Identificación de una firma inmunohistoquímica con valor predictivo en el carcinoma infiltrante de mama de tipo no especial (NST)

Tesis Doctoral: Identificación de una firma inmunohistoquímica con valor predictivo en el carcinoma infiltrante de mama de tipo no especial (NST) Laura Macías García DNI 48821350D [email protected] Departamento: Fisiología Médica y Biofísica Programa de Doctorado: Biología Molecular y Biomedicina Sevilla, 2015 2 Directores Dr. Ricardo González Cámpora Dr. Antonio Robles Frías Tutor Dr. Rafael Fernández Chacón Departamento: Fisiología Médica y Biofísica Programa de Doctorado: Biología Molecular y Biomedicina Sevilla, 2015 3 Quiero dar las gracias al Dr. Ricardo González Cámpora, Dr. Antonio Robles Frías y al Dr. Rafael Fernández Chacón, directores y tutor de este proyecto, por su increíble amabilidad, su inestimable ayuda, su tiempo y su confianza. Dedico esta Tesis, A todo el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital de Valme de Sevilla, por hacerme sentir siempre como en casa. Muy especialmente hago referencia al Dr. Rafael Martínez, Dr. Antonio Robles, Dra. María Jesús Pareja, Dr. Juan Miralles, Dr. José María Conde y Dr. Juan López; fantásticos maestros y mejores compañeros. Así como a Lucía Molina, amiga y compañera de especialidad, y sin olvidar a Almudena González, TEAP del Servicio. Y de manera muy especial, A mis padres, por transmitirme valores como la constancia, la superación y el amor incondicional. A mi hermano Daniel, por enseñarme lo que es sentirse orgullosa y regalarme siempre gratis su alegría; y a Sara, que lo hace tan feliz. A Diego y María, por vuestro increíble cariño todos estos años y permitirme formar parte de vuestras vidas. A Jorge, mi compañero, mi mejor amigo,….mi constante. 4 ÍNDICE: 1.Introducción ________________________________________________________ 7 1.1.E-Cadherina ____________________________________________________________ 9 1.2.Twist _________________________________________________________________ 15 1.3.ABCG2 _______________________________________________________________ 20 1.4.Caveolina _____________________________________________________________ 25 1.5.CD10 _________________________________________________________________ 31 1.6.CD44 _________________________________________________________________ 35 1.7.CD117 ________________________________________________________________ 39 1.8.CDK2 _________________________________________________________________ 43 1.9.Citoqueratina 5/6 ______________________________________________________ 47 1.10.CXCR4 _______________________________________________________________ 52 1.11.Fascina ______________________________________________________________ 58 1.12.FOXA1 ______________________________________________________________ 63 1.13.HER2 ________________________________________________________________ 70 1.14.Ki 67 ________________________________________________________________ 76 1.15.p53 _________________________________________________________________ 79 1.16.Receptor de Estrógenos ________________________________________________ 83 1.17.Receptor de Progesterona ______________________________________________ 88 1.18.RKIP ________________________________________________________________ 91 1.19.Survivina ____________________________________________________________ 95 1.20.TOPO-2alfa __________________________________________________________ 100 1.21.Perfiles Moleculares __________________________________________________ 104 1.22.Matrices Tisulares ____________________________________________________ 110 2.Objetivos _________________________________________________________ 114 3.Material y Métodos ________________________________________________ 116 3.1. Selección de casos ____________________________________________________ 117 3.2. Tejido ______________________________________________________________ 118 3.3 Construcción de los TMAs _______________________________________________ 118 3.4. Inmunohistoquímica __________________________________________________ 121 3.5. Análisis estadístico ____________________________________________________ 133 5 4.Resultados ________________________________________________________ 134 4.1 Características generales de la muestra: ___________________________________ 135 4.2. Resultados Inmunohistoquímicos: _______________________________________ 156 4.3 Estudios Estadísticos Univariantes: _______________________________________ 207 4.4. Estudio estadístico multivariante: ________________________________________ 210 5. Discusión ________________________________________________________ 211 5.1. Estudio Univariante con relación significativa ______________________________ 212 5.2 Estudio Univariante moléculas No representativas ___________________________ 220 5.3 Estudio Multivariante __________________________________________________ 224 6. Conclusiones ______________________________________________________ 227 7. Bibliografía _______________________________________________________ 228 6 7 “ 1.Introducción “Comienza el juego” Sherlock Holmes 8 En la actualidad, el cáncer de mama es la neoplasia maligna más común en la mujer (1), siendo la causa principal de muerte en mujeres entre los 35 y 55 años en todo el mundo. Se estima que una de cada 9 mujeres sufrirá cáncer de mama durante su vida y que 130.000 mujeres mueren de cáncer de mama cada año (1,2). La principal causa de estas muertes no es el tumor primario en sí mismo sino las metástasis a distancia (1). El hueso es el órgano más frecuentemente afectado (3,4), de tal modo que el 65 -75 % de los pacientes presentan afectación en estado avanzado (3), provocando dolor, fracturas patológicas y compresión de la médula espinal; lo que produce una importante reducción de la calidad de la vida del paciente (5). El patrón de afectación metastásica y difusión es distinto para cada órgano, y el establecimiento y el crecimiento de la metástasis dependerá de las interacciones entre el tumor, las células y el microambiente (5). La metastatización de los diferentes tumores depende de las propiedades intrínsecas del tumor primario y de las características específicas del órgano diana. Así pues, el cáncer de mama metastásico es una compleja y no aleatoria (6) secuencia de múltiples pasos que requiere la expresión de genes específicos y receptores que actúan en conjunto (7,8). Aunque varias moléculas están implicadas en la metástasis del cáncer de mama, el mecanismo preciso de migración de las células tumorales a órganos específicos aún no se ha establecido definitivamente (4,9,10). La elevada morbilidad asociada al cáncer de mama metastásico plantea como necesaria la identificación de biomarcadores predictivos de recaída que permitan clasificar a los pacientes en base a un alto o bajo riesgo de metástasis (7,10,11,12), con el fin de poder modular y dirigir la terapia (5). Nuestro estudio pretende valorar la expresión de diversas moléculas mediante métodos inmunohistoquímicos, en matrices tisulares (MT) procedentes de 234 pacientes diagnosticados de carcinoma infiltrante de mama de tipo no específico, con el fin de identificar un perfil de biomarcadores con valor predictivo. 9 1.1.E-Cadherina 16 En los últimos cinco años, se han sugerido que genes implicados en el desarrollo embrionario (zinc fingers, snail, slug, SIP-1, twist…), se desregulan durante la tumorigénesis, (23, 24), iniciándose un proceso de desdiferenciación y reprogramación transcripcional, seguidos de la activación de señales de supervivencia y proliferación tumoral, a través de los factores de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), endotelial (PDGE), IGF-IRm PI3K, quinasas reguladoras, cadenas y vías proinflamatorias, etc….que inducen a la progresión y EMT tumoral (25,34). Estos reguladores genéticos en situaciones de anormalidad actúan reprimiendo la expresión de e-cadherinas y facilitando la de n-cadherina, dando lugar al inicio de la EMT (24). Vernon et al. realizaron estudios con cuatro líneas celulares isogénicas tumorales, derivadas de una sola, utilizando tecnologías de micromatrices tisulares y compararon los niveles de expresión o actividad de cada gen (23), y advirtieron que la actividad genética variaba con la fase de metástasis en que se encontraba el tumor, y que había activación de ciertos genes en las células metastásicas, y represión de éstos en el tumor primario (23). Entre los diferentes genes reguladores de la embriogénesis destacan los siguientes: snail, ZEB1, ZEB2, E47, slug y Twist; habiéndose observado que cada uno de éstos presenta una mayor actividad en las distintas etapas que comprenden el proceso de EMT. Así, el snail1 y ZEB2 se activan al inicio del proceso invasivo, desempeñando papel en los primeros pasos. Los snail2, E47 y ZEB1, favorecen el fenotipo migratorio, e invasivo. Twist desempeña un papel fundamental en los últimos pasos del proceso metastásico, promoviendo la entrada de las células cancerosas en el torrente sanguíneo (intravasación), así como su supervivencia, una vez separadas del foco primario (22). Una vez establecidas en su nueva ubicación, las células cancerosas pierden las recientes características fenotípicas mesenquimales adquiridas y vuelven a adoptar rasgos epiteliales, formando nódulos organizados. Fenómeno inverso al ya conocido como EMT (34). 17 El Twist es uno de los reguladores de genes más potentes de la morfogénesis embrionaria, ya que controlan gran variedad de procesos celulares, necesarios para la adecuada formación del meséquima, mesodermo, gastrulación y crestas neurales (35). Su actividad confiere comportamiento invasivo a una tumoración durante el proceso de tumorigénesis. Su inhibición, por el contrario, implica reducción de la intravasación de células tumorales; hecho que no influye en el grado de proliferación celular, pero sí provoca una disminución del potencial metastásico de las celulares tumorales (23). En los tejidos normales, el twist permanece inactivo. En cambio, durante el proceso de tumorigénesis, las células cancerígenas reactivan la proteína Twist, proporcionando capacidad de movimiento e invasión (24). En el año 2004 se descubrió que la proteína derivada de este gen no se expresa en las células normales ni en el cáncer primitivo, pero que está sumamente activa en los tejidos metastásicos. El gen Twist se localiza en el cromosoma 7q21.2 y codifica una proteína de la familia hélice-bucle-hélice básica (bHLH), que actúa como factor de transcripción. Las proteínas bHLH se unen a una secuencia llamada caja E, CANNTG, permitiéndoles actuar como reguladores de muchos linajes genéticos en diversos procesos de diferenciación, ya sea como reguladores positivos o negativos y desempeñan un importante papel en la neurogénesis y la miogénesis (24). Se han descrito tres familias de bHLH: A, B, C. La proteína humana Twist presente en vertebrados pertenece a la familia B, donde se identifican dos subtipos de twist (1 y 2), ambos implicados en la diferenciación celular de músculo, cartílago y células osteogénicas. Las mutaciones en la secuencia del gen que codifica twist 1 en vertebrados se han relacionado con enfermedades como el síndrome de Saethre-Chotzen (SCS), trastorno hereditario autosómico dominante caracterizado por anomalías en las extremidades y cabeza. En cambio, las mutaciones en la secuencia que codifica twist 2 se han encontrado sobreexpresadas en la leucemia linfocítica crónica (24). La pérdida de e-cadherina secundaria a la actividad de twist, se lleva a cabo mediante la unión de ésta a los sitios e-box de la cadherina, provocando la ocupación del interruptor que los activa o bien bloqueando a aquellos que promocionan su activación (23,24), con la consecuente pérdida de la adhesión célula-célula. Esta pérdida de acción puede revertir mediante el aporte exógeno de la e-cadherina, pero sin conseguir 18 completamente revertir la transición epitelio-mesenquimal (34). Vernon et al. colocan al twist en una larga lista de proteínas reguladoras capaces de influir en la reactivación de las células cancerosas en fase latente, logrando progresión y avance en los pasos de la tumorigénesis (23). Además de su función sobre la e-cadherina, el twist se ha establecido como agente antiapoptótico por su bloqueo de la vía ARF/p53; la cuál es activada en condiciones normales ante el crecimiento no controlado de células anormales, actuando como método de autoconservación, induciendo a una muerte celular programada (24). El bloqueo de la vía ARF/p53 tiene su base bioquímica en una reducción de la expresión del agente supresor de tumores (ARF), junto con una inhibición de la p53, secundaria a modificaciones de la transcripción y post-traduccionales, como son la fosforilación y la acetilación; inhibiendo así la respuesta natural ante el estrés celular y daños en el ADN originados por los oncogenes. El desarrollo de una tumoración maligna, se debe a una co-expresión o coordinación oncogénica, donde la hiperproliferación estimulada por un oncogén se asocia a la inhibición de la capacidad apoptótica. En el neuroblastoma, la hiperproliferación inducida por N-myc se asocia a expresión de Twist-1 y su efecto antiapoptótico se produce por bloqueo de la vía ARF/p53. Datos recientes han demostrado que la sobreexpresión de twist-1 y su función antiapoptótica se observa en una gran variedad de tumores, tales como cáncer de mama, próstata, carcinomas gástricos, melanomas, osteosarcomas, rabdomiosarcomas, síndrome de Sezary y enfermedades de células CD4 (24). El carácter invasivo que la expresión de Twist-1 confiere a las células tumorales, lo sitúan como un importante regulador de la resistencia de las células del cáncer de mama a los agentes quimioterápicos (22,35). La sobreexpresión de Twist-1, asociada a co-expresión de otros reguladores genéticos de la embriogénesis, como snail e SIP-1, se han relacionado con la invasividad, a través de la pérdida de e-cadherina y ganancia de N-cadherina en el cáncer gástrico humano (25); y como un factor de mal pronóstico en el melanoma (24). Por otro lado, la reducción de Twist-1 en el ARNm, disminuye la incidencia de metástasis pulmonar de cáncer de mama (24). 19 Algunos estudios han demostrado que en tumores con e-cadherina conservada, la tasa de supervivencia a los 5 años es mayor en el subgrupo que muestra baja expresión de twist. Por otro lado, otro estudio ha mostrado como la alta expresión de twist es significativamente mayor en lesiones metastásicas que en tumores primarios (35). La expresión conjunta de snail, slug y twist ha sido descrita en varios tipos de tumores, como el cáncer gástrico, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer hepatocelular, cáncer colorrectal, de esófago, cáncer de vejiga, del tracto superior urotelial y de cuello uterino. Snail y twist son reguladores embriogénicos similares, participando ambos en el inicio del EMT. Expresión de snail se ha identificado en el 54% de los tumores y la de twist en el 50% (snail p: 0,014 y twist p: 0,006), existiendo relación estadísticamente significativa entre expresión de snail y twist, con el descenso de e-cadherina y aumento de expresión de n-cadherina; de tal modo que la co-expresión de ambos reguladores embriogénicos ha sido relacionada como factor de mal pronóstico, con una mayor tasa de recurrencia y menor tiempo libre de enfermedad en pacientes con tumores receptores de estrógenos (RE) positivos (36). Estos resultados apoya la conclusión enunciada por Yuen et al. (37) que señala que la expresión de ambos factores independientemente no presentan resultados concluyentes, mientras que su combinación manifiesta una relación estadísticamente significativa con la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer de mama. Concluimos este apartado extrapolando la idea de que Twist es un importante regulador genético capaz de modular de manera determinante el desarrollo del cáncer, mediante el bloqueo o inhibición de los sistemas de seguridad celulares ante una actividad mitótica anormal, así como mediante la alteración de la capacidad de adhesión célula-célula (24). La inhibición de Twist inducida por drogas, así como el control de su activación y el conocimiento del componente molecular que participa en la EMT aumentarían la sensibilidad de las células anormales a la apoptosis, confiriendo una importante barrera contra el cáncer y ayudaría a abrir nuevas vías de investigación en el desarrollo de tratamientos (22,24). 