Bases moleculares de la fibrosis quística.

TRABAJO FIN DE GRADO BASES MOLECULARES DE LA FIBROSIS QUÍSTICA Julián Martín Rivas FACULTAD DE BIOLOGÍA GRADO EN BIOQUÍMICA Tutor: Sergio López Martín Departamento: Biología Celular ÍNDICE 1. Resumen ...................................................................................................................... 1 2. Introducción ................................................................................................................ 1 2.1 Definición ............................................................................................................... 1 2.2 Antecedentes .......................................................................................................... 2 2.3 Epidemiología de la enfermedad ............................................................................ 2 2.4 Objetivo .................................................................................................................. 3 3. Implicación funcional del CFTR ............................................................................... 3 3.1 Gen CFTR: estructura y regulación transcripcional ............................................... 3 3.2 Estructura del canal y proceso de biosíntesis .......................................................... 3 3.3 Activación y apertura del canal ............................................................................... 6 3.4 Localización del CFTR y funciones principales ..................................................... 7 3.4.1 Función del CFTR en las vías respiratorias ..................................................... 8 3.4.2 Función del CFTR en las glándulas sudoríparas .............................................. 9 3.4.3 Función del CFTR en el páncreas ................................................................... 11 3.4.4 Otros órganos donde se expresa el CFTR ...................................................... 13 3.5 Funciones del CFTR más allá del transporte de iones .......................................... 13 4. Fisiopatología ............................................................................................................ 14 4.1 Mutaciones causantes de la enfermedad ............................................................... 14 4.1.1 Características del Phe508del......................................................................... 16 4.2 Manifestaciones clínicas y órganos afectados ...................................................... 17 4.2.1 Afectación en la fisiología del tracto respiratorio .......................................... 18 4.2.2 Afectación en la fisiología del páncreas ......................................................... 20 4.2.3 Afectación en la fisiología de la glándula sudorípara .................................... 21 4.2.4 Afectación en otros órganos y tejidos ............................................................ 21 4.3 Genes que modifican el fenotipo .......................................................................... 22 5. Diagnóstico y seguimiento de la enfermedad ......................................................... 23 5.1 Cribado neonatal y diagnóstico de la enfermedad ................................................ 23 5.2 Seguimiento de la enfermedad .............................................................................. 24 6. Tratamiento ............................................................................................................... 25 6.1 Antibióticos y principales medicamentos recetados ............................................. 25 6.2 Terapia génica ....................................................................................................... 25 6.3 Moduladores del CFTR ........................................................................................ 26 6.4. Trasplante de pulmón ........................................................................................... 26 7. Conclusiones y perspectivas futuras ....................................................................... 27 8. Bibliografía ................................................................................................................ 28 1 1. RESUMEN La fibrosis quística (FQ) se trata de una enfermedad causada por mutaciones en el gen que codifica para el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) que afecta a 1/4500 nacidos. Estas mutaciones provocan una alteración en el transporte de iones Cl- y bicarbonato desde la membrana apical hacia la luz de las vías respiratorias, glándulas sudoríparas, aparato digestivo y conductos del aparato reproductor entre otros. La afectación en el aparato respiratorio es causante de la mayoría de las muertes por FQ, debido a que no se lleva a cabo correctamente la expulsión del moco, lo que provoca infecciones reincidentes y una consecuente inflamación que acaba comprometiendo la función pulmonar. En este trabajo se examinan las alteraciones moleculares debido a las mutaciones y como el conocimiento de estas ha posibilitado el desarrollo de técnicas de diagnóstico y tratamientos cada vez más efectivos que han provocado que la esperanza de vida haya aumentado considerablemente en las últimas décadas. 