Análisis de los receptores D1 y D2 en los procesos de inhibición latente

TESIS DOCTORAL ANÁLISIS DE LOS RECEPTORES D1 Y D2 EN LOS PROCESOS DE INHIBICIÓN LATENTE PRESENTADA POR: JUANA MEDELLÍN MORENO PARA OPTAR POR EL GRADO DE DOCTORA EN PSICOLOGÍA DIRIGIDA POR: DRA. ESTRELLA DÍAZ ARGANDOÑA Y DR. JUAN CARLOS LÓPEZ GARCÍA DEPARTAMENTO DE PSICOLOGÍA EXPERIMENTAL AGRADECIMIENTOS A mis asesores Dra. Estrella Argandoña Díaz y Dr. Juan Carlos López García que han sabido guiar este trabajo para su culminación a lo largo de este proceso, enriqueciendo y siendo esa luz en la oscuridad para evitar perderse en el camino. Índice Introducción 3 Modelos asociativos: fallos en la adquisición y fallos en la recuperación 5 Modelos conductuales 5 Modelos basados en el fallo de adquisición 6 Modelos basados en el fallo de recuperación 9 Modelos que incluyen funciones neurobiológicas 13 Estructuras anatómicas: los sistemas mesolímbico y mesocortical 15 Sistemas de neurotransmisión 23 Sistema mesolímbico y actividad dopaminérgica: Un modelo funcional de la IL 31 El Nac como sistema integrador de funciones 34 Los receptores dopaminérgicos D1 y D2 36 Estudio de la IL y su relación con posibles alteraciones cognitivas 43 El contexto como variable experimental en la IL 53 El paradigma de la aversión condicionada al sabor y su uso en los procesos de inhibición latente 57 Procesamiento neural del sabor 59 Objetivos e hipótesis 63 Experimentos 71 Experimento 1 77 Introducción 77 Métodos 79 Resultados y discusión 82 Experimento 2 89 Introducción 89 Métodos 90 Resultados y discusión 92 Experimento 3 98 Introducción 98 Métodos 99 Resultados y discusión 101 Experimento 4 106 Introducción 106 Métodos 107 Resultados y discusión 109 Discusión general 117 Conclusiones 125 Bibliografía 128 Introducción 3 Introducción El fenómeno de inhibición latente (IL) se refiere al enlentecimiento en la adquisición de la asociación entre un estímulo condicionado (EC) y un estímulo incondicionado (EI) tras la exposición en solitario del EC (De la Casa, 2002; Lubow y Moore, 1959). Específicamente, la IL hace referencia a la disminución de la capacidad para adquirir o expresar una nueva asociación a un estímulo que ha sido previamente recibido en forma pasiva. Este fenómeno se observa al comparar la adquisición de la relación EC-EI del grupo en el que se ha pre-expuesto el EC en ausencia de consecuencia con un grupo que no ha recibido dicha pre-exposición al EC (Lubow & Weiner, 2010). La IL ha sido y es de gran interés para la investigación tanto básica como aplicada, dada su influencia en campos de la neurociencia, además de la psicopatología. Su relación con procesos como la esquizofrenia o la hiperactividad han facilitado que el campo de estudio siga en continuo aumento, incrementando nuestro conocimiento acerca de los procesos cognitivos y neurobiológicos que facilitan la aparición del fenómeno. Por definición una demostración de inhibición latente requiere, como mínimo, dos etapas. En la primera se establece la preexposición del futuro Introducción 10 se registra un fallo a la hora de expresar una de las respuestas aprendidas. Principalmente dos han sido los modelos que se enmarcan en estas teorías: los centrados en los mecanismos de ejecución (por ej., Denniston, Savastano y Miller, 2001, Miller y Matzel, 1988; 1989; Miller y Schatchman, 1985) y aquellos orientados hacia los mecanismos de recuperación de la información (por ej., Bouton, 1993; 1994a; 1994b; Bouton y Bolles, 1985). La hipótesis del comparador: Miller y Matzel (1988) fue planteada por sus autores como una regla de respuestas centrada en la ejecución. El nivel de RC ante un EC vendrá determinado no sólo por la fuerza asociativa adquirida por dicho estímulo durante el entrenamiento; sino también por la fuerza asociativa adquirida por otras claves, incluido el contexto. El modelo plantea un mecanismo de comparación, durante la fase de prueba, entre el valor excitatorio adquirido por el EC y el valor excitatorio adquirido por el resto de las claves presentes durante el condicionamiento. Si en la comparación el valor excitatorio crítico del EC supera el de las claves contextuales, se favorece la ejecución de la RC ante el EC. Si por el contrario, el valor excitatorio de las claves contextuales supera el del estímulo crítico, éste mostrará propiedades de inhibidor condicionado. Así podemos considerar que la ejecución será una función directa de la intensidad de la asociación entre el EC y el EI y una función inversa de la relación entre el resto de las claves contextuales y el EI. La presentación del EC activa una representación del EI (basada en las asociaciones EC-EI propias del entrenamiento) y a su vez activa la representación del conjunto Introducción 11 de estímulos presentes durante el entrenamiento. Esta última representación es asimismo capaz de activar una segunda representación del EI. La comparación entre estas dos representaciones determinará el nivel de RC ante el estímulo clave. La importancia de las distintas claves que conforman el estímulo de comparación se determina según la saliencia relativa de las mismas (por ej., Miller y Escobar, 2001; 2002; Miller y Grace, 2003). Desde el modelo del comparador se predice que cualquier manipulación que disminuya la fuerza de la activación indirecta de la representación del EI (asociaciones contexto-EI o asociaciones EC-contexto) producirá un incremento de la RC ante el estímulo crítico y que las manipulaciones que incrementen la fuerza de dicha activación indirecta, producirán un decremento de la RC al estímulo crítico (por ej., Urushihara, y Miller, 2006). En este marco, el fenómeno de IL presenta muchas posibilidades de explicación. En la primera fase, o fase de preexposición, la presentación del EC en solitario provocará que se establezcan asociaciones entre el contexto y el futuro EC. Durante el condicionamiento la RC está sujeta a la comparación entre la activación del EI de manera directa por el EC y la representación indirecta del EI (activada por la asociación contexto-EC establecida durante la fase de preexposición) y la asociación contexto-EI. En el caso de la IL se producirá una intensa asociación durante la fase de preexposición entre contexto y EC, debido a su presentación en solitario. Posteriormente la activación indirecta del EI interferirá con la expresión de la Introducción 12 RC producida de manera directa por la asociación EC-EI, con lo que hará que disminuya la RC durante la fase de prueba (Grahame, Barnet, Gunther, y Miller, 1994). La teoría de la recuperación de la información (Bouton, 1991; 1993; 1994a; 1994b) también considera que la ejecución del sujeto es fruto de la competencia entre distintos aprendizajes y no producto de fallos en la adquisición de los mismos. Desde esta teoría se plantea que las distintas asociaciones entre un EC y un EI, o entre una respuesta y un reforzador son almacenadas en memoria y perfectamente recuperables. Bouton (1993) además introduce al contexto como factor elemental para reducir la ambigüedad del significado de los estímulos, especialmente durante un proceso de IL. Es decir, que en situaciones donde la asociación entre EC-EI es simple y fácilmente discriminable, el contexto jugaría un papel reducido. Sin embargo, en aquellas situaciones donde se produce ambigüedad a la hora de interpretar el significado del EC, el contexto juega un papel fundamental (Bouton,1991; 1993; 1994a). Este es el caso de la IL, donde el EC aparece inicialmente sin consecuencias positivas o negativas directas y adquiere un valor informativo de la aparición del EI durante la fase de condicionamiento. Será durante la fase de prueba donde el contexto es especialmente significativo, permitiendo reducir la ambigüedad del EC dada sus dos posibles consecuencias. Este hecho ha sido reproducido experimentalmente por Quintero y otros (2011a). Los cambios en el contexto durante la fase de condicionamiento provocaron una reducción drástica en la Introducción 13 expresión de IL, indicando que los sujetos habían aprendido ambos tipos de respuesta, pero dependiendo del contexto, la expresión de cada una de ellas fue claramente diferente. En esta misma línea, Nelson (2002) plantea que la asociación inicial del EC es dependiente de contexto, mientras que la aprendida posteriormente en el caso de la IL, no lo será. En ambos casos los datos de Quintero y otros (2011a) son congruentes con ambas propuestas, dado que la asociación del EC en un contexto nuevo, diferente al de preexposición, muestra un claro condicionamiento y el proceso de extinción se enlentece. Modelos que incluyen funciones neurobiológicas Aunque a simple vista la IL parece un proceso simple, a nivel neurobiológico presenta una complejidad asombrosa. Actualmente este fenómeno parece estar bajo la influencia de varias estructuras del sistema límbico como son la corteza entorrinal, el núcleo accumbens (Nac), y la proyección de dopamina al mesolímbico del área tegmental ventral (Atv). Aunque son numerosas las propuestas, destacaremos aquí dos por su relevancia actual. Un claro ejemplo de estos modelos es el descrito por Weiner (1990). El modelo del cambio conjuga estas estructuras señalando al Nac como estructura central en la expresión de la IL. Concretamente Weiner se centra en los mecanismos de interrupción de la IL mediados por el Nac. Es decir, se centra los procesos de reducida atención a los estímulos irrelevantes durante Introducción 14 la fase de condicionamiento, acentuando el déficit de respuesta en la incapacidad de seguir ignorando las consecuencias del EC. De este modo, una ausencia de IL muestra que el mecanismo de cambio no es efectivo, dada su fragilidad a la hora de responder (Weiner, 2010). Este proceso lo centra en la actividad de las áreas del Nac core y shell. Ambas estructuras actúan de forma inhibitoria, siendo la IL resultado de esta actividad conjunta. Volveremos sobre este tema más adelante. La teoría de redes neuronales de aprendizaje de Schmajuk, Lam y Gray (1996) es un modelo matemático de red neural que asume que EC y EI varían su efectividad durante el condicionamiento. El complejo modelo propone que la IL se manifiesta porque se reduce la novedad del EC durante la primera fase o fase de preexposición y, por tanto, la magnitud de la representación de éste. Esto implica una tasa más lenta de adquisición de la asociación EC-EI durante el condicionamiento y un valor más pequeño en la predicción del EI. El cambio provocado durante la fase de condicionamiento provoca un proceso novedoso, provocando un incremento en la magnitud de la representación del EC. Este modelo incluye de nuevo a diferentes áreas del sistema límbico, y especialmente al Nac y su actividad dopaminérgica como estructura eje del proceso. Introducción 15 Estructuras anatómicas: los sistemas mesolímbico y mesocortical La IL es uno de los fenómenos más interesantes no solo a nivel conductual. A nivel neuroanatómico es igualmente interesante, tal y como han mostrado los múltiples estudios que intentan desentrañar la implicación de las diferentes estructuras que forman el sistema mesolímbico y mesocortical. Analizaremos sucintamente aquí los estudios más relevantes acerca de la relación funcional entre estructuras, iniciando por la que ha acaparado un mayor interés, el Nac. Esta compleja estructura es fundamental en el sistema mesolímbico y mesocortical, y aún más cuando