Nanoliposomas funcionalizados con péptidos bioactivos como sistemas para mejorar la citotoxicidad de fármacos antitumorales

ES 2 389 347 B1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 389 347 Número de solicitud: 201130072 51 Int. CI.: A61K 9/127 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01) A61K 35/00 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 54 Título: NANOLIPOSOMAS FUNCIONALIZADOS CON PÉPTIDOS. 73 Titular/es: FUNDACIÓN PROGRESO Y SALUD (33.3%) Avenida Américo Vespucio, 5 - blq. 2, 2ª pl 41092 Sevilla (Sevilla) ES; UNIVERSIDAD DE SEVILLA (33.3%) y SERVICIO ANDALUZ DE SALUD (33.3%) 72 Inventor/es: POZO PÉREZ, David; KLIPPSTEIN MARTIN, Rebecca; GONZÁLEZ CAMPORA, Ricardo; TRIGO SÁNCHEZ, Inmaculada y VARGAS DE LOS MONTEROS, María Teresas 74 Agente/Representante: ARIAS SANZ, Juan 22 Fecha de presentación: 24.01.2011 43 Fecha de publicación de la solicitud: 25.10.2012 Fecha de la concesión: 03.09.2013 45 Fecha de publicación de la concesión: 13.09.2013 57 Resumen: Nanoliposomas funcionalizados con péptidos en su superficie que permiten la identificación de tejidos y/o células diana y la liberación de fármacos de forma selectiva, y en particular, nanoliposomas funcionalizados con el péptido VIP. Las composiciones, procedimiento de preparación y usos de dichos nanoliposomas. Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP. Aviso: NANOLlPOSOMAS FUNCIONALlZADOS CON PÉPTIDOS La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, de la 5 química, la bioquímica y la inmunología, y se refiere al uso de nanoliposomas funcional izados con péptidos en su superficie que permiten la identificación de tejidos y/o células diana y la liberación de fármacos de forma selectiva, y en particular, a la funcionalización de nanoliposomas con el péptido VIP. La presente invención también se refiere a las composiciones, al procedimiento de 10 preparación ya los usos de dichos nanoliposomas. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR Existe un creciente interés por los efectos biológicos de las nanopartículas, de 15 su toxicidad y su alcance en función del medio (M. Tsoli et al. 2005. Small (2005); 1 :841), por ejemplo, su uso potencial como herramienta terapéutica en tratamientos de cáncer (EI-Sayed et al., 2005. Nano Letters Vo1.5, 5. 829-834). Gracias al enorme interés de esos nano-bioconjugados se han desarrollado un 20 amplio rango de aplicaciones tales como distribución de fármacos, marcadores moleculares, análisis bioquímicos ultrasensibles, desarrollo de dispositivos "Iabon-a-chip", construcción de nanocomponentes electrónicos, motores nanomoleculares ... etc [C. M. Niemeyer, C. A. Mirkin Eds. Nanobiotechnology, Wiley- VCH 2004] 25 Entre los diferentes tipos de nanopartículas, los nanoliposomas son de especial relevancia debido a que son los sistemas nanométricos mejor establecidos clínicamente para el transporte y envío de fármacos gracias a que no son citotóxicos, son biocompatibles y biodegradables, y además su síntesis es 30 relativamente barata y de fácil escalado en procesos industriales. Los liposomas en general se han utilizado en terapias para el tratamiento de cáncer durante más de una década ya que han demostrado reducir de forma sistémica   2 ES 2 389 347 B1 DESCRIPCIÓN los efectos secundarios, la toxicidad y facilitando la eliminación del fármaco.( Torchlin, 2005. Nat Rev. Drug Discovery 4, 145). Los nanoliposomas se pueden utilizar como transportadores de diversas 5 sustancias tanto en su exterior como en su interior y para una variedad de aplicaciones biomédicas como terapia génica o para el envío de fármacos, de forma que los ácidos nucleicos o el fármaco vayan protegidos en su interior evitando su degradación enzimática y su contacto directo con otras células sanas. Por otra parte permiten el envío de moléculas biológicamente activas de 10 carácter lipófilo y tamaños superiores a los 500 Da, dos de los problemas más importantes que puede presentar una molécula activa para terminar como principio activo de un medicamento. Los nanoliposomas de diversos tamaños, normalmente menores de 400 nm 15 pueden entrar en las zonas en las que existen tumores de forma rápida ya que la pared del endotelio vascular se encuentra fenestrada. Por el contrario, los nanoliposomas permanecen en el torrente sanguíneo del tejido sano mediante la pared del endotelio vascular no fenestrado. 20 Además, la funcionalización de los nanoliposomas con péptidos que reconocieran con mayor selectividad las dianas terapéuticas, permitiendo el direccionamiento de forma específica en aquellos caso en los que se conoce que dichas dianas sobreexpresan los receptores que reconocen dichos pépidos. 