Implicaciones del microbioma del líquido amniótico en el desarrollo de enfermedades

TRABAJO FIN DE GRADO IMPLICACIONES DEL MICROBIOMA DEL LÍQUIDO AMNIÓTICO EN EL DESARROLLO DE ENFERMEDADES CURSO 2019-2020 FACULTAD DE FARMACIA MARÍA DEL ÁGUILA GÓMEZ UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO GRADO EN FARMACIA IMPLICACIONES DEL MICROBIOMA DEL LÍQUIDO AMNIÓTICO EN EL DESARROLLO DE ENFERMEDADES AUTORA: MARÍA DEL ÁGUILA GÓMEZ TUTORAS: MARÍA DE LOURDES MORENO AMADOR Y ENCARNACIÓN MELLADO DURÁN TIPOLOGÍA: TRABAJO BIBLIOGRÁFICO DEPARTAMENTO: MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA Lugar y fecha de presentación: Sevilla, 15 de JUNIO 2020 ÍNDICE 1. RESUMEN ................................................................................................. 1 2. INTRODUCCIÓN ...................................................................................... 2 2.1. Historia y definición de líquido amniótico .......................................... 2 2.2. Formación del líquido amniótico ......................................................... 2 2.3. Regulación del líquido amniótico ........................................................ 4 2.4. Composición del líquido amniótico ..................................................... 6 2.5. Concepto de microbiota y microbioma ............................................... 7 2.6. Microorganismos en el líquido amniótico ........................................... 8 3. OBJETIVOS ............................................................................................. 12 4. METODOLOGÍA ..................................................................................... 12 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................... 12 5.1. Microorganismos, antígenos y sistema inmune ................................. 13 5.2. Microorganismos y protección frente a infecciones .......................... 15 5.3. Microorganismos y complicaciones .................................................. 17 5.3.1. Invasión microbiana de la cavidad amniótica (MIAC) ........... 17 5.3.2. Preeclampsia ............................................................................ 20 5.3.3. Infección e inflamación intraamniótica ................................... 23 5.3.4. Corioamnionitis ....................................................................... 28 5.3.5. Ruptura prematura de membranas (PROM) ............................ 30 6. CONCLUSIONES .................................................................................... 32 7. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................... 33 ÍNDICE FIGURAS Figura 1. Relación del volumen de líquido amniótico y el periodo de gestación..........3 Figura 2. Circulación del líquido amniótico...................................................................4 Figura 3. Inmunohistoquímica del amnios para acuaporinas tipo 1...............................6 Figura 4. Hipótesis sobre la adquisición de la microbiota humana..............................10 Figura 5. Vista esquemática de la interfase uterina-placentaria...................................14 Figura 6. Distribución de filos bacterianos en muestras de líquido amniótico de parto prematuro con membranas intactas y en casos de PROM............................18 Figura 7. Géneros bacterianos prevalentes en el líquido amniótico usando la técnica PCR...............................................................................................................19 Figura 8. Implicación de los microorganismos en la patología de la preeclampsia.....21 Figura 9. Papel de las comunidades bacterianas en la preeclampsia...........................22 Figura 10. Comparativa de hallazgos de microorganismos en líquido amniótico utilizando técnicas cultivo-dependientes y PCR...........................................24 Figura 11. Diversidad microbiana del líquido amniótico..............................................24 Figura 12. Fases de la infección intraamniótica ascendente.........................................25 Figura 13. Coincidencia de microbiota en el líquido amniótico y la vagina................26 Figura 14. Hipótesis de flujo de la microbiota del líquido amniótico y parto prematuro.....................................................................................................28 ÍNDICE TABLAS Tabla 1. Diversidad bacteriana del líquido amniótico con estudios cultivosdependientes y métodos moleculares.............................................................9 Tabla 2. Invasión microbiana de la cavidad amniótica y pruebas de detección.........17 Tabla 3. Principales microorganismos aislados de líquido amniótico en pacientes con ruptura prematura de membranas o parto prematuro....................................31 1 1. RESUMEN En los últimos años, los avances en el conocimiento del microbioma humano han supuesto una revolucionaria respuesta a algunas preguntas sin contestar, referidas al desarrollo y padecimiento de determinadas enfermedades. La teoría de que el feto se desarolla en un ambiente estéril ha sido refutada por estudios recientes, utilizando técnicas dependientes de cultivo y técnicas moleculares, tanto en placenta como en líquido amniótico (LA) y cordón umbilical. Por tanto, el microbioma del LA puede suponer complicaciones en el devenir de la gestación, o por el contrario, participar en la protección del feto. Aunque el mecanismo exacto de transferencia de microorganismos es aún desconocido, se piensa que puede estar relacionado con el aumento de la permeabilidad de la mucosa materna, lo que permite un mayor paso de microorganismos desde el lumen a la sangre para después llegar a la placenta. De forma natural