfil volátil de vinagre s de vino han sid o las técnicas SPME, SBSE y DHS , po r ser técnicas simples, con una alta sensib ilidad y reproducibilidad, de bajo coste, automatizables, qu e requie ren pe queños volúm enes de muest ra y q ue ge nera lment e no precisan del u so de disolventes orgánicos para llevar a cabo la e xtracción. Las técnicas S PME y SBSE pueden aplicarse de dos maneras: mediante inmersión directa en la muestra (SPME y SBS E) o e n el espaci o de cabeza (HS - SPM E y HSSE) ( Morales, Aparicio - Ruiz, & Aparicio, 2013) . Este últim o m odo de muestr e o tiene n um erosas venta j as co mo s on l a reducción del riesgo de contaminación, el increm ento de la vida media de la fibra o material de extracción y permite u na el evada c oncen tra ción del an alito (Bicchi, Iori, Rubiolo, & Sandra, 2002; Weldeger gis, Tredoux, & Crouch, 20 07) . Tanto HSS E como HS - SPME se han aplicad o en el análisis de matrices sólidas y lí quidas, como por ejemp l o en vin os y vina gre d e vino ( Callejó n et al., 2008; Castr o Mejías et al., 2002; Cirlini, Caligiani, Palla, & Palla, 2 011; Marrufo - Curtido et al., 2012; Ubeda, Callejón, Troncoso, Peñ a - Neira, & Morales, 2016) , mientras que DHS h a sido m ucho menos aplicada en estas muestras (Manzini et al., 2011) . En base a esto, DHS, HS - SP ME y HSSE son l as técnicas que se han emp lead o en es te trabaj o de tesi s, l as cu ales s e d escrib en a continua ción. INTRODUC CIÓN 67 Por otro lad o, las técnicas de tiemp o - intensidad consisten en registrar la p resencia o ausencia de un odorante y también la in tensidad con la q ue se p ercibe, utilizán dose para ell o diferentes escalas de medida. En general, el prin cipal inconveniente de las té cnicas tiempo - inte nsidad e s el intenso entrenam iento que los panelis tas requ ieren para obtener resulta dos repro duci bles. Sin em bargo, una vez que el panel está en tren ado, se p ued en c aracterizar los perfiles aromáticos de las muestras con una pre cisión mejorada (De lahunty et al., 2006) . Respecto a las técnicas de frecuencia de impact o o citación (NIF, Nasal Impact Frecuency ), un pan el forma do e ntre 6 - 12 personas an alizan el mismo extracto d e la muestra, anotando la ausencia/presencia del od orante y describiendo su aroma. Después, se calcula el porcentaj e d e pa nelis tas q ue s on cap aces de d etec ta r un odoran te en un ti empo de re tenci ón concreto (Pollien et al., 1 997) , conside rándo se que los compu estos que se detec taron co n mayor frecuencia son los que tienen una mayor importanc ia relativa en el aroma de la muestra. Adem ás, se asume qu e los resultados obtenidos está n relacionados con la in tensidad del olo r percibido en la concen tración a la qu e está present e el an alito en el extrac to (Van Ruth, 2001) . Así, un o do rante que ha sido de tect ado por todo el panel te ndrá un valo r de int ensidad de l 100 %. El beneficio fundamental d e la frecue ncia de impacto es su s implici dad. Ademá s, consume me nos tiempo que las otras t écnicas , con muy buena reproduc ibili dad y lo s panelis tas no requie ren m ucho ent renamiento (Plutowska & Wardencki, 2 00 8) . Por el contrar io, su principal limitación está relaci onada con la escala d e medida, ya que un c om puesto a un a c oncentración concreta puede ser percibi do por tod os los panelis tas, alcanzando una frecuencia máxima, p ero si se incrementa su concentración, su intensidad aro mática pro bableme nte también aum en tará y, sin e mbargo, n o podrá h acerlo la fr ecuencia de detección (Delahunt y et al., 2006) . N o obstante, la limitada capa cid ad de discriminaci ón de esta t écnica puede mejorarse si s e tiene en cuent a la inte nsidad a romática, aunque ello re quie re un entrenami e n to específico del panel sensorial. Así, algunos autores emplean la llamada denominada “Frecu encia Modificada”, la cual tiene en cuenta tanto la fre cuencia co mo la intensidad de cada odorante, y , por tanto , se puede considerar como u na técn ica híbrida ent re am ba s (Campo, Ferreira, Escudero, Marqué s, & Cacho, 2006; Escudero, Campo, Fariña, Cacho, & Ferreira, 2007) . La Frecuencia Modificada (FM) de cada od orante se calcula mediante la media g eométrica de la fr ecuencia de detección de una zona aromática y la intensi dad media expresada com o porcentaje. Esta técnica ha dem ostrado proporcionar resultados más fiables que las otras debido a las capacidades discriminati vas de la frec uenci a de detección que se mejor an teniendo en cuenta la int ensi dad ( Dravn i eks, 1 985) . Es p or ello que es la técnica olfatométrica que se ha empleado en es te trabajo de t esis. 68 INTRODUC CIÓN En general, la olfatometría ha d emostrado ser una herramienta eficaz para la caracte rización de aromas aliment arios y, e n particular, para la carac terización del aroma d e algunos vinos y vinagres ( Aceña, Vera, Guasch, Bus to, & Mestres, 2011; Callejón et al., 2008; Callejón et al., 2008; Charles et al., 2000) . S in embar go, a pes ar de que se ha de mostrad o que es un mé todo adec uado para la selección e identifica ción de compuestos aromá ticos en matrices alimentarias , se encuentr a poca i nvesti gación e n la bibliografía sobre la aplicación de esta técnica en vinagr es. De hec ho, solo hay algunos artí culos sobre la caracterización del ar oma de los vinagres de vin o tinto (Charles et al., 2000) , de algunos v inagres c hinos (Zhou et al., 2017) o de Vinagr es d e Jer ez ( Callej ón et al., 2008a y b) . En estos últi mos es tudi os s e det ermin aron los compue stos ac tivos aromátic ament e y los c om puestos de impacto de los V inagres de Jerez. Est os estudio s se cons ideran una pr ime ra aproximac ión, ya que se basaron ex clusiva mente en el análisis de tres Vinagres de Jerez (un V inagre de Jerez, un R eserv a y un Gran Reserva) y por ello, se necesitaría y sería i n tere sante hac er un est udio más pr ofun do sobre e sta DOP y aplicar la olfatometría a las otras do s denominaciones, Vinagre de Montilla - Moriles y Vinagre de Condado de Huelva y ver sus similitudes y diferencias. INTRODUC CIÓN 69 1.4.3.2. Técn ica s espe ct roscópi cas En los últimos años se han producido rápidos avances científicos y tecnológicos en el campo del estudio de la autenticidad de los alimentos debido al avance instrume ntal analítico y al mayor conocimiento sobre la c omposición químic a de los alim entos. Además, en muchos ca sos no es posible tom ar una deci sión ine quívo ca sobre la autentic idad de una muest ra utilizando los métodos con vencionales debido a la apa rición de adulteraci ones sofisticadas. Est o ha inducido a un perfeccionamiento en los controles analíticos. La m ayoría d e los mét odos analíticos convencionales emplead os en la car acterización y control de calidad de al imen tos s uelen s er c os tos os, destructivo s y requier en mucho tiempo, además de requerir operado res calificados y tener un alto impacto ambiental. Por esta razón, las metodologías ráp idas, baratas, no destructivas y directas b asadas en técnicas no dirigidas son cada ve z m ás inter esa ntes en el enfo que de l a autentificación de producto s alim ent arios como el v inagre de vino. Por lo t anto, l a tend encia actual es bu scar técnicas qu e permitan el análisis d e un gran volumen d e muestra s de forma fiable y rápida, y al mismo tiempo obteni endo una amplia informac ión sobre las características físico - químicas de l a muestra. A ser posible de forma no - destructiva. Es t a s técnic as suelen caracterizarse por una baja selectivid ad de la señal, a difer encia de las t écnicas dirigidas, y po r e s e mo tivo es necesaria aplicar quimi ometría. Dentro de este grupo de t écnicas, existe un gran interés en la aplicaci ón de técnica s espectr oscóp ic as basadas en espectroscopía infrarroja (IR), fluore scencia o RMN, que permitan evaluaciones de calidad de vinagre más objetivas, rápid as y menos costosas (Versari et al., 20 11). Estas técnicas permiten obtener la huella dactilar de la muestra permitiendo determinar varias propi edade s simul táne amente teni endo en cuenta tanto la co ntribuc ión indiv idual com o l as interacc iones de l o s dif ere ntes c omponen tes químic os en los vinag res ( Cocchi et a l., 20 04) . Además, otr a d e las venta jas de es tas t écni cas es que no r equi eren un entrenami e nto al tamen te especializado del analista a diferencia de otras técni cas donde el entrena miento del panelista tie ne un gran im pacto en los resulta dos . 1.4.3.2.1. Espectroscopía de infrarrojo medio ( M IR) La espectr osc opí a MIR se basa en la int erpretación del c omportamiento vibratorio de las moléculas, cuando éstas se e xponen a la radiació n electromagnética en el rango espectral entre 50 00 y 5 00 cm -1 . Cuando la radiación infrarroja ( MIR ) interactúa con una molécula, e st a absorbe parte de la mi sma a determin adas frec uencias que corre sponde a grupos func ionales particulares, y el res to se transmite o refleja, por l o que los comp onentes bioquímico s d e l a 70 INTRODUC CIÓN muestra determinan la can tidad y frecuencia de la luz que se absorbe, se tran smite o se refleja. El espectro MIR se divide típicamente en dos region es distintas: la región del gr upo funcional (de 40 00 a 1500 cm -1 ) que incluye señales de los princ ip ales grupos funcionales ( - CH, N - H, O - H) y la regi ón de la h uella dacti lar (de 150 0 a 500 cm -1 ) que incl uye pat rones de absorción d iferent es y únic os para c ada compuest o. S egún la bibliografía , s e ha demo strado que la espe ctroscop í a M IR puede abo rdar una amplia gama de problemas y brindar soluciones para el análisis rápido de lo s alimentos ( B e v i n , Fergusson, Perry, Janik, & Cozzolino, 2 006; Pillonel et al., 2003; R odriguez - Saona & Allendorf, 2011) . Esta técnica combinada con la qui miometría ha g anado una amplia ac eptación para propó si tos de autent icida d y clasificaci ón en ali mento s, sien do infor mativa a nivel mole cular y produc iendo una huell a d actilar espectral úni ca de cada muestra . Además , el uso de un accesorio como la refl ectancia total atenuada (A TR) permite el análisis directo de líquidos de manera simple, rápida , en so lo u nos mi nutos y de manera no destruc tiva, lo que im plic a una preparación mínima de la muestra . Así , d urante el análisis por ATR, cuando se ha ce pas ar radiación IR p or este cristal , é sta exper iment a un a refl exión total en la interfaz muestra - crista l, creá ndose e n la muestra lo qu e se llama una onda evanescente , que penetr a en ella unas pocas micras , a bso rbiendo la m uestra parte de la r adiación . P or l o ta nto, es es encial q ue exista un contac to real de la muestra y el cristal . L a cantidad d e radiación que se refl eja es me nor que la radiación incident e, es decir, la re flexió n está a tenuad a. El espectr o que se g enera de la muestra es la representación gráfic a del grado en que s e absorbe la radiaci ón en función de la longitu d de o nda , es decir, un espect r o de r eflexi ón con band as características de cada t ipo de enlace químico prese nte en la muestra Figura 14 . Figura 14 . Esquema del análisis p or ATR - FTIR de una m ues tra de v inagre de vin o . INTRODUC CIÓN 71 La metodología ATR acoplad a a FTIR ( espect ros c op í a de infrarrojo me dio co n transformada de Fourier ) se ha es tudiado para la e stimación individual d e compuestos d e interés en los vinagres, así como para predecir la puntuación sensorial del Vina gre Balsámico Tradicional de M ódena mediante el desarrollo de m odelos de regresi ón (Versari, Parpinello, Chinnici, & Meglioli, 201 1), así como para det erminar el contenido en ácidos orgánicos de los vinagres en general (Regmi, Pal ma, & Barroso, 2012) . Ad emás, l os espectr o s obt enidos po r FT IR también se han utilizado para d iscriminar entre el vinag re balsámico tradicional y otr os v inagr es (Del Signore, 2001), a sí como para cla sificar vinagres d e diferentes materias pri mas y con o sin envej ecimien to en mad era (Guerrero et al., 20 10) . En general, este método proporciona una may or cantidad de información química en comparación con la espectroscop í a de infrarroj o cercana (NIR) pr op orci ona nd o venta jas e n términos de asignaci ón química de las bandas y una mayor facilidad en l a interpretación de l os espe ctros sin la neces idad de aplicar una quimio metría com pl ej a . 1.4.3.2.2. E spect ros copí a de inf rar roj o cercan o (NIR ) La es pec t rosc opí a de infrarrojo cercano s e ex tiende en un rango e spec tral m ayor que el de MI R, enco ntrá ndose en la re gió n comprendi da ent re 5000 - 1500 0 c m -1 (o l o q ue es lo mis m o de 80 0 a 2500 n m) . Es la pri mera región espectral que muest ra bandas de absorc ión rel aciona das con las vibraciones m oleculares y se caracteriza p or las bandas ar mónicas y las ban das de combinación Los es pectros NIR regis tran información sobre la abs orción de radia ción infrarroja de las m oléculas orgánicas con enla ces h eter oató mic os cuando e xperimen tan un cam bio neto en el mome nto dipola r como consecuenc ia de su m ov imie nto de vibració n o rot a c ió n , lo que implica la respuesta de los enlaces moleculares d e C – H, N – H, C – O y O – H. Cuando se trata de es pecies homonucl eares ( H 2 , O 2 …) el momento dip olar no se altera durante la vibración o rotación, y, en consecu en cia, est e tipo de comp ues t os no absorben en el infrarrojo. Así, l a compo sic ión químic a de la mues tra origina d iferencias que quedan refl ejadas en l as vibraciones armónicas y d e c om binación, cons truyen do de esta manera un espectro característ ico que sirve com o huella dactilar . Esta técnica re sulta de utilidad para deter minar los ác idos orgánicos y el pH de una muestr a . Esta técnica, al igual que MIR, tien e las ventaj as de per mitir llevar a cabo los anális is c o n una alta velocidad, precisi ón, simplicidad y bajo coste, con casi ni nguna preparación de la muestr a, siendo ade más más fácilmente d e impl emen tar a es cala industrial. En co n se c ue nci a, en los últimos años ha hab ido una creciente tendencia del uso de esta esp ectroscopía para el 72 INT RODUCCIÓN análisis cuantitativo y cualitativo de los ali mentos, y particularm ente del vinagre. Así, e sta técnica se ha utilizado para realizar una monitorización simultáne a o “ en línea ” de l etanol y otros compuestos relevant es para la calidad del vinagre, así co mo para monit or iz a r el p r o ce so de produc ció n, lo que perm ite evaluar acciones co rrectoras par ticulares de la manera más rápida posible. Varios trabajos de inv estigación también han demostrado la utilidad de la espectroscopía NIR para clasificar muestras de vinagre de acuerd o co n la materia prima de origen y el proceso de elaboración. Así, Saiz - Abajo et al. (2004) utilizaron la espectroscop í a NIR para diferenciar vinagre s de vino y vinagre s de alco hol en el norte de España, alcanza ndo t a s as de clasificación de c alibración y validació n de l 8 5.7% y 100% , re spe cti vam ente, ad emás d e demostrar la idoneidad de esta técnica para clasificar vinagres de ocho tipos diferentes con diversos métodos de p rocesamient o, tales c omo la adición de mosto, la f ermentación o el envej ecimien to en mad era (Sáiz - Abajo, Gon zález - Sáiz, & Pizarro, 2004b) . Ad e m ás, s e ha aplicado con éxit o para la det erminaci ón de cier tos compuest os en vinagre útiles para el c ont rol de procesos de vinagre a escala in dustrial (Sáiz - Abajo et al., 2006) , para discrimin ar el vinagre fermentado del vinagre m ezclado ( Fan et al., 2011) y para detectar vinagres ad ulterados (Sáiz - Abajo , Gonzál ez - Sáiz, & Pizarro, 2005) . U na de las des ventaja s d e esta espec tros copía respe c to a la esp ectros copía MIR es que adem á s de que los espectros NIR son más difí ciles de interpr eta r que los MIR , y genera lmente se necesita r ealizar un análisis multivaria nte de los dato s para poder obten er resulta dos de los espectros que se generan y poder d esarrollar modelos capaces de clasificar l os vinagres de distintos tipos (Saiz - Abaj o, G onzal ez - Saiz, & Pizarro, 2004 a ; Sáiz - Abajo et al., 20 04b) o incl uso capac es d e pre d e ci r o m o nit o r izar el p roce so d e en vej ecimi ento d el vin agre (Cas ale, Sáiz Abaj o, González Sáiz, Pizarro, & F orina, 2006) . 1.4.3.2.3. Espectroscopía de fluorescencia multidimensional (EF M) La espec troscop í a de fluor escencia también se ha investigado como una herra mienta alternativa de c ontrol de c alidad del vinagr e. Aunque la e spectr oscopía de fluorescencia es un a de l as técnicas analític a s utilizad a s desde ha ce m ucho tiempo , recie ntemente s e h a n desarrollado multitud de aplicaciones e n tecn o logía de ali ment os. Dentro d e esta técni ca , existen difer entes mét od os de aná lisis : el c onvenc io nal consiste en la medición d e los espectros de exci tació n o emisión en una so la emisió n o longit ud de onda de exc itación, respectiv amente , mie ntras que un proce dimiento más reciente co nsiste en registr ar l os espec tros d e emisión en dife rentes longitudes de onda de excitaci ón. Esta té cnica se conoce c omo fluorescencia de em is ió n - excitación o fluor escencia multidimensional. De esta for ma se o btiene una mat riz de INTRODUC CIÓN 73 Em i s ió n - Excitación (EE M) bidimensional ( Figura 15 ) , que c ont iene info rmación ú nica de cada muestra, con la ventaja d e contener más información sobre las especies fluorescentes qu e los espectros de excitación y emisión convencionales por separado . Figura 15 . Ejemplo de matriz de excitaci ón - emisió n (EEM ) de u na muestra de vinagre de vino . Además, el po tencial de la técnica EE M puede mejorarse ap licando métodos multivaria ntes para el análisis de los resultad os de fluorescencia, c omo el Análisis Paralelo d e Factor es ( “ Parallel Factor An alysis ”, PARAFAC) y su c ombinación con el análisis discrim inante. PARAFAC se utiliza para descompon er los EEM de flu orescencia en dif erentes co mponentes de fluorescencia (fluoróforos). Este método extrae la informaci ón más relevante de los datos para construir mo delos más robusto s de calibración y / o clasificación. Así, en un e studio re cie nte, Callejón et al. 2012 demostraron la capacidad de la espectr o sco p í a de fluo rescencia de excitaci ón - emisi ón combinada con métodos multivaria ntes ( Callejón, Amig o, Pairo, Gar món, et al. , 2 012) , para caracteriza r y clasificar las cat egorías d e vinagres de vino de la DOP Vinagre d e Jerez, seg ún el ti empo de en vejeci mient o. Los resultado s obteni dos pusie ron de manifie sto el posi ble e l uso de esta metodología como una técnica rápida para d etectar muestras fraudulentas o falsificadas y asegurar la calidad del producto en comparación con otros similares del mercado. Sin embarg o, e ste estudio s e llevó a c abo analiza ndo un número pe queño de V ina gres de Jerez, por lo que para confirmar estos resu ltados y crear un modelo más r obusto de clasificación, que compre nda la mayor variabilidad posible de los vinagres, sería necesario analizar un mayo r núme ro de mue stras. Po r otro lad o, esta técnica todavía no se ha aplicad o para la caracterización y diferenciación de las otras D OP s existen tes. 74 INTRODUC CIÓN 1.4.3.2.4. E s pect roscopí a de u lt raviole ta -v isib le (U V - vis) D ebido a los result ados satisfactorios obte nidos para el c ontrol de calidad en ot ros productos alimentarios ( Aceve do, Jiménez, Maldo nado, Domíngue z, & Narváez, 2007; Azcarat e, Cantarelli, Pellerano, Mar chevsky, & Ca miña, 201 3) , y en algunos vin agres ( Xi e, Bu , P en g, & L i, 2011) , la es pectroscopí a ultravi oleta es otra técnica qu e podría ser e studiada p ara la discriminación y clasificación del vinagre de vi no. L a espec tros copí a UV - vis es una técnica basada en la medición de la absorción , por las moléculas , de radiación electromagn ética ( luz ) de las regi ones ultravioleta y visible, compr endie ndo las regiones del espec tro de 19 0 nm a 800 nm de longitu d de onda (Skoog, Holler, & Crouch, 2016) . La posición espectral de una banda de absorción es indicativa de la presencia o ausencia d e ciertas caract erísticas estru cturales de compues tos . Las principales razo nes de l interés por esta metodología son su amplia aplicabilidad, la rap idez del análisis, la ausenc ia de residuo s generados y su facilida d de uso s in cost e s ni operadores calificad os. Además, t ambién tien e una alta sensibilidad, selectividad moderada - alta y buena precisión (Esslinger, Riedl, & Fauhl - Has se k, 201 4) . Por lo ta nto, algunos autores han est udiado la posibilidad de discri minar vin os de distintas denomi nacione s m edia nte el uso de esp ect roscopí a UV- vis y procedimientos qu imiométricos como el análi sis de componentes princip ales (PCA) y e l modelado independiente s uave por anal ogía de clase (SIMCA ) ( Azcarate et al., 2013; Urban o Cuadrad o, L uque De Cast ro, & Góme z - Nieto, 2005; Urbano, Luque de Castro, Pérez, Garcíaa - Olmo, & G ómez - Nieto , 2006 ) . Todas estas características la convierten e n una té cnica ad e cuada para controlar los pr ocesos de producci ón , así como p ara monitor iza r y evaluar la com posición y ca lidad de los produ ctos alimentarios y bebidas , así como muestras farmacéuticas y biológicas ( Wang et al. 200 8; Van De n Broeke, Lan gergraber, y Weingart ne r 2 006) . A de m ás, e l desarrollo de dispositivos portátiles de espectroscopía UV - v is está siendo investigado con el fin de autentificar alimento s y bebidas , aum enta ndo t od o el lo el in terés en esta espect roscopí a. 1.4.3.2.5. E spect rosco pí a de re son ancia m agnética n ucl ea r (R MN ) La espectroscopía de RMN tiene la ventaja de ser una técnica analítica no selectiv a, que recientemente ha lograd o una aceptación g eneral c omo una herra mienta poderosa para la determinación de la calida d y aut enticidad del vinagre, siendo principa lme n te apl i c ad o h as t a la fecha a vinagr es balsámicos d e Módena y sus IG P así como a alg unos vinagres bra sileños (Boffo, Tavares, Ferreira, & Ferreira, 2009; Consonni et al., 2008a; Consonni & Gatti, 2004; Graziosi e t al. , 2017) . Ésta técnica per mite obtener información sobre la co mposición química y pe rm i te la INTRODUC CIÓN 75 determinación rápida y simultánea de los metabolitos hidro solubles del vinagre, como azúcares, ácidos y flavonoid es. Además tiene la capacidad de p roporcionar inf ormación estructural y cuantitativa sobre una amplia g ama de especies químicas en un solo análisis (Fotakis et al., 2013) . Esto hac e que e sta técnica sea otra herra mienta útil para la obtención de huellas dactilare s de mues tras pudié ndos e apl icar e n la autenticidad de los alimentos y el control de calidad. Por otro lado, también ofrece una not able selecti vida d y permite la ide ntificación d e compue stos desco nocidos con alta repr oduc ibilid ad y repet i bilidad. La técnic a de R MN más comúnmente aplicada par a la aut entificación de origen, y re cientemente rec onocida com o un método oficial, es la SNIF - RMN de deuterio (fracci onamie nto isotópico natural específico d el sitio estudiado por espectr ometría de resonancia magnética n uclear). Adem ás, la resonancia magnética nuclear de protone s ( 1 H- RMN) ha sido ampliame nte utilizad a para la caracterización y autentificación de c ier to s vinagres. Así, esta t écnica h a permitido la determina ción rápida de compuestos tal es como carb ohidrato s, ácidos orgánicos, alcoholes, polioles y sustancias volátiles relevantes para la discrimina ción de vinagres balsámicos (Caligiani, Acqu otti, Palla, & Bocchi, 2007). Por otra parte, Pap otti et a l. ( 2015) utili zaro n espect ros de 1 H - RMN, resonancia magné tica nuclear de carbono 1 3 ( 13 C- RMN) y espectr os d e cohe ren cia cu ántica ú nica h eteronuclear 1 H- 13 C (HSQC), junto con an álisis de datos estadísticos m ultivariante, en la caracterización de l vinagre balsámico de Mód ena y vinagre b alsámico tradicional de Módena (P a pot t i et al ., 2015) . Consonni et al., (2008 b) tambié n estudiaron el poder de la espectr oscopía 1 H- RMN en combinación con la quimiometría par a caracterizar y discriminar el vinagre balsá mico y el vinagre balsámic o tradicional de Módena, as í como la aplicabilidad de la espectroscopía 13 C- RMN para d eterminar las prácticas fraudu lentas presen tes en las m uestras (C ons onn i et al. , 20 08b ; Consonni et al ., 2 008) . Boffo et a l., ( 2009) demostraron el potencial d e é sta misma técn ica en la discrimina ción de vinagres brasileños de acuerdo con sus materias primas como el vin o, la ma nzana y el vinagre de alcoh ol (Bo ffo et al., 2009) . Finalment e, se ha estudiado reciente mente un enfo que novedoso de RMN bidime nsional para la clasificación de vinag res balsámicos de M ódena (Graziosi et al., 2017) . Sin em bargo, debido a la gran cantidad de datos que g enera est a técni ca, se req uieren n uevament e lo s mét od os m ultivariant es de trat amiento de datos, es decir, s e requiere la co mbinación de est a técnica con la qui miometría para alc anzar los objetivos d e clasificación y caracterización completa de las mue stras de vinagre . 