El fluido folicular y las células del cúmulo como moduladores de la calidad de los gametos

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Departamento de Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Médica El FLUIDO FOLICULAR Y LAS CÉLULAS DEL CÚMULO COMO MODULADORES DE LA CALIDAD DE LOS GAMETOS TESIS DOCTORAL MÓNICA DORADO SILVA Sevilla, 2024 El FLUIDO FOLICULAR Y LAS CÉLULAS DEL CÚMULO COMO MODULADORES DE LA CALIDAD DE LOS GAMETOS Tesis Doctoral presentada por Doña. MÓNICA DORADO SILVA para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2024 D. JAIME GOSÁLVEZ BERENGUER, Doctor en Biología, Catedrático de Genética del Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid D. FERNANDO SÁNCHEZ MARTÍN, Doctor en Medicina, responsable del Área de Reproducción Asistida de Ginemed Sevilla CERTIFICAN Que la presente Tesis Doctoral titulada “El fluido folicular y las células del cúmulo como moduladores de la calidad de los gametos” realizada por DOÑA. MÓNICA DORADO SILVA, ha sido llevada a cabo bajo sus direcciones y reúne las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor. En Sevilla, a 10 de mayo de 2024 VºBº de los directores: Fdo.: Dr. Jaime Gosálvez Berenguer Fdo.: Fernando Sánchez Martín Fdo.: Mónica Dorado Silva SANCHEZ MARTIN FERNANDO - Firmado digitalmente por SANCHEZ MARTIN FERNANDO - Fecha: 2024.05.10 15:20:56 +02'00' El doctorando: DORADO SILVA MONICA - Firmado digitalmente por DORADO SILVA MONICA - Fecha: 2024.05.10 16:30:34 +02'00' GOSALBEZ BERENGUER JOSE JA - 2024.05.10 17:28:46 +02'00' A mis padres. Este logro es un reflejo de vuestro esfuerzo para ofrecerme una educación. A mi compañero de vida. A mis hijos. AGRADECIMIENTOS Ha llegado el momento que durante tanto tiempo he estado esperando y puedo decir que me siento orgullosa de lo que he conseguido. El camino no ha sido fácil, pero no he estado sola en este proyecto. Quiero agradecer a mi gran amigo y tutor el Dr. Antonio Carrillo Vico, Catedrático de la Universidad del Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología de la Facultad de Medicina de Sevilla. Por su ayuda siempre que la he necesitado. A mis directores: El Dr. Fernando Sánchez Martín, Director de Clínicas Ginemed, por animarme a embarcarme en este proyecto, y especialmente al Dr. Jaime Gosálvez Berenguer, Catedrático de Genética de la Universidad Autónoma de Madrid, por su inestimable ayuda, por transmitirme su entusiasmo y por estar siempre cuando lo he necesitado. A todos los coautores de las publicaciones en las que he participado durante el desarrollo de la tesis, así como al personal de los distintos departamentos de las universidades y clínicas implicadas, porque sin sus labores no habría sido posible. A mis compañeras de Huelva, por facilitarme siempre las cosas y darme ánimos en esta etapa final que tan dura se me ha hecho. A mi gran amiga y compañera Mercedes González Martínez, Responsable de Andrología del Laboratorio de Reproducción Humana Asistida de la Clínica Ginemed Sevilla, por su apoyo y por compartir conmigo tantos momentos de nuestras vidas. A mis amigas, por esos ratitos de desconexión y por sus sabios consejos que tal bien me han venido. A mis padres, por darme todas las oportunidades y su amor incondicional. Por último, a mi compañero de vida, mi Cari, su paciencia y comprensión, por estar siempre a mi lado y ser mi apoyo incondicional, y a mis niños Mario y Sara, por entender desde pequeños que “las mamas también estudian”. 3. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE GENES ESPECÍFICOS RELACIONADOS CON LA COMPETENCIA DEL OVOCITO EN CCs COMO POSIBLES PREDICTORES DE IMPLANTACIÓN ........................................................................ 35 4. POSIBLE PAPEL PROTECTOR DEL FF ................................................................. 36 4.1 Efecto del FF sobre la fragmentación de ADN espermático ......................... 36 4.2. Efecto del FF sobre la actividad DNasa del plasma seminal ........................ 36 5. TÉCNICAS EMPLEADAS ........................................................................................ 37 5.1 Análisis de la fragmentación del ADN en CCs ............................................ 37 5.2 Aislamiento de ARN, Transcripción inversa, y PCR en tiempo real .............. 38 5.3 Fragmentación del ADN del espermatozoide .............................................. 39 5.4 Capacidad prooxidante ............................................................................ 39 5.5 Aislamiento de ADN genómico ................................................................ 39 5.6 Efecto del FF sobre actividad DNasa en el eyaculado.................................. 40 5.7 Efecto de la digestión con proteinasa K y la inactivación por calor ............... 40 5.8 Análisis del efecto de cationes divalentes sobre la actividad DNasa .............. 41 5.9 Análisis estadístico .................................................................................. 41 RESULTADOS .............................................................................................................. 43 1. EXPERIMENTOS EN CCs ........................................................................................ 44 1.1 Valoración del posible impacto del CCDFI de CCs ..................................... 44 1.2. Valoración del transcriptoma de las CCs como predictor de ........................ 50 implantación ................................................................................................ 50 2. EXPERIMENTOS EN FF .......................................................................................... 54 2.1 Efecto del FF sobre la fragmentación del ADN espermático ........................ 54 2.2 Capacidad prooxidante en plasma seminal y FF ......................................... 55 2.3 Actividad DNasa del FF y del Plasma seminal ............................................ 56 DISCUSIÓN .................................................................................................................. 63 1. ESTUDIOS EN LAS CCs .......................................................................................... 65 1.1 Análisis de los niveles de fragmentación del ADN en las CCs ...................... 65 1.2 Perfil transcriptómico de las CCs .............................................................. 71 2. ESTUDIOS EN EL FF ............................................................................................... 74 2.1 Análisis del efecto del FF sobre el ADN espermático .................................. 74 2.2 Análisis del efecto del FF sobre el estrés oxidativo del plasma seminal ......... 76 3.3 Análisis del efecto del FF sobre la actividad DNasa del plasma seminal ........ 77 CONCLUSIONES ........................................................................................................ 80 BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 83 RELACIÓN DE TRABAJOS PUBLICADOS CON LOS RESULTADOS DE LA PRESENTE TESIS DOCTORAL ............................................................................. 109 1. Baratas A, Gosálvez J, de la Casa M, Camacho S, Dorado-Silva M, Johnston SD, Roy R. Cumulus Cell DNA Damage as an Index of Human Oocyte Competence. Reprod Sci. 2022;29(11):3194-3200. doi: 10.1007/s43032-021-00817-7. ............ 110 2. Bejarano I, Dorado-Silva M, Sarmiento-Soto H, Álvarez-Sánchez N, Lardone PJ, Guerrero JM, Sánchez-Martín P, Carrillo-Vico A. GPX3 Overexpression in Cumulus Cells Entails a Poor Prognosis for Uterine Implantation of Morphotype A Embryos. Biology (Basel). 2022;11(9):1361. doi: 10.3390/biology11091361 ..................... 117 3. Dorado-Silva M, Bartolomé-Nebreda J, Sánchez-Martín P, Johnston S, Gosálvez J. Co-incubation of spermatozoa with human follicular fluid reduces sperm DNA fragmentation by mitigating DNase activity in the seminal plasma. J Assist Reprod Genet. 2020 Jan;37(1):63-69. doi: 10.1007/s10815-019-01643-2. ...................... 128 4. Bartolomé J, Romeo SC, Dorado-Silva M, García de la Vega C, López C, Sánchez- Martín P, Johnston S, Gosálvez J. DNase activity in human seminal plasma and follicular fluid and its inhibition by follicular fluid chelating agents. Reprod Biomed Online. 2021 Dec;43(6):1079-1086. doi: 10.1016/j.rbmo.2021.09.015. ............... 136 ANEXO ........................................................................................................................ 145 INTRODUCCION 1 INTRODUCCIÓN INTRODUCCION 2 1. ESTADO ACTUAL DE LAS TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA Las técnicas de reproducción asistida (TRA) tienen como objetivo ayudar a parejas que no consiguen reproducirse de forma natural y superar los problemas existentes, en cada caso, tras la aplicación de una serie de metodologías que implican tanto a la mujer como al varón. Una de las técnicas más frecuentemente utilizadas es la fecundación in vitro en sus diferentes variantes: fertilización in vitro (FIV) e inyección de un espermatozoide en un ovocito maduro (ICSI). Con esta serie de técnicas, el ovocito maduro (ovocito secundario o metafase II (MII)) de la mujer es fecundado en el laboratorio con los espermatozoides de un varón. El ovario es el órgano que envejece de forma más rápida en los seres humanos y el deterioro funcional ya es evidente en las mujeres de poco más de 30 años. El envejecimiento reproductivo se caracteriza por una disminución en la cantidad y calidad de los ovocitos, lo que se asocia con un aumento de la infertilidad (1), abortos espontáneos (2) y defectos de nacimiento (3). Por el contrario, aunque los espermatozoides pueden sufrir un deterioro a lo largo del tiempo, éste es mucho más lento, lo que no les impide procrearse a edades más avanzadas. Normalmente, para mejorar los resultados reproductivos en la mujer, se realiza una estimulación hormonal que posibilite el desarrollo de varios folículos a la vez. Esto permite reclutar varios ovocitos de manera simultánea en el laboratorio de Fecundación In Vitro. Al aumentar el número de óvulos disponible, aumentamos las posibilidades de éxito reproductivo. En cualquiera de los casos, y pese a los grandes avances logrados, las tasas de éxito siguen siendo relativamente bajas y no siempre se consigue que el deseado embarazo llegue a término. Con el uso de las TRA es muy frecuente obtener múltiples embriones viables para la transferencia. Cada vez más se practica la transferencia embrionaria única en estadio de blastocisto, pero ello no siempre se traduce en un embarazo evolutivo a término. El éxito de las técnicas de reproducción asistida está centrado en la obtención de preembriones de calidad y aumentar las tasas de implantación. Para ello, además de refinar los protocolos de estimulación ovárica, se ha realizado un gran esfuerzo en la mejora de las condiciones INTRODUCCION 3 de cultivo y en el seguimiento de la evolución de los embriones. De hecho, el desarrollo en las condiciones de cultivo ha mejorado las tasas de éxito de embarazos, pero la capacidad de un embrión de desarrollarse hasta conseguir un nacimiento vivo depende no sólo de esa circunstancia, sino de la calidad de los gametos de los que deriva el embrión, y sobre todo del ovocito. Antes de someter a las parejas a las TRA se deben realizar estudios tanto a las mujeres como a los varones que nos informen sobre el estado de la fertilidad de la pareja. En el caso de los varones el acceso a sus gametos es fácil y nos puede aportar mucha información al respecto. En cambio, el estudio del gameto femenino es inviable actualmente, pues no