encontramos en el LA sustancias que protegen al feto como son las inmunoglobulinas, la lisozima o la transferrina. Sin embargo, pueden no ser suficientes si se produce una invasión microbiana de la cavidad amniótica por microorganismos con factores de virulencia y capacidad de evasión de las respuestas del sistema inmune, como ocurre con las especies del género Ureaplasma, provocando infecciones o ruptura prematura de membranas, entre otras complicaciones. Por otra parte, la presencia de microbiota en el ambiente uterino favorece la activación del sistema inmune en el feto y gracias a esta exposición al inicio de la vida, podría haber una menor incidencia de enfermedades a lo largo de la misma. Este trabajo bibliográfico comprende una revisión actualizada de los últimos hallazgos del microbioma del LA en relación con el desarrollo de enfermedades y sus implicaciones en el desarrollo de la gestación. Palabras clave: microbioma, líquido amniótico, sistema inmune, infecciones e inflamación intraamniótica. 2 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Historia y definición de líquido amniótico A lo largo de la historia, el líquido amniótico (LA) ha sido objeto de distintas concepciones sobre cuál era su función. Así, Hipócrates pensaba que era meramente orina fetal. Sin embargo, primero ha sido concebido como una masa líquida con función mecánica y más tarde se pensó que podía ser un resquicio de la vida acuática cuya función era proteger la osmolaridad interior del exterior (Botella y Clavero, 1993). Estos antecedentes han permitido concebir actualmente el LA como una masa líquida que rodea al feto después de las primeras semanas de gestación, siendo no solo responsable de la protección frente a traumatismos del feto y del cordón, sino también responsable de la nutrición del feto, la regulación metabólica, la “amortiguación” de las contracciones uterinas, promueve el desarrollo del sistema músculo esquelético fetal, del sistema gastrointestinal y maduración pulmonar. Además, una función muy importante, es la actividad antibacteriana que posee y que va a regular el desarrollo posterior de enfermedades (Morgan-Ortiz et al., 2015). El LA constituye un elemento muy importante para analizar (por punción) el desarrollo intrauterino del feto ya que sus principales componentes están aportados por la madre y el feto (Botella y Clavero, 1993). Además del LA, al principio del embarazo también hay otra cavidad que contiene líquido celómico, extraembrionario, que se terminará fusionando con el LA sobre las semanas 12-14 del embarazo y cuya composición es parecida a la del plasma materno (Botella y Clavero, 1993). 2.2. Formación del líquido amniótico El LA se forma inicialmente por las células amniógenas procedentes de la cavidad amniótica, unos 12 días después de la fecundación y, aunque aporta una pequeña parte de éste, la mayor parte de su producción deriva del líquido intersticial materno por difusión a través de la membrana amniocoriónica de la decidua parietal (González-Merlo y González, 2018). A medida que se incrementan las semanas de gestación, el embrión comienza a orinar en la cavidad y a tragar fluido, siendo a partir de este momento la orina el principal componente del LA junto con el líquido de los pulmones, ya que la cornificación de la piel fetal impide la difusión del LA. Cuando se produce la fecundación 3 y aún no se ha formado del todo el embrión, se empieza a formar tanto el LA como el celómico, con lo cual podemos concluir que el embrión no puede ser la fuente primaria de líquidos en el embarazo temprano (Morgan-Ortiz et al., 2015). A partir del momento en el que la orina empieza a constituir una parte principal del LA, se genera un gran cambio en el volumen de éste, haciendo que a partir de entonces el volumen del LA no sea proporcional a la edad gestacional, tal y como se muestra en la Figura 1, donde hay gran concordancia al principio del embarazo y gran dispersión al final (Botella y Clavero, 1993). Figura 1. Relación del volumen de líquido amniótico y el periodo de gestación (Fuchs, 1966). Podemos concluir que las aportaciones de cada fluido al LA son las siguientes (Morgan-Ortiz et al., 2015): - Orina fetal: 800 a 1200 ml/día - Secreción de líquido pulmonar fetal: 170 ml/día - Deglución fetal: 500 a 1000 ml/día - Flujo transmembrana: 200 a 400 ml/día - Secreciones orales-nasales: 25 ml/día - Flujo transmembranoso: 10 ml/día Cabe resaltar la idea de que el volumen del LA es aproximadamente constante ya que hay un equilibrio entre la formación y la eliminación, resultado por una parte de la reabsorción de líquidos (deglución y flujo a través de membranas amniótica y/o corial) y, por otra parte, por la producción de fluidos fetales (pulmones y orina), haciendo a su vez que la regeneración del LA se produzca en un tiempo pequeño, renovándose completamente cada dos o tres horas (Morgan-Ortiz et al., 2015). 4 En este sentido, tanto las membranas ovulares como el cordón umbilical, desempeñan el papel más importante en la circulación y el equilibrio del LA, tanto en lo que se refiere al volumen como en su composición, manteniendo un equilibrio constante entre los compartimentos fetales y maternos (González-Merlo y González, 2018). Por ello, es importante conocer todos los procesos que se dan a lo largo de la gestación que están relacionados con la absorción y producción para entender si se dan alteraciones que puedan dar lugar a un aumento de su volumen (polihidramnios) o, por el contrario, una disminución del volumen (oligoamnios). En este sentido, el estado fetal se refleja en el volumen de LA que es un reflector pasivo de la condición fetal (Morgan-Ortiz et al., 2015). 