estudiamos los procesos de IL y su relación con la dopamina. Los estudios que estimulan la liberación de dopamina, o el bloqueo de recaptación de esta en este núcleo, han mostrado que la IL se interrumpe. Además, este proceso se observa incluso cuando la administración de agentes como la anfetamina es sistémica (Weiner y otros, 1987c). El mecanismo que parece activar la administración de fármacos agonistas de dopamina es el denominado mecanismo de cambio (Weiner, Introducción 16 1990), proceso que bloquean los antagonistas y agonistas inversos. Fármacos como el haloperidol provoca una clara perseveración de la IL, reduciendo la capacidad de un nuevo aprendizaje asociativo (Robbins y Everitt, 1982, 1992; Taghzouti y otros, 1985 a, 1985b; Swerdlow y Koob, 1987; Stahl, 1988; Le Moal ySimon, 1991; Pennartz y otros, 1994). Uno de los modelos que con mayor intensidad ha analizado la relación del Nac con la IL ha sido el modelo de cambio de Weiner (1990). Aunque dedicaremos más adelante un apartado a este modelo, introduciremos algunos conceptos que nos ayudarán a entender la implicación del Nac en la IL. El modelo predice que el Nac no está implicado en los procesos que ocurren durante la fase de preexposición. Su actividad está orientrada a la asiguiente fase, la de condicionamiento. Aquí, el mecanismo de cambio facilita una reorganización en la capacidad de responder del sujeto acorde con la situación experimental actual (Weiner 2000). El incremento de dopamina sistémica, o especialmente en el Nac, genera un proceso de cambio. Es decir, que tras el condicionamiento la actividad de los sujetos sigue controlada por los efectos de la preexposición al EC. Esto es evidente dado que estudios que lesionan completamente el Nac no eliminan la IL. Sin embargo, el aumento en la liberación de dopamina provoca el efecto de cambio, es decir, desinhibiendo el Nac y provocando una respuesta acorde a la nueva situación asociativa EC-EI (Weiner, 1990; 2003). Los procesos inhibitorios que suceden en el Nac se realizan a través de estructuras internas. Estas estructuras dividen anatómicamente al Nac en Introducción 17 dos áreas bien diferenciadas a nivel citoarquitectónico y fisiológico, la más caudal el shell y la más rostral el core (Groenewegen y otros, 1987, 1991, 1996, 1999; Deutch y Cameron, 1992; Heimer y otros, 1997; Maldonado- Irizarry y Kelley, 1994, 1995; Pennartz y otros, 1994; Zahm, 1999, 2000). Según el modelo de cambio, la aportación de cada estructura a la expresión de la IL es diferente, o más concretamente, contraria (Weiner y otros, 1996 a, 1999; Gal 2000). Tanto es así, que las lesiones que alcanzan al shell interrumpen la IL (Weiner y otros, 1996a). Por el contrario, la lesión del core la mantendría intacta. En su modelo de cambio, Weiner (1990; 2003) propuso que la interrupción de la IL podría deberse a un efecto modulador del shell sobre el core. El hecho de lesionar el shell provocaría la expresión de la asociación EC-EI por la ausencia de efectos inhibitorios sobre el core. Es decir, facilitando el proceso de cambio. Por el contrario, el bloqueo de la actividad temporal del core o su lesión generaría una incapacidad para la expresión de la asociación EC-EI, presentando los sujetos una ausencia de cambio o una persistente IL. El papel de la neurotransmisión dopaminérgica es relativamente bien conocido. Dada la irrelevancia del futuro EC durante el efecto de preexposición, se reduciría la actividad dopaminérgica en el shell. Esta falta de activación del shell sería la responsable de no desinhibir al core, y por tanto generar el cambio necesario para expresar la asociación EC-EI (Murphy y otros, 2000; Jeanblanc y otros, 2002a). En este sentido, el shell estaría bajo los mecanismos inhibitorios del cambio, provocando el efecto de Introducción 18 IL. El core sería el responsable del cambio, es decir, de la expresión de condicionamiento o reducción del efecto de IL. Trabajando en conjunto, la expresión de IL podría ser el reflejo de la actividad dopaminérgica en ambas estructuras. Así, la dopamina en el shell podría tener una función inhibitoria sobre la activación dopaminérgica en el core (Cadoni y otros, 2000). Específicamente, el circuito podría funcionar de la siguiente manera. La caída en los niveles de dopamina en el shell facilitaría los efectos inhibitorios sobre el core, mientras que un incremento de la actividad dopaminérgica en este último facilitaría los mecanismos de cambio, es decir la expresión de condicionamiento o reducción del efecto de IL. Otra de las estructuras que se ha relacionado directamente con este proceso ha sido la formación hipocampal. La implicación del hipocampo y de sus áreas adjuntas ha sido contradictoria. Existen datos que apoyan tanto la facilitación de la IL tras su lesión, como la interrupción de la misma (Ackil y otros, 1969; Buhusi y otros, 1998; Clark y otros, 1992; Kaye y Pearce 1987a, b; Purves y otros, 1995; Schmajuk y otros, 1994; Solomon y Moore 1975). Actualmente sabemos que la función del hipocampo es esencial para la actividad del Nac y por tanto para la expresión de una IL normal. Estos cambios parecen estar más asociados a procesos contextuales que a la relación EC-EI. Las lesiones excitotóxicas o la iNactivación mediante agonistas gabaérgicos del hipocampo o la fimbria-fornix no aparecen afectar a la expresión de IL (Cassaday y otros, 1993b; Coutureau y otros, 1999; Holt y Maren 1999; Honey y Good 1993; Pouzet y otros, 1999; Quintero y otros, Introducción 19 2011b; Reilly y otros, 1993; Shohamy y otros, 2000; Weiner y otros, 1998). Sin embargo, las lesiones de la corteza entorrinal y del subículum ventral si afectan claramente a la expresión o interrupción de la IL (Quintero y otros, 2011b; Yee y otros, 1995). Estos estudios nos podrían estar indicando que la vía hasta alcanzar el Nac podría ser diferente tanto a nivle funcional como estructural (Pouzet y otros, 1999; Totterdell y Meredith, 1997; Weiner y otros, 1998). De hecho, las lesiones que afectan claramente a la expresión de la IL, interrumpiéndola, son las lesiones que afectan al córtex entorrinal (Coutureau y otros, 1999, 2000, 2002; Shohamy y otros, 2000; Yee y otros, 1997). Efecto que es invertido tras la administración de haloperidol (Schmajuk y otros, 1994; Yee y otros, 1995). El efecto inverso fue descrito por Quintero y otros (2011b) tras la lesión del subiculum. Esta estructura forma parte de un complejo sistema que modula la actividad dopaminérgica y glutamatérgica en el Nac. Las lesiones de esta área eliminaron el efecto de especificdad contextual, liberando la IL tras un cambio de contexto. Estos datos suponen un apoyo a los procesos moduladores de las diferentes estructuras que forman el sistema mesolímbico sobre la liberación tónica y fásica de dopamina que proyectan desde el Atv (Floresco y otros, 2001). Esta liberación fásica y tónica puede ser dependiente del contexto; y de ahí que los estudios que incluyen el registro, iNactivación o lesión de la formación hipocámpica y las estructuras asociadas puedan arrojar datos contradictorios (Bouton 1993; Gallo y otros, 2005; Hall y Channel 1985; Holt y Maren, 1999; Maren y Holt, 2000; Lubow y Introducción 26 durante la ptreexposición si ejerce una clara influencia sobre la expresión de la IL (Traverso y otros, 2010). Estos datos reflejan que probablemente la actividad del glutamato esté relacionada más con fenómenos de plasticidad neural que con el proceso en sí. Es decir, al actuar sobre estos receptores los sujetos pierden toda capacidad de readaptar su comportamiento ante situaciones nuevas. En este sentido, los cambios de contingencia entre la fase de preexposición y condicionamiento se ve claramente afectado por la incapacidad de reorientar la conducta hacia nuevas asociaciones, que en este caso sería EC-EI. ´Geisler-Salomon y Weiner (2003) analizaron experimentalmente este efecto usando un procedimiento experimental de respuesta emocional condicionada. La administración sistémica de MK-801 no afectó a la expresión de IL, sino más bien a la persistencia de esta. Es decir, que los sujetos se mostraban incapaces de adquirir nuevas respuestas en relación a la fase de condicionamiento, y por tanto una escasa capacidad de responder de forma diferente al EC. Este mismo efecto aparece tras la administración del fármaco durante la fase de condicionamiento, reduciendo claramente la capacidad del animal para readaptar su respuesta (Geisler- Salomon y Weiner, 2003). Los resultados apoyan la hipótesis de la implicación de los receptores NMDA en los procesos plásticos, más que de forma específica en la IL. Por tanto, su peso en los procesos de IL quedaría reducido a los fenómenos de plasticidad sináptica que aparecen en los procesos de aprendizaje (Carlsson y Carlsson 1989, 1990a, 1990b; Moghaddam et al. 1997; Svensson 2000; Jentsch y Taylor 2001; Traverso, Introducción 27 2003, 2009). Dentro de este marco si es interesante plantear la posibilidad de la actividad glutamatérgica en el Nac. La administración sistémica de antagonistas del NMDA competitivos, como es el caso del APV, o no competitivos como el MK801, podría estar interrumpiendo la actividad fásica de liberación dopaminérgica en el Nac, que si presenta una relación directa con la IL (Gray y otros, 1995; Weiner y Joel, 2002). Las proyecciones desde ATV sobre el Nac podrían estar afectadas debido a la interrupción o reducción de actividad de células liberadoras de dopamina. Esta liberación incrementa cuando un estímulo aumenta su saliencia, bien por su aparición sorpresiva o por cambios en las contingencias (Chergui y otros, 1993; Mathe y otros, 1998, 1999; Westerink y otros, 1997; Wu y otros, 1999). Así, esta incapacidad para incrementar la relevancia adquirida por un estímulo tras la asociación con un EI es lo que podría explicar la persistencia de la IL en sujetos tratados con antagonistas del receptor NMDA (Mathe y otros, 1998, 1999; Svensson, 2000). La proyección dopaminérgica desde ATV hacia el Nac ha acaparado gran parte de la atención de la hipótesis dopaminérgica de la IL. La administración de agentes agonistas como las anfetaminas y antagonistas como el haloperidol provocan efectos inversos en la expresión de la IL (Peters y Joseph, 1993; Weiner y otros, 1997b; Weiner, 2003). Este efecto es extensible a las drogas antipsicóticas, bien sean típicas o atípicas. La capacidad para reducir la actividad dopaminérgica de estas drogas facilita el Introducción 28 proceso de inatención al futuro EC. Esto es evidente durante la fase de condicionamiento, donde los sujetos presentan un bajo grado de atención al EC potenciado por la droga durante la fase de preexposición. Por el contrario, los estimulantes incapacitarían al animal para reducir su atención al futuro EC. La consecuencia de ello es una ausencia o reducción de la IL debido al aumento atencional al EC durante el condicionamiento (Weiner, 2003). Es decir, que la estimulación de la transmisión dopaminérgica interfiere sobre la asociación estímulo no evento, y por tanto facilitando el cambio rápido la asociación EC-EI. Por el contrario, el uso de antagonistas dopaminérgicos facilita la actividad durante la preexposición reduciendo la asociación EC-EI durante la fase de condicionamiento. Otra de las funciones asociadas a la dopamina en el aprendizaje asociativo que implica la expresión de la IL, está relacionada con la discrepancia entre los