Estudio de los metalorreguladores Fur en la bacteria extremófila Chromohalobacter salexigens: implicación en la homeostasis del hierro y en la síntesis de ectoínas

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Estudio de los metalorreguladores Fur en la bacteria extremófila Chromohalobacter salexigens: implicación en la homeostasis del hierro y en la síntesis de ectoínas Emilia Naranjo Fernández Sevilla, 2021 Memoria que presenta la Lcda. en Biología Emilia Naranjo Fernández para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Dpto. de Microbiología y Parasitología C/ Profesor García González, 2 41012 Sevilla CARMEN VARGAS MACÍAS Y MONTSERRAT ARGANDOÑA BERTRÁN, PROFESORES DOCTORES DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA DE LA FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA, CERTIFICAN: Que la Tesis Doctoral titulada: Estudio de los metalorreguladores Fur en la bacteria extremófila Chromohalobacter salexigens: implicación en la homeostasis del hierro y en la síntesis de ectoínas, presentada por la Lcda. en Biología EMILIA NARANJO FERNÁNDEZ para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, bajo nuestra dirección, reuniendo los requisitos exigidos. Y para que así conste, expedimos y firmamos el presente certificado en Sevilla, a 18 de enero de 2021 Fdo. Carmen Vargas Macías Fdo. Montserrat Argandoña Bertrán La presente Tesis Doctoral ha sido subvencionada por las ayudas: TÍTULO DEL PROYECTO: Integración de las redes metabólicas y reguladoras de la bacteria halófila productora de ectoína(s) Chromohalobacter salexigens (CONECTOINE) BIO2011-22833 ENTIDAD FINANCIADORA: Ministerio de Ciencia e Innovación. Plan Nacional I+D+I 2008-2011, Acción Estratégica de Biotecnología DURACIÓN: Desde: 01-01-2012 Hasta: 31-12-2014 INVESTIGADOR PRINCIPAL: Carmen Vargas Macías TÍTULO DEL PROYECTO: Nuevas estrategias de Ingeniería metabólica En Chromohalobacter salexigens: Uso racional de la Biología de Sistemas y la Biología sintética aplicada a la producción de ectoínas BIO2015- 63949-R ENTIDAD FINANCIADORA: Ministerio de Economía y Competitividad. Convocatoria 2015 - proyectos I+D+i - Programa Estatal de Investigación, Desarrollo e Innovación orientada a los retos de la sociedad DURACIÓN: Desde: 01-01-2016 Hasta: 31-12-2019 INVESTIGADOR PRINCIPAL: Carmen Vargas Macías y Montserrat Argandoña Bertrán Asimismo, durante la realización de la Tesis Doctoral, la doctoranda ha disfrutado de las siguientes becas: INSTITUCIÓN: Becaria adscrita al proyecto “Integración de las Redes Metabólicas y Reguladoras de la bacteria productora de ectoína(s) Chromohalobacter salexigens” (BIO2011- 22833) (MICINN). CENTRO DE APLICACIÓN DE LA BECA: Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla. FECHA: 1 enero de 2014 a 1 junio de 2014. INSTITUCIÓN: Becaria adscrita al proyecto “Nuevas Estrategias de Ingeniería Metabólica en Chromohalobacter salexigens. Uso Racional de la Biología de Sistemas y la Biología Sintética Aplicada a la Producción de Ectoínas” (BIO2015-63949-R) Ministerio de Economía y Competitividad. CENTRO DE APLICACIÓN DE LA BECA: Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla. FECHA: 1 de septiembre de 2016 a 31 de agosto de 2018. INSTITUCIÓN: Universidad de Sevilla. Estancia breve del Plan Propio de Investigación y Transferencia. Ayudas para la movilidad internacional del personal dedicado a la investigación. CENTRO DE APLICACIÓN DE LA BECA: Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie. Alma Mater Studiorum- Universitá di Bologna. Italia. FECHA: 1 de abril de 2018 a 31 de julio de 2018. Parte de los resultados de esta tesis se obtuvieron durante las siguientes estancias breves de investigación.  Estancia en el laboratorio del Dr. Alberto Danielli en el Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie. Alma Mater Studiorum - Universitá di Bologna. (Italia). Duración: 4 meses, del 01/04/2018 al 31/7/2018. III IV INDICE 0. RESUMEN……………………………………………………………………………………………………………….I I. INTRODUCCION………………………………………………………………………………………………………1 1. Importancia del hierro en microrganismos……………………………………………………………..3 1.1. Disponibilidad del hierro…………………………………………………………………………………4 1.2. Toxicidad del hierro………………………………………………………………………………………..5 1.3. Mecanismos bacterianos de captación de hierro…………………………………………….5 1.3.1. Captación directa de hierro………………………………………………………………….6 1.3.2. Captación de hierro mediante sideróforos……………………………………………6 1.3.2.1. Tipos de sideróforos………………………………………………………………..8 1.3.2.2. Otras funciones……………………………………………………………………….9 1.3.2.3. Aplicaciones………………………………………………………………………….10 1.4. Mecanismo para el control de la homeostasis del hierro……………………………….11 2. La proteína Fur (Ferric Uptake Regulator) …………………………………………………………….12 2.1. Estructura de la proteína Fur……………………………………………………………………….12 2.2. Sitios de unión al ADN de la proteína Fur (Cajas Fur)…………………………………….13 2.3. Mecanismos de regulación mediados por Fur………………………………………………14 2.4. Diversas funciones del regulador Fur no relacionadas con la homeostasis del hierro………………………………………………………………………………………………………….17 3. Osmoadaptacion en Proteobacterias……………………………………………………………………19 3.1. Adaptación de las membranas………………………………………………………………………19 3.2. Acumulación de iones y solutos compatibles…………………………………………………20 4. Solutos compatibles: las ectoínas………………………………………………………………………….21 4.1. Potencial biotecnológico de las ectoínas……………………………………………………….23 4.2. Producción biotecnológica de las ectoínas…………………………………………………….29 5. Chromohalobacter salexigens: productor natural de ectoínas……………………………….33 5.1. Mecanismos de osmoadaptacion en C. salexigens…………………………………………34 5.1.1. Adaptación de las membranas……………………………………………………………34 5.1.2. Acumulación y síntesis de solutos compatibles…………………………………..35 5.1.3. Adaptación metabólica de C. salexigens……………………………………………..40 V 5.1.4. Otras adaptaciones/modificaciones fisiológicas…………………………………43 5.2. Regulación del metabolismo de ectoínas en C. salexigens……………………………..45 5.3. Relación entre la homeostasis del hierro y la osmo- y termoadaptación en C. salexigens……………………………………………………………………………………………………46 II. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………………………49 III. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………………………………….53 1. Material biológico………………………………………………………………………………………………..55 1.1. Cepas bacterianas utilizadas……………………………………………………………………......55 1.2. Plásmidos…………………………………………………………………………………………………….55 2. Medios de cultivo……………………………………………………………………………………………… ..58 2.1. Medios de cultivo para microrganismos halófilos………………………………………….58 2.1.1. Medios complejos………………………………………………………………………………58 2.1.2. Medios mínimos…………………………………………………………………………………59 2.2. Medios de cultivo para Escherichia coli…………………………………………………………60 2.2.1. Medios complejos………………………………………………………………………………60 3. Condiciones de cultivo y conservación de las cepas……………………………………………….60 4. Compuestos antimicrobianos……………………………………………………………………………….60 5. Métodos de transferencia de material genético……………………………………………………61 5.1. Conjugación triparental………………………………………………………………………………..61 5.2. Transformación……………………………………………………………………………………………62 5.2.1. Preparación de células competentes con CaCl2……………………………….....63 6. Mutagénesis…………………………………………………………………………………………………………64 6.1. Obtención de mutantes por doble recombinación homóloga……………………....64 7. Extracción y purificación de ADN…………………………………………………………………………..64 7.1. Extracción de ADN plasmídico……………………………………………………………………...64 7.2. Extracción de ADN genómico………………………………………………………………………..65 8. Electroforesis del ADN en geles de agarosa……………………………………………………………65 9. Manipulación del ADN………………………………………………………………………………………….66 9.1. Manipulación enzimática del ADN………………………………………………………………..66 9.1.1. Digestión del ADN con endonucleasas de restricción…………………………….66 VI 9.1.2. Desfosforilación de los extremos 5´……………………………………………………...67 9.1.3. Ligación de los fragmentos de restricción………………………………………………68 9.1.4. Aislamiento y purificación de fragmentos de ADN de geles de agarosa….68 9.1.5. Amplificación de fragmentos de ADN mediante PCR…………………………….68 9.1.5.1. PCR de extensión solapada (Overlapping PCR)………………………….70 9.1.5.2. PCR de colonia…………………………………………………………………………70 9.1.5.3. Mutagénesis dirigida por PCR…………………………………………………..71 10. Secuenciación y análisis de las secuencias de ADN……………………………………………..72 10.1. Secuenciación de ADN………………………………………………………………………………..72 10.2. Análisis de las secuencias de ADN y de proteínas…………………………………………72 11. Extracción y purificación de ARN…………………………………………………………………………74 11.1. Extracción de ARN total………………………………………………………………………………74 11.2. Purificación de ARN mensajero…………………………………………………………………..76 12. Manipulación de ARN…………………………………………………………………………………………78 12.1. Obtención de ADNc a partir de ARN…………………………………………………………….78 12.2. Determinación de la expresión génica mediante qPCR………………………………..78 13.Transcriptoma…………………………………………………………………………………………………….79 13.1. Análisis diferencial de la expresión génica mediante RNA-seq (Illumina)…….79 13.2. Obtención de las muestras y ARNm……………………………………………………………79 13.3. Secuenciación del ARNm (RNA-seq)……………………………………………………………80 13.4. Análisis bioinformático de las secuencias: mapeo de lecturas y cuantificación de los transcritos……………………………………………………………………………………….80 13.5. Normalización y verificación de la reproducibilidad entre muestras…………….81 13.6. Cuantificación de la expresión diferencial……………………………………………………81 13.7. Validación mediante RT- qPCR de genes diferencialmente expresados………..81 14. Determinaciones analíticas…………………………………………………………………………………82 14.1. Cuantificación de solutos compatibles intracelulares por HPLC…………………..82 14.2. Cuantificación del contenido intracelular de hierro…………………………………….84 15. Producción de sideróforos………………………………………………………………………………….85 16. Ensayo de resistencia a manganeso…………………………………………………………………….87 VII IV. RESULTADOS……………………………………………………………………………………………………….89 1. Análisis de la influencia del hierro en la osmoadaptacion de C. salexigens……………………………..................................................................................91 1.1. Análisis del crecimiento de C. salexigens en diferentes condiciones de salinidad en presencia de diferentes concentraciones de hierro………………………………….91 1.2. Cuantificación del contenido intracelular de ectoínas a baja y a elevada salinidad en presencia de diferentes concentraciones de hierro…………………..92 2. Implicación del regulador Fur en la homeostasis de hierro y en la osmoadaptación de C. salexigens…………………………………………………………………………………………………..94 2.1. Análisis del contexto genómico del gen fur2 (csal3097)…………………………………94 2.2. Obtención de cepas mutantes en el gen Csal_3097 (fur2) …………………………….95 2.3. Implicación de Fur en la regulación de la homeostasis del hierro……………………97 2.3.1. Tolerancia al manganeso en un mutante fur2………………………………………..97 2.3.2. Producción de sideróforos en los mutantes fur…………………………………….98 2.3.3. Contenido intracelular de hierro en los mutantes fur……………………………99 2.3.4. Expresión de genes relacionados con el transporte de hierro…………….101 2.4. Implicación de los reguladores Fur en la osmoadaptación……………………………103 2.4.1. Crecimiento de los mutantes fur a baja y elevada salinidad en condiciones de limitación o exceso de hierro………………………………………………………….103 2.4.2. Implicación de los mutantes fur en la acumulación de ectoína e hidroxiectoína en función de la salinidad…………………………………………….105 2.4.3. Determinación de la expresión de los genes implicados en la síntesis de ectoínas en los mutantes fur……………………………………………………………….107 3. Análisis de la influencia del hierro y de los reguladores Fur en la homeostasis del hierro y la termoadaptacion de C. salexigens……………………………………………………..110 3.1. Análisis del crecimiento de los mutantes fur a elevada temperatura en presencia y ausencia de hierro……………………………………………………………………110 3.2. Implicación de los reguladores Fur y el hierro en la síntesis de ectoínas………111 3.3. Implicación de los reguladores Fur en la homeostasis del hierro: Cuantificación del contenido intracelular de Fe e influencia en la síntesis de sideróforos………………………………………………………………………………………………..115 4. Transcriptoma diferencial de los mutantes fur en respuesta a la salinidad…………..118 4.1. Obtención del transcriptoma mediante RNAseq………………………………………….119 4.2. Normalización y validación de los datos de RNAseq…………………………………….121 VIII 4.3. Análisis global del transcriptoma de Fur1 y Fur2 en respuesta a la salinidad………………………………………………………………………………………..............128 4.4. Genes relacionados con la respuesta metabólica a estrés osmótico en el regulador Fur1…………………………………………………………………………………………..131 4.4.1. Metabolismo carbonado………………………………………………………………….132 4.4.2. Metabolismo nitrogenado……………………………………………………………….133 4.4.3. Metabolismo energético………………………………………………………………….134 4.5. Genes relacionados con la respuesta metabólica a estrés osmótico en el regulador Fur2…………………………………………………………………………………..135 4.5.1. Metabolismo carbonado………………………………………………………………….136 4.5.2. Metabolismo nitrogenado……………………………………………………………….137 4.5.3. Metabolismo energético………………………………………………………………….138 4.6. Influencia de los reguladores Fur en el metabolismo del hierro……………………138 4.7. Influencia de los reguladores Fur en la regulación transcripcional……..140 4.8. Influencia de los reguladores Fur en los procesos de transporte………………….142 4.9. Influencia de los reguladores Fur en la osmoadaptación……………………………..144 V. DISCUSIÓN GENERAL………………………………………………………………………………………….145 1. Influencia del hierro en la osmoadaptación de C. salexigens………………………………..147 2. Implicación de los reguladores Fur en la homeostasis del hierro…………………..........148 3. Los reguladores Fur y el hierro controlan el metabolismo de las ectoínas en función de la salinidad……………………………………………………………………………………………………150 4. Los reguladores Fur y el hierro controlan el metabolismo de las ectoínas en función de la temperatura……………………………………………………………………………………………..151 5. Fur1 y Fur2 son reguladores globales implicados en la adaptación metabólica y fisiológica a la salinidad de C. salexigens…………………………………………………………….154 VI. CONCLUSIONES GENERALES………………………………………………………………………………159 VII. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………………………..163 VIII. ANEXO…………………………………………………………………………………………………………….192 Tabla Anexo I. Clasificación de los genes diferencialmente expresados en Fur1 y Fur2 en el análisis mediante RNAseq………………………………………………………………………………194 IX INDICE DE FIGURAS Figura 1. Homeostasis del hierro en bacterias………………………………………………………4 Figura 2. Sistemas de transporte de hierro ferroso identificados en varias bacterias Gran negativa………………………………………………………………………………………………………6 Figura 3. Modelo propuesto para el intercambio de hierro mediante el transporte de sideróforos en bacterias Gram negativas…………………………………………………………7 Figura 4. Estructura de los diferentes sideróforos………………………………………………….9 Figura 5. Diagrama de la estructura cristalográfica del dímero de Fur en P. aeruginosa con elementos secundarios anotados……………………………………………….13 Figura 6. Sitios de unión de la proteína Fur…………………………………………………………..14 Figura 7. Representación esquemática del modelo clásico de la represión génica llevada a cabo por Fur………………………………………………………………………………………….15 Figura 8. Mecanismo de represión apo-Fur………………………………………………………….15 Figura 9. Mecanismo de activación apo-Fur…………………………………………………………16 Figura 10. Mecanismo de activación directa en Fur……………………………………………..16 Figura 11. Mecanismo de activación indirecta en Fur…………………………………………..17 Figura 12. Esquema de los principales mecanismos de osmoadaptación en procariotas…………………………………………………………………………………………………………20 Figura 13. Estructura química de algunos de los principales solutos compatibles.21 Figura 14. Organización génica de los genes de transporte de ectoínas en C. salexigens……………………………………………………………………………………………………………35 Figura 15. Genética y ruta biosintética de los solutos compatibles ectoína e hidroxiectoína en C. salexigens……………………………………………………………………………37 Figura 16. Genética y rutas metabólicas implicadas en el reciclado o utilización como nutrientes de las ectoínas………………………………………………………………………….39 Figura 17. Esquema del metabolismo central y síntesis de ectoínas en C. salexigens basado en el genoma anotado…………………………………………………………………………….42 Figura 18. Regulación de la síntesis de ectoínas en C. salexigens………………………..46 Figura 19. Organización genética de los genes de síntesis de ectoína y ubicación de los sitios de inicio de la transcripción aguas arriba de los genes ectA (PectA1 a PectA4) y ectB (PectB)…………………………………………………………………………………………47 Figura 20. Esquema del plásmido pBluescript SK(+)……………………………………………56 Figura 21. Esquema del MCS del plásmido pBluescript SK (+) donde se muestran los diferentes puntos de corte………………………………………………………………………………….57 X Figura 22. Esquema del plásmido pJQ200-SK. Los puntos de corte subrayados son puntos de corte únicos………………………………………………………………………………………..57 Figura 23. Esquema del plásmido pHP45Ω…………………………………………………………..58 Figura 24. Marcador de pesos moleculares “1Kb DNA ladder”……………………………..66 Figura 25. Accesorio para extracción de bandas de geles de electroforesis X- tracta………………………………………………………………………………………………………………….68 Figura 26. Fundamento del método usado en el kit “MICROBExpress Kit” (Ambion) para eliminar el ARNr de una muestra de ARN total…………………………………………….76 Figura 27. Equipo ICP Horiba Jobin Yvon, Ultima 2 utilizado en este ensayo…………85 Figura 28. Crecimiento en medio mínimo M63 a baja y elevada salinidad……………92 Figura 29. Contenido intracelular de ectoínas en condiciones diferentes de hierro a 0.6 y 2.5 M de NaCl………………………………………………………………………………………………93 Figura 30. Organización génica de la región Csal_3097 (fur2) de C. salexigens………94 Figura 31. Estrategia utilizada para la construcción de cepas mutantes fur2 de C. salexigens……………………………………………………………………………………………………………96 Figura 32. Sensibilidad al manganeso de las estirpes CHR61 (wt), CHR215 (fur2) y CHR216 (fur1fur2)……………………………………………………………………………………………….97 Figura 33. Determinación de la producción de sideróforos en la cepa silvestre y en las cepas mutantes a diferentes salinidades…………………………………………………………99 Figura 34. Contenido intracelular de hierro de la cepa silvestre y las cepas mutantes fur1, fur2 y fur1fur2…………………………………………………………………………………………100 Figura 35. Determinación de la expresión de los genes Yggx, Zip y EfeU implicados en el transporte de hierro en la cepa silvestre y en los mutantes fur a baja y elevada salinidad en condiciones de exceso y limitación de hierro…………………………………102 Figura 36. Crecimiento de la cepa silvestre y de los mutantes fur en función de la salinidad……………………………………………………………………………………………………………104 Figura 37. Contenido intracelular de ectoína de las cepas silvestre (wt) y mutantes fur de C. salexigens……………………………………………………………………………………………106 Figura 38. Contenido intracelular de hidroxiectoína de las cepas silvestre (wt) y mutantes fur de C. salexigens……………………………………………………………………………107 Figura 39. Esquema de la ruta de síntesis de ectoínas en C. salexigens, donde se puede apreciar los genes que intervienen y las posibles regiones promotoras donde se unen los reguladores Fur………………………………………………………………………………107 Figura 40. Determinación de la expresión de los genes implicados en la síntesis de ectoínas en la cepa silvestre y en los mutantes fur a baja y elevada salinidad en condiciones de exceso y limitación de hierro……………………………………………………109 XI Figura 41. Hipótesis sobre los mecanismos dependientes de salinidad y/o Fe que intervienen en el control transcripcional de los genes implicados en la síntesis de ectoínas (ectA, ectD y ectE) a través de reguladores Fur……………………………………109 Figura 42. Crecimiento de las cepas de C. salexigens a 45° C en medio mínimo M63 adicionado de glucosa a 2,5 M de NaCl con y sin aporte de hierro………………………111 Figura 43. Contenido intracelular de ectoínas en condiciones limitantes de hierro a 2.5 M de NaCl y 45°C…………………………………………………………………………………………112 Figura 44. Contenido intracelular de ectoínas en condiciones de exceso de hierro a 2.5 M de NaCl y 45°C…………………………………………………………………………………………113 Figura 45. Determinación de la expresión de los genes envueltos en la síntesis de ectoínas en la cepa silvestre y las cepas mutantes fur1, fur2 y fur1fur2 por qPCR…………………………………………………………………………………………………………………114 Figura 46. Producción de sideróforos por la cepa silvestre (wt) y los mutantes fur1, fur2 y fur1 fur2 a elevada temperatura………………………………………………………………115 Figura 47. Contenido intracelular de hierro de la cepa silvestre y las cepas mutantes fur1, fur2 y fur1fur2 a 45°C………………………………………………………………………………..116 Figura 48. Determinación de la expresión de los genes envueltos en el transporte de hierro en la cepa silvestre y las cepas mutantes fur1, fur2 y fur1fur2 por qPCR a elevada temperatura…………………………………………………………………………………………118 Figura 49. Monitorización del crecimiento de los mutantes fur y punto de recogida de las muestras para el análisis del transcriptoma por RNAseq…………………………119 Figura 50. Análisis de la calidad del ARN total mediante electroforesis capilar de los mutantes fur…………………………………………………………………………………………………..…120 Figura 51. Análisis de la calidad del ARNm mediante electroforesis capilar de los mutantes fur…………………………………………………………………………………………………..…120 Figura 52. Normalización de las muestras…………………………………………………………121 Figura 53. Análisis PCA de las diferentes réplicas biológicas utilizando el transcriptoma completo normalizado……………………………………………………………….122 Figura 54. Porcentaje de genes incluidos en los distintos rangos de fold-change del transcriptoma diferencial de la cepa silvestre de C. salexigens frente a los mutantes fur1 y fur2……………………………………………………………………………………………………….…123 Figura 55. MA-plot del transcriptoma de la cepa silvestre de C. salexigens frente a los mutantes fur1 y fur2…………………………………………………………………………………….125 Figura 56. Volcano plot del transcriptoma de la cepa silvestre de C. salexigens frente a los mutantes fur1 y fur2 en condiciones de baja y elevada salinidad………………126 Figura 57. Validación mediante semi RT-qPCR de los resultados obtenidos por RNAseq…………………………………………………………………………………………………………….127 Figura 58. Porcentaje de las categorías funcionales asignadas por COG de los genes diferencialmente expresados en fur1 y en fur2…………………………………………………129 XII Figura 59. Porcentaje de las categorías funcionales asignadas por COG de los genes diferencialmente expresados en fur1 y en fur2, estando en azul los datos de baja salinidad y en rojo a elevada salinidad………………………………………………………………130 Figura 60. Distribución del porcentaje de genes diferencialmente expresados en los mutantes fur1 y fur2 con respecto a la cepa silvestre según la clasificación de KEGG…………………………………………………………………………………………………………………131 Figura 61. Distribución del número de genes metabólicos diferencialmente expresados en el mutante fur1………………………………………………………………………….132 Figura 62. Distribución de número de genes diferencialmente expresados a elevada y baja (salinidad, a lo largo de las categorías metabólicas definidas para los carbohidratos por la ortología de KEGG en el mutante fur1………………………………132 Figura 63. Distribución de número de genes diferencialmente expresados a elevada y baja salinidad, a lo largo de las categorías metabólicas definidas para los aminoácidos por la ortología de KEGG en el mutante fur1…………………………134 Figura 64. Distribución del número de genes metabólicos diferencialmente expresados en el mutante fur2…………………………………………………………………………136 Figura 65. Distribución de número de genes diferencialmente expresados a elevada y baja salinidad, a lo largo de las categorías metabólicas definidas para los carbohidratos por la ortología de KEGG en el mutante fur2………………………………136 Figura 66. Distribución de número de genes diferencialmente expresados a elevada (rojo) y baja (azul) salinidad, a lo largo de las categorías metabólicas definidas para los aminoácidos por la ortología de KEGG en el mutante fur2……………………………138 Figura 67. Distribución de número de genes diferencialmente expresados implicados en la regulación en un mutante fur1…………………………………………………141 Figura 68. Distribución de número de genes diferencialmente expresados implicados en la regulación en un mutante fur2…………………………………………………142 Figura 69. Distribución de número de genes diferencialmente expresados implicados en el transporte en un mutante fur1 y un mutante fur2……………………143 Capítulo I: Introducción - 5 - propiedades del hierro no son del todo beneficiosas para la mayoría de los organismos que habitan los ambientes óxicos. Aunque, durante los primeros años de vida, se considera que el hierro ha sido un metal biológicamente “amigable”, una vez que la fotosíntesis oxigénica comenzó a contaminar la atmósfera con oxígeno molecular (hace aproximadamente 2,2 - 2,7 billones de años) la química del hierro cambió considerablemente, generando que la forma predominante de hierro, Fe2+ (forma ferrosa), relativamente soluble (0,1 M a pH 7) pasara a la forma férrica extremadamente insoluble (10-18 M a pH 7). 1.2. Toxicidad del hierro. Además de mantener una concentración adecuada de hierro para el crecimiento bacteriano, es crucial asegurar que el hierro intracelular se mantenga en concentraciones no toxicas para la célula. Esto requiere que el hierro celular no interaccione con especies reactivas de oxígeno que son producidas como consecuencia del metabolismo aerobio (Fridovich, 1983). Los productos de la reducción de oxígeno, el superóxido (O2-) y el peróxido de hidrogeno (H2O2), pueden interaccionar con el hierro generando radicales hidroxilos (HO•) que son altamente reactivos y dañinos. Las reacciones son las siguientes: (i) Reducción de hierro O2- + Fe3+ Fe2++ O2 (ii) Reacción de Fenton Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + HO• (iii) Reacción de Haber-Weiss, (i) + (ii), usando Fe3+ como catalizador O2-+ H2O2 HO• + OH-+ O2 Estas especies reactivas de oxigeno pueden dañar lípidos, proteínas y ADN por oxidación. En la reacción de Fenton es donde se produce el radical hidroxilo que es el más reactivo en los sistemas biológicos, puede interaccionar con los ácidos grasos polinsaturados que componen los fosfolípidos de las membranas dando lugar a uniones inusuales entre ellos, produciendo una disminución en la fluidez de membrana, llegando incluso a causar la lisis de las células (Archibald and Fridovich, 1983; Fridovich, 1983). 1.3. Mecanismos bacterianos de captación de hierro. Debido a su escasa disponibilidad y a su importancia en el metabolismo bacteriano, los microorganismos han desarrollado mecanismos muy eficientes para la captación de dicho metal (Schwyn and Neilands, 1987). Capítulo I: Introducción - 6 - En bacterias Gram negativas, el reconocimiento se lleva a cabo a través de receptores de membrana externa desde donde el sustrato es transportado al citoplasma gracias a permeasas de tipo ABC situadas en el citoplasma. Según sea la fuente de hierro, se distinguen dos tipos de mecanismos: los directos, que requieren que la bacteria esté en contacto con la fuente de hierro exógena, e indirectos, que dependen de compuestos sintetizados y liberados al medio extracelular por parte de los propios microrganismos (Wandersman and Delepelaire, 2004). 1.3.1. Captación directa de hierro. En las bacterias Gram negativas, el hierro ferroso se difunde libremente a través de las porinas de la membrana externa, de modo que pueda entrar al periplasma y de ahí se transporta al citoplasma a través de diferentes sistemas de transporte (Ge and Sun, 2012). Son varios los transportadores de hierro ferroso que han sido descritos en la literatura hasta la actualidad, estos son MntH, ZupT, YfeABCD; FutABC, EfeUOB y Feo (Figura 2) (Lau et al., 2016). El primer sistema bacteriano para el transporte de Fe2+ se describió en E. coli k-12 y se denominó FeO. Este sistema está compuesto por tres genes que forman un operon y codifican las proteínas FeoA, FeoB (que posee un dominio integrado a la membrana interna que actúa como permeasa) y FeoC. Supuestamente este sistema Feo juega un papel crucial en la captación de hierro bajo las condiciones de anaerobiosis o microaerofília (Lau et al., 2016). Figura 2. Sistemas de transporte de hierro ferroso identificados en varias bacterias Gran negativas. Rectángulos y óvalos representan permeasas, canales o transportadores ABC. Los círculos representan las proteínas de unión periplásmicas. Tanto los transportadores de Fe2+ (EfeB/EfeO/EfeU y FeoA/FeoB/FeoC) como los de manganeso (MntH) se han encontrado en E.coli. (Lau et al., 2016). 1.3.2. Captación de hierro mediante sideróforos. El mecanismo de captación de Fe3+ más extendido en las bacterias es el uso de los denominados sideróforos. El término sideróforos vienen del griego sideros phoros “portadores de hierro”, son moléculas de alta afinidad por el ion férrico de bajo peso molecular (menos de 10 KDa) que son excretadas bajo condiciones de escasez de hierro por varios microorganismos Capítulo I: Introducción - 7 - como bacterias, hongos y también por algunas plantas. Recientemente se han encontrado sideróforos de mamíferos (Devireddy et al., 2010). La característica principal de este tipo de moléculas es que presentan una elevada constante de disociación del hierro, oscilando entre 1022 y 1055. Esta afinidad tan elevada, aparte de facilitarles la captación del metal presente en compuestos como el hidróxido de hierro, les permite arrancar los átomos de éste unidos a proteínas como la transferrina o la ferritina (Neilands, 1995). Hay organismos como E. coli, que no sólo usan sus propios sideróforos, sino que también usan los de otros como los de los hongos. Además, también los sideróforos participan en la reacción de intercambio de ligando, tal es el caso de Aeromonas hydrophila, en el que hay un intercambio de hierro de un sideróforo férrico a un sideróforo libre de hierro unido al receptor. Este mecanismo de intercambio de ligando mediado por sideróforos se producen en la superficie celular (Dhungana and Crumbliss, 2001) En general, la adquisición del hierro comienza con la unión del sideróforo excretado al ion férrico formando el complejo ferri-sideróforo, luego este complejo se une a la proteína receptora localizada en la superficie celular (FepA, FecA y FhuA) y de aquí es translocado al interior por transporte activo (Figura 3) (Boda et al., 2016). Todos los receptores comparten la misma propiedad estructural que consta de un barril con 22 cadenas ꞵ-antiparalelas que contienen bucles extracelulares que interaccionan con el complejo ferri-sideróforo y un dominio de eclosión N-terminal (Krewulak and Vogel, 2008). El transporte del complejo ferri-sideróforo a través del periplasma y de la membrana citoplasmática requiere cierta proteína de unión que actúa como lanzadera, estas proteínas de unión como FhuD, recogen el ferri-sideróforo liberado del receptor de la membrana externa y lo entrega a una permeasa afín, por ejemplo, una permeasa ABC presente en la membrana interna. En E. coli, cuando el complejo ferri-sideróforo se internaliza, el enlace éster entre el complejo es hidrolizado por una esterasa, resultando la liberación del hierro y produciendo serina dihidroxibenzoil que actúa como un sideróforo débil (Figura 3) (Dhungana and Crumbliss, 2001; Köster, 2001). Capítulo I: Introducción - 8 - Figura 3. Modelo propuesto para el intercambio de hierro mediante el transporte de sideróforos en bacterias Gram negativas (Dhungana and Crumbliss, 2001). 