2.3. Regulación del líquido amniótico Durante el embarazo, la cantidad y la calidad normal del LA es crítico para el crecimiento y desarrollo fetal, por ello ahora se plantea cómo se produce este aspecto fundamental en el embarazo (Luo et al., 2018). La homeostasis del LA, se mantiene gracias al balance entre la afluencia de la orina fetal y el líquido pulmonar, y la salida por la deglución fetal y la absorción a través de las membranas corioamnióticas, conocida como vía intramembranosa y la circulación placentaria, mostrada en la Figura 2. Dicha vía intramembranosa (a través de la membrana amniótica), se ha reconocido por ser crítica en la reabsorción de LA y participar de forma importante en la homeostasis de su volumen (Wang et al., 2001). Figura 2. Circulación del líquido amniótico (Underwood et al., 2005). 11 Adenovirus,Virus del Herpes simplex, Enterovirus, Virus del Epstein Barr, Virus respiratorio sincitial, el Parvovirus B19. Sin embargo, son necesarios más estudios que nos permitan determinar con exactitud si los virus están presentes en el LA (Lim et al., 2018). En otras investigaciones, se ha planteado también el uso de pruebas de detección molecular como la técnica FISH (hibridación fluorescente in situ dirigida al ARNr 16S), la cual ha permitido la visualización de bacterias en las membranas fetales, y el estudio de sus posibles implicaciones (Steel et al., 2005). Sin embargo, se ha determinado que la presencia de bacterias podrían no ser suficientes unicamente para inicar un parto prematuro o una respuesta inflamatoria sistémica, ya que también se tienen que tener en cuenta otros factores como la naturaleza de los organismos y los tejidos implicados (Steel et al., 2005). Otro aspecto a considerar sobre el ambiente en el que se desarrolla el feto es la microbiota de la placenta, cuya presencia es muy probable, incluso en un embarazo de desarrollo normal. Estos microorganismos, pueden también constituir un mecanismo de defensa frente a aquellos que intenten penetrar en el LA (Lim et at., 2018). En el caso de muestras de la placenta, se pueden recuperar microorganismos mediante técnicas de cultivo, confirmando la presencia de éstos (Zhu et al., 2018). Además, se ha comprobado con técnicas de estudio de ADN que los microorganismos que podemos encontrar en la placenta guardan un estrecho parecido con los de la microbiota de la cavidad oral, más que con los que podemos encontrar en la vagina, piel y/o comunidades del intestino (Borghi et al., 2019) y, aunque pueda resultar un poco desconcertante, la verdad es que hay una explicación para ello. De entre los microorganismos comensales no patógenos encontrados, destacamos Fusobacterium nucleatum y su capacidad de alterar la integridad y permeabilidad del endotelio vascular, consiguiendo de este modo, a través de la vía hematógena, llegar hasta la placenta, para ello dispone de una adhesina llamada FadA y todo ello facilitando también que bacterias como Escherichia coli lleguen a la placenta, siendo la más abundante en la mayoría de los individuos (Wassenaar and Panigrahi, 2014). Esta microbiota de la placenta, puede estar relacionada con partos prematuros o con infección prenatal. 12 3. OBJETIVOS Este Trabajo Fin de Grado tiene como objetivo analizar la microbiota del líquido amniótico y cómo puede relacionarse ésta con el desarrollo de enfermedades. Esto se ha llevado a cabo mediante una serie de objetivos específicos: - Conocer el origen, la formación y el desarrollo de los microorganismos que componen la microbiota del líquido amniótico. - Revisar los últimos avances y proyectos que se están llevando a cabo sobre el microbioma del líquido amniótico. - Dilucidar qué beneficios y perjuicios reporta el microbioma en el feto y posterior desarrollo. - Correlacionar la presencia/ausencia de estos microorganismos con el desarrollo de ciertas enfermedades. 4. METODOLOGÍA Este Trabajo Fin de Grado es una Revisión Bibliográfica y, para su realización, se han realizado consultas en diferentes artículos de revistas científicas obtenidas a través de: Pubmed, ISI web of Knowledge, Public Library of Science (PLOS), Medline, Science direct, IntraMed. También se han consultado libros de texto de Microbiología, así como páginas web. Las palabras clave para la búsqueda han sido: amniotic fluid, amniotic fluid formation, amniotic fluid regulation, amniotic fluid composition, microbiota, microbiome, microorganisms in amniotic fluid, amniotic fluid immunity, antimicrobial factors in amniotic fluid, microbial invasion of the amniotic cavity, preeclampsia, bacteriological analysis of amniotic fluid, chorioamnionitis, PROM, intra-amniotic infection, intra-amniotic inflammation. Los criterios de selección o filtros utilizados fueron: review, free full text, 10 years, clinical trial. Sin embargo, dada la escasez de información científica relacionada con el LA, en algunas ocasiones hemos recurrido a artículos menos recientes. 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Gracias a las aportaciones de distintos estudios se ha podido caracterizar la microbiota del LA y analizar sus repercusiones desde el punto de vista de la salud y 13 protección y complicaciones. A continuación se tratarán algunas cuestiones planteadas relativas a las implicaciones que tiene el microbioma en el sistema inmune y la defensa frente a los patógenos o las complicaciones se pueden derivar de la invasión microbiana de la cavidad amniótica, entre otras. 