resultados obtenidos y los previstos. Iordanova, Westbrook & Killcross (2006) emplearon el paradigma de bloqueo para mostrar que esta discrepancia de aprendizaje se reduce a mayor activación de dopamina después de una perfusión en el Nac de la d-anfetamina, y aumenta por el bloqueo dopaminérgico después de una perfusión en el Nac por infusiones combinadas de antagonistas de D1 (SCH 23390) y D2 (sulpiride), pero no por infusión de un solo antagonista. En concreto se sugiere que la dopamina en el Nac modula la capacidad para regular el aprendizaje sobre otros predictores más pobres, y en la ausencia de cualquier factor de predicción, no tiene ningún efecto. Esto se refleja en las Introducción 29 teorías del procesamiento de aprendizaje predictivo, que sostienen que el establecimiento de relaciones asociativas depende de la capacidad de un EC para acceder al procesamiento atencional. Por lo tanto, los resultados muestran para el aprendizaje del miedo implica la estimulación de dopamina en el Nac, mientras que la reducción de la estimulación o el bloqueo de la estimulación de dopamina en Nac reduce el procesamiento y los estímulos resultan pobres predictores (Iordanova, Westbrook & Killcross, 2006). Toda esta actividad está controlada por la proyección ATV-Nac. Los estudios electrofisiológicos indican que niveles de dopamina tónicos y fásicos se modulan según las entradas de, entre otras áreas, corteza prefrontal, hipocampo y amígdala (Grace y otros, 2000, 2002; Grace, 1991; Gray y otros, 1995). La IL es claramente dependiente de este sistema, incrementando la expresión cuando aparece un aumento fásico y disminuyendo cuando se reduce por estimulación de las células del ATV, amígdala, hipocampo y córtex prefrontal (Binder y otros, 2001, 2002; Grace y otros, 2000, 2002; Tzschentke, 2001). Introducción 30 Introducción 31 Sistema mesolímbico y actividad dopaminérgica: Un modelo funcional de la IL. Uno de los modelos más interesantes a la hora de explicar la IL tanto a nivel conductual como neurofisiológico es el switching model o modelo del cambio (Weiner, 1990, 2003). Este modelo integra elementos conductuales, anatómicos y fisiológicos para explicar los procesos subyacentes a la fase de preexposición al futuro EC y la fase de condicionamiento o asociación EC-EI. Para ello utiliza al Nac como eje central del fenómeno adjudicando a las áreas shell y core roles diferentes. Así lo avalan estudios recientes, que indican que las lesiones del shell interrumpen la IL mientras que las del core provocan el efecto contrario, es decir, una persistencia de la IL. Estos efectos están modulados por diferentes áreas del sistema límbico, cuya alteración provocan efectos similares a los descritos en shell y core. Dada la importancia de la modulación dopaminérgica que realizan sobre estas áreas, la lesión de la corteza entorrinal también interrumpe la expresión de la IL (Coutureau y otros, 1999, 2000,2002; Shohamy y otros, 2000; Yee y otros, 1997). De igual modo, la lesiones de hipocampo o amígdala basolateral Introducción 32 generan un efecto similar a la lesión de core, esto es, una persistencia de la IL (Cardinal y otros, 2002; Cassaday y otros, 1993b; Holland y Gallagher, 1999; Honey y Good 1993; Jeanblanc y otros, 2002a; Louilot y Besson, 2000; Pouzet y otros, 1999; Weiner y otros, 1998). El modelo propone que durante la preexposición se genera un aprendizaje de la asociación EC-ausencia de consecuencias y, posteriormente durante el condicionamiento, el animal aprende la asociación EC-EI (Weiner, 2003). Estas dos asociaciones entrarían en conflicto durante la fase de prueba. Es decir, competirían por su expresión. Y es el Nac el encargado de seleccionar el tipo de respuesta a expresar. Concretamente, sería el core el sistema donde se produciría el cambio, es decir, la expresión de la asociación EC-EI realizada durante el condicionamiento. Este núcleo es inhibido por el shell, que facilitaría la expresión de la IL o de la asociación EC-ausencia de consecuencias. Es decir, que el shell es el encargado de inhibir el mecanismo de cambio y por lo tanto la expresión de la relación ECEI. Una fase de preexposición reducida o un condicionamiento muy intenso podrían inhibir la actividad del shell y expresar la relación EC-EI. Actualmente desconocemos como la información alcanza estas subestructuras. La unión entre shell y core parece formar un bucle que implica a varias estructuras del diencéfalo, sistema límbico y del estriado. Una de las posibles vías descritas sería la que parte del shell hasta el pálido ventral, tálamo y corteza frontal antes de alcanzar el core (Zahm y Brog, 1992; Zahm, 1999). El otro es el que avanza hasta el ATV y proyecta desde Introducción 33 esta área hasta el core (Berendse y otros, 1992; Groenewegen, 1991, 1996; Otake y Nakamura, 2000; Zahm y Brog, 1992). Esta última parece ser la responsable de inhibir los mecanismos de cambio debido a que esta proyección es dopaminérgica y la actividad del shell estaría dirigida a inhibirla. Es decir, que su actividad estaría orientada a reducir los niveles de expresión dopaminérgica en el Nac, necesarios para establecer asociaciones entre estímulos. A nivel conductual esto se traduce como una reducción en la expresión de la asociación EC-EI. Tanto shell como core reciben aferencias de estructuras relacionas con diversos procesos implicados en el aprendizaje. Por ejemplo, las lesiones de hipocampo (Honey y Good 1993) o del subiculum ventral (Quintero y otros, 2011b) provocan efectos similares a la lesión del core. Es decir, que las estructuras que parecen procesar la información del contexto modulan la expresión de la actividad del core. Quintero y otros (2011b) observaron que tras la lesión del subiculum ventral se reducía la especificidad contextual de la IL. Así, los cambios en el contexto provocan una activación del core (Phillips y LeDoux, 1992; Myers y Gluck, 1994; Fanselow, 2000), una inhibición del shell y por tanto se aprecia el efecto de especificidad contextual. Sin embargo, la lesión de subiculum ventral no permite un adecuado procesamiento del contexto, generando una expresión de la IL y ausencia del fenómeno de especificidad contextual. Estos efectos también aparecen con la lesión de la amígdala basolateral (LeDoux, 1992; Robbins y otros, 1989; Robbins y Everitt, 1996), pero en estos casos Introducción 34 relacionados con procesos que afectan a la magnitud del reforzador durante la fase de condicionamiento. El efecto contrario se halla por ejemplo tras la lesión de córtex entrorrinal, estructura encargada de activar al shell para inhibir el cambio o expresión del condicionamiento (Pouzet y otros, 1999; Totterdell y Meredith, 1997; Weiner y otros, 1998; Yee y otros, 1995). En resumen, el factor del cambio se encuentra en el core. Dependiendo de su actividad los sujetos mostrarán una IL normal, atenuada o incrementada. El Nac como sistema integrador de funciones. El Nac es el centro de control donde proyectan diferentes áreas del sistema mesolímbico y mesocortical. Sin embargo, no sabemos con exactitud las zonas donde la proyección de la corteza entrorrinal, hipocampo y amígdala ejercen su función moduladora de la IL. En este sentido los estudios electrofisiológicos nos han ayudado a entender un poco más como podría articularse el sistema. Sabemos que tanto al ATV como a la core llegan proyecciones desde la amígdala e hipocampo. Puede que los cambios en el procedimiento experimental, como una variación en el contexto de aprendizaje o variaciones en la magnitud del reforzador, faciliten el incrememnto de liberación diopaminérgica desde ATV al Nac. Esto tendría como resultado una reorientación de la respuesta del animal ante esta situación nueva (Pennartz y otros, 1994; Redgrave y otros, 1999; Weiner y Joel, 2002). Es decir, que los cambios relacionados con la predicción de error, o entre lo que se espera y lo se obtiene, facilitan la readaptación del Introducción 35 animal en su entorno. Y todo ello parece claramente mediado por las neuronas dopaminérgicas del sistema mesolímbico (Schultz, 1998). Al alcanzar el core, se estaría facilitando el mecanismo de cambio. Queda por saber que función desarrolla el shell en esta situación. Actualmente creemos que no es más que una competición entre diferentes tipos de respuesta, dado que la actividad del shell, sobre el ATV mediada por el córtex entorrinal, quedaría ensombrecida por los cambios sucedidos durante la fase experimental (cambios de contexto o de magnitud del reforzador). Sin cambios, la respuesta mediada por el shell prevalece, mostrando una IL normal. La implicación de la amígdala es controvertida en la IL. Durante la fase de preexposición el futuro EC puede asociarse con un valor hedónico o predictor cercano a cero. Es decir, que tendría más sentido implicarla en la fase de condicionamiento, donde el EC si adquiere un valor sustancial a nivel predictivo. Curiosamente la lesión de la amígdala provoca una persistente IL, probablemente porque el condicionamiento deja de ser efectivo (Weiner, 2003). Sin embargo, Traverso y otros (2010) hallaron que la amígdala basolateral posee además capacidad para asociar un EC con la ausencia de evento. Mediante el bloqueo de los receptores NMDA utilizando APV, un antagonista competitivo, observaron una ausencia de IL. En este sentido, la amígdala basolateral podría jugar un doble papel. Por un lado, facilitar la relación EC-ausencia de consecuencias; por otro, actuar sobre los procesos perceptivos de un estímulo reduciendo su capacidad para almacenar Introducción 42 observar la desaparición de este efecto en animales con lesión del subiculum ventral (Quintero y otros, 2011b), dado que las aferencias sobre el Nac estaban iNactivas. La falta de estimulación dopaminérgica del Nac impidió inhibir el pálido ventral. Este hecho provocó una actividad normal en la vía gabaérgica inhibitoria del pálido ventral al VTA. Como resultado, la actividad basal en la liberación dopaminérgica se mantendría inalterada (Quintero y otros, 2011b). Introducción 43 Estudio de la IL y su relación con posibles alteraciones cognitivas La IL se refiere a la observación de que bajo condiciones específicas, la preexposición sin consecuencias a un estímulo retarda la eficacia con este estímulo cuando se presenta con el reforzamiento, en comparación con un estímulo no preexpuesto. La farmacología de la IL ha sido asociada casi exclusivamente con el uso de un modelo animal de esquizofrenia, y por lo tanto coincide en gran medida con la farmacología de la esquizofrenia (Lubow & Weiner, 2010). Específicamente, debido a que la esquizofrenia en algunos de sus síntomas se caracteriza por una incapacidad para filtrar, o ignorar estímulos irrelevantes o sin importancia, la IL anormal se propuso como herramienta para el modelamiento de la atención deficiente en la esquizofrenia (Lubow & Weiner, 2010). Uno de los modelos utilizados es el uso de anfetaminas para provocar una activación del sistema nervioso que impida su capacidad de discriminar entre estímulos relevantes e irrelevantes. En roedores se observa que el efecto de la anfetamina provoca un mayor aprendizaje en la condición de Introducción 44 preexposición (Weiner, Lubow & Feldon, 1988), siendo además inversamente dependiente de la dosis (baja dosis bloquea la IL o la atenúa, altas dosis la mantiene). La razón de esta dependencia de dosis de efecto inverso de las