Aprovechamiento de semillas de uva sobremaduras para la mejora del color de vinos tintos elaborados en clima cálido

Aprovechamiento de semillas de uva sobremaduras para la mejora del color de vinos tintos elaborados en clima cálido Francisco José Rivero Granados Área de Nutrición y Bromatología. Facultad de Farmacia c/ P. García González 2. 41012 SEVILLA (Spain). Tel. (34) 954 55 70 17 La tesis titulada “Aprovechamiento de semillas de uvas sobremaduras para la mejora del color de vinos tintos elaborados en clima cálido”, presentada por el Ldo. D. Francisco José Rivero Granados para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Área de Nutrición y Bromatología del Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal (Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla), bajo la dirección de los Doctores D. Francisco José Heredia Mira, Catedrático de la Universidad de Sevilla , Dª Mª Lourdes González Miret-Martín, Profesora Titular de la Universidad de Sevilla y Dª Belén Gordillo Arrobas, Profesora Ayudante Doctor de la Universidad de Sevilla. Considerando que se han alcanzado los objetivos inicialmente previstos, y que el trabajo reúne los requisitos necesarios, autorizan su presentación En Sevilla, a 18 de julio de 2019. Fdo.: Francisco José Heredia Mira Fdo.: Mª Lourdes González Miret-Martín Fdo.: Belén Gordillo Arrobas Los Directores de la Tesis Fdo. Francisco José Rivero Granados AGRADECIMIENTOS En primer lugar deseo expresar mi enorme agradecimiento a mis Directores de esta Tesis Doctoral, al Dr. Francisco José Heredia Mira por la oportunidad que me brindó gracias a su confianza, a la Dra. M. Lourdes González Miret-Martín y a la Dra. Belén Gordillo Arrobas. Sin su dedicación, paciencia y saber hubiera sido imposible llevar a cabo este trabajo, y más en las condiciones que han tenido lugar. A través de esta Tesis Doctoral me habéis transmitido vuestra pasión por la ciencia y a luchar por retos complicados, siempre a través de sabios consejos y desde la humildad del talento. Muchísimas gracias por todo. Agradecer a la Dra. Anna Mignani por admitirme en su laboratorio en el CNR-IFAC de Florencia para la realización de mi estancia doctoral, así como al Dr. Leonardo Ciaccheri y al Dr. Andrea Mencaglia por acogerme con una gran hospitalidad y ayudarme a lograr los objetivos marcados gracias a su profesionalidad y sapiencia. Agradecimientos a mi maestro y amigo D. Santiago Alonso, su conocimiento en el campo de la enología que me ha transmitido con tanta pasión, siempre me marcará y guiará profesional y personalmente. A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Color y Calidad de Alimentos José Miguel, Julio, Paco, María José, Berta, María Jesús, Félix, Emi, Pau, Carla…a todos muchas gracias por vuestra ayuda durante todo este tiempo. Siempre pensaré que soy un afortunado por teneros, ya que más que un grupo de compañeros de trabajo sois un gran grupo de amigos. A mis amigas Ana Benítez y Rocío Álvarez, grandes profesionales y mejores personas. Sin tu constante ayuda, Ana, aunque pienses lo contrario y no lo creas, ha sido clave en este largo camino. Mil gracias A todo el personal técnico del Servicio de Biología de los Servicios Generales de la Universidad de Sevilla, a la Cooperativa Ntra. Señora del Socorro y muy especialmente a D. Diego Bort por permitirnos realizar las vinificaciones en sus instalaciones, y, a D. Francisco Espinosa y Bodega La Aurora por proporcionarnos de forma altruista las muestras de semillas necesarias para realizar estos estudios. Gracias a mis queridos padres y hermana por sus constantes consejos y ánimos, a mis suegros, cuñados y amigos por su apoyo moral y humano. Gracias enormemente a Cristina por su paciencia, por su apoyo y sobre todo por solidarizarse en tantos y tantos momentos. Sin tu ayuda, este momento jamás habría llegado, gracias Cris. Pero sobre todo gracias a ti, Julia. A ti te he robado muchísimo tiempo durante estos últimos meses y por ello, no hemos podido disfrutar de muchas cosas juntos. Espero que a través de esta tesis, al menos te pueda enseñar una gran lección de vida para dentro de unos años cuando tengas momentos difíciles a lo largo de tu camino, recuerda que luchando, trabajando y perseverando se pueden lograr casi todos los retos y sueños, así que levántate siempre y continua hasta conseguirlo. Este trabajo ha sido realizado con el apoyo institucional de la Universidad de Sevilla a través de la acción II.3 del V Plan Propio de Investigación y del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España con el proyecto “Evaluación de estrategias tecnológicas adaptativas para vinificación en condiciones de cambio climático” (AGL2014-58486-C2-2-R), del que el Dr. Francisco José Heredia Mira es el investigador principal. A mi hija, Julia RESUMEN / ABSTRACT 2 Se han elaborado vinos tintos de variedad Syrah, y se han añadido semillas sobremaduras de variedad Pedro Ximénez, como fuente alternativa de copigmentos, en diferentes condiciones en cuanto a la cantidad de semillas añadidas (dosis de 3 g/L y 12 g/L), el tiempo de maceración (7, 30 y 60 días) y la etapa de maceración (fermentativa y postfermentativa). Se determinó el perfil fenólico de los vinos y se aplicó la Colorimetría Triestímulo para evaluar el efecto sobre la copigmentación con antocianos y el color de los vinos, así como su evolución en el tiempo. Los vinos con adición fermentativa de semillas sobremaduras, es decir, coincidiendo con el encubado de los orujos, presentaron un mayor contenido en antocianos y procianidinas que los vinos testigo (sin adición de semillas), lo que condujo a una mayor estabilización de los antocianos en las últimas etapas de vinificación, con un efecto cromático positivo, obteniendo vinos tintos de color más estable, más oscuros y cuyos tonos permanecieron rojos hacia los azulados. Para poder controlar la duración de la maceración con las semillas, se planteó la adición de semillas sobremaduras tras el descube de los orujos, con diferentes tiempos de contacto. Con maceraciones postfermentativas de 60 días se obtuvieron