tenemos acceso a ellos hasta el mismo día en que se extraen, y por supuesto, solo podemos ver sus características morfológicas en el momento de la realización de la TRA. Por esta razón, la información de la que se dispone sobre la calidad de los ovocitos actualmente es muy limitada. Lo ideal sería poder identificar biomarcadores no invasivos que nos permitieran predecir el potencial de desarrollo de los ovocitos humanos y el buen desarrollo de los embriones, pero actualmente, como ya hemos comentado, la estrategia más utilizada es la evaluación morfológica visual. Esta es la herramienta disponible habitual en las clínicas de reproducción para la selección de ovocitos o embriones previa a su transferencia y se utiliza de forma rutinaria para intentar identificar cuál de los embriones reviste el mayor potencial para establecer un embarazo y así establecer correlaciones con la calidad embrionaria y sobre todo con la consecución final de niños nacidos vivos, pero la realidad es que no siempre el embrión con mejor morfología es el que consigue implantarse. INTRODUCCIÓN 4 2. MADURACIÓN OVOCITARIA El ovocito se origina cuando el ovario en desarrollo (gónada primitiva) comienza a ser poblado de células germinales primordiales en la quinta semana de desarrollo embrionario (4). Las células germinales primordiales continúan proliferando y dan lugar a las oogonias. Al inicio de la meiosis, estas células quedan detenidas un largo periodo de tiempo. La transformación de la gónada indiferenciada en un ovario se inicia en las semanas octava y novena de la gestación mediante tres acontecimientos: inicio de la meiosis de las células germinales, formación de los folículos y formación de otros tipos celulares (4). La maduración del ovocito comienza, por tanto, antes del nacimiento y continúa a lo largo de la foliculogénesis. Es un proceso largo y prolongado. Al nacimiento las niñas tienen 600.000-800.000 folículos primordiales detenidos en profase I. Cuando llegan a la pubertad, en el ciclo menstrual, tan solo algunos folículos antrales continúan creciendo hasta conseguir madurar completamente. Seguidamente se desplazan hacía las trompas de Falopio y al útero, donde serán potencialmente fecundables (menos de 500 a lo largo de la vida reproductiva), el resto quedarán detenidos en profase I (5). 2.1. Ovogénesis y foliculogénesis Los ovarios humanos son dos cuerpos ovalados que después de la pubertad tienen unas dimensiones de 4 x 3 x 1 cm, y se encuentran alojados en la pelvis fijados a la superficie posterior del ligamento ancho del útero por medio de un pliegue peritoneal denominado mesovario (6). En el ovario se distinguen tres regiones: una corteza externa (cortex externo) que contiene al epitelio germinal que origina a los folículos, una médula central constituida por un estroma de tejido conectivo laxo y fibroso, y el hilio interno (hilum), que se encuentra alrededor de la zona de unión del ovario al mesovario, a través del cual se insertan en la gónada las fibras nerviosas y los vasos sanguíneos (6). El ovario se encuentra dividido funcionalmente en dos compartimentos: el intersticial, conformado por células del estroma y de la teca externa, y el folicular, que contiene el ovocito, las células de la granulosa y las células de la teca interna, que interaccionan entre sí durante las diversas etapas de la maduración folicular. Los ovocitos se desarrollan en el ovario, dentro del folículo. El folículo ovárico es la unidad fundamental del cortex, en él se producirán una serie de cambios en función del grado de diferenciación y desarrollo de los ovocitos INTRODUCCIÓN 5 contenidos en su interior. Estos cambios están vinculados a las dos funciones del ovario: secretar hormonas a partir de la pubertad y proporcionar los óvulos. De acuerdo con su organización estructural, se puede definir cinco fases en el desarrollo folicular: folículos primordiales, primarios, secundarios, terciarios (antral temprano) y de Graff o preovulatorios, si bien es común clasificar los folículos en preantrales (desde primordiales hasta secundarios) y antrales (desde terciarios hasta preovulatorios) (Figura 1). Una vez que se produce la ovulación, la estructura folicular evoluciona hacia la formación de un cuerpo lúteo, considerado como la fase final de maduración del folículo (7). El cuerpo lúteo funciona como glándula endocrina temporal del ovario, encargada de producir la progesterona esencial para la nidación del óvulo. La formación del cuerpo lúteo se induce en cada ciclo menstrual tras el pico de secreción ovulatoria de la hormona luteinizante (LH) (6). INTRODUCCIÓN 6 Figura 1: Esquema del desarrollo folicular, ovulación y formación del cuerpo lúteo. Se distingue la fase folicular en la cual se encuentran los distintos estados de desarrollo del folículo: folículo primordial, folículo primario, folículo secundario y folículo preovulatorio. Tras la liberación del óvulo comienza la fase lútea Durante la fase prolongada de reposo en el folículo primordial, los cromosomas del ovocito están solo moderadamente dispersos empaquetados en un núcleo conocido como vesícula germinal (VG) y transcripcionalmente activos para asegurar un nivel suficiente de funciones de mantenimiento, se encuentra detenido en fase de diplotene dentro de la profase I de la meiosis (8) . El desarrollo y diferenciación posterior del folículo se acompaña de una fase paralela de crecimiento de los ovocitos (9), no obstante, el crecimiento del ovocito finaliza en una etapa antral temprana, antes de que se complete el desarrollo del folículo. En esta etapa, el gameto femenino alcanza su tamaño completo en preparación para la fertilización y el desarrollo previo a la implantación. El crecimiento solo se puede lograr a través de una transcripción de ARN intensa y sostenida. Con este fin, la cromatina del ovocito adquiere INTRODUCCIÓN 7 una condición de máxima dispersión para permitir el acceso a múltiples sitios de transcripción por parte de la maquinaria de transcripción (8). El crecimiento de los ovocitos se desarrolla durante 110 a 120 días, durante los cuales la masa celular experimenta un aumento de más de 100 veces y el diámetro de la célula cambia de 40 a 120 mm. La maduración citoplasmática conlleva una serie de sucesos que preparan al ovocito para reanudar la meiosis, fecundación y futuro desarrollo del preembrión. Esta fase se denomina capacitación (10). Durante esta fase de crecimiento, la mayor parte de la foliculogénesis, el ovocito sufre un reordenamiento del citoplasma, el ovocito produce y acumula macromoléculas y orgánulos en grandes cantidades (11). Estas, regularán funciones cruciales en el desarrollo, tales como ARN latente y proteínas llamadas “factores de efecto materno” que son fundamentales para transición materno cigótica y la embriogénesis temprana (el ARN materno será almacenado y traducido en el momento adecuado) (12). De esta manera, el ovocito acumula suficiente citoplasma, necesario para poder llevar a cabo el desarrollo embrionario previo a la implantación (para que el óvulo fecundado se pueda dividir en ausencia de un crecimiento neto). Medidas de la síntesis proteica revela que los ovocitos no pueden sintetizar todas las proteínas que necesitan durante la fase de crecimiento (13). Parte de esas proteínas son obtenidas del exterior (14). La maduración ovocitaria implica muchos procesos intercelulares e intracelulares cuyas implicaciones para el desarrollo del embrión son tan importantes como el logro de la haploidía (8). Por ejemplo, cambios importante en la cromatina que acompañan la reanudación meiótica (15), modificaciones en la distribución, agrupamiento y actividad mitocondrial en respuesta a las cambiantes demandas de energía de la maquinaria celular (16) y reorganización y maduración del Retículo Endoplásmico (ER) que finaliza con un incremento en la capacidad de liberar Ca2+ intracelular (17). Una vez el ovocito alcanza su máximo tamaño (~120 μm), empieza a formarse la primera acumulación de fluido folicular (FF) entre las células de la granulosa (CG) (formación del antro), dando lugar a los llamados folículos antrales. A partir de entonces, los folículos pasan a ser dependientes de las gonadotrofinas, la hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH), formándose los receptores tanto de las CG como de la teca. INTRODUCCIÓN 14 GMPc en el folículo puede derivar de la regulación positiva del GMPc sobre PDE3A, pero también es causada por la inhibición de la actividad guanil ciclasa de NPR2 en el compartimento CCs (43). Por lo tanto, la reducción de la producción del ligando NPPC, la inhibición de la actividad de la guanil ciclasa del receptor afín NPR2 y la supresión de la comunicación mediada por la unión GAP actúan en paralelo para reducir el nivel intraovocitario. La supresión de la síntesis de GMPc y la inhibición del transporte al interior del ovocito, permiten incrementar la actividad de PDE3A. Esto provoca la disminución de la concentración de AMPc intraovocitario, que disminuya la actividad de PKA, y con ello, aumente la actividad CDC25, CDK1 se desfosforila y se pueda reiniciar la maduración meiótica. La activación del MPF se detecta antes o simultáneamente con la rotura de la vesícula germinal (GVBD). La actividad de la MPF se incrementa hasta metafase de la primera meiosis y disminuye durante la transición anafase-telofase. Dicha actividad aumenta de nuevo hasta que el ovocito llega a MII, el ovocito termina su primera división meiótica y queda detenido en MII hasta ser fecundado por el espermatozoide (Figura 4). INTRODUCCIÓN 15 Figura 4: Representación MPF activo. La estimulación aguda de LH es seguida de la disminución en los niveles de GMPc y una supresión de la síntesis de NPPC. La caída en la concentración de GMPc en el folículo GMPc deja de producir la inhibición sobre PDE3A, disminuye la concentración de AMPc, la PKA baja su actividad, y aumenta la actividad CDC25, CDK1 se desfosforila y se pueda reiniciar la maduración meiótica INTRODUCCIÓN 16 3. LAS CÉLULAS DEL CÚMULO (CCs) El ovocito se desarrolla en el interior del folículo inmerso en el FF envuelto en varias capas de las CCs que se encuentran íntimamente relacionada con el mismo (44). Las CCs están en contacto con el ovocito formando el COC. Este complejo permite la comunicación entre el ovocito y CCs, afectando directamente a la expresión génica y a la síntesis de proteínas, lo que conduce a la diferenciación y expansión de las CCs, así como a la maduración del ovocito, del folículo primordial (algunos de ellos, los reclutados, son los que iniciarán su maduración, el resto quedarán detenidos toda la vida). Desempeñan un papel importante en el crecimiento del ovocito, la maduración meiótica, la ovulación y la fecundación (45,46). El papel de los CCs en el crecimiento de los ovocitos es sincronizar la maduración nuclear y del citoplasma, regular la reanudación de la meiosis y proporcionar los factores que sean necesario como el AMPc y el GMPc (mensajeros secundarios) (39). Las CCs son originadas a partir de células de la granulosa (GCs) indiferenciadas. Durante la formación del antro en el folículo, las GCs se diferencian en células de la granulosa mural (MGCs) y CCs (45). Las CCs contactan directamente con el ovocito a través de largas proyecciones transzonales con uniones terminales que conectan las células del cúmulo con el ovocito (47). Están en contacto con el citoplasma del ovocito y penetran en la zona pelúcida (ZP) mediante uniones GAP (48) y se produce un diálogo intercelular. Se produce a través de dos mecanismos