20 1.3.ABCG2 21 La cirugía es el principal tratamiento y el más efectivo para el cáncer de mama en la actualidad. Sin embargo, muchos pacientes reciben tratamiento adyuvante (postoperatorio), el cual reduce el riesgo de enfermedad loco-regional y disminuye la tasa de recurrencia del tumor, siendo su principal objetivo proporcionar un beneficio máximo de supervivencia con la mínima toxicidad (38). La terapia adyuvante incluye diversas opciones de tratamiento, entre los que destacan quimioterapia adyuvante, radioterapia, terapia endocrina y agentes biológicos. La terapia sistémica aumenta el tiempo libre de enfermedad en los pacientes, pero no presenta un efecto curativo radical de aquellos con enfermedad avanzada o metastásica, así como tampoco beneficia a pacientes con enfermedad localizada de cáncer de mama. Así pues, obtenemos la idea de que el tratamiento adyuvante es considerado en la actualidad como complementario de la cirugía, siendo ésta última la que presenta resultados de curación. Uno de los aspectos más estudiado por los investigadores en los últimos años, respecto a la terapia adyuvante es la resistencia intrínseca a la quimioterapia, convirtiéndose así en una causa importante de fracaso del tratamiento sistémico (39). El fenotipo de resistencia al tratamiento adyuvante se ha relacionado con un aumento de la expresión de los genes “ATP-binding cassette” (ABC), cuyas proteínas actúan como transportadores de fármacos dependientes de gradiente. Los ABC llevan a cabo el trasporte de un sustrato desde el interior, hacia el exterior de la célula atravesando la membrana celular contra gradiente, mediante el empleo de energía (40). Dentro de los genes ABC, destacamos el perteneciente a la subfamilia G2, conocido como ABCG2 (ATP-binding cassette subfamilia G2). La sobreexpresión de ABCG2 ha sido relacionada con un fenotipo de resistencia a los fármacos de la terapia adyuvante, por lo que también se le conoce como “proteína de resistencia” (BCRP). En 1998, Doyle et al. clonaron el primer gen conocido responsable del fenotipo de resistencia al tratamiento adyuvante, el gen BCRP. Más tarde, se descubrieron en diferentes laboratorios dos moléculas transportadoras que fueron conocidas como ABCP, para el transportador ABC altamente expresado en la placenta (41), y MXR, 22 para el gen de resistencia a mitoxantrona (42) y se advirtió que los tres genes (BCRP, ABCP y MXR) prácticamente tenían la misma secuencia (43). El gen ABCG2 se localiza en el cromosoma 4q21-4q22 (44), consta de 16 exones y 15 intrones y su proteína contiene 655 aminoácidos (45). En condiciones fisiológicas, el gen ABCG2 se expresa en la placenta (en las células del sincitiotrofoblasto), así como en el colon, el intestino delgado, canalículos biliares, el tejido mamario, el endotelio venoso, y en capilares (46). En tumores, la proteína ACBG2 desempeña un importante papel en el transporte de fármacos al espacio extracelular, relacionándose su sobreexpresión con el fenotipo de resistencia a los fármacos adyuvantes. Esta situación convierte al ABCG2 en un importante factor predictivo en la quimioterapia en el cáncer de mama (43) así como en diana terapéutica en la búsqueda de una mejora en la efectividad de los tratamientos administrados al paciente (47-50). En la actualidad, el desarrollo de los anticuerpos anti-ABCG2 ha permitido su identificación celular (citoplásmica y de membrana) mediante técnicas inmunohistoquímicas. Los parámetros valorados son el porcentaje celular teñido, y la intensidad de esa tinción, obteniéndose como resultado final el producto de ambos parámetros. La proporción de células tumorales teñidas se puntúa de la siguiente manera: 0 (ausencia de células tumorales positivas);1 (≤ 30% positivo células tumorales); 2 (31 a 50% de células tumorales positivas); 3 (51 a 80% las células tumorales positivas) y 4(> del 80% de las células tumorales positivas) (51). La intensidad de la tinción se clasifica en base a la siguiente criterios: 0 (-, ausencia de tinción), 1 (+, tinción débil), 2 (+ +, tinción moderada) y 3 (+ + +, Tinción fuerte) (51). El índice de tinción (SI) se calcula como el producto de la puntuación de intensidad de la tinción y la proporción de células tumorales positivas, obteniéndose los posibles siguientes valores: 0,1,2,3,4,6,9 o 12. Se considera como punto de corte positivo una puntuación final ≥ 4, siendo una puntuación ≤ 3 utilizada para indicar una expresión ABCG2 bajo, y la puntuación 0, implica la expresión negativa. 23 La expresión de ABCG2 en el tejido glandular mamario normal es de bajo nivel o prácticamente ausente (Figura 1), mientras que los tumores con alto grado y con componente infiltrante presentan una mayor expresión (Figura 2). Existe relación significativa entre expresión de ABCG2, y nivel de invasión tumoral, consagrándose este biomarcador como factor pronóstico, cuyos altos niveles de expresión indican mala respuesta al tratamiento adyuvante, así como menor tiempo libre de enfermedad y menor supervivencia. Altos niveles de expresión de ABCG2 se han señalado con frecuencia en los tumores de mama, del tracto digestivo, endometrio y melanoma (52) y cáncer de pulmón (53, 54). La expresión de ABCG2 se correlaciona con la alta expresión de HER2, lo que aporta solidez a la idea de que ABCG2 se correlaciona con un peor comportamiento biológico y una mayor agresividad clínica. Además, la expresión de ABCG2 se correlaciona con metástasis ganglionar y clínica, lo que sugiere que los pacientes con alta expresión de ABCG2 pueden tener un peor pronóstico (43,53). La correlación significativa entre ABCG2 y HER2 puede sugerir que ABCG2 no actúa sólo como un transportador de la familia ABC, sino que éste se descubre como un nuevo biomarcador de alto potencial capaz de predecir la evolución biológica del tumor, la progresión clínica y la eficacia a la quimioterapia. Este transportador permite el empleo de una terapia personalizada más eficaz para el paciente, evitándole efectos secundarios tóxicos. Así pues, los últimos estudios han definido que ante una fuerte expresión de ABCG2 el tratamiento adyuvante Fig. 1 Fig. 2 24 administrado debe ir acompañado de los antagonistas de ABCG2, para asegurar una mayor efectividad y eficacia en el tratamiento (43). Otro de los avances que han aportado los últimos estudios se centra en la inhibición del efecto de la sobreexpresión de ABCG2, no mediante el aporte de antagonistas, sino a través del control y regulación del promotor de ABCG2. El promotor de este transportador es regulado por diversos factores, entre los que destacan los estrógenos (55), la hipoxia (56) y los receptores de andrógenos (57). El control y regulación de este transportador se lleva a cabo mediante la vía de señalización PI3/Akt (56). 25 1.4.Caveolina 32 El CD10 es una metaloproteinasa dependiente de zinc con un peso molecular de 110 KDa. Se le conoce como el “antígeno de la leucemia linfoblástica aguda común” (CALLA). También se han referido al CD10 como “metaloendopeptidasa neutra” en el riñón, así como “encefalinasa” en el cerebro (107). El término CALLA es debido a su expresión constante en la superficie celular de la leucemia linfoblástica aguda (108,109), lo cual es un hallazgo de notable utilidad diagnóstica (110). Las células tumorales inducen la sobreexpresión de estas metaloproteinasas en el estroma (111). Este aumento de expresión conduce a la degradación de la matriz extracelular, tumorigénesis, apoptosis y proliferación, así como a la interacción con las células cancerosas, acelerando el ciclo celular y activando la motilidad de las células tumorales. Esta cascada de acontecimientos tiene como resultado el inicio de un bucle cerrado centrado en la degradación, la invasión y la metástasis tumoral (112). Este proceso puede verse influenciado por varios factores entre los que destacan las interleuquinas IL-1 y IL-6. El CD10 se expresa en gran variedad de células normales no neoplásicas, como células precursoras de centro germinal, enterocitos, células epiteliales prostáticas y de la vesícula biliar, así como células mioepiteliales de las glándulas mamarias y salivares (113) (Figura 7). La expresión de CD10 ha sido descrito también en células estromales en el cáncer de mama, (114), en el cáncer de próstata y vejiga urinaria (115,116), estómago y colorrectal (117,118), en el sarcoma del estroma endometrial (119,120) así como en el nasofaríngeo (121), y en el hepatocelular carcinoma (122-124). Fig. 7 33 La evaluación inmunohistoquímica de CD10 considera tinción negativa, aquella que se presenta de forma débil, ya sea de forma difusa o focal, o fuerte en menos del 30% de los núcleos de las células estromales del cáncer de mama. Por el contrario, se considera positiva aquella tinción fuerte en más del 30% de los núcleos de las células estromales (114). Obteniendo valores numéricos comprendidos entre 0-2. Siendo 0: negativo; 1: positivo débil, y 2: positivo intenso. Otros estudios consideran CD10 con expresión positiva o negativa, en función de si la tinción ocupa más o menos del 10% de las células estromales del cáncer de mama (125). CD10 presenta tinción positiva en condiciones no neoplásicas en las células basales mioepiteliales de la glándula mamaria durante su desarrollo y tras su maduración, considerándose un marcador específico de componente mioepitelial (126) (figura 8). Otros componentes de la mama, como las células epiteliales y lo fibroblastos, son negativos en condiciones fisiológicas. (127). Se ha demostrado una mayor expresión de CD10 a nivel estromal en el carcinoma de mama de estadio avanzado (126). Este hallazgo se asocia con el tamaño tumoral, el estadio, el grado histológico, la presencia de ganglios positivos y metástasis a distancia, negatividad para receptores hormonales de estrógeno, así como con la pérdida de moléculas de adhesión como la E- cadherina (125). Por tanto, positividad al CD10 en las células estromales en el cáncer de mama es un factor pronóstico adverso que se relaciona directamente con un menor tiempo libre de enfermedad y una menor supervivencia (116) (Figura 9). Fig. 8 Fig. 9 34 En otras neoplasias, como en el carcinoma colorrectal y el carcinoma hepatocelular, o el tumor fibroepitelial de la mama de tipo filodes (128); la expresión de CD10 en las células estromales, también orienta a peor pronóstico con menor supervivencia y mayor tendencia al desarrollo de metástasis (107,114,117,128,129,130). Para concluir, la expresión de CD10 se correlaciona intensamente con otros biomarcadores cuya expresión son indicativos de mal pronóstico, como el HER2 y p53 positivo y Ki67 elevado; así como con expresión negativa de receptores de estrógenos, y progesterona (131). El CD10 es un marcador independiente de mal pronóstico, y menor supervivencia, que puede ser utilizado como diana terapéutica en el desarrollo de tratamientos innovadores contra el cáncer de mama (107,114,125,131). 35 1.6.CD44 36 El CD44 es una glicoproteína transmembrana que pertenece a una familia de receptores de superficie celular, los cuales reconocen al hialuronato como su principal ligando (132-137). El ácido hialurónico es un polímero de glicosaminoglicano no sulfatado abundante en la matriz extracelular, que rodea a la célula cancerosa y no cancerosa, y tras su adhesión al receptor transmembrana promueve el crecimiento y la propagación de las células tumorales (138). El CD44 presenta varias isoformas. Estas variantes se constituyen por la inserción de un aminoácido adicional en el dominio extracelular de la proteína (139,140) mediante el empalme de uno o más exones alternativos entre los exones estándar 5 y 6 (141). Las isoformas que contienen el exón v6 codificado (CD44v6), inducen a la diseminación del tumor en el carcinoma de páncreas de la rata (142), en el cáncer de colon en seres humanos (143,144), así como en linfomas no-Hodgkin en humanos (145). Variantes homólogas del CD44v6 sobreexpresado en otros tumores implican un papel importante en la progresión tumoral y en la metástasis en los seres humanos. Así pues, se relaciona la expresión de CD44v6 con un mal pronóstico de varios tumores, concretamente en aquellos de origen gastrointestinal (146). La unión del receptor a su principal ligando, hialuronano-CD44, media la adhesión celular a la matriz extracelular, y además, activa un proceso basado en la internalización del ligando en el interior de la célula, desencadenándose un proceso de degradación del hialuronano, lo cual permite una remodelación de los tejidos, así como una estimulación de la proliferación celular (135, 147,148). Además, CD44 juega un importante papel en la migración de algunas células neoplásicas, en especial de los linfocitos (149). De manera que esta función proliferativa y migratoria conduce a la progresión de varios tumores (136). Se ha señalado que la variante exón 6 promueve la metástasis de las células cancerosas del cáncer de mama (150), donde el aumento de los niveles en suero de CD44v6 se correlaciona significativamente con el estadio del tumor, y la presencia de metástasis ganglionares y a distancia (151). 37 La evaluación de CD44 se realiza mediante técnicas inmunohistoquímicas (141), que reflejan expresión de membrana de varias isoformas en las células epiteliales de los conductos neoplásicos mamarios (Figura 10). El tejido mamario no patológico no expresa ninguna isoforma de CD44 (152). Tras diversos protocolos de interpretación, se ha realizado una clasificación que combina dos parámetros: intensidad de la tinción y porcentaje de tejido tumoral teñido. De esta manera, se consideran varias categorías: 0: (<5%), 1: (5-25%), 2: (25-75%), y 3: (>75%) (141). Otros estudios, valoran la expresión inmunohistoquímica en base al producto del porcentaje teñido y la intensidad de la tinción (153), o sólo en base a tinción focal o generalizada (154). Algunos estudios sugieren que la expresión de CD44 y el CD44v6, no aporta suficiente información como para ser útiles como indicadores pronósticos en el cáncer de mama en estadios iniciales a nivel individual; siendo su función revalorizada y ensalzada en presencia de coexpresión con otros marcadores, como los receptores de estrógenos (152). De manera que en la actualidad, las diferencias de opiniones en las hipótesis enunciadas, confieren al valor pronóstico de la expresión del CD44 y CD44v6 en el cáncer de mama, un significado confuso y controvertido. Aún así, la mayoría de los estudios, coinciden que la expresión positiva de CD44v6 es un marcador importante y de utilidad, en la indicación de mal pronóstico en mujeres diagnosticadas de carcinoma de mama en estadio inicial, con correlación significativa entre sobreexpresión de isoforma, y una supervivencia más corta (155-160) (Figura 11). Fig. 10 Fig. 11 38 En conclusión, la expresión del CD44v6 se correlaciona directamente con el tamaño del tumor, las metástasis de ganglios axilares, el TNM; así como inversamente, con la supervivencia global. 