2. INTRODUCCIÓN 2.1 Definición La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad monogénica autosómica que presenta un patrón de herencia recesivo y que afecta especialmente al tejido pulmonar, aunque también se encuentran afectados otros órganos como el páncreas, el aparato digestivo o el hígado. Está causada por mutaciones en el gen que codifica para una proteína conocida como regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y se caracteriza por ser degenerativa y de carácter crónico 1. El CFTR se sitúa en la membrana apical del tejido epitelial de distintos órganos ejerciendo un papel fundamental en la homeostasis de las sales y los fluidos corporales. En concreto, se encarga del transporte de aniones cloruro (Cl-) y en menor medida de bicarbonato (HCO3-) hacia la luz del epitelio además de repercutir en la reabsorción de sodio. Los niveles de éstos tendrán como finalidad mantener la hidratación de la superficie epitelial lo cual es imprescindible para el correcto funcionamiento del epitelio y evitar infecciones de las vías respiratorias. Ésto último es la complicación más relevante a la que se enfrentan las personas que padecen FQ 2. 2 2.2 Antecedentes Existe un consenso generalizado acerca de que la mutación más común desencadenante de la FQ (Phe508del) surgió en el noroeste de Europa y se fue propagando hacia el sureste en distintas migraciones 3. Sin embargo, aún no se ha logrado determinar con exactitud el momento preciso en que dicha mutación se originó. Si bien tradicionalmente se había afirmado que esta mutación se originó hace 52.000 años en base a un estudio realizado en el año 1994 en el que se realiza un análisis de haplotipo de 3 microsatélites 4; estudios posteriores en los que se realiza un análisis genético y estadístico de familias con la mutación sugieren que la mutación apareció hace unos 3.000 años 3. Una de las primeras referencias a la FQ en la historia recae en un dicho irlandés del siglo XV que dice: “Ay de aquel niño que al ser besado en la frente sabe salado. Él está embrujado y pronto morirá” 5. Este dicho pone de manifiesto la realidad de que, durante muchos años, la causa de la enfermedad se atribuía al supuesto “mal de ojo”. Fue necesario que pasaran unos 500 años hasta que se relacionaron estos síntomas con una enfermedad que se describió como “fibrosis quística del páncreas”. Dorothy Andersen fue la autora de esta definición describiendo por primera vez la afección como una entidad clínica separada observando que los pacientes que la padecían también presentaban problemas respiratorios 6. En 1989 se identificó y clonó en gen responsable de la FQ siendo un evento clave, ya que permitió un mayor conocimiento sobre la enfermedad que repercutió en el desarrollo de terapias y técnicas de diagnóstico 7. 2.3 Epidemiología de la enfermedad La incidencia de la FQ, a nivel mundial, varía entono a 1/3000 y 1/6000 nacimientos. Con estos datos puede ser considerada como enfermedad rara, aunque no presenta una incidencia homogénea, ya que es predominante en poblaciones europeas 8. Una de las hipótesis para explicar la elevada incidencia en esta población hace referencia al hecho de que ser heterocigotos supone una ventaja hacia ciertas enfermedades epidémicas como el cólera, la tuberculosis o la peste. Esto explicaría por qué la frecuencia de portadores se eleva hasta valores de 1/25 en Europa 9. Los avances médicos y en el conocimiento de la patología han modificado el paradigma que consideraba la FQ como una enfermedad predominante en niños habiendo, actualmente, un mayor número de adultos con la enfermedad debido a que antes los niños 3 fallecían y no llegaban a la etapa adulta. Por lo tanto, el objetivo actual se centra en el cuidado y mejora de la calidad de vida de estos adultos. Gracias a mejoras en el diagnóstico precoz, tratamientos más efectivos y una investigación continua, la esperanza de vida ha aumentado llegando a establecerse en torno a los 40 años a nivel mundial 1. La prevalencia en España se sitúa en 1 por cada 5000 nacidos y se ha observado que la media de la edad a la que fallecen los pacientes ha aumentado, significativamente, en las últimas décadas correspondiendo a 41 años. De hecho, según el informe de 2019 del Registro Español de Fibrosis Quística, elaborado por la Sociedad Española de Fibrosis Quística, el número total de pacientes en España es de 2460 de los cuales un 54% son adultos 10. Además, existen diferencias dentro del territorio nacional, ya que hay ciertas localidades como Cádiz, Sevilla, Málaga o Santa Cruz de Tenerife en las que el riesgo de muerte aumenta, aunque no ha llegado a establecerse una causa concreta de este hecho 11. 2.4 Objetivo Conocer las bases moleculares y la causa subyacente de la FQ es crucial para el desarrollo de tratamientos más efectivos que puedan abordar directamente la causa de la enfermedad, la prevención y el asesoramiento genético. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo reside en realizar una revisión sobre el conocimiento actual del funcionamiento fisiológico y patológico del CFTR e inspeccionar los avances que se han conseguido en relación con su diagnóstico y tratamiento. 3. IMPLICACIÓN FUNCIONAL DEL CFTR 3.1 Gen CFTR: estructura y regulación transcripcional El gen CFTR se localiza en el brazo largo del cromosoma 7 y se compone de 27 exones. El promotor presenta un elemento de respuesta a AMPc (CRE) que hace que aumente la expresión del gen en respuestas a incrementos en la concentración de AMPc. La expresión es específica de ciertos tejidos encontrándose, sobre todo, en pulmón, páncreas, glándulas sudoríparas, intestino, hígado, mucosa nasal, glándulas salivales, tracto respiratorio y reproductor 12. 