Estudio de prevalencia, incidencia, supervivencia y factores de riesgo asociados al Esófago de Barrett y adenocarcinoma esofágico. Utilidad de los biomarcadores TWIST, p504s y CD133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett

/UNIVERSIDAD DE SEVILLA 1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA /UNIVERSIDAD DE SEVILLA 2 FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MEDICINA ESTUDIO DE PREVALENCIA, INCIDENCIA, SUPERVIVENCIA Y FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS AL ESÓFAGO DE BARRETT Y ADENOCARCINOMA ESOFÁGICO. UTILIDAD DE LOS BIOMARCADORES TWIST, P504S Y CD133 EN LA VALORACIÓN DE LA PROGRESIÓN DEL ESÓFAGO DE BARRETT. Tesis doctoral presentada por QUETZALIHUITL ARROYO MARTÍNEZ Para optar al grado de Doctor 2016 /UNIVERSIDAD DE SEVILLA 3 D. MANUEL RODRÍGUEZ TÉLLEZ, profesor asociado de Medicina de la Universidad de Sevilla y Facultativo Especialista de Área de la Unidad de Gestión Clínica de Aparato Digestivo del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla y D. ANTONIO AZNAR MARTIN, profesor titular del Departamento de Medicina de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla. CERTIFICAN QUE: D. QUETZALIHUITL ARROYO MARTÍNEZ, Licenciado en Medicina, ha realizado bajo su conjunta dirección y en la Unidad de Gestión Clínica de Aparato Digestivo del Hospital Universitario Virgen Macarena y Área el trabajo titulado <<Estudio de prevalencia, incidencia, supervivencia y factores de riesgo asociados al Esófago de Barrett. Utilidad de los biomarcadores TWIST, p504s y CD 133 en la valoración del la progresión del Esófago de Barrett>> reuniendo el mismo las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor. Sevilla a 13 de enero del 2016 Vº Bº de los Directores El Doctorando D. Manuel Rodríguez Téllez D. Quetzalihuitl Arroyo Martínez D. Antonio Aznar Martín /UNIVERSIDAD DE SEVILLA 4 D. JOSÉ VILLAR ORTIZ, profesor del Departamento de Medicina de la Facultad de Medicina y Tutor del Programa de Doctorado en Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Sevilla. CERTIFICA QUE: El trabajo titulado <<Estudio de prevalencia, incidencia, supervivencia y factores de riesgo asociados al Esófago de Barrett. Utilidad de los biomarcadores TWIST, p504s y CD 133 en la valoración del la progresión del Esófago de Barrett>>, presentado por D. QUETZALIHUITL ARROYO MARTÍNEZ, para optar al grado de Doctor, ha sido realizado bajo la conjunta dirección de D. MANUEL RODRÍGUEZ TÉLLEZ y D. ANTONIO AZNAR MARTIN en la Unidad de Gestión Clínica de Aparato Digestivo del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla y Área. Sevilla a 13 de enero del 2016 Tutor del Programa de Doctorado Fdo.: D. José Villar Ortiz /UNIVERSIDAD DE SEVILLA 5 Una vez vivían en la antigua ciudad de Afkar dos hombres cultos que odiaban y despreciaban cada uno el conocimiento del otro. Ya que uno negaba la existencia de los diosesy el otro era creyente. Un día los dos se encontraban en el mercado, y con sus seguidores, empezaron a disputar y a discutir sobre la existencia o la no existencia de los dioses. Y después de horas decontroversia, se marcharon. Esa noche, el ateo fue al templo y se ponstró ante el altar y rezó a los dioses por el perdón de su pasado caprichoso. Y a la misma hora, el hombre culto, que creía en los dioses, quemó sus libros sagrados. Ya que se había convertido en ateo. El loco Gibram Jalil Gibram /UNIVERSIDAD DE SEVILLA 6 AGRADECIMIENTOS El presente trabajo es el resultado de una ardua labor en la que han participado una gran cantidad de personas, todas ellas dedicando su tiempo y atención de una forma por demás excepcional y desinteresada. Antes que nada agradecer a dos personas que, aunque ya disfrutando de esa justa jubilación, lograron sentar las bases de la endoscopia en España en general y en Sevilla en particular, el Dr. Francisco Pellicer Bautista y el Dr. Manuel Gómez Parra, éste último, dedicando horas extra a la confección de una base de datos que, hasta la fecha, sigue siendo el pilar de muchos estudios científicos. A los Dres. Paul Desmond y Andrew Taylor, del St. Vincent Hospital en Melboune, Australia, por darme la oportunidad de tener una visión más amplia de las enfermedades esofágicas y dar pie a esas dudas que el presente trabajo intenta contestar. A los Dres. Antonio García Escudero y Javier Brugal Medina, por su excepcional ayuda y quienes, aún a costa de su tiempo libre, han logrado y no sin salvar grandes obstáculos, recuperar, procesar y analizar unas ingentes cantidades de información, consiguiendo no sólo ampliar el conocimiento en el esófago de Barrett sino, además, generando líneas de investigación que puedan resultar en un futuro mejor entendimiento de esta patología. A todos esos patólogos, técnicos, enfermeras, auxiliares y demás personal por su ayuda directa e indirecta, en la realización de éste trabajo. A la UGC Intercentros de Aparato Digestivo del HU Virgen Macarena, por darme todas las herramientas, tanto humanas como financieras, para la consecución de éste estudio. A la UGC Intercentros de Cirugía del Hospital Virgen del Rocío, mi nueva casa, y muy en especial al Prof. Javier Padillo Ruiz, por ser un continuo estímulo a la superación profesional y académica. También a la Dra. Carmen Bernal, por su tenacidad e insistencia en transmitirnos la importancia del trabajo académico como parte integral de la formación de cualquier profesional de la salud. A mi familia que, aunque lejos en la distancia, me han apoyado incondicionalmente en cada una de las decisiones importantes de mi vida. A mi pareja, Shaila, por no sucumbir a los deseos de medicarme con todos esos potingues que los psiquiatras tienen como herramientas de trabajo, al verme agobiado intentando no sucumbir ante tantos frentes abiertos. Dejo para el final mi más grande agradecimiento para esa persona que creyó en mí por sobre todas las cosas, incluso, en ocasiones, con más fe en mí y en mi trabajo que yo mismo; por motivarme a librar obstáculos, a tener paciencia y tenacidad, a no dejar trabajos inconclusos, por transmitirme que, cuanto mayor es la dificultad, mayor gloria hay en superarla, a ti Manolo, mi más profundo agradecimiento. ÍNDICE. 7 ÍNDICE. ÍNDICE. 8 ÍNDICE ABREVIATURAS .............................................................................................................................. 11 1. RESUMEN ................................................................................................................................... 14 1.1 Estudio de prevalencia, incidencia, supervivencia y factores de riesgo asociados al Esófago de Barrett. ................................................................................................................. 14 1.2 Uso de los biomarcadores TWIST, p504s y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett. ........................................................................................... 20 2. INTRODUCCIÓN.......................................................................................................................... 25 2.1 Antecedentes históricos sobre el Esófago de Barrett. .................................................. 26 2.2 Incidencia del Esófago de Barrett y del Adenocarcinoma Esofágico. ............................ 34 2.3 Factores de riesgo en el desarrollo del Adenocarcinoma esofágico sobre Esófago de Barrett. ....................................................................................................................................... 37 2.3.1 Factores innatos. .................................................................................................... 37 2.3.2 Factores Gastrointestinales. .................................................................................. 39 2.3.3 Otros factores de riesgo modificables. .................................................................. 50 2.4 Aspectos histopatológicos del Esófago de Barrett. ....................................................... 56 2.4.1 Negativo para Displasia.......................................................................................... 56 2.4.2 Positivo para displasia, de bajo y alto grado. ........................................................ 58 2.4.3 Problemas actuales en la interpretación de las lesiones en el EB. ........................ 65 2.4.4 Inmunohistoquímica en el Esófago de Barrett. ..................................................... 75 2.4.4.2 Papel de la Inmunohistoquímica en el Esófago de Barrett. ................................. 103 2.5 Screening y vigilancia endoscópica del Esófago de Barrett. ........................................ 117 2.6 Tratamiento del esófago de Barrett. ........................................................................... 123 2.6.1 Esófago de Barrett sin displasia. .......................................................................... 123 2.6.2 Esófago de Barrett con displasia de bajo grado. ................................................. 124 2.6.3 Esófago de Barrett indefinido para displasia. ...................................................... 126 2.6.4 Esófago de Barrett con displasia de alto grado/carcinoma in situ. ..................... 127 3. HIPÓTESIS ............................................................................................................................. 131 3.1 Hipótesis nula (H0) ....................................................................................................... 132 ÍNDICE. 9 3.2 Hipótesis alternativa (H1) ............................................................................................ 132 4. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 133 4.1. Objetivos sobre el comportamiento del Esófago de Barrett y el Adenocarcinoma Esofágico en el Área Sanitaria Virgen Macarena. .................................................................... 134 4.2 Objetivos del uso de biomarcadores TWIST, P504S y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett ........................................................................................... 136 5 MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................................................ 137 5.1 Metodología para valorar el comportamiento del Esófago de Barrett y del Adenocarcinoma esofágico en el Área Hospitalaria Virgen Macarena de Sevilla. ...................... 138 5.1.3 Análisis estadístico. .................................................................................................. 140 5.2 Metodología para valorar el uso de los biomarcadores TWIST, P504S y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett. ................................................................... 143 5.2.1 Criterios de inclusión: .......................................................................................... 143 5.2.2 Criterios de exclusión: .......................................................................................... 143 5.2.3 Metodología empleada para las tinciones inmunohistoquímicas: ...................... 144 5.2.4 Valoración Inmunohistoquímica: ......................................................................... 146 5.2.5 Análisis estadístico. .............................................................................................. 147 6 RESULTADOS ........................................................................................................................ 150 6.1 Resultados respecto al comportamiento del Esófago de Barrett y del Adenocarcinoma esofágico en el Área Hospitalaria Virgen Macarena de Sevilla. ................................................... 152 6.1.1 Tasas de incidencia del EB y ACE. ........................................................................ 152 6.1.2 Características sociodemográficas por grupos .................................................... 155 6.2 Resultados respecto al uso de los biomarcadores TWIST, P504S y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett. ..................................................................................... 164 6.2.1 Características de las tinciones. ........................................................................... 165 6.2.2 Resultado de las tinciones (Proporción, Intensidad y Q-Score). .......................... 176 6.2.3 Interpretación de los valores del Q-Score de Allred ............................................ 186 6.2.4 Estudio inmunohistoquímico según propio control ............................................ 189 7 DISCUSIÓN ........................................................................................................................... 192 7.1 Comportamiento del Esófago de Barrett y del Adenocarcinoma esofágico en el Área Hospitalaria Virgen Macarena de Sevilla. .................................................................................... 193 7.1.2 Incidencia del ACE y del EB. ..................................................................................... 193 Estudio de prevalencia, incidencia, supervivencia y factores de riesgo asociados al Esófago de Barrett 16 Virgen Macarena, Sevilla. Se incluyeron todos los pacientes con diagnóstico de EB y/o ACE entre enero de 1996 y marzo del 2011. El periodo de seguimiento se calculó desde el diagnóstico de EB hasta la fecha de última endoscopia con biopsia esofágica. El periodo de supervivencia se estableció desde el diagnóstico inicial del EB hasta la fecha de última consulta o defunción. Los pacientes fueron divididos inicialmente en 2 grupos: (1) EB y (2) ACE y posteriormente en cuatro subgrupos según el comportamiento histológico del EB a los largo del seguimiento. Valoramos aspectos demográficos tales como sexo, edad, tabaquismo (considerando como positivo un consumo según Índice Tabáquico >10), etilismo (considerando como positivo una ingesta de >15 Unidades/semana hombre y >12 Unidades/semana mujeres), tiempo de seguimiento (meses), supervivencia (meses) y las causas de defunción en cada uno de los subgrupos. Análisis estadístico. Las variables cuantitativas se expresaron como media y desviación estándar (DE), y las variables cualitativas como número absoluto y porcentaje. El análisis estadístico de las variables cuantitativas para grupos independientes se realizó con el test paramétrico de la t de Student y el test no paramétrico de la U de Mann Whitney. Para cuantitativas no dicotómicas el análisis de la varianza (ANOVA). Para el estudio estadístico de las variables cualitativas empleamos el test de chi-cuadrado de Pearson (χ2). Se valoró la Odds Ratio (OR) de cada uno de los factores de riesgo en los diferentes grupos y se analizó la supervivencia mediante curvas de Kaplan-Meier y el test de log-Rank. Estudio de prevalencia, incidencia, supervivencia y factores de riesgo asociados al Esófago de Barrett 17 RESULTADOS Durante el periodo estudiado (enero de 1996 - marzo del 2011) se realizaron un total de 38 929 endoscopias digestivas altas con hallazgos “sugestivos” de EB en 850 casos. Se obtuvo confirmación histopatológica en 649 muestras (prevalencia global del 1.7%) correspondientes a 263 pacientes. 92 pacientes fueron diagnosticados de ACE sin diagnóstico previo de EB. Tasas de incidencia del EB y ACE Según los diferentes periodos de tiempo estudiados y tomando en cuenta nuestra población de referencia aproximada (400 000 habs), la mayor tasa de incidencia (TI) para EB se obtuvo entre enero 2008 y diciembre 2009 (76/100 000 habs), y para ACE entre enero 2010 y diciembre 2011 (19/100 000 habs). La mayor parte de los pacientes presentaban un EB corto (250 casos, 74%). Características sociodemográficas por grupos  Grupo EB vs ACE Se estudiaron un total de 430 pacientes, la mayor parte de ellos con EB (79%) corto (74%) mientras que 92 pacientes (21%) presentaron ACE sin diagnóstico previo de EB. La mayoría fueron hombres, tanto en el EB como en el ACE (75% y 88% respectivamente), valores estadísticamente significativos respecto a las mujeres (p<0.05). La media de edad fue de 53 años en el EB y de 67 en el ACE (p<0.05). El grupo más afectado fue el de la franja de edad de 50-59 años para el EB con una TI de 20/100 000 personas año mientras que en el caso del ACE, la franja con mayor tasa de incidencia fue la comprendida entre los 70-79 años (6,5/100 000 personas-año). Estudio de prevalencia, incidencia, supervivencia y factores de riesgo asociados al Esófago de Barrett 18 Se observa además que, mientras la TI en el caso del EB aumenta de forma progresiva conforme se progresa en edad, y disminuye a partir de la séptima década de la vida, la de ACE aumenta de forma lineal hasta la octava década de la vida, para, a partir de entonces, empezar a disminuir. La mayoría de pacientes, tanto en el EB como en el ACE, presentaba antecedentes de consumo de alcohol (52% y 81% respectivamente) y tabaco (63% y 76%, respectivamente), valores que resultaron estadísticamente significativos en el caso del alcohol [p<0.05 OR 3.7 (IC 95% 1.4-9.5)], mas no en el tabaco [p=0.16 OR 1.8 (IC 95% 0.7-4.1)]. El seguimiento en el grupo de EB tuvo una media de 30 meses (0-175). La supervivencia del EB fue estadísticamente superior respecto al ACE (92 vs 24 meses, p<0.05) La mortalidad global para el EB fue del 6.2% mientras que para el ACE del 89% (p<0.05).  Análisis por Subgrupos La mayor parte de pacientes presentaban EBSD 270 (62,7%) y eran predominantemente del sexo masculino en todos los grupos. La población más joven correspondía a EBSD ( x =53 años) mientras que el grupo ACE presentaba la mayor edad ( x =66.6 años). Hubo mayor proporción de pacientes con EB corto en los grupos EB sin displasia y EBDE respecto al grupo EBPG con valores estadísticamente significativos [p<0.01 y p=0.014 OR de 4.3 (IC 95% 2.2-8.6) y 0.27 IC (0.09-0.7) respectivamente]. Observamos una mayor proporción de consumo de alcohol en el grupo ACE respecto a los grupos EBSD y EBDE (p=0.003 y p=0.044 respectivamente). La mayor supervivencia se observó en el grupo EBPD (115.3 meses), estadísticamente Estudio de prevalencia, incidencia, supervivencia y factores de riesgo asociados al Esófago de Barrett 19 significativa respecto al resto de los grupos (p<0.01). La mortalidad fue estadísticamente superior en el ACE respecto al resto de grupos (p<0.001). De los 338 pacientes con EB (270 sin displasia, 28 con displasia estable y 40 con progresión de cambios histológicos), 8 (2.4%) evolucionaron a ACE durante el seguimiento, de estos, 2 (25%) fallecieron por complicaciones relacionadas a la enfermedad neoplásica; el primero de ellos debutó con DAG y falleció 31 meses más tarde y el segundo debutó con EB sin displasia, con cambios histológicos evolutivos hacia ACE, siendo éxitus a los 60 meses del diagnóstico inicial del EB. CONCLUSIONES Existe una mayor incidencia y prevalencia tanto del EB como del ACE en los últimos años. Como FR encontramos el sexo masculino, mayor edad y consumo de alcohol. El EB largo (>3 cms) está implicado en la progresión del EB. La enfermedad cardiovascular y neoplásica no esofágica han sido las principales causas de mortalidad en los pacientes con EB. El diagnóstico de ACE ha sido, mayormente, como debut de la enfermedad neoplásica. PALABRAS CLAVE: Esófago, Esófago de Barrett, Adenocarcinoma esofágico, Displasia de alto grado. Uso de los biomarcadores TWIST, p504s y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett 20 1.2 Uso de los biomarcadores TWIST, p504s y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett INTRODUCCIÓN La inmunohistoquímica (IHQ) es una técnica que ha revolucionado la histopatología. Según el sitio de localización, la inmunomarcación de antígenos celulares puede presentarse en la membrana, el núcleo o el citoplasma. Con los recientes avances en el campo de la biología molecular, los investigadores se han dado a la tarea de caracterizar aquellos eventos decisivos que ocurren durante la transformación metaplasia-displasia-carcinoma. El uso de estos biomarcadores podría aportar una herramienta simple, reproducible y certera en la valoración de la progresión neoplásica. A medida que las células del EB progresan a displasia, adquieren alteraciones genéticas secuenciales que las acercan gradualmente hacia una transformación cancerígena. Recientes investigaciones han destacado el importante papel de diversos biomarcadores de crecimiento tumoral en el diagnóstico y seguimiento de diversos tipos de tumores gastrointestinales, incluido el ACE en el EB, sin embargo, en el momento actual, el gold standard para valorar el riesgo de progresión y malignización en el EB, sigue siendo su estratificación histopatológica. En lo que respecta a las diferentes técnicas a utilizar en nuestro estudio, sabemos que el CD 133 (también conocido como AC 133) es una glicoproteína transmembrana de cinco dominios que es expresada de forma selectiva en células madre hematopoyéticas y células progenitoras provenientes de la médula ósea fetal y adulta, cordón umbilical y sangre periférica. Es un marcador de células madre de una gran variedad de tejidos no hematopoyéticos incluyendo células neuronales y gliales en el cerebro fetal y células de progenitoras neuronales en la piel. El CD133 es un marcador expresado por un número limitado de células tumorales llamadas células madre carcinogénicas (CMC) que parecen ser responsables de iniciar el proceso de diferenciación celular tumoral, las Uso de los biomarcadores TWIST, p504s y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett 21 metástasis y la recurrencia, además de poseer capacidad auto-replicativa, potencial de diferenciación múltiple, capacidad proliferativa y carcinogénesis. La α-metilacil-coenzima A racemasa (AMCAR/P504S), pertenece a la familia de la caiB/baiF coA-transferasa. Localizada en el peroxisoma y la mitocondria es una enzima involucrada en la oxidación de los ácidos grados de cadena larga. La sobreexpresión de la proteína AMCAR se encontró presente en varios tipos de cáncer tales como colo-recto, próstata, ovario, mama, vejiga, pulmón, carcinoma de células renales, linfoma y melanoma. También se encuentra presente en los adenomas de colon y adenocarcinomas pero no en epitelio colónico normal lo que sugiere podría tener un importante papel en el desarrollo de tumores gastrointestinales. Twist1 y Twist2 son los principales reguladores de la embriogénesis. Se ha demostrado que en condiciones patológicas Twist1 favorece la migración metastásica de células cancerosas a través de su capacidad para inducir una transición epiteliomesenquimal. TWIST ha sido relacionada con un gran número de procesos tumorales entre los que destacan el cáncer colorrectal y pulmonar. Parece igualmente estar relacionado con la capacidad de progresión de la displasia hacia ACE en el EB aunque la evidencia obtenida hasta el momento es escasa. OBJETIVO El objetivo primario fue determinar la utilidad del uso de los marcadores inmunohistoquímicos TWIST, CD133 y P504S en la valoración de la progresión de displasia en pacientes con esófago de Barrett y ACE. Como secundarios estudiar la utilidad de estos marcadores como auxiliares en la valoración histopatológica de la displasia y del adenocarcinoma esofágico. . Uso de los biomarcadores TWIST, p504s y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett 22 MATERIAL Y METODO Tomando como punto de referencia el estudio previo, se incluyeron pacientes de cada uno de los subgrupos según el comportamiento histopatológico observado. Las diferentes técnicas de IHQ fueron realizadas en aquellos casos cuyas piezas quirúrgicas/biopsias endoscópicas fueran recuperables y tuvieran material suficiente para la realización de las mismas. Una vez analizado el tamaño de la muestra necesario, los pacientes fueron categorizados según las características histopatológicas observadas y se incluyeron para su estudio mediante las diferentes técnicas inmunohistoquímicas (CD 133, p504s y TWIST). Se utilizó el sistema de calificación rápida (Q-score) de Allred basado en la intensidad y proporción de la tinción. La segunda parte del estudio inmunohistoquímico incluyó un análisis utilizando a cada paciente como su propio control. Se llevaron a cabo tinciones de IHQ a diferentes zonas (mucosa normal, EBSD y EB con displasia, además de las zonas de ACE) de las piezas quirúrgicas extraídas (esofagectomías) con diagnóstico de ACE a fin de buscar diferencias en la expresión IHQ en cada una de las diferentes tinciones estudiadas. Análisis estadístico Para el cálculo del tamaño de muestra se utilizó la fórmula basada en la proporción. Las diferencias entre los grupos se estudiaron mediante el empleo de la Chi cuadrado (χ2 ) si menos del 20% de las casillas contenían valores menores a 5 (n<5); en los casos en que esto no se cumplió (>20% de las casillas con valores <5), se utilizó el test exacto de Fisher. Para el análisis de variables cuantitativas se utilizó el test de Uso de los biomarcadores TWIST, p504s y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett 23 ANOVA. Finalmente, para la comparación de proporciones entre grupos relacionados (siendo cada paciente su propio control) se utilizó la Q de Cochran. RESULTADOS Se incluyeron 71 pacientes en el grupo control (“Mucosa normal”), 110 en el grupo Esófago de Barrett sin displasia (“EBSD”), 72 en el grupo “EB con displasia” y 34 en el grupo “ACE”. No se observan diferencias estadísticamente significativas en las variables comparadas (Sexo, edad, Consumo de alcohol o tabaco ni en el IMC) La tinción CD 133 se observó, principalmente, en la zona apical, tanto de la membrana como del citoplasma en el caso de tejido tumoral. Ésta tinción también resulto francamente positiva en las glándulas submucosas de los pacientes con EB así como en zonas necróticas y detritus celulares. En el caso de p504s, la tinción fue de tipo granular localizada a nivel del citoplasma celular. La expresión del TWIST fue muy heterogénea, resultando positiva a nivel nuclear y citoplasmático en una gran variedad de tejidos, desde células del estroma, hasta linfocitos, folículos linfoides y células inflamatorias; lo cual, aunado a la falta de experiencia en el uso de esta técnica IHQ, hace que los resultados sean confusos y muy poco satisfactorios. En el caso del CD 133, éste resulta mayormente negativo en los casos de “Mucosa normal” y “EB sin displasia”, mientras que se vuelve progresivamente positiva a medida que avanzan los cambios histológicos, siendo francamente positiva en los casos de “EB con DAG” y “ACE”. En lo que respecta al p504s, vemos que resulta completamente negativo en los casos de “mucosa normal” mientras es predominantemente negativo en los casos de “EB sin displasia”. Al igual que en el caso del CD 133, a medida que progresan los cambios histológicos, estos se acompañan de cambios en las proporciones de Uso de los biomarcadores TWIST, p504s y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett 24 positividad a la tinción; de esta forma, ya encontramos que hasta casi el 70% de los casos con DBG son positivos, situación que progresa hasta el 93% en los casos de DAG y del 68% en el ACE. Mediante el empleo de la fórmula estadística seleccionada en donde cada paciente fue su propio control, se encontraron diferencias en las proporciones de positividad tanto del CD 133 como del p504s a medida que progresan los cambios histológicos en la línea metaplasia-displasia-adenocarcinoma. CONCLUSIONES En los pacientes con esófago de Barrett, CD 133 se expresa tanto a nivel luminal en las glándulas submucosas como a lo largo del trayecto de su conducto excretor hacia la luz esofágica, por lo que podrían ser éstas células el origen del epitelio de Barrett. La P540s presentó un patrón de tinción citoplasmático siendo más positiva en los casos de displasia que en los casos sin displasia. La expresión de CD 133 es más frecuente en los casos de DAG y ACE respecto a la DBG, por ello, una tinción positiva podría estar relacionada con un peor pronóstico. La expresión de p504s con su característico patrón citoplasmático, resultó más frecuente en los casos de EB con displasia, tanto de bajo como de alto grado, respecto a la metaplasia de Barrett sin displasia. Mientras que, tanto el CD 133 como la p504s podrían ser útiles en identificar aquellos casos de EB que presenten dudas respecto a la displasia, sobre todo para patólogos no expertos y en centros no especializados, el TWIST presenta múltiples dificultades técnicas y de interpretación, que hacen muy difícil su uso rutinario en la práctica clínica habitual. PALABRAS CLAVE: Esófago, Esófago de Barrett, Adenocarcinoma esofágico, Displasia de alto grado. 