39 1.7.CD117 40 El c-KIT es un proto-oncogen localizado en el cromosoma 4q11-21, que codifica un receptor transmembrana tirosínquinasa de 145 KDalton (161). Su estructura consta de 5 dominios tipo inmunoglobulina extracelular y un dominio de escisión de la tirosin quinasa y su estructura se encuentra estrechamente relacionada, compartiendo una similitud estructural, con el factor de crecimiento derivado de plaquetas y el factor estimulante de receptores de colonia (161). Este receptor transmembrana se une a un ligando, llamado factor ligando o KIT ligando (162,163). La interacción del receptor c-kit y su ligando da lugar a la activación del dominio quinasa KIT, con la consecuente fosforilación de residuos de tirosina que transactiva una gran variedad de señales, involucradas en la proliferación, la apoptosis y la tumorigénesis (162,164). Cómo receptor transmembrana, el c-kit desempeña diversas funciones en la hematopoyesis, melanogénesis, espermatogénesis, y en el desarrollo de las células intersticiales de Cajal (165). En condiciones normales, el c-kit se expresa en células madre hematopoyéticas, mastocitos, melanocitos, células intersticiales de Cajal, epitelio normal de glándula mamaria. Su ausencia de expresión se ha referido en localizaciones como pulmón, endocérvix, páncreas, estómago e intestino (166,167). En situaciones patológicas, el c-kit se expresa principalmente en el tumor del estroma gastrointestinal (GIST), asociado a mutaciones en el gen c-kit (exones 9 y 11 principalmente) (168). También se ha señalado expresión de la proteína C-KIT en una gran variedad de tumores malignos, incluidos leucemia mieloide, carcinoma de pulmón de células pequeñas y seminomas (168-171). En el carcinoma de mama no se han encontrado mutaciones del gen c-kit en el cáncer de mama; aunque se expresa en el epitelio de una glándula mamaria normal (172-176). Así pues, mientras que el c-kit está implicado en el crecimiento y mantenimiento de un epitelio escamoso y glandular normal en determinadas localizaciones; éste pierde su expresión en el epitelio tumoral, como se advierte en el cáncer de mama, melanoma, cáncer de tiroides, y carcinoma renal de células claras y papilar (176, 177); siendo su expresión conservada en el carcinoma cromófobo de células renales (178). 41 Diversos estudios han confirmado y demostrado que el c-kit es altamente expresado en el epitelio mamario normal, pero sólo se expresa a niveles bajos o se pierde completamente en cáncer de mama primario o metastásico (174, 179,180,181,182). Debido a ello, el c-kit ha sido incluido dentro de los factores que pueden influir en la transformación de un carcinoma de mama in situ en cáncer invasivo, colocándolo como factor que juega un importante papel en la carcinogénesis de mama, y relacionando su ausencia completa de expresión con un carcinoma de mama invasivo en estadio avanzado. (161,181). La figura 12 muestra como el resultado cuantitativo inmunohistoquímico de c-kit, es considerado como factor pronóstico, asociando ausencia de expresión con tumoración de alto grado y menor supervivencia global del paciente (182). La expresión inmunohistoquímica de c-kit ha sido evaluado de diferentes maneras, considerando como método más estandarizado la combinación de dos parámetros: el porcentaje de tejido tumoral teñido, y la intensidad de la tinción (183). 0: Ausencia de tinción, o tinción en menos del 10% de las células del carcinoma. 1+: Tinción citoplasmática débil o moderada en el 10% o más, de las células del carcinoma a evaluar. 2+: Tinción citoplasmática fuertemente teñida, con o sin tinción de membrana en el 10% o más de las células tumorales del carcinoma a evaluar. Fig. 12 48 Las citoqueratinas (CK) constituyen el mayor grupo de filamentos intermedios y junto con otros filamentos, forman el citoesqueleto de las células eucariotas. Algunas de sus funciones residen en el mantenimiento de la estructura de la célula epitelial, la protección ante traumatismos y la comunicación entre los componentes citoplasmáticos. Su expresión se lleva a cabo en forma de pares y varía de acuerdo con el tipo de célula (223). Se clasifican numéricamente del 1 al 20, según su peso molecular y su punto isoeléctrico; distinguiéndose 2 grandes grupos de CK: Citoqueratinas de epitelios simples (CK7, CK8, CK18, CK19, CK20); y Citoqueratinas de epitelios complejos, como la piel (CK5/6, CK10, CK14, CK15). Otro sistema de clasificación distingue entre CK ácidas o tipo I, que generalmente corresponden a CK de bajo peso molecular (CK9-CK20) y CK básicas o tipo II, que generalmente son CK de alto peso molecular (CK1-CK8). Las citoqueratinas son útiles en el diagnóstico tumoral, permitiendo la identificación de adenocarcinomas y carcinomas derivados de epitelio escamoso no queratinizante. La CK5/6 es una CK de alto peso molecular, presente en las células escamosas, que resulta útil para la tipificación de tumores de diferentes localizaciones. En la piel, la CK5/6 se expresa en la epidermis y en el epitelio de los anejos, por lo que su expresión está presente en neoplasias anexiales cutáneas, tanto benignas como malignas. No obstante, también se expresa débilmente, hasta en el 30% de las metástasis de adenocarcinoma, por lo que posee cierta utilidad en el diagnóstico diferencial histopatológico entre neoplasias cutáneas primarias y metástasis cutáneas de carcinomas viscerales (224,225). La mayoría de los mesoteliomas, carcinomas de células escamosas, carcinomas de células basales y carcinomas de células transicionales expresan CK5/6, mientras que la mayoría de los adenocarcinomas son CK5/6 negativos. Habitualmente se considera positiva a la tinción de CK5/6 cuando existe: algún tipo de marcaje (débil o fuerte) citoplasmático o de membrana, en las células tumorales (226). 49 En la evaluación de su expresión se valoran dos parámetros: Intensidad, adoptando valores del 0 al 3; y porcentaje de células tumorales marcadas, con valores entre el 0 y el 100%. Ambos parámetros se multiplican obteniendo una puntuación final comprendida entre 0 y 300. Se considera expresión negativa el producto final igual o inferior a 10. Por el contrario, se considera expresión positiva a aquellos valores mayores a 10 (227). En el carcinoma de mama el estudio de la expresión de CK5/6 forma parte de una nueva subclasificación de base molecular con significado pronóstico y predictivo (223). El panel inmunohistoquímico propuesto por Nielsen (Figura 17) permite clasificar los carcinomas infiltrantes de mama en cuatro tipos; Luminal A, Luminal B, HER2, y basales o triple negativos, éstos últimos se caracterizan por presentar inmunorreacción negativa a receptores de estrógeno, progesteronas y HER2; y expresión de citoqueratina 5/6 (Figura 18) Clasificación de Cáncer según panel Inmunohistoquímico definido por Nielsen: CK, Citoqueratina; EGFR, Factor de crecimiento epidérmico; RE, Receptor de estrógenos. Grupo HER2 RE CK 5/6-EGFR HER2 + +/- +/- Luminal - + +/- Basal-like - - + Indeterminado - - - Fig. 17 50 Aunque aún no existe consenso internacional para elegir un panel de anticuerpos que permita establecer el diagnóstico definitivo de carcinomas mamarios con fenotipo basallike, en numerosas publicaciones se ha propuesto varios paneles (228). En general, se ha demostrado que en aquellos tumores de fenotipo basal confirmados por “microarrays”, el panel de inmunohistoquímica tiene una sensibilidad del 76 % y una especificidad del 100 % (191). La CK5/6 actualmente es considerada como el marcador basal más sensible (90,1%), seguido del factor de crecimiento epidérmico 1 (EGFR1) (73,33%) y de la CK17 (61%) (191, 229, 230). Ésta última se caracteriza por relacionarse con una mayor tendencia al desarrollo de metástasis pulmonares y cerebrales, y con menor supervivencia (191,228). Los carcinomas con fenotipo basal (triple negativo), presentan rasgos histológicos de agresividad (alto grado nuclear y elevado índice mitótico), así como ausencia de expresión de RE-, RP- y HER2-; y han sido asociados a resultados clínicos pobres y pronóstico peor (191). Fig. 18 51 Los tumores de tipo basal comparten características morfológicas, tales como necrosis tumoral focal, esclerosis y/o necrosis central, componente linfocitario abundante asociado, presencia de células tumorales fusiformes o células tumorales con diferenciación sarcomatoides, metaplasia escamosa y/o diferenciación escamosa, alto grado nuclear, alta tasa mitótica, elevada relación núcleo-citoplasma y patrón sincitial de las células tumorales (231,232). 52 1.10.CXCR4 53 Es bien sabido que el establecimiento de metástasis depende de las propiedades intrínsecas del tumor primario y de las características específicas del órgano diana. Destacamos la función de las quimiocinas y sus receptores, como biomarcadores predictivos asociados con metástasis de cáncer de mama; y su expresión en el tumor, los microvasos y en el parénquima del órgano diana (233). De hecho, la interacción de quimioquinas con sus receptores puede desempeñar un papel importante en las dos fases diferentes del proceso de metastatización. En primer lugar, en la migración de las células neoplásicas desde el foco primario al secundario. En segundo, en la progresión local de la metástasis mediante la inhibición del proceso de apoptosis y la inducción de la angiogénesis (234). Además, influyen en la infiltración linfocitaria estromal (235,236). Las células tumorales producen receptores de quimioquinas que reconocen a ligandos homólogos (producido por ciertos órganos) y permiten la migración a lo largo de los gradientes de quimioquinas para el establecimiento de metástasis en órganos específicos. De todos los receptores de quimiocinas conocidos, las células del cáncer de mama expresan específicamente la CXCR4 y CCR7, siendo sus ligandos HCXCL12 y CCL21 respectivamente (4). Las quimiocinas pertenecen a la gran familia de citoquinas e inducen organización del citoesqueleto y migración endotelial y direccional de las células tumorales a través de su interacción con los receptores de proteína G acoplados (4). Muller et al. defienden la hipótesis de que los órganos diana presentan aumento de expresión y que actúan como atrayentes específicos de células tumorales, de modo análogo a su función quimioatrayente de las células hematógenas durante el proceso inflamatorio (233,237). Entre las quimiocinas destaca el receptor de CXC - 4 quimiocina ( CXCR4 ) y su único ligando, ligando quimiocina CXC – 12 ( CXCL12 ) (4, 238). Las quimioquinas son proteínas pequeñas monoméricas de 8 a 15 kiloDalton, que se clasifican en función de la existencia y localización de los residuos de cisteína en cuatro subgrupos: CXC , CC , C , y CX3C (238). 54 Diversos estudios anteriores han documentado una participación e influencia directa del eje receptor /ligando CXCL12 - CXCR4 sobre la vía de señalización PI3K/Akt y ERK, y en los procesos de disociación, la invasión de la matriz, adhesión, transporte y migración celular (238-241). La tinción de CXCR4 en las células tumorales es citoplásmica y / o nuclear o de membrana (Figura 19). La evaluación de la tinción se realiza en base a dos parámetros, tinción citoplasmática y nuclear. La intensidad citoplasmática se evalúa del siguiente modo: ( 0 ) ausencia; ( 1 + ) debil, ( 2+ ) moderado, y ( 3 + ) fuerte. Se consideran como positivos, los casos con puntuación 2 o 3; y negativos, aquellos con puntuación 0 o 1. De acuerdo a la tinción nuclear, ésta es catalogada como positiva ( 1 ) y como negativa ( 0 ) (4). Kang et al. definen una firma genética, que relaciona la sobreexpresión de IL – 11, MMP - 1 y CXCR4 en las células tumorales de cáncer de mama con metástasis en hueso (7). Por otra parte, CXCR4 ha sido significativamente expresado en células tumorales de cáncer de mama con ganglios linfáticos positivos para metástasis y su ligando CXCL12 se expresan más en tumores metastásicos que en tumores primarios del mismo paciente (4). La expresión de CXCR4 en tumores primarios ha sido asociada con un mayor riesgo para el posterior desarrollo de metástasis óseas (Figura 20) (242). La expresión de CXCR4, y otros biomarcadores como CCR7 y EGFR, se asocian con metástasis de ganglios linfáticos y se consideran indicadores de mal pronóstico (4). Fig. 19 Fig. 20 55 CXCR4 es expresado intensamente en las células neoplásicas de cáncer de mama en humano y en sus metástasis tumorales. Mientras que su ligando CXCL12 se expresa preferentemente en los tumores de pulmón, hígado, médula ósea y ganglios. Por lo tanto, se deduce que el eje CXCL12 - CXCR4 puede estar asociado con la metástasis pulmonares, hepáticas, óseas y cerebrales (4,243). Informes recientes sugieren que la expresión de CXCR4 puede estar regulada o influenciada por la amplificación de HER2 /neu (4), ya que su expresión se asocia fuertemente con factores de crecimiento (EGFR y HER2/neu) (4). La expresión de CXCR4 ha sido identificada como factor predictivo de peor pronóstico en tumores metastásicos y también en tumores malignos de origen neural, como el glioma (236) y el neuroblastoma (244). De la misma manera, los receptores de quimioquinas / quimiocinas se han relacionado directamente con el activado de las células endoteliales linfáticas (LEC) y linfangiogénesis del tumor (238). La sobreexpresión elevada de CXCR4 en el cáncer de mama predice una evolución peor en los pacientes que tienen cáncer de mama triple negativo (245). Estudios actuales han confirmando la relación entre CXCR4, MMP-9 y VEGF, y la existencia de metástasis en ganglios linfáticos en el cáncer de mama y explican cómo la expresión combinada de los tres presenta una fuerte y firme asociación con la metástasis ganglionares (246). A pesar de haber sido registrado y considerado como válido un marcaje indistinto citoplasmático, nuclear o de membrana de las células tumorales; la heterogeneidad que en sí mismo presenta el tumor de mama y los distintos patrones de tinción han sido objeto de numerosos estudios. La alta expresión de CXCR4 a nivel nuclear y/o citoplasmática está directamente relacionada con un peor pronóstico, menor período libre de enfermedad y menor supervivencia global (4). Diversos estudios han demostrado que el proceso metastásico es diferente en el cáncer de mama según presente ganglios negativos o positivos para metástasis (247). 56 En el cáncer de mama con ganglios negativos sugieren que la expresión de membrana de CXCR4 parece desempeñar un papel clave en la invasión vascular de las células tumorales, mientras que posiblemente sea importante pero no esencial durante la invasión linfática (247). La alta expresión nuclear de CXCR4 ha sido detectada en cánceres de mama invasivos, correlacionándola directamente con el grado de progresión tumoral (237). La expresión citoplasmática se ha relacionado con rasgos de agresividad tumoral, como receptores hormonales negativos y HER2 sobreexpresado y amplificado (237), y con metástasis en los ganglios linfáticos (4). La literatura defiende y relaciona una alta expresión citoplasmática de CXCR4 (Figura 21) en cánceres de células no pequeñas, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de mama y carcinoma de células escamosas orales, nasofaríngeo y esofágico, así como en el carcinoma hepatocelular (248-252), y también ha demostrado que los pacientes con alta expresión de CXCR4 tienen un período más corto de supervivencia. Es decir, existe relación directa entre la intensidad de la tinción y el mal pronóstico (245). Así pues, todo parece indicar que la molécula CXCR4 es un marcador de invasión en el cáncer de mama, y la expresión alta se asocia a progresión tumoral, de tal modo que existe relación directa entre intensidad de tinción y grado de invasión tumoral (237). No obstante, Andre et al. (242) han mostrado resultados contradictorios. En un estudio de 200 cánceres de mama, de los cuales 103 presentaban metástasis óseas, el 80 % (82 de 103) de la metástasis óseas se produjeron en pacientes con tumores CXCR4 negativo, siendo sólo el 20 % de los pacientes con metástasis óseas CXCR4 positivas. Fig. 21 57 Esta observación sugiere que la expresión de CXCR4 a nivel individual, puede no ser lo suficientemente precisa para ser considerado como un buen predictor independiente de las metástasis óseas. De tal modo que es necesario la coexistencia de otros biomarcadores que complementen el resultado de la expresión de CXCR4 para el desarrollo de metástasis óseas. Smid et al. (11) identificaron un grupo de 31 genes como predictores principales de metástasis ósea en el carcinoma de mama. Entre ellos Kang et al. (7) destacan como más importantes la IL-11, el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), y factor de crecimiento transformante (TGF), y posiblemente también el CXCR4. Estos datos sugieren que a pesar de que la expresión de CXCR4 se asocia con una mayor tasa de metástasis ósea, es necesaria la presencia de otros biomarcadores complementarios para poder predecir con mayor precisión la aparición de metástasis óseas (242). La expresión de los receptores de quimioquinas puede servir como herramienta para guiar la toma de decisiones terapéuticas (3), y pueden ser útiles en la identificación de nuevas vías en la terapia del cáncer de mama (4). 