principales: las uniones GAP y las señales paracrinas (comunicación con una célula cercana modificando su comportamiento) (49). Las uniones GAP son canales de membrana intercelulares formados por conexinas. Cuando se conectan a las conexinas de células adyacentes, forman canales permeables (47). Las pequeñas moléculas que pueden penetrar a través de las uniones GAP incluyen iones, nucleótidos cíclicos (AMPc, GMPc), metabolitos, aminoácidos y transcritos de ARN, todos los cuales contribuyen a la meiosis, la producción de ATP y el equilibrio del pH en el ovocito (48–50). Esta comunicación también es importante para la diferenciación de las CCs (51). La diferenciación de GC indiferenciados en MGCs y CCs es estimulada por la FSH en estrecha colaboración con factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) (52,53). La diferenciación inducida por FSH de las MGCs juega un papel crucial en la INTRODUCCIÓN 17 fertilidad y prepara los órganos reproductores femeninos para transporte de los espermatozoides, la fertilización y el desarrollo embrionario temprano (54). Las CCs y MGCs no solo se diferencian en la localización del folículo, también son funcionalmente distintas (55). Las CCs apoyan el crecimiento del ovocito, producen ácido hialurónico (AH) y tienen capacidad de expandirse en respuesta a FSH, mientras que las MGCs tienen función endocrina y apoyan el crecimiento del folículo (56), no sintentizan AH y no por tanto permanecen no expandidas (57). Tras el aumento de la LH previo a la ovulación, CCs experimenta expansión acumulando HA en la matriz extracelular (ECM) que ayuda a la ovulación y a la posterior fertilización (58). Las MGCs son citoplasmas compactos, oscuros y con forma epitelial. Por el contrario, los CCs son citoplasmas laxos y claros y tienen forma redonda (45). De esta forma, es lógico imaginar que el daño que presenten estas células, debido a patologías de diferente etiología, puede inducir a una reducción de las tasas de fertilización y la posibilidad de embarazo (59). El incremento de estudios de la evaluación del transcriptoma de CCs ha demostrado el potencial que pueden tener para predecir la competencia embrionaria (60,61). La caracterización del perfil transcriptómico en CCs es un procedimiento no invasivo. En esta línea, se han propuesto revisar las expresiones diferenciales de ARNm de varias proteínas en CCs como potenciales predictores de la competencia ovocitaria. Genes de las células del cúmulo incluyen COX2, GREM1, HAS2 y PTX3 como marcadores de la calidad de los ovocitos (62,63). Otro estudios demuestran que las células del cúmulo de ovocitos que tienen mayores niveles de transcripción de HAS2, GREM1 y COX2 se desarrollan en embriones de alta calidad, comparado con las células del cúmulo de ovocitos que no se fertilizan ni se desarrollan en embriones de mala calidad (63,64). La expresión del gen HAS2 se promueve por las hormonas luteinizantes (LH) en el COC durante el proceso de ovulación y desempeña un papel esencial en el agrandamiento del cúmulo, lo que resulta en una maduración adecuada de los ovocitos (65). INTRODUCCIÓN 18 En un estudio de 2018 se presentó que una alta expresión en CCs de tres genes de actividad GDF9 (HAS2, PTGS2 y GREM1) se correlacionó con blastocistos de mejor calidad. Los embriones que progresaron hasta convertirse en embriones de alta calidad (grados 3, 4 y 5) tenían una alta expresión en comparación con embriones de baja calidad (grados 1 y 2) (66). La sobreexpresión del gen CDC42 en las células de la granulosa se ha asociado con ovocitos competentes que lograron resultados de embarazo (67). CDC42 es una proteína de unión a GTP de la familia Rho que desempeña varias funciones celulares como la regulación de la apoptosis, activación de la transcripción, proliferación y polaridad celulares. El aumento de genes relacionados con el estrés oxidativo en las células del cúmulo humano, se asocian con una reducción de la fertilización de ovocitos mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides (68). Los factores estresantes como la hipoxia actúan como fuertes reguladores de la expresión de GPX3. En este sentido, La sobreexpresión de GPX3 se ha asociado con la producción de ROS en CCs, ovocitos y líquido folicular (69). ROS causan peroxidación lipídica, inactivación enzimática y daño celular, lo que resulta en apoptosis (70) de células del cúmulo y ovocitos (71). CX43 juega un papel esencial en la unión gap conformacional, una piedra angular en la diafonía CCs-ovocitos, garantizando la detención meiótica y confiriendo competencia en el desarrollo (72). Sin embargo, los resultados obtenidos de óvulos humanos muestran una caída en los niveles de CX43 en los CCs una vez que el ovocito alcanza la etapa madura de la MII (73). INTRODUCCIÓN 19 4. EL FLUIDO FOLICULAR (FF) El fluido folicular se encuentra en el interior de los folículos de De Graaf en la cavidad antral rodeando al óvulo (4). El FF es generado durante la foliculogénesis en un proceso que comienza en el córtex del ovario en el momento en el que se empiezan a formar los folículos primordiales (74). Está formado, en parte, por secreciones procedentes de las células foliculares y, en parte, es un exudado del plasma (75). Por otro lado, la barrera folicular sanguínea juega un papel central en la composición del líquido folicular mediante la regulación de la transferencia de proteínas con un peso molecular de hasta 500 kDa (76). La composición de FF difiere de la del suero, lo que sugiere que puede ser adecuado para suplir las necesidades de los ovocitos en desarrollo (77). Los componentes principales de FF son hormonas esteroideas, metabolitos, polisacáridos, proteínas, ROS y así como enzimas antioxidantes que ayudan principalmente en el crecimiento y maduración de ovocitos y células foliculares además de protegerlas de daño físico y estrés oxidativo (78). El líquido folicular también sirve como medio de comunicación entre el ovocito y las células foliculares, que es necesario para la adquisición de competencias de desarrollo y fertilización por parte del ovocito (78). Se ha sugerido que cambios en los componentes de FF influyen en la calidad de los ovocitos (desde la maduración hasta la fertilización), el desarrollo temprano del embrión y el embarazo posterior (79). El ovario sintetiza dos tipos de hormonas: las hormonas esteroideas (fundamentalmente estrógenos y progesterona, aunque también pequeñas cantidades de andrógenos) y hormonas no esteroideas (relaxina, inhibina y activina) (80). Un ambiente estrogénico intrafolicular está asociado con un buen crecimiento folicular y tiene efectos antiatrésicos. El estradiol (tipo de estrógeno), presente también en el FF, mejora la maduración de los ovocitos (81). La progesterona es el componente hormonal más abundante del líquido folicular y es importante en las etapas finales del desarrollo folicular y en la ovulación (82). Con respecto a los andrógenos, aunque un ambiente predominantemente androgénico puede inducir atresia folicular y niveles elevados de testosterona se asocian a ovocitos de menor calidad (83), es necesaria una cierta cantidad de este tipo de hormonas para obtener un crecimiento folicular óptimo (84,85). En el líquido folicular, altos niveles de inhibina INTRODUCCIÓN 20 A y B se asocian con una mejor respuesta ovárica, pero no se observa relación con la tasa de fertilización y de embarazo (86–88). También podemos encontrar las diferentes gonadotropinas: LH, FSH, y la gonadotropina coriónica humana (hCG), y otras hormonas como la hormona del crecimiento (GH), la prolactina (PRL), la hormona antimulleriana (AMH) o corticoides, como el cortisol y la cortisona (89). Las gonadotropinas (FSH, LH y hCG) están involucradas en el crecimiento y desarrollo del folículo, y altas concentraciones promueven la maduración del ovocito y se asocian con el número de ovocitos que tienen una alta probabilidad de ser fertilizados (90,91). Entre los metabolitos que podemos encontrar en el FF destacan los aminoácidos, tanto esenciales como no esenciales; pequeños iones (sodio, potasio, calcio, cloruro, bicarbonato); ácidos orgánicos (ácido ascórbico); carbohidratos (glucosa, piruvato, lactato); ácidos grasos (ácido palmítico, oleico, linoleico, araquidónico, esteárico), nucleótidos y otras pequeñas moléculas derivadas de la actividad metabólica de las células foliculares (92). Las proteínas que constituyen la matriz extracelular son factores importantes expresados durante la foliculogénesis. Realizan una serie de funciones esenciales, entre las que se incluyen la señalización celular, el crecimiento, el mantenimiento de la forma celular, la diferenciación y la esteroidogénesis (93). Se pueden encontrar dos tipos de matrices en los folículos en desarrollo. Por un lado, la matriz de la lámina basal, que rodea la membrana basal y las células de teca. Por otro lado, la matriz del COC, entre las CCs y el ovocito (zona pelúcida) rica en hialuronano ( ácido hialurónico) cuya expansión y remodelación es esencial para el crecimiento del folículo y la ovulación (78). Los factores de crecimiento son proteínas o compuestos similares a proteínas con capacidad de estimular la proliferación celular y también se encuentran presentes en el líquido folicular, como por ejemplo varios factores de crecimiento de la familia IGF (factor de crecimiento insulínico), como IGF-II, así como IGFBP-3 e IGFBP-4 (proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico) que están implicados en la fertilización de ovocitos y en la escisión, desarrollo y morfología del embrión (94). INTRODUCCIÓN 21 Las principales enzimas que se han detectado en el FF son transferasas, que transfieren grupos funcionales (ej quinasa que transfieren grupos fosfatos), hidrolasas, que catalizan la ruptura de enlaces químicos mediante la adición de moléculas de agua (ej proteasas y nucleasas, que descomponen proteínas y ácidos nucleicos respectivamente) y metaloproteasas entre otras. Las transferasas e hidrolasas pueden catalizar la síntesis de varios metabolitos para proporcionar nutrientes al ovocito en desarrollo y también a las células foliculares (78). En definitiva, en el fluido folicular, estas enzimas pueden desempeñar diversos roles, incluyendo la regulación del desarrollo folicular, la maduración ovárica y la interacción entre el óvulo y las células del folículo durante la ovulación y la fertilización. También se ha encontrado miARNm, pequeñas moléculas de ARN no codificantes monocatenarias que actúan como importantes reguladores de diversos procesos biológicos, como la proliferación, la diferenciación, la migración y la apoptosis (95). La comparación de FF humano de ovocitos MII versus VG permitió a los investigadores identificar 13 miARN expresados diferencialmente, mientras que la comparación de FF humano de ovocitos MII versus MI identificó siete miARN expresados diferencialmente (96). El análisis mostró que estos miARN parecían apuntar a la vía de señalización de GnRH y, por lo tanto, podrían modular el momento de la meiosis y la maduración de los ovocitos (96). La composición de FF puede estar influenciada por la edad. Las MCG producen más progesterona que las CCs en mujeres jóvenes, pero este patrón se invierte con la edad hasta que las CCs producen más progesterona que las MCG (97). También se han observado variaciones en los niveles foliculares de ROS/antioxidantes, hormonas y metabolitos en distintas etapas del desarrollo folicular (77,98). El FF se genera tanto por las células de la granulosa (CG) como por las CCs durante las últimas fases