vinos tintos con mayor calidad y estabilidad cromática. A partir de los extractos fenólicos en sistemas modelo, se han establecido diferencias cualitativas y cuantitativas en la composición de las semillas sobremaduras de diferentes variedades de uva blanca. Se estudió la influencia en la evolución de los antocianos monoméricos de hollejos de uvas tintas y la formación de nuevos pigmentos derivados. Aplicando la Colorimetría Triestímulo Diferencial, se ha evaluado la eficacia copigmentante y el efecto sobre la calidad y estabilización del color. Se comprobó que los efectos colorimétricos más positivos (colores más intensos y más estables en el tiempo) se produjeron con los extractos de semillas de Moscatel, seguidos de los de Pedro Ximénez. Por último, se ha aplicado la Espectroscopía Raman como método rápido y no destructivo, en comparación con el análisis cromatográfico, que implica la destrucción de la muestra, el gasto de tiempo en su preparación y el coste económico por el uso de reactivos. Por Espectroscopía Raman con excitación a 1064 nm, se han caracterizado espectroscópicamente semillas sobremaduras de uvas blancas de distinto perfil fenólico, obteniendo una buena discriminación entre variedades y diferentes estados de sobremaduración. RESUMEN / ABSTRACT 3 ABSTRACT Due to the environmental impact, the management and reuse of agricultural waste is one of the great challenges of today's society. In the case of vine, one of the most widespread crops, millions of tons of waste are produced each year and the oenological industry is constantly searching for ways to take advantage of byproducts since, in addition, they are rich in phenolic compounds, having bioactive interest. In Andalusia, generous wines of high alcohol content are produced from white grapes subjected to concentration of sugars by direct exposure to the sun in paseras, which leads to special physicochemical and sensory characteristics, both in the grapes and in the wines obtained, and whose elaboration generates a large volume of residues. More recently, adapting to the market trends, the wineries of this warm climate region began to elaborate red wines. This was a great challenge due to the high temperatures that are reached, aggravated by the effects of the climate change. The ripening of the red grape is inadequate being a gap between the technological (sugar/acid) and the phenolic maturation, which puts at risk the obtaining high-sensory quality red wines, mainly taste (astringency) and visual quality (intensity and color stability). Thus, it is known that warm-climate red wines are frequently unbalanced, unstable in color and, therefore, little accepted by the consumer. The main objective of this Thesis is to integrate both circumstances, on the one hand, the use of overripe seeds originated in the production of generous wines and, on the other hand, the improvement of the color of warm-climate red wines. Thus, the goal is to valorize the overripe seeds as a source of phenols, optimizing their application in red wine (moment, time, dose), and evaluate the effect on the quality and stabilization of color through the copigmentation phenomenon. By means of high efficiency liquid chromatography, the phenolic profile of seeds of three white grapes varieties commonly used for the production of generous wines (Pedro Ximénez, Moscatel and Zalema), with different levels of over-ripening, has been determined. The phenolic richness of these overripe seeds is highlighted, mainly in flavanols, benzoic acids and procyanidins, having the highest phenolic content in Moscatel variety. Red wines from Syrah variety have been produced, and Pedro Ximénez variety overripe seeds have been added, as external natural source of copigments, at different conditions regarding the amount of seeds added (doses of 3 g/L and 12 g/L), the RESUMEN / ABSTRACT 4 maceration time (7, 30 and 60 days) and the maceration stage (fermentative and postfermentative). The phenolic profile of wines was determined and Tristimulus Colorimetry was applied to evaluate the effect on copigmentation with anthocyanins and the color of the wines, as well as their evolution over time. The wines obtained with fermentative addition of overripe seeds, that is to say, coinciding with the vatting period, showed higher content in anthocyanins and procyanidins than the control wines (without seeds addition), which led to a greater stabilization of the anthocyanins in the last stages of vinification, with a positive chromatic effect, obtaining red wines of more stable color, darker and red towards bluish hues. Another assay consisted on adding the he overripe seeds after drawing-off (postfermentative addition), in order to manage the time of contact (maceration) between wine and seeds. Also, different contact times were studied. 60-day post-fermentative macerations lead to red wines with higher quality and chromatic stability. Using the phenolic extracts of seeds in model systems, qualitative and quantitative differences have been established in the phenolic composition of overripe seeds from different white grape varieties. The influence on the evolution of monomeric anthocyanins from red grape skins and the formation of new derived pigments was studied. The copigmentation efficiency and the effect on the quality and stabilization of the color have been evaluated by applying Differential Tristimulus Colorimetry. It was found that the most positive colorimetric effects (colors more intense and more stable over time) were produced with Moscatel seed extracts, followed by those of Pedro Ximénez. Finally, Raman spectroscopy has been applied as a rapid and non-destructive method, in comparison with the chromatographic analysis, which involves sample destruction, time spent in preparing it and economic cost due to the use of reagents. By Raman spectroscopy with excitation at 1064 nm, we have characterized spectroscopically overripe seed of white grapes having different phenolic profile, obtaining a good discrimination between varieties and between different overripening