anfetaminas aún no está clara. Gray (1998) sugiere que las dosis bajas pueden liberar dopamina más eficazmente en el Nac que en el caudadoputamen, que es la otra región de los ganglios basales que reciben aferencias dopaminérgicas ascendentes, y que esto puede producir la dependencia de la dosis inversa de los cambios en la IL (Weiner, et al., 1988). Los efectos de la dopamina en el del Nac podrían estar favoreciendo la liberación de la IL. Además, el grado en que la anfetamina induce la liberación de dopamina parece implicar un fenómeno similar a la sensibilización. Es posible que estos aspectos de la acción de las anfetaminas provoque una curva en forma de U invertida, generando un proceso inverso dosis dependiente (Weiner, et al., 1988). La relación de la esquizofrenia en humanos procede del uso de antipsicóticos en modelos animales para invertir el proceso descrito previamente. En roedores, la administración de antagonistas de los receptores de dopamina con propiedades antipsicóticas invierte el efecto de las anfetaminas (Gray, 1998; Weiner, 2003). Experimentalmente se han utilizado drogas antpsicóticas atípicas para definir con más precisión el peso que cada receptor dopaminérgico aporta al proceso. Feldon, Shofel y Weiner (1991) llevaron a cabo dos experimentos para conocer los efectos de la administración de antipsicóticos típicos y atípicos en un procedimiento de IL Introducción 45 utilizando un modelo de respuesta emocional condicionada. El procedimiento contaba de tres etapas: 1. antes de la exposición, en la que un estímulo (tono) se presentó repetidamente sin consecuencias; 2. fase de condicionamiento, en el que el estímulo preexpuesto fue emparejado con una descarga, y (3) la prueba, donde IL fue evaluada respecto a la conducta de consumo por los animales durante la presentación del tono. Se les administró tan sólo diez preexposiciones, un procedimiento conocido por ser insuficiente para producir la IL en los animales normales. Es más, la IL estuvo de hecho ausente en los animales tratados con placebo. En marcado contraste, los animales tratados con haloperidol así como con sulpiride presentaron IL. Estos resultados mostraron que los neurolépticos típicos y atípicos permiten mejorar la capacidad de los animales para ignorar estímulos irrelevantes (Feldon, Shofel & Weiner, 1991). Del mismo modo, Ruob, Elsner, Weiner y Feldon (1997) evaluaron en dos experimentos la IL mediante una respuesta emocional condicionada (lick suppression). Los resultados mostraron que de todos los estímulos utilizados, la administración de fármacos antipsicóticos fue eficaz tan sólo con el estímulo utilizado durante la preexposición, en este caso un estímulo luminoso. Este resultado indica que el efecto perturbador de la anfetamina y el efecto potenciador de haloperidol en la IL son modificables mediante la manipulación de la naturaleza del estímulo preexpuesto (Ruob, Elsner, Weiner & Feldon, 1997). Schmajuk, Gray & Larrauri (2004) sugieren que las células dopaminérgicas del mesencéfalo ventral están implicados en los procesos Introducción 46 atencionales que modulan la acción del EC. En este sentido, esta representación se incrementa por agonistas y disminuyen con antagonistas dopaminérgicos. Las simulaciones por ordenador con el modelo describen el efecto de agentes como la nicotina y el haloperidol sobre la IL. De acuerdo a los resultados las simulaciones demuestran qué tanto la nicotina como el haloperidol afectan a la IL cuando se administra durante la fase de preexposición. Además, el modelo reproduce los datos que muestran que la administración de nicotina o haloperidol participan en el deterioro o la facilitación de la IL dependiendo de la duración de EC o el número de ECs. Por lo que han concluido que el modelo demuestra que en la pre-clínica los resultados experimentales, incluyendo la actividad celular y farmacológica, son consistentes con un papel atencional para la dopamina durante el condicionamiento clásico (Schmajuk, Gray & Larrauri, 2005). De la misma forma, la IL abre una línea de la investigación en los procesos de inhibición cognitivos, en la esquizotipía y la posibilidad de estudiar otros trastornos psicopatológicos. El modelo propuesto se basa en la experimentación, premisas neuroquímicas y clínicas que lo convierten en un tema prometedor futuro para la investigación. Las asociaciones que se realizan durante la administración de un fármaco son sumamente complejas. Por ejemplo, cuando un estímulo neutro se empareja repetidamente con un fármaco se establece una asociación entre ellos que pueden inducir dos respuestas diferentes: ya sea una respuesta oponente que contrarresta el efecto de la droga, o una respuesta Introducción 47 que es similar a la inducida por el fármaco. Además, el proceso se hace aún más complejo cuando se analizan las asociaciones que se pueden establecer entre las claves contextuales y la administración de agonistas y antagonistas de la dopamina. Se ha señalado que la administración repetida de fármacos que modulan la actividad dopaminérgica en presencia de un contexto específico genera una respuesta al contexto similar a la inducida por el fármaco condicionado (Álvarez, De La Casa & Sánchez, 2003). De la Casa y Lubow (2002) han considerado que el contexto donde se desarrollan los experimentos bajo la administración de fármacos es una variable importante en la modulación de la IL. Más concretamente, el contexto funcionaría como un estímulo de tal forma que las asociaciones que se formen por parte del sujeto dependerán directamente del contexto donde se haya desarrollado. Además, se ha afirmado que cuando se emplean contextos novedosos y se hacen claramente discriminables, incluyendo por ejemplo cambios en la ilumiNación, en el olor, en la temperatura y en la superficie de las cajas la IL parece exhibirse sensible a las manipulaciones contextuales desarrolladas entre las diferentes fases experimentales (Quintero y otros, 2011a). Para probar el efecto que tiene el cambio de contexto sobre el sistema mesolímbico se realizaron dos experimentos utilizando un procedimiento de inhibición pre-pulso. Los resultados revelaron que las señales contextuales adquirieron la propiedad de modular la inhibición pre-pulso por emparejamientos anteriores del contexto con el antagonista dopaminérgico haloperidol y con el agonista dopaminérgico d- Introducción 48 anfetamina. Las implicaciones de estos resultados son interesantes debido a las posibilidades que podrían implicar el uso de claves del contexto para la administración terapéutica de los fármacos dopaminérgicos. En este sentido, un contexto emparejado repetidamente con un antagonista de dopamina o con un agonista del mismo podría adquirir la propiedad de provocar una RC similar a la producida por el fármaco (De la Casa, Mena, Orgaz & Fernández, 2013). El papel principal del Nac es restringir la expresión de la IL a ciertas condiciones, y de esta manera asegurar que la IL es flexible y sensible a las demandas ambientales. Es importante destacar que, en ausencia de mecanismos moduladores responsables de restringir la expresión de la IL a las condiciones específicas, los efectos de un estímulo intrascendente a la preexposición habrían sido extremadamente robustos y de una mala adaptación, generalizando a través de contextos y contrarrestando la expresión de su condicionamiento posterior al estímulo. En este sentido, se cree que la IL refleja los procesos psicológicos que están deteriorados en la esquizofrenia, mostrando los pacientes una IL reducida. La identificación de regiones cerebrales, cuyo daño conduce a interrumpir la IL frente a la persistencia de ésta en modelos animales, puede proporcionar indicaciones valiosas en los circuitos cerebrales disfuncionales en esquizofrenia (Gal, Schiller & Weiner, 2005). Ya en décadas anteriores se sugería que algún tipo de hiperactividad de los sistemas de dopamina representaba una alteración Introducción 49 bioquímica primaria en la esquizofrenia y que en apariencia constituía al menos una justificación plausible de alteración bioquímica en dicho trastorno (Iversen, 1976; Matthysse, 1978). Por otro lado la entrada mesocortical de la dopamina y la corteza prefrontal juegan un papel crítico en el proceso cognitivo normal y en varias patologías neuropsiquiátricas. Esta entrada de dopamina regula los aspectos de la función de la memoria de trabajo, la planificación y la atención. Del mismo modo, algunas disfunciones pueden ser la base de una gran variedad de síntomas positivos y negativos, y por tanto de muchos de los déficits cognitivos asociados con la esquizofrenia. A pesar de una intensa investigación, todavía tenemos una gran falta de comprensión acerca de los principios básicos de la actividad de la dopamina en la corteza prefrontal. En los últimos años, ha habido un esfuerzo considerable por parte de muchos grupos para entender los mecanismos celulares de la modulación de la dopamina en las neuronas de la corteza prefrontal. Sin embargo, los resultados de estos esfuerzos han conducido a contradicciones y controversias (Nieoullon, 2002). Una de las propuestas de mayor consenso en relación a la función de la dopamina es que actúa como un neuromodulador, y no es claramente un neurotransmisor excitador o inhibidor. Muchas teorías modernas de aprendizaje suponen que la cantidad de atención a una señal depende de lo bien que la señal predice el acontecimiento importante del pasado. La esquizofrenia está asociada con un déficit en la atención y las teorías recientes de la psicosis han argumentado que los síntomas positivos como delirios y aluciNaciones están Introducción 50 relacionados con una falta de atención selectiva. Actualmente sabemos que los pacientes con diagnóstico de esquizofrenia, que presentaban síntomas positivos severos, muestran una calar dificultad para discriminar entre claves predictivas y no predictivas en relación a adultos sanos. Además, el índice de aprendizaje sobre las señales no predictivas correlaciona positivamente con síntomas positivos más graves en la esquizofrenia. Estos resultados sugieren que los síntomas positivos de la esquizofrenia están relacionados con una mayor atención, tanto a las señales que son susceptibles de ser predictivas como a aquellas que no son predictivas durante el aprendizaje causal. Este déficit en la atención selectiva es el resultado del aprendizaje de las asociaciones causales irrelevantes (Morris, Griffiths, Le Pelle & Weickert, 2013). Con independencia de los efectos de la dopamina, algunos resultados sugieren la existencia de al menos otros tres señales moduladoras que parecen funcionar de manera análoga a la propuesta de la dopamina (Fiorillo, 2013). Existe considerable evidencia derivada de estudios in vitro que apoya la hipótesis de que desequilibrios de oxitocina en la interfase materno-fetal podrían estar implicados críticamente en la mediación de los efectos de infección prenatal en el cerebro y el desarrollo del comportamiento. De este modo se incrementa el riesgo de trastornos de desarrollo neurológico que originan la esquizofrenia. Específicamente, la ruptura del equilibrio de oxitocina en el cerebro fetal podría conducir a múltiples anormalidades del comportamiento en la edad adulta. Esto sugiere Introducción 51 que los cambios relativos entre distintas clases de oxitocina pueden determinar el desarrollo neurológico final con implicación