25 INTRODUCCIÓN 2. INTRODUCCIÓN 32 2. INTRODUCCIÓN lugar a la aparición de cáncer a los largo de décadas (cáncer colorrectal) o (2) adición o pérdida de grandes fragmentos, o cromosomas enteros que dan lugar al desarrollo de cáncer de forma acelerada (por ejemplo, cáncer de próstata). Dado que el ACE presenta, a diferencia de otros tipos de cáncer gastrointestinal, gran número de alteraciones genéticas (CDKN2A LOH, TP53, LOH y aneuploidia), encajaría en el segundo tipo de desarrollo de carcinogénesis [37]. Hay experimentos que sugieren que la pérdida del alelo 17p (p53), precede a la pérdida del alelo 5q (APC), durante la progresión neoplásica en el EB, este ordenamiento de pérdida de alelos tipo 17p (p53) a 5q (APC) contrasta con aquel propuesto para el cáncer de colon, en el cual la pérdida del alelo 5q (APC) tiende a preceder a la pérdida del alelo 17p (p53), lo cual sugiere un orden genético invertido de pérdida de alelos en el desarrollo del adenocarcinoma asociado al EB, sin embargo, y como ya se comentó, no se debe perder la perspectiva de que la presencia de metaplasia columnar en esófago, refleja la ERGE y, más aún, hay estudios recientes que revelan la fuerte asociación entre los síntomas del RGE y el riesgo de ACE, independientemente de la presencia del EB [38-41]. Con la ayuda de los avances tecnológicos en materia de genética y bioinformática, se han desarrollado modelos que pretenden explicar la secuencia que da origen al EB, y que lo posicionan como una clara enfermedad que evoluciona debido a una selección clonal donde el Índice de diversidad (“Diversity índices”) se sitúa como un factor predictor del desarrollo de ACE sobre EB [42]. Por esta definición moderna, irónicamente, ninguno de los pacientes que Barrett describió, tenía EB [25]. Si la definición aceptada actualmente privilegia el sustento histológico de metaplasia intestinal como se ha descrito, el criterio previo de definir el Esófago de según su extensión, debe ser siempre consignado, pues las medidas y formas son importantes a la hora de realizar estudios comparativos, manteniendo un mismo 33 2. INTRODUCCIÓN lenguaje para evitar errores y apreciaciones subjetivas en la extensión de la enfermedad. Hoy día se considera la clasificación de Praga [43-44] como la mejor en lo que se refiere a valoración endoscópica del EB. En ésta, cada segmento de Barrett se describe como su extensión circunferencial (C) y la máxima extensión longitudinal (M). Figura 2.2. Fig 2.2 Clasificación de Praga. Ejemplo de un EB C2M5 (C2= circunferencia localizada a 2 cms de la unión esofagogástrica, M5= extensión máxima de metaplasia a 5 cms de la unión esofagogástrica). (Sharma P et al. Gastroenterology 2006). Merece la pena subrayar que si bien la prevalencia del EB se incrementa con la edad, no sucede de la misma manera con la longitud del mismo, esto es, que de acuerdo a las observaciones de diversos investigadores, estos sugieren que el epitelio de Barrett se desarrolla a su máxima longitud rápidamente, permaneciendo estable por muchos años. Sin embargo, los aspectos demográficos y de patogénesis de ambas entidades parecen ser similares, sugiriendo que ellas representan la continuidad de una sola entidad [45-46]. 34 2. INTRODUCCIÓN 2.2 Incidencia del Esófago de Barrett y del Adenocarcinoma Esofágico El EB fue raramente diagnosticado antes del uso extendido de la endoscopía flexible, y los estudios consignados antes de la década del 70, eran hechos con base a estudios utilizando endoscopios rígidos [47]. Si bien se conoce que la prevalencia de los síntomas del RGE en la población adulta en general, en países de occidente, es de alrededor del 20%, en los que tienen un episodio de pirosis diario y de alrededor del 7% en los que manifiestan un episodio de pirosis semanal, la prevalencia del EB en la población general no puede ser estimada de la información precedente, debido a que muchos pacientes no tienen una historia previa de RGE [48-50]. Cuando se ha evaluado su prevalencia, ésta ha sido en base a estudios realizados con pacientes sometidos a endoscopia digestiva alta. Se ha estimado que la metaplasia de Barrett presenta una prevalencia del 1.2% en la población general, sin embargo, cuando se analizaron pacientes con síntomas de RGE, esta prevalencia aumentó hasta situarse cerca del 2.3%, aunque series más antiguas la estiman hasta en el 20% de los pacientes con ERGE [51]; en presencia de esofagitis la prevalencia aumenta hasta situarse en el 2.6% de los casos [52]. Por tanto, se concluye que “es razonable decir que alrededor del 1% de pacientes que acuden a los servicios de endoscopía, por cualquier razón, tendrán EB y que la prevalencia del mismo se incrementa hasta alrededor del 2-4%, cuando los pacientes se presentan con síntomas de RGE, siendo este padecimiento más frecuente en hombres que en mujeres” [47]. Una observación que merece la pena destacar es que, cuando se han realizado estudios de prevalencia de Barrett en pacientes sometidos a necropsia, esta se incrementa hasta en 16 veces (prevalencia estimada de 376 casos/100 000 habs), lo que lleva a la conclusión de que la mayoría de los individuos con EB en la población general, no son diagnosticados [53]. 35 2. INTRODUCCIÓN La prevalencia del EB en el sur de Europa, según estudios obtenidos desde servicios de endoscopia, se ha incrementado de forma alarmante en los últimos años, pasando del 6.51 a 76.04/100 000 habitantes (1985-2001) [54]. La tasa más alta de EB en pacientes sometidos a endoscopia digestiva alta por síntomas de ERGE la tiene España con una prevalencia cercana al 12%, si tomamos en cuenta que cuanta con una población aproximada de 4,5 millones, tendríamos un total de 540 000 personas afectadas de EB; a esta alta prevalencia le siguen Italia con el 1.5% y Alemania con el 1.3% de la población con ERGE afecta de EB [55]. En Inglaterra, la prevalencia se ha incrementado de 0.8- 2% en los períodos evaluados de 1987-1996 [31] hasta el 4.6% en 2004 [56]. En Asia, las enfermedades del esófago (RGE, esofagitis erosiva, EB y el ACE), son infrecuentes, sin embargo, al igual que en países occidentales, el EB ha aumentado su prevalencia a niveles alarmantes en los últimos años, según estudios realizados en Malasia [57], Corea del Sur [58], Japón [59], China [60] e India [61]. También el ACE ha mostrado aumento en Singapur [62], Japón [63] e Irán [64]. En Singapur la incidencia ajustada a la edad (IAE) para carcinoma escamoso de esófago (CEE) ha disminuido de 8.31 a 3.85 /100 000 habitantes, en el caso de los hombres, y del 3.43 al 0.81/100 000 habs, en el caso de las mujeres mientras que la IAE en lo que respecta al ACE ha aumentado del 0 al 0.54/100 000 habs en el caso de los hombres y del 0.03 al 0.13/100 000 habs en el caso de las mujeres [62]. La prevalencia en Japón, en adultos que acuden a los servicios de endoscopía es de alrededor del 0.6%, con predominancia del sexo masculino y una edad promedio de 60 años [58]. El carcinoma epidermoide aún continúa siendo el cáncer dominante en Japón, con el ACE explicando menos del 5% de las neoplasias de esófago [63]. El aumento del número de neoplasias (ACE) asociadas a ERGE y EB se ha intentado explicar por varios motivos, siendo el principal la “occidentalización” de la dieta y de los hábitos de vida. Esto ha traído consigo un aumento en las tasas de 36 2. INTRODUCCIÓN obesidad central, ERGE, además del mismo efecto cancerígeno de los productos procesados. También la erradicación sistemática de H. pylori se ha mostrado que ha condicionado este aumento, al ser, la colonización por esta bacteria, un factor protector para el desarrollo de ACE [65-66]. Aunque el tabaco se ha mostrado como FR en el desarrollo del EB en Corea del Sur y Malasia [67-68], no existe un consenso universal sobre su grado de implicación en el desarrollo del EB en países asiáticos. En países del África y del Oriente Medio, el EB y el ACE son infrecuentes, siendo la neoplasia prevalente el carcinoma epidermoide. En países tales como Uganda, Kenya, Nigeria, Etiopía y Zimbabwe, el EB es raro (casi no existe), con el ACE que explica únicamente el 4-6% de todas las neoplasias de esófago. Por otro lado, la infección por H. pylori en esta población es extremadamente común. Por ejemplo, en Soweto, África del sur, el 46% de niños han adquirido el H. pylori al año de edad, y el 100% alrededor de los 12 años. Se ha sugerido que la alta prevalencia de la infección por el H. pylori en estos países, podría llevar a una reducción en la secreción de ácido por parte del estómago y a una consecuente reducción en el RGE, pudiéndose explicar de esta manera la baja prevalencia de enfermedades del esófago relacionadas al factor de la producción del ácido, si bien esta hipótesis aún no ha sido confirmada [69-71]. 37 2. INTRODUCCIÓN 2.3 Factores de riesgo en el desarrollo del Adenocarcinoma esofágico sobre Esófago de Barrett 2.3.1 Factores innatos 2.3.1.1 Edad Aunque varios estudios han intentado evaluar el papel de la edad en el riesgo de progresión del EB hacia displasia/ACE, hasta la fecha no hay resultados concluyentes [72-74]. Uno de estos estudios, realizado en la Cleveland Clinic, demostró el papel de la edad en la progresión del EB hacia cualquier tipo de displasia [75], resultado que se confirmó posteriormente en un amplio estudio que incluyó 4205 pacientes [76]. En este estudio, los autores encontraron una incidencia de EB de 2/100 000 personas-año en el grupo de edad correspondiente a los 21-30 años que se incrementaba de forma muy importante hasta alcanzar los 31/100 000 personas-año en el grupo de los 61-70 años. Se ha estimado que el riesgo de desarrollo de ACE en el EB se incrementa un 6.6% por cada 5 años que aumenta la edad [77]. Sin embargo, otro estudio no demostró ninguna diferencia en el riesgo de progresión al separar pacientes <50 y >50 años [78]. Aunque estudios multicéntricos han aportado algo más de evidencia al respecto, al encontrar que los pacientes más “añosos” presentan mayor riesgo de progresión [79], la evidencia encontrada hasta ahora es débil a la hora de realizar afirmaciones a este respecto. Por tanto, quizá lo más razonable sería concluir que, aunque con evidencia débil, la edad puede tener un papel en el desarrollo de displasia/ACE al actuar con un FR independiente. 2.3.1.2 Sexo En este aspecto los resultados de diversos estudios son bastante homogéneos en sus conclusiones, el sexo masculino es más prevalente tanto en pacientes con EB, 38 2. INTRODUCCIÓN como en pacientes con ACE [80-83], con una incidencia aproximada en el caso del EB de 31/100 000 personas-año (95% IC 28 a 34), en el caso de los hombres y de 17/100 000 personas-año (95% IC 15-20) en el caso de las mujeres; respecto al ACE la incidencia aproximada es de 4.2/100 000 personas-año (95% IC 3.8-4.5) para los hombres y 0.6/100 000 personas-año (95% IC 0.4-0.7) para las mujeres. Esto se puede interpretar como una mayor prevalencia para los hombres de 2:1 y de 4:1 para EB y ACE respectivamente [76]. Sin embargo, como no podría ser de otra manera, también existe evidencia que refuta esta observación al no encontrar diferencias significativas. En este caso, se trata de un estudio prospectivo [73], débil en su metodología lo cual nos hace tomar con cautela sus conclusiones. El porqué el sexo masculino es un FR independiente no está claro hasta la fecha. Algunos autores has especulado sobre que sea debido a que los hombres son más propensos a un patrón de obesidad visceral respecto a las mujeres, sin embargo, no hay nada concluyente al respecto. Por tal motivo, y ante la gran cantidad de evidencia que existe a su favor, sería razonable admitir que el sexo masculino es un FR independiente que confiere a los hombres, respecto a las mujeres, 2-3 veces más riesgo de desarrollo de EB y, cuando éste está presente, 3-4 veces más riesgo de que evolucione hacia ACE. 2.3.1.3 Raza Al igual que en el caso anterior, en lo que respecta al origen étnico como FR de EB, los resultados son bastante homogéneos. Los caucásicos parecen ser la población más frecuentemente afectada, tanto para el EB como para el ACE [84-85]. Los análisis más importantes a este respecto han sido realizados utilizando bases de datos de los EEUU [86]. En este estudio, respecto al ACE, la población caucásica muestra una incidencia del doble respecto a los hispanos y cuatro veces más respecto a los afroamericanos, asiáticos, de las islas del Pacífico y nativos americanos. Cabría esperar 39 2. INTRODUCCIÓN que dadas las importantes diferencias en lo que respecta al acceso a los recursos sanitarios (teniendo los inmigrantes, en general poco acceso a servicios sanitarios y pólizas de seguros más bajas) las diferencias se debieran a este sesgo de selección; sin embargo, este estudio toma en cuenta este factor, al realizar un estudio estratificado según los distintos distritos geográficos ajustándose a similares prestaciones sanitarias. De hecho, otro estudio, también de índole epidemiológica, pero esta vez enfocado al estudio de prevalencia de ERGE en los distintos grupos étnicos ha encontrado similares resultados, a similar incidencia de RGE, son los caucásicos son los más frecuentemente afectados por ERGE existiendo, en los afroamericanos, muy poca incidencia de esofagitis y casi nula de EB [87]. Esto hace pensar que, aunque no claramente identificados, podrían existir algunas características genéticas que confieran a la mucosa intestinal un factor protector frente al RGE. 2.3.2 Factores Gastrointestinales 2.3.2.1 Esófago de Barrett Diversos estudios han intentado estimar la incidencia del ACE en el EB. Los estimados de estudios retrospectivos varían entre 1/55 a 1/441 pacientes-año de seguimiento [88-93], cuando se evalúan estudios prospectivos la incidencia de ACE varía de 1/52 a 1/98 pacientes-año de seguimiento, sobre un periodo evaluado de 3 a 5 años [94-98]. Los datos son difíciles de interpretar cuando son de estudios retrospectivos ya que entre otras razones tienen diferentes criterios diagnósticos de inclusión y cortos periodos de evaluación. Por otro lado, los estudios prospectivos tienen cortos periodos de seguimiento y sus tamaños muestrales son igualmente pequeños. 40 2. INTRODUCCIÓN Sin embargo, cuando se combinan los datos de todas las series prospectivas, la incidencia del ACE es de 1/104 pacientes-año [99]. De acuerdo a un estudio internacional multicéntrico, que comprendió países de Europa del Este, del Asia, de América Central y América del Sur, se pudo apreciar que la prevalencia del EB es del 0.6-1%, con una prevalencia extremadamente baja de displasia y cáncer [69]. Las razones para tratar de explicar la disparidad en la prevalencia del EB y del ACE en las diferentes partes del mundo no están claramente entendidas, no obstante, la prevalencia de la ERGE, la obesidad, la infección por el H. pylori y los factores genéticos, han sido implicados [31]. El EB es un marcador aceptado de riesgo en el desarrollo de ACE. Se estima que su presencia incrementa el riesgo de ACE unas 30 veces, mientras que la ERGE sin EB sólo lo incrementa 3.1 veces respecto a la población general [100]. Un análisis realizado en el Reino Unido sobre 1761 pacientes obtenidos del “Barrett´s oesophagus registry” demostró que el riesgo de desarrollo de ACE sobre un EB es de 23 casos en 3912 años de seguimiento (0.59% por año) [101], Otros estudios han encontrado incidencias variables que varían desde el 0.32% al 0.55% [103-106. También se ha demostrado que la mayoría de pacientes con EB no desarrollará ACE [107] y morirán de otras causas no relacionadas con esta enfermedad. Se estima que, aproximadamente el 10% de los pacientes con EB desarrollarán una displasia de alto grado (DAG) o ACE a los 10 años desde el inicio de síntomas como disfagia/odinofagia o nausea/vómito. El tiempo desde el inicio de los síntomas hasta la aparición del EB ronda los 2.6 años para seguir hasta el desarrollo de displasia aproximadamente a los 5 años y displasia de alto grado al cabo de 9.6 años aproximadamente [108]. 41 2. INTRODUCCIÓN Extensión del esófago de Barrett. La extensión del EB ha sido ampliamente estudiada como FR condicionante del desarrollo de la DAH y posteriormente, del ACE tanto en estudios prospectivos como retrospectivos. Las limitaciones en el tamaño de la muestra han sido los principales condicionantes de que, hasta la fecha, no existan conclusiones claras a este respecto [109-112]. Estudios retrospectivos han encontrado asociación entre la extensión del EB y el desarrollo del DAH/ACE; sin embargo, las conclusiones se realizan a través de un estudio multivariante por lo que es difícil realizar afirmaciones a este respecto [113-114]. Otros estudios prospectivos también han encontrado esta asociación “extensión del EBDAG-ACE” [115-116]. En otro estudio, la extensión del EB era factor pronóstico en el desarrollo de cualquier tipo de displasia y, subsecuentemente, de ACE [117]. Aunque no existe un consenso claro sobre la extensión que debe tener el EB para ser un FR en el desarrollo de displasia, la mayoría de estudios hacen mención al EB > de 6 cms como condicionante de este riesgo [118]. Sin embargo, también existe evidencia que contradice esta observación [119-121]. Un estudio prospectivo con importante tamaño muestral [122], ha mostrado que, una vez que se agrupa a los pacientes según los hallazgos anatomopatológicos, la extensión del EB deja de ser un FR claramente identificable y condicionante de evolución hacia displasia y ACE. Una conclusión semejante fue obtenida por otro grupo de investigadores, publicada en forma de metaanálisis, hace referencia a la poca calidad de los trabajos publicados hasta la fecha, con especial énfasis al hecho de que solo 6 estudios proporcionan datos suficientes para calcular la incidencia de ACE en los pacientes con EB de segmento corto (con un seguimiento de 1400 años-persona); grupo en el que se contabilizaron solo 7 casos de cáncer [118]. Otro meta-análisis muestra también un menor riesgo de desarrollo de ACE en EB de segmento corto [123], sin embargo, al estar basado en la recopilación de datos de pequeños estudios, tampoco tiene la calidad suficiente como para sacar conclusiones definitivas. 48 2. INTRODUCCIÓN momento muestran que la cirugía disminuye, mas no elimina el riesgo de displasia y ACE en pacientes con EB [161-166] Una revisión sistemática, que incluyó 25 estudios con un tamaño muestral de 1,696 pacientes, demostró que el riesgo de ACE en pacientes tratados mediante cirugía antirreflujo es significativamente menor respecto de aquellos tratados únicamente mediante tratamiento médico (2.8% vs 6.3%/ 1000 pacientes-año, respectivamente [167]. Se recomienda que los pacientes sometidos a cirugía antirreflujo por EB sean sometidos a pH-metría postoperatoria a fin de detectar aquellos que mantienen reflujo gastroduodenal asintomático, situación que podría incrementar el riesgo de desarrollo de displasia y ACE [168]. El fallo en la funduplicatura, con la consecuente recurrencia de la ERGE también se relaciona con progresión del EB hacia displasia y ACE [169-171]. Respecto a si la cirugía antirreflujo induce la remisión del EB, diversos estudios han abordado esta interrogante. Lo que sí parece claro es que, cuando la cirugía se realiza en condiciones óptimas y logra, objetivado mediante pH metría, el control del reflujo gastroduodenal, se observa una remisión significativa el EB comparado frente a tratamiento médico [171-172]; en particular en el EB corto [173]. El estudio más importante realizado hasta el momento [181] muestra que la cirugía antirreflujo logra una regresión significativa del EB comparada frente a tratamiento médico (15.4 vs 1.9% p= 0.0004). Esta regresión afecta predominantemente al EB sin displasia que involuciona hacia epitelio normal (17 vs 0.4%). 2.3.2.5 Infección por Helicobacter pylori Helicobacter pylori (HP) es una bacteria que coloniza la mucosa gástrica. Actúa modulando la secreción de ácido gástrico lo cual, según diferentes teorías, vendría a disminuir la incidencia de ERGE, esofagitis y, finalmente, EB [174-178]. Cuando la 49 2. INTRODUCCIÓN infección por HP causa inflamación gástrica y atrofia, disminuye la producción de ácido gástrico al dañar las células parietales del fundus gástrico [179]. Diversa evidencia en forma de meta-análisis y revisiones sistemáticas han llegado a relacionar de forma inversa la presencia de HP y ERGE, aunque, hasta ahora esta asociación es heterogénea en sus resultados [180-182]. Estudios recientes estiman que la incidencia de EB y ACE se reduce aproximadamente a la mitad en presencia de H pylori y atrofia gástrica (Odds ratio 0.52% y 0.64% respectivamente) [183-184]. La cadena cagA del H pylori está directamente relacionada con la su poder para inducir inflamación de alto grado y atrofia [185]. A esto hay que añadir que un gran estudio prospectivo que compara pacientes con EB vs ERGE demostró una relación inversa entre la intensidad de la enfermedad y la presencia de infección por H pylori; es decir, la ERGE presenta tasas de infección por H pylori del 44%, porcentaje que baja hasta el 35% en pacientes con EB no complicado y que continúa bajando hasta situarse cerca del 14-15% en paciente con EB con displasia de alto grado y ACE [186]. Sin embargo, al igual que con otros factores de riesgo, también existe evidencia contradictoria. Un estudio diseñado para evitar sesgos demográficos y de estilo de vida no pudo demostrar la relación entre la presencia de cagA y ACE [187]. Quizá esto sea debido a otro factor de confusión, el reflujo biliar. Estudios han demostrado que la presencia de reflujo biliar evita la colonización por H pylori pero no evita y, de hecho, contribuye, al daño tanto en la mucosa gástrica como en la esofágica, de tal forma que podemos tener atrofia gástrica producto del excesivo reflujo biliar y, a la misma vez un EB/ACE [155]. Aún así, dado que sí que está demostrado el poder carcinogénico del H pylori (mutágeno de clase 1, según la Organización Mundial de la Salud) resulta altamente cuestionable el papel protector de esta bacteria y aún más cuestionable el no erradicarla cuando es detectada. 