Celulosoma: Implicaciones en la biorrefinería del futuro

TRABAJO FIN DE GRADO CELULOSOMA: IMPLICACIONES EN LA BIORREFINERÍA DEL FUTURO AUTOR: ALEJANDRA DE LOS SANTOS BACARIZA FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA, 2016 2 TRABAJO FIN DE GRADO GRADO EN FARMACIA CELULOSOMA: IMPLICACIONES EN LA BIORREFINERÍA DEL FUTURO AUTOR: ALEJANDRA DE LOS SANTOS BACARIZA PROFESOR: Dr. JUAN DIONISIO BAUTISTA PALOMAS FACULTAD DE FARMACIA, 7 JULIO 2016 DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR UNIVERSIDAD DE SEVILLA TRABAJO BIBLIOGRÁFICO 3 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………………..………5 2. METODOLOGÍA………………………………………………………………………………………………………7 3. ANÁLISIS DEL ESTADO DEL ARTE……………………….…………………….…………………………….9 3.1. DESCRIPCIÓN MATERIAL LIGNOCELULÓSICO………………….….…………………………..9 3.1.1. CELULOSA, HEMICELULOSA Y LIGNINA………..……………………………………….9 3.1.2. DEGRADACIÓN DE LA CELULOSA………..………………………………………………11 3.1.2.1. CELULASAS EXTRACELULARES…………………………………………………12 3.1.2.2. CELULOSOMA……………………………………………………………………..…..13 3.1.3. ETAPAS DE LA CONVERSIÓN DEL MATERIAL LIGNOCELULÓSICO……….15 3.1.3.1. PRETRATAMIENTO………………………………………………………….……...16 3.1.3.2. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA……………………………………………….………..19 3.1.3.3. FERMENTACIÓN………………………………………………………….…………..20 4. ÚLTIMAS TENDENCIAS…………………………………………………………….…………………………..20 4.1. ABORDAJES LLEVADOS A CABO A FECHA 2015…………………..………………………..20 4.1.1.1. HIDRÓLISIS Y FERMENTACIÓN SEPARADAS (HFS)…………………..20 4.1.1.2. SACARIFICACIÓN Y FERMENTACIÓN SIMULTÁNEAS (SFS)………21 4.1.1.3. SACARIFICACIÓN Y COFERMENTACIÓN SIMULTÁNEAS (SCFS)..21 4.1.1.4. BIOPROCESAMIENTO CONSOLIDADO (BPC)……………………….…..21 4.2. ¿QUÉ SE ESTÁ INTENTANDO HACER PARA MEJORAR?....................................23 4.2.1. APROVECHAMIENTO DE LOS SUSTRATOS…………………………………..………23 4.2.2. AVANCES EN BPC……………………………………………………………………..…………24 4.2.3. CELULOSOMAS DE DISEÑO…………………………………………………………………24 4.2.4. CÓCTELES ENZIMÁTICOS……………………………………………………..……………..25 4.2.5. DISEÑO RACIONAL DE CELULASAS…………………………………….……………….26 4.2.6. EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE GENES DE CELULOSAS DE LEVADURAS..27 4.2.7. EVOLUCIÓN DIRIGIDA…………………………………………………………………………27 4.2.8. METAGENÓMICA………………………………………………………………………………..28 5. CONCLUSIONES……………………………………………………………………………………………………29 6. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………..……………………………………30 4 RESUMEN El bioetanol se clasifica en tres tipos de acuerdo con la biomasa utilizada. De primera generación, a partir de caña de azúcar o de almidón. Presenta la desventaja de competir con el uso de éstos como alimentos y por las tierras de cultivo. De segunda generación, a partir de biomasa lignocelulósica. Tiene la desventaja de requerir pretratamiento. De tercera generación, a partir de macro algas. Aún está en fase experimental, por lo que no son aplicables en escala industrial hasta el momento, además de no ser rentable. En el presente trabajo nos centraremos en la síntesis de bioetanol de segunda generación, exponiendo pues los distintos pretratamientos existentes, con sus ventajas y desventajas, y los nuevos abordajes que en un futuro próximo estarán en el mercado, con el fin de optimizar este proceso tanto en rendimiento como en coste. PALABRAS CLAVE: celulosoma, material lignocelulósico, bioetanol, lignocelulosa, pretratamiento. ABSTRACT Bioethanol is classified into three types according to the biomass used. First generation from sugar cane or starch. It has the disadvantage of competing with the use of these as food and farmland. Second generation from lignocellulosic biomass. It has the disadvantage of requiring pretreatment. Third generation, from macro algae. It is still experimental, so they are not applicable on an industrial scale so far, besides not being profitable. In this paper we focus on the synthesis of second generation bioethanol, exposing for the various existing pretreatments, with its advantages and disadvantages and new approaches in the near future will be on the market in order to optimize this process both performance and cost. KEYWORDS: celullosome, lignocellulosic material, bioethanol, lignocellulose, pretreatments. 