5.1. Microorganismos, antígenos y sistema inmune Durante el embarazo, se dan un conjunto de cambios fisiológicos, hormonales, inmunológicos y microbiológicos. Centrándonos en los microbiológicos, esto puede suponer unas consecuencias negativas, como el desarrollo de infecciones o, por el contrario, se puede traducir en un efecto protector. Aun así, hay evidencias clínicas y epidemiológicas que sugieren que, frente a estas consecuencias negativas como infecciones, las mujeres durante el embarazo tienen mayor susceptibilidad de sufrirlas, debido a los cambios inmunológicos (Fuhler, 2020). Es conocido que la unidad materno-fetal está colonizada por microorganismos y esto es un requisito tanto para la preparación del sistema inmune como para la “maduración” metabólica y homeostasis hormonal (Staude et al., 2018), ya que los microorganismos pueden exponer al feto a distintos antígenos que “preparan” al sistema inmune y participan en su completo desarrollo (Borghi et al., 2019). Cambios en el microbioma dan lugar a infecciones complicadas cuyo diagnóstico es fundamental ya que el feto está expuesto a la microbiota de la cavidad amniótica y experimenta una adaptación inmunológica, conocido como “Inmunotolerancia o Inmunoparálisis”. Este hecho consiste en que la exposición prolongada a la microbiota suprime la respuesta inmune fisiológica necesaria y esto no garantiza el adecuado aumento de los clásicos marcadores de la inflamación, dificultando así su diagnóstico (Staude et al., 2018). De las partes del cuerpo que podrían funcionar como fuente de estimulación del sistema inmune microbiano, está el intestino, cuyo correcto establecimiento de diversas comunidades microbianas, resulta en una apropiada estimulación y preparación del sistema inmune innato y adaptativo (Ximenez y Torres, 2017; Walker et al., 2017). Es en el intestino donde la inmunidad innata, que es la que primeramente reconoce a los microorganismos, está más desarrollada, ya que una variedad de células epiteliales e inmunes codifican receptores moleculares para ligandos de origen microbiano como polisacáridos o lipopolisacáridos (Francino, 2014). Esta microbiota del intestino se 14 desarrolla en la etapa prenatal en el útero tal y como se muestra en estudios del meconio (Walker et al., 2017) con una estrecha relación al propio desarrollo del sistema inmune. Y es ahí donde se desarrolla su microbiota, en el útero, en presencia del LA, ya que éste tiene un papel significativo dentro del sistema inmune innato al albergar alguno de sus componentes (Underwood et al., 2005). Alcanzar un equilibrio adecuado en el proceso de la colonización del intestino es el primer requisito para la modulación del sistema inmune y la inducción de la tolerancia inmunológica. Algún fallo en este proceso, como una exposición reducida a los microorganismos, resulta en una colonización del intestino alterada, que da lugar a desajustes en el balance inmune y enfermedades (Francino, 2014). Además, la placenta expresa antígenos fetales, que junto con las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en las cuales son presentados, pueden no ser reconocidos por el sistema inmune de la madre; esto significa que la inmunidad materna puede dañar el propio desarrollo del feto (Fuhler, 2020), por ejemplo, el feto podría ser rechazado, algo que no ocurre; esto se conoce como “Paradoja inmunológica del embarazo” (Solano, 2019). Este hecho, fue reconocido hace años por Sir Peter Medawar (1977), el cual atribuyó dicha “Paradoja” a que la placenta supone una barrera que limita el contacto entre los compartimentos maternales y fetales, así se muestra en la Figura 5 (Solano, 2019). Hoy en día se conoce que más que una supresión inmune lo que se da es un equilibrio o “sintonía” de las respuestas inmunes en la gestación para proteger al feto de las respuestas aloinmunes (Solano, 2019). Figura 5. Vista esquemática de la interfase uterina-placentaria (Solano, 2019). 15 Teniendo en cuenta todos estos aspectos, podemos afirmar que la exposición a los microorganismos en el LA contribuyen al inicio de una maduración inmune en el útero y que posteriormente, en el periodo postparto y durante los primeros años de vida, tiene lugar las etapas esenciales para terminar el desarrollo del mismo sistema inmune (Leshem et al., 2020) además, es importante un adecuado equilibrio entre los antígenos fetales y los agentes infecciosos (Fuhler, 2020). 5.2. Microorganismos y protección frente a infecciones Ya desde el año 1975, Larsen y Schlievert trabajaron en la idea de que en el LA existían sustancias que inhibían el crecimiento de los microorganismos. Durante años de estudio se ha confirmado la capacidad antibacteriana del LA, que llega a su punto máximo entre la semana 36-40 de la gestación. Esta protección del feto frente a los patógenos, es gracias al efecto combinado de ciertos factores antibacterianos encontrados en el LA como lisozimas, peroxidasas, transferrina, lactoferrina, cistatina C, complejos de proteína-zinc, etc (Ahn et al., 2004; Mao et al., 2019). Dentro de la matriz compleja que forma el LA, compuesta por una fracción insoluble (elementos celulares, lanugo, vérnix…) y otra soluble (carbohidratos, proteínas, lípidos, electrolitos…), Mao et al. (2019) llegaron a la conclusión de que es en la fracción soluble donde se encuentra esta protección al llevar a cabo una aproximación donde se eliminaba la fracción insoluble y en la soluble, permanecían componentes y vesículas extracelulares que se ha demostrado que activan mecanismos endógenos, facilitando la respuesta inmune, la regeneración y recuperación de tejidos. De entre los compuestos solubles, destacamos tres de las proteínas encontradas: la lactoferrina, cistatina C y lisozima. La cistatina C y la lactoferrina, fueron las proteínas antibacterianas más expresadas, y de ellas, la cistatina C es una de las cinco más abundante de las trescientas que fueron identificadas y cuantificadas. La