50 2. INTRODUCCIÓN 2.3.2.6 Nitritos salivares Tanto los nitratos de los alimentos como aquellos concentrados en la saliva, son reducidos a nitritos por acción de las bacterias contenidas en el tracto digestivo superior. En pacientes con RGE, los nitritos se transforman en óxido nítrico (ON) en la luz esofágica. Esta situación se ve agravada en caso de aclorhidria secundaria a toma crónica de IBP´s o por gastritis atrófica donde las bacterias reductoras de nitritos crecen sin restricciones, agravando y elevando la presencia de ON en el esófago [155]. Estudios in vitro han demostrado el poder carcinogénico del ON. Actúa, al parecer, rompiendo los enlaces de doble cadena del ADN de las células de Barrett lo cual podría ser un factor carcinogénico asociado a su progresión hacia ACE [188]. En el siglo XX hemos asistido al uso cada vez mayor de nitratos en la agricultura lo cual ha derivado no solo en su consumo de forma directa en los alimentos, sino también en el agua que bebemos, situación que coincide, de forma paralela, al aumento lineal en la incidencia de ACE observada en los últimos años [189]. 2.3.3 Otros factores de riesgo modificables. 2.3.3.1 Obesidad El incremento en la obesidad mundial también es paralelo al que observamos en el EB y ACE. Se han encontrado fuertes asociaciones entre la obesidad y la presencia de ERGE/esofagitis erosiva [190]. Aunque parecería lógico pensar que a mayor obesidad, mayor riesgo de ERGE y EB, un meta-análisis que relacionó el Índice de Masa Corporal (IMC) con la presencia de EB, sólo pudo demostrar un incremento muy discreto del riesgo [191]. Sin embargo, un IMC elevado sí que parece ser un FR para ACE (OR 1.8 y 2.4 para IMC de >25 y >30, respectivamente) [192]. Este incremento del riesgo parece más relacionado con la distribución de la grasa que del IMC en sí, donde 51 2. INTRODUCCIÓN la obesidad visceral resulta el FR más importante [193]. Otros estudios han demostrado relación entre el IMC y la presencia de ACE a edades tempranas, sugiriendo que la adiposidad puede actuar de forma muy temprana en la evolución de la enfermedad [135, 194]. Durante los últimos años han surgido otros pequeños estudios que han fallado en el objetivo de relacionar el IMC como FR en la progresión del EB hacia displasia de alto grado y ACE [195]; este fallo puede ser debido al pequeño tamaño muestral así como a otros factores de confusión. Sin embargo, un estudio del Seattle Barrett´s Esophagus Program reveló una fuerte asociación entre el Índice Cadera-Cintura y el riesgo de progresión del EB hacia ACE; de nuevo, la distribución de la grasa resultó más importante que el peso per se. La obesidad está relacionada con la ERGE a través de varios mecanismos mecánicos y fisiológicos. Sin embargo, parte de la asociación entre la obesidad y el EB/ACE es independiente de la presencia de ERGE; esto sugiere la existencia de un mecanismo independiente del RGE. La obesidad central está relacionada con resistencia a la insulina, niveles más bajos de globulina fijadora de hormonas sexuales, grelina y adiponectina. También se observan niveles elevados de insulina, leptina y ácidos grasos libres [196-204]. La insulina estimula de forma directa la producción del Factor de Crecimiento dependiente de la Insulina (IGF) y sus respectivos receptores de formas complejas. Niveles elevados de insulina inhiben la producción hepática de las Proteínas ligadoras de Factor de Crecimiento dependiente de la Insulina tipo 1 (IGF- binding protein 1) [205]. Esto condiciona una mayor liberación y biodisponibilidad de IGF-I, lo cual, mantenido en el tiempo ha demostrado un FR fundamental en el desarrollo de varios tipos de cáncer (mama, próstata, pulmón, colon y recto) [206]. Habiendo identificado a la obesidad como FR en el EB/ACE, parecería lógico pensar que una disminución en el IMC conllevaría una reducción en este riesgo. Sin embargo, los estudios de los que disponemos hasta el momento no han logrado aclarar esta suposición. En un estudio relativamente reciente, una dieta sana asociada a 52 2. INTRODUCCIÓN reducción de peso no mostró disminución significativa de este riesgo. Este hallazgo quizá sea relativo al pequeño tamaño muestral (87 pacientes) y a la escasa pérdida de peso (3.6 kgs) [207]. 2.3.3.2 Dieta. Numerosos estudios han establecido la relación entre la dieta alta en frutas y vegetables, y la disminución del riesgo de ACE [208-209]. Así como el aumento con el consumo de carne procesada [210]. Un estudio observacional realizado en Suecia demostró que los pacientes que presentaban un mayor consumo de frutas (cuartil superior) y vegetales presentaban una reducción del riesgo de ACE cercano al 50%, respecto aquellos que consumían menos (cuartil inferior) [211]. Sin embargo, otras investigaciones han puesto esto en tela de juicio al no encontrar disminución en los marcadores de proliferación celular, en aquellos pacientes a los que se aumentó la cantidad de frutas y vegetales consumidos en la dieta [212-213]; a la vez que el estudio FINBAR demostró reducción del riesgo de ACE con el consumo de frutas, mas no de vegetales [149]. Por todo esto, se ha propuesto el posible papel que los antioxidantes contenidos en la fruta como posible explicación a este hallazgo. Otros estudios han avalado este hallazgo dado que se ha demostrado que los pacientes que toman pastillas multivitamínicas presentaban disminución tanto en el riesgo de tetraploidía (Cociente de riesgo HR 0.19) como de ACE (HR 0.38). También se observaron reducciones del riesgo con la vitamina E (HR 0.25) y vitamina C (HR 0.25), este último confirmado por otro estudio similar [214]. Otros estudios realizados con diferentes antioxidantes como el zinc, vitamina A, B-criptoxantina, riboflavina, acido fólico, fibra, proteínas y carbohidratos han mostrado similares resultados, mientras las grasas saturadas aumentaban este riesgo [215]. Un estudio encaminado a evaluar el efecto protector del selenio en pacientes con EB demostró que aquellos con mayores niveles 53 2. INTRODUCCIÓN en sangre (situados en los tres cuartiles superiores) presentaban menos riesgo de displasia de alto grado, (OR 0.5), aneuploidia (OR 0.5) y de disminución de heterocigosis en el fragmento 17p (LOH 17p), cuando se comparan con aquellos pacientes situados en el cuartil inferior. Esta misma investigación no encontró afectación tipo LOH 16p, un evento temprano en el desarrollo de displasia, lo que indica que el selenio podría tener un papel protector en la fase tardía de la progresión hacia ACE. [216]. Ante todos esto hallazgos, la European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) realizó una revisión sistemática que ha sentado las bases sobre el papel de la dieta en el desarrollo de ACE. De esta forma se ha llegado a la conclusión de que, independientemente de la cantidad de frutas y vegetales consumidos, es la variedad en la misma lo que atribuye a estos alimentos una relación inversa entre su consumo y el riesgo de desarrollo de carcinoma escamoso de esófago. La principal asociación inversa entre el consumo de fruta y el carcinoma escamoso se observa en pacientes que han fumado alguna vez. Aunque según los diferentes estudios, el consumo de estos alimentos ha mostrado que reduce la incidencia de adenocarcinoma intestinal (aunque a niveles no significativos), estos mismos han fallado en demostrar, de forma definitiva, que el consumo de frutas y verduras disminuya el riesgo de desarrollo de ACE o gástrico, dado que se encuentran, probablemente, sesgados por el estilo de vida que mantienen a la par este tipo de personas (vida más sana, ejercicio habitual, menor IMC, menor consumo de alcohol y tabaco, etc.) [217]. 2.3.3.3 Alcohol Los estudios que relacionan el consumo de alcohol con el desarrollo de EB y ACE son escasos. El registro de EB del Reino Unido (UK BE Registry) no encontró asociación entre el consumo de alcohol y el EB, al compararlo con pacientes con 54 2. INTRODUCCIÓN esofagitis por reflujo [218]. A la fecha existen numerosos estudios (al menos 14) que buscan establecer una relación entre el consumo de alcohol y el ACE; los resultados son dispares, heterogéneos e involucran un número reducido de pacientes. La mayor parte de estos estudios no encuentra relación o incluso, proponen que el vino tinto tiene cierto papel protector [219-229]. Recientemente se ha realizado un meta-análisis que concluye que, en base a la evidencia epidemiológica con la que contamos hasta el momento, el consumo de alcohol no representa un factor de riesgo en la malignización y progresión del EB. También se concluye que se necesitan mayores y mejores estudios, con mayor tamaño muestral, mejor control de los factores de confusión así como mayores tiempos de seguimiento para obtener conclusiones más definitivas [230]. 2.3.3.4 Tabaco En contraste con lo se sabe sobre el tabaco como FR para el desarrollo de carcinoma escamoso de esófago, su papel en el ACE es contradictorio. Existen estudios que no encuentran ninguna asociación [227-229], y otros que le otorgan un riesgo hasta 3.4 veces mayor [230]. Un estudio realizado en Australia demostró que los pacientes que fuman tienen un riesgo 2-3 veces mayor de EB y ACE. Sin embargo, este riesgo no era dosis dependiente [231]. Otros estudios, realizados con menor tamaño muestral, no han encontrado esta asociación [226]. Un estudio reciente, realizado con amplio tamaño muestral y con un seguimiento de 12 años encontró que el tabaco era una FR para progresión del EB hacia ACE. El riesgo se incrementa 2 veces para el desarrollo de displasia de alto grado y ACE (HR 2.03, IC 95% 1.29-3.17) [232]. Este riesgo es independiente de la cantidad de tabaco inhalado. De ahí que se deba insistir sobre el cese del consumo de tabaco en la población en general, con especial importancia en los pacientes con EB. 55 2. INTRODUCCIÓN 2.3.3.5 Nivel socioeconómico No existe evidencia clara que asocie el nivel socioeconómico y el riesgo de progresión del EB. Mientras que unos estudios sugieren que un nivel elevado implica mayor riesgo, otros estudios encuentran lo contrario [81]. 2.3.3.6 Inhibidores de la COX-2 Dado el rol del ácido araquidónico (AA) en la vía de la progresión neoplásica, su inhibición farmacológica podría modificar la historia natural del EB. Varios estudios han intentado investigar el papel protector de la aspirina y de los anti-inflamatorios no esteroideos (AINE´s) en la progresión del EB hacia ACE. Un meta-análisis demostró el papel protector (OR 0.67) de estos medicamentos, tanto usados de forma esporádica como continuada. La aspirina confería el mayor efecto protector respecto a los AINE´s [246]. Sin embargo, otro estudio aleatorizado a la toma de celecoxib vs placebo en pacientes con EB, no compartió esta observación [233]. Y así, la evidencia con que contamos hasta el momento, sigue siendo heterogénea. Mientras que un estudio retrospectivo realizado en Reino Unido con más de 3683 pacientes-año no demostró un efecto protector de la aspirina frente a la malignización del EB [234], otro estudio, también retrospectivo desde 1996 al 2010 y que incluyó 2932 pacientes con cáncer aerodigestivo superior, demostró que la aspirina, los AINE´s y los inhibidores de la COX-2 otorgaban un papel protector frente al desarrollo de neoplasias, al ser comparados con controles sanos [235]. Dada la información contradictoria con que contamos hasta la fecha, se puede decir que el uso de aspirina y otros AINE´s/inhibidores de la COX-2, podrían ser usados de forma empírica, no sólo por su efecto antineoplásico sino por, y sobre todo, su beneficio cardiovascular; previa valoración riesgo/beneficio en cada caso en particular. Quizás el estudio AspECT brinde mayor información, una vez sea concluido. 56 2. INTRODUCCIÓN 2.4 Aspectos histopatológicos del Esófago de Barrett. Según la clasificación actualmente aceptada [236], el EB puede incluir diferentes términos histológicos: 2.4.1 Negativo para Displasia El diagnóstico “negativo para displasia” se aplica a aquellos casos en que se observa epitelio columnar metaplásico con cambios regenerativos. Desafortunadamente, en ocasiones, los cambios regenerativos epiteliales son extremos, en especial en la mucosa adyacente a la unión escamo-columnar o en aquellos casos con inflamación y/o ulceraciones activas. En general, el EB “negativo para displasia” muestra características histológicas regenerativas junto con conservación de la arquitectura críptica. En general, el pleomorfismo nuclear, la pérdida de la polaridad celular y un marcado incremento del cociente Núcleo/Citoplasma (N/C) son marcadores de displasia y no de regeneración celular. Sin embargo, el epitelio recién formado sobre una úlcera puede mostrar un incremento en el índice N/C, hipercromaticidad y leve disminución de la polaridad además de ligero pleomorfismo. En este sentido, las crestas sobre la superficie celular son la norma, lo cual nos ayuda a interpretar la benignidad del epitelio. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en la displasia, las células caliciformes, tanto normales como distróficas, son bastante comunes. La mucina citoplasmática puede estar disminuida, en especial en áreas de inflamación, pero incluso en estas circunstancias, las células críticas usualmente muestran las células muestra un incremento progresivo en la cantidad de mucina a medida que nos aproximamos a la superficie epitelial. Estas características, la preservación del índice N/C y la disminución en el grado de estratificación nuclear en los niveles superiores de las criptas y en el epitelio superficial, representan las características distintivas de la “maduración” superficial, que es la característica más importante en lo que respecta al diagnóstico de EB sin displasia. En general, cambios nucleares y citoplasmáticos 57 2. INTRODUCCIÓN aunados a estratificación, son más frecuentes en superficies ulcerosas o inflamadas. Sin embargo, en estas circunstancias, y en contraste con respecto a lo que ocurre en la displasia, el grado de atipia en relación con cambios regenerativos usualmente se disipa gradualmente a lo largo de la mucosa conforme nos alejamos del proceso inflamatorio/ulceroso; esto representa una ayuda a la hora de distinguir “atipia” de “displasia”. (Figura 2.3) Fig 2.3. (A). Metaplasia intestinal en EB con cambios regenerativos moderados. Se observa un leve grado de distorsión críptica, situación normal en el EB; los núcleos son normales. (B). Fotografía de alta resolución que muestra los cambios regenerativos en la unión escamo-columnar del EB. (C). Se observa un área de regeneración extrema próxima a una zona ulcerosa. Se observan células atípicas en el epitelio que recubre la úlcera. La biopsia, tras tratamiento, a los 6 meses, no mostró displasia. (Odze RD, J Clin Pathol. 2006) 64 2. INTRODUCCIÓN Fig 2.7. (A) Displasia de alto grado no adenomatosa en EB. En contraste con la variedad adenomatosa, las células neoplásicas muestran un fenotipo levemente columnar o cuboidal, núcleos altamente irregulares con marcado incremento del cociente N/C además de marcada disminución de la polaridad celular. (B) Un mayor aumento de otra área del mismo paciente muestra el patrón “espalda con espalda” además de un claro aspecto cuboidal, con aumento del cociente N/C, nucléolos prominentes y pérdida de la polaridad celular. (Odze RD, J Clin Pathol. 2006) 65 2. INTRODUCCIÓN 2.4.3 Problemas actuales en la interpretación de las lesiones en el EB 2.4.3.1 Proceso regenerativo vs displasia de bajo grado Como se ha comentado anteriormente, a la fecha existen estudios contradictorios respecto al papel que juega la DBG en la morbimortalidad de los pacientes con EB. Desafortunadamente, si tomamos en cuenta que los cambios que sigue el EB hacia la displasia pueden ser muy sutiles y que las alteraciones histológicas producto de la inflamación y reparación tisular pueden ser muchas y de muy variada presentación, es de entender la amplia variabilidad intra e inter-observador a la hora de interpretar las muestras, en especial cuando la displasia puede ser muy incipiente. Esta dificultad afecta incluso a patólogos expertos. El mayor nivel de variabilidad ocurre al intentar separar aquellos pacientes con importante actividad regenerativa de aquellos con DBG, ante esta dificultad a menudo se recurre a un diagnóstico “indefinido para displasia”. En uno de los estudios más importantes sobre EB que se han publicado hasta la fecha [237], se reunió a un grupo de 8 patólogos expertos en enfermedades del tracto gastrointestinal, los resultados fueron que, en el diagnóstico de “negativo para displasia” vs “indefinido para displasia” vs DBG, el nivel de coincidencia era del 0.6, es decir, el diagnóstico sólo era coincidente en un 60% de los casos, este resultado sólo fue levemente mejorado en otro trabajo [238] al intentar separar los casos “negativos para displasia” de aquellos con DBG. Estos autores encontraron especial dificultad a la hora de evaluar lesiones en el espectro más bajo de la displasia, por ejemplo, los valores de kappa (porcentaje de acuerdo entre observadores) fueron de 0.32 (razonable) y 0.15 (escaso) en el diagnóstico de de DBG e indefinido para displasia, respectivamente. Quizá el término de “indefinido para displasia” debería utilizarse, según varios autores [236], en las siguientes circunstancias: 66 2. INTRODUCCIÓN  Debido a dificultades técnicas  Atipia relacionada con inflamación y ulceración; y  Cambios celulares “sugestivos de displasia” que afecten únicamente las bases de las criptas, con evidencia de maduración de la superficie epitelial. Las biopsias obtenidas de manera tangencial, sometidas a quemaduras o carentes de superficie epitelial, hacen que la valoración de la displasia sea un asunto prácticamente imposible (Figura 2.8). Fig 2.8. Vista de alta potencia que muestra un área considerada indefinida para displasia. Aunque las criptas muestras algunas características compatibles con DBG, la ausencia de la superficie epitelial hace que la evaluación de la maduración superficial sea imposible. (Odze RD, J Clin Pathol. 2006) 67 2. INTRODUCCIÓN De esta forma se entiende que las evaluaciones histopatológicas resulten muchas veces complejas y no exentas de equivocaciones a la hora de su interpretación. Un estudio que sometió a reevaluación, por patólogos expertos, muestras con diagnóstico de DBG y DAG realizadas por patólogos generales, terminó por “desescalar” el grado histológico de 64 de los 71 casos de DBG y de 11 de los 23 con DAG. De hecho, el 46% de estas desescaladas fueron realizadas en base a que las muestras de tejido no reunían las características mínimas para ser evaluadas en este aspecto [239]. Las biopsias tangenciales, que carecen de criptas bien orientadas y superficie epitelial pueden ser difíciles de evaluar para la presencia o ausencia de maduración en la superficie, parámetro muy importante a la hora de decidir si los cambios observados se corresponden a cambios regenerativos o displásicos. El epitelio regenerativo, en especial en los casos de inflamación activa o procesos ulcerosos, pueden, en ocasiones, presentar una considerable atipia celular que llega a ser incluso tan marcada que nos podría hacer pensar en DBG o incluso en DAG. En biopsias que conserven una arquitectura relativamente normal, la ausencia de una transición brusca entre el epitelio típico y atípico, la presencia de maduración en la superficie, combinado con la ausencia de pleomorfismo nuclear, mitosis atípicas y perdida de la polaridad celular, son características que nos ayudan a distinguir los procesos inflamatorios de la displasia. En este escenario, parece lógico considerar que estos pacientes “indefinidos para displasia” deban mantener un seguimiento clínico así como repetir el estudio anatomopatológico de muestras obtenidas tras un tratamiento antirreflujo agresivo, a fin de evitar sesgos en la interpretación de los estudios producto de procesos inflamatorios agudos o crónicos. Como se ha mencionado antes, los cambios “atípicos” producto de procesos regenerativos, suelen ser más marcados a nivel de la unión escamo-columnar, zona que, por su situación anatómica, se encuentra sometida a mayor recambio celular como consecuencia del proceso normal lesiónreparación. Por este motivo, debemos insistir en la importancia de evaluar 68 2. INTRODUCCIÓN detalladamente las muestras obtenidas de esta zona anatómica, a fin de evitar caer en un error al sobreestimar el grado de lesión tisular interpretando como “displásicas” zonas que, en su contexto, pueden ser normales. La evaluación de la displasia, por tanto, implica valoraciones subjetivas por diversos autores. Resulta habitual, entre los patólogos digestivos [237,116, 240] diagnosticar como displásicas, independientemente del grado, aquellas lesiones que involucran a la totalidad de la cripta y la superficie epitelial en ausencia de maduración superficial. Sin embargo, otras observaciones [241] han dejado patente que puede existir displasia que afecte sólo a la base de la cripta, con relativa preservación de zonas más apicales y superficie epitelial. En este estudio, los autores estudian un grupo de pacientes (15) que muestran cambios histológicos sugestivos de displasia en la base de las criptas, sin embargo, conservan la propiedad de maduración superficial y que son sometidos a diversas técnicas inmunohistoquímicas y moleculares (p53, cuantificación de 9pLOH, 17pLOH y aneuploidia). Los autores encuentran evidencia suficiente como para concluir que “los cambios en estos pacientes son muy sugestivos de displasia, pese a que conservan la capacidad de maduración superficial (Figura 2.9). 69 2. INTRODUCCIÓN Fig. 2.9. Vista de potencia media (A) y alta (B) que muestra una zona que combina cambios sugestivos de displasia críptica basal con maduración superficial. En esta toma, la parte basal de la cripta muestra células que impresionan de displásicas (alargamiento nuclear, estratificación y pérdida de la polaridad). Se observan también algunas zonas de mitosis. La parte superficial de las criptas muestra, sin embargo, un proceso de maduración del epitelio, caracterizado por disminución progresiva del tamaño del núcleo, de la estratificación así como adquisición progresiva de mucina citoplasmática a medida que nos aproximamos a la superficie mucosa. (Odze RD, J Clin Pathol. 2006) 70 2. INTRODUCCIÓN La siguiente figura representa un algoritmo que podría resultar útil a la hora de evaluar aquellas lesiones difíciles de interpretar (Figura 2.10) Fig. 2.10. Algoritmo para el abordaje diagnóstico en casos de EB con atipia epitelial. (Odze RD, J Clin Pathol. 2006). 2.4.3.2 Displasia de bajo grado vs displasia de alto grado Como se ha comentado anteriormente, la principal diferencia entre la DAG respecto a la DBG radica en el grado de desestructuración de la arquitectura normal así como de las alteraciones celulares observadas. Desafortunadamente, a medida que los cambios histológicos avanzan realmente no existe ningún punto de corte que nos haga definir, tajantemente, si estos cambios se corresponden con DBG o DAG. En general, la tipificación de la displasia se realiza tomando en cuenta el mayor grado de atipia observada en la muestra. Sin embargo, el número de criptas que deben estar afectadas, para hacer una valoración global de DAG representa un tema que, hasta la fecha, no está aclarado. Sí es de destacar que en el artículo publicado y que, hasta la fecha, sirve 71 2. INTRODUCCIÓN de patrón de referencia a la hora de clasificar la displasia [112] hacen mención a que “no parece prudente clasificar con DAG la presencia de afectación de un o dos criptas”. Estudios recientes hacen mención al beneficio que supone valorar la extensión de la DAG en el riesgo de progresión hacia ACE. De esta forma, se ha observado que aquellos pacientes que presentan mayor cantidad de criptas afectas (5.8 vs 2.6), presentaban un riesgo mucho mayor de progresión hacia ACE [242]. Esta observación ha sido también corroborada por otro estudio; en este, la supervivencia de los pacientes con “focos de DAG” era significativamente mayor respecto a aquellos pacientes con “DAG difusa” [243]. 