5 1. INTRODUCCIÓN Podríamos decir que la preocupación por el medio ambiente y el cambio climático global se han convertido en un tema de actualidad a nivel internacional. Los factores económicos y geopolíticos como la demanda mundial de energía con fuentes de petróleo, su alto precio y la inestabilidad de la oferta, han jugado un gran papel en la reactivación del interés en los recursos renovables. Figura 1. Podemos observar cómo algunos países ya han alcanzado el máximo de su generación de petróleo, los cuales son preocupantes datos e incitan a una conciliación inminente (gráfico tomado de Cortés Sordo, 2013). El material lignocelulósico es el más abundante de los recursos renovables disponibles en la Tierra. Otro punto que hace que despierte el interés es el hecho de que sea la única fuente energética primaria interna, sostenible y renovable para la producción de combustibles líquidos para el transporte. Es por ello que sea la materia prima más atractiva para la producción de biofuels de segunda generación. La tecnología actual del proceso implica tres operaciones unitarias: pretratamiento del material lignocelulósico, hidrólisis enzimática y fermentación de los azúcares hasta biofuels. Por tanto el esquema a seguir es el siguiente: MATERIAL LIGNOCELULÓSICO AZÚCARES FERMENTABLES BIOFUELS 6 Analizando la bibliografía existente, uno observa que en la conversión de material lignocelulósico en azúcares fermentables se obtiene un insignificante rendimiento, por lo que no es económicamente viable. Sólo el pretratamiento del material lignocelulósico representa un 40% del coste total de todo el proceso. Diversas son las causas de este problema: 1. Compleja degradación por parte de los sistemas celulolíticos del polímero celulosa por la presencia de fibras cristalinas con enlaces de hidrógeno. 2. Poco conocimiento de estos sistemas implicados en el proceso de bioconversión del material lignocelulósico en azúcares fermentables. 3. Mal aprovechamiento del material lignocelulósico utilizado. 4. Variabilidad del proceso en los diversos microorganismos, y en las diversas estaciones del año. 5. Naturaleza heterogénea y recalcitrante de los residuos de celulosa. Entre las alternativas propuestas para hacer esta línea de resolución rentable encontramos: 1. Aumento de la eficiencia hidrolítica del material lignocelulósico en azúcares fermentables por la vía enzimática, ya que en comparación con la hidrólisis química parece que ofrece un mayor alcance para el avance en el futuro. 2. Reutilización de subproductos generados en la hidrólisis en biomateriales de alto valor añadido: nanocelulosa. La aparición del nuevo concepto "celulosoma", complejo multienzimático formado por varios tipos de celulasas que actúan sinérgicamente para catalizar la hidrólisis de la celulosa, se ha apuntado como una posible vía para solucionar este problema. Es por ello que éste va a ser nuestro objeto de estudio. Este complejo lo podemos encontrar en bacterias anaeróbicas tales como Clostridium. Existe evidencia de que la acción sinérgica de las enzimas celulosomales da lugar a una mayor eficiencia en la degradación de nuestro sustrato. Además este microorganismo ofrece la ventaja de que se puede combinar la producción de celulasas, la hidrólisis y la fermentación en un único biorreactor, es decir permite la sacarificación y fermentación simultánea. A este proceso se le denomina bioprocesamiento consolidado (BPC). 