1.3.2.1. Tipos de sideróforos. Dependiendo de los ligandos de oxígeno para la coordinación con el Fe3+, los sideróforos se pueden clasificar en tres categorías principales:  Sideróforo de hidroxamato: es el grupo más común producido por los microorganismos. La mayoría de los grupos hidroxamato consisten en C (= O) N- (OH) R, donde R es un aminoácido o un derivado de este. Dos moléculas de oxígeno proceden de cada hidroxamato forman un ligando bidentado con el hierro. Por lo tanto, cada sideróforo es capaz de formar un complejo octaédrico hexadentado con el Fe3+. Los hidroxamatos se unen al hierro mediante una unión constante en un rango de 1022 a 1032 M-1 (Figura 4 A) (Winkelmann, 2007; Saha et al., 2016).  Sideróforo de catecolato (fenolatos): es producido por ciertas bacterias, cada catecolato suministra dos átomos de oxígeno para la quelación con hierro y formar el complejo octaédrico hexadentado (Figura 4 B). Ciertas bacterias como E. coli, Salmonella typhimurium y Klebsiella pneumoniae producen enteroquelina (Dertz et al., 2006) que se unen fuertemente al Fe3+ (K=1052 M-1). Otras bacterias, sin embargo, pueden producir solo sideróforos catecolatos (Erwinia carotovora) o sideróforos mixtos, donde el catecolato es uno de los miembros (miembros de Pseudomonas producen una mezcla de sideróforos que constan de catecolatos e hidroxamatos) (Figura 4 D) (Leong and Neilands, 1982).  Sideróforos de carboxilato: es producido principalmente por bacterias como Rhizobium y Staphylococcus y por hongos mucorales. Este tipo de sideróforos se unen al hierro a través de grupos carboxilos e hidroxilos (Figura 4C) (Dave and Dube, 2000). Un ejemplo es la rizobactina producido por la cepa Rhizobium meliloti DM4, se considera el sideróforo carboxilato mejor caracterizado, tiene un ácido amino policarboxílico que posee motivos dicarboxil diamina etileno y motivos carboxil hidroxil que actúan como quelantes de grupos con hierro (Smith and Neilands, 1984). Capítulo I: Introducción - 9 - Figura 4. Estructura de los diferentes sideróforos. A) sideróforo de hidroxamato: desferrioxamina; B) sideróforo de catecolato: enterobactina; C) sideróforo de carboxilato: vibrioferrina y D) sideróforo mixto: yersiniabactina. 1.3.2.2. Otras funciones. Además de la adquisición de hierro, los sideróforos realizan muchas otras funciones (Khan et al., 2018).  Regulación de otras biomoléculas: son responsables de la “teledetección”, es decir, percibir y mediar la respuesta con respecto a la concentración de hierro en la “vecindad” de microrganismos. Esto se debe a que los sideróforos participan en la inducción de una respuesta genética en la unión del ligando (Roux et al., 2009). Este mecanismo, por ejemplo, se ha observado en Pseudomonas aeruginosa que secreta dos sideróforos principalmente, pioverdina y piochelina. La pioverdina se autorregula su propia producción, así como también controla la producción de factores de virulencia exotoxina A y la proteasa PrpL, considerándose la pioverdina una molécula con una señalización diversificada (Lamont et al., 2002).  Interacción cooperativa: esta co-operación se observa ampliamente entre sideróforos de Pseudomonas (Luján et al., 2015). Se compararon la cepa silvestre con una cepa mutante pvdL no productora de sideróforos, cuando se cultiva un monocultivo, la tasa de productores se registró más alta que la de no productores, pero cuando se realizó un co-cultivo la tasa de crecimiento de los no productores aumento significativamente. Estos resultados indican el efecto de las interacciones sobre la evolución de la producción de sideróforos.  Tolerancia al estrés oxidativo: ampliamente es sabido que los microrganismos productores de sideróforos reducen el estrés oxidativo. Un buen ejemplo es la enterobactina, durante el estrés oxidativo el aumento de expresión de enterobactinas Capítulo I: Introducción - 10 - alivia y contrarresta el efecto represivo del hierro ya que reduce la sensibilidad frente a los factores de estrés oxidativo peróxido de hidrogeno y paracuato (Peralta et al., 2016).  Virulencia: el hierro juega un papel importante en los procesos metabólicos de patógenos. En humanos, los patógenos séricos tienen que adquirir hierro unido a transferrina, ferritina y hemoglobina, por lo tanto, los quelantes como el sideróforo resultan esenciales por su virulencia. En un estudio realizado por Fetherston y col. (Fetherston et al., 2010) demostraron que la pérdida del sistema de sideróforo yersiniabactina en Yersinia pestis provocaba una reducción de la virulencia de más de 4,3 x 105 veces cuando se infecta por vía subcutánea en ratones. 1.3.2.3. Aplicaciones.  Remediación frente a metales pesados y tóxicos. La cepa Streptomyces tendae F4 produce un sideróforo hidroxamato que mejora la absorción de hierro y cadmio en plantas de girasol, promoviendo el crecimiento vegetal (Dimkpa et al., 2009). Otro ejemplo es el sideróforo delftibactina que es secretado por una bacteria que vive en el oro, Deftia acidovorans, es la encargada de formar nanopartículas de oro y se ha demostrado que media la protección a la toxicidad del oro mediante este metalóforo (Wyatt et al., 2014).  Antibiótico “Caballo de Troya”: complejos lábiles de hierro se combinan con ligandos similares a sideróforos bacterianos se pueden intercalar en el ADN provocando su fragmentación en Staphylococcus aureus (Boda et al., 2016). Este enfoque puede resultar útil en el tratamiento de patógenos MRSA (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina), siendo una combinación de dirección de ADN e imitación de sideróforos. Los ligandos conjugados con hierro pueden desplegarse como Caballo de Troya para la entrada de antimicrobianos en bacterias patógenas.  Posible papel contra el cáncer: es un hecho bien estudiado que, debido a la rápida proliferación de las células cancerosas, requieren una concentración de hierro más alta que las células normales. Existe una relación entre la sobrecarga de hierro y la progresión del cáncer (Huang, 2003). Recientemente, el uso de ciertos quelantes de hierro como los sideróforos se ha visto que disminuye el crecimiento de células cancerosas (Nakouti et al., 2013). Por ejemplo, las deferoxaminas disminuyen la progresión de tumores agresivos en pacientes con neuroblastoma. También la desferoxamina E actúa como compuesto citotóxico que reduce la viabilidad celular e induce la apoptosis en células malignas de melanoma. Capítulo I: Introducción - 11 -  Siderotipado: la tipificación de sideróforos se puede utilizar para clasificar organismos según el tipo de sideróforos que producen utilizando métodos como el enfoque isoeléctrico, detección de inmunotransferencia, etc. Cepas de Pseudomonas aeruginosa se han agrupado en tres grupos de productores y de no productores de sideróforos (Meyer et al., 1997). 1.4. Mecanismos para el control de la homeostasis del hierro. Como se ha visto en los apartados anteriores, las bacterias poseen multitud de mecanismos para la importación de hierro, y, por otra parte, elevadas concentraciones de hierro en el citoplasma celular provocan toxicidad. Teniendo en cuenta que en bacterias no se han descrito bombas de excreción para este elemento (Ratledge and Dover, 2000), las bacterias tienen que regular los mecanismos de captación de este elemento a través de la membrana. Así pues, no sólo se regula la incorporación sino también el metabolismo del hierro en general. Un mecanismo para el control de la homeostasis del hierro es la presencia o ausencia de este elemento. Por ejemplo, en presencia de elevadas concentraciones extracelulares de Fe3+ el sistema sensor-regulador de dos componentes, PmrA/PmrB en Salmonella entérica se activa. El sensor de membrana histidina quinasa PmrB interacciona con el Fe3+ y fosforila al regulador PmrA, que induce genes involucrados en la modificación del lipopolisacarido. De esta forma Salmonella previene la actividad antimicrobiana del Fe3+ (Kox et al., 2000; Chamnongpol et al., 2002; Khan et al., 2018). Hay evidencias que a nivel postraduccional, algunas aconitasas bacterianas (enzima del ciclo TCA que contiene complejo [4Fe-4S]), cuando los niveles de hierro son bajos, esta pierde el complejo hierro-azufre y ya no funciona como una aconitasa. En su lugar se comporta como una proteína de unión a ARNm que reconoce específicamente a reguladores de Fe y puede inhibir su traducción o estabilizar al mensajero (Tang and Guest, 1999). Otro mecanismo de regulación implica factores sigma específicos con funciones extracitoplasmáticas (ECF) que normalmente se encuentran asociados con factores antisigma unidos a membrana. Una señal extracitoplasmáticas libera al ECF de la inhibición por el antisigma de manera que puede haber transcripción de los operones diana (Helmann, 2002; Otero-Asman et al., 2019; Jochim et al., 2020). Por último, la homeostasis del hierro puede ser controlada por diversos reguladores transcripcionales que, en la mayor parte de los procariotas, pertenecen a dos familias de proteínas represoras dependientes del hierro conocidas como Fur (Ferric Uptake Regulator) y DtxD (Diphteria Toxin Represor). En este trabajo nos vamos a centrar en la proteína Fur que ejerce un control transcripcional sobre casi todos los genes implicados en el transporte e Capítulo I: Introducción - 12 - incorporación de dicho metal en función de la concentración intracelular existente y también sobre otros sistemas no vinculados directamente con el metal (Tsolis et al., 1995) 2. La proteína Fur (Ferric Uptake Regulator) A finales de los años 70 se describió por primera vez la existencia de una cepa de Salmonella typhimurium portadora de una mutación que le permitía expresar de manera constitutiva genes cuya expresión estaba asociada únicamente a estrés férrico en la cepa silvestre. Esto sugería que la mutación afectaba a un gen responsable de la regulación de dichos genes en respuesta a los niveles de hierro extracelulares. A este gen se le denominó fur (Ferric Uptake Regulator) (Ernst et al., 1978). No fue hasta principios de los años 80 cuando se consiguió clonar e identificar el gen fur aislando mutantes de E. coli K12 con un comportamiento similar (Hantke, 1981) y hasta 1988 no se purificó la primera proteína Fur en E. coli k12 (Wee et al., 1988). Esta proteína Fur es una subclase dentro de la superfamilia del mismo nombre. La familia Fur tiene una gran diversidad en la selección del metal y en la función biológica, que incluye además de sensores para el hierro (Fur), sensores para el zinc (Zur), manganeso (Mur) y níquel (Nur). Otros miembros están relacionados con la respuesta el estrés por peróxido (PerR) y por la disponibilidad del hierro (Irr) (Lee and Helmann, 2007; Fillat, 2014). 2.1. Estructura de la proteína Fur. La proteína Fur es un homodímero formado por dos subunidades de 17-21 KDa aproximadamente (Bags and Neilands, 1987; Martin-Luna et al., 2006). Fur se une específicamente como un dímero a secuencias palindrómicas ricas en A/T que se encuentran en los promotores de sus genes diana utilizando un cofactor metálico como co-represor (Figura 6A) (Lee and Helmann, 2007; Fillat, 2014) . La coordinación con el co-represor produce un cambio conformacional del regulador que promueve y estabiliza su interacción con el ADN. El plegamiento de la proteína (una longitud media de 120 aminoácidos) da lugar a dos dominios bien diferenciados, un dominio de unión a ADN en el extremo N-terminal con un motivo helixturn-helix y un dominio que contiene un sitio regulador de unión a metales que se localiza en el extremo C-terminal de la proteína y que también permite la dimerización (Fillat, 2014; Kaushik et al., 2016). La primera imagen detallada de los dos dominios se consiguió en Pseudomonas aeruginosa con la publicación de la estructura cristalográfica de la proteína Fur (Figura 5) (Pohl et al., 2003). Capítulo I: Introducción - 13 - Figura 5. Diagrama de la estructura cristalográfica del dímero de Fur en P. aeruginosa con elementos secundarios anotados. A) vista perpendicular; B) vista general. Los dominios de unión a ADN están representados en azul y el dominio de unión a metal en verde (Pohl et al., 2003). Por lo general, al principio del dominio de dimerización tienen un motivo rico en histidina HHHXHX2 – CX2-C, después de una región bisagra presente entre el dominio de unión a ADN y el dominio C-terminal. En la mayoría de los casos, la primera X de la secuencia consenso corresponde a un residuo de aspártico, aunque es menos conservado que el dominio rico en histidina. Hay un segundo motivo CXXC cerca del dominio C-terminal que se da en algunos Fur, pero presente en todos los Zur y PerR (Fillat, 2014). 2.2. Sitios de unión al ADN de la proteína Fur (Cajas Fur). Al principio se pensaba que las proteínas Fur reconocían y se unían a una secuencia consenso altamente conservada que consistía en repeticiones invertidas de 19 pb localizadas corrientes arriba de la región promotora de los genes de respuesta a hierro en procariotas (5 - GATAATGATAATCATTATC-3) (Figura 6A y B) (Calderwood and Mekalanos, 1988; Stojiljkovic et al., 1994). Otro modelo demostrado es el de la Figura 6C, que consiste en un tándem de tres hexámeros (5 -GATAAT-3) con una unidad de reconocimiento de Fur (5 - NAT (A / T) AT-3) (Escolar et al., 1998). Nuevas propuestas revisadas justifican el solapamiento entre dímeros y explican su disposición a lo largo del ADN. Este nuevo modelo propone que la secuencia consenso se compone de motivos solapantes de 13 pb distribuidos como 6-1-6 en E. coli (Figura 6D izquierda) (Lavrrar et al., 2002; Lavrrar and McIntosh, 2003). Más tarde demostraron que el sitio de unión a Fur es en realidad una región central de 15 pb formada por motivos heptámeros 7-1-7 (Figura 6D izquierda). En Anabaena sp. PCC7120, se observaron secuencias consenso conteniendo repeticiones invertidas 7-1-7 (Napolitano et al., 2012). Las cajas Fur están generalmente caracterizadas por la presencia de una región rica en AT. Se han encontrado numerosas cajas Fur ricas en AT en diferentes bacterias que comparten una similitud de 50-80% con la secuencia consenso de E. coli (Baichoo and Helmann, 2002; Fillat, Capítulo I: Introducción - 14 - 2014). Las variaciones entre las cajas Fur fueron debido a la adicción de secuencias a la secuencia basal (GATTAT) que alteran la afinidad y polimerización de los homólogos Fur a las cajas Fur (Fillat, 2014). Figura 6. Sitios de unión de la proteína Fur. A) Secuencia consenso de 19 pb del sitio de unión de Fur en E. coli; B) Modelo de unión clásico. Se muestra cada monómero uniéndose a una secuencia de 9 pb repetida e invertida (señalada con flechas), con un par de bases A:T en medio; C) Modelo hexamétrico, la unidad de reconocimiento es la secuencia 5´-GATAAT-3´. Se ha sugerido que cada hexámero es reconocido por un solo dímero y D) Modelo de unión con dímeros solapados. Cada monómero se une a un hexámero invertido, se requerirían dos dímeros para unirse a la secuencia consenso de 19 pb. Las pares de bases C:G espaciadores se muestran en negrita. A la derecha modelo 7-1- 7 descrito en Bacillus subtulis. 2.3. Mecanismos de regulación mediados por Fur. La proteína Fur es muy abundante en la célula, de hecho, incluso en abundancia de hierro los niveles de Fur son altos, y en condiciones de estrés férrico la concentración de Fur se mantiene o aumenta ligeramente (Watnick et al., 1997). Esto da idea de la complejidad y rigurosidad de los mecanismos de regulación mediados por Fur. El modelo más habitual propone que la proteína Fur es un apo-represor que requiere la unión del ion metálico como co-represor (Figura 7). El complejo Fur-Fe2+ en forma de dímero se une a las cajas Fur, esta unión impide el acceso físico de la ARN polimerasa y con ello la transcripción de los genes. Por el contrario, en condiciones de baja disponibilidad de hierro, Fur en forma de apo-proteína no es capaz de unirse a sus secuencias dianas permitiendo así que la ARN polimerasa lleve a cabo la transcripción (Escolar et al., 1998; Carpenter et al., 2009). Capítulo I: Introducción - 21 - biosintéticas. Ésta es la estrategia más utilizada por la mayoría de los procariotas debido a su mayor versatilidad de adaptación al medio externo, simplemente regulando la concentración interna de estos osmolitos para equilibrar la presión osmótica extracelular. Así, es la utilizada por las bacterias halófilas moderadas y marinas, las halotolerantes, algunas arqueas metanógenas halófilas moderadas, e incluso algas, levaduras, hongos, plantas y células humanas (Welsh, 2000; Wood et al., 2001; Sleator and Hill, 2002; Roberts, 2005). Además, las bacterias halófilas requieren de moderadas a elevadas concentraciones salinas para su crecimiento, siendo su hábitat natural los ambientes hipersalinos (Ventosa et al., 1998). 4. Solutos compatibles: las ectoínas. Los solutos compatibles son moléculas multifuncionales que se acumulan en la mayoría de los organismos en respuesta al estrés abiótico (sobre todo la elevada salinidad y elevadas temperaturas) y que son capaces de estabilizar la estructura de las proteínas celulares, pero sin interferir con el metabolismo celular, actuando así como chaperonas químicas (Welch and Brown, 1996). Por ello se denominan solutos “compatibles” o también “bioestabilizadores”. La naturaleza de los solutos compatibles puede ser muy variada, pero principalmente son azúcares, polioles y heterósidos, - y β-aminoácidos y sus derivados, diaminoácidos N- acetilados, compuestos de trimetilamonio, aminas cuaternarias (betaína) o tetrahidropirimidinas (ectoínas) (da Costa et al., 1998) (Figura 13). Entre ellos, destacan especialmente por su multifuncionalidad el disacárido trehalosa y las ectoínas (Santos and Da Costa, 2002; Yancey, 2005). Generalmente, la mayoría de las bacterias acumulan más de un tipo de soluto compatible como estrategia para poder afrontar las diferentes agresiones ambientales. Figura 13. Estructura química de algunos de los principales solutos compatibles Las ectoínas son, junto con la betaína, los solutos compatibles mayoritarios acumulados por las bacterias Gram positivas halófilas moderadas y halotolerantes (Galinski, 1995). El término ectoínas engloba a dos compuestos tetrahidropirimidínicos cíclicos: la ectoína (ácido Capítulo I: Introducción - 22 - 1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidinocarboxílico) y su derivado hidroxilado, la hidroxiectoína (ácido 1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroxi-2-metil-4-pirimidinocarboxílico) (Figura 13). La ectoína fue descrita inicialmente en la bacteria purpúrea halófila fotosintética Halorhodospira halochloris (anteriormente Ectothiorhodospira halochloris, de donde proviene el nombre ectoína) (Galinski et al., 1985), mientras que la hidroxiectoína fue descubierta en el productor de actinomicina D, Streptomyces parvulus (Inbar and Lapido, 1988). Por otro lado, muchas bacterias incapaces de sintetizarlas, como E. coli, B. subtilis y C. glutamicum, cuando están presentes en el medio provenientes de restos microbianos, pueden transportarlas y acumularlas a través de transportadores específicos (Welsh, 2000). En el caso de algunas bacterias como Sporosarcina pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002), C. salexigens (Cánovas et al., 1999; Calderón et al., 2004), Halomonas boliviensis (Guzmán et al., 2009) y H. elongata (Schwibbert et al., 2011), la síntesis de ectoína e hidroxiectoína está osmorregulada, produciéndose un aumento en la síntesis de estos solutos compatibles al aumentar la concentración salina del medio. Además, la síntesis de estos solutos puede estar también termorregulada. En el caso de Vibrio anguillarum, se produce un aumento de la síntesis de ectoína bajo estrés por frío (Ma et al., 2017), mientras que en C. salexigens (García-Estepa et al., 2006a) o en S. coelicolor (Bursy et al., 2008), se produce un aumento de la misma al aumentar la temperatura. Por otro lado, en el caso de Halobacillus halophilus, una elevada concentración salina conlleva la acumulación tanto de ectoína como de prolina durante el crecimiento celular, mientras que en la fase estacionaria tardía la cantidad de ectoína acumulada es muy superior a la de prolina (Saum and Müller, 2008). Además, es interesante destacar el papel como soluto compatible del Nγ-acetildiaminobutírico (NADA), que posee una estructura muy similar a la de la ectoína, ya que se trata de su inmediato precursor en la ruta biosintética. Su función termo- y osmoprotectora ha sido demostrada por nuestro grupo de investigación ((Cánovas et al., 1997b; Cánovas et al., 1999; García-Estepa et al., 2006b). Aunque la función principal de las ectoínas es servir como osmoprotectores o termoprotectores, ambos solutos compatibles también pueden servir como fuente de carbono y nitrógeno, tal y como se ha descrito en H. elongata (Schwibbert et al., 2011), C. salexigens (Vargas et al., 2006) o Ensifer meliloti (Jebbar et al., 2005). Por otro lado, las ectoínas son los solutos compatibles que han mostrado mejores propiedades estabilizantes, protegiendo eficazmente a proteínas, ácidos nucleicos, membranas, e incluso células enteras, frente al estrés por el calor, la congelación, la desecación, la elevada salinidad, los radicales de oxígeno, las radiaciones, presencia de urea y otros agentes desnaturalizantes (da Costa et al., 1998; Lentzen and Schwarz, 2006). Se ha descrito que la hidroxiectoína presenta unas propiedades adicionales, tales como la protección frente a la desecación y a ambientes ácidos ricos en metales pesados Capítulo I: Introducción - 23 - (García-Estepa et al., 2006a; Tanne et al., 2014; Moritz et al., 2015), entre otras. Además en estudios realizados in vitro la hidroxiectoína mostró un mayor efecto protector de macromoléculas y células que la ectoína (Manzanera et al., 2002; Manzanera et al., 2004a; Van- Thuoc et al., 2013). 4.1. Potencial biotecnológico de las ectoínas. De acuerdo con las propiedades descritas, las ectoínas poseen numerosas aplicaciones con interés comercial, tanto reales como potenciales, para su uso en Medicina, Cosmética o Biología Molecular. De hecho, actualmente existen más de 200 productos cosméticos en el mercado que contienen ectoína, debido principalmente a su efecto beneficioso para la piel (www.bitop.de; www.ectoin.net). Algunos factores externos como la radiación, el viento, humedad y temperaturas extremas conducen a un envejecimiento de ésta. Así, la ectoína protege a la piel de estos factores de estrés que provocarían la deshidratación de la misma (Pastor et al., 2010). Por otro lado, también se incluyen en soluciones estabilizadoras para la protección de enzimas y otras macromoléculas utilizadas en ensayos de laboratorio (Lippert and Galinski, 1992; Van-Thuoc et al., 2013). Además, es interesante su utilización como bioestabilizadores en procesos biotecnológicos en los que las enzimas sufren procesos desnaturalizantes o están sometidas a altas temperaturas (Harishchandra et al., 2010; Bownik and Stȩpniewska, 2016; Zaccai et al., 2016; Meyer et al., 2017; Salmannejad and Nafissi-Varcheh, 2017) Hace unos años, nuestro Grupo de investigación publicó una revisión sobre las múltiples aplicaciones que poseen las ectoínas (Pastor et al., 2010). Desde entonces, se han incrementado las investigaciones relacionadas con su potencial biomédico, tal y como se manifiesta en la Tabla 2. Efecto Compuesto Referencias Protección de macromoléculas Bloqueo del sitio de unión de las endonucleasas de tipo II en el ADN de plásmidos Hidroxiectoína (Malin et al., 1999) Disminución de la temperatura de fusión del ADN Ectoína (Lapidot et al., 1999) Estabilización de la lactoperoxidasa bovina Ectoína (Boroujeni and Nayeri, 2018) Capítulo I: Introducción - 24 - Efecto Compuesto Referencias Estabilización de recubiertas proteicas secas Ectoína, Hidroxiectoína (Killian et al., 2018) Estabilización del complejo LRP y H-NS en la regulación de la transcripción Ectoína (Pul et al., 2007) Incremento de la estabilidad y la temperatura de fusión de la ARNasa A Hidroxiectoína (Knapp et al., 1999) Mejora de la calidad del ADN en los microarrays Hidroxiectoína (Mascellani et al., 2007) Mejora de la fidelidad en la PCR Hidroxiectoína (Schnoor et al., 2004) Mejora la fluidez de membrana Ectoína (Harishchandra et al., 2010; Dwivedi et al., 2014) Optimización de las condiciones de cristalización de proteínas para cristalografía por rayos X Ectoína (Harjes et al., 2004) Protección de anticuerpos frente a la degradación proteolítica Ectoína (Bersch et al., 2000) Protección de enzimas frente al calor, la congelación y la desecación Hidroxiectoína, Ectoína (Lippert and Galinski, 1992; Van-Thuoc et al., 2013) Protección de inmunotoxinas frente al estrés descongelación/congelación Hidroxiectoína (Barth et al., 2000) Protección de la membrana celular frente a agentes surfactantes Ectoína (Bünger, 1999; Graf et al., 2008) Protección de LDH frente al calor, la urea y el estrés por congelación/descongelación Hidroxiectoína, Ectoína (Göller and A. Galinski, 1999) Protección de proteínas recombinantes frente a la degradación, agregación, desnaturalización y congelación Hidroxiectoína (Barth et al., 2000) Protección del ADN frente a radiaciones ionizantes Ectoína (Schröter et al., 2017) Protección del daño oxidativo de las proteínas (LDH) Hidroxiectoína (Andersson et al., 2000) Capítulo I: Introducción - 25 - Efecto Compuesto Referencias Protección frente a elevadas temperaturas Hidroxiectoína (Tanne et al., 2014) Termo estabilidad de la cianoficina sintetasa Ectoína (Hai et al., 2002) Termo estabilidad de la fitasa (90 °C) Ectoína (Zhang et al., 2006) Usos terapéuticos potenciales Estabilización de barrera intestinal para mejorar la enfermedad inflamatoria intestinal experimental Ectoína, Hidroxiectoína (Abdel-Aziz et al., 2013; Abdel-Aziz et al., 2015) Estabilización de vectores retrovirales para la terapia génica Hidroxiectoína (Cruz et al., 2006) Inhibición de la agregación inducida por calor del interferón Alpha2 recombinante Ectoína, Hidroxiectoína (Salmannejad and Nafissi-Varcheh, 2017) Inhibición de la agregación y la neurotoxicidad del betaamiloide en la enfermedad de Alzheimer Ectoína, Hidroxiectoína (Kanapathipillai et al., 2005) Inhibición de la agregación y la neurotoxicidad del prion 106-206 Ectoína (Kanapathipillai et al., 2008) Inhibición de la formación del amiloide de la insulina Ectoína (Arora et al., 2004) Inhibición de la unión in vitro de un péptido del tipo Tat al ARN TAR del virus VIH Hidroxiectoína (Lapidot et al., 1995) Inhibición migración células madre del tejido adiposo Hidroxiectoína (Thamm et al., 2015) Prevención de daño isquémico por frío en trasplantes Hidroxiectoína (Srinivasan et al., 2014) Prevención de los efectos de las nanopartículas de carbón Ectoína (Autengruber et al., 2014; Kroker et al., 2015) Protección de células neuronales frente a la toxicidad inducida por poliglutaminas en la enfermedad de Machado-Joseph Ectoína (Furusho et al., 2005) Protección de zimógenos frente a la proteólisis Ectoína (Kolp et al., 2006) Capítulo I: Introducción - 26 - Efecto Compuesto Referencias Protección del intestino frente a la isquemia y en la posterior reperfusión in vitro Ectoína (Wei et al., 2009; Pech et al., 2013) Protección frente a la inflamación neutrofílica de pulmón inducida por nanopartículas Ectoína (Sydlik et al., 2009) Recuperación de la apoptosis de neutrófilos en inflamación pulmonar Ectoína (Sydlik et al., 2013) Reducción de la inflamación pulmonar Ectoína (Unfried et al., 2016) Tratamiento contra faringitis y laringitis Ectoína (Müller et al., 2016) Tratamiento contra la rinitis alérgica y rinoconjuntivitis Ectoína (Eichel et al., 2014; Sonnemann et al., 2014) Efecto protector sobre células completas Criopotección de eritrocitos humanos Ectoína (El Assal et al., 2014) Crioprotección de células endoteliales y mesenquimales humanas Ectoína, Hidroxiectoína (Hofmann et al., 2015) Crioprotección de células mononucleares de cordón umbilical Ectoína, Hidroxiectoína (Bissoyi et al., 2014) Destoxificación de fenol en Halomonas Ectoína (Maskow and Kleinsteuber, 2004) Efecto promotor de la fermentación alcohólica en Zymomonas mobilis Ectoína (Zhang et al., 2008) Estabilización de E. coli durante la liofilización y el almacenamiento Ectoína, Hidroxiectoína (Louis and Galinski, 1997) Mantenimiento de la actividad respiratoria en E. coli in vivo Ectoína (Nagata et al., 2002) Mejora de la termo tolerancia en E .coli Hidroxiectoína (Malin and Lapidot, 1996) Osmoprotección de bacterias ácido lácticas Ectoína (Baliarda et al., 2003) Protección en la encapsulación de E. coli y P. putida Hidroxiectoína (Manzanera et al., 2004b) Capítulo I: Introducción - 27 - Efecto Compuesto Referencias Protección frente a elevadas temperaturas y tóxicos en Daphia magna Ectoína (Bownik et al., 2014; Bownik and Stępniewska, 2015) Protección frente a estrés por frío en Vibrio anguillarum Ectoína (0et al., 2017) Protección frente a la desecación en E. coli Hidroxiectoína (Manzanera et al., 2004a) Protección frente a la desecación en Pseudomonas putida Hidroxiectoína (Manzanera et al., 2002) Tolerancia a la sal en células de plantas de tabaco transformadas Ectoína (Moghaieb et al., 2006) Tolerancia a la sal en plantas de tabaco transformadas Ectoína (Nakayama et al., 2000) Protección de la piel Agente humectante in vivo de la piel humana Ectoína (Motitschke et al., 2014) Bloqueo de la formación de ceramidas inducida por rayos UVA en queratinocitos humanos Ectoína (Grether-Beck et al., 2005) Foto protección in vivo frente a la luz visible Ectoína (Botta et al., 2008) Inducción de las proteínas de shock térmico en queratinocitos humanos Ectoína (Buommino et al., 2005) Inhibición in vitro de las SBCs y protección in vivo de las células de Langerhans Ectoína (Bünger et al., 2001; Pfluecker et al., 2005) Inhibidor sobre la síntesis de melanina en las líneas celulares de melanoma B16-F0 y A2058 Ectoína (Yao et al., 2013) Protección anti-envejecimiento de la piel humana Ectoína (Heinrich et al., 2007) Protección anti-envejecimiento in vitro de la piel humana, protección del ADN mitocondrial e inhibición de la respuesta inflamatoria mediada por ceramidas Ectoína (Buenger and Driller, 2004) Capítulo I: Introducción - 28 - Efecto Compuesto Referencias Protección de las células de Langerhans frente a la luz UV Ectoína (Beyer et al., 2000) Protección in vivo frente a la deshidratación en la piel y en modelos in sillico Ectoína (Graf et al., 2008) Protección in vivo frente a la deshidratación de la piel por surfactantes Ectoína (Bünger, 1999) Tratamiento tópico de la dermatitis atópica Ectoína (Marini et al., 2014) Tabla 2. Propiedades de las ectoínas (modificado de Pastor et al., 2010). Tabla obtenida de la Tesis Doctoral de Rosa Mª García Valero. Entre las aplicaciones más interesantes de las ectoínas podemos destacar su potencial en Biomedicina. En relación a la ectoína, y debido a sus propiedades protectoras de la piel, se ha investigado su aplicación en cremas para pacientes con dermatitis atópica (Heinrich et al., 2007; Marini et al., 2014). Además, la ectoína posee propiedades antiinflamatorias (Buommino et al., 2005; Casale et al., 2019). También puede ser usada como una nueva estrategia para contrarrestar la inflamación pulmonar, ya que mediante la aplicación de ectoína se produce una recuperación de la apoptosis de los neutrófilos (Sydlik et al., 2013; Unfried et al., 2016; Müller et al., 2016). Asimismo, se ha descrito que la ectoína previene las respuestas inflamatorias asociadas con la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), utilizando la colitis como modelo (Abdel-Aziz et al., 2013; Abdel-Aziz et al., 2015). Otras aplicaciones de la ectoína son su uso en aerosoles nasales o gotas para los ojos contra la rinitis alérgica (Sonnemann et al., 2014; Werkhäuser et al., 2014), y en aerosoles nasales para la rinosinusitis aguda (Eichel et al., 2013; Eichel et al., 2014; Mösges et al., 2017; Dao et al., 2019; Tran et al., 2019). Otra de las propiedades interesantes de cara al uso de la ectoína en biomedicina es su actividad antioxidante (Lentzen and Schwarz, 2006). De hecho, se ha descrito en estudios in vitro que la ectoína reduce la hemólisis y el estrés oxidativo inducido por toxinas Hlya (alfahemolisina) provenientes de Staphylococcus aureus (Bownik and Stępniewska, 2015). Por último, recientemente se han desarrollado poligeles de ectoína (Poly(ectoine) hydrogels), con propiedades prometedoras para ser usado como biomaterial (Jain et al., 2017). La hidroxiectoína, por su parte, protege frente a la desecación, tiene propiedades antioxidantes, y se ha propuesto como agente crioprotector de células e incluso tejidos y órganos (Pastor et al., 2010). Capítulo I: Introducción - 29 - El posible uso de ambas ectoínas en enfermedades neurodegenerativas humanas se está estudiando actualmente este grupo de investigación. Este potencial se deriva no solo de su capacidad antiagregante (Kanapathipillai et al., 2005; Pastor et al., 2010; Jorge et al., 2016), sino también por la combinación de propiedades antioxidantes e inhibidoras de la respuesta inflamatoria (Buommino et al., 2005), lo que les da un gran valor añadido como potenciales productos biofarmacéuticos para el tratamiento o prevención de este tipo de enfermedades. 