2.4.3.3 DAG vs adenocarcinoma intramucoso. La distinción entre estas dos entidades no sólo entraña, al igual que en las situaciones previas, algunas dificultades en su interpretación, sino que estas dificultades son trascendentales en el manejo clínico de estos pacientes (Figura 2.11) Fig 2.11. EB con DAG y un área focal sugestiva de adenocarcinoma intramucoso. En el centro del campo se observa una zona con proliferación de pequeñas glándulas en un patrón “espalda con espalda”, existe una leve afectación de la lámina propria que es difícil de explicar por la afectación de criptas previas. También se observa la presencia de una célula aislada en el interior de la lámina propria. 72 2. INTRODUCCIÓN Dado que existen vasos linfáticos en la lámina propia de la mucosa esofágica, la posibilidad de metástasis ganglionares en pacientes con tumores limitados al compartimiento mucoso es entre 5-8% [244], de ahí que muchos de estos pacientes, hasta la fecha, prefieran ser manejados de formas más agresivas mediante cirugía [245- 246]. Diversos estudios han intentado evaluar las alteraciones histológicas más relevantes que nos permitan diferenciar la DAG del carcinoma intramucoso; sin embargo, si algo ha quedado claro, es que, con mucha frecuencia, se tiende a sobrecalificar los casos como carcinomas intramucosos en lugar de DAG. En uno de estos estudios, la concordancia inter-observador a la hora de evaluar estas dos entidades, comparando un patólogo general y dos especializados en patología digestiva, obtuvo un valor de kappa de tan solo 0.42 (escaso). En este estudio, la mayor diferencia se relaciona con el hecho de sobre-estadificar los hallazgos observados, en especial cuando las muestras son evaluadas por el patólogo general [244]. Hasta ahora, lo que sí parece razonable, es clasificar como carcinoma intramucoso una muestra obtenida con una adecuada técnica (evitando muestras tangenciales) adecuada en cantidad y localización y que muestre las siguientes particularidades:  Células aisladas o en pequeños racimos, localizadas en la lámina propria, que muestren un patrón de distribución “espalda con espalda”.  Glándula de aspecto completo o “cribiforme”, con evidencia de expansión de la lámina propria y distorsión de las criptas que la rodean.  Presencia de células neoplásicas o glándulas con patrón “espalda con espalda” con importante afectación de la arquitectura glandular normal; que no pueda ser explicada por una presencia previa de glándulas de Barrett. 73 2. INTRODUCCIÓN La presencia de necrosis o desmoplasia, aunque muy ligadas a la presencia de un adenocarcinoma, suelen ser entidades muy poco frecuentes en carcinomas limitados a la mucosa e incluso en aquellos con patrón submucoso invasivo [244]. En cualquier caso, de existir dudas diagnósticas, parece razonable seguir muy de cerca a estos pacientes con control endoscópico estrecho a fin de detectar aquellos cambios histológicos más claramente interpretables. 2.4.3.4 Carcinoma intramucoso vs submucoso En ocasiones, las glándulas displásicas se localizan en la muscularis mucosae. En estos casos, la dificultad radica en el hecho de saber diferenciar si los cambios observados corresponden a un verdadero adenocarcinoma intramucoso invasivo o a la localización ectópica de una glándula sin patrón invasivo (Figura 2.12). El no sobreinterpretar los hallazgos observados resulta fundamental, en especial si las glándulas presentan una estructura más no menos normal o sólo cambios compatibles con DBG y las criptas se encuentran relativamente preservadas. Otro factor añadido, y que supone una dificultad más en la interpretación de estas muestras, es que los pacientes con EB a menudo desarrollan una capa de muscularis mucosae “falsa” en el sentido del origen histológico, el encontrar glándulas en su interior siembra dudas sobre si interpretar los resultados como adenocarcinoma intramucoso o submucoso. Sin embargo, parece que la supervivencia, tanto si invaden la “falsa” muscularis mucosae como la “verdadera”, no parece verse afectada. En este estudio [247], cuando la invasión afectaba a la “falsa” muscularis, sólo existía afectación linfática en el 1% de los casos respecto al 44% cuando afectaba la porción media o profunda de la “verdadera” submucosa. De esto se deduce, que los tumores localizados en este espacio, entre submucosa “falsa” y “verdadera”, invaden la lamina propria y 80 2. INTRODUCCIÓN Expresión en la membrana celular La coloración de la membrana puede presentarse en diferentes circunstancias (Figura 2.14). Fig 2.14. Inmunomarcación de membrana: CD31 en células plasmáticas reactivas. E-caderina en carcinoma mamario ductal infiltrante. CD 177 en el seminoma clásico. CD 138 en el mieloma de células plasmáticas. Distrofina, marcación submembranal en músculo esquelético. EMA membrana y acentuación paranuclear en linfoma anaplásico de células grandes. CD 15 positivo granular en región paranuclear. CD 30 células de Reed-Sternberg con marcación membranosa y paranuclear. 1) Antígenos localizados en la membrana celular  Moléculas de adhesión celular como: caderinas, moléculas plaquetarias de adhesión endotelial (PECAM), moléculas de adhesión celular neural (N-CAM), moléculas de adhesión celular epitelial (Ep-CAM).  Proteínas y receptores de la superficie celular o transmembranosas, como el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), Her2/neu (c-erbB-2), CD117 (c-kit), 81 2. INTRODUCCIÓN CD31, CD34, algunos antígenos leucocitarios (CD20, CD3, CD43, CD138), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR) y la proteína latente de membrana del virus de Epstein-Barr (LMP1). 2) Moléculas con patrón membranoso. Se obtiene este patrón debido a que los anticuerpos se unen a proteínas de membrana y con el citoesqueleto subyacente, como la β-catenina (en células epiteliales), la distrofina (en células musculares) y la espectrina (en eritrocitos). Estas proteínas muestran inmunorreactividad de membrana por su localización lineal a lo largo de la interfase membrana-citoplasma [261]. Algunos anticuerpos dirigidos contra antígenos de las membranas suelen producir marcación perimetral, que puede estar acompañada de acentuación citoplásmica para-nuclear (aparato de Golgi) como el CD30, CD15, el LMP-1 y el EMA (este último en casos de linfoma anaplásico de células grandes). Esto se debe a que el aparato de Golgi es el sitio donde se agregan los carbohidratos a las proteínas antes de ser transportadas hacia la superficie celular (Figura 2.14). En ocasiones, la marcación es exclusivamente en el aparato de Golgi, cuando la densidad de las moléculas en la superficie celular es muy baja para su detección inmunohistoquímica, como puede verse con el CD15 (LeuM1), como en algunos casos de linfoma de Hodgkin clásico (figura 2); la fascina tiene marcación membranosa y citoplásmica [261]. La polarización normal de las células epiteliales hace que algunos antígenos de la membrana muestren marcación restringida o predominante en su superficie apical, como puede verse con el antígeno de membrana epitelial, el antígeno carcinoembrionario, la villina o en las superficies baso-laterales, como cuando se utiliza E-caderina, β-catenina, o Ep-cam (figura 3). Este es el patrón de marcación “polarizado” de algunos antígenos en células normales y puede reemplazarse por marcación perimetral en neoplasias malignas debido a los trastornos en la polaridad celular que ocurren en las células neoplásicas El carcinoma mucinoso es un ejemplo de polaridad 82 2. INTRODUCCIÓN alterada. Esta variante de carcinoma mamario mucinoso podría ser una forma de carcinoma in situ en donde la mucina, en lugar de ser secretada hacia la superficie apical celular, por medio de un mecanismo de “inversión de la polaridad”, produce secreción hacia el estroma, lo que conlleva el desprendimiento del epitelio de su estroma subyacente. De esta forma, la mucina “invade” el estroma y separa a las células de su membrana basal. Lo anterior no sólo explica el excelente pronóstico del carcinoma mucinoso de la mama sino, además, el hecho de que casi la mayor parte del moco es extracelular.21 En el carcinoma mucinoso la expresión de algunos inmunorreactantes, como el antígeno de membrana epitelial y el antígeno carcinoembrionario predominan hacia la superficie basal, lo que traduce esta “inversión de la polaridad” (Figura 2.15) [274-279] Fig 2.15. Inmunomarcación con antígeno carcinoembrionario (CEA). A) Carcinoma hepatocelular. Nótese la polarización de la inmunorreacción hacia la superficie apical de las células (flechas). B) Carcinoma mucinoso de la glándula mamaria. La positividad CEA exhibe acentuación en la parte adluminal (flechas). Los siguientes tres ejemplos de inmunorreacción membranosa tienen relevancia clínica bajo ciertas circunstancias: 1) La expresión membranosa del Her-2/neu tiene implicaciones pronosticas. Existe correlación directa entre la expresión de HER-2/neu y la resistencia a citoxano/metotrexato y tamoxifeno. Con tecnología recombinante se desarrolló un anticuerpo monoclonal contra HER-2/neu, conocido como traztuzumab 83 2. INTRODUCCIÓN (huMAB HER-2, Herceptin®) que inhibe al HER- 2/neu y, a su vez, bloquea el crecimiento de la célula neoplásica. Por inmunohistoquímica utilizando HercepTest (DAKO Corporation®), o con cerbB2/CB11 se puede determinar si hay expresión de Her2/neu. La interpretación se hace mediante una escala que va de 0 a 3 (marcación de membrana) con equivalencia con la sobreexpresión génica. Cuando las células tienen menos de 20,000 receptores no muestran inmunomarcación (negativo, 0); si tienen cerca de 100,000 receptores muestran inmunomarcación parcial, leve o moderada de la membrana con menos de 10% de las células con marcación completa en la membrana (positivo, 1+); cuando tienen 500,000 receptores muestran inmunomarcación en la membrana en más de 10% de las células (positivo, 2+), y si tienen aproximadamente 2’300,000 receptores muestran inmunomarcación completa de la membrana en más del 10% de las células (positivo, 3+). Cuando se realiza inmunohistoquímica estandarizada en tejidos bien fijados y procesados hay una excelente correlación entre el número de genes amplificados y la expresión proteica membranosa [280-298]. Otro marcador de membrana con implicaciones pronosticas es el factor de crecimiento epidérmico que normalmente se expresa en los estratos basal y supra basal de los epitelios escamosos estratificados y se sobreexpresa en varios carcinomas, por incremento en el número de copias génicas.23 El anti- EGFR (Gefitinib ®, Cetuximab®) se utiliza en el tratamiento de carcinomas del pulmón, carcinomas de la cabeza y el cuello, y otros tipos de tumores. La evaluación inmunohistoquímica del anti-EGFR es membranosa y, de manera similar al Her2/neu, existe una forma de evaluar la sobreexpresión del factor de crecimiento epidérmico: multiplicando la extensión e intensidad de la positividad de la marcación (0,1, 2, 3) [299-313]. 84 2. INTRODUCCIÓN 2) Los antígenos leucocitarios, que incluyen CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5, CD-7, CD-8, CD-19, CD-20, CD-43 y CD-45, CD133, son receptores de la superficie celular o ligandos involucrados en el reconocimiento, interacción, adhesión y transducción celular de señales o interacción con proteínas solublesglicoproteínas y matriz extracelular. La marcación inmunohistoquímica para estos antígenos produce un patrón perimetral de membrana debido a la distribución uniforme de estos antígenos en la superficie celular. La expresión de membrana en los linfocitos neoplásicos puede ser el blanco de anticuerpos terapéuticos. El más utilizado en el tratamiento de linfomas de células B y linfoma de Hodgkin de predominio linfocítico nodular es el anticuerpo anti-CD- 20/rituximab (Mabthera®). Se han estudiado otros anticuerpos como el Blinatumomab®, Polatuzumab® y Bortezomib®, con resultados esperanzadores [314-317]. Rituximab es un anticuerpo monoclonal quimérico murino-humano que se une específicamente al CD20 y establece funciones para mediar la lisis de las células B. Otro anticuerpo del que recientemente puede disponerse es el Campath-1H (Alentuzumab®) y los anticuerpos Ofatumumab®, Obinutuzumab®. Este anticuerpo está dirigido contra el CD52, que es una proteína que se encuentra en la membrana de los linfocitos B, y que se ha utilizado en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica [318-325]. 3) El CD117 (c-kit) es una proteína transmembranosa de 145 KDa que funciona como receptor de la tirosina cinasa. El gen c-kit se localiza en el cromosoma 4 (4q11-12) próximo al gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). El CD117 es un epítopo localizado en el dominio extracelular del receptor y es estructuralmente similar a otros receptores con actividad de tirosina cinasa, como el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRs), y el factor estimulante de colonias (CSF1R) entre otros. El c-kit, 85 2. INTRODUCCIÓN normalmente, se expresa en las células hematopoyéticas progenitoras, células cebadas (mastocitos), células germinales, melanocitos y células intersticiales de Cajal. La mutación da como resultado la activación constitutiva del c-kit, que participa en la patogénesis de los tumores del estroma gastrointestinal y representa uno de los mayores criterios diagnósticos para estos tumores. La demostración inmunohistoquímica de CD117 no sólo contribuye al diagnóstico de los GIST, sino en la selección de los pacientes que pueden beneficiarse con el tratamiento con el inhibidor del receptor de tirosina cinasa STI571 (Gleevec ®). Existen algunos informes de la expresión de CD117 en sarcomas de células claras, tumores desmoides intra-abdominales, angiomiolipomas, y otros tumores de partes blandas. Por las características biológicas del c-kit, que es un receptor transmembranoso, la inmunomarcación debe ser predominantemente de la membrana celular o citoplasmática con acentuación de la primera [326-343]. Expresión nuclear Existen diversos anticuerpos dirigidos contra las proteínas o enzimas nucleares. La mayor parte de los antígenos nucleares incluye a proteínas asociadas al ciclo celular, proteínas reparadoras de genes, enzimas nucleares, factores de trascripción, productos de genes supresores tumorales, receptores de hormonas esteroides, proteínas ligadoras de calcio, y algunas proteínas virales nucleares (cuadro 1 y figura 4). La decoración nuclear puede ser homogénea granular, como: TdT, bcl-6, p63 y los receptores de estrógenos, progesterona y andrógenos; con patrón moteado, como lo expresa del antígeno nuclear latente del Herpes virus humano 8, o granular fino con acentuación nucleolar como el Ki-67 (MIB-1), telomerasa, nucleofosmina o transductinlike enhancer of split 1 TLE-1 (Figura 2.16). El WT1, por sus siglas en inglés [resultado de la translocación recíproca t (11;22) (p13;q11) o (p13;q12)], es un marcador nuclear 86 2. INTRODUCCIÓN que se encuentra en el tumor de Wilms, tumor desmoplásico intra-abdominal y tumores serosos del ovario; sin embargo, en algunos otros tumores puede haber positividad citoplásmica [344-355]. Fig 2.16. Inmunomarcación nuclear. TdT en un linfoma linfoblástico, TLE1 en sarcoma sinovial, p63 células mioepiteliales de la glándula mamaria. Receptores de estrógenos en carcinoma mamario ductal, WT1 en tumor seroso de ovario, Ki67 en linfoma B difuso de células grandes. El Pax-5 y Oct2 son marcadores de expresión nuclear intensa en linfocitos B y contribuyen al diagnóstico de linfoma de Hodgkin clásico y al de predominio linfocítico. La familia de transcriptores nucleares Pax está compuesta por nueve miembros que funcionan durante la embriogénesis y regulan la diferenciación celular. El Pax 5 (localizado en el cromosoma 9p13) codifica a una proteína de línea específica de linfocitos B (B-cell specific activator protein/BSAP) que se expresa en células precursoras B (pro-B y pre-B) y linfocitos maduros. La expresión débil granular nuclear en las células de Reed-Sternberg es de utilidad en el diagnóstico inmunohistoquímico 87 2. INTRODUCCIÓN del linfoma de Hodgkin clásico. El Oct2 es un factor de trascripción nuclear de células B que se une específicamente al octámero (5’ATTGCAT- 3’) y regula la activación de la expresión génica de inmunoglobulinas en conjunto con la coactivación de BOB-1. El Oct2 se expresa en la mayor parte de los núcleos de los linfocitos B y en casi todos los linfomas B. El Oct2 es positivo en los núcleos de las células L y H (en palomita de maíz) del linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular y es negativo hasta en 75% de las células de Reed-Sternberg del linfoma de Hodgkin clásico (Figura 2.17). En algunos anticuerpos la marcación nuclear puede estar acompañada de positividad citoplasmática variable, quizá relacionada con la difusión de moléculas o localización parcial de las moléculas en el citoplasma, como la proteína S-100, la calretinina, y el Alk-1 (este último en algunas circunstancias produce marcación simultánea del núcleo y el citoplasma, vide infra) [356-368]. Fig 2.17. Inmunomarcación con Oct-2. A) Linfoma de Hodgkin de predominio linfocítico nodular. Inmunomarcación nuclear en células L y H. B) Linfoma de Hodgkin clásico (esclerosis nodular). Nótese que la célula de Reed-Stermberg (centro) es negativa, mientras que los linfocitos B pequeños reactivos muestran positividad nuclear. 88 2. INTRODUCCIÓN Expresión citoplasmática El citoplasma contiene diversos orgánulos y una red de estructuras que forman el citoesqueleto (microfilamentos, filamentos intermedios y microtúbulos) responsable de la forma, rigidez, transporte intracelular y de la movilidad celular. Los antígenos citoplasmáticos muestran tres patrones de tinción: a) granular, b) difuso, y c) fibrilar. a) Patrón citoplásmico granular. La decoración citoplásmica granular identifica los antígenos que se localizan en los orgánulos, como: anticuerpos anti-mitocondriales, enzimas y proteínas lisozomales (CD68), gránulos citoplásmicos de los mastocitos (triptasa, CD117), gránulos citotóxicos (CD56, Tia-1), gránulos secretores neuroendocrinos (cromogranina, sinaptofisina, PGP 9.5), hormonas (prolactina, ACTH, hormona del crecimiento) y algunos microorganismos (Figura 2.18). La marcación puede parecer homogénea cuando la célula está “empaquetada” por dichos orgánulos o gránulos, pero en la observación detallada se podrán identificar gránulos en una proporción del citoplasma celular. Los gránulos citoplasmáticos pueden tener polarización celular particular, como los gránulos de las células neuroendocrinas del aparato gastrointestinal que se concentran en la base de la célula, que es el polo donde son vertidos hacia los vasos sanguíneos del estroma. Los gránulos de secreción exocrina o apócrina se localizan, predominantemente, por debajo del polo apical de las células (localización luminal). 89 2. INTRODUCCIÓN Fig 2.18. Inmunomarcación citoplásmica. A) Tumor de Warthin H y E. Antimitocondrias en el mismo tumor de Warthin de la figura A y en un caso de carcinoma mamario oncocítico. CD68 en macrófagos, prolactina en hipófisis normal, triptasa en mastocitoma cutáneo, Tia-1 en linfoma T/NK. b) Patrón citoplásmico fibrilar. El esqueleto celular está compuesto por filamentos: pequeños (actina), grandes (microtúbulos) e intermedios (citoqueratina, vimentina, desmina, proteína fibrilar ácida glial, neurofilamentos, nestina, periferina, internexina y lamininas nucleares). Las fibras del citoesqueleto forman una malla que se extiende desde la membrana nuclear hasta la membrana celular, por lo que la inmunomarcación de estas proteínas exhibe de forma característica un patrón fibrilar, frecuentemente con acentuación submembranosa debido al “revestimiento” laminar que estas fibras tienen por debajo de la membrana celular y simulan el patrón de marcación de membrana. Con diversos anticuerpos en los carcinomas de células pequeñas (queratinas), carcinomas de células de Merkel (CK 20, 96 2. INTRODUCCIÓN negativo al Bcl-2 mientras que el linfoma difuso puede expresar Bcl-2 hasta en 30% de los casos [419-426]. 3) BCL-10. El Bcl-10 es una proteína adaptadora, con una unión a caspasa (caspase recriutment domain/ CARD) que promueve la apoptosis y activa la pro-caspasa 9 y NF-kB, descrita por primera vez en los linfomas B tipo MALT. Lo normal es que Bcl-10 se exprese en el citoplasma de linfocitos B localizados en centros germinales y en la zona marginal. La expresión nuclear de BCL-10 se manifiesta en un grupo de linfomas B de la zona marginal, extraganglionar (linfomas MALT) con translocación t(1;14)(p22;q32) o t(11;18)(q21;q21). Puede haber inmunomarcación citoplásmica en casos de LZM con t(14;18) que afectan el gen MART1.57,58 Los casos de LZM con marcación nuclear positiva tienen menor edad de presentación (51.4), mayor predominio del sexo masculino (19/14) y predilección por la localización pulmonar y del aparato digestivo, comparados con los casos con solo marcación citoplasmática (como en los linfomas MALT tiroideos). En los casos originados en el aparato digestivo existe correlación entre el porcentaje de tumores Bcl-10 positivos y el grado de invasión de la neoplasia. Fueron positivos al Bcl-10 36.4% de los tumores confinados a la mucosa y en 100 % de los casos de los tumores con extensión mas allá de la serosa. Además de su reconocida expresión en linfomas B tipo MALT, la expresión de Bcl-10 puede presentarse en algunos casos de linfomas linfoplasmocíticos (macroglobulinemia de Waldenstrom, 55%), todos con positividad nuclear. En general, este último grupo de linfomas muestra mayor índice de afección de la médula ósea, pero no existe correlación entre la 97 2. INTRODUCCIÓN positividad al anticuerpo y las concentraciones séricas de paraproteína IgM de cadenas ligeras o variables clínicas [427-436]. 2.4.4.1.3 Antígenos extracelulares a) Osteocalcina Existen diversas proteínas que intervienen en el proceso de mineralización, que al identificarlas mediante inmunohistoquímica son de importancia diagnóstica en los tumores óseos. La osteocalcina es una de las principales proteínas intraóseas, de función poco precisa, que predominantemente se localiza en el citoplasma de los osteoblastos. Es una molécula de peso aproximado de 5.8 KDa compuesta por 49 aminoácidos que incluyen tres residuos ácido gammacarboxilglutámico (gla). Después de su producción por los osteoblastos, la osteocalcina se incorpora a la matriz ósea y una fracción se libera a la circulación y puede medirse como parámetro bioquímico del metabolismo óseo. La osteocalcina se sobreexpresa en presencia de análogos de la vitamina D, como la 1,25dihidroxivitamina D2 y la 24-epi-1,25dihidroxivitamina D2, en el paso final de la diferenciación osteoblástica y en la formación de osteoide. Está demostrado que algunos fibroblastos pueden expresar epítopes que pueden producir reacciones cruzadas cuando se utilizan anticuerpos policlonales anti-osteocalcina, por lo que para un diagnóstico específico se requieren anticuerpos monoclonales con reconocimiento selectivo de péptidos. En la detección de tumores formadores de hueso, la osteocalcina tiene 70% de sensibilidad y 100% de especificidad, comparada con 90% de sensibilidad y 50% de especificidad informada con la osteonectina. Además, hay que considerar que la osteonectina puede ser positiva en el tumor de células gigantes, el condroblastoma, en células endoteliales y fibroblastos, por lo cual debe tenerse precaución en su interpretación [437-442]. 