states. Introducción INTRODUCCIÓN 5 1. LA UVA Y EL CAMBIO CLIMÁTICO Los estudios de fósiles datan la presencia de Vitis silvestris L. por todo el hemisferio norte desde hace más de 3 millones de años. Debido a las glaciaciones que se produjeron en la era cuaternaria, esta planta sólo sobrevivió en las regiones más cálidas como sucedió en la cuenca mediterránea y en los valles de las zonas más septentrionales. Sin embargo, también se extendió por los continentes americano y asiático debido a la unión que existía entre ellos. La especie original, que presentaba cepas masculinas y cepas femeninas, sufrió una mutación originada en la región del mar Caspio hace 6000-8000 años dando lugar a una nueva especie, Vitis vinífera, con flores hermafroditas, hecho que ayudó en gran medida a su propagación a lo largo de toda la cuenca mediterránea. Durante las épocas griega y romana, el cultivo de Vitis vinifera se extendió por sus colonias, adquiriendo una gran importancia el desarrollo de la viticultura durante este periodo. En el siglo XVI, la planta llegó a América llevada allí por los españoles para su propio suministro de uvas y vino. Estas “vides del Nuevo Mundo”, en siglos posteriores, serían las salvadoras de la viticultura, ya que durante el siglo XIX las vides europeas sufrieron el ataque de la filoxera (Daktylosphaera vitifoliae), un insecto que ataca directamente y destruye las raíces de la planta. Esta plaga, prácticamente, acabó con las vides europeas (Figura 1). Los injertos realizados de vides europeas sobre pies de origen americano, que habían mostrado mayor resistencia, ayudaron a paliar esta plaga (Hidalgo-Togores, 2011). Figura 1: Difusión de la Filoxera en Europa. 1868-1920 (Juan Piqueras Haba) INTRODUCCIÓN 6 El género Vitis cuenta con un gran número de especies, y dentro de cada una de ellas existen diferentes variedades. Si nos centramos en V. vinifera L., se citan 10.000 variedades diferentes, llegándose a hablar de hasta 20.000 teniendo en cuenta las hibridaciones (Martínez de Toda, 1991). Sin embargo, no todas tienen un valor comercial en la producción de vino y como uva de mesa, restringiéndose este enorme número sólo a una fracción Según la definición dada por la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV, 2016), la uva fresca es el fruto maduro procedente de la vid. Estos frutos están compuestos por la piel u hollejo, las semillas o pepitas, la pulpa y el pedicelo, que lo une al raspón o parte del racimo destinado a unirlo con la planta (Figura 2). a) b) Figura 2. a) Corte esquemático de un grano de uva, b) Morfología esquemática de los tejidos de un grano de uva madura. (Fuente: Hidalgo-Togores, 2011). En concreto, uva de vinificación es la uva fresca que, por sus características, se destina esencialmente a vinificación. En ocasiones, puede estar sobremadura, ligeramente pasificada o afectada de podredumbre noble, a condición de que pueda ser estrujada o prensada usando los procedimientos ordinarios de cada bodega y produzca espontáneamente una fermentación alcohólica (OIV, 2016). 1.1. Composición química de la uva y su evolución durante la maduración. Las características físicas y químicas de la uva están relacionadas, en primer lugar, con la variedad. Además, la composición de la uva puede variar apreciablemente dependiendo de las condiciones medioambientales y agronómicas en las que se desarrolla la vid. INTRODUCCIÓN 7 De manera general, los ácidos orgánicos y azúcares sencillos, junto con el agua, se encuentran sobre todo en la pulpa, mientras que los compuestos fenólicos lo hacen fundamentalmente en las semillas y los hollejos. La composición de las distintas partes de la uva tiene una gran importancia en la elaboración de los vinos y su calidad, ya que una buena parte de los compuestos serán transferidos al mosto durante la vinificación. Esta composición se muestra en la Figura 3. Figura 3. Composición de las distintas partes de la uva. Pulpa: La pulpa supone entre el 75 y el 85% del peso total de la uva debido a que sus vacuolas contienen el mosto, un líquido de base acuosa que, fundamentalmente, contiene azúcares (glucosa y fructosa como mayoritarios), ácidos orgánicos (tartárico, málico y cítrico como prioritarios), minerales (calcio, magnesio y sodio), compuestos nitrogenados (aminoácidos y proteínas solubles) y otros compuestos como aldehídos y esteres en forma de compuestos aromáticos, y fenoles. Por otro lado, los ésteres de ácidos hidroxicinámicos son los compuestos fenólicos que predominantemente se encuentran en la pulpa de la uva (Guchu et al., 2015). Hollejo: La piel de la uva corresponde al 5-10% del peso total seco de la uva. Actúa como una barrera natural contra factores climáticos o enfermedades fúngicas. En los hollejos se pueden diferenciar 3 partes: cutícula, epidermis e hipodermis. La cutícula es una capa fina que constituye la parte más externa de la piel y es dónde se encuentra la pruina que protege las células interiores de la lluvia y la humedad, y retiene en su superficie los microorganismos transportados por el aire, como las levaduras. Más internamente se encuentran la epidermis y la hipodermis. La composición de esta última capa es muy importante para la vinificación ya que en ella se encuentran compuestos responsables de atributos sensoriales del vino como el sabor, el aroma y el color (pigmentos antociánicos, ácidos cinámicos, flavonoles y sustancias aromáticas). Pruina HOLLEJO o PIEL Antocianos(pigmentos uva tinta) Ácidos Flavonoles Sustancias aromáticas Sustancias pépticas, celulosa Enzimas RASPÓN o ESCOBAJO Celulosa, lignina Sustancias nitrogenadas Sales minerales Taninos SEMILLA Flavanoles, Taninos Lípidos Polisacáridos PULPA Agua (70‐85%) Azúcares: Glucosa y Fructosa Ácidos orgánicos : Tartárico, málico Ácidos fenólicos Sustancias nitrogenadas Sales minerales Vitaminas (B1,B6, C, A) INTRODUCCIÓN 8 Semillas: Dependiendo de la variedad de uva, cada grano puede tener de 1 a 4 semillas, aunque también se puede dar que no contengan ninguna (Shi et al., 2003). Las semillas constituyen el 0-6% del peso de la uva y es la parte que