Estudio fenotópico y genotípico de los aislamientos de streptococcus pneumoniae causantes de enfermedad invasiva en el hospital Virgen del Rocío

Departamento de Microbiología Sección de Biología Molecular UNIVERSIDAD DE SEVILLA “Estudio fenotípico y genotípico de los aislamientos de Streptococcus pneumoniae causantes de enfermedad invasiva en el Hospital Universitario Virgen del Rocío” Tesis que para aspirar al grado de Doctor en Farmacia presenta la Licenciada Doña Patricia Iraurgui Arcarazo. Sevilla, 2012 Departamento de Microbiología Dª. Mª José Torres Sánchez, Profesora Doctora de la Universidad de Sevilla y D. Javier Aznar Martín, Catedrático de Microbiología de la Universidad de Sevilla. CERTIFICA!: que la tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla que lleva por título “Estudio fenotípico y genotípico de los aislamientos de Streptococcus pneumoniae causantes de enfermedad invasiva en el Hospital Universitario Virgen del Rocío” ha sido realizada por Dª. Patricia Iraurgui Arcarazo bajo nuestra supervisión, considerando que reúne los requisitos necesarios para su presentación. Y para que conste donde proceda firmamos el presente certificado en Sevilla a 9 de febrero de 2012. Fdo. Dra. Mª José Torres Sánchez Fdo. Prof Javier Aznar Martín Addendum Artículo aceptado en Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica pendiente de publicar: Iraurgui P, Torres MJ, Aznar J. Molecular Epidemiology of Fluoroquinolone Resistance in Invasive Clinical Isolates of Streptococcus pneumoniae in Seville. Iraurgui P, Torres MJ, Gandia A, Vazquez I, Cabrera EG, Obando I, Garnacho J, Aznar J. Modified sequential multiplex PCR for determining capsular serotypes of invasive pneumococci recovered from Seville. Clin Microbiol Infect. 2010;16:1504–1507. Estudio fenotípico y molecular de las resistencias a fluorquinolonas en Streptococcus pneumoniae. Iraurgi P, Torres M.J y Aznar J. XIV congreso SEIMC. 19-22 mayo 2010, Barcelona. Modified sequential multiplex PCR for determining capsular serotypes of invasive Streptococcus pneumoniae clinical isolates. Iraurgui P, Torres MJ, Cabrera E, Lepe JA, Garnacho J, Obando I, Aznar J. 19th ECCMID. Congreso Europeo de la Sociedad Europea de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas. 16 - 19 May 2009, Helsinki, Finlandia. PCR múltiple secuencial para determinación los serotipos capsulares de Streptococcus pneumoniae. Iraurgui P, De Toro M, Torres MJ, G-Cabrera E, Garnacho J, Ortiz-Leiva C, Lepe JA, Aznar J. XIII Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología clínica (SEIMC). 11-14 de mayo de 2008. Madrid. Agradecimientos Ante todo agradezco al Dr. Javier Aznar la oportunidad brindada para realizar la Tesis Doctoral y poder llevar a cabo este proyecto. Gracias por mostrarme siempre los errores realizados y el camino a seguir con paciencia y conocimiento. Por sus consejos para seguir adelante y por transmitirme el entusiasmo por la ciencia y la microbiología. Gracias a la Dra. María José Torres por sus constantes animos, su serenidad y su comprensión durante todo este tiempo. El saber que estabas ahí lo ha hecho todo mucho más sencillo. Al Dr. Ignacio Obando por facilitarme sus cepas y datos, y compartir su conocimiento. A todo el Servicio de Microbiología del Virgen del Rocío, por haberme mostrado lo bueno y no tan bueno de esta profesión. Por haberme hecho sentir parte de un equipo y hacer que cada día fuera contenta a trabajar y a aprender. A María y a Verónica por haberme prestado su apoyo durante toda mi estancia en Sevilla y haberme acogido y ayudado siempre que me ha hecho falta. A Bernabé, por su paciencia y su apoyo. Por creer en mí y poder compartir y vivir juntos los mismos sueños y aspiraciones. A toda mi familia y amigas, especialmente a mis padres y mi hermana, que sin su apoyo y comprensión incondicional nada hubiera sido posible. Í!DICES Índices II 1. I!TRODUCCIÓ! ......................................................................................................1 1.1. Streptococcus pneumoniae.....................................................................................2 1.1.1 Antecedentes históricos ...................................................................................2 1.1.2. Microbiología.................................................................................................. 3 1.1.3. Estructura........................................................................................................4 1.1.4. Aspectos epidemiológicos e importancia clínica............................................5 1.1.5. Patogénesis de la infección neumocócica.......................................................9 1.1.6. Factores de virulencia...................................................................................10 1.1.7. Resistencias en S. pneumoniae .....................................................................11 1.1.8. Vacunas.........................................................................................................15 2. JUSTIFICACIÓ! E HIPÓTESIS...........................................................................19 3. OBJETIVOS..............................................................................................................22 4. MATERIAL ..............................................................................................................24 4.1. Microorganismos .................................................................................................25 4.1.1. Muestras y aislamientos................................................................................25 4.1.2. Cepa patrón...................................................................................................31 4.2. Productos químicos y biológicos.........................................................................32 4.3. Agentes antimicrobianos......................................................................................34 4.4. Medios de cultivo.................................................................................................34 4.5. Soluciones y tampones.........................................................................................35 4.5.1. Soluciones para electroforesis ......................................................................35 4.5.2. Soluciones para electroforesis en campo pulsado (ECP)..............................35 5. MÉTODOS................................................................................................................39 5.1. Estudio de los datos clínicos................................................................................40 5.2. Procesamiento de las muestras clínicas ...............................................................40 5.3. Pruebas de identificación y sensibilidad..............................................................40 5.4. Estudio de serotipado...........................................................................................44 5.4.1. Técnicas de Biología Molecular para estudio de serotipado ........................44 Índices III 5.4.2. Diferenciación de los serotipos 6A/B/C .......................................................49 5.5. Tipificación molecular.........................................................................................52 5.5.1. Técnica de electroforesis en campo pulsado (ECP) para S. pneumoniae .....52 5.5.2. Análisis de los datos obtenidos por ECP ......................................................57 5.5.3. Estudio clonal mediante multilocus sequence typing (MLST).....................58 5.6. Estudio de resistencia a fluorquinolonas ............................................................. 61 5.6.1. Detección de mutaciones mediante hibridación con sondas.........................62 5.6.2. Secuenciación de los genes QRDR...............................................................63 5.6.3. Estudio del efecto de las bombas de expulsión............................................. 65 6. RESULTADOS .........................................................................................................68 6.1. Características epidemiológicas de los casos de ENI..........................................69 6.2. Características clínicas y evolución.....................................................................72 6.3. Características demográficas ...............................................................................76 6.4. Resultados microbiológicos.................................................................................78 6.4.1. Aislamiento e identificación de los microorganismos..................................78 6.4.2. Estudio de sensibilidad .................................................................................78 6.5. Estudio de serotipado...........................................................................................80 6.5.1. Serotipos obtenidos vs serotipos vacunales..................................................87 6.5.2. Evolución interanual de los serotipos obtenidos...........................................90 6.5.3. Serotipos obtenidos vs patologías.................................................................96 6.5.4. Serotipos obtenidos vs resistencias...............................................................99 6.6. Electroforesis en campo pulsante (ECP) ...........................................................100 6.7. Estudio de resistencias a fluorquinolonas..........................................................111 6.7.1. Estudio fenotípico de la resistencia a fluorquinolonas ...............................111 6.7.2. Estudio molecular de la resistencia a fluorquinolonas................................ 113 6.7.3. Estudio del efecto de las bombas de expulsión...........................................118 7. DISCUSIÓ! ............................................................................................................120 8. CO!CLUSIO!ES ..................................................................................................145 9. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................149 Índices IV Í!DICE DE TABLAS Tabla 1: Cepas invasivas de Sreptococcus pneumoniae por año de aislamiento...........26 Tabla 2: Recomendaciones del Documento M100-S20 del CLSI 2010 para el neumococo.......................................................................................................43 Tabla 3: Serotipos y cebadores utilizados para la PCR múltiple...................................44 Tabla 4: Distribución de serotipos en el esquema propuesto por el CDC y en el esquema modificado en el Hospital Universitario Virgen Del Rocío..............47 Tabla 5: Mezcla de la reacción de serotipado................................................................48 Tabla 6: Cebadores utilizados para la secuenciación del serogrupo 6...........................49 Tabla 7: Cebadores utilizados para serotipado de 6A/6B/6C........................................51 Tabla 8: Mezcla de la reacción de PCR para serotipado de 6A/6B/6C.........................51 Tabla 9: Mezcla de la reacción de PCR para amplificación de los genes “housekeeping”................................................................................................ 60 Tabla 10: Mezcla de la reacción de PCR para la detección de resistencias por hibridación con sondas..................................................................................62 Tabla 11: Oligonucleótidos utilizados para amplificar y secuenciar los genes QRDR. ..........................................................................................................64 Tabla 12: Mezcla de la reacción de PCR para la detección de resistencias en los genes QRDR por secuenciación. ..................................................................64 Tabla 13: Distribución interanual de los aislamientos de Streptococcus pneumoniae..69 Tabla 14: Distribución anual de cepas en adultos y niños, incluidas en el estudio.......71 Tabla 15: Distribución del número de pacientes y cepas en función del cuadro clínico............................................................................................................ 72 Tabla 16: Distribución de los casos de neumonía y empiema entre adultos y niños.....73 Tabla 17: Distribución de los casos en función de la patología diagnosticada y el grupo de adultos o niños...............................................................................74 Tabla 18: Distribución de los neumococos causantes de NAC en función de la muestra en la que se hallaron........................................................................75 Tabla 19: Distribución de los neumococos causantes de meningitis en función de la muestra en la que se aislaron. .......................................................................75 Tabla 20: Distribución de los fallecidos en adultos y niños en función de la patología........................................................................................................76 Índices V Tabla 21: Distribución de los casos entre hombre y mujeres, en niños y en adultos. ...77 Tabla 22: Distribución de muestras incluidas en el estudio. .........................................78 Tabla 23: Sensibilidad acumulada de los aislamientos de S. pneumoniae a los diferentes antibióticos probados. ..................................................................79 Tabla 24: Distribución de los serotipos en cada PCR y los resultados obtenidos de cada serotipo y cada reacción...................................................................85 Tabla 25: Distribución de los serotipos y su cobertura por las diferentes vacunas neumocócicas................................................................................................88 Tabla 26: Resultados de las pruebas de sensibilidad a fluorquinolonas por los diferentes métodos probados. .....................................................................112 Tabla 27: CMI de NFX y LVX de los 14 aislamientos resistentes a NFX..................113 Tabla 28: Resultados de la hibridación reversa con sondas de las cepas resistentes a norfloxacina. ............................................................................................114 Tabla 29: Mutaciones detectadas por secuenciación en los genes parC, parE y gyrA..........................................................................................................115 Tabla 30: MLST de los neumococos resistentes a NFX.............................................. 117 Tabla 31: Características fenotípicas y moleculares de las cepas resistentes a norfloxacina. ...............................................................................................119 Introducción 5 ocasiones, otros componentes, y que tienen actividad antigénica. La cápsula se considera el factor de virulencia más importante y reconocido del neumococo. Hasta hace poco se habían descrito un total de 91 serotipos capsulares que difieren en los azúcares y enlaces de las unidades repetitivas y que son patógenos para el hombre (13). Debido a la reacción cruzada que existe entre algunos serotipos a causa de determinantes antigénicos comunes, se han agrupado en 46 serogrupos. 1.1.4. Aspectos epidemiológicos e importancia clínica La enfermedad neumocócica tiene una gran relevancia socio-sanitaria. En todo el mundo mueren más de cinco millones de niños cada año a causa de la enfermedad neumocócica. S. pneumoniae se considera la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad y su severidad puede ir desde una otitis media o neumonía hasta una septicemia o meningitis. Cuando la bacteria se aísla en otras localizaciones diferentes a secreciones respiratorias como sangre o líquidos biológicos, se considera una infección invasiva. La enfermedad neumocócica invasiva (ENI) en pacientes adultos sigue asociándose a una elevada mortalidad. S. pneumoniae se encuentra en las vías respiratorias altas del 5-10% de los adultos sanos, no obstante, ha habido tasas de portadores superiores al 60% en poblaciones cerradas (14). En los adultos, la colonización y el estado de portador suelen prolongarse de 2 a 4 semanas (15). Los lactantes suelen colonizarse a los 3 o 4 meses con un serotipo concreto y se mantienen así alrededor de 4 meses. La mayor incidencia de colonización se da a los 2 a 3 años, pudiendo alcanzar una tasa de 40-60% (11,16,17). La incidencia también varía porque se ve afectada por los métodos empleados para detectar la bacteria y por la población estudiada (9). La colonización de los lactantes se asocia a la falta de anticuerpos anticapsulares específicos y los serotipos poco antigénicos (18). Las tasas de colonización suelen ser más frecuentes en los niños que asisten a guarderías, en comunidades cerradas y en los meses fríos. La mayor susceptibilidad de las personas ancianas a la enfermedad neumocócica se debe al envejecimiento del sistema inmunitario y la posterior disminución de la producción de anticuerpos (11,19). Introducción 6 Las infecciones neumocócicas ocurren durante toda la vida, pero son más frecuentes en individuos muy jóvenes (< 3 años de edad) y en ancianos (> 65 años) (14). La enfermedad neumocócica aparece cuando los microorganismos que colonizan la nasofaringe u orofaringe se diseminan a localizaciones como el pulmón, los senos paranasales, el oído o las meninges. La bacteriemia puede ocurrir en todas estas infecciones. En los adultos, la enfermedad broncopulmonar subyacente y la inmunidad humoral comprometida predisponen a la enfermedad neumocócica (19). Las personas con asplenia funcional o que han sufrido esplenectomías quirúrgicas también tienen un mayor riesgo de desarrollar una bacteriemia neumocócica invasiva, que puede llegar a ser mortal (20). Debido al daño que causan los virus en los mecanismos de depuración bronquial, las infecciones respiratorias virales también predisponen a la infección neumocócica del aparato respiratorio. Los hemocultivos suelen ser positivos en el 2030% de los pacientes con neumonía neumocócica (11). S. pneumoniae es la causa más frecuente de bacteriemia, sepsis y meningitis bacteriana tanto en niños como en adultos (14). En los adultos, el neumococo representa alrededor de un tercio de las meningitis extrahospitalarias en los Estados Unidos y tiene una mortalidad asociada del 20-25% (21). En niños el neumococo representa el 40-50% de los casos de otitis media aguda (OMA) y se asocia a sinusitis y mastoiditis (22,23). Con el uso de la penicilina han ocurrido dos cambios importantes a nivel mundial. El primero, fue que las epidemias debidas a los serotipos más invasivos, el 1, 2, 3, 5 y 7 eran menos frecuentes, ya que el tratamiento precoz interrumpía la cadena de