98 2. INTRODUCCIÓN b) Colágena tipo IV y laminina La colágena tipo IV es el principal componente estructural de la membrana basal. Los genes que codifican para la molécula de la colágena IV se localizan en el cromosoma13q. La colágena IV difiere de los otros tipos de colágena en su secuencia de aminoácidos, pues no forma fibras y su estructura helicoidal se interrumpe. La laminina y la enactina-nidogen son otros de los componentes de la membrana basal que se une a los glucosaminoglicanos: actúan como puente para la unión de la colágena tipo IV de la membrana basal con la matriz adyacente. Además, la colágena IV forma el sustrato para el crecimiento de algunas células endoteliales, musculares y de nervios periféricos y participa en la interacción intercelular. Quizá la alteración estructural de la colágena IV contribuya a diversas alteraciones en la morfología celular [443-451]. Los anticuerpos contra colágena IV son útiles para evaluar la integridad de las membranas en células normales, así como la ausencia de ésta en carcinomas. La adenosis esclerosante y la microglandular de la glándula mamaria tienen una membrana basal bien desarrollada que puede ser resaltada por medio de inmunomarcación con colágena IV. Lo anterior y la existencia de células mioepiteliales evidenciadas por medio de la actina (p63 o CD10) favorecen el proceso reactivo sobre un carcinoma. Para distinguir la pseudoinvasión provocada por cortes tangenciales en un pólipo adenomatoso de un verdadero adenocarcinoma infiltrante puede utilizarse colágena IV (vide infra). Un ejemplo de la utilidad de la colágena IV en sarcomas es el diagnóstico diferencial histológico entre histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma y tumor maligno de vaina nerviosa periférica. La existencia de colágena IV o laminina favorece el tumor maligno de vaina nerviosa periférica, cuando la P-S100 y el CD57 (marcadores de tumor maligno de vaina nerviosa periférica) son negativos [452-457]. Con E-caderina y colágena tipo IV es posible evaluar el estado de las uniones intercelulares junto con la membrana basal. En el adenocarcinoma estos anticuerpos 99 2. INTRODUCCIÓN muestran marcación discontinua en 65% con E-caderina y 96% con colágena IV. Las glándulas en focos de pseudoinvasión muestran expresión membranosa intensa, difusa y continua con E-caderina y continua y bien delimitada en la membrana basal con colágena tipo IV [458-460]. c) Amiloide El término amiloide (amylum) lo acuñó en 1838 el botánico Matthias Schleiden para describir la apariencia del almidón en las plantas. En 1854 Rudolf Virchow empleó el término para designar a los cuerpos amiláceos del sistema nervioso debido a su reacción con tinciones de yodo. Virchow estaba convencido que los cuerpos amiláceos cerebrales podían considerarse idénticos al almidón de las plantas y aplicaba el término amiloide para las enfermedades llamadas “degeneración lardácea” o “ceroide de órganos”, como el hígado o el bazo [461]. La existencia de amiloide define un grupo de enfermedades con etiopatogenia diversa, cuyas características sobresalientes son: el depósito tisular de material proteináceo acelular, amorfo, eosinófilo y que muestra birrefringencia color verdemanzana con luz polarizada con la tinción de rojo Congo.67 El amiloide corresponde a diversos grupos de proteínas fibrilares no ramificadas que, por difracción de rayos X, orientan perpendicularmente al eje de la fibra a las cadenas de amiloide, en una especie de patrón de “plegamiento beta” (b fibrilosis). Un elemento más de ayuda para la identificación del material amorfo eosinófilo sospechoso como amiloide es la presencia de una molécula pentagonal de 25 KDa, llamada componente amiloide P, que es parte de todos los tipos de amiloide.69,70 Existen anticuerpos comerciales dirigidos en contra del componente P. En un estudio de 169 biopsias con amiloidosis, todas fueron positivas para el componente P.67 100 2. INTRODUCCIÓN Después de que se determina que el material amorfo es amiloide, el siguiente paso es la caracterización de la proteína amiloidogénica, pues el tratamiento médico es diferente, dependiendo de la causa subyacente a la producción de amiloide. Hasta el momento se han identificado más de 20 diferentes tipos de sustancias generadoras de amiloide. Los tipos más frecuentes de amiloidosis son los provocadas por: a)cadenas ligeras de inmunoglobulinas (AL/45%/ amiloidosis primaria), b) el amiloide AA (amiloidosis reactiva/AA-19%) y c) por transtiretina (ATTR-12%/ amiloide senil). Algunos otros tipos de substancias amiloidogénicas poco frecuentes son la β2-microglobulina, calcitonina, fibrinógeno, apolipoproteína AI, lisozima, queratoepitelina y lactoferrina. Para la caracterización de AL se utilizan anticuerpos contra las cadenas ligeras kappa y lambda de las inmunoglobulinas. El material casi siempre es positivo a uno de los dos inmunorreactantes. Desafortunadamente el AL deriva de las porciones variables de las cadenas ligeras κ o λ por lo cual cada paciente poseerá un tipo único de amiloide L, lo que disminuye las posibilidades de que un solo anticuerpo sea capaz de detectar todas las variantes. Aunado a esto, las proteínas amiloides, especialmente el tipo L, pueden precipitar otras proteínas séricas y provocar inmunomarcación positiva con más de un anticuerpo. Una dificultad más estriba en la coexistencia de dos o más proteínas amiloides en el mismo paciente (AL+Aβ2M, AL+ATTR, AA+Aβ2M). Por lo tanto, es importante identificar si existe restricción de cadenas ligeras en las células plasmáticas del tejido en estudio y correlacionarlas con los hallazgos clínicos del paciente [462-481]. 101 2. INTRODUCCIÓN 2.4.4.1.4 Consideraciones técnicas Factores que influyen en la inmunomarcación En la evaluación de las inmunomarcaciones son importantes dos elementos: 1) el factor preanalítico (intrínseco) y 2) el factor analítico (extrínseco) [482-486]. a. El factor pre-analítico se refiere a las características del tejido y su preservación antigénica. La conservación adecuada de las características antigénicas del tejido depende del tipo de fijador empleado, de la fijación adecuada, y del tiempo de la fijación. El formol buffer al 10% es el fijador más utilizado. El pH del formol tiene influencia directa en la conservación antigénica del tejido y la variación de este puede alterar la estructura proteica de los epítopes. Algunos procedimientos técnicos, como el sobrecalentamiento del tejido, la descalcificación y la congelación, también pueden afectar la preservación antigénica. b. Los factores analíticos (extrínsecos) son los elementos externos al tejido que pueden controlarse en el laboratorio de inmunohistoquímica e incluyen: el tipo de anticuerpo utilizado, la sensibilidad y dilución, el sistema de detección, los cromógenos empleados, el método de recuperación utilizado y la interpretación de la reacción por el patólogo. Falsos positivos por biotina endógena La biotina es una proteína que actúa como cofactor en la reacción de descarboxilación, es parte del complejo de la vitamina B, y se encuentra en células ricas en mitocondrias, como en las células de los túbulos contorneados proximales del riñón, los hepatocitos, las células apócrinas y las células de Hürthle de la tiroides. Durante la recuperación antigénica inducida por el calor (Heat induced antigen retrieval/ HIAR) puede incrementarse la actividad de la biotina endógena y la actividad tipo biotina 102 2. INTRODUCCIÓN (actividad de unión a avidina) y producir marcaciones falsas positivas cuando se utiliza un sistema de detección inmunohistoquímico tipo avidina-biotina. Estos falsos positivos se presentan, sobre todo, con algunos anticuerpos, como es el caso de la inhibina en carcinomas hepatocelulares, del virus herpes simple en endometrio gestacional, y del citomegalovirus cuando se utiliza hibridación in situ. La tinción de biotina se localiza con más frecuencia en el citoplasma, casi siempre con patrón granular o moteado. La biotina también puede localizarse en el núcleo, como puede verse en el endometrio gestacional, en las “mórulas” del carcinoma de endometrio, en el blastoma pulmonar, en la variante cribiforme del carcinoma papilar de tiroides, en el pancreatoblastoma y en los adenomas colónicos. Estas falsas positivas secundarias a la actividad de biotina endógena pueden sospecharse cuando la localización y el patrón subcelular de un anticuerpo dado no es el esperado, como el patrón idéntico de marcación visto con múltiples anticuerpos dirigidos contra diferentes antígenos, particularmente si la tinción es débil. La forma de solucionar esta marcación de biotina endógena es con la inmunomarcación con un bloqueo avidina-biotina o un sistema de detección alternativo que no incluya avidina-biotina, como el sistema de detección de polímeros o peroxidasa-antiperoxidasa. Sin embargo, estos sistemas de detección no están totalmente libres de tinciones inespecíficas. Un ejemplo relativamente común es observar la tinción citoplasmática difusa débil en las células del músculo liso usando el sistema de detección de polímeros (EnVision/Dako®); además, algunos anticuerpos por sí solos también pueden producir tinciones inespecíficas (como algunos anticuerpos policlonales) [494-509]. 103 2. INTRODUCCIÓN 2.4.4.2 Papel de la Inmunohistoquímica en el Esófago de Barrett Con los recientes avances en el campo de la biología molecular, los investigadores se han dado a la tarea de caracterizar aquellos eventos decisivos que ocurren durante la transformación metaplasia-displasia-carcinoma. El uso de estos biomarcadores podría aportar una herramienta simple, reproducible y certera en la valoración de la progresión neoplásica. A medida que las células del EB progresan a displasia, adquieren alteraciones genéticas secuenciales que las acercan gradualmente hacia una transformación cancerígena. Los cambios moleculares responsables de esta transformación no se conocen en su totalidad. Se han propuesto seis factores fisiológicos decisivos que las células deben adquirir en su evolución hacia el cáncer (Figura 2.23). Estos eventos decisivos incluyen la habilidad para proliferar sin necesidad de estimulación exógena, para resistir las señales de inhibición celular, para evadir los mecanismos de muerte celular programada o apoptosis, para resistir la senescencia celular, el desarrollo de factores de angiogénesis y la capacidad para invadir y metastatizar [510]. 104 2. INTRODUCCIÓN Fig 2.23. Señales moleculares en la transformación carcinomatosa del esófago de Barrett. 105 2. INTRODUCCIÓN Recientes investigaciones han destacado el importante papel de diversos biomarcadores de crecimiento tumoral en el diagnóstico y seguimiento de diversos tipos de tumores gastrointestinales, incluido el ACE en el EB, sin embargo, en el momento actual, el gold standard para valorar el riesgo de progresión y malignización en el EB, sigue siendo su estratificación histopatológica. Sin embargo, esta valoración presenta una gran variabilidad inter-observador (kappa 0.18-0.35) [511], y marcada tendencia hacia la sobreestimación de los hallazgos observados [512], lo cual puede explicar la gran diferencia en cuanto a predicción del riesgo de malignización se refiere y que va desde el 0.6% hasta el 13.4% [513-515]. Por este motivo, diferentes técnicas inmunohistoquímicas han sido usadas en la estimación objetiva de este riesgo. 2.4.4.2.1 p53 El gen p53 se localiza en el cromosoma 17p13. El gen p53 codifica un factor de transcripción, la proteína p53, que fue descubierta a fines de los años 70 y participa en el control del ciclo celular, en la síntesis y reparación del ADN y en la apoptosis al activar la p21 en la fase G1/S del ciclo celular. El producto del gen p53 es un regulador del crecimiento y la proliferación celular; en su forma libre (wild type) la proteína p53 suprime el crecimiento celular, mientras que en la proteína mutada actúa como oncogén. El contexto celular, la interacción con otras proteínas celulares y oncovirales y los cambios en la conformación física del p53, son los responsables de la modulación de las funciones de p53 [516-518]. Las mutaciones del gen p53 usualmente tienen como resultado la acumulación de la proteína p53 y de esta manera el producto del gen puede ser detectado por métodos inmunohistoquímicos. Se asume que la p53 está dañada en las áreas que resultan positivas a esta técnica. En el EB, la función de esta proteína se ve alterada por mutaciones o por perdida de la heterocigosis. La acumulación de la proteína p53 puede ser detectada en una variedad de tumores como carcinoma de mama, pulmón, testículo, estómago, tumores de tejidos blandos y 112 2. INTRODUCCIÓN hasta la fecha, hacen falta mayores estudios que aclaren su utilidad en la valoración de la progresión del EB (Figura 2.27) Fig 2.27. Ejemplo de tinciones CD133 para EB sin displasia, con DBG y ACE. 2.4.4.2.4 TWIST Twist1 y Twist2 son los principales reguladores de la embriogénesis. Se ha demostrado que en condiciones patológicas Twist1 favorece la migración metastásica de células cancerosas a través de su capacidad para inducir una transición epiteliomesenquimal. En este sentido, también se conoce que una gran cantidad de tumores humanos sobre-expresan a Twist1 y/o Twist2, en donde, ambas proteínas anulan la senescencia prematura inducida por los oncogenes a través de la supresión de reguladores clave de las vías dependientes de p53 y Rb (reguladores de la división celular normal). Además, Twist1 y Twist2 cooperan con el gen y las proteínas Ras para transformar a los fibroblastos embrionarios de ratón. Curiosamente, en las células epiteliales, la interacción entre las proteínas Twist y las oncoproteínas mitogénicas 113 2. INTRODUCCIÓN activadas, tales como Ras o ErbB2, da lugar a una completa transición epiteliomesenquimal. Estos hallazgos sugieren una relación directa entre la falla regulatoria de uno más genes específicos y la adquisición de características invasoras de las células cancerosas [595-596]. (Figura 2.28) Fig 2.28. La expresión de TWIST conduce a la pérdida de contactos célula a célula y a la dispersión celular. Favorece la pérdida de marcadores epiteliales y la ganancia de marcadores mesenquimáticos, lo que deriva en la intravasación de células tumorales para entrar en la circulación y producir las metástasis. La proteína TWIST posee propiedades oncogénicas, de resistencia a medicamentos, angiogénicas e invasivas [597-598]. Estudios realizados recientemente [599-601], señalan que Twist-1 y las proteínas Snail son relevantes para la transformación neoplásica, lo que sugiere que la capacidad metastásica de algunas células cancerosas puede ser adquirida al comienzo de la conversión maligna. Se cree que la capacidad de las proteínas codificadas por TWIST-1, Snail homólogo 1 (SNAI1) y Snail homólogo 2 (SNAI2) para suprimir la expresión de E-cadherina, una potente molécula de adhesión intercelular, es fundamental en estos procesos, que implican la migración celular. La intensidad en la expresión de E-cadherina está inversamente relacionada con el tamaño y el estadio tumoral. 114 2. INTRODUCCIÓN El modelo clásico de desarrollo del cáncer propone que los factores de transcripción implicados en la promoción de la transición epitelio-mesenquimal están activados en las células cancerígenas que residen en el borde invasivo del cáncer avanzado. Según este modelo, la activación de las proteínas asociadas con la transición epitelio-mesenquimal no ofrece una ventaja de crecimiento en el tumor primario, sino más bien, media el último paso en la progresión tumoral (es decir, la metástasis). En contraste, los resultados de estos estudios indican que la diseminación metastásica se produce continuamente a lo largo del curso de desarrollo del tumor primario, por lo menos en algunos tipos de cáncer (Figura 2.29) [602-604]. En resumen, TWIST promueve la transición epitelio, mesenquimal, disminuye la expresión y acción de la ecadherina, incrementa la movilidad celular y actúa como factor anti-apoptosis, lo cual conduce, finalmente, a aumentar la supervivencia de las células cancerosas. TWIST ha sido relacionada con un gran número de procesos tumorales entre los que destacan el cáncer colorrectal y pulmonar [605]. Parece igualmente estar relacionado con la capacidad de progresión de la displasia hacia ACE en el EB aunque la evidencia obtenida hasta el momento es escasa [594] (Figura 2.30) 115 2. INTRODUCCIÓN Fig 2.29. En el modelo clásico para el desarrollo del cáncer en humanos, las metástasis corresponden a la etapa final de la cascada tumorígena (panel A). Sin embargo, estudios recientes apoyan un modelo diferente, que predice que la expresión de proteínas que regulan la transición epitelio-mesenquimal promueve la conversión maligna concomitantemente con la diseminación metastásica (panel B). En este modelo alternativo, la difusión celular del tumor primario se puede producir en cualquier momento durante el desarrollo del cáncer. 116 2. INTRODUCCIÓN Fig 2.30. Inmunohistoquímica de TWIST en EB sin displasia, DBG y ACE. 117 2. INTRODUCCIÓN 2.5 Screening y vigilancia endoscópica del Esófago de Barrett Las recomendaciones acerca de los métodos y periodos de vigilancia en el EB están basadas en el supuesto de que el EB afecta la supervivencia y, por ende, su vigilancia deberá afectar positivamente la mortalidad. Sin embargo, dado que hasta la fecha no existe ningún estudio lo suficientemente grande y potente (en parte por el altísimo costo que supondría a nivel económico y ser, éticamente difícil o imposible de realizar), existe varias corrientes tanto a favor como en contra de los métodos de vigilancia. A) En contra de un programa de seguimiento: a. No existen estudios aleatorizados que muestren eficacia en la reducción de la mortalidad relacionada al cáncer de esófago en pacientes con EB. b. Algunos estudios observacionales y modelos informáticos no muestran un beneficio razonable de los programas de vigilancia [606- 607] c. La endoscopia entraña un riesgo en su realización, no es un método inocuo. d. El diagnóstico de EB puede traer consecuencias en el desarrollo de otros problemas médicos (ansiedad, disminución de la calidad de vida, aumento de los costos de los seguros médicos, etc.) [608-609]. e. La endoscopia es cara, y más aún cuando se añaden los costos relativos al procesamiento de muestras para su estudio anatomopatológico. f. La gran mayoría de pacientes no muestra un beneficio de los métodos de vigilancia. 118 2. INTRODUCCIÓN B) A favor de un programa de seguimiento: a. No se esperan estudios aleatorizados que valoren la utilidad real de la vigilancia endoscópica, hacerlos resultaría sumamente caro a la vez que éticamente cuestionable. b. Algunos estudios con modelos informáticos muestran un beneficio razonable de la vigilancia endoscópica [610-613]. c. Los riesgos de la endoscopia programada son mínimos y ningún estudio ha encontrado que los métodos de vigilancia endoscópica disminuyan la supervivencia [614]. d. El no realizarlos supondría perder la oportunidad de diagnosticar y tratar un cáncer en sus etapas iniciales. e. Algunos estudios con modelos informáticos muestra un costobeneficio razonable al aumentar los años de vida [611-613]. f. En algunos pacientes, los programas de vigilancia podrían salvarles la vida. Los diferentes métodos de vigilancia en el EB están destinados, fundamentalmente, a descartar y/o confirmar la presencia de displasia. Esto se basa en considerar al cáncer un proceso que se desarrolla longitudinal en el tiempo a través de una serie de alteraciones genéticas que progresan a medida que los cambios displásicos se hacen más severos. Sin embargo, la progresión real de EB hacia displasia sigue sin estar del todo claro; si tomamos en cuenta los mayores estudios con los que contamos al respecto, el ACE sobre EB se desarrolla aproximadamente en el 4% de los casos con un aumento de la incidencia anual de 0.54 (95% IC 0.32-0.76); si estudiamos la presencia de DAG y ACE, esta incidencia aumenta hasta el 1.73% por año [614]. 119 2. INTRODUCCIÓN La displasia en el EB a menudo se presenta de forma parcheada en extensión y severidad [615-616]. Los endoscopistas tradicionalmente han optado por la realización de biopsia aleatorias para identificar la displasia, por lo cual, puede darse el caso de obviar zonas que contengan displasia y, consecuentemente, infravalorar la severidad de la enfermedad. Además, aunque se detecte displasia, zonas de cáncer invasivo pueden pasar desapercibidas. En estudios realizados en pacientes sometidos a esofagectomías por DAG, sin evidencia aparente de masas tumorales, se observó cáncer en hasta el 40% de los casos [617-619]. Cabe también mencionar que un meta-análisis realizado sobre los mismos pacientes, encontró que sólo el 13% presentaban cáncer invasivo, el resto (27%) presentaban una forma más atenuada en forma de carcinoma intramucoso [617]. Otro estudio ha confirmado esta observación con hallazgos de cáncer en un 18% de los pacientes sometidos a esofagectomía por DAG [620]. La realización de numerosas biopsias, de preferencia en aquellas zonas que se observen con alteraciones sospechosas, puede disminuir el riesgo de obviar lesiones displásicas o neoplásicas, sin embargo, no elimina el problema por completo [621-623]. Las biopsia aleatorias han sido, tradicionalmente, la forma más habitual de seguimiento endoscópico del EB, esta modalidad se va reduciendo gradualmente a medida que se dispone de más y mejores aparatos de alta resolución. En estos, se da preferencia para biopsiar aquellas zonas nodulares o con alteraciones en la superficie mucosa [624-625]. Existen varias modalidades de técnicas endoscópicas para la vigilancia del EB. La principal consiste en la endoscopia digestiva alta, de preferencia con aparatos de alta resolución y luz blanca; con ella se debe intentar realizar una inspección cuidadosa y biopsiar aquellas lesiones sospechosas de displasia y/o neoplasia. Otras técnicas se encuentra en desarrollo (cromoendoscopia, ecoendoscopia, microendoscopia confocal, y espectrografía), pero su alto costo y baja disponibilidad hacen que no sean los 120 2. INTRODUCCIÓN métodos de elección para ser utilizados de forma rutinaria en la vigilancia del EB [626- 631]. Guías clínicas de vigilancia en el EB En 2011 la American Gastroenterological Association (AGA) se dio a la tarea de realizar una guía clínica sobre la vigilancia del EB, tomando como referencia los estudios y la evidencia con la que se contaba hasta el momento [632]. También la British Society of Gastroenterology (BDG) se ha manifestado al respecto y viene a complementar las recomendaciones hechas por la AGA [633]. Estas guías clínicas establecen, entre otras cosas: a. Se recomienda un screening para EB en aquellos paciente con ERGE que además presenten múltiples factores de riesgo relacionados con adenocarcinoma esofágico (mayores de 50 años, sexo masculino, raza caucásica, ERGE crónica, hernia de hiato, índice de masa corporal elevado o distribución predominantemente abdominal de la grasa corporal). b. La AGA no recomienda el screening de EB en la población general con ERGE. c. Para pacientes con EB, la terapia antirreflujo para tratar los síntomas de la ERGE así como permitir la curación de la esofagitis está claramente indicada, al igual que en los pacientes con ERGE sintomática sin EB. d. El diagnóstico de EB debe ser confirmado, al menos, por otro patólogo, de preferencia que sea experto en patología esofágica. e. Se recomienda la vigilancia endoscópica del EB según los siguientes intervalos:  EB sin displasia: cada 3-5 años (la BSG lo recomienda cada 2-3 años en casos de EB largos >3 cms).  EB con displasia de bajo grado: Cada 6-12 meses. 121 2. INTRODUCCIÓN  EB con displasia de alto grado: Si no se ha realizado tratamiento erradicador, cada 3 meses.  La BSG hace una recomendación que no aparece en la AGA. En caso de EB indefinido para displasia, repetir la biopsia a los 6 meses, en caso negativo, el paciente debe ser manejado como EB sin displasia. f. La AGA se postula en contra de los biomarcadores para confirmar el diagnóstico histológico de displasia o como método para valorar el riesgo de malignización del EB (la BSG sugiere que la p53 podría utilizarse como un marcador auxiliar a las técnicas convencionales). g. La evidencia que apoya el uso de inhibidores de la bomba de protones (IBP) para reducir el riesgo de progresión de displasia en el EB o la aparición de ACE es indirecta y no ha sido apoyada por estudios a largo plazo. El riesgo y potencial beneficio un tratamiento prolongado con IBP debe ser consensuado con cada paciente en el contexto de los medicamentos que consuma y su estado de salud, en general. h. Si el paciente se encuentra en un programa de vigilancia, siempre se deben obtener biopsias (de preferencia con pinzas de gran capacidad, según recomendaciones de la American Society for Gastrointestinal Endoscopy) [634- 635]. Para los pacientes en programa de vigilancia, la AGA recomienda:  Evaluación endoscópica utilizando endoscopios de luz blanca.  Biopsia de los cuatro cuadrantes cada 2 centímetros.  Biopsias específicas de cualquier irregularidad en la superficie mucosa, que debe ser remitida al patólogo por separado.  Biopsia de los cuatro cuadrantes cada centímetro en paciente con displasia conocida o sospechada. i. La AGA se posiciona en contra de la cromoendoscopia o técnicas avanzadas de imagen para la vigilancia rutinaria de pacientes con EB. La BSG sugiere el uso de endoscopios de alta resolución en pacientes en los que se ha detectado 128 2. INTRODUCCIÓN afectación de estructuras ganglionares [684-689]. El US National Cancer Institute ha publicado recientemente sus resultados sin encontrar diferencias en la supervivencia en pacientes con DAG o carcinoma estadio T1N0 tratados con esofagectomía o terapia endoscópica [663, 690-691]. Otro estudio publicado recientemente apoya la idea de que la terapia de erradicación endoscópica logra similares resultados en cuanto a supervivencia a mediano y largo plazo (36.7% vs 42.8% a 5 años de seguimiento) [692]. Si bien existen otros estudios al respecto [690-691, 693], la gran posibilidad de sesgos hace que, hasta el momento, no existan recomendaciones claras sobre la mejor opción de tratamiento. Una revisión reciente realizada por la Cochrane [694] ha insistido sobre la urgencia de realizar estudios de calidad a este respecto, si bien es consciente de la dificultad de que esto ocurra, debido a la heterogeneidad tanto en el tipo de procedimientos quirúrgicos como endoscópicos disponibles en los diferentes centros así como en las limitaciones inherentes al diagnóstico histopatológico; un punto clave a este respecto consiste en la elección de los pacientes para uno u otro brazo de tratamiento, situación que no deja de ser difícil y con gran posibilidad de sesgo a la hora de interpretar los datos, sobre todo en cuanto a supervivencia se refiere. Los factores que pueden influir nuestra decisión sobre el tratamiento de elección (esofagectomía vs tratamiento endoscópico) incluyen: el estadio de la enfermedad (DAG o CIM); concurrencia de un EB de segmento corto o largo; lesión unifocal ó multifocal; la presencia de invasión vascular y el grado de diferenciación [663]. La terapia endoscópica ha demostrado erradicar la DAG con bajas tasas de recurrencia a los 3 años [695-697]. En caso de recurrencia de la displasia/carcinoma, estos pacientes se podrían manejar de forma quirúrgica sin incrementos muy importantes de la mortalidad relacionada a la realización de un segundo tratamiento sobre un esófago ya previamente manipulado [698-699]. Se recomienda el tratamiento quirúrgico de primera en caso de sospecha de carcinoma invasivo dentro de la DAG, también parece claro que éste debería ser el abordaje de los pacientes con grados T1b o mayores [700]. 