Método para obtener información útil para el diagnóstico de enfermedades neuromusculares

ES 2 408 137 B1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 408 137 Número de solicitud: 201131840 51 Int. CI.: G06T 9/00 (2006.01) G06K 9/00 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 54 Título: MÉTODO PARA OBTENER INFORMACIÓN ÚTIL PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES 73 Titular/es: SERVICIO ANDALUZ DE SALUD (33.3%) Avda. de la Constitución, 18 41071 Sevilla (Sevilla) ES; UNIVERSIDAD DE SEVILLA (33.3%) y CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC) (33.3%) 72 Inventor/es: ESCUDERO CUADRADO, Luis; MONTERO SÁNCHEZ, Adoración; PARADAS LÓPEZ, Carmen; RIVAS INFANTE, Eloy; PASCUAL BRAVO, Alberto; SÁEZ MANZANO, Aurora; SERRANO GOTARREDONA, Carmen y ACHA PIÑERO, Begoña 74 Agente/Representante: ILLESCAS TABOADA, Manuel 22 Fecha de presentación: 15.11.2011 43 Fecha de publicación de la solicitud: 18.06.2013 Fecha de la concesión: 15.04.2014 45 Fecha de publicación de la concesión: 24.04.2014 56 Se remite a la solicitud internacional: PCT/ES2012/070796 57 Resumen: Método para obtener información útil para el diagnóstico de enfermedades neuromusculares. Procedimiento para obtener, a partir de la biopsia de un paciente, nuevos parámetros que permiten diagnosticar de manera objetiva diferentes enfermedades neuromusculares y su grado de afectación al paciente, que comprende: - realizar una tinción de la biopsia para resaltar las fibras musculares tipo I, las fibras musculares tipo II y el endomisio; - obtener una imagen de la biopsia tras la tinción; - segmentar la imagen para identificar los contornos de las fibras musculares; - formar una red donde las fibras musculares constituyen nodos y los contactos entre fibras musculares constituyen las uniones entre los nodos; - formar un vector característico de la biopsia cuyos elementos se eligen entre parámetros geométricos de las fibras y parámetros de la red construida; y - comparar biopsias control y afectas por medio de ACP utilizando en cada caso el vector característico seleccionado. Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP. Aviso: MÉTODO PARA OBTENER INFORMACIÓN ÚTIL PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES OBJETO DE LA INVENCIÓN 5 El objeto de la presente invención es un método para obtener, a partir de la biopsia de un paciente, un conjunto de nuevos parámetros que permiten, mediante un estudio histológico comparativo, diagnosticar de manera objetiva diferentes enfermedades neuromusculares y su grado de afectación al paciente. Además, el método puede realizarse de manera automática por 10 ordenador. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El músculo esquelético constituye el músculo voluntario y está inervado15 por las neuronas motoras del sistema nervioso somático. El músculo esquelético está constituido por células tubulares muy largas, también denominadas fibras musculares, cuyos diámetros oscilan entre 10 y 100 micras y que contienen muchos núcleos ubicados en la periferia de la célula. Las fibras musculares están separadas unas de otras por una red de tejido 20 conectivo laxo compuesto de fibras de colágeno y reticulares denominado endomisio. A su vez, las fibras musculares se agrupan formando fascículos, que están rodeados por un tejido conectivo denominado perimisio. Las fibras musculares pueden ser de dos tipos normalmente 25 denominados tipo I y tipo II, estando dispuestos ambos tipos de fibras según un mosaico desordenado a lo largo de los fascículos (Helliwell, 1999; O'Ferrall and Sinnreich, 2009; Pette and Staron, 2000). El tipo de fibra muscular depende de la naturaleza de la neurona motora que la inerva: Fibras tipo I: Contienen una isoforma de miosina que utiliza ATP a baja 30 velocidad. Son fibras de contracción lenta. Fibras tipo II: Contienen una isoforma de miosina que utiliza ATPasa a  ES 2 408 137 B1 2 DESCRIPCIÓN alta velocidad. Son fibras de contracción rápida. El diagnóstico de las enfermedades neuromusculares está principalmente basado en la caracterización histológica y la evaluación morfológica de secciones de muestras musculares, normalmente biopsias