76 INTRODUC CIÓN 1.5. QUIMIOMETRÍA Como se ha mencionad o anteriormente, se po drían emplear muchas t écnicas cromatográ ficas y esp ectroscópicas para c onseguir caracterizar, clasifi car o a utentificar los vinagres de vino. El problema es que, a p esar de las ventajas qu e caracterizan a to das e stas técnicas a n teriorm ente descri tas, se d ebe ten er en c uenta q ue debido a que lo s d a t o s espectral es lo fo rm a n miles de variables, es casi imposible interpretar los sin la ayuda de la quimiometría , y hoy en día no se entie nde una técnic a sin la otra (Lohu mi, Lee, Lee , & C h o , 2015) . De hech o, los da tos que se obtien en están formado s po r un numero al to de var iables que define n una muestr a, lo que implica que el analít ico tiene que lidi ar muc has veces con una gran cantidad de nú meros. Esta es la raz ón básica p or la cu al, en el pr oblema de la aut entificación de alimentos, se utiliza cada vez m ás la quim iometría. Con ayuda de la qui miometría se podrí a afrontar con mayor probabilidad de éxito , las dificultades que surgen al emplear d ichas técnicas para el c ontrol de calidad de los vinagres de vino, c omo serían la s señales no r esueltas, la gran canti dad de co mpone ntes que fo rma una mue stra de vina gre y la comp leji dad de los espect ros de infrarrojo ( Caballer o, Ríos - Reina, & Amig o, 2019) . La quimiometría es una disciplina analítica q ue utiliza métodos e stadísticos y matemáticos para lograr una evaluación objetiva d e los datos mediante la extracción de la información más importante de colecciones de datos químicos (Massart, Van deg inste, B. G. M. Buyde ns, de Jong, Lew i, & Smeyeres - Verbe ke, 1 997) . O de for ma más re sumida , la quimiometría es un camp o interdisciplinario que involucra el análisis mul tivariante, la matemática, la informática y la química analítica que sirve para extraer informaci ón de manera eficiente utilizando el análisis de datos multivariante. La ventaja de acoplar el aná lisis de datos multivariante y las p oderosas herra mientas para la representación e int erpreta ción de dat os, con el análisis qu ímico , es ex tre mada mente r elevante ya que permite la construc ció n de modelos cuantitativos para evaluar la aut enticidad y la calidad de un ali me nto , predecir el co ntenid o de l os con stitu yen tes e in cluso clasificar mu estras desconocidas. En particular, para problemas como la autentificación de l a calidad, la veri ficación del cumpli miento del etiquetado o la trazabilidad del orig en, es importante verificar si una muestra p erten ece o no a una cl ase específica, y todos es tos p roble mas en tér min os esta dí sti cos se encue ntra n en el ám bito de l reco nocimi ento de pat rones. La quimiometría (o análisis de datos multivaria nt e ) ha dem o strado tene r mucha s aplicaciones en la determinación cuantitativa y cualitat iva de parámetros químicos para evaluar la autenticidad de pro ductos alimentarios (Yu, Low, & Zhou, 201 8) , pro porcionan do resultados INTRODUC CIÓN 83 revelar patrones ocultos en dato s compl ejos , que describe la variación en d atos multivariantes me diante la combinación lineal de un conjunto de variables, posible mente correlacionadas entre sí, reduciéndolas a un núme ro peque ño de vari ables no correlac ionadas llam adas Componentes principales “PCs” . Por e llo, el PCA es un mé todo muy úti l para l a com presió n de dato s . Los PCs s on, por tanto, combinaci ones lineales de variables originales definidos por vector es ort ogonal es en tre sí (Jolif f e, 20 02; Wol d, 1 987 ) . La principal característica de un PCA es que, combinan do las variables originales en un número de nuevas variables, se puede manten er y extraer la máxima cantidad de infor mación presente en los datos originales. Además , d eb ido a qu e el objetivo principal del PCA es capturar la máxima información convirtiendo la matriz original en una lo más simple posible, intentando que el núme ro de PCs seleccio nado s sea e l menor posi ble. No t odos los com ponentes princi pales contienen la misma inf ormación; los p rimeros son l os que describen la mayor vari abilidad de lo s datos, que se asocia a la información má s rele vante, mientras que los últimos d escriben variaciones en l os datos que pueden s er debidas a ruid o o error experimental, o a un sobreajust e del mo delo y pueden s er descarta dos, con lo que se consigue una importa nte reduc ción de l núme ro de variable s, así como de ruido y de informac ión redundant e. Y esto ofr ece otra ventaja que pued e ex plica rse desde un punt o de vist a geométric o: supo nie ndo qu e la matriz de dat os original tiene M objetos y N variables, proyectar todas estas variables en el es pacio sería casi imposible. Sin embargo, cuando se calculan los PCs, los N objet os pueden ser entonce s proyectados en el espacio de dimensiones iguales al número de PCs, sie ndo el número d e dime nsione s menor al número de var iable s, principalm ente de bido a que la mayor parte de la varianza de los datos es está c ontemplada en los primeros PCs. Por tanto, otra de las ventajas que o frece PCA es que, desde un pu n to de vi sta explor atorio, los datos pued en se r visualizados en un es pacio de do s o tres dim ensio nes, llam ados “ s core plots ” . El proc edimi ento mate mático de PC A se basa en l a s iguiente ecuación : 𝐗𝐗 𝑚𝑚𝑚𝑚 = � 𝐭𝐭 𝒊𝒊 𝐩𝐩 𝒊𝒊 𝑻𝑻 𝒊𝒊=𝒂𝒂 + 𝐄𝐄 s iendo X la matriz de datos a tratar , de dime nsione s m x n , dividida por PCA en d os m atrices: t , que es la matriz de puntos de coorde nadas en el espacio del PCA que conti ene las nuev as variables o t a m bié n l l am ad o s s co r es o; y p , la m atriz de lo adings , que conti ene el peso de contribución de cada variable original sobre la combi nación linea l con el superíndice T q ue se refiere a la matriz tr anspuesta. E es una matriz de err or, es decir la varia ción residu al de X que no es explicada por e l modelo co n a compo nente s principal es . 84 INTRODUC CIÓN 1.5.3. MÉTODOS S EMI - SUPE RV I SAD O S , MÉTODO S D E D ESCO MPO S I CIÓ N D E MÚ LT IP L ES VÍAS , O MÉ TODO S DE RE SOL U C IÓ N MÚLTIPLE ( N- WA Y M ETH O D S ) Mucho s de los da tos obtenido s del a nális is de alimento s procede n de difer entes o múltiples métodos y por t anto van a proporcional, diferentes informaciones o variables de distinta naturaleza (c omo por ejemplo GC - MS, fluo rescencia, etc . ). En estos ca sos exis ten métod os de des comp o sici ón d e matri ces de datos m últiple s (N - w ay ma t r ix) co mo s on el a nálisis paralelo de factores (PA RAllel FACtor Anal ysis, PARAFAC) o la resolu ción de múltiples curvas (Multple curve resolution, MCR) los cuales van a ser u tilizados en el pr esen te p royect o de t esis. 1.5.3.1. Aná lisis pa rale lo de fact ores (PARAF AC) PARAFAC es un método de desco mposi ción de matrices dime nsione s, y más concretamente, de matri ces con estructura triline ar o matrices de tres dim ensiones (3D). Básic ament e es un m étodo de re so lución de curv as que des com pone una m atriz tr idim ension al en tre s sub - matrices bidimensionales, PA RAFAC como se muestra en la Figura 19. Figura 19 . R epresentaci ón esq uemática de la d escomposici ón por PAR AFAC de una matriz de exc itación - emisión de fluorescencia multidimensio nal. La ecu ació n e n la que se basa PARAFAC es la sigui ente: 𝐗𝐗 ijk = � 𝐚𝐚 if F f=1 𝐛𝐛 if 𝐜𝐜 kf + 𝐞𝐞 ijk siendo X un c ubo de dim ensio nes I x J x K que e s descompue sta en tres nuevas mat rices : una primera matriz A que c ontien e los score s ( a if ) , y do s matrices B y C qu e contiene los loadings ( b if ) INTRODUC CIÓN 85 y ( c kf ) , j unto con u na m at r iz E ( e ij k ) que c ont iene los residua les con la inf orma ción n o explicada por las anteriores . Los fact ore s o c omponen tes que se ex traen en este ca so no son forzad o s a ser ortogonales, como o curría co n lo s PCs en PCA, dando PARAFAC u na so lución úni ca, siempre y cuando a diferencia tambi én de PCA . Así, u na de las principales ventajas de PARAFAC con respecto a otras técnicas de resolución es la singularidad de la solución. Es decir, no hay ambi güedade s m atemáticas en el modelo final, siempre y cuando se elijan bien el número de componen tes a extraer y se fijen cier tos pa rámetr os. Sin embargo , aunque pare zca contradictorio, la selección del correcto número de componentes en PARAFAC no es algo fácil. Para ello, lo más utilizado es la aplicación del conoci miento previo que se tenga de la muestra, el estudio de los residuales y el es tudio de tres parámetros: la consistencia central o del núcle o , llamada cor e - consiste ncy , que m ide la robu stez de l a descom posici ón matemática, cuanto m ás cercana a 100% mejor; así como el menor nú mero de iteraciones y la similitud entre múltiple s mod elos PARAFAC. Ade más se es tán desarrolland o nuevos métod os para la sel ección de los componen tes, com o el lla mado CO RCONDIA (Bro & Kier s, 20 03) . Si se ajus tan e stos p ará metros correctamente , el mo delo PARAFAC permite proporcionar una descri pción quím ica com pleta de las moléculas in volucr a das en muest ras de compos ición compl eja , lo c u al ha demostrad o ser ú t i l para la caracterización d e muestras de vinagre de alta c alidad p o r té cn i c as co m o la espectr ometrí a o l a fluorescencia multidimensional ( Calle jón, Amigo, Pairo, Garmán, e t al., 2012 ; Cocchi, Durante , Mar chetti, Armanino, & Casale , 2007) . 1.5.3.2. Resolución multiv ariante de curvas (MCR) Lo s méto dos de resolu ción de c urva s son un co njunto de téc nicas cuyo objetivo es describir la contribución subya cente co rrecta de u n conjunt o de datos. Estos método s apun tan a resol ver m ezclas, dad o el númer o correc to d e cons titu yentes , sus per fil es de r espu esta (p or ejemplo, espectral, ti empo o perfiles d e elución) y su influencia relativa d e la señal en la mu estra (Amigo, S kov, & Br o, 201 0) . La resolución Multivaria nte de C urvas - Mínimos Cuadrados Alternos (Multivariate Curve Resolution - Alternating Least Squar e, MCR - ALS) es quizás la m etodología de reso luc ión de curvas que mayor aplicabilidad ha demostrado a la hora de resolver problemas diversos en matrices alimentarias (Az zouz & Tauler , 2 008; Hantao et al ., 2012 ; Lach enmeier & Kessler , 200 8) . E n la mayoría de las situaciones, los métodos de res olución de curvas necesitan cierta información a priori (núm ero de c omponentes, estima ciones iniciales sensibles, i nformación de 86 INTRODUC CIÓN se lectividad) para minimiz ar el gran pr oblema d e las a mbigüedades que tienen estas metodologías. Así, l os pasos fundam entales par a la aplicació n de MCR con el fi n d e obten er un a resolución última de este método son similar es a los de PARAFAC : i) núme ro de co mponen tes; ii) estimaciones iniciales; ii i) restricciones. En e l caso d el uso de mínimos cuadrados alternos , para determinar la s olución MCR se nec esi ta una estimación inicial d e la conc entración o d e la matriz , por lo que la cant idad de com ponentes tien e que ser ajustados pre viamente. Matemá tica mente , MCR s e pued e exp resar con la sigu iente ecuaci ón: 𝐦𝐦 jk = � 𝐂𝐂 jr 𝐒𝐒 kr T R r=1 + e jk Así, la matriz m de dimensiones J x K , se desc ompone prin cip alm ente en dos sub - matrices: C y S . Pero esta ecuación pu ede definirse de manera global d e la siguiente for ma: M=CS T +E dónde C y S son las s ub - matrices en las que se divide la matriz M , junto con E que es la matriz de los res iduale s. Hay de nuev o a lgunos aspecto s en c omún co n PCA, como que am bos so n mé todos de descom posición de matric es que desc riben los datos ori ginales como un product o de dos su b - matrices que re sumen la inf ormación r elevante d e las muestras y la c ontribución de las variables. Además, amb os métodos dan solu ciones que n o son únicas, a diferencia d e PARAFAC, utilizando PCA la ortogonalidad para resolver esta a mbigüedad rotacional mientras que M C R utiliza otras restricciones que se explican más adelante. Otra diferenci a entre ambos mé todos son po r ejemplo que los com ponente s de MCR no son orto gona les ni secue ncial es. En concre to, en el ca so de datos de cromatografía d e gases - espectr o metría d e ma sas (GC- MS), en los que se aplicará dic ho método en la prese nte tesis , los datos e n bruto se desc omponen en un co njunto de perfil es de elución (conc entr ación) y en los espectro s de mas as de com ponent es puros . Sin emba rgo, co m o y a he mo s d i c ho , ciertas cond i c io ne s de b en cumplirse para realiz ar una MCR ade cuada (Hantao et al., 2012) . A sí, l a prese ncia de ambi güedade s de rot ación y de so lucione s no únicas en l os resul tados de MCR dism inuye su fiabilidad y dificulta su e valuación. Se han propue sto restri ccione s como la no - ne gatividad (que fuerza a las con centraciones a ser p ositivos), la unim odalidad (que fuerza al pe rfil a t e ne r un máx imo único) , el rango l ocal y la selectividad (relacion ada con la inf orma ción pres ente/ ausen te de los c omponen tes en el e xperim ento), para limitar la s ambigüedades de rotación e intensida d util i zando mé todo s MCR . Las restricci ones de no nega tividad y unim odalidad están vinculadas a INTRODUC CIÓN 87 las propiedades quí micas del sistema, mientras que la selectividad es u na restricci ón matemática, relacionada c on los sub - espacios del set de da tos m últi ple . Adem ás, en el caso de trabaj ar co n un set de datos cons titu ido por señales mu y compl ejas , como por ejemplo una muest ra formada por numero sos c ompues tos que genera n un gran núm ero de pic os en el cromatograma, s e prefiere trabajar mediante la d ivisión de l espectro o cr omatograma c ompleto en secci ones, lo que agiliza el cálculo y a que fa cilita la sele cció n del número de com pone ntes, así como pr o p orc iona r esultados má s exactos y la cuidadosa aplicación de las restricciones. La sel ección de es tas p equeñ as s eccion es o venta na s se suele realizar m ediante inspección visual. En esta tesis, este será el procedim iento elegido para trabajar. Per o a pesar de estas d esven tajas , los método s de reso lució n de curv as se han utilizado ampliamente en cromatogr afía, donde han demostrad o su versatilidad para resolver pr oblemas cromatográficos comunes y resol ver picos que de ot ra manera son difíciles de resolver. Un ejempl o de est o se mues tra en l a Figura 20 , donde se muestra la versatilidad d el MCR para resolver diferentes probl emas cromatográficos comunes, c omo son la línea base o la superp osi ción de p icos cromatográfic os . As í, como s e muestra en esta figura, lo que a simple vista parecía un p ico cr omatográfico relacionado c on un solo co mpuesto, tras a plicarle M C R , resultan ser dos picos cromatográfico s que e staban so lapado s rel acionado s co n la prese ncia de dos c ompue stos dife rente s (pic os en verde y r ojo de la Figura 20 ), además de un tercer compo nente extra ído que es la línea base . Por lo ta nt o, con e ste mé tod o se cons igue s olucion a r en este caso, el problema de la línea base, así com o el de la su perposición o s olapamiento de picos cromatográficos, lo c ual nos permite obtener m ejores y más c ompletos resultados. ‘’’ Figura 20 . Ejemplo de res olución de un pico c romatográfico me diante la aplicac ión de MCR . 88 INTRODUC CIÓN 1.5.4. MÉ TODOS SUPE RVI SADOS 1.5.4.1. Métodos de regresión o c ali brac ión linear En esta secci ón se menci on arán las técnicas multivaria ntes emp leadas en esta m emoria de tesis para buscar una relación en tre la señal analític a y alguna pr opiedad de la muestra. 1.5.4.1.1. R egresión d e m ínimo s cua drado s pa rcial es (PLS) La regresión de mínimos cu adrados parciales (PL S ) es un m é t o do que se utiliza para enco ntra r las relaciones fun damentales entre las va riables independientes ( X ) y las variable s dependi ente s ( Y ), las cuales s on modelad as simu ltán eamen te ten iend o en cu enta n o sól o la varianza de X , sin o la c ovarianza entre X e Y . Uno de los alg oritmos más usados para este fin es el de nomina do NIPAL S ( N on -L inear I ter at i ve P a rtial L east S quares ) . NIPALS descompone X e Y simultán eam ente en un produc to de ot ras dos matr ices de sco r es y l oadings . Este métod o es descrit o por las siguientes ecuaciones: X= TP T +E Y=UQ T +F d ond e X e s una matriz de N x M pre dictores ; Y es una matriz de N x P respues tas; TP T se aproxima a los datos de la matriz X y UQ T a los verdaderos valores de Y . L a des composici ón no e s independiente y existe una relación lineal entre los sco res T y U , que so n matrices N x L ( scores ), que so n a su vez, proyeccio nes de X y d e Y respect ivamente . P y Q s on, re spectiv amen te, matrices de carg as ortogo nales (loadings ) ; y l os términ os E y F de la s ec uacione s anter iores son matrices de error y el s uperíndice T significa la transpu esta de la matriz (W old & Sj östr öm , 2001) . NIPALS trata de encontra r factores (llamados variables latentes) que maximizan la cantidad de variación explicada en X que es relevante para la p redicción de Y , es decir, c apturar varianza y conseguir correlación. L a parte importante de cualqui er regre sión es su us o par a prede cir e l bloque depe ndiente de l bloque inde pendiente , esto se ha ce descompo nie ndo el bloqu e X y construy endo e l bloque Y utilizand o los valores calculados para la cali bración. El núm ero de variables lat entes que se utilizarán es un parámetro importante de un modelo PLS. Así, si e l modelo para la relación entre X e Y es un modelo l ineal , el número de compo nente s necesario para describir es igual a la dimensionalidad del m odelo . Para la corr ecta selecci ón de est os compon entes, existen diver sos mét odos c omo el uso de la su ma r esidua l de INTRODUC CIÓN 89 predicción de cuad rados (P RESS) o el lla mado RMSECV (error cuadrátic o medio e n la validación cruzada ) ( Geladi & Kowalski, 198 6; Wold, Sjostrom, & E riksson, 2001) . Esta m etodología ha sid o aplicada en el ámbito de c ontrol de ali mentos para múltiples predicciones, como por ejemplo determinar el a margor de una cerveza o la a cidez en vinagres (Christensen, Ladefoged, & Norgaard, 2005; Moros, Iñ ón, Garrigues, & De la Guard ia, 2008) , predecir parámetros sens oriales del vinagre balsá mico italiano (Versari et al., 2011) , o determinar y cuantificar la concen tración de cier tos c ompuest os ( como antocianos, ácidos orgánicos, etc.) en una mat riz alimentaria o inclus o detectar ad ulteraci o ne s (Alampres e, Amigo, Casiraghi, & Engels en, 2016; R egmi et al., 2012; Sorian o, Pérez - Juan, Vicari o, González, & Pérez - Coell o, 20 07) . 1.5.4.1.2. R egresión d e m ínimo s cua drado s pa rcial es de múl tipl es vías ( N - PLS) N- PLS es un método de regres ión line ar de múltiples vías, sien do una extensión de l método PLS, anteriormente descrito, a da tos de múltip les dimensiones, es decir, a matrices de orde n supe rior , princip al mente matri ces d e tr es di men siones (Bro , 19 96 ) . Pr im e ro s e de s a rro l ló c omo un modelo si milar a PARAFAC, demo st r án do se m ás tarde que N - PLS resultaba ser un algoritmo más rápido y qu e podía ex tenderse fácilmente a cualquier ord en deseado para las matrices X e Y , a sí como que proporcionaba mejores resultados de predicci ón . Como e n PLS , este método consiste en dos pasos: la descomposición de la matriz de calibración y el establecimiento de la r elación (regresión) entre la matriz desc ompuesta de variables indepe ndient es y la v ariable o variables dependientes. Pero en este cas o, la matriz de calibraci ón X es un cubo, y es descompuesta en un c onju nto de cubos de rango uno que describe n la matriz X. E ste métod o ti ene la ven taja de poder ha cer f ren te a l os ef ectos d e la ma triz y a la s propiedades intrínsecas de los analitos. Matemá tica mente, para cada co mponen te se cons truye un mode lo de X e Y , a c ontinuac ión , estos mod el os se restan d e X e Y , y se encuentr a un nuevo con junto de co mponen tes d e los r esidua les. Este m étod o ha resulta do de utilidad en datos tridimensionales como la matriz excitaci ón - e misión (EE M) de espectroscopía de fluorescencia multidim ensional, p ara correlacionar fluoróforos presentes en la matriz ali mentaria con parámetr os de calidad ( G ui me t, Fer ré, Boqué, Vidal, & Ga rcia, 2005) e incluso para relacionar datos sensoria les con dat os cromatográficos (Marchetti, Bro, Durante, Cocchi, & G randi, 2006) . 