transmisión y se reducía el número de portadores e infectados (2). El segundo, fue que los serotipos menos virulentos en niños, el 6, 9, 14, 19 y 23, tuvieron mayor éxito como colonizantes y empezaron a reemplazar a los serotipos epidémicos en las infecciones graves (24). Veintitres de los 91 serotipos de neumococo producen enfermedad con más frecuencia que los otros, pudiendo alcanzar el 88% de las bacteriemias y meningitis neumocócicas (14). La edad de los pacientes y la distribución geográfica de los casos también varía. Estas diferencias se deben, al parecer, al incremento de los factores de Introducción 7 virulencia en estos tipos, pero no se han podido aclarar las causas específicas. Estas características no influyen en el tratamiento médico de los casos individuales, pero tienen importancia para idear estrategias de prevención, como las inmunizaciones. La cápsula es el principal factor de virulencia del neumococo. Por tanto, la determinación del serotipo capsular en la enfermedad invasora tiene un doble interés: clínico porque va a condicionar la virulencia y por tanto la presentación clínica, y epidemiológico a la hora de formular y de conocer el impacto de las nuevas vacunas. Clásicamente, el estudio de la distribución de serotipos se realiza mediante el aislamiento y posterior serotipificación de las cepas mediante la reacción de hinchazón capsular de Neufeld (Quellung). El alto coste de los antisueros, la subjetividad en la interpretación de los resultados y la necesidad de experiencia son grandes limitaciones de esta técnica. Pai R. et al (25), basándose en los datos epidemiológicos del programa de vigilancia del CDC, han desarrollado un sistema basado en 7 PCRs múltiples secuenciales de los genes que codifican los diferentes tipos de antígenos capsulares e incluye el gen cps (antígeno capsular común a todos los S. pneumoniae) como control interno. Este sistema permite identificar el 95% de los serotipos más prevalentes en USA, utilizando un equipo básico de amplificación de ADN y de electroforesis. El esquema propuesto por el CDC ha sido utilizado en diferentes países para conocer la distribución de los serotipos capsulares de S. pneumoniae en aislamientos clínicos. En algunos casos este esquema ha sido modificado y adaptado a la prevalencia de los serotipos de cada área geográfica (26,27). En España, entre 1990 y 1996, los diferentes serotipos hallados en función de la edad coincidían con otros estudios. Así, los serogrupos más frecuentes en niños eran el 6, 14, 18, 19 y 23, mientras que en adultos fueron el 3, 8 y 9 (28). Los serogrupos relacionados con la resistencia a penicilina fueron el 6, 9, 14, 19, and 23. Un trabajo realizado en España entre 1990 y 1999 por los mismos autores, donde se estudiaron 3921 cepas aisladas en niños menores de 15 años de los hospitales de todas las Comunidades Autónomas de España, mostró una cobertura de la vacuna heptavalente en aislamientos procedentes de hemocultivos de un 78% (29). Introducción 8 En 2000-2002 los serogrupos invasivos más frecuentes en niños seguían siendo los cinco nombrados anteriormente (6, 14, 18, 19 y 23) más el serotipo 1, mientras que en adultos, los 5 serogrupos más prevalentes entre 2000-2002 fueron el 3, 14, 1, 19 y 4 (8). Según un estudio realizado en Estocolmo, la ENI está causada por 2 grupos clonales diferentes, uno incluye los clones altamente virulentos y el otro incluye los clones que producen ENI debido a su capacidad de colonización y difusión (30). Con respecto a la capacidad el neumococo para producir ENI, se cree que es más importante el serotipo capsular que el genotipo (31). No obstante, los aislamientos del mismo serotipo suelen ser genéticamente más similares que los de otro serotipo. Esto explica que muchos clones del mismo serotipo posean la misma capacidad de producir ENI (30). Aunque vayamos adquiriendo un mayor conocimiento sobre los aspectos básicos de la patogénesis de la enfermedad neumocócica, todavía se desconocen los mecanismos y motivos exactos por los cuales ciertos clones son habitualmente los causantes de ENI. Para la caracterización de los aislamientos bacterianos se han desarrollado métodos tanto fenotípicos como genotípicos, que nos proporcionan una valiosa información para las investigaciones epidemiológicas. Las técnicas de análisis genético como el ribotyping, la electroforesis en campo pulsante (ECP) y el MLST (multilocus sequence typing) han mostrado tener un poder discriminatorio superior al serotipado (32). Entre los métodos de tipado molecular, la ECP ha sido ampliamente utilizada para caracterizar diferentes microorganismos, incluyendo el S. pneumoniae, debido a su alto poder discriminatorio y se considera mejor que otras técnicas de tipado molecular (33-36). La ECP tiene la ventaja de no ser cara y ser altamente reproducible. Suele ser más efectiva para estudios epidemiológicos locales (37,38). Se ha visto que aislamientos de distintos serotipos pueden estar relacionados genéticamente y que aislamientos del mismo serotipo pueden mostrar diferentes patrones de ECP. La ECP puede discriminar aislamientos en función de su serotipo o lugar de infección (32). Introducción 9 La dinámica evolutiva del neumococo hace imprescindible el empleo de técnicas fenotípicas y de la epidemiología molecular para lograr sistemas de vigilancia más completos a nivel nacional como internacional. 1.1.5. Patogénesis de la infección neumocócica La elevada prevalencia de la colonización neumocócica se debe al éxito con el que se adhiere y se multiplica en las células epiteliales de la nasofaringe humana. La colonización nasofaríngea por S. pneumoniae está mediada por la unión de las bacterias a las células epiteliales por medio de adhesinas de superficie (9), en concreto la proteína fijadora de colina se une a las colinas y los carbohidratos que cubren la pared de la célula epitelial de huésped. La aspiración de las secreciones respiratorias que contienen a estos neumococos puede culminar en una neumonía (39). En condiciones normales, los mecanismos de aclaramiento locales como la tos, los reflejos epiglóticos o la fagocitosis, son suficientes para eliminar con rapidez los microorganismos aspirados. Sin embargo, cuando existen factores del huésped que alteran la eficacia de estas defensas, los neumococos pueden llegar a los alveolos y multiplicarse. Entre estos factores se encuentran enfermedades pulmonares crónicas, lesión del epitelio bronquial por humo de tabaco o contaminación aérea y disfunción respiratoria por intoxicación alcohólica, narcóticos, anestesia y traumatismos (39). Una vez que la bacteria se encuentra en el alveolo, parece que los factores de virulencia actúan en dos etapas. La primera se da al principio de la infección, como consecuencia de la actividad antifagocítica que proporciona la cápsula. La segunda etapa ocurre cuando los microorganismos empiezan a desintegrarse y a liberar diversos factores como la neumolisina, la autolisina y componentes de la pared celular (39). Estos factores atraen a las células inflamatorias hacia el foco de infección, favoreciendo la destrucción tisular. La patogénesis de la infección neumocócica es consecuencia de la interacción entre los factores de virulencia neumocócicos y la respuesta inmune del huésped. Los determinantes de virulencia neumocócicos y su correspondiente respuesta inmune producen cuatro efectos clave: la adhesión, la invasión, la inflamación y el shock (40). Introducción 10 1.1.6. Factores de virulencia Como ya se ha comentado anteriormente, la virulencia del S. pneumoniae se debe principalmente a su capacidad para resistir la fagocitosis y a la destrucción intracelular de las células fagocíticas (14). Esta resistencia a la fagocitosis se debe a su vez a la cápsula de polisacárido de la bacteria. De hecho, en modelos animales, cuando se inhibe la producción de la cápsula mediante técnicas genéticas, éstos se vuelven avirulentos (11). Los diferentes tipos capsulares varían en la capacidad para producir respuestas de anticuerpos humorales y en las propiedades biológicas que confieren mayor o menor virulencia (41). La principal función de cápsula polisacarídica es la protección de la bacteria frente a la actividad fagocítica de las células del sistema inmunitario, principalmente los macrófagos. Por ello, los organismos capsulados son resistentes a la fagocitosis y se multiplican rápidamente, mientras que los neumococos no capsulados son fagocitados rápidamente. Algunos productos celulares como la neumolisina o autolisina, podrían desempeñar un papel en la virulencia de los neumococos, ya que los mutantes defectuosos en la producción de estos componentes poseen una menor virulencia en modelos animales (11,42). La neumolisina (Ply) es miembro de la familia de toxinas formadoras de poros transmembranales, entre las que se encuentran la toxina estafilocócica alfa, estreptolisina O de S. pyogenes y otras (43). El neumococo no secreta neumolisina, sino que se descarga como consecuencia de la lisis de los microorganismos (44,45). La neumolisina actúa uniéndose al colesterol en las membranas celulares de distintas células huéspedes. A continuación se introduce en la membrana y tras una oligomerización provoca unos poros transmembrana, que finalmente lisan las células (46). La neumolisina es una toxina bifuncional y además de sus propiedades citotóxicas, tienen la capacidad de activar directamente la vía clásica del complemento (46). Inhibe además la actividad bactericida de los leucocitos, reduce la movilidad ciliar del epitelio respiratorio y estimula la producción de citocinas por los macrófagos (47-49). Introducción 11 La autolisina (LytA), es responsable de la lisis celular que conlleva la liberación intracelular de la Ply y otros factores de virulencia (50). La mutagénesis del gen lytA previene la autolisis. La neuraminidasa es un factor de virulencia que se ha encontrado en todos los neumococos estudiados. Este enzima escinde el ácido siálico terminal de los glucanos como la mucina, glicolípidos o las glicoproteínas que se encuentran en las superficies celulares, exponeniendo nuevas porciones de la molécula que median la adherencia de las células bacteriana (51,52). Existen al menos dos tipos de neuraminidasa, NanA and NanB. Algunas cepas neumocócicas también producen hialuronidasa (hyl) e IgA proteasas, que facilitan la propagación y colonización bacteriana (53). La proteína de unión a la colina A (CbpA) tiene una gran habilidad para reaccionar tanto con anticuerpos humanos como con el suero protector del ratón, ya que permite la adherencia al tejido huésped y la posterior colonización (53). El antígeno de superficie A (PsaA) es otro factor de virulencia del neumococo. Se ha observado que los anticuerpos dirigidos a la PsaA en ratones confieren protección contra el neumococo y que los mutantes para la PsaA son avirulentos (52). La proteína PspA es uno de los antígenos mejor caracterizado de la familia de las CBP (proteína de unión a colina). Se encuentra en la superficie de todos los neumococos (54) y su papel en la patogénesis del neumococo está demostrado (55,56). Su principal función es reducir la deposición de las moléculas del complemento C3b sobre la superficie del neumococo y la posterior aclaración mediada por el complemento (56). La PspA también se une a la lactoferrina (57,58), protegiendo al neumococo del efecto bactericida de la apolactoferrina y facilitando así la colonización de las mucosas (59). 1.1.7. Resistencias en S. pneumoniae Tras el primer neumococo con sensibilidad disminuida a penicilina descrito en Australia en 1967 (60), la preocupación con respecto a las resistencias a los antibióticos en S. pneumoniae ha ido en aumento (3,61,62). Durante la década de 1970, la Introducción 12 resistencia a la penicilina entre las cepas de S. pneumoniae era rara en los Estados Unidos y sólo el 0.2% eran resistentes. La penicilina siguió siendo el tratamiento de elección mientras emergían las resistencias a tetraciclinas, cloranfenicol, macrólidos y cotrimoxazol (3). En 1978 emergen en África, cepas no solamente resistentes a los antibióticos nombrados, sino también completamente resistentes a la penicilina; esto marcó la era de los neumococos multirresistentes (63). Durante la década de 1980, fueron halladas cepas multirresistentes (resistencia a 3 o más tipos de antibióticos) en España y se extendieron globalmente (3). Durante la década de 1990, hubo un aumento de neumococos multirresistentes en Estados Unidos (64). Cuando en el año 2000, se introdujo la primera vacuna neumocócica conjugada en Estados Unidos, aproximadamente la mitad de los aislamientos de las enfermedades neumocócicas invasoras fueron resistentes a penicilina y/o a macrólidos (64). Aunque la invasividad y la resistencia no están obligatoriamente relacionadas, sí tienen una importancia fundamental en el manejo de la enfermedad invasora y su evolución clínica. El estudio de la sensibilidad y de los mecanismos de resistencia a betalactámicos (sobre todo penicilina) y macrólidos, ha sido objeto de intenso estudio en las últimas décadas. Los problemas de resistencia a betalactámicos y macrólidos han conducido al empleo de nuevas moléculas en el tratamiento, como las fluorquinolonas. La mayoría de los mecanismos de resistencia conocidos en bacterias han sido descritos para S. pneumoniae, con la excepción de la resistencia mediada por plásmidos. Sin embargo se ha descrito la resistencia mediada por un plásmido linealizado en un transposón y la inserción de éste en el cromosoma neumocócico. Es el caso del cloranfenicol (65). En el neumococo, la resistencia de al menos 3 clases de antibióticos está mediada por la mutación de una base en el gen cromosómico. Por ello, esta clase de resistencia podría ser fácilmente seleccionada por la terapia antibiótica y el amplio uso de estos antibióticos. El uso generalizado de un agente podría seleccionar una cepa multirresistente. La resistencia a la penicilina se asocia con una alteración de las proteínas de unión a la penicilina (PBP) que tienen menor afinidad para fijar la penicilina a la pared de la célula bacteriana. Las PBPs son enzimas transpeptidasa que participan en la síntesis de peptidoglicano y cada especie bacteriana contiene un conjunto característico Introducción 13 de PBPs. Dependiendo de la estructura de los dominios y los aminoácidos conservados en el dominio N-terminal se distinguen las de clase A y clase B de alto peso molecular y la PBPs de bajo peso molecular. S. pneumoniae contiene 6 PBPs: tres PBPs de clase A de alto peso molecular (1A, 1B y 2A), dos de la clase B de alto peso molecular (2X y 2B) y la PBP3 de bajo peso molecular (66). El primer mecanismo de resistencia a macrólidos descrito en S. pneumoniae fue una modificación post-transcripcional de la 23S rRNA por una adenina-N 6 metiltransferasa (67). Los genes que codifican estas metilasas se designaron erm (erythromycin ribosome methylase) y se han hallado en numerosas bacterias grampositivas (53). Ocasionalmente el enzima ErmA del S. pneumoniae es codificado por el gen ermA de un Streptococcus pyogenes resistente (68). En Estados Unidos la resistencia a macrólidos a menudo suele ser debida al gen de reflujo mefE (69). Este gen está asociado con el 20-30% de las resistencias a macrólidos en la mayor parte del mundo. En Italia el reflujo está mediado por el gen mefA (70). Un pequeño porcentaje de la resistencia a macrólidos está mediada por mutaciones en la diana en todas las copias de genes para rRNA y/o mutaciones en los genes para proteínas ribosomales (71). La resistencia a trimetropim-sulfametoxazol está mediada por mutaciones en los genes cromosómicos de la dihidrofolato reductasa (72) y la dihidropteroato sintetasa (73). La resistencia a tetraciclinas está mediada por tetM y ocasionalmente tetO (74), y la de cloranfenicol por la adquisición de un gen cloranfenicol acetiltransferasa (75). En 1962 apareció la primera quinolona, el ácido nalidíxico, obtenida por síntesis a partir de la cloroquina, pero no fue hasta 1978 cuando se inició la era de las quinolonas fluoradas, análogas del anterior. Debido a la incorporación del átomo de fluor en la posición 6 del anillo de dihidroquinoleína, poseen un amplio espectro de acción que engloba bacterias grampositivas, gramnegativas (como Pseudomonas y enterobacterias) y micobacterias. Se caracterizan también por estar dotadas de propiedades farmacológicas que las hacen útiles para el tratamiento de infecciones Introducción 14 sistémicas. Estos quimioterápicos bactericidas son inhibidores de la ADN-girasa y topoisomerasa IV, enzimas compuestas por cuatro subunidades (dos A y dos B). Las fluorquinolonas como el levofloxacino, por su elevada actividad frente al neumococo, se recomienda en el tratamiento empírico de la neumonía adquirida en la comunidad que requiere ingreso (76,77). Aunque el porcentaje de resistencias a fluorquinolonas en neumococo se mantiene bajo en todo el mundo, el aumento de su utilización incrementa el riesgo de la aparición de aislados resistentes (78). En los últimos años se han descrito mutantes de primer paso a fluorquinolonas en aislamientos invasivos de neumococo en USA, Canadá y China (79,80). En España la tasa de resistencia se ha elevado del 0,9% en 1990 al 7,1% en el año 2000. Esta resistencia se traduce en fracasos terapéuticos (80,81). Recientemente en España se ha descrito un fracaso terapéutico, con evolución mortal, en un paciente con enfermedad invasiva en tratamiento con levofloxacino en el que se aisló una cepa de S. pneumoniae con mutación ParC (82). La resistencia bacteriana a las fluoroquinolonas se debe a la alteración de las dianas de esta clase de antibióticos, la ADN topoisomerasa IV y la ADN girasa y a la expulsión activa de la molécula mediante bombas (83,84). La alteración de las enzimas se da por mutaciones en los genes QRDR (quinolone resistance-determining region) y la consiguiente sustitución de los aminoácidos. La mutación se puede dar sólo en una de las dianas o en ambas. En el primer caso tendríamos una mutante de primer paso y en el segundo, un mutante de resistencia de alto nivel (85). La sensibilidad diminuida se da sobre todo por mutaciones en la subunidad ParC de la topoisomerasa IV o en la subunidad GyrA de la ADN girasa y menos en ParE o GyrB (86-88). La diana alterada en los mutantes de primer paso depende de la FQ (87,89). Así, para pefloxacino, ciprofloxacino y levofloxacino la diana es el del gen parC y para esparfloxacino, moxifloxacino, gatifloxacino, gemifloxacino y garenoxacino es el gyrA (87,90,91). Estos resultados demuestran que la estructura de estos antibióticos determina su modo de acción frente a S. pneumoniae. Con el propósito de detectar resistencias de bajo nivel y prevenir la selección in vivo de mutantes de segundo paso o fracasos terapéuticos, la Sociedad Francesa de Microbiología sugiere un método de cribado con norfloxacino (NFX) (92). Justificación e hipótesis 21 adulta se asociaría con una mayor porcentaje de cepas con sensibilidad disminuida a fluorquinolonas, que bajo la presión antibiótica podrían mutar a cepas con resistencia de alto nivel. Por otro lado, la vigilancia continua de los serotipos circulantes y el estudio rutinario de las cepas con sensibilidad disminuida a fluorquinolonas en los laboratorios de Microbiología Clínica requiere de técnicas sencillas y económicas. Por ello, nuestra segunda hipótesis es la utilización de técnicas de PCR para el serotipado y la necesidad de implantar un método de cribado para la detección de cepas con sensibilidad disminuida a fluorquinolonas. 