3.2 Estructura del canal y proceso de biosíntesis El CFTR es una glicoproteína multidominio perteneciente a la superfamilia de proteínas transportadores dependientes de ATP (ABC) formada por 1480 aminoácidos y un peso 4 molecular de aproximadamente 170 kDa. Presenta la estructura típica de las proteínas ABC: dos dominios transmembrana (MSD1 y MSD2) cada uno a su vez formado por 6 alfa hélices, dos dominios de unión a nucleótidos (NBD1 y NBD2) citoplasmáticos que se encuentran unidos cada uno a un dominio transmembrana. Además, posee una región intrínsecamente desordenada, el dominio regulador (RD), localizado entre el NBD1 y el MSD2 que lo diferencia del resto de proteínas ABC y que debe ser fosforilado para permitir la apertura del canal (Figura 1). El canal se encuentra anclado a la membrana citoplasmática por los dos dominios MSD que la atraviesan y junto con 4 loops (2 por cada MSD) citoplasmáticos (ICL) delimitan el poro del canal y confiriéndole la especificidad iónica 12,13. El proceso de síntesis comienza con la traslocación del polipéptido en formación hacia el retículo endoplasmático (ER) y va plegándose dominio a dominio. Los primeros en sintetizarse y plegarse son los dominios MSD1 y NBD1 que interaccionan con distintas chaperonas que los estabilizan mientras se va formando el dominio regulador formando parte estos tres de la porción N-terminal del canal. Los dominios individuales del CFTR son capaces de adoptar una estructura muy similar a la que presenta la proteína final de manera independiente. Conforme se van sintetizando se insertan en la membrana del ER produciéndose el plegamiento correcto. Sin embargo, requieren de un mecanismo posttraduccional en el que se producen interacciones entre los distintos dominios, siendo este proceso también mediado por chaperonas, consiguiendo así la estructura funcional definitiva12,14. La maquinaria de control de calidad del ER se asegura de que se produzca un correcto plegamiento de la proteína y que aquellas que no lo consiguen sean degradadas por la vía Figura 1. Representación esquemática de la estructura del canal. Se reflejan 5 dominios de los que está formado el CFTR quedando señaladas las glucosilaciones que presentan en los bucles extracelulares (ECL) (A), la organización estructural de los mismos en la membrana plasmática (B) y la estructura de dichos dominios destacando la posición concreta del NBD1 donde tiene lugar la mutación más común (Phe508) (C). Fuente: Tomado del trabajo de Farinha y Canato 14 . 5 del proteosoma. Dentro de los distintos puntos de control se pueden destacar las chaperonas y co-chaperonas citosólicas como Hsp70 y 90 que se encargan de estabilizar proteínas con un plegamiento parcial y la calnexina, una chaperona tipo lectina, que participa en el correcto plegamiento de las proteínas dentro del ER, requiriendo de glicosilaciones concretas para su funcionamiento. Las que adquieren una conformación inadecuada son sometidas a un proceso de degradación mediado por el proteasoma 14. El CFTR funcional, habiendo pasado por todos los puntos de control de calidad, es introducido en la vía secretora de proteínas de membrana. En el NBD1 reside la señal de exportación hacia el complejo de Golgi que consta de dos residuos aminoacídicos de carácter ácido que interaccionan con el complejo proteico COPII para facilitar el transporte vesicular anterógrado desde el ER hacia el Golgi. En este van ocurriendo las distintas modificaciones, como la glicosilación, a través de los compartimentos cis, medio y trans. Por último, para llegar a la membrana plasmática el péptido DTRL del extremo C-terminal interacciona con dominios PDZ de diferentes proteínas que ayudan a que se transporte el canal exclusivamente en la cara apical de la célula epitelial 12. Una vez en la membrana plasmática, los niveles de CFTR dependerán del equilibrio que se dé entre el flujo vesicular del transporte anterógrado, y el proceso de reciclaje 15. En cuanto al proceso de reciclado, primero se debe dar una endocitosis mediada por clatrina gracias a la interacción de dominios de la cola C-terminal del canal con el complejo adaptador AP2. Las proteínas NHERF (intercambiador iónico Na+/H+) y CAL (ligando asociado del CFTR) compiten por la unión al CFTR presentando funciones opuestas: la primera favorece la vuelta a la membrana plasmática del CFTR mientras que la segunda promueve la degradación lisosomal del mismo. Sin embargo, la afinidad de la unión de NHERF es mucho mayor lo cual explicaría la eficacia del proceso de reciclaje 12. 6 3.3 Activación y apertura del canal Para que se active el CFTR se deben fosforilar ciertos residuos del dominio RD que están ampliamente conservados en mamíferos gracias a la actividad de la proteína kinasa A (PKA) dependiente de AMPc. El aumento de AMPc es producido por la activación de la adenilato ciclasa por diferentes estímulos como el glucagón, la epinefrina o diferentes agonistas beta-adrenérgicos como la acetilcolina o la adenosina. Una vez fosforilado, la apertura del canal está promovida por la unión del ATP a los dominios NBD 13. En un estado inactivo, el RD no se encuentra fosforilado y tiene un papel inhibitorio al evitar la dimerización de los dominios NBD1 y NBD2 y por tanto la apertura del canal 16. Una vez se fosforila el RD se permite la unión de ATP a los dos dominios NBD1 y NBD2 provocando que estos formen un dímero y que generen un cambio conformacional que se transmite hacia los dominios MSD1 y MSD2, abriéndose el canal. El ATP que se une al dominio NBD1 permanece unido durante varios ciclos de apertura y cierre siendo el ATP del NBD2 el que se hidroliza debido a la actividad enzimática del mismo. Una vez hidrolizado, la salida del fósforo inorgánico provoca el cierre del canal con la sucesiva liberación del ADP quedando listo para la unión de un nuevo ATP y comienzo del siguiente ciclo de apertura (Figura 2) 13. Estudios recientes sugieren que la dimerización de los dominios NBD1 y NBD2 y la permeabilidad iónica no se encuentran del todo acoplados, si no que éstos están relacionados a través de mecanismos alostéricos, aunque aún se desconoce el mecanismo concreto 17. Figura 2. Representación del ciclo de apertura y cierre del canal CFTR. El ciclo de apertura conlleva la unión de ATP a los dominios NBD1 y NBD2 provocando su dimerización que provoca un cambio conformacional en lo dominios MSD1 y MSD2 haciendo que se abra el canal. Fuente: Tomado del trabajo de Moran 13. 