transferrina, por ser también un inhibidor bacteriano al desplazar el hierro del LA (Ahn et al., 2004). ▪ La cistatina C es una proteína inhibidora que está presente en la mayoría de los tejidos y fluidos corporales, con una importante función moduladora de la respuesta inflamatoria, al regular la acción de los neutrófilos (Mao et al., 2019). ▪ Por su parte la lactoferrina, proteína más abundante del suero de la leche humana, inhibe a los patógenos gracias a su capacidad para la unión del hierro, elemento traza necesario para la supervivencia y proliferación de los microorganismos ya que 16 constituye el cofactor de la mayoría de las enzimas; presente en el LA y con elevada afinidad por el hierro, no quedando disponible para el uso de las bacterias (Ahn et al., 2004; Underwood et al., 2005; Mao et al., 2019). Frente a estas proteínas, las bacterias han desarrollado sistemas de captación de hierro, considerados como determinantes de virulencia ya que permite su supervivencia en el LA bajo condiciones restrictivas como la baja disponibilidad de hierro. Por lo tanto, si las bacterias pueden crecer o no en el LA, dependerá de la expresión de dichos sistemas de captación, altamente expresados como en el caso de Staphylococccus aureus (Ahn et al., 2004). Otra proteína importante es la β2-microglobulina, componente del MHC de clase I. Contribuye a la defensa cuando las células amnióticas están expuestas a los patógenos y su importante actividad antibacteriana ha sido estudiada frente a la inhibición del crecimiento de microorganismos como Listeria monocytogenes y Escherichia coli (Kim et al., 2012). Además, otro aspecto importante de esta actividad bactericida del LA depende de la relación fosfato-zinc (Acosta y Duva, 1981). Hay una relación indirecta entre el ion fosfato del LA y la cantidad de zinc, de manera que la actividad antibiótica es mayor cuando disminuye el fosfato, lo cual ocurre al término de la gestación (Botella y Clavero, 1993). Acosta y Duva (1981) llegaron a la conclusión de que la relación de fosfato-zinc predice la capacidad inhibidora del LA, indicando los siguientes valores: - relación<100: efecto bactericida - relación 110-200: efecto bacteriostático - relación >200: ninguna actividad antibacteriana Esta relación de fosfato-zinc, por consiguiente, determina el riesgo del feto frente a una infección bacteriana (Acosta y Duva, 1981). En resumen, son los péptidos y las proteínas antimicrobianas las que constituyen la primera línea de defensa frente a las bacterias, virus y hongos; su importancia y el papel de la microbiota intestinal en la secreción y la regulación en las infecciones, ha sido ampliamente demostrada (Kim et al., 2012; Leshem et al., 2020). 17 5.3. Microorganismos y complicaciones 5.3.1. Invasión microbiana de la cavidad amniótica (MIAC) En primer lugar, tal y como introducimos anteriormente, la MIAC (invasión microbiana de la cavidad amniótica) es considerado el principal agente etiológico de parto prematuro y la principal causa de mortalidad neonatal en el mundo (DiGiulio, 2012). Se trata de un estado subclínico de infección relacionado como hemos mencionado con la etiopatología del parto prematuro, pero principalmente a edades gestacionales tempranas (Cobo et al., 2017). Para establecer los principales microorganismos que pueden llegar a producir las MIAC, se han utilizado diferentes aproximaciones experimentales, entre los que destacamos primeramente el uso de diferentes medios de cultivo, que aunque dan una aproximación bastante buena, debemos tener en cuenta que la mayoría de los microorganismos no son cultivables y debido al sesgo sistemático, se deduce que la especie recuperada más frecuentemente en los cultivos pueden no ser numéricamente dominante o de importancia clínica relevante entre los todos los miembros presentes en la muestra (DiGiulio, 2012). Utilizando diferentes medios de cultivo, se ha detectado que las bacterias que causan frecuentemente las MIAC son: Ureaplasma spp., Mycoplasma spp., Fusobacterium spp. pero también Streptococcus spp. y Bacteroides spp. (DiGiulio, 2012; Cobo et al., 2017). Por ello, se empezó a utilizar una aproximación molecular mediante el uso de la PCR que permitía la detección de microorganismos sin la necesidad de aislarlos. En esta línea se prestó especial énfasis a las especies de los géneros Ureaplasma y Mycoplasma como los microorganismos más frecuentes en invadir la cavidad amniótica y producir MIAC (DiGiulio, 2012). Tanto la utilización de los medios de cultivo como el uso de la PCR son técnicas complementarias en la detección de las MIAC y ninguna de ellas de forma individual, puede ser de confianza para excluir su diagnóstico (Combs et al., 2014). Un ejemplo de ellos se expone en la Tabla 2. Tabla 2. Invasión microbiana de la cavidad amniótica y pruebas de detección (Combs et al., 2014). 18 En este caso, las pruebas de la PCR resultaron negativas, los cultivos positivos y con bajos niveles de IL-6 y aun así, se han clasificado como casos de colonización por Ureaplasma urealyticum, siendo un microorganismo común de la microbiota del tracto genital, no implicando que Ureaplasma sea siempre benigno (Combs et al., 2014). La Figura 6 muestra la distribución taxonómica de las bacterias asociadas con MIAC en tres estudios basados en 212 individuos de parto prematuro (Figura 6A), y 267 de tres estudios de rotura prematura de membranas (PROM) (Figura 6B) (DiGiulio, 2012). Figura 6. Distribución de filos bacterianos en muestras de LA de parto prematuro con membranas intactas y en casos de PROM (DiGiulio, 2012). En la Figura 7 relativa al estudio de DiGiulio (2012) podemos comprobar los cuatro phylum predominantes que son Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria y Proteobacteria. A éstos, también añadimos Fusobacteria que marca la diferencia con respecto a otras localizaciones del cuerpo. También se observa una elevada prevalencia de los géneros Sneathia y Leptotrichia que no se esperaba, debido a la ausencia en los ensyaos cultivo-dependientes realizados. De hecho, ahora parece que el género Sneathia es tan prevalente como Mycoplasma, género que ha sido considerado como el invasor más frecuente de la cavidad amniótica (DiGiulio, 2012). Por otro lado, sorprende también la poca prevalencia del género Lactobacillus en el LA presumiendo su elevada cantidad en la vagina (DiGiulio, 2012). 