3. OBJETIVOS Objetivos 23 3. OBJETIVOS El objetivo de este estudio es conocer la epidemiología de la enfermedad neumocócica invasiva mediante el serotipado, el estudio de clonalidad y el estudio de la sensibilidad disminuida a fluorquinolonas de los aislamientos invasivos de Streptococcus pneumoniae en el Hospital Universitario Virgen del Rocío. Para alcanzar el objetivo principal, y confirmar las hipótesis planteadas se establecieron una serie de objetivos concretos. 1. Diseño y adaptación de la PCR multiplex de los CDC a los serotipos prevalentes en nuestro medio. 2. Caracterización de los serotipos de todos los aislamientos de Streptococcus pneumoniae invasivos en población adulta y pediátrica. 3. Determinar los patrones de sensibilidad de Streptococcus pneumoniae a los antibióticos y determinar la prevalencia de aislados con sensibilidad disminuida a fluorquinolonas. 4. Aplicación y evaluación del método de cribado sugerido por la Sociedad Francesa de Microbiología para la detección de aislados con sensibilidad disminuida a fluorquinolonas. 5. Estudio genotípico de las mutaciones en los genes QRDR (parC, parE, gyrA y gyrB) que condicionan la resistencia a fluorquinolonas. 6. Estudio de clonalidad de todos los aislamientos invasivos por electroforesis en campo pulsante, tras tratamiento con endonucleasas de restricción SmaI. 7. Correlacionar los datos microbiológicos y las manifestaciones clínicas de la enfermedad invasiva y evolución final de la misma. 4. MATERIAL Material 25 4. MATERIAL 4.1. MICROORGA!ISMOS 4.1.1. Muestras y aislamientos Se recopilaron 274 aislamientos invasivos de Streptococcus pneumoniae procedentes de distintas muestras clínicas procesadas en el laboratorio de Microbiología y Parasitología Clínica de los Hospitales Universitarios Virgen del Rocío de Sevilla durante 2001-2008. Todos los aislamientos fueron recuperados de líquidos estériles: sangre (222 aislamientos), líquido cefalorraquídeo (19 aislamientos), sangre y líquido cefalorraquídeo (19 aislamientos), líquido pleural (10 aislamientos), biopsia pulmonar (1), líquido peritoneal (1) y líquido sinovial (2 aislamientos). 115 de estos aislamientos pertenecían a pacientes pediátricos y 159 a adultos. 96 de los 115 aislamientos pediátricos fueron serotipados previamente mediante reacción de Quellung en el Laboratorio de Referencia de Neumococos del Centro Nacional de Microbiología. Todos los aislamientos utilizados en este estudio procedían de pacientes distintos, excepto en un caso en el que un paciente tuvo dos episodios de ENI separados en el tiempo. En la siguiente tabla se muestra la relación de cepas y su año de aislamiento junto con el tipo de muestra y el servicio: Material 26 Tabla 1: Cepas invasivas de Sreptococcus pneumoniae por año de aislamiento. !º Año Muestra Servicio 1 2001 Sangre H. Infantil 2 2001 Sangre H. Infantil 3 2001 Sangre H. Infantil 4 2001 Sangre H. Infantil 5 2001 Sangre H. Infantil 6 2001 Sangre H. Infantil 7 2001 L.C.R. H. Infantil 8 2001 Sangre H. Infantil 9 2002 L.C.R./Sangre H. Infantil 10 2002 L.C.R./Sangre H. Infantil 11 2002 Sangre H. Infantil 12 2002 L. pleural H. Infantil 13 2002 Sangre H. Infantil 14 2002 L. pleural H. Infantil 15 2002 Sangre H. Infantil 16 2002 L.C.R. H. Infantil 17 2002 L.C.R./Sangre H. Infantil 18 2002 Sangre H. Infantil 19 2002 Sangre H. Infantil 20 2003 Sangre H. Infantil 21 2003 Sangre H. Infantil 22 2003 Sangre H. Infantil 23 2003 Sangre H. Infantil 24 2003 Sangre H. Infantil 25 2003 Sangre H. Infantil 26 2003 Sangre H. Infantil 27 2003 L.C.R./Sangre H. Infantil 28 2003 L. articular H. Infantil 29 2003 Sangre H. Infantil 30 2003 Sangre H. Infantil 31 2003 L.C.R. H. Infantil 32 2003 L.C.R. H. Infantil 33 2003 Sangre H. Infantil 34 2003 Sangre H. Infantil 35 2003 Sangre H. Infantil 36 2003 Sangre H. Infantil 37 2004 L.C.R. H. Infantil 38 2004 Sangre H. Infantil 39 2004 Sangre H. Infantil 40 2004 Sangre H. Infantil 41 2004 Sangre H. Infantil 42 2004 Sangre H. Infantil 43 2004 Sangre H. Infantil 44 2004 L.C.R./Sangre H. Infantil 45 2004 L.C.R./Sangre H. Infantil 46 2004 Sangre H. Infantil Material 27 !º Año Muestra Servicio 47 2004 L.C.R. H. Infantil 48 2004 Sangre Observación 49 2004 Sangre H. Infantil 50 2004 Sangre Infecciosos 51 2004 Sangre Medicina interna 52 2004 Sangre Urgencias 53 2004 Sangre H. Infantil 54 2004 Sangre Reumatología 55 2004 Sangre U.C.I. 56 2004 Sangre Urgencias 57 2004 Sangre U.C.I. 58 2004 Sangre U.C.I. 59 2004 Sangre Respiratorio 60 2004 L.C.R. U.C.I. 61 2005 L. pleural H. Infantil 62 2005 L. pleural H. Infantil 63 2005 Sangre H. Infantil 64 2005 Sangre H. Infantil 65 2005 L.C.R./Sangre H. Infantil 66 2005 L. pleural H. Infantil 67 2005 Sangre H. Infantil 68 2005 Sangre H. Infantil 69 2005 Sangre H. Infantil 70 2005 Sangre H. Infantil 71 2005 L.C.R./Sangre H. Infantil 72 2005 Sangre H. Infantil 73 2005 Sangre H. Infantil 74 2005 Sangre H. Infantil 75 2005 Sangre H. Infantil 76 2005 Sangre H. Infantil 77 2005 Sangre H. Infantil 78 2005 L.C.R. H. Infantil 79 2005 L.C.R./Sangre H. Infantil 80 2005 Sangre H. Infantil 81 2005 Sangre U.C.I. 82 2005 Sangre U.C.I. 83 2005 Sangre Urgencias 84 2005 Sangre U.C.I. 85 2005 Sangre U.C.I. 86 2005 Sangre Respiratorio 87 2005 Sangre Urgencias 88 2005 Sangre Oncología 89 2005 Sangre D. del Infantado 90 2005 Sangre Respiratorio 91 2005 Sangre Reumatología 92 2005 Sangre Infecciosos 93 2005 Sangre Desconocido Material 28 !º Año Muestra Servicio 94 2005 Sangre D. del Infantado 95 2005 Sangre Urgencias 96 2005 Sangre Oncohematología 97 2005 Sangre D. del Infantado 98 2005 Sangre Oncología 99 2005 Sangre Urgencias 100 2005 Sangre Urgencias 101 2005 Sangre D. del Infantado 102 2005 Sangre U.C.I. 103 2005 Sangre U.C.I. 104 2005 Sangre Infecciosos 105 2005 Sangre Observación 106 2005 Sangre U.C.I. 107 2005 Sangre Infecciosos 108 2005 Sangre Oncología 109 2005 L.C.R. Observación 110 2005 Sangre U.C.I. 111 2005 Sangre U.C.I. 112 2005 Sangre Digestivo 113 2005 L.C.R. U.C.I. 114 2005 Sangre Reumatología 115 2005 Sangre U.C.I. 116 2005 L.C.R. U.C.I. 117 2005 L.C.R. Observación 118 2005 Sangre Observación 119 2006 Sangre H. Infantil 120 2006 Sangre H. Infantil 121 2006 Sangre H. Infantil 122 2006 Sangre H. Infantil 123 2006 Sangre H. Infantil 124 2006 Sangre H. Infantil 125 2006 Sangre H. Infantil 126 2006 Sangre H. Infantil 127 2006 L. pleural H. Infantil 128 2006 L.C.R./Sangre H. Infantil 129 2006 L.C.R. H. Infantil 130 2006 L. pleural H. Infantil 131 2006 L. pleural H. Infantil 132 2006 Sangre H. Infantil 133 2006 Sangre H. Infantil 134 2006 Sangre H. Infantil 135 2006 Sangre H. Infantil 136 2006 Sangre H. Infantil 137 2006 Sangre H. Infantil 138 2006 L.C.R H. Infantil 139 2006 Sangre H. Infantil 140 2006 L.C.R H. Infantil Material 29 !º Año Muestra Servicio 141 2006 Sangre H. Infantil 142 2006 Sangre Observación 143 2006 Sangre U.C.I. 144 2006 L.C.R U.C.I. 145 2006 Sangre Medicina interna 146 2006 Sangre Urgencias 147 2006 Sangre Medicina interna 148 2006 Sangre Oncohematología 149 2006 Sangre Infecciosos 150 2006 Sangre Medicina interna 151 2006 Sangre Medicina interna 152 2006 Sangre H. Infantil 153 2006 Sangre U.C.I. 154 2006 L. pleural Observación 155 2006 Sangre Infecciosos 156 2006 Sangre Infecciosos 157 2006 Sangre U.C.I. 158 2006 Sangre Medicina interna 159 2006 Sangre Urgencias 160 2006 Sangre Observación 161 2006 Sangre Observación 162 2006 Sangre Observación 163 2006 Sangre U.C.I. 164 2006 Sangre Respiratorio 165 2006 Sangre U.C.I. 166 2006 Sangre Oncohematología 167 2006 Sangre Observación 168 2006 Sangre Urgencias 169 2006 Sangre Observación 170 2006 Sangre Infecciosos 171 2006 Sangre Respiratorio 172 2006 Sangre Reumatología 173 2007 L.C.R H. Infantil 174 2007 Sangre H. Infantil 175 2007 Sangre H. Infantil 176 2007 Sangre H. Infantil 177 2007 L.C.R H. Infantil 178 2007 Sangre H. Infantil 179 2007 Sangre H. Infantil 180 2007 Sangre H. Infantil 181 2007 Sangre H. Infantil 182 2007 Sangre H. Infantil 183 2007 Sangre H. Infantil 184 2007 Sangre Medicina interna 185 2007 Sangre Observación 186 2007 Sangre U.C.I. 187 2007 Sangre Medicina interna Material 30 !º Año Muestra Servicio 188 2007 Sangre Traumatología 189 2007 L.C.R./Sangre U.C.I. 190 2007 Sangre D. del Infantado 191 2007 Sangre U.C.I. 192 2007 Sangre Recoger lab 193 2007 Sangre U.C.I. 194 2007 Sangre Psiquiatría 195 2007 L.C.R Traumatología 196 2007 Sangre Medicina interna 197 2007 Sangre Oncohematología 198 2007 Sangre H. Infantil 199 2007 Sangre H. Infantil 200 2007 Sangre Observación 201 2007 Sangre Infecciosos 202 2007 Sangre Infecciosos 203 2007 Sangre Urgencias 204 2007 Sangre Cardiología 205 2007 Sangre Urgencias 206 2007 Sangre Reumatología 207 2007 Sangre Observación 208 2007 Sangre U.C.I. 209 2007 Sangre U.C.I. 210 2007 Sangre D. del Infantado 211 2007 Sangre Medicina interna 212 2007 Sangre Observación 213 2007 Sangre Observación 214 2007 Sangre D. del Infantado 215 2007 Sangre D. del Infantado 216 2007 Sangre H. Infantil 217 2007 Sangre Urgencias 218 2007 Sangre U.C.I. 219 2007 Sangre Urgencias 220 2007 Sangre Observación 221 2007 Sangre Reumatología 222 2007 L.C.R./Sangre H. VALME 223 2008 Sangre Urgencias 224 2008 Sangre D. del Infantado 225 2008 Sangre Medicina interna 226 2008 Sangre Urgencias 227 2008 Sangre Consultas externas 228 2008 Sangre U.C.I. 229 2008 Sangre U.C.I. 230 2008 Sangre Medicina interna 231 2008 Sangre H. Infantil 232 2008 Sangre Trasplante 233 2008 Sangre Reumatología 234 2008 Sangre Cardiología Material 37  Solución de Proteinasa K (10 mg/ml) : • Proteinasa K………………………10 mg • Agua destilada estéril……………….1 ml Conservar en pequeñas alícuotas a -20ºC.  Solución de Cloruro sódico (NaCl) 5 M : • NaCl…………………………........29,2 g • Agua destilada……………….......100 ml Autoclavar y conservar a temperatura ambiente.  Solución básica de lisis (ST): • Tris-HCl 1M pH 8..........................0,6 ml • NaCl 5 M.........................................20 ml • EDTA 0,5 M pH 8...........................20 ml • SDS 10 % ..........................................2 ml • Sarcosil 10 %.....................................5 ml • Agua destilada (c.s.p.) ..................100 ml Completar con agua destilada hasta 100ml. Autoclavar en alícuotas de 100 ó 200 ml.  Solución para la incubación con proteinasa-K(ES): • EDTA Na 2 0,5 M pH 8....................90 ml • Sarcosil 10%....................................10 ml Autoclavar en alícuotas de 100 ó 200 ml. Material 38  Tampón Tris-Borato-EDTA (TBE) 10x pH 8: • Tris base…………………………....108 g • Ácido bórico……..…………….........55 g • EDTA Na 2 0,5 M pH 8………..…...40 ml • Agua destilada (c.s.p)……….………...1L Disolver los componentes. Autoclavar y guardar a temperatura ambiente.  Solución de bromuro de etidio (10 mg/ml)(BrEt): • Bromuro de Etidio………………........1 g • Agua destilada……………………100 ml Disolver con ayuda de un agitador magnético durante varias horas hasta disolver el colorante. Cubrir el recipiente con papel de aluminio y conservar a temperatura ambiente. 4.6. PREPARACIÓ! DE LA SOLUCIÓ! DE A!TIBIÓTICO Y RESERPI!A !orfloxacino La solución madre del norfloxacino se prepararó a una concentración de 1 mg/ml en NaOH 0.5 N. Se conservaron a –20 ºC y protegidas de la luz. Reserpina La reserpina se preparó en una solución al 50% (v/v) de agua y metanol y a una concentración de ácido acético del 1%. 5. MÉTODOS Métodos 40 5. MÉTODOS 5.1. ESTUDIO DE LOS DATOS CLÍ!ICOS Los datos clínicos y demográficos del estudio se obtuvieron mediante la revisión de la historia clínica. Las comparaciones entre los datos obtenidos como variables independientes se llevaron a cabo mediante el análisis de Chi cuadrado (χ 2 ) para variables cualitativas. 5.2. PROCESAMIE!TO DE LAS MUESTRAS CLÍ!ICAS Los neumococos estudiados en este trabajo fueron aislados a partir de muestras invasivas siguiendo los Protocolos Normalizados de Trabajo de cada sección correspondiente del Servicio de Microbiología y Parasitología Clínica de los HH.UU. Virgen del Rocío de Sevilla. Todas las muestras se sembraron en agar-sangre y fueron cultivadas en un 5% de CO 2 a 37ºC durante 24-48 horas. Se recuperaron 274 aislamientos de Streptococcus pneumoniae de un total de 560 que hubo entre 2002 y 2008 en Sevilla, 115 aislamientos pediátricos, de los cuales 96 fueron previamente serotipados de modo convencional, y 159 aislamientos de adultos. Todos los aislamientos recuperados fueron de muestras invasivas: sangre, LCR, líquido peritoneal, biopsia pulmonar, líquido pleural y líquido sinovial. 5.3. PRUEBAS DE IDE!TIFICACIÓ! Y SE!SIBILIDAD Los aislamientos de Streptococcus pneumoniae se identificaron basándose en la morfología de las colonias, la sensibilidad a la optoquina y la solubilidad en bilis. Así, a las colonias α-hemolíticas, ya fueran mucosas o con el centro de la colonia umbilicado, se les realizó la prueba de sensibilidad a optoquina y solubilidad en bilis para diferenciar Métodos 41 a Streptococcus pneumoniae de los demás estreptococos α-hemolíticos. Las pruebas de aglutinación en latex comercialmente disponibles (Slidex Pneumo-kit® o Pneumoslide™) se utilizaron también para ayudar a identificar algunos aislamientos de S. pneumoniae en placas de agar sangre. En las muestras en las que se requirió una tinción de Gram urgente y se observaron cocos lanceolados grampositivos agrupados en pares haciendo contacto por sus extremos (diplococos), la identificación se orientó hacia el neumococo realizándose una aglutinación con el método comercial de aglutinación (Pastorex TM Meningitis) en muestra directa. La conservación de los microorganismos se realizó a -70º C en viales específicos con un medio especial basado en leche para la conservación de microorganismos. Pruebas de identificación  Tinción de Gram: • Preparar frotis para microscopía. • Cubrir la preparación con colorante cristal violeta durante 1 minuto. • Lavar con agua. • Añadir lugol. Dejar actuar 30 segundos • Lavar con agua. • Decolorar con alcohol etílico durante aproximadamente 10 segundos. • Lavar con abundante agua, para bloquear la decoloración • Cubrir con safranina durante 1 minuto. • Lavar con agua. • Secar a temperatura ambiente. • Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100x). Las bacterias Gram positivas se observaran teñidas de color violeta, y las Gram negativas de color rojo. Métodos 42  Prueba de sensibilidad a la optoquina • La prueba de sensibilidad a la optoquina se realizó con un disco de 6 mm y 5 µg de optoquina (Oxoid; BBL (BD)). Con esto diferenciamos las cepas de S. pneumoniae de las de estreptococo viridans. Las cepas sensibles a optoquina corresponden a S. pneumoniae.  Prueba de solubilidad en bilis • La prueba de solubilidad en bilis se desarrolló en aislamientos con pequeñas zonas de inhibición en la prueba de sensibilidad a la optoquina. Se desarrolló usando el método en tubo, añadiendo 0,25ml de desoxicolato de sodio al 2% (sales biliares) a uno de los tubos con una suspensión de células bacterianas con una turbidez de 0,5 McFarland y suero salino al otro tubo. A continuación se comprovó la turbidez visualmente (10). Pruebas de sensibilidad antimicrobiana  Método de difusión en placa Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana de los neumococos se realizaron mediante el método de difusión en placa usando tiras de E-test de diferentes antimicrobianos. Para la preparación del inóculo, se recogieron varias colonias del microorganismo con ayuda de un asa estéril desechable de la placa de aislamiento. Se suspendieron en un tubo con de 2 ml de suero fisiológico (Suspensión médium. Biomérieux®). Se agitaron hasta la completa disolución de las colonias y se ajustó con la ayuda de un turbidímetro a la concentración de 0.5 McFarland. Métodos 43 A continuación se introdujo un hisopo dentro de la suspensión de neumococo y se inocularon las placas de Müller-Hinton previamente retiradas de la nevera para que estuvieran a temperatura ambiente en el momento de su utilización. Posteriormente se colocaron las tiras de E-test manualmente, asegurándose de que contacten perfectamente con la superficie del agar. La interpretación del antibiograma se realizó siguiendo las recomendaciones del CLSI de cada año. Teniendo en cuenta que los puntos de corte para la penicilina y la cefotaxima en el neumococo han ido cambiando, para este estudio se han seguido las recomendaciones del documento M100-S20, CLSI 2010 (110) (tabla 2). Tabla 2: Recomendaciones del Documento M100-S20 del CLSI 2010 para el neumococo. Antibiótico S I R Penicilina parenteral(meningitis) Penicilina parenteral(no-meningitis) Penicilina oral ≤ 0,06 ≤2 ≤0,06 - 4 0,12-1 ≥ 0,12 ≥8 ≥2 Cefotaxima (meningitis) Cefotaxima (no-meningitis) ≤ 0,5 ≤1 1 2 ≥ 2 ≥4 Eritromicina ≤ 0,25 0,5 ≥ 1 Meropenem ≤ 0,25 0,5 ≥ 1 Levofloxacina ≤ 2 4 ≥ 8 Vancomicina ≤ 1 - - Métodos 44 5.4. ESTUDIO DE SEROTIPADO 5.4.1. Técnicas de Biología Molecular para estudio de serotipado  Extracción de AD!: La extracción del ADN se realizó a partir de cultivo puro de Streptococcus pneumoniae en placas de Columbia Blood agar, mediante el sistema Quiagen (DNeasy®) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se conservó a -20ºC hasta su análisis.  