90 INTRODUC CIÓN 1.5.4.2. Mé todos de cla sifi caci ón 1.5.4.2.1. Modelado suave in dependiente por an alogía de clases (SIMCA) SIMCA es un método de clasificac ión super visado donde cada c lase se mode la usa ndo un PCA d e forma i ndependient e, d e forma que ca da clase tiene un mo delo especí fico descrit o por un n úme ro ópt imo de PCs. D e esta man era, se pued e construir un “espacio de la clase”, cuyo volumen marca el límit e entre las muestras que son descritas por el modelo como perteneci entes a l a clas e estudia da y las muestr as qu e no p ueden ser c onsi der adas c om o perteneci entes a ella, p ara un nivel de confianza seleccionado. Tras c onstruir los model os PCA indepe ndient es, las muestras des conocida s son proyectadas en ello s. Para saber si una nu eva muestra se ajusta a la clas e, la infor mación que se calcula es dividida en dos, una p arte explicada por el m odelo de la clase y otra q ue per manece en l os residuales. Si l os residuales de la mu estra son si gnificativamente ma yores que los de la c lase, la muestra es rechazada. Otra forma de interpretar los resul tados obtenidos, es d eterminar el espacio d efinido por un a clase dada (T 2 ) y su espacio residual (Q), c on la finalidad d e evaluar si lo s valores de ca da mue stra pre dicha está n mejor descritos por el espacio T 2 ; de ser así, las muest ras son clasificadas como miembros de la clase. E ste mét odo fue originalmente propuesto por Svante Wold, ( 1 980) . S e de no m i n a “suave” porque no asume l a distribución de la variable, “independiente” p orque cada categoría o c lase s e mode la de forma ind ependi ente me diant e PCA, y “por analogías d e clase” porque se centra en similit udes entr e objetos de la misma clas e en lugar de en las diferencias entr e clases. Uno de los parámetr os cuya optimización es crucial es determinar el corr ect o número de PCs para cada PCA. Este métod o, a dif erenc ia d e PLS - DA y SVM qu e exp licar emos en los s iguientes apart ados , permite que una m uestra pueda ser cla sificada en una clase, en varias clases o e n ninguna clase. De este mod o, una muestra descon ocida solo se asigna a una cla se para la cua l tiene una alta probabilidad, y si la varianza residual d e la muestra excede el límite superior par a cada clase modelada en el conjunto de datos, la muestra n o se asignará a ningun a de las clases. E ste m étodo de clasificación ha sido también utilizado para resolver problemas d e autenticidad y control de alimentos (Boffo et al., 2009; Coc ch i et al. , 200 7; Ló pe z - Feria, Cárdenas, Gar cía - Mesa, & Valcárce l, 2008; Xie, Y ing, & Ying, 2 009) . INTRODUC CIÓN 91 1.5.4.2.2. Anális is d iscriminante so bre mínimos cuadrados p ar cial es ( PLS - DA) PLS - DA e s un mé todo supervi sado de anális is, e n concreto es dis crimina ci ón que se bas a en la regresión en mínimos cuadrados parciales P LS (anteriormente descrita), el cual, aunq ue se desarrolló inicialmente para construir modelos de predicción, se adaptó aún más para lo s problemas de c lasificación . En PL S - DA, la m atriz X c ont iene las variabl es indepe ndientes que pued en s er el esp ectro o el cromat ograma de cad a muestra, mientras qu e la variable dependiente Y es una variable categórica, llamada “ dummy matrix ”, que es d efinida por el analista y que codifica cada clase de las muestras de manera n umérica (Ballabio & Consonni, 2 013). Habitualmente, la matriz Y consta de nú mer os en teros (gener al mente cer os y un os) y lo s valor es pred ichos en es te ca so d e PLS - DA para las muestras desc onoci das son valores t ambién numé ricos entre c ero y un o, con virtié ndose e n una clase co ncreta según un umbra l op timizado . Para convertir estos resultados numéricos en clases se utiliza el Teore ma de Bayes, el cual, de manera resumida y general, vincula la pr oba bilida d de un e vento A da do B , con la probabilidad de B dado A. PLS - DA reduce el número d e variables utilizad as en el modelo, al combinar las variables en el c onjunto de datos p ara calcular n uevas variabl es (llamadas va riables laten tes, LV) que tienen l a máxima correlaci ón con la variable de cla se. Estas LV son c ombinaciones lineales de las variables originales y, en co nsecuencia, permiten la visualización gráfica y la comprensión de lo s difer ente s patro nes de datos y re lacio nes por puntuac io nes - s c or e s - de LV y loadings . E n e s te caso, y al contrario de SIMCA, las muestras s on siempre clasificadas en una de las clases, ya que su clasificación se basa e n probabilidad. Por tanto, y de manera g eneral, P LS - DA se puede considerar como un clasificador lineal de dos clases. Es decir, el método apunta a encontrar una línea recta que divide el espacio en dos r egiones. Así, en la práctica , asumie ndo que los valores de pre dicció n sigue n una distribu ció n normal , el límite o u mbral que las s epara se marc a do nde el núm ero de falsos positiv os y negativos es el mismo. Las ecuaciones fundament ales de PLS - DA son las siguientes: X= T P +E C =Tq+f siendo X la matriz de datos inicial; C (también a veces ll amado y) el conjunto de números dis cret os (0 y 1 o - 1 1), por lo gener al de do s niveles, un nivel para el grupo A y el otro para el 92 INTRODUC CIÓN resto de dato s, o en un modelo de dos clases , el gr u po B ; E y f son re siduales; T es la matriz de scores y P lo s loadings (Richard G. Brereton & Lloyd, 2014) . Esta me todología se aplica ho y en día de manera rutinaria por la mayoría de quimiométricos y h a s id o amplia mente utilizada para pr oblemas d e clasificación y autentificación de ali mentos (Al a mp rese e t al ., 2016; Callejón, A migo, Pairo, G armón, et al., 2012 ; Ong , 2008 ; R oh man & Man , 2 01 0; Wu , Ch en, Li n, & Ta n, 2016 ) . 1.5.4.2.3. Anális is d iscrim inan te N- PLS (NPLS - DA) NPL S - DA o también llamado N - way PLS - D A, es una extensión de PLS, utilizada en el caso de dat os tri dimensio nales. Esta m etodología consiste en aplicar el algoritm o N - PL S a la clasificación, prediciendo la p ertenencia de una muestra a un grupo cualitati vo previamente definido (Vigneau, Qannari, Jaillais, Mazer olles, y Bertrand, 2006). En es encia, N - P LS para análisis discriminante es e l mismo que para propósitos de calibración e xplicado anteriormente, s olo que el vect or Y en es te ca so es la dummy matrix o dummy v ector , co nteniendo cada clase c omo 1 o 0, co mo ocurr e en el m étodo d e PLS - DA (Folch - Fortuny, P rats - Montalbán, Cubero, Blasc o, & Ferrer, 2016) . Igualmente, s e utiliza para pr oblemas d e clasificación en matrices tridimensionales co mo las EEM o i magen hiperespectral ( Azcarate, Teglia, Karp, Ca miña, & Goicoechea, 2017; Oli veri et al., 2014) . 1.5.4.2.4. Máqu ina de vectores de soporte (SV M) La m áquina de vecto res de sopo rte , máqui na d e soporte vectorial o máq uinas de v ecto r sopor te ( Support Vector Machines , SVM) es una t écnica de clasifi cación desa rrollada por Vapnik 1979 (Va pni k, 19 79) basada en un conjunt o de algor itmos de aprendizaj e sup ervisado . SVM e s un método de clas ificaci ón basta nte rec iente que no neces ita un gran núme ro de muestr as pa ra ser en tren ado y no s e ve afec ta do por la presencia de valores atípicos. Además, SV M está ganand o interés c on respect o a o tras técnicas de clasificació n debido a su capacidad para realizar clasificaciones lineales y no lineales. E l problema de clasificación se pued e restringir a un p r oblema de dos clases. Así, d ado un co njunto de muestra s de entrenam iento, po demos etiqu etar las cl ases y entrenar al modelo SVM para pred ecir la clase de una nuev a mue stra . Un a SVM es un modelo que represe nta a las mue stras como punt os en el espa cio, separ ando las clases a 2 espacios lo m ás amplios posibl es me diante un hipe rplano de sepa raci ón ópt imo (OSH) defini do c omo el vector entre los 2 puntos más cercanos , de las 2 clases, a los qu e se le llaman “vector es soporte”. Cuan do l a s nue v as INTRODUC CIÓN 99 M ediant e el métod o B ootstrap , s e cons iguen estima r lo s err ores estándar d e los datos originales m edian te un nuevo mu estreo, lo que per mite calcular los inter valos de confianza par a cada muestra, así como la confiabilidad en los modelos de clasificación al conocer la incer tidum bre de cada grupo d efinido en el model o jerárquico ( Snee , 19 77) . Adem ás , B ootstr ap proporciona límites de confianza consistentes (CL), qu e son la manera más comú n de estimar la incer tidum bre de un m o delo . Con la distr ibución B o otst r ap , el val or central (el pun to estimado ) y los intervalos de confianza (límites de confianza) se pueden calcular de m anera similar al cálculo del intervalo de confianz a de una media. Por tanto, en resu m en, es te m étodo p ermite v alorar el error muestral, establecer u n intervalo de confianza y validar modelos. 100 INTRODUC CIÓN 101 102 2. JUSTIFICACIÓN Y OB JETI VOS JUS TIFI CATI ON A ND O B JECTI VES JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 103 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 104 JUST UFI CAC I Ó N En la actualidad, cada v ez son más frecuentes las noticias relacionadas con fr audes alimentarios y falsificaciones , sobre todo en pro ductos aliment icios de a lta calidad . E s t o h a provo cado que la autent icidad de es to s alimentos se a una preo cupa ción que está cobra ndo una mayor importancia en la vida diaria d e productores, consumidor es e investigado res . Este interés social ha dado lugar al nacimiento de nue vas normativas y regu laciones de los países europeo s y de Estados Unidos, g enerándose nu evos retos analíti cos para los laboratorios de control de l a calidad de los alimentos. La autenticidad y la lucha c ontra el fraude es uno de los obje tivos promo tores de la Unió n Europea (UE) , así como una de las líneas de actu ación del Programa Marco de Investigaci ón e Innovación de la UE (Horizonte 2020 ) calificado como “desafío d e la sociedad”. La autentificación de alime ntos comprende el control de un amplio rang o de parámetros fisicoquímicos y s ensoriales. Los métodos c om únmen te usados para cara cterizar, e valuar la calidad o descubrir adulteraciones y fraudes en alimen tos, son principalmente la cromatografía de gases o de líqu idos acoplados a espec trometría de masas (GC - MS, HPLS - MS) o electroforesis capilar (CE). Éstos tien en la desv entaja de que consum en bastante tiemp o, son ca ros, laboriosos y re quieren e ntrenam iento del persona l. Así mismo , los compu estos que deben ser cuantificados para asegurar la autenticidad aliment aria están co ntinuam ente aumentando debido a la mayor sofisticación de los métodos de adu lteració n. En consecue ncia, hay una creciente necesidad de bus car métodos analític os rápidos, sencillos, barat os, robustos, efectivos y que no requi eran a penas ma nipulac ión de la muestr a , capaces de aut entificar alimento s, clasificarlos y detectar adulteraciones o fraudes. Con esta finalidad, las técnicas espectroscópicas co mbinadas con técnicas quimiom étricas, han d emostrado s er útiles para l a caracterización y autentificación de alim entos, así como para la det ección de posible s adulteraciones o fraudes. Hoy en día, uno de los producto s aliment icios que se están viendo a fectados por nume roso s fraudes y fal sificac iones s on a quellos que se enc uent ran protegid os ba jo una Denominación de Origen Protegida (DOP ) . Dicha p rotec ción sirve para garantizar al consumido r un nivel de calidad ele vado y constante y unas cara cterísticas singulare s de dic hos product os elaborados en una z ona geográfica específica. Ad emás, otorga a los productores una protección legal contra falsificaci one s. Ent re los producto s amparados ba jo una DOP , enc o n t ram o s el vinagre de vino. En España son tr es las DOP de vina gre de vino reconoc idas: “Vin agre de Jerez” , 105 JUSTIFICACIÓN Y O BJETIVOS “Vinagre del Condado de Huelva”, y “Vinagre d e Montilla - Moriles”, siend o las tres producidas en An dalucía. La alt a calidad d e estos vinagres de vino con DOP se d ebe fundamentalmente a su aroma, ya que es lo que el consumidor percibe c omo calidad. Así, estos vinagre s de vino con DOP cuentan con una complejidad aromática y s ensorial originados e in fluenc ia do s p o r e l material de partida, el método de producción, los compuestos formados du rante la ferme ntac ión, y en algunos casos, dura nte el envejecim iento. Por tan to, uno de los parámetros principales necesari os para determinar la calidad de estos vinagr es y diferenciarlos d e otros y entre sí, es el estudio de su perfil volátil, aromático y sensorial, el cual no se h abía realizado hasta la fecha con l os vinagres de vino de las tres DOP españolas. En este c ontext o, el pr oy ecto de tesi s titu lado “Caracterización espectroscópica y aromática de vinagres espa ñoles con d enominació n de o rigen prot egida ” pr etende , por un lado, ofrecer una nueva met odología analítica que permita de forma rápida y eficaz la caracterización y detección de fraudes en alimentos con un alto val or añadido en la dieta Medit erránea, como son l os vin agr es c on DOP , para garant izar que el consumid or reci ba un produc to con total garantía en cuanto a segu ridad, origen y métodos de producci ón , ut iliza ndo un mé todo de contr ol econ ómi c o , rápido y sencill o como alternativa a los métodos tradicion ales . P ara la con secució n de este obj etivo se pro pone emplear técnicas e spectros cópica s en combinac ión con técnicas quimiométricas , debido a que esta combinac ió n ya ha d emostrado ser altamente com p etitivas en el campo de la caracterización y clasi ficación de alimentos por ser técnicas no destructivas, sensibles, rá pidas y de rel ativo bajo c oste. P or otro lado, el pr oyecto de t esis tam bién pret ende realizar una caracterización aromática de estos vina gres de vino con DO P mediante la deter minación de sus perfiles volátiles , aromáticos y sens oriales, así c omo la determinación de los c ompuestos ar omáticos que puedan servir como marcador es de calidad y aute ntici dad de ca da DO P. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 106 OBJETIVO S Uno de los objetiv os principales del pro yecto de Te sis es l a cara cteri za ción espec tr oscópica de los v inagres de vi no españole s c on DOP mediante m étodos analíticos m ás rápidos y económicos que los métodos tradicionales, que permitan la autentificación y discriminación de los vinag res de las 3 DOP españ olas (Vinag re de Jerez, Vinagre de Condado d e Huelva y Vinagre de Montilla - Moriles) , y de su s categorías , garantizand o con ello su autenti ci dad , su denomi nación de origen y l a c a t eg or ía a la que p ertenecen. A demás, por ot ro lado, el segundo objetivo prin cipal es la c aracteri zación aromát ic a de los vinagres de vino de las tres DOP y sus c ateg orías mediant e el estud io d e su perfi l aromát ico po r c r omatografí a de gase s - espect rome tría de masas, análi sis olfat ométricos y anális i s senso rial , c on e l obj et o d e intentar relacionar los datos s ensori ales con los o btenido s in strume ntalme nte y obt ener con todo ello una caract erización aromática completa de las mu estras que permita s u autenticación y discriminación. T od o e st o se culminaría con el des arrollo de una herr amienta i nformáti ca basada en lo s resul tados o btenido s e n com binació n c on métodos de anál is is multivari ante , que sea capaz de consegu ir los objet iv os cita d os . Para ello se definen los siguientes sub - obje ti vos : 1. Carac terización de vinagres de vi no e spañole s co n DOP m edian te té c n i c as espec tr oscópicas rápida s, econ ómicas y robustas (EFM, FTIR, NIR, RMN , UV - VIS) en combinación con t écnicas quimiométricas. 2. Cons truc ción de model os mul tivari antes de cla sif ica ción a partir de l os resultados espectroscópic os, indivi dualmente o de forma fusi onada , que pe rm it a n la d iferenciación y auten ticación entre DOP , así com o entre l as disti ntas categorías comercializadas s eg ún ti emp o de envej eci miento y dulzor , e incluso la d etecc ión d e adulteraciones o de prá cticas fraudulentas. 3. Caracterización aromática de los vinagre s de vino c on DOP m edi ante anál isis GC - MS, anális is s ensorial y análi sis olfatométri co ( GC - MS - O) , con el fin de estable cer las diferencias entre el p erfil volátil y aro máti co de las diferentes DOPs y categorías , para darle un mayor valor añad ido a estos vinagres y DO Ps , así co mo determinar aquellos compuestos volátiles y odo rantes de impacto responsables de la diferenci ación de estos vinagres, los cuales podrían considerars e marcadores de la calidad y autentici dad de cada DOP y categ oría. 107 JUSTIFICACIÓN Y O BJETIVOS 4. Cons truc ción de una herrami enta i nform ática basada en métodos de anál is is mult ivariant e a par tir de l mejor modelo de clasificación que , de for ma rápida y sencilla , permita ident ifica r los vinagr es de v ino de di stintos or íg enes, disti ntos mét odos de produc ci ón, dist intos envej ecim ient os, así como vinagres de v ino c on o si n D.O. P, garantizando la autenticidad de cada vinagre y de tecta ndo m uestra s fraudule ntas , siendo su scep tible d e patente. L a realización de la prese nte propuesta requiere una experiencia multidiscip linar y compl ement aria. Está vincula da a un proyec to de Excelenc ia de la Junta de Andalucía ( P12 - AGR - 1601 ) , el cual ha sido dir igido des de la Universidad de Sevilla y en el que part icipan tres c entr os de investigación (Universidad de Sevilla, Ins tituto de la Grasa y Univer sidad de Copenhague). E l conocimiento generado pe rmitirá dar un valor añadido a la producción y comercialización de vinagres andaluces con DOP. A de má s , t o do s e sto s objetivos específicos se enmarcan en un objetivo general de la industria vinagrera centrad a en la o bte nción de procedim iento s de trazabilidad integral, au mentando de esa for ma la confianza del c onsumidor y reforzando l a compe tit ividad de las empresas en un mercado agroalimentario cada vez más competitivo. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 108 DIAGRA MA DE FLUJ O Figura 25 . Diagrama de flujo de lo s obj etivos a rea lizar en la presente Tesis Doctoral. MATERIA LES Y M ÉTODOS 115 3.2. MATERIALES, INST RUMENTACIÓN Y PROCE DIMIENTOS ANALÍT ICO S 3.2.1. ANÁLI SIS E SPECT ROSCÓ PICO 3.2.1 .1. Espe ctro scopí a d e infrar rojo me dio con T rans form ada de Fou rier y cri stal de Ref lactan cia tot al ate nu ad a (ATR -FTIR)  Materiales y reactivos : o E spectr ómetr o Bruk er Ver tex 7 0 FTIR equipado con detec tor DGTS (Bru ker Optics, Ettlingen, Alemania) o Accesorio ATR: La estación de muestre o estaba e quip ada con un accesorio de reflectancia t otal atenuada y multi - reflexi ó n de smontab le (ATR, seis rebot es, Spec ac , Orpington, U.K.). Este accesori o consiste en un cristal ZnSe de 45 ℃ de á ngulo. o Ácido acético de calidad analítica - Merck ( Madrid, España) o Agua Milli - Q (Millipore, US A)  Instru men tació n y pr ocedimiento analítico : El análisis se llevó a cab o en el es pectr óme tro qu e se mu estra en la Fig ura 26 . Cada espectr o se r egist ró a la misma temperatura (22°C) en la región de 4000 - 600 cm − 1 con un prome dio d e 5 0 e xplorac iones a una resol ució n de 4 cm −1 . Antes de analiz ar ca da muestra, se tomó un espe ctro de fondo con un cri stal ATR vac ío. 250 µ l de cada m uestr a se exte ndiero n uniformemente a través del cristal ATR utilizando una micropipeta. Los espectros se exa minaron utilizando OPUS versión 7.0 (Bruker Optics, Ettlingen , Alemania) y se manipularon con el software OMNIC. Cada muestra fue analizada por tripl icado. Estos análisis se llevaron a cabo en el Instituto de la Grasa , CSIC. Figura 26 . Imágenes del equipo utilizado para el análisis de las muestras por ATR - FTIR. 116 MATERIA LES Y M ÉTODOS 3.2.1 .2. E spe ctro sco pía d e Infra rro jo c erc ano (NIR )  Materiales y reactivos : o Espectr ómetr o IR ABB d e B omen (Q - interline, X, Dinamarca), equipado con una lo ngitud de trayecto ria de 1 mm pa ra cubet as . o Vial transparente de 1 mL , 40x80 mm (Skandinaviska Genetec AB, L und, Suenci a) o Ordena dor c on s oftware d e espectr oscopía GRA MS/AI ™ (s oftwar e Th ermo Fisher Scientific)  Instru men tació n y procedimi ento a nalít ico : Los datos espectrales se recopilaron tras el análisis de los vinagres de vino por el espectr ómetr o m ostrad o en la Figura 27 , e n el rango de 12000 - 40 00 c m −1 , co n una reso lución de 8 cm −1 y 64 exploraciones. Las mues tras de vinagr e de vin o se an alizaron directamente si n tratamiento previo de la muestra pipeteándo las e n un vi al transparente de 1 ml antes de su análisis . El espectro de cada muestra se obtuvo por triplicado en una secuencia aleatoria y a temper atur a ambiente (21 - 23 ° C). Estos análisis se ll evaron a cabo en el Depa rtamento de Ciencia de los Alimentos de la Unive rsida d de Cope nhague. Figura 27 . Imáge nes del equipo NIR y cubetas util izadas para el análisis de las muestras de vinagre de vino. MATERIA LES Y M ÉTODOS 117 3.2.1 .3. E spectroscopía de fluorescencia multi dimensional (EFM) 3.2.1.3.1 Determina ción de huella dig ital o perf il es pectr oscó pic o  Materiales y reactivos: o E spectr of otómetr o de flu oresc encia Varian Car y - Eclipse (Varian Iberica, Madri d, Es paña) equipa do co n dos monoc romadores Czer ny - Tur ner, una l ámpa ra de descarga pulsada de xenó n a 80 Hz con altura m edia de pico de 2 µ (p oder d e pic o eq uivalente a 75 kW) y u n d etect or de tubo fotomultiplicador R298 de alto rendimien to . o C ubetas de cuarzo de 3,5 ml estándar ( Hellma Analytics, Müllheim, Alemania) de 1 c m de longitud d e trayectoria. o Recipien te te rmost a tiz ad o Pelt ie r ( 25,00 ± 0, 05 ° C). o Ordena dor c on s oftware Cary - Eclipse  Instru men tació n y pr ocedimiento analítico : Las muestras de vinagre de vino se analizaron dire ctamente por el espe ctrofo tóm etro de fluorescencia sin trata miento previo de la m uestra , pipeteánd olas directamente en cu b etas de cua rzo para su análisis . El equip o y cubetas utiliza do se muestra en la siguiente f igura ( Figura 28 ). Est os análisis se llevaron a cabo en el Departamen to de Química Analítica de la Facultad de Química de la Universidad de Sevilla. Figura 28 . Imág ene s del equi po de espe ctr osc opí a d e fluo resc enci a y cub eta uti liza do s en el pr esen te tra bajo de tes is . 118 MATERIA LES Y M ÉTODOS Las matrices de fluorescencia de emisión - excitac ión (EEM ) fue ron obteni das v ariando el rango de longit ud de onda de excit ación ( λ e x) ent re 250 y 700 nm (c ada 5 nm) , y reg i strando la em is ió n ( λ em) de 30 0 a 800 n m (cada 2 nm). P ara estas m ediciones, las ranuras de excitación y emisión se ajustar on a 5 nm, y la vel ocidad de escan eo se fij ó a 12 00 nm min -1 . El sistema se calibró todos los día s por medi o de la longitu d de onda d el pico Raman de agu a. Los espec tros EEMs fueron registrados por triplicado para cada muestra y prepr ocesados par a evitar áre as ruidosas y no info rmativas seleccionando rangos espectrales más cortos ( λ ex d e 25 0 a 68 0 n m, y λ em de 31 0 a 800 nm ). 3.2.1.3.2 . Determinación de la presencia o concentr ación de caramelo de mosto  Materiales y reactivos: o Caramelo de mosto (caramel o colorante MO - 7) suministrada por SE C NA S.A. (Valencia, España) c on el número d e identificación CEE: E - 150d . o Agua de purificación Milli - Q (Millipore, EE. UU.) o Ácido acético calidad analí tica de Merck (Darmstadt, A lemania) o Metanol de calidad analític a de Merck ( Darmstadt, Alemania) o 5- Hydroxymethylfurfural ( 5 - HMF) de Sigma - Aldrich (Madrid, España) o E spectr of otómetr o de flu oresc encia Varian Cary - Eclip se (Varian Iberica, Madri d, Es paña) equipa do co n dos monoc romadores Czer ny - Tur ner, una l ámpa ra de descarga pulsada de xenó n a 80 Hz con altura m edia de pico de 2 µ (p oder d e pic o eq uivalente a 75 kW) y u n d etect or de tubo fotomultiplicador R298 d e alto rend imien to . o C ubetas de cuarzo de 3,5 ml estándar ( Hellma Analytics, Müllheim, Alemania) de 1 c m de longitud d e trayectoria. o Recipi ente te rm ost at izad o Pel ti er ( 25, 00 ± 0, 05 ° C). o Ordena dor c on s oftware Cary - Eclipse o Cromatógrafo de líquidos L aChrom® WWR - Hitachi (Ba rcelona, Es pa ña ) con una bomba cuaternaria L - 7100 cone ctada a un detec tor de red de diodo s L - 7455 (DAD), acoplad o a un automestreador L - 2200. o C olum na Lun a C18 , 5 µm, 250 × 4 ,6 mm y p recolum na de prote cción de 4, 0 × 3,0 mm de Analyti cal Phe nomenex (Torrance, CA, EE . UU.). o Fase móvil de 8 0% de agua , 18% de metan ol y 2% ácido ac ético. o Filtro de membrana 0. 45 µm PTFE (Merck, Darmstadt, Alemania ) MATERIA LES Y M ÉTODOS 119  Instru men tació n y procedimi ento a nalít ico Las muestras de vinagre de vino se analizaron directam en te sin trata mien to previ o de l a muestr a pipe teándo las en cubeta s de cuarzo pa ra su medición , us ando el mis mo m étodo descrito en el apartado anterior, pero ajustando las longitudes de onda de exci tació n - em i sió n a 250 - 650 nm ( ca da 5 nm) y a 300 - 700 n m (cada 4 nm) , resp ecti vamen te . Estos análisis se llevaron a cabo en el Dep artamento de Quí mica Analítica de la Facu ltad de Química de la Universidad de Sevilla. Se realizaron cur vas de calibración de 13 puntos mediante la adici ón de dife rentes canti dades de caramelo de mos to (entre 5 y 250 µ L) a distintas matrices ( vinagre de vin o con DOP sin caramelo, vinagr es de vin o con DOP c omerciales y matriz hidroa céti ca 6% ). Un esquema de esta s cur vas s e mu estra en l a siguien te Figura 29 . 3.2.1 .4. R e sonancia magn ética nuclear de protones (1 H- RMN)  Materiales y reactivos o Sal sódica del ácido 3 - (tri metilsilil) propiónico - 2, 2,3, 3 - d4 (TM SP - 2,2,3, 3 - d4 ) de Me rck (Darmstadf, Alemania) o Óxido d e deu teri o, D 2 O (9 9,96%), de VWR Chemicals ( Leuven, Belgica). o E spectr ómetr o Bru ker A VIII 700 (B ru ker Bi ospin G mbH Rhei nste tten, Karlsruhe, Alemania) Figura 29 . Esquema de l a metodología utilizada para el a nálisis del caramelo de mosto por EFM. Se m uestran las distintas a diciones de re alizadas a una mues tra de vinagre de vi no Crianza, así como las botellas corresp ondientes al caramelo de mosto y vinagre de vino (izqui er da) y e l e qui po d e fl uore sce nc ia u tiliza do (dere cha). 