7 En el presente trabajo pretendemos revisar el estado del arte de los procedimientos seguidos para aumentar la eficiencia hidrolítica del material lignocelulósico. Figura 2. Estructura de la biomasa lignocelulósica (tomada de Castro-Martínez, 2009). 2. METODOLOGÍA Ha consistido en la búsqueda bibliográfica en distintas bases de datos utilizando los siguientes perfiles de búsqueda. Tabla 1. Relación de las bases de datos utilizadas con las palabras claves. SCIENCEDIRECT PUBMED Cellulosome & lignocellulosic 15 20 Cellulosome & biofuels 11 28 8 Figura 3. Diagrama de Venn relacionando las palabras claves utilizadas. Tabla 2. Relación de los artículos distribuidos en los diferentes años en la base de datos ScienceDirect. SCIENCEDIRECT Cellulosome & lignocellulosic Cellulosome & biofuels 2000-2005 2 0 2006-2010 7 6 2011-2015 5 5 2016 to present 1 0 TOTAL 15 11 Tabla 3. Relación de los artículos distribuidos en los diferentes años en la base de datos PUMBED. PUMBED Cellulosome & lignocellulosic Cellulosome & biofuels 2000-2005 2 0 2006-2010 6 6 2011-2015 14 23 2016 TO PRESENT 3 4 TOTAL 25 33 9 3. ANÁLISIS DEL ESTADO DEL ARTE A continuación se procede a la exposición de algunos conceptos necesarios para comprender el tema a tratar, y posteriormente haremos un despliegue de lo que se está llevando a cabo actualmente y lo que se pretende realizar en un futuro próximo. 3.1. DESCRIPCIÓN MATERIAL LIGNOCELULÓSICO 3.1.1. CELULOSA HEMICELULOSA Y LIGNINA La lignocelulosa es el principal componente de la pared celular de las plantas. Es producida mediante la fotosíntesis, y se ha convertido en la fuente de carbono renovable más prometedora para solucionar los problemas actuales de energía y materias primas (Álvarez-Castillo y cols., 2012). Se compone de celulosa, hemicelulosa y lignina. La celulosa es un polímero de D-glucosa unida por enlaces glucosídicos β-1,4, que se estructuran en largas cadenas lineales unidas mediante puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals intramoleculares. Todo ello forma una estructura cristalina resistente a la hidrólisis y una región amorfa susceptible a la degradación enzimática. Figura 4. Estructura química de la cadena de celulosa (tomada de Tomás Pejo, 2009). La hemicelulosa es un polímero complejo de heteropolisacáridos formado por pentosas (D-xilosa y L-arabinosa) y hexosas (D-glucosa, D-manosa y D-galactosa) que forman cadenas ramificadas mediante uniones β-1,4 y ocasionalmente β-1,3. 16 CONCENTRADOS DILUIDOS Necesidad grandes cantidades. Recuperación costosa. Necesaria neutralización antes de la fermentación. Efectos corrosivos. Requieren altas temperaturas. Mayor corrosión de los equipos. Mayor degradación de los azúcares hemicelulósicos. Se observa claramente que el proceso no es rentable económicamente y por tanto la opción de hidrólisis enzimática es más prometedora. La HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA consta de las siguientes etapas, descritas a continuación. Figura 11. Esquema del proceso de hidrólisis enzimático (tomado de Tomás Pejo, 2009). 3.1.3.1. PRETRATAMIENTO El objetivo del pretratamiento es mejorar la accesibilidad de las enzimas a la celulosa, disociando el revestimiento que la lignina y la hemicelulosa forman alrededor de ésta. Al remover la lignina y hemicelulosa reducimos la cristalinidad de la celulosa e incrementamos la porosidad del material, mejorando así la liberación de los azúcares, 17 evitando la degradación o pérdida de carbohidratos y la formación de compuestos inhibitorios para la posterior fermentación. Como hemos mencionado antes el pretratamiento representa aproximadamente un 40% del coste total del proceso de bioconversión, de ahí la necesidad de desarrollar tecnologías eficientes que reduzcan este alto porcentaje. Figura 12. Biomasa antes y después del pretratamiento (tomada de Cortés Sordo, 2013). Citaremos algunos pretratamientos que existen actualmente (ver Tabla 6). 