de las condiciones infecciosas prenatales (Meyer, Feldon & Yee, 2009). Es evidente que aún queda mucho trabajo por delante, tanto en la búsqueda de cada uno de estos modelos como en la forma en que puedan acoplarse entre sí como un modelo teórico neuropsicológico unificado (Gray, 1998). Introducción 58 de sacarina, mientras que el EI varía según el objetivo del trabajo. Generalmente suele ser una solución de LiCl de administración intraperitoneal aunque también han sido utilizados procedimientos como la administración de giros o radiaciones (Bures y otros, 1998, Hutchison, 1973, Islam, 1978, Smith y otros, 1964). En relación a la IL, la Acs ha sido también frecuentemente utilizada. El procedimiento es simple, administrar el EC en una fase de preexposición de duración variable para posteriormente emparajar con el EI aversivo. La fase de prueba posterior evalúa el grado de devaluación del EC medido por la ingesta de este. Reilly y Bornovalova (2005) tasan el proceso en cinco fases diferentes. Inicialmente el procesamiento del futuro EC. La siguente fase estaría orientada al procesamiento del EI, es decir, al estímulo aversivo que daría paso a la asociación del EC con el EI. Esta última asociación sería la tercera fase. La fase cuarta sería la fase de recuperación, mientras que la quinta sería la de expresión de la asociación EC-EI. Aunque simple a primera vista, la asociación EC ausencia de consecuencias y EC-EI no es del todo tan simple. Existen un gran número de factores que modulan la expresión de la IL (Lubow, 2008). Factores como el número de preexposiciones o fases del experimento, la neofobia, el proceso de contracondicionamiento y los contextos, tanto temporales como espaciales, generan variaciones considerables en la expresión del fenómeno (Domjan, 1976; De la Casa y Lubow, 2000; Lubow, 1989; Lubow y De la Casa, 2005; Rodríguez y Alonso, 2004; Siegel, 1974; Wheeler y otros 2004). Introducción 59 Procesamiento neural del sabor Actualmente se conoce relativamente bien el procesamiento que realiza el sistema nervioso ante la presentación de sabores. El proceso parece iniciarse en el núcleo del tracto solitario bajo la actividad de los nervios craneales facial, glosofaríngeo y vago (Bermúdez-Rattoni, 2004; Contreras, Beckstead y Norgren, 1982; Hamilton y Norgren, 1984; Yamamoto, 2006; Yamamoto y otros, 1994). A continuación se alcanzaría el núcleo parabraquial, con una doble función. Las áreas mediales del núcleo parabraquial se relacionan con información gustativa, las de la zona lateral se relacionan con las sensaciones viscerales (Bielavska y Roldan, 1996; Sacchetti y Bielavska, 1998; Reilly, 1999; Sakai y Yamamoto, 1999; Smith y St John, 1999; Yamamoto y otros, 1994, 1995). El núcleo parabraquial recibe a su vez información de un gran número de áreas relacionadas con el procesamiento del sabor. Estas permiten la modulación de la información permitiendo una actividad adaptativa (Bermúdez-Rattoni, 2004, Bérmudez- Rattoni y otros, 2005; Fulwiler y Saper, 1984; Karimnamazi y Travers, 1998; Saggu y Lundy, 2008). La corteza insular ha sido relacionada directamente con la memoria al sabor (Bermúdez-Rattoni, 2004; Bermudez-Rattoni y otros, 2004; Bures y otros, 1998). Quintero y otros (2014) analizaron la función de las áreas granular y agranular de la corteza insular en el procesamiento de un sabor en diferentes contextos. Los resultados indicaron una clara dependencia de contexto en el control de sabores, apoyando la propuesta de la activación de Introducción 60 la capa granular ante estímulos sápidos (Bermudez-Rattoni y McGaugh, 1991; Braun, 1990; Nerad y otros, 1996; Cubero y otros, 1999; Ormsby y otros, 1998). Estudios con la expresión el gen c-fos muestran una mayor actividad antes sabores novedosos que ante sabores familiares (Koh y otros, 2003; Koh y Bernstein, 2005). Y la lesión de esta área bloquea la capacidad del animal para discriminar entre estímulos sápidos familiares y novedosos (Koh y otros, 2003). Este hecho hace que la corteza insular sea una estructura esencial en la asociaqción EC-EI (Arcolla y Carleton, 2008; Grinvald y otros, 1999). Otra de las estructuras vinculada directamente a la memoria del sabor ha sido la amígdala. Vinculada al núcleo parabraquial y el núcleos del tracto solitario a través de la amígdala central, y con la corteza insular a través de la amígdala lateral y basolateral (Fulwiler y Saper 1984; Krettek y Price, 1977; McDonald y otros, 1999; Price, 2003; Ricard y Koh, 1978; Traverso y otros, 2010), la lesión o bloqueo de esta estructura reduce la capacidad de adquirir Acs. De igual forma, el córtex perirrinal presenta una actividad similar a la amígdala, dado que su bloqueo reduce la Acs durante el consumo, pero no tras este y la aparición de malestar (Gutierrez y otros, 2004; Tassoni y otros, 2000). Objetivos e hipótesis 63 Objetivos e hipótesis El objetivo general del presente trabajo se centra en el análisis de los receptores dopaminérgicos implicados en la IL. Específicamente se analizarán los receptores de dopamina D1 y D2 mediante la administración de antagonistas. Además, se analizará la posible relación de estos receptores con los factores moduladores de la IL. Concretamente se utilizará el fenómeno de la especificidad contextual para evaluar la implicación concreta de estos receptores en cada una de las fases que median el proceso de la IL. El presente trabajo desarrollará 4 experimentos con los siguientes objetivos. 1. El primer experimento analiza el efecto sobre la IL de dos agentes antagonistas dopaminégicos directos, Sulpiride (antagonistas de receptores dopaminérgicos D2) y SCH-23390 (antagonista de los receptores dopaminérgicos D1). Concretamente se analizan los efectos que sobre la recuperación tiene el bloqueo de los receptores D1 y D2. Estos receptores han sido relacionados con procesos atencionales, y en este sentido su implicación en la Objetivos e hipótesis 64 recuperación debería ser limitada, dado que el procesamiento asociativo del estímulo se ha realizado en una fase previa (Weiner, 2003). Con el objetivo de determinar su efecto en los procesos de recuperación estos compuestos se aplicará durante la fase de prueba. 2. Una vez analizada la implicación de los receptores dopaminérgicos D1 y D2 en los procesos de recuperación en un procedimiento de IL, se analizará su implicación en uno de los procesos moduladores de la IL como es la especificidad contextual (Hall y Honey, 1989; Hall y Minor, 1984; Quintero y otros 2011a, b; Westbrook y otros, 2000). Las manipulaciones experimentales en el Sub-v modulan la liberación de dopamina en el ATV sobre el Nac (Floresco y otros, 2001). Esta liberación se ve facilitada por las proyecciones glutamatérgicas desde el ATV y los receptores dopamnérgicos postsinápticos que incrementan la actividad del Nac. Con el objetivo de analizar si esta actividad es dependiente del contexto, se analizó el bloqueo de los receptores dopaminérgicos D1 y D2 bajo un procedimiento que evaluaba la especificidad contextual de la IL. 3. Los receptores de dopamina D2 han sido relacionados directamente con los procesos atencionales. Las proyecciones Objetivos e hipótesis 65 prefrontales sobre el Nac utilizan este tipo de receptor en forma de modulador presináptico. Estos datos han sido descritos por estudios electrofisiológicos (Floresco y otros, 2001), donde el incremento de la actividad dopaminérgica reduce la actividad del córtex prefrontal sobre el Nac. Con el objetivo de analizar si el receptor D2 está implicado en los procesos atencionales, se evaluó el bloqueo de este receptor durante la fase de preexposición. Es durante esta donde los procesos atencionales adquieren una mayor relevancia. 4. El último experimento se realizó con el objetivo de analizar el fenómeno de la superinhibición latente cuando se utiliza un contexto experimental durante la pre-exposición y condicionamiento, y durante la fase de test se utiliza el contexto hogar. Quintero y otros (2011a) describieron este fenómeno observando un incremento significativo de la IL cuando el contexto hogar sirve de contexto de recuperación. Este fenómeno es de gran interés dado que es uno de los más característicos a la hora de evaluar la recuperación de las asociaciones entre estímulos. En este sentido, indicar que tanto los procesos atencionales como el procesamiento contextual, relacionados por los receptores dopaminérgicos D2 y D1 respectivamente, podrían presentar una actividad específica en el proceso modulador de la superinhibición Objetivos e hipótesis 66 latente. Este último experimento evaluó esta actividad administrando durante las fases de pre-exposición y condicionamiento los agentes bloqueadores de los receptores dopaminérgicos D1 y D2. En resumen, los objetivos del presente trabajo intentan diferenciar la implicación de los receptores dopaminérgicos D1 y D2 en las diferentes fases que describe un procedimiento de inhibición latente con un doble objetivo general: 1. analizar en qué medida la IL es un problema de adquisición o recuperación y 2. Como modula la dopamina la expresión, tanto por exceso (superinhibición latente) como por defecto (especificidad contextual), de la IL. Por lo tanto nuestra hipótesis de partida será la siguiente: 1. Si los receptores dopaminérgicos D2 están implicados en los procesos atencionales deberíamos observar un incremento de la IL cuando el bloqueo de estos sea durante la fase de pre-exposición, pero no de recuperación. 2. El bloqueo de los receptores D2 debería ser independiente del contexto, y por tanto no debería afectar a la expresión de la IL cuando su administración fuera durante la fase de recuperación. De igual modo, la expresión de la IL debería ser independiente de contexto cuando la administración de antagonistas de D2 fuera durante la fase de adquisición. Objetivos e hipótesis 67 3. El bloqueo del receptor D1 debería afectar exclusivamente a la expresión de la IL cuando se realizan cambios contextuales. Así, la administración durante la fase de recuperación y de adquisición deberían mostrar una IL normal, sin expresar superinhibición latente ni especificidad contextual. Experimentos 75 condicionamiento (Experimento 2) o exclusivamente durante la fase de prueba (Experimento 4). Experimentos 76 Experimentos 77 Experimento 1 Introducción La mayoría de los experimentos que han analizado el efecto de los fármacos agonistas y antagonistas de dopamina en la IL han mostrado que en dicho fenómeno están especialmente implicados los receptores dopaminérgicos del tipo D2. De hecho se ha mostrado que la estimulación de dichos receptores atenúa la IL, y que tanto los antipsicóticos típicos como los atípicos que bloquean los receptores D2 neutralizan el efecto de los fármacos agonistas, facilitando la expresión de dicho fenómeno en condiciones que generan una IL débil (Dunn y otros, 1993; Gosselin y otros, 1996; Warburton y otros, 1994; Weiner y otros, 1996). Por el contrario, y con relación a los receptores D1, aunque existen experimentos que muestran que los antagonistas de D1 pueden invertir los efectos de atenuación de la IL provocada por la estimulación de los receptores D2 (Nelson y otros, 2012), en la mayoría de los estudios no se observa una implicación directa de estos receptores en la IL (Ellenbroek y otros, 1996; Stevenson y Graton, 2002; Trimble y otros, 2002). Más bien, el papel de estos receptores en la IL parece estar