4.2. Producción biotecnológica de las ectoínas Dado el gran potencial biotecnológico de estas moléculas, es de gran interés el estudio sobre su síntesis y producción. Hasta mediados de los noventa no se desarrolló ningún método de producción biotecnológica de ectoínas lo suficientemente eficiente para su explotación comercial. Hasta esa fecha, éstas eran obtenidas principalmente por síntesis química (Koichi et al., 1991). Sin embargo, debido a su naturaleza quiral y a la necesidad de precursores muy preciados como el ácido diaminobutírico, la síntesis química a gran escala no era competitiva. Como alternativa, éstas se extraían de los microorganismos productores pero en bajas cantidades (Sauer and Galinski, 1998). El primer proceso de producción biotecnológica de ectoínas a nivel industrial, denominado “bacterial milking”, fue patentado por la firma alemana bitopAG (DE4244580-A), utilizando el microorganismo H. elongata, por su amplio rango salino de crecimiento y aprovechando su gran capacidad de excreción de ectoínas al cambiar la osmolaridad del medio, así como su alto porcentaje de síntesis de éstas al retornar a un medio con alta concentración de sales (Galinski and Trüper, 1994; Lentzen and Schwarz, 2006). En los últimos años, se han desarrollado otras estrategias para su producción biotecnológica a gran escala, optimizando procesos de fermentación discontinuos con limitación de nutrientes (“fedbatch”) (Kunte et al., 2014). Actualmente H. elongata es el microorganimo de elección para la producción a nivel industrial de ectoína, mientras que algunas cepas del género Marinococcus se emplean para la producción de hidroxiectoína (Schiraldi et al., 2006; Pastor et al., 2010). Sin embargo, en los últimos años también se han investigado y desarrollado otros productores bacterianos alternativos para mejorar la producción o hacerla más competitiva. En la Tabla 3 se muestra un resumen de los principales microorganismos productores descritos para la producción de ectoína e hidroxiectoína, los cuales se pueden clasificar en dos grupos: productores naturales (halófilos) y productores heterólogos (no halófilos, en gris). Capítulo I: Introducción - 30 - Microorganismo Producto Referencia Bacillus pasteurii Ectoína (Kuhlmann and Bremer, 2002) Corynebacterium glutamicum Ectoína (Becker et al., 2013; Pérez-García et al., 2017; Gießelmann et al., 2019) Chromohalobacter salexigens DSM3043 Ectoína/Hidroxiectoína (Fallet et al., 2010; Salar-García et al., 2017) C. salexigens DSM30431 Ectoína/Hidroxiectoína (Rodríguez-Moya et al., 2013a) Escherichia coli BL21 Ectoína (Parwata et al., 2019) E. coli DH5α Ectoína (Schubert et al., 2007; Bestvater et al., 2008) E. coli DH5α Hidroxiectoína (Seip et al., 2011) E. coli FF4169 Hidroxiectoína (Czech et al., 2016) Halomonas boliviensis DSM15516 Ectoína/Hidroxiectoína (Van-Thuoc et al., 2010) H. elongata DSM142 Ectoína (Sauer and Galinski, 1998) H. elongata DSM1421 Ectoína (Schwibbert et al., 2011; Tanimura et al., 2013) H. hydrothermalis1 Ectoína (Zhao et al., 2019) H. salina BCRC 17875 Ectoína (Chen et al., 2018) H. salina BCRC 17875 Hidroxiectoína (Chen et al., 2019) H. salina DSM 5928 Ectoína (Zhang et al., 2009; Lang et al., 2011) Marinococcus M52 Hidroxiectoína (Frings et al., 1995; Schiraldi et al., 2006) M. sp.ECT1 Ectoína (Wei et al., 2011) Methylomicrobium alcaliphilum Ectoína (Cantera et al., 2020) Nitrosopumilus maritimus Ectoína/Hidroxiectoína (Widderich et al., 2016) Capítulo I: Introducción - 37 - et al., 2006a; Reina-Bueno, 2010). Además, se ha propuesto una ruta alternativa para la síntesis de hidroxiectoína a partir del N--acetildiaminobutírico NADA (Cánovas et al., 1999) (Figura 15B). En C. salexigens, la síntesis de ectoína a partir de la glucosa en medio mínimo es máxima a NaCl 2,5 M y 37°C, mientras que la de hidroxiectoína se produce a NaCl 2,5 M y 45°C (García-Estepa et al., 2006a). Figura 15. Genética y ruta biosintética de los solutos compatibles ectoína e hidroxiectoína en C. salexigens. A) Organización genética de los diferentes clústeres de biosíntesis de ectoína e hidroxiectoína en C. salexigens DSM 3043. Los promotores se muestran con flechas. B) Ruta de síntesis de ectoína e hidroxiectoína. Modificación de Pastor y colaboradores (Pastor et al., 2010). El espacio delimitado con línea discontinúa señala la posible vía de síntesis alternativa de hidroxiectoína a partir del intermediario NADA. Catabolismo y ciclo de reciclado de ectoínas. Las ectoínas no son únicamente utilizadas para mantener el equilibro osmótico, sino que además pueden ser utilizadas como fuente de carbono o nitrógeno en ausencia de estos compuestos en el medio. Esto implica la existencia de una ruta de degradación para convertirlas Capítulo I: Introducción - 38 - en compuestos que funcionen como nutrientes para la célula (Vargas et al., 2006). En E. meliloti (antes Sinorhizobium meliloti) se describieron por primera vez una serie de genes, denominados eutABCDE, que intervienen en la ruta de degradación de ectoínas, así como los genes doeCDX, situados en otro marco de lectura (Schwibbert et al., 2011), siendo doeX un regulador transcripcional de tipo GntR. E. meliloti no ha sido el único microorganismo en el que se encuentran estos genes. Tanto en C. salexigens como en H. elongata existen ortólogos de los genes eutBCDE y doeCDX, aunque, a diferencia de E. meliloti, en estos dos microorganismos no se encuentra el homólogo a eutA, y los genes eutD y eutE se denominaron doeA y doeB, respectivamente. Esta denominación se extiende a C. salexigens (Figura 16A) (Schwibbert et al., 2011). La comparación de las secuencias de proteínas que codifican estos genes de degradación de ectoínas en estos tres organismos indica que éstas guardan una estrecha relación, ya que los tres poseen los genes doeABCD y eutCB, lo que lleva a pensar que las rutas de degradación entre dichos microorganismos son parecidas. La implicación de estos genes en una ruta de catabolismo de ectoína se ha comprobado experimentalmente en H. elongata (Figura 16B) (Schwibbert et al., 2011). Además, se ha comprobado que esta ruta de degradación no sólo se puede emplear para el uso de la ectoína como fuente de carbono y nitrógeno, sino que también permite mantener el equilibrio de la concentración de ectoína intracelular, a través de una parte de la ruta en la que están implicados los genes doeA y doeB. Las enzimas codificadas por estos genes, junto con las enzimas de síntesis de ectoína (EctA y EctC), forman un ciclo fútil o de reciclado que es utilizado para controlar un ajuste fino de la concentración celular de ectoínas en respuesta a las diferentes condiciones ambientales (Figura 16B) (Schwibbert et al., 2011; Salvador et al., 2018). Recientemente, se ha demostrado en Ruegeria pomeyori que los genes eutABC participan en una ruta de catabolismo de hidroxiectoína que se conecta con la de ectoína a través de la producción de N-α-Acetil-L-2,4-diaminobutirato. Se ha propuesto que, para ello, en primer lugar, la hidroxiectoína (5-(S)-hidroxiectoína), a través de la racemasa EutA, sufre una inversión estérica del grupo hidroxilo convirtiéndose en el enantiómero 5-(R)-hidroxiectoína. Seguidamente, se produciría la eliminación del grupo hidroxilo de dicho enantiómero a través de EutB (una enzima PLP dependiente similar a las threonina dehidratasas), obteniendo el compuesto 2-methil-4,5-dihidropirimidine-6-carboxilato. Finalmente, éste se reduciría a ectoína a través de EutC, una enzima perteneciente a la familia de las ornitina ciclodeaminasas, a través de una reducción NADH-dependiente (Schulz et al., 2017) (16B). Tanto en H. elongata como en C. salexigens se han encontrado ortólogos a dichos genes, con excepción del gen eutA (Vargas et al., 2006; Schwibbert et al., 2011; Piubeli et al., 2018), lo que indica la existencia de esta ruta en estos dos microorganismos, aunque quizá con alguna diferencia. Esta hipótesis se ha Capítulo I: Introducción - 39 - corroborado recientemente en C. salexigens, ya que un mutante en el gen eutC es incapaz de crecer cuando la hidroxiectoína es la única fuente de carbono (Argandoña et al., resultados sin publicar). Figura 16. Genética y rutas metabólicas implicadas en el reciclado o utilización como nutrientes de las ectoínas. A) Organización genética del cluster de catabolismo/reciclado de ectoína e hidroxiectoína en E. meliloti SM11, R. pomeroyi DSS-3, H. elongata DSM 258 y C. salexigens DSM 3043. B) Rutas de síntesis y catabolismo/reciclado de ectoína e hidroxiectoína en H. elongata/R. pomeyori. En verde las enzimas implicadas en el catabolismo de ectoínas; en naranja las enzimas implicadas en la síntesis de ectoínas; en azul enzimas implicadas en la síntesis de precursores de la ectoína. En gris se señala el ciclo fútil o de reciclado de ectoínas. Modificada de Schwibbert et al. 2011 y Schulz et al. 2017. En C. salexigens, se ha observado que el catabolismo de las ectoínas varía con la salinidad. Así, en presencia de ectoína como única fuente de C, se ha observado que el microorganismo es incapaz de crecer en condiciones de baja salinidad (0,75 M de NaCl), mientras que el crecimiento es óptimo a NaCl 1,5 M, disminuyendo a salinidades mayores (NaCl 2,5 M). También se ha observado que a salinidad óptima (1,5 M de NaCl), la ectoína es mejor fuente de C que la hidroxiectoína (Vargas et al., 2006). Recientemente, se ha observado mediante análisis de RNAseq que, cuando la glucosa es la única fuente de C, a elevada salinidad se produce una Capítulo I: Introducción - 40 - sobreexpresión de los genes de degradación de ectoína e hidroxiectoína en C. salexigens, indicando que estos genes siguen activos en condiciones no catabólicas, posiblemente por su implicación en el ciclo de reciclado (Salvador et al., 2018). Además, se ha observado que existe una regulación por temperatura, ya que los genes doeB, doeC, y doeD se inhiben en condiciones de elevada salinidad y temperatura (Salvador et al., 2018). 5.1.3. Adaptación metabólica de C. salexigens. En C. salexigens, la producción de ectoínas es una ruta osmorregulada y además está conectada con las rutas metabólicas centrales mediante el drenaje metabólico de intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT). La ruta biosintética de la ectoína comienza con la fosforilación del L-aspartato y consume oxaloacetato (OAA) y acetil-CoA. Este último se produce por la descarboxilación oxidativa del piruvato vía piruvato deshidrogenasa (Pdh) (Figura 17). No es de extrañar, pues, que el metabolismo de C. salexigens esté adaptado para suplir los requerimientos de dichos intermediarios. El metabolismo central de C. salexigens ha sido analizado en profundidad, comprobándose que la salinidad influye en el consumo de glucosa y en la producción de biomasa (Pastor et al., 2013a). Así, el coeficiente estequiométrico de consumo de glucosa es mucho más alto a baja salinidad, mientras que la producción de biomasa es menor, lo que sugiere que el metabolismo es ineficiente en condiciones de baja salinidad. Dicha ineficiencia se refleja en la aparición de un metabolismo de desbordamiento u “overflow”, en esas condiciones. Esta pérdida de flujo de carbono puede deberse a precisamente a la existencia de un catabolismo limitado o ineficiente de glucosa a baja salinidad, lo que conlleva a una excreción de ácidos orgánicos, como acetato, piruvato y lactato. Esta excreción de metabolitos se produce a lo largo de la fase exponencial del crecimiento y, curiosamente, éstos no son consumidos hasta que los niveles de glucosa extracelular son mínimos. A diferencia de E. coli, C. salexigens utiliza la vía Entner-Doudoroff (ED) en lugar de la vía glucolítica estándar para el catabolismo de la glucosa, ya que esta bacteria carece de la enzima fosfofructoquinasa (Pfk). En esta vía, también descrita en otras proteobacterias como P. putida (Del Castillo et al., 2007) o Gluconobacter oxydans (Hanke et al., 2013), la glucosa se oxida a gluconato-6P a través de D-glucono-1, 5-lactona, bien a través de una vía oxidativa o bien a través de una vía fosforilativa. En la primera, intervienen las enzimas Glucosa deshidrogenasa (Gdc) o Glucosa deshidrogenasa dependiente de quinonas (Gdcq) y Gluconolactonasa (Glcnl) y existen dos variantes, la variante periplásmica y la variante citoplásmica. En la periplásmica, se produce gluconato en el periplasma a partir de la oxidación de la glucosa (Figura 17) y posteriormente, el gluconato producido es transportado al citoplasma a través de un Capítulo I: Introducción - 41 - transportador GntP, y fosforilado por GnuK, obteniéndose gluconato-6P. En la variante citoplásmica, la glucosa es transportada al citoplasma y allí oxidada hasta gluconato y posteriormente también éste es fosforilado por GnuK, para obtener gluconato-6P. En la vía fosforilativa, no se produce gluconato, sino que la glucosa captada por C. salexigens, es oxidada a gluconato-6P, a través de la acción conjunta de la Glucoquinasa (Glk), la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Zwf) y la 6-fosfogluconolactonasa (Pgl) (Pastor et al., 2013a) (Figura 17). Nuestro grupo de investigación ha analizado la producción de gluconato extracelular en ambas salinidades, observándose su perfil a lo largo de la curva de crecimiento. A baja salinidad (NaCl 0,6 M) este metabolito se produce al principio de fase exponencial y es consumido a lo largo de dicha fase de crecimiento. Esta producción y consumo de gluconato extracelular a lo largo de la curva de crecimiento también se observó a elevada salinidad (NaCl 2,5 M), aunque la concentración máxima observada fue menor. Estos resultados sugieren que parte de la glucosa es asimilada vía oxidación a gluconato, ya sea citoplásmica o periplásmicamente, tal y como se ha descrito en P. putida (Del Castillo et al., 2007) o G. oxidans (Hanke et al., 2013), pero en mayor o menor cantidad en función de la salinidad. El balance redox de la ruta de ED puede ser diferente, dependiendo de si la glucosa es oxidada en el citoplasma por la ruta fosforilativa o en el periplasma por la ruta no fosforilativa. En el primer caso se produce un NADPH y un NADH, y en el segundo se forma únicamente un NADH y una quinona reducida. Así, parece ser que en condiciones de elevada salinidad tiene lugar una mayor oxidación citoplasmática, posiblemente para favorecer una mayor síntesis de ectoínas, ya que una oxidación citoplasmática satisface los requerimientos de poder reductor necesarios para una mayor síntesis de ectoínas en esas condiciones (Pastor et al., 2013a). La síntesis de ectoínas consume 3 equivalentes de NADPH, y las rutas catabólicas de la glucosa deben proveer no sólo el esqueleto carbonado sino además los equivalentes de reducción necesarios. La existencia de varias vías alternativas para la metabolización de la glucosa con diferentes balances redox, podría permitir al microorganismo un control de la velocidad de producción de equivalentes de reducción y un ajuste fino de su estado redox para maximizar el crecimiento y la biosíntesis de ectoínas. Además, el patrón de marcaje de las ectoínas que se obtuvo tras cultivar a las células en presencia de glucosa -(1-13C), -(2-13C) y -(U-13C6), corrobora la hipótesis de que C. salexigens utiliza la ruta ED, pero no la ruta Embden-Meyerhof-Parnas o (EMP) o glucólisis, para la producción de piruvato a partir de glucosa, produciéndose a partir de dicho piruvato el acetil-CoA y el oxaloacetato necesario para la biosíntesis de ectoína. Recientemente, se ha comprobado que a baja salinidad el crecimiento de C. salexigens es más eficiente en presencia de fructosa en lugar de glucosa, no observándose metabolismo Capítulo I: Introducción - 42 - "overflow", lo que sugiere una adaptación más eficiente de las vías ED y EMP a la asimilación de fructosa, en comparación con la glucosa, en estas condiciones (Pastor et al., 2019). Figura 17. Esquema del metabolismo central y síntesis de ectoínas en C. salexigens basado en el genoma anotado. Se proponen vías que conducen de la glucosa al gluconato de 6-P (6PGln) en la comparación del análisis in sillico de C. salexigens y P. putida (Pastor et al., 2013a). Las flechas punteadas se usan para conversiones que requieren más de un paso enzimático. Por otro lado, los espectros de 13C-RMN de ectoínas apuntan a una distribución de flujos en la que tanto la anaplerosis como el CAT contribuyen de forma notable al flujo de carbono desde piruvato a ectoínas. Este uso de intermediarios del CAT es de especial relevancia, ya que se necesitan vías anapleróticas activas para reponer el ciclo. Por otro lado, la partición del piruvato y el acetil-CoA en determinados “nodos” enzimáticos claves (Pc/Pdh, Cs/EctA y Pc/Cs), revela que la proporción de flujos correspondientes a la anaplerosis y el catabolismo con respecto a la síntesis de ectoínas son similares en condiciones de elevada y baja salinidad. Este hecho es sorprendente, ya que se esperaba que dicha proporción disminuyera a baja salinidad, circunstancia en la que la síntesis de ectoínas está muy reducida. Así, se ha propuesto que la ausencia de variaciones en dichas proporciones podría estar relacionada con la formación de subproductos, fruto del metabolismo “overflow” a baja salinidad (Pastor et al., 2013a). Capítulo I: Introducción - 43 - Por otro lado, hemos descrito que la mayor producción de ectoínas a elevada salinidad se produce a expensas de una menor producción de proteínas, para equilibrar el consumo total de amonio (Argandoña et al., 2010). Este es un hallazgo notable, ya que la mayor producción de ectoínas a elevada salinidad debería conducir a una mayor demanda de la fuente de nitrógeno (ya que la ectoína se considera un aminoácido heterocíclico o como un derivado de pirimidina parcialmente hidrogenado). Sin embargo, se ha observado que la estequiometria del consumo de amonio no varía significativamente entre condiciones de baja y elevada salinidad (Pastor et al., 2013a). 5.1.4. Otras adaptaciones/modificaciones fisiológicas El conjunto de estudios globales de transcriptómica mediante RNAseq y análisis fisiológicos realizados por nuestro grupo de investigación, han puesto de manifiesto algunas adaptaciones fisiológicas adicionales en respuesta a salinidad y temperatura, relacionadas con la síntesis de ectoínas (Salvador et al., 2018). Mecanismos de respuesta a estrés oxidativo En primer lugar, se ha observado que se inducen diferentes mecanismos de respuesta a estrés oxidativo en función de las condiciones utilizadas. Así, a baja salinidad, se inducen mayoritariamente mecanismos de reparación secundarios, mientras que a elevada salinidad se inducen principalmente los mecanismos primarios. Todos ellos se inhiben por temperatura. Además, se ha observado que C. salexigens es más sensible a estrés oxidativo a elevada salinidad. Todo ello sugiere que las causas que producen el estrés oxidativo son diferentes en función de las condiciones ensayadas. A baja salinidad, parece ser que está relacionado con una mayor acumulación de hierro, probablemente por los mayores requerimientos de hierro en estas condiciones (Argandoña et al., 2010). Sin embargo, a elevada salinidad la causa podría ser una mayor producción de especies reactivas de oxígeno debida bien directamente a la salinidad, o bien a un incremento de equivalentes reducidos y/o tasa de respiración necesarios para una mayor producción de ectoínas en esas condiciones (Pastor et al., 2013a; Piubeli et al., 2018). El hecho de que estos mecanismos se inhiban a elevada temperatura podría estar relacionado con la mayor acumulación de hidroxiectoína, ya que ésta posee mejores propiedades antioxidantes que la ectoína. Capítulo I: Introducción - 44 - Respuesta a proteínas desplegadas Por otro lado, se ha observado que a baja salinidad se produce un estrés que produce una respuesta a proteínas desplegadas, probablemente debido a que las proteínas en C. salexigens están mejor adaptadas a condiciones de elevada salinidad y tienden a perder su conformación a baja sal. Además, las ectoínas pueden actuar como chaperonas, pero la menor concentración citoplasmática de las mismas a baja salinidad podría no ser suficiente como para ayudar a evitar dicho desplegamiento proteico. De hecho, a elevada salinidad no se induce la respuesta por desplegamiento proteico. Este estrés por desplegamiento proteico parece no ser exclusivo de C. salexigens, ya que se ha observado en otros microorganismos como en las bacterias halotolerantes V. parahaemolyticus o V. vulnificus (Yang et al., 2010; Rao et al., 2013). Adaptación de la cadena respiratoria y variación en los gradientes de Na+ y H+ Adicionalmente, parece ser que C. salexigens también adapta la cadena respiratoria, junto con los sistemas Na+/antiporter y Na+ soluto/simporter, en función de la salinidad y la temperatura. Así, se han observado diferencias de expresión en los genes que codifican los tres tipos de NADH-deshidrogenasa respiratorias (NAD-II, NAD-I y Na+-NQR). A baja salinidad se induce la enzima NAD-II (NADH quinona deshidrogenasa) de forma que las quinonas se oxidan directamente por el citocromo bo3/bd oxidasa terminal. Esta enzima es parcial o totalmente reemplazada por la NAD-I (enzima que también bombea protones) a elevada salinidad, condición en la que también se observa una inducción de la ATP sintasa. Esto sugiere que en estas condiciones se necesita más energía para llevar a cabo procesos dependientes de ATP tales como la síntesis de solutos compatibles, la síntesis de flagelo o el transporte de solutos (osmoprotectores o nutrientes). Cuando se produce un aumento de la temperatura a elevada salinidad, se observa una inducción de la enzima Na+-NQR (NADH: quinona oxidorreductasa que bombea Na+) y una inducción adicional de la ATP sintasa. Parece ser que esta enzima es una bomba primaria de Na+ que produce una fuerza sodio motriz (FSM) y que se suele activar por salinidad. Como la temperatura puede alterar los gradientes de H+ y Na+, el hecho de que la inducción se produzca por un aumento de la temperatura podría indicar que esta enzima se podría estar utilizando de forma preferente para poder mantener los requerimientos de ATP, así como los gradientes de Na+, en estas condiciones. Esta disponibilidad de los tres tipos de NADH-deshidrogenasas no es común entre las proteobacterias. Es por ello que podría constituir una ventaja evolutiva en aquellos microorganismos que se encuentran en ambientes con frecuentes variaciones en las condiciones ambientales, como es el caso de C. salexigens. Capítulo I: Introducción - 45 - La expresión diferencial en función de la salinidad y temperatura tanto de los genes que codifican las NADH deshidrogenasas respiratorias, la ATP sintasa, el pool de quinonas, así como los Na+/H+ antiporters y Na+-soluto/simporters, indica que existe una modulación de dichos sistemas para la generación de los gradientes de H+ y/o Na+ en función de las condiciones ambientales. En relación a esto, hay que destacar que la concentración intracelular de Na+ se mantiene constante (85–90 nmol/mg PSC), independientemente de la salinidad y temperatura. Esto sugiere que en condiciones hiperosmóticas los gradientes de Na+ son mayores y son mantenidos por los sistemas de extrusión indicados anteriormente. Se ha observado que, además, la alteración tanto de los gradientes de Na+ como de H+ influye en la síntesis de ectoínas, aunque de forma diferente en función de las condiciones ambientales. 5.2. Regulación del metabolismo de ectoínas en C. salexigens. Con respecto a la regulación de la acumulación de ectoínas, la cantidad intracelular de estos solutos en C. salexigens debe ser finamente ajustada para responder adecuadamente a todas las variaciones del medio externo. Para ello C. salexigens es capaz de integrar distintas señales tanto internas como externas, y controlar, a través de una compleja red de señalización, la síntesis, el transporte y el catabolismo de las ectoínas. En cuanto a la síntesis de ectoína, se ha visto que los genes ectABC están controlados tanto por reguladores globales (σs, σ70, Fur), como locales (EctZ). Así, existe una región promotora delante de los genes ectABC, denominada PectA1-4, cuya inducción depende principalmente de salinidad. La activación de esta región promotora se produce a través del regulador general de estrés σs (Calderón et al., 2004; Salvador et al., 2015) y del regulador de la homeostasis de hierro Fur (Argandoña et al., 2010) (Figura 18). Además, el promotor PectB (un promotor interno situado delante del gen ectB) se induce a elevada temperatura, probablemente mediado por el regulador de estrés térmico σ32. Sin embargo, la expresión de los genes ectABC está parcialmente reprimida por la presencia de hierro y osmoprotectores como la betaína y la propia ectoína. Además del control transcripcional de la síntesis de ectoína, existe también un control a nivel post-transcripcional por acción de la betaína y las ectoínas, y que podría actuar a nivel de la actividad enzimática (Calderón et al., 2004). Por otro lado, se ha demostrado que existe una acumulación jerarquizada de solutos compatibles en C. salexigens, de forma que la presencia de betaína en el medio externo inhibe la síntesis de ectoínas (Vargas et al., 2006), y a su vez, las ectoínas endógenas inhiben la síntesis de trehalosa a la temperatura óptima de crecimiento (37°C), acumulándose ésta únicamente cuando la temperatura se eleva hasta los 45°C o en mutantes incapaces de sintetizar ectoínas (Cánovas et al., 1996; Vargas et Capítulo I: Introducción - 46 - al., 2008). Al menos el mecanismo de control de la síntesis de ectoína por betaína actúa tanto a nivel transcripcional como postranscripcional (Vargas et al., 2006). Respecto a la síntesis de hidroxiectoína, el gen ectD está también osmo- y termorrregulado a través de los factores σ32 y 70/S y también por el activador transcripcional EctZ (Reina-Bueno, 2010) (Figura 18). Recientemente se ha comprobado que el gen ectE, que codifica la segunda ectoína hidroxilasa de C. salexigens, es totalmente dependiente de RpoS, tanto en fase exponencial como estacionaria y de forma independiente de la salinidad o temperatura. EctZ también interviene en su regulación, pero en condiciones diferentes a las del gen ectD. Además, EctZ actúa como inhibidor de ectE, mientras que actúa como activador de ectD. También se ha comprobado que ambos genes están osmorregulados, pero no termorregulados, en fase estacionaria tardía (Gandullo Sánchez, 2014). Figura 18. Regulación de la síntesis de ectoínas en C. salexigens. Recientemente se ha comprobado la existencia de un regulador de tipo LysR que interviene en el control de los genes de catabolismo de ectoína (doeA y doeD) y de hidroxiectoína (doeC) (Martínez Martínez, 2015). Finalmente, nuestros resultados preliminares sugieren que la captación y transporte de ectoínas desde el medio externo a través del sistema TeaABC están reguladas a nivel transcripcional por el regulador EupR (de Ectoine Uptake Regulator), un regulador de respuesta perteneciente a la familia NarL/FixJ (Rodríguez-Moya et al., 2010) (18). 