129 2. INTRODUCCIÓN Una vez establecido que la terapia endoscópica representa, hoy día, una opción muy válida de tratamiento en caso de DAG [701], acompañada de un estricto protocolo de vigilancia, tratamiento precoz de la recurrencia y cirugía (esofagectomía) precoz; queda por definir el mejor tratamiento endoscópico. En caso de DAG y/o cáncer precoz (intramucoso), se aceptan como tratamientos válidos a la resección mucosa endoscópica (RME) y la ablación mucosa (AM). No existen, hasta el momento, estudios controlados aleatorizados que evalúen un beneficio claro del tratamiento combinado respecto al aislado en cada una de las modalidades. Sin embargo, se acepta por consenso [701] que la combinación de ambos puede resultar más eficaz (basado en estudios prospectivos con pequeños tamaños muestrales) [702-704]. La RME de lesiones focales (tanto DAG como CIM), deben realizarse intentando siempre alcanzar un R0. Una correcta realización de las mismas puede alcanzar unas tasas de éxito de hasta el 82.5-95% además de ser muy útil a la hora de evaluar la presencia de un carcinoma invasivo [689, 705-706]. Sin embargo, puede asociarse con lesiones metacrónicas además de no lograr, en muchos casos una erradicación sostenida de la displasia, con tasas de recurrencia en torno al 14% a los 12 meses y del 21.5% a los 5 años [663, 703, 707-709]. El empleo de técnicas de ablación que traten la totalidad del epitelio de Barrett ha demostrado disminuir estas tasas de recurrencias, con buenos resultados a largo plazo [710-714]. Las técnicas de ablación incluyen la ablación por radiofrecuencia (RFA), terapia fotodinámica (PTD), coagulación con argón-plasma (APC), electrocoagulación multipolar (MPEC), ablación laser y la crioterapia. Tanto la RFA como la PDT alcanzan una profundidad de tratamiento bastante aceptable a la vez que se pueden emplear para grandes superficies, incluso de forma circunferencial; ambas son muy efectivas en la erradicación del EB [715-722]; sin embargo, en la actualidad la tendencia es hacia una mayor utilización de la RFA dados sus menores efectos secundarios y a ser un método relativamente fácil de realizar, con una curva de aprendizaje relativamente 130 2. INTRODUCCIÓN rápida [723]. Los estudios realizados hasta el momento han objetivado similares tasas de éxito en la erradicación del EB tanto al utilizar PDT como RFA, PDT ó RME, también con similares tasas de recurrencia. [722]. Dado que la MPEC y el APC presentan mayores riesgos de perforación, omisión en el tratamiento de glándulas enterradas y mayor riesgo de estenosis, se reservan para tratar pequeñas lesiones residuales de metaplasia como tratamiento complementario a otras modalidades ablativas [724]. 131 HIPÓTESIS 3. HIPÓTESIS 132 HIPÓTESIS Dadas las características del presente trabajo, se desprenden dos hipótesis. La primera de ellas es que ha habido un aumento de la incidencia y prevalencia tanto en el EB como en el ACE en nuestra Área Sanitaria. La segunda es que, a medida que en el EB se producen cambios histológicos en el sentido displasia de bajo grado, alto grado y finalmente ACE, estos cambios pueden ser observados y valorados mediante el uso de los marcadores inmunohistoquímicos CD 133, p504s y TWIST, por lo que serían de utilidad a la hora de identificar aquellos pacientes con mayor riesgo de desarrollo de displasia y/o adenocarcinoma esofágico a efectos de una vigilancia más estrecha y tratamiento más precoz. 3.1 Hipótesis nula (H0) No existe un aumento de prevalencia e incidencia en el EB y ACE en el Área Sanitaria Virgen Macarena de Sevilla durante el periodo de estudio. Tampoco existen diferencias significativas respecto a la valoración de la progresión de la displasia en pacientes con EB y ACE mediante el uso de las técnicas de inmunohistoquímica CD 133, p504s y TWIST. 3.2 Hipótesis alternativa (H1) Existe un aumento de la incidencia y prevalencia del EB y ACE en el Área Sanitaria Virgen Macarena de Sevilla. Existen, además, diferencias significativas respecto a la valoración de la progresión de la displasia en pacientes con EB y ACE mediante el uso de los biomarcadores inmunohistoquímicos CD 133, p504s y TWIST. 133 OBJETIVOS 4. OBJETIVOS 134 OBJETIVOS 4.1. Objetivos sobre el comportamiento del Esófago de Barrett y el Adenocarcinoma Esofágico en el Área Sanitaria Virgen Macarena El (EB) es una condición adquirida definida por la presencia de metaplasia intestinal en el esófago distal, habitualmente como resultado de la enfermedad por reflujo gastro-esofágico (ERGE) en donde el epitelio normal de tipo escamoso es remplazado por epitelio de tipo columnar. Si bien se conoce que la prevalencia de los síntomas del reflujo gastro-esofágico (RGE) en la población adulta en general, en países de occidente, es de alrededor del 20% en los que tienen un episodio de pirosis diario, y del 7% en los que manifiestan un episodio de pirosis semanal, la prevalencia del EB en la población general no puede ser estimada de la información precedente, debido a que muchos pacientes no tienen una historia previa de reflujo gastro-esofágico [48-50, 725]. La prevalencia del EB en el sur de Europa, según estudios obtenidos desde servicios de endoscopia, se ha incrementado de forma alarmante en los últimos años, pasando de 6.51/100 000 habs a 76.04/100 000 habs (1985-2001 respectivamente) [54]. La tasa más alta la tiene España con una prevalencia cercana al 12%, si tomamos en cuenta una población aproximada de 4,5 millones, tendríamos un total de 540 000 personas afectadas de EB; a esta alta prevalencia le siguen Italia con el 1.5% y Alemania con el 1.3% de la población con ERGE afecta de EB [55]. En Inglaterra esta prevalencia ha aumentado desde el .08-2% en el periodo 1987-1996 [31] hasta el 4% en 2004 [56]. Hasta la fecha no está claro el porqué unas personas con diagnóstico de ERGE desarrollan EB y otras no, aunque parece que ciertos factores (genéticos, edad avanzada, sexo masculino, obesidad, el consumo de tabaco y alcohol) podrían aumentar este riesgo [130, 726-740]. El EB es un marcador aceptado de riesgo en el desarrollo de ACE. Se estima 135 OBJETIVOS que su presencia incrementa el riesgo de ACE unas 30 veces, mientras que la ERGE sin EB sólo lo incrementa 3.1 veces [100]. El riesgo de desarrollo de ACE sobre un EB ronda el 0.32% anual, con incidencias que varían desde el 0.1% al 0.59%, según diferentes estudios [101, 105-107, 112, 741]. En este primer estudio, que sirve como base para la presente tesis doctoral, se establecieron los siguientes objetivos: 1. Primario: a. Analizar el comportamiento del EB y del ACE en nuestra Área sanitaria durante el periodo de estudio. 2. Secundarios: a. Estudiar los factores de riesgo asociados al EB en nuestra población de referencia. b. Analizar el comportamiento histológico del EB a lo largo del periodo de seguimiento. c. Evaluar la supervivencia y causas de defunción en este tipo de pacientes. 136 OBJETIVOS 4.2 Objetivos del uso de biomarcadores TWIST, P504S y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett Debido al riesgo de progresión de la displasia de alto grado hacia ACE, situada entre el 10-30% en 5 años, el tratamiento de ésta ha sido clásicamente mediante el empleo de terapias invasivas, tanto endoscópicas (mucosectomía y ablación endoscópica) como quirúrgicas (esofagectomía), por lo que un correcto diagnóstico resulta muy importante. La confirmación del grado de displasia y el riesgo de progresión de la metaplasia-displasia mediante el uso de marcadores inmunohistoquímicos podría ayudar en la toma de decisiones, no solo en cuanto a las opciones de tratamiento sino en cuanto a detectar aquellos pacientes que se beneficiarían de un seguimiento más estrecho. Con el presente estudio nos proponemos determinar si el uso de los biomarcadores de crecimiento tumoral p504S, CD133 y TWIST podrían tener utilidad en la valoración de la progresión de la metaplasia-displasia del EB hacia ACE, pudiendo ser una herramienta importante en el seguimiento de estos pacientes. La segunda parte de la presente tesis doctoral pretende establecer la utilidad de estas novedosas técnicas de inmunohistoquímica mediante los siguientes objetivos: 1. Primario: a. Determinar la utilidad del uso de los marcadores inmunohistoquímicos TWIST, CD133 y P504S en la valoración de la progresión de displasia en pacientes con esófago de Barrett y ACE. 2. Secundarios: a. Estudiar la utilidad de estos marcadores como auxiliares en la valoración histopatológica de la displasia y del adenocarcinoma esofágico. 137 MATERIAL Y MÉTODOS 5 MATERIAL Y MÉTODOS 144 MATERIAL Y MÉTODOS por otros motivos diferentes al EB. El Grupo II fueron pacientes con diagnóstico de EB no complicado; se excluyeron de este grupo aquellos pacientes cuyos cambios histológicos progresaron durante el seguimiento. El Grupo III fueron pacientes con diagnóstico de EB con DBG en alguna de las muestras. El Grupo IV fueron pacientes con DAG en algunas de las muestras obtenidas endoscópicamente; dado que, en este caso, el número de pacientes resultó muy pequeño, se seleccionaron 10 casos de pacientes intervenidos quirúrgicamente por ACE; a efectos de disminuir este sesgo, se tomaron muestras de tejidos con DAG alejados de la masa tumoral principal. El Grupo V se constituyó de pacientes sometidos a esofagectomía por ACE. 5.2.3 Metodología empleada para las tinciones inmunohistoquímicas Una vez seleccionadas las muestras y obtenidos los bloques de parafina desde el Banco de Tejidos de AP, se realizaron cortes de 4 micrómetros en estos bloques, tanto para realizar un nuevo estudio de Hematoxilina-Eosina (H&E) (a fin de confirmar y descartar la presencia de displasia), como para la realización de las diferentes técnicas de IHQ. Estos cortes fueron montados en portaobjetos de alta adherencia electrostática positiva SuperFrost® Plus (Thermo Scientific) cuya atracción electrostática une los cortes de tejido recién congelados y las preparaciones citológicas. Las tinciones de H&E fueron procesadas mediante el uso del teñidor automático Leica® ST5010 XL según técnicas habituales mientras que para la IHQ se utilizó el sistema automatizado de teñido Ventana Benchmark® ULTRA. Para el estudio de la racemasa (p504s) se utilizaron los anticuerpos comercialmente disponibles (AMARC/p504s® Monoclonal Rabbit Anti-Human AMACR Clon 13H4 peso molecular 54 kDa de Master Diagnóstica® Madrid). Se realizaron los procedimientos recomendados por el fabricante para la recuperación de los 145 MATERIAL Y MÉTODOS anticuerpos (preparación del antígeno a temperatura media por 28 minutos y posteriormente a 95ºC por 8 minutos y luego 20 minutos a 100ºC). Cada una de estas preparaciones viene prediluida para, posteriormente, ser incubadas 1 hora a temperatura ambiente. Una vez comprobada la correcta aplicación del primer anticuerpo, se aplicó el segundo anticuerpo, Ventana OmniMap anti-Rabbit/HRP, dejándolo 20 minutos a temperatura ambiente. Para el estudio del CD133 se utilizó el anticuerpo monoclonal del tipo IgG1k (CD133 Clon AC133, Mouse mAb, peso molecular 95 kDa, Miltenyi Biotec®, Germany). El procedimiento de tinción y valoración fue el mismo que el realizado para el P504, salvo que la titulación y dilución del primer anticuerpo se realizó manualmente a una escala 1/10. Para el estudio inmunohistoquímico del TWIST se utilizó un anticuerpo IgG1 de ratón comercialmente disponible de Abcam® (clon Twist2C1a, peso molecular de 28 kDa). La recuperación óptima de los anticuerpos se realizó mediante técnica Standard de CC1® para el acondicionamiento celular durante 48 minutos (8 minutos a 95ºC; 40 minutos a 100ºC). Se realizó una titulación manual a 1/10 por 30 minutos a temperatura ambiente para posteriormente aplicarse el segundo anticuerpo (Ventana OmniMap anti-Mouse/HRP) dejándolo incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Se realizaron controles, según especificaciones de cada uno de los fabricantes, para garantizar una correcta realización de cada una de las técnicas empleadas. Se utilizó el sistema de detección Ventana ChromoMAP DAB para visualizar las reacciones inmunohistoquímicas. Las muestras que no cumplieron los requisitos de calidad, fueron desechadas y descartadas del estudio. 146 MATERIAL Y MÉTODOS 5.2.4 Valoración Inmunohistoquímica Se utilizó el sistema de calificación rápida (Q-score) de Allred [743] basado en la intensidad y proporción de la tinción (Tabla 5.2) Cada caso fue valorado y consensuado por dos patólogos con la ayuda de un microscopio multicabezal. La intensidad se valoró y puntuó como: 0= Negativa, 1= Tinción débil, 2= Tinción moderada y 3= Tinción fuerte. La proporción de células con tinción positiva se valoró y puntuó como 0= Sin tinción, 1=<1% teñidas, 2=1-10% teñidas, 3=11-33% teñidas, 4=34-66% teñidas y 5=67-100% teñidas. El score (Q-score) se obtuvo de la suma de la intensidad y proporción de las tinciones; de esta suma se pudo categorizar cada uno de los casos como: Negativa (Score 0), Tinción débil (score 1-3), Tinción moderada (Score 4-6) y Tinción fuerte (score 7-8). Se estudiaron las diferencias en la Intensidad, Proporción así como el Q-score de cada uno de los grupos y se compararon con el resto a fin de encontrar diferencias estadísticamente significativas. Posteriormente y dado que las tinciones débiles pero positivas podrían conducir a errores en su interpretación y, como consecuencia, sesgar las observaciones realizadas, endurecimos los criterios de positividad a las diferentes técnicas IHQ utilizando el Q-score como base; de esta forma, los pacientes fueron divididos en 2 grupos según el comportamiento del tejido a la tinción:  Grupo 1 (Tinción negativa) con score Negativo (0) y Débil (1-3)  Grupo 2 (Tinción positiva) con score Moderado (4-6) y fuerte (7-8) Se analizaron las diferencias entre cada uno de los grupos a efectos de encontrar valores de significancia estadística. La segunda parte del estudio inmunohistoquímico incluyó un análisis utilizando a cada paciente como su propio control. Se procesaron mediante las diferentes técnicas 147 MATERIAL Y MÉTODOS IHQ las diferentes zonas (mucosa normal, EBSD y EB con displasia, además de las zonas de ACE) de las piezas quirúrgicas extraídas mediante esofagectomías de aquellos pacientes con diagnóstico de ACE. De esta forma se buscaron diferencias en la expresión IHQ en cada una de las diferentes tinciones/zonas estudiadas. 5.2.5 Análisis estadístico Para el cálculo del tamaño de muestra se utilizó la fórmula basada en la proporción. Se estimó una población de 400 000 personas, el margen de error fue del 20% para enfermedad maligna (10% para enfermedad benigna), con un nivel de confianza del 95% y un nivel de heterogeneidad del 50%. Las variables estudiadas se resumen en la tabla 5.3 Para las variables categóricas, las diferencias entre los grupos se estudiaron mediante el empleo de la Chi cuadrado (χ2 ) si menos del 20% de las casillas contenían valores menores a 5 (n<5); en los casos en que esto no se cumplió (>20% de las casillas con valores <5), se utilizó el test exacto de Fisher. Para el análisis de variables cuantitativas se utilizó el test de ANOVA. Finalmente, para la comparación de proporciones entre grupos relacionados (siendo cada paciente su propio control) se utilizó la Q de Cochran. Todos el análisis estadístico se realizó utilizando el programa estadístico SPSS (Versión 19, IBM ®, Chicago, IL) considerándose como estadísticamente significativos valores de P<0.05. 148 MATERIAL Y MÉTODOS Proporción de muestra teñida Score Intensidad de la tinción Score No hay tinción 0 No hay tinción 0 1% 1 Débil 1 1-10% 2 Moderada 2 11-33% 3 Fuerte 3 34-66% 4 67-100% 5 Suma de la proporción e intensidad Score Interpretación 0 Negativa 1-3 Débil 4-6 Moderada 7-8 Fuerte Tabla 5.2. Score de Allred para la interpretación de resultados de las tinciones inmunohistoquímicas. 149 MATERIAL Y MÉTODOS Variable Naturaleza Variable categórica Tipo Unidades Parámetros sociodemográficos Edad Cuantitativa continua Numérico Años Sexo Categórica 1=Hombre 2=Mujer Consumo de tabaco Categórica 0=No Fumador 1=Fumador/ex fumador Consumo de alcohol Categórica 0=No bebedor 1=Bebedor Índice de masa corporal (IMC) Cuantitativa continua Numérico kg/m2sc Inmunohistoquímica Intensidad de la tinción Categórica 0=Negativa 1=Débil 2=Moderada 3=Fuerte Proporción de la tinción Categórica 0=Negativa 1=<1% 2=1-10% 3=11-33% 4=34-66% 5=67-100% Q-Score Categórica 1=Negativa 2=Débil 3=Moderado 4=Fuerte Q-Score (modificado) Categórica 0=Negativa 1=Positiva Tabla 5.3. Características de las variables analizadas en la parte del estudio sobre el uso de los biomarcadores TWIST, P504S y CD 133 en la valoración de la progresión del Esófago de Barrett. Kg/m2sc (kilogramo/metro cuadrado de superficie corporal). 150 RESULTADOS 6 RESULTADOS 151 RESULTADOS El análisis de la base de datos de Gestión de Endoscopia reveló 102 230 exploraciones desde enero de 1996 a marzo del 2011 de las cuales 38 929 correspondieron a endoscopias digestivas superiores (38%). El diagnóstico endoscópico de EB se realizó en 850 exploraciones (2.2% respecto al total de endoscopias digestivas superiores) confirmándose, mediante anatomía patológica que 649 de ellas (76,3%) eran verdaderos casos de EB lo cual da una prevalencia total, respecto al número de endoscopias digestivas altas, del 1.7%. Estas exploraciones se correspondieron con 338 pacientes. La revisión de la base de datos de AP nos permitió obtener 92 pacientes con ACE sin diagnóstico previo de EB en ese mismo intervalo de tiempo. La muestra total de pacientes fue de 430. (Figura 6.1) Fig. 6.1. Diagrama de flujo de la selección de los pacientes. Total de endoscopias (Ene´1996 y Mar´2011) 102,230 Otro tipo de exploraciones endoscópicas 63,301 Endoscopias digestivas altas 38,929 Disagnóstico endoscópico de EB 850 (2.2%) EB con confirmación histológica 649 (76,3%) Correspondientes a 338 pacientes Base de datos de AP (ene´96-mar´11) ACE sin EB previo 92 Total de pacientes incluidos 430 Otros diagnósticos 38,079 (97,8%) 152 RESULTADOS 6.1 Resultados respecto al comportamiento del Esófago de Barrett y del Adenocarcinoma esofágico en el Área Hospitalaria Virgen Macarena de Sevilla 6.1.1 Tasas de incidencia del EB y ACE Según los diferentes periodos de tiempo estudiados y tomando en cuenta nuestra población de referencia aproximada (400 000 habs), el mayor número de casos de EB se observa en el intervalo del 2008-2009 y de ACE en 2010-2011. La mayor tasa de incidencia (TI) para EB se obtuvo entre enero del 2008 y diciembre del 2009 (19/100 000 personas/año), y para ACE entre enero del 2010 y diciembre del 2011 (4,75/100 000 personas/año). La mayor parte de los pacientes con EB presentaban un EB corto (250 casos, 74%). (Figuras 6.2 y 6.3). Se calculó también la TI por grupos de edad (Figura 6.4 A); para ello se tomó en cuenta la Memoria 2012 del Hospital Universitario Virgen Macarena. Se consideró como numerador el número de casos nuevos por año y como denominador una población estimada de 400 000 personas mayores de 15 años. Como se puede observar, el grupo más afectado fue el de la franja de edad de 50-59 años para el EB con una TI de 20/100 000 personas año mientras que en el caso del ACE, la franja con mayor tasa de incidencia fue la comprendida entre los 70-79 años (6,5/100 000 personas-año). Se observa además que, mientras la TI en el caso del EB aumenta de forma progresiva conforme se progresa en edad, y disminuye a partir de la séptima década de la vida, la de ACE aumenta de forma lineal hasta la octava década de la vida, para, a partir de entonces, empezar a disminuir. En el análisis del comportamiento histológico por grupos de edad (Figura 6.4 B), como era de esperar, el mayor número de casos se corresponde con EB sin displasia siendo la población principalmente afectada aquella en la franja de edad de los 50-59 años (TI 16,5/100 000 personas-año). Por otro lado, cuando el EB presentó displasia, la incidencia también aumenta de forma lineal con un máximo de aparición en la misma franja que el EB sin displasia, esto es, en la década de los 50 153 RESULTADOS a los 59 años, sin embargo, a partir de esta edad se diferencian dos escenarios, mientras que la TI va disminuyendo gradualmente en aquellos pacientes con displasia de comportamiento benigno (con estabilidad de los cambios histológicos o desaparición de la displasia), la TI en la displasia “agresiva” (progresión de los cambios histológicos) va aumentando de forma paralela de forma muy similar a la observada en el caso del ACE, con un pico máximo a los 60-69 años (2/100 000 años persona) aunque también se mantiene alta de los 70-79 años (1,75/100 000 personas-año). Fig.6.2. Número de casos de EB, ACE EB corto y EB largo por intervalo de tiempo. Los números corresponden a los casos nuevos en cada periodo y se representan en números absolutos. 9 22 25 43 70 67 76 26 5 12 16 14 8 9 9 19 9 16 21 30 49 46 60 16 4 6 4 13 21 21 16 6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1996-1997 1998-1999 2000-2001 2002-2003 2004-2005 2006-2007 2008-2009 2010-2011 Número de casos EB ACE EB corto EB largo 256 BIBLIOGRAFIA 10 cases including a subset with aggressive clinical course. Am J Surg Pathol. 2015 Feb;39(2):157-68. 412. Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, Nowell PC, Croce CM. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome translocation. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome translocation. Science 1984;226(4678):1097-9. 413. Verma YK, Gangenahalli GU, Singh VK, Gupta P, et al. Cell death regulation by B- cell lymphoma protein. Apoptosis 2006;11:459-71. 414. Bosch R, Dieguez-Gonzalez R, Céspedes MV, Parreño M, Pavón MÁ, Grañena A, Sierra J, Mangues R, Casanova I. A novel inhibitor of focal adhesion signaling induces caspase-independent cell death in diffuse large B-cell lymphoma. Blood. 2011 Oct 20;118(16):4411-20. 415. Thompson RC, Vardinogiannis I, Gilmore TD. The sensitivity of diffuse large B-cell lymphoma cell lines to histone deacetylase inhibitor-induced apoptosis is modulated by BCL-2 family protein activity. PLoS One. 2013 May 7;8(5):e62822. 416. Akl H, Vervloessem T, Kiviluoto S, Bittremieux M, Parys JB, De Smedt H, Bultynck G. A dual role for the anti-apoptotic Bcl-2 protein in cancer: mitochondria versus endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 2014 Oct;1843(10):2240-52. 417. Pan R, Hogdal LJ, Benito JM, Bucci D, Han L, Borthakur G, Cortes J, DeAngelo DJ, Debose L, Mu H, Döhner H, Gaidzik VI, Galinsky I, Golfman LS, Haferlach T, Harutyunyan KG, Hu J, Leverson JD, Marcucci G, Müschen M, Newman R, Park E, Ruvolo PP, Ruvolo V, Ryan J, Schindela S, Zweidler-McKay P, Stone RM, Kantarjian H, Andreeff M, Konopleva M, Letai AG. Selective BCL-2 inhibition by ABT-199 causes on-target cell death in acute myeloid leukemia. Cancer Discov. 2014 Mar;4(3):362-75. 418. Giménez-Cassina A, Danial NN. Regulation of mitochondrial nutrient and energy metabolism by BCL-2 family proteins. Trends Endocrinol Metab. 2015 Apr;26(4):165- 75. 419. Gulmann C, Espina V, Petricoin E 3rd, Longo DL, Santi M, Knutsen T, Raffeld M, Jaffe ES, Liotta LA, Feldman AL. Proteomic analysis of apoptotic pathways reveals prognostic factors in follicular lymphoma. Clin Cancer Res. 2005 Aug 15;11(16):5847-55. 420. Coelho Siqueira SA, Ferreira Alves VA, Beitler B, Otta MM, Nascimento Saldiva PH. Contribution of immunohistochemistry to small B-cell lymphoma classification. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2006;14:1-6. 421. Bende RJ, Smit LA, van Noesel CJ. Molecular pathways in follicular lymphoma. Leukemia 2007;21:18-29. 257 BIBLIOGRAFIA 422. Ruminy P, Jardin F, Picquenot JM, Parmentier F, Contentin N, Buchonnet G, Tison S, Rainville V, Tilly H, Bastard C. S(mu) mutation patterns suggest different progression pathways in follicular lymphoma: early direct or late from FL progenitor cells. Blood. 2008 Sep 1;112(5):1951-9. 423. De Jong D, Rosenwald A, Chhanabhai M, Gaulard P, et al. Lymphoma Biomarker Consortium. Immunohistochemical prognostic markers in diffuse large B-cell lymphoma: validation of tissue microarray as a prerequisite for broad clinical applications- a study from the Lunenburg Lymphoma Biomarker Consortium. J Clin Oncol 2007;25:805-12. 