del desarrollo del folículo secundario (19). Las secreciones de estas células se vierten en el espacio antral y contribuyen progresivamente a un aumento en el volumen del líquido folicular. Tanto CCs como el FF son determinantes críticos para la calidad del INTRODUCCIÓN 22 ovocito. Un entorno intrafolicular sano favorece la adquisición de la competencia de desarrollo en los ovocitos. El ovocito es capaz de completar la meiosis y de ser fecundado para generar un embrión viable (99). INTRODUCCIÓN 23 5. PROCESOS QUE AFECTAN A LA CALIDAD OVOCITARIA 5.1 Fragmentación del ADN de CCs y apoptosis El daño en el ADN es un hecho muy común al que todas las células están expuestas en múltiples procesos durante su vida útil (100). Las células interpretan las roturas de cadena sencilla (SSBS) o roturas de cadena doble (DSBS) del ADN como una amenaza grave para su integridad y reaccionan con una respuesta al daño del ADN (DDR) que implica una detención del ciclo celular como efecto posterior de la activación de puntos de control de daños en el ADN (DDC), para permitir que intervengan los mecanismos de reparación (101). Si la escala del daño es abrumadoramente superior a la capacidad del mecanismo de reparación, la respuesta toma la forma de muerte celular programada mediante la cual las células afectadas son eliminadas por apoptosis (102). El aumento de la apoptosis de las células de la granulosa acompaña a un menor resultado del embarazo mediante FIV (103,104) . El aumento de la apoptosis de las células del cúmulo también acompaña a una alteración de la maduración y fertilización de los ovocitos, así como a un menor resultado del embarazo (105,106). Los ovocitos de mamíferos están particularmente expuestos al daño del ADN. De hecho, antes de emprender el crecimiento y la maduración permanecen latentes en el ovario durante largos periodos de tiempo (hasta más de 40 años en la especie humana). DDR puede activarse principalmente en las transiciones de fase G1/S y G2/M del ciclo celular. En G2, en presencia de daño en el ADN, estos reguladores inhiben la entrada en la fase M mediante la activación de las quinasas de punto de control Chk1 y ChK2 que, al destruir CDC25A o fosforilar CD25B o CDC25C, impiden la activación de CDK1 y, con ella, el complejo ciclina B-CDK1 que actúa como el principal regulador del ciclo celular (101,107,108). El nivel de diferenciación y el posible daño que se origine en el ADN tiene como resultado la fragmentación que se registra en las CCs. En ovocitos obtenidos tras estimulación ovárica que se utilizarán para técnicas de reproducción asistida, puede guardar una relación directa con la fertilización, el desarrollo embrionario tras la fertilización y la implantación embrionaria. La fragmentación del ADN en las CCs, dado que produce interrupciones en HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 30 Objetivo 3.- Analizar el efecto de los FF sobre características asociadas el espermatozoide tales como la fragmentación del ADN de los espermatozoides. Hipótesis 4.- Al igual que ocurre en la mayoría de los fluidos y tejidos celulares, el ambiente REDOX de los FF es variable dependiendo del ovocito que se analiza. Objetivo 4.- Valorar la capacidad prooxidante presente en los FF como posibles disruptores del estado celular de las CCs. Hipótesis 5.-. La actividad DNasa está regulada por la presencia de los iones Ca2+ y Mg2+, que modulan la actividad de estas enzimas. En presencia de estos iones, en concentraciones adecuadas, estas enzimas están activas. El FF impediría que las DNasas del plasma seminal se una a estos iones regulando su actividad. Objetivo 5.- Estudiar si el efecto protector del FF sobre la fragmentación del ADN espermático puede deberse a que inhiba la actividad DNasa del plasma seminal. Hipótesis 6.- Se asume que, la posible actividad DNasa presente en los FF estaría inhibida para evitar el daño que produciría en el ADN tanto de las CCs y el ovocito como de los espermatozoides que alcanzan el útero. Objetivo 6.- Valorar si el FF, al igual que ocurre en la mayoría de los fluidos fisiológicos, presenta actividad DNasa. MATERIAL Y MÉTODOS 31 MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 32 1. PACIENTES Todos los experimentos realizados en este trabajo fueron aprobados por el comité de ética de los hospitales universitarios Virgen Macarena-Virgen del Rocío (C.P. MDS_16 - C.I. 1169-M1-16). (ANEXO) Previamente a la toma de muestras, todos los participantes firmaron el consentimiento informado autorizando el uso de sus muestras correspondientes a las CCs y FF o bien de las muestras seminales. Para la estimulación ovárica previa a la la ICSI, todas las mujeres recibieron una dosis homogénea utilizando 150–200 UI de r-FSH (GONAL F®, Merck Serono, Australia) y 75-150 de UI de hMG (Menopur 75, Ferring Pharmaceuticals, West Drayton, Reino Unido). Este tratamiento fue seguido con la administración de gonadotropina sintética (0,25 mg de Orgalutran®, Organon Ltd, Irlanda). Esta se aplicó el día que el primer folículo alcanzó los 14 mm (días 6-7 del ciclo). La estimulación con rFSH y hMG duró 10 días y las dosis se mantuvieron sin cambios durante todo el proceso de estimulación. La maduración final del folículo se generó con una sola dosis de 250 µg de gonadotropina coriónica humana recombinante (hCG) (Ovitrelle®, Merk-Serono, Madrid, España), y se indujo cuando el número de folículos mayor de 17 mm fue >4, y pasadas 36h se realizó la punción folicular mediante aspiración con aguja transvaginal guiada por ecografía. Las mujeres incluidas en el estudio 1 y 2 presentaban un índice de masa corporal normal, eran no fumadoras de tabaco ni consumidoras habituales de contenido alcohólico. Además, estas mujeres firmaron una declaración indicando que no tenían antecedentes clínicos de diabetes, hipertensión arterial, infecciones bacterianas recientes, alteraciones genéticas determinadas, evidencia de hidrosálpinx u ovarios poliquísticos. Las mujeres incluidas en el estudio 3 y 4 pertenecían al programa de donación de óvulos, menos de 30 años, sin problemas de fertilidad, ni antecedentes de enfermedades genéticas. MATERIAL Y MÉTODOS 33 Las muestras de espermatozoides se recogieron mediante masturbación después de 3 a 4 días de abstinencia sexual y luego se dejó licuar durante 30 min. Se evaluaron los parámetros seminales de rutina según criterios de la OMS (140). A todos los pacientes varones se les había diagnosticado infertilidad idiopática por factor masculino no grave. Tras la realización de la ICSI, los embriones fueron clasificados en función de su día de desarrollo según los criterios propuestos por ASEBIR (141) y dependiendo del estudio planteado se utilizaron diferentes grupos de pacientes. Las características de las muestras experimentales que se usaron en cada experimento se detallan a continuación. MATERIAL Y MÉTODOS 34 2.VALORACIÓN DEL POSIBLE IMPACTO DE LA FRAGMENTACIÓN DE LAS CCs Para valorar el impacto de la fragmentación en las CCs sobre el éxito reproductivo, se utilizaron las CCs que son desechadas habitualmente durante la denudación de los ovocitos para ICSI. En este estudio se incluyeron 25 parejas a las que se les diagnosticó infertilidad idiopática (no se identificó ningún factor femenino o masculino específico). Todas las parejas acudieron a la clínica respectiva después de la búsqueda durante 1 año de embarazo sin éxito. La cohorte de estudio incluyó parejas que acudieron a la clínica para su primer ciclo reproductivo. La ICSI se realizó utilizando muestras de semen normozoospérmicas del varón de cada pareja. Después de la recuperación por aspiración del COC, las CCs se extrajeron del ovocito pipeteando suavemente en una solución de ácido hialurónico 1X (Hyase 10X, Vitrolife, Göteborg, Suecia). Todas las muestras se conservaron por criopreservación hasta su análisis. La crioconservación se llevó a cabo utilizando el protocolo de congelación estándar de semen (Cryoprotect II, Nidacon International Göteborg, Suecia). Las CCs se almacenaron en nitrógeno líquido durante aproximadamente 1 semana antes de ser analizadas. MATERIAL Y MÉTODOS 35 3. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE GENES ESPECÍFICOS RELACIONADOS CON LA COMPETENCIA DEL OVOCITO EN CCs COMO POSIBLES PREDICTORES DE IMPLANTACIÓN El estudio se realizó en 25 mujeres sometidas a tratamientos de reproducción asistida (ICSI) en primer o segundo intento. Las pacientes eran menores de 38 años, normorrespondedoras, o no presentaban problemas reproductivos severos. El número de MII (ovocitos en metafase II) recuperado debía ser entre 3 y 15. Las transferencias de embriones se realizaron en los primeros tres meses después de la fecha de la punción ovárica, sin exceder el número de tres embriones a transferir, según la Ley española 14/2006 sobre Técnicas de Reproducción Asistida. Los CCs se dividieron en 2 grupos: el "grupo de embarazadas" correspondía a las CCs de ovocitos cuya tasa de implantación de los embriones generados fue del 100% de lo que se transfirió, independientemente del número de embriones transferidos (el embarazo se verificó como latido cardíaco fetal positivo el detectado tras 9 semanas y además, la ecografía descartó gemelos monocoriónicos), y el grupo de mujeres “no embarazadas”, que correspondía a las CCs cuyos embriones transferidos no se implantaron con éxito. Las CCs recogidas de embriones que produjeron implantación parcial (un número menor de embriones implantados que transferidos) no se utilizaron en el estudio para no perder la trazabilidad de cuáles fueron los embriones transferidos que implantaron. En este caso, las CCs se extrajeron del ovocito mecánicamente utilizando dos agujas en una jeringa de 1 ml en un medio de fertilización (FM; Sage, Copenhague, Dinamarca). Individualmente, las CCs de cada ovocito se lavaron en un medio de cultivo (Quinn's Advantage TM Medium con HEPES Sage, Copenhague, Dinamarca), y fueron congelados inmediatamente en nitrógeno líquido, y finalmente se almacenó a 80ºC hasta su análisis en Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS) para el análisis posterior de las poblaciones de ARNm. MATERIAL Y MÉTODOS 36 4. POSIBLE PAPEL PROTECTOR DEL FF El estudio se realizó en donantes menores de 30 años. Se eligió el FF del primer folículo de la donante (aproximadamente 18 mm de diámetro) mediante aspiración. De este folículo se recuperó el ovocito de forma habitual y el FF fue reservado. El FF recuperado se centrifugó a 350 g durante 10 minutos y el sobrenadante se separó del sedimento. Parte del FF aspirado se inactivó mediante incubación a 56 °C durante 30 min, se llevó a cabo con el propósito de desactivar cualquier actividad enzimática o biológica presente en el fluido folicular. Otra parte se dejó sin inactivar Las muestras de semen de pacientes tenían los siguientes criterios de inclusión: concentración de espermatozoides > 25 × 106 espermatozoides ml-1 y con una motilidad lineal de espermatozoides de > 25%. 