más relacionado con efectos moduladores. Estudios recientes han mostrado la implicación del subiculum ventral en el procesamiento contextual que modula la expresión de la IL (Quintero y otros, 2011b). Específicamente se ha planteado que el subiculum ventral puede actuar como interface entre las áreas ventrales CA1 y CA3 del hipocampo implicadas en los procesos de codificación y recuperación de Experimentos 78 información contextual y la modulación dopaminérgica de áreas subcorticales como el Nac y la Vta (Floresco y otros, 2001). La implicación central de los receptores D1 en la plasticidad sináptica de estas áreas hipocampales (Ortiz y otros, 2010) apuntan a un efecto modulador de los mismos a través de la información contextual en la IL. En el presente experimento analizamos el efecto en la IL de dos antagonistas dopaminégicos directos, Sulpiride (antogonistas de receptores D2) y SCH-23390 (antagonistas de los receptores D1). Dichos fármacos fueron aplicados durante las fases de preexposición y de condicionamiento. La mayoría de los estudios que han utilizado antagonistas dopaminérgicos han aplicado los fármacos a procedimientos que generaban una débil IL (Dunn y otros, 1993; Feldon y Weiner, 1991; Trimble y otros, 2002) o lo han usado para tratar de invertir el efecto de agonistas dopaminérgicos (De la Casa y otros, 1999; Weiner y otros, 1990). Dado que el objetivo general del estudio se centra tanto en el análisis los efectos directos de los antagonistas D1 y D2 sobre la IL, así como sobre la especificidad contextual de la misma, en el presente experimento aplicaremos dichos fármacos a un procedimiento que ha mostrado ser efectivo para producir un efecto robusto de IL. De esta manera podremos comparar los efectos de los fármacos sobre la IL con y sin cambio de contexto. Experimentos 79 Métodos Sujetos. En el presente experimento participaron un total de 47 ratas macho Wistar, totalmente ingenuas al comienzo del experimento. El rango de peso de los sujetos experimentales estuvo entre 295g y 342g. Durante el experimento las ratas fueron alojadas individualmente en cajas de plexiglás cubiertas en la base con serrín. El tamaño de las cajas fue de 40 x 20 x 24 cm. Los animales fueron mantenidos en un ciclo regular 12:12 horas de luzoscuridad. Las sesiones experimentales se llevaron a cabo durante el periodo de luz. La comida estuvo disponible ad libitum durante todo el experimento y el agua fue restringida a un periodo de 25 minutos por día. Uno de los animales fue eliminado del experimento debido a problemas con una de las botellas experimentales durante la sesión de prueba. El animalario estuvo iluminado por bombillas de 100W. Los animales en este y en los siguientes experimentos fueron mantenidos y usados para experimentación siguiendo la normativa establecida por la Directiva 86/609/CEE del Consejo de la Comunidad Europea y el real decreto 223/1988 de la normativa española. Aparatos. Todas las sesiones experimentales fueron realizadas en las jaulas hogar de los animales (ver apartado de Sujetos). Las soluciones fueron proporcionadas a temperatura ambiente en botellas de plástico graduadas de 150 ml. La boquilla de la botella era de acero inoxidable. Las botellas fueron colocadas en la parte frontal de las rejillas de las cajas Experimentos 80 durante la presentación de líquidos. La cantidad de líquido consumido por cada rata fue medido mediante el diferencial del peso de la botella antes y después de la presentación de las soluciones de agua o de sabor. Las soluciones fueron agua o sacarina sódica disuelta en agua al 0.04%. El estímulo incondicionado consistió en una inyección intraperitoneal de cloruro de litio (0.4-M) al 5% del peso corporal. El fármaco antagonista de los receptores D1 fue una solución de SCH-23390 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) disuelto en solución salina y administrada al 0.02% mg/kg. El fármaco antagonista de los receptores D2 fue una solución de sulpiride (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) disuelta en solución salina. La administración fue de 100mg/kg. Los sujetos control se utilizaron inyecciones de salino (0.1 ml.). Todas las drogas fueron inyectadas intraperitonealmente veinte minutos antes de la presentación de las botellas con las soluciones correspondientes. Procedimiento. Veinticuatro horas antes del comienzo del experimento se retiraron las botellas de agua de las jaulas hogar de los animales. Durante la fase de preexposición cada rata recibió cuatro sesiones (de 5 minutos cada una) de acceso a la solución correspondiente. Esto es: sacarina el grupo preexposición (Pe), o agua el grupo de no preexposición (Npe) en sus jaulas hogares en días consecutivos (ver tabla 1). El día 5 (fase de condicionamiento), todas las ratas recibieron 5 minutos de acceso a la solución de sacarina seguida de una inyección intraperitoneal de LiCl. Experimentos 81 Previo al desarrollo del experimento, las ratas de cada grupo (Pe y Npe) fueron asignadas a una de las tres condiciones de droga: Sal, Sulp o SCH-23390. Los grupos (n=8, salvo el grupo Npe-Sal=7) fueron igualados en función del peso. Durante la fase de preexposición y condicionamiento los animales recibieron sesiones de 5 min cada una de acceso a la sacarina en días consecutivos. La administración del salino (Sal) o del compuesto de sulpiride (Sulp) o SCH-23390 (SCH), correspondientes a cada grupo, fue inyecta 20 minutos antes del comienzo de cada sesión de preexposuición o condicionamiento (ver tabla 1). Diseño experimental. Pre 1 2 3 4 EC-EI Test 1 Test 2 Test 3 Npe Sal A A A A S-LiCl S S S Sulp SCH Pe Sal S S S S S S S Sulp SCH Tabla 1. Diseño experimental. Npe: grupo de no preexposición. Pe: grupo de preexposición. A: Agua. S: Compuesto de sacarina sódica al 0.04%. EC-EI: fase de condicionamiento. Sal: solución salina. Sulp. Sulpiride. SCH: SCH-23390 Experimentos 82 Resultados y discusión Los consumos medios en los ensayos de la fase de preexposición en función del sabor y de la droga se muestran en la figura 1. Los datos fueron analizado con un ANOVA mixto 4 (ensayos) x 2 (sabor: sacarina vs agua) x 3 (droga: Sal, Sulp, SCH) con medidas repetidas para la primera variable. El análisis mostró un efecto significativo de la variable Ensayos, F(3, 123)= 31.17, p< 0.001, debido a un incremento generalizado del consumo a lo largo de los ensayos de preexposición. Los efectos principales de las variables sabor y droga no fueron significativos (ps> 0.05). Las interacciones sabor x droga, ensayos x droga y ensayos x sabor x droga no fueron significativas (todas las ps> 0.05). Hubo un efecto significativo de la interacción ensayos x sabor, F(3, 123)= 9.82, p< 0.001 debido a la habituación a la neofobia de la sacarina. El análisis de los efectos simples mostró que el consumo de sacarina fue menor que el de agua en el primer ensayo de preexposición (p< 0.01) y que este patrón se invirtió en los ensayos 3 y 4 en los que el consumo de sacarina fue mayor que el de agua (ps< 0.01). En la figura 2 se muestra el consumo medio de sacarina el día del condicionamiento en función de la preexposición y de la droga. El análisis de los datos realizados con un ANOVA 2 (preexposición) x 3 (droga) mostró un efecto significativo de la variable droga, F(2, 41)= 4.69, p< 0.05 debido a que los animales de la condición Sul consumieron más sacarina que los de la condición Sal (p< 0.05) y los de la condición SCH (p< 0.05). También hubo un efecto significativo de la variable preexposición, F(1, 41)= 11.37, p< 0.001 Experimentos 83 debido que los grupos preexpuestos consumieron más sacarina que los no preexpuestos (media Pe=9.56, sd=2.04 y media Npe= 8, sd=1.22. Figura 1. Consumo medio de sacarina sódica (grupo de Pe) o agua (grupo de Npe) durante la fase de preexposición. La gráfica muestra los cuatro ensayos en días consecutivos previos al condicionamiento. Npe.: grupo de no preexposición a sacarina. Pe: grupo de preexposición a sacarina. Sal: grupo de inyección salina. Sulp: grupo de inyección de sulpiride. SCH: grupo de inyección SCH-23390. Dado que el consumo del día del condicionamiento es una variable que afecta directamente al tamaño del efecto de la IL para el análisis de los consumos de los días de prueba, decidimos realizar una transformación de los datos en razones de supresión. Dicha transformación se realizó dividiendo el consumo del día de prueba correspondiente entre el sumatorio del consumo del día de condicionamiento y el consumo de la prueba. Esta transformación nos permite controlar las diferencias debidas al consumo del día del condicionamiento. 0 2 4 6 8 10 12 Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 Consumo medio en ml NPE-SAL PE-SAL NPE-SULP PE-SULP NPE-SCH PE-SCH Experimentos 84 Figura 2. Consumo medio de sacarina sódica durante la fase de condicionamiento. Npe.: grupo de no preexposición a sacarina. Pe: grupo de preexposición a sacarina. Sal: grupo de inyección salina. Sulp: grupo de inyección de sulpiride. SCH: grupo de inyección SCH-23390. En la figura 3 se muestran las razones de supresión media durante los ensayos de prueba 1 (A), 2 (B) y 3 (C) en función de la preexposición y de la droga. Como puede observarse durante el primer ensayo de prueba hubo un efecto de IL para todas las condiciones de droga, siendo el efecto mayor para los grupos SUL y el menor para los grupos SCH. El efecto de IL no aparece, sin embargo, en los ensayos 2 y 3. 0 2 4 6 8 10 12 14 Sal Sulp SCH Consumo medio de sacarina (ml) NPE PE Experimentos 91 animalario iluminada por una luz roja de 75W. El resto de los aparatos fueron idénticos a los usados en el Experimento 1. La fase de prueba se realizó en las cajas hogar de los animales. Procedimiento. Como en el Experimento 1, durante las cuatro sesiones de la fase de preexposición, el grupo Npe recibió 5 minutos de acceso al agua en sus cajas hogares mientras que los grupos de Pe recibieron acceso a una solución de sacarina. El ensayo de condicionamiento (día 5), al igual que la preexposición, se desarrolló en el contexto A (ver tabla 2). Los ensayos comenzaron con un periodo de adaptación de 10 minutos al nuevo contexto. Posteriormente, durante el condicionamiento, todos los animales tuvieron 5 min de acceso a la solución de sacarina seguida inmediatamente de una inyección IP de LiCl. Los animales permanecieron en este contexto durante 5 minutos antes de ser trasladado a sus cajas hogar. Antes del comienzo del experimento, los animales fueron asignados a los diferentes grupos (n=8) siguiendo el mismo criterio usado en el Experimento 1 (Npe-Sal, Pe-Sal, Npe-Sulp, Pe-Sulp, Npe-SCH, Pe-SCH). Veinte minutos antes del comienzo de cada sesión cada rata fue inyecta intraperitonealmente con la correspondiente droga, permaneciendo durante este periodo en su caja hogar. Las tres sesiones de la fase de prueba se desarrollaron en el contexto hogar. Como en la fase de condicionamiento, tras 10 min, los animales tuvieron acceso a la solución de sacarina durante 5 min. Experimentos 92 Diseño experimental. Contexto A Cajas hogar Pre 1 2 3 4 EC-EI Test 1 Test 2 Test 3 Npe Sal A A A A S-LiCl S S S Sulp SCH Pe Sal S S S S S S S Sulp SCH Tabla 2. Diseño experimental. Npe: grupo de no preexposición. Pe: grupo de preexposición. A: Agua. S: Compuesto de sacarina sódica al 0.04%. EC-EI: fase de condicionamiento. Sal: solución salina. Sulp. Sulpiride. SCH: SCH-23390. Resultados y discusión En