64 FOX es una familia de factores de transcripción que se compone de al menos 40 miembros. La subfamilia FOXA/HNF-3, regula la transcripción de numerosos genes en hepatocitos de hígado adulto (275, 276). Dentro de esta subfamilia se reconocen tres factores diferentes: FOXA1/HNF3α (factor nuclear de hepatocitos 3α), FOXA2/HNF3β y FOXA3/HNF3γ. La expresión de estos factores de transcripción se advierte especialmente en mama, hígado, páncreas, vejiga, próstata, colon y pulmón y pueden unirse a promotores de más de cien genes asociados con la regulación de la señalización celular y el ciclo celular (277-282). FOXA1, en particular, desempeña un papel importante en páncreas, riñón, hígado, pulmón, tracto gastro-intestinal, cerebro, próstata y glándula mamaria (275,277). FOXA2 es el primer factor de transcripción del grupo en expresarse. Se observa durante la embriogénesis. La expresión de FOXA1 se detecta en la etapa tardía de la embriogénesis, en la línea media del endodermo, seguido de la expresión en la placa del piso ventral, notocorda y el intestino. FOXA3 es el último factor de transcripción en ser activado, advirtiéndose en el intestino su posterior diferenciación (275). FOXA presenta una estructura conservada, en forma de hélice, que consiste en un dominio de unión a ADN similar al que presentan las histonas (275) y 4 regiones de transactivación, 2 en el lado C-terminal de la proteína y 2 en su extremo N-terminal (278-280). Entre las múltiples funciones generales de FOXA1 destacamos su capacidad para configurar la cromatina, permitiendo el desarrollo de otros reguladores transcripcionales (281-283); la participación en el proceso de diferenciación de las células pluripotenciales P19 (284), el cual viene precedido por la unión de FOXA1 a ADN; así como la posterior pérdida de la metilación de citosina y la desmetilación de la histona H3 lisina K4 (H3K4) (275) (Figura27). 65 La capacidad de remodelación de la heterocromatina que presenta FOXA1 la involucran en un proceso de transcripción que influye en el ciclo celular y en el desarrollo de la enfermedad. FOXA1 se requiere para el desarrollo normal de la mama y glándula prostática, y es necesaria para el desarrollo de los receptores de estrógenos y andrógenos (275). A su vez, su ausencia, ha sido relacionada con hipoglucemia grave y deshidratación. La expresión de FOXA1 en el cáncer de mama se correlaciona positivamente con la expresión de ER y con otros factores de transcripción, entre los que destacamos el GATA3 (285,286). Ambos son mediadores necesarios para el desarrollo normal de la glándula mamaria (287). No obstante, Kouros-Mehr et al. (287) han demostrado que la expresión de GATA3 no influye en la expresión de FOXA1 y por lo tanto, es prescindible para la expresión de FOXA1 en la glándula mamaria. En cambio, demostraron que en carcinomas en otras localizaciones existe unión GATA3 al promotor FoxA1 (287), dejando así abierta la posibilidad que presenta a GATA3 como posible regulador de la expresión de FOXA1 en otros tipos de tejidos diferentes al mamario (275). Fig. 27 66 La correlación existente entre FOXA1 y RE en cáncer de mama parece indicar que FOXA1 desempeña un papel esencial en la regulación transcripcional de RE. En apoyo a esta hipótesis, FOXA1 y RE son co-expresados en el epitelio luminal de la glándula mamaria durante el desarrollo (275,288). A diferencia del cáncer de próstata, donde la pérdida de FOXA1 afecta a la expresión de los receptores hormonales afines pero se conserva su expresión; en el cáncer de mama, la pérdida de la expresión de FOXA1, se asocia a pérdida de expresión epitelial de RE (275). En glándulas mamarias deficientes de RE se mantiene la expresión de FOXA1 y GATA3 (288). Esto contrasta con lo que se observa en glándulas mamarias deficientes de GATA3 donde se mantiene la expresión de FOXA1 (288), pero se pierde la RE. Así pues, existe un orden jerárquico de estos tres factores de transcripción que sitúa a GATA-3 y FOXA1 en un nivel superior a RE; revelándose también cómo la expresión de GATA-3 y FOXA1 no son interdependientes. Curiosamente, a diferencia de los defectos observados en páncreas, pulmón, intestino y próstata, secundarios a la ausencia o falta de expresión de FOXA1, la pérdida de este factor de transcripción en la glándula mamaria no afecta a la maduración lobulo-alveolar y la producción de leche (288). El papel de FOXA1 en la carcinogénesis se ha estudiado especialmente en el carcinoma de mama; donde parece existir relación entre agresividad histológica y la expresión de este factor de transcripción y subtipo molecular. Los subtipos moleculares de cáncer de mama se distinguen por la expresión diferencial de numerosos genes. En particular, el FOXA1 se expresa en tumores subtipo luminal, junto con varios otros genes discriminatorios, incluidos ESR1 y GATA3. Diversos estudios anteriores han confirmado una frecuencia de FOXA1 positivo del 42 y el 77% en los tumores subtipo luminal A (279,285, 289,290,291). Desde que se descubrió la relación de FOXA1 y su presencia en los tumores subtipo luminales, ésta se ha convertido en una molécula de gran interés. 67 Varios grupos de investigación han propuesto utilizar FOXA1 como herramienta pronóstica para estadificar a los pacientes en el subtipo luminal con RE-positivo. Los resultados de estos estudios sugieren que FOXA1 puede predecir la supervivencia en esta población, y por lo tanto ayudar en la toma de decisiones terapéuticas. Hannenhalli et al. (275) investigaron la correlación entre la expresión de FOXA1 y Oncotype DX en pacientes con enfermedad con ganglios negativos y RE-positivo. Se observó expresión negativa de FOXA1 ante indicaciones de Oncotype de recurrencia. Esta idea llevó a los autores a sugerir cómo la expresión de FOXA1 podría resultar un método más rentable y práctico que el Oncotype DX para el estadiaje de tumores de mama RE positivos. Aunque FOXA1 se correlaciona estadísticamente con RE, diversos estudios han registrado expresión de FOXA1 en tumores RE negativos. Por otro lado, también se ha señalado que FOXA1/Receptores de andrógenos positivos inducen a la transcripción de un conjunto de genes que transmiten el fenotipo de cánceres de mama apocrino (275). Podemos concluir que FOXA1 es necesario para el crecimiento celular y específicamente para la progresión del ciclo celular mediada por estrógenos. La unión de FOXA1 generalmente disminuye con el tratamiento antiestrógenos. Además de la capacidad del FOXA1 para controlar la actividad de RE, se han descrito otras funciones, tales como supervivencia celular HER2-inducida y la expresión de la molécula de adhesión de célula a célula, E-cadherina, con la consecuente disminución de la capacidad migratoria de estas células, lo que sugiere que FOXA1 puede promover su diferenciación y actúa como un factor de protección frente al cáncer de mama. En el cáncer de mama la expresión FOXA1 se asocia con un grado histológico bajo, menor recuento mitótico, menor tamaño tumoral (289) y expresión positiva de receptores hormonales (RE, RPG y RA), y otros marcadores luminales que sugieren su asociación con el bajo grado nuclear. La sobreexpresión de FOXA1, se ha relacionado con un buen pronóstico, mayor supervivencia y mayor período libre de enfermedad, y menor frecuencia de metástasis a distancia (277). 68 La expresión de FOXA1 puede ser un marcador útil para el cáncer de mama RE positivo/HER2-negativo en la identificación de los pacientes con buen pronóstico que no requieren tratamiento neoadyuvante (292). Por lo tanto, es un biomarcador necesario para ayudar a identificar a los pacientes con cáncer de mama RE-positivo / HER2- negativos que hacen necesario la neoadyuvancia (292). Además de en el cáncer de mama, la expresión de FOXA1 ha sido estudiada en varios cánceres humanos, donde se ha confirmado una función estimuladora o supresora en función del tipo y la localización (275). El gen FOXA1 se amplifica en carcinomas anaplásico de tiroides, y en un subconjunto de tipos de cáncer de esófago y pulmón. La valoración de la expresión de FOXA1 en inmunohistoquímica se basa en la cuantificación de dos parámetros. Porcentaje de células neoplásicas teñidas; observándose una tinción nuclear de las células neoplásicas, sin evidencias de tinción de membrana o citoplasmática, y detectándose expresión en las células neoplásicas y también en algunas células ductales epiteliales de tejido mamario normal. Este porcentaje es representado por una variable numérica comprendida entre 0-10, en función del porcentaje de expresión de las células tumorales. El segundo parámetro estudiado es la intensidad, confiriéndole a ésta valores entre 0, 1, 2 o 3, según ausencia de tinción, débil, moderada o intensa. Posteriormente ambos valores numéricos se multiplican dando como producto final un valor comprendido entre 0-30. Se considerará expresión baja los valores entre 0-3; y alta los comprendidos entre 4- 30 (293). Los valores superiores a 3 se relacionan directamente con un mejor pronóstico y mayor supervivencia (Figura 28). Fig. 28 69 Resumiendo, diversos estudios han confirmado cómo la expresión positiva de FOXA1 se asocia con receptores de hormonas esteroides (ERA, RPG y RA), buen pronóstico, menor tamaño tumoral, menor grado histológico, citoqueratinas luminales (CK18 y CK7 / 8), BRCA1 y E-cadherina. Su expresión mostró una relación inversa con citoqueratinas basales (CK14 y CK5 / 6) y P-cadherina; así como una correlación inversa con el grado nuclear y el índice de Ki67 (292). Se encontró asociación entre la expresión elevada de FOXA y una mejor supervivencia (277). La expresión de FOXA1 puede disminuir a medida que el cáncer progresa. Por lo tanto, los esfuerzos futuros deben centrarse en las pruebas que confirmen si la ausencia de expresión de FOXA1 en el cáncer es indicativa del tipo de origen y/o de un aumento progresivo de la actividad (294). 70 1.13.HER2 71 El HER2 es una proteína transmembrana de la familia de los receptores de crecimiento epidérmico epitelial, con actividad tirosín quinasa y favorece el desarrollo celular en una gran variedad de lesiones neoplásicas. Histológicamente, los tumores que expresan HER2 son tumores de grado nuclear alto, poco diferenciados (295). Esta proteína se expresa aproximadamente en el 30% de los carcinomas de la glándula mamaria, y en concreto, en el 15-25% de los carcinomas invasivos de mama, asociando su sobreexpresión con un peor pronóstico (296-299). Es considerado un marcador predictivo de la respuesta a la terapia endocrina (300,301); no observándose diferencias de beneficio entre el tamoxifeno y los inhibidores de aromatasa (302-304), que son ambos el tratamiento empleado en la actualidad. El HER2, junto con otros biomarcadores como los receptores de estrógeno y progesterona, y el Ki67; forman parte de un perfil inmunohistoquímico que mide la sobreexpresión de la proteína HER2 (305). Diversos estudios han confirmado la consideración de la amplificación de HER2 como un factor predictivo de la respuesta ante diversos fármacos citotóxicos, incluidos la antraciclina y el paclitaxel (296,306); éste último se ha relacionado concretamente con la respuesta y el efecto en pacientes con enfermedad metastásica (307). Por lo que se obtiene la idea principal de que el HER2, localizado en el cromosoma 17; puede ser un importante regulador de la capacidad de respuesta al tratamiento con antraciclina (296). La amplificación del gen HER2 se ha identificado como indicador pronóstico del cáncer de mama, de tal modo que su sobreexpresión se relaciona con mayor riesgo de recidiva y una menor supervivencia global (302) (Figura 29). La amplificación del Gen HER2 y la sobreexpresión de la proteína HER2 se encuentran intensamente relacionadas (308). Fig. 29 72 De igual modo, Farzand et al. (309) realizaron un estudio de 50 adenocarcinomas de distintas localizaciones del sistema digestivo, y obtuvieron como resultado una sobreexpresión de la proteína HER2 en 33 (66%) de los pacientes estudiados (P = 0,000); siendo éstos en su mayoría carcinomas gástricos y de colon. Se identifica la amplificación de HER2 como indicador pronóstico del cáncer gástrico y se describe una asociación entre un mayor grado de agresividad biológica del tumor y la sobreexpresión de la proteína HER2 (309). El desarrollo del anticuerpo monoclonal trastuzumab, conocido como Herceptin, actúa específicamente sobre el HER2. El estado de HER2 se evalúa actualmente en la mayoría de los casos inicialmente por inmunohistoquímica presentando una característica tinción de membrana (Figura 30). En los casos no concluyentes, los niveles de expresión de proteínas HER2, y el número de copia del gen es calculado a través de técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH) o hibridación in situ cromatina (CISH) (310). Tanto FISH como CISH presentan resultados concordantes en tumores con alta amplificación de HER2 (Figura 31); mientras que los casos con amplificación baja producen resultados discordantes y confusos (296). Actualmente, los parámetros y la metodología óptima para la evaluación de HER2 no se encuentran bien definidos (299). Fig. 30 Fig. 31 73 En el estudio Inmunohistoquímico se interpretan dos parámetros: el porcentaje de componente tumoral teñido y la intensidad de la tinción (mediante el uso de variables numérica, de 0 a 3). Ambos parámetros permiten obtener tres posibles resultados: negativo, indeterminado (no concluyente) y positivo (300,305). En el año 2013 se realizó una revisión y actualización en el protocolo y normas de evaluación de los resultados con respecto a las normas de la guía original que se estableció en el año 2007. El CAP ha modificado su programa de acreditación y ha incluido una evaluación más rigurosa y estricta de las pruebas de HER2. La causa principal de esta actualización ha sido la preocupación general que existía acerca de un porcentaje importante de pacientes con cáncer de mama con resultados de HER2 falsos positivos o negativos, y que según diversos estudios, son sobre o infratratados con terapias HER2; así como debido al vacío importante en la literatura en relación a los pacientes con resultados de la prueba HER2 2+ (equívoco). Esta revisión ha sido destinada a mitigar los falsos negativos y positivos, particularmente en relación con los problemas de fijación de la muestra e interpretación de resultados. Según la guía original del año 2007, el resultado HER2 positivo 3+ era otorgado sólo a aquellos casos con una tinción muy intensa de membrana expresada en más del 30% del componente tumoral infiltrante. En la revisión realizada en el año 2013, el resultado HER2 positivo 3+ se aplica a los casos que expresen tinción de membrana completa intensa y difusa en más del 10% de las células tumorales (311). La tinción de membrana completa intensa en menos del 10% de las células tumorales infiltrantes, o incompleta débil o moderada, en más del 10%, se le adjudicará resultado inmunohistoquímico HER2 2+, considerado Equívoco o indeterminado. Esta situación se resuelve mediante la técnica de hibridación in situ (HIS) de DUAL-SISH que relaciona el número de copias de HER2 que se encuentran amplificados en el cromosoma 17. La amplificación mediante HIS utilizando una sonda de doble señal (gen HER2 y cromosoma 17) está definida en primer lugar por el cociente HER2/CEP17 y, en segundo lugar por el número medio de copias de HER2 en el corte. 