19 Figura 7. Géneros bacterianos prevalentes en el LA usando la técnica PCR. (A) Muestras obtenidas de mujeres con parto prematuro. (B) Muestras obtenidas de mujeres con prematuro PROM (DiGiulio, 2012). Con respecto al significado clínico de los distintos microorganismos encontrados utilizando la metodología de PCR en el LA, resaltamos que, aunque la PCR nos permite estudiar microorganismos que no se pueden cultivar, hay razones que nos plantean si la detección de éstos con este método tiene relevancia clínica. Las dos razones son las siguientes: - La PCR es capaz de detectar microorganismos no viables. - La elevada sensibilidad de la PCR, la hace susceptible de cometer falsos positivos. La mayoría de las bacterias que causan MIAC, tienen un origen endógeno, es decir la microbiota humana (Cobo et al., 2017); así, estos microorganismos que invaden la cavidad amniótica pueden llegar por cuatro rutas posibles, siendo las dos primeras las más importantes (DiGiulio, 2012; Kim et al., 2015): - Migración ascendente desde la vagina y el cérvix - Diseminación hematógena seguido de invasión transplacentaria - Siembra retrógrada de la cavidad peritoneal vía Trompas de Falopio - Introducción accidental en el momento de la amniocentesis u otro proceso invasivo En relación con las fuentes anatómicas de estos microorganismos, en primer lugar Lactobacillus acidophilus de la vagina constituye la principal fuente de microorganismos que producen MIAC. Su disminución y el aumento de las bacterias anaerobias y facultativas derivan en una vaginosis bacteriana, que podría aumentar el riesgo de 20 embarazo prematuro. Con respecto a la orofaringe, también se considera una fuente de microorganismos que causan MIAC, entre ellos Fusobacterium o Streptococcus. Y por último, en el intestino, Faecalibacterium spp. y Coprobacillus spp. pueden también llegar a producir este tipo de complicación (DiGiulio, 2012). La patogénesis de las MIAC estará influenciada por algunos factores como la respuesta materna y fetal, la capacidad de adhesión, de formación de biofilms o la colonización vaginal (DiGiulio, 2012). Además de bacterias, también se han descrito algunos parásitos, virus y protozoos (Toxoplasma y Trypanosoma) como posibles responsables de producir MIAC (Ahmadian et al., 2020). Un conocimiento sobre la diversidad de los microorganismos que causan MIAC, será importante para el desarrollo de la prevención, diagnóstico y tratamiento (DiGiulio, 2012) ya que esta colonización puede dar lugar a otras afecciones como infección, inflamación intraamniótica, corioamnionitis, de forma que alguno de los microorganismos mencionados en este apartado tendrán relevancia o protagonismo en algunas de las patologías derivadas de la colonización. 5.3.2. Preeclampsia Además de las MIAC, otra de las principales causas de morbilidad y mortalidad en madres y niños es la preeclampsia (PE) (Ahmadian et al., 2020). Es una de las complicaciones más serias en obstetricia debida a su rápido desarrollo, de etiología no clara y exclusiva de embarazos en humanos (Moura et al., 2012). Dicha complicación se manifiesta con hipertensión y proteinuria, después de veinte semanas de gestación, que puede incluso llegar a producir daño en algunos órganos como el hígado y los riñones principalmente (Dunn et al., 2019; Ahmadian et al., 2020). Es conocido que existen microorganismos en la cavidad uterina, bucal, la vagina y en la placenta de mujeres embarazadas, y que cualquier alteración en ello, podría estar relacionado con la patogénesis de la PE (Ahmadian et al., 2020); de hecho, se ha demostrado que mujeres con bacteriuria asintomática, infección del tracto urinario, enfermedad periodontal y pielonefritis crónica, están sujetas a un mayor riesgo de sufrir PE (Moura et al., 2012; Dunn et al., 2019). Sin embargo, el mecanismo principal que modifica la microbiota no se conoce con certeza. La PE se caracteriza por función vascular deteriorada y activación de la inflamación sistémica materna en varios órganos, que puede verse agravada por muchos factores como la infección (Dunn et al., 2019). En este sentido, se han hecho estudios que confirman la influencia de la infección bacteriana 27 (Staude et al., 2018). No obstante, hay mujeres que desarrollan infecciones intraamnióticas y otras que no. Esto se puede explicar porque hay que tener en cuenta distintos aspectos (Romero et al., 2019): - Durante el embarazo, el cérvix uterino produce moco con propiedades antimicrobianas; la pérdida de este moco puede dar lugar a una infección intraamniótica. - Las membranas corioamnióticas representan una barrera física y bioquímica frente a los microorganismos; pacientes con PROM, tienen más posibilidades de sufrir este tipo de infecciones. - El LA cuenta con factores antimicrobianos que podrían controlar la infección; además de células del sistema inmune. - Las mujeres con disbiosis en los microorganismos de su tracto genital, pueden tener predisposición a la infección. - Y por último, también intervienen factores de virulencia, que explica la razón por la que algunos microorganismos alcanzan la cavidad amniótica y otros no. Estos factores de virulencia han sido detectados por ejemplo en Ureaplasma spp. y Mycoplasma spp. Además de los microorganismos de la vagina, podemos encontrarnos en el LA otros microorganismos procedentes de otras fuentes como la cavidad oral y el tracto gastrointestinal, que acompañado de alteraciones microbianas y causas metabólicas, contribuyen al parto prematuro, así se muestra en la Figura 14 (Staude et al., 2018). 