424. Delsol G. [Molecular abnormalities in lymphomas]. Bull Cancer. 2010 Nov;97(11):1347-64. 425. Seiler TM, Hiddemann W. Advances in the management of follicular lymphoma. Curr Opin Oncol. 2012 Nov;24(6):742-7. 426. Rossi D, Ciardullo C, Gaidano G. Genetic aberrations of signaling pathways in lymphomagenesis: revelations from next generation sequencing studies. Semin Cancer Biol. 2013 Dec;23(6):422-30. 427. Capello D, Gaidano G. Molecular pathophysiology of indolent lymphoma. Haematologica 2000;85:195-201. 428. Merzianu M, Jiang L, Lin P, Wang X, et al. Nuclear BCL-10 expression is common in lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström macroglobulinemia and does not correlate with p65 NF-kappaB activation. Mod Pathol 2006;19:891-98. 429. Li L, Li GD, Jiang W, Yang WX, Liu WP, Li JM, Li FY. [Expression of bcl-10 protein in MALT lymphoma]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 2005 Dec;34(12):780-4. 430. Li L, Li GD, Jiang W, Yang WX, Liu WP, Zhang WY, Li JM, Tang Y. [Expression of BCL-10 protein and the relationship with API2-MALT1 fusion gene in extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa associated lymphoid tissue]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2006 Sep;28(9):678-82. 431. Talwalkar SS, Valbuena JR, Abruzzo LV, Admirand JH, et al. MALT1 gene rearrangements and NF-kappaB activation involving p65 and p50 are absent or rare in primary MALT lymphomas of the breast. Mod Pathol 2006;19:1402-8. 432. Zhu J, Wei RL, Wang LH, Jiao BH. [Significance of detection of Bcl-10 novel mutation in ocular adnexal mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma]. Zhonghua Yan Ke Za Zhi. 2007 Nov;43(11):1010-6. 433. Briones J, Moga E, Espinosa I, Vergara C, Alvarez E, Villa J, Bordes R, Delgado J, Prat J, Sierra J. Bcl-10 protein highly correlates with the expression of phosphorylated p65 NF-kappaB in peripheral T-cell lymphomas and is associated with clinical outcome. Histopathology. 2009 Mar;54(4):478-85. 258 BIBLIOGRAFIA 434. Geissinger E, Sadler P, Roth S, Grieb T, Puppe B, Müller N, Reimer P, Vetter- Kauczok CS, Wenzel J, Bonzheim I, Rüdiger T, Müller-Hermelink HK, Rosenwald A. Disturbed expression of the T-cell receptor/CD3 complex and associated signaling molecules in CD30+ T-cell lymphoproliferations. Haematologica. 2010 Oct;95(10):1697-704. 435. Moar-Antelo AR, Pérez-Sayáns M, Suárez-Peñaranda JM, Gayoso-Diz P, Barros- Angueira F, Gándara-Rey JM, García-García A. BCL10 expression is unrelated to clinico-pathological parameters or prognoses for oral squamous cell carcinomas. Biotech Histochem. 2012 Aug;87(6):423-7. 436. Rajasekaran K, Kumar P, Schuldt KM, Peterson EJ, Vanhaesebroeck B, Dixit V, Thakar MS, Malarkannan S. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10- MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat Immunol. 2013 Nov;14(11):1127-36. 437. Roach HI. Why does bone matrix contain non-collagenous proteins? The possible roles of osteocalcin, osteonectin, osteopontin and bone sialoprotein in bone mineralisation and resorption. Cell Biol Int. 1994 Jun;18(6):617-28. 438. Fanburg JC, Rosenberg AE, Weaver DL, Leslie KO, Mann KG, Taatjes DJ, Tracy RP. Osteocalcin and osteonectin immunoreactivity in the diagnosis of osteosarcoma. Am J Clin Pathol. 1997 Oct;108(4):464-73. 439. Fanburg-Smith JC, Bratthauer GL, Miettinen M. Osteocalcin and osteonectin immunoreactivity in extraskeletal osteosarcoma: a study of 28 cases. Hum Pathol 1999;30:32-8. 440. Sakamoto A, Oda Y, Iwamoto Y, Tsuneyoshi M. A comparative study of fibrous dysplasia and osteofibrous dysplasia with regard to expressions of c-fos and c-jun products and bone matrix proteins: a clinicopathologic review and immunohistochemical study of c-fos, c-jun, type I collagen, osteonectin, osteopontin, and osteocalcin. Hum Pathol. 1999 Dec;30(12):1418-26. 441. Won KY, Lee CH, Kim YW, Park YK. Primary giant-cell-rich osteosarcoma of the urinary bladder: usefulness of osteocalcin and osteonectin immunohistochemical staining and literature review. Pathology. 2011 Feb;43(2):161-4. 442. Stavri S, Zarnescu O. The expression of alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, and chondroitin sulfate during pectoral fin regeneration in Carassius auratus gibelio: a combined histochemical and immunohistochemical study. Microsc Microanal. 2013 Feb;19(1):233-42. 443. Ortega N, Werb Z. New functional roles for non-collagenous domains of basement membrane collagens. J Cell Sci 2002;15;(Pt 22):4201-14. 444. Honma K, Miyata T, Ochiya T. Type I collagen gene suppresses tumor growth and invasion of malignant human glioma cells. Cancer Cell Int. 2007 Jun 20;7:12. 259 BIBLIOGRAFIA 445. Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z. Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Mar;8(3):221-33. 446. Latvanlehto A, Fox MA, Sormunen R, Tu H, Oikarainen T, Koski A, Naumenko N, Shakirzyanova A, Kallio M, Ilves M, Giniatullin R, Sanes JR, Pihlajaniemi T. Musclederived collagen XIII regulates maturation of the skeletal neuromuscular junction. J Neurosci. 2010 Sep 15;30(37):12230-41. 447. Gunda V, Boosani CS, Verma RK, Guda C, Sudhakar YA. L-arginine mediated renaturation enhances yield of human, α6 Type IV collagen non-collagenous domain from bacterial inclusion bodies. Protein Pept Lett. 2012 Oct;19(10):1112-21. 448. Clause KC, Barker TH. Extracellular matrix signaling in morphogenesis and repair. Curr Opin Biotechnol. 2013 Oct;24(5):830-3. 449. Zaferani A, Talsma DT, Yazdani S, Celie JW, Aikio M, Heljasvaara R, Navis GJ, Pihlajaniemi T, van den Born J. Basement membrane zone collagens XV and XVIII/proteoglycans mediate leukocyte influx in renal ischemia/reperfusion. PLoS One. 2014 Sep 4;9(9):e106732. 450. Nita M, Strzałka-Mrozik B, Grzybowski A, Mazurek U, Romaniuk W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Med Sci Monit. 2014 Jun 18;20:1003-16. 451. Oefner CM, Sharkey A, Gardner L, Critchley H, Oyen M, Moffett A. Collagen type IV at the fetal-maternal interface. Placenta. 2015 Jan;36(1):59-68. 452. Joshi MG, Lee AK, Pedersen CA, Schnitt S, et al. The role of immunocytochemical markers in the differential diagnosis of proliferative and neoplastic lesions of the breast. Mod Pathol 1996;9:57-62. 453. Huang L, Espinoza C, Welsh R. Malignant peripheral nerve sheath tumor with divergent differentiation. Arch Pathol Lab Med 2003;127:147-50. 454. Huang L, Espinoza C, Welsh R. Malignant peripheral nerve sheath tumor with divergent differentiation. Arch Pathol Lab Med. 2003 Mar;127(3):e147-50. 455. Pytel P, Taxy JB, Krausz T. Divergent differentiation in malignant soft tissue neoplasms: the paradigm of liposarcoma and malignant peripheral nerve sheath tumor. Int J Surg Pathol. 2005 Jan;13(1):19-28. 456. Shintaku M, Wada K, Wakasa T, Ueda M. Malignant peripheral nerve sheath tumor with fibroblastic differentiation in a patient with neurofibromatosis type 1: imprint cytological findings. Acta Cytol. 2011;55(5):467-72. 457. Guo A, Liu A, Wei L, Song X. Malignant peripheral nerve sheath tumors: differentiation patterns and immunohistochemical features - a mini-review and our new findings. J Cancer. 2012;3:303-9. 260 BIBLIOGRAFIA 458. Yantiss RK, Goldman H, Odze RD. Hyperplastic polyp with epithelial misplacement (inverted hyperplastic polyp): a clinicopathologic and immunohistochemical study of 19 cases. Mod Pathol. 2001 Sep;14(9):869-75. 459. Yantiss RK, Bosenberg MW, Antonioli DA, Odze RD. Utility of MMP-1, p53, E- cadherin, and collagen IV immunohistochemical stains in the differential diagnosis of adenomas with misplaced epithelium versus adenomas with invasive adenocarcinoma. Am J Surg Pathol 2002;26:206-15. 460. Ichikawa Y, Nagashima Y, Morioka K, Akimoto K, Kojima Y, Ishikawa T, Goto A, Kobayashi N, Watanabe K, Ota M, Fujii S, Kawamata M, Takagawa R, Kunizaki C, Takahashi H, Nakajima A, Maeda S, Shimada H, Inayama Y, Ohno S, Endo I. Colorectal laterally spreading tumors show characteristic expression of cell polarity factors, including atypical protein kinase C λ/ι, E-cadherin, β-catenin and basement membrane component. Oncol Lett. 2014 Sep;8(3):977-984. 461. Virchow R. Lecture XVII. Amyloid degeneration. Inflammation. In: Cellular Pathology as Based Upon Physiological and Pathological Histology. New York: Dover Publications, 1971;pp:409-37. 462. Skinner M, Pepys MB, Cohen AS, Heller LM, Lian JB. Amyloid and Amyloidosis. Eds: Glenner GG, Pinho e Costa P, Falcao de Freitas F. Amsterdam: Excerpta Medica, 1980;pp:384-91. 463. Linke RP. Monoclonal antibodies against amyloid fibril protein AA. Production, specificity, and use for immunohistochemical localization and classification of AA- type amyloidosis. J Histochem Cytochem. 1984 Mar;32(3):322-8. 464. Donini U, Casanova S, Dal Bosco F, Linke RP. Immunohistochemical typing of amyloid on hydroxyethyl-methacrylate-embedded renal biopsies. Appl Pathol. 1984;2(6):299-307. 465. Störkel S, Stürer A. Combined amyloidosis of the AA and AB type following chronic hemodialysis. Pathologe 1989;10:107-13. 466. Hoshii Y, Takahashi M, Ishihara T, Uchino F. Immunohistochemical classification of 140 autopsy cases with systemic amyloidosis. Pathol Int. 1994 May;44(5):352-8. 467. Toyoda M, Ebihara Y, Kato H, Kita S. Tracheobronchial AL amyloidosis: histologic, immunohistochemical, ultrastructural, and immunoelectron microscopic observations. Hum Pathol. 1993 Sep;24(9):970-6. Erratum in: Hum Pathol 1994 Jan;25(1):113. 468. Tennent GA, Lovat LB, Pepys MB. Serum Amyloid P component prevents proteolysis of the amyloid fibrils of Alzheimer’s disease and systemic amyloidosis. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:4299-303. 469. Isobe T, Matsushita T, Minakata T, et al. Coexistence of AL and Ab2M amyloid in tissues of a patient with myeloma on hemodialysis. Amyloid 1996;3:41-43. 261 BIBLIOGRAFIA 470. Röcken C, Schwotzer EB, Linke RP, Saeger W. The classification of amyloid deposits in clinicopathological practice. Histopathology. 1996 Oct;29(4):325-35 471. Shah PL, Gillmore JD, Copley SJ, Collins JV, Wells AU, du Bois RM, Hawkins PN, Nicholson AG. The importance of complete screening for amyloid fibril type and systemic disease in patients with amyloidosis in the respiratory tract. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis. 2002 Jun;19(2):134-42. 472. Liepnieks JJ, Benson MD. Codeposition of transthyretin and immunoglobulin lambda light chain in senile cardiac (ATTR) amyloidosis. In: Grateau G, Kyle R, Skinner M, eds. Amyloid and Amyloidosis. London: CRC Press, 2005;pp:332-33. 473. Kebbel A, Rocken C. Immunohistochemical classification of amyloid in surgical pathology revisited. Am J Surg Pathol 2006;30:673-83. 474. Kebbel A, Röcken C. Immunohistochemical classification of amyloid in surgical pathology revisited. Am J Surg Pathol. 2006 Jun;30(6):673-83. 475. Linke RP, Oos R, Wiegel NM, Nathrath WB. Classification of amyloidosis: misdiagnosing by way of incomplete immunohistochemistry and how to prevent it. Acta Histochem. 2006;108(3):197-208. 476. Shah KB, Inoue Y, Mehra MR. Amyloidosis and the heart: a comprehensive review. Arch Intern Med. 2006 Sep 25;166(17):1805-13. 477. Kuçi H, Ebert MP, Röcken C. Anti-lambda-light chain-peptide antibodies are suitable for the immunohistochemical classification of AL amyloid. Histol Histopathol. 2007 Apr;22(4):379-87. 478. Collins AB, Smith RN, Stone JR. Classification of amyloid deposits in diagnostic cardiac specimens by immunofluorescence. Cardiovasc Pathol. 2009 Jul- Aug;18(4):205-16 479. von Hutten H, Mihatsch M, Lobeck H, Rudolph B, Eriksson M, Röcken C. Prevalence and origin of amyloid in kidney biopsies. Am J Surg Pathol. 2009 Aug;33(8):1198- 205 480. Röcken C. [Update on immunohistological classification of amyloidoses]. Pathologe. 2009 Dec;30 Suppl 2:121-3. 481. Schönland SO, Hegenbart U, Bochtler T, Mangatter A, Hansberg M, Ho AD, Lohse P, Röcken C. Immunohistochemistry in the classification of systemic forms of amyloidosis: a systematic investigation of 117 patients. Blood. 2012 Jan 12;119(2):488-93. 482. Leong A SY. Pitfalls in diagnostic immunohistology. Adv Anat Pathol 2004; 11:86-93. 483. Long E, Hofman V, Ilie M, Washetine K, Lespinet V, Bonnetaud C, Bordone O, Gavric-Tanga V, Gaziello MC, Lassalle S, Selva E, Zahaf K, Lamy A, Sabourin JC, Hofman P. [Accreditation of the activity of molecular pathology according to ISO 262 BIBLIOGRAFIA 15189: key steps to follow and the main potential pitfalls]. Ann Pathol. 2013 Feb;33(1):12-23. 484. Li X. Pitfalls in the pathological diagnosis of lymphoma. Chin Clin Oncol. 2015 Mar;4(1):3. 485. Williamson DA, Chen SC. Contemporary molecular approaches in the clinical microbiology laboratory: progress and pitfalls. Pathology. 2015 Apr;47(3):189-90. 486. Horling L, Neuhuber WL, Raab M. Pitfalls using tyramide signal amplification (TSA) in the mouse gastrointestinal tract: endogenous streptavidin-binding sites lead to false positive staining. J Neurosci Methods. 2012 Feb 15;204(1):124-32 487. Zheng H, Jiang HY, Yan YH. [Effect of endogenous biotin on SP immunohistochemical result]. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2003 Apr;28(2):195-6. 488. Srivastava A, Tischler AS, Delellis RA. Endogenous biotin staining as an artifact of antigen retrieval with automated immunostaining. Endocr Pathol. 2004 Summer;15(2):175-8. 489. Cruz Spano L, Merçon de Vargas PR, Gagliardi Leite JP, Pereira do Nascimento J. False positive reaction due to endogenous biotin activity in glandular epithelium of decidua. Braz J Microbiol 2005;36:109-13. 490. McKay BE, Molineux ML, Turner RW. Endogenous biotin in rat brain: implications for false-positive results with avidin-biotin and streptavidin-biotin techniques. Methods Mol Biol. 2008;418:111-28. 491. Kamphuis W, Klooster J. Pseudo-immunolabelling with the avidin-biotin-peroxidase complex due to the presence of endogenous biotin in the retina. Methods Mol Biol. 2008;418:129-38. 492. Nikiel B, Chekan M, Jarzab M, Lange D. Endogenous avidin biotin activity (EABA) in thyroid pathology: immunohistochemical study. Thyroid Res. 2009 Apr 8;2(1):5. 493. Ahrens WA, Folpe AL. CD1a immunopositivity in perivascular epithelioid cell neoplasms: true expression or technical artifact? A streptavidin-biotin and polymerbased detection system immunohistochemical study of perivascular epithelioid cell neoplasms and their morphologic mimics. Hum Pathol. 2011 Mar;42(3):369-74. 494. Kalousek DK, Lau AE. Pathology of spontaneous abortion. In: Dimmick JE and Kalousek, eds. Developmental pathology of the embryo and fetus. Philadelphia: Lippincott, 1992;pp:55-82. 495. Kaplan C. The placenta and viral infections. Seminars Diag Pathol 1993;10: 232-50. 496. Yokoyama S, Kashima K, Inoue S, Daa T, et al. Biotin-containing intranuclear inclusions in endometrial glands during gestation and puerperium. Am J Clin Pathol 1993;99:13-7. 263 BIBLIOGRAFIA 497. Sickel JZ, di Sant’Agnese PA. Anomalous immunostaining of ‘optically clear’ nuclei in gestational endometrium. A potential pitfall in the diagnosis of pregnancy-related herpesvirus infection. Arch Pathol Lab Med 1994;118:831-3. 498. Nakatani Y, Kitamura H, Inayama Y, Ogawa N. Pulmonary endodermal tumor resembling fetal lung. The optically clear nucleus is rich in biotin. Am J Surg Pathol 1994;18:637-42. 499. Ekblad U. Biological Agents and Pregnancy. JOEM 1995;37:962-65. 500. Kashima K, Yokoyama S, Daa T, Nakayama I, et al. Cytoplasmic biotin-like activity interferes with immunohistochemical analysis of thyroid lesions: a comparison of antigen retrieval methods. Mod Pathol 1997;10:515-9. 501. Bussolati G, Gugliotta P, Volante M, Pace M, Papotti M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology 1997;31:400-7. 502. Cameselle-Teijeiro J, Chan JK. Cribriform-morular variant of papillary carcinoma: a distinctive variant representing the sporadic counterpart of familial adenomatous polyposis-associated thyroid carcinoma? Mod Pathol 1999;12:400-11. 503. Zheng H, Jiang HY, Yan YH. [Effect of endogenous biotin on SP immunohistochemical result]. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2003 Apr;28(2):195-6. 504. Srivastava A, Tischler AS, Delellis RA. Endogenous biotin staining as an artifact of antigen retrieval with automated immunostaining. Endocr Pathol. 2004 Summer;15(2):175-8. 505. Cruz Spano L, Merçon de Vargas PR, Gagliardi Leite JP, Pereira do Nascimento J. False positive reaction due to endogenous biotin activity in glandular epithelium of decidua. Braz J Microbiol 2005;36:109-13. 506. McKay BE, Molineux ML, Turner RW. Endogenous biotin in rat brain: implications for false-positive results with avidin-biotin and streptavidin-biotin techniques. Methods Mol Biol. 2008;418:111-28. 507. Kamphuis W, Klooster J. Pseudo-immunolabelling with the avidin-biotin-peroxidase complex due to the presence of endogenous biotin in the retina. Methods Mol Biol. 2008;418:129-38. 508. Nikiel B, Chekan M, Jarzab M, Lange D. Endogenous avidin biotin activity (EABA) in thyroid pathology: immunohistochemical study. Thyroid Res. 2009 Apr 8;2(1):5. 509. Ahrens WA, Folpe AL. CD1a immunopositivity in perivascular epithelioid cell neoplasms: true expression or technical artifact? A streptavidin-biotin and polymerbased detection system immunohistochemical study of perivascular epithelioid cell neoplasms and their morphologic mimics. Hum Pathol. 2011 Mar;42(3):369-74. 510. Sonwalkar SA, Rotimi O, Scott N, Verghese E, Dixon M, Axon ATRA, et al. A study of indefinite for dysplasia in Barrett's oesophagus: reproducibility of diagnosis, clinical 264 BIBLIOGRAFIA outcomes and predicting progression with AMACR (alpha-methylacylCoA- racemase). Histopathology 2010 Jun;56(7):900-7. 511. Hanahan D, Weinberg R A. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100: 57–70 512. Curvers WL, ten Kate FJ, Krishnadath KK, Visser M, Elzer B, Baak LC, et al. Lowgrade dysplasia in Barrett's esophagus: overdiagnosed and underestimated. Am J Gastroenterol 2010 Jul;105(7):1523-30. 513. Bhat S, Coleman HG, Yousef F, Johnston BT, McManus DT, Gavin AT, et al. Risk of malignant progression in Barrett's esophagus patients: results from a large population-based study. J Natl Cancer Inst 2011 Jul 6;103(13):1049-57. 514. Dulai GS, Shekelle PG, Jensen DM, Spiegel BMR, Chen J, Oh D, et al. Dysplasia and risk of further neoplastic progression in a regional Veterans Administration Barrett's cohort. Am J Gastroenterol 2005 Apr;100(4):775e83. 515. Wani SB, Falk GW, Post J, Yerian L, Hall M, Wang A, et al. Risk factors for progression of low-grade dysplasia in patients with Barrett's esophagus. Elsevier Gastroenterology 2011 Oct 1;141(4):1179e86. 1186.- 516. Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res 1994; 54:4855–78. 517. Kim R, Clarke MR, Melhem MF, Yuong MA, Vanbibber MM, Safatle-Ribeiro AV, et al. Expression of p53, PCNA, cerB-2 in Barrett’s metaplasia and adenocarcinoma. Dig Dis Sci. 1997 Dec; 42(12):2453-62. 518. Reid BJ, Prevo LJ, Galipeau P, Sanchez C, Longton G, Levine DS. Barrett’s oesophagus: from metaplasia to dysplasia and cancer. Gut 2005; 54(Suppl I):i6–i12. 519. Levine DS. Barrett’s oesophagus and p53. Lancet 1994; 344:212-3. 520. Younes M, Lechago J, Chakraborty S, Ostrowski M, Bridges M, Meriano F, et al. Relationship between dysplasia, p53 protein accumulation, DNA ploidy and Glut-1 overexpression in Barrett’s metaplasia. Scand J Gastroenterology. 2000. Feb; 35(2):131-7. 521. Giménez A, de Haro LM, Parrilla P, Bermejo J. Immunohistochemical detection of p53 protein could improve the management of some patients with Barrett’s oesophagus and mild histologic alterations. Arch Pathol Lab Med.1999. Dec; 123(12):1260-3. 522. Illueca C, Llombart Bosch A, Ferrando C. Factores pronósticos en el esófago de Barrett: estudio inmunohistoquímico y morfométrico de 120 casos. J. Rev. Esp. Enferm. Dig. 2000; 92(11):726-37. 523. Coggi G, Bosari S, Roncalli M, Grazianni D, Bossi P, Viale G et al. P53 protein accumulatión en p53 gene mutatión in esophageal carcinoma. A molecular and 265 BIBLIOGRAFIA immunohistochemical study whith clinicopathologic correlations. Cancer. 1997;79:425-32. 524. Garewall H, Ramsey L, Sharma P, Kraus K, Sampliner R, Fass R. Biomarkers studies in reversed Barrett’s esophagus. Am J Gastroenterol. 1999; 94(10):2829-33. 525. Klump B, Hsich CJ, Holzmann K, Borchard F, Gaco V, Greschnich A. Diagnostic significance of nuclear p53 expression in the surveillance of Barrett’s esophagus. A longitudinal study. Gastroenterology. 1999; 37(10): 1005-11. 526. ] Dulak AM, Stojanov P, Peng S, Lawrence MS, Fox C, Stewart C, et al. Exome and whole-genome sequencing of esophageal adenocarcinoma identifies recurrent driver events and mutational complexity. Nat Genet 2013 May;45(5):478-86. 527. Schneider PM, Casson AG, Levin B, Garewal HS, Hoelscher AH, Becker K, et al. Mutations of p53 in Barrett's esophagus and Barrett's cancer: a prospective study of ninety-eight cases. J Thorac Cardiovasc Surg 1996;111(2):323-33. 528. Weaver JMJ, Ross-Innes CS, Shannon N, Lynch AG, Forshew T, Barbera M, et al. Ordering of mutations in preinvasive disease stages of esophageal carcinogenesis. Nat Genet 2014 Jun 22;46(8):837-43 529. Galipeau PC, Prevo LJ, Sanchez CA, Longton GM, Reid BJ. Clonal expansion and loss of heterozygosity at chromosomes 9p and 17p in premalignant esophageal (Barrett's tissue). J Natl Cancer Inst 1999;91(24):2087-95. 530. Kaye PV, Haider SA, James PD, Soomro I, Catton J, Parsons SL, et al. Novel staining pattern of p53 in Barrett's dysplasiaethe absent pattern. Histopathology 2010 Dec;57(6):933-5. 531. Fitzgerald RC, Pietro M, Ragunath K, Ang Y, Kang J, Watson P, et al. British society of gastroenterology guidelines on the diagnosis and management of Barrett's oesophagus. 2013. p. 1-36. 532. Kaye PV, Haider SA, Ilyas M, James PD, Soomro I, Faisal W, et al. Barrett's dysplasia and the Vienna classification: reproducibility, prediction of progression and impact of consensus reporting and p53 immunohistochemistry. Histopathology 2009 May;54(6):699-712. 533. Sikkema M, Kerkhof M, Steyerberg EW, Kusters JG, van Strien PMH, Looman CWN, et al. Aneuploidy and overexpression of Ki67 and p53 as markers for neoplastic progression in Barrett's esophagus: a case-control study. Am J Gastroenterol 2009 Nov;104(11):2673-80. 534. Rygiel AM, Milano F, Ten Kate FJ, Schaap A, Wang KK, Peppelenbosch MP, et al. Gains and amplifications of c-myc, EGFR, and 20.q13 loci in the no dysplasiadysplasia-adenocarcinoma sequence of Barrett's esophagus. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2008 Jun;17(6):1380-5. 272 BIBLIOGRAFIA 608. Shaheen NJ, Dulai GS, Ascher B, Mitchell KL, Schmitz SM. Effect of a new diagnosis of Barrett’s esophagus on insurance status. Am J Gastroenterol. 2005;100(3):577-580. 609. Crockett SD, Lippmann QK, Dellon ES, Shaheen NJ. Health-related quality of life in patients with Barrett’s esophagus: a systematic review. Clin Gastroenterol Hepatol. 2009;7(6):613-623. 610. Corley DA, Levin TR, Habel LA,Weiss NS, Buffler PA. Surveillance and survival in Barrett´s adenocarcinomas: a population-based study. Gastroenterology. 2002;122(3):633-640. 611. Provenzale D, Schmitt C,Wong JB. Barrett´s esophagus: a new look at surveillance based on emerging estimates of cancer risk. Am J Gastroenterol. 1999;94(8):2043- 2053. 612. Sonnenberg A, Soni A, Sampliner RE. Medical decision analysis of endoscopic surveillance of Barrett´s oesophagus to prevent oesophageal adenocarcinoma. Aliment Pharmacol Ther. 2002;16(1):41-50. 613. Hur C, Nishioka NS, Gazelle GS. Cost-effectiveness of aspirin chemoprevention for Barrett´s esophagus. J Natl Cancer Inst. 2004;96(4):316-325. Spechler SJ. Screening and surveillance for Barrett´s esophagus—an unresolved dilemma. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol. 2007;4(9):470-471. 614. Singh S, Manickam P, Amin AV, Samala N, Schouten LJ, Iyer PG, Desai TK. Incidence of esophageal adenocarcinoma in Barrett's esophagus with low-grade dysplasia: a systematic review and meta-analysis. Gastrointest Endosc. 2014 Jun;79(6):897-909 615. Reid BJ, Weinstein WM, Lewin KJ, Haggitt RC, VanDeventer G, DenBesten L, Rubin CE. Endoscopic biopsy can detect high-grade dysplasia or early adenocarcinoma in Barrett's esophagus without grossly recognizable neoplastic lesions. Gastroenterology. 1988 Jan;94(1):81-90 616. Cameron AJ, Carpenter HA. Barrett's esophagus, high-grade dysplasia, and early adenocarcinoma: a pathological study. Am J Gastroenterol. 1997 Apr;92(4):586-91 617. Konda VJ, Ross AS, Ferguson MK, Hart JA, Lin S, Naylor K, Noffsinger A, Posner MC, Dye C, Cislo B, Stearns L, Waxman I. Is the risk of concomitant invasive esophageal cancer in high-grade dysplasia in Barrett's esophagus overestimated? Clin Gastroenterol Hepatol. 2008 Feb;6(2):159-64. 