120 MATERIA LES Y M ÉTODOS o Tubo s RM N DEU QUANT 5 - 7 de DEUTERO GMBH ( Kastellaun , A lemania). o Registr o del espec tro p or s ecuenci a de Bruke r spin - echo “c pmgpr. fb” (Carr - Purcell – Me i bo o m – Gill, Bruker Library ) con presaturación d e agua o S ecuenc ia Br uker "baseopt" para o ptimiz ación de líne a base. o S oftware Bruker To pSpin 3 .0 o Chenom x NMR Suit e 7.0 (Cheno mx,E dmonto n, Canada)  Instru men tació n y pr ocedimiento analítico Las muestras se prepararon mediante la adición de 100 μL de 0, 16% de TMSP - 2,2,3, 3 - d4 en disoluc ión de D2O , a 600 μL de cada vinagre de vino . E l T MSP se usó como re ferencia de cambio químico (δ = 0) y estándar interno. Los espectros de 1 H- RMN s e adq uirieron a 300 K de temper atura en un esp ectr ómetr o que op era a 700.2 5 MHz . Los FID s e regis trar on co mo la su ma de 64 explo racione s de 7,4 s, cada una cubri endo un ancho espect ral de 11,0 ppm con 1 s entre cada e xplora ción cons ecutiva. E l equipo y materiales u tilizados se muestran en la s iguiente figura ( Figura 30 ). Estos análisis se lle varon a cabo en el Servicio de RMN del Centro d e Investigación, Tecnol og ía e Inno vación (CITIUS) de la Un iversidad de S evilla. 3.2.1 .5. E spe ctro sco pía d e Ul travi ole ta - visible ( UV - v is )  Materiales y reactivos o E spectr of otómetr o UV - vis CHEM USB4 ( USB 40 00) de Ocean O ptics junto c on un de te ctor c on m atriz de di odo s . o C ubeta d e cuarz o con una longitud d e trayect oria de 10 mm (Hellma Analytics, Müllheim, Alemania) o A gua ultrapura calidad Milli - Q (Millipore, EE. UU. ) o Ordenador con software OceanView Figura 30 . Material y equipo utilizado para el análi sis de los vinagr es de vin o por 1 H- RMN. MATERIA LES Y M ÉTODOS 121  Instru men tació n y procedimi ento a nalít ico Como el análisis dir ecto de l os vinagres d e vin o pr oducía s atura ción de seña l en el detect or del e spectr ofot ómetr o, fue n ecesar io un estudi o de dilu ción previ o , en el cual la dilución óptima seleccionada fu e de 1/10 vinagre/ agua (v / v), y a que permi tí a re gistrar el espectr o de mayor in tens id ad, p ero también la observación de las curvas espec trales de aquell os con la señal más baja. L as m e di c io ne s de espectroscopía UV - vis de es tas muestras diluidas se realizaron utilizando un espectrofotómetro UV - vis CHEMUSB 4 de Ocean O ptics junto con un detect or c on matriz d e d iodos. Las muestras se c olocaron en una cubeta de cuarz o y l a abso rbanci a en fu nció n de la lo ngitud de onda se midió c on una resol ución de 2 nm en un ra ngo de tr abajo de 180 a 890 nm , por duplic ado . Se us ó agua ultrapura ( calidad MilliQ) co mo la exploración de referencia y se seleccionó el rango de 280 a 60 0 nm como la región con información relevante. Un esquema del procedimiento seguido, así como el mat erial y equipo utilizado se muestra en la siguiente fig ura ( Figura 31 ) . Este eq uip o per tenec e al centr o d e trabajo de la Dra. Silvana M. Azcára te, la Facultad d e Ciencias Exactas y Natural es, Universidad Nacional de La Pampa (CONICET) e Instituto de Ciencias de la Tierra y Ambientales de La Pampa (INCITAP), de Santa Ros a, Argentina. Figura 31 . Procedimie nto esquemati zado, materia l y equipos u tilizados par a el análisis de los vinagres de vino p or espectrosco pí a UV - vis. 122 MATERIA LES Y M ÉTODOS 3.2.2. ANÁLISIS CRO MATOG RÁFICO: GC - MS, G C - MS -O  Materiales y reactivos : o 4- methyl - 2 - pentanol (Merck, Dar mstadf, Alemania ) o Ethano l (Merck, Darmstadf, Alemania) o Agua ultrapura de ca lidad Milli - Q ( Millipore, USA) o Serie d e N- alcan o s de cade na lineal C10 a C4 0 de Fluka (Madrid, España) o Barra de agitación larga de 10 mm recubierta con PDMS de la marca Twisters® (Gerstel, Müllhei m and der Ruhr, Ale mania) o Tubos s orben tes T enax TA TM (Gerstel, Müllheim an d der Ruhr, Alemania) o Fibra de S PM E recubie rta co n 5 0/3 0 μ m de divinilbenceno / Carboxen en fibra PDMS (DVB /Carb oxen/PDMS) de Sigma - Aldrich (Bellefonte, PA, USA) o Estándares de c ompuestos volátiles utilizados en la ide ntificación de Sig ma - Aldrich (Madrid, España), Merck ( Darmstadf, Ale mania) y Fluka ( Madrid, España ). o Diclorometano de calidad a nalítica Merck (Darmstadt, Germany) o Sulfato de sodio anhidro de calidad analítica Merck (Darmstadt, Ger many) o Cloruro de sodio de calidad analítica Merc k ( Darmstad t, Germany ) o Á cido acético de calidad an alítica Merck ( Darmstadt, G ermany) o Colu mna CPWax - 57C B, co n 50 m x 0, 25 mm y 0, 2 0 µm de esp es or d e película (Varian, Middelburg, Países Baj os) o Co lumna H P5 d e 30. 0 mx 0. 25 m m y 0. 25 lm d e esp es or d e pel ícu la (A gilen t) o Sistema de Desorción Térm ica (TDS2) conectada a un i nyector con enfoque criogénico CIS -4 PTV (Ger stel) o Unidad de Espacio en Cabe za Dinámico (Gers tel) o Sistema GC 6890 Agil ent acoplado con un espectrómetro de masas de cuadrupo lo simple Agil ent 597 5ine rt o Siste ma GC Bruker 450 acoplado a un e spectrómetro de masas de tripl e cuadrupolo Bruker 320. o Ordenador con softwar e M S ChemStation (Agilent te chnologies Inc.) y S t a r Cromatography Workstatio n (Varian CA 94 598 - 1675 / USA)  Instru men tació n y procedimi ento a nalít ico Las técnicas de extracción estudiadas para l os distintos análisis cromatográficos d e este presen te trabajo de tesis se resu men a continuación y s u proc edimie nto se muestra en la Figura 32 . MATERIA LES Y M ÉTODOS 123 3.2.2.1. Extracción por sorción en e spacio en cabeza estático ( HSSE) Las c ondiciones de ex tracción y desorci ón óptimas para el análisis de las muestras de vinagre de vino por HSSE -GC- MS se realizaron de acu erdo al método previa mente validado por (R. M. Callejón, González, Troncoso, & Morales, 2008) . Este método será descrito en detalle en su correspondiente capítulo (Capítul o VI) de la presente memoria de t esis. Tras la extra cción, la desorción de los Twister ® se realizó en el sistema GC 6890 Agil ent acoplado co n un espectr ómetr o d e masas de cu adru pol o simple A gilen t 5975inert ( Agilent Te chnologies, Santa Clara, CA, USA ) equipa do con un sist ema de Desor ción Térmic a (TD S2) conecta do a un inyec tor con enfoque crio génico CIS - 4PTV , per tene ciente a l g rupo de inv es tigac ión AGR167 de la Universidad de Sevilla ( Fig ura 32 ). 3.2.2 .2. Ex t racció n por esp acio de ca beza din ámico (DH S) Las condici ones de extracc ión y desorción para el análi sis de las muestras de vina gre de vino p or DHS -GC- MS se rea lizaron usando la unidad d e G erstel de Espacio en Ca beza Dinámic o, bajo las condicio nes del méto do de (Ubed a et al ., 2016 ) . Este mét odo será desc rito en detalle en su corresp ondiente capí tulo (Capítulo VI) de la pr esente m emoria de tesis. Est a extracción se realizó en el s ist ema GC 6890 Agile nt aco plado con un e spec trómetro de masas de cuadrupo lo simple Agilent 5975 inert descrito en el apartado anterior, per teneciente al grup o d e investigación AGR167 d e la Universidad d e Sevilla ( Figura 32 ). 3.2.2 .3. Mi croext racci ón e n fase sóli da en esp acio de cabe za (HS - SPME ) El método utilizado para el análisis de l as muestras p or HS - SPME -GC- MS fue adap tado de los métodos pre viamente validados de (Cirlini, Cali giani, Palla, & Pa lla, 2011; Natera Mar ı  n, Castro Mej ı  as, de Valme Ga rc ı  a Moreno, Garc ı  a Rowe, & Garc ı  a Barroso, 2002; Pizarro, Esteban - Díe z, Sáe nz - Gonzále z, & Go nzále z - Sá iz, 2008 ) . Este mé tod o será d escr ito en deta lle en su cor respond iente c apítulo (Capítulo VI) de la pres ent e me moria de tes is. En este c aso, esta extracción y des orción de la fibra s e realizaron en el Sis t em a G C Br u k er 4 50 ac o pl a do a un espectr ómetr o de masas de trip le cuad rupolo Br uker 3 20, per teneci ente al Cen tro d e In vestig aci ón Tec nol ógi ca e Inno vación de la US (CITIUS) ( Figura 32 ). 3.2.2 .4. Ex t racció n Lí quido - Líquido (ELL) La extra cci ón utilizada para el análisis olfatométrico de las muestras de vinagre de vino ( detallado en el Capítulo VII ) se realizó mediante el método de extracción líquido - líquido ( ELL ) , de acuerdo con la m etodología validada pr eviamente p or Ferreira et al. (2003) (Silva Ferreira , Barbe, & B ertrand, 200 3) y utilizado por los aut ores e n trabajos an teriores (R aq uel M Call ejón, Morales, Tro ncoso, & Silva Ferreira, 2008) ( Figura 32 ). 124 MATERIA LES Y M ÉTODOS Figura 32 . Esquema del procedimiento seg uido en el a nálisis cromatográ fico (G C - MS y GC - MS -O ) por las diferentes técnicas de ex tracció n MATERIA LES Y M ÉTODOS 131 3.2.5. ANÁLI SIS QUIMIO MÉTRIC O DE LO S DATOS Para llevar a cabo el proces ado de datos se ha utilizad o el progra ma Excel como interfaz entre la inf ormación proporcionad a por los instrumentos analític os y los p rograma s utilizados para el tra tamien to de l os datos, creaci ón de model os , etc. Los programas o softwares de análisis de da tos utilizado s son los siguie ntes: - Matlab 2015b ( Th e Math works Inc., Na tick, MA). - PLS_ Tool bo x 7.9.5 y 8.2 . 1 ( Eigen vector Re search I nc., W enatch ee, WA) - Infostat software (Grup o InfoStat, Argentina). Con respecto a los diferentes algoritmos y procedimientos estadístic os usados pa ra interpretar los r esultados nu méricos de acuerd o con lo s obj eti vos de l trab aj o, esto s se m ue s t ra n en la siguiente tabla ( Tabla 7 ) . Est as metodologías y sus abre viaturas c orrespondientes han sid o desc rita s en la secc ión de Intro ducció n . Tabl a 7. Algo ritmos y me to do logía s ut ili zad as e n lo s dis tint os capítul os que componen la pres ente mem oria de t esi s. Alg oritmos univariante s, de pretr atami ento y normal izaci ón de datos Algo rit mos mu lt ivar ian tes Medi a ANOVA SIMCA Desviación e stándar PCA SVM SNV PARAFAC HM SMT MCR P- ComDim Corrección línea base PLS MC N- PLS Scaling PLS - DA Autoscali ng N- PLSDA 132 MATERIA LES Y M ÉTODOS 133 134 4. RESU LT ADOS Y DISCUSIÓN RESULTS AND DISCUSSIO N 135 BLOQUE I: CARACTERIZ AC IÓN Y CLASIFICACIÓN E SPECTROSCÓPICA DE LOS VINAGRES DE VINO ESPAÑ OL ES CON DOP BLOQUE I. CAPÍTULO I: TÉCNICAS DE ESPECTROSCOPÍA VIBRACIONAL ( AT R - FTIR y NIR) 136 CAPÍTULO I: TÉCNICAS D E ESPECTROSCOPÍA VIBRACIONA L (ATR - FTIR Y NIR) CHAPT ER I. Vibrational spectrosc opic tec hniqu es (ATR - FTIR and NIR) BLOQUE I. CAPÍTULO I: TÉCNICAS DE ESPECTROSCOPÍA VIBRACIONAL ( AT R - FTIR y NIR) 137 BLOQUE I. CAPÍTULO I: TÉCNICAS DE ESPECTROSCOPÍA VIBRACIONAL ( AT R - FTIR y NIR) 138 RESU MEN E ste capítulo se centra en el análisis de las muestras de vinagre de vino con DOP por téc nicas de espectroscopí a vibracional, en concreto, p or espectrosc opia de in frarrojo medi o (MIR) y e spectroscopía de infrarrojo cercano (NIR). Ambas té cnic as fueron e legidas de bido a sus altos potenciales co mo técn icas rápidas, económica s y n o destructivas para la caracterizaci ón de vinag res de d if erent es ti pos. Sin embarg o, am b as ti enen una serie de ventajas y limitacion es, y po r tan to s e nece s i ta evaluar y sele cciona r la t écnic a espectroscópica más apropiada para la naturaleza de la muestra, el vin agre de vino en este cas o . A sí , en el pres ente capítu lo se evaluaron las mu estras de vinagre de vino c on DOP por ATR - FT IR y N IR , comp ar ándo se lo s resultados de caracterizaci ón y clasificación obtenidos por ambas técnicas . En primer lugar, el primer trabajo, publicado en Food Control 78 (2017) 23 0 - 237, presenta los resul tados obtenidos del análisis de las muestras de vinagre de vino p or espectroscopia de infrarr ojo por Transfor mada de Fourier (FTIR) ac oplada a un cristal d e Reflactancia Total Atenua da (ATR). Para ello , 67 vinagres de vino con D OP p e rteneci entes a diferen tes categorías y proporcionados por lo s Con sejos Reguladores de cad a DOP , f ue r on analizados : 36 “Vinagre de Jerez” y 31 “Vinagre Condad o de Huelva” . La DOP “Vinagre de Montilla - Moriles” no fue in cluida en este estudio ya q ue esta DOP s e enc ontraba en su prim er año de certificación y todavía no disponíamos de muestras de vi n agre de vino en e l año en el que se realizó el es tudio. Aun así, posteri or a esta pub licación, las muestras de la DOP “Vinagr e de Montilla - Moriles” fueron fin almente analizadas p or la misma metod olo gía, mos tra ndo l o s mism os patrone s que se obser v aron para las otras dos DOPs. E st a t écnica pe rm i tió o bs e rv ar , casi directamente m ediante la visualizaci ón del esp ectr o, apoyándos e en los resul tado s de l análisis de componentes principales ( PCA), diferencias entre las ca tegorías establecidas en cada DOP, debidas a c ompue stos que dura nte el envej ecimi ento i ncrementa n su conc entraci ón (como por ejemplo ácido acético, alcoh oles y ésteres) o que son cara cterísticos de la categoría Pedr o Ximénez ( como por ejemplo azúcares y furf urales). La habilidad esta técni ca pa ra dist inguir los v inagres por sus categorías se basó principalmente en un a serie de bandas observadas en la regi ón de 1500 - 90 0 c m -1 . Este estudio permitió prob ar por primera vez diferencias entr e las categorías de env ejecimie nto de las do s DOP de v inagres m edian te u n análisis direct o, rápido y económico , demostrando la posibl e utilidad d e la técnica ATR - FT IR para la ca racterización d e las cat egorías de envejecimiento establec idas de los vinagre s de vino de alta calid ad protegidos bajo una D OP. Este p roced imien to ade más permitió ca racterizar vinagres dulces ( “Pedro Xi ménez ” ) cu yo BLOQUE I. CAPÍTULO I: TÉCNICAS DE ESPECTROSCOPÍA VIBRACIONAL ( AT R - FTIR y NIR) 139 espectro era claram ente diferente, incluso a si mple vista, en compara ció n con las categorías d e envejecimiento, principalmente debido a las bandas asignadas a az ú cares y compuestos de Maillard localizadas en la s r egiones d el esp ectro de 1 175 a 1 000 cm -1 . Las ventajas de ésta técnic a (rápida , no destructiv a y sin ne cesidad de pre paració n de muestr a) p odría permit ir la implement ación de este proce dimiento como un contro l adicio nal para los Consejos R egulad ores de las D OP s y product ores para evaluar la autenticidad d e cada categ oría den tro d e la DO P, y monit oriza r el proces o de env ejeci miento c on un procedi m ient o simple y rápido. Este primer artículo h a sido premiado con el “ Premio a la Publicaci ón Científica del mes de Farm acia, marzo de 2017”. Sin embargo, mediante este análisis n o se consiguieron buenos resultados de clasificación de las tres DOP y sus c ategorías, por lo que, en la búsqu eda de la técnica espectroscópica más apro piada para el análisi s d e es tos vinag r es, se p lante ó analizar la s muestras de vinagre de vino con DOP median te la esp ectroscopía de infrarrojo c ercana (NIR), ya que esta técnica había demostrado ampliamente su utilidad en la clasificación y en la aute ntica ción de al imen tos. Los resul tad os obten id os de es te es tudi o se muestra n en el seg und o traba jo qu e se present a en es te c apítul o, publica do e n Food Con tr ol 89 (2 018) 10 8 - 116 . En este caso se consiguió ampliar el número de muestras a analizar h aciendo un total de 83 vi nagres de vino de las DOP españ olas ( 41 mues tras de “Vi nagr e de Jer ez”, 29 d e “Vinag re de Condado de Huelva” y 13 de “Vinagre de Montilla Moriles” de diferentes categorías) y 1 1 vinagres sin DOP de disti ntas regiones en l os mer cados locales y b odegas . T o da s ellas se analizaron por espec troscopia NIR a 1 2000 - 400 0 cm -1 . El análisis de componentes principale s (PCA) se realizó para explorar los esp ectros y se utilizó el Análisis Discriminant e de Mínimos Cuadrados Parciales (PLS - DA) para const ruir mode los con di ferente s pr o pósi tos d e clasificación : clasificar las dif erentes cat egorías comercializadas (envejecidas y dulces) dentr o de la mism a DOP , como se había intentado co n MIR, y, p or otro la do, clasificar vinagre s con DOP de aquellos sin la certificación DOP. Lo s result ados de la expl oración de lo s datos NIR mediant e mode los PCAs m ost rar on que el en vejeci mien to y la pr otección b aj o una D OP ten ían un ef ect o relevante en distint as zo nas del esp ectr o. A sí, l as bandas de abso rció n más implicadas e n el envejec imient o fueron de ~ 5200 a ~ 65 00 cm -1 , siendo as ociadas a la presencia d e agua y compuestos ar omáticos y fenólicos ; a demás, la categoría dulce "Pedro Xi ménez " mostró band as característ icas en l a misma región (~ 5600 cm -1 ) asociadas pri ncipalmente a l os azúcares . BLOQUE I. CAPÍTULO I: TÉCNICAS DE ESPECTROSCOPÍA VIBRACIONAL ( AT R - FTIR y NIR) 140 Este estudi o prop orcion ó ad emás una comparació n ent re los r esultad os de caracterización y clasificac ión de los vinagres de vino con DOP por amba s téc nicas. De este m o do , a part ir de los resultado s obt enidos se pudo conc luir que MIR pued e ser m ejor técn i c a analítica para la carac terización de los vinagres de vin o y sus categ orías debido a que ofr ece la ventaja de poder visualizar casi directamente las ban das que producen las diferencias entre muestras, así como permite u na asignac ión química más fácil , m i ent ras que e n N IR las diferencias entre espectr os no son fá ciles de observar a simple vista , ni de int erpretar, y se requie re un pro cesamie nto más compl ejo de los dato s. Por otro lado, l a alta capacidad d e predic ció n ob teni da en e l estudio NIR (> 9 0% de c l asificación corr ecta) en compar ac ió n co n MI R , demues tra la mejor utilidad d e esta metodología para la au tenticación y clasificación de l os vinagres de DOP y sus ca tegorías, así como su difer enciación de vinagres sin DO P. Por lo tanto, la selección de una de las t écnicas como métod o para la cara cterización y au tentificación de lo s vinagres de vino con DO P depende rá del pro pósito qu e se busque, o inc luso se pue de con templar la opci ón de co mbinar ambas técnicas par a obtener mejores result ados . Est e segundo ar t ículo ha sido también pre miado con el “Premio a la Publicación Científica del mes de F armacia, julio de 20 18”. for CSC category. A PCA model was developed with the least aged PDO wine vinegars ( Fig. 3 A): “ Crianza ” for “ Vinagre de Montilla-Moriles ” and “ Vinagre de Jerez ” PDOs (coded as MCR and JCR, respectively) and “ Solera ” (CSO) from “ Vinagre de Condado de Huelva ” PDO. Moreover, vinegars without aging (CSC) for “ Vinagre de Condado de Huelva ” PDO were included in the model. Thus, PC1 explains 92.97% of the total variance and clearly showed a separation between JCR and CSO, in the negative side of PC1 ( Fig. 3 . A.2 ), from MCR and CSC in the positive PC1 side, having this last category more positive PC1 scores than MCR. Moreover, JCR and CSO were separated by PC3. The similarity between MCR and CSC could explain that MCR samples were aged for the minimum period of aging allowed for this category (i.e. 6 months), whereas JCR and CSO cate- gories could be aged for more than 6 months. A second PCA model was developed by including the least aged vinegars but in this case, without the “ Vinagre de Condado de Huelva ” and “ Non-aged ” category (CSC), in order to study the most similar wine vinegars from the three PDO ( Fig. 3 . B2-3 ). The included samples belonged to a category legislated with a minimum period of 6 months and a maximum of 2 years of aging in wood barrels (named as “ Crianza ” and “ Solera ” categories), so in this case, all of them should have some effects of being stored in wood for a period of time and the differences might be more related to the origin. Once again, the separation between PDOs was clearly observed: MCR was placed in the positive side of PC1, CSO in the positive side of PC2, and JCR in the negative side of PC1 and PC2. By looking the loadings plots of these PCA models ( Fig. 3 . A3 and B3 ), the main wavelengths respons ible for the distinction of PDOs were found around 295 nm and from 500 to 600 nm for MCR samples, around 325 – 350 nm for JCR samples and around 350 – 450 nm for CSO samples. These results matched with those observed by the direct visualization of the spectral pro fi le. The “ Reserva ” category of each PDO was also studied by separate ( Fig. 3 C). These samples were similar between them, due to they had to be aged for at least 2 years in wood barrels, independently of the PDO. Regarding the scores plot ( Fig. 3 .C2), a good separation was achieved according to the fi rst two PCs. PC1, which accounts for 93.08% of total variance, seemed to be responsible of the separation of the JRE samples, with negative values, from MRE samples. In the same way, MRE samples were separated from CRE samples mainly by PC2. The loadings plot ( Fig. 3 .C3) showed again the importance of the spectral regions between 300 and 350 nm above mentioned. As it is known, UV – Vis spectrum represents the information based in the composition of absorbent species, such as phenolic, benzoic, and hydroxycinnamic acids, polyphenolic compou nds, and also stilbenes, fl avanols, and anthocyanins. Some of these compounds absorb in the ultraviolet region between 300 and 400 nm, which has shown to be Fig. 3. Spectral pro fi le (1) and the score and loadings plot of a PCA model (2 and 3, respectively) developed with the least aged categories (CR and SO) and the Non- aged category (CSC) of the three PDOs ( A ). Spectral pro fi le (1) and the score and loadings plot of a PCA model (2 and 3, respectively) developed with only the least aged categories of the three PDOs (CR and SO) ( B ). Spectral pro fi le (1) and the score and loadings plot of a PCA model (2 and 3, respectively) developed with the “ Reserva ” category of the three PDOs ( C ). The acronyms for the different vinegar categories are de fi ned in Table 1 . R. Ríos-Reina et al. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 191 (2019) 42 – 53 47 243 mainly responsible of the differentiation of PDOs, and also they have been related to the color and taste characteristics of wine and wine vinegars [ 20 ]. Among them, phenolic compounds of wine vinegars had shown to be useful for differentiating them according to the elaboration method applied or the geograph ical origin of the wine substrate. Thus, according to García-Parrilla et al. (1997), compounds such as (hydrox- ymethyl)-furaldehyde, tyrosol, vanillic acid, vanillin, and caffeic acid were selected as the relevant for a classi fi cation according to geograph- ical origin [ 45 ]. Moreover, Urbano et al. (2006) also observed that some esters and hydroxycinnamic acids absorb at these ultraviolet regions and were responsible of the discriminati on of wines by their origin [ 25 ]. Therefore, from the present exploratory analysis, it can be seen that the origins are clearly separated, probably due to differences in composition of these aforementioned compounds in each geographical origin. The other conclusion of this exploratory analysis that can be extracted by observing the spectral regions where the differences occur is that the discrimination could not be visual, i.e. related only to the color, since the differences mainly lead in the ultraviolet region. This fact was also observed by other authors that used UV – vis for the discrimination of wines [ 20 , 25 ]. 