PCR múltiple: El protocolo de PCR múltiple propuesto por el CDC (25) consiste en 7 reacciones secuenciales ordenadas en función de la prevalencia de serotipos. Cada una de las 7 reacciones incluye 4 parejas de cebadores dirigidas a 4 secuencias diferentes específicas de cada serotipo y un control de amplificación. Este control es una pareja de cebadores que amplifica una región muy conservada de 160 pb en el operón cps del neumococo (Tabla3). Tabla 3: Serotipos y cebadores utilizados para la PCR múltiple . Cebadores Secuencia de cebadores (5' 3') Concentración (µ µµ µM) Tamaño del producto (bp) 1-f CTC TAT AGA ATG GAG TAT ATA AAC TAT GGT TA 1,5 280 1-r CCA AAG AAA ATA CTA ACA TTA TCA CAA TAT TGG C 1,5 3-f ATG GTG TGA TTT CTC CTA GAT TGG AAA GTA G 1,5 371 3-r CTT CTC CAA TTG CTT ACC AAG TGC AAT AAC G 1,5 4-f CTG TTA CTT GTT CTG GAC TCT CGA TAA TTG G 1,5 430 4-r GCC CAC TCC TGT TAA AAT CCT ACC CGC ATT G 1,5 5-f ATA CCT ACA CAA CTT CTG ATT ATG CCT TTG TG 1 362 5-r GCT CGA TAA ACA TAA TCA ATA TTT GAA AAA GTA TG 1 Métodos 45 Cebadores Secuencia de cebadores (5' 3') Concentración (µ µµ µM) Tamaño del producto (bp) 6A/B-f AAT TTG TAT TTT ATT CAT GCC TAT ATC TGG 0,5 250 6A/B-r TTA GCG GAG ATA ATT TAA AAT GAT GAC TA 0,5 7F-f CCT ACG GGA GGA TAT AAA ATT ATT TTT GAG 2 826 7F-r CAA ATA CAC CAC TAT AGG CTG TTG AGA CTA AC 2 7C-f CTA TCT CAG TCA TCT ATT GTT AAA GTT TAC GAC GGG A 1,5 260 7C-r GAA CAT AGA TGT TGA GAC ATC TTT TGT AAT TTC 1,5 8-f GAT GCC ATG AAT CAA GCA GTG GCT ATA AAT C 1,5 294 8-r ATC CTC GTG TAT AAT TTC AGG TAT GCC ACC 1,5 9V-f CTT CGT TAG TTA AAA TTC TAA ATT TTT CTA AG 1,5 753 9V-r GTC CCA ATA CCA GTC CTT GCA ACA CAA G 1,5 10A-f GGT GTA GAT TTA CCA TTA GTG TCG GCA GAC 1,5 628 10A-r GAA TTT CTT CTT TAA GAT TCG GAT ATT TCT C 1,5 11A-f GGA CAT GTT CAG GTG ATT TCC CAA TAT AGT G 1 463 11A-r GAT TAT GAG TGT AAT TTA TTC CAA CTT CTC CC 1 12F-f GCA ACA AAC GGC GTG AAA GTA GTT G 1,5 376 12F-r CAA GAT GAA TAT CAC TAC CAA TAA CAA AAC 1,5 14-f CTT GGC GCA GGT GTC AGA ATT CCC TCT AC 1,5 208 14-r GCC AAA ATA CTG ACA AAG CTA GAA TAT AGC C 1,5 15A-f ATT AGT ACA GCT GCT GGA ATA TCT CTT C 1,5 436 15A-r GAT CTA GTG AAC GTA CTA TTC CAA AC 1,5 15B/C-f CAT CCG CTT ATT AAT TGA AGT AAT CTG AAC C 1,5 496 15B/C-r CTG TTC AGA TAG GCC ATT TAC AGC TTT AAA TC 1,5 16F-f CAT TCC TTT TGT ATA TAG TGC TAG TTC ATC C 2 988 16F-r TTC GTG ATG ATA ATT CCA ATG ATC AAA CAA GAG 2 17F-f GAT GTA ACA AAT TTG TAG CGA CTA AGG TCT GC 1,5 693 Métodos 46 Cebadores Secuencia de cebadores (5' 3') Concentración (µ µµ µM) Tamaño del producto (bp) 17F-r CTT AAT AGC TCT CAT TAT TCT TTT TTT AAG CC 1,5 Sg18-f TTA TCT GTA AAC CAT ATC AGC ATC TGA AAC 1,25 573 Sg18-r GTT AGT CCT GTT TTA GAT TTA TTT GGT GAT GT 1,25 19A-f CAT CCG CTT ATT AAT TGA AGT AAT CTG AAC C 1 478 19A-r GAG CAG TCA ATA AGA TGA GAC GAT AGT TAG 1 19F-f GTT AAG ATT GCT GAT CGA TTA ATT GAT ATC C 1,5 304 19F-r GTA ATA TGT CTT TAG GGC GTT TAT GGC GAT AG 1,5 20-f GAG CAA GAG TTT TTC ACC TGA CAG CGA GAA G 1,5 514 20-r CTA AAT TCC TGT AAT TTA GCT AAA ACT CTT ATC 1,5 22F-f GAG TAT AGC CAG ATT ATG GCA GTT TTA TTG TC 1,5 643 22F-r CTC CAG CAC TTG CGC TGG AAA CAA CAG ACA AC 1,5 23F-f GTA ACA GTT GCT GTA GAG GGA ATT GGC TTT TC 1,5 384 23F-r CAC AAC ACC TAA CAC ACG ATG GCT ATA TGA TTC 1,5 31-f GGA AGT TTT CAA GGA TAT GAT AGT GGT GGT GC 2 701 31-r CCG AAT AAT ATA TTC AAT ATA TTC CTA CTC 2 33F-f GAA GGC AAT CAA TGT GAT TGT GTC GCG 1 338 33F-r CTT CAA AAT GAA GAT TAT AGT ACC CTT CTA C 1 34-f GCT TTT GTA AGA GGA GAT TAT TTT CAC CCA AC 1,5 408 34-r CAA TCC GAC TAA GTC TTC AGT AAA AAA CTT TAC 1,5 35B-f GAT AAG TCT GTT GTG GAG ACT TAA AAA GAA TG 1 677 35B-r CTT TCC AGA TAA TTA CAG GTA TTC CTG AAG CAA G 1 35F-f GAA CAT AGT CGC TAT TGT ATT TTA TTT AAA GCA A 1,5 517 35F-r GAC TAG GAG CAT TAT TCC TAG AGC GAG TAA ACC 1,5 38-f CGT TCT TTT ATC TCA CTG TAT AGT ATC TTT ATG 1,5 574 38-r ATG TTT GAA TTA AAG CTA ACG TAA CAA TCC 1,5 Métodos 53 periódicamente, estas son las denominadas técnicas de electroforesis en campo pulsante (ECP) o pulse-field gel electrophoresis. Mediante este procedimiento se consigue dividir el cromosoma bacteriano en patrones sencillos, de 10 a 20 bandas, lo cual facilita la comparación de unos aislados con otros, permitiendo establecer grados de similitud genética entre las bacterias estudiadas.  Extracción del AD! cromosómico  Preparación del inóculo del microorganismo  Rotular tubos eppendorf de 1,5 ml con los números identificativos de cepas y dispensar 200 µl de solución PIV resuspendiendo a continuación el pellet de la cepa asignada.  Preparar las cubetas del espectrofotómetro con 1ml de PIV y añadir 5 µl de la suspensión microbiana preparada en el apartado anterior.  Medir la densidad óptica (OD 620 ) en el espectrofotómetro y calcular el volumen de PIV necesario para la dilución según la siguiente ecuación: Vol dil = (OD 620 x 40 x 210) - 210  Añadir el volumen de PIV necesario para la dilución anterior.  Elaboración de los bloques de agarosa  Mantener una solución de agarosa al 1,5% de bajo punto de fusión fundida (>40ºC).  Mezclar 200µL de la suspensión bacteriana y 200µL de la solución de agarosa fundida en nuevos eppendorf, convenientemente rotulados. Mezclar suavemente con la pipeta y dispensar en los moldes. Métodos 54  Conservar los moldes 5 minutos a -20ºC y, como mínimo, 10 minutos a temperatura ambiente.  Lisis  Preparar tantos ml de tampón de lisis (ST) como microorganismos se estén analizando. Para obtener la solución de lisis, se añadiran al ST 5 µl de Rnasa (10mg/ml), 2 µl de lisozima (50mg/ml) y 50 µl de Brij al 10%. En tubos de plástico estériles desechables, convenientemente rotulados, dispensar 1ml de dicha solución.  Una vez transcurridos, como mínimo, 10 minutos a temperatura ambiente, transferir los bloques a tubos de 10 ml que contengan 1ml de solución de lisis. Todos los bloques obtenidos del mismo microorganismo deben depositarse en el mismo tubo.  Incubar a 37ºC durante 5 horas.  Tratamiento con proteinasa-K  Decantar la solución de lisis y sustituirla por 1 ml de una solución (ES) de proteinasa-K (1mg/ml) recién preparada  Incubar durante 18 horas a 50ºC.  Lavados  Decantar la solución de proteinasa-K y sustituirla, llenando completamente el tubo, por tampón TE. Disponer los tubos horizontalmente en un agitador orbital y mantenerlos en agitación suave durante 30-45 minutos. Al cabo de ese tiempo, decantar el TE y sustituirlo por uno nuevo repitiendo el proceso. Es necesario repetir este proceso durante 4 ó 5 veces.  Finalizados los lavados los bloques se conservan en TE a 4ºC. Métodos 55  Digestión del AD! con enzimas de restricción  Rotular tubos eppendorf de 1,5 ml con los números de las cepas elegidas y depositar en su interior un bloque extraído del tubo inicial.  Preparar la solución de restricción. Esta reacción se llevará a cabo en un volumen de 60µl del tampón de restricción, al que se le añadirá 1µl de enzima de restricción SmaI (10 Unidades) y 1,2µl de albúmina bovina sérica (BSA).  Añadir 60µl de la solución de restricción en cada uno de los tubos eppendorf conteniendo el bloque correspondiente, asegurándose de que el disco queda inmerso en la solución.  Se incuba a 25ºC durante 18 horas.  Electroforesis en campo pulsátil (ECP)  Preparación del gel de agarosa al 1%  Preparar un gel de agarosa al 1% en 0,5xTBE mezclando los siguientes componentes e hirviendo durante 5-10 minutos. Volumen final Agarosa 10xTBE Agua bidestilada 100 ml (16 pocillos) 1g 5 ml 95 ml 150 ml (30 pocillos) 1,5g 7,5 ml 142,4 ml  Dejar enfriar la solución en agitación durante 30 minutos.  Preparar el molde de ECP de BioRad, encajando la bandeja en el soporte. Seleccionar el peine correspondiente (16 ó 30 pocillos), y colocar consecutivamente en cada uno de los dientes un bloque. Métodos 56 Es recomendable la colocación en los extremos de los marcadores de peso molecular. Como marcador molecular se utilizó lambda ladder y low range (BioLabs). Colocar el peine ya cargado con los discos en las ranuras del molde de ECP.  Verter cuidadosamente la agarosa, evitando que ésta arrastre alguno de los bloques, y esperar 30 minutos hasta que la agarosa solidifique.  Colocación en el sistema CHEF-DRIII  Preparar 2 L de tampón de electroforesis 0,5xTBE (100 ml 10xTBE en 1900 ml de agua bidestilada) y verter en la cubeta de electroforesis.  Poner en marcha.  Las condiciones de los pulsos para Streptococcus pneumoniae son 1-30s. El voltaje (volts/cm) siempre se mantiene en 6.00 y el ángulo se mantiene en 120º.  Bomba de recirculación del tampón de electroforesis. Debe programarse a una velocidad aproximada de 1L/m.  Se ajusta el refrigerador a 11ºC y el tiempo a 20 horas.  Desmontar el molde que contiene al gel y depositarlo, sujeto a la bandeja, en la cubeta de ECP. Comprobar que la cubeta contiene el marco adecuado para la bandeja, ajustar ésta en el espacio correspondiente y cerrar la tapa de la cubeta.  Conectar los electrodos y poner en marcha el sistema.  Extracción del gel y tinción  Una vez finalizados los ciclos de ECP, abrir la tapa de la cubeta y extraer el gel sujeto a la bandeja. La cubeta debe vaciarse del Métodos 57 tampón de electroforesis, utilizando el conector designado para ello, y lavarse con agua bidestilada, si no se va a volver a utilizar inmediatamente.  Desprender el gel de la bandeja y sumergirlo en una solución de bromuro de etidio (1 µg/ml) durante 30 minutos, a temperatura ambiente.  Visualizar el gel en el transiluminador de luz ultravioleta y fotografiarlo. 5.5.2. Análisis de los datos obtenidos por ECP Se empleó el programa informático BioNumerics (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica) para el análisis e interpretación de los patrones de ECP. Este programa permite establecer el valor de similitud entre patrones de electroforesis de diferentes cepas, basándose en el número de bandas obtenidas y sus correspondientes pesos moleculares. De esta forma, se crean dendogramas que permiten el agrupamiento de las cepas. El primer paso en el análisis de los resultados es la normalización de los geles. Esta normalización consiste en asignar a estas bandas el mismo peso (posición) a pesar de las diferencias generadas en el proceso analítico. Una vez normalizados los geles, para calcular la similitud entre un par de cepas pueden usarse varios coeficientes. El más usado es el coeficiente de Dice que se basa en la posición de las bandas. El algoritmo matemático que se utiliza más comúnmente para construir dendogramas a partir de la matriz de similitud, es el método de agrupación por pares no ponderados, usando promedios (Unweighted Pair Group Method using arithmetic Averages: UPGMA). En un dendograma, el punto de corte para considerar las cepas como relacionadas es arbitrario pero la experiencia y la concordancia de sistemas de tipado ayudan a seleccionar el más adecuado. En nuestro estudio, se empleó el método UPGMA, según el cual, el valor de similitud entre las bandas se calcula de acuerdo a la posición de las mismas. Se usó el Métodos 58 coeficiente de similaridad de Dice, para la comparación de los fragmentos de ADN, con una optimización de 1% y una posición de tolerancia de 1%. Se definió como clon a los grupos de dos o más aislamientos que presentan una similitud ≥ 90% en el dendograma. 5.5.3. Estudio clonal mediante multilocus sequence typing (MLST) El MLST es una herramienta de tipificación molecular que caracteriza los aislamientos utilizando las secuencias de ADN de fragmentos internos de genes “housekeeping” que codifican enzimas metabólicos. De cada gen se secuencia aproximadamente un fragmento interno de 450-500 pb. Las diferentes secuencias de cada gen se comparan con las ya existentes en una base de datos centralizada y se les asigna un número que identifica el alelo. Cada uno de estos números, define junto con los otros 6, el perfil alélico o el tipo de secuencia (“sequence type”) de ese aislamiento. La mayoría de las bacterias poseen suficiente variabilidad en estos 7 genes como para que se generen billones de perfiles alélicos distinguibles. El MLST se caracteriza por asignar los alelos de los 7 loci directamente mediante secuenciación del ADN, en lugar de por la mobilidad electroforética de los productos de cada gen. La ventaja del MLST frente a otras técnicas de tipificación, es la facilidad para comparar los resultados con una base de datos centralizada. Sin embargo tiene un coste mayor. Esta técnica se realizó únicamente a las cepas de neumococo resistentes a norfloxacina.  Extracción del ADN La extracción del ADN se realizó a partir de cultivo puro de Streptococcus pneumoniae en placas de Columbia Blood agar, mediante el sistema Quiagen (DNeasy®) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se conservó a -20ºC hasta su análisis.  Amplificación del ADN por PCR Métodos 59 El esquema de MLST del neumococo utiliza los fragmentos internos de los siguientes 7 genes: aroE (shikimato deshidrogenasa) gdh (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) gki (glucosa kinasa) recP (transcetolasa) spi (peptidasa señal I) xpt (xantina fosforribosiltransferasa) ddl (D-alanina-D-alanina ligasa) Los cebadores utilizados para la amplificación de los fragmentos internos de los genes anteriores fueron los siguientes (www.mlst.net): aroE-up, 5'-GCC TTT GAG GCG ACA GC aroE-dn, 5'-TGC AGT TCA (G/A)AA ACA T(A/T)T TCT AA gdh-up, 5'-ATG GAC AAA CCA GC(G/A/T/C) AG(C/T) TT gdh-dn, 5'-GCT TGA GGT CCC AT(G/A) CT(G/A/T/C) CC gki-up, 5'-GGC ATT GGA ATG GGA TCA CC gki-dn, 5'-TCT CCC GCA GCT GAC AC recP-up, 5'-GCC AAC TCA GGT CAT CCA GG recP-dn, 5'- TGC AAC CGT AGC ATT GTA AC Métodos 60 spi-up, 5'-TTA TTC CTC CTG ATT CTG TC spi-dn, 5'-GTG ATT GGC CAG AAG CGG AA xpt-up, 5'-TTA TTA GAA GAG CGC ATC CT xpt-dn, 5'-AGA TCT GCC TCC TTA AAT AC ddl-up, 5'-TGC (C/T)CA AGT TCC TTA TGT GG ddl-dn, 5'-CAC TGG GT(G/A) AAA CC(A/T) GGC AT Los componentes de la PCR se indican en la siguiente tabla: Tabla 9: Mezcla de la reacción de PCR para amplificación de los genes “housekeeping”. Volumen (µ µµ µl) Tampón 10x 5 µl Desoxinucleótidos (d!TPs) 10 mM 1 µl Taq D!A polimerasa (5 U/ µ µµ µl) 0,5 µl Cebadores (10µ µµ µM) 1 µl AD! 1 µl H 2 O estéril Hasta 50 µl Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: • Desnaturalización durante 5 min a 95ºC • Amplificación (30 ciclos)  1 min a 95ºC  1 min a 50ºC Métodos 61  1 min a 72ºC • Extensión durante 30s a 72ºC • Mantener a 4ºC  Purificación del ADN La purificación del producto de amplificación tras la PCR de cada uno de los 7 cebadores se realizó con el sistema comercial QlAquick PCR Purification Kit (250) (QUIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.  Secuenciación del ADN El ADN correspondiente de cada fragmento y cepa se envió a NBT (Newbiotechnic S.A.- NBT. Sevilla) para su secuenciación.  Análisis de las secuencias Una vez obtenidas las secuencias, la asignación de cada alelo y el perfil alélico se llevó a cabo mediante la página web de MLST (www.mlst.net). 5.6. ESTUDIO DE RESISTE!CIA A FLUORQUI!OLO!AS La sensibilidad a levofloxacino (LVX) se determinó mediante el método de difusión E-test y la de norfloxacino (NFX) mediante el método de difusión E-test y disco de 5µg, en placas de Müller-Hinton Sangre (bioMerieux) a 0,5 McFarland. Los aislamientos con una CMI a norfloxacino >16 µg/ml y un halo de inhibición <10 mm se consideraron cepas con resistencia de primer paso o de bajo nivel y los aislamientos con una CMI a norfloxacino >16 µg/ml y una CMI a LVX ≥ 8 µg/ml, se consideraron cepas con resistencia de alto nivel. Métodos 62 5.6.1. Detección de mutaciones mediante hibridación con sondas A los 14 aislamientos con la CMI a NFX >16 µg/ml se les realizó la identificación de las mutaciones que codifican la resistencia a FQs mediante amplificación por PCR seguida de una hibridación reversa con sondas específicas de las secuencias gyrA y parC (GenID® GmbH, Straβberg) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los componentes de la PCR comercial se indican en la siguiente tabla. Tabla 10: Mezcla de la reacción de PCR para la detección de resistencias por hibridación con sondas. Volumen (µ µµ µl) Tampón 10x 2,5 µl MgCl 2 (25mM) concentración final de 2 mM 2 µl Desoxinucleótidos (d!TPs) 2,5 mM 1 µl Taq D!A polimerasa (5 U/ µ µµ µl) 0,2 µl Cebadores 15 µl AD! 1 µl H 2 O estéril Hasta 25 µl La PCR se realizó bajo las siguientes condiciones:  un primer paso de 5 min a 95 ºC  10 ciclos con: • 30 s a 95 ºC • 2 min a 60 ºC  22 ciclos con: • 10 s a 95ºC Resultados 69 6. RESULTADOS 6.1. CARACTERÍSTICAS EPIDEMIOLÓGICAS DE LOS CASOS DE E!I En el periodo 2002-2008, se aislaron en nuestro centro 560 cepas invasivas de Streptococcus pneumoniae [132 muestras de niños (21 LCR, 9 líquidos pleurales, 102 hemocultivos) y 428 muestras de adultos (49 LCR, 38 líquidos pleurales, 7 líquidos articulares, 2 líquidos peritoneales y 332 hemocultivos)]. En la tabla 13 podemos observar el número total de neumococos aislados por año en adultos y niños, considerándose como niños los menores de 15 años. Tabla 13: Distribución interanual de los aislamientos de Streptococcus pneumoniae. Año Cepas totales Adultos !iños 2002 67 43 24 2003 64 43 21 2004 59 45 14 2005 93 73 20 2006 78 54 24 2007 109 93 16 2008 90 77 13 Total 560 428 132 Se puede observar tanto, en la tabla 13 como en la figura 3, un aumento de casos totales a partir del año 2005, alcanzándose el pico máximo con 109 aislamientos en el año 2007. Este aumento de aislamientos de los últimos 4 años es debido a casos diagnosticados en adultos. En niños, sin embargo, no se ha detectado tendencia a la subida. Resultados 70 Figura 3: Distribución interanual de los aislamientos en adultos y niños. 0 20 40 60 80 100 120 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Cepas Infantil Adultos Cuando estudiamos la distribución de los neumococos aislados en el laboratorio en función de los meses y comparamos los diferentes años, vimos que el patrón que seguían era siempre el mismo. Entre septiembre y octubre empiezan a aumentar los casos, alcanzando los picos entre diciembre y marzo y disminuyendo de nuevo hasta septiembre. El mayor número de casos coincide con la época invernal y el menor con el verano (Figura 4). Figura 4: Distribución mensual de los aislamientos. 0 5 10 15 20 25 Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Cepas 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Debido a que el trabajo descriptivo se diseñó de manera retrospectiva, no se pudieron rescatar todas las cepas aisladas en el periodo de estudio, por lo que estas Resultados 71 cifras se han obtenido de la base de datos donde se archiva el trabajo diario del Servicio de Microbiología. En la figura 5 se observa la representación de la distribución mensual de las cepas incluidas en el estudio entre 2005 y 2008, comprobándose que el patrón que siguen nuestras cepas es similar al número total de cepas. Figura 5: Distribución mensual de los aislamientos incluidos en el estudio. 