4.1 Efecto del FF sobre la fragmentación de ADN espermático Para estudiar el efecto del FF sobre la fragmentación del ADN espermático, se utilizaron 23 muestras de FF y 23 muestras de semen de pacientes. El FF se utilizó inactivado 4.2. Efecto del FF sobre la actividad DNasa del plasma seminal Para estudiar el efecto del FF sobre la actividad DNasa se utilizaron 20 muestras de FF y 12 de semen de paciente. Todas las muestras de FF fueron conservadas por criopreservación para su posterior procesamiento y evaluación en la Universidad Autónoma de Madrid. Parte de los FF aspirados se inactivaron mediante incubación a 56 °C durante 30 min y parte se utilizaron sin inactivar, según el experimento que fuéramos a realizar MATERIAL Y MÉTODOS 37 5. TÉCNICAS EMPLEADAS 5.1 Análisis de la fragmentación del ADN en CCs Para el análisis, las CCs se descongelaron mediante inmersión rápida de la pajuela que contenía las células en un baño de agua a 37°C durante 3 minutos. Posteriormente las células se centrifugaron a 400 g durante 10 minutos y se reconstituyeron con medio RPMI nuevo (RPMI Media 1640; Life Technologies; Carlsbad, CA, EE. UU.) en preparación para el análisis de fragmentación. El CCDFI en cada muestra se cuantificó utilizando una versión comercial de la serie de kits Halomax adaptada específicamente para su uso en CCs (D3-Max; Halotech DNA, SL Madrid, España). Todas las muestras se ajustaron a una concentración de 1 x 106 ml utilizando RPMI media 1640 (Life Technologies; Carlsbad, CA, EE. UU.) después de la centrifugación a 400g durante 10 min para concentrarlas, Se añadió un volumen de 25 µl de muestra diluida a un vial que contenía agarosa de bajo punto de fusión a 37ºC y se mezcló suavemente. Luego se extendieron 10 µl de la mezcla de células de agarosa sobre portaobjetos pretratados proporcionados en el kit y se cubrieron con un cubreobjetos de vidrio. Después de presionar suavemente el cubreobjetos, cada portaobjetos se colocó a 4ºC durante 5 minutos para producir un microgel. Una vez formado el microgel, se retiró el cubreobjetos y el portaobjetos se incubó en una bandeja en posición horizontalmente utilizando 10 ml de la solución de lisis proporcionada en el kit durante 5 minutos para lograr la extracción controlada de las proteínas. El microgel tratado que contenía CCs parcialmente desproteinizadas se lavó en dH2O durante 5 minutos y se deshidrató en una serie de baños de etanol (70%, 90% y 100%). El control negativo incluyó el protocolo estándar, pero evitó el uso de la solución de lisis. Para la visualización bajo microscopía de fluorescencia, los portaobjetos se montaron con partes iguales de SYBR Green (Sigma Aldrich, Madrid, España) y medio de montaje VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) para inhibir la perdida de fluorescencia tras la excitación. MATERIAL Y MÉTODOS 38 Se contaron un total de 300 CCs por muestra utilizando un microscopio de epifluorescencia Leica DMRB (Leica Microsystems, Barcelona, España) equipado con filtros de bloque de fluorescencia de banda única (FITC-2024B-000; Semrock, Rochester, NY, EE. UU.). Alternativamente, la visualización se puede realizar utilizando una microscopía de campo brillante estándar y tinción Diff-Quick (Sanilabo, Valencia, España). 5.2 Aislamiento de ARN, Transcripción inversa, y PCR en tiempo real El ARN de las CCs se extrajo utilizando el reactivo de aislamiento TriPure (Roche, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. A partir de 1 µg de ARN se sintetizó ADNc de cadena única, utilizando el Kit de Síntesis de ADNc de Primera Cadena Transcriptor (Roche, Mannheim, Alemania). La PCR en tiempo real se llevó a cabo en un LightCycler 480 (Roche) utilizando la Máster Mix de SYBR Green I LightCycler® 480 (Roche, Mannheim, Alemania). Las secuencias de los cebadores se detallan en la (Tabla 1). Tabla 1: Secuencias de los cebadores y condiciones de PCR en tiempo real utilizadas en este estudio Todas las reacciones de PCR incluyeron controles negativos en los que se omitió el ADNc. El nivel de expresión de cada gen se normalizó al de la actividad de la ß-actina y la expresión relativa del gen se calculó utilizando el método 2-ΔΔCt. Gene Sequence ng of cDNA/well Tº of annealing HAS2 Forward 5’-ACTTGTGGATGACCTACGAAGCGATTATCACT-3’ 120 65°C Reverse 5’-AAACATCTTGGCGGGAAGTAAACTCGAC-3’ CDC42 Forward 5’-GAAAGGCCTAAAGAATGTATTTGACGAAGC-3’ 120 58°C Reverse 5’-TGGGCCTTGTCTCACACGAGTGCAT-3’ CX43 Forward 5’-CAGCGACCTTCAAGCAGAGCCAGCAGTCGT-3’ 120 65°C Reverse 5’-TGTTGAGTACCACCTCCACCGGATCAAA-3’ GPX3 Forward 5’-TTACACACATGCCTACAGGTATGCGTGATT-3’ 120 58°C Reverse 5’-TGGAGAACTGGAGAGAAAGGGTTGTCACT-3’ B-ACTIN Forward 5’-GGCCGAGGACTTTGATTGCACATTGTT-3’ 120 58-65°C Reverse 5’-CCTTAGAGAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGA-3’ MATERIAL Y MÉTODOS 39 5.3 Fragmentación del ADN del espermatozoide El DFI se evaluó utilizando Dyn-Halosperm® (HalotechDNA, Madrid, España) según las especificaciones proporcionadas en el kit. Se obtuvieron los valores iniciales de DFI en cada momento de observación predefinido y se calculó la tasa de DFI (r- DFI), definida como el aumento de DFI por hora. El DFI se determinó analizando 300 espermatozoides por muestra, por tratamiento, en cada momento. Los eyaculados licuados de los 23 pacientes diferentes se dividieron en cuatro alícuotas iguales y se incubaron con diferentes composiciones del FF (semen neto, semen con Medio HTF (HTF-Media: Quinn's Advantage™ Medium con HEPES Sage, Dinamarca), semen con HTF al 20% de FF y semen con HTF al 50% de FF). Las diferentes combinaciones se incubaron durante 3h y 24h y se tomaron muestras para el análisis de la fragmentación del ADN espermático desde el inicio de la incubación (T0), a las 3h de incubación (T3) y a las 24 h de incubación (T24). Con estos valores, se calculó la tasa de fragmentación, se calculó la tasa de incremento de la fragmentación (r-DFI), definida como el aumento de DFI por unidad de tiempo (h). El DFI se determinó analizando 300 espermatozoides por muestra en cada tiempo elegido de incubación. 5.4 Capacidad prooxidante La capacidad prooxidante de los espermatozoides y FF se evaluó mediante un kit disponible comercialmente (Oxisperm®, HalotechDNA, Madrid, España). La prueba se basa en una reacción colorimétrica en presencia de NitroBlue Tetrazolium (NBT). El NBT es un compuesto que cambia de color cuando se reduce en presencia de ROS. Las sustancias con actividad prooxidante transfieren electrones al NBT generando una molécula insoluble (formazán) que tiene un color violeta, siendo la intensidad de color directamente proporcional a la concentración de ROS en el medio. La intensidad del color se evaluó mediante protocolos de análisis de imágenes (ImageJ; https://imagej.nih.gov). 5.5 Aislamiento de ADN genómico Tras la centrifugación de los eyaculados, se obtuvieron pellet de espermatozoides que se resuspendieron en 100 µl de solución salina tamponada con fosfato (NaCl 137 mM, KCl RESULTADOS 46 Figura 7: CCs tras realizar el test de dispersión de la cromatina. Tipos principales de CCs teñidos con fluorescencia (a) y con Diff Quick (b). Células que presentan un halo de tamaño similar o menor al diámetro del “core” de la célula (más oscuras), células con ADN dañado que presentan diámetros de halo mayores que su “core” (señalado en la figura con un triángulo) RESULTADOS 47 1.1.2 Distribución de la fragmentación de las CCs (CCDFI) En este experimento se usaron un total de 130 CCs procedentes de punciones de 25 pacientes. El resultado de los CCDFI de los diferentes grupos preestablecidos se muestra en la Figura 8. Para estudiar si existen diferencias en cuanto a la fragmentación observadas en los núcleos de las CCs, las muestras se separaron en 3 grupos: NIO (Non Injected Oocytes): Ovocitos inmaduros, UFO (Unferilized Oocytes): Ovocitos no fertilizados y FEO (Fertilized Oocytes): Ovocitos con fertilización normal tras ICSI. Se analizaron 6, 34 y 90 ovocitos respectivamente. Figura 8: Representación gráfica de caja y bigotes con respecto a la distribución de la fragmentación del ADN en las CCs en los distintos grupos. (a), representación gráfica de caja y bigotes con respecto a la distribución de la fragmentación del ADN en las CCs del grupo inmaduros (NIO) no fecundados (UFO) y fecundados (FEO) (b), representación gráfica de caja y bigotes con respecto a la distribución de la fragmentación del ADN en las CCs la evolución embrionaria: descartados por bloqueo embrionario o mala calidad (REJ) vs embriones seleccionados para transferencia embrionaria o criopreservación (EMB) (c) representación gráfica de caja y bigotes con respecto a la distribución de la fragmentación del ADN en las CCs según el grupo de calidad embrionaria Grado A, Grado B y Grado C RESULTADOS 48 Previamente a la realización del experimento, para determinar que los procedimientos de criopreservación y descongelación no tiene una influencia adversa sobre el posible daño que se pueda originar el ADN por esta causa, se realizó un análisis preliminar que comparó la fragmentación del ADN de las CCs recién recolectadas y congeladas y no se observaron diferencias significativas (n = 8; Z= −0,577; p=0,564). Los valores de CCDFI obtenidos al comparar todos los grupos (NIO, UFO y FEO) muestra que existen diferencias significativas entre los diferentes niveles de fragmentación obtenidos (Kruskal-Wallis; H = 28,4; p < 0,001). De igual forma, cuando se comparan los valores CCDFI obtenidos en cada grupo por pares, se obtienen diferencias significativas entre todos los grupos (NIO-UFO: Mann-Whitney U = 36; p = 0,012; NIO-FEO Mann- Whitney U = 11; p < 0,001; UFO-FEO Mann-Whitney U = 820, p < 0,001) (Figura 8a). 1.1.3 Desarrollo embrionario y CCDFI Con respecto al desarrollo embrionario, de los 90 ovocitos fertilizaron de forma normal (FEO), un total de 31 fueron rechazados (REJ), bien porque su división celular se detuvo o bien porque eran percibidos por el embriólogo como de mala calidad. Se seleccionaron 59 embriones para transferencia o criopreservación hasta día 3 o 5 (EMB). En análisis estadístico para comparar los niveles de fragmentación en los dos grupos (REJ versus EMB) muestra que existen diferencias significativas (Mann-Whitney U = −4,27; p<0,001). En la Figura 8b se muestra la fragmentación del ADN en las CCs en ambos grupos. 1.1.4 Calidad embrionaria y CCDFI Una vez que los embriones fueron clasificados y se determinó la calidad embrionaria después de 3 o 5 días de cultivo embrionario, se procedió al análisis de la correlación de la CCDFI con la calidad embrionaria. Los resultados de los niveles de fragmentación y la calidad embrionaria se muestran en la Figura 8c. Se calificaron un total de 49 embriones:15 embriones como grado A, 19 como grado B y 15 como grado C. La prueba de Kruskal-Wallis para comparar los resultados asociados a la CCDFI no muestra diferencias significativas entre los grupos (Kruskal-Wallis H = 2,19; p = 0,33). RESULTADOS 49 Con objeto de estimar la sensibilidad y la especificidad proporcionadas por la CCDFI, cuando esta se asocia a los grupos representados en la Figura 9 se utilizaron curvas ROC. Figura 9: Curvas ROC resultantes de la confrontación de los datos de fragmentación del ADN en las CCs frente al desarrollo de la calidad ovocitaria, fertilidad y calidad embrionaria. La curva ROC de la línea verde muestra la capacidad del CCDFI para predecir los valores de daño que se asocian a ovocitos fertilizados (FEO) y aquellos que no fueron fertilizados (UFO). La línea azul ROC muestra la capacidad del CCDFI para predecir embriones que fueron rechazados por el embriólogo (REJ) y aquellos que eran aptos para transferencia y/o criopreservación (FEO). La línea roja ROC muestra la capacidad del CCDFI para predecir embriones que alcanzan los 3-5 días de desarrollo. La primera curva ROC se obtiene utilizando los valores asociados al CCDFI de ovocitos no fecundados (UFO) frente aquellos que resultaron fertilizados (FEO). El área bajo la curva fue de 0.769 y que resulta estadísticamente significativa (p<0.001; 95% CI [0.68– 0.86]; SE=0.046). El valor de corte estimado del CCDFI resulto ser del 24% de fragmentación asociado a las CCs. Este valor discrimina en resultado de fertilización asociado al CCDFI con una sensibilidad del 75.6% y una especificidad del 65%, línea Verde Figura 9. RESULTADOS 50 La segunda curva ROC evalúa cómo el CCDFI predice la calidad del embrión, comparando embriones rechazados por el embriólogo (REJ) con aquellos elegidos para transferencia o criopreservación (EMB). El área bajo la curva fue de 0.775 que resulta estadísticamente significativa (p<0.001; 95% CI [0.68–0.87]; SE = 0.048) y con un valor de corte de CCDFI del 20.3% y que proporcionaba una sensibilidad del 71.2% y una especificidad del 61%, línea azul Figura 9. El tercer análisis comparó el CCDFI de los embriones que alcanzaron con éxito los 3-5 días de desarrollo (N = 59) con aquellos ovocitos que no alcanzaron este desarrollo (EMB vs REJ, UFO, NIO). El área bajo la curva fue de 0.808 (p<0.001; 95% CI [0.74–0.88]; SE = 0.037), con un valor de corte de CCDFI del 21% y que proporcionaba una sensibilidad del 74.6% y una especificidad del 64%, línea roja Figura 9. 