3.1.4. Differences between categories of each individual PDO Once differences between PDOs have been analyzed, each PDO was assessed separately in order to study the differences between categorie s within each PDO. Thus, the different categories produced and commercialized for each PDO according to aging in wood barrels were analyzed by the development of new PCA models. The raw spectra and the scores and loading plots of the three PCA models developed, one for each PDO, are shown in Fig. 4 . It should be highlighted that in this case, the reduction of variables was very important to achieve a good sepa- ration of categories. As it can be observed in the plot of the raw spectral pro fi les (left side of Fig. 4 ), the differentiation between categories for each PDO was not based on the intensity of the signal, as occured with the PDO-discrimination, but it was based in the overall shape of the pro fi le. By looking at the score plots, a good separation of categories could be observed in the three models, although the best separation was obtained in the PCA model of “ Vinagre de Condado de Huelva ” PDO ( Fig. 4 B). In this model, the three categories were placed completely separated in different quadrants of the scores plot. The scores plot for samples of “ Vinagre de Montilla-Moriles ” PDO showed also a good separation of categories. However, some overlapping appeared in the PCA model of “ Vinagre de Jerez ” PDO ( Fig. 4 A). Thus, in spite of the “ Crianza ” and “ Reserva ” samples were placed separately mainly by means of PC3, this was not perfectly clear for some samples, also having different groupings within each category. These differences could be explained by the fact that the different samples of each category from “ Vinagre de Condado de Huelva ” PDO were from the same wineries, so the differences between them may be only due to the effect of aging. However, in the other two PDO, due to they belonged to different wineries, the aging effect was also affected for differences in the elaboration. Fig. 4. Score and loading plots of the three PCA models developed, one for each PDO, showing the different aging categories within each PDO. The acronyms for the different vinegar categories are de fi ned in Table 1 . R. Ríos-Reina et al. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 191 (2019) 42 – 53 48 244 According to the loading plots (right side of Fig. 4 ), some similarities and differences between the three models could be observed. Thus, the spectral region around 300 nm and the visible range from 500 to 600 nm seemed to be, in general, responsible of the “ Reserva ” samples, whereas the least aged categories (Crianza and Solera) for each PDO were more related to absorption regions around 290 nm and between 350 and 500 nm. However, some differences could be also noticed for these cat- egories within each PDO. In “ Vinagre de Jerez ” PCA model, the JRE category was explained by the above mentioned regions, but showed the maximum absorption around 330 nm with a shoulder around 360 nm (with the most negative values of PC3), while the JCR samples were mainly explained by a peak at 310 nm and the region between 400 and 500 nm. Regarding the PCA model of “ Vinagre de Condado de Huelva ” PDO, the loadings showed a maximum peak in the positive loadings of PC2 at 330 nm that explained the CRE samples, while the CSO samples were explained by the region between 350 and 450 nm while the “ Non- aged ” PDO category (CSC) by a high positive PC1 loadings around 290 nm. Finally, the loadings plot obtained for the model of “ Vinagre de Montilla-Moriles ” PDO showed that the spectral region more related to MRE samples -corresponding to those with negative values of PC2- was placed in the region closer to 300 nm, while for MCR samples the related regions were around 290 nm and between 350 and 450 nm. According to the literature, the group of polyphenols is one of the groups of compounds related to the aging, i.e. to the “ Rerserva ” category, which can be seen by UV – vis in the above mentioned spectral ranges. The phenolic composition has proved to be useful to determine the method by which vinegar is produced (submerged or surface aceti fi cation), as well as for determining the different aging periods [ 48 ]. Thus, for example, within this group of compounds, authors as García-Parrilla et al. (1999) and Tesfaye et al. (2002) showed that gallic acid, vainilli c acid or hydroxymethylfuraldehyde were presented in higher concentrations in very aged vinegars than in less aged vinegars of the PDO “ Vinagre de Jerez ” [49 – 50]. Other absorbent species that have shown to be present in aged wines and vinegars and are able to be represented in the UV – vis spectra are phenolic, benzoic , and hydroxycinnamic acids and stilbenes, fl avanols, and anthocyanins [ 20 ]. Moreover, the relevance of the visible region of the spectrum (500 – 600 nm) in the “ Reserva ” samples could be explained by the change of colour that occurs during aging, because storaging in wood barrels produces changes in the darkening of colour in comparison to the less aged vinegars [ 49 ]. 3.2. Hierarchical classi fi cation by SIMCA and PLS-DA analysis A hierarchical classi fi cation model was developed ( Fig. 5 ) by using soft independent modelling by class analogy (SIMCA) and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) in the different nodes. The clas- si fi cation results of the different models (assessed by sensitivity, speci- fi city and percenta ge of correct classi fi cation of the different models) are shown in Table 2 . The fi rst classi fi cation level (named as root) consisted on classifying the training samples into two general classes, “ Aged ” and “ Non-Aged ” .A SIMCA model (numbered as SIMCA 1 in Fig. 5 and Table 2 ) was carried Fig. 5. Flowchart of the hierarchical classi fi cation model developed. The acronyms for the different vinegar categories are de fi ned in Table 1 . Table 2 Classi fi cation results of the SIMCA and PLS-DA models used for the construction of the hierarchical classi fi cation model express ed by the percentage of sensitivity, speci fi city and correct classi fi cation. Model SIMCA 1 PLS-DA 1 PLS-DA 2 SIMCA 2 SIMCA 3 SIMCA 4 P C s o r L V s 5 4 5 3 32442 3 Class AGED NON- AGED C J M CSC RV CSO CRE JCR JRE MCR MRE Sensitivity CAL 91.3 100 96.0 92.0 91.3 100 100 85.7 100 100 93.3 100 100 Speci fi city CAL 100 91.3 77.2 95.8 94.0 100 100 100 85.7 93.3 100 100 100 % correct classi fi cation CAL 90.4 97.0 80. 0 92.0 87.0 100 100 83.3 100 100 92.9 100 100 % correct classi fi cation PRED 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 R. Ríos-Reina et al. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 191 (2019) 42 – 53 49 245 out for that purpose by using a PCA model with fi ve PCs for “ Aged ” samples and PCA model of four PCs for the “ Non-aged ” group. All the “ Aged ” samples were correctly classi fi ed, although three of them (i.e. MCR samples) were assigned to both classes. Moreove r, only one of the replicates of a “ Non-aged ” sample was unassigned to any class. The next level of classi fi cation was performed by PLS-DA in order to classify samples of the previous two groups into wine vinegars with and without a PDO. Regarding the “ Aged ” group, a PLS-DA model (numbered as PLS-DA 1 in Fig. 5 and Table 2 ) was built in order to classify PDO Aged samples according to the three Spanish PDOs ( “ Vinagre de Jerez ” , “ Vinagre de Montilla-Moriles ” and “ Vinagre de Condado de Huelva ” ), together with another group in which “ Aged ” samples without a PDO were classi fi ed. AS it was explained before, this last class was formed by a few “ rapid vinegars ” made in Argentina, without a PDO, but aged for a short period of time. The best classi fi cation results were achieved by a fi ve latent variables (LVs) PLS-DA model accounting a 99.71% of explained variance. The 80%, 92% and 87% of samples were correctly classi fi ed as “ Vinagre de Condado de Huelva ” , “ Vinagre de Jerez ” and “ Vinagre de Montilla-Moriles ” PDOs, respectively, in calibration and cross-validation. Within the “ Non-aged ” group, another PLS-DA model (numbered as PLS-DA2 in Fig. 5 and Table 2 ) was carried out by using three latent variables (LVs) and the 100% of the samples were correctly classi fi ed as PDO and Non-PDO in calibration and cross-validation. Samples classi fi ed as “ Non-aged ” and PDO wine vinegars were those wine vinegars belonging to the category CSC of “ Vinagre de Condado de Huelva ” PDO, due to these samples were not aged in barrels but they were made by the procedure described in the regulations of this PDO. Among each PDO, the corresponding aged categories were classi fi ed by SIMCA in the last level of the hierarchical model (numbered as SIMCA 2, 3 and 4 in Fig. 5 and Table 2 ). Thus, for “ Vinagre de Condado de Huelva ” PDO, 3-PCs and 2-PCs PCA models were developed for CSO and CRE categories, respectively. All the samples were correctly classi fi ed except one CSO sample that was categorized as multiple class. Regarding “ Vinagre de Jerez ” SIMCA model, 4-PCs PCA models were developed for each category and all the samples were correct classi fi ed except one replicate of a JRE sample that was classi fi ed in both categories. Finally, for “ Vinagre de Montilla-Moriles ” PDO, SIMCA model was built by a 2- PCs PCA model for MCR category and a 3-PCs PCA model for the aged category MRE. A 100% of correct classi fi cation was achieved for this PDO. Once the hierarchical model was made, the test-set with the samples of unknown class or category was used for validation of the model. The percentage of correct classi fi cation obtained showed that all the test samples were classi fi ed according to their labeled class or category ( Table 2 ), which means that the hierarchical model provided a 100% of correct classi fi cation. Moreover, the probability (%) that each sample belongs to one category or class ( Table 3 ) also revealed the good classi- fi cation ability of the hierarchical model. 3.3. Validation of the hierarchical model by bootstrapping One of the problems of a hierarchical model is that the number of samples in the last nodes or steps are reduced as a direct consequence of focusing only on a subset of outcomes. Moreover, the aforementioned classi fi cation results by means of the fi gures of merit of the models (i.e. sensitivity, speci fi city … ) give an overall vision of the behavior of the model, but do not give information about individual samples (i.e. the error for each sample is not computed). For these reasons, in addition to the cross-validation procedure carried out in each model, the bootstrap re-sampling method was performed for the last step of the hierarchical tree where the amount of sample was reduced, that is, in the SIMCA classi fi cation within each PDO according to the aged category (SIMCA 2, 3 and 4 in Fig. 5 ). Fig. 6 shows the bootstrap based on 95% BCa CLs of score values for the different PCA models, developed for each PDO category within each SIMCA model: “ Vinagre de Condado de Huelva ” PDO ( Fig. 6 A-B), “ Vinagre de Jerez ” PDO ( Fig. 6 C-D) and “ Vinagre de Montilla-Moriles ” PDO ( Fig. 6 E-F). Each score plot ( Fig. 6 A, C and E) shows the bootstrap based 95% score values of one category and the predicted scores of the other one from which it wanted to be separated calculated by using the loadings values obtained for the fi rst one. The calculated scores for the test samples of each category are also shown. The uncertainty estimation for samples was shown by the error bar in the scores plots of Fig. 6 (A, C and E). Moreover, the lower and upper 95% BCa CLs of each sample by the PCs mainly involved in the separatio n were also shown in the right part of Fig. 6 (B, D and F). It could be seen that the CLs for the fi rst principal component were nearly symmetric and of equal size for all objects of the same category. That means that, theoretically, the samples for this category may have similar spectral characteristics. Moreover, as it could be seen in each PCA score plot, all the samples were clearly separated by categories, even taking into account the con fi dence limits, which could con fi rm the reli- ability of the SIMCA model to classify between categories within a PDO. In addition, the prediction of the test samples for each model showed the correctly separation by categories of the different samples. These results show the reliability of the model to discriminate between categories within each PDO in spite of the low amount of samples for each one. 4. Conclusions The present study showed for the fi rst time the application of UV – vis spectroscopy for the authenti fi cation and differentiation of wine vine- gars. In addition, this methodology was combined with the development Table 3 Supplementary material. Mean values of probability expressed as % obtained for the each sample of the test set. MODEL Category %probability JCR JRE MCR MRE CSO CRE CSC RV NOT AGED RV AGED SIMCA1 %probability of being Aged 100 100 100 100 100 100 0.0 0.0 80.0 PDO 100 100 100 100 100 100 0.0 0.0 5.0 NON-PDO 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 85.0 SIMCA1 %probability of being Non-aged 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 99.9 0.0 BEING CSC 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 0.0 0.0 PLS-DA2 BEING RV 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100 8.0 PLS-DA1 %probability of being C 1.3 3.7 40.0 3.5 90.1 47.0 –– – SIMCA2 BEING CSO ––– – 98.0 0.0 –– – BEING CRE ––– – 4.0 100 –– – PLS-DA1 %probability of being J 99.9 99.5 0.02 0.06 0.2 18.0 –– – SIMCA3 BEING JCR 60.4 3.5 –– – – – – – BEING JRE 2.68 58.0 –– – – – – – PLS-DA1 %probability of being M 0.3 0.4 99.5 99.9 7.3 8.1 –– – SIMCA4 BEING MCR –– 100 0.0 –– – – – BEING MRE –– 0.0 100 ––– – – R. Ríos-Reina et al. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 191 (2019) 42 – 53 50 246 of an hierarchical classi fi cation model, by using PLS-DA and SIMCA methods and bootstrapping for the assessment of the uncertainty, with the aim of distinguishing between “ Aged ” and “ Non-aged ” wine vinegars, between PDO and non-PDO or rapid vinegars, between different PDOs and even between different categories of aging within a PDO. Moreover, it is the fi rst time that all the classes are classi fi ed at once with only one analytical technique and by this chemometric methodologies. The results obtained showed that the region of the UV spectra around 300 nm, and the visible region between 500 and 600 nm explained the differentiation of the most aged vinegars ( “ Reserva ” category), within which in turn, each PDO showed a difference in the intensity and a displacement of these UV regions (i.e. JRE around 360 nm and the highest intensity, CRE around 330 nm and MRE closer to 300 nm an the lowest intensity). Moreover, the least aged PDO vinegars ( “ Crianza ” and “ Solera ” categorie s) were better explained by the spectral range around 290 nm and between 350 and 500 nm. Thus, in general, JCR is more explained by the absorbtion bands at 310 and 330 nm aprox., MCR around 290 and 295 nm, and CSO at 290 nm plus the region around 400 nm. Finally, the Non-aged PDO vinegars (CSC) showed the lowest intensity and the principal peak at 290 nm. Even though the information containe d in the UV – Vis spectra is unspeci fi c because compounds related to the aging or to the origin were not speci fi ed, the aim of the study was the differentiation of wine vinegar categories and origin by the simplest and fastest method. So, the prom- ising results obtained by the classi fi cation models, and even by the direct observation of the spectra, avoids the use of quantitative methods that need to know the speci fi c compounds related to aging or origin, which would require trained operators as well as the use of standards and time- consuming analyses. In conclusion , the results demonstrated that the hierarchical classi fi cation model developed in this study with UV – vis spectra in conjunction with SIMCA and PLS-DA open up the possibility of developing a software that provides an easy and fast differentiation for the authentication of wine vinegars. Besides, this procedure present the possibility of in situ and non-destructive analysis using a portable in- strument, which could be used as an alternativ e tool for PDO council regulations to standard control procedures. Acknowledgements We would like to thank to the Regulatory Councils of the PDO wine vinegars for their invaluable help with the acquisition of the sample s for this study. Moreover, authors also thank to the Argentinian wineries for Fig. 6. Bootstrap based 95% BCa CLs for score-values of the different PCA models developed for each PDO category within each SIMCA model, with the uncertainty estimation for each sample plotted by error bars ( A, C and E ). Train samples are represented with ‘ o ’ and Test samples with ‘ * ‘ . Lower and upper 95% BCa CLs of each sample by the PCs involved in the separation ( B, D and F ). The acronyms for the different vinegar categories are de fi ned in Table 1 . R. Ríos-Reina et al. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 191 (2019) 42 – 53 51 247 the samples provided. This work was supported by “ Consejería de Economía, Innovaci  on y Ciencia ” of “ Junta de Andalucía ” [P12-AGR- 1601], and Ministerio de Educaci  on, Cultura y Deporte for the FPU pre- doctoral fellowship [grant number FPU2014/01247]. In addition, we would like to thank the University of Seville for the mobility grant for international staff dedicated to research that allowed Professor Azcarate to stay with our research group [VI Plan Propio De Investigaci  on Y Trasnferencia-US2017]. References [1] Council Regulation (EC), No 510/2006 of 20 March 2006 on the Protection of Geographical Indications and Designations of Origin for Agricultural Products and Foodstuffs, 2006 . 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St udy of C- O isot ope fingerprint for Spanis h wine v ineg a rs from different geographical provenanc es Eur opean F ood Research and T echnology 1 3 vinegar regis tered in Europe [ 8 ] with a “Protected Desig - nation of Or igin” (PDO): “V inagre de Jerez” (also known as “Sher r y wine vinegar”), “V inagre de Montilla-Mor iles” and “V inagre de Condado de Huelv a”. The production of these high-quality PDO wine vinegars in Spain is center ed in Andalusia, a Souther n Spanish region traditionally asso - ciated to wine culture, and eac h of them is produced using the cor responding protected wines (“V ino de Jerez”, “V ino de Montilla-Mor iles” and “V ino de Condado de Huel v a”), which pr o vide singular and specific c haracter istics. These vinegars ha v e high pr ices in the marke t due to their high quality , the long aging time in w ooden butts and the high cost of their production. Their high price increases the vul - nerability of these products to fraud [ 9 ]. For this reason, impar tial tools are req uired to fight agains t mislabeling or e v en f alsification and be tter sys tems must be es tablished to define their quality , authenticity and geographical or igin. In man y cases, an ir refutable conclusion about t he authenticity of a sample using con ventional me thods is not possible and more accurate inf or mation is needed f or obtaining a high guarantee of authentication. With this pur pose, t he analy sis of isotope ratios of some bioelements is being e valuated to pro vide a g eographical profiling of f ood products t hat can be applied in geographical identification [ 1 ]. In this regard, the analy sis of stable isotope r atios of carbon ( 13 C/ 12 C; e xpressed as δ 13 C) and o xy g en ( 18 O/ 16 O; expressed as δ 18 O), among others, has already been introduced as an officiall y accepted method in f ood aut henticity and or igin determina - tion [ 10 ]. Since 1991, the addition of w ater and e x ogenous sugars (from bee t or sugar cane), the most common adul - terations of wine, has been detected in wine b y analyzing the isotopic ratios of h ydrog en (D/H) and carbon ( 13 C/ 12 C) in ethanol and of o xy g en ( 18 O/ 16 O) in water . Inter national Org anization of V ine and W ine (OIV) methods are cur rently adopted: OIV -MA- AS311-05 f or site-specific anal y sis of the D/H ratio using 2 H-site-specific natur al isotope fractionation NMR ( 2 H-SNIF-NMR), OIV -MA- AS312-06 f or anal y sis of the 13 C/ 12 C ratio (e xpressed as δ 13 C ‰) using isotope ratio mass spectrometry (IRMS), OIV -MA- AS2-12 f or anal ysis of the 18 O/ 16 O ratio (e xpressed as δ 18 O‰) using IRMS. V ery recently , isotopic methods ha ve been recognized b y the European Committee f or Standardization (CEN) and in par t by OIV as a means of de tecting the presence of e x og - enous acetic acid and tap w ater in wine vinegar [ 5 , 6 ]. The δ 13 C of the acetic acid can indicate if the source of the acetic acid and the grape sugars i s tr uly grape (wine) e th - anol or wine must, or other e thanol made from f erment ation of some other agr icultural products such as cereal, po tato starch, bee troo t or sugarcane. Concerning photosynthetic pathw a y , some of those plants are C 4 -type (Hatch–Slac k, C4-dicarbo xy lic acid pathw a y), whose δ 13 C v alues com - monl y rang e from − 9 to − 19‰. By contrast, these val - ues usuall y rang e from − 20 to − 35‰ in vine and the rest of C 3 -type plants, in which the atmospheric CO 2 is fix ed through the reductive pentose phosphate pathw ay [ 11 ]. Since 13 C anal ysis b y isotope ratio mass spectrome tr y (IRMS) has sho wn a strong capability t o identify synthetic vinegars and distinguish and detect pho tosynthetic C 3 -type (as grape) and C 4 -type (as sugarcane or maize)-der iv ed products in mix - tures, it could be used as a tool f or t he detection of adul - terated vinegars [ 1 ]. Although the photosynthetic pathw a y defines the carbon isotope ratios of plant in its or ganic matter [ 12 , 13 ], some en vironmental factors or conditions, as w ater stress, can also cause these v alues to increase or decr ease dur ing the g ro wing cy cle, resulting in detectable differ - ences e v en within the same genotype [ 14 ]. Furt her more, it must be noted that the isotopic v alues of acetic acid are not affected when the methods f or transf or ming wine to vinegar are applied [ 6 ]. Reg arding δ 18 O, the v alue f or t his isotope is pr imar il y affected b y the source of plant-a v ailable w ater . Chiocchini e tal. [ 15 ] repor ted t hat lo w er v alues of δ 18 O in e xtra-vir gin oliv e oils w ere related to w ater from regions with high elev ation, inland location and cool climate, whereas higher v alues w ere related to areas with lo w ele v a - tion, coastal location and w armer weather . Similar studies car r ied out in wine also f ound that its isotopic composition is significantl y determined by the climate conditions dur ing the pre-vintage period [ 16 , 17 ]. In gener al ter ms, the 18 O content of the w ater in grape products has sho wn to depend on the en vironment—natural or anthropog enic—from whic h it or iginates. Thus, the isotopic 18 O anal ysis has also sho wn to be able to detect the addition of e xternal water , not com - ing from the grapes. The possible dilutions wit h tap w ater to reduce the acetic degree in the resulting wine vinegar could be detected since this practice leads to significant c hanges in the 18 O isotopic ratio [ 1 ]. Thereb y , Thomas and Jamin [ 18 ] demonstrated the potential of the o xyg en-stable isotope anal ysis of w ater to distinguish wine vineg ar from vinegars made from dried g rapes, where the 18 O isotopic content is influenced b y the t ap w ater used in production. Furt her more, Camin et al. [ 5 ] pro v ed e xper imentally that δ 18 O anal ysis of be v erag e w ater , officially used to de tect the w ater ing of wine and reh ydration of concentrated fr uit juice, can also be applied to vinegar to de tect this kind of fraud. The y estab - lished minimum v alues f or t he δ 18 O of w ater in − 2 and − 5‰ for r a w and diluted vinegars, respectiv el y . δ 18 O values lo w er than − 5‰ in wine vinegar products, theref ore, could indicate an anomalous and e x cessiv e water addition. The f act that w ater source affects δ 18 O v alues mak es the latter eligible to be selected as potential g eographical mark - ers of vinegars. Thus, the legal limits es tablished f or wine, which ar e based on the wine isotope databank , ha ve been used as ref erence f or δ 18 O anal y sis to detect the g eographi - cal or igin authenticity of wine vinegar [ 6 ]. Raco etal. [ 11 ] also confir med the efficacy of δ 18 O analy sis, tog ether with the deter mination of the deuter ium ( 2 H) isotope content, f or 259 Eur opean F ood Research and T echnology 1 3 detecting the g eographical or igin of wine. How e v er, since the 2 H and 18 O isotopic compositions of those products sho w ed a high cor relation in that research, δ 2 H v alue could be considered a dependent v alue from the δ 18 O v alue. Despite the promising results, much w ork is needed since these types of studies are still scarce and had no t pre viousl