25 Actualmente existen liposomas funcionalizados con péptidos en su superficie. Por ejemplo, los liposomas funcionalizados con tuftsina han permitido aumentar la eficacia de estibogluconato sódico (Agrawal & Gupta, 2000. Adv. Drug Deliv. Rev. 41: 135-146;, Gupta & Haq, 2005. Methods Enzymol. 391: 291-304) Y 30 anfotericina B (Gupta & Haq, 2005. Methods Enzymol. 391: 291-304, Agrawal et al., 2002. J. Drug Target. 10: 41-45). Sin embargo, aún no se conocen nanoliposomas funcional izados con neropéptidos, y una de las limitaciones para el uso clínico de los neuropéptidos en general, y del VIP en particular, ha   3 ES 2 389 347 B1 sido siempre su corta vida media en circulación. Esto implica la necesidad de administrar crónicamente dicho péptido, aumentando los costes económicos y dificultando su posología en pacientes. Además, el proceso de funcionalización de nanoliposomas con VIP se enfrenta al problema añadido de diseñar un 5 procedimiento en el que quede el extremo carboxilo terminal de VIP libre, ya que es por este extremo por el que interacciona con sus receptores específicos de membrana. Es necesario, por tanto, desarrollar un procedimiento de funcionalización de nanoliposomas con péptidos, dejando el extremo carboxilo terminal de dicho péptido libre para interaccionar con su receptor. 10 DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN Los autores de la presente invención han desarrollado nanoliposomas 15 funcionalizados con péptidos en su superficie, estables, no tóxicos, solubles en agua, y compatibles con los sistemas biológicos, y un procedimiento para su obtención, que son útiles para vehiculizar principios activos y/o composiciones farmacéuticas. Además, han demostrado que la funcionalización de VIP en la superficie del nanoliposoma, optimizando su síntesis a un tamaño de 100 nm 20 se maximiza su entrada en las zonas con tumores debido al endotelio vascular fenestrado, y a la vez se permite su direccionamiento de forma específica en aquellos caso en los que se conoce que las células cancerosas sobreexpresan los receptores de la familia de VIP del tipo siete dominios transmembrana acoplados a proteínas G, como es el caso del cáncer de próstata. Además de 25 permitir que VIP actúe como agente terapéutico sobre células diana o como modo de liberación de fármacos sobre células que sobreexpresan receptores VIP, aumenta la vida media de la molécula unida a la misma, ya que dificulta el ataque proteolítico. 30 Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un nanoliposoma funcionalizado con un péptido en su superficie, de ahora en adelante, nanoliposoma de la invención. En una realización preferida, el extremo carboxilo-terminal del péptido queda libre, pudiendo interaccionar con su   4 ES 2 389 347 B1 receptor mediante su extremo carboxilo-terminal. En otra realización preferida, el péptido se selecciona de la lista que comprende: glucagon, GIP (gastric inhibitory polypeptide), secretina, hormona de crecimiento, somatoliberina, somatotropina, péptido PHI (peptide histidine isoleucine), péptido PHM (Peptide 5 Histidine-Methionine), PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating peptides), adrenomedulina, corticostatina y VIP(vasoactive intestinal peptide). Una de las limitaciones para el uso clínico de los péptidos en general, fundamentalmente de los neuropéptidos, y del VIP en particular, es su corta 10 vida media en circulación, lo que haría necesaria la administración crónica del mismo, aumentando los costes económicos y dificultando su posología al paciente. La unión de los péptidos a los nanoliposomas, yen concreto de VIP, aumenta la vida media de las moléculas unidas a los mismos, ya que dificulta el ataque proteolítico. 15 Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, el péptido es un neuropéptido, y más preferiblemente, es el péptido intestinal vasoactivo (VIP). 