7 3.4 Localización del CFTR y funciones principales Para comprender el funcionamiento del canal en el transporte de iones, es fundamental tener en cuenta su ubicación en la célula epitelial: la membrana apical. La polaridad es una característica esencial del tejido epitelial, que se manifiesta en la clara distinción entre dos regiones, la membrana apical que está en contacto con el medio externo y la membrana basolateral que da hacia el intersticio celular 18. Esta polaridad se ve mantenida por los complejos de unión (ocluyentes y adherentes) que se dan entre las células epiteliales adyacentes y que permiten que haya una distribución no homogénea de las proteínas de membrana 2. El concepto de complejo de unión hace referencia a la aparición de distintos tipos de uniones a lo largo del epitelio en un orden sistemático. En la parte más cercana al lado apical aparecen las uniones estrechas u ocluyentes que rodean todo el perímetro celular. Por debajo de las uniones ocluyentes se localizan las uniones adherentes de cadherinas que dan una unión firme que rodea toda la célula y, por último, más cercano al lado basolateral, se encuentran los desmosomas que ofrecen una unión firme y puntual 2,19. Además, los complejos de unión permiten el movimiento direccional de iones y fluidos debido a los procesos de absorción y secreción regidos por la localización diferencial de distintas proteínas de canal 18. En la membrana basolateral se encuentra la ATPasa Na+/K+ que transporta activamente Na+ fuera de la célula provocando un gradiente electroquímico que permite el cotransporte de Na+, K+ y Cl- a través del transportador NKCC1 también presente en la membrana basolateral. Las concentraciones de Clintracelular aumentan y éste es secretado a través del CFTR mediante transporte activo primario y otros canales específicos según el tejido. En la membrana apical también se encuentra el canal de sodio epitelial (ENaC) que se encarga de la absorción de Na mediante difusión facilitada. Éste genera, junto con el transporte de la ATPasa, una fuerza electroquímica que impulsa el transporte pasivo de Cl- a través de la vía paracelular. En cuando al movimiento del agua, está gobernado por la fuerza osmótica que se genera al acumularse los distintos iones y puede darse tanto por la vía transcelular como a través de acuaporinas. Es importante resaltar que el CFTR ejerce una regulación a la baja en la actividad del ENaC limitando su función reabsorbiendo Na+ 2. También se ha observado que influye sobre otros canales como el intercambiador HCO3-/Cl- (que pertenece a la familia de transportadores de solutos o SLC) o los canales de cloruro activados por calcio (CaCC) 20. 14 celular por alteración de las uniones estrechas. Sin embargo, no está claro si el CFTR modula la organización del citoesqueleto y las uniones o si son estos los encargados de regular el CFTR. Probablemente se trate de una interacción entre ambos procesos 32. 4. FISIOPATOLOGÍA 4.1 Mutaciones causantes de la enfermedad Las mutaciones en el CFTR pueden ocurrir tanto en las regiones codificantes, en los intrones o en el promotor. Actualmente el número de alteraciones en la secuencia genética que hay determinadas asciende hasta 2074 aunque no todas se relacionan con el desarrollo de FQ 33. La clasificación clásica de las distintas mutaciones que generan FQ las categoriza en seis grupos en función del defecto que provoquen en el funcionamiento del canal. Se pueden diferenciar las siguientes clases de mutaciones 34 (Figura 6): - Mutaciones de clase I: Afectan a la síntesis de la proteína. Se incluyen mutaciones sin sentido que generan un codón de parada prematuro produciendo un mRNA de un tamaño menor. También se puede deber a mutaciones que afectan a la zona de empalme de exones provocando un splicing defectuoso. Esto provoca una disminución acentuada o directamente una ausencia completa de CFTR en la membrana plasmática. - Mutaciones de clase II: Causan defectos en el plegamiento de la proteína. La proteína queda retenida en el ER produciéndose una degradación prematura sin llegar a darse el tráfico celular hacia la membrana. Dentro de esta clase encontramos la mutación predominante a nivel global (Phe508del) y que está presente en el 85% de las personas con FQ. - Mutaciones de clase III: Se producen defectos en la regulación de la apertura del canal observándose una disminución en la probabilidad de apertura. En este caso, sí que se producen proteínas que maduran completamente y que llegan a la membrana, pero con un funcionamiento alterado. - Mutaciones de clase IV: Se caracterizan por una disminución en la conductancia. El flujo de Cl- y bicarbonato se encuentra significativamente reducido. Se debe a mutaciones que afectan al poro del canal concretamente. 