alberga el embrión. Están compuestas, fundamentalmente, por agua (25-45%), fibra (40%), aceites esenciales (16%), proteínas (11%), polifenoles (7%) y otros compuestos minoritarios como azúcares o minerales (García-Jares et al., 2015). La semilla es una de las principales fuentes fenólicas de la uva, contribuyendo entre el 20-55% del total de los polifenoles de la baya. Entre los polifenoles más abundantes se encuentran las formas oligoméricas y poliméricas de los flavanoles (procianidinas y taninos, respectivamente). Estos compuestos fenólicos, al igual que los de los hollejos, tienen una gran importancia en las propiedades sensoriales del vino y se transfieren al mosto durante la maceración. Las semillas se dividen en 3 partes: envoltura externa, albumen y embrión. La envoltura externa, rica en compuestos fenólicos, está compuesta de subcapas como la epidermis o la cutícula, además de los tegumentos externos, medio e interno (Figura 4). El albumen es un tejido interno de la semilla donde se encuentra una importante cantidad de aceites con ácidos grasos como el oleico y el linoleico, además de otros compuestos orgánicos como proteínas (Gazzola et al., 2014). Figura 4. Sección longitudinal de la semilla de uva (Fuente: Hidalgo-Togores, 2011), junto con imágenes gráficas y corte transversal. Raspón: El raspón o escobajo es el elemento del racimo que sirve de soporte a las bayas, y conduce los nutrientes a través de los vasos situados en su interior (Hidalgo- Togores, 2011). En cuanto a su composición, es pobre en azúcares, contiene sales minerales destacando el potasio, y es rico en compuestos fenólicos como flavanoles, ácidos fenólicos y flavonoles (Souquet et al., 2000). Su riqueza fenólica lo hace interesante en la elaboración de vinos pobres en estos compuestos, pero generalmente se elimina del racimo previamente a la maceración, ya que su composición puede aportar al vino aromas y sabores herbáceos indeseables. INTRODUCCIÓN 9 Composición fenólica de la uva Los fenoles son compuestos químicos sintetizados por las plantas a través de mecanismos secundarios, en respuesta a situaciones o factores de estrés abióticos y/o bióticos, como pueden ser la intensa luz solar, las altas temperaturas, el ataque de animales o patógenos, o la propia actividad humana (Hernandez et al., 2006; Oliveira et al., 2013). En el caso de los fenoles de la uva, la mayor parte se transfiere al vino durante el proceso de vinificación, especialmente en el caso del vino tinto (aproximadamente el 60%). Estos compuestos tienen gran importancia en la calidad del vino debido a que están implicados en propiedades sensoriales como el cuerpo, el aroma, el sabor, la astringencia o el color (Cassassa, 2017). Además de su importancia sensorial, los fenoles de la uva presentan diversas propiedades bioactivas entre las que destaca el efecto antioxidante (Arvanitoyannis et al., 2006; Anastasiadi et al., 2010, Jara-Palacios et al., 2016). Muchos de estos compuestos han demostrado tener capacidad para prevenir ciertas enfermedades como algunos tipos de cáncer, diabetes tipo 2 o anomalías cardiovasculares (He & Giusti, 2010). Por ello, sectores como el alimentario, el farmacéutico o el cosmético muestran gran interés en el estudio y desarrollo de nuevas aplicaciones de los compuestos fenólicos de la uva y el vino (Jayaprakasha et al., 2001; Yilmaz & Toledo, 2004; Feringa et al., 2011; Li et al., 2017; Tomi et al., 2017). Desde el punto de vista químico, en la uva existe una gran diversidad de compuestos fenólicos, con una estructura común cuya unidad principal es el fenol: un anillo aromático que aporta una gran reactividad, con al menos un grupo hidroxilo en su estructura (Monagas et al., 2005). Además, en la uva existen otras estructuras más complejas denominadas polifenoles, los cuales pueden tener en su composición más de un anillo fenólico, y con uno o más grupos hidroxilos. Estos grupos funcionales se pueden encontrar libres o unidos a moléculas de diferente naturaleza, generando así una amplia diversidad química (Cheynier et al, 2010). La clasificación de los compuestos fenólicos se puede realizar en función de diferentes criterios. Teniendo en cuenta la estructura de su esqueleto carbonado, los fenoles se clasifican en flavonoides y no flavonoides. En las uvas tintas de la especie V. vinifera L., los principales grupos de flavonoides son los antocianos, los flavan-3-oles y los flavonoles; y en menor medida los flavanonoles y las flavonas. Entre los compuestos no flavonoides, se encuentran los ácidos fenólicos (benzoicos e hidroxicinámicos) y los estilbenos. La uva contiene esencialmente compuestos no flavonoides en la pulpa y los flavonoides en los hollejos, semillas y raspones. INTRODUCCIÓN 16 altamente galoiladas y poseen un grado medio de polimerización alrededor de 10 unidades. En cambio, los taninos del hollejo no presentan tanta galoilación, están compuestos de procianidinas y prodelfinidinas y poseen cerca de 30 unidades (Busse-Valverde et al., 2011). - Flavonoles. Se caracterizan por tener un doble enlace entre los carbonos C2 y C3 y un grupo hidroxilo en el C3. La mayoría de los flavonoles tienen además grupos hidroxilos en los carbonos C5 y C7 por lo que son llamados derivados 3,5,7- trihidoxilatos. Los flavonoles de uva se encuentran principalmente en los hollejos. Esta familia comprende glucósidos, galactósidos y glucurónidos de seis agliconas: quercetina, miricetina, isorhamnetina, kaempferol, laricitrina y siringetina; junto con la quercetina 3-rutinósido. Recientemente, derivados acetilados y p-coumaroilados de la isoramnetina, laricitrina y siringetina (3-O-glucosidos) han sido identificados por primera vez en los hollejos de uvas Vitis vinífera de las variedades Tannat, Marselan y Syrah, así como en sus vinos (Favre et al., 2018). Sus estructuras químicas se presentan en la Figura 13. Figura 13. Estructura química de los principales flavonoles de la uva y sus respectivas agliconas. (Adaptado de Favre et al., 2018) En las uvas, los flavonoles están presentes como 3-O-glicósidos, mientras que sus correspondientes