del 5 músculo esquelético (Dubowitz and Sewry, 2006). Para este diagnóstico, es de vital importancia la determinación del tamaño y de las proporciones entre los dos tipos de fibras, así como el tamaño de las fibras de colágeno, ya que el tipo de problema en los componentes de la conexión muscular (neurona motora-axón-músculo) se refleja en un patrón característico de la sección 10 muscular. Principalmente se pueden distinguir tres patrones característicos correspondientes a dos grupos de enfermedades: 15 1) Miopatía con origen en el propio músculo a. Patrón distrófico: Se caracteriza por un aumento de endomisio debido a la aparición de fibrosis. Las fibras adquieren una morfología más redondeada. La afectación suele ser homogénea dentro del músculo, y 20 afecta a todos los músculos. No es frecuente la selectividad de afectación entre fibras tipo I y tipo II. b. Patrón no distrófico: Las fibras adquieren también una morfología más redondeada, aunque sin aumento de endomisio. Se observa una mayor 25 disparidad entre los tamaños de las fibras 2) Patología neuromuscular con origen en el sistema nervioso periférico c. Patrón de atrofia neurógena: Gran cantidad de fibras normales a simple 30 vista, aunque aparecen pequeños grupos sin patrón específico de células pequeñas. Puede afectar más a unos músculos que a otros.  ES 2 408 137 B1 3 Puede presentar selectividad en la afectación de fibras tipo I y tipo II, aunque no ocurre siempre. Pueden aparecer reinervaciones, lo cual elimina el mosaico. En casos muy avanzados, pueden aparecer principios de fibrosis. 5 Actualmente, la evaluación morfológica de las biopsias o secciones musculares para realizar el diagnóstico es realizada visualmente por médicos especialistas denominados patólogos. Es fácil apreciar que existe un elevado grado de subjetividad en estos diagnósticos basados en la interpretación visual de los patólogos, pudiendo aparecer diferencias en los diagnósticos en función 10 del grado de formación, de la experiencia o de la pericia de cada patólogo. Además, actualmente los patólogos son capaces de determinar la presencia o ausencia de una determinada enfermedad y de estimar el grado de afectación o de evolución en el paciente, pero no pueden cuantificarlo. 15 Recientemente se ha descubierto la utilidad de aplicar la teoría de redes a la caracterización de la organización de los tejidos. La teoría de redes se ha utilizado ampliamente para analizar diversos tipos de procesos o sistemas biológicos complejos a diferentes escalas, desde interacciones entre moléculas hasta interacciones entre especies. Sin embargo, su aplicación a nivel de 20 individuo o de grupos de células ha sido limitada hasta la publicación del artículo “Epithelial organisation revealed by a network of cellular contacts”, de Luis M. Escudero et al. (Escudero et al., 2011). El método descrito en este artículo está basado en el análisis de las imágenes de tejidos la mosca Drosophila y de pollo, que están básicamente constituidas por simples células 25 poligonales de diferentes tamaños según el tipo de epitelio. De este análisis se obtienen una serie de parámetros fundamentalmente basados en el tamaño, forma y conectividad de dichas células, construyéndose un vector característico de cada muestra. Se descubre entonces que el vector característico de cada muestra permite identificar cambios en el epitelio como 30 consecuencia de la mutación de un gen, diferenciar entre tejidos de uno u otro organismo, e incluso identificar diferentes estados de crecimiento de un mismo  ES 2 408 137 B1 4 organismo, todo ello de forma de forma automática y objetiva. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe un método que aplica los recientes 5 descubrimientos relacionados con la teoría de redes para obtener nuevos parámetros específicos capaces de caracterizar una biopsia de tejido músculo esquelético de un paciente. La comparación del vector característico correspondiente a la biopsia del paciente con el vector característico correspondiente a una biopsia control permitirá determinar de un modo objetivo 10 la existencia de posibles enfermedades musculares. Es más, en función de la diferencia entre unos parámetros y otros, será posible incluso determinar el grado de afectación del paciente. El método está desarrollado específicamente para el tejido músculo 15 esquelético que, como se ha mencionado anteriormente, está formado por fibras musculares alargadas agrupadas en fascículos. Cada fibra se interpreta como un nodo de la red, mientras que los contactos entre fibras constituyen las uniones entre los nodos de la red. El método de la invención reconoce dos tipos de nodos según si la fibra muscular es de tipo I o de tipo II, y además 20 tiene en cuenta el colágeno almacenado en forma de endomisio en las fronteras entre fibras. Según un primer aspecto de la invención, el método para obtener información útil para el diagnóstico de enfermedades neuromusculares a 25 partir de una biopsia de tejido músculo esquelético comprende los siguientes pasos: 1) Realizar una tinción de la biopsia para resaltar las fibras musculares tipo I, las fibras musculares tipo II y el endomisio. 30 El objeto de la tinción es poder identificar visualmente en la  ES 2 408 137 B1 5 muestra los dos tipos de fibras musculares (tipo I y tipo II), así como el endomisio. En principio, se podría aplicar cualquier tipo de tinción capaz de conseguir este propósito, aunque preferentemente se aplican preparaciones de dos anticuerpos que tiñen de colores diferentes dos elementos de entre los tres mencionados. Es decir, se 5 tiñen dos de ellos de colores diferentes, quedando el color del tercero sin modificar. Más concretamente, en una realización preferida de la invención se aplica un primer anticuerpo que actúa contra la proteína 10 colágeno VI para teñir el endomisio de un primer color (verde) y un segundo anticuerpo que actúa contra la cadena pesada de la isoforma lenta de la miosina (concretamente sMyHC) para teñir las fibras musculares tipo I de un segundo color (rojo). Las fibras musculares tipo II, que no han sido teñidas, se mantienen de un color oscuro 15 cercano al negro. 2) Obtener una imagen de la biopsia tras la tinción. Para obtener la imagen se utiliza preferentemente un 20 microscopio de fluorescencia, normalmente conectado a un ordenador. La imagen se obtiene de una zona de la biopsia carente de artefactos causados durante la preparación de la misma. El resultado es una imagen que contiene fundamentalmente un mosaico de fibras musculares de colores rojo (tipo I) y negro (tipo II) separadas 25 por bandas de color verde (endomisio). 3) Segmentar la imagen para identificar los contornos de las fibras musculares. 30 Se lleva a cabo a continuación un paso de segmentación para separar de un modo claro las diferentes fibras musculares del  ES 2 408 137 B1 6 endomisio. En principio, se podrían utilizar diferentes técnicas resegmentación conocidas en la técnica, aunque en una realización preferida de la invención se aplica la transformada de Watershed. Esta técnica requiere del diseño de marcadores que 5 identifiquen las fibras que deseamos segmentar mediante la aplicación de distintos operadores de morfología matemática. El objetivo es encontrar los mínimos locales de la imagen que indiquen la presencia de fibras musculares, para después aplicar la Transformada Watershed que ya sí identificará de una manera exacta 10 el contorno de cada fibra. Para evitar que algunos capilares se confundan con dichas fibras, se aplican condiciones de color, basadas en los planos R (rojo), G (verde) y en el plano G cuando se realiza una ecualización del histograma 15 4) Formar una red donde las fibras musculares constituyen nodos y los contactos entre fibras musculares constituyen las uniones entre los nodos. Una vez realizada la segmentación, se identifican las fibras y se representa la imagen como un grafo formado por nodos (las fibras 20 musculares) y uniones entre esos nodos (cada fibra/nodo está unida a las fibras/nodos vecinos, es decir, aquellos que están en contacto con ella). Además, puesto que existen fibras de tipo I y fibras de tipo II, 25 también existirán nodos de tipo I y nodos de tipo II. La información acerca del tipo de nodo se utilizará para determinar diferentes parámetros de red, según se describirá más adelante en este documento. Por ejemplo, permitirá calcular cuántos vecinos de tipo I tiene una fibra de tipo II, el tamaño medio de las fibras de tipo I, y 30 otros parámetros similares.  