15 - Mutaciones de clase V: En este caso la proteína presenta características normales pero la cantidad que hay es mucho menor. Se engloban en esta clase algunas mutaciones que afectan al promotor o que generan un splicing anormal. -Mutaciones de clase VI: Se genera una inestabilidad en la proteína debido a una reducción en el tiempo que dura en la membrana, ya que se ve potenciado el proceso de endocitosis y no se lleva a cabo un correcto reciclaje. Las mutaciones de clase I-III se han relacionado con una mayor severidad de la enfermedad mientras que la IV-VI con una más leve. La gravedad con la que se manifiesta la enfermedad vendrá determinada tanto por el tipo de mutación que se presente, por la presencia de otros genes alterados, y por el ambiente y estatus socioeconómico. Habría que destacar que esta clasificación restrictiva en la que una mutación debe ser incluida en una clase presenta ciertas limitaciones. Algunas mutaciones no encajan del todo en una clase, ya que presentan varias alteraciones por lo que hay una clasificación alternativa en la que existen 31 clases de mutaciones formadas por las VI clásicas y por 26 que son combinaciones de estas 35 Figura 6. Mutaciones del CFTR y su consecuencia molecular. Las diferentes mutaciones que pueden afectar al CFTR se pueden agrupar en diferentes clases según la repercusión funcional: no se da síntesis de proteína (clase I); hay defectos en el plegamiento y se da una degradación prematura (clase II); no se da una correcta regulación de la apertura del canal (clase III); la conductancia del canal se ve alterada (clase IV); se reduce la cantidad de CFTR (clase V); se obtiene una proteína inestable que sufre una mayor endocitosis (clase VI). Fuente: Adaptado del trabajo de Rowe y Hoover 9. 16 4.1.1 Características del Phe508del Como ya se ha comentado, la mutación más abundante es la conocida como Phe508del. Esta mutación implica la delección de tres bases en el gen CFTR, lo que resulta en la ausencia de una fenilalanina en la posición 508 de la proteína. Esta fenilalanina forma parte del dominio NBD1, y su ausencia provoca alteraciones en las interacciones de este con otros dominios de la proteína. En concreto, en el canal normal, el NBD1 interacciona con el bucle intracelular ICL4 (ubicado en el dominio MSD2), lo que permite que se llegue a la proteína funcional. Sin embargo, debido a esta desestabilización en el NBD1, el plegamiento del CFTR se ve afectado, lo que resulta en la retención en el ER y afecta al tráfico celular (ER-Golgi-Membrana plasmática apical) normal 12,14. Al comparar la estructura del CFTR mutante con el normal mediante estudios de cristalografía y dinámica molecular, se ha observado que solo hay diferencias estructurales mínimas, pero son las regiones móviles como en NBD1 con la fenilalanina afectada las que se ven comprometidas. La eficiencia en el plegamiento se reduce drásticamente en el mutante, llegando a valores de solo el 0,4%, lo que es reconocido por la maquinaria de control de calidad del ER. El polipéptido puede ser marcado por ubiquitinación para su posterior degradación co-traduccinalmente por las chaperonas Hsp70 (forman el primer punto de control del ER) o una vez ya sintetizado por completo. La calnexina también puede detectar alteraciones en el plegamiento a través de glicosilaciones características, lo que lleva a la introducción de estas proteínas en la vía del proteasoma. Otro fallo que se encuentra en este mutante está relacionado con la señal de exportación presente en el NBD1 que como ya se comentó, está formada por dos aminoácidos ácidos que facilitan el transporte hacia Golgi por interacción con COPII. Sin embargo, debido a la mutación, esta señal de exportación puede estar enmascarada, lo que podría explicar la retención del CFTR en el ER 12,14. Debido a estos fallos se produce una acumulación de la proteína en el ER y una saturación del proteasoma, lo que desencadena un proceso conocido como respuesta a proteínas mal plegadas (UPR). Como respuesta a este estrés, se produce un aumento en la transcripción de chaperonas y proteínas antioxidantes, y se inhibe la transcripción de genes que codifican proteínas que se traslocan al ER. La inflamación, que es típica en personas con FQ y que se discutirá más adelante, también participa en el desencadenamiento de esta respuesta por lo que se ve aún más potenciada 36 17 Por lo tanto, considerando que en este mutante se da una ausencia de CFTR funcional en le membrana debido a fallos en el plegamiento, se podría incluir dentro de las mutaciones de clase II. Sin embargo, también se observa un defecto en la apertura y cierre del canal que consigue llegar a la membrana (característica de la clase III), además de presentar una estabilidad reducida por la glicosilación alterada, lo que provoca un aumento en la endocitosis del canal (característico de la clase VI). Este caso ejemplifica claramente que una clasificación restrictiva no se adapta completamente a todas las mutaciones 37. 