agliconas libres también se pueden encontrar en vinos debido a la hidrólisis ácida que se produce durante la vinificación y el envejecimiento. En general, los derivados glicosilados más abundantes son los glucósidos, mientras que los galactósidos y glucurónidos son minoritarios, exceptuando a la quercetina 3-O-glucurónido, que se encuentra en cantidad similar a la quercetina 3-O-glucósido (Mattivi et al., 2006). En cuanto a las agliconas, las mayoritarias son la quercetina y miricetina (Castillo-Muñoz et al., 2007). INTRODUCCIÓN 17 - Antocianos. Los antocianos son pigmentos fenólicos que se encuentran en la piel de las uvas tintas. Su estructura consta de un esqueleto con dos anillos bencénicos unidos por una cadena de tres átomos de carbono ciclada en un heterociclo oxigenado, insaturado y catiónico, denominado catión flavilio o antocianidina (Figura 14). Figura 14. Estructura básica del catión flavilio. Las distintas antocianidinas se diferencian entre sí según el número de grupos hidroxilos y grupos metilos que presentan como sustituyentes en el anillo bencénico B. En las variedades tintas de Vitis vinifera, se han encontrado 5 antocianidinas diferentes: cianidina, delfinidina, malvidina, peonidina y petunidina (Figura 15). Figura 15. Estructura química de las principales antocianidinas de uvas y vinos Una de las características de Vitis vinifera es la glucosilación en posición 3 de las antocianidinas formando las antocianinas o monoglucósidos no acilados. Los azúcares más comunes son los 3-monoglucósidos, siendo la malvidina 3-O- glucósido el compuesto mayoritario. En los últimos años, se ha confirmado la presencia de 3,5 o 3,7-diglucósidos en uvas y vinos tintos mediante técnicas de espectrometría de masas (Alcalde-Eón et al., 2006; García-Marino et al., 2010). Además, las antocianinas pueden encontrarse unidas a través de la posición 6 del azúcar a ácidos orgánicos, en mayor medida al ácido acético, cumárico o cafeico formando los derivados antociánicos acilados. Entre los distintos antocianos INTRODUCCIÓN 18 acilados identificados en vinos, los derivados acetilados y cumaroilados de la malvidina 3-O-glucósido son los mayoritarios, cuyas estructuras químicas se presentan en la Figura 16. Figura 16. Estructura de los antocianos monoglucósidos y los que presentan acilación. El color exhibido por los antocianos, debido a la estructura resonante del catión flavilio, fue explicado por Pauling (1940). Los flavonoides muestran una absorción intensa en el intervalo espectral UV de 250-270 nm. Particularmente, los antocianos absorben, además, en el intervalo espectral visible de 520-560 nm (λmáx=520 nm) (Figura 17). Figura 17. Espectro de absorción de antocianos y sus variaciones según presenten glucosilaciones y acilaciones. Con la espectroscopía visible es posible diferenciar los distintos antocianos, ya que su color y su forma espectral varían según las metilaciones, glicosilaciones o acilaciones. Estas combinaciones químicas son responsables de la gran variedad de tonalidades que exhiben, y a los ligeros desplazamientos hipsocrómicos o batocrómicos en torno a la λmax (Heredia et al., 1998). Así, la peonidina y cianidina exhiben tonos rojo-anaranjados (dos sustituyentes en el anillo B); mientras que la delfinidina, petunidina y malvidina exhiben tonos rojo-azulados (tres sustituyentes en el anillo B). EFECTO GLICOSILACIÓN Y ACILACIÓN INTRODUCCIÓN 19 Evolución de la composición de la uva durante la maduración El proceso de desarrollo de la baya de uva se suele dividir en tres etapas (Figuras 18 y 19): fase inicial de crecimiento rápido (fase I), fase de latencia, sin crecimiento o con un crecimiento muy lento (fase II), y fase final (fase III), de crecimiento lento, que se inicia con el final del envero y finaliza con la completa maduración de la uva (Stafne, 2011). Figura 18. Etapas en el desarrollo y maduración de la uva (Adaptado de Stafne, 2011). Figura 19. Cambio de tamaño y color en la uva tinta desde la etapa de crecimiento hasta la completa maduración. La fase inicial de crecimiento rápido (fase I) está relacionada a la formación del fruto. Esta fase inicia en la floración y dura aproximadamente 50-60 días durante la cual se produce una importante acumulación de solutos, como los ácidos tartárico y málico, pero con baja concentración de azúcar. Al inicio de esta etapa, se forman las semillas, Envero Fase I Maduración Fase II INTRODUCCIÓN 20 donde comienzan a acumularse los taninos. En esta etapa las bayas alcanzan al menos la mitad de su volumen y su peso final. La fase de latencia (fase II) se corresponde con el final del crecimiento herbáceo de la uva. No hay un tiempo específico ya que la duración depende de la variedad de la uva y de los factores agronómicos y de cultivo. Al inicio de la fase II, los frutos han alcanzado al menos la mitad del tamaño que tendrán al final de su crecimiento y continúan acumulando ácidos y taninos, los cuales alcanzarán su máximo nivel en el envero. En esta etapa, las semillas alcanzan la madurez y su tamaño final, aproximadamente, 10 días antes del envero, comenzando entonces su lignificación. El final de la fase II coincide con el comienzo del envero, etapa en la que se produce un cambio en la coloración de las bayas debido a que se reduce o se anula la fotosíntesis (disminución de la clorofila) y a la síntesis de nuevos pigmentos (Figura 20). En particular, las variedades tintas desarrollan tonalidades rojas azuladas debido a la acumulación de antocianos en las células de la hipodermis (y también en la pulpa en variedades tintóreas), mientras que en las variedades blancas se sintetizan otros pigmentos fenólicos (flavonoles, flavononoles, etc.) dando tonalidades amarillas (Hidalgo-Togores, 2011). El envero representa una transición entre el crecimiento de la uva y su maduración. Figura 20. Cambio de coloración de la uva tinta durante el envero. La fase de post-envero y maduración del fruto (fase III) comienza con el final del envero, el cual marca el comienzo de la maduración de la uva, y a partir de aquí, prácticamente, se detiene su