la figura 4 se muestra el consumo medio de fluido de los animales durante la fase de preexposición en función del sabor preexpuesto y del fármaco inyectado. Un ANOVA 2 (sabor) x 3 (droga) x 4 (ensayos) realizado sobre el consumo de los animales, con medidas repetidas para la última variable, reveló un efecto significativo de la variable droga, F(2, 43)= 17.427, p< 0.001 debido a un menor consumo de fluido de la condición SCH. Ni el efecto principal de la variable sabor ni el de la interacción droga x sabor y el de la interacción sabor x ensayo fueron significativos (todas las ps> 0.05) indicando que el efecto de la droga se produjo sobre el consumo independientemente del sabor consumido. Experimentos 93 Figura 4. Consumo medio de sacarina sódica (Pe) o agua (Npe) durante la fase de preexposición en el Contexto A. La gráfica muestra los cuatro ensayos en días consecutivos previos al condicionamiento. Npe.: grupo de no preexposición a sacarina. Pe: grupo de preexposición a sacarina. Sal: grupo de inyección salina. Sulp: grupo de inyección de sulpiride. SCH: grupo de inyección SCH-23390. El efecto principal de la variable ensayos fue significativo, F(3, 129)= 27.031, p< 0.001, debido a un incremento generalizado del consumo a lo largo de los ensayos de preexposición. El efecto de la interacción droga x ensayo fue significativo, F(6, 129)= 8.522, p< 0.001. La triple interacción sabor x droga x ensayo también fue significativa, F(6, 129)= 7.05, p< 0.001. El análisis de los efectos simples mostró que esta interacción fue debida a que en los grupos Sal el consumo de agua y sacarina fue similar en los 4 ensayos de preexposición (todas las ps>0.05), sin embargo en los grupos SCH el consumo de sacarina fue mayor que el de agua el último ensayo de preexposición, F(1, 14)= 14.59, p< 0.001. Y en los grupos de Sulp el 0 2 4 6 8 10 12 Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 Consumo medio (ml) NPE-SAL PE-SAL NPE-SULP PE-SULP NPE-SCH PE-SCH Experimentos 94 consumo de agua fue mayor que el de sacarina en los ensayos 1, F(1, 14)= 5.91, p< 0.05 y 2, F(1, 14)= 5.47, p> 0.05. Sin embargo en el ensayo 3, la relación de consumo se invirtió, siendo mayor el consumo de sacarina que el de agua, F(1, 14)= 44.94, p< 0.001. En el ensayo 4, el consumo del grupo de agua y el de sacarina se igualó (p> 0.05). La comparación de los grupos de Npe mostró un efecto significativo de la droga en el primer ensayo de preexposición, F(2, 21)= 16.67, p< 0.001. El análisis a posteriori con la prueba de Tuckey mostró que el consumo de agua del grupo Sulp fue mayor que el del grupo Sal (p< 0.05) y que el del grupo SCH (p< 0.05). El grupo Sal consumió significativamente más agua que el grupo SCH. En el ensayo 2, el efecto de la droga también fue significativo, F(2, 21)= 8.623, p< 0.01. El grupo Sul consumió más agua que los otros dos grupos (ps< 0.05) los cuales no difirieron entre sí. En el ensayo 3 también hubo un efecto significativo de la droga, F(2, 21)= 3.991, p< 0.05. El grupo Sal consumió significativamente más agua que el grupo Sulp (p< 0.05). Los grupos se igualaron en el consumo de agua en el último ensayo de preexposición (p> 0.05). En los grupo de Pe hubo un efecto significativo de la droga en todos los ensayos de preexposición (todas las ps< 0.05). El consumo de sacarina fue mayor en el grupo Sulp que en el grupo SCH (p< 0.05) durante el primer ensayo. En el ensayo 2 el grupo SCH consumió menos sacarina que el grupo Sal (p< 0.05). En el ensayo 3 el consumo del grupo SCH fue menor que el de los otros dos grupos (ps< 0.05). Sin embargo, en el cuarto ensayo el grupo Sal consumió significativamente menos sacarina que el resto de los grupos (p< 0.05). Experimentos 95 Figura 5. Consumo medio de sacarina sódica durante la fase de condicionamiento en el Contexto A. Npe.: grupo de no preexposición a sacarina. Pe: grupo de preexposición a sacarina. Sal: grupo de inyección salina. Sulp: grupo de inyección de sulpiride. SCH: grupo de inyección SCH-23390. El consumo medio de sacarina durante el día del condicionamiento en función de la Preexposición y la Droga se muestra en la figura 5. El análisis de los datos se realizó con un ANOVA 2 (preexposición: Npe vs.Pe) x 3 (droga: Sal, Sulp, SCH). Sólo el efecto de la preexposición fue significativa, F(1, 43)= 5.49, p> 0.05, dado que los grupos Pe consumieron más sacarina que los grupos Npe, probablemente debido a un efecto de neofobia. Al igual que en el experimento anterior transformamos los datos de consumo directo en razones de supresión con el objetivo de controlar el efecto del consumo del día de condicionamiento. En la figura 6 aparecen representados los consumos medios de los animales en los tres días de prueba en función de la preexposición y de la 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sal Sulp SCH Consumo medio de sacarina (ml) NPE PE Experimentos 96 droga. Como puede observarse durante el primer día de prueba hubo un efecto de IL para todas las condiciones de drogas, aunque el efecto parece ser mayor en la condición SCH. La IL parece disminuir a lo largo de los ensayos de prueba. Sin embargo, los resultados de los análisis estadísticos no confirmaron estas impresiones. El ANOVA 3 (prueba) x 3 (droga) x 2 (prexposición) realizado sobre las razones de supresión no mostró ningún efecto significativo de la droga ni principal ni interactivo (todas las ps> 0.05). Hubo un efecto significativo de la variable preexposición, F(1, 43)= 28.90, p< 0.001, debido a un mayor consumo de sacarina de los grupos Pe que de los Npe (efecto de IL). El efecto de la variable prueba también fue significativo, F(2, 86)= 193.97, p< 0.001, debido a un incremento generalizado del consumo a lo largo de los ensayos. La interacción preexposición x prueba también fue significativa, F(2, 86)= 10.27, p< 0.001. Figura 6. Consumo medio de sacarina sódica durante la fase de prueba. A. Primer día de prueba. B y C segundo y tercer día de prueba respectivamente. Npe.: grupo de no preexposición a sacarina. Pe: grupo de preexposición a sacarina. Sal: grupo de inyección salina. Sulp: grupo de inyección de sulpiride. SCH: grupo de inyección SCH-23390. Experimentos 97 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 SAL SULP SCH Consumo medio de sacarina (ml) A NPE PE 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 SAL SULP SCH Consumo medio de sacarina (ml) B NPE PE 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 SAL SULP SCH Consumo medio de sacarina (ml) C NPE PE Experimentos 98 Experimento 3 Introducción La ausencia de resultados significativos en los experimentos anteriores no condujeron a replantearnos el procedimiento seleccionado para analizar el efecto de las drogas agonistas dopaminérgicas sobre la modulación contextual de la IL. Por ello, en los dos siguientes experimentos utilizamos un diseño más tradicional para el análisis de dicho efecto. Como hemos planteado anteriormente los resultados más consistentes con relación a esta temática se han obtenido cuando se ha introducido un cambio de contexto de la fase de preexposición a las fases de prueba. Además del cambio procedimental en el presente experimento aplicamos los fármacos exclusivamente durante la fase de prueba. Como comentamos en la introducción, existen numerosos trabajos han demostrado la dependencia dopaminérgica de la IL cuando las drogas se han inyectado en las fases de preexposición y condicionamiento, pero esta manipulación no nos permite identificar si los efectos de los fármacos actúan sobre los procesos de codificación o sobre los procesos de recuperación. Por ello, en el presente experimento analizamos el efecto en la IL de dos antagonistas dopaminégicos directos, Sulpiride (antogonistas de receptores D2) y SCH- 23390 (antagonistas de los receptores D1), aplicados durante la fase de prueba. Con el objetivo de determinar si, tal y como plantean las teorías del fallo de la recuperación, es en esta fase donde se produce la competición entre los aprendizajes establecidos durante la preexposición y el Experimentos 99 condicionamiento Métodos Sujetos. En el experimento se utilizaron 48 ratas Wistar, macho (provenientes del animalario de la Universidad de Sevilla). El peso medio de los animales varió en un rango de 250 a 315 gr. Durante el experimento las ratas fueron alojadas individualmente en cajas de plexiglás cubiertas en la base con serrín. Las condiciones de estabulación fueron similares a la de los experimentos anteriores. Aparatos. Al igual que en el Experimento 1 todas las sesiones experimentales fueron realizadas en las cajas hogar de los animales. Las cajas, las botellas experimentales, las soluciones utilizadas como EC y control, el EI fueron idénticos a los del Experimento 1. Los fármacos utilizados fueron los mismos del Experimento 1. Procedimiento. Veinticuatro horas antes del comienzo del experimento se retiraron las botellas de agua de las jaulas hogar de los animales. Durante la fase de preexposición cada rata recibió cuatro sesiones (de 5 minutos cada una) de acceso a la solución correspondiente. Esto es: sacarina el grupo preexposición (Pe), o agua el grupo de no preexposición (Npe) en sus jaulas hogares en días consecutivos (ver tabla 3). El día 5 (fase de condicionamiento), todas las ratas recibieron 5 minutos de acceso a la solución de sacarina seguida de una inyección Experimentos 100 intraperitoneal de LiCl. Tras el condicionamiento, las ratas de cada grupo (Pe y Npe) fueron asignadas a una de las tres condiciones de droga: salino (Sal), sulpiride (Sulp) o SCH-23390 (SCH). Los grupos (n=8, salvo el grupo Npe-SCH=7) fueron igualados en función del consumo y del peso. Durante la Fase de prueba, los animales recibieron tres sesiones (de 5 min. Cada una) de acceso a la sacarina en días consecutivos. Las drogas correspondientes a cada grupo fue inyecta 20 minutos antes del comienzo de cada sesión de prueba. Diseño experimental Pre 1 2 3 4 EC-EI Test 1 Test 2 Test 3 Npe A A A A S-LiCl Sal S S S Sulp SCH Pe S S S S Sal S S S Sulp SCH Tabla 3. Diseño experimental. Npe: grupo de no preexposición. Pe: grupo de preexposición. A: Agua. S: Compuesto de sacarina sódica al 0.04%. EC-EI: fase de condicionamiento. Sal: solución salina. Sulp. Sulpiride. SCH: SCH-23390 Experimentos 107 Métodos Sujetos. En este estudio participaron 48 ratas Wistar macho proporcionadas por el animalario de la Universidad de Sevilla. El peso de los animales estuvo entre 290g y 340g. Las ratas fueron alojadas y mantenidas en condiciones similares a las del Experimento 1. Aparatos. La fase de preexposición fue realizada en las cajas hogar de los animales. Las fases de condicionamiento y prueba fueron realizadas en un contexto diferente al de preexposición (contexto A). Este contexto fue el mismo que el utilizado en el experimento 2. El resto de los aparatos fueron idénticos a los usados en el Experimento 1, 2 y 3. Procedimiento. Como en el Experimento 1 y 3, durante las cuatro sesiones de la fase de preexposición, el grupo Npe recibió 5 minutos de acceso al agua en sus cajas hogares mientras que los grupos de Pe recibieron acceso a una solución de sacarina. El ensayo de condicionamiento (día 5) se desarrolló en el contexto A (ver tabla 5). Este ensayo comenzó con un periodo de adaptación de 10 minutos al nuevo contexto. Posteriormente todos los animales tuvieron 5 min de acceso a la solución de sacarina seguida inmediatamente de una inyección