5.3. Relación entre la homeostasis del hierro y la osmo- y termoadaptación en C. salexigens. III. MATERIALES Y MÉTODOS Capítulo III: Materiales y Métodos 54 Capítulo III: Materiales y Métodos 55 1. MATERIAL BIOLÓGICO 1.1. Cepas bacterianas utilizadas En la tabla 4 se muestra las distintas cepas de Chromohalobacter salexigens y Escherichia coli que se han utilizado en la presente Tesis Doctoral. Tabla 4. Cepas bacterianas utilizadas. Cepa bacteriana Características relevantes Fuente o referencia Chromohalobacter salexigens CHR61 Mutante espontaneo de la estirpe silvestre C.salexigens DSM 3043, RfR (Cánovas et al., 1997a) CHR134 CHR61 con doble evento de recombinación. Obtenido a partir de CHR133. Contiene la delección de la región fur. RfR, GmR (Argandoña et al., 2010) CHR215 Cepa CHR61 fur2::SmR. Mutante en el gen csal3097 (fur2) de C. salexigens RfR . En este estudio CHR216 Cepa CHR134  fur1 fur2::SmR. RfR, SmR. Mutante deficiente en fur1 y fur2 En este estudio Escherichia Coli DH5α F-80dlacZM15 (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk-) phoAsupE44 -thi-1 gyrA96 relA1 Invitrogen 1.2. Plásmidos En la tabla 5 se relacionan los plásmidos utilizados en la presente Tesis Doctoral. Tabla 5. Plásmidos utilizados en este estudio. Plásmido Cepa hospedadora de E. coli Características relevantes Fuente o referencia pBluescript KS(+) DH5α Vector de clonación de 3 kb derivado de pUC19. oriColE1, AmpR Stratagene pJQ200-SK DH5α Vector suicida, mob+, sacB. GmR (Quandt and Hynes, 1993) pHP45Ω HB101 Derivado del pBR322 con el casette Ω (SpcR/StrR). AmpR, SmR, SpcR (Prentki and Krisch, 1984) pRK600 DH5α Plásmido “helper o cooperador”, oriColE1, Tra+. CmR (Kessler et al., 1992) pHS551 DH5α Derivado de pKSBluscript con un fragmento de 2,1Kb que contiene parte del gen csal3097, el gen csal3098, el gen En este estudio Capítulo III: Materiales y Métodos 56 csal3099 y parte de csal3100 y csal3096. Amplificado por Pfu Turbo PCR, AmpR pHS552 DH5α Derivado de pHS551 en el que se ha introducido un punto de corte HpaI en el gen fur por mutagénesis in vitro. AmpR En este estudio pHS553 DH5α Derivado de pHS552 con un fragmento SmaI−Xbal que contiene el gen fur2, interrumpido por un casette de resistencia a Sm, introducido en el vector. SmR En este estudio pHS554 DH5α Derivado de pHS553 con un fragmento de 4,1 Kb que contiene pKS::fur2::SmR, introducido en el vector pJQ200. SmR En este estudio A continuación, detallaremos algunos vectores citados anteriormente. pBluescript KS(+): vector de clonación derivado del pUC19, de 3 kb y comercializado por Stratagene (Figura 20). Posee el gen lacZ que codifica la enzima β-galactosidasa junto con su promotor (Plac), por lo que en presencia de X-gal e IPTG las colonias son azules. En el gen lacZ se incluye un MCS (sitio múltiple de clonación) con 21 sitios únicos de reconocimiento para enzimas de restricción que permite la fácil clonación de insertos (Figura 21). Así, la clonación de un inserto interrumpe el gen lacZ y se obtienen colonias blancas en presencia de X-gal e IPTG, ya que las cepas hospedadoras de E.coli que albergan el plásmido poseen fenotipo Lac-. De esta manera se seleccionan fácilmente los transformantes que poseen el inserto. La designación SK indica que el punto de corte SacI está más cerca del promotor de lacZ y el punto KpnI está localizado más lejos del promotor de lacZ. La designación (+) o (-) indica la orientación del origen de replicación del fago f1, siendo la versión (+) aquella en la que el origen de replicación está orientado en el mismo sentido que el gen lacZ. Este vector también posee el gen bla, que le confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Figura 20. Esquema del plásmido pBluescript SK(+). Capítulo III: Materiales y Métodos 57 Figura 21. Esquema del MCS del plásmido pBluescript SK (+) donde se muestran los diferentes puntos de corte. pRK600: también denominado plásmido cooperador o “Helper”, ya que facilita el proceso de conjugación entre dos bacterias. Dicho plásmido posee los genes mob y tra, del plásmido RK2, responsables de la movilización y transferencia del ADN, y el gen cat, que codifica la enzima cloranfenicol acetil transferasa, que le confiere resistencia al antibiótico cloranfenicol (Kessler et al., 1992). PJQ200-SK: vector suicida muy versátil que permite el reemplazamiento de genes por doble recombinación homóloga en muchas bacterias Gram negativas. Al plásmido pJQ200 (4,8 kb) se le introdujeron 448 pb del MCS del pBluescriptSK, obteniéndose el plásmido pJQ200-SK. La presencia del MCS permite emplear diferentes estrategias de clonación para el reemplazamiento de genes. Además, tiene el gen lacZ, que permite una fácil identificación de los fragmentos clonados por selección de colonias blancas/azules. Presenta el origen de replicación P15a del plásmido pACYC184, cuya función está restringida a enterobacterias, así como el origen de transferencia (oriT) y los genes mob, del plásmido RP4, que permiten su movilización a bacterias Gram negativas. Figura 22. Esquema del plásmido pJQ200-SK. Los puntos de corte subrayados son puntos de corte únicos. Capítulo III: Materiales y Métodos 58 Contiene el gen aacC, que codifica la resistencia al antibiótico gentamicina y el gen sacB de B. subtilis, inducible por sacarosa, y que codifica una levanosacarasa que cataliza la hidrólisis de la sacarosa, así como la síntesis de levanos que, en bacterias Gram negativas, se acumulan en el periplasma y producen la muerte celular cuando la concentración de sacarosa es mayor o igual al 5% (p/v) (Quandt and Hynes, 1993). Así pues, sacB resulta letal cuando se expresa en bacterias Gram negativas, permitiendo el reemplazamiento de genes y la discriminación entre la integración del vector y los eventos de doble recombinación (Figura 22). pHP45Ω: Es un plásmido de 4,3 kb formado por el vector pHP45 (2,3 kb, derivado de pBR322, AmpR) y el casete  (2 kb), que contiene el gen aadA+ , que codifica resistencia a los antibióticos estreptomicina y espectinomicina. El casete  está flanqueado por numerosos puntos de corte reconocidos por diferentes enzimas de restricción (EcoRI, SmaI, BamHI y HindIII). Este casete contiene en sus extremos terminadores de la transcripción, así como codones Stop, utilizándose para la inactivación insercional de genes, muy fácil de seleccionar por su resistencia a la estreptomicina y la espectinomicina (Prentki and Krisch, 1984) (Figura 23). Figura 23. Esquema del plásmido pHP45Ω. 2. MEDIOS DE CULTIVO A continuación, se detalla la composición de los diferentes medios de cultivos utilizados. Tras su preparación, todos se estilizaron en autoclave a una temperatura de 121°C y a 1 atmósfera de presión durante 20 minutos. Cuando fue necesario, los cultivos se solidificaron añadiendo al medio un 1,5% de Agar Bacteriano Europeo (iNtRON Biotechnology). 2.1. Medios de cultivo para microorganismos halófilos 2.1.1. Medios complejos Capítulo III: Materiales y Métodos 59 Medio SW: las bacterias halófilas moderadas se cultivaron en un medio compuesto a partir de una solución stock de sales concentradas (30%), denominada SW30 (SW deriva de las iniciales en inglés “Sea Water”) (Subow, 1931), que se adicionó en la proporción adecuada para obtener diferentes concentraciones (p/v), y un 0,5% de extracto de levadura (iNtRON Biotechnology). Dicha solución de sales mantiene las proporciones relativas del agua del mar, con un aligera disminución en las concentraciones de CaCl2 y NaHCO3 para evitar la precipitación de las mismas. Cuando fue necesario, el medio se preparó a diferentes concentraciones salinas finales (2% y 10%) y los medios resultantes se denominaron SW-2 y SW-10 respectivamente (Nieto et al., 1989). La composición de la solución de stock SW-30 se detalla a continuación. NaCl 234g MgCl2· 6H2O 39g MgSO4· 7H2O 61g KCl 6g CaCl2·2H2O 1g NaBr 0,7g NaHCO3 0,2g H2O dest. c.s.p. 1000 ml El pH se ajustó a 7,2 con una solución de KOH 1N. 2.1.2. Medios mínimos Medio M63: como medio mínimo para el cultivo de las cepas de bacterias halófilas moderadas se ha utilizado el medio M63 (Csonka, 1982). Su composición base, a la que hay que añadir la fuente de carbono y la concentración deseada de NaCl, se detalla a continuación. KOH 4,2g KH2PO4 16,3g (NH4)2SO4 2g MgSO4 0,195g FeSO4·7H2O 0.005g H2O dest. c.s.p. 1000 ml El pH se ajustó a 7,2 con una solución de KOH 1N. La fuente de carbono usada en los distintos experimentos fue glucosa (que fueron añadidas una vez estéril) a una concentración de 20 mM. Además, el medio se suplementó con 35g/l (0,6M) y 146 g/l (2,5M) de NaCl. Capítulo III: Materiales y Métodos 60 2.2. Medios de cultivo para Escherichia coli 2.2.1. Medios complejos Medio LB: El medio de Luria-Bertani (LB) (Miller, 1972; Russell and Sambrook, 2001) fue el medio complejo utilizado para cultivar las distintas cepas de E.coli. Su composición se muestra a continuación. Triptona 10g Extracto de levadura 5g NaCl 10g H2O dest. c.s.p. 1000 ml 3. CONDICIONES DE CULTIVO Y CONSERVACION DE LAS CEPAS Para la determinación de los diferentes ensayos, se recogieron células a partir de cultivos de C. salexigens crecidos en matraces de 500 ml con 100 ml de medio mínimo M63 y diferentes concentraciones de salinidad y temperatura: baja salinidad (NaCl 0,6 M a 37°C), elevada salinidad (NaCl 2,5 M a 37°C) y elevada salinidad y temperatura (NaCl 2,5 M a 45°C). Dichos cultivos se incubaron en agitadores orbitales (New Brunswick Sci. Co.) a 200 rpm. Para ello, se cultivaron las diferentes cepas en 5 ml de SW-2 hasta alcanzar la fase exponencial, a continuación, se utilizó un 1% del volumen final de dichos precultivos para inocular matraces de medio mínimo M63 a las diferentes concentraciones de NaCl descritas anteriormente. Cuando los cultivos alcanzaron un punto cercano al final de la fase exponencial se recogieron diferentes alícuotas para los respectivos análisis. Para la realización de las curvas de crecimiento de los cultivos líquidos, se determinó la absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro Lan Optics SP- 1104. Todas las cepas y plásmidos utilizados y obtenidos durante la realización de la presente Tesis Doctoral se conservaron a -80°C (congelador Revco) en una solución estéril de glicerol a una concentración final del 20% (p/v). 4. COMPUESTOS ANTIMICROBIANOS En las ocasiones requeridas a los medios de cultivo se les adicionaron distintos compuestos antimicrobianos, todos ellos proporcionados por Sigma. En la tabla 6 se muestran las concentraciones de almacenamiento, los disolventes utilizados para la preparación de las soluciones de los antimicrobianos, así como las diferentes concentraciones finales de uso de los mismos para E. coli y C. salexigens. Las soluciones acuosas de los antimicrobianos se esterilizaron Capítulo III: Materiales y Métodos 61 por filtración a través de filtros de membrana de 0,22 m de diámetro (Millipore). Todas las soluciones se conservaron a 20ºC. Tabla 6. Compuestos antimicrobianos utilizados en el presente estudio. Antimicrobiano Disolvente Conc. Stock (mg/ml) Conc. final E. coli (µg/ml) Conc. final C. salexigens en SW-2 (µg/ml) Ampicilina (Amp) Agua destilada estéril + NaOH 5 N 100 150 ND Cloranfenicol (Cm) Etanol 96% (p/v) 50 30 ND Estreptomicina (Str) Agua destilada estéril 100 20 50 Gentamicina (Gm) Agua destilada estéril 200 20 25 Kanamicina (Kan) Agua destilada estéril 100 50 75 Ácido nalidíxico (Nal) Agua destilada estéril + NaOH hasta pH 11 50 20 ND Rifampicina (Rf) Metanol 25 25 25 Tetraciclina (Tc) 50% agua destilada estéril + 50% etanol 96% (p/v) 100 15 100 Geneticina (Gn) Agua destilada estéril 50 20 20 Espectinomicina (Spc) Agua destilada estéril 100 50 ND 5. MÉTODOS DE TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO 5.1. Conjugación triparental La transferencia de plásmidos movilizables, aunque no autotransmisibles, desde cepas de E. coli a C. salexigens se llevó a cabo según el modelo de conjugación triparental, utilizando el plásmido pRK600 como plásmido movilizador en trans (Kessler et al., 1992). Protocolo 1. El donador, el receptor y el “Helper” se siembran el día anterior en tubos del medio de cultivo adecuado con sus antibióticos correspondientes. Estos cultivos se incuban una noche en agitación. 2. Los cultivos se mezclan en proporciones 1:4:1 (donador: receptor: Helper). Capítulo III: Materiales y Métodos 62 3. La mezcla resultante se centrifuga 2 minutos a 13.000 r.p.m. y se lava dos veces con el medio correspondiente, dependiendo de la bacteria receptora utilizada, para eliminar los restos de antimicrobianos. 4. La mezcla de conjugación se concentra por centrifugación y se resuspende en 100 µl del medio complejo correspondiente. 5. Los 100 µl se depositan sobre un filtro Millipore estéril de 0,22 µm de diámetro de poro, colocado sobre una placa de Petri con medio sólido, y la placa se incuba a 37 °C durante 10-12 horas. 6. Tras la incubación, la mezcla de conjugación se resuspende en 1 ml de una solución estéril de glicerol al 20 % (v/v), para su siembra y conservación a -20 °C. 7. Para aislar los transconjugantes, tras realizar las diluciones oportunas, se siembran 100 µl en los medios selectivos apropiados adicionados de los correspondientes compuestos antimicrobianos. 8. El donador, el receptor y el Helper se siembran paralelamente en los mismos medios selectivos, como control de las posibles mutaciones espontáneas. 5.2. Transformación El método rutinario de transformación utilizado en la presente Tesis Doctoral ha sido el de transformación de células competentes por choque térmico descrito por Hanahan, 1983. Como células competentes se utilizaron las de las estirpes DH5α de E. coli (bien adquiriéndolas directamente como células competentes a Invitrogen, o bien preparándolas en el laboratorio). Protocolo 1. Se toma un vial de células competentes congeladas a -80 °C y se coloca en hielo para que se descongele lentamente. 2. Una vez descongeladas las células, se les añade el ADN a transformar, normalmente 10 µl, y se incuban en hielo durante 30 minutos. 3. Tras la incubación se somete a las células a un choque térmico de 45 segundos a 37 °C, seguido de 2 minutos en hielo. 4. A continuación, se añaden 500 µl de medio LB para recuperar las células y se incuban 1 hora a 37 °C en agitación. 5. Posteriormente se siembran alícuotas de 100 y 200 µl en placas de LB adicionadas del correspondiente antimicrobiano. En los casos en los que se usaron los plásmidos pBluescript o pJQ200-SK como vector, se puso de manifiesto la actividad β-galactosidasa Capítulo III: Materiales y Métodos 69 Esta técnica y algunas de sus variantes además de para amplificar fragmentos de ADN, se usó para la comprobación de clones o para mutagénesis in vitro. Las reacciones de PCR se realizaron siguiendo las indicaciones del manual de Sambrook y Russell (Russell and Sambrook, 2001), utilizándose un volumen total de 20 o 50 µl según el experimento. La enzima empleada en la mayoría de las reacciones fue MyTaq ADN polymerase (Bioline), para uso rutinario; para los experimentos que precisaban una alta fiabilidad se usó la enzima Pfu Turbo (Stratagene) o Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) ya que estas minimizan los posibles errores en amplificación. Los cebadores usados se diseñaron según la región diana que se quería amplificar (Ver Tabla 7). Los termocicladores usados fueron RoboCycler (Strategene), PCRSystem 9700 (AppliedBiosystems), un Mastercycler (Eppendorf) o T100TM Thermal Cycler (BioRad). Tabla 7. Cebadores utilizados para la amplificación de ADN. Nombre Gen Secuencia 5´ 3´ Referencia FUR2-fw fur2 TTCGAGTTCTCCAACCGCTTGCTGG ACCACCATCTGCATATCGAGAAGCGTG En este estudio FUR2-rv QchFUR2Hpa_fw QchFUR2Hpa GACCGTGTATCGTGTGTTAACCCAATTCGAAACCGCC En este estudio QchFUR2Hpa_rv GGCGGTTTCGAATTGGGTTAACACACGATACACGGTC ETAPAS DE LA PCR Desnaturalización ADN molde 2-5 min a 94-98° Desnaturalización 18 a 35 ciclos Hibridación Extensión Extensión final 10 min a 72° El número de ciclos, la temperatura de hibridación de los cebadores y el tiempo de extensión variaron según el tipo de experimento. El tamaño y la calidad de los productos obtenidos se comprobaron mediante electroforesis en geles de agarosa habitualmente al 1%. A continuación, se detallan otras variaciones de la PCR convencional utilizadas en este trabajo. Capítulo III: Materiales y Métodos 70 9.1.5.1. PCR de extensión solapada (Overlapping PCR) La reacción en cadena de la polimerasa de extensión solapada es una variante de la PCR. Se utiliza para insertar mutaciones específicas en puntos concretos de una secuencia o para unir fragmentos de ADN más pequeños en un polinucleótido más grande (Higuchi et al., 1988). El método consiste en la realización de dos reacciones de PCR primarias, que generan fragmentos de ADN con extremos superpuestos, y una reacción secundaria que permite incluir los dos fragmentos en un solo fragmento (Russell and Sambrook, 2001). Uno de los pasos cruciales de esta técnica es el diseño de cebadores, así, los cebadores solapantes de cada región nativa tuvieron una longitud entre 20 a 30 nucleótidos y, su contenido en G+C fue cercano al 50%. Cuando el experimento lo requirió, se incluyeron puntos de restricción en los extremos a los que se añadieron de 4-6 nucleótidos para facilitar la actividad de las endonucleasas. Del mismo modo también se añadieron determinados nucleótidos para generar etiquetas en el extremo C-terminal o N-terminal de las proteínas expresadas. ETAPAS DE LA PCR DE EXTENSIÓN SOLAPADA Desnaturalización ADN molde 30 seg a 98°C Desnaturalización 5-10 seg a 98°C 25 a 35 ciclos Hibridación 10-30 seg a 50-72°C Extensión 20-30 seg por Kb a 72°C Extensión final 2-5 min a 72°C El número de ciclos, la temperatura de hibridación de los cebadores y el tiempo de extensión variaron según el tipo de experimento. El tamaño y la calidad de los productos obtenidos se comprobaron mediante electroforesis en geles de agarosa habitualmente al 1%. 9.1.5.2. PCR de colonia La PCR de colonias se utilizó como método rápido y sencillo para detectar las colonias de bacterias que habían adquirido una construcción génica tras un paso de transformación. Esta técnica se empleó bien para verificar que la construcción génica deseada estaba presente o bien para amplificar parte de la misma sin tener que purificar los plásmidos. Para ello normalmente se emplearon cebadores específicos del vector en el que se había clonado el fragmento (Bergkessel and Guthrie, 2013) (Tabla 7). Capítulo III: Materiales y Métodos 71 Protocolo 1. Coger la colonia de la placa utilizando una punta de pipeta estéril. 2. Transferir la colonia a un eppendorf que contenga 50 µl de agua estéril. Mezclar bien para resuspender las células. 3. Incubar 5 min en agua hirviendo o en un termobloque a 99°C para lisar las células y desnaturalizar las ADNasas. 4. Centrifugar 1 minuto a 12.0000 g para eliminar los restos celulares. 5. Transferir 10 µl del sobrenadante a un nuevo tubo de PCR. 6. Mantener en hielo hasta su uso. 7. Realizar una PCR de comprobación. ETAPAS DE LA PCR DE COMPROBACION Desnaturalización 1 min a 94°C 35 ciclos Hibridación 1min a Tª cebadores Extensión 2 min a 72°C Extensión final 6 min a 72°C Al concluir la reacción, el tamaño y la calidad de los productos se comprobaron mediante electroforesis en geles de agarosa. 9.1.5.3. Mutagénesis dirigida por PCR. El método de mutagénesis dirigida por PCR se utilizó para la generación de mutaciones puntuales. Para ello, se utilizó el Kit Quickchange Site-Directed Mutagénesis (Stratagene), ya que es el método más rápido y sencillo para la realizar una mutagénesis dirigida. Para obtener la mutación se empleó una pareja de cebadores complementarios entre sí que poseían la mutación deseada, ya sea la deleción de un fragmento o una mutación puntual. Así, los cebadores se unen al ADN del vector que contiene el inserto donde se quiere generar la mutación y se extienden mediante una polimerasa de alta fidelidad, generándose un nuevo plásmido que contiene las mutaciones deseadas. Las características de estos cebadores fueron las siguientes (Braman, 1996):  Ambos cebadores contenían la mutación deseada  Longitud de los cebadores comprendida entre 25-45 bases  La mutación localizada en la zona central del cebador  Contenido G+C 40% Capítulo III: Materiales y Métodos 72 Utilizando ADN genómico de C. salexigens como ADN molde, se realizó la PCR según las instrucciones del Kit y empleando los cebadores descritos en la tabla X. ETAPAS DE LA PCR DE EXTENSIÓN SOLAPADA Desnaturalización ADN molde 30 seg a 95°C Desnaturalización 1 min a 95°C 16 ciclos Hibridación 30 seg a 55°C Extensión 2 min 30 seg a 72°C Extensión final 1 min a 72°C Una vez realizada la PCR, la mezcla se trató con la endonucleasa de restricción DpnI (10 U/µl, NEB), para eliminar el ADN molde, y se incubo 1 h a 37°C. Esta enzima corta el ADN en la secuencia 5´- Gm6ATC-3´, específica para ADN metilado y hemimetilado, por lo que, en este caso, se utilizó para digerir el ADN molde y seleccionar el ADN generado por PCR, que contenía la mutación deseada. Se tomaron 5 µl del ADN tratado con DpnI para transformar células competentes de distintas cepas de E. coli (Apartado 5.2). 10. SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS DE ADN 10.1. Secuenciación del ADN La secuenciación de los fragmentos de ADN analizados en este trabajo, se ha realizado por las empresas Newbiotechnic S.A. (NBT, Sevilla) y Eurofins Genomics (Eurofins Scientific Group). 10.2. Análisis de las secuencias de ADN y de proteínas El tratamiento y análisis de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas (identificación de marcos abiertos de lectura, análisis de restricción, composición de aminoácidos, diseño de cebadores y alineamientos) se llevó a cabo utilizando el paquete de programas DNASTAR Lasergene (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin, EEUU). DNASTAR consta de cuatro programas diferentes que han sido utilizados para distintas aplicaciones:  EditSeq: edición de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas e identificación de marcos abiertos de lectura.  MapDraw: análisis de restricción de las secuencias.  PrimerSelect: diseño de cebadores.  MegAlin: alineamiento de dos o más secuencias proteicas. Capítulo III: Materiales y Métodos 73 Para el diseño de los cebadores, además de usar el programa PrimerSelect, se utilizó principalmente el programa Primer3 (Whitehead Institute for Biomecdical Research, Cambridge, MA, USA) (http://frodo.wi.mit.edu/). Posteriormente, las características de los cebadores diseñados se comprobaron en el programa disponible en la página web de la casa comercial Sigma-Genosys (http://www.sigma-genosys.com/calc/DNAcalc.asp). La búsqueda de secuencias homólogas en las bases de datos de ADN y proteínas (EMBL, Gen Bank, DDBJ, UniProt), así como el alineamiento preliminar de dos secuencias, se realizó mediante las diferentes herramientas del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997), en el servidor del NCIB (National Center for Biotechnology Information) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). El genoma de C. salexigens ha sido secuenciado en el Joint Genome Institute, que pertenece al Departamento de Energía de los Estados Unidos. La secuencia ensamblada en un solo “contig”, está disponible de forma libre en la página web: http://genome.ornl.gov/microbial/csal/. La misma página nos permite utilizar el programa BLAST para buscar ortólogos de genes conocidos en el genoma de C. salexigens. Para la predicción de regiones promotoras, se utilizó el programa BDGP Neural Network Promoter Prediction Input (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) (Hampshire and Waibel, 1990). La predicción de los terminadores transcripcionales se realizó mediante el programa SoftBerri-Find Term (http://www.softberry.ru/berry.phtml). Para el análisis de proteínas se usaron diferentes programas y bases de datos. Para la predicción de péptidos señal y la topología de las proteínas se utilizó principalmente la aplicación online SMART 6 (http://smart.embl-heidelberg.de/; Schultz et al., 1998; Letunic et al., 2008). Otras aplicaciones usadas para el análisis funcional y la predicción de motivos conservados en proteínas fueron: STRING 8.2 (http://string.embl.de/ ; Jensen et al., 2009) KEGG (http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/ko/ko02020.html; Kanehisa et al., 2004), Sinaling census (http://hodgkin.mbu.iisc.ernet.in/-king; Galperin, 2005), PROSITE (http://www.expasy.org/prosite/ ; Hulo et al., 2008), BLOCKS (http://blocks.fhcrc.org/; Henikoff et al., 2000), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/; Finn et al., 2006), CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml; Marchler-Bauer and Bryant, 2004), InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/; Zdobnov and Apweiler, 2001), Phobius (http://www.ebi.ac.uk/Tools/phobius/ ; Käll et al., 2004). Para el análisis filogenético se utilizó el programa Megalign del paquete de programas DNASTAR Lasergene, y el programa MEGA versión 4.0.2 (Tamura et al., 2007). Capítulo III: Materiales y Métodos 74 11. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ARN 11.1. Extracción de ARN total Para realizar una extracción de ARN que permita obtener un ARN de calidad, se ha de conseguir minimizar la presencia de actividad ribonucleasa en los estadios iniciales de la extracción. Para ello, es importante que tanto los reactivos como el material de trabajo estén libres de ARNasas, por lo que rutinariamente se trató el agua con DEPC a una concentración del 0,1 % (p/v) (Fedorcsák I., 1966) y se autoclavó posteriormente para eliminar el DEPC, ya que este puede inactivar el ARN por carboximetilación. Con esta agua tratada se prepararon el resto de reactivos no suministrados en el kit comercial. Todos los reactivos y material fungible de origen comercial utilizados durante este proceso se adquirieron libres de ARNasas. Las superficies de trabajo se trataron con SDS al 10% (p/v) preparado con agua DEPC. Para la extracción de ARN total el utilizó el kit “High Pure RNA insolate Kit” (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante para el aislamiento de ARN de bacterias. Protocolo 1. Un mililitro de muestra se centrifuga 5’ a 2000 x g, se tira el sobrenadante y se resuspende el pellet en 200 µl Tris 10 mM pH 8. 2. Se añade 4 µl lisozima (50mg/ml) y se incuba 10’ a 37 °C. 3. Añadir 400 µl Lysing/Binding Buffer y mezclar bien. Dar un spin de 3’’ (Añadir de 100 en 100 µl ya que es muy viscoso). 4. Poner la muestra en la columna con su tubo colector. 5. Centrifugar 30’’ a 8000 g y retirar el sobrenadante. 6. Añadir 90 µl DNasa Incubation Buffer a un tubo estándar y mezclarlo bien con 10 µl de DNasa I. Añadir todo a la columna e incubar 60’ a 15-25 °C (T° ambiente). 7. Añadir 500µl Wash Buffer I y centrifugar 30’’ a 9000 g y tira el líquido. 8. Añadir 500µl Wash Buffer II y centrifugar 30’’ a 9000 g y tirar el líquido. 9. Añadir 200µl Wash Buffer II y centrifugar 2’30’’ a velocidad máxima. 10. Tira tubo colector y poner en un epp. estéril (1,5 ml). 11. Añadir 50 µl de agua DEPC y centrifugar 1’ a 8000g (x2). 12. Utilizar o almacenar a -80 °C. Para eliminar totalmente el ADN genómico contaminante presente en las muestras, se utilizó el kit “Turbo DNA-free Kit” (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Capítulo III: Materiales y Métodos 75 Protocolo 1. Añadir 0,1 volumen 10X DNase I Buffer y 1 µl rDNase I al ARN, mezclar bien. 2. Incubar la muestra a 37 °C durante 20 o 30´. 3. Añadir DNase Inactivation Reagent (normalmente 0,1 volumen) y mezclar bien. 4. Incubar 2 minutos a temperatura ambiente, mezclando ocasionalmente. 5. Centrifugar a 10000 g durante 1,5´ y transferir el ARN a un tubo limpio. Para comprobar la ausencia de ADN genómico se usaron los oligos del gen ARNr 16S (Argandoña et al., 2010). La concentración y pureza (A260/A280 ratio) del ARN obtenido se determinó mediante un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies). La calidad del ARN se determinó mediante electroforesis capilar de microfluidos en un bioanalizador Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Para ello las muestras se diluyeron hasta alcanzar un rango de concentración entre 25-500 ng/µl, se trataron con el kit “Agilent RNA 6000 Nano Kit” (Agilent Technologies) y se cargaron en un soporte nanochip siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente se determinaron los siguientes parámetros en el bioanalizador:  Relación ARNr 23S/16S: la relación entre los ARN ribosómicos 23S y 16S.  RIN (“RNA integrity number”): este parámetro fue introducido por Agilent Technologies con el fin de estandarizar el proceso de interpretación de la integridad del ARN y eliminar así el sesgo asociado a la interpretación individual. El algoritmo en el que se basa este parámetro permite la clasificación de las muestras de ARN procariótico total en base a un sistema numérico de 1 a 10, siendo 1 el valor para una muestra de ARN totalmente degradada y 10 el valor obtenido para una muestra intacta. El número RIN es independiente de la variación en el instrumento y la concentración determinada, lo que facilita la comparación de muestras entre distintos laboratorios, razón por la cual se utiliza en el control de calidad de los servicios de secuenciación. Como estándares de un ARN de calidad se establecieron los siguientes valores para cada uno de los parámetros: A260/A280 ratio > 2,0, 23S/16S ARNratio≈1,6, y un valor de RIN > 7,0. Las muestras de ARN que se ajustaron a dichos estándares de calidad se almacenaron a -80 ⁰C hasta su posterior utilización. El método utilizado para la obtención de ARN total elimina los ARN de tamaño pequeño o “small RNAs”, de forma que no se obtuvieron datos de este tipo de ARN en el análisis posterior de las secuencias. Capítulo III: Materiales y Métodos 76 11.2. Purificación de ARN mensajero. Para la obtención del ARN mensajero (ARNm) a partir de muestras de ARN total, se utilizaron de forma secuencial dos kits diferentes para eliminar el ARN ribosómico (ARNr) en un 99% y, a la misma vez, obtener calidad suficiente de ARNm para ser secuenciado. En ambos kits se utilizan oligonucleótidos específicos para realizar una hibridación que captura específicamente el ARNr 16S y 23S de bacterias Gram negativas. De esta forma, se obtuvo una cantidad y concentración suficiente de ARNm para su posterior secuenciación. Los kits utilizados fueron “MICROBExpress kit” (Ambion) y “Ribo-Zero Magnetic Kits Gram-negative bacteria” (Epicentre). El método en el que se basan estos dos kits es una modificación reciente de los protocolos convencionales de hibridación desarrollados para la captura y detección de ácidos nucleicos (Hunsaker et al., 1989; Morrissey and Collins, 1989; Morrissey et al., 1989). El proceso implica una primera hibridación con oligonucleótidos específicos del ARNr 16S y 23S (“capture oligos”). En el segundo proceso de hibridación, se añaden oligonucleótidos derivatizados con perlas magnéticas (“oligos MagBeads”) que hibridan con el extremo libre de los oligonucleótidos que han “capturado” previamente el ARNr. De esta forma, utilizando un imán diseñado a tal efecto (Single Place Magnetic Stand, Ambion), se forma un precipitado que contiene las perlas magnéticas unidas al ARNr 16S y al ARN 23S, quedando únicamente en el sobrenadante el resto de ARNm (Figura 26). Figura 26. Fundamento del método usado en el kit “MICROBExpress Kit” (Ambion) para eliminar el ARNr de una muestra de ARN total. Para realizar la primera fase de eliminación del ARNr se partió de 10 µg del ARN total obtenido anteriormente utilizando un volumen máximo de 15 µl y se utilizó el kit “MICROBExpress kit” (Ambion), según las instrucciones del fabricante. Tras el paso de enriquecimiento se obtuvieron unos 350 µl de ARNm enriquecido a los que se les realizó un paso de precipitación con etanol según el siguiente protocolo: Capítulo III: Materiales y Métodos 77 Protocolo 1. Añadir a los 350 µl de ARNm enriquecido 35 µl de acetato de sodio (3M) y 7 µl de glucógeno 5 mg/ml 2. Añadir 1175 µl de etanol absoluto helado y agitar en vórtex para mezclar bien 3. Dejar precipitar a -20°C durante al menos 1 hora 4. Centrifugar 30 minutos a ≥ 10000g y desechar cuidadosamente el sobrenadante 5. Realizar dos lavados con etanol al 70% (v/v) de la siguiente manera:  Agregar 750 µl de etanol 70% (v/v) helado y agite brevemente  Centrifugar durante 5 minutos a ≥ 10000g. Desechar el sobrenadante 6. Centrifugar brevemente el tubo después de descartar el segundo lavado con etanol al 70% (v/v) y retirar con cuidado cualquier sobrenadante restante con una pipeta, teniendo cuidado de no tocar el sedimento 7. Dejar secar el pellet al aire durante 5 minutos 8. Resuspender el sedimento en 27 µl de agua libre de nucleasas (Agua-DEPC) 9. Rehidratar el ARN durante 15 minutos a temperatura ambiente 10. Agitar vigorosamente la muestra para resuspender el ARN 11. Centrifugar brevemente para recoger la muestra Si la solución de ARN tiene un color marrón, probablemente quede una pequeña cantidad de Oligos MagBeads en la muestra. Para eliminarlos, colocar el tubo en el soporte magnético durante 3 minutos y transferir la solución de ARNm enriquecida a un nuevo tubo. Si bien la eliminación de ARNr mediante la utilización de este kit no es completa (aproximadamente un 50%), sí permite obtener una cantidad suficiente de ARN parcialmente desribosomizado que permita pasar a la segunda fase de eliminación del ARNr, y obtener una cantidad suficiente de ARNm libre de ARNr al final de todo el proceso. Para esta segunda fase de eliminación del ARNr se utilizó el kit “Ribo-Zero Magnetic Kits Gram-negative bacteria”. En este caso se partió de un volumen máximo de 26 µl y de una concentración de entre 2,5-5 µg de ARN. Con este paso se consigue un porcentaje mínimo de depleción del 90%. El ARNm se resuspendió en un volumen final de 11 µl de agua DEPC y se conservó a -80°C. La concentración y pureza (A260/A280 ratio) del ARN obtenido se determinó siguiendo el método explicado en el apartado 11.1. lo que hay que tener en cuenta es que al ser muestras desribosomizadas, la cuantificación por Nanodrop no es lo suficientemente sensible, por lo que se utilizó un método fluorimétrico (Qubit®) mediante el empleo del kit Quant-iT RiboGreen (Invitrogen). El reactivo de ARN Quant-iT™ RiboGreen® es un colorante de detección muy Capítulo III: Materiales y Métodos 78 sensible para la cuantificación de ARN en solución, con una detección de fluorescencia lineal dentro del intervalo 1-200 ng de ARN (Aranda IV et al., 2009). 