crecimiento herbáceo. La maduración puede durar entre 5 y 10 semanas dependiendo, en gran parte, de factores agronómicos, de la variedad de uva y de las condiciones climatológicas. La maduración de la uva es el resultado de múltiples cambios fisiológicos y bioquímicos de cada uno de sus componentes (pulpa, semilla y hollejo), que no son necesariamente correlativos entre sí. Desde un punto de vista biológico, la madurez de la baya se alcanza en el momento en que las semillas adquieren capacidad de viabilidad para formar un nuevo individuo al germinar, denominándose madurez fisiológica (Hidalgo-Togores, 2011). Este proceso comienza los días posteriores al envero, momento en el cual, el aporte de nutrientes en la baya se desvía desde la semilla, al completarse su formación, y comienzan a acumularse en la pulpa y el hollejo. En términos generales, la baya aumenta de peso y tamaño hasta INTRODUCCIÓN 21 alcanzar un tamaño estable, pero no por multiplicación celular sino por acumulación en la pulpa de nutrientes, principalmente azúcares libres y agua, pero también cationes, ácidos aminados y compuestos fenólicos, mientras que las concentraciones de ácidos tartárico y málico disminuyen. En el hollejo continúa la acumulación de pigmentos antociánicos, así como fenoles, aromas, aminoácidos, etc. Al mismo tiempo, a partir de la fase de envero, se produce una modificación de las paredes celulares de los tejidos vegetales de la uva. En la pulpa, las paredes celulares se debilitan porque el crecimiento celular y de su tamaño no está acompañado del engrosamiento de éstas. El hollejo crece en menor medida que la pulpa, por lo que se produce un aumento progresivo de la tensión de la piel. El aprovechamiento de la uva para la vinificación determina que su estado de maduración sea el factor principal y uno de los más determinantes de la calidad global del vino. Desde un punto de vista enológico, el momento óptimo de madurez se alcanza cuando se produce una evolución armoniosa de las transformaciones que ocurren en las distintas partes de la baya. A pesar de los numerosos cambios bioquímicos que ocurren durante la maduración, de forma simplificada, se establece que la madurez óptima está condicionada por la concentración de azúcar y ácidos alcanzada en la pulpa en el momento de cosecha, así como el contenido y tipo de compuestos fenólicos y aromáticos acumulados en las semillas y los hollejos (Ozcan et al., 2017). Sin embargo, la síntesis y acumulación de todos estos compuestos en las distintas partes de la uva no ocurren simultáneamente durante la maduración, y además están influidos por factores genéticos, edáficos, climáticos y agronómicos. Como consecuencia, en enología se define el concepto de madurez según diferentes criterios (Ribereau-Gayon et al., 2006): Madurez tecnológica (la relación entre azúcares y ácidos), fenólica (contenido y extractabilidad de fenoles), y aromática (mayor potencial en aromas). La madurez tecnológica o madurez de la pulpa se refiere a la concentración de azúcares, la acidez total y el pH, y a la relación azúcares/acidez (Nogales-Bueno et al., 2014). La acumulación de azúcares en la pulpa ocurre lentamente desde las primeras etapas del desarrollo hasta el envero, con niveles de 10 a 15 g/kg de uva, y posteriormente se incrementa rápidamente hasta la completa maduración, donde se alcanzan niveles de 150-200 g/L de mosto. En casos excepcionales de vendimias sobremaduras el contenido en azucares puede llegar a los 300 g/L. Este importante incremento a partir del envero es debido a que el exceso de glúcidos no utilizados por las semillas se almacena en la pulpa por su proximidad y por los aportes diarios realizados por la fotosíntesis de las hojas (Hidalgo-Togores, 2011). Por ello, en climas INTRODUCCIÓN 22 cálidos, donde hay una mayor actividad fotosintética, las uvas alcanzan una mayor acumulación de azúcares. En la uva, los azúcares mayoritarios son la glucosa y la fructosa, dándose en la maduración contenidos prácticamente iguales. Los ácidos orgánicos se encuentran en todas las partes verdes de la planta y en la pulpa tienden a disminuir a medida que avanza la maduración por la combustión o respiración e incluso pueden transformarse en azúcares, especialmente en la última etapa de la maduración. Los ácidos más importantes son el tartárico, el málico y, en menor medida, el cítrico. La evolución de los ácidos tartárico y málico en la maduración es distinta, debido a que su síntesis, origen y degradación también lo son, estando a su vez influidos por condiciones edafoclimáticas. En particular, el ácido málico desaparece más rápidamente que el tartárico, que es más estable y en gran parte el responsable de la acidez del vino (Figura 21). La acidez de un mosto puede estar entre 3 y 7 g/L expresados en ácido tartárico (pH entre 2.8 y 3.8.). Figura 21. Representación gráfica de la evolución de los ácidos tartárico y málico durante el desarrollo de la baya de uva y su maduración. (Adaptado de Deloire, 2010). De forma global, la uva adquiere la madurez tecnológica óptima cuando la relación azúcar/acidez alcanza su valor máximo. La evolución de los azúcares, los ácidos y el peso de baya durante la maduración se muestran en la Figura 22. Cuando se habla de madurez fenólica, se hace referencia al potencial de compuestos fenólicos presentes en las uvas en el momento de cosecha y su extractabilidad durante la vinificación (Zamora, 2003; Ribereau-Gayón et al., 2006). Fundamentalmente, está condicionada por la cantidad y tipo de antocianos y flavonoles en el hollejo, así como taninos en las semillas y el hollejo. INTRODUCCIÓN 23 Figura 22. Evolución del peso de la baya, azúcares, ácido tartárico, ácido málico y acidez total a lo largo del proceso de maduración (Fuente: Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera, JUNTA DE ANDALUCÍA, 2012). En el hollejo, la síntesis de los pigmentos antociánicos se produce a partir del envero, donde su concentración aumenta durante la fase de maduración alcanzando un máximo que generalmente coincide con la madurez tecnológica. Posteriormente, la