1.2. Valoración del transcriptoma de las CCs como predictor de implantación En el estudio participaron 25 mujeres, alguna de ellas repitió ciclo de TRA. Se analizaron en total 38 transferencias. No obtuvieron embarazo 18 de ellas. En el grupo donde se registró embarazo con una tasa de implantación del 100% había 7 mujeres. No se observaron diferencias significativas en edad, ni en el índice de masa corporal entre mujeres embarazadas y no embarazadas. El número de embriones transferidos y la calidad de cada uno de ellos se muestra en la Tabla 2. RESULTADOS 51 Tabla 2: Datos de los participantes: Las transferencias se identificaron con un ID del 1-38 , se muestra el número de embriones transferidos en función de si hubo o no implantación y calidad embrionaria. Se transfirieron 55 embriones con 0% de implantación de 29 pacientes y 17 embriones de 7 pacientes con implantación 100%. Todos los cúmulos (CCs) de los embriones transferidos fueron estudiados para cuantificar la expresión génica de los genes seleccionados. La calidad embrionaria se refleja en la tabla según sean de máxima calidad (A), calidad buena (B), calidad intermedia (C), mala calidad (D). RESULTADOS 52 El análisis de la cuantificación de la expresión génica relativa a los genes HAS2, CDC42, CX43 y GPX3 en las CCs recuperadas de folículos del grupo de embarazadas (n = 17), mostró un nivel del gen GPX3 significativamente inferior que en el grupo de mujeres no embarazadas (n = 55; línea discontinua). Los datos representan la media SEM. * p < 0,001 respecto al grupo de no embarazadas. (Figura 10). Figura 10: Expresión de genes implicados en el desarrollo de ovocitos en CCs. Expresión relativa expresión relativa de HAS2, CDC42, CX43 y GPX3 en las CCs extraídas de los folículos del grupo gestante (n = 17) en comparación con el grupo no gestante (n = 55; línea discontinua) de folículos del grupo gestante (n = 17) en comparación con el grupo no gestante (n = 55; línea discontinua). Los datos representan la media SEM. * p < 0,001 en comparación con el grupo de no embarazadas. Como se muestra en la Figura 11A, la calidad de los embriones transferidos en el grupo de no embarazadas (implantación 0%) fue inferior al del grupo de embarazadas (100% de implantación): 60,4% de embriones de calidad A, 22, 6% de embriones calidad B, 7,6% de embriones calidad C y 9,4% de embriones calidad D frente a 88,2% embriones calidad A, y 11% de embriones calidad B en el grupo de embarazadas. Los embriones de grado A de mujeres no embarazadas mostraron una expresión significativamente mayor de GPX3 en comparación con los embriones de grado A del grupo de embarazo (Figura 11B). RESULTADOS 53 Figura 11: Clasificación de los embriones y expresión relativa del ARNm de GPX3 en CCs en embriones de grado A de calidad. Los datos representan el % de cada grado de calidad embrionaria alcanzado en ambos grupos para este estudio. (B) Expresión relativa del ARNm de GPX3 en CCs extraídas de folículos cuyo embrión alcanzó el grado A de calidad. Los datos representan la media de los valores calculados en comparación con las CCs extraídas de los folículos del grupo gestante (n = 17), con el método 2-ΔΔCt, y el error estándar de la media de cada grupo (n = 55). * p = 0,0115 en comparación con el grupo de no embarazadas. RESULTADOS 54 2. EXPERIMENTOS EN FF 2.1 Efecto del FF sobre la fragmentación del ADN espermático Para estudiar el efecto que ejerce el FF sobre la fragmentación del ADN espermático a lo largo del tiempo, los espermatozoides se incubaron en diferentes soluciones: 1) en plasma seminal neto (NEAT), 2) en medio de cultivo sintético (HTF), 3) en medio de cultivo sintético con 20% de FF (HTF20) y 4) en medio de cultivo sintético con 50% (HTF50). Se estudió el efecto del FF sobre la cinética de fragmentación del ADN del espermatozoide durante 24h (a los 30 min tras ser recogido, 3h y 24 h (Figura 12). Figura 12: Gráfico de caja y bigotes de la fragmentación del ADN del semen de 23 pacientes después de una incubación de 24 h para cuatro tratamientos experimentales. NEAT: muestra recién eyaculada después de 30 minutos de licuefacción; Espermatozoides HTF0 (incubados con medios HTF después de la eliminación del plasma seminal); Espermatozoides HTF20 (incubados con medio HTF después del semen eliminación de plasma con adición de 20% v/v de líquido folicular); Espermatozoides HTF50 (incubados con RESULTADOS 55 medio HTF después de la eliminación del plasma seminal suplementado con 50% de líquido folicular). Los puntos y los asteriscos etiquetan los casos atípicos representados en el programa SPSS El r-DFI (valores crecientes de DFI por unidad de tiempo -h-) después de 24 h de incubación para NEAT, HTF0, HTF20 y HTF50 fueron: 0,91, 0,69, 0,25 y 0,36 (unidades de DFI por h), respectivamente. Los porcentajes de DFI a lo largo del tiempo se compararon por pares utilizando el estadístico Log Rank Mantel-Cox. La comparación de supervivencia generado por las curvas de Kaplan-Meier a lo largo del periodo de incubación mostró diferencias significativas cuando las muestras de semen NEAT se compararon con FF0 (χ2 = 11,78; P = 0,001), cuando se comparó FF0 con FF20 (χ2 = 52,38; P = 0,000) y cuando se comparó FF0 con FF50 (χ2 = 34,85; P = 0,000). No hubo diferencias en r-DFI entre los espermatozoides diluidos en FF20 y FF50 (χ2 = 1,85; P = 0,173). 2.2 Capacidad prooxidante en plasma seminal y FF La capacidad prooxidante del plasma seminal se examinó en una submuestra de 10 de los 23 varones mediante el ensayo NBT. El resultado muestra una gran variación en la respuesta colorimétrica que se deriva de cada reacción (Figura 13a) y Figura 13c); media: 94,6 unidades de color; SD: 65,4). Se aplicó el mismo procedimiento a 10 muestras de líquido folicular. La respuesta colorimétrica media mostró un valor estadísticamente menor que el observado en los varones (Mann-Whitney 1,5; p = 0,000) y sobre todo, presentó con una distribución más homogénea en la respuesta colorimétrica (Figura 13b), c; media: 29,9 unidades de color; SD: 6,3). En la Figura 12c se observa los gráficos de colores. RESULTADOS 62 c) Incubación de ADN genómico con FF no inactivado (F + Ca2++ y F + Mg2+) lo digerido con proteinasa K (PK) (F + PK + Ca2+ y F + PK + Mg2+) con concentraciones crecientes (1 mM, 5 mM y 10 mM) de CaCl2 y MgCl2. Tenga en cuenta que en muestras digeridas con proteinasa K, la actividad DNasa de FF queda abolida independientemente de la concentración de ambos cationes. C ADN genómico incubado con d dH2O; F, ADN genómico incubado con FF no digerido; F+PK, ADN genómico incubado con FF digerido con proteinasa K d) ADN genómico incubado con FF más 10 mM de CaCl2 y concentraciones crecientes (1, 5 y 10 mM) de EDTA (F + Ca2+ EDTA) o 10 mM de MgCl2 y concentraciones crecientes (1, 5 y 10 mM) de EDTA (F+ Mg2+ +EDTA). C, ADN genómico incubado con d dH2O; F, ADN genómico incubado conFF. F + Ca2+, ADN genómico incubado con FF más 10 mM de CaCl2. F + Mg2+, ADN genómico incubado con FF más 10mM de MgCl2. Los valores de densidad integrados de las bandas de ADN genómico en cada panel se muestran debajo del carril correspondiente. Esta figura muestra sólo un experimento representativo. La adición de Ca2+ y Mg2+ al FF reveló que este fluido también poseía DNasa, cuya actividad dependía de la concentración de estos cationes divalentes. El aumento de la concentración de cationes divalentes correspondió a un aumento en la degradación del ADN genómico (Figura 19b) Para demostrar que la actividad DNasa dependiente de cationes de FF estaba asociada a proteínas y no a otro tipo de factor, se digirió FF con proteinasa K y se demostró que este tratamiento abolió la actividad DNasa inducida por Ca2+ y Mg2+, independientemente de la concentración de ambos cationes (experimento representativo en la Figura 19c). Finalmente, se verificó si la adición del quelante EDTA revirtió el efecto del Ca2+ y Mg2+ sobre la actividad DNasa del FF. Como se puede ver en la Figura 19d, el EDTA indujo la inhibición de la actividad DNasa FF, confirmando que esta actividad. DISCUSIÓN 63 DISCUSIÓN DISCUSIÓN 64 Como ya se comentó anteriormente, los ovocitos se obtienen siempre a través de una punción eco-guiada vía vaginal mediante la aspiración del líquido de la cavidad antral del folículo, donde se encuentra el ovocito. El FF envuelve a los ovocitos cuando estos se transfieren al laboratorio para su aislamiento. Los ovocitos recuperados tras la punción folicular están rodeados de células de la granulosa. Cada ovocito está envuelto en varias capas de células formando un cúmulo. Conseguir un consenso para predecir la competencia embrionaria durante la transferencia uterina durante los ciclos ICSI-FIV es uno de los principales desafíos en la investigación en el campo de la reproducción. El desarrollo embrionario está determinado por la fisiología del ovocito que, a su vez, está fuertemente determinada por el metabolismo del CCs. Los componentes del FF ayudan principalmente en el crecimiento y maduración de ovocitos y células foliculares además de protegerlas de daño físico y estrés oxidativo (78), y sirve como medio de comunicación entre el ovocito y las células foliculares, necesario para la adquisición de competencias de desarrollo y fertilización por parte del ovocito (78). Los procesos de reproducción asistida suponen el manejo ex vivo de los gametos. Esto implica la generación de un daño iatrogénico que es ineludible y de difícil evaluación. Esta circunstancia supone el riesgo en la interpretación de los resultados obtenidos y en el presente estudio se ha minimizado con el procesado instantáneo del material que se obtiene para estudio. Tanto el FF como las CCs suponen una gran fuente para el cribado no invasivo de biomarcadores para la maduración de ovocitos, éxito de la fertilización, resultados de FIV, embarazo y trastornos ováricos y ofrece resultados muy próximos a la realidad fisiológica que estos tienen en el momento de la extracción. En este apartado se quiere enmarcar los aspectos principales que han sido objeto de estudio en el presente trabajo. Los estudios realizados se han agrupado en dos bloques: Estudios asociados a las CCs y Estudios asociados a los FF. DISCUSIÓN 65 1. ESTUDIOS EN LAS CCs 1.1 Análisis de los niveles de fragmentación del ADN en las CCs La determinación de la calidad de los ovocitos es crucial para lograr una singamia eficaz después de la inyección del espermatozoide y el desarrollo embrionario. Las CCs son responsable de aislar al ovocito de las condiciones perjudiciales que le