ES 2 408 137 B1 7 Según una realización preferida de la invención, este paso comprende además representar gráficamente la biopsia como un grafo formado por los nodos y las uniones entre nodos, estando los nodos ubicados en el centro de masa de cada fibra. 5 5) Formar un vector característico de la biopsia cuyos elementos se eligen entre parámetros geométricos de las fibras y parámetros de red. Por último, se construye un vector característico que comprende al menos un parámetro de red o parámetro geométrico de 10 las fibras. Preferentemente, los parámetros del vector característico se eligen entre los siguientes: 1Área media de las fibras 2Desviación típica del área de las fibras 3Número medio de vecinos de cada fibra 4Desviación típica del número de vecinos de cada fibra 5Área media de las fibras tipo I 6Desviación típica del área de las fibras tipo I 7Área media de las fibras tipo II 8Desviación típica del área de las fibras tipo II 9 Desviación típica del número de vecinos de las fibras tipo I 10 Desviación típica del número de vecinos de las fibras tipo II 11 Número medio de vecinos tipo I de las fibras tipo I 12 Número medio de vecinos tipo II de las fibras tipo I 13 Número medio de vecinos tipo I de las fibras tipo II 14 Número medio de vecinos tipo II de las fibras tipo II 15 Media del cociente A1/A2 16 Desviación típica del cociente A1/A2 17 Dimensión media del eje mayor de las fibras 18 Dimensión media del eje menor de las fibras  ES 2 408 137 B1 8 19 Media de la relación de ejes 20 Desviación típica de la relación de ejes 21 Media de la envoltura convexa 22 Desviación típica de la envoltura convexa 23 Ángulos medios 24 Desviación típica de los ángulos 25 Media cociente área fibra/ área media fibras vecinas 26 Desviación típica cociente área fibra/ área media fibras vecinas donde: - Cociente A1/A2: área de cada fibra tras la segmentación partida por el área de la fibra tras la expansión proporcional 5 - Relación de ejes: es la relación entre el eje mayor y eje menor de una fibra, entendiendo como tales los ejes mayor y menor de la elipse que tiene el mismo segundo momento central normalizado que la fibra. 10 - Envoltura convexa: Proporción de píxeles de la envoltura convexa que también pertenecen a la fibra, entendiendo por envoltura convexa el polígono convexo más pequeño posible que contiene a la fibra. 15 - Ángulos: El ángulo que forma el eje mayor con el eje x. De este modo, es posible elegir un subgrupo de estos parámetros que tenga capacidad discriminatoria con relación a enfermedades musculares concretas, como miopatías o patologías neuromusculares, construyéndose 20 así un vector característico que permite determinar, a través de la comparación con un vector característico control correspondiente o equivalente a la biopsia de un individuo sano, no sólo la presencia de dichas enfermedades musculares, sino incluso su grado de afectación al paciente.  ES 2 408 137 B1 9 La Fig. 5 muestra un ejemplo donde el vector característico seleccionado está formado por las características 19 (media de la relación de ejes), 23 (ángulos medios) y 25 (media cociente área fibra/ área media fibras vecinas) de la tabla anterior. A continuación, se ha aplicado Análisis de Componente Principal (ACP) para representar un primer grupo de 16 5 biopsias correspondientes a individuos sanos (representados por cuadrados negros) y un segundo grupo de 20 biopsias correspondientes a pacientes con distrofias musculares (representados por círculos negros). Todas las biopsias pertenecen a cuádriceps de personas de entre 2 y 15 años de edad. 10 El análisis ACP es un método objetivo que utiliza los valores de las características seleccionadas para realizar la comparación entre dos grupos o más de imágenes. Como resultado, se obtiene una proyección en dos o tres dimensiones que maximiza la dispersión cada una de las imágenes. Esta visualización permite la cuantificación de las diferencias entre grupos 15 formados por cada tipo de datos. Cada