28 Figura 14. Hipótesis de flujo de la microbiota del LA y parto prematuro. El microbioma de la cavidad amniótica se ha pensado siempre que proviene del microbioma cervical y vaginal. Sin embargo, la microbiota de la cavidad oral, intestino e incluso la placenta supone una importante contribución al microbioma de la cavidad amniótica principalmente vía hematógena (Staude et al., 2018). En resumen, en la mayoría de las mujeres, los microorganismos que causan las infecciones intraamnióticas forman parte de la microbiota vaginal, apoyado por la hipótesis de que la infección ascendente es la ruta más común de invasión microbiológica de la cavidad amniótica, con el desenlace de un parto prematuro espontáneo y membranas intactas en la mayoría de los casos (DiGiulio et al., 2008; Romero et al., 2019). 5.3.4. Corioamnionitis La corioamnionitis es una causa común de parto prematuro cuando la infección bacteriana está presente, ya que se produce la liberación de endotoxinas y exotoxinas, se estimula la liberación de citoquinas desde las membranas deciduales y fetales, induciendo las contracciones uterinas y/o la ruptura de las membranas (Peng et al., 2018). Podemos diferenciar dos tipos de corioamnionitis: la corioamnionitis subclínica/histológica que hace referencia a lesiones inflamatorias agudas de alguna de las tres estructuras que forman la placenta con importancia clínica significativa, pero no necesariamente es evidencia de una infección intraamniótica (Kim et al., 2015). Es más común que la corioamnionitis clínica y es asintomática (Peng et al., 2018). La corioamnionitis clínica 29 está caracterizada por fiebre en la madre, sensibilidad uterina, leucocitosis, taquicardia maternal y/o fetal, ruptura prematura de membrana, etc. (Sweeney et al., 2016; Peng et al., 2018). Hay que aclarar que la funisitis en cambio, hace referencia al proceso inflamatorio que se da en el cordón umbilical (Kim et al., 2015). El estudio histológico de la placenta es considerado la mejor forma de diagnóstico de la corioamnionitis (Sweeney et al., 2016). En un principio, se había considerado que estas lesiones inflamatorias eran el reflejo de la presencia de una infección en el LA, sin embargo, recientemente se ha mostrado que una inflamación “estéril”, es más frecuente que una infección intraamniótica en pacientes con parto prematuro con membranas intactas o con rotura de membranas. Por lo tanto, la idea de que la corioamnionitis aguda pueda estar presente sin infección intraamniótica está ganando peso (Kim et al., 2015). Existen algunas explicaciones a este hecho: - La inflamación de las membranas corioamnióticas es un mecanismo no específico de la defensa del hospedador - La infección extraamniótica, es muy poco común - Pueden existir microorganismos no viables que pueden producir inflamación placentaria a través de la producción de factores quimiotácticos No obstante, de forma general este síndrome está asociado con la infección intraamniótica en al menos el 60% de los casos y es el mayor factor de riesgo de la sepsis neonatal (Romero et al., 2016). De hecho, normalmente la corioamnionitis se desarrolla en paralelo con la infección microbiana del corioamnios y el LA (Sweeney et al., 2016). Esta infección da lugar a la inflamación del corioamnnios que es la manifestación de la respuesta inmune maternal y fetal. Frecuentemente es la corioamnionitis histológica la que está más asociada con la infección intrauterina bacteriana, y puede coexistir con la funisitis (Peng et al., 2018). Se han reconocido como posibles agentes causales de la corioamnionitis un conjunto de microorganismos, incluyendo bacterias, virus y menos frecuentemente los hongos. De ellos, los microorganismos a destacar son diferentes especies bacterianas del género Ureaplasma (U. parvum y U. urealyticum), Fusobacterium spp., Streptococcus spp. y en menor medida Gardnerella spp., Mycoplasma spp. y Bacteroides spp. (Sweeney et al., 2016). Dentro de éstos, Ureaplasma spp. es el microorganismo más común en el LA y la placenta de mujeres con corioamnionitis y funisitis (Romero et al., 2016; Sweeney et al., 2016). De hecho, se ha propuesto que la presencia de Ureaplasma spp. en el tracto genital 30 bajo podría ser un factor de riesgo de la corioamnionitis; aun así se detectan mujeres infectadas con este microorganismo que sufren corioamnionitis y otras que no, cuya posible explicación podría ser la capacidad de algunas especies de este microorganismo de evadir el sistema inmune. En este aspecto, podría intervenir factores de virulencia de Ureaplasma spp. como lo son los antígenos de banda múltiples (MBA), las fosfolipasas A y C, la proteasa IgA y el gen de la ureasa (Sweeney et al., 2016). En la práctica clínica, el término corioamnionitis, ha sido utilizado excesivamente e implica la presencia de condiciones infecciosas e inflamatorias que afectan a la madre, al feto y al recién nacido. Por ello, se acuña el término “Triple I” para indicar inflamación o infección intrauterina o ambos, restringiendo el término corioamnionitis al diagnóstico patológico (Sweeney et al., 2016; Peng et al., 2018). 