rodean, y desempeñan un papel importante en todos los acontecimientos de transformación fisiológica que sufre el ovocito. Como ya se ha comentado, las CCs en la práctica clínica diaria son desechadas. Por ello y por la estrecha relación que tienen con el ovocito (121), son candidatos de elección para su estudio desde un punto de vista tanto funcional como estructural, ya que pueden ser indicadores indirectos del estado fisiológico del ovocito (122). De esta forma, por ejemplo, el daño en el ADN es un hecho muy común al que todas las células están expuestas en múltiples procesos durante su vida útil (100). Por tanto, el daño que presenten estas CCs puede inducir a una reducción de las tasas de fertilización y la posibilidad de embarazo dado que se genera una pérdida de funcionalidad en la relación esperada entre las CCs y el ovocito (59). Si el daño en el ADN de las CCs es superior a la capacidad de reparación las células afectadas éstas son eliminadas por apoptosis (102), lo que supone una merma de la funcionalidad total esperada. De hecho, el aumento de la apoptosis de las células de la granulosa acompaña a una menor consecución del embarazo mediante FIV (103,104). El análisis de la fragmentación del ADN de las CCs (CCDFI) se desarrolló con objeto de evaluar el impacto en la competencia del ovocito con respecto a la fertilización y el desarrollo embrionario. De esta forma, se encontraron diferencias significativas en los niveles de fragmentación del ADN de ovocitos no fertilizados y fertilizados. Los resultados de este estudio sugieren que los ovocitos asociados a CCs, que muestran un alto nivel de daño en el ADN, tienen tendencia a ser atrésicos o corresponden a ovocitos con fallo de fertilización después de ICSI. DISCUSIÓN 66 Es importante señalar que una vez que las células se descongelan, deben procesarse rápidamente (en aproximadamente en 1h) para visualizar la calidad del ADN; de lo contrario, las células y la molécula de ADN pueden deteriorarse. Si bien en este estudio se criopreservaron los CCs con fines logísticos, desde una perspectiva clínica, es recomendable que el ensayo utilice directamente CCs recién recolectadas de cada uno de los pacientes. En este experimento se determinó que un valor umbral DFI del 24% fue capaz de discriminar la capacidad del ovocito de ser fecundado con una sensibilidad del 75,6% y una especificidad del 65%. Estas diferencias se encontraron también entre el CCDFI de los embriones que se descartaron y aquellos que se desarrollaron y se consideraron aptos para transferencia o se aquellos que dirigieron a criopreservación. Desde este punto de vista, los niveles de fragmentación de las CCs se pueden utilizar como una herramienta que justifica la selección de un embrión para ser transferido y el descarte de los otros. Se encontraron diferencias significativas en el nivel de calidad del ADN de las CCs de diferentes ovocitos individuales, que pueden ser informativos sobre los resultados de la fertilización y calidad embrionaria observada en las primeras etapas de desarrollo. En algunos modelos animales tales como el ganado porcino, la apoptosis se ha asociado con la tasa de atresia folicular observada en el ovario (143). Situación que se repite en el caso del ganado bovino (144) y en roedores (145). La capacidad del ovocito para madurar y fertilizar también se ha correlacionado con el estado apoptótico de las células del cúmulo (146). Recientemente, Emanuelli et al. (147) han demostrado que los ovocitos procedentes de vacas y que presentan mayor calidad en su nivel de desarrollo embrionario, muestran niveles más bajos de fragmentación del ADN en las CCs que en los óvulos asociados a CCs de menor calidad. Estos mismos autores también describen una correlación negativa entre la fragmentación nuclear de los CCs y el desarrollo in vitro de embriones de ganado. Conceptualmente, los pronúcleos masculino y femenino tienen dos funciones u obligaciones que pueden verse afectados negativamente por la presencia de una molécula de ADN dañada. Estas funcionalidades se pueden dividir en aquellas que ocurren antes de la singamia y que pueden denominarse "deber haploide" y aquellas que continúan después DISCUSIÓN 67 de la singamia, denominadas "deber diploide". Integrada con estas responsabilidades individuales de los gametos, la situación se complica aún más durante la singamia, ya que ahora está bien descrito que el ovocito, bajo ciertas circunstancias, tiene la capacidad de reparar el ADN del espermatozoide que penetra en el ovulo (148). Por lo tanto, una falta de una maduración normal del ovocito también podría comprometer los mecanismos de reparación del ADN del espermatozoide. Con respecto a las funciones haploides del ovocito, las vías de acetilación de las histonas H3/H4 son clave para lograr un núcleo listo para la singamia (149) y de forma antagónica, se ha comprobado que el desequilibrio en el oolema, previene la fusión de gametos (150). La composición de la matriz de COC es crítica para la fertilización. Los modelos de ratones mutantes con ablación de cada una de las proteínas de la matriz del cúmulo muestran deficiencias en la capacidad de ser fertilizados, debido a cambios en la rigidez de la matriz, interacciones proteicas específicas entre el COC y el espermatozoide, así como una posible reducción en la competencia de los ovocitos (151). Es necesario reconocer que otros factores pueden estar afectando a la singamia. Entre ellos, es de resaltar la contribución del gameto masculino. En la concepción natural, una vez que el espermatozoide se une a la zona pelúcida y penetra en el espacio de la línea perivitelina del ovocito, toda una cascada de cambios moleculares permite que el oolema absorba el núcleo del espermatozoide en el ooplasma, lo que lleva a la formación del pronúcleo masculino, descondensación del ADN de este gameto y que culmina finalmente en la singamia. La unión del espermatozoide al oolema desencadena un flujo de Ca2+ intracelular dentro del ooplasma (152) que comienza en el sitio de penetración del espermatozoide y penetra a través de todo el ovocito (153). Dado que este estudio utilizó ICSI como forma de fertilización, es difícil evaluar cómo el entorno del ovocito, en ausencia de este estímulo biológico, puede influir en el resultado de la singamia, pero existen otras funciones haploides de los espermatozoides necesarias para la consecución de la singamia. Por ejemplo, la fusión de gametos depende en gran medida de la etapa de maduración del espermatozoide inyectado. Kimura y Yanagimachi (154) han demostrado que, si bien, las espermátidas alargadas han adquirido la capacidad de activar óvulos, las espermátidas redondas no pueden inducir la activación. DISCUSIÓN 68 Algunos de estos escenarios pueden ayudar a explicar un paro en el proceso de singamia, lo cual no fue insignificante en nuestro experimento, ya que el 27,4% de los ovocitos no lograron ser fertilizados después de la inyección de esperma. En este contexto, es interesante recordar la sugerencia de Albertini (155): “La singamia se ha convertido en un centinela aceptable para el comienzo de la vida”. Claramente, existe la necesidad de obtener un mejor conocimiento de las funciones haploides tanto del ovocito como del espermatozoide para comprender mejor el fracaso de la singamia. Una vez obtenida la singamia, el ovocito se ocupa de cumplir otra función a la que se pueda referir como su “deber diploide”; esto implica el control del nuevo cigoto pluripotente para dividirse y generarse en blastómeros indiferenciados hasta que se produzca la especialización celular. Esto implica una serie de modificaciones epigenéticas del genoma, incluida una serie de patrones híbridos o asimétricos de metilación de histonas cuando se comparan los genomas paternos y maternos. Por ejemplo, mientras que la H3 está metilada en el genoma materno, no está metilada en el genoma paterno, y este patrón se mantiene durante el desarrollo embrionario temprano (156). Durante esta fase de desarrollo, cualquier desregulación de las enzimas necesarias para realizar estos procesos, en combinación con deficiencias asociadas con la entrega de nutrientes y hormonas de las células del cúmulo, pueden manifestarse en la detención del desarrollo embrionario. Con respeto a la información relevante a los deberes diploides (desarrollo embrionario) del ovocito, en nuestro estudio se diferenciaron 2 grupos: embriones descartados después de 1 día de incubación y embriones que se desarrollaron con éxito hasta el estadio (3 a 5 días) apto para transferencia y/o criopreservación. Se demostró que los ovocitos que alcanzan una etapa más avanzada en desarrollo embrionario presentaban un nivel más bajo de CCDFI. De hecho, el 34,5% de los ovocitos fecundados no lograron llegar al día 3 de desarrollo. Las clínicas de fertilidad intentan extender el cultivo de embriones hasta la etapa de blastocisto (157). Extender el cultivo de día 3 a día 5 permite al embriólogo tener una mejor evaluación de la selección de embriones (157). Los ovocitos que han podido desarrollarse in vitro hasta el día 5, por lo tanto, se consideran que son de mayor calidad, tienen más probabilidades de dar lugar a un embarazo, y en consecuencia tienen un valor CCDFI bajo. Los resultados de nuestro estudio apoyarían esta hipótesis porque DISCUSIÓN 69 los valores más alto del CCDFI fueron los asociados con los embriones descartados, y los valores de CCDFI más bajos fueron los que se desarrollaron hasta embriones d3 y d5. Bosco et al. (158) y Ruvolo et al. (159) utilizaron el ensayo TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling) para evaluar la fragmentación del ADN y llegaron a una conclusión similar. Los resultados de la curva ROC (Figura 9 línea azul) para diferenciar entre ovocitos cuyos embriones no se desarrollan normalmente (rechazados por embriólogo en el día 1) y aquellos que se desarrollan hasta día 3-5 reveló que CCDFI podría usarse para predecir el destino de cada ovocito; además, el límite para CCDFI se estableció en 21%; este valor de corte está de acuerdo con otros estudios de la fragmentación del ADN de CCs (158– 160). Los resultados de nuestra investigación sugieren que un valor umbral CCDFI del 24%, es posible discriminar la capacidad del ovocito para ser fertilizado o no, con una sensibilidad y especificidad del 75,6% de 65%. Esta información tiene importancia tanto para el clínico como para embriólogo, ya que se podría reducir potencialmente la necesidad de inyecciones innecesarias de esperma y, por lo tanto, permitir una mayor eficacia en el procedimiento ICSI si los ovocitos de mejor calidad se pueden seleccionar de antemano. En este estudio, también demostró que CCDFI se puede utilizar como predictor o marcador de referencia a la hora de ampliar el desarrollo in vitro de embriones a lo largo del tiempo. Nuestros resultados muestran que un CCDFI que no supera el 21%, se identifican como ovocitos que en la clínica de fertilidad normalmente clasificaría como de buena calidad y lograron alcanzar la etapa máxima. de desarrollo (3 o 5 días). De esta manera, este 21% de DFI podría establecerse como el límite máximo para identificar un ovocito de buena calidad. Esto aumentaría la eficiencia de la implantación y, por tanto, la tasa de reproducción en TRA. De particular interés fue el hecho de que el CCDFI no fue un buen predictor de la calidad del grado embrionario después de 3 a 5 días de incubación, ya que no hubo diferencias significativas en el CCDFI entre los embriones de grado A, B y C. Esta observación resalta