y been made with Spanish PDO. Theref ore, it w ould be inter - esting to continue with the isotopic c haracter ization of cer ti - fied high-quality wine vineg ars, to de v elop specific applica - tions. The aim of this w ork w as to characterize Spanish wine vinegars from differ ent regions with respect to their oxy g en and carbon isotopic ratio and to assess the applicability of these values to de ter mine their geographical or igin. This ten - tative s tudy also aimed to pro vide a better understanding of the isotopic composition of wine vinegars and its correlation with climatic conditions, w ater content of wine, production process and origin. Materials andmethods W ine vinegar samples 27 samples pro vided by the Regulatory Councils of the three Andalusian PDOs “Vinagre de Condado de Huel va” (11), “V inagre de Jerez” (11) and “Vinagre de Montilla- Mor iles” (5) wer e selected and anal yzed. Fur ther more, eight samples belonging to commercial vineg ars from Norther n Spain—Galicia (2), Catalonia (3) and La Rioja (3)—wit h a guaranteed pro venance w ere included. Furt her inf ormation about grape variety , year of harv est, acetic acid degree and geographical location can be f ound in T able 1 . The number of samples per group is not w ell balanced, being the Nor ther n g roup considerabl y smaller than t he Souther n g roup of samples, although it w as in accordance to the marke t a vailability of vineg ars in Spain. Thus, the rate of production and, theref ore, commercialization of wine vinegars in Spain is higher f or those wit h PDO due to their high quality pr o vided b y their cer tification. Hence, t he total number of wine vinegar samples collected fr om Souther n Spain, registered under a PDO, has been higher than those samples from N or ther n regions due to t he high demand, and theref ore high presence of the f or mer . Moreov er, t o ensure the pro v enance of the samples without a PDO (Nor ther n wine vinegars), onl y wine vinegars produced from wines of high-quality made with the typical v ar ieties of g eographical area w ere selected. This led to reduce the number of nor th - er n samples a vailable but guaranteed its origin and quality . The y ear of har v est of the grape used to setup the vinegars of this set of samples w as t he same (2014) to compare samples of the same vint age and t o a void c hang es in the 18 O ratio due to this f actor . Fur ther more, the time of aging in wooden butts w as also considered in the cr iter ia selection of these samples, due to it is a f actor t hat could ha v e an isotopic fractionation effect. For this reason, all samples of this first set w ere ag ed f or a shor t and similar aging per iod (between 6 and 12months). In addition, to test the possible v ar iation of 18 O ratio betw een y ears of har v est and among different aging times, a second set of Spanish PDO vineg ars w ere anal yzed: 9 “V inagre de Condado de Huelv a” samples (6 from 2015: 3 with more than 12months of aging and 3 with less than 12mont hs; and 3 from 2014 with more than 12mont hs), 11 “V inagre de Jerez” samples (7 from 2015: 4 with more than 12 months of aging and 3 with less t han 12mont hs; and 4 from 2014 with more than 12 mont hs) and 4 “V inagre Montilla-Mor iles” samples (2 from 2015: 1 with more than 12 mont hs of aging and other with less t han 12 months; and 2 from 2014 with more t han 12 mont hs) (T able 2 ).Samples w ere anal yzed in tr iplicates. Isotopic analy sis The 13 C/ 12 C and 18 O/ 16 O results are e xpressed in standard delta notation (δ) as per mil (‰) deviation from the stand - ards VPDB (V ienna-P ee Dee Belemnite, IAEA, V ienna) nor malized b y assigning consensus v alues [ 19 ], and V -SMO W (V ienna-Standard Mean Ocean W ater) nor mal - ized to the V SMOW–SLAP (S tandard Light Antarctic Pre - cipitation) scale, respectiv el y , according to the equation: where i/j E denotes the higher (superscr ipt i ) the low er (super - scr ipt j ) atomic mass number of element E and R is the ratio of the hea vy to light stable isot ope in the sample ( R p ) and the inter national ref erence mater ial ( R ref ) = 18 O/ 16 O or 13 C/ 12 C ratios. δ 13 C determination was perf ormed by combusting the sample at 1020 °C in a Carlo Erba 1108 elemental ana - l yzer coupled in continuous flo w mode to an IRMS (Iso - tope Ratio Mass Spectrome ter) V G Isochrom. The main standards used w ere NBS-22, IAEA CH6 and IAEA 600. The anal ytical precision, based on the repeated anal ysis of inter nal standard w aters, w as 0.1‰. δ 18 O determination w as conducted b y a process of eq ui - libration with a mixture of gases He–CO 2 f or 18 h and fur ther analy sis of CO 2 in a GasBenc h coupled in con - tinuous flo w mode to an Isotope R atio Mass Spectrometer (IRMS) Delta V Adv ant age, Bremen (German y). The main standards used f or cor rection were V -SMO W2 and SLAP2. Measurement precision (on the standards used) w as 0.2‰. All measurements w ere car r ied out against labora - tor y standards that are per iodically calibrated ag ainst 𝛿 ( i ∕ jE ) ‱ = i ∕ j Rp − i ∕ j RRef i ∕ j RRef × 1000 260 Eur opean F ood Research and T echnology 1 3 inter national standards recommended b y the Inter national Atomic Ener gy Agency (IAEA). Statistical analysis The isotopic data w ere anal yzed using Inf ostat sof t - w are (Grupo Inf oStat, Ar gentina). Anal ysis of v ariance (ANO V A) and leas t significant difference (LSD) Fisher test w ere car r ied out on the dat a set to identify differ - ences betw een groups of samples from cert ain geographi - cal Spanish or igin. The Pearson correlation coefficient ( R ) and p v alue w ere used to sho w the linear dependence and their significance betw een the studied v ar iables. Probabil - ity v alues of p < 0.05 were adopted as the criter ion f or significant differences. T able 1 Character istics of the samples according to grape variety , geographical location and isotopic 18 O and 13 C ratios All samples had the same year of harv est (2014) and w ere aged less than 12months PDO/origin No Grape variety Acetic degree Spatial c haracteristics δ 13 C‰ vs. VPDB δ 18 O‰ v s. V SMOW Latitude Longitude Altitude (m) Condado de Huel va 1 Zalema 8.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 −26.2 1.8 2 8.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 −25.2 1.5 3 8.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 −25.0 2.4 4 7.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 −25.2 2.4 5 8.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 −25.2 6.8 6 8.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 −22.3 2.3 7 8.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 −25.1 2.0 8 8.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 −24.5 1.9 9 8.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 − 25.1 2.3 10 8.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 − 24.4 2.8 11 7.0 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 − 24.9 3.1 Jerez 1 Palomino 7.0 36°36 ′ 58 ′′ N 06°09 ′ 08 ′′ W 20 − 24.4 0.3 2 7.0 36°42 ′ 00 ′′ N 06°07 ′ 00 ″ W 56 − 24.4 0.6 3 7.0 36°42 ′ 00 ′′ N 06°07 ′ 00 ′′ W 56 − 25.6 2.4 4 7.0 36°43 ′ 08 ′′ N 06°19 ′ 48 ′′ W 32 − 24.6 1.3 5 7.0 36°36 ′ 58 ′′ N 06°09 ′ 08 ′′ W 20 − 24.8 2.3 6 7.0 36°43 ′ 08 ′′ N 06°19 ′ 48 ′′ W 32 − 25.3 3.2 7 7.0 36°36 ′ 58 ′′ N 06°09 ′ 08 ′′ W 20 − 25.1 0.7 8 7.0 36°42 ′ 00 ′′ N 06°07 ′ 00 ″ W 56 − 25.6 3.5 9 7.0 36°42 ′ 00 ″ N 06°07 ′ 00 ″ W 56 − 25.0 2.8 10 7.0 36°42 ′ 00 ″ N 06°07 ′ 00 ″ W 56 − 26.1 1.3 11 7.0 36°36 ′ 58 ′′ N 06°09 ′ 08 ′′ W 20 − 25.0 2.5 Montilla-Moriles 1 Pedro Ximénez 8.0 37°36 ′ 10 ″ N 04°38 ′ 03 ″ W 207 − 24.2 − 0.5 2 8.0 37°36 ′ 10 ″ N 04°38 ′ 03 ″ W 207 − 26.1 2.4 3 9.7 37°36 ′ 10 ″ N 04°38 ′ 03 ″ W 207 − 25.4 5.8 4 7.0 37°36 ′ 10 ″ N 04°38 ′ 03 ″ W 207 − 24.9 − 0.1 5 6.0 37°29 ′ 53 ′′ N 04°25 ′ 51 ′′ W 547 − 23.3 0.3 Galicia 1 Albariño 6.0 42°07 × 59 ″ N 08°15 × 47 ″ W 187 − 25.3 − 2.2 2 6.0 42°07 × 59 ″ N 08°15 × 47 ″ W 187 − 22.2 − 3.6 Catalonia 1 Chardonna y Blanc 6.0 41°22 ′ 50 ′′ N 01°36 ′ 39 ″ E 257 − 25.6 − 1.4 2 6.5 41°22 ′ 50 ″ N 01°36 ′ 39 ″ E 257 −24.7 1.9 3 6.0 41°22 ′ 50 ″ N 01°36 ′ 39 ″ E 257 −25.5 − 0.8 La Rioja 1 V iura 6.0 42°28 ′ 12 ″ N 02°26 ′ 44 ″ W 465 −23.9 − 5.9 2 6.0 42°28 ′ 12 ″ N 02°26 ′ 44 ″ W 465 −25.3 − 5.2 3 6.0 42°28 ′ 12 ″ N 02°26 ′ 44 ″ W 465 −23.7 − 6.2 261 Eur opean F ood Research and T echnology 1 3 T able 2 Isotopic 18 O and 13 C ratios of a new se t of PDO wine vinegars including different aging time and different y ears of har vest PDO/origin No Grape variety Acetic acid Y ear Spatial characteristics Aging (months) δ 13 C‰ vs. VPDB δ 18 O‰ vs. V SMOW Latitude Longitude Altitude Condado de Huel va 12 Zalema 10 2015 37°22 ′ 01 ′′ N 06°32 ′ 29 ′′ W 192 < 12 − 26.4 2.5 13 7 2015 37°22 ′ 01 ″ N 06°32 ′ 29 ″ W 192 < 12 − 26.2 2.2 14 8 2015 37°22 ′ 01 ″ N 06°32 ′ 29 ″ W 192 < 12 − 25.5 3.7 15 8 2014 37°22 ′ 01 ″ N 06°32 ′ 29 ″ W 192 > 12 − 25.4 5.9 16 8 2014 37°22 ′ 01 ″ N 06°32 ′ 29 ″ W 192 > 12 − 25.2 1.7 17 8 2015 37°22 ′ 01 ″ N 06°32 ′ 29 ″ W 192 > 12 − 24.5 2.3 18 6 2015 37°22 ′ 01 ″ N 06°32 ′ 29 ″ W 192 > 12 − 25.4 4.7 19 8 2015 37°22 ′ 01 ″ N 06°32 ′ 29 ″ W 192 > 12 − 25.2 1.5 20 6 2014 37°22 ′ 01 ″ N 06°32 ′ 29 ″ W 192 > 12 − 24.4 5.9 Jerez 12 Palomino 7 2015 36°36 ′ 58 ″ N 06°09 ′ 08 ″ W 20 < 12 − 24.9 0.6 13 7 2015 36°42 ′ 00 ″ N 06°07 ′ 00 ″ W 56 < 12 − 24.9 2.1 14 7 2015 36°36 ′ 58 ″ N 06°09 ′ 08 ″ W 20 < 12 − 25.1 3.0 15 7 2015 36°40 ′ 43 ″ N 06°09 ′ 13 ″ W 20 < 12 − 24.9 0.7 16 8 2014 36°43 ′ 08 ″ N 06°19 ′ 48 ″ W 32 > 12 − 25.1 3.7 17 7 2015 36°36 ′ 58 ″ N 06°09 ′ 08 ″ W 20 > 12 − 24.9 3.7 18 8.3 2014 36°42 ′ 00 ″ N 06°07 ′ 00 ″ W 56 > 12 − 25.8 3.9 19 7 2014 36°42 ′ 00 ″ N 06°07 ′ 00 ″ W 56 > 12 − 25.7 2.1 20 7 2015 36°42 ′ 00 ″ N 06°07 ′ 00 ″ W 56 > 12 − 24.3 2.2 21 7 2014 36°40 ′ 43 ″ N 06°09 ′ 13 ″ W 20 > 12 − 25.2 2.0 22 9.5 2015 36°40 ′ 43 ″ N 06°09 ′ 13 ″ W 20 > 12 − 24.9 4.6 Montilla- Moriles 6 Pedr o Ximé- nez 8 2015 37°36 ′ 10 ″ N 04°38 ′ 03 ″ W 207 < 12 − 24.7 1.4 7 8 2014 37°36 ′ 10 ″ N 04°38 ′ 03 ″ W 207 > 12 − 25.0 3.7 8 8 2014 37°36 ′ 10 ″ N 04°38 ′ 03 ″ W 207 > 12 − 24.4 1.4 9 8 2015 37°36 ′ 10 ″ N 04°38 ′ 03 ″ W 207 > 12 − 25.7 3.4 262 Eur opean F ood Research and T echnology 1 3 Results anddiscussion δ 13 C andδ 18 O isotopic values indiff eren t Spanish wine vinegars Isotopic 18 O and 13 C ratios vs. eac h cor responding stand - ard obtained in the analy sis of the different wine vinegar samples are sho wn in T ables 1 and 2 . Regarding those results, δ 13 C v alues ranged fr om − 26.4 (cor responding to a sample from “V inag re de Condado de Huelv a” PDO) to −22.2‰ (cor responding to a sample from “Galicia”), whereas δ 18 O ranged fr om − 6.2 (cor responding to a sample from La Rioja) to 6.8‰ (corresponding to a sam - ple from “V inagre de Condado de Huel v a” PDO). With respect to 13 C isotope, se veral researc hes hav e demon - strated the association betw een δ 13 C v alues, and wine and wine vinegar adulterations due to the relationship of these v alues with the photosynthetic pathw a y . According to that, Raco etal. [ 11 ] claimed that the δ 13 C (vs. VPDB) v alues from wine ethanol, that has been f ound to be not different from that of acetic acid after e xtraction from vineg ars, should rang e from − 20 to − 35‰. By contrast, some o ther authors [ 1 , 6 , 20 ] es tablished t hat v alues betw een − 24 and − 20‰ in temperate European regions ha v e sho wn to be related to vineg ars with acetic acid coming from C 4 plants or from grapes e xposed to se v ere w ater stress. In regards t o the results obt ained in this study (T ables 1 , 2 ) , w e f ound that all our samples presented v alues less than − 20‰ and t hat the vas t majority of them were belo w the threshold of − 24‰. With respect to the determination of stable oxy gen iso - tope ratio, Camin etal. [ 5 ] established t he minimum value of the δ 18 O f or ra w vinegars (− 2‰) and diluted vinegars (− 5‰), which w as also confirmed by W er ner and R oβmann [ 1 ]. According t o that, our results sho w ed that most of the vinegar samples w ere in ag reement with t hose authors ’ find - ings, with only tw o samples belo w − 2‰ and three belo w − 5‰ (T ables 1 , 2 ). Besides, almost all of the samples belonging to the three Andalusian PDOs presented positive v alues of δ 18 O. As a visual summar y of the af orementioned results, Fig. 1 depicts the isotopic δ 13 C and δ 18 O v alues of all the samples considered in the present study , toge ther wit h the af orementioned t hresholds, separating samples according t o their isotopic 13 C and 18 O content. As sho wn in t he Fig. 1 , the vinegars from the three Andalusian PDOs are placed toge ther in the same area of t he graph, regardless of the y ear of har v est and the aging time. In gener al ter ms, it can be obser v ed that vinegar samples from “V inag re de Jerez” PDO had the most homogeneous iso topic v alues (SD v alues of ± 0.54 and ± 1.11 f or δ 13 C and δ 18 O, respectiv ely), f ollo w ed b y “V inagre de Condado de Huel v a” (± 0.95 and ± 1.45), possibl y due to the f act that these PDOs are highly consoli - dated. Samples from “V inag re de Montilla-Mor iles” PDO, ho w e v er , presented a higher dispersion (± 1.07 and ± 2.62) within their isotopic values (T able 3 ). This recent PDO w as registered in 2015 and that f act, together with the difficulty Fig . 1 δ 13 C values and δ 18 O values fr om different Spanish wine vinegars. Condado de Huel v a ‘C’ , Vinagre de Jerez ‘J’ and Montilla Moriles‘M’ vinegars from 2015 and more than 12months of aging, respectivel y (T able 2 ) 263 Eur opean F ood Research and T echnology 1 3 in obtaining a higher number of samples in the present study , could e xplain the obt ained results [ 21 , 22 ]. Wine vinegars with a PDO indication are exposed t o an e xhaustiv e routine chec ked b y the Regulatory Councils that larg el y pre v ent the occur rence of possible production frauds and er rors. This is a quality guarantee confirmed b y our results. Isotopic differ entia tion ofgeographical origin T o deter mine whether the δ 13 C and δ 18 O change accor ding to the geographical or igin, tw o sets of ANO V A s and L SD Fisher tests w ere per formed f or eac h isotope. One se t con - sisted on six different regions of Spain where wine vineg ars are produced (Condado de Huel v a, Jerez, Montilla-Mor iles, Galicia, La Rioja and Catalonia) and t he second set included those Spanish regions g rouped in tw o classes according to latitude: Nort her n and Souther n Spain. ANO V A results are sho wn in T able 3 . With regard to δ 13 C, significant dif - f erences ( p < 0.05) according to g eographical origin and latitudes North and Sout h w ere obser v ed. The significant differences betw een Nor th and Sout h (− 24.51 ± 1.19‰ f or Nor ther n vinegars and − 24.92 ± 0.81‰ f or Souther n vinegars) w ere no t v ery evident. Moreo v er, this parameter is more related to adulteration de tection and no clear differ - entiation of the PDO zone is achie v ed. The lev el of discrimi - nation w as higher within δ 18 O v alues. In f act, mean v alues of δ 18 O obtained f or the Nor th (−2.93 ± 2.82‰) and South locations (2.16 ± 1.59‰) sho w ed greater significant differ - ences than δ 13 C mean values. Further more, with respect to δ 18 O results, positiv e mean v alues w ere associated to South - er n vinegars (“V inagre de Condado de Huel v a”, “V inagre de Jerez” and “V inagre de Montilla-Mor iles” in t his order) and negativ e δ 18 O values w ere related with Nort her n vinegars (T able 3 ). The significant v ar iability obser v ed within δ 18 O v alues reflected the effect of geographical or igin and its associated meteorological conditions on the isotopic com - position of wine vinegars, se parating the considered sam - ples according to Souther n and Nor ther n regions. Hence, the isotopic results obtained in this study were in agreement with other researches that demonstrated the utility of iso - topic anal y sis in the deter mination of geographical origin of butter [ 23 ], the discr imination of milks produced at dif - f erent altitudes [ 24 ] and t he influence of climatic conditions and grape variety , highly related to g eog raphical or igin, in vinegars and wines [ 6 , 11 ]. With respect to samples fr om PDOs, the δ 18 O mean v alue f or “Vinagre de Condado de Huel v a” samples were the highest (2.67 ± 1.45‰), while these values w ere sig - nificantl y lo w er f or “Vinagre de Montilla-Mor iles” wine vinegars (1.60 ± 2.62‰). The values of “V inag re de Jerez” samples w ere betw een t hese tw o e xtremes (1.91 ± 1.11‰). These inter mediate v alues ma y be associated to the g eo - graphical or igin of these samples, since t he production area of “V inagre de Jerez” PDO wine vinegars is located betw een “V inagre de Condado de Huel v a” and “V inagre de Montilla-Mor iles” PDOs (all of them in Souther n Spain), being the land type and the latitude and longitude coordi - nates v er y similar (T able 1 ). These c haracter istics make their differentiation with only δ 18 O isotopic anal ysis difficult to accomplish. On the other hand, ANO V A w as also per f or med to deter - mine whether the δ 13 C and δ 18 O chang e according to time of aging in w ood bar rels and the year of harv est. R egard - ing the aging time f actor , an y significant differences w ere not observed f or δ 13 C isotopes. Ho we v er , wit h regards to δ 18 O isotope, it w as possible to obser ve f or each PDO that samples aged more than 12mont hs had higher v alues, incrementing around 1.5 times with respect to less ag ed samples (T able 2 ). In spite of this, t he δ 18 O mean v alue f or “V inagre de Condado de Huelv a” samples aged f or more than 12 months was the highes t (3.69 ± 2.08‰) as it w as obser v ed bef ore, “Vinagre de Jerez” ag ed samples had also inter mediate v alues (3.18 ± 1.06‰) and the δ 18 O mean val - ues f or “Vinagre de Montilla-Mor iles” more aged vineg ars w ere again signi ficantl y lo w er (2.82 ± 1.27‰). Fur ther more, these values w ere ev en more significantl y different from those of Nor ther n vinegars due to δ 18 O mean v alues f or this group w as neg ativ e (− 2.93 ± 2.82‰). Regarding the y ear of har v est, and taking into account onl y samples f or the same categor y (< 12mont hs) to a void the v ariance show ed with the aging f actor , δ 13 C and δ 18 O mean v alues did no t sho w significant differences betw een the 2 years of harv est con - sidered f or t he three PDOs, mainly due to the comple x pro - duction process of these vinegars, that had man y processes betw een the har v est of the grapes and the final product, including, among them, their aging in wood barrels. Thus, T able 3 Mean values ± standard deviation (SD) and ANO V A results of isotopic 13 C and 18 O ratios (‰) according to g eographical origin Letters mean significant differences ( p < 0.05) according to LSD test Isotopic ratios Geog raphical pro v - enance Mean v alue ± SD (‰) δ 13 C (‰) vs. VPDB Galicia − 23.74 ± 2.23 a La Rioja − 24.30 ± 0.86 a,b Montilla-Moriles − 24.79 ± 1.07 b,c Condado de Huel va −24.82 ± 0.95 b,c Jerez − 25.08 ± 0.54 c Catalonia − 25.24 ± 0.50 c δ 18 O (‰) vs. V SMOW Condado de Huel va 2.67 ± 1.45 a Jerez 1.91 ± 1.11 a,b Montilla-Moriles 1.60 ± 2.62 b Catalonia − 0.12 ± 1.75 c Galicia − 2.89 ± 0.99 d La Rioja − 5.77 ± 0.53 e 264 Eur opean F ood Research and T echnology 1 3 δ 13 C mean v alues in 2014 and 2015 f or t his isotope w ere around − 25.0 ± 0.16‰ and − 25.20 ± 0.70‰, respectiv el y , as w ell as mean v alues in 2014 and 2015 f or δ 18 O ratio wer e around 2.00 ± 0.5, 1.94 ± 0.70‰, respectivel y . Hence, these results sho w ed that ev en with different years of harves t or aging per iods, the 13 C and 18 O ratios wer e mainl y dependent of the geographical or igin. Finall y , a study of cor relations betw een the isotopic ratios and some vinegar parame ters described in T able 1 w as car - r ied out. The Pearson ’ s cor relation coefficients, sho wn in T able 4 , sho w ed that there is a highly significant ( p < 0.001) cor relation of the isotopic 18 O ratio with geographical loca - tion e xpressed as altitude (samples from regions with dif - f erent elev ation abo v e sea lev el), longitude (samples fr om Eastern and W estern regions) and latitude (samples from Souther n and Nor ther n regions). From these t hree geo - graphical variables, the higher cor relation w as observed in latitude (− 0.77). This result w as in ag reement with t he con - clusions of Renou e t al. [ 24 ] on their researc h about milk and with those from Chiocchini et al. [ 15 ] f or extra-vir gin olive oils, who claimed that low er values of δ 18 O w ere related to w aters from regions with high ele v ation, inland location and cool climate. Consequentl y , and according to the obt ained results, the δ 18 O deter mination show ed to be more useful f or the discr imination of wine vinegar according to its origin than the δ 13 C, since 18 O ratio was correlated wit h the three geographical coordinates or parame ters, whereas δ 13 C w as onl y cor related with t he latitude ( p < 0.01) and wit h a lo w er cor relation coefficient (0.27 f or δ 13 C vs. −0.77 f or δ 18 O). This Pearson ’ s cor relation anal y sis w as in agreement with the results obtained in t he pre vious ANO V As (T able 2 ) and reinf orced t he conclusions of the present study . C onclusions The results of the present study indicated that δ 18 O anal y sis can be used as a v alid tool to distinguish among some Span - ish wine vinegars fr om different latitude, Nort h and South (negativ e and positive δ 18 O v alues respectiv el y), and e v en among regions with similar latitude. “V inagre de Condado de Huel v a” PDO wine vinegars sho wed the highest δ 18 O v alues, f ollow ed b y “V inagre de Jerez” and “V inagre de Montilla-Mor iles” PDO samples. In f act, the results sho w ed that mean values of δ 18 O be tw een 2.67 and 1.60‰ could be established f or Sout her n Spanish PDO wine vinegars. This rang e could be used as a fingerpr int of t hese high- quality wine vineg ars. Fur ther more, t he δ 18 O isotopic v al - ues sho w ed a significant cor relation with different altitude, latitude and longitude. The carbon stable isotope anal ysis re v ealed that most of the Spanish vinegars presented δ 13 C v alues that were in agreement wit h some other isotopic studies about Eur opean wine vinegars. According t o the results, although t he time of aging in w ood bar rels seems to increase the δ 18 O isotope of PDO vinegars, the same the isotopic relationship and differences w as maintained among the different vinegars. Theref ore, w e could conclude that t he 13 C and 18 O ratios w ere mainl y dependent of the geographical or igin, e v en with different y ears of harvest or aging per iods. In conclusion, the results of this study allo wed confirming that stable isotope 18 O and 13 C anal ysis, especiall y t he first one, could be considered as a useful anal ytical method f or regulator y author ities to identify or assess the geographi - cal or igin of Spanish wine vinegars and v er ify t he cor rect labeling of geographical denomination. Furt her studies with higher number of samples, and some controlled samples w ould contribute to define better ranges and limits of iso tope ratios f or each area. Acknowledgemen ts This work w as suppor ted by the “Consejería de Economía, Inno vación y Ciencia, Junta de Andalucía” under the project P12- AGR -1601. W e t hank the Regulatory Councils of each Protected Designation of Origin—“Vinagre de Jerez” (“Sherr y wine vinegar”), “V inagre de Montilla-Moriles” and “Vinagre de Condado de Huel va”—f or supplying the wine vinegar sam ples. W e also ackno w l - edge the Mass Spectrome tr y Ser vices (Stable Isotopes Laboratory) of the Autonomic U niv ersity of Madrid for the isot opic analy ses and the mass spectrometry instr uments (Dr . Ramón Redondo and Dr . V anessa Peir o). C ompliance with ethical standards Conflict of interest The authors report no conflicts of interest. Complianc e with ethics requiremen ts No humans nor animals w ere- in v ol v ed in the study . Refer ences 1. 