80 P53 es una proteína supresora de tumores codificada por el gen TP53. En situaciones de normalidad funciona como regulador de la actividad divisional, lo que le confiere el nombre de "el guardián del genoma" por su importante papel en la conservación de la estabilidad, mediante la prevención de las mutaciones del genoma. Aunque fue identificado en 1979 por científicos de la Universidad de Princeton (Instituto del Cáncer de Nueva Jersey), su función como gen supresor de tumor no fue demostrado hasta 1989 por Bert Vogelstein. El gen TP53 se localiza en el brazo corto del cromosoma 17 (17p13.1) y la estructura de la proteína codificada difiere de vertebrados a invertebrados. En el ser humano contiene cinco regiones con alto grado de conservación en los vertebrados, particularmente los exones 2, 5, 6, 7 y 8. La proteína P53 consta de 393 aminoácidos y siete dominios: Un dominio de activación, que se fija a factores de transcripción. Dos dominios complementarios de activación transcripcional, involucrados en la regulación de varios genes pro-apoptóticos. Un dominio de activación 2, seguido de otro de actividad apoptótica de p53, señalización nuclear y homo-oligomerización de dominio (OD) y, por último, un dominio central, implicado en la regulación negativa de unión al ADN. Las mutaciones que desactivan P53 en el cáncer pueden afectar a cualquiera de los dominios, siendo las más frecuentes las que afectan al dominio DBD, que impide la activación transcripcional y las mutaciones en otros dominios como OD. Además de la función reguladora del crecimiento, la P53 desempeña un papel importante en el desarrollo de la apoptosis, la estabilidad genómica, y la inhibición de la angiogénesis. Entre sus funciones destacamos: Activación de las proteínas de reparación del ADN cuando éste ha sufrido daños; inducción a la detención del ciclo celular en el punto de regulación G1 / S ante el reconocimiento de ADN dañado, permitiendo su reparación e impidiendo proliferación de células con ADN aberrante; e inducción de la apoptosis, ante daño irreparable de ADN. En la célula normal, la proteína P53 se inactiva por su regulador negativo, MDM2 (también llamada HDM2 en los seres humanos), que es, en sí mismo, un producto inducido por la propia P53. El regulador se une a ésta, impidiendo su acción y 81 transportándola desde el núcleo al citosol. MDM2 también actúa como ubiquitina ligasa y une covalentemente ubiquitina a P53. Ante un daño en el ADN u otros factores de estrés (UV, IR, agentes químicos, estrés oxidativo y choque osmótico entre otros), diversas vías conducen a la disociación del complejo de P53 y MDM2, liberando así a la P53 de su regulador negativo, y adquiriendo esta proteína un estado de activación, donde se produce un incremento de la vida media de la proteína p53, y un cambio conformacional de la misma, que inhibe su actividad quinasa y produce la fosforilación de su dominio N-terminal, alterando su capacidad de regulación de la transcripción en estas células. Una vez activada, la P53 pone en marcha los diversos mecanismos, induciendo la detención del ciclo celular (mediante la formación del complejo WAF1/CIP1-CDK2 a través de la proteína p21, que le impide continuar a la siguiente etapa de la división celular) y permitir, así, la reparación y supervivencia de la célula o la inducción de la apoptosis si la célula está dañada. Ante una mutación de la P53, la MDM2 no actúa y se produce su acumulación en el núcleo. La P53 alterada pierde su capacidad de unión al ADN y no se lleva a cabo la transcripción de la proteína P21, perdiéndose la "señal de parada" para la división celular, con un resultado de superproducción de células con ADN dañado. Estudios recientes relacionan la P53 y la proteína RB, como importantes proteínas cuyas vías de activación a través de ARF presentan una gran importancia en el control del ciclo celular. Ante la herencia de un gen TP53 dañado, se reduce el control de la división celular y se facilita el desarrollo de tumores en la edad adulta temprana, dando lugar a la enfermedad conocida como el síndrome de Li-Fraumeni. En contraste, el aumento de activación de P53, lejos de presentar efectos beneficiosos, se ha relacionado con un envejecimiento prematuro. Algunos estudios han demostrado que la expresión de RE, RP, HER2, Ki67 y P53 se correlacionan con el grado del tumor, en lugar de con la invasión (322,323). 82 Así pues, estudios que compararon los resultados inmunohistoquímicos en una serie de carcinomas in situ y en carcinomas infiltrante de mama de tipo no especial, encontraron una sobreexpresión de P53 en carcinomas infiltrantes de alto grado, relacionándolo con los subtipos moleculares HER2 y triple negativos (305); así como una disminución de su expresión o resultado negativo en carcinomas in situ, o en carcinomas infiltrantes de bajo grado, y los tipos Luminal A y Luminal B. La expresión inmunohistoquímica de P53 en una extensión superior al 10% de las células tumorales se considera un signo de inactivación funcional (305). Estos niveles son superiores con mayor frecuencia en carcinomas infiltrantes de mama, en relación a los carcinomas in situ y en tumores de alto grado, frente a tumores de bajo grado con independencia de que sean in situ o infiltrantes (305). Estos hallazgos obtenidos en diversos estudios, consolidan la posición de la P53, como uno de los componentes del panel de inmunohistoquímica básico en el cáncer de mama y, junto con el RE y el HER2, constituyen factores pronósticos importantes de esta enfermedad (305). 83 1.16.Receptor de Estrógenos 84 El receptor de estrógeno (RE) pertenece a un grupo de receptores celulares que son activados por la hormona 17β-estradiol. Se han descrito dos tipos de receptores de estrógeno: RE nuclear y el RE acoplado a proteínas G GPR30 (GPER). El tipo de RE que vamos a considerar en este proyecto es el nuclear, cuya principal función es la de actuar como factor de transcripción de determinados genes. Dentro de esta familia de RE nucleares, se distinguen dos tipos: α y β, ambos codificados por genes diferentes e independientes (ESR1 y ESR2), situados en el cromosoma 6 (6q25.1) y en el cromosoma 14 (14q), respectivamente. Los receptores de estrógeno α y β presentan una secuencia similar y contienen cada uno siete dominios (324). Ambos tipos de receptores, alfa y beta, se expresan en una amplia variedad de tejidos. El receptor REα está presente principalmente en endometrio, tejido mamario, células del estroma ovárico e hipotálamo, y el REβ mayoritariamente en los riñones, cerebro, hueso, corazón, pulmones, mucosa intestinal, próstata y células del endotelio. Los RE, en ausencia de ligando, se localizan en el citoplasma, pero estudios recientes han identificado también una fracción nuclear. La unión de la hormona al receptor pone en funcionamiento una secuencia de movimientos, que tienen como resultado final la migración del complejo desde el citoplasma al núcleo, la dimerización del receptor y la unión de éste a unas secuencias específicas de ADN conocidas como elementos de respuesta a hormonas. El complejo receptor/ADN recluta otras proteínas implicadas en la transcripción de los genes diana, expresando así determinadas proteínas que darán lugar a variaciones en la función celular. Los receptores de estrógeno también tienen un dominio de unión a ADN y pueden actuar como factores de transcripción para regular la producción de proteínas. Algunos de estos receptores pueden asociarse con otros (receptores tirosín quinasa y no tirosín quinasa) y formar complejos, como por ejemplo EGFR e IGF-1 y Src. A través de los receptores tirosina quinasa, las señales se transmiten al núcleo por la vía de las MAPK y la vía PI3K/AKT. 85 Los RE se sobreexpresan en el 70% de los casos de cáncer de mama. Estos tumores se conocen bajo el nombre de tumores "RE positivos". Se han propuesto dos mecanismos para explicar la relación entre expresión de RE y tumorigénesis. Por un lado, la unión de estrógeno a su receptor induce la proliferación de las células de las glándulas mamarias a través del estímulo de la división celular, con replicación del ADN y el consiguiente riesgo de sufrir mutaciones. Por otro, el metabolismo del estrógeno produce residuos genotóxicos, que se depositan y acumulan, induciendo a un estrés celular, que al superar la capacidad autoconservadora de la célula, acaba originando células neoplásicas. El resultado de ambos procesos es el bloqueo de la apoptosis y de la reparación del ADN, con la consecuente posibilidad del inicio de formación de un tumor. Respecto al tratamiento, la terapia endocrina requiere el uso de moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs), que se comportan como antagonistas de los RE en el tejido mamario, o bien inhibidores de aromatasa. El estatus de RE se utiliza para determinar la sensibilidad del cáncer de mama al Tamoxifeno y a los inhibidores de aromatasa (IA). Los estrógenos y sus receptores también se encuentran implicados en cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata y cáncer de endometrio. En la actualidad se emplea la inmunohistoquímica para la detección de receptores nucleares de hormonas. Su expresión guarda relación con una mejor evolución, además de ser considerado como indicador importante de respuesta al tratamiento hormonal. Desde hace mucho tiempo, se sabe que el cáncer de mama es una enfermedad heterogénea. La mayoría de los carcinomas son positivos para receptores de estrógenos (RE) y su firma genética está representada por expresión de genes relacionadas con los estrógenos (Tipo Luminal A y B). La mayoría de los tumores negativos para RE pertenecen a un grupo definido, conocido como tipo basal (Figura 32). 86 Los carcinomas de mama RE positivos y RE negativos presentan diferencias notables, respecto a sus características clínicas y anatomopatológicas, que influyen en la respuesta al tratamiento y en su evolución. Los cánceres RE positivos responden mejor a la terapia endocrina y peor al tratamiento con quimioterapia. Por el contrario, los RE negativos tienen una probabilidad inferior al 10% de responder al tratamiento hormonal, pero, en cambio, presentan una respuesta mejor a la quimioterapia. La incidencia de cáncer invasivo RE positivo ha disminuido en los últimos años, por razones multifactoriales, entre las que destaca la disminución en el uso de tratamiento hormonal sustitutivo postmenopáusico (325), ya que se considera que éstos estimulan el crecimiento de los carcinomas RE positivos. Diversos estudios han confirmado una disminución de la tasa de mortalidad en pacientes con cáncer de mama RE-positivos tratados con tratamiento endocrino y una ausencia total de beneficios en los casos RE-negativos tratados con Tamoxifeno durante Fig. 32 87 5 años (326). El beneficio aportado es mayor en aquellos tumores con niveles de expresión cuantitativamente mayores (302, 326, 327). En relación a una posible diferencia en cuanto al tipo de tratamiento endocrino (inhibidores de aromatasa vs. tamoxifeno) en tumores RE+, no han mostrado diferencias significativas (303,328). Los RE también se han relacionado con la predicción de la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante. Múltiples estudios clínicos han demostrado que pacientes con tumores RE-negativos, tratados con quimioterapia, presentan mayor probabilidad de alcanzar una respuesta completa, que otros que presentan tumores RE-positivos. De manera que relacionamos RE-positivos con una mejor respuesta al tratamiento hormonal, y RE-negativo, con una respuesta más efectiva al tratamiento quimioterápico (329). Una posible explicación a estas observaciones radica en el hecho de que la expresión elevada de RE se relaciona con la amplificación del gen ESR1 (330). No obstante, en el 3% de los carcinomas invasivos existe amplificación del gen en ausencia de sobreexpresión normal (331, 332). La guía de la Sociedad Americana de Clínica Oncológica (ASCO) para el tratado del cáncer de mama, recomienda solicitar y valorar el resultado de RE en todos los casos de cáncer de mama en el momento del diagnóstico, así como en cualquier recidiva local o a distancia (302,305). 88 1.17.Receptor de Progesterona 89 El receptor de progesterona (RP) también conocido como NR3C3 (receptor nuclear subfamilia 3, grupo C, miembro 3), es un tipo de receptor esteroideo caracterizado por unirse específicamente a la progesterona. En los seres humanos, el RP es codificado por el gen PGR, que se localiza en el cromosoma 11q22. Los antagonistas del RP actúan como antiprogestágenos y su principal representante es la mifepristona. La progesterona participa en la regulación de diversos procesos fisiológicos en los mamíferos y su respuesta biológica está mediada por dos isoformas, denominadas RP-A y RP-B. Ambas están codificadas por el mismo gen, pero reguladas por distintos promotores y bajo la acción de los estrógenos. La diferencia entre ambos tipos de receptores descansa en la secuencia de aminoácidos. La RP-B contiene un tramo de 164 aminoácidos en región amino-terminal que no está presente en RP-A. RP-B actúa como fuerte activador transcripcional en diferentes contextos celulares mientras que RP-A funciona como inhibidor (333). Diversos estudios han demostrado que los carcinomas de mama RE positivos y RP positivos, tienen mejor pronóstico y mejor respuesta al tratamiento hormonal, existiendo una correlación inversamente proporcional entre expresión de RE y RP y el grado histológico tumoral (305). Además del papel pronóstico y predictivo de los RP en el cáncer de mama, los RP son uno de los biomarcadores que, junto a otros como RE, HER2, y Ki67, conforman el perfil inmunohistoquímico que permite la subtipificación de las variantes moleculares del carcinoma de mama invasivo (302,305). La expresión del gen PGR es dependiente, y se encuentra estrechamente relacionado con la presencia del receptor de estrógenos. La mayoría de los carcinomas RP positivos, son RE positivos, siendo muy raros (< 1%) aquellos en que existe expresión de RP en ausencia de RE (303). Por lo que, se aconseja repetir la prueba inmunohistoquímica para los receptores de estrógeno si esto sucede, ya que los tumores RP+/RE- tienen una respuesta más limitada al Tamoxifeno, que los tumores RP+/RE+. No obstante, la terapia hormonal sigue siendo la mejor opción en tumores RP+/RE- (334). 