4.2 Manifestaciones clínicas y órganos afectados El fenotipo de la FQ se caracteriza por la pérdida progresiva de la función pulmonar, lo cual es la principal causa de muerte, junto con otras complicaciones como la insuficiencia pancreática, malabsorción intestinal, sudor excesivamente salado, entre otras (Figura 7). Debido a la amplia variedad de mutaciones que pueden ocurrir, existe una gran diversidad de síntomas, lo que determina la gravedad de la enfermedad. Además, puede haber enfermos que sean heterocigotos, es decir, que presenten dos alelos defectuosos pero cada uno con una mutación distinta que junto con la influencia de otros genes y del ambiente amplía aún más la diversidad sintomatológica 1. A continuación, se describen los principales desórdenes que presentan las personas con FQ lo que no quiere decir que todos los pacientes experimenten todos los trastornos que se mencionarán. Figura 7. Principales manifestaciones clínicas que presentes en las personas con fibrosis quística. La afectación pulmonar es la principal causa de muerte entre los pacientes, pero también se ven afectados otros órganos. Fuente: Elaboración propia 18 4.2.1 Afectación en la fisiología del tracto respiratorio Los pacientes con FQ presentarán concentraciones intracelulares elevadas de Cl- y Na+, lo que provoca una absorción pasiva de agua tanto por vía paracelular como mediante las acuaporinas. Este movimiento de agua conlleva una deshidratación del ASL haciendo que el moco sea más espeso y se vea comprometido el movimiento ciliar. Como resultado, la eliminación inadecuada de los microorganismos, debido a este moco anómalo, conduce a infecciones respiratorias recurrentes y a una tos crónica 22. Se estima que un 33% de los niños en edad preescolar padecen bronquiectasia, una dilatación permanente de las vías respiratorias causada por los ciclos de infección e inflamación que deterioran el tejido epitelial haciendo que las paredes se distiendan con facilidad 1. Las infecciones más comunes en las vías respiratorias son causadas por bacterias de las especies P.aeruginosa, Staphylococcus aureus y hongos del género Aspergillus . La infección por P.aeruginosa se relaciona con un aumento en la mortalidad y un rápido deterioro de la función pulmonar. Para evitar la infección cruzada entre personas con FQ se suele recomendar evitar el contacto entre enfermos. Sin embargo, estas bacterias suelen ser inofensivas para las personas sanas, por lo que en principio no se correría este riesgo de infección. Además, debido a que la secreción de bicarbonato también se ve disminuida provocando un ambiente más ácido, el sistema inmune se ve comprometido llevando a cabo una defensa frente a las bacterias menos efectiva 38. El bicarbonato presente en la superficie epitelial desempeña un papel crucial a la hora de quelar los iones calcio que rodean los agregados masivos de mucina secretados, permitiendo así la expansión de las mucinas que les confiere un estado viscoelástico compatible con un aclaramiento mucociliar fisiológico. Por lo tanto, como en la FQ hay una disminución en las concentraciones de bicarbonato, este proceso se ve alterado, dando lugar a una secreción demasiado viscosa que se adhiere en exceso al tracto respiratorio, dificultando la movilización del moco 39. Otro proceso en el que el bicarbonato está implicado es la estimulación de la adenilato ciclasa soluble. Esta enzima cataliza la conversión de ATP a AMPc, el cual actúa como segundo mensajero en una infinidad de procesos, incluyendo la estimulación de la expresión del CFTR, como se mencionó en el apartado de biosíntesis, y en el movimiento ciliar. Por lo tanto, en la CF, se produce una desregulación en el sistema de control de la 19 expresión del CFTR y no habrá un movimiento ciliar correcto debido a la disminución en niveles de AMPc causada por falta de estimulación del bicarbonato 23. La disminución del pH en el ASL también tiene un impacto en el ENaC. Este fenómeno se atribuye a la interacción de una proteína denominada SPLUNC1 con el canal, lo que conduce a su internalización y, por lo tanto, a una reducción de su función. En un entorno ácido, esta proteína no puede desempeñar adecuadamente su función, lo que resulta en que esta regulación negativa no se lleva a cabo y hay un aumento en la reabsorción de sodio y, como consecuencia, en la retención de agua, lo que provoca una deshidratación de la ASL 2,23. Durante mucho tiempo ha sido objeto de debate si la infección es previa a la inflamación del tracto respiratorio, una característica distintiva en la CF, o si esta inflamación se debe a un defecto intrínseco del CFTR. La susceptibilidad a la infección se limita únicamente a las vías respiratorias y no en todo el organismo, lo que sugiere que no hay un defecto genérico en el sistema inmunológico, sino que está localizado en el aparato respiratorio. Se ha llegado a la conclusión de que el fenómeno inicial radica en el defecto en el aclaramiento mucociliar de las vías, lo que finalmente conduce a la inflamación y daños en estas estructuras, debido a una eliminación defectuosa de los patógenos 20. A continuación, se mencionan las diferentes causas asociadas al desarrollo de una inflamación descontrolada: - El reclutamiento continuo y la migración de neutrófilos hacia las vías respiratorias con el fin de combatir las infecciones resulta en un claro aumento de los niveles de elastasa leucocitaria humana (HLE). Su función es remodelar los tejidos y atacar a los patógenos, estando regulada de manera natural por inhibidores como la α-1 antitripsina para controlar su actividad. En la FQ estos inhibidores no se producen en la cantidad adecuada para contrarrestar el efecto de los altos niveles de HLE provocando daños en el tejido. Además, la HLE impide que ocurra una respuesta inmunológica adecuada, ya que se une a inmunoglobulinas y proteínas del complemento dificultando la opsonización y a receptores de macrófagos, comprometiendo así la fagocitosis 40. - Existe un aumento en la generación de especie reactivas de oxígeno (ROS) por parte de los neutrófilos y