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CAPÍTULO VI: CARA CTERIZACIÓN DEL PERF IL VOLÁTIL DE LOS VINAGRES DE VINO ES PAÑOLES C ON D OP 268 CAPÍTULO VI: Caracteriz ación del perfil volátil de los vinagres de vino españoles co n DOP CHA PTER VI. Characteriz a tion of the volatile p rofile of Span ish PDO w ine vineg ars 275 BLOQUE III. CAPÍTULO VI: CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL VOLÁTIL DE LOS VINAGRES DE VINO ESPA ÑOLES C ON DO P Contents lists available at ScienceDirect Food Research International journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodre s Sampling methods for the study of volatile pro fi le of PDO wine vinegars. A comparison using multivariate data analysis Rocío Ríos-Reina a , M. Lourdes Morales a , Diego L. García-González b , José M. Amigo c , d , Raquel M. Callejón a , ⁎ a Dpto. de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, C/P. García González n°2, E-41012 Sevilla, Spain b Instituto de la Grasa (CSIC), Campus University Pab4lo de Olavide - Building 46, Ctra. de Utrera, km. 1 E – , 41013 Sevilla, Spain c Chemometric Analytical Technologies, Department of Food Sciences, Faculty of Science, University of Copenhagen, Rolighedsvej 30, Frederiksberg CDK-1958, Denmark d Department of Fundamental Chemistry, Federal University of Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, 1235 – Cidade Universitária, Recife, Brazil ARTICLE INFO Keywords: Wine vinegars Headspace solid phase microextraction Headspace stir bar sorptive extraction Dynamic headspace extraction Gas chromatography – mass spectrometry Multivariate curve resolution ABSTRACT High-quality wine vinegars have been registered in Spain under protected designation of origin (PDO): “ Vinagre de Jerez ” , “ Vinagre de Condado de Huelva ” and “ Vinagre de Montilla - Moriles ” . The raw material, production and aging processes determine their quality and their aromatic composition. Vinegar volatile pro fi le is usually analyzed by gas chromatography – mass spectrometry (GC – MS), being necessary a previous extraction step. Thus, three di ff erent sampling methods (Headspace solid phase microextraction “ HS-SPME ” , Headspace stir bar sorptive extraction “ HSSE ” and Dynamic headspace extraction “ DHS ” ) were studied for the analysis of the vo- latile composition of Spanish PDO wine vinegars. Multivariate curve resolution (MCR) was used to solve chromatographic problems, improving the results obtained. Principal component analysis (PCA) showed that not all the sampling methods were equally suitable for the characterization and di ff erentiation between PDOs and categories, being HSSE the technique that made able the best vinegar characterization. 1. Introduction Wine vinegar is the most commonly used vinegar in Mediterranean countries and Central Europe ( Solieri & Giudici, 2009 ). It is a product obtained by a double fermentation process (alcoholic and acetous fer- mentation or aceti fi cation). Nowadays, it has become a highly de- manded food product, much appreciated in gastronomy, used as a condiment and food preservative ( Natera, Castro, De Valme García- Moreno, Hernández, & García-Barroso, 2003 ). Some wine vinegars are linked to geographical indications and produced within traditional specialties and the European Union has protected them with a legisla- tive system known as “ Protected designation of origin ” (PDO). This PDO status provides an additional protection of the product against falsi fi cations and it guarantees some speci fi cations related to their chemical and sensory features ( Chinnici et al., 2009 ). In recent years, three high-quality Spanish wine vinegars have been registered under a PDO: “ Vinagre de Jerez ” (also known as “ Sherry wine vinegar ” ), “ Vinagre de Condado de Huelva ” and “ Vinagre de Montilla - Moriles ” ( Council Regulation ( EC ) No 510 / 2006 of 20 March 2006 ). Furthermore, within each PDO, there are di ff erent categories according to their aging time and type (static or dynamic) in wood barrels. The fi nal quality and sensory properties of each wine vinegar are determined by the raw material used, the production process and the aging in wood barrels, with di ff erent systems and di ff erent aging per- iods ( Callejón, Morales, Silva Ferreira, & Troncoso, 2008; Chinnici et al., 2009 ). All these variables in fl uence the volatile composition of vinegar and this unique pro fi le represents a fi ngerprint of each one. For this reason, aroma is considered one of the most important indicators of vinegar quality. Wine vinegar aroma contains a large variety of volatile compounds, with a wide range of polarities, solubility, volatilities and concentrations, making it a complex matrix di ffi cult to qualify and quantify ( Blanch, Tabera, Sanz, Herraiz, & Reglero, 1992 ). Gas chro- matography-mass spectrometry (GC – MS) is the most widely employed technique for analyzing the volatile composition, but it is necessary an extraction step prior to GC – MS analysis ( Hantao et al., 2012; Marín, Zalacain, De Miguel, Alonso, & Salinas, 2005 ). In spite of the fact that di ff erent sampling techniques have been applied to extract and concentrate the volatile compounds from wine vinegars, this procedure is still a problem not well resolved due to the wide variety of matrices and the di ff erences in the sampling techniques ( Castro Mejías, Natera Marín, De Valme García Moreno, & García Barroso, 2002; Guerrero, Marín, Mejías, & Barroso, 2006 ). Moreover, https://doi.org/10.1016/j.foodres.2017.12.001 Received 4 October 2017; Received in revised form 29 November 2017; Accepted 1 December 2017 ⁎ Corresponding author. E-mail addresses: [email protected] (R. Ríos-Reina), [email protected] (R.M. Callejón). Food Research International 105 (2018) 880–896 Available online 05 December 2017 0963-9969/ © 2017 Elsevier Ltd. All rights reserved. T 276 classical sampling methods, such as solid-phase extraction (SPE) or li- quid/liquid extraction, have low reproducibility, high time consump- tion, and are expensive. For these reasons, there is an increasing trend in the development of new extraction methods with better detection and quantitation limits, that are easy-to-automate, faster and do not consume solvents ( Guerrero et al., 2006; Marrufo-Curtido et al., 2012; Pizarro, Esteban-Díez, Sáenz-González, & González-Sáiz, 2008 ). In general, there are two modes of sampling: direct from the liquid phase or an alternative by the extraction of volatile compounds from the vapor phase above the sample, known as headspace sampling ( Morales, Aparicio-Ruiz, & Aparicio, 2013 ). This mode of sampling has several advantages such as reducing the risk of contamination, the increase of the stir bar and fi ber lifetime and a high solute concentration ( Bicchi, Iori, Rubiolo, & Sandra, 2002; Weldegergis, Tredoux, & Crouch, 2007 ). Moreover, regarding the headspace sampling, it can be done in a static (HS) or dynamic (DHS) mode. Headspace solid phase microextraction (HS-SPME) and Headspace Sorptive extraction (HSSE) techniques have been successfully applied in the analysis of solids and liquids ( Bicchi et al., 2002; Callejón, González, Troncoso, & Morales, 2008; Weldegergis et al., 2007 ), whereas DHS method has been less used in vinegar samples ( Manzini et al., 2011 ). Regarding DHS, the main dif- ference with HS is that the sample is purged from the matrix by means of an inert gas and the extracted compounds are trapped and con- centrated into a tube fi lled with a sorbent material. The main ad- vantages of DHS are low detection limits and high sensitivity. One of the most commonly employed techniques for analyzing the volatile pro fi le of wine vinegars is the Solid phase microextraction (HS- SPME), developed by Arthur and Pawliszyn (1990) .I to ff ers important advantages over traditional sampling methods due to its capability of not using extraction solvents, carrying out the extraction and con- centration steps simultaneously in a short time ( Pizarro et al., 2008 ). HS-SPME has been widely applied for studying wine ( Alves, Nascimento, & Nogueira, 2005; Andujar-Ortiz, Moreno-Arribas, Martín- Alvarez, & Pozo-Bayón, 2009 ) and vinegar aroma ( Aceña, Vera, Guasch, Busto, & Mestres, 2011; Pizarro et al., 2008 ). The type of polymer on the fi ber employed, the extraction time and temperature, the salt con- centration and the sample volume are the most important parameters to be considered in HS-SPME methods. However, the lack of sensitivity mainly due to the small amount of polymer is the most important dis- advantage of this technique ( Baltussen, Cramers, & Sandra, 2002 ). Stir bar sorptive extraction (SBSE), a sampling technique developed by Baltussen, Sandra, David, and Cramers (1999) , has basic principles of extraction and its advantages are similar to those of HS-SPME. However, this technique has shown higher sensitivity than HS-SPME due to its higher content of extraction polymer employed ( Alves et al., 2005; Callejón et al., 2009; Guerrero, Marín, Mejías, & Barroso, 2007 ). Moreover, the detection limits are improved due to the direct re- lationship between the amount of analyte extracted and the coating thickness, which is higher in SBSE compared with HS-SPME ( David & Sandra, 2007 ). Successful studies about the application of SBSE in the analysis of the volatile pro fi le in vinegars have been already carried out ( Marrufo-Curtido et al., 2012 ). Regardless these sampling methods have been widely employed in the analysis of the volatile composition of vinegars ( Callejón et al., 2008; Callejón et al., 2008; Casale, Armanino, Casolino, Oliveros, & Forina, 2006; Castro Mejías et al., 2002; Chinnici et al., 2009; Cirlini, Caligiani, Palla, & Palla, 2011; Cocchi, Durante, Marchetti, Armanino, & Casale, 2007; Marrufo-Curtido et al., 2012; Pizarro et al., 2008 ), the experimental sources of variability related to GC – MS (e.g. columns, stationary phase, temperature or experimental conditions and sample preparation) still cause some variations that directly a ff ects the fi nal results ( Amigo et al., 2010 ). Some of these problems are baseline drifts, co-elution or the presence of unexpected overlapped peaks especially in highly complex samples, decreasing the analytical quality of results ( Amigo, Skov, Bro, Coello, & Maspoch, 2008 ). To handle these pro- blems, some internal standards have been traditionally used. However, they have shown, in many cases, a limited capability of solving severe problems ( Oliver-Pozo, Aparicio-Ruiz, Romero, & García-González, 2015 ). The development of chemometric tools has opened a new way for solving such chromatographic problems and for improving the in- terpretation of complex data by means of a quick and accurate analysis ( Amigo, Skov, & Bro, 2010 ). In particular, multivariate curve resolution (MCR) is one of the powerful chemometric technique that has increased its application in the resolution of chromatographic and spectral pro- fi les of a wide variety of complex mixtures improving the fi nal chro- matographic results ( Asadollahi-Baboli & Aghakhani, 2015; Azimi & Fatemi, 2016; Jalali-Heravi, Parastar, & Sereshti, 2008; Zeng, Xu, & Chen, 2009 ). MCR is a conjunction of algorithms, which helps resolving complex data, transforming it into a simple model of pure responses with a single term per component contribution. It is performed in a mathematical environment, such as MATLAB (Mathworks, Natick, MaA, USA), and can be extended to the analysis of many types of ex- perimental data such as GC – MS data, shortening the time of data pro- cessing and improving the results obtained ( Hantao et al., 2012 ). With all this background, the aim of this study was threefold: fi rstly, to assess and compare the applicability in the analysis of the volatile composition of Spanish PDO wine vinegars of three di ff erent advanta- geous sampling techniques (HS-SPME-GC – MS, HSSE-GC – MS and DHS- GC – MS). The second one was to demonstrate that the combination of GC – MS analysis and the application of MCR tool was a powerful methodology to overcome common chromatographic problems, to help the extraction of relevant information and identify new analytes in a complex matrix dataset, and to speed up data processing. The third objective was the selection of the best sampling methodology for the characterization and di ff erentiation of PDO wine vinegars and their commercialized categories. 2. Materials and methods 2.1. Samples Ten wine vinegar samples belonging to the three Spanish PDOs ( “ Vinagre de Jerez ” , “ Vinagre de Condado de Huelva ” and “ Vinagre de Montilla - Moriles ” ) were collected from di ff erent wineries working in compliance with the Regulatory Councils. Furthermore, two categories were considered in each PDO: “ Reserva ” wine vinegars (named JRE, CRE and MRE, respectively) aged from more than two years, and the “ Pedro Ximenez ” category, a sweet category only included in “ Vinagre de Jerez ” and “ Vinagre de Montilla - Moriles ” PDOs (JPX and MPX, re- spectively). Each sample was analyzed in duplicate by the three sam- pling methods applied. 2.2. Chemicals and materials A solution of 4-methyl-2-pentanol (Merck) was employed as internal standard (IS) (6.6 μ L in 1 mL of Ethanol fl ushed with Milli-Q water to a fi nal volume of 10 mL). Sodium chloride and ethanol were of analytical quality and supplied by Merck. Water was obtained from a Milli-Q puri fi cation system (Millipore, USA). The retention index (RI) was calculated via injection of a series of C10 to C40 straight-chain n-al- kanes (50 mg/L in n-hexane) purchased from Fluka (Madrid, Spain). The volatile compound standards used for the identi fi cation of target compounds were purchased from the commercial sources Sigma – Aldrich (Madrid, Spain), Merck (Darmstadt, Germany), and Fluka (Madrid, Spain). Twisters ® (10 mm long stir bar coated with 0.5 mm PDMS layer) and Tenax TA ™ sorbent tubes used for HSSE and DHS methods respectively, were purchased from Gerstel Inc. (Gerstel, Müllheim and der Ruhr, Germany). The fi ber used for HS-SPME method was purchased from Sigma-Aldrich (Bellefonte, PA, USA) and coated with 50/30 μ m of divinylbenzene/Carboxen on PDMS fi ber (DVB/ Carboxen/PDMS). R. Ríos-Reina et al. Food Research International 105 (2018) 880–896 881 277 2.3. Sampling methods Three di ff erent sampling methods coupled with GC – MS were used for determining the volatile pro fi le of the PDO wine vinegars: HSSE, HS- SPME and DHS. The basic conditions of sample extraction were based on previously reported validated methods ( Bicchi et al., 2002; Callejón et al., 2008; Callejón et al., 2008; Natera Mar ı n, Castro Mej ı as, de Valme Garc ı a Moreno, Garc ı a Rowe, & Garc ı a Barroso, 2002; Pizarro Fig. 1. Example of the total ion chromatogram (TIC) of the PDO wine vinegar analyzed by each sampling method (scales are not equal for a better visualization of chromatograms). Two peak cluster were selected and showed as examples in HS-SPME sampling TIC (A) (B). R. Ríos-Reina et al. Food Research International 105 (2018) 880–896 882 278 et al., 2008; Ubeda et al., 2016 ), which were slightly adapted in order to achieve similar conditions between them that facilitates their compar- ison. Thus, the raw validated and published conditions for the analysis of volatile compounds in vinegar (i.e. salt content and internal stan- dard) were in certain cases adapted for using a sample volume of 5 mL in the three extraction methods. The samples were analyzed in dupli- cate and two blank runs were included in the sequence of analysis. 2.3.1. HSSE sampling Optimal sample extraction and desorption conditions for HSSE were used according to the validated method of Callejón et al. (2008) and Callejón et al. (2008) . The desorption step was performed by a Gerstel Thermo Desorption System (TDS2) connected to a cryo-focusing CIS-4 PTV injector (Gerstel). 2.3.2. DHS sampling The extraction of the volatile fraction of the wine vinegars was carried out by using the Gerstel Dynamic Headspace unit and under sampling conditions from Ubeda et al. (2016) . The desorption step was carried out using the same TDS2 and CIS-4 PTV mentioned above. 2.3.3. HS-SPME sampling The HS-SPME method used for the extraction was adapted from previous validated methods ( Cirlini et al., 2011; Natera Mar ı n et al., 2002; Pizarro et al., 2008 ). Samples were incubated at an agitation temperature of 62 °C. The volatile extraction was carried out by ex- posing the fi ber to the sample headspace (22 mm of fi ber depth) during 60 min and agitated at 250 rpm. For desorption of compounds, the fi ber was inserted and keep into the injector for 10 min at 240 °C in splitless mode and then at 220 °C for 2 min with a fl ow rate of 90 mL/min. It was previously conditioned by inserting it into the GC – MS injector at 270 °C for 60 min. 2.3.4. Gas chromatography – mass spectrometry analysis Two GC – MS systems were used since it was not available an equipment with the three extraction or injection systems (DHS, HSSE and SPME): a 6890 Agilent GC system coupled to a simple quadrupole mass spectrometer Agilent 5975inert for carrying out HSSE and DHS Gerstel extraction and a Bruker 450 GC system coupled to a Bruker 320 triple quadrupole mass spectrometer for HS-SPME method. Analysis were performed in the same conditions and to ensure that the results were comparable, fi rstly, a comparison between both equipment by the injection of a mixture of standards was performed. Once this test was done this study was carried out. Moreover, we used an internal standard in order to correct the possible variation in sensibility between detec- tors. Hence, all sampling methods used the same analytical column, a CPWax-57CB column (50 m × 0.25 mm, 0.20- μ m fi lm thickness, Varian, Middelburg, Holland) as well as the same oven program. The carrier gas was He at a fl ow rate of 1 mL/min. The oven temperature program was 35 °C for 5 min, and then raised to 220 °C at 2.5 °C/min (held 5 min). The temperature of transfer line was kept constant at 300 °C. The quadrupole, source and transfer line temperatures were maintained at 150, 230 and 280 °C, respectively. Electron ionization mass spectra in the full-scan mode were recorded at 70 eV electron energy in the range 35 – 350 m / z . All data were recorded using a MS ChemStation version E.02.02.1431 (Agilent technologies Inc.) for HSSE and DHS, and the Star Chromatography Workstation version 6.41 (Varian CA 94598 – 1675/USA) for HS-SPME. 2.4. Chemometric analysis 2.4.1. Multivariate curve resolution (MCR) MCR was applied in this study in order to extract the pure mass spectrum and the chromatographic pro fi le of each compound from the original GC – MS data matrix. MCR is a powerful methodology for multi- set (multi-sample) analysis. The theory of MCR is fully described in details in the literature ( Azimi & Fatemi, 2016; De Juan, Jaumot, & Tauler, 2014; Hantao et al., 2012; Rutan, De Juan, & Tauler, 2009 ). The fi rst step was to export all the GC – MS fi les in three-dimensional CSV format for processing in MATLAB version 2014b (The Mathworks Inc., Natick, MA) where all data treatments were performed. All algorithms of chemometric curve resolution were carried out using the PLS_Toolbox 7.9.5 (Eigenvector Research Inc., Wenatchee, WA) working under MATLAB environment and the library searches and spectral matching of the resolved pure components were conducted on the NIST MS database (NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library, NIST Scienti fi c and Technical Databases, Gaithersburg, MD 20899 – 8380). The details of each developed step is presented as follows: (1) Data processing: The fi nal data form was a three-way array, X (I x J x K), in which the three modes accounted for elution time (I scans), spectral domain ( m / z fragments “ J ” ) and samples (K), respectively. In the present work, the three-way array X was 22,845 × 316 × 20 (10 samples in duplicate). Once the data was structured in the correct way, the total ion chromatogram (TIC) for each sample was overlaid. Then, for increasing the e ffi ciency of MCR in terms of computation time ( Amigo et al., 2010 ), the entire chromatographic dataset was inspected and divided into di ff erent intervals and each part was analyzed by independent MCR models. The intervals were selected accordingly to previous knowledge about the GC – MS analysis of some wine vinegars ( Callejón et al., 2008; Callejón et al., 2008; Callejón, Torija, Mas, Morales, & Troncoso, 2010 ). The nonnegativity constraints were incorporated on the conditionally linear parameters of the chromatographic and spectral pro fi les. (2) Determination of the correct number of chemical factors: There are many methods for chemical data rank determination such as Fig. 2. MCR-resolved elution pro fi les of two peak clusters (A-B) selected from HS-SPME sampling TIC. (A) Peak cluster and MCR-resolved elution pro fi le example of a completely overlapping components. (B) Peak cluster and MCR-resolved elution pro fi le example of segments with a single component peak. R. Ríos-Reina et al. Food Research International 105 (2018) 880–896 883 279 Table 1 Mean relative area of the volatile compounds extracted in the di ff erent wine vinegar samples by each sampling method. CRE JRE MRE Nº Volatile compounds a ID b RI c HSSE DHS HSSPME HSSE DHS HSSPME HSSE ARm d ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD Acetic esters 1 Ethyl acetate A 903 48.2 8.16 25.4 21.1 nd – 42.5 0.61 15.7 7.90 nd – 29.4 21.5 2 n-Propyl acetate A 947 1.47 1.31 1.55 1.76 nd – 0.88 0.67 0.85 0.59 nd – 0.17 0.20 3 sec-Butyl acetate A 959 0.28 0.28 nd – nd – 0.09 0.03 nd – nd – 0.16 0.21 4 Isobutyl acetate a A 983 6.46 4.60 3.66 2.98 0.51 0.15 4.45 2.12 2.48 1.02 0.71 0.54 2.00 0.20 5 2-Methylbutyl acetate a A 1091 8.69 6.46 9.82 8.57 2.37 1.02 5.59 0.60 6.36 1.05 2.19 1.06 3.36 0.25 6 Isoamyl acetate a A 1091 40.1 35.8 73.6 79.6 6.37 4.52 21.2 5.34 33.7 11.6 4.53 3.16 10.3 3.35 7 Hexyl acetate A 1253 0.54 0.72 1.82 2.51 nd – 0.23 0.13 0.34 0.09 nd – 0.09 0.12 8 Butyl acetate B 54,56 1044 nd – 1.81 2.12 nd – nd – 0.60 0.27 nd – nd – 9 3-Ethoxypropyl acetate C 1348 0.07 0.03 1.76 2.00 nd – 0.07 0.03 1.04 0.89 nd – 0.10 0.04 10 2,3-Butanediol diacetate B 54 1477 0.14 0.04 1.05 1.12 nd – 0.17 0.08 1.25 0.91 nd – 0.28 0.14 11 1,3-Propanediol, diacetate a B 54 1654 0.14 0.01 3.81 3.60 0.23 0.02 0.10 0.06 1.18 0.86 0.12 0.05 0.22 0.20 12 2,3-Dihydroxypro-pyl acetate B 54 2282 nd – 0.51 0.43 0.34 0.04 nd – 0.19 0.10 0.02 0.00 nd – 13 Benzyl acetate a A 1720 0.12 0.05 1.22 1.36 0.10 0.02 0.20 0.10 1.25 0.85 0.16 0.07 0.12 0.07 14 2-Phenylethyl acetate a A 1810 5.19 2.55 22.2 25.2 4.78 1.12 6.28 2.67 15.8 9.42 5.73 2.14 5.92 1.77 15 Methyl acetate B 54 874 1.04 0.11 nd – nd – 0.92 0.21 nd – nd – 0.97 0.08 Total of acetic esters 112 60.2 148 152 14.7 6.90 82.7 12.6 80.9 35.6 13.5 7.03 53.1 28.1 Acids 16 Acetic acid a A 1437 9.27 0.00 40.1 9.85 3.26 0.62 10.4 7.89 55.4 37.7 4.24 3.54 14.02 1.25 17 Propanoic acid A 1518 nd – 2.19 1.37 0.37 0.09 nd – 2.65 0.80 0.27 0.10 nd – 18 Isobutyric acid a A 1564 0.32 0.04 3.02 0.94 0.56 0.08 0.39 0.31 5.82 3.01 0.58 0.29 0.35 0.01 19 Butanoic acid a A 1629 0.11 0.03 10.30 7.86 0.53 0.08 0.16 0.19 13.9 12.4 0.52 0.40 0.21 0.20 20 Isovaleric acid a A 1669 2.93 0.59 24.4 16.7 3.95 0.52 3.84 2.03 27.6 6.79 4.87 0.94 4.64 0.70 21 2-methylbutanoic acid A 1539 nd – nd – 0.48 0.04 nd – nd – 0.57 0.26 nd – 22 Pentanoic acid A 1722 nd – 0.21 0.20 0.08 0.01 nd – 0.34 0.17 0.13 0.05 nd – 23 Hexanoic acid a A 1855 0.07 0.01 3.28 3.42 0.73 0.17 0.11 0.08 3.84 1.02 0.71 0.18 0.12 0.01 24 2-Ethylhexanoic acid a B 1 1958 0.02 0.01 0.21 0.23 0.08 0.02 0.07 0.01 0.27 0.21 0.12 0.06 0.03 0.01 25 Octanoic acid a A 2084 0.12 0.03 3.38 3.57 1.87 0.28 0.17 0.12 3.07 1.20 1.99 0.46 0.11 0.03 26 Sorbic Acid B 1,55 2138 nd – 0.03 0.04 0.20 0.09 nd – 0.12 0.17 0.04 0.02 nd – 27 Nonanoic acid A 2163 nd – 0.30 0.32 0.40 0.11 nd – 0.22 0.10 0.46 0.06 nd – 28 Decanoic acid a A 2298 0.19 0.03 10.7 10.2 5.28 1.53 0.15 0.12 7.38 6.03 4.89 0.99 0.18 0.09 29 Dodecanoic acid B 1 2456 nd – 0.17 0.17 0.33 0.12 nd – 0.24 0.31 0.26 0.12 nd – 30 Tetradecanoic acid B 1,2 2 6 0n d – 0.22 0.22 nd – nd – 0.28 0.30 nd – nd – 31 Pentadecanoic acid B 1,2 2670 nd – 0.08 0.09 nd – nd – 0.13 0.13 nd – nd – 32 Hexadecanoic acid B 1,2 2776 nd – 0.30 0.28 nd – nd – 0.51 0.33 nd – nd – Total of acids 13.04 0.75 98.9 2 .6 18.1 3.70 15.3 10.7 121 70.6 19.6 7.5 19.6 2.31 Alcohols 33 Ethanol A 932 5.88 4.62 nd – nd – 5.79 2.42 nd – nd – 1.36 1.24 34 Isoamyl alcohol A 1207 7.90 8.08 21.7 23.6 nd – 4.48 1.99 8.00 3. 