imagen o punto de la Fig. 5 corresponde, por tanto, al vector característico de un paciente con distrofia o de un individuo sano. Se aprecia cómo ambos grupos aparecen separados en la Fig. 5, quedando los cuadrados correspondientes a individuos sanos principalmente a la izquierda de la gráfica y los círculos correspondientes a 20 individuos con distrofias principalmente a la derecha de la gráfica. Además, se descubre que la distancia entre los vectores correspondientes a pacientes afectados de distrofia (círculos) y el centro de masas de los vectores correspondiente a individuos sanos (cuadrados) se 25 correlaciona con el grado de afectación al paciente. Para comprobarlo, un neuropatólogo experto realizó, sin conocer el resultado del análisis anterior, evaluaciones del grado de afectación de cada biopsia de los pacientes con distrofia. Se asignó a cada biopsia una gradación de entre 1-4, correspondiendo el grado 1 a una biopsia poco afectada por la distrofia y el 30 grado 4 a una biopsia muy afectada por la distrofia.  ES 2 408 137 B1 16 En la Fig. 5 se puede ver que en la mayoría de los casos la evaluación del grado de afectación realizada por el patólogo, que se muestra como un número junto a cada círculo correspondiente a pacientes con distrofias musculares, se correlaciona directamente con la distancia entre dicho punto y el centro de masas del grupo de cuadrados correspondientes a 5 pacientes control. Es decir, básicamente cuanto más a la derecha se encuentra el círculo correspondiente al vector característico, mayor es el grado de afectación de la distrofia correspondiente a esa biopsia. Se demuestra así que el método de análisis de imagen aporta datos útiles para el diagnóstico de enfermedades musculares de una forma rápida, automática 10 y objetiva. Para una entrada (una biopsia) nueva a este sistema, también es posible estimar la clase a la que ésta pertenece empleando el método KNN (K vecinos más cercanos, o nearest neighbours según sus siglas en inglés). 15 En ese caso, se calcula la distancia entre los vectores característicos ya almacenados y el nuevo vector característico de la nueva biopsia, y se seleccionan los k ejemplos más cercanos. La nueva biopsia es clasificada con la clase que más se repite en los k vectores seleccionados.  ES 2 408 137 B1 17 REFERENCIAS Dubowitz, V., and Sewry, C.A. (2006). Muscle Biopsy: A Practical Approach (Eselvier). Escudero, L.M., da F. Costa, L., Kicheva, A., Briscoe, J., Freeman, M., and Babu, M.M. (2011). Epithelial organisation revealed by a network of cellular 5 contacts. Nature Communications. In press. Helliwell, T.R. (1999). Muscle: Part 1 - Normal structure and function. Current Orthopaedics 13, 33 41. Mitiche, A., and Ben Ayed, I. (2010). Variational and Level Set Methods in Image Segmentation. (Springer).10 O'Ferrall, E.K., and Sinnreich, M. (2009). The role of muscle biopsy in the age of genetic testing. Curr Opin Neurol 22, 543-553. Pette, D., and Staron, R.S. (2000). Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech 50, 500-509. 15  ES 2 408 137 B1 18 REIVINDICACIONES 1. Método para obtener información útil para el diagnóstico de enfermedades neuromusculares a partir de una biopsia de tejido músculo esquelético, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:5 - realizar una tinción de la biopsia para resaltar las fibras musculares tipo I, las fibras musculares tipo II y el endomisio; - obtener una imagen de la biopsia tras la tinción;10 - segmentar la imagen para identificar los contornos de las fibras musculares; - formar una red donde las fibras musculares constituyen nodos y los 15 contactos entre fibras musculares constituyen las uniones entre los nodos; y - formar un vector característico de la biopsia cuyos elementos se eligen entre parámetros geométricos de las fibras y parámetros de 20 red. 2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el paso de tinción de la muestra comprende aplicar preparaciones de dos anticuerpos que tiñen de colores diferentes dos elementos de entre: las fibras musculares 25 tipo I, las fibras musculares tipo II y el endomisio. 