una disminución en antioxidantes, como el glutatión o el tiocianato, que, como ya se comentó, son transportados al lumen de las vías respiratorias por el CFTR. Además, también se ha observado una disfunción en las mitocondrias de las células 20 epiteliales en esta localización, lo que resulta en una menor producción de energía y un aumento en la generación de ROS 30. - El perfil lipídico se ve claramente alterado en la FQ ya que, como se explicará en los siguientes apartados, no se produce una correcta absorción de las grasas en el intestino delgado debido a una disminución en la secreción de enzimas pancreáticas. Esto resulta en niveles desequilibrados de ácidos grasos esenciales de la serie omega-3, como el ácido docosahexaenoico (DHA) o el ácido eicosapentaenoico (EPA), en favor de ácidos grasos de la serie omega-6, como el ácido araquidónico (AA). Los primeros son precursores de prostaglandinas antiiflamatorias mientras que el AA lo es de prostaglandinas proinflamatorias 20. 4.2.2 Afectación en la fisiología del páncreas Aproximadamente el 85% de los bebés que nacen con FQ presentan insuficiencia pancreática (IP), lo que implica una reducción en la función del páncreas de aproximadamente el 80-90%. Sin embargo, el porcentaje de adultos que presentan IP es mucho menor debido a la implementación de las medidas adecuadas, que se detallarán en el apartado de tratamiento 9. La prevalencia de IP está influenciada por el tipo de mutación presente, ya que las personas con mutaciones de clase I-III y VI presentarán una IP grave en comparación con aquellas con mutaciones de clase IV y V, que pueden tener una IP leve o no presentarla en absoluto 1. La secreción de bicarbonato se ve disminuida debido a la afectación del CFTR, ya que no se produce la regulación positiva hacia el transportador SLC26A ni la secreción de bicarbonato a través del propio CFTR, tal como se explicó anteriormente. Además, se produce una mayor acumulación de moco con unas mucinas más compactas, similar a lo que ocurre en las vías respiratorias, lo que promueve la obstrucción de los conductos pancreáticos. Como resultado, se dificulta la neutralización del ácido gástrico, además de darse una activación prematura de las enzimas pancreáticas, lo que conduce a la destrucción del tejido pancreático. Esto dificulta la digestión de grasas y proteínas, sobre todo, y dificulta su absorción, lo que lleva a un crecimiento alterado y unas necesidades energéticas superiores para compensar la falta de absorción de nutrientes. Además, la falta de grasas afecta la absorción de vitaminas liposolubles, lo que es característico en las personas con CF, quienes presentan deficiencias de estas vitaminas 2,30. 21 Además de las complicaciones en el páncreas exocrino, la función endocrina también se ve afectada. Se observa que hay una disminución en el número de células productoras de insulina, probablemente debido al aumento en la viscosidad de las secreciones exocrinas, que no solo afecta a los ductos donde se transporta, sino que la activación prematura de estas enzimas también puede afectar a estas células adyacentes provocando su destrucción y sustitución por quistes de tejido conjuntivo 41. Como resultado, los individuos con FQ presentarán desórdenes en el metabolismo de la glucosa pudiendo llegar a desarrollar diabetes asociada a la FQ, aproximadamente en un 35% de los adultos 1. 4.2.3 Afectación en la fisiología de la glándula sudorípara Aunque la secreción mediada por la vía colinérgica (a través del transportador NKCC1) es prácticamente igual en personas sanas que en aquellas con CF, se evidencia una clara disminución de le secreción regulada por la vía adrenérgica, la cual está mediada por el CFTR. Además, no se lleva a cabo correctamente la reabsorción de NaCl en el conducto excretor. Como consecuencia, se produce una pérdida excesiva de sales en el sudor, siendo una manifestación clínica que se puede cuantificar fácilmente como se explicará más adelante en el diagnóstico de la enfermedad 26. Bajo condiciones normales, no representa un gran problema, aunque en ambientes excesivamente calurosos o húmedos se produzca una pérdida excesiva de sales y agua, lo que puede llevar a la deshidratación 2. Los niños son especialmente susceptibles a la deshidratación, sobre todo cuando también presentan vómitos o diarrea por otras causas, lo que puede resultar en una situación de alcalosis hipoclorémica o hiponatremia, es decir, baja concentración de cloro y sodio respectivamente en el plasma sanguíneo 9. Además, puede haber una disminución en las moléculas con función antimicrobiana en el sudor, lo que puede provocar infecciones en la piel y dermatitis atópica 2. 4.2.4 Afectación en otros órganos y tejidos El íleo meconial en los bebés recién nacidos es un signo que sugiere un rápido diagnóstico de FQ. El término “meconio” se refiere a la primera evacuación del bebé. Cuando se produce una obstrucción en el intestino delgado debido a un contenido excesivamente espeso que impide una expulsión adecuada, se diagnostica el íleo meconial, el cual puede afectar hasta al 10% de los recién nacidos. Por otro lado, el síndrome de obstrucción distal del intestino delgado es el equivalente al íleo de meconio en adultos (afecta al 15-20% de los pacientes), y se caracteriza por estreñimiento y dolor abdominal 42. También se ha 22 observado que en la FQ se da una disbiosis, es decir, una alteración en la microbiota intestinal debido a alteraciones en el CFTR, junto con el efecto del uso recurrente de antibióticos para tratar