618. Collard JM. High-grade dysplasia in Barrett's esophagus. The case for esophagectomy. Chest Surg Clin N Am. 2002 Feb;12(1):77-92 619. Peters JH. SSAT controversies intramucosal esophageal cancer and high-grade dysplasia: which treatment? Surgical therapy: improved outcomes and piece of mind. J Gastrointest Surg. 2009 Jul;13(7):1179-81. 273 BIBLIOGRAFIA 620. Nasr JY, Schoen RE. Prevalence of adenocarcinoma at esophagectomy for Barrett's esophagus with high grade dysplasia. J Gastrointest Oncol. 2011 Mar;2(1):34-8 621. Levine DS, Haggitt RC, Blount PL, et al. An endoscopic biopsy protocol can differentiate high-grade dysplasia from early adenocarcinoma in Barrett's esophagus. Gastroenterology 1993; 105:40. 622. Falk GW, Rice TW, Goldblum JR, Richter JE. Jumbo biopsy forceps protocol still misses unsuspected cancer in Barrett's esophagus with high-grade dysplasia. Gastrointest Endosc 1999; 49:170. 623. Abela JE, Going JJ, Mackenzie JF, et al. Systematic four-quadrant biopsy detects Barrett's dysplasia in more patients than nonsystematic biopsy. Am J Gastroenterol 2008; 103:850. 624. Curvers WL, Bansal A, Sharma P, Bergman JJ. Endoscopic work-up of early Barrett's neoplasia. Endoscopy 2008; 40:1000. 625. ASGE Standards of Practice Committee, Evans JA, Early DS, et al. The role of endoscopy in the assessment and treatment of esophageal cancer. Gastrointest Endosc 2013; 77:328. 626. Canto MI, Setrakian S, Willis J, et al. Methylene blue-directed biopsies improve detection of intestinal metaplasia and dysplasia in Barrett's esophagus. Gastrointest Endosc 2000; 51:560. 627. Scotiniotis IA, Kochman ML, Lewis JD, et al. Accuracy of EUS in the evaluation of Barrett's esophagus and high-grade dysplasia or intramucosal carcinoma. Gastrointest Endosc 2001; 54:689. 628. Kobayashi K, Izatt JA, Kulkarni MD, et al. High-resolution cross-sectional imaging of the gastrointestinal tract using optical coherence tomography: preliminary results. Gastrointest Endosc 1998; 47:515. 629. Georgakoudi I, Jacobson BC, Van Dam J, et al. Fluorescence, reflectance, and lightscattering spectroscopy for evaluating dysplasia in patients with Barrett's esophagus. Gastroenterology 2001; 120:1620. 630. Kendall C, Stone N, Shepherd N, et al. Raman spectroscopy, a potential tool for the objective identification and classification of neoplasia in Barrett's oesophagus. J Pathol 2003; 200:602. 631. Wallace MB, Sharma P, Lightdale C, et al. Preliminary accuracy and interobserver agreement for the detection of intraepithelial neoplasia in Barrett's esophagus with probe-based confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc 2010; 72:19. 632. American Gastroenterological Association, Spechler SJ, Sharma P, et al. American Gastroenterological Association medical position statement on the management of Barrett's esophagus. Gastroenterology 2011; 140:1084. 274 BIBLIOGRAFIA 633. Fitzgerald RC, di Pietro M, Ragunath K, et al. British Society of Gastroenterology guidelines on the diagnosis and management of Barrett's oesophagus. Gut 2014; 63:7. 634. ASGE Standards of Practice Committee, Evans JA, Early DS, et al. The role of endoscopy in Barrett's esophagus and other premalignant conditions of the esophagus. Gastrointest Endosc 2012; 76:1087. 635. ASGE Standards of Practice Committee, Sharaf RN, Shergill AK, et al. Endoscopic mucosal tissue sampling. Gastrointest Endosc 2013; 78:216. 636. Fleischer DE, Odze R, Overholt BF, et al. The case for endoscopic treatment of nondysplastic and low-grade dysplastic Barrett’s esophagus. Dig Dis Sci. 2010;55:1918– 1931. 637. El-Serag HB, Graham DY. Routine polypectomy for colorectal polyps and ablation for Barrett’s esophagus are intellectually the same. Gastroenterology. 2011;140:386– 388. 638. Madisch A , Miehlke S , Bayerdorff er E et al. Long-term follow-up aft er complete ablation of Barrett's esophagus with argon plasma coagulation . World J Gastroenterol 2005;11: 1182–6. 639. Manner H , May A , Miehlke S et al. Ablation of nonneoplastic Barrett's mucosa using argon plasma coagulation with concomitant esomeprazole therapy (APBANEX): a prospective multicenter evaluation . Am J Gastroenterol 2006 ; 101 : 1762 – 9 . 640. Ferraris R , Fracchia M , Foti M et al. Barrett's oesophagus: long-term follow-up aft er complete ablation with argon plasma coagulation and the factors that determine its recurrence . Aliment Pharmacol Th er 2007 ; 25 : 835 – 40 . 641. Gondrie JJ, Pouw RE, Sondermeijer CM, et al. Effective treatment of early Barrett’s neoplasia with stepwise circumferential and focal ablation using the HALO system. Endoscopy. 2008;40:370–379. 642. Fleischer DE, Overholt BF, Sharma VK, et al. Endoscopic radiofrequency ablation for Barrett’s esophagus: 5-year outcomes from a prospective multicenter trial. Endoscopy. 2010;42:781–789. 643. Shaheen NJ, Fleischer DE, Eisen GM, et al. Durability of epithelial reversion after radiofrequency ablation: follow-up of the AIM dysplasia trial. Gastroenterology. 2010;138:A92 644. Spechler SJ. Barrett's Esophagus without dysplasia: wait or ablate? Dig Dis Sci. 2011 Jul;56(7):1926-8 645. Shaheen NJ , Sharma P , Overholt BF et al. Radiofrequency ablation in Barrett's esophagus with dysplasia . N Engl J Med 2009 ; 360 : 2277 – 88 . 132. Shaheen NJ , Overholt BF , Sampliner RE et al. Durability of radiofrequency ablation in Barrett's esophagus with dysplasia . Gastroenterology 2011;141:460–8. 275 BIBLIOGRAFIA 646. Bennett C, Moayyedi P, Corley DA, DeCaestecker J, Falck-Ytter Y, Falk G, Vakil N, Sanders S, Vieth M, Inadomi J, Aldulaimi D, Ho KY, Odze R, Meltzer SJ, Quigley E, Gittens S, Watson P, Zaninotto G, Iyer PG, Alexandre L, Ang Y, Callaghan J, Harrison R, Singh R, Bhandari P, Bisschops R, Geramizadeh B, Kaye P, Krishnadath S, Fennerty MB, Manner H, Nason KS, Pech O, Konda V, Ragunath K, Rahman I, Romero Y, Sampliner R, Siersema PD, Tack J, Tham TC, Trudgill N, Weinberg DS, Wang J, Wang K, Wong JY, Attwood S, Malfertheiner P, MacDonald D, Barr H, Ferguson MK, Jankowski J. BOB CAT: a Large-Scale Review and Delphi Consensus for Management of Barrett's Esophagus With No Dysplasia, Indefinite for, or Low-Grade Dysplasia. Am J Gastroenterol. 2015 May;110(5):662-82 647. Wani S, Falk GW , Post J et al. Risk factors for progression of low-grade dysplasia in patients with Barrett's esophagus. G astroenterology 2 011; 1 41: 1 179– 8 6. 648. Singh S , Sharma AN , Murad MH et al. Central adiposity is associated with increased risk of esophageal infl ammation, metaplasia, and adenocarcinoma: a systematic review and meta-analysis . Clin Gastroenterol Hepatol 2013 ; 11 : 1399 – 412 . 649. Abdalla M, Dhanekula R , Greenspan M et al. Dysplasia detection rate of confi rmatory EGD in nondysplastic Barrett's esophagus. Dis Esophagus 2014; 27:505–10 . 650. Phoa KN , van Vilsteren FG , Weusten BL et al. Radiofrequency ablation vs endoscopic surveillance for patients with Barrett esophagus and lowgrade dysplasia: a randomized clinical trial . JAMA 2014; 311:1209 – 17 . 651. Picardo SL , O'Brien MP , Feighery R et al. A Barrett's esophagus registry of over 1000 patients from a specialist center highlights greater risk of progression than population-based registries and high risk of low grade dysplasia . Dis Esophagus 2015 ; 28 : 121 – 6 652. Shaheen NJ , Sharma P , Overholt BF et al. Radiofrequency ablation in Barrett's esophagus with dysplasia . N Engl J Med 2009 ; 360 : 2277 – 88. 653. Shaheen NJ , Overholt BF , Sampliner RE et al. Durability of radiofrequency ablation in Barrett's esophagus with dysplasia . Gastroenterology 2011 ; 141 : 460 – 8 . 654. Pech O , Behrens A , May A et al. Curative endoscopic therapy for Barrett's early cancer and high grade dysplasia: long-term results in 304 patients . Gastrointest Endosc 2006 ; 63 : AB83 . 655. Ell C , May A , Gossner L et al. Endoscopic mucosal resection of early cancer and high-grade dysplasia in Barrett's esophagus . Gastroenterology 2000 ; 118 : 670 – 7 . 656. Schlemper RJ , Riddell RH , Kato Y et al. Th e Vienna classifi cation of gastrointestinal epithelial neoplasia . Gut 2000 ; 47 : 251 – 5 . 276 BIBLIOGRAFIA 657. Montgomery E , Bronner MP , Goldblum JR et al. Reproducibility of the diagnosis of dysplasia in Barrett esophagus: a reaffi rmation . Hum Pathol 2001 ; 32 : 368 – 78 . 658. Horvath B , Singh P , Xie H et al. Risk for esophageal neoplasia in Barrett's esophagus patients with mucosal changes indefi nite for dysplasia . J Gastroenterol Hepatol 2015 ; 30 : 262 – 7 . 659. Younes M , Lauwers GY , Ertan A et al. Th e significance of "indefinite for dysplasia" grading in Barrett metaplasia . Arch Pathol Lab Med 2011 ; 135 : 430 – 2 . 660. Curvers WL , ten Kate FJ , Krishnadath KK et al. Low-grade dysplasia in Barrett's esophagus: overdiagnosed and underestimated . Am J Gastroenterol 2010 ; 105 : 1523 – 30 . 661. Duits LC , Phoa KN , Curvers WL et al. Barrett's oesophagus patients with low-grade dysplasia can be accurately risk-stratified after histological review by an expert pathology panel . Gut 2014 , 10.1136/gutjnl-2014-307278:10.1136/gutjnl-2014- 307278. 662. Reid BJ, Weinstein WM, Lewin KJ, Haggitt RC, VanDeventer G, DenBesten L, Rubin CE. Endoscopic biopsy can detect high-grade dysplasia or early adenocarcinoma in Barrett's esophagus without grossly recognizable neoplastic lesions. Gastroenterology. 1988 Jan;94(1):81-90 663. Almond LM, Barr H, Jankowski J. Barrett’s Oesophagus. In: SM Griffin, SA Raimes, editors. A companion to specialist surgical practice: oesophagogastric surgery. 5th ed. Saunders Elsevier (in print). 664. Buttar NS, Wang KK, Sebo TJ, et al. Extent of high-grade dysplasia in Barrett’s esophagus correlates with risk of adenocarcinoma. Gastroenterology. 2001;120(7):1630–9. 665. Altorki NK, Sunagawa M, Little AG, et al. High-grade dysplasia in the columnar-lined esophagus. Am J Surg. 1991;161(1):97–9. 666. Pera M, Trastek VF, Carpenter HA, et al. Barrett’s esophagus with high-grade dysplasia: an indication for esophagectomy? Ann Thorac Surg. 1992;54(2):199–204. 667. Streitz JM Jr, Andrews CW Jr, Ellis FH. Endoscopic surveillance of Barrett’s esophagus. Does it help? J Thorac Cardiovasc Surg. 1993;105(3):383–7. 668. Levine DS, Haggitt RC, Blount PL, et al. An endoscopic biopsy protocol can differentiate high-grade dysplasia from early adenocarcinoma in Barrett’s esophagus. Gastroenterology. 1993; 105(1):40–50. 669. Edwards MJ, Gable DR, Lentsch AB, et al. The rationale for esophagectomy as the optimal therapy for Barrett’s esophagus with high-grade dysplasia. Ann Surg. 1996;223(5):585–9. 277 BIBLIOGRAFIA 670. Peters JH, Clark GW, Ireland AP, et al. Outcome of adenocarcinoma arising in Barrett’s esophagus in endoscopically surveyed and nonsurveyed patients. J Thorac Cardiovasc Surg. 1994;108(5):813–21. 671. Rice TW, Falk GW, Achkar E, et al. Surgical management of high-grade dysplasia in Barrett’s esophagus. Am J Gastroenterol. 1993;88(11):1832–6. 672. Collard JM, Romagnoli R, Hermans BP, et al. Radical esophageal resection for adenocarcinoma arising in Barrett’s esophagus. Am J Surg. 1997;174(3):307–11. 673. FergusonMK, Naunheim KS. Resection for Barrett’s mucosa with high-grade dysplasia: implications for prophylactic photodynamic therapy. J Thorac Cardiovasc Surg. 1997;114(5):824–9. 674. Cameron AJ, Carpenter HA. Barrett’s esophagus, high-grade dysplasia, and early adenocarcinoma: a pathological study. Am J Gastroenterol. 1997;92(4):586–91. 675. Falk GW, Rice TW, Goldblum JR, et al. Jumbo biopsy forceps protocol still misses unsuspected cancer in Barrett’s esophagus with high-grade dysplasia. Gastrointest Endosc. 1999;49(2): 170–6. 676. Headrick JR, Nichols FC 3rd, Miller DL, et al. High-grade esophageal dysplasia: long-term survival and quality of life after esophagectomy. Ann Thorac Surg. 2002;73(6):1697–702. 677. Tseng EE, Wu TT, Yeo CJ, et al. Barrett’s esophagus with high grade dysplasia: surgical results and long-term outcome–an update. J Gastrointest Surg. 2003;7(2):164–70. 678. Sujendran V, Sica G, Warren B, et al. Oesophagectomy remains the gold standard for treatment of high-grade dysplasia in Barrett’s oesophagus. Eur J Cardiothorac Surg. 2005;28(5):763–6. 679. Reed MF, Tolis G Jr, Edil BH, et al. Surgical treatment of esophageal high-grade dysplasia. Ann Thorac Surg. 2005;79(4): 1110–5. 680. Wang VS, Hornick JL, Sepulveda JA, et al. Low prevalence of submucosal invasive carcinoma at esophagectomy for highgrade dysplasia or intramucosal adenocarcinoma in Barrett’s esophagus: a 20-year experience. Gastrointest Endosc. 2009;69(4):777–83. 681. Nasr JY, Schoen RE. Prevalence of adenocarcinoma at esophagectomy for Barrett’s esophagus with high grade dysplasia. J Gastrointest Oncol. 2011;2(1):34–8. 105(1):40–50. 682. Konda VJ, Ross AS, Ferguson MK, et al. Is the risk of concomitant invasive esophageal cancer in high-grade dysplasia in Barrett’s esophagus overestimated? Clin Gastroenterol Hepatol. 2008;6(2):159–64. 278 BIBLIOGRAFIA 683. Tharavej C, Hagen JA, Peters JH, Portale G, Lipham J, DeMeester SR, et al. Predictive factors of coexisting cancer in Barrett’s high-grade dysplasia. Surg Endosc. 2006;20(3): 439–43. 684. Chennat J, Waxman I. Endoscopic treatment of Barrett’s esophagus: from metaplasia to intramucosal carcinoma. World J Gastroenterol. 2010;16(30):3780–5. 685. Leung WD, Chennat J. Comparison of endoscopic and surgical resection of intramucosal carcinoma in Barrett’s esophagus. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2011;5(5):575–8. 686. Nealis TB, Washington K, Keswani RN. Endoscopic therapy of esophageal premalignancy and early malignancy. J Natl Compr Canc Netw. 2011;9(8):890–9. 687. Prasad GA, Wu TT, Wigle DA, et al. Endoscopic and surgical treatment of mucosal (T1a) esophageal adenocarcinoma in Barrett’s esophagus. Gastroenterology. 2009;137(3):815–23. 688. Schembre DB, Huang JL, Lin OS, et al. Treatment of Barrett’s esophagus with early neoplasia: a comparison of endoscopic therapy and esophagectomy. Gastrointest Endosc. 2008;67(4):595–601. 689. Singh S, Sharma P. How effective is endoscopic therapy in the treatment of patients with early esophageal cancer? Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol. 2009;6(2):70–1. 690. Das A, Singh V, Fleischer DE, et al. A comparison of endoscopic treatment and surgery in early esophageal cancer: an analysis of surveillance epidemiology and end results data. Am J Gastroenterol. 2008;103(6):1340–5. 691. Allum WH, Blazeby JM, Griffin SM, et al. Guidelines for the management of oesophageal and gastric cancer. Gut. 2011;50(5): 106–12. 692. Wani S, Drahos J, Cook MB, Rastogi A, Bansal A, Yen R, Sharma P, Das A. Comparison of endoscopic therapies and surgical resection in patients with early esophageal cancer: a population-based study. Gastrointest Endosc. 2014 Feb;79(2):224-232. 693. Prasad GA, Wang KK, Buttar NS, et al. Long-term survival following endoscopic and surgical treatment of high-grade dysplasia in Barrett’s esophagus. Gastroenterology. 2007;132(4): 1226–33. 694. Bennett C, Green S, Decaestecker J, Almond M, Barr H, Bhandari P, Ragunath K, Singh R, Jankowski J. Surgery versus radical endotherapies for early cancer and high-grade dysplasia in Barrett's oesophagus. Cochrane Database Syst Rev. 2012 Nov 14;11:CD007334. 695. Shaheen NJ, Overholt BF, Sampliner RE, et al. Durability of radiofrequency ablation in Barrett’s esophagus with dysplasia. Gastroenterology. 2011;141(2):460–8. 696. Shaheen NJ, Sharma P, Overholt BF, et al. Radiofrequency ablation in Barrett’s esophagus with dysplasia. N Engl J Med. 2009;360(22):2277–88. 279 BIBLIOGRAFIA 697. Pouw RE, Wirths K, Eisendrath P, et al. Efficacy of radiofrequency ablation combined with endoscopic resection for barrett’s esophagus with early neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 2010;8(1):23–9. 698. Badreddine RJ, Prasad GA, Wang KK, et al. Prevalence and predictors of recurrent neoplasia after ablation of Barrett’s esophagus. Gastrointest Endosc. 2010;71(4):697–703. 699. Pech O, May A, Rabenstein T, Ell C. Endoscopic resection of early oesophageal cancer. Gut. 2007;56(11):1625–34. 700. Sgourakis G, Gockel I, Lang H. Endoscopic and surgical resection of T1a/T1b esophageal neoplasms: a systematic review. World J Gastroenterol. 2013 Mar 7;19(9):1424-37 701. Bennett C, Vakil N, Bergman J, et al. Consensus statements for management of barrett’s dysplasia and early-stage esophageal adenocarcinoma, based on a delphi process. Gastroenterology. 2012;143:336–46. 702. Li YM, Li L, Yu CH, et al. A systematic review and metaanalysis of the treatment for Barrett’s esophagus. Dig Dis Sci. 2008;53(11):2837–46. 703. Pech O, Behrens A, May A, Nachbar L, et al. Long-term results and risk factor analysis for recurrence after curative endoscopic therapy in 349 patients with highgrade intraepithelial neoplasia and mucosal adenocarcinoma in Barrett’s oesophagus. Gut. 2008;57(9):1200–6. 704. van Vilsteren FG, Pouw RE, Seewald S, et al. Stepwise radical endoscopic resection versus radiofrequency ablation for Barrett’s oesophagus with high-grade dysplasia or early cancer: a multicentre randomised trial. Gut. 2011;60(6):765–73. 705. Hull MJ, Mino-Kenudson M, Nishioka NS, et al. Endoscopic mucosal resection: an improved diagnostic procedure for early gastroesophageal epithelial neoplasms. Am J Surg Pathol. 2006;30(1):114–8. 706. Moss A, Bourke MJ, Hourigan LF, et al. Endoscopic resection for Barrett’s highgrade dysplasia and early esophageal adenocarcinoma: an essential staging procedure with long-term therapeutic benefit. Am J Gastroenterol. 2010;105(6):1276–83. 707. ASGE Technology Committee, Kantsevoy SV, Adler DG, Conway JD, Diehl DL, Farraye FA, et al. Endoscopic mucosal resection and endoscopic submucosal dissection. Gastrointest Endosc. 2008;68(1):11–8. 708. Ciocirlan M, Lapalus MG, Hervieu V, et al. Endoscopic mucosal resection for squamous premalignant and early malignant lesions of the esophagus. Endoscopy. 2007;39(1):24–9. 709. Inoue H, Fukami N, Yoshida T, et al. Endoscopic mucosal resection for esophageal and gastric cancers. J Gastroenterol Hepatol. 2002;17(4):382–8. 280 BIBLIOGRAFIA 710. Haidry RJ, Lipman G, Banks MR, Butt MA, Sehgal V, Graham D, Dunn JM, Gupta A, Sweis R, Miah H, Morris D, Smart HL, Bhandari P, Willert R, Fullarton G, Morris J, Di Pietro M, Gordon C, Penman I, Barr H, Patel P, Boger P, Kapoor N, Mahon B, Hoare J, Narayanasamy R, O'Toole D, Cheong E, Direkze NC, Ang Y, Veitch A, Dhar A, Nyalender D, Ragunath K, Leahy A, Fullard M, Rodriguez-Justo M, Novelli M, Lovat LB. Comparing outcome of radiofrequency ablation in Barrett's with high grade dysplasia and intramucosal carcinoma: a prospective multicenter UK registry. Endoscopy. 2015 Jun 30. [Epub ahead of print] 711. Li N, Pasricha S, Bulsiewicz WJ, Pruitt RE, Komanduri S, Wolfsen HC, Chmielewski GW, Corbett FS, Chang KJ, Shaheen NJ. Effects of preceding endoscopic mucosal resection on the efficacy and safety of radiofrequency ablation for treatment of Barrett's esophagus: results from the United States Radiofrequency Ablation Registry. Dis Esophagus. 2015 Jun 30. doi: 10.1111/dote.12386. [Epub ahead of print] 712. Peter S, Mönkemüller K. Ablative Endoscopic Therapies for Barrett's-Esophagus- Related Neoplasia. Gastroenterol Clin North Am. 2015 Jun;44(2):337-53. 713. Small AJ, Araujo JL, Leggett CL, Mendelson AH, Agarwalla A, Abrams JA, Lightdale CJ, Wang TC, Iyer PG, Wang KK, Rustgi AK, Ginsberg GG, Forde KA, Gimotty PA, Lewis JD, Falk GW, Bewtra M. Radiofrequency Ablation Is Associated With Decreased Neoplastic Progression in Patients With Barrett's Esophagus and Confirmed Low-Grade Dysplasia. Gastroenterology. 2015 Apr 24. [Epub ahead of print] 714. Künzli HT, Schölvinck DW, Phoa KN, Schoon EJ, Houben MH, Bergman JJ, Weusten BL. Simplified protocol for focal radiofrequency ablation using the HALO90 device: short-term efficacy and safety in patients with dysplastic Barrett's esophagus. Endoscopy. 2015 Jul;47(7):592-7. 715. Overholt BF, Wang KK, Burdick JS, et al. Five-year efficacy and safety of photodynamic therapy with Photofrin in Barrett’s high-grade dysplasia. Gastrointest Endosc. 2007;66(3):460–8. Ragunath K, Krasner N, Raman VS, et al. Endoscopic ablation of dysplastic Barrett’s oesophagus comparing argon plasma coagulation and photodynamic therapy: a randomized prospective trial assessing efficacy and costeffectiveness. Scand J Gastroenterol. 2005;40(7):750–8. 716. Biddlestone LR, Barham CP, Wilkinson SP, et al. The histopathology of treated Barrett’s esophagus: squamous reepithelialization after acid suppression and laser and photodynamic therapy. Am J Surg Pathol. 1998;22(2):239–45. 717. Overholt BF, Lightdale CJ, Wang KK, et al. Photodynamic therapy with porfimer sodium for ablation of high-grade dysplasia in Barrett’s esophagus: international, 281 BIBLIOGRAFIA partially blinded, randomized phase III trial. Gastrointest Endosc. 2005;62(4): 488– 98. 718. Bulsiewicz WJ, Shaheen NJ. The role of radiofrequency ablation in the management of Barrett’s esophagus. Gastrointest Endosc Clin N Am. 2011;21(1):95–109. 719. Herrero LA, van Vilsteren FG, Pouw RE, et al. Endoscopic radiofrequency ablation combined with endoscopic resection for early neoplasia in Barrett’s esophagus longer than 10 cm. Gastrointest Endosc. 2011;49(5):286–301. 720. Lyday WD, Corbett FS, Kuperman DA, et al. Radiofrequency ablation of Barrett’s esophagus: outcomes of 429 patients from a multicenter community practice registry. Endoscopy. 2010;42(4): 272–8. 721. Semlitsch T, Jeitler K, Schoefl R, et al. A systematic review of the evidence for radiofrequency ablation for Barrett’s esophagus. Surg Endosc. 2010;24(12):2935– 43. 722. David WJ, Qumseya BJ, Qumsiyeh Y, Heckman MG, Diehl NN, Wallace MB, Raimondo M, Woodward TA, Wolfsen HC. Comparison of endoscopic treatment modalities for Barrett's neoplasia. Gastrointest Endosc. 2015 Jun 10. 723. Pasricha S, Cotton C, Hathorn KE, Li N, Bulsiewicz WJ, Wolf WA, Muthusamy VR, Komanduri S, Wolfsen HC, Pruitt RE, Ertan A, Chmielewski GW, Shaheen NJ. Effects of Learning Curve on Efficacy of Radiofrequency Ablation for Barrett's Esophagus. Gastroenterology. 2015 Jun 24. 724. Sharma P, Wani S, Weston AP, Bansal A, et al. A randomized controlled trial of ablation of Barrett’s oesophagus with multipolar electrocoagulation versus argon plasma coagulation in combination with acid suppression: long term results. Gut. 2006;55(9):1233–9. 725. Gatenby P, Caygill C, Wall C, Bhatacharjee S, Ramus J, Watson A, Winslet M. Lifetime risk of esophageal adenocarcinoma in patients with Barrett's esophagus. World J Gastroenterol. 2014 Jul 28;20(28):9611-7. 726. Hecht SS. Tobacco carcinogens, their biomarkers and tobacco induced cancer. Nat Rev Cancer. 2003;3:733–744. 727. Van Soest EM, Dieleman JP, Siersema PD, Sturkenboom MCJM, Kuipers EJ. Increasing incidence of Barrett’s oesophagus in the general population. Gut. 2005;54(8):1062–1066. 728. Van Blankenstein M, Looman CW, Johnston BJ, Caygill CP. Age and sex distribution of the prevalence of Barrett’s esophagus found in a primary referral endoscopy center. Am J Gastroenterol. 2005;100(3):568–576. 729. Watanabe S, Hojo M, Nagahara A. Metabolic syndrome and gastrointestinal diseases. J Gastroenterol. 2007;42:267–274. 288 BIBLIOGRAFIA 800. O`Brien CA, Pollett A, Gallinger S, et al. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice [J]. Nature, 2007, 445(7123):106- 110. 801. Yin S, Li J, Hu C, et al. CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity. Int J Cancer, 2007, 120(7): 1444-1450. 802. Meregalli M, Farini A, Belicchi M, Torrente Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert Opin Biol Ther. 2010 Nov;10(11):1521-8 803. Jankowski J, Barr H, Wang K, Delaney B. Diagnosis and management of Barrett's oesophagus. BMJ. 2010 Sep 10;341:c4551 804. Xu J, Stolk JA, Zhang X, Silva SJ, Houghton RL, Matsumura M, Vedvick TS, Leslie KB, Badaro R, Reed SG. Identification of differentially expressed genes in human prostate cancer using subtraction and microarray. Cancer Res. 2000 Mar 15;60(6):1677-82. 805. Thisse B, el Messal M, Perrin-Schmitt F. The twist gene: isolation of a Drosophila zygotic gene necessary for the establishment of dorsoventral pattern. Nucleic Acids Res. 1987 Apr 24;15(8):3439-53. 806. Lee KW, Kim JH, Han S, Sung CO, Do IG, Ko YH, Um SH, Kim SH. Twist1 is an independent prognostic factor of esophageal squamous cell carcinoma and associated with its epithelial-mesenchymal transition. Ann Surg Oncol. 2012 Jan;19(1):326-35 807. Xie F, Li K, Ouyang X. Twist, an independent prognostic marker for predicting distant metastasis and survival rates of esophageal squamous cell carcinoma patients. Clin Exp Metastasis. 2009;26(8):1025-32. 808. Ru GQ, Wang HJ, Xu WJ, Zhao ZS. Upregulation of Twist in gastric carcinoma associated with tumor invasion and poor prognosis. Pathol Oncol Res. 2011Jun;17(2):341-7 809. Zhu DY, Guo QS, Li YL, Cui B, Guo J, Liu JX, Li P. Twist1 correlates with poor differentiation and progression in gastric adenocarcinoma via elevation of FGFR2 expression. World J Gastroenterol. 2014 Dec 28;20(48):18306-15.