cantidad de antocianos disminuye hasta las fechas de la vendimia y en etapas de sobremaduración (Kennedy et al., 2002; Obreque-Slier et al., 2010). Este patrón de comportamiento es similar al mostrado por los flavonoles en los hollejos. En cuando a los taninos de la piel, se sintetizan rápidamente durante el periodo herbáceo, acumulándose estos compuestos hasta el envero. A partir del envero y durante la maduración, su síntesis se va ralentizando y, aunque se produce una estabilización durante las últimas fases de la maduración, su máximo se alcanza ligeramente después que el de los antocianos. El patrón de síntesis de procianidinas afecta activamente a la síntesis de los compuestos que forman parte de su estructura, los flavanoles monoméricos. La concentración de estos compuestos aumenta radicalmente durante la fase herbácea hasta el envero, a partir de dicho momento estos compuestos decrecen debido a la síntesis de las procianidinas. En relación a los taninos de la semilla, su concentración disminuye tras el envero hasta la maduración. Simultáneamente las semillas cambian de coloración de verde a amarillo y finalmente a tonalidades marrón grisáceo (Figura 23), lo cual puede ser usado como indicador de la madurez de la uva (Braidot et al., 2008; Rodriguez-Pulido 2012; Quijada-Morín et al., 2016). Se ha podido comprobar que no se producen diferencias en la composición de las procianidinas durante la maduración, aunque sí se producen variaciones en su grado medio de polimerización, el cual aumenta INTRODUCCIÓN 24 progresivamente hasta el momento de la recolección de la uva (Kontoudakis et al., 2011a; Gil et al., 2012). Figura 23. Evolución de semillas de uva y cambios de color asociados a la maduración. La evolución de antocianos y flavanoles en las distintas partes de la uva se muestra en la Figura 24. Figura 24. Evolución de los compuestos fenólicos durante la maduración de la uva (Adaptado de R. Gayón, 2006). Por otra parte, la concentración de ácidos hidroxicinámicos se incrementa rápidamente en la baya durante el periodo herbáceo hasta el envero, decreciendo en etapas posteriores y manteniéndose constante hasta la vendimia. La concentración de los ácidos benzoicos y concretamente el mayoritario, el ácido gálico, aumenta de una manera constante hasta el envero, momento en el que se produce una disminución progresiva hasta la vendimia (Obreque-Slier et al., 2010). Durante el proceso de maduración se producen también cambios en la estructura de la pared celular de los polisacáridos y lignificaciones, lo que afecta la extractabilidad de los compuestos según su procedencia de la semilla, pulpa u hollejo (Bautista-Ortin et al., 2012). Conforme la uva madura, la capa interna de la piel se vuelve más fina y, en presencia de etanol, la capa externa se solubiliza, lo que facilita una mayor extracción de compuestos del hollejo. Por el contrario, las semillas endurecen su superficie con una cutícula lignificada que dificultará la extracción. Recientemente, la combinación de técnicas ópticas basadas en imágenes hiperespectrales en el infrarrojo cercano y espectroscopía Raman, junto con técnicas INTRODUCCIÓN 25 quimiométricas, se ha aplicado para estimar el contenido fenólico extraíble en semillas y hollejos de uva (Quijada-Morín et al., 2015; Nogales-Bueno et al., 2017a, 2017b; Baca-Bocanegra et al., 2018a; 2018b, 2019). Estos estudios aportan una información muy útil para predecir el potencial fenólico extraíble de las partes sólidas de la uva según su estado de madurez y por tanto optimizar las condiciones de maceración durante la vinificación. En particular, se ha confirmado que semillas con un mayor grado de madurez presentaron una menor cantidad de fenoles extraíbles (Baca- Bocanegra et al., 2018a). Por otro lado, en términos generales, la uva menos madura posee una baja concentración de antocianos que, además, son de difícil extracción. Asimismo, presenta una mayor extractabilidad de taninos procedentes de las semillas que además son más astringentes. Por el contrario, la uva más madura tiene una alta concentración de antocianos fácilmente extraíbles y taninos menos astringentes (Zamora, 2003; Kontoudakis et al., 2011b). Sobremaduración. Una vez finalizada la maduración completa de la uva, comienza un periodo de sobremaduración que no puede considerarse una etapa más de su ciclo vegetativo ya que la baya resulta prácticamente aislada del racimo debido a la lignificación del raspón o escobajo y al agostamiento de los sarmientos (Hidalgo- Togores, 2011). Durante esta fase, las bayas evaporan agua con lo que se produce la pérdida de peso del fruto y la concentración de alguno de los componentes del mosto, como los azúcares (Figura 25). Figura 25. Uvas en estado de sobremaduración En procesos de sobremaduración, la concentración de algunos compuestos fenólicos continúa disminuyendo en la baya, mientras que otros se mantienen estables o incluso se incrementan (Mencarelli et al., 2010). Se ha comprobado que, generalmente, estos descensos en la concentración se producen en los ácidos benzoicos (ácido gálico) y en INTRODUCCIÓN 32 mucho más preocupados e informados sobre los vinos que desean tomar, demandando aquellos de una mayor calidad. De hecho, se ha confirmado que el descenso global en el consumo de vinos no afecta de igual manera a todos los vinos según su calidad. Mientras que la demanda de vinos de mesa o corrientes ha disminuido significativamente en los últimos 50 años (superior al 50%), la tendencia de consumo para los vinos de calidad es en aumento (García, 2010). Entre las características que definen la calidad de los vinos, el color es el primer atributo apreciado en la evaluación sensorial o cata (Zamora, 2003). Según diferentes estudios de mercado, es una de las características más relevantes considerada por los consumidores para valorar la calidad de los vinos, junto con el sabor, aroma-bouquet, la denominación de origen, añada, zona de origen, marca, precio, o variedad de uva (Ikerfel-MAPA, 2000; Bernabéu et al.; 2005; Nielsen, 2009). El color del vino tinto y su estabilidad