la cuestión de que los criterios morfológicos para la mejor identificación de ovocitos DISCUSIÓN 70 pueden ser controvertidos debido a su bajo valor predictivo con respecto a la supervivencia del embrión y el resultado del embarazo (161). Aunque el CCDFI en este estudio no fue útil para predecir el grado morfológico de los embriones, se debe tener en cuenta que algunos estudios han demostrado que los embriones con buena morfología aún pueden mostrar aneuploidías (162). Finalmente, con respecto al CCDFI, se quiere resaltar que si bien, la evaluación de Los CCs agrupados pueden proporcionar información sobre la situación general de la capacidad de la mujer para producir ovocitos de cierta calidad (163), el análisis de ovocitos individuales cuando se preparan para realizar la ICSI proporciona información sobre la calidad de cada ovocito en concreto. Puede ocurrir que exista una gran variación en CCDFI cuando se obtienen ovocitos del mismo ovario. Este aspecto tiene que ser investigado en mayor profundidad, dado que probablemente una misma estimulación no solo puede aflorar tasas diferentes de fragmentación en el ADN de las CCs, también podrían existir diferencias entre el estado de maduración de distintos ovocitos. Aunque nuestros resultados son preliminares y requieren una mayor validación utilizando un tamaño de muestra más grande, había una relación clara entre CCDFI y desarrollo de ovocitos/embriones. Se podría por tanto afirmar que se puede utilizar un umbral de CCDFI inferior al 24% para discriminar ovocitos comprometidos de un buen ovocito con los niveles de sensibilidad y especificidad anteriores determinado. Asimismo, la capacidad de predecir mejor el éxito del TRA basado en la selección informada de ovocitos, permitiría inyectar tan solo el número de ovocitos que fuera necesario. Adicionalmente, en los protocolos ICSI proporcionarían un criterio adicional para seleccionar el mejor embrión para transferir. Otra área de posible aplicación sería utilizar la prueba para ayudar a clasificar ovocitos para bancos de ovocitos y congelar tan solo aquellos ovocitos que se identifican como eficientes. DISCUSIÓN 71 1.2 Perfil transcriptómico de las CCs El incremento de estudios para la evaluación del transcriptoma de CCs ha demostrado el potencial que pueden tener para predecir la competencia embrionaria (60,61). Al igual que ocurre con estudio de los niveles de fragmentación en el ADN de las CCs, la caracterización del perfil transcriptómico es también un procedimiento no invasivo. La evaluación convencional de la morfología embrionaria es el procedimiento no invasivo más común utilizado y que se utiliza en la clínica diaria como un predictor de implantación (164). En este marco, el poder entender los escenarios del transcriptoma de las CCs y su relación con los procesos de maduración de los ovocitos podría ofrecer una herramienta de pronóstico adicional además del análisis morfocinético, en el rango de unas pocas (2 a 3) horas. En nuestra aproximación experimental, se estudiaron proteínas cuya expresión en alta concentración estaba relacionada con buen pronóstico (alta tasa de implantación), y proteínas cuya alta concentración se asociaba a fracaso (baja tasa de implantación). Entre los marcadores genéticos analizados en este estudio, sólo GPX3 mostró una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión entre los grupos de no embarazadas y embarazadas. Según nuestros resultados, el desarrollo del embarazo se ha relacionado negativamente con la sobreproducción de ARNm GPX3, La sobreexpresión de GPX3 se ha asociado con la producción de ROS en CCs, ovocitos y líquido folicular (69). Nuestro estudio muestra una importante regulación a la baja de la expresión del gen GPX3 en CCs aisladas de ovocitos en mujeres embarazadas en comparación con CCs de mujeres no embarazadas que se sometieron a reproducción asistida (Figura 11b). Este resultado es plenamente coincidente con los trabajos realizados por Huang et al. (165). Cabe señalar que nuestros resultados también muestran la sobreexpresión del ARNm de GPX3 en CCs del grupo sin embarazo en comparación con el grupo que generó embarazo, incluso cuando solo se estudiaron CCs de embriones de morfología A. El aumento de la actividad de genes relacionados con el estrés oxidativo en las células del cúmulo humano, se ha asociado con una reducción de la fertilización de ovocitos mediante ICSI (68). Por tanto, el análisis de los niveles de ARNm de GPX3 en CCs añade valor a la clasificación morfológica de embriones para predecir las posibilidades de éxito del embarazo. DISCUSIÓN 78 los necesarios para el funcionamiento de la DNasa en el plasma seminal. En nuestra opinión, ambas explicaciones alternativas parecen improbables. Primero, los niveles de Ca2+ y Mg2+ en FF son similares a los del plasma sanguíneo (197) en el que la DNasa está completamente activa (198). En segundo lugar, la dilución del plasma seminal en dH2O a los mismos niveles que los de las muestras en las que se agrega FF a la mezcla de reacción no resultó en la pérdida de la actividad DNasa. Las DNasas son proteínas secretoras que están presentes en muchos fluidos biológicos, incluido el plasma sanguíneo (198), que es una de las fuentes principales en la formación de FF. Además, la DNasa I, que es la DNasa más abundante en la sangre, tiene un peso molecular de 38 kDa y un punto isoeléctrico de 3,9 (199). De acuerdo con estas características fisicoquímicas, la DNasa I podría cruzar libremente la barrera hematofolicular (200). Por lo tanto, aunque no se detectó actividad de DNasa en FF sin tratar, estos datos y nuestros resultados sobre la existencia de un quelante en FF, nos llevaron a investigar si podría haber actividad de DNasa en FF que no fuera detectable porque estaba inhibida por agentes quelantes. Nuevamente, la adición de concentraciones crecientes de Ca2+ y Mg2+ a la mezcla de reacción reveló la existencia de actividad DNasa en FF que no se había descrito previamente (Figura 19b). Además, esta actividad DNasa se asoció con una proteína o proteínas, ya que la digestión previa de FF con proteinasa K abolió la actividad independientemente de la adición de cationes divalentes a la mezcla de reacción. La actividad de la DNasa del plasma seminal está altamente conservada en vertebrados, ya que se ha encontrado en peces, aves y una variedad de mamíferos (201–204); esto sugiere que la molécula tiene una función fisiológica importante. Un posible papel podría estar relacionado con la presencia de neutrófilos en el tracto reproductivo femenino y la respuesta inflamatoria que ocurre después de la inseminación, cuya función principal es eliminar el exceso de espermatozoides y contaminantes microbianos (205). En situaciones de inflamación los neutrofilos secretan al medio las denominadas “Neutrophil extracellular Traps” (NET) y se ha demostrado que los espermatozoides pueden quedar atrapados por estas NETs lo que provoca una reducción en la motilidad y, por lo tanto, en la fertilidad (206). La actividad DNasa del plasma seminal podría degradar este ADN DISCUSIÓN 79 liberado por los neutrófilos y facilitar así el acceso de los espermatozoides (transporte y fertilización) al ovocito. Independientemente de las funciones beneficiosas de las DNasas en el plasma seminal, estas actividades DNasa también pueden ser perjudiciales en la fertilización, produciendo la fragmentación del ADN del óvulo fertilizado. En este contexto, una de las funciones fisiológicas del FF sería la de proteger al ADN tanto del ovulo como de los espermatozoides de los efectos adversos de las DNasas en el momento de la fecundación. Sin embargo, la relevancia clínica de este hallazgo requiere más investigación. Desde un punto de vista clínico, sería interesante analizar las posibles diferencias en la actividad DNasa de los espermatozoides y del correspondiente potencial inhibidor de DNasa del FF en diferentes pacientes para examinar si existe relación con problemas de fertilidad. También sería interesante estudiar el efecto inhibitorio del FF sobre la actividad DNasa en mujeres de edad superior a los 35 años, con objeto de valorar si se mantiene, o se reduce a medida que se genera una pérdida de fertilidad. CONCLUSIONES 80 CONCLUSIONES CONCLUSIONES 81 De acuerdo con los resultados presentados, se puede derivar las siguientes conclusiones: 1. Los niveles de daño asociados al ADN de las CCs se puede considerar un marcador no invasivo que ayudaría a clasificar a los distintos ovocitos de acuerdo con su nivel de fragmentación, Esto permitiría establecer un “ranking” de calidad ovocitaria que sería útil en el momento de la elección del embrión con mayor potencial de implantación 2. La sobreexpresión de GPX3 en las CCs podría ser un indicador de mal pronóstico de implantación, discriminando más allá de la calidad morfológica. De esta forma, se establecería una discriminación molecular que podría ser complementaria a la clasificación morfológica tradicional de estos embriones. 3.El bajo nivel de capacidad prooxidante asociado al FF podría mitigar los efectos adversos de moléculas con capacidad oxidativa del plasma seminal mediante la adición de FF a los medios de preparación/almacenamiento de espermatozoides. 4. Los eyaculados procedentes de diferentes individuos poseen una actividad de DNasa diferente y asociada a su plasma seminal. 5. La eliminación del plasma seminal después de la eyaculación-licuefacción de las muestras seminales en aquellos pacientes o donantes que se utilicen en reproducción asistida puede ser beneficioso dado el efecto negativo que pueden ejercer las DNasas presentes en el eyaculado. 6. Se ha observado un claro beneficio de los FF sobre la mejora de la longevidad de su ADN. Se recomienda, cuando ello sea posible, suplementar el medio de cultivo comercial con FF para aliviar el impacto negativo del daño iatrogénico 7. Se ha demostrado una posible “capacidad de bloqueo" del FF con respecto a la actividad de la DNasa presente en el plasma seminal. Hecho que debería incrementaría la longevidad del ADN del espermatozoide. El FF parece contener una molécula/s o elementos con capacidad quelante y que tienen la capacidad de inhibir la actividad DNasa del FF y del plasma seminal. Se necesitan estudios para identificar las moléculas responsables de esta inhibición, así como comprobar si el FF es capaz de prevenir la producción de roturas en el ADN. CONCLUSIONES 82 8. El uso de FF puede mejorar el éxito de la fertilización y es potencialmente útil en UI, FIV o en ICSI. Sin embargo, hasta que se puedan identificar las moléculas específicas responsables de este comportamiento del ADN del espermatozoide, la aplicación clínica de FF como adyuvante de los diluyentes de semen estándar para atenuar la fragmentación del ADN del esperma, se limitaría a parejas que den su consentimiento. BIBLIOGRAFÍA 83 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 84 1. Collins J, Crosignani PG, Group ECW. Fertility and ageing. Hum Reprod Updat. 2005;11(3):261–76. doi: 10.1093/humupd/dmi006. 2. Broekmans FJ, Knauff EAH, te Velde ER, Macklon NS, Fauser BC. Female reproductive ageing: current knowledge and future trends. Trends Endocrinol Metab. 2007;18(2):58–65. doi: 10.1016/j.tem.2007.01.004 3. Balestena Sánchez JM, Pereda Serrano Y, Milán Soler JR. La edad materna avanzada como elemento favorecedor de complicaciones obstétricas y del nacimiento. Rev Ciencias Médicas Pinar del Río. 2015;19(5):789–802. 4. Bosquet EG, Bosquet JG. González-Merlo. Ginecología. 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