0 2 4 6 8 10 12 14 Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Novienbre Diciembre Cepas 2005 2006 2007 2008 En la tabla 14 se muestra el número de cepas recuperadas en total y las que pertenecían a adultos y niños. En la columna del número total de cepas, entre paréntesis, se indica el porcentaje de cepas recuperadas del total de cepas que se aislaron ese año. Tabla 14: Distribución anual de cepas en adultos y niños, incluidas en el estudio. Año Total (%) Adultos !iños 2001 8 (ND) ND 8 2002 11 (16.4) ND 11 2003 17 (26.5) ND 17 2004 24 (40.6) 11 13 2005 58 (63.7) 38 20 2006 54 (77.1) 30 24 2007 50 (45.8) 36 14 2008 52 (57.7) 44 8 Total 274 (49) 159 115 ND: No Disponible Resultados 72 Entre los años 2001 y 2003 apenas se pudieron recuperar neumococos del cepario. Los pocos aislamientos que se incluyeron para el estudio fueron cedidos de otro estudio realizado en el hospital y pertenecían todos a la población pediátrica. En el 2001 no sabemos el número total de neumococos que se aislaron, ya que no hay datos disponibles de ese año. Entre los años 2004 y 2008 se pudieron recuperar entre el 40% y el 77% de las cepas. En total se incluyeron 274 (49%) aislamientos, distribuidos entre niños y adultos como se muestra en la figura 6. Figura 6: Distribución interanual de las cepas incluidas en el estudio. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Cepas Infantil Adultos 6.2. CARACTERÍSTICAS CLÍ!ICAS Y EVOLUCIÓ! En cuanto a las patologías descritas en los pacientes, los diagnósticos más frecuentes fueron la neumonía adquirida en la comunidad (NAC) con 146 casos, la bacteriemia con 71 casos y la meningitis con 52 casos (tabla 15). Tabla 15: Distribución del número de pacientes y cepas en función del cuadro clínico. Cuadro clínico !º pacientes (%) !º aislamientos invasivos !AC 146 (53) 150 Bacteriemia 71 (26) 76 Meningitis 52 (19) 72 Otros 5 (2) 6 Total 274 304 Resultados 73 Aunque en algunos pacientes se aislara el neumococo en varias muestras invasivas (no se aportan datos de aislamientos en muestras no invasivas), para el posterior estudio sólo se consideró una cepa por paciente. Entre todos estos casos se describió un shock séptico en 8 pacientes, 2 con meningitis, 3 con neumonía y 3 con una sepsis sin foco. Una de las dos meningitis tenía un foco ótico. En el apartado “otros” de la tabla 15 se han agrupado un caso de osteomielitis, 2 casos de artritis séptica y 2 casos de peritonitis. El caso de la osteomielitis fue en un niño de un mes de edad que también tenía un absceso epidural y en el que el neumococo se aisló en sangre. Las artritis fueron en un adulto y en un niño, y en ambos, el neumococo se aisló en líquido articular. Los dos casos de peritonitis fueron en adultos. El neumococo se aisló en sangre en ambos casos y en líquido peritoneal en uno de ellos. Respecto a los 146 casos de enfermedad neumocócica invasiva (ENI) diagnosticados como neumonía, 94 (64,4%) pertenecían a adultos y 52 (35,6%) a niños. Por otro lado, 26 de los pacientes con neumonía desarrollaron un empiema. De éstos últimos, 10 fueron adultos y 16 niños (tabla 16). Tabla 16: Distribución de los casos de neumonía y empiema entre adultos y niños. Adultos !iños Total !AC 84 36 120 !AC-Empiema 10 16 26 Total !AC 94 52 146 Si tenemos en cuenta el número de empiemas desarrollados respecto a las neumonías totales de cada grupo, vemos que en niños el 30,8% de estas neumonías desarrollaron un empiema y el 10,6% en adultos, obteniéndose un valor de p= 0,0023. Resultados 74 Por otro lado, tal y como se observa en la tabla 17, de los 159 S. pneumoniae aislados en adultos, las neumonías supusieron el 59% (94 pacientes), mientras que de los 115 aislamientos infantiles, las neumonías supusieron el 45% (52 pacientes). Si aceptamos un nivel de significación de 0,05, podemos afirmar que hubo diferencias significativas. El 6,3 % de las patologías en adultos fueron empiemas. En niños éstas llegaron al 14%, siendo esta diferencia estadísticamente significativa. De los 16 niños con un empiema, 9 eran menores de 1 año, 3 tenían 2 años, 1 tenía 3 años, otro 5 años, otro 9 años y otro 12. En 71 pacientes se aisló el neumococo sólo en sangre, sin ningún foco aparente. Con un 26,4% de bacteriemias en adultos y un 25,2% en niños, la diferencia no fue significativa entre ellos. En 52 pacientes el diagnóstico fue de una meningitis, 32 casos de niños y 20 de adultos. En cinco de los adultos se describió un foco ótico. Los casos de meningitis, alcanzaron el 12,6% y el 28% de los S. pneumoniae aislados en adultos y niños respectivamente. La diferencia fue estadísticamente significativa. Tabla 17: Distribución de los casos en función de la patología diagnosticada y el grupo de adultos o niños. Adultos (%) !iños (%) Total p∗ ∗∗ ∗ !AC 84 (53) 36 (31,3) 120 0,0228 !AC-Empiema 10 (6,3) 16 (14) 26 0,0336 Meningitis 20 (12,6) 32 (28) 52 0,0015 Bacteriemia 42 (26,4) 29 (25,2) 71 0,8233 Otros 3 2 5 - Total 159 115 274 * χ 2 Vemos, por tanto, que los adultos presentan más neumonías pero menos empiemas que los niños y que éstos tienen más empiemas y meninigitis. Resultados 75 Si analizamos la rentabilidad diagnóstica en función del tipo de muestra en la que se aislaron las cepas en cada patología, observamos que de los 146 casos de NAC, en 135 el neumococo se aisló en el hemocultivo (tabla 18), como era esperable ya que sólo hemos considerado la ENI. Tabla 18: Distribución de los neumococos causantes de !AC en función de la muestra en la que se hallaron. Patología (n) Sangre L.Pleural Bx pulm. !AC (120) 119 - 1 !AC-Empiema (26) 16 10 - Total !AC (146) 135 10 1 De estos 135 neumococos aislados en hemocultivos, 16 pertenecían a pacientes con diagnóstico de empiema, pero sin aislamiento en el líquido pleural. En los 10 casos restantes de empiema, el neumococo se aisló en líquido pleural. Nueve de estos 10 pacientes fueron niños. Teniendo en cuenta que el líquido pleural se estudió en 22 de los 26 casos de empiema, podríamos decir que el líquido pleural tiene una rentabilidad diagnóstica del 45% y que la rentabilidad del hemocultivo para los empiemas fue de 61,5%. Por otro lado, hubo un caso de un niño de 324 días que ingresó con broncoespasmos y tras su fallecimiento se aisló el neumococo en una biopsia pulmonar. Es de destacar que de los 52 pacientes diagnosticados de meningitis, en 14 (27%) casos S. pneumoniae se aisló exclusivamente en hemocultivos. En 19 casos sólo en L.C.R. y en otros 19 casos se aisló tanto en hemocultivo como en L.C.R. (tabla 19). Por tanto la rentabilidad diagnóstica del hemocultivo ha sido del 63,5% y del 73% en L.C.R. Tabla 19: Distribución de los neumococos causantes de meningitis en función de la muestra en la que se aislaron. Patología (n) Sangre LCR S+LCR Meningitis (52) 14 19 19 Resultados 76 En total, fallecieron 33 pacientes (12%), 7 de los cuales eran niños, 3 con meningitis, 3 con neumonía y 1 con una sepsis. De los 26 (16%) adultos fallecidos, hubo 1 caso con un empiema, 1 caso con meningitis de origen ótico, 4 sepsis y 20 neumonías (tabla 20). La mortalidad en adultos alcanzó el 16%, mientras que en los niños supuso el 6%. Tabla 20: Distribución de los fallecidos en adultos y niños en función de la patología. Adultos !iños !AC 20 3 !AC-Empiema 1 0 Sepsis 4 1 Meningitis 1 3 Total 26 7 6.3. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS a. Edad Se obtuvo el dato de la edad en 248 de 273 pacientes. Al comparar el número de pacientes en cada grupo etario, observamos que existe un predominio de casos en el grupo de niños menores de 2 años seguido del grupo de edad comprendida entre los 60 y 90 años. Las edades más afectadas son, por tanto, las de los extremos de la vida (figura 7). Resultados 77 Figura 7: Distribución de los aislamientos incluidos en el estudio en función de la edad. 77 29 28 48 66 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 <2 3 años-14 15-39 40-59 60-90 Cepas b. Género Respecto al sexo de los pacientes, 165 (60.4%) eran hombres y 108 (39.6%) mujeres. Si observamos la diferencia de género separando la población infantil de la adulta obtenemos los resultados que se indican en la tabla 21. Tabla 21: Distribución de los casos entre hombre y mujeres, en niños y en adultos. Adultos !iños p ∗ ∗∗ ∗ Hombres 105 (66.4%) 60 (52.2%) Mujeres 53 (33.6%) 55 (47.8%) Total 158 115 0,0172 * χ 2 En la población adulta, el 66,4% de los afectados fueron hombres y el 33,6% mujeres. En la población infantil el 52,2% fueron niños y el 47,8% niñas. La diferencia que encontramos fue significativa. En adultos, si observamos la diferencia de la mortalidad en función del sexo, vemos que de los 26 fallecidos que hubo, 18 (69%) fueron hombres y 8 (31%) mujeres, porcentajes similares a la distribución de la ENI en función del género. Resultados 78 6.4 RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS 6.4.1. Aislamiento e identificación de los microorganismos Las cepas se identificaron, en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Virgen del Rocío, como Streptococcus pneumoniae basándose en la morfología de las colonias, la sensibilidad a la optoquina y la solubilidad en bilis. En agar sangre se observó crecimiento abundante a las 18-24 horas de incubación en CO 2 al 5% y 37ºC. Las colonias presentaron una morfología circular, con un diámetro de 0.5-2 mm. Su aspecto era brillante, con una pequeña invaginación en el centro y rodeadas por una zona verdosa de hemólisis alfa. El número y tipo de muestra en la que se aisló e identificó Streptococcus pneumoniae se indica en la tabla 22. Tabla 22: Distribución de muestras incluidas en el estudio. MUESTRA !ÚMERO Sangre L.C.R. Sangre y L.C.R. Líquido Pleural Líquido Sinovial Biopsia Pulmonar Líquido Peritoneal/Sangre Total 222 19 19 10 2 1 1 274 6.4.2. Estudio de sensibilidad Las pruebas de sensibilidad de cada aislado de S. pneumoniae se realizaron siguiendo los protocolos vigentes en cada momento y en la sección en la que se procesó la muestra. Las pruebas de sensibilidad se realizaron mediante E-test y se interpretaron siguiendo las guías del CLSI. En el caso del S. pneumoniae, los puntos de corte para la Resultados 85 Tabla 24: Distribución de los serotipos en cada PCR y los resultados obtenidos de cada serotipo y cada reacción. Serotipos incluidos en cada PCR Producto de PCR esperado (pb) Serotipos obtenidos en adultos (%) n:159 Valor acumulativo (%) Serotipos obtenidos en niños (%) n:115 Valor acumulativo (%) PCR 1 19A 3 22F 6 478 371 643 250 36 (22,6) 13 7 9 7 36 (22,6) 34 (29,6) 8 7 3 16 34 (29,6) PCR 2 4 14 12F 7F 430 208 376 826 50 (31,4) 8 17 10 15 86 (54) 25 (21,7) 0 15 0 10 59 (51,3) PCR 3 1 16F 35F 5 280 988 517 362 29 (18,2) 13 3 2 11 115 (72,3) 25 (21,7) 18 2 0 5 84 (73,0) PCR 4 23F 9V 11A 8 384 753 463 294 15 (9,4) 1 6 4 4 130 (81,7) 8 (7,0) 3 1 3 1 92 (80,0) PCR 5 19F 15A 18 35B 304 436 573 677 16 (10,1) 5 6 2 3 146 (92) 10 (8,7) 3 0 6 1 102 (88,7) PCR 6 33F 15B/C 38 31 338 496 574 701 5 (3,1) 3 1 1 0 151 (95) 2 (1,7) 1 0 0 1 104 (90,4) PCR 7 20 7C 17F 34 514 260 693 408 3 (1,9) 0 0 3 0 154 (97) 2 (1,7) 0 0 1 1 106 (92,2) 10 628 0 0 No amplificación 2 (1,3) 2 (1,7) No tipables 3 (1,8) 7 (6,1) Si comparamos los resultados obtenidos con el esquema modificado y los que habríamos obtenido con el esquema original, vemos que se ha mejorado la eficiencia del esquema tanto en adultos como en niños, ya que el porcentaje de cepas tipadas con las Resultados 86 primeras reacciones es mayor en ambos casos (figura 13 y 14). Además, incluyendo el serotipo 5, que el esquema original no lo incluía, aumenta el número de cepas tipadas. Figura 13: Comparación del porcentaje de aislamientos tipados con cada reacción, entre el esquema original y el modificado en aislamientos de adultos. 31,4 18,2 9,4 10,1 3,1 1,9 9,4 5,7 6,9 22,6 3,8 25,8 14,5 8,2 0 5 10 15 20 25 30 35 MM1 MM2 MM3 MM4 MM5 MM6 MM7 Srtp. 5 % H.U.V.R C.D.C Como se observa en la última columna de las figura 13 y 14, el serotipo 5 se detectó en el 6,9% y 4,3% de las cepas, respectivamente y no estaba incluido en el protocolo. Figura 14: Comparación del porcentaje de aislamientos tipados con cada reacción, entre el esquema original y el modificado en aislamientos de niños. 21,7 21,7 78,7 1,7 1,7 10,4 1,7 16,5 0,9 4,3 29,6 14,8 13,9 0 5 10 15 20 25 30 35 MM1 MM2 MM3 MM4 MM5 MM6 MM7 Srtp. 5 % H.U.V.R C.D.C En los aislamientos de pacientes adultos, el esquema modificado de la PCR múltiple secuencial nos permitió tipar el 72,3% de las cepas con las primeras tres reacciones y con las dos PCR siguientes se tipó el 92%, mientras que aplicando el Resultados 87 esquema original, hubieramos tipado el 63% y el 74,9% respectivamente (Fig. 13). En los aislamientos del grupo pediátrico, los resultados obtenidos fueron el 73% versus 58,3% con las tres primeras reacciones y el 88,7% versus el 70,4% con dos PCRs adicionales (Fig. 14). El cebador utilizado para tipar el serogrupo 6, amplificaba un fragmento que no permitía distinguir entre los diferentes serotipos de este grupo, de modo que hubo que aplicar otras técnicas a los aislamientos con este serogrupo. Por secuenciación de los 23 aislamientos 6A/B se identificaron 10 como 6A/C y 12 como 6B. En un caso no se pudo diferenciar. De los 10 6A/C, obtuvimos 3 aislamientos del serotipo 6C por PCR. La distribución final del serotipo 6 fue: doce cepas del 6B, siete cepas del serotipo 6A, tres cepas del 6C y una cepa que no se pudo diferenciar (figura 15). Figura 15: Distribución de los subtipos del serotipo 6. 7 12 31 6A 6B 6C 6A/B 6.5.1. Serotipos obtenidos vs serotipos vacunales Cómo ya se ha mencionado anteriormente, en 1983 se autoriza en Estados Unidos una vacuna antineumocócica no conjugada que contiene los antígenos polisacarídicos capsulares de 23 serotipos. En febrero del año 2000, la FDA aprobó la vacuna conjugada heptavalente antineumocócica en Estados Unidos que incluye los siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) más frecuentemente implicados en la etiología de la enfermedad invasora neumocócica en niños menores de 2 años. En 2009 se aprobó la vacuna decavalente con tres serotipos más (1, 5 y 7F) y en febrero de 2010 Resultados 88 sale la vacuna tridecavalente que engloba los 13 serotipos más comunes, los 10 anteriores más el 19A, el 3 y el 6A. En la tabla 25 se muestran ordenados por el número de casos los serotipos obtenidos y la cobertura de éstos por las diferentes vacunas neumocócicas. El serotipo mayoritario en nuestro caso, el 14, está cubierto por todas las vacunas, pero los siguientes cinco serotipos más frecuentes no los cubre el la vacuna heptavalente. Sin embargo, con la PCV13 quedarían cubiertos los 7 primeros. La vacuna no conjugada cubriría nuestros 15 serotipos más frecuentes, excepto el 6A, que sí lo cubre la PCV13. Tabla 25: Distribución de los serotipos y su cobertura por las diferentes vacunas neumocócicas. Serotipo !º de casos PCV7 PCV10 PCV13 PPV23 14 32 + + + + 1 31 + + + 7F 25 + + + 19A 21 + + 5 16 + + + 3 14 + + 6B 12 + + + + 22F 12 + 12F 10 + 4 8 + + + + 19F 8 + + + + Sg18 8 + + + + 6A 7 + 9V 7 + + + + 11A 7 + 15A 6 8 5 + 16F 5 35B 4 17F 4 + 23F 4 + + + + 33F 4 + 6C 3 Resultados 89 Serotipo !º de casos PCV7 PCV10 PCV13 PPV23 35F 2 15B/C 1 + 38 1 31 1 34 1 No obstante, la prevalencia de los distintos serotipos en los diferentes grupos de edad varía y con ello la composición e indicación de las vacunas. Por ello, hemos estudiado los serotipos obtenidos en niños menores de 6 años y la cobertura de éstos por las diferentes vacunas indicadas para ellos. Así, encontramos que con la PCV7 cubrimos el 35,2% de los casos. Si a esto le sumamos los 6 serotipos más que cubre la PCV13, abarcaríamos casi el 80% de los casos en niños menores de 6 años (figura 16). Figura 16: Porcentaje de casos de E!I en niños menores de 6 años en función de los serotipos vacunales. 20,9 35,2 16,5 3,3 6,6 7,7 3,3 6,6 otros srtps PCV7 1 5 7F 19A 6A 3 Si comparamos el porcentaje de cobertura de las diferentes vacunas según los grupos de edad a partir de los 6 años, podemos observar que con la PCV7 cubrimos entre el 7 y el 31% de los casos, con la PCV13 entre el 60-70% de los casos y con la PPV23 entre el 80-90% de los casos (figura 17). Resultados 90 Figura 17: Porcentaje de casos de E!I causados por los serotipos vacunales agrupados por tipo de vacuna y en función de los grupos de edad. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 6 años-14 15-39 40-59 60-90 % casos PCV7 PCV13 PPV23 6.5.2. Evolución interanual de los serotipos obtenidos Teniendo en cuenta las limitaciones del corto periodo de estudio y el tamaño muestral, definir la tendencia o patrón a seguir por cada serotipo no es fácil. Además, la escasa tasa de vacunación en España, dificulta la valoración del efecto de la vacuna tanto en los serotipos vacunales como en los no vacunales, aunque se sepa que la vacuna también tiene efecto sobre la población no vacunada. En las siguientes gráficas se representan los porcentajes obtenidos cada año de los diferentes serotipos. Las figuras siguientes (Figuras 18 a 24), muestran la evolución de los serotipos de la vacuna heptavalente (14, 23F, 18C, 6B, 19F, 4, 9V). Resultados 91 Figura 18: Distribución anual de las cepas del serotipo 14 (n= == = 32) Serotipo 14 0 5 10 15 20 25 30 35 40 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Los resultados obtenidos con el serotipo 14, muestran una tendencia a la bajada en los últimos años. Figura 19: Distribución anual de las cepas del serotipo 23F (n= == = 4) Serotipo 23F 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Tal y como se observa en la gráfica 17, el serotipo 23F muestra una tendencia a la bajada en los últimos años. Figura 20: Distribución anual de las cepas del serogrupo 18 (n= == = 8) Serogrupo 18 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Resultados 92 El serogrupo 18, al igual que el serotipo 6B y el 19F (figura 20, 21 y 22) también parecen tener una tendencia a la baja. Figura 21: Distribución anual de las cepas del serotipo 6B (n= == =12) Serotipo 6B 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Figura 22: Distribución anual de las cepas del serotipo 19F (n= == =8) Serotipo 19F 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Figura 23: Distribución anual de las cepas del serotipo 4 (n= == =8) Serotipo 4 0 1 2 3 4 5 6 7 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Resultados 93 Figura 24: Distribución anual de las cepas del serotipo 9V (n= == =7) Serotipo 9V 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Hasta ahora hemos visto la evolución de los serotipos de la vacuna heptavalente. Exceptuando el serotipo 4 y el 9V, en los demás se observa una tendencia a disminuir. En las Figuras 25 a 30 se recoge la evolución de los serotipos 1, 7F, 6A, 3, 19A y 5, que son los añadidos a la formulación de la vacuna PCV13. Figura 25: Distribución anual de las cepas del serotipo 1(n= == =31) Serotipo 1 0 5 10 15 20 25 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Resultados 94 Figura 26: Distribución anual de las cepas del serotipo 7F (n= == =25) Serotipo 7F 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Figura 27: Distribución anual de las cepas del serotipo 6A (n= == =7) Serotipo 6A 0 1 2 3 4 5 6 7 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Figura 28: Distribución anual de las cepas del serotipo 3 (n= == =14) Serotipo 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 % casos Resultados 101 serotipo (figura 38-47). Por otro lado, en 17 (4, 6B, 6C, 8, 11A, 15A, 15B/C, 16F, 17F, 18, 19F, 23F, 31, 34, 35B, 35F y 38) de los 28 serotipos/serogrupos obtenidos, obtuvimos muy pocas cepas como para valorar su relación clonal o se halló una variabilidad alta entre las cepas del mismo serotipo. En la figura 37 presentamos un ejemplo de ECP. Las cepas de los pocillos 1, 2, 3, 10 y 11 comparten el mismo pulsotipo y son todas del serotipo 1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Figura 37: Imagen de una ECP de aislamientos de neumococo . De izquierda a derecha: 1. Cepa 15, 2. Cepa 20, 3. Cepa 21, 4. Cepa 22, 5. Cepa 23, 6. Cepa 24, 7. Cepa 25, 8. Marcador de peso molecular, 9. Cepa 27, 10. Cepa 28, 11. Cepa 29. a. Serotipo 1 Se estudiaron las 31 cepas del serotipo 1 mediante ECP, 25 pertenecían a pacientes diagnosticados de neumonía, de los cuales 9 desarrollaron un empiema, uno a un paciente con una artritis, 2 a pacientes con meningitis y el resto eran casos de bacteriemia. El análisis de patrones de ECP utilizando el programa informático bioNumerics, diferenció 7 pulsotipos y 2 clones. El pulsotipo mayoritario (A), incluía 24 (77,4%) Resultados 102 Dice (Opt:1.50%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] neumococos 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 neumococos cepa 62 63 146 191 213 154 229 237 251 269 40 72 124 241 61 187 84 220 15 20 21 28 29 67 120 99 73 123 50 12 6 serotipo 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Origen H. Infantil H. Infantil Urgencias UCI Observación Observación UCI UCI Observación H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil Urgencias H. Infantil M. Interna UCI Observación H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil Urgencias H. Infantil H. Infantil Infecciosas H. Infantil H. Infantil Año 2005 2005 2006 2007 2007 2006 2008 2008 2008 2008 2004 2005 2006 2008 2005 2007 2005 2007 2002 2003 2003 2003 2003 2005 2006 2005 2005 2006 2004 2002 2001 ECP A1 A1 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A3 A3 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 A4 B C D E F F G cepas (figura 38), sin clara relación epidemiológica, ya que se aislaron muy separados en el tiempo y en diferentes servicios. Dentro de las 24 cepas del clon A, había 4 patrones (A1, A2, A3 y A4) de 2 cepas o más. El patrón que más cepas incluía era el A2 con 11 cepas, seguido del A4 con 9 cepas y por último el A1 y el A3 con 2 cepas en cada. En total, el 84% de las cepas pertenecía a alguno de los dos clones. Figura 38: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 1 Resultados 103 Dice (Opt:1.50%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] neumococos 100 95 90 85 80 75 70 neumococos cepa 224 66 121 153 89 170 32 83 215 171 125 174 serotipo 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Origen D. del Infantado H. Infantil H. Infantil UCI D. del Infantado Infecciosas H. Infantil Urgencias D. del Infantado Respiratorio H. Infantil H. Infantil Año 2008 2005 2006 2006 2005 2006 2003 2005 2007 2006 2006 2007 ECP A A A B B B B C C C C D b. Serotipo 3 Figura 39: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 3 En el caso del serotipo 3, hay dos cepas de las que no disponemos del patrón de ECP. En total se estudiaron 12 cepas del serotipo 3, que fueron responsables de 9 neumonías, de las cuales 3 fueron empiemas, 2 meningitis y 1 bacteriemias. El análisis de patrones de ECP utilizando el programa informático BioNumerics, diferenció 4 pulsotipos y 3 clones diferentes. El 92% de las cepas se agrupaba en algún clon. El clon A tenía 3 cepas indistinguibles, aisladas en años diferentes, 2 pediátricas y una de adulto. Del clon B teníamos 4 cepas, una de 2003, otra de 2005 y 2 de 2006, con 5 meses de diferencia. El clon C, también formado por 4 cepas, 3 de adultos y una infantil, pertenecían a diferentes servicios y años (figura 39). c. Serotipo 5 Se estudiaron las 16 cepas del serotipo 5 mediante ECP, siendo responsables de 11 neumonías y 5 bacteriemias. Todas pertenecían al mismo clon, en el que se distinguían dos patrones con una similitud del 99,20%. El patrón A1 incluía 2 cepas, una de adulto de 2005 y otra infantil de 2007. El patrón A2, el mayoritario, estaba Resultados 104 compuesto por 14 cepas. Menos una cepa de 2006, las otras cepas estaban repartidas entre 2007 y 2008 (figura 40). Figura 40: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 5. Los 16 aislamientos estudiados mostraron una similitud del 99,2%. d. Serotipo 7F De las 25 cepas del serotipo 7F que teníamos, obtuvimos la ECP en 23, 14 neumonías, 1 empiema, 2 meningitis y 6 bacteriemias. El análisis de patrones de ECP utilizando el programa informático BioNumerics, diferenció 5 pulsotipos, de los cuales uno fue el mayoritario (C), comprediendo el 83% de las cepas (figura 41). El clon C incluía 19 cepas, divididas en 5 patrones. El C1, con 12 cepas, era el que tenía mayor número. El C2 incluía una cepa, el C3 otra, el C4 otra y el C5 estaba formado por 4 cepas, todas de niños, una de 2005 y tres de 2006. Dice (Opt:1.50%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] neumococos 100 neumococos . . . . . . . . . . . . . . . . cepa 199 118 185 182 196 200 206 214 152 221 232 233 240 253 254 257 serotipo 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Origen H. Infantil Observación Observación H. Infantil M. Interna Observación Reumatología D. del Infantado H. Infantil M. interna Cirugía Reumatología Urgencias H. Infantil Urgencias H. Infantil Año 2007 2005 2007 2007 2007 2007 2007 2007 2006 2007 2008 2008 2008 2008 2008 2008 ECP A1 A1 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 Resultados 105 Dice (Opt:1.50%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] neumococos 100 95 90 85 80 75 70 neumococos cepa 225 132 150 122 57 59 218 219 238 245 248 252 273 27 263 227 39 75 131 133 137 134 272 serotipo 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F 7F Origen M. Interna H. Infantil M. Interna H. Infantil UCI Respiratorio UCI Urgencias Infecciosas H. Infantil Observación Infecciosas M. Interna H. Infantil Respiratorio C. Externas H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil UCI Año 2008 2006 2006 2006 2004 2004 2007 2007 2008 2008 2008 2008 2008 2003 2008 2008 2004 2005 2006 2006 2006 2006 2008 ECP A B C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C2 C3 C4 C5 C5 C5 C5 D E Figura 41: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 7F e. Serotipo 12F En total se estudiaron las 10 cepas del serotipo 12F mediante ECP, 8 cepas pertenecientes a pacientes diagnosticados de neumonía, 1 de meningitis y otra de bacteriemia. El análisis de patrones de ECP utilizando el programa informático BioNumerics, diferenció 4 pulsotipos y 2 clones, que engloban el 80% de las cepas. El clon A incluía 4 cepas indistinguibles, aisladas una en 2007 y 3 en 2008, todas de adultos. Del pulsotipo B y C había una cepa de cada. El clon D, también estaba formado por 4 cepas, aisladas entre 2004 y 2005 (figura 42). Resultados 106 Dice (Opt:1.50%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] neumococos 100 95 90 85 80 neumococos cepa 217 246 258 262 234 114 92 52 95 102 serotipo 12F 12F 12F 12F 12F 12F 12F 12F 12F 12F Origen Urgencias M. Interna Urgencias H. Maternal Cardiología Reumatología Infecciosas Urgencias Urgencias UCI Año 2007 2008 2008 2008 2008 2005 2005 2004 2005 2005 ECP A A A A B C D D D D Figura 42: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 12F f. Serotipo 14 y 9V Se estudiaron 31 cepas de las 32 del serotipo 14 mediante ECP. El análisis de patrones de ECP utilizando el programa informático BioNumerics, incluyó las 7 cepas del serotipo 9V entre las cepas del serotipo14. De este modo, algunas cepas del serotipo 9V estaban más relacionadas clonalmente con cepas del serotipo 14 que con las otras del 9V. En la figura 43 se muestra el dendograma del serotipo 14 y el 9V. Se pueden observar 20 pulsotipos y 5 clones, de los cuales el H es el mayoritario, con 11 cepas divididas en 7 patrones diferentes. El patrón H1, incluía 3 cepas, 2 del serotipo 9V y un del 14. Los dos del 9V se aislaron entre febrero y marzo del 2008. El paciente de la UCI tenía una meningitis y el paciente de Medicina Interna falleció con una sepsis. El patrón H2 incluía una cepa. Con el patrón H3, teníamos 3 cepas del serotipo 14, de adultos aisladas en 2005. Los patrones H4, H5, H6 y H7 incluían 1 cepa cada uno. En total el 60,5% (n=23) de las cepas formaba parte de algún clon. Resultados 107 Dice (Opt:1.50%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] neumococos 100 95 90 85 80 75 70 65 neumococos cepa 265 19 126 76 159 163 88 90 264 9 239 243 13 136 81 96 117 169 26 148 43 11 160 260 157 111 166 261 259 109 51 25 147 1 74 127 24 71 serotipo 9V 14 14 14 14 14 9V 9V 14 14 9V 9V 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 9V 14 14 9V 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 Origen Valme H. Infantil H. Infantil H. Infantil Urgencias UCI Oncología Respiratorio Valme H. Infantil M. Interna UCI H. Infantil H. Infantil UCI Hematología Observación Observación H. Infantil Hematología H. Infantil H. Infantil Observación M. Interna UCI UCI Hematología H. Infantil Diálisis Observación M. Interna H. Infantil M. Interna H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil H. Infantil Año 2008 2002 2006 2005 2006 2006 2005 2005 2008 2002 2008 2008 2002 2006 2005 2005 2005 2006 2003 2006 2004 2002 2006 2008 2006 2005 2006 2008 2008 2005 2004 2003 2006 2001 2005 2006 2003 2005 ECP A B C D E1 E2 F1 F1 F2 G H1 H1 H1 H2 H3 H3 H3 H4 H5 H6 H7 I J J K L1 L1 L2 L3 L4 M N Ñ O P Q R S Figura 43: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 14 y 9V Resultados 108 Dice (Opt:1.50%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] neumococos 100 95 90 85 80 75 70 65 neumococos cepa 184 55 242 204 14 79 130 186 250 167 44 208 178 172 135 210 106 216 70 103 serotipo 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A 19A Origen M. Interna UCI Urgencias Cardiología H. Infantil H. Infantil H. Infantil UCI Urgencias Observación H. Infantil UCI H. Infantil Reumatología H. Infantil D. del Infanta. UCI H. Infantil H. Infantil UCI Año 2007 2004 2008 2007 2002 2005 2006 2007 2008 2006 2004 2007 2007 2006 2006 2007 2005 2007 2005 2005 ECP A A A B C1 C1 C1 C2 C2 D D E1 E2 F G H I J K L g. Serotipo 19A Se estudiaron mediante ECP, 20 de las 21 cepas del serotipo 19A, responsables de 8 neumonías, 3 meningitis y 9 bacteriemias. El análisis de patrones de ECP utilizando el programa informático BioNumerics, diferenció 12 pulsotipos y 4 clones (60% de las cepas), de los cuales el C era el mayoritario con 5 cepas divididas en 2 patrones. Le seguía el clon A, con 3 cepas indistinguibles y los clones E y D con 2 cepas cada uno (figura 44). Las cepas se distribuyen entre diferentes servicios y años. Figura 44: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 19A Resultados 109 h. Serotipo 22F En total se estudiaron 12 cepas del serotipo 22F, 7 neumonías, 1 meningitis, 1 peritonitis y 3 bacteriemias. El análisis de patrones de ECP utilizando el programa informático BioNumerics, diferenció 5 pulsotipos, de los cuales uno era mayoritario con 7 cepas (clon C). Dentro del clon C encontramos 3 patrones (figura 45). El C1 contenía 2 cepas indistinguibles, el patrón C2 estaba formado por una cepa y el patrón C3 contenía 4 cepas indistinguibles, una infantil aislada en 2004 y 3 de adultos aisladas en febrero de 2005. Dos de éstos tres últimos eran pacientes ingresados en el Duque del Infantado y del tercero se desconoce este dato. Este último paciente y uno de los del Duque del Infantado fallecieron durante el episodio de la ENI. El 75% de las cepas formaba parte de uno de los dos clones. Figura 45: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 22F i. Serotipo 33F El análisis de los patrones de las 4 cepas del serotipo 33F, mostró que había una relación clonal entre ellas. Con una similitud de más del 90%, las 4 eran parte de un Dice (Opt:1.50%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] neumococos 100 95 90 85 80 75 70 neumococos . . . . . . . . . . . . cepa 176 226 54 34 235 93 94 97 45 266 104 270 serotipo 22F 22F 22F 22F 22F 22F 22F 22F 22F 22F 22F 22F Origen H. Infantil Urgencias Reumatología H. Infantil M. interna Desconocido D. del Infantado D. del Infantado H. Infantil Reumatología Infecciosas Respiratorio Año 2007 2008 2004 2003 2008 2005 2005 2005 2004 2008 2005 2008 ECP A B C1 C1 C2 C3 C3 C3 C3 D E1 E2 Resultados 110 100 98 96 94 . . . . cepa 164 100 108 64 serotipo 33F 33F 33F 33F Origen Respiratorio Urgencias Oncología H. Infantil Año 2006 2005 2005 2005 ECP A1 A1 A1 A2 clon con 2 patrones diferentes. El patrón A1 englobaba 3 cepas indistinguibles. Las tres perten: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 19Aecían a adultos, pero fueron aisladas en años o meses diferentes. Con el patrón A2 había una cepa de un niño. Figura 46: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 33F j. Serogrupo 6 Se estudiaron mediante ECP las 7 cepas del serotipo 6A. El análisis mostró 4 pulsotipos y dos clones (71% de las cepas). El clon A incluía 3 cepas indistinguibles, 2 de adultos de 2006 y una infantil de 2007. La cepa 144 fue aislada en febrero de 2006 del LCR de un paciente de la UCI con meningitis. La cepa 145 se aisló en mayo de 2006 en un hemocultivo de un paciente de Medicina Interna con neumonía. Los pulsotipos B y C sólo contenían una cepa y el clon D incluía 2 cepas indistinguibles de dos casos de meningitis del infantil, uno de 2006 y otro de 2007 (figura 47). Figura 47: Dendograma obtenido de las cepas de S. pneumoniae serotipo 6A Si estudiamos el análisis clonal de las cepas de todos los tipos del serotipo 6, se observa que no existe una relación clonal entre ellas. Entre las cepas del serotipo 6B, 100 95 90 85 80 75 70 65 . . . . . . . cepa 144 145 183 249 175 128 177 serotipo 6A 6A 6A 6A 6A 6A 6A Origen UCI M. Interna H. Infantil Observación H. Infantil H. Infantil H. Infantil Año 2006 2006 2007 2008 2007 2006 2007 ECP A A A B C D D Resultados 117 Dice (Opt:1.50%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] neumococos 100 95 90 85 80 75 70 65 neumococos cepa 143 87 42 184 242 32 127 90 14 201 156 172 serotipo 6A/B 8 18C 19A 19A 3 14 9V 19A NA 38 19A Origen UCI Urgencias H. Infantil M. Interna Urgencias H. Infantil H. Infantil Respiratorio H. Infantil Infecciosas Infecciosas Reumatología Año 2006 2005 2004 2007 2008 2003 2006 2005 2002 2007 2006 2006 ECP A A B C C D E F G H H I Figura 49: ECP de los aislamientos de S. pneumoniae resistentes a norfloxacina d. Multilocus Sequence Typing (MLST) Los resultados obtenidos del análisis de ADN mediante secuenciación se muestran en la tabla 30. Las cepas con el mismo tipo de secuencia están sombreadas con el mismo color. En 3 aislamientos (nº 32, 42 y 127) no se pudo realizar la técnica. Tabla 30: MLST de los neumococos resistentes a !FX. !º asignado por alelo CEPA Serotipo ECP ST aroE gdh gki recP spi xpt ddl 14 19A G 7466 2 19 2 17 6 22 271 87 8 A 7340 2 5 36 12 17 21 271 90 9V F 7464 7 99 10 1 6 58 1 143 6A A 7340 2 5 36 12 17 21 271 156 38 H 105 5 15 4 1 6 1 6 162 8 - 7340 2 5 36 12 17 21 271 172 19A I 7465 7 5 1 1 6 31 271 184 19A C 1201 1 5 1 12 17 3 8 201 NA H 105 5 15 4 1 6 1 6 203 7F - 7341 8 9 2 1 6 446 17 242 19A C 1201 1 5 1 12 17 3 8 ECP: Electroforesis en campo pulsante. ST: Sequence Type. Resultados 118 Los resultados obtenidos mediante MLST mostraron concordancia con los obtenidos mediante ECP. Las tres parejas de clones obtenidas por ECP contenían el mismo perfil alélico por MLST. Con el MLST pudimos además obtener el tipo de secuencia de los dos aislamientos que no se pudieron genotipar por ECP. Uno de ellos (cepa 162) mostró el mismo perfil alélico que una de las anteriores parejas de clones (cepa 87 y 143). En este caso el serotipo de la cepa 162 coincidía con el de la cepa 87, el serotipo 8. 