96 Durante el proceso de desarrollo de un tumor, las células cancerosas pueden perder la capacidad de autodestruirse de forma programada debido a la pérdida alélica de los activadores de muerte celular, dando lugar a un cúmulo de células con ADN aberrante. Esta pérdida de la capacidad de apoptosis es llevada a cabo por un grupo de proteínas conocidas como inhibidores de la apoptosis. Aunque la proteína Bcl-2 fue la primera que se describió con capacidad para prolongar la supervivencia, mediante el bloqueo de la apoptosis (356), posteriormente se han descrito otras. Entre ellas, destaca especialmente la survivina (357), una proteína de 16,5 KDa, también conocida como AP14, o BIRC5 (356), que es codificada por un gen localizado en el cromosoma 17q25. Su estructura consta de un dominio inhibidor de baculovirus (BIR) de repetición, el cual lo clasifica como miembro de la familia de los inhibidores de apoptosis (IAP). A través de este dominio desempeña la característica función de inhibir la apoptosis interfiriendo con la función de las caspasas (357) mediante la interacción previa con cdk4 y p21 (358), que conduce a la inhibición de la caspasa 3, la caspasa 7 (359) y la caspasa 9 (360). Otra de sus funciones se basa en la regulación del ciclo celular mediante la asociación con los microtúbulos del huso mitótico. La transcripción de survivina se incrementa durante la fase G1 y alcanza un máximo en la fase G2-M (361); de manera que influye en la viabilidad y división celular (358). Así pues, las principales funciones de la survivina son la regulación de la división celular (Figura 36) y la inhibición de la apoptosis (Figura 37) (361). Fig. 36 Fig. 37 97 A diferencia de bcl-2 y otras proteínas inhibidoras de la apoptosis (356), la survivina es indetectable en los tejidos adultos maduros y bien diferenciados en condiciones de normalidad, excepto en placenta, timo y endometrio. En cambio, se expresa en células del cáncer de pulmón, colon, páncreas, próstata y mama, así como también, en linfomas de Hodgkin de alto grado. De manera que encontramos expresión de survivina en tejidos neoplásicos entre el 30% y el 100% de los casos registrados (357), destacando su expresión en prácticamente la totalidad de las células tumorales. A pesar de su papel en la apoptosis y división celular, no se ha demostrado una relación estadísticamente significativa entre expresión de survivina y mayor índice mitótico en el tejido neoplásico (357). De esta manera, la survivina impide la muerte de las células tumorales, y promueve su proliferación descontrolada. Este importante papel ha sido estudiado en diversas neoplasias, siendo muy escasas las publicaciones sobre el cáncer de mama (358). La expresión de la survivina se evalúa mediante estudio inmunohistoquímico y se basa en la valoración de la tinción nuclear y citoplasmática. Aunque un método de valoración de su expresión se ha realizado de muy diversas formas, la más utilizada es la valoración individualizada de la intensidad de tinción y del porcentaje del tejido tumoral teñido, para su posterior multiplicación y obtención de un resultado final numérico (357). La intensidad de la tinción se gradúa en débil (1+), moderada (2+) e intensa (3+); y el porcentaje de tejido teñido en 5 tramos: < del 5% (0), 5-20% (1), 21-50% (2), 51-75% (3), >75% (4). Los casos con puntación <1 se consideran negativos, mientras que los > o = 1 son positivos (357). 98 A su vez, la expresión de la survivina se estratifica en grado I, grado II y grado III (Figura 38). Diversos estudios han señalado que la tinción inmunohistoquímica puede encontrarse en el núcleo o en el citoplasma y que sólo la presente en el citoplasma está fosforilada y representa la forma activa. De manera que la survivina nuclear y la ausencia de fosforilación hacen posible la inducción de la apoptosis, revelando esta tinción un mejor pronóstico que la tinción citoplasmática (356-358). Estudios recientes han revelado baja expresión de survivina en los tumores de mama con fenotipo luminal, y alta, en fenotipos basal-like (357), sobreexpresión de EGFR (362) y estrés celular (363). La expresión de survivina aporta información pronóstica útil al relacionarse con menor supervivencia, mayor aceleración y progresión de la enfermedad, menor tiempo de recurrencia y reducción del tiempo libre de enfermedad, tanto en pacientes con cáncer de mama, como con otras neoplasias, especialmente en carcinoma colorrectal, gástrico y en el neuroblastoma (357). Por último, destacar el importante papel de la survivina en el tratamiento de ciertos tumores, debido a su función en la supervivencia de las células cancerosas. La expresión de survivina se relaciona con mayor resistencia y menor efecto al tratamiento con radiación y quimioterapia. El conocimiento del nivel de expresión permite seleccionar el tratamiento más adecuado en tumores agresivos (357). Fig. 38 99 Los últimos estudios mencionan a la molécula YM155 como principal fármacos diana molecular en la actualidad, que bloquea la función de la survivina (364); demostrando que la survivina es un objetivo universal en las redes intrínsecas de búsqueda de supresión tumoral (365). 100 1.20.TOPO-2alfa 101 La topoisomerasa 2 alfa (TOP2A) es una enzima nuclear codificada por el gen TOP2A. Esta enzima controla los estados topológicos del ADN durante la transcripción genética y está implicada en procesos tales como la condensación del cromosoma, la separación de las cromátidas y la liberación de la tensión de torsión durante el proceso de transcripción, proliferación celular y replicación del ADN. Se han descrito dos formas de topoisomerasa, la alfa, codificada por el gen TOP2A, ubicada en el cromosoma 17 (17q12-17q21) y la forma beta, localizada en el cromosoma 3 (299). La expresión de la proteína topoisomerasa IIa varía en las distintas etapas del ciclo celular, existiendo picos en la fase G2 y M, y reducción al mínimo al final de la fase M (299). La proteína actúa como una enzima que repara las alteraciones durante los diversos procesos del metabolismo del ADN, incluyendo la transcripción, recombinación, replicación y segregación cromosómica durante la división celular. El análisis inmunohistoquímico define como positiva aquella situación en la que existe expresión en > 5% de las células tumorales (Figura 39). Esta expresión proteica se correlaciona con la amplificación del gen TOP2A, que se puede demostrar mediante las técnicas de FISH y CISH (299). Estudios recientes en cáncer de mama han demostrado que la sobreactividad puede bloquearse mediante el uso de inhibidores de la TOP2A, como la doxorrubicina. Este hecho convierte a este gen y a su proteína en dianas específicas para el tratamiento del cáncer de mama localmente avanzado. El gen TOP2A se encuentra a una distancia telomérica de 700 kb del gen HER2 y, en un determinado número de casos, la amplificación de HER2 arrastra por contigüidad al gen TOP2A, con una consecuente co-amplificación de ambos genes. Fig. 39 102 Estos casos de co-amplificación HER2-TOP2A tienen especial interés terapéutico para el uso de antraciclinas y otros agentes quimioterapéuticos (296, 306, 366). Aunque la co-amplificación HER2-TOP2A se observa en el 30% - 40% de tumores con amplificación del gen HER2, la delección de TOP2A también se presenta con frecuencia (367). Niveles elevados de TOP2A se asocian a peor pronóstico, menor tasa de supervivencia, y menor tiempo libre de enfermedad (Figura 40) (368), pero también a una mejor respuesta a las antraciclinas. Por lo que la amplificación del gen TOP2A se considera un marcador predictivo de respuesta a antraciclinas (369-371). Se distinguen dos parámetros diferentes de TOP2A: la amplificación del gen, y la expresión de ARNm. Ambos parecen tener un claro impacto sobre el resultado de cáncer de mama de los pacientes tratados con tratamiento adyuvante. Existen estudios que sugieren que la sobreexpresión de la proteína Topoisomerasa II alfa, en lugar de la amplificación del gen TOP2A, es el principal indicador predictivo y pronóstico de la respuesta del paciente ante tratamiento adyuvante con antraciclina (296). La expresión ARNm de TOP2A y la expresión de proteínas TOP2A se encuentran intensamente relacionados entre sí, pero no muestran relación con el estado del gen TOP2A. Fig. 40 103 Esta falta de asociación entre el gen TOP2A y los productos génicos de TOP2A (ARN y proteínas) se ha confirmado en varios estudios (372). Una posible explicación a este dato se basa en la mayor demanda de proteína TOP2A durante la replicación del ADN, con respecto al número de copias del gen necesarias, por lo tanto, el gen correspondiente se transcribe de forma independiente al número de copias o de oncogenes activados existentes (373,374). La amplificación de TOP2A se ha señalado exclusivamente en aquellos carcinomas de mama con amplificación de HER2, de tal modo que no hay casos de amplificación de TOP2A en ausencia de amplificación de HER2. Como se ha mencionado anteriormente, la delección de TOP2A es otra alteración cromosómica que puede asociarse a amplificación de HER2. Este hallazgo se observa en el 11% de los tumores HER2-amplificados (299). Pero hasta la fecha se desconoce su significado y su mecanismo de producción. Es importante tener en consideración los siguientes puntos, ratificados en diversos estudios: 1. La amplificación de TOP2A se produce exclusivamente en presencia de la amplificación de HER2 y se lleva a cabo mediante un proceso de repetición de rotura-fusión-puente (299). 2. La amplificación del gen TOP2A se asocia a una sobreexpresión de la proteína TOP2A con una frecuencia > 70% en los tumores de mama (296). 3. Los casos en los que la amplificación del gen no se acompaña de sobreexpresión de la proteína, (tinción inmunohistoquímica negativa), pueden explicarse como consecuencia de la pérdida de la antigenicidad durante el procesamiento de tejido. Otra posible razón de esta disparidad puede deberse a que la expresión de TOP2A está vinculada al ciclo celular y como tal, a la tasa de proliferación celular; parámetro independiente al número de copias oncogénicas. La topoisomerasa II alfa se considera, además de factor pronóstico y predictivo de respuesta a tratamiento adyuvante, un marcador de proliferación celular (299). 104 1.21.Perfiles Moleculares 105 Actualmente, y a pesar de los grandes avances y estudios centrados en la búsqueda de la erradicación del cáncer de mama, éste continúa siendo la segunda causa de muerte por cáncer en la población femenina. El proceso de desarrollo tumoral comienza en la base del tumor primario y termina en la localización del tumor secundario. En el cáncer de mama, el riesgo de metástasis puede predecirse en base a la expresión global de genes del tumor primario, lo cual cuestiona la hipótesis que defiende que el carácter metastásico es adquirido en fases tardías de la formación del tumor primario (375) (Figura 41). Destacamos sin embargo, diversos estudios que han confirmado la conservación de las firmas moleculares del tumor a lo largo de su vida, incluso tras el desarrollo de metástasis, lo cual relaciona directamente la firma molecular del tumor primario con el tipo de tumor (376,377). Fig. 41 112 Se han definido varios tipos de TMAs según su finalidad: - TMA de prevalencia. Constituido por uno o varios tumores simples, sin aportar previamente información clínica o patológica. Se utiliza para determinar la prevalencia de una determinada alteración en un área concreta en un tumor. - TMA multitumor. Contienen muestras de diferentes tumores, habitualmente orientados al cribado de alteraciones moleculares. - TMA de progresión. Incluyen diferentes estadios evolutivos de un mismo tumor. Son utilizados para determinar la asociación entre el genotipo y el fenotipo de un tumor. - TMA de pronóstico. Valoran de forma rápida tumores de los que se conocen datos clínicos y de evolución. El uso de este tipo de TMA permite establecer asociaciones entre características clínicas y moleculares del tumor. - TMA experimental. Constituido a partir de un TMA simple ya archivado, con el objetivo de evaluar nuevos anticuerpos y buscar patrones genéticos. En la actualidad, el proceso de creación de lo que hoy en día conocemos bajo el nombre de tissue micrroarray (TMA) consiste, en esencia, en obtener cilindros de tejido desde un bloque de parafina que contiene el tejido de interés (bloque donante) e irlos insertando en un bloque de parafina en blanco (bloque receptor), en el que se van abriendo simultáneamente los huecos necesarios. Este proceso se suele realizar utilizando distintos sistemas mecánicos comerciales desarrollados para tal fin, ya sean manuales ó automatizados. Previamente a la extracción del tejido mediante los sistemas de agujas, el patólogo debe seleccionar el área considerada de interés sobre el porta vidrio. Posteriormente, este cristal adecuadamente marcado, se coloca sobre el bloque de parafina que contiene el tejido, permitiendo localizar con precisión el área que debe ser extraída con aguja. Normalmente estos sistemas de TMA constan de un conjunto de agujas (conocidas como punch) de diferentes calibres que pueden ir intercambiándose para tomar tejido del bloque donante y para abrir los nichos en el bloque receptor, e incluyen un sistema 113 micrométrico programable que permite el desplazamiento exacto dentro del bloque receptor para colocar el número de cilindros deseado de manera uniforme y equidistante. El diámetro del cilindro obtenido es un dato crítico y muy importante en la construcción de un TMA. Hay cuatro tamaños de punch empleados para la obtención del cilindro de tejido; 0,6 mm, 1 mm, 1,5 mm y 2 mm. Tras diversos estudios en los últimos años, los investigadores recomiendan emplear un punch de 1 o 1,5 mm; siendo el punch de 0,6 mm reservado para aquellos TMAs constituidos por más de 200 cilindros. No se recomienda usar el punch de 2mm de diámetro. El espacio entre los distintos cilindros es un dato importante que no debe ser ignorado y debe estar en relación con el diámetro de éste, siendo recomendado como ideal o estándar un espacio de 0,3 mm entre cilindros de tejido de 1mm de diámetro. Una vez creado el TMA, la superficie de éste debe ser alisada y seccionada. Este proceso se lleva a cabo sometiendo al TMA a temperaturas de entre 70-80ºC hasta conseguir reblandecimiento de la parafina que une cada cilindro, y permitir así su manipulación. Posteriormente, los TMA son conservados a una temperatura de 37 ºC. La sección de los tissue microarrays se realiza de modo rutinario en un micrótomo, obteniendo cortes de entre 4-5 micras. Los cortes obtenidos se recogen en portas y deben conservarse a -20 ºC, hasta que sean utilizados. Con sistemas de este tipo se pueden construir TMAs de alta densidad que pueden incluir hasta 1200 cilindros en un solo bloque, aunque en la práctica suelen contener entre 100 y 400. Nuestro trabajo presenta un método manual de construcción de TMAs de baja densidad, con el que creamos TMA capaces de contener 39 muestras en un bloque de parafina, del que pueden obtenerse cortes histológicos usando un microtomo convencional. 114 2.Objetivos "No necesito un sueño, tengo un plan" Spike Lee 115 La identificación en el cáncer de mama de distintas alteraciones genéticas y el desarrollo de técnicas de análisis de alto rendimiento ha permitido en la última década la definición de distintos patrones de expresión genómica con valor pronóstico. De ellos, dos, son los más conocidos, y han dado lugar a firmas génicas comercializadas como Mammaprint (383) y Oncotype (327). No obstante, el alto coste de dichas determinaciones y la infraestructura que requiere su realización son factores que limitan de forma importante su incorporación a la práctica clínica rutinaria. Aunque recientemente se ha comenzado a utilizar tejido fijado en formol e incluido en parafina, con frecuencia, este tipo de técnicas requiere del empleo de tejido en congelación, muestra que en lesiones pequeñas no es posible obtener, ya que comprometería el diagnóstico en tumores de pequeño tamaño. Teniendo en cuenta que en la actualidad es posible estudiar mediante técnicas de inmunohistoquímica el producto proteico postranscripcional de muchos de los genes implicados en el desarrollo y progresión tumoral, es posible definir una “firma inmunohistoquímica” que tuviese valor pronóstico en el cáncer de mama. Trasladar a la práctica clínica la aplicación de dicho perfil sería más fácil, teniendo en cuenta el menor coste que supondría y la mayor accesibilidad a este tipo de técnicas, que se encuentran en cualquier laboratorio convencional de Anatomía Patológica. Existen algunas descripciones de perfiles inmunohistoquímicos en la literatura, la mayor parte de ellos sustentados sobre inmunohistoquímica cuantitativa (388-390), y que han demostrado valor predictivo en distintas subpoblaciones de cáncer de mama. El objetivo principal de nuestro trabajo es intentar definir un perfil inmunohistoquímico que muestre valor predictivo en pacientes con cáncer de mama. Para ello estudiamos la expresión inmunohistoquímica de diferentes marcadores, que correspondan a proteínas producto de genes implicados en proliferación (Ki67, p53, survivina, CDK2, TOP2A), crecimiento tumoral (HER2, c-Kit), invasión y metástasis (TWIST, E-cadherina, RKIP, fascina, caveolina, CD10), marcadores de stem cells (CD44, CXCR4), factores predictivos de respuesta (ABCG2) y de subtipo tumoral (RE, RP, CK5-6, FOXA1). Esta selección de anticuerpos se ha realizado de acuerdo a su función y disponibilidad. 