1 nd – 2.14 0.66 35 2-Methy-1-butanol a A 1207 4.77 2.98 7.44 6.19 1.83 0.97 3.38 0.96 4.62 1.02 1.42 0. 4 2.06 0.09 36 2-Ethyl-1-hexanol A 1489 0.12 0.05 nd – nd – 0.16 0.01 nd – nd – 0.08 0.04 37 2-Phenylethanol a A 1930 1. 1 0. 5 33.3 37.4 3.77 1.34 1.85 0.63 20.1 9.80 3.39 1.07 1.60 0.34 38 1-Hexanol A 1348 nd – 5.71 7.84 nd – nd – 1.36 0.38 nd – nd – 39 1,3-Propanediol B 1 18 6 nd – 0.09 0.06 nd – nd – 0.13 0.11 nd – nd – 40 2-Furanmethanol A 1669 0.41 0.14 nd – nd – 0.46 0.07 nd – nd – 0.29 0.13 (continued on next page) R. Ríos-Reina et al. Food Research International 105 (2018) 880–896 884 280 Table 1 (continued) CRE JRE MRE Nº Volatile compounds a ID b RI c HSSE DHS HSSPME HSSE DHS HSSPME HSSE ARm d ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD Total of alcohols 20.6 16.4 68.2 75.0 5.61 2.31 16.1 6.06 34.2 14.8 4.81 1.65 7.53 2.50 Aldehydes 41 Benzaldehyde a A 1514 0.87 1.13 21.0 28.8 0.51 0. 5 0.47 0.02 5.81 0.96 0.36 0.08 1.17 1.17 42 Furfural A 1437 1.14 0.79 32.6 39.7 nd – 1.53 0.89 29.6 12.9 nd – 1.00 0.81 43 5-Methylfurfural a A1 3 4 0.08 0.05 1.08 1.33 0.04 0.04 0.11 0.09 1.05 0.62 0.07 0.03 0.06 0.06 44 5-Acetoxymethyl-2- furaldehyde B 1 2191 nd – 0.02 0.02 nd – nd – 0.04 0.03 nd – nd – 45 5- Hydroxymethylfurfural A 2480 nd – 0.06 0.03 0.10 0.03 nd – 0.10 0.00 0.19 0.01 nd – Total of aldehydes 2.09 1.97 1 .78 69.83 0.66 0.65 2.12 1.00 36.6 14.5 0.62 0.12 2.23 2.04 Ethyl esters 46 Ethyl propanoate A 932 1. 3 1.42 1.69 2.02 nd – 0.70 0.43 0. 2 0.32 nd – 0.29 0.38 47 Ethyl isobutyrate A 947 1.89 1.64 0.78 0.75 nd – 1.11 0.64 0.45 0.18 nd – 0.18 0.21 48 Ethyl butyrate a A 999 1.50 1.34 4. 5 5.33 0.14 0.07 0.88 0.90 1.66 1. 3 0.18 0.21 0.32 0.45 49 Ethyl 2-methylbutyrat a A 1014 1.16 0.94 0. 1 0.44 0.09 0.03 0.61 0.22 0.26 0.11 0.10 0.08 0.10 0.11 50 Ethyl isovalerate a A 1036 8.89 6.96 6.21 5.04 1.05 0.47 6.19 0.53 4.75 0.60 1.15 0. 6 0.91 1.10 51 Ethyl pentanoate A 1093 nd – 0.53 0.62 nd – nd – 0.22 0.11 nd – nd – 52 Ethyl hexanoate a A 1207 1. 4 1.84 9.12 12.33 0.34 0.33 0.52 0.15 1.32 0.86 0.16 0.11 0.10 0.11 53 Ethyl 3- ethoxypropanoate B 1,2 1326 nd – 0.80 1.05 nd – nd – 0.24 0.18 nd – nd – 1 Ethyl heptanoate A 1319 0.04 0.05 nd – nd – 0.01 0.01 nd – nd – 0.00 0.00 2 Ethyl octanoate A 1437 1.47 1.91 13.52 18.40 nd – 0.44 0.01 1. 5 0.66 nd – 0.06 0.06 3 Ethyl sorbate B 1 1491 0.21 0.23 2.23 3.07 nd – 0.04 0.01 0.04 0.01 nd – 0.04 0.03 4 Ethyl decanoate A 1629 0.22 0.28 nd – 0.23 0.19 0.07 0.04 nd – 0.12 0.01 0.01 0.01 5 Ethyl benzoate A 16 1 0.13 0.10 nd – 0.09 0.04 0.07 0.03 nd – 0.06 0.03 0.04 0.03 6 Diethyl succinate a A 1669 0.81 0.99 24.3 33.9 0.71 0.85 0.32 0.34 2.42 2.78 0.22 0.22 0.07 0.04 60 Ethyl phenyl acetate a A 1779 1.18 0.84 11.02 13.33 1.02 0.43 1.19 0.79 6.11 4.81 1.02 0. 6 0.20 0.21 61 Ethyl dodecanoate A 1818 0.01 0.00 0.05 0.07 nd – 0.01 0.00 0.01 0.00 nd – 0.01 0.01 62 Diethyl malate B 2 2038 nd – 0.07 0.10 nd – nd – 0.01 0.01 nd – nd – 63 Methyl hexadecanoate B 1 2222 0.05 0.02 nd – nd – 0.09 0.01 nd – nd – 0.07 0.06 64 Ethyl hexadecanoate A 2260 0.02 0.01 nd – nd – 0.01 0.01 nd – nd – 0.01 0.00 65 Ethyl furoate a A 1608 0.10 0.05 1.41 1.63 0.05 0.01 0.08 0.03 0.74 0.40 0.05 0.02 0.03 0.01 66 Ethyl hydrogen succinate B 4 22 1 nd – nd – 0.21 0.20 nd – nd – 0.11 0.08 nd – Total of ethyl esters 20.8 18.6 76.8 98.1 3.92 2.63 12.3 4.15 20.4 12.6 3.17 1.94 2.43 2.83 Ketones 67 2,3-Butanedione C 947 1. 1 1.26 nd – nd – 1.23 0.27 nd – nd – 2. 6 0.76 68 Methyl Isobutyl ketone B 1,2 983 0.20 0.16 nd – nd – 0.37 0.38 nd – nd – 0.04 0.01 69 Acetoin A 1275 0. 5 0.39 5.27 4.80 nd – 0.90 0.41 4.16 2.01 nd – 2.09 1.61 70 1-Hydroxy-2-propanone A 1279 1.50 0.35 nd – nd – 1. 3 0.15 nd – nd – 1. 5 1.04 71 3-Nonanone A 1348 0.06 0.06 nd – nd – 0.02 0.01 nd – nd – 0.01 0.01 72 2-Acetoxy-3-butanone B 1 1370 0.14 0.06 nd – nd – 0.23 0.14 nd – nd – 0. 2 0.30 73 2-Acethylfuran A 1498 0.10 0.04 1.60 1.71 nd – 0.12 0.04 1.70 0.21 nd – 0.09 0.04 74 2(5H)-Furanone B 5 17 4 0.23 0.07 nd – nd – 0.26 0.03 nd – nd – 0.19 0.08 Total of ketones 4.33 2.40 6.87 6.51 0.00 0.00 4.69 1.45 5.86 2.22 0.00 0.00 7.13 3.85 Others 75 Trans-linalool oxide B 6 1460 0.09 0.04 nd – nd – 0.08 0.02 nd – nd – 0.05 0.02 76 TDN a B 2 1732 0.17 0.14 0.35 0.25 0.13 0.01 0.09 0.03 0.12 0.07 0.06 0.01 0.13 0.17 77 2,4,5-Trimethyl-1,3- Dioxolane B 2 932 2.82 2.41 2.38 2.03 nd – 1.04 0.63 0.62 0.33 nd – 0.77 0.51 78 1,4:3,6-Dianhydro- α -d- glucopyranose C 2433 0.06 0.01 0.02 0.02 nd – 0.08 0.04 0.05 0.05 nd – 0.05 0.00 79 Methyl salicylate a A 1765 0.02 0.00 0.11 0.11 0.02 0.00 0.08 0.04 0.41 0.29 0.08 0.05 0.02 0.01 (continued on next page) R. Ríos-Reina et al. Food Research International 105 (2018) 880–896 885 281 Table 1 (continued) CRE JRE MRE Nº Volatile compounds a ID b RI c HSSE DHS HSSPME HSSE DHS HSSPME HSSE ARm d ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD 80 Isopropyl myristate B 1 2041 0.02 0.01 nd – nd – 0.02 0.01 nd – nd – 0.07 0.04 81 4-Ethylguaiacol A 2041 0.03 0.01 0.25 0.27 nd – 0.07 0.01 0.36 0.09 nd – 0.03 0.01 Total of others 3.20 2.61 3.11 2.68 0.15 0.01 1.47 0.77 1. 3 0.82 0.14 0.05 1.12 0.77 MRE JPX MPX Nº Volatile compounds a DHS HSSPME HSSE DHS HSSPME HSSE DHS HSSPME ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD Acetic esters 1 Ethyl acetate 2.95 3.70 nd – 54.7 17.9 20.7 0.90 nd – 39.0 0.72 8.68 2.90 nd – 2 n-Propyl acetate 0.21 0.24 nd – 1.34 0.02 1.17 0.14 nd – 0.13 0.01 0.26 0.24 nd – 3 sec-Butyl acetate nd – nd – 0.07 0.05 nd – nd – 0.03 0.00 nd – nd – 4 Isobutyl acetate a 0.97 0.27 0.22 0.00 6.63 0.96 3.30 0.13 2.36 1.78 1.57 0.02 1.25 0.56 1.03 0.22 5 2-Methylbutyl acetate a 3.32 0.42 1.05 0.09 6.28 0.38 6.66 0.62 6.55 5.10 2.46 0.03 2.91 0.74 4.99 0.08 6 Isoamyl acetate a 14.8 5.99 1.63 0.41 29.9 6.94 41.9 0.12 19.8 18.49 8.44 0.13 13.3 9.05 8.81 4.64 7 Hexyl acetate 0.12 0.15 nd – 0.16 0.03 0.25 0.04 nd – 0.03 0.00 0.04 0.01 nd – 8 Butyl acetate 0.40 0.42 nd – nd – 0.78 0.02 nd – nd – 0.19 0.19 nd – 9 3-Ethoxypropyl acetate 0.96 0.56 nd – 0.09 0.00 1.62 0.08 nd – 0.03 0.00 0.46 0.46 nd – 10 2,3-Butanediol diacetate 1.62 0.94 nd – 0.19 0.04 1.38 0.74 nd – 0.11 0.01 0.46 0.53 nd – 11 1,3-Propanediol, diacetate a 1.79 1.61 0.21 0.15 0.11 0.06 1.49 0.43 0.30 0.21 0.04 0.01 0.56 0.63 0.29 0.12 12 2,3-Dihydroxypro-pyl acetate 0.24 0.06 0.78 0.20 nd – 0.27 0.01 0.12 0.13 nd – 0.08 0.03 0.06 0.01 13 Benzyl acetate a 0.64 0.42 0.12 0.05 0.19 0.11 1.31 0.76 0.37 0.23 0.18 0.02 0.90 1.17 0.96 1.17 14 2-Phenylethyl acetate a 12.6 4.95 5.60 0.57 6.74 2.02 18.3 5.92 16.3 12.7 2.63 0.22 4.98 3.36 14.6 5.51 15 Methyl acetate nd – nd – 1.18 0.16 nd – nd – 0.55 0.00 nd – nd – Total of acetic esters 40.7 19.7 9.60 1.47 107 28.7 99.1 9.91 45.8 38.7 55.2 1.18 34.0 19.9 30.75 11.7 Acids 16 Acetic acid a 25.7 9.38 4.94 4.42 14.1 2.63 26.2 13.2 12.3 7.16 8.90 0.32 20.7 2.79 9.51 6.38 17 Propanoic acid 3.12 2.39 0.32 0.16 nd – 2.28 1.32 0.59 0.35 nd – 1.09 0.81 0.65 0.30 18 Isobutyric acid a 4.32 1.19 0.40 0.02 0.43 0.26 5.56 3.37 1.03 0.34 0.16 0.00 2.08 0.80 0.81 0.13 19 Butanoic acid a 11.5 12.7 0.55 0.42 0.19 0.15 13.2 13.5 1.25 0.63 0.05 0.00 1.91 0.92 1.08 0.04 20 Isovaleric acid a 18.9 5.14 5.01 0.99 4.04 1.75 26.4 8.53 10.1 6.43 2.60 0.01 13.27 4.66 14.6 3.38 21 2-methylbutanoic acid nd – 0.45 0.08 nd – nd – 0.99 0.34 nd – nd – 0.92 0.21 22 Pentanoic acid 0.26 0.22 0.08 0.01 nd – 0.33 0.19 0.31 0.22 nd – 0.09 0.05 0.27 0.03 23 Hexanoic acid a 2.49 0.73 0.64 0.08 0.14 0.04 3.43 1.60 1.92 1.53 0.08 0.00 1.22 0.67 1.97 0.56 24 2-Ethylhexanoic acid a 0.11 0.06 0.06 0.01 0.05 0.04 0.31 0.16 0.25 0.13 0.01 0.00 0.04 0.01 0.15 0.01 25 Octanoic acid a 2.21 1.13 2.26 0.27 0.15 0.14 2.21 0.02 4.03 2.44 0.07 0.00 1.51 0.88 6.49 1.13 26 Sorbic Acid 0.04 0.05 0.09 0.02 nd – 0.00 0.00 0.09 0.04 nd – 0.03 0.04 0.11 0.07 27 Nonanoic acid 0.16 0.07 0.55 0.03 nd – 0.16 0.01 1.39 1.25 nd – 0.12 0.05 2.23 0.22 28 Decanoic acid a 5.75 2.54 5.17 1.12 0.14 0.13 4.00 1.25 8.75 4.47 0.10 0.02 3.91 1.72 13.1 6.81 29 Dodecanoic acid 0.13 0.08 0.32 0.11 nd – 0.03 0.00 0.71 0.51 nd – 0.07 0.06 2.83 2.27 30 Tetradecanoic acid 0.18 0.10 nd – nd – 0.05 0.02 nd – nd – 0.08 0.08 nd – 31 Pentadecanoic acid 0.07 0.04 nd – nd – 0.03 0.02 nd – nd – 0.03 0.03 nd – 32 Hexadecanoic acid 0.22 0.11 nd – nd – 0.20 0.11 nd – nd – 0.12 0.08 nd – Total of acids 75.3 35.9 20.8 7.73 19.2 5.14 84.4 43.3 43.7 25.8 11.9 0.36 46.3 13.6 1 .7 21.5 Alcohols 33 Ethanol nd – nd – 6.81 0.97 nd – nd – 3.28 0.14 nd – nd – (continued on next page) R. Ríos-Reina et al. Food Research International 105 (2018) 880–896 886 282 Table 1 (continued) MRE JPX MPX Nº Volatile compounds a DHS HSSPME HSSE DHS HSSPME HSSE DHS HSSPME ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD 34 Isoamyl alcohol 3.47 1.70 nd – 5.67 0.30 10.6 0.15 nd – 2. 4 0.07 5.00 4.68 nd – 35 2-Methy-1-butanol a 2. 1 0.50 0.74 0.00 3. 2 0.72 4.85 0.70 3.49 2.36 2.14 0.06 3.00 1.68 3.93 1.65 36 2-Ethyl-1-hexanol nd – nd – 0.15 0.04 nd – nd – 0.14 0.00 nd – nd – 37 2-Phenylethanol a 15.0 5.19 3. 3 0.01 1.76 0.75 22.1 6.94 10.2 8.50 1.17 0.20 10.8 8.80 15.0 10.4 38 1-Hexanol 0. 2 0.71 nd – nd – 0.93 0.22 nd – nd – 0.19 0.09 nd – 39 1,3-Propanediol 0.04 0.01 nd – nd – 0.14 0.09 nd – nd – 0.04 0.01 nd – 40 2-Furanmethanol nd – nd – 0.38 0.06 nd – nd – 0.25 0.07 nd – nd – Total of alcohols 21.6 8.11 4.30 0.02 18.3 2.83 38.6 8.10 13.6 10.9 9. 2 0.53 19.0 15.3 18.9 12.0 Aldehydes 41 Benzaldehyde a 10.8 11.2 0.68 0. 2 0.29 0.23 3.71 3.92 0.45 0.06 0.22 0.00 1.61 0.66 0.93 0.01 42 Furfural 16.6 17.4 nd – 0.75 0.21 14.2 8.90 nd – 0.80 0.05 10.4 7.52 nd – 43 5-Methylfurfural a 0.53 0.62 0.03 0.03 0.06 0.01 0. 5 0.05 0.10 0.08 0.10 0.00 0.76 0.27 0.37 0.23 44 5-Acetoxymethyl-2- furaldehyde 0.01 0.01 nd – nd – 0.04 0.03 nd – nd – 0.07 0.02 nd – 45 5- Hydroxymethylfurfural 0.02 0.01 0.06 0.01 nd – 0.14 0.05 0.50 0.42 nd – 0.14 0.06 1.10 0.04 Total of aldehydes 27.9 29.2 0.76 0. 6 1.10 0.45 18.6 12.9 1.05 0. 3 1.13 0.06 12.9 8.53 2.40 0.28 Ethyl esters 46 Ethyl propanoate 0.19 0.26 nd – 0.79 0.29 0. 5 0.28 nd – 0.21 0.01 0.28 0.21 nd – 47 Ethyl isobutyrate 0.10 0.11 nd – 1.28 0.39 0.43 0.21 nd – 0.24 0.00 0.15 0.04 nd – 48 Ethyl butyrate a 0. 6 0.83 0.04 0.06 0.97 0.79 1.67 1. 3 0.30 0.04 0.09 0.00 0.23 0.09 0.07 0.02 49 Ethyl 2-methylbutyrat a 0.04 0.05 0.01 0.01 0.69 0.09 0.30 0.07 0.26 0.15 0.13 0.00 0.07 0.00 0.09 0.04 50 Ethyl isovalerate a 0.65 0.81 0.12 0.13 6.40 0.24 4.62 0.79 2.98 2.00 1.80 0.03 1. 5 0.03 1.65 0.52 51 Ethyl pentanoate 0.08 0.06 nd – nd – 0.27 0.05 nd – nd – 0.07 0.04 nd – 52 Ethyl hexanoate a 0.17 0.20 0.02 0.03 0.72 0.13 1.65 0.39 0.65 0. 6 0.15 0.00 0.23 0.15 0.24 0.03 53 Ethyl 3- ethoxypropanoate 0.13 0.14 nd – nd – 0.27 0.14 nd – nd – 0.06 0.06 nd – 1 Ethyl heptanoate nd – nd – 0.02 0.01 nd – nd – 0.00 0.00 nd – nd – 2 Ethyl octanoate 0.26 0.24 nd – 0.44 0.00 1.65 0. 2 nd – 0.15 0.00 0.43 0.23 nd – 3 Ethyl sorbate 0.06 0.05 nd – 0.04 0.00 0.04 0.00 nd – 0.03 0.00 0.05 0.05 nd – 4 Ethyl decanoate nd – 0.01 0.01 0.04 0.01 nd – 0.17 0.05 0.05 0.00 nd – 0.23 0.02 5 Ethyl benzoate nd – 0.03 0.02 0.09 0.01 nd – 0.21 0.18 0.05 0.00 nd – 0.25 0.17 6 Diethyl succinate a 0.44 0.37 0.06 0.03 0.34 0.31 2.69 2.39 0.52 0.21 0.07 0.01 0.61 0.77 0.40 0.41 60 Ethyl phenyl acetate a 0.98 1.11 0.24 0.23 1.14 0.87 6.17 4.72 2.13 0.99 0.21 0.02 0.83 0. 2 1.44 0.36 61 Ethyl dodecanoate 0.00 0.00 nd – 0.01 0.01 0.01 0.00 nd – 0.03 0.00 0.02 0.02 nd – 62 Diethyl malate 0.00 0.00 nd – nd – 0.01 0.00 nd – nd – 0.00 0.00 nd – 63 Methyl hexadecanoate nd – nd – 0.05 0.03 nd – nd – 0.06 0.03 nd – nd – 64 Ethyl hexadecanoate nd – nd – 0.01 0.01 nd – nd – 0.04 0.00 nd – nd – 65 Ethyl furoate a 0.23 0.12 0.02 0.01 0.09 0.02 0.86 0.23 0.15 0.12 0.04 0.00 0.25 0.28 0.13 0.11 66 Ethyl hydrogen succinate nd – 0.05 0.02 nd – nd – 0.18 0.02 nd – nd – 0.08 0.10 Total of ethyl esters 3.92 4.34 0.61 0. 1 13.1 3.21 21.2 11.4 7. 4 4.35 3.37 0.13 4.86 2.52 4.60 1.78 Ketones 67 2,3-Butanedione nd – nd – 1.40 0.02 nd – nd – 0.86 0.01 nd – nd – 68 Methyl Isobutyl ketone nd – nd – 0.09 0.02 nd – nd – 0.03 0.00 nd – nd – 69 Acetoin 6.61 3.98 nd – 1.06 0.18 5.68 0.14 nd – 0.74 0.01 5.25 5.63 nd – 70 1-Hydroxy-2-propanone nd – nd – 1.94 0.38 nd – nd – 1.42 0.26 nd – nd – 71 3-Nonanone nd – nd – 0.02 0.00 nd – nd – 0.01 0.00 nd – nd – 72 2-Acetoxy-3-butanone nd – nd – 0.29 0.06 nd – nd – 0.20 0.01 nd – nd – 73 2-Acethylfuran 0.78 0. 5 nd – 0.11 0.03 1.70 0.20 nd – 0.12 0.00 1.39 0.62 nd – (continued on next page) R. Ríos-Reina et al. Food Research International 105 (2018) 880–896 887 283 principal component analysis (PCA), orthogonal projection ap- proach (OPA) and SIMPLISIMA ( Azimi & Fatemi, 2016; Jalali- Heravi et al., 2008 ). However, due to the accumulation of noise in complex system analyzed by GC – MS, it is often di ffi cult to achieve a true rank. In the present study, and due to previous knowledge of its correct functionality ( Amigo et al., 2010 ), the correct number of components for each MCR model was determined by calculating the explained variance of the model and by visual appearance of the chromatographic and spectral pro fi les as well as the residuals. The explained variance was calculated as follows: =× ⎛ ⎝ − ⎞ ⎠ SSE SSX % VAR 100 1 , where SSE and SSX account for the sum of the squares of the residuals and the elements in the three-way array, respectively. (3) Final results: The results obtained were one matrix containing the areas for each one of the compounds modelled in each sample (integrated peaks matrix), another matrix containing the pure mass spectral pro fi les for each analyte and a set of matrices containing the pure chromatographic pro fi les for each sample. (4) Normalization of chromatographic areas and identi fi cation of compounds: In order to determine di ff erences in the volatile com- position between vinegars, areas of chromatographic peaks were integrated and used as fi ngerprint signals of samples. After resol- ving the GC – MS data into pure chromatograms and mass spectra pro fi les, the integrated peak areas were pre-processed by normal- izing all peaks to the peak area associated with the IS (relative areas) to eliminate minor injection discrepancies between samples and extraction e ffi ciency. Moreover, the ‘ NIST MS Search 2.0 ’ software was used to identify the volatile compounds giving rise to the obtained mass spectra pro fi les by MCR models. The tentatively identi fi cation was based on the mass spectrum matching in the NIST library. Within a total of 192, 228 and 68 components ex- tracted by HSSE, DHS and HS-SPME methods respectively, only those with a probability of matching upper 80% obtained by NIST comparing were selected for this study and con fi rmed by available retention index of standards (RIs). When standards were not available, the compounds were identi fi ed by computer matching to the reference mass spectra from the NIST library and by the com- parison of their RIs with the RIs obtained with standards that have been reported in the literature. The remaining compounds were tentatively identi fi ed by computer matching to the reference mass spectra from the NIST library and/or through comparisons of their RIs with those of online databases (Flavornet; Pherobase) and the literature. RIs were calculated by using the retention times of n- alkanes under identical conditions for each instrument. All these steps were applied for the three GC – MS data matrices obtained by each sampling method separately. 2.4.2. Statistical analysis All statistical analysis was carried out by using the PLS_Toolbox 7.9.5 working under MATLAB environment. Analysis of variance (ANOVA), followed by a post hoc comparison test (Tukey's test), and principal component analysis (PCA) were performed. 3. Results and discussion 3.1. MCR analysis The total ion chromatograms (TIC) of a PDO wine vinegar by the di ff erent sampling techniques were shown in Fig. 1 . Observing this fi gure, the complex chemical composition of the analyzed vinegars was clearly showed. Moreover, the presence of a large number of com- pounds, with overlapping and embedded peaks as well as the baseline/ background contribution and low S/N ratio increase the complexity of Table 1 (continued) MRE JPX MPX Nº Volatile compounds a DHS HSSPME HSSE DHS HSSPME HSSE DHS HSSPME ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD ARm ± SD 74 2(5H)-Furanone nd – nd – 0.23 0.00 nd – nd – 0.17 0.02 nd – nd – Total of ketones 7.39 4. 3 0.00 0.00 5.14 0.70 7.38 0.34 0.00 0.00 3. 2 0.32 6.64 6.25 0.00 0.00 Others 75 Trans-linalool oxide nd – nd – 0.06 0.01 nd – nd – 0.12 0.00 nd – nd – 76 TDN a 0.13 0.15 0.10 0.13 0.06 0.01 0.05 0.02 0.11 0.08 0.70 0.00 0.41 0. 1 2.32 3.05 77 2,4,5-Trimethyl-1,3- Dioxolane 0.39 0.32 nd – 1.17 0.44 0.66 0.28 nd – 0.41 0.04 0.25 0.29 nd – 78 1,4:3,6-Dianhydro- α -d- glucopyranose 0.01 0.00 nd – 0.06 0.00 0.07 0.02 nd – 0.05 0.00 0.01 0.01 nd – 79 Methyl salicylate a 0.07 0.04 0.02 0.01 0.07 0.06 0.37 0.35 0.13 0.02 0.01 0.00 0.03 0.01 0.08 0.01 80 Isopropyl myristate nd – nd – 0.05 0.02 nd – nd – 0.10 0.08 nd – nd – 81 4-Ethylguaiacol 0.15 0.06 nd – 0.06 0.02 0.36 0.09 nd – 0.02 0.00 0.07 0.05 nd – Total of others 0.75 0. 4 0.12 0.13 1.52 0. 4 1.51 0.76 0.24 0.10 1.41 0.14 0.78 0.89 2.40 3.06 nd: peak not detected. a Volatile compounds extracted in common by the three sampling methods. b ID (identi fi cation): reliability of identi fi cation: A, mass spectrum and LRI agreed with standards; B, mass spectrum agreed with mass spectral data base and LRI agreed with the literature data obtained with standards; C, mass spectrum agreed with mass spectral data base. Reference which matched the experimental LRI: 1: National Center for Biotechnology Information (2005) ;2 : Morales et al. (2017) ;3 : Ruiz-Bejarano et al. (2013) ;4 : Selli et al. (2004) ;5 : Pozo-Bayón et al. (2007) ;6 : Loscos et al. (2007) . c RI: Retention Index. d ARm: Mean relative areas. R. Ríos-Reina et al. Food Research International 105 (2018) 880–896 888 284 propanoic acid (17) and decanoic acid (28) and some ethyl esters as ethyl butyrate (48) according to the loadings plot showed in Table 4 . Regarding the separation of both categories, PC1 had an important role in this di ff erentiation, especially in HS-SPME model. Taking into ac- count that this method extracted the least number of compounds it could be deduced that all of the compounds extracted by this technique, with positive PC1 loadings and negative PC2 loadings, would be those that characterize the Pedro Ximenez category ( Table 4 ). Some of those compounds were 2-phenylethyl acetate (14), 2-phenylethanol (37), 5- methylfurfural (43), 5-hydroxymethylfurfural (45), TDN (76) and al- most all the extracted acids. Regarding HSSE and DHS, “ Pedro Xi- menez ” samples were characterized by volatile compounds with nega- tive loadings of PC1 and PC2 in both techniques, and negative PC6 loadings and positive PC4 loadings, respectively. In this two sampling methods, ethyl acetate (1), isobutyl acetate (4) or ethyl dodecanoate (61) were some of the compounds involved in this di ff erentiation. It should be highlighted that the “ Pedro Ximenez ” category di ff ers from the aged category by their di ff erent production process. Thus, they are produced by the addition of must of raisined “ Pedro Ximenez ” grapes (in the case of “ Vinagre de Montilla-Moriles ” ) or the addition of “ Pedro Ximenez ” wine to the vinegar (in “ Vinagre de Jerez ” PDO) ( Ríos-Reina et al., 2017; Ríos-Reina, Callejón, Oliver-Pozo, Amigo, & García- González, 2017 ). This addition could increase the residual alcohol in the wine vinegar, which had showed a clearly in fl uence in their fi nal content of volatile compounds, mainly ethyl acetate ( Tesfaye, Morales, García-Parrilla, & Troncoso, 2002 ). Furthermore, as it can be observed in Table 1 , the content of ethanol (33) as well as the total amount of ethyl esters, was higher in “ Pedro Ximenez ” wine vinegars (MPX and JPX) than in the Reserva samples of their corresponding PDOs (MRE and JRE). After applying the multivariate data analysis, the compounds that showed an important relevance in the wine vinegar characterization were generally consistent with previous reported compounds in high quality wine vinegars by di ff erent extraction methods prior to GC – MS analysis ( Callejón et al., 2008; Callejón et al., 2008; Castro Mejías et al., 2002; Chinnici et al., 2009; Marrufo-Curtido et al., 2012; Pizarro et al., 2008 ). Nevertheless, this study demonstrated that the wine vinegar volatile pro fi le obtained by GC – MS analysis highly depends on the previous sampling technique used. 4. Conclusions According to the aims of this study, the physical, chemical and methodological di ff erences between the three sampling methods have demonstrated to have an important in fl uence in the volatile composi- tion obtained for each wine vinegar. Hence, not all the sampling methods applied prior to GC – MS analysis are equally suitable for the di ff erentiation and characterization of high quality wine vinegars and their aged and sweet categories. Greater number of compounds were extracted by HSSE for most of the chemical families, followed closely by DHS. HS-SPME was the technique that extracted the least amount of volatile compounds in all the chemical families. Taking into account that one of the main needs of the wineries is the characterization of their vinegars, the knowledge of the maximum information about the wine vinegar is essential to perform this issue. In terms of di ff erentia- tion, HSSE-GC – MS and HS-SPME-GC – MS have shown a better dis- crimination of PDOs and categories, although HS-SPME showed a clearer discrimination between aged and sweet categories. A suitable selection of the sampling method in combination with chemometric methodologies, such as multiple curve resolution, could be successfully applied as a quality control tool for PDO wine vinegars and some of their most commercialized categories. Furthermore, MCR methodology has demonstrated to reduce the associated problems to the GC – MS analysis of complex mixtures such as high quality food products and to streamlines data processing. Although it should be noted that this is only a feasibility study, once the in fl uence of this prior step has been demonstrated, the encouraging results obtained justify the consideration of a similar approach in future in order to better evaluate its actual performance and to broaden the fi eld of application to a wider range of vinegar types. The applicability of the proposed methodology by any of the studied sampling methods requires further research. Thus, the development of classi fi cation models and the in- clusion of a broader number of samples of each PDO and category are being carried out. Acknowledgements The authors would like to thank the Spanish Regulatory Councils of the wine vinegar PDOs for their invaluable help with the acquisition of the samples. This work was supported by “ Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía ” [P12-AGR-1601]; and the FPU scholarship of “ Ministerio de Educación, Cultura y Deporte ” [FPU014/01247]. References Aceña, L., Vera, L., Guasch, J., Busto, O., & Mestres, M. (2011). Chemical characterization of commercial sherry vinegar aroma by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-olfactometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59 (8), 4062 – 4070. http://dx.doi.org/10.1021/jf104763u . Alves, R. F., Nascimento, A. M. D., & Nogueira, J. M. F. (2005). Characterization of the aroma pro fi le of Madeira wine by sorptive extraction techniques. 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Food Research International 105 (2018) 880–896 895 291 [Document text truncated for crawler view.]