6.7.3. Estudio del efecto de las bombas de expulsión En cuanto a los resultados del estudio del efecto de las bombas de expulsión, utilizamos reserpina como inhibidor de bombas. En total, 10 (71,4%) aislamientos fueron susceptibles al efecto inhibidor de la reserpina. Los 5 aislamientos en los que no se detectó ninguna mutación en los genes QRDR, pero fenotípicamente eran resistentes a la norfloxacina, mostraron un efecto positivos para la reserpina. El aislamiento con alto nivel de resistencia que sólo mostró mutación en el parC, también fue susceptible al efecto de la reserpina. Las CMIs de NFX que obtuvimos por microdilución en el ensayo de la reserpina, variaron en una o dos diluciones respecto a las obtenidas por E-test, pero se mantenía la misma categoría, excepto en dos cepas. Las dos cepas tenían una CMI de 24µg/ml por E-test y 16µg/ml por microdilución. En ninguna se detectaron mutaciones y el estudio de las bombas con reserpina fue posistivo. Resultados 119 Tabla 31: Características fenotípicas y moleculares de las cepas resistentes a norfloxacina. Cepa Serotipo CMI !FX (µ µµ µg/ml) CMI LVX (µ µµ µg/ml) Mutaciones parC por sonda Mutaciones gyrA por sonda Mutaciones parC por secuenciación Mutaciones parC por secuenciación Efecto reserpina 14 19A 24 1 N N WT WT P 32 3 24 1 N N WT WT P 42 Sg18 24 1 N N WT WT P 87 8 >256 1,5 P N S79F WT N 90 9V >256 >32 P N S79Y WT P 127 14 24 1 N N WT WT P 143 6A >256 2 P N S79F WT N 156 38 >256 1,5 P N S79Y WT N 162 8 >256 2 P N S79F WT P 172 19A >256 2 N N S79Y WT P 184 19A >256 2 P N S79F WT P 201 NA 128 2 P N S79Y WT N 203 7F 24 1 N N WT WT P 242 19A >256 >32 P P S79F S81F P N.A.: No amplificación. N: negativo. P: positivo. WT: wild type. 7. DISCUSIÓ! Discusión 121 7. DISCUSIÓ! Las neumonías y otitis neumocócicas han tenido y tienen una importancia vital en la sociedad, sin embargo, en este trabajo nos hemos querido centrar en el estudio de la enfermedad neumocócica invasiva (ENI) en nuestro entorno, tanto en niños como en adultos, así como en los serotipos y genotipos que la producen. S. pneumoniae es uno de los principales agentes de bacteriemia y sepsis en adultos y niños. Aproximadamente, el 25% de los casos de bacteriemia en niños sanos se asocia con una otitis media, el 30-40% con una neumonía y en el resto el foco es indetectable (11,115-117). Sin embargo, el origen del 90% de las bacteriemias en los adultos es una neumonía (118). A pesar de la terapia antimicrobiana, la enfermedad neumocócica invasiva (ENI) en niños persiste como la mayor causa de morbi-mortalidad en el mundo (119). La incidencia de ENI en niños a nivel mundial varía, según un estudio realizado por Greenwood et al. (120) antes de la introducción de la vacuna conjugada, desde 100 casos/100,000 niños en Finlandia, hasta más de 1,000/100,000 en niños aborígenes australianos. En este mismo trabajo, se compara la edad de aparición de la ENI entre los niños de Gambia y los niños de poblaciones de alto y bajo riesgo en Estados Unidos, comprobándose que se dan a una edad más temprana en Gambia. La variabilidad que encontramos en los distintos países respecto a la epidemiología de la ENI se debe tanto a la diferencia en la susceptibilidad de la población a la enfermedad como a las diferencias en el diagnóstico y el tratamiento. Esta variabilidad podemos verla comparando algunos de los trabajos publicados. En Canadá, se hizo en 1998 un estudio de 292 casos de ENI en niños (121), donde el 70,5% fueron bacteriemias sin foco, 8% meningitis y 10% neumonía. La mortalidad fue de 0,7%. En 2001, Laurichesse et al. (122) publicaron un estudio de ENI en una región francesa entre 1994-1998 donde observaron la incidencia más alta en niños menores de 2 años. El 62% del total de pacientes fue diagnosticado de neumonía, Discusión 122 el 10% de meningitis y el 20% de bacteriemia sin foco con una tasa global de mortalidad del 21,5%. En 2004, Ispahani et al. (123) publican un análisis prospectivo en el Reino Unido, de 266 episodios de ENI en niños, de los cuales el 39% pertenecen a niños menores de 1 año y 60% a niños de 2 años. Las principales patologías fueron la meningitis, en un 32%, la neumonía en un 31% y la bacteriemia sin foco en un 30%. En septiembre de 2011 se ha publicado un trabajo retrospectivo sobre la ENI pediátrica en Arabia Saudí, donde incluyeron 41 pacientes entre 2 y 12 años. El 27% fueron meningitis, 32% bacteriemias sin foco y 34% neumonías bacteriémicas (124). De los 274 pacientes que incluimos en nuestro estudio, 146 (53%) fueron diagnosticados de neumonía bacteriémica, de los cuales 26 desarrollaron un empiema, 71 (26%) fueron diagnosticados de bacteriemia sin foco y 52 (19%) de meningitis. Si sólo tenemos en cuenta los 115 niños, 52 (45%) tuvieron una neumonía bacteriémica, 29 (25%) una bacteriemia sin foco y 32 (28%) una meningitis. El número de casos de ENI más alto en nuestro trabajo, también (122,126) lo encontramos entre los niños menores de 2 años, seguido de adultos mayores de 60 años, aunque hay que tener en cuenta que desconocemos los casos de enfermedad neumocócica no invasiva de cada grupo etario. La tasa de neumonía bacteriémica, de meningitis y de bacteriemia sin foco en la población pediátrica varía de un país a otro e incluso de un trabajo a otro. Así, podemos encontrar un 69% de bacteriemias sin foco en Finlandia (127), frente a un 18% en Reino Unido (128) y hasta un 1% en Gambia (129). Sin embargo, en este último, las neumonías bacteriémicas suponen un 77% de la ENI, 4-5 veces mayor que en los estudios anteriores. El porcentaje de bacteriemias sin foco hallado en niños en nuestro estudio (25%) se sitúa por debajo de los valores del estudio Finlandés, pero es mayor que el de Reino Unido. El número de neumonías bacteriémicas (45%) también se encuentra dentro de los rangos hallados en otros estudios (127,129). En general, la distribución de los cuadross clínicos en este trabajo se asemeja a la publicada por otros autores (123-125). Discusión 123 El grado de severidad y la mortalidad hallada difiere de unos trabajos a otros. Mientras en Estados Unidos o Canadá la mortalidad es más baja, hemos visto una mortalidad de 21% en el trabajo de Laurichesse (122). En nuestro estudio la mortalidad hallada en el total de los casos de ENI fue del 12%, siendo en adultos y niños del 16% y 6% respectivamente. En los adultos, el 81% de los fallecidos fueron pacientes diagnosticados de neumonía. Aunque no dispongamos del número total de NAC ni de la enfermedad de base, los resultados hallados concuerdan con el hecho de que en la NAC en adultos la mortalidad aumenta con la edad (130). Otro factor predisponente es el sexo, siendo el riesgo mayor en hombres (130). En nuestro caso, aunque hubo más fallecimientos entre los hombres, la diferencia no fue significativa debido a que también hubo un mayor número de infecciones neumocócicas invasivas entre esta población. Entre las formas clínicas más comunes de la ENI, la meningitis suele ser la menos frecuente, aunque con una gravedad y secuelas importantes. Los principales agentes de la meningitis bacteriana en niños son similares en países industrializados y en vías de desarrollo, sin embargo la incidencia y la mortalidad son mayores en estos últimos (120). Aunque en nuestro estudio no disponemos de datos sobre el número casos de neumonías totales, ni de aislamientos en muestras no invasivas, sabemos que de los 274 aislamientos invasivos del estudio, hubo 222 que sólo se hallaron en sangre y que de éstos, 135 pertenecían a pacientes diagnosticados de neumonía, 71 a bacteriemias sin foco, 14 a meningitis y 2 a otras patologías. De los 52 casos de meningitis que registramos, hubo 19 en los que el neumococo sólo se aisló en LCR, 14 en los que sólo se aisló en el hemocultivo y 19 casos en los que se aisló el neumococo tanto en sangre como en LCR. Por lo tanto, en 38 de los 52 casos se halló en neumococo en LCR y en 33 de los 52 casos en sangre, alcanzando así una rentabilidad diagnóstica del 73% y 63,5% respectivamente. El método de referencia en el diagnóstico de la meningitis bacteriana sigue siendo la observación de anomalías en el LCR extraído por punción lumbar. Además, el examen microscópico y el cultivo proporcionan el diagnóstico etiológico en la mayoría de los casos de meningitis bacteriana (119). La microscopía y el cultivo del LCR han demostrado mayor sensibilidad (70-80%) que los hemocultivos en el diagnóstico de la Discusión 124 neumonía neumocócica (120). Por tanto, parece haber resultados más eficaces en el diagnóstico de las meningitis que en las neumonías bacteriémicas. La sensibilidad de las actuales herramientas diagnósticas para definir la etiología de las infecciones del tracto respiratorio inferior es aún limitada, dificultando la valoración del papel específico que juega la neumonía neumocócica en la salud pública, tanto en niños como en adultos (119). El hemocultivo, el método más utilizado, tiene una sensibilidad de 3-30% (131). Existen también ciertos factores que contribuyen a reducir aún más la sensibilidad, como el volumen de sangre recogido y el tratamiento antibiótico previo a la extracción. En la guía realizada por la “British Thoracic Society” sobre la NAC en adultos en 2009, recomiendan utilizar las pruebas microbiológicas en función de la severidad de la neumonía (132). Según la guía de 2011 para la NAC pediátrica, se realizarán hemocultivos en función de la gravedad del paciente (133). En adultos, uno de los avances que permitió mejorar el diagnóstico de la neumonía neumocócica y orientar su tratamiento ha sido la detección de antígenos neumocócicos en orina mediante un ensayo inmunocromatográfico rápido (134). En niños esta técnica no resulta útil, debido al número de falsos positivos en portadores nasofaríngeos. Aunque en la práctica clínica, la tasa de detección de este microorganismo en neumonías bacteriémicas suele ser baja, los cultivos microbiológicos siguen siendo importantes para la vigilancia epidemiológica y el estudio de las resistencias. En cuanto al empiema, hay que decir que es una de las complicaciones más comunes de la neumonía y en la mayoría de los casos el neumococo suele ser el agente responsable. Varios trabajos publicados muestran un aumento de casos a partir de la mitad de los 90 (135-137). En Chile, el estudio de Levine et al. muestra un 25% de casos de empiema en niños hospitalizados con neumonía (138). En el presente estudio, de los 26 casos con un empiema (10 adultos y 16 niños), hubo 16 en los que el neumococo se aisló en sangre y 10 en líquido pleural. De estos 10 casos, 9 eran niños. Este hecho podría tener que ver en gran parte con las prácticas o protocolos que se siguen tanto en adultos y como en niños. En adultos, sólo en uno de Discusión 125 los 10 casos de empiema que teníamos se aisló el neumococo en el líquido pleural, aunque en 4 de estos de 10 casos no se realizó el cultivo de líquido pleural. Por lo tanto, obtuvimos una rentabilidad diagnóstica del 45% en el líquido pleural y de 61% en el hemocultivo. Para una mejor estimación de los casos de empiema en la ENI se están utilizando técnicas moleculares sobre muestra directa. En un estudio realizado por Obando et al. (139), de 100 empiemas diagnosticados, recuperan 25 neumococos por cultivo. El 89% de los líquidos pleurales con cultivo negativo mostraron un resultado positivo para neumococo por PCR. En los niños con empiema de nuestro estudio, la edad media no se ajustó a la que suele hallarse en otros estudios. En nuestro caso la media de edad de los 16 niños fue de 2 años, ya que hubo 9 niños menores de 1 año. Sin embargo, la media de edad de los niños con empiema está alrededor de los 6 años (135,136). Se ha visto que en muchos casos el empiema se da en niños con coinfecciones con VRS, influenza o varicela. Talbot et al. (140) muestran una correlación directa entre los episodios de ENI y los aislamientos de VRS e influenza. La incidencia de la ENI aumenta cuando están circulando estos virus. Observamos que los casos ENI en nuestro medio son más frecuentes en los meses de invierno y menos frecuentes en verano. Sin embargo, los empiemas no se ajustaron a este patrón temporal. La cápsula de neumococo es probablemente uno de los principales determinantes de su poder patógeno. Esta cápsula es muy variable antigénicamente, habiéndose descrito 92 tipos de polisacáridos capsulares serológicamente diferenciables. El sistema más utilizado para el nombramiento de estos serotipos ha sido la nomenclatura danesa. El método para identificar el serotipo de cada aislamiento consiste en antisueros capaces de reconocer las diferencias químicas entre aislamientos (Quellung). Como ya se ha comentado en la introducción, también existen diferentes reactivos comerciales para test rápidos de identificación, basados en la detección visible del complejo antígeno-anticuerpo por aglutinación. Discusión 126 El serotipado convencional tiene ciertos inconvenientes como son el coste de antisueros, la subjetividad en la interpretación del resultado y la necesidad de personal altamente entrenado en esta técnica. Por ello, con el objetivo de facilitar el serotipado y los estudios de monitorización y epidemiología de los serotipos, se han desarrollado nuevos métodos basados en la PCR. En 2003, Brito et al. (141) describen una PCR múltiple, rápida, simple y económica para serotipar. El 94% de los aislamientos tipados coincide con el serotipado convencional. En 2006, el CDC propone un sistema de serotipado fácil y fiable que consiste en un esquema de 7 PCRs múltiples secuenciales en el que el orden de las reacciones se basa en los resultados obtenidos en el programa de vigilancia realizado entre 2002-2003 (25). Los cebadores corresponden a la parte específica de cada serotipo del locus cps. Además, en todas las reacciones se añade el cebador cpsA como control interno, ya que es común a todos los serotipos. No hay evidencias que sugieran que la variabilidad genética entre diferentes cepas del mismo serotipo pueda afectar al serotipado por PCR (25,142). No obstante, algunos cebadores utilizados no son del todo específicos, como en el caso del serugrupo 6 y 18. Además existen reacciones cruzadas entre algunos serotipos del esquema (7F, 7C, 9V, 38, 11A, 12F, 22F, 33F y 35F) y otros serotipos minoritarios, que no podemos distinguir mediante esta PCR, por lo tanto habría que utilizar los antisueros. La frecuencia con la que estas cepas responsables de la reacción cruzada causan ENI grave en Estados Unidos es baja (25). Entre nuestros aislamientos tipados convencionalmente no se halló ninguna. Por lo tanto estaríamos ante una técnica simple y económica que podría suponer una buena alternativa al serotipado convencional. Una de las ventajas de este esquema es su flexibilidad para adaptarla a la prevalencia de cada región. Otros autores lo han hecho modificando el orden y la combinación de serotipos de las reacciones (26,27). Dias et al. (27) reformulan el esquema basándose en estudios de vigilancia previos e identificar así los serotipos más frecuentes en Latino América. El esquema que proponen para su población consta de 6 reacciones de PCR, con 5 serotipos en cada una de ellas, incluyendo en total 30 serotipos/serogrupos. Al igual que nosotros, adelantan el serotipo 1 y el 7F a las primeras reacciones e incluyen el serotipo 5 en las segunda. Con este esquema tipan el 90,1% de las cepas con las tres primeras reacciones. Morais et al. (26) realizan el estudio con aislamientos clínicos de África Subsahariana. Su esquema se compone de 7 reacciones múltiples secuénciales, con 4 pares de cebadores cada uno, Discusión 133 En caso de los niños mayores y adultos, un análisis realizado antes de introducir la PCV7 por Hausdorff et al. (155), muestra que no hay serogrupos concretos que estén muy extendidos o que sean extremadamente comunes en todas las regiones. Por ejemplo, el serotipo 14, que se situaba entre los 3 primeros fuera de Asia, era el séptimo más común en Asia. La vacuna heptavalente contenía 6 de los serogrupos más comunes en Estados Unidos y Canadá y 5 de los 7 más comunes en Oceanía y Europa, pero sólo 3 de los 7 serogrupos más comunes en África y Asia. La cobertura de la PCV7 se estimó en 30-60% de la ENI (155). No obstante, entre los adultos, los serotipos responsables de ENI también varían con la edad, siendo mayor la cobertura de la PCV7 entre los mayores de 50-60 años. Esto puede ser debido a que el sistema inmune se debilite a partir de esa edad, que adquieran los serotipos pediátricos por un estrecho contacto con los niños o por la presión selectiva del excesivo uso de antibióticos (158). Otro factor a tener en cuenta en la formulación de vacunas, es la resistencia a antibióticos de los diferentes serotipos y su epidemiología. La mayoría de los serotipos de los considerados más resistentes (6B, 6A, 9V, 15A, 14, 19A, 19F y 23F) (151,159) están cubiertos por las tres vacunas, excepto el 19A, que solamente lo cubre la PCV13. Los serotipos más frecuentes entre los aislamientos resistentes a penicilina y eritromicina de nuestro estudio fueron, coincidiendo con lo publicado anteriormente, el 6B, el 14, el 19F y el 19A. Los serotipos más comunes hallados entre los aislamientos no-sensibles a penicilina en portadores del estudio de Sandgren et al. (30) fueron el 19F, 35B, 14 y 6B. Muñoz-Almagro et al. (126) obtienen en 2009 un 18,7% de aislamientos no-sensibles a penicilina y un 18,3% a eritromicina. En nuestro periodo de estudio los aislamientos no-sensibles a penicilina y eritromicina alcanzaron un 9% y un 22%, respectivamente. En 2010, Liñares et al. (159) publican una revisión de las resistencias antimicrobianas de Streptococcus pneumoniae durante un periodo de 30 años. Los estudios de vigilancia globales mostraron un aumento de neumococos no-sensibles a ßlactámicos durante los 90 y 2000. La tasa más alta de cepas no-sensibles a penicilina en el sur de Europa entre 2001-2004, la tenían Francia, Grecia y España (éste último, 29% intermedios y 13% resistentes). Sin embargo, en 2008, el sistema de vigilancia Europeo resalta un descenso significativo de aislamientos no-sensibles a penicilina en España. Según el Laboratorio de Referencia Español entre 2000-2008 hubo un descenso significativo (34% vs 22%), especialmente entre 2005-2008, coincidiendo con la Discusión 134 introducción de la vacuna (158). La resistencia a macrólidos en España también aumentó durante los 90 y disminuyó tras la introducción de la PCV7 (42% en 2003 vs 21% en 2006) (159). El porcentaje de cepas resistentes a eritromicina obtenido en nuestro estudio se ajusta a lo publicado previamente, sin embargo, nuestra tasa de resistencia a penicilina es considerablemente menor. El efecto que ha tenido la vacuna conjugada en la epidemiología de los serotipos y el efecto que seguirá ejerciendo ha sido un tema muy debatido y estudiado. Por un lado ha habido una disminución en la incidencia de la ENI debida a los 7 serotipos vacunales tras la introducción de la PCV7, tanto en niños vacunados como en el resto de grupos de edades. Esto se debe al llamado “efecto rebaño” que se basa en la interrupción de la transmisión de la bacteria como resultado de la disminución de niños portadores. Por otro lado, tenemos el efecto de reemplazo, en el que tras la implementación de la vacuna han aumentado los casos de ENI por serotipos no vacunales. Entre los serotipos no vacunales responsables del efecto de reemplazo, el más relevante ha sido el 19A. Respecto a si ha sido la vacuna o el uso excesivo de antibióticos el responsable del aumento de casos por cepas 19A resistentes, ha habido cierta controversia. En España la incidencia del serotipo 19A ha aumentado considerablemente tras introducción de la vacuna (154). Según el estudio de Fenoll et al. (154), no se puede asegurar que este hecho sea debido a la presión vacunal, ya que en países como Corea o Israel, donde no se introdujo la vacuna, también observaron un aumento del serotipo 19A. Si el número total de casos ha aumentado o disminuido, depende también de la región y el estudio, y lo mismo ocurre con los neumococos resistentes. Según el programa de vigilancia realizado en 2003 por el CDC, el número de casos se redujo considerablemente en todos los grupos de edad tras la introducción de la vacuna (160). Calbo et al. (137) observaron una clara sustitución de serotipos vacunales por serotipos no vacunales entre los casos de ENI estudiados entre un periodo prevacunal y postvacunal. Sin embargo, la tasa de ENI en Barcelona no sufrió una disminución importante tras la introducción de la vacuna. Esto podría deberse al bajo índice de vacunación que tenían (4,8% en 2002 y 34% en 2004). Discusión 135 Ardanuy et al. analizan entre 1997-2007, la ENI en adultos en el sur de Barcelona, estudiando la diferencia entre 3 subperiodos dentro de éste (161). Dependiendo de la edad, observan diferentes tendencias en la ENI. Por un lado, en el último periodo (2005-2007) obtienen un aumento en la incidencia de la ENI, debido a la expansión clonal de serotipos no-vacunales. Por otro lado, la disminución de la ENI debida a los 7 serotipos vacunales en personas mayores de 65 años, muestra el efecto rebaño de la vacuna. En 2007 Obando et al. (139) publican un trabajo sobre la ENI pediátrica en el sur de España tras la introducción de la vacuna conjugada. Aquí volvemos a encontrarnos con un bajo índice de vacunación (se había vacunado el 29% de los 515 niños menores de 5 años