116 3.Material y Métodos “No. No lo intentes. Hazlo o no lo hagas, pero no lo intentes” El imperio contraataca. Episodio V saga Star Wars 117 3.1. Selección de casos El listado de pacientes se obtuvo del programa Vitropath®, que recoge toda la información generada en el servicio de Anatomía Patológica. A través de un sistema de consultas, se filtran los casos seleccionados y la información obtenida se vierte en una base de datos externa. El listado de pacientes obtenido se anonimizó parcialmente durante la recogida de información, eliminándose del mismo, nombre y apellidos de las pacientes y conservándose inicialmente NUHSA, NHC y número de registro de la prueba (número de biopsia) para comprobar duplicidades de casos o recidivas. De cada caso se obtuvo información relativa a las características del tumor (tamaño, grado histológico, número de ganglios metastáticos y totales obtenidos) y datos relativos a la evolución del paciente (tiempo libre de enfermedad, supervivencia). Esta última información se obtuvo del sistema informático del Hospital. El estudio está diseñado de forma que todos los pacientes incluidos tengan un seguimiento mínimo de 5 años. El tiempo libre de enfermedad (TLE, expresado en meses) se calculó hallando la diferencia entre la fecha de diagnóstico y la fecha del primer evento positivo detectado en la historia clínica (recidiva, metástasis,…). La supervivencia global (expresada en meses) se calculó asimismo hallando la diferencia entre la fecha de éxitus y la fecha de diagnóstico. Se cerró la recogida de datos clínicos y de seguimiento el día 6/VII/2012; por tanto, esta es la fecha final de seguimiento en aquellos casos en los que a dicha fecha no se produjese recidiva o éxitus. En relación a la recidiva, en el caso de que ésta existiese desde que se inició el estudio hasta que se cerró, se indica la fecha de la misma, para poder obtener el TLE (tiempo libre de enfermedad). Si ésta no se hubiera producido, al igual que en el caso del éxitus, se indica la fecha de cierre del estudio. Por último, en aquellos casos en que no se produjo recidiva secundaria a la enfermedad, pero sí éxitus del paciente, la casilla procedió a dejarse en blanco, puesto que consideramos incongruencia estadística, indicar una fecha de recidiva (fecha cierre del estudio) posterior a la del éxitus. 118 Una vez recogida toda la información necesaria, y eliminados los duplicados, se anonimizó totalmente la base de datos, eliminándose de la misma NUHSA y NHC, y sustituyéndose el número de biopsia por un número ordinal correlativo que correspondía a cada caso y que fué el que identificó al mismo durante el resto del estudio. El número inicial de casos fue de 250, y tras elimiación de duplicados y pacientes con tratamiento neoadyuvante previo a la intervención quirúrgica, el número final que conformó el estudio fue de 234. El proyecto del estudio fue aprobado por la comisión de ética del Hospital antes de proceder a su realización. 3.2. Tejido El tejido empleado en el estudio se obtuvo de piezas quirúrgicas fijadas en formol durante 24 horas e incluidas en parafina. Los bloques de tejido se recuperaron del archivo del Servicio de Anatomía Patológica una vez seleccionados los campos de interés y se almacenaron en una habitación a una temperatura aproximada de 20ºC previamente a la construcción de los TMAs. 3.3 Construcción de los TMAs La construcción de los tissue microarrays se realizó usando un método manual, basado en una modificación de un método descrito previamente en la literatura. Para obtener el tejido de los bloques donantes, utilizamos el kit de biopsia de médula ósea (Figura 44), compuesto por un trocar con un diámetro de luz de 2´5 mms y una guía para la recuperación posterior del cilindro del interior del trocar. Fig. 44 119 Para construir el TMA se diseñó una plantilla en papel, de la medida del molde de parafina, que incluía 40 posiciones (cinco columnas de ocho posiciones), cada una de ellas de 2´5 mms de diámetro. Se marcó una posición en la esquina superior izquierda, que se dejaría posteriormente en blanco, a efectos de producir una asimetría en el patrón resultante que nos permitiera la correcta orientación del TMA independientemente de cómo fuese recuperada la sección tisular en la preparación histológica. Cada plantilla en papel es de un solo uso y permite la construcción de un solo bloque conteniendo un TMA. Se colocó una cinta adhesiva de doble cara transparente sobre la superficie de la plantilla (Figura 45.A), y se colocó al fondo de un molde metálico para construir bloques de parafina (Figura 45.B). De este modo, la plantilla quedaba expuesta en el fondo del molde con una superficie de contacto adhesiva. La construcción de cada microarray pasa por una fase previa de selección de tejido, en la que se valoraron los bloques de parafina de cada caso. La selección de los bloques a muestrear dependió de la cantidad de tumor en los mismos. Los casos seleccionados fueron evaluados por los dos patólogos que han intervenido en el estudio. Para la selección de los campos representativos se marcaron sobre cada preparación de hematoxilina-eosina dos áreas representativas de un diámetro de 2´5 mms. La superposición de la preparación al bloque tisular permitió la identificación de las áreas de interés (Figura 45.C). Posteriormente se procedió a la obtención de cilindros mediante el método mencionado (Figura 45.D, E, F). Cada cilindro se colocó, con la ayuda de unas pinzas, en cada una de las posiciones de la plantilla (Figura 45.G) hasta completar la misma, por lo que cada bloque obtenido contenía 39 cilindros de tejido (Figura 45.H). Se marcó con tinta china el cilindro situado en la posición diagonalmente opuesta al hueco en el que no se colocó ningún cilindro, para facilitar la orientación de los casos en situaciones de pérdida de material. Una vez que todos los cilindros fueron adheridos a la plantilla, se rellenó el molde con parafina líquida (Figura 45.I), vertida suavemente para evitar el desplazamiento de los cilindros adheridos. Enfriado el bloque, se extrajo del molde metálico, y se retiró con cuidado la plantilla de papel que ahora quedaba en la superficie del bloque. 120 Posteriormente, se introdujo el bloque en la estufa durante aproximadamente 2 minutos; tras sacarlo, se utilizó un portaobjetos para homogeneizar la superficie del bloque, presionando la misma durante unos segundos, y volviendo a dejar enfriar el bloque. Se diseñó adicionalmente una plantilla para identificar los casos incluidos en cada bloque. De cada caso del estudio se obtuvieron dos muestras, que se colocaron en bloques diferentes, para evitar que un problema técnico en un bloque concreto eliminase casos del estudio. Adicionalmente, cada muestra pareada se colocó en una posición diferente a su homóloga (interior versus exterior del TMA), para evitar que problemas de difusión de los anticuerpos invalidasen casos en la misma zona. Fig. 45 121 Como medida inicial de control de calidad en los TMAs construidos, se tiñeron con hematoxilina-eosina la primera y la última sección de cada bloque para comprobar la presencia de tejido tumoral valorable en todas las posiciones de cada TMA (Figura 46). Las secciones obtenidas entre ambas, sobre las que se realizó el estudio inmunohistoquímico, se conservaron en frío (-20ºC) hasta la realización de dicho estudio. Una vez evaluados los cortes teñidos con hematoxilina-eosina, se comprobó que la mayor parte de los casos contenía tejido tumoral en cantidad suficiente para la evaluación de las técnicas de inmunohistoquímica, contando con dos muestras diferentes para cada caso. En una pequeña proporción de los casos, solo contábamos con tejido tumoral viable en uno de los dos cilindros obtenidos, y en cuatro casos (los casos 70, 120, 194 y 199) no se obtuvo tejido tumoral conservado en ninguno de los dos cilindros muestreados. El reducido número de casos en los que ocurrió esta circunstancia nos permitió recuperar dichos casos para el estudio realizando las técnicas de inmunohistoquímica sobre cortes obtenidos de uno de los bloques originales del caso. 3.4. Inmunohistoquímica El estudio inmunohistoquímico se realizó siguiendo el procedimiento estándar. Para ello se obtuvieron cortes de tejido de 4 micras de espesor de los TMAs que se deparafinaron en xilol, se rehidrataron en alcoholes decrecientes y se colocaron en un baño de buffer Tris. La peroxidasa endógena se bloqueó usando peróxido de hidrógeno al 3%. Después de la incubación con los anticuerpos primarios, los cortes se tiñeron con avidina-biotina para la visualización, contratiñéndose con hematoxilina. Todo este proceso se realizó de forma automatizada mediante el sistema de inmunotinción Ventana® de Roche. Fig. 46 128 Caveolina 1 y CD10: Tinción de membrana. Se valoró la tinción de Caveolina (394) y CD10 (114) en el estroma tumoral. La intensidad se evaluó siguiendo un sistema semicuantitativo, como negativa (0, no tinción), débil (1, tanto tinción difusa de intensidad débil, como tinción fuerte en <30% de las células estromales), o fuerte (2, definida como tinción intensa de más del 30% de las células estromales). Se consideró débil intensidad a aquella tinción que comparativamente con los endotelios, era inferior y fuerte, cuando ésta era similar. Solo se valoró la presencia de tinción de membrana, con o sin tinción citoplásmica. La inmunotinción presente en células endoteliales se usó como control interno de la técnica y no se consideró a efectos de puntuación. La puntuación de mayor valor de las muestras pareadas en los dos TMAs correspondientes fue la puntuación final para cada caso. CD44 Tinción de membrana. La inmunotinción se estratificó en cuatro subgrupos reproducibles (395): Negativo, cuando no existía inmunotinción detectable ó bien había expresión débil en menos del 5% de las células tumorales, 1, cuando la expresión de la tinción en las células neoplásicas comprendían entre el 5-25%, 2, cuando afectaba al 25-75% y 3, cuando era superior al 75%. A efectos estadísticos, todos los casos que expresaron CD44 de + a +++ (con valores numéricos de 1 a 3) fueron considerados positivos. Aquellos casos límite (-/+) se volvieron a revisar en conjunto hasta alcanzar un consenso entre ambos observadores. Los casos con expresión CD44 – se consideraron negativos. 129 CXCR4 La inmunohistoquímica con CXCR4 puede mostrar patrones de tinción citoplásmica o nuclear. Nosotros valoramos ambas expresiones por separado. La inmunotinción citoplásmica para CXCR4 se catalogó en base a la Intensidad y el porcentaje de tinción; confiriendo valor 1: en tinción leve o negativa; 2: en tinción de intensidad y porcentaje medios, mostrando coloración amarillenta; 3: con tinción fuerte y de color marrón. A su vez, el valor 1, se consideró negativo, y los valores 2 y 3, fueron considerados como positivos. Por otra parte, la valoración de la tinción nuclear, se clasificó en 0: expresión baja o tenue; y 1: expresión fuerte de color marrón. Siendo 0: negativo y 1: positivo (4). Receptores de estrógeno y progesterona Tinción nuclear. Se utilizó el sistema de Allred, basado en la estimación de dos parámetros, el porcentaje de células positivas y la intensidad de tinción en la mayoría de las células evaluadas (396). Se suman los dos parámetros y se obtiene una puntuación final con 8 posibles valores. El Porcentaje de tinción se evaluó del siguiente modo: 0: 0% de células tumorales teñidas, 1: tinción < 1%; 2: tinción entre 1-10%; 3: tinción del 11-33%; 4: tinción del 34-66% y 5: tinción en > 67%. En relación con la intensidad, se distinguieron 4 categorías: 0: ausencia de tinción; 1: débil; 2: moderada y 3: fuerte. El puntuación final se obtuvo de la suma de ambos parámetros. Los valores comprendidos entre 0 y 2 se consideraron negativos y entre 3 y 8 como positivos. 130 FOXA1 (HFN3α) Tinción nuclear. Se valoró la inmunotinción en 11 categorías teniendo en cuenta la proporción de células que mostraban positividad nuclear (0: ninguna; 1: ≤10%; 2: 11-20%;… y respectivamente hasta el 100%, por lo que el rango de puntuación se encontraba entre 0 y 10), y la intensidad de la tinción (1, 2 o 3 para tinción débil, moderada o fuerte). La puntuación final se obtuvo multiplicando entre sí ambos parámetros (con un rango entre 0 y 30). Se consideró baja expresión de FOXA1 cuando el resultado se encontraba entre 0 y 3, y alta cuando estaba entre 4 y 30 (285). HER2 Tinción de membrana. La valoración de la expresión de HER2 se realizó de acuerdo a las recomendaciones definidas y actualizadas en el año 2013 por la Sociedad Americana de Oncología Médica (ASCO) (311). Se distinguieron cuatro grupos: 0 (-): no se observa tinción de membrana o ésta es incompleta y apenas perceptible en < o = 10% de las células tumorales; 1(-): se observa tinción de membrana incompleta y apenas perceptible en > 10% de células tumorales; 2 (equívoco): tinción de membrana incompleta débil o moderada en > 10% de las células tumorales o tinción de membrana completa o intensa en < o = 10% de las células tumorales; 3 (+): tinción de membrana completa e intensa en > 10% de las células tumorales. En el resultado final, los grupos 0 y 1 se consideran negativos. El grupo 2 refleja un resultado dudoso o equívoco que implica solicitar una nueva determinación sobre la misma muestra utilizando técnicas de Hibridación in situ (HIS). En nuestro centro se realiza HIS cromogénica con técnicas de plata (S-ISH), que determina la relación de HER2/CEP17, así como el número de copias de HER2 por célula. El grupo 3 se considera positivo. 131 c-Kit (CD117) Tinción citoplásmica y de membrana. El nivel de expresión de c-Kit se evaluó según el siguiente esquema (397): 1+: el citoplasma se tiñó con intensidad débil a moderada en el 10% o más de las células neoplásicas; 2+: tinción citoplásmica intensa con o sin tinción de membrana en más del 10% de las células neoplásicas. Cuando no se observaba tinción o estaba presente en menos del 10%, se asignó una puntuación 0. Las puntuaciones 1+ y 2+ se consideraron positivas, frente a la puntuación 0, negativa. Topoisomerasa IIα Tinción nuclear. Como se ha descrito en la literatura (299), se consideraron positivos aquellos tumores con inmunotinción nuclear moderada o intensa en más del 5% de las células neoplásicas. Ki-67 Tinción nuclear. Se valoró la expresión nuclear de Ki-67, estimando el porcentaje de células positivas, y separando dos grupos, ≤20% frente a >20% de células teñidas (398). p53 Tinción nuclear. La expresión de p53 en más del 10% de las células se consideró sobreexpresión. La inmunotinción se consideró negativa (no expresa) cuando el número de células + era ≤ 10% (305). 