12. MANIPULACIÓN DE ARN 12.1. Obtención de ADNc a partir de ARN La retrotranscripción es el proceso por el cual se obtiene ADNc a partir de ARN, este ADNc es mucho más estable que el primero, permitiéndonos un procesamiento de las muestras más seguro. Para la síntesis de ADNc se utilizó el kit “Transcriptor First Strand cDNA synthesis” (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante, a partir de 2 µg de ARN, utilizándose como oligonucleótidos los random primers incluidos en el kit. El ADNc obtenido se comprobó mediante PCR usando cebadores específicos de un gen cuya expresión es constante e independiente a las condiciones de cultivo (housekeeper), siendo en nuestro caso cebadores que amplifican una región de 80 pb del gen 16S (Argandoña et al., 2010). 12.2. Determinación de la expresión génica mediante qPCR. La qPCR (quantitative polymerase chain reaction) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que nos permite amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN. El molde empleado es el ADNc (Véase apartado 12.1), de hebra simple. Se han determinado los niveles de expresión de genes implicados en la síntesis de ectoínas (ectA, ectD y EctE), así como genes implicados en el transporte de hierro (Yggx, Zip y EfeU), en las diferentes condiciones de crecimiento, tanto de salinidad como de temperatura. Para ello se diseñaron cebadores internos específicos de cada gen (Tabla 7). Los cebadores deben de tener una longitud entre 20-25 pb, un contenido de G+C de más del 50%, una Tm de alrededor de 60 °C y estar diseñados para amplificar un fragmento de 50 a 200 pb. Tabla 8. Cebadores utilizados en las reacciones de qPCR Nombre Gen Secuencia 5´ 3´ Referencia ectA-qRT-fw ectA ACGAACTCGTCAAGGCATGC (Argandoña et al., 2010) ectA-qRT-rv TGCCATAGAAAGTAGGTGTCCG RT-ectD-fw ectD ATTTCGACATGAAGACGTGACATTC (Salvador et al., 2015) RT-ectD-rv TCGGCCAGAAAATGGGGTTC RT-ectE-fw ectE TACCGTTCCCAGCAGACTAATG Argandoña et al. Capítulo III: Materiales y Métodos 85 Las muestras se enviaron al Servicio de Microanálisis del Centro de Investigación, Tecnología e Innovación (CITIUS) de la Universidad de Sevilla donde se determinó el contenido intracelular de hierro por Espectrometría de emisión de plasma acoplado por inducción (ICP-OES) mediante el equipo ICP Horiba Jobin Yvon, Ultima 2 (Figura 27). Figura 27. Equipo ICP Horiba Jobin Yvon, Ultima 2 utilizado en este ensayo. La espectrometría atómica de emisión mediante plasma ICP permite la determinación multielemental de más de 70 elementos en muestras acuosas de forma secuencial. La muestra, en disolución es aspirada mediante un nebulizador a través de un capilar, pasando a una cámara de nebulización, donde es convertida en un fino aerosol. Una corriente de argón transporta este aerosol a la antorcha del plasma, donde, sometido a una temperatura en torno a los 6000 K, es disociado en átomos libres e iones, que emiten luz de longitudes de onda características de los elementos presentes. La luz emitida es difractada por medio de un monocromador, quedando separada en diferentes haces de una sola longitud de onda. Estos haces llegan secuencialmente a un tubo fotomultiplicador, encargado de convertir los fotones en una señal eléctrica, que es medida y registrada. 15. PRODUCCIÓN DE SIDEROFOROS El estudio de la producción de sideróforos se ha llevado a cabo según el procedimiento descrito por Argandoña et al., 2010 utilizando placas de Cromo Azurol S (CAS). El ensayo CAS es un método colorimétrico universal que detecta sideróforos independientemente de su estructura (Himpsl and Mobley, 2019). En este ensayo, los sideróforos extraen hierro de un complejo de Fe-CAS-bromuro hexadeciltrimetilamonio, posteriormente el colorante CAS se libera dando como resultado un cambio de color de verde oscuro a naranja. Los ensayos basados Capítulo III: Materiales y Métodos 86 en soluciones con CAS dan como resultados tanto medidas cuantitativas, ya que se correlaciona el tamaño de los sideróforos con la producción de los mismos, como medidas cualitativas ya que el cambio de color es observable en placas con agar y en medio líquido. El experimento parte de un cultivo en medio mínimo M63 1X incubado en las diferentes condiciones a estudiar, se tomaron alícuotas de 1 ml del cultivo cuando llegaron a mitad de fase exponencial de cada una de las cepas bacterianas. Estas muestras se centrifugaron a 13000 r.p.m. durante 3 minutos y el sedimento obtenido se lavó con medio M63 modificado para eliminar la posible presencia de sideróforos. A continuación, el pellet obtenido tras el lavado se resuspendió en 30 µl de este mismo medio y se depositaron alícuotas de 10 µl de cada cepa bacteriana en la placa de CAS. Las placas sembradas se incubaron a las diferentes condiciones de temperatura en un periodo de 3 semanas donde semanalmente se fueron comprobando su crecimiento y la producción de sideróforos. Para la elaboración de las placas de sideróforos hay que preparar previamente dos soluciones STOCK: STOCK SOLUCION Fe III 50 mM Cl3Fe 200µl (1mM) HCl 1N 100 µl (10 mM) Agua c.s.p 10 ml A partir de estas dos, se lleva a cabo la preparación de la tercera solución STOCK: STOCK SOLUCION I Volumen 100 ml CAS (Cromo Azurol S) 60,5 mg Agua 50 ml Solución Fe III 10 ml Añadir lentamente y en agitación 40 ml del STOCK CTAB y autoclavar. Guardar la solución I hasta la elaboración de las placas. STOCK CTAB 91 mg CTAB 50 ml agua Capítulo III: Materiales y Métodos 87 Protocolo Protocolo a seguir para preparar placas de 50 ml 1. En un matraz añadir:  KH2PO4: 0,045g  KOH: 0,63g  (NH4)SO4: 0,3g  MgSO4: 150 µl (0,04g MgSO4•7H2O/ 10 ml)  H20 c.s.p: 130 ml 2. Preparar 43 ml de esta solución en matraces independientes según la salinidad a la cual se quiera estudiar. 3. Añadir 1,5g de PIPES (piperazina-N, N-bis [ácido 2-ethanolsulfonico]) (añadir NaCl para mejorar la disolución del PIPES). 4. Ajustar el pH a 6,6 con HCl concentrado. 5. Añadir 1,5g de agar a cada matraz. 6. Autoclavar 7. Dejar enfriar los matraces y a continuación añadir 500 µl de glucosa 2M y 5 ml de solución I (lentamente y con agitación). 8. Verter en placas. 16. ENSAYO RESISTENCIA A MANGANESO El ensayo de resistencia al manganeso se ha basado en un protocolo previamente descrito por Hantke, 1987, en el cual se ha modificado el medio LB y se le ha añadido una solución estéril de MnCl2, cuya concentración final fue de 10 mM de MnCl2. SW30 modificado Volumen 500 ml NaCl 117g MgSO4 /Cl3 Fe •7 H2O 5 ml CaCl2 0,5g KCl 3g NaHCO3 0,1g NaBr 0,35g H2O miliQ 500 ml Filtrar el SW30 modificado para su esterilización. Capítulo III: Materiales y Métodos 88 Para la realización de las placas se tuvo en cuenta las siguientes concentraciones. PLACAS DE MANGANESO Extracto de levadura 0,5g/100ml SW30 modificado 6,6ml/100ml Agar 2g por placa Al medio se le ajusto el pH a 7,2 y se autoclavó. Una vez se hubo enfriado se le añadió la solución de Mn2Cl filtrada. IV. RESULTADOS Capítulo IV: Resultados 90 Capítulo IV: Resultados 91 1. Análisis de la influencia del hierro en la osmoadaptacion de C. salexigens 1.1. Análisis del crecimiento de C. salexigens en diferentes condiciones de salinidad en presencia de diferentes concentraciones de hierro. En primer lugar, se realizó un estudio detallado sobre la influencia del hierro en la osmoadaptación de C. salexigens y, por tanto, en la acumulación de solutos compatibles, cuando existe un aporte de hierro en el cultivo. Para ello se comparó el crecimiento de la cepa silvestre a distintas salinidades y concentraciones de hierro, preparándose un preinóculo en medio complejo SW2 a 37°C y en agitación hasta alcanzar una D.O. de 1,5-1,7. A continuación, se utilizó un 1 ml de dicho cultivo para inocular 100 ml de medio mínimo M63 adicionado de glucosa (20 mM), con diferentes concentraciones de NaCl (0,6 M y 2,5 M) y de Fe3Cl (0, 1, 5, 10, 25 y 50 µM). Como se muestra en la Figura 28 A, a baja concentración de sal (0,6 M) no se apreció ningún efecto en el crecimiento, observándose una fase exponencial con una pendiente similar a todas las concentraciones de hierro ensayadas. Sin embargo, a las concentraciones intermedias de 5 y 10 mM de Fe3Cl sí se detectó un ligero aumento en los valores máximos de la biomasa celular alcanzada, siendo 3 y 2.72 respectivamente (Tabla 10). Sin embargo, a elevada salinidad (Figura 28 B) se observó que el aporte de hierro causó una mejora en el crecimiento, observándose una fase lag más corta seguida de una fase exponencial con una pendiente más pronunciada que antes y a todas las concentraciones de Fe3Cl ensayadas, a excepción de en ausencia de Fe3Cl. En estas condiciones, el aporte de hierro también causó un aumento en el valor máximo de la biomasa alcanzada en todas las concentraciones ensayadas, siendo 50 µM la concentración óptima con una biomasa de 3,51 ± 0.1 (Tabla 10). Tabla 10. Tasa de crecimiento y biomasa obtenidas de las curvas de crecimiento a 0.6 y 2.5 M de NaCl a 37°C y con diferentes concentraciones de hierro. Capítulo IV: Resultados 92 Figura 28. Crecimiento en medio mínimo M63 a baja (A) y elevada salinidad (B). La cepa silvestre de C. salexigens se cultivó a 0,6 y 2,5 M de NaCl, a 37ºC y con diferentes concentraciones de Fe3Cl (0, 1, 5, 10, 25 y 50 µM). 1.2. Cuantificación del contenido intracelular de ectoínas a baja y a elevada salinidad en presencia de diferentes concentraciones de hierro. Para comprobar si el estrés osmótico y las diferentes concentraciones de hierro influían en la cantidad de ectoínas acumuladas intracelularmente, se tomaron alícuotas de los cultivos anteriores y se cuantificó por HPLC-MS el contenido intracelular de ectoínas al final de la fase exponencial, ya que se ha descrito previamente que es la etapa del crecimiento donde se produce la máxima acumulación de las mismas. Como se observa en las Figuras 29 A y 29 B, con respecto a la salinidad, el contenido intracelular de ectoína y de hidroxiectoína en ausencia de hierro fue mayor a 2,5 M que a 0,6 M, coincidiendo con resultados obtenidos anteriormente (Pastor et al., 2013b). Con respecto al aporte de hierro, se puede observar que tanto a baja salinidad como a elevada salinidad éste no tuvo efecto significativo en la producción de ectoína ni hidroxiectoína. Capítulo IV: Resultados 93 Lo que si se apreció es que a elevada salinidad (Figura 29 B) el contenido intracelular de ectoínas sufrió una ligera bajada a favor de una mayor concentración de hidroxiectoína, es decir, el aporte de hierro desplazó el equilibrio entre la formación de ectoína e hidroxiectoina hacia la formación de esta última, favoreciéndose la hidroxilación de la ectoína para obtener hidroxiectoína. Este desplazamiento fué máximo cuando la concentración de Fe3Cl ensayada fué 50 µM. Figura 29. Contenido intracelular de ectoínas en condiciones diferentes de hierro a 0.6 y 2.5 M de NaCl. La cepa silvestre se cultivó en medio mínimo M63, a 0,6 M (figura A) y 2,5 M de NaCl (figura B) con diferentes aportes de hierro, con glucosa como única fuente de carbono. El contenido intracelular de ectoínas de la cepa silvestre se cuantificó mediante HPLC-MS. La acumulación de solutos intracelulares se expresó en miligramos de soluto por peso seco celular. Las muestras fueron tomadas al final de la fase exponencial. Se han considerado diferencias significativas aquellas que producen una variación de ˃ 20% y, además, según el test t-Student, cuando el p-value ˂0.1 o ˂0.05, indicándose con dos asteriscos en el caso de la ectoína y con 2 puntos en el caso de la hidroxiectoína. Capítulo IV: Resultados 94 2. Implicación del regulador Fur en la homeostasis de hierro y en la osmoadaptación de C. salexigens. Una vez comprobado el crecimiento de C. salexigens a baja y a elevada salinidad y en presencia de diferentes concentraciones de hierro, así como su efecto en el contenido intracelular de las ectoínas, se realizó un estudio sobre el posible papel del segundo regulador, Fur2, en la homeostasis de hierro y en la osmoadaptación de esta bacteria. Además, se profundizó en el papel del regulador Fur1 descrito anteriormente en (Argandoña et al., 2010) y se estudió la posible viabilidad de un doble mutante fur, fur1fur2. 2.1. Análisis del contexto genómico del gen fur2 (csal3097). Antes de la obtención de un mutante en el regulador Fur2, se realizó un análisis in silico la región del genoma en la que se encontraba el gen fur2 (csal3097) y se analizó su entorno genómico (http://genome.ornl.gov/microbial/csal/). Como se observa en la Figura 30, el gen fur2 forma una única unidad transcripcional, ya que el gen localizado corriente abajo (csal3096) se encuentra en posición opuesta a éste. Además, se procedió a la búsqueda de promotores utilizando herramientas de predicción de promotores bacterianos (http://www.softberry.com). La búsqueda in silico de promotores indicó que tanto corriente arriba como corriente abajo de fur2 existen regiones promotoras, confirmando así que fur es una unidad transcripcional independiente, lo que permitió diseñar una estrategia de mutagénesis mediante inserción de cassette sin causar una mutación polar en los genes localizados en posición 3’. Figura 30. Organización génica de la región Csal_3097 (fur2) de C. salexigens. Región genómica de C salexigens que contiene el gen fur (Csal_3097), corriente abajo el gen Csal_3096 implicado en la reparación del ADN, y corriente arriba se localizan los genes Csal_3098 (gen SmpA/OmlA), Csal_3099 (proteína de función desconocida), Csal_3100 (ciclasa) y Csal_3101 (Ssr-unión a proteínas). Las flechas indican las posiciones de los promotores putativos. Por otro lado, se realizó un análisis mediante BLAST para comparar la proteína Fur2 con otras homólogas, encontrándose que Fur2 presenta un dominio conservado característico de la superfamilia de reguladores Fur, con una similitud del 93% con proteínas anotadas como Fur del csal 3097 csal3096 csal 3098 csal 3099 csal 3100 csal 3101 smpB; SsrA- unión proteína ciclasa/ dehidrasa Proteína de función desconocida SmpA/ OmlA fur2 Proteína reparadora DNA; RecN (130pb) (1pb) (15pb) (78pb) (132pb) Capítulo IV: Resultados 101 a 70°C. El contenido intracelular de hierro fue medido por espectrometría de emisión de plasma atómico (ICP-OES). De acuerdo con el test tstudent, las diferencias significativas (p-value ≤ 0.05) comparado con la cepa silvestre se mostraron con 2 asteriscos cuando las diferencias fueron significativas. Tabla 11. Porcentaje de hierro intracelular acumulado por las cepas mutantes en comparación con la cepa silvestre. 2.3.4. Expresión de genes relacionados con el transporte de hierro. Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se procedió a analizar el papel de los reguladores Fur en la homeostasis del hierro de una manera más específica estudiando varios genes implicados en el transporte de hierro. La determinación de la expresión de los genes se llevó a cabo mediante RT-PCR cuantitativa, siendo el ARN extraído en fase exponencial tardía. Este estudio se realizó en las condiciones de baja y elevada salinidad con y sin aporte de hierro en el medio. Por este motivo se han seleccionado algunos de los genes más relevantes implicados en el transporte de hierro:  el gen Yggx relacionado con el tráfico de Fe2+, se considera un mediador en las transacciones de hierro entre la adquisición de hierro y los procesos que lo requieren, como la síntesis o reparación de grupos Fe-S en enzimas biosintéticas. Además, es necesario para mantener altos niveles de la enzima aconitasa baja estrés oxidativo (Pomposiello et al., 2003; Cui et al., 2006; Osborne et al., 2009).  el gen EfeU, transportador transmembrana de hierro ferroso (Fe2+) (Große et al., 2006). Forma parte de un transportador de hierro ferroso compuesto por EfeU, EfeO y EfeB. EfeO se considera una cupredoxina, por lo que el transporte de hierro se encuentra asociado al Cu2+ (Rajasekaran et al., 2010).  el gen Zip, transportadores que son capaces de transportar una variedad de cationes, incluidos cadmio, hierro, manganeso y zinc (Guerinot, 2000). Capítulo IV: Resultados 102 Si nos centramos en la cepa silvestre (Figura 35), se observó que no hay diferencias significativas en el gen Yggx en ninguna condición, sin embargo, el gen Zip está regulado por hierro a elevada salinidad, siendo éste un inhibidor de la expresión. Por otro lado, el gen EfeU se encuentra osmorregulado, a elevada salinidad está sobreexpresado en comparación con baja salinidad. Además, un aporte de hierro en el medio inhibe la expresión, ya sea a baja como a elevada salinidad. Con respecto al mutante fur1, a 0.6 M de NaCl sin aporte de hierro se observó que hay una disminución de la expresión en los 3 genes de estudio, comportándose el regulador Fur1 como un activador de los 3 genes. Además, este papel de activación de Fur1 se da en todas las condiciones en el gen EfeU cuando está unido a hierro, solo a elevada salinidad sin aporte de hierro es cuando el papel de Fur1 cambia a inhibidor de la expresión del gen EfeU. En el mutante fur2, no se observaron diferencias significativas ni en el gen Yggx, ni en el gen Zip, lo que si destacó es el papel inhibidor en el gen EfeU del regulador Fur2 en todas las condiciones. En ausencia de los dos reguladores (mutante fur1fur2) hay una inhibición del gen Yggx a baja salinidad, igual ocurre con el gen Zip, existe una inhibición de dicho gen tanto a baja como a elevada salinidad con y sin aporte de hierro comparado con la cepa silvestre. Sin embargo, con respecto al gen EfeU, el papel cambió, ya que en ausencia de los dos reguladores hay una activación del gen tanto a baja salinidad con hierro como a elevada salinidad con y sin aporte de hierro. Capítulo IV: Resultados 103 Figura 35. Determinación de la expresión de los genes Yggx, Zip y EfeU implicados en el transporte de hierro en la cepa silvestre y en los mutantes fur a baja y elevada salinidad en condiciones de exceso y limitación de hierro. El ARN total fue extraído de cultivos crecidos en medio mínimo M63, o medio mínimo M63 suplementado con 50 µM FeCl3 a 0.6 o 2.5 M NaCl. La expresión de los genes fue medida por RT-PCR cuantitativa. De acuerdo con el test tstudent, las diferencias significativas (p-value ≤ 0.05) comparado con la cepa silvestre se mostraron con 2 asteriscos cuando las diferencias fueron significativas y un fold-change menor/igual o superior a 2. 2.4. Implicación de los reguladores Fur en la osmoadaptación. 2.4.1. Crecimiento de los mutantes fur a baja y elevada salinidad en condiciones de limitación o exceso de hierro. Para comprobar el papel de los reguladores Fur en la osmoadaptación de C. salexigens en condiciones de limitación o exceso de hierro se monitorizó tanto el crecimiento de la cepa silvestre como de las cepas mutantes fur2 CHR215 (fur2::) y CHR216 (  fur1 fur2::), a 0,6 M y 2,5 M de NaCl, y en condiciones limitantes (0,0 µM Fe3Cl) y de exceso de hierro (50 µM Fe3Cl), siendo la glucosa la única fuente de carbono. La concentración de hierro escogida para el ensayo viene dada de los resultados observados previamente en el apartado 1, siendo ésta la que producía un mayor efecto en la modificación de la concentración de ectoínas y un aumento en el valor máximo alcanzado en la biomasa celular a elevada salinidad. En condiciones de baja salinidad y limitación de hierro (Figura 36 A), se observó que el mutante fur2 presentó un retraso en el crecimiento (0.17 de tasa de crecimiento frente a 0.23 de la cepa silvestre (Tabla 12)), alcanzando niveles de D.O más bajos que la cepa silvestre. Sin embargo, fueron los mutantes fur1 y el doble mutante fur1fur2 los más afectados a baja Capítulo IV: Resultados 104 salinidad (0,12 y 0,11 respectivamente), presentando un crecimiento mucho más lento y alcanzando valores de D.O mucho más bajos que los obtenidos con las cepas silvestre y el mutante fur2. Este hecho sugiere que tanto Fur1 como Fur2 están implicados en la osmoadaptación de C. salexigens en condiciones de baja salinidad, pareciendo ser más relevante el papel de Fur1 en estas condiciones. Por otro lado, en condiciones de exceso de hierro, el comportamiento de todas las cepas fue similar al observado en condiciones limitantes de hierro, indicando que en estas condiciones de baja salinidad el aporte de hierro no mejora el crecimiento de los mutantes. A elevada salinidad (Figura 36B) y en condiciones limitantes de hierro, el crecimiento tanto del mutante fur1 como del mutante fur2 se afectó de forma similar (0.08 y 0.09 respectivamente). Sin embargo, el doble mutante presentó un crecimiento mucho más lento que el de las otras cepas (0.06), alcanzando la fase estacionaria al cabo de las 70 horas, mientras que las demás cepas lo hicieron antes (50-60 horas). En condiciones de exceso de hierro, se observó una mejora del crecimiento y un aumento en la biomasa final en la cepa silvestre. Con respecto a los mutantes, el aporte de hierro causó una mejora en el crecimiento del mutante fur1 y se observó un comportamiento similar al de la cepa silvestre en condiciones de ausencia de aporte de hierro. Sin embargo, con respecto al mutante fur2, aunque el aporte de hierro causó una mejora en su crecimiento, éste no llegó a alcanzar los niveles observados con las otras dos cepas, es decir, que se detectó un mayor efecto en estas condiciones que con el mutante fur1. De todas las cepas, fue en el doble mutante en el que se observó un mayor efecto sobre el crecimiento, ya que, aunque se apreció una ligera mejora en el crecimiento en condiciones de exceso de hierro, este efecto fue menor que el observado con en el resto de las cepas. Estos resultados sugieren que tanto Fur1 como Fur2 intervienen en la osmoadaptación de C. salexigens en condiciones de elevada salinidad, si bien el regulador Fur2 parece tener un papel más relevante que Fur1 en estas condiciones, al contrario de lo que sucede en condiciones de baja salinidad. Capítulo IV: Resultados 105 Figura 36. Crecimiento de la cepa silvestre y de los mutantes fur en función de la salinidad. Crecimiento en medio mínimo M63 a baja (A) y elevada salinidad (B). La cepa silvestre de C. salexigens y las cepas mutantes (fur1¯, fur2¯ y fur1fur2¯) se cultivaron a 0,6 y 2,5 M de NaCl, a 37ºC sin y con aporte de hierro (50µM Cl3Fe) Tabla 12. Tasa de crecimiento y biomasa obtenidas de las curvas de crecimiento a 0.6 y 2.5 M de NaCl a 37°C y con limitación y exceso de hierro. Capítulo IV: Resultados 106 2.4.2. Implicación de los mutantes fur en la acumulación de ectoína e hidroxiectoína en función de la salinidad. Para dilucidar si las diferencias observados en el crecimiento de los mutantes se correlacionaban con la acumulación de ectoínas y para comprobar también si había diferencias significativas entre los fenotipos, se cuantificó mediante HPLC-MS el contenido intracelular de dichos solutos compatibles, en las mismas condiciones que el apartado anterior. Así, a 0,6 M de NaCl no se observaron diferencias significativas entre la producción de ectoínas por la cepa silvestre y por los mutantes (Figura 37), apreciándose además que el hierro no influyó en la producción de ectoínas a baja salinidad en ninguno de los casos. Con respecto al contenido intracelular de ectoína a elevada salinidad, se observó un ligero aumento en la producción de la misma por los mutantes y, sobre todo, por el mutante fur2, al compararlo con la producción de la cepa silvestre. Este hecho sugiere que tanto Fur1 como Fur2 estarían implicados en la regulación de la síntesis de ectoínas, y que se comportarían como activadores. Por otro lado, en condiciones de aporte de hierro se observó en la cepa silvestre una disminución en la concentración intracelular de ectoína (al igual que en los resultados anteriores), hecho que también se observó tanto en el mutante fur1 como en el mutante fur2. En el doble mutante es donde se observó el efecto más acusado, ya que presentó una menor producción de ectoína que los mutantes simples, llegando a alcanzar los niveles producidos por la cepa silvestre. Figura 37. Contenido intracelular de ectoína de las cepas silvestre (wt) y mutantes fur de C. salexigens. Las cepas fueron cultivadas en medio mínimo M63, a 0,6 M y 2,5 M de NaCl con y sin aporte de hierro, con glucosa como única fuente de carbono. El contenido intracelular de ectoína de la cepa silvestre y de los mutantes se cuantificó mediante HPLC-MS. La acumulación de solutos intracelulares se expresó en miligramos de soluto por peso seco celular. Las Capítulo IV: Resultados 107 muestras fueron tomadas al final de la fase exponencial. Se han considerado diferencias significativas aquellas que producen una variación de ˃ 20% y, además, según el test t-Student, cuando el p-value ˂0.1 o ˂0.05, indicándose con dos asteriscos. En el caso de la hidroxiectoína (Figura 38), a baja salinidad, cuando no hay aporte de hierro no se encontraron diferencias significativas entre las cepas mutantes simples y la cepa silvestre, solo en el doble mutante es donde se apreciaron dichas diferencias significativas, con un 63% más de hidroxiectoína en comparación con la cepa silvestre. Sin embargo, cuando añadimos hierro al medio se observó un aumento del contenido intracelular de hidroxiectoína en todas las cepas, destacando el mutante fur1 y el doble mutante con aproximadamente un 76%. Estos hechos sugieren que los reguladores Fur1 y Fur2 están implicados en la regulación de la síntesis de hidroxiectoína, actuando como activadores. A elevada salinidad, sin aporte de hierro se produjo un aumento del contenido de hidroxiectoína de todas las cepas mutantes excepto el mutante fur2 cuyo contenido intracelular es similar al de la cepa silvestre. A elevada salinidad, con aporte de hierro en el medio, se produjo un aumento de la concentración de este soluto compatible en todas las cepas de estudio, destacando el doble mutante que acumula casi un 73% más que la cepa silvestre. Lo que sí cabe destacar es que se confirma que un exceso de hierro en el medio favorece la hidroxilación de la ectoína para obtener hidroxiectoína, observándose este resultado sobretodo en el doble mutante. Figura 38. Contenido intracelular de hidroxiectoína de las cepas silvestre (wt) y mutantes fur de C. salexigens. Las cepas fueron cultivadas en medio mínimo M63, a 0,6 M y 2,5 M de NaCl con y sin aporte de hierro, con glucosa como única fuente de carbono. El contenido intracelular de hidroxiectoína de la cepa silvestre y de los mutantes se cuantificó mediante HPLC-MS. La acumulación de solutos intracelulares se expresó en miligramos de soluto por peso seco celular. Las muestras fueron tomadas al final de la fase exponencial. Se han considerado diferencias significativas aquellas que producen una variación de ˃ 20% y, además, según el test t-Student, cuando el p-value ˂0.1 o ˂0.05, indicándose con dos asteriscos. Capítulo IV: Resultados 108 2.4.3. Determinación de la expresión de los genes implicados en la síntesis de ectoínas en los mutantes fur. Estudios anteriores de nuestro grupo se había comprobado que la homeostasis del hierro está muy ligada a la capacidad de osmoadaptación de esta bacteria halófila y, por lo tanto, a la síntesis de ectoínas a través del regulador global Fur1. Únicamente en C. salexigens se ha demostrado una relación directa entre Fur y la síntesis de solutos compatibles (Figura 39) (Argandoña et al., 2010). Figura 39. Esquema de la ruta de síntesis de ectoínas en C. salexigens, donde se puede apreciar los genes que intervienen y las posibles regiones promotoras donde se unen los reguladores Fur. Tras el análisis de los resultados obtenidos por qPCR se observó una compleja regulación de los genes de síntesis de ectoína (ectA) e hidroxiectoína (ectD y ectE) por parte de ambos reguladores Fur (Figura 40 y 41), observándose que a elevada salinidad el control que ejercen ambos Fur es más relevante. Si nos centramos en el gen ectA, destacó la regulación por sal, observándose que aumenta la expresión del gen más del doble. A baja salinidad ya sea sin hierro en el medio como con un aporte de dicho metal, no se observaron diferencias significativas en ninguno de los 3 mutantes en comparación con la cepa silvestre. A elevada salinidad sin aporte de hierro tanto el regulador Fur1 como el regulador Fur2 se comportarían como inhibidores de la expresión del gen ectA, ya que al estar mutados hay un aumento en los niveles de expresión, mientras que en presencia de hierro parece ser que es Fur2 el que interviene en la regulación del gen, siendo este un inhibidor. Con respecto al gen ectD, si nos fijamos en la cepa silvestre, hay una activación por hierro a baja salinidad y una activación por sal. Por otro lado, a baja salinidad con aporte de hierro hay una regulación de inhibición por parte de Fur2, además hay un mecanismo dependiente de Capítulo IV: Resultados 109 hierro que activa la expresión del gen. A elevada salinidad, sin aporte de hierro, parece ser que el regulador Fur2 es el que juega un papel más relevante, siendo este un inhibidor de ectD. En el caso de ectE, se observó que hay una regulación dependiente de hierro y de salinidad. La regulación de Fur1 es dependiente de la salinidad, ya que a baja salinidad se comportaría como un activador, pero a elevada salinidad tanto con hierro como sin hierro actuaría como un inhibidor. Sin embargo, Fur2 actuarían en ambas salinidades como un inhibidor y también de forma independiente de Fe. Cabe destacar como hay un mecanismo de activación por hierro independientemente de la salinidad que se observó cuando no están presentes ninguno de los reguladores Fur. Figura 40. Determinación de la expresión de los genes implicados en la síntesis de ectoínas en la cepa silvestre y en los mutantes fur a baja y elevada salinidad en condiciones de exceso y limitación de hierro. El ARN total fue extraído de cultivos crecidos en medio mínimo M63, o medio mínimo M63 suplementado con 50 µM FeCl3 a 0.6 o 2.5 M NaCl. La expresión de los genes fue medida por RT-PCR cuantitativa. De acuerdo con el test tstudent, las diferencias significativas (p-value ≤ 0.05) comparado con la cepa silvestre se mostraron con 2 asteriscos cuando las diferencias fueron significativas y un fold-change menor/igual o superior a 2. Capítulo IV: Resultados 110 Figura 41. Hipótesis sobre los mecanismos dependientes de salinidad y/o Fe que intervienen en el control transcripcional de los genes implicados en la síntesis de ectoínas (ectA, ectD y ectE) a través de reguladores Fur. 3. Análisis de la influencia del hierro y de los reguladores Fur en la homeostasis del hierro y la termoadaptacion de C. salexigens. 