18 Tabla 6. Pretratamientos. PRETRATAMIENTOS FÍSICOS MOLIENDA: utiliza fuerzas de impacto y cizalla para disminuir la cristanilidad de la celulosa. Supone altos costes energéticos y de capital. PRETRATAMIENTOS QUÍMICOS ÁCIDO DILUIDO: mejora significativamente la hidrólisis enzimática. OZONO PERÓXIDOS SOLVENTES ORGÁNICOS PRETRATAMIENTOS BIOLÓGICOS HONGOS: sus principales inconvenientes es que también consumen celulosa y la lentitud con la que llevan a cabo el proceso. PRETRATAMIENTOS FISICO-QUÍMICOS EV: explosión por vapor (más utilizado), para un amplio rango de materias primas. ACL: agua caliente en fase líquida, sometemos la biomasa a agua caliente en estado líquido y alta presión durante un período de tiempo, obteniendo una gran recuperación de azúcares y bajas concentraciones de productos de degradación. AFEX: explosión por vapor con amoniaco, impregnamos la biomasa con amoniaco a alta presión y a temperaturas menores de 100ºC. LI: líquidos iónicos, sales compuestas únicamente por iones que se encuentran en estado líquido a temperatura ambiente. Poseen mayor estabilidad térmica y química respecto a los solventes orgánicos. Al ser un producto barato, el coste de producción es bajo, compensa el escaso rendimiento obtenido. Existen dos tipos (ver Tabla 7) 19 Tabla 7. Tipos de líquidos iónicos. VENTAJAS INCONVENIENTES LÍQUIDO IÓNICO APRÓTICO (AIL) Buen rendimiento en la hidrólisis de celulosa. Poco biodegradable. Alta higroscopicidad. LÍQUIDO IÓNICO PRÓTICO (PIL) Baja toxicidad. Baja higroscopicidad. Bajo coste de producción. Pocos antecedentes en su estudio. Rendimientos insuficientes respecto a algunos AILs. 3.1.3.2. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA Es la etapa limitante del proceso global. VENTAJAS INCONVENIENTES Método amigable con el medio ambiente. Incremento en la accesibilidad al material celulósico. Alto rendimiento del producto. Poca generación de compuestos tóxicos. Mínima demanda de energía. Tolerabilidad de altas temperaturas. Rango amplio de pH. Proceso lento (limita uso industrial). Baja actividad específica de las enzimas. Empleo alto de celulasas. El último inconveniente citado representa una parte significativa en el alto coste del proceso. En la última década se han realizado numerosos estudios para afrontar este problema, que comentaremos en apartados posteriores. 20 3.1.3.3. FERMENTACIÓN Proceso por el que los azúcares liberados en la hidrólisis se transforman en biofuels, generalmente etanol, y CO2. Este proceso sigue la siguiente reacción: El microorganismo habitualmente utilizado es la levadura Saccharomyces cerevisiae, debido a su capacidad de utilizar todo tipo de hexosas y a la producción de etanol con un rendimiento muy cercano al teórico. La principal limitación se presenta cuando se quiere utilizar en la fermentación de azúcares hemicelulósicos, ya que no es capaz de fermentar pentosas como la xilosa. Por esta razón se buscan microorganismos capaces de fermentar tanto pentosas como hexosas, y que también sean capaces de tolerar los posibles tóxicos generados durante el pretratamiento (Tomás Pejo, 2009). 4. ÚLTIMAS TENDENCIAS Comentaremos ahora los diferentes mecanismos utilizados hasta la fecha y los novedosos métodos que, de ser posible, se aplicarán en un futuro muy cercano. 