132 CDK2 Tinción nuclear. Se evaluó la inmunotinción del CDK2 en función del porcentaje de células con positividad nuclear en cinco categorías: negativa (0-5% de las células neoplásicas), + (5-25%), ++ (26-50%), +++ (51-75%), y ++++ (76-100%) (193). CK 5-6 Tinción de membrana. Para la evaluación de la inmunotinción de CK 5-6, se utilizó un índice que se obtuvo multiplicando la intensidad de tinción (0, no inmunotinción; 1+, tinción débil; 2+ tinción moderada; 3+, tinción fuerte) por la proporción de células neoplásicas teñidas, valoradas entre el 0 y el 100%. Obteniendo un producto comprendido entre 0-300 (227). Los resultados del estudio inmunohistoquímico se fueron anotando en plantillas diseñadas para tal efecto. Se obtuvo un resultado numérico el cual representaba expresión positiva o negativa en base a lo explicado anteriormente de cada molécula concreta. Se obtuvieron dos resultados de cada inmunotinción correspondiente a las dos muestras extraídas de cada caso. Nosotros valoramos la mayor de ellas. 133 3.5. Análisis estadístico Tamaño de muestra Con el objeto de identificar factores pronósticos independientes de supervivencia hasta recidiva o muerte (los dos eventos en estudio) se realizan sendos modelos multivariantes de Regresión de Cox. El tamaño muestral se determina mediante la regla de Freeman 10*(k+1) (399), donde k es el número de potenciales variables pronósticas que hemos estudiado, explicadas anteriormente, resultando necesario para el estudio de cada evento un mínimo de 220 pacientes, 110 con el evento y otros 110 sin él. Análisis estadístico Tras una depuración inicial de los datos se procede a la descripción de los mismos. Las variables cuantitativas se expresan con medias y desviaciones típicas o, en caso de distribuciones asimétricas, con medianas y percentiles P25 y P75, y las variables cualitativas con porcentajes. Este resumen se realiza según los dos eventos del estudio, recidiva y muerte. Para identificar factores pronósticos de supervivencia hasta recidiva o muerte, se realizan sendos modelos multivariantes de Regresión Cox tras análisis univariantes de Cox previos, los cuáles identificarán factores relacionados con supervivencia al 5%. Posteriormente, aquellas variables con significación < 25% (400) se introducen en el modelo multivariante para la selección final. Este análisis se complementa con gráficos de supervivencia mediante el método de Kaplan-Meier para algunos factores cualitativos interesantes en estudio, testándose las diferencias de supervivencia con el test log-rank. El análisis de los datos se realizó con el programa estadístico IBM SPSS 22.0 para Windows. 134 4.Resultados “Siempre se llega a alguna parte si se camina lo bastante” Alicia en el país de las maravillas 135 4.1 Características generales de la muestra: Toda la información detallada aparece recogida en la tabla 1. Los resultados de mayor interés fueron los siguientes: Nº Casos: Nuestro estudio recoge una muestra de 234 pacientes (233 mujeres y un hombre). Edad del diagnóstico: La edad media del paciente en el que se diagnosticó la enfermedad fue de 59,78 años, siendo la máxima 91 años y la mínima 29 años. Recidiva y Mortalidad: De los 234 pacientes que conforman el estudio, se identificaron 42 recidivas (17,95%) y 27 fallecimientos como consecuencia de la enfermedad (11,54%) durante el período de tiempo que duró el estudio. Tamaño tumoral: La medida media recogida en nuestros estudios fue de 2,678 cm, con un rango de tamaño que osciló entre 0,7 cm y 14 cm. Grado de NOTTINGHAM: De las 234 muestras de carcinoma infiltrante de mama de tipo no especial recogidas en nuestro estudio, 54 (23,07%) presentaron un grado 1; 94 (40,17%) grado 2; y 86 (30,75%) grado 3. Estadio Inicial (clasificado según el sistema TNM). Nuestro estudio recogió 57 pacientes con estadio inicial IA (24,36%), 81 IIA (34,62%), 50 IIB (21,37%), 27 IIIA (11,54%), 5 IIIB (2,14%), y 14 IIIC (5,98%). Ganglios positivos: Nuestros resultados reflejaron ganglios metastásicos en 93 pacientes (39,74%), y ganglios negativos para metástasis en 141 de ellos (60, 25%). El número medio de ganglios positivos para metástasis de carcinoma fue de 11,96 ganglios, con un rango entre 0 y 28 ganglios positivos. En función del número de ganglios positivos para metástasis, se clasificaron los pacientes en base al estadio N (según el sistema TNM de estadiaje tumoral). De esta manera se obtuvieron 141 casos no metastásicos catalogados como N0 (60,25%), 55 N1 (23,5%), 24 N2 (10,25%), y 14 N3 (5,98%). Estos datos no aportaron información adicional y no fueron incluidos en la tabla. 136 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 1 0 30/06/1947 56 09/01/2004 02/06/2009 06/07/2012 1,8 2 IA 0 0 2 0 03/11/1918 85 13/01/2004 06/07/2012 06/07/2012 2,2 2 IIA 12 0 3 0 13/10/1930 73 15/01/2004 06/07/2012 06/07/2012 3,5 3 IIA 2 0 4 0 22/04/1923 80 15/01/2004 01/03/2005 06/07/2012 3 3 IIA 5 0 5 0 07/04/1926 77 28/01/2004 11/02/2007 3 3 IIB 12 1 6 0 27/10/1972 31 28/01/2004 06/07/2012 06/07/2012 2 3 IIA 11 0 7 0 01/11/1924 79 02/02/2004 24/01/2005 2 2 IIA 0 0 8 0 21/10/1943 60 04/02/2004 06/07/2012 06/07/2012 2,5 3 IIA 10 0 9 0 02/02/1938 66 05/02/2004 06/07/2012 06/07/2012 1 1 IA 0 0 10 0 02/12/1954 49 24/02/2004 06/07/2012 06/07/2012 2 3 IA 0 0 11 0 31/08/1961 42 25/02/2004 06/07/2012 06/07/2012 2,5 3 IIB 10 2 12 0 06/03/1947 56 27/02/2004 06/07/2012 06/07/2012 1,5 2 IIA 0 0 137 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 13 0 19/05/1944 59 10/03/2004 06/07/2012 06/07/2012 1,8 2 IA 14 0 14 0 06/02/1921 83 22/03/2004 02/03/2007 28/01/2010 3 1 IIA 0 0 15 0 10/06/1928 75 24/03/2004 06/07/2012 06/07/2012 2 1 IA 0 0 16 0 20/01/1942 62 31/03/2004 26/04/2006 27/10/2008 5 3 IIB 15 2 17 0 04/08/1960 43 14/04/2004 06/07/2012 06/07/2012 4 2 IIA 10 0 18 0 01/01/1915 89 15/04/2004 16/09/2007 06/07/2012 3,5 3 IIB 12 1 19 0 01/04/1927 77 21/04/2004 06/07/2012 06/07/2012 2,5 2 IIA 1 0 20 0 25/09/1948 55 22/04/2004 06/07/2012 06/07/2012 1,3 1 IA 0 0 21 0 10/07/1930 73 22/04/2004 06/07/2012 06/07/2012 5 3 IIA 8 0 22 0 27/07/1950 53 23/04/2004 03/11/2005 26/06/2007 6 3 IIIA 23 1 23 0 02/08/1940 63 26/04/2004 06/07/2012 06/07/2012 1,5 2 IA 10 0 24 0 15/02/1965 39 26/04/2004 06/07/2012 06/07/2012 3 3 IIIC 24 22 144 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 97 0 13/08/1946 58 25/05/2005 06/07/2012 06/07/2012 0,9 3 IIA 12 3 98 0 12/09/1943 61 01/06/2005 27/11/2011 06/07/2012 2,8 3 IIB 14 1 99 0 19/06/1946 58 01/06/2005 06/07/2012 06/07/2012 1,2 1 IA 13 0 100 0 08/10/1936 68 09/06/2005 06/07/2012 06/07/2012 1,7 3 IIIA 15 5 101 0 19/12/1961 43 15/06/2005 06/07/2012 06/07/2012 2 2 IIA 15 0 102 0 05/09/1928 76 16/06/2005 02/08/2006 11/09/2008 2,3 2 IIA 0 0 103 0 23/12/1952 52 16/06/2005 06/07/2012 06/07/2012 1 2 IIA 12 1 104 0 08/11/1957 47 29/06/2005 06/07/2012 06/07/2012 2 3 IIA 14 0 105 0 12/04/1932 73 30/06/2005 24/12/2011 2,2 2 IIA 26 0 106 0 23/05/1935 70 30/06/2005 21/10/2008 06/07/2012 2,4 1 IIA 17 0 107 0 13/03/1930 75 30/06/2005 06/07/2012 06/07/2012 1,4 2 IIIA 22 4 108 0 08/12/1946 58 14/07/2005 06/07/2012 06/07/2012 2,2 2 IIA 13 0 145 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 109 0 02/06/1966 39 14/07/2005 06/07/2012 06/07/2012 2,7 3 IIIA 15 5 110 0 24/06/1962 43 14/07/2005 06/07/2012 06/07/2012 3 2 IIIB 16 5 111 0 21/06/1923 82 19/07/2005 06/07/2012 06/07/2012 2,7 3 IIB 16 3 112 0 08/02/1928 77 21/07/2005 06/07/2012 06/07/2012 3,5 2 IIIB 19 8 113 0 30/03/1966 39 12/08/2005 06/07/2012 06/07/2012 3,5 3 IIA 0 0 114 0 02/07/1924 81 29/08/2005 06/07/2012 06/07/2012 11 3 IIB 31 0 115 0 08/08/1930 75 09/09/2005 06/07/2012 06/07/2012 5,5 3 IIB 0 0 116 0 18/09/1959 45 15/09/2005 06/07/2012 06/07/2012 2 2 IA 14 0 117 0 27/09/1931 73 23/09/2005 24/10/2007 06/07/2012 2,4 2 IIA 17 0 118 0 10/08/1971 34 17/10/2005 21/09/2006 08/08/2007 2,7 3 IIIC 17 10 119 0 30/08/1972 33 19/10/2005 06/07/2012 06/07/2012 2,4 3 IIB 31 3 120 0 08/11/1975 29 19/10/2005 06/07/2012 06/07/2012 2,5 3 IIA 16 0 146 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 121 0 13/03/1955 50 20/10/2005 06/07/2012 06/07/2012 3,7 2 IIIA 18 4 122 0 14/07/1924 81 25/10/2005 06/07/2012 06/07/2012 1,9 1 IIA 12 1 123 0 07/09/1946 59 31/10/2005 06/07/2012 06/07/2012 0,8 1 IA 0 0 124 0 08/01/1966 39 09/11/2005 06/07/2012 06/07/2012 2,7 2 IIA 11 0 125 0 16/11/1948 57 23/11/2005 06/07/2012 06/07/2012 3 2 IIB 13 1 126 0 02/03/1930 75 24/11/2005 06/07/2012 06/07/2012 5,5 3 IIB 16 0 127 0 17/10/1948 57 25/11/2005 06/07/2012 06/07/2012 4,5 3 IIB 24 23 128 0 08/09/1945 60 09/12/2005 06/07/2012 06/07/2012 2,2 3 IIA 8 0 129 0 09/09/1959 46 16/12/2005 11/12/2009 06/07/2012 5,2 2 IIIA 11 5 130 0 14/01/1926 79 22/12/2005 06/07/2012 06/07/2012 2,5 2 IIA 20 0 131 0 05/04/1932 73 23/12/2005 06/07/2012 06/07/2012 3 2 IIIB 13 1 132 0 17/01/1969 36 27/12/2005 06/07/2012 06/07/2012 3,3 3 IIB 15 1 147 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 133 0 10/08/1928 77 18/01/2006 06/07/2012 06/07/2012 4 3 IIA 7 0 134 0 19/09/1924 81 18/01/2006 06/07/2012 06/07/2012 4 1 IIB 12 0 135 0 14/03/1962 43 19/01/2006 01/09/2011 06/07/2012 2,5 3 IIA 13 0 136 0 18/08/1948 57 26/01/2006 06/07/2012 06/07/2012 1 3 IA 0 0 137 0 28/11/1914 91 26/01/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,5 2 IIA 0 0 138 0 21/09/1963 42 01/02/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,2 1 IIA 15 0 139 1 18/07/1926 79 16/02/2006 06/07/2012 06/07/2012 2 2 IA 0 0 140 0 28/01/1948 58 01/03/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,2 2 IIA 16 1 141 0 18/12/1947 58 01/03/2006 05/06/2010 5 3 IIIA 15 5 142 0 03/10/1952 53 08/03/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,2 3 IIB 15 2 143 0 04/08/1946 59 13/03/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,7 2 IIB 0 0 144 0 02/05/1940 65 15/03/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,3 1 IA 12 0 148 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 145 0 01/09/1946 59 17/03/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,1 3 IIA 22 0 146 0 02/01/1958 48 29/03/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,5 2 IIA 14 0 147 0 12/07/1919 86 05/04/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,5 1 IA 2 0 148 0 01/09/1922 83 18/04/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,252 2 IIIC 31 28 149 0 23/10/1946 59 20/04/2006 06/07/2012 06/07/2012 5,5 2 IIB 13 0 150 0 24/08/1949 56 03/05/2006 06/07/2012 06/07/2012 5,5 3 IIB 11 0 151 0 15/01/1938 68 10/05/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,7 1 IA 14 0 152 0 22/09/1970 35 11/05/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,2 2 IA 10 0 153 0 29/08/1942 63 16/05/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,9 3 IIIA 18 7 154 0 01/01/1945 61 16/05/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,7 2 IIA 14 1 155 0 29/07/1949 56 24/05/2006 03/05/2012 06/07/2012 3 2 IIIC 0 0 156 0 01/11/1959 46 02/06/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,3 1 IIB 12 2 149 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 157 0 28/08/1963 42 06/06/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,9 1 IA 15 0 158 0 05/06/1943 63 06/06/2006 06/07/2012 06/07/2012 3 3 IIA 20 0 159 0 05/07/1944 61 12/06/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,2 1 IA 15 0 160 0 06/06/1921 85 19/06/2006 06/07/2012 09/03/2012 2,5 1 IIB 24 1 161 0 18/12/1953 52 26/06/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,1 2 IIB 15 1 162 0 02/05/1961 45 27/06/2006 06/07/2012 06/07/2012 0,7 2 IIA 21 1 163 0 01/01/1947 59 03/07/2006 06/07/2012 06/07/2012 0,9 1 IA 18 0 164 0 10/10/1944 61 04/07/2006 06/07/2012 06/07/2012 0,8 1 IA 0 0 165 0 16/10/1932 73 04/07/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,3 3 IIB 14 1 166 0 19/05/1935 71 04/07/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,3 1 IA 17 0 167 0 06/11/1931 74 11/07/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,7 2 IA 10 0 168 0 01/03/1921 85 11/07/2006 26/10/2010 06/07/2012 4 2 IIA 0 0 150 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 169 0 13/05/1967 39 18/07/2006 14/07/2008 30/12/2008 1,5 3 IIIA 25 6 170 0 31/10/1960 45 18/07/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,4 2 IIB 20 1 171 0 06/01/1933 73 21/07/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,7 3 IIB 14 2 172 0 01/05/1931 75 28/07/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,8 2 IIB 5 1 173 0 01/01/1948 58 04/08/2006 06/07/2012 06/07/2012 1 3 IIIA 11 4 174 0 02/07/1974 32 11/08/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,2 3 IIIA 13 5 175 0 05/09/1975 31 25/09/2006 13/05/2009 3,5 3 IIB 14 2 176 0 23/04/1936 70 13/11/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,3 1 IIA 9 0 177 0 28/12/1965 40 21/11/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,3 1 IA 2 0 178 0 01/12/1924 81 21/11/2006 06/07/2012 06/07/2012 3 2 IIA 9 0 179 0 31/05/1975 31 21/11/2006 12/05/2009 05/09/2009 2,5 3 IIIA 10 3 180 0 13/06/1922 84 21/11/2006 06/07/2012 06/07/2012 2,6 1 IIA 14 0 151 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 181 0 19/08/1941 65 04/12/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,1 1 IA 3 0 182 0 17/04/1949 57 05/12/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,3 3 IA 0 0 183 0 25/10/1926 80 05/12/2006 22/05/2012 06/07/2012 1,7 3 IIA 0 0 184 0 16/05/1963 43 18/12/2006 06/07/2012 06/07/2012 2 1 IIA 17 0 185 0 09/09/1931 75 19/12/2006 06/07/2012 06/07/2012 3 2 IIB 10 1 186 0 15/10/1960 46 22/12/2006 06/07/2012 06/07/2012 1,5 2 IA 10 0 187 0 24/03/1956 50 22/12/2006 27/04/2012 06/07/2012 0,9 2 IA 15 0 188 0 07/02/1955 51 08/01/2007 06/07/2012 06/07/2012 2 2 IIA 17 0 189 0 21/08/1943 63 15/01/2007 06/07/2012 06/07/2012 1 2 IIA 0 0 190 0 18/09/1954 52 30/01/2007 06/07/2012 06/07/2012 2,5 3 IIB 27 3 191 0 01/06/1927 79 26/02/2007 06/07/2012 06/07/2012 2,1 3 IIA 17 2 192 0 05/03/1944 62 26/02/2007 06/07/2012 06/07/2012 1,8 1 IA 13 0 152 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 193 0 23/02/1933 74 06/03/2007 06/07/2012 06/07/2012 1,4 2 IIIA 7 4 194 0 14/02/1950 57 13/03/2007 06/07/2012 06/07/2012 2,5 1 IIA 0 0 195 0 02/08/1956 50 12/03/2007 06/07/2012 06/07/2012 4,5 2 IIIA 21 3 196 0 01/04/1951 55 20/03/2007 06/07/2012 06/07/2012 2,5 2 IIB 13 1 197 0 09/10/1964 42 23/03/2007 15/06/2011 06/07/2012 5,2 2 IIIA 15 7 198 0 08/04/1950 56 26/03/2007 06/07/2012 06/07/2012 0,9 1 IA 16 0 199 0 19/06/1945 61 02/04/2007 06/07/2012 06/07/2012 0,7 1 IIA 0 0 200 0 05/04/1933 73 02/04/2007 06/07/2012 06/07/2012 2,5 1 IIA 14 0 201 0 18/12/1938 68 16/04/2007 06/07/2012 06/07/2012 2,8 3 IIA 2 0 202 0 03/01/1962 45 02/05/2007 06/07/2012 06/07/2012 1,7 2 IA 17 0 203 0 01/02/1953 54 07/05/2007 06/07/2012 06/07/2012 5,5 2 IIIC 21 9 204 0 16/01/1934 73 07/05/2007 06/07/2012 06/07/2012 1,5 1 IA 0 0 153 Tabla 1 Nº Caso Sexo Fecha Nacimiento Edad al Diagnóstico Fecha Recepción Fecha de Recidiva Fecha Mortalidad Tamaño Nottingham Estadio Inicial Ganglios totales Ganglios positivos 205 0 25/11/1944 62 24/05/2007 06/07/2012 06/07/2012 3 3 IIA 0 0 206 0 08/03/1941 66 01/06/2007 06/01/2009 2,5 3 IIA 0 0 207 0 02/11/1944 62 14/06/2007 06/07/2012 06/07/2012 1,3 2 IA 0 0 208 0 13/05/1934 73 22/06/2007 10/06/2011 24/09/2011 1,3 2 IA 0 0 209 0 02/08/1951 55 21/06/2007 06/07/2012 06/07/2012 2,5 3 IIA 1 0 210 0 07/05/1953 54 06/07/2007 11/07/2010 06/07/2012 2,3 3 IIB 17 1 211 0 19/11/1935 71 05/07/2007 14/10/2010 06/07/2012 1,7 3 IIIA 13 2 212 0 26/05/1941 66 13/07/2007 06/07/2012 06/07/2012 1,4 2 IA 0 0 213 0 28/08/1959 47 19/07/2007 06/07/2012 06/07/2012 3,8 2 IIA 0 0 214 0 14/12/1927 79 19/07/2007 27/07/2010 24/09/2010 3,5 2 IIB 20 2 215 0 21/12/1972 34 03/08/2007 06/07/2012 06/07/2012 2 2 IIA 3 0 216 0 29/08/1943 63 17/08/2007 30/04/2009 21/12/2009 5 2 IIIC 25 12 256 291. 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