las infecciones pulmonares. Esto resulta en un crecimiento excesivo de ciertas poblaciones bacterianas del intestino y una disminución en la cantidad de bacterias productoras de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) que poseen propiedades inmunomoduladoras. Además, esta disbiosis altera la permeabilidad intestinal y afecta a la absorción de nutrientes 43. En el hígado, los conductos que transportan la bilis experimentan un deterioro y obstrucción, lo cual se agrava con el tiempo siendo una complicación clínicamente relevante y que llega a afectar a un 5-10% del total de enfermos. Esta sintomatología se desarrolla debido a un aumento en la viscosidad y disminución del flujo biliar que provocará en última instancia la cirrosis del hígado. Esto, junto con la disminución en la secreción de enzimas pancreáticas, dificultará la absorción de grasas. 44. El aparato reproductor masculino se ve gravemente afectado en la FQ. Se estima que aproximadamente el 95-98% de los hombres nace sin conductos deferentes, los cuales son los conductos encargados de conectar el epidídimo con la uretra para el transporte del esperma, siendo esto la principal causa de la infertilidad en estos casos 45. Por otro lado, en las mujeres se estima que la infertilidad afecta al 20% debido a la presencia de un moco cervical demasiado espeso y pegajoso que dificulta el correcto desplazamiento de los espermatozoides 9. Por último, pero no por ello menos importante, es evidente que la salud mental se ve significativamente afectada en las personas con FQ. Esta enfermedad crónica, caracterizada por una esperanza de vida limitada, requiere de una gran inversión de tiempo para realizar todos los tratamientos necesarios. Como resultado de esta realidad, la ansiedad y la depresión afecta entorno al 25-30% de esta población. Es importante destacar que un estado mental negativo puede tener consecuencias graves en la progresión de la enfermedad, por lo que el apoyo psicológico resulta de vital importancia 46. 4.3 Genes que modifican el fenotipo Es importante reconocer que la gravedad de la enfermedad no se ve determinada exclusivamente por el CFTR, sino que están involucrados otros genes que influyen en el desarrollo y progresión de la enfermedad. Entre estos genes, podemos destacar otras proteínas transmembrana cercanas al CFTR que se han visto relacionadas con el 23 desarrollo del íleo meconial como el SLC6A14 que codifica para un transportador de aminoácidos neutros y catiónicos dependiente de Na+ y Cl-. Éste también se ha relacionado con la propensión a desarrollar infección por Pseudomonas aeruginosa y, por tanto, provocar la afectación de la función pulmonar. En estudios con gemelos se ha llegado a la conclusión de que la heredabilidad del daño pulmonar es del 50% no siendo el CFTR el principal causante, sino que se ha relacionado con otros genes como la glutatión-S-transferasa, la lectina de unión a manosa, la óxido nítrico sintasa y el antígeno leucocitario humano de clase II. Por lo tanto, para tener una visión global de la FQ no sólo hay que centrarse en el CFTR, sino que se deben tener en cuenta todos los posibles genes modificadores y el efecto del ambiente como puede ser la exposición a toxinas o variaciones en los tratamientos 20. 5. Diagnóstico y seguimiento de la enfermedad 5.1 Cribado neonatal y diagnóstico de la enfermedad El cribado neonatal es un programa de detección temprana de enfermedades en recién nacidos que está implementado numerosos países, incluido España. Este programa, comúnmente conocido como “prueba del talón”, consiste en la obtención de una muestra de sangre del recién nacido en las primeras 48-72 horas después del nacimiento, con el propósito de identificar diversas enfermedades tales como la fenilcetonuria, el hipotiroidismo congénito o la FQ. En el contexto específico de la FQ, se lleva a cabo una detección mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) del tripsinógeno inmunorreactivo (IRT) presente en la muestra. El tripsinógeno, una enzima sintetizada por el páncreas, es un marcador de la función pancreática, ya que su elevación en el plasma sanguíneo puede ser causa de una obstrucción de los ductos pancreáticos tal y como ya hemos comentado sugiriendo el diagnóstico de FQ. Una concentración elevada de IRT no es específico de FQ, ya que hay otras patologías como la pancreatitis aguda o la obstrucción de los ductos por otras causas. Por lo tanto, serán necesarias otras pruebas para el diagnóstico definitivo 38. El incremento de la concentración de sales en el sudor ha sido relacionado con la FQ desde la antigüedad, a pesar de que la causa subyacente de este fenómeno no se conocía. En 1959, se desarrolló la prueba de sudor por iontoforesis de policarpina, la cual continúa siendo el método de referencia para el diagnóstico de FQ 22. Esta prueba, que se realiza tanto en pacientes con un cribado neonatal positivo como en los casos en los que hay 30 37. Bareil, C. & Bergougnoux, A. CFTR gene variants, epidemiology and molecular pathology. Arch Pediatr 27 Suppl 1, eS8–eS12 (2020). 38. Ratjen, F. et al. Cystic fibrosis. Nat Rev Dis Primers 1, 15010 (2015). 39. Morrison, C. B., Markovetz, M. R. & Ehre, C. Mucus, Mucins and Cystic Fibrosis. Pediatr Pulmonol 54, S84 (2019). 40. Voynow, J. A. & Shinbashi, M. Neutrophil Elastase and Chronic Lung Disease. Biomolecules 11, (2021). 41. Prentice, B. J. et al. Cystic fibrosis-related diabetes and lung disease: an update. Eur Respir Rev 30, (2021). 42. 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