20 Tal como se entiende en esa memoria, un neuropéptido se refiere a pequeñas moléculas parecidas a proteínas de un enlace peptídico de dos o más aminoácidos y que se diferencian de proteínas por su longitud, y porque se originan por transducción sináptica cerebral. Su dimensión puede variar desde dos aminoácidos, como la carnosina, hasta más de 40 como la CRH 25 (Corticotropin-releasing hormone u hormona liberadora de corticotropina). Tienen función cerebral tanto estimulante como inhibidora, produciendo efectos como la analgesia, apetito, sueño, etcétera. En esta memoria se entiende como péptido intestinal vasoactivo (VIP por sus 30 siglas en inglés vasoactive intestinal peptide), es una hormona polipeptídica formada por 28 residuos de aminoácidos y es producida por muchas estructuras del cuerpo humano como el aparato digestivo, el páncreas y el núcleo supraquiasmático del hipotálamo en el cerebro. Se caracteriza por su   5 ES 2 389 347 B1 propiedad vasodilatadora y su actividad en el sistema nervioso periférico (por ejemplo, el VIP relaja los pulmones, la traquea y la musculatura gástrica). Inhibe la secreción de enzimas gástricas y estimula la secreción de glucagón, insulina y somatostatina, aumenta la adenilciclasa, así como la secreción biliar 5 en el hígado. 10 El VIP, o "vasoactive intestinal peptide", también denominada como PHM27 ó MGC13587. Está codificado por un gen que se encuentra en el cromosoma 6 (6q25). Su secuencia aminoacídica se encuentra en la SEO ID NO: 1. En el contexto de la presente invención, VIP se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEO ID NO: 1, Y que comprendería diversas variantes procedentes de: 15 a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 1, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) 20 debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 1, Y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las 25 características estructurales el péptido VIP. Los nanoliposomas de diversos tamaños, normalmente menores de 400 nm pueden entrar en las zonas en las que existen tumores de forma rápida ya que la pared del endotelio vascular se encuentra fenestrada. Por el contrario, los 30 nanoliposomas permanecen en el torrente sanguíneo del tejido sano mediante la pared del endotelio vascular no fenestrado. En otra realización preferida de la invención, el nanoliposoma comprende:   6 ES 2 389 347 B1 5 10 15 (a) 1 ,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, fórmula 1), (b) 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC, fórmula 11), y al menos un fosfolípido pegilado. (1) (11) o cualquiera de sus sales, derivados o análogos, o cualquiera de sus 20 combinaciones, de los compuestos de fórmula (1) y (11). En otra realización preferida, el fosfolípido pegilado es:   7 ES 2 389 347 B1 combinaciones, de los compuestos de fórmula (I) y (II). En otra realización preferida, el fosfolípido pegilado es: 5 a. 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilen glicol-Maleimida(DSPE-PEG-Maleimida), b. 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilen glicol (DSPE-PEG), o una combinación de ambos.10 En otra realización preferida, el nanoliposoma se obtiene por un procedimiento que comprende: a. formar un film de lípidos mediante evaporación de fase reversa de un compuesto que comprende 1,2-distearoil-sn-glicero-3-15 fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado, b. añadir el solvente orgánico y la fase acuosa quedando finalmente un ratio de volumen de aproximadamente 4:1 (fase orgánica:fase acuosa),20 c. someter el sistema de dos fases a sonicación hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase, todo el solvente orgánico mediante un rotavapor hasta obtener una fase de gel, d. convertir el gel en una suspensión acuosa,donde se han formado los liposomas25 e. convertir los liposomas de (e) en nanoliposomas mediante sonicación, hasta un tamaño medio menor de 500 nm, preferiblemente de un tamaño medio de 400 nm o menor, y más preferiblemente de un tamaño medio menor de 200 nm, f. purifica los nanoliposomas mediante una columna de Sephadex, 30 preferiblemente G-50,   ES 2 389 347 B1 8 durante al menos 20 horas, 22 horas, y mucho más preferiblemente, durante 24 horas. Más preferiblemente, se obtiene por un procedimiento donde el DPPC y el 5 DSPC se encuentran en una relación de masa de aproximadamente 6:4. Aún más preferiblemente el DSPE-PEG y el DSPE-PEG-Maleimida se encuentran a una concentración final del 5 y 10%, respectivamente. Más preferiblemente, el solvente orgánico que consiste en una mezcla de di-etil-éter y cloroformo a aproximadamente el 50%. Más preferiblemente, el ratio en volumen fase 10 orgánica: fase acuosa es de aproximadamente 4:1. Más preferiblemente, el sonicado del paso (c) se hace en un baño sonicador hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase, preferiblemente durante 3 a 5 minutos. Aún más preferiblemente, la evaporación de todo el solvente orgánico mediante el rotavapor del paso (d) hasta alcanzar una fase de gel, se realiza a una 15 temperatura de netre 35 y 55 oC, y más preferiblemente de 40°C y a una rotación de entre 100 Y 150 rpm, y más preferiblemente de 120 rpm. Más preferiblemente la sonicación de la muestra del paso (f) se realiza en un baño sonicador a temperatura superior a la de su fase de transición, y preferiblemente a más de 60°C, para controlar el tamaño del nanoliposoma. 