4.1. ABORDAJES LLEVADOS A CABO A FECHA 2015 4.1.1. HIDRÓLISIS Y FERMENTACIÓN SEPARADAS (HFS) Hidrólisis y fermentación de la glucosa realizadas en dos reactores diferentes. VENTAJAS INCONVENIENTES Cada etapa realizada en sus condiciones óptimas de pH y temperatura. Posibilidad de reciclaje de las células. Dos pasos  aumento del coste. Inhibición de las celulasas por el producto final (glucosa). 21 4.1.2. SACARIFICACIÓN Y FERMENTACIÓN SIMULTÁNEAS (SFS) Hidrólisis y fermentación tienen lugar en un mismo reactor, de manera simultánea. VENTAJAS INCONVENIENTES Un solo paso  disminución del coste. Amplia elección de microorganismos eficientes. Empleo de menores concentraciones de enzimas. Se minimiza la inhibición por el producto final, ya que conforme se produce la hidrólisis la glucosa se va transformando a etanol. Necesidad de fijar unas condiciones de temperatura y pH acorde a ambos procesos. Imposibilidad de reciclaje de células. NO fermentación de las pentosas. 4.1.3. SACARIFICACIÓN Y COFERMENTACIÓN SIMULTANEAS (SCFS) Tanto la glucosa como la xilosa están presentes en el medio y son fermentados simultáneamente. VENTAJAS INCONVENIENTES Un solo paso  disminución del coste. Empleo de menores concentraciones de enzimas. Se minimiza la inhibición por producto final. Aprovechamiento de la mayoría de azúcares presentes en la materia prima. Necesidad de fijar unas condiciones de temperatura y pH acorde a ambos procesos. Imposibilidad de reciclaje de células. Microorganismos fermentadores de pentosas poco desarrollados. 4.1.4. BIOPROCESAMIENTO CONSOLIDADO (BPC) Conlleva la combinación de las 4 reacciones biológicas necesarias para la transformación de la lignocelulosa a etanol en un único reactor: 22 1. Producción de las enzimas (celulasas y hemicelulasas). 2. Hidrólisis del material a azúcares. 3. Fermentación de las hexosas. 4. Fermentación de las pentosas. Para la aplicación de dicho proceso se necesita un único microorganismo, o mezcla de éstos, capaces de hidrolizar y fermentar la biomasa pretratada. Entre los microorganismos capaces de degradar la celulosa, las bacterias celulolíticas del género Clostridium han sido las más estudiadas y caracterizadas. Estas bacterias digieren la celulosa mediante el complejo enzimático extracelular llamado celulosoma. Los celulosomas son capaces de hidrolizar tanto la parte amorfa como la parte cristalina de la celulosa. En concreto, Clostridium thermocellum es una bacteria que utiliza la celulosa como única fuente de carbono y lleva a cabo la fermentación produciendo lactato, acetato, etanol, H2 y CO2 (Tomás Pejo, 2009). 𝑪𝒆𝒍𝒖𝒍𝒐𝒔𝒂 → 𝑨𝒄𝒆𝒕𝒂𝒕𝒐 + 𝑳𝒂𝒄𝒕𝒂𝒕𝒐 + 𝑬𝑻𝑨𝑵𝑶𝑳 + 𝑯𝟐+ 𝑪𝑶𝟐 Es el candidato perfecto por su naturaleza anaerobia y su tolerancia a altas temperaturas (termófilo). Su capacidad para hidrolizar y fermentar y dar lugar a productos de valor añadido como es el etanol, además de otros compuestos beneficiosos industriales, lo convierte en un biocatalizador atractivo para la CBP. Además, C.thermocellum presenta las velocidades más altas de hidrólisis de celulosa conocidas hasta el momento. Sin embargo, no es capaz de fermentar la xilosa, por tanto para esta causa utilizamos Clostridium thermosaccharolyticum, permitiendo la cofermentación simultánea de glucosa y xilosa a etanol en un mismo reactor. A pesar de todas las ventajas que implicaría la realización de este tipo de BPC, en la actualidad todavía no existen microorganismos con todas las características requeridas para un eficiente BPC. Sin embargo, existen expectativas de poder superar las limitaciones de los actuales microorganismos mediante dos estrategias, que comentaremos en el apartado siguiente. 