5.3.5. Ruptura prematura de membranas (PROM) Rehbinder et al. (2018), trabajaron con 10 muestras de LA procedente de 51 mujeres con membranas amnióticas intactas y con 14 muestras de LA, de mujeres con ruptura de membranas amnióticas (ROM) con la idea de estudiar la presencia de microbiota en muestras de LA en embarazos a término no complicados. Para ello, utilizaron varias técnicas como la PCR que se realizó en las muestras de LA procedente de mujeres sin rotura de membranas. Se encontró una baja cantidad de ADN bacteriano; mientras que en el grupo de mujeres con rotura de membranas (ROM), había elevada cantidad de ADN bacteriano. Mediante el empleo de la técnica de secuenciación y cultivos no fueron detectadas bacterias en el grupo de no rotura de membranas, y en el otro grupo, se detectaron bacterias en un 50% de los casos en condiciones aeróbicas, y en un 14,3% de los casos en condiciones aeróbicas. Además, las colonias fueron identificadas como bacterias habituales de la microbiota-vaginal y/o asociada a infecciones intrauterinas: Streptococcus agalactiae, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus vaginallis, Peptoniphilus harei, Prevotella amnii. La secuenciación del ARNr 16S de cinco de seis muestras de LA, reveló especies bacterianas que forman parte de la microbiota vaginal como son Bifidobacterium, Prevotella, Lactobacillus, Sneathia…de las cuales algunas son conocidas por estar relacionadas con vaginosis bacteriana y/o infecciones. Los resultados obtenidos por tanto, han cambiado la visión de que en los embarazos no complicados no existen comunidades bacterianas, al identificar bacterias comunes con 31 la microbiota de la placenta y del meconio al inicio del parto, con la ruptura de las membranas (Rehbinder et al., 2018). Es importante resaltar, que la ruptura de membranas no es necesariamente la forma en la que las bacterias alcanzan la cavidad amniótica; de hecho, hay evidencias de que las bacterias pueden atravesar membranas intactas (Kim et al., 2015). En definitiva, en el grupo ROM se encontraron especies que son conocidas por formar parte de la microbiota vaginal de una mujer en edad reproductiva, dominado por especies de Lactobacillus entre otras, que están relacionadas con vaginosis bacteriana; apoyando la idea de la colonización ascendente de la cavidad intrauterina en mujeres con rotura de membranas y comienzo próximo del parto. Por otro lado, en el grupo de no rotura de membranas, la cantidad de ADN encontrado fue demasiado baja para identificar microbiota bacteriana (Rehbinder et al., 2018). Esta rotura de membranas, se puede producir de forma “prematura” o temprana, conociéndose como ruptura prematura de membrana (PROM) y es aquella que ocurre antes del inicio del parto, a una edad gestacional menor a las 37 semanas (Escalante et al., 2010; Peng et al., 2018). La PROM constituye una condición heterogénea, caracterizada por la carga microbiana y/o la presencia de inflamación intraamniótica (Theis et al., 2020). En condiciones normales, existe un tapón mucoso cervical que protege junto con la integridad del corioamnios, de la colonización e infección de organismos presentes en la vagina; cuando ésta se rompe antes del parto, esta “protección” se pierde, aumentado el riesgo de infección, conocida como corioamnionitis la cual puede tener relación con la morbimortalidad perinatal (Escalante et al., 2010). Pettker et al. (2007), en su estudio, indicaron los siete microorganismos aislados más frecuentes de cultivos de LA, en pacientes con ruptura prematura de membranas o parto prematuro. El microorganismo más frecuente aislado fue Ureaplasma urealyticum. Sus resultados se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Principales microorganismos aislados de LA en pacientes con ruptura prematura de membranas o parto prematuro (Pettker et al., 2007). 32 6. CONCLUSIONES 1. El intenso estudio del líquido amniótico ha evidenciado que el microbioma tiene un papel fundamental en el desarrollo del feto. 2. La exposición a los microorganismos en el líquido amniótico, permitirá al feto iniciar la maduración de su sistema inmune en condiciones normales, gracias principalmente a la colonización del intestino y a la presencia de sustancias con actividad antimicrobiana. 3. Existen circunstancias bajo las cuales algunos microorganismos debido a sus factores de virulencia o debido simplemente a disbiosis en los mismos, pueden llegar a producir la invasión microbiana de la cavidad amniótica, dando lugar a infecciones o inflamación. 4. Con relación a la corioamnionitis, se ha establecido que se desarrolla frecuentemente con infección intraamniótica, con un especial protagonismo de los microorganismos Ureaplasma spp. y Fusobacterium spp. aunque existen casos de corioamnionitis sin la presencia de infección. 5. Se ha establecido correlación entre la presencia de microorganismos no habituales en el LA con el desarrollo de afecciones como la preeclampsia, teniendo un papel destacado S. haemolyticus. 6. Por último, a pesar de la evidencia de los beneficios que nos aporta el microbioma, es evidente que alteraciones en su equilibrio pueden producir consecuencias negativas en el devenir de la gestación, como es el caso de la infección intrauterina o la preeclampsia que podrían dar lugar a un parto prematuro. 33 7. BIBLIOGRAFÍA • Aagaard K, Ma J, Antony KM, Ganu R, Petrosino J, Versalovic J. The placenta harbors a unique microbiome. Sci Transl Med. 2014; 6 (237): 237-265. • Ahmadian E, Rahbar Saadat Y, Hosseiniyan Khatibi SM, Nariman-Saleh-Fam Z, Bastami M, Zununi Vahed F et al. Pre-Eclampsia: Microbiota possibly playing a role. Pharmacol Res. 2020; 155: 104692. • Ahn YJ, Park SK, Oh JW, Sun HY, Shin SH. 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