20 Más preferiblemente, el nanoliposoma se ajusta a un tamaño medio del el tamaño medio es de entre 75 y 125 nm, preferiblemente de entre 85 y 115 nm, y más preferiblemente de aproximadamente 95-105 nm. En otra realización preferida, la funcionalización de los nanoliposomas con el 25 péptido se realiza mediante la adición de al menos 100 )lg del péptido, más preferiblemene 125 )lg del péptido, y aún mucho más preferiblemene de al menos 150 )lg del péptido modificado a la muestra de nanoliposomas y manteniéndolo en agitación ya temperatura ambiente más de 10 horas, y más preferiblemente entre 12 y16 horas. Más preferiblemente, el péptido es un 30 neuropéptido, y aún más preferiblemente, el neuropéptido es el VIP. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del nanoliposoma de la invención, para la vehiculización de principios activos.   9 ES 2 389 347 B1 minutos con nanoliposomas de VIP a una concentración efectiva funcionarizada de VIP de 10-7M.   16 ES 2 389 347 B1 1- Un nanoliposoma funcionalizado con un péptido en su superficie. 5 2- El nanoliposoma según la reivindicación anterior, donde el extremo carboxilo-terminal del péptido queda libre. 3- El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el péptido es el péptido VIP.10 4- El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende: 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina(DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado.15 5- El nanoliposoma según la reivindicación anterior, donde el fosfolípido pegilado es: a. 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilen 20 glicol-Maleimida(DSPE-PEG-Maleimide), b. 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilen glicol (DSPE-PEG), o una combinación de ambos. 25 6- El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, obtenible mediante un procedimiento que comprende: a. formar un film de lípidos mediante evaporación de fase reversa de un compuesto que comprende 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina30 (DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado (DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado,   17 ES 2 389 347 B1 REIVINDICACIONES b. añadir el solvente orgánico y la fase acuosa quedando finalmente un ratio de volumen de aproximadamente 4:1 (fase orgánica:fase acuosa), c. someter el sistema de dos fases a sonicación hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase,5 d. evaporar todo el solvente orgánico mediante un rotavapor hasta obtener una fase de gel, e. convertir el gel en una suspensión acuosa,donde se han formado los liposomas f. convertir los liposomas de (e) en nanoliposomas mediante 10 sonicación, hasta un tamaño medio de 500 nm, preferiblemente de un tamaño medio de 400 nm o menor, y más preferiblemente de un tamaño medio menor de 200 nm, g. purifica los nanoliposomas mediante una columna de Sephadex, preferiblemene G-50,15 a. añadir añadir al menos 100 g del péptido, preferiblemente en una cantidad aproximada de 150 g, a los nanoliposomas del paso (f) y mantener en agitación y temperatura ambiente al menos 10 horas, y preferiblemente entre 12 y 16 horas, y h. purificar la mezcla resultante del paso (h) mediante diálisis frente 20 a agua desionizada durante al menos 15 horas, preferiblemente durante al menos 20 horas, 22 horas, y mucho más preferiblemente, durante 24 horas. 7- El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el 25 DPPC y el DSPC se encuentran en una relación de masa de aproximadamente 6:4. 8- El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el DSPE-PEG y el DSPE-PEG-Maleimide se encuentran a una 30 concentración final del 5 y 10%, respectivamente.   18 ES 2 389 347 B1 9- El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, donde el solvente orgánico que consiste en una mezcla de di-etil-éter y cloroformo aaproximadamnte el 50%. 10-El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, donde el5 ratio en volumen fase orgánica: fase acuosa es de aproximadamente 4:1. 