23 VENTAJAS INCONVENIENTES ÚNICO REACTOR. No necesaria la adición de enzimas exógenas. Aumento del rendimiento del producto. Corta duración. No existen actualmente microorganismos con todas las características requeridas para un eficiente proceso. Inhibición por productos finales. Incompatibilidad entre la temperatura de hidrólisis y de fermentación. 4.2. ¿QUÉ SE ESTÁ INTENTANDO HACER PARA MEJORAR? 4.2.1. APROVECHAMIENTO DE LOS SUSTRATOS El aprovechamiento máximo de los sustratos es esencial para la mejora del rendimiento y la aceptación por parte de los inversores. La celulosa es uno de los biopolímeros más abundantes del planeta por lo que en las últimas décadas ha cobrado un creciente interés para el desarrollo de proyectos sostenibles basados en la química verde (Álvarez-Castillo y cols., 2012). Esto conduce además de la generación de energía por la obtención de bioetanol a la generación de materiales celulósicos novedosos, para el aprovecho total de este compuesto:  Biomateriales compuestos con fibras de celulosa.  Whiskerías y microfibras de celulosa. Después de la celulosa la lignina es la segunda fuente renovable más abundante que existe en la naturaleza, por lo que se han desarrollado usos alternativos para aprovechar este subproducto:  Una vez seca es vendida a la industria química para ser utilizada como reactivo para productos poliméricos.  Generación de fibras de carbón para la industria de los materiales reforzados. 24 4.2.2. AVANCES EN CBP Las dos estrategias para superar las limitaciones en el CBP son: 1. La manipulación de microorganismos que manifiestan una alta actividad celulolítica con el fin de mejorar su producción de etanol, aumentado los rendimientos o la tolerancia al mismo. 2. La modificación genética de microorganismos que presentan altos rendimientos a etanol, de manera que sean capaces de producir enzimas para hidrolizar la celulosa y hemicelulosa. Dichos avances podrían implicar importantes mejoras en el proceso de producción de bioetanol en un futuro, pero se encuentran todavía en una etapa inicial de investigación. 4.2.3. CELULOSOMAS DE DISEÑO La asociación de celulasas y celulosomas ofrece una mayor actividad hidrolítica. Esta afirmación fue de inspiración para la creación a través de manipulación genética de celulosomas sintéticos utilizando la subunidad 18; complejo de proteínas denominado rosettasome. Este complejo tiene la ventaja de que es capaz de acomodar un mayor número de enzimas en una sola partícula, al contener un módulo de cohesinas fusionado a cada subunidad del rosettasome. Algunas de las características que presentan son:  La posibilidad de unión a los módulos dockerin que contienen endo y exo glucanasas.  EL aumento de la actividad de degradación de celulosa en comparación con las enzimas libres en solución.  El aumento de actividad dependerá de la relación y cantidad de glucanasas unidas.  Son termoestables.  En presencia de ATP/Mg2+ forman estructura de doble anillo. 25 Figura 13. Posible modelo de la rosettasome unida al módulo de cohesina (a y b) y un rosettazyme (c y d) tomado de Mitsuzawa, 2009. Lo que se pretende conseguir con estos celulosomas es que sean capaces de unirse tanto a la celulosa, como a la hemicelulosa y a la lignina. Es decir, disminuir la especificidad del complejo multienzimático por el sustrato. Otra de las características que se requiere es la capacidad para acomodar múltiples cadenas de sustrato de distintas formas y tamaños, por lo que se debe sintetizar un sitio de reconocimiento que se pueda amoldar fácilmente. 4.2.4. CÓCTELES ENZIMÁTICOS Empresas como Genencor y Novozyme están jugando un papel importante en la innovación ofreciendo un cóctel de enzimas para la degradación de la biomasa. Este cóctel se compone de celulasas, hemicelulasas, glucanasas y ligninasas (lacasas). Pero como venimos comentando, también es necesaria aquí la reducción del coste para llevar a cabo este proceso. 