incluidos en el estudio en el año 2005), un aumento en la proporción de ENI causada por serotipos no vacunales, pero sin cambios en el número total de casos. Concluyen que puede que sea pronto para esperar un cambio en la incidencia de la ENI en niños. Respecto a la evolución o la tendencia que ha tenido cada serotipo durante los últimos años teniendo en cuenta los factores y medidas externas como la vacuna o terapia antibiótica, hay que decir que ni el número de aislamientos ni el periodo de estudio de nuestro trabajo es lo suficientemente amplio como para poder sacar conclusiones contundentes. Si comparamos nuestros resultados con los obtenidos por el estudio de Fenoll et al. (154) sobre los patrones temporales de cada serotipo entre 1997 y 2007, observamos cierta coincidencia en algunos serotipos. De este modo, vemos que los serotipos vacunales 14, Sg18, 6B, 19F y 23F disminuyen a partir de 2001, coincidiendo con los resultados del trabajo de Fenoll et al. Sin embargo, con el serotipo 4 y el 9V, que en su caso siguen la misma tendencia que el resto de los serotipos vacunales, en nuestro trabajo se aprecia un aumento de ambos serotipos en los últimos años del periodo de estudio. Por otro lado, en los serotipos que se introdujeron en las nuevas formulaciones vacunales y que en la mayoría de los trabajos muestran un aumentó, observamos diferentes comportamientos. En el caso del serotipo 7F, se aprecia un aumento entre los años 2002-2008. En los serotipos 3, 6A y 19A se observa un aumento hasta 2007 y una disminución en 2008. El aumento de los serotipos 19A y Discusión 136 6A se ha relacionado con la falta de inmunidad cruzada con los serotipos incluidos en la vacuna (157). Los serotipos 1, 2, 3 y 5, se han relacionado con epidemias (24). Durante la epidemia, la transmisión se ve facilitada por el hacinamiento y factores socioeconómicos, pero disminuye en cuanto desaparecen estos factores predisponentes (152). Los serotipos 1 y 5 pueden aparecer como ondas periódicas. Actualmente, las epidemias neumocócicas son raras, principalmente por la mejora de las condiciones socioeconómicas y la disponibilidad de antimicrobianos. Los brotes que se dan en adultos suelen estar causados mayoritariamente por el serotipo 1 y se dan en prisiones, refugios para indigentes o agrupaciones militares (151). La evolución del serotipo 1 en el periodo se estudio de nuestro trabajo durante el periodo de estudio muestra un pico en el año 2003 y luego se mantiene más o menos constante durante 2004-2008. Los 4 casos del año 2003 pertenecían al mismo clon y tenían el mismo patrón electroforético (A4). No obstante, hubo otros 20 aislamientos del mismo clon repartidos entre 2004-2008. El serotipo 5, prácticamente está ausente durante 2002-2006 y alcanza un pico del 16% de los casos de ENI en 2007. En este caso todos los aislamientos del serotipo 5 pertenecían al mismo clon. En cuanto a si es el serotipo o el genotipo el que define la invasividad, no está del todo claro. Brueggemann et al. (31) utilizan el MLST para comparar aislamientos invasivos en niños, con aislamientos nasofaríngeos en niños portadores de la misma comunidad y mismo periodo. No existen muchos trabajos sobre los serotipos o clones que causan ENI y los serotipos o clones que en ese mismo periodo se encuentren en portadores. En este trabajo miden el potencial de ENI de los serotipos y clones, calculando una “odds ratio” (OR) para cada uno en función del número de cepas que hallen de cada serotipo o clon entre muestras invasivas y portadores. Tanto en éste como en otro estudio (30) se estimó que los serogrupos 1, 2, 7, 9, 14 y 16 eran los más invasivos y el 3, 6, 15, 19 y 23 los menos. Los serotipos 4, 18C y el 19A también se relacionaron con ENI. Hallaron dos clones del serotipo 14 causantes de ENI más frecuentemente de lo que se esperaba por su prevalencia como portadores. Por otro lado el mayor clon del serotipo 3, que se encontraba comúnmente como portador, raramente aparecía en infecciones invasivas. No encontraron ningún clon mayoritario que nunca Discusión 137 apareciera en los aislamientos invasivos. Aunque los serotipos más comunes entre los invasivos fueran los de la vacuna heptavalente, también hubo diferencias en las OR entre ellos (14 > 6B). Observaron que el serotipo y el genotipo estaban bastante relacionados, es decir, que los clones más invasivos correspondían a los serotipos más invasivos. Sin embargo concluyen que el serotipo es más importante que el genotipo en la invasividad, ya que obtienen casos de genotipos diferentes del mismo serotipo que poseen altas OR y casos de un mismo genotipo con diferentes serotipos en los cuales uno de los serotipos se halla en aislamientos invasivos y el otro en portadores. En el presente trabajo no se han estudiado los aislamientos y serotipos en portadores y por tanto no podemos calcular la invasividad de nuestros serotipos y clones. Sin embargo, podemos comparar los serotipos y la clonalidad hallada en nuestros aislamientos invasivos con los hallados en otros estudios (30,31). Así, podemos ver que la mayoría de los aislamientos que en nuestro estudio tenían alguna relación clonal, también coincidían en el serotipo, es decir, que el serotipo y el genotipo estaban relacionados. Entre nuestros serotipos invasivos, hallamos tanto los serogrupos que según el trabajo de Brueggemann et al. tenían mayor invasividad, como los considerados menos invasivos (3 y 6), aunque los más prevalentes entre nuestras cepas coinciden con los más invasivos de su estudio (1, 14, 7F y 19A). En otro trabajo realizado por Sandgren et al. (30) en Estocolmo, comparan la epidemiología molecular del neumococo en ENI y en portadores mediante serotipado y genotipado (ECP y MLST). En este caso concluyen que tanto el tipo clonal como el serotipo son importantes en la invasividad. Hallaron diferentes clones del mismo serotipo con diferente invasividad y aislamientos que pertenecían al mismo clon pero tenían diferente serotipo debido al “switching capsular”, con la misma invasividad. Si realmente la invasividad dependiera únicamente de la expresión capsular, el hecho de repoblar los nichos nasofaríngeos con serotipos de baja invasividad utilizando vacunas multivalentes supondría una reducción de la tasa de ENI. En cuanto a los efectos de la vacuna, otro fenómeno que está siendo objeto de estudio, es el “switching capsular” (CS), que se da por recombinación en el locus cps. Los genes de biosíntesis capsular (cps) se encuentran agrupados en el cromosoma del Discusión 138 neumococo. En todos los serotipos, los genes cps se encuentran en la misma posición en el cromosoma, entre dexB y aliA. El locus cps tiene una estructura tipo cassette, con genes que no son homólogos entre distintos serotipos y que son responsables de las diferencias químicas. Éstos, están flanqueados por genes comunes a todos (162). La estructura de cassette, permitiría cambiar de serotipo mediante recombinación de los genes no-homólogos (serotipo-específicos) mediada por los genes homólogos. Debido a la recombinación de genes capsulares, neumococos de un mismo tipo clonal pueden tener serotipos diferentes, es decir, pueden adquirir mediante transformación los genes que codifican una cápsula diferente de la suya. Actualmente se ha demostrado en diferentes partes del mundo el intercambio de cápsulas entre el serotipo 23F y el 19F, así como entre el serotipo 9V y 14. Para predecir el impacto de los programas vacunales, es importante conocer los tipos clonales y la extensión del CS, ya que estos programas podrían ejercer una presión selectiva sobre genotipos virulentos o invasivos hacia un “switching” y escapar de la cobertura vacunal (163,164). Incluso cepas resistentes pueden modificar su serotipo por serotipos no incluidos en la vacuna y aumentar potencialmente su virulencia (171). Adquirir una cápsula no-vacunal por una cepa con capacidad invasiva, supone un problema en cuanto al uso de vacunas específicas de serotipo. Según Brueggemann et al. (172), al principio, la PCV7 redujo la ENI debida a serotipos resistentes, pero luego, la resistencia antimicrobiana aumentó con el aumento del 19A. El programa de vigilancia ABC del CDC, estudió en 2005 los serotipos 19A mediante MLST, revelando que la evasión de la vacuna empezó en 2003. Estas cepas tenían el genotipo MLST ST695, que siempre había estado asociado al serotipo 4 y ahora se encontraba también asociado al 19A. Estas cepas se detectaron 3 años después de la introducción de la vacuna heptavalente, pero aumentaron su prevalencia rápidamente (en 2003, 1 cepa; en 2004, 2 cepas; en 2005, 32 cepas) (166). En 2005 emergieron otros dos tipos de cepas 19A de evasión vacunal, con nuevos procesos de recombinación y procedentes de cepas del serotipo 4. La evasión vacunal mediante recombinación del locus capsular podría reducir la efectividad de cualquier vacuna basada en serotipos, por ello es importante mantener la vigilancia y conocer los procesos genéticos de evasión. El estudio de clonalidad de nuestros aislamientos mediante ECP, mostró, como se ha podido ver en los resultados, que en algunos serotipos había muy poca Discusión 139 variabilidad, con la mayoría de las cepas perteneciendo a un clon o clones muy relacionados. En total 10 serotipos mostraron relación clonal, el serotipo 1, 3, 5, 7F, 12F, 19A, 22F, 33F, 6A, 14 y 9V. En el trabajo de Sandgren et al. nombrado anteriormente (30), donde estudian la influencia de los serotipos y la clonalidad en la invasividad, observaron que los aislamientos invasivos formaban dos grupos principales: uno hallado entre los casos de ENI (serotipos 1, 4, 7F y 9V) y que estaban relacionados clonalmente y otro grupo que era común tanto en casos de ENI como en portadores y que eran más variables genéticamente (serotipos 6A, 6B, 14 y 19F). Entre nuestras cepas, observamos que los serotipos 1 y 7F estaban muy relacionados clonalmente, que los serotipos 9V, 6A y 14 mostraban mayor variabilidad y que los serotipos 4, 6B y 19F apenas tenían relación clonal. El serotipo que menos variabilidad mostró fue el serotipo 5, con los 16 aislamientos del mismo clon. Como ya se ha comentado anteriormente, el serotipo 5 suele aparecer en ondas periódicas y en nuestro caso la mayoría de los aislamientos se dieron entre 2007 y 2008. Para los serotipos 1, 3 y 7F, la diversidad también fue muy pequeña, estando englobados en clones el 84%, 92% y el 83% de los aislamientos respectivamente. En el caso del serotipo 33F, el 100% de las cepas pertenecían a un mismo clon, aunque sólo obtuvimos 4 aislamientos con este serotipo. Estos resultados concuerdan con los resultados de Sandgren et al. (30). Otro ejemplo de recombinación capsular es el que estudiaron Coffey et al. (162) entre el 23F y los serotipos 19A y 19F. Se habían descrito en España cepas del serotipo 19A y 19F genotípicamente muy relacionadas y con el mismo patrón de resistencia que cepas multirresistentes del serotipo 23F, comunes en España durante 20 años. Se cree que la dirección del intercambio fue de 23F al 19F, porque el primero fue común en España antes que el segundo, aunque no se puede excluir la otra opción, que el intercambio fuera del 19F al 23F. En un principio, pensaban que la variante 19F del clon 23F, sufrió una recombinación y luego se expandió clonalmente en España, pero parece que hay diferentes variantes del 19F, con diferencias en la secuencia de los genes cps importados, que demuestran recombinaciones independientes. Coffey et al. también describieron en otro trabajo (167) la relación entre un clon resistente a penicilina del Discusión 140 serotipo 14 y el clon MPSp9V. En el caso de los aislamientos del serotipo 9V de nuestro estudio, observamos que había relación clonal con otro serotipo diferente. De los 7 aislamientos del serotipo 9V obtenidos, 5 compartían clonalidad con aislamientos del serotipo 14. Esto podría deberse al “switching capsular” previamente descrito entre estos dos serotipos, aunque las cepas del serotipo 14 y 9V relacionadas de nuestro estudio eran sensibles a penicilina. Además, ambos serotipos están incluidos en las vacunas. Entre los serotipos 23F y 19F no observamos ninguna relación clonal, es más, los 8 aislamientos del seortipo 19F pertenecían a diferentes pulsotipos. Estudio de resistencias a fluorquinolonas Aunque la resistencia antimicrobiana en Streptococcus pneumoniae continúe siendo un problema, la resistencia a FQ permanece baja (1-7%) (168-170). La resistencia a FQ se puede adquirir por mutaciones, recombinación intraespecífica o recombinación interespecífica de estreptococos del grupo mitis (171). Un programa de vigilancia realizado por los CDCs en 1998, reveló una tasa de resistencia a LVX de 0,2% en 3475 cepas procedentes de muestras invasivas (64). En nuestro estudio hallamos una tasa de resistencia a LVX de 0,7% entre el total de los aislamientos invasivos, pero un 1,3% en adultos. Según un estudio de vigilancia realizado en Estados Unidos entre 1998 y 2000 la prevalencia de la resistencia a LVX es mayor entre los aislamientos de las muestras respiratorias que en los de hemocultivos (172). Según las revisión de las resistencias de los últimos 30 años realizada por Liñares et al. (159), en España, la tasa de resistencia a ciprofloxacino se mantienen estable, con un 2,6% en 2002 y 2,3% en 2006. Los factores que podrían haber contribuido a estabilizar las resistencias en FQ son el uso moderado de FQ, el cambio de los clones circulantes tras la vacuna, la no recomendación de FQ en niños y el alto coste fisiológico que confiere la resistencia (174). En Canada, sin embargo, la resistencia a ciprofloxacino aumentó de 0,6% en 1998 a 7,3% en 2006 debido al gran consumo de FQ (174). Como hemos podido observar en los resultados, tuvimos 10 (6,3%) aislamientos en adultos y 4 (3,5%) en niños que mostraron una CMI >16 µg/ml a NFX por Etest. Sin embargo, ninguno de los aislamientos de niños y sólo 2 (1,3%) de las cepas de adultos fueron resistentes a LVX. Los 4 aislamientos pediátricos presentaron una CMI a NFX baja dentro del rango no-sensible (24 µg/ml) y el único mecanismo de resistencia que se Discusión 141 halló en ellos fue la posible acción de las bombas de reflujo. Esto sugiere que probablemente los niños no han estado expuestos a FQ. Entre las mutaciones relacionadas con resistencias que encontramos en los 14 aislamientos estudiados mediante secuenciación, están la sustitución de la serina en la posición 79 del gen parC y la sustitución de la serina de la posición 81 del gen gyrA. Las sustituciones del parC fueron por los aminoácidos fenilalanina (Phe) y tirosina (Tyr), aunque la primera fue más frecuente. Detectamos mutaciones solamente en el gen parC en 8 aislamientos (57%) y 7 de ellos fueron sensibles a LVX (resistencia de primer paso). El aislamiento con mutaciones en parC y gyrA (Ser-81) fue resistente a NFX y a LVX. Hubo un aislamiento que siendo resistente a LVX, sólo mostró una mutación relevante en parC. En este aislamiento encontramos polimorfismos no relacionados con la resistencia a FQ y un efecto positivo a la reserpina y por tanto a las bombas de reflujo. Este patrón tan inusual, en el cual tenemos una resistencia de alto nivel con una mutación de primer paso, requiere un estudio más profundo. En la actualidad se acepta la posibilidad de que la resistencia a FQ también pueda ser debida a mutaciones fuera de la región QRDR (174). Heather et al. secuencian los genes completos gyrA, parC y parE de 51 aislamientos resistentes a ciprofloxacino (176). Obtienen una gran variedad de mutaciones no-QRDR, pero ninguna la asocian con la resistencia a FQ. En este trabajo realizan una caracterización molecular de 205 cepas resistentes a ciprofloxacino mediante el estudio de mutaciones en la región QRDR, estudio de bombas de reflujo mediante reserpina, serotipado y patrones de ECP. Las mutaciones más comunes en su estudio también fueron la Ser79Phe (parC) y la Ser81Phe (gyrA). Los 5 aislamientos con bajo nivel de resistencia en los que no se detectó ninguna mutación importante en las secuencias de los genes QRDR, fueron positivos en el estudio de las bombas de reflujo, es decir, en presencia de reserpina mostraron una disminución de cuatro o más diluciones en su CMI a norfloxacino. Aunque las cepas resistentes a penicilina y macrólidos se propagan clonalmente, la relación clonal entre los aislamientos resistentes a FQ no está clara (177). En nuestro estudio no hallamos relación entre clones ni serotipos, aunque el número de aislamientos que se estudiaron fue pequeño. Sin embargo, existen estudios de vigilancia Discusión 142 publicados previamente donde también se observa diversidad clonal entre aislamientos resistentes a FQ (176,178). Entre las tres parejas de aislamientos que tenían el mismo perfil de ECP, en una el serotipo fue diferente, en otra pareja uno de los aislamientos fue no-tipable y la tercera pareja eran dos cepas que pertenecían a distintos episodios de un mismo paciente en el que se desarrollo la resistencia de alto nivel. En el estudio de resistencias a FQ realizamos el genotipado mediante ECP y MLST. Con ambas técnicas obtuvimos el mismo grado de variabilidad y se identificaron 3 clones diferentes. Algunos de los ST obtenidos por MLST no habían sido publicados previamente. Entre las cepas resistentes a LVX también se han descrito fenómenos de recombinación capsular (179,180). Las cepas resistentes a FQ halladas en Hong Kong fueron muy similares genéticamente, pero con diferente serotipo (180). Esto indujo a los autores a pensar que provenían del clon Spanish 23F, dominante en Hong Kong, del cual adquirieron la resistencia a FQ. Cuando realizamos la prueba de las bombas de reflujo, las CMIs de NFX obtenidas por microdilución sin reserpina variaron en una o dos diluciones, pero excepto en dos aislamientos pediátricos, mantuvieron la misma categoría. Estos dos aislamientos tuvieron una CMI de 24µg/ml por Etest y de 16µg/ml por microdilución. En ninguno de ellos se detectaron mutaciones relacionadas con resistencias. Según las recomendaciones de la Sociedad Francesa, por Etest, estos dos neumococos serían resistentes de bajo nivel. La utilidad de la reserpina para el estudio de las bombas de reflujo ha sido cuestionada debido a que cepas con reflujo positivo no han mostrado acumulación en presencia de reserpina (97). Por ello los resultados de las pruebas con reserpina hay que interpretarlos con precaución. En 10 de los 14 aislamientos resistentes a NFX el estudio de las bombas de expulsión con reserpina fue positivo. En 5 de ellos este mecanismo se dio junto con mutaciones en los genes QRDR. Los otros 5 que sólo presentaron el mecanismo de reflujo mostraron unas CMI a NFX más bajas (24 µg/ml). Los aislamientos con