11-El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde el sonicado del paso (c) se hace en un baño sonicador hasta que la 10 muestra aparece dispersa en una sola fase. 12-El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 6-11, donde la evaporación de todo el solvente orgánico mediante el rotavapor del paso 15 (d) hasta alcanzar una fase de gel, se realiza a una temperatura de 40ºC y a una rotación de 120 r.p.m.. 13-El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 6-12, donde sonicación de la muestra del paso (f) se realiza en un baño sonicador a 20 más de 60ºC. 14-El nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el tamaño medio es de entre 75 y 125 nm, preferiblemente de entre 85 y 115 nm, y más preferiblemente de aproximadamente 95-105nm.25 15-Uso de un nanoliposoma como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para la vehiculización de principios activos. 30 16-Uso del nanoliposoma según la reivindicación anterior, donde el principio activo tiene actividad antitumoral.   19 ES 2 389 347 B1 17-Uso del nanoliposoma según la reivindicación 15, donde el principio activo tiene actividad antiinflamatoria. 18-Uso de un nanoliposoma como se define en cualquiera de las 5 reivindicaciones 1-14, para la vehiculización de composiciones farmacéuticas. 19-Uso de un nanoliposoma como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la elaboración de un medicamento para el 10 tratamiento de enfermedades que cursan con proliferación celular. 20-Uso del nanoliposoma según la reivindicación anterior, donde la enfermedad que cursa con proliferación celular se selecciona de la lista que comprende: neoplasmas epiteliales malignos, cáncer de pulmón y 15 otros cánceres como cáncer de estómago, colon, mama, próstata, hígado y vejiga urinaria. 21-Uso del nanoliposoma según cualquiera de las reivindicaciones 19-20, donde la enfermedad que cursa con proliferación celular es cáncer de 20 próstata. 22-Un procedimiento de obtención de nanoliposomas funcionalizado con péptidos, que comprende las etapas de: 25 a. formar un film de lípidos mediante evaporación de fase reversa de un compuesto que comprende ,1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado, b. añadir el solvente orgánico y la fase acuosa quedando finalmente 30 un ratio de volumen de aproximadamente 4:1 (fase orgánica:fase acuosa),   20 ES 2 389 347 B1 c. someter el sistema de dos fases a sonicación hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase, d. evaporartodo el solvente orgánico mediante un rotavapor hasta obtener una fase de gel, e. convertir el gel en una suspensión acuosa,donde se han formado 5 los liposomas f. convertir los liposomas de (e) en nanoliposomas mediante sonicación, hasta un tamaño medio menor de 500 nm, preferiblemente de un tamaño medio de 400 nm o menor, y más preferiblemente de un tamaño medio menor de 200 nm,10 g. purifica los nanoliposomas mediante una columna de Sephadex, preferiblemente G-50, h. añadir el péptido a los nanoliposomas del paso (g) y mantener en agitación y temperatura ambiente de al menos 10 horas, y preferiblemente entre 12 y 16 horas, y15 i. purificar la mezcla resultante del paso (h) mediante diálisis frente a agua desionizada durante al menos 15 horas, preferiblemente durante al menos 20 horas, 22 horas, y mucho más preferiblemente, durante al menos 24 horas. 20 23-El procedimiento según la reivindicación 22, donde el DPPC y el DSPC se encuentran en una relación de masa de aproximadamente 6:4. 24-El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22-23, donde el DSPE-PEG y el DSPE-PEG-Maleimide se encuentran a una 25 concentración final del 5 y 10%, respectivamente. 25-El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22-24, donde el solvente orgánico que consiste en una mezcla de di-etil-éter y cloroformo aaproximadamnte el 50%.30  ES 2 389 347 B1 21 26-El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22-25, donde el ratio en volumen fase orgánica: fase acuosa es de aproximadamente 4:1. 27-El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22-26, donde 5 el sonicado del paso (c) se hace en un baño sonicador hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase. 28-El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22-27, donde 10 la evaporación de todo el solvente orgánico mediante el rotavapor del paso (d) hasta alcanzar una fase de gel, se realiza a una temperatura de 40ºC y a una rotación de 120 r.p.m.. 29-El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22-28, donde 15 sonicación de la muestra del paso (f) se realiza en un baño sonicador a más de 60ºC. 30-El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22-29, donde el tamaño medio es de entre 75 y 125 nm, preferiblemente de entre 85 y 20 115 nm, y más preferiblemente de aproximadamente 95-105 nm.  ES 2 389 347 B1 22  ES 2 389 347 B1 23  ES 2 389 347 B1 24  ES 2 389 347 B1 25