32 12. Martínez-Restrepo, Y. M. Selección de hongos filamentosos con potencial para la degradación de lignocelulosa aislados de desechos agroindustriales de café e higuerilla. J. Chem. Inf. Model. 2013; 53(9): 1689–1699. 13. Mitsuzawa, S., Kagawa, H., Li, Y., Chan, S. L., Paavola, C. D., Trent, J. D. The rosettazyme: A synthetic cellulosome. J. Biotechnol. 2009; 143(2): 139–144. Investigación sobre los celulosomas sintéticos, posibles estructuras y aplicaciones. Valoración del aumento del rendimiento. 14. Moraïs S., Himmel, M. E., Bayer, E. A. New Paradigms for Engineering Plant Cell Wall Degrading Enzymes. En: Himmel M. E. Direct Microbial Conversion of Biomass to Advanced Biofuels. 1st ed. Ámsterdam: Elsevier; 2015. p. 129-149 15. Morrison, M., Pope, P. B., Denman, S. E., McSweeney, C. S. Plant biomass degradation by gut microbiomes: more of the same or something new? Curr. Opin. Biotechnol. 2009; 20(3): 358–363. 16. Munir, R. I., Spicer, V., Shamshurin, D., Krokhin, O. V., Wilkins, J., Ramachandran, U., et al. Quantitative proteomic analysis of the cellulolytic system of Clostridium termitidis CT1112 reveals distinct protein expression profiles upon growth on α-cellulose and cellobiose. J. Proteomics. 2015; 125: 41–53. 17. Percival Zhang, Y. H., Himmel, M. E., Mielenz, J. R. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnol. Adv. 2006; 24(5): 452–481. Nuevos avances en el campo de investigación de los sistemas celulolíticos, ventajas y desventajas que nos ofrecen. 33 18. Rubio-Guerri, C., Vicente-Rubiano, M., Sánchez-Vizcaíno, J. M. Metagenómica, la técnica que “descubre” nuevos virus. Universidad Complutense de Madrid, (C). 2010. http://www.colvema.org/WV_descargas/metagenweb- 15022012152421.pdf 19. Hernández-Santoyo, A., García-Hernández, E., Rodríguez-Romero, A. Celulosomas: sistemas multienzimáticos. Rev. Soc. Quim. Mex. 1999; 43(3-4): 137-142. Artículo muy completo en la materia del celulosoma, tratando en profundidad su estructura, componentes y mecanismo de acción. 20. Simões, M. F., Antunes, A., Ottoni, C. A., Amini, M. S., Alam, I., Alzubaidy, H., et al. Soil and Rhizosphere Associated Fungi in Gray Mangroves (Avicennia marina) from the Red Sea - A Metagenomic Approach. Genomics. Proteomics. Bioinformatics. 2015; 13(5): 310–320. 21. Tomás-Pejó, M. Bioetanol De Paja De Trigo: Estrategias De Integración De Las Etapas Del Proceso. Renew. Sust. Ener. Rev. 2009; Madrid, España. Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas (Doctorado). http://eprints.ucm.es/10802/1/T31774.pdf Artículo que aporta gran cantidad de información en lo referente al material lignocelulósico y el proceso de producción del bioetanol de segunda generación. También contiene los distintos pretratamientos más utilizados hasta la fecha. 22. Thomas, L., Joseph, A., Gottumukkala, L. D. Xylanase and cellulase systems of Clostridium sp.: An insight on molecular approaches for strain improvement. Bioresour. Technol. 2014; 158: 343–350. 23. You, C., Zhang, X. Z., Zhang, Y. H. P. Mini-scaffoldin enhanced mini-cellulosome hydrolysis performance on low-accessibility cellulose (Avicel) more than on high-accessibility amorphous cellulose. Biochem. Eng. J. 2012; 63: 57–65. 34 24. http://biosciences.dupont.com/ 25. http://carrionvazquez-lab.org/es/page.cfm?id=19#.V2FD7fmLTNM 26. http://www.efm.leeds.ac.uk/~mark/ISIabbr/E_abrvjt.html 27. http://metagenomics.anl.gov/ 28. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 29. https://www.novozymes.com/en 30. http://www.sciencedirect.com/ 31. http://www.wordreference.com/es/