ip de LiCl. Los animales permanecieron en este contexto durante 5 minutos antes de ser trasladado a sus cajas hogar. Antes del comienzo de la fase de prueba los animales fueron asignados a los diferentes grupos (n=8) siguiendo el mismo criterio Experimentos 108 usado en el Experimento 3 (Npe-Sal, Pe-Sal, Npe-Sulp, Pe-Sulp, Npe-SCH, Pe-SCH). Veinte minutos antes del comienzo de cada sesión cada rata fue inyecta intraperitonealmente con la correspondiente droga, permaneciendo durante este periodo en su caja hogar. Las tres sesiones de la fase de prueba se desarrollaron en el contexto A. Como en la fase de condicionamiento, tras 10 min, los animales tuvieron acceso a la solución de sacarina durante 5 min y permanecieron en dicho contexto durante 5 min antes de ser trasladados a sus cajas hogar. Diseño experimental. Cajas hogar Contexto A Pre 1 2 3 4 EC-EI Test 1 Test 2 Test 3 Npe A A A A S-LiCl Sal S S S Sulp SCH Pe S S S S Sal S S S Sulp SCH Tabla 5. Diseño experimental. Npe: grupo de no preexposición. Pe: grupo de preexposición. A: Agua. S: Compuesto de sacarina sódica al 0.04%. EC-EI: fase de condicionamiento. Sal: solución salina. Sulp. Sulpiride. SCH: SCH-23390. Experimentos 109 Resultados y discusión. En la tabla 6 se muestra el consume medio de fluido en los ensayos de preexposición en función de la condición de preexposición. Un ANOVA mixto 4 (ensayos) x 2 (preexposición) mostró un efecto principal significativo de los ensayos, F(3,138)=54.39, p< 0.01. El efecto de la prrexposición no fue significativo, F(1,46)=0.48, p> 0.50. La interacción ensayos x preexposición fue significativa, F(3,138)=7.05, p< 0.01, reflejando probablemente un efecto general de habituación a la neofobia del grupo Pe. Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 EC-EI Npe 7.49 (0.57) 9.19 (0.49) 9.59 (0.44) 9.36 (0.43) 8.74 (0.28) Pe 5.96 (0.37) 8.49 (0.32) 9.61 (0.29) 10.2 (0.30) 9.25 (0.327) Tabla 6. Consumo medio a lo largo de los ensayos de preexposición en función del sabor preexpuesto (Npe: agua vs. Pe: sacarina) y de la fase de condicionamiento (EC-EI). SEMs aparecen entre paréntesis. El día del condicionamiento los grupos consumieron cantidades similares de sacarina, t(1,46)=1.59, p> 0.05. El consumo medio de sacarina para los grupos Npe y Pe aparece en la tabla 6. La figura 8 muestra el consumo medio de los grupos en los ensayos de prueba en función de la preexposición y de la droga. Para analizar el consumo en los día de prueba realizamos un ANOVA mixto 3 x 2 x 3 (droga x preexposición x ensayos de prueba) con medidas repetidas para la última variable. El análisis mostró un efecto significativo de la droga, F(2, 42)=68.64, Experimentos 110 p< 0.01, de la preexposición, F(1, 42)=32.57, p< 0.01 y de los ensayos de prueba, F(2, 84)=126.12, p< 0.01. También fueron significativas las interacciónes droga x ensayos de prueba, F(4,84)= 22.71, p< 0.01, droga x preexposición, F(2, 42)=12.16, p< 0.01 y droga x ensayos de prueba x preexposición, F(4,84)=4.05, p< 0.01. La interacción ensayos de prueba x preexposición no fue significativa (p> 0.05). Figura 8. Consumo medio de sacarina sódica durante la fase de prueba. La gráfica muestra los tres ensayos de prueba de tres días consecutivos tras el condicionamiento. Npe.: grupo de no preexposición a sacarina. Pe: grupo de preexposición a sacarina. Sal: grupo de inyección salina. Sulp: grupo de inyección de sulpiride. SCH: grupo de inyección SCH-23390. El análisis de la triple interacción mostró que en el primer ensayo, la interación droga x preexosición fue significativa, F(2, 42)=33.10, p< 0.01. El análisis de efectos simples (prueba T-Student) mostró que el cambio de 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Test 1 Test 2 Test 3 Consumo medio de sacarina (ml) Sesiones de prueba NPE-SAL PE-SAL NPE-SULP PE-SULP NPE-SCH PE-SCH Experimentos 111 contexto abolió el efecto de IL en la condición salino, t(1, 14)=0.91, p= 0.37. Sin embargo, este efecto fue invertido en la condición sulpiride, t(1, 14)=6.92, p< 0.01. No hubo diferencias significativas entre los grupos Npe y Pe en la condición SCH, t(1, 14)=1.98, p> 0.05. Los grupos de Npe fueron significativamente diferentes, F(2, 21)=10.65, p< 0.01. Los animales de la condición SCH bebieron menos sacarina que los de la condición Npe-Sal (p< 0.01) y Npe-Sulp (p< 0.01). El consumo de sacarina fue similar en los dos últimos grupos. Los consumos de los grupos de Pe fueron significativamente distintos, F(2, 21)=41.19, p< 0.01. El grupo Pe-Sulp bebió más sacarina que el grupo Pe-Sal (p< 0.01) y el grupo Pe-SCH (p< 0.01). El consumo de sacarina fue similar para los dos últimos grupos. El segundo día de prueba se obtuvo un efecto de IL en las condiciones salino y sulpiride. Hubo diferencias entre los grupos de Pe y Npe para la condición salino, t(1, 14)=3.14, p< 0.01, y sulpiride, t(1, 14)=3.76, p< 0.01. Las diferencias entre los grupos de Pe y Npe no fueron significativa en la condición SCH, t(1, 14)=0.24, p> 0.05. El grupo Pe-Sulp bebió más sacarina que el grupo Pe-SCH (p< 0.05), y el grupo Pe-Sal (p< 0.05). Las comparaciones entre los grupos Npe mostraron que el grupo Npe-Sulp consumió más sacarina que el grupo Npe-Sal (p< 0.05) y el grupo Npe-SCH (p< 0.01). No existieron diferencias significativas entre los grupos Npe-Sal y Npe-SCH (p> 0.05). La interacción droga x preexposición fue significativa el tercer día de prueba, F(2, 42)=6.29, p> 0.01. Los análisis de los efectos simples mostraron Experimentos 112 un efecto de IL en la condición salino t(1, 14)=2.55, p< 0.05, y Sulp, t(1, 14)=4.14, p< 0.01 pero no para la condición SCH, t(1, 14)=1.11, p> 0.05. El consumo de sacarina fue diferente en los grupos de Pe, F(2, 21)=44.47, p< 0.01. El grupo Pe-Sulp consumió más sacarina que los grupos Pe-Sal y Pe- SCH (ps< 0.01). El grupo Pe-Sal ingirió más sacarina que el grupo Pe-SCH (p< 0.05). Hubo diferencias significativas entre los grupos Npe, F(2, 21)=27.08, p< 0.05. El grupo Npe-Sulp consumió más sacarina que los grupos Npe-Sal y Npe-SCH (ps< 0.01). Sin embargo, no se hallaron diferencias significativas entre estos dos grupos (p= 0.19). Para finalizar las comparaciones intragrupos mostraron que el consumo de sacarina incrementó a lo largo de los ensayos de prueba en el grupo Pe-Sal, F(2, 14)=22.04, p< 0.01. Este incremento fue significativo en todos los ensayos (todas las ps< 0.01). El consumo del grupo Pe-Sulp también incrementó significativamente con los ensayos, F(2, 14)=29.53, p< 0.01 pero no hubo diferencias significativas del ensayo 1 al ensayo 2 (p> 0.05). El consumo de sacarina fue similar a lo largo de los ensayos de prueba en el grupo Pe-SCH (todas las ps< 0.05). La extinción de la Acs fue significativa en el grupo Npe-Sal, F(2, 14)=12.58, p< 0.01. El consumo de sacarina incrementó del ensayo 2 al 3 (p< 0.05). El patrón de respuesta fue similar en el grupo Npe-Sulp , F(2, 14)=59.39, p< 0.01, con un incremento significativo del consumo a lo largo de los ensayos de prueba (todas las ps< 0.01). El grupo Npe-SCH también incrementó el consumo en los ensayos de prueba, F(2, 12)=17.53, p< 0.05. Y Experimentos 113 se hallaron diferencias significativas en todos los ensayos (todas las ps< 0.05). Los resultados muestran un efecto dependencia contextual de la IL y un patrón diferencial de los antagonistas D2 y D1 sobre dicho efecto. El cambio de contexto abolió el efecto de IL en los grupos de salino. Este efecto se observó sólo durante el primer día de prueba. La aplicación de los antagonistas D2 (sulpiride) invirtió este efecto observándose un efecto de IL desde el primer día de prueba. Los antagonistas D1, sin embargo no sólo no alteraron el efecto del cambio contextual sino que lo intensificaron manteniendo la abolición de la IL a lo largo de los tres ensayos de prueba. Discusión general 117 Discusión General Nuestros resultados mostraron que el bloqueo de los receptores D1 y D2 durante las fases de preexposición y de condicionamiento no tuvieron ningún efecto sobre la IL (Experimento 1) ni sobre su especificidad contextual (Experimento 2). Sin embargo, se observaron efectos diferenciales sobre la IL (Experimento 3) y su especificidad contextual (Experimento 4) cuando se aplicaron durante la fase de prueba. Con relación a los experimentos 1 y 2 podríamos considerar que el fenómeno de incremento de la IL por las claves de seguridad del contexto de prueba parece ser un fenómeno elusivo que puede ser dependiente de variables que normalmente no afectan a otros fenómenos relacionados con la especificidad contextual de la IL. Concretamente nuestros resultados apuntan a que variables como las claves de inyección que normalmente no afectan de forma significativa al efecto de IL pudieron ensombrecer el efecto facilitador del contexto de seguridad sobre el aprendizaje de preexposición. Esta interferencia no ocurrió, en los Experimentos 3 y 4 en los que utilizamos un procedimiento de cambio contextual que tradicionalmente arroja resultados robustos con relación a esta temática de investigación. En relación a los experimentos 3 y 4, la aplicación de sulpiride, un 125 Conclusiones El presente trabajó analizó la implicación de los receptores D1 y D2 en la expresión de IL. Las principales conclusiones que podemos extraer son las siguientes: 1. Los receptores D1 y D2 juegan un papel central en los procesos de recuperación. 2. El bloqueo de la actividad de los receptores D2 durante la fase de prueba (recuperación) provoca una liberación de la IL. Esto implica que su actividad estaría relacionada con la expresión de la asociación EC-EI. 3. El bloqueo de los receptores D1 genera el efecto inverso, indicando que su actividad parece más relacionada con la expresión de la asociación EC ausencia de consecuencias que se aprende durante la fase de preexposición al futuro EC. 4. Esta relación inversa entre la actividad de los receptores D1 y D2 apoyaría la propuesta de fallo en la recuperación de la IL, dado que su papel diferencial durante la expresión de la IL otorga una función específica. 5. El fallo en la recuperación indica que la IL es la expresión de un proceso de interferencia que se genera entre dos asociaciones de un mismo Conclusiones 126 EC. 6. esta propuesta se apoya en los experimentos realizados, donde el bloqueo de los receptores D1 y D2 no afectaron a la expresión de IL cuando son inactivados durante la fase de preexposición y condicionamiento. 7. Los cambios de contextos indican que además la compleja relación de los receptores D1 con la recuperación. Su bloqueo reduce la influencia del contexto y facilita las conductas dirigidas a metas. Este hecho se aprecia tras observar en el experimento 4 que los cambios de contextos reducen la extinción de la asociación EC-EI. 8. El bloqueo de los receptores D2 durante la fase de recuperación reduce la actividad dirigida a meta. Esto facilita que se recupere la relación EC ausencia de consecuencias y no EC-EI, siendo independiente del contexto. Bibliografía 129 Bibliografía Abi-Dargham, A., Laruelle, M., Aghajanian, G. K., Charney, D. y Krystal, J. (1997). The role of serotonin in the pathophysiology and treatment of schizophrenia. The Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences, 9, 1-17. Ackil, J., Mellgren, R. L., Halgren, C. y Frommer, S. P. (1969). Effects of CS pre-exposure on avoidance learning in rats with hippocampal lesions. 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