3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, donde un primer anticuerpo actúa contra la proteína colágeno VI para teñir el endomisio de un primer color y un segundo anticuerpo actúa contra la cadena pesada de la 30 isoforma lenta de la miosina para teñir las fibras musculares tipo I de un segundo color.  ES 2 408 137 B1 19 4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, donde el anticuerpo contra la cadena pesada de la isoforma lenta de la miosina es sMyHC. 5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el paso de obtención de una imagen de la biopsia teñida se lleva a 5 cabo utilizando un microscopio de fluorescencia en una zona de la biopsia carente de artefactos causados durante la preparación de la misma. 6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el paso de segmentación comprende el cálculo de marcadores 10 morfológicos para fibras musculares y la aplicación de la Transformada Watershed. 7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, donde el paso de formación de la red comprende identificar los vecinos de las fibras 15 musculares mediante la expansión del contorno de cada fibra aplicando directamente la Transformada Watershed a los marcadores morfológicos para fibras musculares. 8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, 20 donde el paso de formación de la red comprende además representar gráficamente la biopsia como un grafo formado por nodos y uniones entre nodos, estando los nodos ubicados en el centro de masa de cada fibra. 9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, 25 donde los parámetros del vector característico se eligen entre los siguientes: 1Área media de las fibras 2Desviación típica del área de las fibras 3Número medio de vecinos de cada fibra 4Desviación típica del número de vecinos de cada fibra 5 Área media de las fibras tipo I  ES 2 408 137 B1 20 6Desviación típica del área de las fibras tipo I 7Área media de las fibras tipo II 8Desviación típica del área de las fibras tipo II 9 Desviación típica del número de vecinos de las fibras tipo I 10 Desviación típica del número de vecinos de las fibras tipo II 11 Número medio de vecinos tipo I de las fibras tipo I 12 Número medio de vecinos tipo II de las fibras tipo I 13 Número medio de vecinos tipo I de las fibras tipo II 14 Número medio de vecinos tipo II de las fibras tipo II 15 Media del cociente A1/A2 16 Desviación típica del cociente A1/A2 17 Dimensión media del eje mayor de las fibras 18 Dimensión media del eje menor de las fibras 19 Media de la relación de ejes 20 Desviación típica de la relación de ejes 21 Media de la envoltura convexa 22 Desviación típica de la envoltura convexa 23 Ángulos medios 24 Desviación típica de los ángulos 25 Media cociente área fibra/ área media fibras vecinas 26 Desviación típica cociente área fibra/ área media fibras vecinas 10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los parámetros del vector característico se eligen utilizando los métodos SFS y SBS mediante una red neuronal Fuzzy-ARTMAP 5 11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende comparar el vector característico con un vector característico control correspondiente o equivalente a una biopsia de tejido sano. 10 12. Método de acuerdo con la reivindicación 11, donde la comparación del  ES 2 408 137 B1 21 vector característico con el vector característico control se realiza utilizando la técnica de Análisis de la Componente Principal (ACP). 13. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde un vector característico formado por los parámetros 19 (media de la 5 relación de ejes), 23 (ángulos medios) y 25 (media cociente área fibra/área media fibras vecinas) permite determinar la presencia y grado de afectación de distrofia muscular. 14. Programa de ordenador que comprende instrucciones de programa 10 para hacer que un ordenador lleve a la práctica el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13. 15. Programa de ordenador según la reivindicación 14, incorporado en medios de almacenamiento.15 16. Programa de ordenador según la reivindicación 14, soportado en una señal portadora.  ES 2 408 137 B1 22 FIG. 1 FIG. 2  ES 2 408 137 B1 23 FIG. 4 FIG. 3  ES 2 408 137 B1 24 FIG. 5  ES 2 408 137 B1 25