3.1. Análisis del crecimiento de los mutantes fur a elevada temperatura en presencia y ausencia de hierro. Para comprobar el papel de los reguladores Fur en la termoadaptación de C. salexigens en condiciones de limitación o exceso de hierro se monitorizó tanto el crecimiento de la cepa silvestre como de las cepas mutantes fur1 (CHR134) (Argandoña y col., 2010), fur2 (CHR215) y fur1fur2 (CHR216) en condiciones de elevada salinidad y temperatura (45°C), y en condiciones limitantes (0 µM Fe3Cl) y de exceso de hierro (50 µM Fe3Cl). Dicha concentración de hierro se escogió para el ensayo dado que habíamos observado previamente que ésta era la que producía un mayor efecto en la modificación de la concentración de ectoínas y un aumento en el valor máximo alcanzado en la biomasa celular a elevada salinidad. Como se observó en la figura 42 A en condiciones de limitación de hierro, las cepas mutantes sufrieron un retraso en el crecimiento con respecto a la cepa silvestre destacando sobre todo el mutante fur1. En la tabla 13 se muestra las tasas de crecimiento observándose que el mutante fur1 creció 3 veces más lento que la cepa silvestre (0.028 frente a 0.099) mientras que el mutante fur2 presentó una tasa de crecimiento reducida a la mitad con respecto a la cepa silvestre. Con respecto a la densidad óptica, ni el mutante fur2 ni el mutante fur1 alcanzaron la densidad óptica de la cepa silvestre, cuyo valor de este último es la mitad. Fijándonos en el doble mutante (fur1fur2) se apreció un retraso en el crecimiento con respecto a la cepa silvestre, pero Capítulo IV: Resultados 117 Figura 47. Contenido intracelular de hierro de la cepa silvestre y las cepas mutantes fur1, fur2 y fur1fur2 a 45°C. El ensayo se realizó en medio mínimo M63 a 45°C sin aporte (A) y con aporte de hierro (B), las células de alícuotas de 5 ml fueron tomadas en mitad de fase exponencial y se lavaron 3 veces con medio M63 modificado, el pellet se secó a 70°C. El contenido intracelular de hierro fue medido por espectrometría de emisión de plasma atómico (ICP-OES). De acuerdo con el test tstudent, las diferencias significativas (p-value ≤ 0.05) comparado con la cepa silvestre fueron mostradas con 2 asteriscos. Los datos de contenido intracelular de hierro no guardaron relación con los datos de producción de sideróforos, porque como puede ser que la cepa silvestre que no sintetizó sideróforos tuviera la misma cantidad de hierro que las cepas mutantes que si se apreció una desrregulación de la síntesis de sideróforos. Se llevó a cabo la determinación de la expresión de estos genes en la cepa silvestre y en los mutantes fur1, fur2 y fur1fur2 a 2.5 M NaCl y a 45°C. Como se observó en la figura 48 A y B, solo se encontraron diferencias significativas en la expresión del gen Yggx en el mutante fur1 ya sea con aporte o con limitación de hierro, comportándose el regulador Fur1 como un activador del gen Yggx. Capítulo IV: Resultados 118 Con respecto al gen Zip, cuando hay limitación de hierro (Figura 48 C) se apreció la disminución de la expresión del gen en todas las cepas mutantes en comparación con la cepa silvestre, comportándose tanto el regulador Fur1 como Fur2 como activadores de la expresión del gen Zip. La bajada de expresión en el doble mutante se debe a la ausencia de los 2 reguladores. En condiciones de exceso de hierro, figura 48 D, solo el mutante fur1 y el doble mutante tuvieron una disminución de la expresión estadísticamente significativa con respecto a la cepa silvestre, siendo el regulador Fur1 el que ejerce el papel principal en esta condición comportándose como un activador. En cuanto a la expresión del gen EfeU en condiciones de no hierro, figura 48 E, se observó como en un mutante fur1 la expresión es más de dos veces mayor que la de la cepa silvestre, sin embargo, en el mutante fur2 no se apreciaron diferencias significativas; esto nos da a entender que en esta condición es el regulador Fur1 el que lleva un papel más relevante, siendo este represor de la expresión del gen EfeU. El doble mutante por el contrario presentó una disminución de la expresión respecto a la wt, este comportamiento debe ser por otro factor diferente a los reguladores Fur1 y Fur2. Cuando hay un exceso de hierro en el medio (Figura 48 F) se produjo un cambio de papel, es decir, un mutante fur1 no presentó diferencias en la expresión con respecto a la cepa silvestre, pero sorprendentemente los niveles de expresión del mutante fur2 y del mutante fur1fur2 fueron altísimos, llegando incluso a tener 50 veces más de expresión que la wt. En esta condición, sería el regulador Fur2 el que presentó el papel más importante, comportándose como represor. Capítulo IV: Resultados 119 Figura 48. Determinación de la expresión de los genes envueltos en el transporte de hierro en la cepa silvestre y las cepas mutantes fur1, fur2 y fur1fur2 por qPCR a elevada temperatura. A) expresión del gen YggX sin aporte de hierro, B) gen Yggx con aporte de hierro, C) gen Zip sin aporte de hierro, D) gen Zip con aporte de hierro, E) gen efeU sin aporte de hierro y F) gen efeU con aporte de hierro. Las cepas fueron crecidas en medio mínimo M63 a 2.5 M NaCl a 45°C bajo condiciones de limitación y exceso de hierro. El ARN total fue extraído del cultivo celular y la expresión fue medida por RT-PCR cuantitativa. Según el test t-student, las diferencias significativas (p-value≤0.05) comparado con el control (cepa silvestre) fueron mostradas con 2 asteriscos. Además, se tuvo en cuenta un fold-change mayor de 2 de las unidades relativas de expresión. 4. Transcriptoma diferencial de los mutantes fur en respuesta a la salinidad. Los resultados obtenidos en osmoadaptación y termoadaptación sugieren que los reguladores Fur desempeñan un papel relevante en el metabolismo central de C. salexigens, ya que están involucrados en el control del metabolismo de la ectoína. Es por ello, que se decidió profundizar en el estudio de dichos reguladores desde un punto de vista más global mediante la secuenciación masiva del transcriptoma en diferentes condiciones de salinidad. Capítulo IV: Resultados 120 4.1. Obtención del transcriptoma mediante RNAseq. Para estudiar las diferencias de expresión génica entre la cepa silvestre y los mutantes fur en respuesta a la salinidad, las cepas mutantes se cultivaron en medio mínimo M63 a baja y elevada salinidad. Con objeto de asegurar la reproductividad entre los distintos experimentos de análisis multiómicos realizados previamente en nuestro Grupo de Investigación (Salvador et al., 2018), y permitir su posterior comparación o incorporación de los mismos a un futuro modelo de regulación o metabólico a escala genómica, todas las muestras se cogieron en el mismo punto de la fase exponencial de crecimiento, respetando el estado metabólico de las distintas cepas, es decir, cuando se había consumido gran parte de la fuente de carbono. En la figura 49 se muestran las curvas de crecimiento de las cepas en las distintas salinidades. También se indica el punto de recogida de la muestra que coincide con el final de fase exponencial, pero cuando todavía queda fuente de carbono en el medio. Este punto permite, por una parte, asegurar que las células todavía se encuentren en fase exponencial, y por otra, permite recoger una mayor cantidad de biomasa, facilitando con ello la obtención de cantidad suficiente de ARNm para su posterior secuenciación. Figura 49. Monitorización del crecimiento de los mutantes fur y punto de recogida de las muestras para el análisis del transcriptoma por RNAseq. Las cepas se cultivaron por triplicado en medio mínimo M63 con glucosa 20 mM a 37°C con 0,6 M de NaCl: A) mutante fur1, B) mutante fur2 o 2,5 M de NaCl: C) mutante fur1 y D) mutante fur2. El punto de recogida de muestra se indicó con una flecha roja. Una vez alcanzado el punto donde se recoge la muestra, se recogieron alícuotas de 3 ml de los cultivos y se procedió, en primer lugar, a la extracción del ARN total. Una vez extraído el ARN, se eliminó la posible contaminación de ADN y se comprobó por PCR (ver material y Capítulo IV: Resultados 121 métodos). Posteriormente, la concentración de ARN se cuantificó por Nanodrop y se evaluó su calidad por electroforesis capilar de microfluidos utilizando un nanochip y el sistema Bioanalyzer. En todos los casos, los perfiles indicaron que no se había producido degradación, pudiéndose observar los picos correspondientes al ARNr 16S y ARNr 23S (Figura 50). Figura 50. Análisis de la calidad del ARN total mediante electroforesis capilar de los mutantes fur. Perfiles promedio de las muestras de ARN total utilizando nanochip en sistema Bioanalyzer (Agilent). Las muestras se obtuvieron de cultivos en medio M63 a 37°C con NaCl 0,6 M y NaCl 2,5 M. A continuación, se procedió a la eliminación del ARNr para la obtención de muestras enriquecidas en ARN mensajero (ARNm) a partir de las muestras de ARN total. Para ello, se utilizaron de forma secuencial dos kits diferentes para eliminar el ARNr en un 99% (Ver material y métodos) y obtener cantidad suficiente para la secuenciación. Finalmente se evaluaron los perfiles de los ARNm obtenidos mediante el sistema Agilent RNA 6000 pico kit. En la figura 51 se puede observar la distribución del tamaño del fragmento de las muestras sin observarse degradación y donde no se aprecian los picos de ARNr 16S y 23S, confirmando la depleción casi total de los mismos. Por último, se midió la concentración de ARNm por fluorimetría. Capítulo IV: Resultados 122 Figura 51. Análisis de la calidad del ARNm mediante electroforesis capilar de los mutantes fur. Perfiles promedio de las muestras de ARNm utilizando picochip en sistema Bioanalyzer (Agilent). El ARN total procedente de cultivos en medio M63 con 0,6 y 2,5 M NaCl a 37°C se procesó para eliminar el 99% del ARNr 23S y 16S. La secuenciación del ARNm se realizó mediante la plataforma Ilumina y se llevó a cabo por la empresa Sistemas Genómicos (Valencia). Para ello se utilizó la estrategia de “paired-ends” o secuenciación en pares. Esta estrategia consiste en la secuenciación de un fragmento de ADN desde ambos extremos, lo que permite obtener fragmentos largos de casi 600 pb. Esto mejora el ensamblado posterior de las secuencias, generando datos de secuencia alineables de alta calidad. Además, la secuenciación en pares facilita la detección de reordenamientos genómicos y elementos de secuencia repetitivos, así como fusiones de genes y transcritos novedosos. 4.2. Normalización y validación de los datos de RNAseq. Para comparar las muestras entre si es necesario normalizar los datos de cuantificación para poder de esta manera evitar las distorsiones en los análisis posteriores provocadas por las diferentes desviaciones estadísticas (Risso et al., 2011; Hansen et al., 2012). Las desviaciones de mayor peso se producen en función de la longitud del gen, el tamaño de librería por muestra y el contenido en GC, entre otros. Aplicando los distintos protocolos de normalización se pueden eliminar o minimizar estos efectos. En la figura 52 se observan los resultados después de la normalización de los datos en función del tamaño de la librería. Este valor, junto a los diferentes procesos estadísticos que se describen en Trapnell y colaboradores (Trapnell et al., 2013) permite eliminar los sesgos estadísticos. Capítulo IV: Resultados 123 Figura 52. Normalización de las muestras. Distribución de la cuantificación por gen para condición sin normalizar A) Fur1 y C) Fur2. Distribución de la cuantificación por gen para cada muestra normalizada por tamaño de librería B) Fur1 y D) Fur2. No se observaron desplazamientos durante los diferentes pasos de normalización en las muestras, tanto de la cepa silvestre como en la cepa mutante, por lo que la distribución de la expresión génica fue reproducible. Se realizó un estudio de componentes principales (PCA) para comprobar la reproductibilidad entre las muestras de una misma condición, este permite analizar la agrupación de las muestras y su variabilidad entre ellas. De esta forma se puede comprobar la relación entre las condiciones y entre las réplicas, y asegurarse de que ninguna de ellas tiene un comportamiento anómalo y que, por tanto, todas se pueden considerar como réplicas biológicas dentro de cada condición estudiada. En la figura 53 se puede observar las comparativas entre la cepa silvestre y el mutante fur1 a baja salinidad (A) y a elevada salinidad (B), así como el mutante fur2 a baja salinidad (C) y alta salinidad (D). se pudo observar un alto nivel de similitud entre las réplicas de la cepa silvestre, las cuales difirieron significativamente de las de los mutantes fur. Además, las réplicas biológicas de cada cepa fueron más similares entre sí, segregándose de los perfiles transcripcionales de la otra cepa, considerándose por tanto buenas replicas biológicas. Esto permito la inclusión de todas ellas en el estudio de expresión diferencial. Capítulo IV: Resultados 124 Figura 53. Análisis PCA de las diferentes réplicas biológicas utilizando el transcriptoma completo normalizado. A) Entre la cepa silvestre y el mutante fur1 a baja salinidad, B) entre la cepa silvestre y el mutante fur1 a elevada salinidad, C) entre la cepa silvestre y el mutante fur2 a baja salinidad y D) entre la cepa silvestre y el mutante fur2 a elevada salinidad. A continuación, se calcularon los distintos parámetros de expresión diferencial:  baseMean, o el nivel medio de expresión del gen objeto de estudio.  Fold-change, que indica la variación en el nivel de expresión de un transcrito entre dos condiciones.  P-value, indica la fiabilidad del valor del fold-change, desde el punto de vista estadístico.  padj o p-value ajustado mediante FDR que indica la fiabilidad del valor del foldchange, desde el punto de vista estadístico. Se compararon los datos de fold-change de wt y los mutantes fur para cada salinidad, observándose que más del 60% de los genes diferencialmente expresados entre la cepa silvestre y los mutantes fur se encontraban dentro del rango 2-4 de fold-change (con un p-value ˂0,05), tal y como se puede ver en la figura 54. Así, se consideró que un gen se encontraba diferencialmente expresado cuando la media del número de lecturas por gen de cada una de las réplicas biológicas tuvo una variación de ˃ ±1,8 (valor umbral) y un valor de p-value ajustado mediante “False Discovery Rate” de ˂ 0,05 (Yoav Benjamini and Yosef Hochberg, 1995). Capítulo IV: Resultados 125 Figura 54. Porcentaje de genes incluidos en los distintos rangos de fold-change del transcriptoma diferencial de la cepa silvestre de C. salexigens frente a los mutantes fur1 y fur2. A y B) rangos de fold-change en mutante fur1 a baja y elevada salinidad y C y D) rangos de fold-change en mutante fur2 a baja y elevada salinidad. Para visualizar la proporción de genes diferencialmente expresados respecto al total de genes contenidos en el genoma se usó los gráficos de tipo MA o MA-plot, en este tipo de gráfico cada punto representa un gen. En este caso en el eje X se representó la expresión media normalizada y en el eje Y el log de los datos de fold-change, obteniéndose un diagrama de dispersión. En la figura 55 se puede observar los “MA plot” de los mutantes fur para cada salinidad. Sobre la línea horizontal 0 se muestran los genes que no están diferencialmente expresados entre ambas condiciones. Los puntos negros representan los transcritos que están diferencialmente expresados, pero en niveles por debajo del valor umbral seleccionado (con un valor absoluto de fold-change ˂1,8) y que, en consecuencia, no son significativos. Los puntos rojos que se encuentran en el eje horizontal por encima del valor 0, representan los transcritos que se encuentran sobreexpresados en la cepa mutante frente a la cepa silvestre, mientras que los puntos rojos que se encuentran por debajo del cero en el eje X corresponden a los transcritos que poseen una menor expresión en la cepa mutante frente a la cepa silvestre. Ambos por encima del valor umbral seleccionado, es decir con un valor absoluto de fold-change ˃ 1,8. Según esto, se observó una independencia entre el nivel de expresión medio (eje X) y la expresión diferencial (puntos rojos), entre la cepa silvestre y el mutante fur1 a baja salinidad (Figura 55A) y el mutante fur2 (Figura 55C) como ha elevada salinidad, siendo el mutante fur1 la figura 55B y el mutante fur2 la figura 55D. Capítulo IV: Resultados 126 Figura 55. MA-plot del transcriptoma de la cepa silvestre de C. salexigens frente a los mutantes fur1 y fur2. Cada gráfico muestra la distribución de los valores del log de los datos de fold-change frente a los valores de expresión media entre la cepa silvestre y los mutantes fur. A y B) baja y elevada salinidad respectivamente en un mutante fur1 y C y D) a baja y elevada salinidad en fur2. En rojo se muestran los datos cuyo fold-change es ˃± 1,8. Los triángulos representan los valores que exceden el área de visualización del gráfico. Otro tipo de gráficas para visualizar la proporción de genes diferencialmente expresados respecto al total de genes contenidos en el genoma son las gráficas en volcanes o Volcano-plot, en ellas se visualizan la varianza entre dos muestras en términos de valores de expresión génica. En este caso, se representó gráficamente (Figura 56) el –log10 de los valores p calculados (eje Y) frente a los cambios –log2 (eje X). los puntos grises corresponden a genes que no variaron de forma significativa, mientras que los puntos rojos representaron los genes cuya expresión significativa fue de Fold-change ˃ ±1,8 y –log10 p-value ˂ 0,05. Capítulo VIII: Anexo 229 Others CSAL_RS09045 Csal_1785 uracil-xanthine permease COG2233F K16345 -4,272 -2,719 -2,799 -3,169 1,77E-03 8,97E-04 3,74E-03 3,87E-03 CSAL_RS00395 Csal_0076 cytosine/purines uracil thiamine allantoin permease COG1953FH K03457 -7,754 -8,519 -6,217 -5,474 3,44E-05 1,56E-05 3,50E-07 1,77E-03 Metabolism of other amino acids Selenoamino acid metabolism CSAL_RS08575 Csal_1686 sulfate adenylyltransferase subunit 2 COG0175EH K00957 -2,612 -5,954 -2,543 -6,492 3,84E-07 7,59E-10 2,66E-07 5,40E-10 CSAL_RS01930 Csal_0385 S-adenosylmethionine synthetase COG0192H K00789 2,424 2,49E-15 CSAL_RS08820 Csal_1740 gamma-glutamyltransferase COG0405E K00681 -2,270 3,03E-03 CSAL_RS08330 Csal_1636 cysteine synthase B COG0031E K12339 2,137 1,965 5,54E-04 3,94E-03 beta-Alanine metabolism CSAL_RS15530 Csal_3067 aspartate alpha-decarboxylase COG0853H K01579 -5,023 -3,373 -3,208 -3,155 5,50E-04 5,05E-05 6,09E-04 6,72E-04 CSAL_RS00720 Csal_0142 aldehyde dehydrogenase COG1012C - 2,043 1,90E-02 CSAL_RS14730 Csal_2913 aldehyde dehydrogenase COG1012C K00128 2,580 6,41E-09 CSAL_RS06555 Csal_1289 4-aminobutyrate aminotransferase COG0160E K07250 2,341 1,963 4,51E-10 6,88E-04 CSAL_RS05730 Csal_1125 beta alanine--pyruvate transaminase COG0161H K00822 2,194 6,86E-07 CSAL_RS05735 Csal_1126 methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase COG1012C K00140 1,964 1,01E-06 Glutathione metabolism CSAL_RS09520 Csal_1875 NADPH-glutathione reductase COG1249C K00383 2,719 1,858 2,11E-07 1,83E-03 CSAL_RS12775 Csal_2521 aminopeptidase N COG0308E K01256 2,605 3,70E-22 Capítulo VIII: Anexo 230 CSAL_RS08820 Csal_1740 gamma-glutamyltransferase COG0405E K00681 -2,270 3,03E-03 CSAL_RS13875 Csal_2741 glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase COG0364G K00036 2,199 1,57E-02 CSAL_RS10815 Csal_2125 glutathione S-transferase-like protein COG0625O K00799 -2,051 2,82E-04 CSAL_RS05275 Csal_1029 LamB/YcsF family protein COG1540R K07160 -2,020 1,66E-02 CSAL_RS00300 Csal_0057 glutathione synthase COG0189HJ K01920 1,854 4,05E-04 CSAL_RS14295 Csal_2825 glutathione peroxidase COG0386O K00432 -1,834 1,68E-02 Taurine and hypotaurine metabolism CSAL_RS08820 Csal_1740 gamma-glutamyltransferase COG0405E K00681 -2,270 3,03E-03 CSAL_RS00815 Csal_0161 short-chain dehydrogenase/reductase SDR COG4221R K15373 -13,484 -9,269 -13,252 -7,638 7,13E-03 4,76E-08 3,44E-03 9,15E-06 CSAL_RS14990 Csal_2966 L-alanine dehydrogenase COG0686E K00259 1,810 9,92E-11 CSAL_RS06805 Csal_1340 glutamate dehydrogenase COG2902E K15371 1,877 6,15E-03 Cyanoamino acid metabolism CSAL_RS08820 Csal_1740 gamma-glutamyltransferase COG0405E K00681 -2,270 3,03E-03 D-Glutamine and D-glutamate metabolism CSAL_RS11165 Csal_2192 UDP-N-acetylmuramoylalanine--D-glutamate ligase COG0771M K01925 2,003 2,32E-02 Phosphonate and phosphinate metabolism CSAL_RS14130 Csal_2792 N-acetyltransferase GCN5 COG1247M K03823 2,158 2,56E-04 Other CSAL_RS14600 Csal_2885 2OG-Fe(II) oxygenase COG3491R - 1,831 2,13E-04 Carbohydrate metabolism Ascorbate and aldarate metabolism Capítulo VIII: Anexo 231 CSAL_RS12610 Csal_2487 5-dehydro-4-deoxyglucarate dehydratase COG0329EM K00957 -6,179 -11,638 -9,193 -8,500 1,49E-05 3,38E-11 3,94E-09 6,49E-07 CSAL_RS08925 Csal_1761 UDP-glucose 6-dehydrogenase COG1004M K00012 2,144 2,164 1,942 1,958 1,86E-06 1,59E-06 1,94E-05 3,17E-04 CSAL_RS00720 Csal_0142 aldehyde dehydrogenase COG1012C - 2,043 1,90E-02 CSAL_RS14730 Csal_2913 aldehyde dehydrogenase COG1012C K00128 2,580 6,41E-09 CSAL_RS09445 Csal_1860 UDP-glucose/GDP-mannose dehydrogenase COG1004M K00012 2,144 1,889 8,68E-04 7,13E-03 CSAL_RS12605 Csal_2486 mandelate racemase/muconate lactonizing protein COG4948MR K01706 -2,073 2,94E-04 CSAL_RS05805 Csal_1140 aldehyde dehydrogenase COG1012C K14519 1,967 2,444 8,80E-04 6,65E-05 CSAL_RS12560 Csal_2476 mandelate racemase/muconate lactonizing protein COG4948MR - -1,805 8,80E-04 CSAL_RS12555 Csal_2475 amidohydrolase 2 COG3618R - -1,802 1,73E-03 Starch and sucrose metabolism CSAL_RS01190 Csal_0236 HAD family hydrolase COG1877G K01087 -5,012 -2,576 -3,267 -2,907 5,95E-09 1,26E-04 1,19E-06 1,40E-04 CSAL_RS08925 Csal_1761 UDP-glucose 6-dehydrogenase COG1004M K00012 2,144 2,164 1,86E-06 1,59E-06 CSAL_RS15075 Csal_2983 phosphomannomutase COG1109G K15778 1,932 1,947 1,43E-04 2,75E-04 CSAL_RS09445 Csal_1860 UDP-glucose/GDP-mannose dehydrogenase COG1004M K00012 2,144 8,68E-04 Pentose phosphate pathway CSAL_RS04230 Csal_0831 deoxyribose-phosphate aldolase COG0274F K01619 2,551 2,348 2,67E-03 1,50E-02 CSAL_RS01880 Csal_0375 fructose-bisphosphate aldolase COG1830G K11645 2,238 4,04E-11 CSAL_RS14325 Csal_2831 quinoprotein glucose dehydrogenase COG4993G K00117 -2,463 1,63E-05 Capítulo VIII: Anexo 232 CSAL_RS00105 Csal_0019 ribose-5-phosphate isomerase A COG0120G K01807 2,078 1,79E-06 CSAL_RS01790 Csal_0357 ribose-5-phosphate isomerase COG0698G K01808 3,458 5,86E-03 CSAL_RS13875 Csal_2741 glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase COG0364G K00036 2,199 1,57E-02 CSAL_RS08875 Csal_1751 NAD(P)-dependent oxidoreductase COG2084I - -9,817 -11,560 -5,508 -6,896 5,72E-07 1,71E-08 1,35E-07 1,58E-04 CSAL_RS04220 Csal_0829 phosphopentomutase COG1015G K01839 -1,878 -1,906 1,61E-02 7,22E-03 CSAL_RS15075 Csal_2983 phosphomannomutase COG1109G K15778 1,932 1,947 1,43E-04 2,75E-04 CSAL_RS04810 Csal_0936 phosphogluconate dehydratase COG0129EG K01690 1,961 1,11E-02 CSAL_RS03340 Csal_0645 transaldolase B COG0176G K00616 1,929 4,98E-04 Pentose and glucuronate interconversions CSAL_RS08925 Csal_1761 UDP-glucose 6-dehydrogenase COG1004M K00012 2,144 2,164 1,86E-06 1,59E-06 CSAL_RS09445 Csal_1860 UDP-glucose/GDP-mannose dehydrogenase COG1004M K00012 2,144 8,68E-04 CSAL_RS15030 Csal_2974 mandelate racemase/muconate lactonizing protein COG4948MR - -10,011 -49,333 -6,871 -34,337 1,33E-10 3,05E-29 1,26E-15 9,11E-23 CSAL_RS05805 Csal_1140 aldehyde dehydrogenase COG1012C K14519 2,444 6,65E-05 CSAL_RS11310 Csal_2221 KpsF/GutQ family protein COG0794M K06041 1,858 8,21E-04 CSAL_RS06685 Csal_1316 aldo/keto reductase COG0656R K06222 1,900 8,64E-03 CSAL_RS08865 Csal_1749 altronate dehydratase COG2721G K01685 1,877 1,57E-02 Glycolysis / Gluconeogenesis CSAL_RS14725 Csal_2912 zinc-binding alcohol dehydrogenase COG1064R K13953 3,302 2,153 1,73E-08 6,15E-04 CSAL_RS07945 Csal_1559 pyruvate kinase COG0469G K00873 2,307 2,011 1,94E-02 9,87E-04 CSAL_RS00720 Csal_0142 aldehyde dehydrogenase COG1012C - 2,043 1,90E-02 CSAL_RS04365 Csal_0855 pyruvate dehydrogenase subunit E1 COG2609C K00163 2,283 6,44E-12 Capítulo VIII: Anexo 233 CSAL_RS14730 Csal_2913 aldehyde dehydrogenase COG1012C K00128 2,580 6,41E-09 CSAL_RS05560 Csal_1091 alcohol dehydrogenase GroES-like protein COG1063ER K00001 3,759 2,87E-24 CSAL_RS01880 Csal_0375 fructose-bisphosphate aldolase COG1830G K11645 2,238 4,04E-11 CSAL_RS04815 Csal_0937 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase COG0057G K00134 2,239 6,71E-03 CSAL_RS04415 Csal_0865 acetyl-coenzyme A synthetase COG0365I K01895 2,065 5,84E-06 CSAL_RS16365 Csal_3230 phosphoglycerate mutase COG0406G K15634 -2,372 6,55E-03 CSAL_RS15075 Csal_2983 phosphomannomutase COG1109G K15778 1,932 1,947 1,43E-04 2,75E-04 CSAL_RS05050 Csal_0985 alcohol dehydrogenase GroES-like protein COG1062C K00121 1,901 1,05E-04 CSAL_RS12480 Csal_2460 aldehyde dehydrogenase COG1012C - -1,960 2,08E-03 CSAL_RS02310 Csal_0453 gluconolactonase COG3386G - -1,842 2,20E-04 CSAL_RS07520 Csal_1482 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase COG0057G K00134 -1,955 1,09E-06 Fructose and mannose metabolism CSAL_RS01880 Csal_0375 fructose-bisphosphate aldolase COG1830G K11645 2,238 4,04E-11 CSAL_RS17230 Csal_1692 mannose-1-phosphate guanylyltransferase (GDP) COG0836M K00971 -2,008 -1,854 3,20E-04 7,62E-03 CSAL_RS03325 Csal_0642 putative fructose transport system kinase COG1072H - -2,542 1,55E-02 CSAL_RS15075 Csal_2983 phosphomannomutase COG1109G K15778 1,932 1,947 1,43E-04 2,75E-04 CSAL_RS08990 Csal_1774 mannose-1-phosphate guanylyltransferase (GDP) COG0836M K16011 1,988 1,65E-03 CSAL_RS16190 Csal_3195 mandelate racemase/muconate lactonizing protein COG4948MR - -1,979 1,20E-03 Citrate cycle (TCA cycle) Capítulo VIII: Anexo 234 CSAL_RS04365 Csal_0855 pyruvate dehydrogenase subunit E1 COG2609C K00163 2,283 6,44E-12 CSAL_RS06175 Csal_1214 succinate dehydrogenase subunit D COG2142C K00242 -2,061 1,72E-05 CSAL_RS10470 Csal_2058 bifunctional aconitate hydratase 2/2- methylisocitrate dehydratase COG1049C K01682 2,164 5,35E-04 CSAL_RS14970 Csal_2962 aconitase COG1048C K01681 1,883 1,980 1,40E-04 1,08E-02 CSAL_RS10730 Csal_2108 fumarate hydratase COG0114C K01679 -1,832 1,28E-06 Galactose metabolism CSAL_RS08730 Csal_1722 UDP-galactose 4-epimerase COG1087M K01784 -2,750 3,72E-04 CSAL_RS05215 Csal_1017 galactose 1-dehydrogenase COG0673R K00035 1,956 1,870 1,895 1,82E-04 1,40E-02 2,41E-04 CSAL_RS15075 Csal_2983 phosphomannomutase COG1109G K15778 1,932 1,947 1,43E-04 2,75E-04 CSAL_RS03315 Csal_0640 tagatose-bisphosphate aldolase noncatalytic subunit COG4573G K16371 1,896 9,19E-03 Pyruvate metabolism CSAL_RS07945 Csal_1559 pyruvate kinase COG0469G K00873 2,307 2,011 1,94E-02 9,87E-04 CSAL_RS00720 Csal_0142 aldehyde dehydrogenase COG1012C - 2,043 1,90E-02 CSAL_RS04365 Csal_0855 pyruvate dehydrogenase subunit E1 COG2609C K00163 2,283 6,44E-12 CSAL_RS14730 Csal_2913 aldehyde dehydrogenase COG1012C K00128 2,580 6,41E-09 CSAL_RS04415 Csal_0865 acetyl-coenzyme A synthetase COG0365I K01895 2,065 5,84E-06 CSAL_RS09875 Csal_1944 hydroxyacylglutathione hydrolase COG0491R K01069 -1,971 -2,346 2,21E-03 1,76E-12 CSAL_RS03580 Csal_0692 sodium pump decarboxylase subunit gamma COG3630C K01573 3,260 8,97E-04 Capítulo VIII: Anexo 235 CSAL_RS03545 Csal_0685 glyoxalase/bleomycin resistance protein/dioxygenase COG0346E K01759 -1,821 -2,010 3,02E-05 1,21E-04 CSAL_RS01260 Csal_0251 2,3-dimethylmalate lyase COG2513G K01003 1,993 2,641 3,55E-04 1,63E-17 CSAL_RS07940 Csal_1558 methylglyoxal synthase COG1803G K01734 1,832 1,974 1,996 7,73E-04 1,82E-02 1,52E-03 CSAL_RS12745 Csal_2515 2-isopropylmalate synthase COG0119E K01649 1,930 5,38E-04 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism CSAL_RS16120 Csal_3181 hydroxypyruvate isomerase COG3622G K01816 -3,065 -9,440 -2,641 -6,152 5,49E-06 1,23E-04 2,70E-07 5,76E-03 CSAL_RS13805 Csal_2727 oxidoreductase alpha (molybdopterin) subunit COG0243C - 2,129 2,366 6,11E-04 9,62E-06 CSAL_RS14055 Csal_2776 tartrate dehydrogenase COG0473CE K07246 2,173 1,94E-05 CSAL_RS08120 Csal_1594 HAD family hydrolase COG0546R K01091 -2,027 4,77E-06 CSAL_RS12425 Csal_2449 isocitrate lyase COG2224C K01637 -1,904 -2,015 8,97E-04 1,94E-05 CSAL_RS10470 Csal_2058 bifunctional aconitate hydratase 2/2- methylisocitrate dehydratase COG1049C K01682 2,164 5,35E-04 CSAL_RS09185 Csal_1812 glycine cleavage system protein H COG0509E K02437 2,417 2,74E-03 CSAL_RS05605 Csal_1100 catalase COG0753P K03781 -1,830 -1,923 1,18E-02 2,00E-03 CSAL_RS13605 Csal_2688 glycolate oxidase FAD binding subunit COG0277C K11472 -1,889 1,05E-02 CSAL_RS03965 Csal_0777 glutamine synthetase COG0174E K01915 -1,852 1,53E-02 CSAL_RS16290 Csal_3215 RuBisCo-like protein COG1850G K01601 -1,860 1,15E-02 CSAL_RS13610 Csal_2689 glycolate oxidase iron-sulfur subunit COG0247C K11473 -1,814 5,41E-05 CSAL_RS06010 Csal_1181 L-glutamine synthetase COG0174E K01915 1,862 2,78E-03 CSAL_RS15310 Csal_3029 3-oxoacyl-ACP reductase COG1028IQR K00023 -1,969 9,00E-04 Amino sugar and nucleotide sugar metabolism Capítulo VIII: Anexo 236 CSAL_RS16625 Csal_3282 glucosamine-1-phosphate N- acetyltransferase/UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase COG1207M - 2,714 2,829 2,228 3,139 2,03E-10 7,83E-07 4,57E-08 1,27E-06 CSAL_RS08925 Csal_1761 UDP-glucose 6-dehydrogenase COG1004M K00012 2,144 2,164 1,86E-06 1,59E-06 CSAL_RS08730 Csal_1722 UDP-galactose 4-epimerase COG1087M K01784 -2,750 3,72E-04 CSAL_RS09445 Csal_1860 UDP-glucose/GDP-mannose dehydrogenase COG1004M K00012 2,144 8,68E-04 CSAL_RS17230 Csal_1692 mannose-1-phosphate guanylyltransferase (GDP) COG0836M K00971 -2,008 3,20E-04 CSAL_RS08105 Csal_1591 UDP-N-acetylmuramate dehydrogenase COG0812M K00075 2,102 1,918 3,23E-03 1,39E-02 CSAL_RS15075 Csal_2983 phosphomannomutase COG1109G K15778 1,932 1,947 1,43E-04 2,75E-04 CSAL_RS04705 Csal_0915 nucleotidyl transferase COG1208MJ - 2,043 4,63E-04 CSAL_RS08990 Csal_1774 mannose-1-phosphate guanylyltransferase (GDP) COG0836M K16011 1,988 1,65E-03 CSAL_RS04710 Csal_0916 aminoglycoside phosphotransferase COG3178R K07102 1,818 7,37E-04 CSAL_RS15600 Csal_3079 phosphoglucosamine mutase COG1109G K03431 1,908 9,14E-04 CSAL_RS00165 Csal_0031 amidase, hydantoinase/carbamoylase COG0624E K06016 -1,875 1,31E-02 Propanoate metabolism CSAL_RS00720 Csal_0142 aldehyde dehydrogenase COG1012C - 2,043 1,90E-02 CSAL_RS14730 Csal_2913 aldehyde dehydrogenase COG1012C K00128 2,580 6,41E-09 CSAL_RS06555 Csal_1289 4-aminobutyrate aminotransferase COG0160E K07250 2,341 4,51E-10 CSAL_RS05730 Csal_1125 beta alanine--pyruvate transaminase COG0161H K00822 2,194 6,86E-07 CSAL_RS04415 Csal_0865 acetyl-coenzyme A synthetase COG0365I K01895 2,065 5,84E-06 Capítulo VIII: Anexo 237 CSAL_RS12055 Csal_2380 methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase COG1012C K00140 -2,498 6,34E-03 CSAL_RS12285 Csal_2421 2-methylisocitrate lyase COG2513G K03417 -1,916 1,60E-03 CSAL_RS05735 Csal_1126 methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase COG1012C K00140 1,964 1,01E-06 CSAL_RS12280 Csal_2420 2-methylcitrate synthase COG0372C K01659 -1,847 5,91E-04 Butanoate metabolism CSAL_RS00720 Csal_0142 aldehyde dehydrogenase COG1012C - 2,043 1,90E-02 CSAL_RS04365 Csal_0855 pyruvate dehydrogenase subunit E1 COG2609C K00163 2,283 6,44E-12 CSAL_RS14730 Csal_2913 aldehyde dehydrogenase COG1012C K00128 2,580 6,41E-09 CSAL_RS06555 Csal_1289 4-aminobutyrate aminotransferase COG0160E K07250 2,341 4,51E-10 CSAL_RS06175 Csal_1214 succinate dehydrogenase subunit D COG2142C K00242 -2,061 1,72E-05 CSAL_RS09220 Csal_1820 acetoacetyl-CoA synthetase COG0365I K01907 -2,060 6,23E-04 CSAL_RS06560 Csal_1290 succinate semialdehyde dehydrogenase COG1012C K00135 -1,926 2,78E-03 CSAL_RS11655 Csal_2291 succinate semialdehyde dehydrogenase COG1012C K00135 1,825 3,12E-03 Inositol phosphate metabolism CSAL_RS12055 Csal_2380 methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase COG1012C K00140 -2,498 6,34E-03 CSAL_RS05735 Csal_1126 methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase COG1012C K00140 1,964 1,01E-06 Others CSAL_RS00365 Csal_0070 HpcH/HpaI aldolase COG3836G - -2,598 -3,513 -4,059 -4,121 2,69E-04 1,36E-05 1,98E-11 2,43E-04 CSAL_RS01345 Csal_0268 HAD family hydrolase COG0637R - -2,295 -3,041 -2,590 -3,358 1,14E-07 3,89E-11 1,37E-10 1,80E-07 Capítulo VIII: Anexo 238 CSAL_RS02360 Csal_0463 short-chain dehydrogenase/reductase SDR COG0300R - -4,905 -2,790 -4,911 -5,417 1,82E-17 2,22E-15 5,93E-10 3,91E-07 CSAL_RS03300 Csal_0637 HAD family hydrolase COG0637R - 2,584 4,72E-03 CSAL_RS08795 Csal_1735 altronate dehydratase COG2721G K01685 -1,980 1,20E-03 CSAL_RS03905 Csal_0764 alpha/beta hydrolase COG0596R K00433 -1,963 7,00E-04 CSAL_RS12530 Csal_2470 alpha/beta hydrolase COG2267I - 1,809 1,97E-02 Glycan biosynthesis and metabolism Lipopolysaccharide biosynthesis CSAL_RS11215 Csal_2202 phosphoheptose isomerase COG0279G K03271 -2,713 -2,403 -2,266 -2,868 1,12E-06 9,67E-05 1,41E-05 2,18E-05 CSAL_RS00095 Csal_0017 bifunctional heptose 7-phosphate kinase/heptose 1-phosphate adenyltransferase COG2870M K03272 2,383 3,011 2,955 2,311 8,69E-05 4,97E-06 1,91E-06 8,40E-04 CSAL_RS00055 Csal_0009 lipopolysaccharide heptosyltransferase II COG0859M K02843 2,402 1,880 2,31E-11 1,25E-04 CSAL_RS00100 Csal_0018 three-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase-like protein COG1519M K02527 2,252 1,844 1,852 1,68E-04 5,76E-06 8,31E-03 CSAL_RS08550 Csal_1681 lipopolysaccharide biosynthesis protein COG3765M - -3,471 -2,898 -2,212 -2,822 4,08E-09 9,21E-12 3,53E-04 2,20E-07 CSAL_RS09670 Csal_1905 histone deacetylase superfamily protein - - -2,003 -1,852 -1,912 3,41E-04 1,05E-04 6,25E-03 CSAL_RS10450 Csal_2054 UDP-2,3-diacylglucosamine hydrolase COG2908S K03269 -1,987 -2,349 -1,994 6,00E-04 1,62E-03 3,42E-03 Peptidoglycan biosynthesis CSAL_RS11165 Csal_2192 UDP-N-acetylmuramoylalanine--D-glutamate ligase COG0771M K01925 2,003 2,32E-02 CSAL_RS08105 Csal_1591 UDP-N-acetylmuramate dehydrogenase COG0812M K00075 2,102 3,23E-03 Capítulo VIII: Anexo 245 CSAL_RS09025 Csal_1781 LysR family transcriptional regulator COG0583K - -1,809 1,05E-04 CSAL_RS05265 Csal_1027 LysR family transcriptional regulator COG0583K - -1,880 1,99E-03 CSAL_RS12080 Csal_2385 LysR family transcriptional regulator COG0583K - -1,931 2,07E-03 CSAL_RS12450 Csal_2454 LysR family transcriptional regulator COG0583K - -1,980 1,13E-02 XRE family CSAL_RS09675 Csal_1906 XRE family transcriptional regulator COG1396K - -2,800 -2,268 -2,624 -2,900 2,11E-08 3,53E-05 1,21E-09 2,60E-05 CSAL_RS01950 Csal_0389 XRE family transcriptional regulator COG1396K - 2,481 4,106 5,797 6,672 2,81E-03 6,42E-04 1,26E-19 1,25E-05 CSAL_RS06140 Csal_1209 XRE family transcriptional regulator COG1396K - 2,056 1,816 5,33E-15 4,50E-07 CSAL_RS08530 Csal_1677 XRE family plasmid maintenance system antidote protein COG3093R - 1,851 2,064 1,967 3,01E-05 1,43E-10 1,77E-02 RipR family CSAL_RS03490 Csal_0674 RpiR family transcriptional regulator COG1737K - -3,829 -8,596 -4,568 -10,627 7,89E-05 2,70E-09 1,29E-06 2,06E-09 CSAL_RS00475 Csal_0092 RpiR family transcriptional regulator COG1737K - -1,993 6,29E-04 CSAL_RS05295 Csal_1033 RpiR family transcriptional regulator COG1737K - -1,949 4,63E-03 GntR family CSAL_RS03850 Csal_0753 GntR family transcriptional regulator COG2186K - -7,342 -3,959 -4,371 -2,453 1,61E-10 9,01E-19 1,01E-13 2,47E-04 CSAL_RS15025 Csal_2973 GntR family transcriptional regulator COG1802K - -3,816 -59,151 -3,025 -18,709 8,98E-03 2,35E-11 8,29E-04 2,16E-08 CSAL_RS01730 Csal_0345 GntR family transcriptional regulator COG1802K K11475 2,037 2,506 2,249 2,224 2,53E-05 1,75E-05 1,06E-07 5,17E-04 Capítulo VIII: Anexo 246 CSAL_RS08815 Csal_1739 GntR family transcriptional regulator COG2186K - 2,017 2,197 2,985 2,183 2,93E-03 1,55E-03 4,16E-08 2,11E-03 CSAL_RS03725 Csal_0722 GntR family transcriptional regulator COG2188K K03710 -2,748 -9,532 -2,209 -5,573 5,62E-04 3,55E-16 2,33E-05 2,40E-06 CSAL_RS13245 Csal_2616 GntR family transcriptional regulator COG2186K - -2,421 -2,055 3,37E-04 1,18E-02 CSAL_RS05610 Csal_1101 GntR family transcriptional regulator COG1167KE - -2,126 3,84E-05 CSAL_RS08835 Csal_1743 GntR family transcriptional regulator COG1802K - 2,014 8,66E-03 CSAL_RS16180 Csal_3193 GntR family transcriptional regulator COG2186K - 2,149 5,23E-03 CSAL_RS13700 Csal_2707 GntR family transcriptional regulator COG1802K - 4,115 1,99E-16 CSAL_RS00360 Csal_0069 GntR family transcriptional regulator COG1802K - 1,824 2,197 1,969 8,77E-03 7,26E-07 8,03E-03 CSAL_RS08870 Csal_1750 GntR family transcriptional regulator COG1802K - 1,987 2,011 4,07E-03 3,47E-03 CSAL_RS02020 Csal_0403 GntR family transcriptional regulator COG2186K K05799 -1,905 7,04E-03 CSAL_RS05510 Csal_1076 GntR family transcriptional regulator COG1802K - -1,861 1,95E-02 CSAL_RS05555 Csal_1090 GntR family transcriptional regulator COG1167KE - 1,821 8,55E-03 CSAL_RS03960 Csal_0776 GntR family transcriptional regulator COG1802K - -1,835 5,34E-03 AraC family CSAL_RS01735 Csal_0346 AraC family transcriptional regulator COG2207K - -2,713 -4,361 -3,619 -4,417 6,88E-07 6,70E-11 1,68E-26 2,11E-08 CSAL_RS16065 Csal_3170 GlxA family transcriptional regulator COG4977K K17736 2,053 1,83E-02 CSAL_RS16400 Csal_3237 AraC family transcriptional regulator COG2207K - 2,778 5,57E-06 Capítulo VIII: Anexo 247 CSAL_RS14735 Csal_2914 AraC family transcriptional regulator COG2207K - -2,199 2,63E-03 CSAL_RS13205 Csal_2607 AraC family transcriptional regulator COG2207K - -1,876 -2,224 1,01E-02 2,66E-03 CSAL_RS12870 Csal_2540 AraC family transcriptional regulator COG2207K - 1,817 1,61E-02 CSAL_RS16510 Csal_3259 AraC family transcriptional regulator COG2207K - -1,978 6,23E-03 CSAL_RS01965 Csal_0392 AraC family transcriptional regulator COG2207K - -1,998 3,10E-03 Fur family CSAL_RS09555 Csal_1882 ferric uptake regulator family protein COG0735P K09823 -3,349 -4,597 1,03E-08 6,65E-21 Csal_3097 ferric uptake regulator family protein COG0735P K03711 -1,805 3,19E-03 TetR family CSAL_RS04865 Csal_0947 TetR family transcriptional regulator COG1309K K03577 -2,625 -2,286 -2,410 -2,940 3,35E-11 1,67E-04 3,51E-12 9,94E-05 CSAL_RS14715 Csal_2910 TetR family transcriptional regulator COG1309K - -2,329 -3,589 -2,860 -4,271 3,58E-03 1,87E-04 5,53E-06 1,35E-04 CSAL_RS00210 Csal_0041 TetR family transcriptional regulator COG1309K - 2,065 6,80E-03 CSAL_RS10525 Csal_2069 TetR family transcriptional regulator COG1309K - -1,980 1,46E-05 LacI family CSAL_RS01365 Csal_0272 LacI family transcriptional regulator COG1609K K02529 -8,726 -9,728 -6,208 -7,231 3,35E-06 5,95E-27 1,49E-08 8,74E-12 CSAL_RS13410 Csal_2649 LacI family transcriptional regulator COG1609K - -2,159 -2,169 1,66E-02 2,69E-03 CSAL_RS04765 Csal_0927 LacI family transcriptional regulator COG1609K - -1,998 1,89E-03 MerR family Capítulo VIII: Anexo 248 CSAL_RS02375 Csal_0466 MerR family transcriptional regulator COG0789K - -1,965 -1,907 6,82E-07 5,08E-04 IclR family CSAL_RS00680 Csal_0134 IclR family transcriptional regulator COG1414K - -3,009 -1,912 1,88E-05 1,53E-04 CSAL_RS01705 Csal_0340 IclR family transcriptional regulator COG1414K - -1,928 -2,453 1,93E-02 1,82E-02 CSAL_RS01490 Csal_0297 IclR family transcriptional regulator COG1414K K02624 -1,904 8,79E-04 CSAL_RS00345 Csal_0066 IclR family transcriptional regulator COG1414K K13641 1,825 2,19E-04 MarR family CSAL_RS01400 Csal_0279 MarR family transcriptional regulator COG1846K - 1,986 2,24E-03 Rcf2 family CSAL_RS06265 Csal_1232 Transcriptional regulator, BadM/Rrf2 family COG1959K - 2,247 1,39E-02 DeoR family CSAL_RS10715 Csal_2105 DeoR family transcriptional regulator COG1349KG K02444 -2,006 4,12E-03 CSAL_RS01795 Csal_0358 DeoR family transcriptional regulator COG2390K - 1,880 3,96E-03 Other families CSAL_RS02300 Csal_0451 anaerobic nitric oxide reductase transcriptional regulator COG3604KT K12266 -1,968 1,05E-02 CSAL_RS04535 Csal_0884 AsnC family transcriptional regulator COG1522K - -1,808 1,24E-02 CSAL_RS04470 Csal_0876 Crp/FNR family transcriptional regulator COG0664T K01420 -1,811 2,21E-03 Others CSAL_RS13100 Csal_2586 transcriptional regulator NrdR COG1327K K07738 1,851 9,11E-04 Capítulo VIII: Anexo 249 CSAL_RS05435 Csal_1060 two component transcriptional regulator COG0745TK - -2,142 7,05E-04 CSAL_RS08770 Csal_1730 transcriptional repressor COG1940KG - 1,882 2,49E-03 CSAL_RS12320 Csal_2428 transcriptional regulator CysB COG0583K K13634 -1,803 6,46E-03 CSAL_RS03750 Csal_0727 two component transcriptional regulator COG0745TK 1,980 7,25E-03 CSAL_RS12245 Csal_2418 two component transcriptional regulator COG0745TK K02483 -1,851 1,08E-04 CSAL_RS03230 Csal_0627 carbon storage regulator CsrA COG1551T K03563 -1,836 1,70E-03 Membrane transport(ordenar) ABC transporters, Prokaryotic Type Molybdate transporter CSAL_RS13550 Csal_2677 molybdenum ABC transporter periplasmic molybdate-binding protein COG0725P K02020 2,730 2,357 2,894 2,287 8,86E-04 2,79E-03 4,69E-04 9,06E-03 Tungstate transporter CSAL_RS10595 Csal_2083 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG4662H K05773 -2,921 -2,044 1,90E-04 1,90E-03 CSAL_RS10600 Csal_2084 Molybdate-binding protein COG2998H K05772 -2,081 7,91E-04 CSAL_RS10590 Csal_2082 ABC transporter-like protein COG1131V K06857 -1,837 1,37E-02 Mineral and organic ion transporters Iron(III) transporter CSAL_RS02855 Csal_0551 iron ABC transporter permease COG1178P K02011 -3,895 -2,293 -4,154 -2,868 1,34E-05 1,86E-04 2,96E-06 4,42E-05 CSAL_RS15655 Csal_3090 Iron(III) dicitrate transport system permease protein FecD COG0609P K02015 -1,872 -1,845 4,89E-03 1,01E-02 CSAL_RS07355 Csal_1449 extracellular solute-binding protein COG1840P K02012 -1,875 1,70E-02 Capítulo VIII: Anexo 250 Osmoprotectant transporter CSAL_RS14895 Csal_2946 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG1174E - -4,286 -2,072 -4,898 -2,407 3,40E-05 1,43E-02 8,96E-08 1,10E-02 CSAL_RS01125 Csal_0223 choline transport protein BetT COG1292M - 2,344 3,95E-11 CSAL_RS11955 Csal_2353 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG1174E K05846 -2,087 2,47E-04 CSAL_RS11965 Csal_2355 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG1174E K05846 2,309 4,59E-06 CSAL_RS08625 Csal_1701 glycine betaine/choline ABC transporter substratebinding protein COG1732M - 2,884 1,89E-05 Spermidine/putrescine transporter CSAL_RS06070 Csal_1193 extracellular solute-binding protein COG0687E K11069 -1,914 2,599 -2,088 1,88E-03 2,38E-04 2,04E-03 CSAL_RS06085 Csal_1196 ABC transporter-like protein COG3842E K11072 1,967 4,85E-04 CSAL_RS06080 Csal_1195 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG1176E K11071 -1,923 7,80E-03 Glycine betaine/proline transporter CSAL_RS14605 Csal_2886 glycine betaine ABC transporter substrate-binding protein COG2113E K02002 1,891 2,085 1,71E-06 8,34E-06 CSAL_RS12465 Csal_2457 glycine betaine ABC transporter substrate-binding protein COG2113E - -3,798 -2,706 -4,349 -3,288 2,82E-03 6,00E-03 6,53E-06 1,09E-02 CSAL_RS01105 Csal_0219 glycine betaine ABC transporter protein COG2113E K02002 -2,040 1,13E-08 CSAL_RS09655 Csal_1902 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG4176E K02001 -2,264 -1,934 7,69E-07 1,02E-03 Capítulo VIII: Anexo 251 CSAL_RS15715 Csal_3102 glycine betaine ABC transporter substrate-binding protein COG2113E K02002 -1,935 -2,144 5,58E-06 1,09E-05 CSAL_RS07700 Csal_1517 glycine betaine ABC transporter substrate-binding protein COG2113E K02002 1,871 1,30E-03 Putative hydroxymethylpyrimidine transporter CSAL_RS09815 Csal_1932 ABC transporter-like protein COG1116P K15600 2,167 9,60E-04 CSAL_RS09820 Csal_1933 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG0600P K15599 -1,872 2,33E-02 CSAL_RS09825 Csal_1934 NLPA lipoprotein COG0715P K15598 -1,990 5,28E-03 Saccharide and polyol transporters Glucose/mannose transporter CSAL_RS12235 Csal_2416 extracellular solute-binding protein COG1653G - 8,582 3,072 8,512 2,929 3,23E-52 1,84E-16 2,51E-09 1,81E-12 CSAL_RS12230 Csal_2415 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG1175G K17316 2,409 2,109 4,65E-03 2,03E-05 CSAL_RS12220 Csal_2413 ABC transporter-like protein COG3839G K10112 1,888 2,16E-02 Erythritol transporter CSAL_RS01815 Csal_0362 inner-membrane translocator COG1172G K17203 -5,453 -2,615 -4,114 -2,389 1,43E-03 2,69E-04 4,20E-04 9,19E-03 Phosphate and amino acid transporters Phosphate transporter CSAL_RS07505 Csal_1479 phosphate ABC transporter permease COG1117P K02036 -3,903 -2,468 -3,491 -2,085 6,65E-07 3,61E-04 1,84E-07 1,69E-02 CSAL_RS16535 Csal_3264 phosphate uptake regulator PhoU COG0704P K02039 2,126 1,84E-06 CSAL_RS05570 Csal_1093 ATPase COG0474P - 2,775 4,59E-04 Capítulo VIII: Anexo 252 CSAL_RS16555 Csal_3268 phosphate binding protein COG0226P K02040 1,972 1,907 1,99E-04 5,02E-04 CSAL_RS07495 Csal_1477 phosphate ABC transporter permease COG0573P K02037 -1,811 -1,906 4,75E-03 1,08E-02 CSAL_RS05580 Csal_1095 sodium/hydrogen exchanger COG4651P - -1,898 5,94E-03 CSAL_RS16550 Csal_3267 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG4590R - 1,846 1,14E-05 CSAL_RS07500 Csal_1478 phosphate ABC transporter permease COG0581P K02038 -1,846 9,07E-04 Phosphonate transporter CSAL_RS01240 Csal_0247 phosphonate-binding periplasmic protein COG3221P K02044 1,909 2,264 5,88E-06 4,01E-04 Glutamine transporter CSAL_RS16700 Csal_3297 amino acid ABC transporter permease COG0765E K10037 -5,337 -2,085 -3,218 -2,053 1,27E-04 3,03E-03 2,04E-04 1,29E-02 CSAL_RS16705 Csal_3298 extracellular solute-binding protein COG0834ET K10036 2,713 2,850 3,359 3,513 2,03E-03 7,48E-05 3,00E-04 4,02E-06 General L-amino acid transporter CSAL_RS00625 Csal_0123 ABC transporter-like protein COG1126E K09972 -1,938 4,71E-03 Branched-chain amino acid CSAL_RS07200 Csal_1418 extracellular ligand-binding receptor COG0683E K01999 3,603 2,502 3,624 2,571 4,02E-09 1,20E-04 6,38E-07 9,40E-05 CSAL_RS01045 Csal_0208 putative regulator protein COG0683E K01999 -6,514 -4,127 -9,245 -4,262 1,19E-05 4,52E-04 1,36E-11 1,68E-03 CSAL_RS07220 Csal_1422 ABC transporter-like protein COG0411E K01995 2,335 3,44E-03 CSAL_RS07210 Csal_1420 inner-membrane translocator COG0559E K01997 -1,803 5,11E-04 CSAL_RS08745 Csal_1725 putative leucine/isoleucine/valine-binding protein COG0683E - 1,914 2,50E-02 D-Methionine transporter Capítulo VIII: Anexo 253 CSAL_RS10685 Csal_2101 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG2011P K02072 -1,878 -2,523 1,40E-02 2,90E-04 Putative S-methylcysteine transporter CSAL_RS13175 Csal_2601 amino acid ABC transporter permease COG0765E - -4,682 -7,316 -3,698 -7,316 7,36E-07 1,07E-11 2,26E-06 1,70E-09 Putative polar amino acid transporter CSAL_RS02760 Csal_0532 amino acid ABC transporter permease COG4160E K02029 2,812 8,80E-03 CSAL_RS02775 Csal_0535 ABC transporter-like protein COG4598E K02028 2,151 5,21E-03 CSAL_RS02765 Csal_0533 amino acid ABC transporter permease COG4215E K02029 -1,869 2,96E-04 CSAL_RS14095 Csal_2784 extracellular solute-binding protein COG0834ET - -1,928 2,19E-04 Arginine/ornithine transporter CSAL_RS14090 Csal_2783 amino acid ABC transporter permease COG4160E - -7,153 -9,886 -7,263 -11,067 1,03E-05 1,04E-09 4,56E-09 8,16E-09 CSAL_RS14085 Csal_2782 amino acid ABC transporter permease COG4215E - -2,873 -2,747 -2,228 -2,248 1,71E-03 3,42E-06 1,89E-03 5,75E-03 Urea transporter CSAL_RS11765 Csal_2312 inner-membrane translocator COG0559E K11960 2,216 1,81E-02 Peptide and nickel transporters Oligopeptide transporter CSAL_RS15170 Csal_3001 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG1173EP K15582 -6,096 -3,441 1,58E-07 9,10E-07 CSAL_RS15165 Csal_3000 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG0601EP K15581 -2,563 1,34E-04 CSAL_RS15175 Csal_3002 ABC transporter-like protein COG4172R K10823 1,808 1,67E-02 Capítulo VIII: Anexo 254 CSAL_RS15160 Csal_2999 extracellular solute-binding protein COG4166E K15580 1,920 1,52E-05 Peptides/nickel transporter CSAL_RS09505 Csal_1872 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG0601EP K02033 -2,574 -2,747 1,978 4,95E-04 1,89E-04 1,58E-02 CSAL_RS09510 Csal_1873 extracellular solute-binding protein COG0747E K02035 2,827 3,933 1,13E-06 1,03E-06 CSAL_RS09495 Csal_1870 oligopeptide/dipeptide ABC transporter ATP- binding protein-like protein COG0444EP K02031 3,264 2,848 3,88E-07 1,47E-03 Microcin C transporter CSAL_RS09900 Csal_1949 ABC transporter-like protein COG4172R K13896 -2,061 -2,011 6,44E-05 4,34E-04 CSAL_RS09895 Csal_1948 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG4239R K13895 -1,812 -2,120 -2,278 1,65E-04 2,56E-05 1,68E-04 Metallic cation, iron-siderophore and vitamin B12 transporters zinc transporter CSAL_RS00950 Csal_0189 ABC transporter-like protein COG1121P K09817 37,584 93,019 1,83E-52 3,18E-216 CSAL_RS00955 Csal_0190 hypothetical protein COG1108P K09816 55,493 101,891 1,98E-100 9,05E-165 Putative zinc/manganese transporte CSAL_RS01110 Csal_0220 periplasmic solute binding protein COG0803P K02077 19,386 10,527 7,54E-36 1,34E-96 CSAL_RS01120 Csal_0222 ABC transporter-like protein COG1121P K02074 13,089 11,592 6,68E-19 7,44E-67 iron complex transporter CSAL_RS12305 Csal_2425 transport system permease COG0609P K02015 -2,114 -1,936 1,41E-03 4,95E-05 CSAL_RS12915 Csal_2549 ABC transporter-like protein COG1120PH - 2,055 3,52E-03 CSAL_RS05335 Csal_1041 transport system permease COG0609P K02015 -1,949 -1,902 -2,616 1,05E-03 3,23E-06 9,33E-05 Capítulo VIII: Anexo 261 CSAL_RS08005 Csal_1571 Na(+)-translocating NADH-quinone reductase subunit C COG2869C K00348 1,887 2,01E-06 CSAL_RS14685 Csal_2902 lysine exporter protein LysE/YggA COG1280E - 1,956 1,13E-02 CSAL_RS08010 Csal_1572 Na(+)-translocating NADH-quinone reductase subunit D COG1347C K00349 -1,885 1,93E-02 CSAL_RS14565 Csal_2878 lysine exporter protein LysE/YggA COG1280E - -1,836 1,64E-02 CSAL_RS12075 Csal_2384 Na+/solute symporter COG0591ER - -1,933 3,27E-03 CSAL_RS00980 Csal_0195 plasmid stabilization system protein COG3668R - -1,900 1,09E-09 CSAL_RS06345 Csal_1248 Sodium/proline symporter COG0591ER - -1,877 1,09E-02 CSAL_RS12340 Csal_2432 lysine exporter protein LysE/YggA COG1279R K06895 1,983 4,37E-03 Adhesin protein transporters CSAL_RS00275 Csal_0053 ABC transporter-like protein COG2274V K12541 -3,100 2,81E-08 Sugar transporter CSAL_RS05825 Csal_1144 MFS transporter COG2211G - -2,578 -6,639 -2,300 -3,354 1,81E-04 1,78E-12 2,70E-05 7,08E-05 CSAL_RS02555 Csal_0500 sugar porter family MFS transporter COG2814G - -4,161 -2,986 -4,563 -3,694 1,34E-02 7,04E-09 5,01E-04 4,76E-07 CSAL_RS13220 Csal_2611 sugar ABC transporter permease COG1175G - -11,823 -3,581 -5,823 -4,427 4,35E-05 5,43E-04 1,43E-06 2,15E-03 CSAL_RS01300 Csal_0259 sugar ABC transporter permease COG1175G K10237 -3,836 -25,131 -5,643 -10,459 3,26E-04 2,57E-32 1,76E-06 3,67E-12 Saccharide, polyol, and lipid transporters L-Arabinose transporter CSAL_RS05225 Csal_1019 periplasmic binding protein/LacI transcriptional regulator COG1879G K10537 2,192 4,81E-03 Capítulo VIII: Anexo 262 CSAL_RS05230 Csal_1020 L-arabinose transporter ATP-binding protein COG1129G K10539 -1,983 2,42E-03 Sorbitol/Mannitol transporter CSAL_RS03285 Csal_0634 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG1175G K10228 -4,560 -6,331 -3,544 -2,551 6,86E-04 1,63E-10 7,31E-06 1,45E-02 sn-Glycerol 3-phosphate transporter CSAL_RS13845 Csal_2735 ABC transporter-like protein COG3839G K05816 -4,290 -2,089 -2,767 -2,248 1,33E-04 1,28E-03 1,12E-04 5,44E-03 Phospholipid transporter CSAL_RS11290 Csal_2217 toluene tolerance protein COG2854Q K07323 -2,055 9,66E-04 Glycerol transporter CSAL_RS10635 Csal_2091 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG0395G - -3,293 -5,750 -2,473 -6,238 6,19E-04 4,41E-05 3,04E-05 2,73E-04 CSAL_RS10645 Csal_2093 ABC transporter-like protein COG3839G - -2,918 -8,139 -2,545 -6,894 5,10E-07 8,91E-09 2,91E-09 1,75E-06 CSAL_RS10640 Csal_2092 binding-protein-dependent transport system inner membrane protein COG1175G - -6,568 -9,214 -4,343 -8,699 1,46E-18 1,98E-07 2,27E-27 3,22E-06 Serine/threonine transporter CSAL_RS14545 Csal_2874 serine/threonine transporter SstT COG3633E - -2,917 -3,794 -2,132 -3,266 3,95E-03 3,36E-06 1,38E-04 1,09E-03 Not classified CSAL_RS00695 Csal_0137 major facilitator superfamily transporter COG2271G - -13,915 -25,514 -5,646 -32,768 7,19E-05 8,78E-05 2,30E-07 3,16E-04 CSAL_RS03830 Csal_0749 major facilitator superfamily transporter COG2814G - -21,929 -18,028 -8,868 -14,657 2,40E-03 2,85E-08 2,76E-07 2,68E-06 CSAL_RS00205 Csal_0040 major facilitator superfamily transporter COG2271G - -62,271 -5,780 -56,230 -6,188 9,54E-32 3,93E-04 8,64E-66 1,74E-03 CSAL_RS00315 Csal_0060 amino acid permease-associated protein COG0531E - -4,780 -4,364 -3,299 -2,804 9,70E-04 1,39E-06 2,56E-03 6,94E-03 Capítulo VIII: Anexo 263 CSAL_RS04200 Csal_0825 sulfate transporter COG0659P - -3,821 -2,302 -3,660 -2,276 1,59E-08 7,68E-04 2,48E-09 6,23E-03 CSAL_RS05760 Csal_1131 major facilitator superfamily transporter COG2223P K02575 -2,950 -2,619 -2,510 -2,871 3,09E-03 7,10E-04 1,64E-04 1,67E-02 CSAL_RS06525 Csal_1283 Sodium/myo-inositol cotransporter COG4146R K03307 -4,456 -3,667 -2,721 -2,016 8,95E-11 2,05E-11 6,57E-07 8,65E-03 CSAL_RS08930 Csal_1762 YeiH family putative sulfate export transporter COG2855S - -6,606 -3,864 -5,172 -3,664 8,50E-06 4,91E-04 4,47E-09 9,46E-03 CSAL_RS05195 Csal_1013 secretion protein HlyD COG1566V K03543 -17,788 -19,647 -10,573 -30,199 2,40E-17 1,21E-05 6,97E-16 3,85E-05 CSAL_RS07675 Csal_1512 acriflavin resistance protein COG0841V - -2,867 -2,279 -2,931 -2,861 1,24E-06 1,79E-03 8,25E-08 8,83E-04 CSAL_RS13990 Csal_2764 sulfate transporter COG0659P K03321 -2,963 -2,356 4,41E-04 3,09E-05 CSAL_RS01615 Csal_0322 major facilitator superfamily transporter COG2814G - -2,041 -1,974 3,90E-03 4,04E-05 CSAL_RS08240 Csal_1618 biopolymer transport protein ExbD/TolR COG0848U K03559 2,822 5,16E-05 CSAL_RS06690 Csal_1317 MATE efflux family protein COG0534V - -2,226 1,36E-04 CSAL_RS13595 Csal_2686 L-lactate transport COG1620C K03303 -4,326 1,03E-12 CSAL_RS07625 Csal_1503 nucleoside transporter COG1972F - -2,268 4,10E-04 CSAL_RS04755 Csal_0925 gluconate transporter COG2610GE - -2,503 -1,957 2,03E-05 5,99E-06 CSAL_RS06615 Csal_1302 MadN protein - - -2,007 1,29E-05 CSAL_RS09100 Csal_1795 anion transporter COG0471P K14445 -1,831 -3,705 4,17E-06 1,46E-10 CSAL_RS16025 Csal_3162 Ammonium transporter COG0004P K03320 2,009 4,74E-03 CSAL_RS06675 Csal_1314 hypothetical protein COG2353S - -2,008 1,30E-02 CSAL_RS09805 Csal_1930 potassium/proton antiporter COG3263P K11105 1,842 1,838 2,04E-08 9,75E-06 CSAL_RS04115 Csal_0808 hypothetical protein COG0842V K01992 -1,971 3,58E-03 CSAL_RS14540 Csal_2873 K+ transporter Trk COG0168P K03498 -1,918 1,56E-03 CSAL_RS10130 Csal_1994 Sulfate permease COG0659P K03321 -1,868 4,33E-03 CSAL_RS14380 Csal_2841 cytosine/purines uracil thiamine allantoin permease COG1457F - -1,867 2,09E-02 Capítulo VIII: Anexo 264 CSAL_RS07605 Csal_1499 sodium/calcium exchanger membrane protein COG0530P K07301 1,83929 3,05E-04 CSAL_RS13115 Csal_2589 camphor resistance protein CrcB COG0239D K06199 1,92181 4,10E-04 CSAL_RS16715 Csal_3300 VWA containing CoxE-like protein COG0038P - 1,859 1,55E-03 CSAL_RS11850 Csal_2330 major facilitator superfamily transporter - - -1,834 2,96E-03 CSAL_RS16360 Csal_3229 major facilitator superfamily transporter COG2814G K08156 1,874 8,83E-06 CSAL_RS05025 Csal_0980 choline/carnitine/betaine transport COG1292M - -1,887 3,15E-05 CSAL_RS14135 Csal_2793 extracellular solute-binding protein COG0834ET K10022 -1,821 1,11E-03 CSAL_RS15955 Csal_3148 amino acid carrier protein COG1115E K03310 -1,861 3,00E-04 CSAL_RS15260 Csal_3019 hypothetical protein COG4536P - -1,845 3,06E-03 Bacterial secretion system Type II secretion system Pilin secretion/fimbrial assembly protein CSAL_RS03135 Csal_0608 type IV pilus assembly protein PilM COG4972NU K02662 2,238 6,16E-05 Tight adherence (Tad) export apparatus CSAL_RS08435 Csal_1658 type II and III secretion system protein COG4964U K02280 -1,926 -2,751 9,81E-05 7,25E-05 Type IVa pilus homolog protein CSAL_RS15475 Csal_3056 hypothetical protein COG0762S K02221 -1,984 2,85E-03 CSAL_RS15460 Csal_3053 twitching motility protein COG2805NU K02669 1,912 1,06E-02 Sec (secretion) system Bacterial Sec-SRP protein CSAL_RS02090 Csal_0408 protein translocase subunit secE/sec61 gamma COG0690U K03073 -2,541 -3,583 -2,106 -2,680 1,70E-03 2,01E-07 1,02E-02 2,51E-04 Capítulo VIII: Anexo 265 CSAL_RS12150 Csal_2399 Sec-independent protein translocase TatD COG0084L K03424 -2,333 4,64E-05 CSAL_RS15250 Csal_3017 signal recognition particle subunit FFH/SRP54 (srp54) COG0541U K03106 1,810 2,50E-04 Type VI secretion system Imp/Vas secretion system protein CSAL_RS11495 Csal_2258 hypothetical protein COG3157S K11903 -3,479 -2,310 1,21E-07 9,80E-06 CSAL_RS11520 Csal_2264 hypothetical protein COG3522S K11893 -4,385 -2,892 -6,273 -3,208 7,40E-07 1,43E-06 9,52E-10 8,96E-07 CSAL_RS11540 Csal_2268 hypothetical protein COG3516S K11901 -1,892 -2,082 1,13E-03 2,21E-04 CSAL_RS11570 Csal_2274 Rhs element Vgr protein COG3501S - -1,829 -2,234 4,38E-07 7,23E-14 CSAL_RS11515 Csal_2263 hypothetical protein COG3455S K11892 -1,982 8,15E-04 CSAL_RS11505 Csal_2261 hypothetical protein COG3913S K11890 -1,926 3,83E-05 Twin-arginine translocation (Tat) system Twin-arginine translocation (Tat) pathway protein CSAL_RS03055 Csal_0592 Sec-independent protein translocase TatB COG1826U K03117 -1,885 9,73E-04 Type III secretion system Type III protein secretion pathway protein Flagellar export apparatus protein CSAL_RS10230 Csal_2015 flagellar biosynthesis protein FlhA COG1298NU K02400 1,821 5,61E-04 Phosphotransferase System (PTS) Phosphocarrier protein NPr CSAL_RS11355 Csal_2230 hypothetical protein COG1925G K08485 -2,625 3,11E-05 Nittrogen regulation CSAL_RS13050 Csal_2576 phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase PtsP COG3605T K08484 1,844 1,873 2,042 1,803 2,19E-03 2,46E-03 6,65E-04 4,78E-03 Other CSAL_RS05680 Csal_1115 isoaspartyl dipeptidase COG0044F - 2,180 2,312 2,636 2,275 1,09E-03 1,01E-03 3,09E-06 1,58E-02 Capítulo VIII: Anexo 266 CSAL_RS05660 Csal_1111 beta-aspartyl-peptidase COG2936R - -2,074 -3,414 -2,146 -2,901 2,21E-03 3,87E-07 1,95E-05 3,66E-04 CSAL_RS16405 Csal_3238 secretion protein HlyD COG0845M - 8,241 2,49E-07 CSAL_RS08125 Csal_1595 signal peptide peptidase SppA, 36K type COG0616OU K04773 1,854 1,896 3,59E-04 1,52E-03 CSAL_RS13570 Csal_2681 secretion protein HlyD COG1566V - -1,858 3,41E-03 CSAL_RS11075 Csal_2174 type II secretion system protein E COG2804NU K02652 1,901 9,16E-04 Chromosome associated protein Divisome proteins CSAL_RS15095 Csal_2987 cell division protein FtsX COG2177D K09811 2,227 1,93E-03 CSAL_RS08130 Csal_1596 maf protein COG0424D - -2,226 -2,498 -3,413 -3,412 4,60E-04 7,62E-07 6,49E-10 2,57E-05 CSAL_RS03100 Csal_0601 sporulation-like protein COG3087D - 2,044 2,668 2,698 2,664 7,50E-03 5,70E-04 2,75E-05 5,35E-04 CSAL_RS06480 Csal_1274 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase COG0860M K01448 1,978 1,969 8,11E-05 1,98E-04 Other chromosome partitioning proteins CSAL_RS11400 Csal_2239 rod shape-determining protein MreC COG1792M K03570 -3,317 -2,833 -3,597 -2,610 1,68E-05 2,58E-04 1,56E-06 1,10E-03 CSAL_RS11405 Csal_2240 rod shape-determining protein MreB COG1077D K03569 2,240 1,22E-12 CSAL_RS07880 Csal_1546 rod shape-determining protein RodA COG0772D K05837 -1,841 1,12E-05 Phage related - Csal_1390 hypothetical protein - - -15,052 -12,045 -24,055 -9,360 2,56E-04 4,23E-03 1,71E-07 1,52E-02 CSAL_RS07005 Csal_1372 phage late control D COG3500R K06905 -3,075 1,40E-02 - Csal_1377 phage tail E - - -4,673 1,18E-03 CSAL_RS06915 Csal_1356 phage integrase COG4974L K14059 2,366 5,18E-04 CSAL_RS16905 Csal_1384 Phage-related tail fiber protein-like protein COG5301R - -3,100 1,13E-04 CSAL_RS01160 Csal_0230 CRISPR-associated Cas5e family protein - - -2,185 4,17E-04 Capítulo VIII: Anexo 267 CSAL_RS07120 Csal_1396 phage small terminase subunit - - 4,279 3,39E-03 CSAL_RS01165 Csal_0231 CRISPR-associated Cse3 family protein - - -2,266 3,19E-04 CSAL_RS15790 Csal_3115 phage integrase COG4973L K03733 -1,911 -1,952 -2,106 2,58E-03 1,73E-03 3,64E-03 CSAL_RS01145 Csal_0227 hypothetical protein - - 1,994 6,48E-09 CSAL_RS01170 Csal_0232 CRISPR-associated Cas1 family protein COG1518L K15342 -1,916 1,17E-03 Nucleoid associated proteins CSAL_RS16460 Csal_3249 histone-like DNA-binding protein COG0776L K05787 2,191 1,60E-09 Other CSAL_RS04320 Csal_0849 condensin subunit ScpA COG1354S K05896 1,910 1,53E-02 Translation Ribosome Large subunit CSAL_RS02170 Csal_0424 50S ribosomal protein L2 COG0090J K02886 -1,986 4,98E-07 CSAL_RS02215 Csal_0433 50S ribosomal protein L5 COG0094J K02931 -1,830 6,08E-05 CSAL_RS02230 Csal_0436 50S ribosomal protein L6 COG0097J K02933 -2,082 5,53E-06 CSAL_RS02100 Csal_0410 50S ribosomal protein L11 COG0080J K02867 2,242 1,817 3,67E-03 1,40E-02 CSAL_RS02115 Csal_0413 50S ribosomal protein L12 COG0222J K02935 2,532 2,888 3,66E-05 5,52E-04 CSAL_RS11240 Csal_2207 50S ribosomal protein L13 COG0102J K02871 -1,972 1,49E-10 CSAL_RS02250 Csal_0440 50S ribosomal protein L15 COG0200J K02876 -1,852 -1,840 3,74E-03 3,42E-04 CSAL_RS02190 Csal_0428 50S ribosomal protein L16 COG0197J K02878 -1,920 1,56E-03 CSAL_RS09135 Csal_1802 50S ribosomal protein L20 COG0292J K00606 2,322 1,50E-03 CSAL_RS02425 Csal_0474 50S ribosomal protein L21 COG0261J K02888 2,379 2,705 1,51E-03 4,24E-03 CSAL_RS02180 Csal_0426 50S ribosomal protein L22 COG0091J K02890 -4,251 -3,489 -3,332 -2,311 2,16E-06 2,27E-06 1,59E-04 3,84E-03 CSAL_RS02165 Csal_0423 50S ribosomal protein L23 COG0089J K02892 -4,457 -3,735 -3,399 -2,241 4,67E-06 4,43E-08 2,10E-04 4,81E-03 CSAL_RS15015 Csal_2971 50S ribosomal protein L28 COG0227J K02902 -1,927 1,36E-04 Capítulo VIII: Anexo 268 CSAL_RS02195 Csal_0429 50S ribosomal protein L29 COG0255J K02904 -13,246 -17,021 -12,131 -11,269 9,89E-06 1,03E-06 1,08E-05 7,47E-05 CSAL_RS02245 Csal_0439 50S ribosomal protein L30 COG1841J K02907 -4,662 -4,742 -3,829 -3,382 5,40E-06 1,88E-06 7,85E-05 3,58E-04 CSAL_RS03115 Csal_0604 50S ribosomal protein L31 COG0254J K02909 -3,937 2,13E-08 CSAL_RS15010 Csal_2970 50S ribosomal protein L33 COG0267J K02913 -1,831 7,48E-03 CSAL_RS09130 Csal_1801 50S ribosomal protein L35 COG0291J K02916 -10,964 -6,199 -12,904 -5,395 1,04E-08 2,06E-05 7,39E-09 4,73E-05 CSAL_RS17100 Csal_0442 50S ribosomal protein L36 COG0257J K02919 5,337 1,92E-03 Small subunit CSAL_RS02185 Csal_0427 30S ribosomal protein S3 COG0092J K02982 -1,905 6,47E-07 CSAL_RS02270 Csal_0445 30S ribosomal protein S4 COG0522J K02986 -2,024 1,04E-04 CSAL_RS02135 Csal_0417 30S ribosomal protein S7 COG0049J K02992 2,610 2,799 1,88E-02 2,82E-03 CSAL_RS02225 Csal_0435 30S ribosomal protein S8 COG0096J K02994 -1,857 2,12E-06 CSAL_RS02130 Csal_0416 30S ribosomal protein S12 COG0048J K02950 -1,983 1,13E-04 CSAL_RS02260 Csal_0443 30S ribosomal protein S13 COG0099J K02952 -1,920 -2,381 4,14E-11 6,55E-07 CSAL_RS15550 Csal_3071 30S ribosomal protein S15 COG0184J K02956 -5,204 -2,832 -3,413 -2,304 6,86E-13 3,61E-10 3,04E-07 3,87E-05 CSAL_RS15245 Csal_3016 30S ribosomal protein S16 COG0228J K02959 1,911 2,230 2,78E-03 2,21E-04 CSAL_RS02200 Csal_0430 30S ribosomal protein S17 COG0186J K02961 -2,270 -3,429 -2,173 -2,274 2,83E-04 4,75E-09 6,35E-04 1,82E-03 CSAL_RS04575 Csal_0889 30S ribosomal protein S18 COG0238J K02963 -4,473 -4,018 -2,433 -2,622 5,26E-08 9,23E-06 3,11E-03 4,42E-03 CSAL_RS02175 Csal_0425 30S ribosomal protein S19 COG0185J K02965 -1,898 4,77E-05 CSAL_RS02445 Csal_0478 30S ribosomal protein S20 - K02968 2,837 2,774 6,62E-03 3,79E-03 Aminoacyl-tRNA biosynthesis prolyl-tRNA synthetase CSAL_RS10900 Csal_2139 prolyl-tRNA synthetase COG0442J K01881 2,445 2,914 2,608 2,620 4,76E-05 6,05E-06 2,18E-05 3,59E-05 tyrosyl-tRNA synthetase CSAL_RS15445 Csal_3050 tyrosyl-tRNA synthetase COG0162J K01866 2,021 1,944 2,21E-06 4,65E-06 CSAL_RS15890 Csal_3135 D-tyrosyl-tRNA(Tyr) deacylase COG1490J K07560 2,508 1,10E-03 leucyl-tRNA synthetase CSAL_RS11915 Csal_2344 leucyl-tRNA synthetase COG0495J K01869 2,086 1,829 9,42E-05 2,08E-05 Capítulo VIII: Anexo 269 lysyl-tRNA synthetase, class I CSAL_RS12820 Csal_2530 tRNA synthetase COG2269J K04568 2,437 2,40E-05 phenylalanyl-tRNA synthetase alpha chain CSAL_RS09140 Csal_1803 phenylalanyl-tRNA synthetase subunit alpha COG0016J K01889 -1,974 -2,194 4,51E-06 4,44E-09 threonyl-tRNA synthetase CSAL_RS09120 Csal_1799 threonyl-tRNA synthetase / Ser-tRNA(Thr) hydrolase COG0441J K01868 1,941 1,802 1,75E-04 2,09E-03 ethionyl-tRNA formyltransferase CSAL_RS14515 Csal_2868 methionyl-tRNA formyltransferase COG0223J K00604 -1,889 3,48E-04 aspartyl/glutamyl-tRNA(Asn/Gln) amidotransferase subunit B CSAL_RS11420 Csal_2243 aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase subunit B COG0064J K02434 1,865 8,19E-03 Other CSAL_RS04330 Csal_0851 ribosomal large subunit pseudouridine synthase B COG1187J K06178 1,834 1,01E-05 Transcription RNA polymerase Core subunits CSAL_RS02120 Csal_0414 DNA-directed RNA polymerase subunit beta COG0085K K03043 2,528 6,82E-06 CSAL_RS16415 Csal_3240 2',5' RNA ligase COG1514J K01975 5,147 2,38E-06 CSAL_RS16385 Csal_3234 DNA-directed RNA polymerase subunit omega COG1758K K03060 1,924 1,825 3,62E-04 3,25E-03 CSAL_RS02275 Csal_0446 DNA-directed RNA polymerase subunit alpha COG0202K K03040 1,859 5,69E-03 Sigma factors CSAL_RS05390 Csal_1052 sigma-24 (FecI-like protein) COG1595K K03088 4,482 1,31E-02 Capítulo VIII: Anexo 270 CSAL_RS05005 Csal_0976 sigma 70 (RpoD) COG0568K K03086 1,986 7,65E-04 Other transcription-related factors RNA polymerase-associated proteins CSAL_RS02390 Csal_0469 ATP-dependent helicase HepA COG0553KL K03580 -3,155 4,28E-06 CSAL_RS10455 Csal_2055 ATPase-like protein COG3899R - 2,025 4,31E-15 Transription elongation factors CSAL_RS15625 Csal_3084 GreA/GreB family elongation factor COG0782K K03624 1,832 1,857 2,275 2,005 3,24E-03 4,45E-03 3,88E-05 1,89E-03 CSAL_RS12960 Csal_2558 GreA/GreB family elongation factor COG0782K K04760 2,045 3,39E-06 CSAL_RS15495 Csal_3060 TraR/DksA family transcriptional regulator COG1734T K06204 4,539 8,74E-03 Others CSAL_RS10830 Csal_2128 ribonuclease T COG0847L K03683 -2,382 -2,406 -2,753 -2,500 7,06E-03 1,79E-05 1,85E-05 3,85E-04 CSAL_RS16245 Csal_3206 ribonuclease PH COG0689J K00989 2,155 1,834 7,17E-04 8,29E-03 CSAL_RS06230 Csal_1225 exoribonuclease II COG4776K K01147 1,827 1,891 7,29E-15 1,97E-05 CSAL_RS13980 Csal_2762 endoribonuclease L-PSP COG0251J - 1,826 1,839 2,97E-04 1,21E-04 CSAL_RS08305 Csal_1631 ribonuclease III COG0571K K03685 -1,844 2,09E-04 Ribosome biogenesis rRNA modification factors CSAL_RS06800 Csal_1339 tRNA (uracil-5-)-methyltransferase COG2265J K00557 2,609 2,119 1,875 7,69E-04 1,93E-03 2,47E-02 CSAL_RS16790 Csal_3315 tRNA modification GTPase TrmE COG0486R K03650 2,365 2,061 1,831 3,13E-06 4,45E-03 9,03E-04 CSAL_RS10460 Csal_2056 tRNA--hydroxylase COG4445FJ K06169 -2,006 1,71E-04 CSAL_RS15555 Csal_3072 tRNA pseudouridine synthase B COG0130J K03177 2,958 2,74E-03 CSAL_RS14520 Csal_2869 sun protein COG0144J K03500 -1,868 3,23E-03 Capítulo VIII: Anexo 277 CSAL_RS14900 Csal_2947 entericidin EcnAB COG5510S - 2,452 2,03E-03 CSAL_RS13105 Csal_2587 transglycosylase-associated protein - - -3,043 2,71E-06 CSAL_RS12045 Csal_2376 glyoxalase/bleomycin resistance protein/dioxygenase COG4070O - 2,971 1,50E-02 CSAL_RS11290 Csal_2217 toluene tolerance protein COG2854Q K07323 -2,055 9,66E-04 CSAL_RS15200 Csal_3007 glyoxalase/bleomycin resistance protein/dioxygenase COG0346E - -1,977 -1,878 -2,540 1,59E-03 8,58E-09 2,32E-05 CSAL_RS04945 Csal_0964 glyoxalase/bleomycin resistance protein/dioxygenase COG0346E - -14,737 -3,137 -12,296 -3,600 2,72E-05 5,79E-03 1,29E-05 7,00E-03 CSAL_RS06470 Csal_1272 hypothetical protein COG0063G K17758 1,862 1,815 1,997 4,68E-05 1,49E-04 9,54E-05 Other CSAL_RS09305 Csal_1832 OsmC-like protein COG1765O - -1,823 1,81E-06 Unknown CSAL_RS06700 Csal_1319 hypothetical protein - - 3,829 8,865 2,944 9,362 3,59E-06 4,93E-05 3,74E-04 2,38E-05 CSAL_RS07650 Csal_1507 hypothetical protein - - 2,049 2,190 2,057 2,450 3,03E-03 8,44E-03 4,58E-05 2,87E-03 CSAL_RS10175 Csal_2004 hypothetical protein - - -5,615 -8,894 -7,527 -6,571 3,02E-05 5,18E-10 8,87E-08 1,24E-06 CSAL_RS05485 Csal_1071 hypothetical protein - - -15,085 -6,036 -8,833 -3,292 2,88E-10 2,09E-08 5,03E-10 2,29E-03 CSAL_RS10065 Csal_1982 hypothetical protein - - -4,050 -3,875 -4,289 -5,112 1,30E-08 8,42E-05 2,50E-13 8,56E-05 CSAL_RS17045 Csal_3228 hypothetical protein - - 2,189 4,977 2,429 4,711 9,59E-04 6,98E-05 7,01E-06 7,97E-05 CSAL_RS08045 Csal_1579 hypothetical protein - - -2,495 -3,544 -2,338 -3,076 4,87E-04 3,82E-05 4,96E-04 1,07E-03 CSAL_RS14825 Csal_2932 hypothetical protein - - -25,898 -59,985 -21,507 -56,578 8,50E-03 1,22E-04 1,51E-10 5,25E-04 CSAL_RS13635 Csal_2694 diiron oxygenase - - -4,929 -7,609 -4,170 -9,470 2,38E-06 3,42E-06 1,33E-09 1,44E-03 CSAL_RS02340 Csal_0459 hypothetical protein - - -4,585 -5,309 -7,736 -6,138 2,48E-06 9,24E-11 1,73E-08 5,19E-08 CSAL_RS15720 Csal_3103 hypothetical protein - - -1553,362 ######### -790,748 -2663,936 8,24E-07 1,85E-10 1,98E-08 4,39E-09 CSAL_RS05010 Csal_0977 hypothetical protein - - -4,161 -5,413 -2,707 -2,886 8,37E-16 4,48E-10 2,73E-09 1,16E-03 CSAL_RS12050 Csal_2377 hypothetical protein - - 7,893 -3,888 7,628 -4,497 2,42E-03 4,33E-03 1,64E-04 1,11E-02 Capítulo VIII: Anexo 278 CSAL_RS10555 Csal_2075 hypothetical protein - - -12,563 -47,478 -9,670 -24,683 3,52E-03 1,40E-05 8,37E-04 3,68E-04 CSAL_RS12010 Csal_2366 hypothetical protein - - 2,872 -2,403 4,082 -2,401 1,33E-02 1,91E-03 3,26E-04 4,88E-03 CSAL_RS06300 Csal_1239 hypothetical protein - - -2,257 -2,880 -2,878 -2,531 1,83E-04 3,74E-08 1,87E-07 5,73E-05 CSAL_RS13565 Csal_2680 hypothetical protein - - -3,875 -5,384 -3,263 -4,652 2,68E-04 1,36E-05 5,66E-06 7,58E-04 CSAL_RS02725 Csal_0526 hypothetical protein - - -7,302 -6,839 -8,202 -7,414 3,34E-03 1,42E-06 6,05E-04 6,25E-06 CSAL_RS11435 Csal_2246 hypothetical protein - - -2,914 -3,327 -2,729 -2,454 1,56E-04 5,03E-06 3,96E-05 9,81E-03 CSAL_RS12760 Csal_2518 putative motility protein - - -4,162 -3,311 -4,544 -3,822 3,67E-06 5,44E-06 1,41E-06 1,50E-06 - Csal_2259 hypothetical protein - - -42,408 -87,700 -183,184 -65,895 2,12E-03 3,92E-06 3,77E-07 6,54E-05 CSAL_RS03375 Csal_0652 hypothetical protein - - -6,146 -3,584 -2,145 -5,130 3,82E-04 8,35E-03 4,51E-03 8,13E-03 CSAL_RS16045 Csal_3166 hypothetical protein - - -31,332 -11,309 -14,093 -10,231 1,28E-08 1,64E-08 1,45E-10 5,57E-07 CSAL_RS09230 Csal_1822 hypothetical protein - - -2,315 -3,954 -3,331 -6,508 1,21E-04 1,05E-07 2,19E-08 2,61E-09 CSAL_RS12690 Csal_2504 hypothetical protein - - 2,720 2,753 2,543 3,455 6,43E-03 2,03E-03 1,04E-02 1,11E-04 - Csal_3185 hypothetical protein - - -18,135 -11,732 -7,275 -8,132 8,39E-04 4,09E-04 1,76E-04 3,23E-03 CSAL_RS10885 Csal_2136 hypothetical protein - - -3,340 -3,620 -3,424 -3,794 1,15E-03 7,77E-05 9,65E-04 2,82E-04 CSAL_RS12765 Csal_2519 hypothetical protein - - -100,525 -115,158 -44,028 -108,680 1,23E-07 1,81E-07 1,76E-09 8,54E-06 - Csal_2948 hypothetical protein - - -20,885 -89,645 -59,894 -36,527 1,91E-04 1,10E-06 2,17E-10 8,12E-04 CSAL_RS07970 Csal_1564 hypothetical protein - - -4,338 -2,246 -4,061 -3,070 3,19E-07 2,95E-04 2,16E-06 1,50E-05 CSAL_RS00155 Csal_0029 hypothetical protein - - -13,978 -8,435 -12,292 -13,978 2,80E-04 3,45E-04 1,08E-06 2,02E-04 CSAL_RS11855 Csal_2331 hypothetical protein - - -3,949 -5,299 -2,687 -3,575 4,37E-06 4,57E-10 4,89E-05 1,14E-04 - Csal_2608 hypothetical protein - - -14,058 -21,260 -11,677 -25,415 1,99E-04 3,67E-06 1,04E-05 9,16E-06 CSAL_RS15340 Csal_3034 hypothetical protein - - 3,731 2,511 4,384 2,475 1,45E-04 5,86E-03 1,00E-06 8,06E-03 CSAL_RS16420 Csal_3241 hypothetical protein - - -7,278 -11,200 -3,537 -13,048 1,35E-05 1,15E-07 4,84E-05 2,14E-07 CSAL_RS16940 Csal_1663 hypothetical protein - - -5,780 -37,341 -7,942 -68,417 2,56E-05 1,51E-15 4,17E-08 5,99E-09 - Csal_0095 hypothetical protein - - -7,795 -8,569 -4,677 -8,721 1,33E-03 1,25E-05 4,89E-05 1,79E-04 CSAL_RS02365 Csal_0464 nuclear transport factor 2 family protein - - -5,993 -3,780 -5,259 -7,310 6,25E-15 7,50E-10 5,21E-09 3,85E-09 CSAL_RS11120 Csal_2183 hypothetical protein - - -7,832 -3,221 -12,257 -2,474 1,06E-07 8,98E-05 3,17E-13 1,37E-02 CSAL_RS08260 Csal_1622 hypothetical protein - - -4,740 -3,850 -2,413 -4,249 2,32E-05 1,90E-04 5,08E-04 7,71E-04 - Csal_1203 hypothetical protein - - -116,989 -421,422 -269,456 -264,166 3,46E-06 2,44E-08 4,23E-10 1,09E-06 - Csal_0744 hypothetical protein - - -3,485 -7,174 -2,806 -9,082 2,09E-02 3,75E-06 3,16E-03 2,65E-05 Capítulo VIII: Anexo 279 CSAL_RS17295 Csal_2627 hypothetical protein - - -6,039 -4,726 -9,048 -4,786 4,32E-03 5,01E-06 2,08E-04 3,50E-05 - Csal_0953 hypothetical protein - - -2,657 -83,999 -5,818 -110,803 3,51E-03 5,12E-08 3,12E-06 9,38E-07 CSAL_RS10945 Csal_2148 hypothetical protein - - -3,291 -4,006 -2,938 -5,214 5,54E-04 4,27E-04 1,05E-04 1,19E-03 CSAL_RS17260 Csal_2253 hypothetical protein - - -2,764 -2,565 -4,860 -3,221 7,30E-07 1,68E-04 9,13E-21 3,96E-05 CSAL_RS03795 Csal_0739 hypothetical protein - - -2,389 -3,418 -2,274 -3,936 4,39E-03 3,03E-04 6,72E-03 5,79E-05 CSAL_RS03900 Csal_0763 nuclear transport factor 2 family protein - - 2,604 3,072 2,726 2,501 3,24E-03 2,91E-04 1,49E-03 5,11E-03 - Csal_2350 hypothetical protein - - -7,651 -5,729 -5,760 -7,651 4,41E-05 6,80E-05 3,16E-09 1,26E-04 CSAL_RS15420 Csal_3049 hypothetical protein - - -11,946 -149,461 -29,375 -130,380 1,68E-04 1,27E-05 7,04E-05 2,79E-04 - Csal_2002 hypothetical protein - - -15,428 -13,043 -20,817 -14,885 1,43E-03 3,21E-04 2,01E-05 1,19E-03 CSAL_RS17285 Csal_2378 hypothetical protein - - 2,460 -2,259 2,651 -2,574 9,27E-03 6,68E-04 3,08E-03 2,37E-03 CSAL_RS16200 Csal_3197 hypothetical protein - - -4,512 -14,353 -5,037 -9,188 8,30E-03 9,81E-10 4,14E-07 1,32E-05 - Csal_1813 hypothetical protein - - -4,016 -11,640 -5,808 -10,352 1,07E-04 6,93E-07 1,36E-10 1,02E-05 CSAL_RS06970 Csal_1364 hypothetical protein COG1703E - -14,904 -15,647 -20,138 -4,561 3,88E-09 4,12E-10 2,94E-13 1,66E-03 CSAL_RS13765 Csal_2720 hypothetical protein COG1280E - -6,843 -9,078 -3,795 -9,440 6,56E-06 7,93E-07 5,98E-07 5,75E-06 CSAL_RS16115 Csal_3180 aldolase COG0235G - -4,684 -6,903 -4,896 -4,613 3,16E-13 2,54E-06 2,41E-26 1,01E-02 CSAL_RS00335 Csal_0064 short-chain dehydrogenase/reductase SDR COG1028IQR - -6,422 -8,847 -6,127 -11,222 1,13E-03 1,30E-03 8,33E-04 5,18E-04 CSAL_RS13230 Csal_2613 3-oxoacyl-ACP reductase COG1028IQR - -6,595 -2,674 -5,969 -3,365 3,33E-04 7,11E-03 2,63E-09 1,52E-02 CSAL_RS13010 Csal_2568 hypothetical protein COG2378K - -27,548 -6,489 -11,312 -4,997 1,84E-04 6,31E-05 2,91E-04 1,24E-03 CSAL_RS11640 Csal_2288 DNA-binding transcriptional regulator Fis COG2901KL K03557 -3,827 -2,414 -3,441 -2,023 7,06E-05 1,82E-04 8,42E-06 1,79E-02 CSAL_RS03125 Csal_0606 hypothetical protein COG3137M K07283 -2,603 -2,391 -2,604 -2,864 8,38E-06 2,71E-06 1,74E-08 7,41E-05 CSAL_RS12355 Csal_2435 outer-membrane lipoprotein carrier protein LolA COG2834M K03634 2,038 2,311 2,220 2,237 6,15E-03 8,99E-04 4,21E-03 1,10E-03 CSAL_RS12920 Csal_2550 sulfatase COG1368M - -9,790 -3,154 -6,321 -2,830 5,30E-05 1,52E-07 1,27E-06 1,66E-04 CSAL_RS10180 Csal_2005 arsenite-activated ATPase ArsA COG0003P K01551 -4,705 -5,586 -6,641 -4,001 4,50E-06 4,19E-10 6,12E-10 3,50E-05 Capítulo VIII: Anexo 280 CSAL_RS13525 Csal_2672 sulfite exporter TauE COG0730R - -2,732 -2,559 -2,293 -2,063 5,47E-04 3,41E-05 9,12E-04 1,70E-02 CSAL_RS03920 Csal_0767 oxidoreductase-like protein COG0673R - -6,111 -7,924 -5,440 -5,593 8,71E-05 5,66E-15 8,86E-08 1,86E-06 CSAL_RS02355 Csal_0462 FAD dependent oxidoreductase COG2907R - -5,119 -4,622 -5,746 -9,278 7,35E-21 4,56E-27 2,50E-08 2,96E-10 CSAL_RS15800 Csal_3117 GTP-binding protein COG0218R K03978 -2,614 -2,007 -2,669 -2,012 1,61E-04 1,51E-03 1,27E-04 4,41E-03 CSAL_RS00080 Csal_0014 sulfatase COG3083R K07014 -3,816 -2,569 -2,876 -2,491 3,97E-06 2,84E-08 4,91E-05 1,15E-05 CSAL_RS12330 Csal_2430 hypothetical protein COG0628R - -3,191 -2,495 -3,687 -2,408 2,12E-04 1,31E-04 1,12E-07 1,55E-03 CSAL_RS05780 Csal_1135 Pirin-like protein COG1741R K06911 -3,223 -2,157 -3,027 -2,452 1,52E-04 6,93E-04 2,14E-06 3,38E-03 CSAL_RS04860 Csal_0946 alpha/beta hydrolase COG0596R - -3,235 -2,210 -2,314 -2,160 6,07E-08 2,13E-03 2,57E-04 1,58E-02 CSAL_RS07315 Csal_1441 hypothetical protein COG2081R K07007 3,165 2,011 3,114 2,591 2,04E-05 7,56E-03 7,03E-08 1,69E-03 CSAL_RS10495 Csal_2063 phosphoenolpyruvate synthase regulatory protein COG1806S K09773 -2,130 -2,889 -2,149 -2,894 1,17E-03 7,19E-05 4,55E-04 5,09E-04 CSAL_RS11480 Csal_2255 hypothetical protein COG4104S - -7,364 -3,371 -8,520 -4,430 8,89E-04 2,39E-04 1,51E-04 1,96E-05 CSAL_RS00420 Csal_0081 hypothetical protein COG3336S - -5,403 -3,933 -7,452 -3,431 4,29E-05 1,59E-03 1,20E-12 1,19E-02 CSAL_RS10950 Csal_2149 hypothetical protein COG1289S - -5,874 -3,291 -4,830 -3,511 2,08E-06 1,61E-04 2,52E-05 3,98E-04 CSAL_RS09615 Csal_1894 hypothetical protein COG2105S - -7,429 -4,098 -5,936 -5,196 3,03E-04 7,21E-06 2,46E-07 7,29E-05 CSAL_RS11550 Csal_2270 hypothetical protein COG3518S K11897 -11,082 -4,727 -8,639 -4,754 1,85E-11 4,18E-06 9,12E-10 3,95E-06 CSAL_RS04770 Csal_0928 hypothetical protein COG2431S - -5,699 -3,506 -2,694 -3,289 8,31E-04 3,85E-05 1,73E-04 5,97E-03 CSAL_RS08885 Csal_1753 hypothetical protein COG3333S - -9,278 -7,880 -6,274 -5,870 6,06E-07 1,28E-07 1,29E-08 6,30E-05 CSAL_RS00370 Csal_0071 hypothetical protein COG3333S - -13,077 -9,948 -11,892 -8,684 1,09E-09 9,91E-08 3,45E-18 1,21E-05 CSAL_RS12725 Csal_2511 hypothetical protein COG5616S - -12,106 -3,248 -15,012 -4,044 6,99E-06 1,06E-02 7,92E-11 5,66E-03 CSAL_RS17240 Csal_1865 hypothetical protein COG3012S K09858 -4,381 -3,761 -3,914 -3,718 5,38E-06 1,92E-05 1,43E-06 1,26E-04 CSAL_RS08070 Csal_1584 hypothetical protein COG3216S K09928 -3,418 -3,264 -5,087 -4,062 2,50E-04 7,45E-04 1,18E-06 2,89E-04 CSAL_RS07330 Csal_1444 hypothetical protein COG5393S - -4,978 -2,046 -5,601 -2,077 1,42E-03 1,02E-02 2,13E-06 1,02E-02 CSAL_RS05315 Csal_1037 CsbD-like protein COG3237S - 2,285 3,383 2,368 3,848 2,17E-02 2,33E-06 1,60E-02 1,77E-07 CSAL_RS10630 Csal_2090 hypothetical protein COG5477S - -15,597 -19,973 -10,273 -22,032 2,01E-06 4,19E-04 2,37E-11 9,32E-04 CSAL_RS04130 Csal_0811 hypothetical protein COG1704S K03744 -3,337 -2,416 -2,674 -2,772 2,19E-05 1,07E-04 1,92E-04 5,81E-05 CSAL_RS02350 Csal_0461 hypothetical protein COG3496S K09701 -8,594 -4,168 -9,437 -8,695 1,89E-19 3,07E-15 5,42E-13 1,19E-08 CSAL_RS09610 Csal_1893 Smr protein/MutS2 COG2840S - 2,356 2,951 2,171 2,756 4,31E-04 2,82E-05 1,17E-03 9,08E-05 CSAL_RS00570 Csal_0112 hypothetical protein COG2323S - -3,975 -2,206 -2,609 -2,146 1,82E-04 6,03E-04 2,53E-04 6,39E-03 Capítulo VIII: Anexo 281 CSAL_RS16720 Csal_3301 hypothetical protein COG1981S K08973 -3,008 -2,058 -2,338 -2,707 3,78E-06 2,86E-03 3,72E-05 2,09E-04 CSAL_RS12875 Csal_2541 metal dependent phosphohydrolase COG2206T - -4,732 -2,860 -5,119 -3,259 4,05E-06 2,41E-03 1,99E-06 5,41E-04 CSAL_RS16945 Csal_1665 TadE-like protein COG4961U - -2,641 -3,534 -3,634 -5,111 2,97E-04 2,51E-09 1,22E-11 1,61E-08 CSAL_RS08665 Csal_1709 hypothetical protein - - -3,289 -2,141 1,31E-03 2,63E-03 CSAL_RS07295 Csal_1437 hypothetical protein - - -2,341 -2,234 6,23E-05 1,94E-02 CSAL_RS01875 Csal_0374 LrgA protein - - -2,340 -2,656 1,93E-02 2,72E-04 CSAL_RS06830 Csal_1345 hypothetical protein - - 2,458 2,428 1,883 8,98E-05 5,45E-04 1,27E-03 CSAL_RS00740 Csal_0146 hypothetical protein - - 2,857 2,822 1,839 2,62E-09 3,73E-04 6,00E-05 CSAL_RS14375 Csal_2840 hypothetical protein COG0028EH - -3,494 -2,578 1,88E-03 1,37E-03 CSAL_RS09850 Csal_1939 sterol-binding protein COG3255I - -2,485 -2,247 -1,892 7,36E-08 1,84E-09 1,60E-03 CSAL_RS08680 Csal_1712 polysaccharide export protein COG1596M K01991 -3,017 -2,492 1,78E-02 2,05E-02 CSAL_RS14060 Csal_2777 hemerythrin HHE cation binding protein - - 1,814 2,357 2,218 8,64E-05 3,67E-04 2,66E-05 - Csal_2252 hypothetical protein COG4399S - -1,885 -2,686 -2,296 2,61E-06 6,62E-12 8,71E-10 CSAL_RS09370 Csal_1845 hypothetical protein COG0217S - 2,327 2,352 7,19E-03 1,41E-02 CSAL_RS04530 Csal_0883 SpoVR family protein COG2719S - -2,302 -2,743 1,03E-04 3,90E-03 CSAL_RS12160 Csal_2401 hypothetical protein COG3448T - 1,944 2,628 2,339 7,09E-03 4,98E-09 3,94E-03 CSAL_RS04580 Csal_0890 hypothetical protein - - -2,001 1,875 1,22E-05 1,77E-03 CSAL_RS12035 Csal_2373 abortive infection protein - - 2,217 9,18E-04 CSAL_RS16825 Csal_0241 hypothetical protein - - -2,899 1,02E-02 CSAL_RS06125 Csal_1205 hypothetical protein - - -4,315 1,63E-02 CSAL_RS14870 Csal_2941 hypothetical protein - - 2,071 1,41E-06 CSAL_RS08040 Csal_1578 hypothetical protein - - 2,284 1,858 1,37E-03 4,29E-03 CSAL_RS12065 Csal_2382 hypothetical protein - - -4,691 6,10E-03 CSAL_RS01575 Csal_0314 hypothetical protein - - -2,844 2,06E-02 CSAL_RS10970 Csal_2153 hypothetical protein - - -2,126 -1,956 1,69E-08 6,72E-08 CSAL_RS11590 Csal_2278 hypothetical protein - - -2,084 1,79E-04 - Csal_1366 hypothetical protein - - 3,895 2,66E-03 Capítulo VIII: Anexo 282 CSAL_RS04775 Csal_0929 hypothetical protein - - -2,306 -1,911 2,36E-03 9,43E-04 CSAL_RS12135 Csal_2396 hypothetical protein - - -2,208 5,36E-03 CSAL_RS03825 Csal_0748 hypothetical protein - - -2,649 -1,884 1,97E-04 4,85E-03 CSAL_RS15400 Csal_3045 aldo/keto reductase COG0667C - 2,618 2,37E-09 CSAL_RS03605 Csal_0697 chromosome segregation protein SMC COG1196D K03529 2,176 3,73E-04 CSAL_RS14185 Csal_2803 N-acetyltransferase GCN5 COG1246E - -2,175 -1,839 1,13E-03 2,54E-03 CSAL_RS09415 Csal_1854 OmpA/MotB protein COG2885M K03640 2,052 3,30E-04 CSAL_RS04070 Csal_0798 hypothetical protein COG3187O - 2,426 1,953 1,937 2,99E-07 2,08E-03 7,57E-05 CSAL_RS05540 Csal_1081 AAA ATPase COG0464O - 4,563 9,21E-03 CSAL_RS14140 Csal_2794 putative ammonia monooxygenase COG3180R K07120 -2,022 -1,844 4,51E-03 9,04E-03 CSAL_RS09480 Csal_1867 alpha/beta hydrolase COG0429R K07019 -2,140 1,05E-03 CSAL_RS17255 Csal_2247 Sel1-like protein COG0790R K07126 3,303 2,09E-03 CSAL_RS03535 Csal_0683 metal-dependent hydrolase COG1988R K07038 2,238 1,960 3,51E-03 1,05E-02 CSAL_RS06365 Csal_1252 hypothetical protein COG3181S - 2,134 9,07E-04 CSAL_RS13330 Csal_2633 hypothetical protein COG2035S K08974 -2,375 -1,901 -1,851 9,91E-09 3,86E-08 9,48E-03 CSAL_RS12945 Csal_2555 hypothetical protein COG3151S K09920 -2,270 -1,958 1,78E-05 9,31E-03 CSAL_RS08630 Csal_1702 hypothetical protein COG5464S - 2,324 8,16E-05 CSAL_RS00855 Csal_0169 hypothetical protein COG1971S - -3,483 1,64E-03 CSAL_RS11930 Csal_2347 hypothetical protein COG3189S - -2,542 -1,831 7,94E-06 6,07E-06 CSAL_RS05245 Csal_1023 hypothetical protein COG3802S - 2,059 3,16E-10 CSAL_RS17265 Csal_2279 hypothetical protein - - -2,168 6,03E-03 CSAL_RS05460 Csal_1065 hypothetical protein - - -3,464 4,79E-06 CSAL_RS15995 Csal_3156 hypothetical protein - - 2,368 1,935 5,82E-03 1,90E-04 CSAL_RS07035 Csal_1380 hypothetical protein - - -2,390 1,38E-02 CSAL_RS13795 Csal_2726 hypothetical protein - - -2,505 9,53E-07 CSAL_RS08710 Csal_1718 acyltransferase family protein - - -3,707 5,75E-03 CSAL_RS14015 Csal_2768 hypothetical protein - - 2,090 1,04E-02 Capítulo VIII: Anexo 283 CSAL_RS06950 Csal_1361 hypothetical protein - - -2,830 1,39E-03 - Csal_1646 hypothetical protein - - -4,644 7,04E-03 CSAL_RS06960 Csal_1363 hypothetical protein - - -3,440 1,78E-03 CSAL_RS11530 Csal_2266 hypothetical protein - - -2,093 -1,963 1,24E-10 5,20E-05 CSAL_RS15305 Csal_3028 hypothetical protein - - 2,077 3,13E-04 CSAL_RS10845 Csal_2131 hypothetical protein - - -2,426 1,22E-03 CSAL_RS11460 Csal_2251 hypothetical protein - - -2,053 -1,875 4,49E-05 2,67E-03 CSAL_RS14805 Csal_2928 hypothetical protein - - -2,614 1,23E-02 CSAL_RS07595 Csal_1497 hypothetical protein - - 2,273 1,950 1,36E-12 1,33E-05 CSAL_RS11910 Csal_2343 hypothetical protein - - 2,035 3,17E-05 CSAL_RS06955 Csal_1362 hypothetical protein - - -2,760 6,96E-03 CSAL_RS06390 Csal_1256 hypothetical protein - - 2,147 1,934 2,55E-06 1,76E-04 CSAL_RS16445 Csal_3246 hypothetical protein - - 2,507 1,33E-07 CSAL_RS07175 Csal_1414 short-chain dehydrogenase/reductase SDR COG1028IQR - -2,255 6,07E-03 CSAL_RS02685 Csal_0521 AsmA protein COG2982M K07289 2,061 1,968 7,83E-05 3,52E-04 CSAL_RS02625 Csal_0509 hypothetical protein COG3015MP - 2,161 1,862 5,95E-05 2,39E-03 CSAL_RS06295 Csal_1238 hypothetical protein COG2949S K03748 2,090 1,899 4,72E-11 4,16E-05 CSAL_RS08535 Csal_1678 HicB protein COG4226S - -2,570 1,83E-02 CSAL_RS04450 Csal_0872 hypothetical protein COG4327S - -8,563 3,27E-08 CSAL_RS14550 Csal_2875 TraB family protein COG1916S - -2,111 1,75E-04 CSAL_RS03630 Csal_0702 hypothetical protein COG3089S K09898 2,640 2,03E-03 CSAL_RS11865 Csal_2333 SH3 domain-containing protein COG3103T K07184 2,002 8,33E-06 CSAL_RS08385 Csal_1648 hypothetical protein - - 3,417 2,00E-05 CSAL_RS11115 Csal_2182 hypothetical protein - - -3,061 4,55E-10 CSAL_RS09635 Csal_1898 hypothetical protein - - -1,866 -2,181 5,69E-03 2,44E-05 CSAL_RS05910 Csal_1161 hypothetical protein - - -2,273 4,06E-14 CSAL_RS10110 Csal_1990 hypothetical protein - - 3,225 2,13E-02 Capítulo VIII: Anexo 284 - Csal_1403 hypothetical protein - - 2,637 1,53E-02 CSAL_RS14980 Csal_2964 hypothetical protein - K07112 2,249 4,07E-03 CSAL_RS13155 Csal_2597 hypothetical protein - K07112 3,304 1,95E-02 CSAL_RS08375 Csal_1645 hypothetical protein - - 2,668 1,49E-06 CSAL_RS01035 Csal_0206 hypothetical protein - - -2,310 8,24E-07 CSAL_RS16820 Csal_0200 hypothetical protein - - 1,976 1,856 3,811 2,11E-02 2,54E-02 1,53E-09 CSAL_RS08670 Csal_1710 hypothetical protein - - -2,797 1,85E-04 CSAL_RS07955 Csal_1561 hypothetical protein - - 3,173 6,02E-03 CSAL_RS06360 Csal_1251 hypothetical protein - - -2,267 2,15E-04 - Csal_2322 hypothetical protein - - -1,978 -2,423 1,91E-03 3,59E-05 CSAL_RS10220 Csal_2013 hypothetical protein - - -2,207 1,88E-04 CSAL_RS02835 Csal_0547 hypothetical protein - - -1,967 -2,272 4,20E-05 2,64E-08 CSAL_RS09290 Csal_1829 TatD-related deoxyribonuclease COG0084L K03424 -1,849 -2,084 1,04E-02 1,70E-03 CSAL_RS11050 Csal_2169 recombination associated protein COG2974L K03554 2,049 3,78E-10 CSAL_RS14265 Csal_2819 SirA-like protein COG0425O - 2,258 5,45E-04 CSAL_RS00240 Csal_0047 rhodanese-like protein COG0607P - 1,855 2,597 5,17E-04 6,56E-05 CSAL_RS02435 Csal_0476 GTPase ObgE COG0536R K03979 1,913 2,471 1,15E-02 4,98E-04 CSAL_RS10770 Csal_2116 hypothetical protein COG4103S - -2,044 1,33E-04 CSAL_RS02870 Csal_0554 SlyX family protein COG2900S K03745 2,363 3,76E-05 CSAL_RS08030 Csal_1576 hypothetical protein COG2991S K05952 -2,013 2,58E-04 CSAL_RS00250 Csal_0049 hypothetical protein COG1385S K09761 2,317 4,18E-05 CSAL_RS15275 Csal_3022 hypothetical protein COG2135S - -1,871 -2,177 1,64E-02 1,83E-05 CSAL_RS14620 Csal_2889 hypothetical protein COG5607S - 2,209 3,81E-05 CSAL_RS16140 Csal_3186 hypothetical protein COG3685S - 2,880 2,61E-02 CSAL_RS00835 Csal_0165 hypothetical protein COG3333S - 2,151 2,14E-05 CSAL_RS10100 Csal_1988 hypothetical protein COG2206T - 3,088 6,65E-05 CSAL_RS04455 Csal_0873 cyclic nucleotide-binding domain-containing protein COG2905T K07182 2,544 3,10E-06 Capítulo VIII: Anexo 285 CSAL_RS05310 Csal_1036 hypothetical protein - - 2,054 3,95E-03 CSAL_RS00865 Csal_0171 hypothetical protein - - -1,989 -2,002 2,67E-03 1,52E-03 CSAL_RS06725 Csal_1324 hypothetical protein - - 1,851 2,128 1,06E-03 4,35E-03 CSAL_RS14965 Csal_2961 hypothetical protein - - 1,900 -1,993 2,582 1,72E-02 1,83E-03 7,06E-04 CSAL_RS08915 Csal_1759 hypothetical protein - - 2,193 3,81E-03 CSAL_RS07000 Csal_1371 hypothetical protein COG1974KT - 2,239 1,79E-02 CSAL_RS02715 Csal_0524 hypothetical protein COG1853R - -1,951 -2,476 1,06E-04 2,52E-04 CSAL_RS14155 Csal_2797 hypothetical protein COG3803S - -2,073 6,71E-03 CSAL_RS03085 Csal_0598 hypothetical protein COG3536S - 2,133 8,00E-04 CSAL_RS03950 Csal_0774 ATP-binding protein COG1112L - -1,889 -1,819 -1,944 3,09E-03 9,01E-03 3,79E-04 - Csal_1291 hypothetical protein - - 1,829 1,807 1,946 3,17E-03 1,006E-06 1,44E-03 CSAL_RS12645 Csal_2495 hypothetical protein COG0397S - 1,870 1,966 5,31E-05 1,173E-05 CSAL_RS16015 Csal_3160 hypothetical protein COG2960S K09806 1,811 1,951 1,31E-04 1,02E-04 CSAL_RS16055 Csal_3168 putative transposase, IS891/IS1136/IS1341 COG0675L K07496 -1,878 -1,882 2,66E-03 9,21E-04 CSAL_RS03530 Csal_0682 ACP phosphodiesterase COG1182I K01118 1,966 1,884 7,97E-03 4,37E-04 CSAL_RS13945 Csal_2755 hypothetical protein COG4258R - -1,888 -1,995 8E-05 4,811E-05 CSAL_RS05650 Csal_1109 hypothetical protein - - -1,872 -1,918 7,97E-03 4,36E-03 - Csal_0801 hypothetical protein - - -1,946 -1,945 6,25E-04 1,246E-05 CSAL_RS15385 Csal_3042 zinc-binding alcohol dehydrogenase COG0604CR - 1,923 1,880 2,32E-03 4,25E-03 CSAL_RS11535 Csal_2267 hypothetical protein - - -1,901 -1,833 2,27E-06 4,12E-04 CSAL_RS04475 Csal_0877 hypothetical protein COG3571R K07020 1,801 1,987 1,62E-02 1,02E-02 CSAL_RS03955 Csal_0775 prevent-host-death protein COG4118D - -1,878 1,41E-02 CSAL_RS12680 Csal_2502 hypothetical protein COG2314S - -1,874 4,44E-03 CSAL_RS07390 Csal_1456 hypothetical protein - - -1,919 4,41E-06 CSAL_RS08555 Csal_1682 hypothetical protein - - -1,882 3,81E-03 CSAL_RS08510 Csal_1673 nucleotidyltransferase substrate binding protein - - -1,949 7,57E-03 Capítulo VIII: Anexo 286 CSAL_RS08135 Csal_1597 hypothetical protein COG1399R K07040 -1,845 3,67E-04 CSAL_RS02880 Csal_0556 hypothetical protein - - 1,939 6,50E-03 CSAL_RS15330 Csal_3032 circadian clock protein KaiC COG0467T K08482 1,823 3,24E-04 CSAL_RS05165 Csal_1007 hypothetical protein COG0613R - -1,850 2,25E-04 CSAL_RS04820 Csal_0938 hypothetical protein - - 1,819 9,66E-03 CSAL_RS09585 Csal_1888 HesB/YadR/YfhF - - -1,815 1,15E-04 CSAL_RS08390 Csal_1649 hypothetical protein - - -1,845 1,16E-02 CSAL_RS01845 Csal_0368 amidohydrolase 2 COG3618R K07046 -1,868 1,29E-02 CSAL_RS14575 Csal_2880 plasmid maintenance system killer protein COG3549R K07334 -1,919 2,48E-05 CSAL_RS09870 Csal_1943 type 11 methyltransferase - - 1,911 1,14E-02 CSAL_RS07555 Csal_1489 hypothetical protein - - 1,822 5,63E-03 CSAL_RS09090 Csal_1793 LrgA protein COG1380R - 1,999 1,55E-02 CSAL_RS08420 Csal_1655 hypothetical protein COG2831U - -1,987 7,25E-05 CSAL_RS09775 Csal_1926 hypothetical protein - - -1,986 0,021735 CSAL_RS16980 Csal_2124 hypothetical protein - - 1,863 1,46E-10 CSAL_RS12405 Csal_2445 hypothetical protein COG2915R K07153 -1,907 5,34E-03 CSAL_RS07440 Csal_1466 von Willebrand factor type A domain-containing protein - - 1,806 9,45E-04 CSAL_RS09455 Csal_1862 hypothetical protein - - 1,915 6,05E-04 CSAL_RS09695 Csal_1910 hypothetical protein - - -1,826 4,26E-04 CSAL_RS08490 Csal_1669 hypothetical protein - - -1,981 8,39E-03 CSAL_RS13955 Csal_2757 hypothetical protein - - 1,921 1,24E-02 CSAL_RS12110 Csal_2391 hypothetical protein - - -1,871 6,98E-03 CSAL_RS09835 Csal_1936 hypothetical protein COG1738S K09125 -1,897 1,44E-04 CSAL_RS15395 Csal_3044 Sel1-like protein COG0790R - -1,866 4,73E-08 CSAL_RS13920 Csal_2750 hypothetical protein COG4648S - -1,914 1,53E-02 CSAL_RS09465 Csal_1864 hypothetical protein COG2911S K09800 1,878 4,37E-03