están determinados por su composición química, especialmente por su composición fenólica. En particular, son los pigmentos antociánicos presentes en los hollejos de las uvas los compuestos fenólicos directamente responsables del color (Fernandes et al., 2017). A su vez, otros fenoles como los flavanoles y taninos procedentes de las semillas, los flavonoles procedentes del hollejo, y ácidos fenólicos de la pulpa, intervienen indirectamente en el color del vino mediante interacciones con los antocianos, en las denominadas reacciones de copigmentación (Boulton, 2001; Aleixandre-Tudo & Du Toit, 2018) En ese sentido, el color proporciona información de la estructura química del vino, la edad y su estado de evolución en el tiempo. Además, es el reflejo de posibles alteraciones que el consumidor detecta, influyendo significativamente en la aceptación o rechazo del producto (Martínez et al., 2001). Igualmente, se ha demostrado que el color puede influenciar otras cualidades sensoriales como el aroma o el gusto (Valentín 2016). En particular, y en cuanto a su apariencia, los vinos más apreciados en el mercado son aquellos con colores más intensos y estables (Zamora, 2003; Loureiro et al., 2016). Por ello, la estabilización química de los pigmentos del vino, y por tanto del color, constituye una de las líneas de investigación más importantes en el campo de la enología. El estudio y control de los factores, tanto agronómicos como enológicos, que determinan su contenido y evolución durante la vinificación ha sido y continúa siendo uno de los principales objetivos en los controles de calidad del vino. INTRODUCCIÓN 33 2.2. Transferencia de color al vino: Extracción de compuestos fenólicos durante la maceración. Durante la vinificación pueden diferenciarse dos fases que claramente determinan la transferencia de color de la uva al vino (fase de maceración) y su posterior evolución (fase de estabilización). Durante la maceración, se extraen los compuestos responsables del color desde las partes sólidas de la uva. En la etapa de conservación y/o envejecimiento, los compuestos extraídos se ven implicados en numerosas reacciones enzimáticas y/o químicas que tienen como resultado la degradación parcial de éstos, así como la formación de nuevos pigmentos (De Freitas & Mateus, 2011). En los vinos tintos, la extracción/difusión de los antocianos y otros compuestos fenólicos desde la uva hacia el mosto comienza con el estrujado de los racimos, y se prolonga hasta el prensado durante el encubado, en el que se mantiene en contacto el mosto con las partes sólidas de la uva (hollejos y semillas). Este periodo puede durar desde pocos días hasta varias semanas dependiendo del tipo de vino que se quiera elaborar. Durante este periodo, se pueden distinguir tres fases: prefermentativa, fermentativa y posfermentativa. La maceración prefermentativa, desde el estrujado de la uva hasta el inicio de la fermentación alcohólica (de unas horas a pocos días), en la que la extracción ocurre en ausencia de etanol. La maceración fermentativa, simultánea a la fermentación alcohólica (entre 2 y 7 días), en la que la extracción ocurre en presencia de etanol. La maceración posfermentativa, en la que la extracción continúa una vez finalizada la fermentación (desde días a semanas), especialmente en vinos en los que desea un mayor potencial de envejecimiento. Los compuestos fenólicos, localizados en diferentes partes de la uva, presentan distinta solubilidad y capacidad de difusión, en función de la proporción agua/alcohol presente en el medio, así como de la mayor o menor disgregación de las paredes celulares del hollejo y de las semillas (Busse-Valverde et al., 2011; Nogales-Bueno et al., 2017b). La extracción de antocianos se inicia ya en la fase prefermentativa, obteniéndose la máxima concentración de estos pigmentos en pocos días. Posteriormente, se observa una tendencia a la disminución en la concentración de antocianos debido a que, desde las fases iniciales de la vinificación, se ven implicados en diferentes reacciones químicas como oxidación, copigmentación, polimerización, precipitación, adsorción, etc. (Ribereau-Gayón et al., 2006). INTRODUCCIÓN 34 Los taninos, al ser más solubles en medio alcohólico, se solubilizan más lentamente. Durante la maceración prefermentativa, sin etanol en el medio y a temperaturas moderadas, su extracción es muy limitada. Posteriormente, la aparición de etanol y el aumento de la temperatura, suponen un aumento del poder extractante del líquido, y una mayor degradación celular. De esta forma se favorece una mayor difusión de compuestos menos accesibles como los taninos más polimerizados, los unidos a las proteínas de las membranas vacuolares y a los polisacáridos de las paredes celulares (González-San José, 2005). Es necesario distinguir entre los taninos de la piel y los de las semillas, ya que su cinética de extracción es también diferente. Los taninos de la piel comienzan a solubilizarse conjuntamente con los antocianos, si bien su extracción se prolonga más tiempo. Por el contrario, los taninos de las semillas no se solubilizarán hasta la mitad de la fermentación, cuando el alcohol haya disuelto la cutícula. La evolución de la intensidad cromática del vino durante el encubado es acorde a la extracción de los distintos compuestos fenólicos anteriormente descrita. Desde el estrujado de la uva, se produce un aumento notable del color del vino debido a la extracción de los antocianos, alcanzándose un máximo al final de la fase prefermentativa. Durante este periodo, el incremento de intensidad está además favorecido por las interacciones no covalentes que se establecen entre los antocianos de la uva con otros compuestos cedidos al mosto (fundamentalmente fenoles simples) mediante reacciones de copigmentación. Por el contrario, durante la fermentación alcohólica puede producirse una ligera disminución en el color del vino, ya que la presencia de alcohol produce la ruptura de los complejos de copigmentación (Casassa, 2017). Posteriormente, en la fase posfermentativa, la intensidad colorante puede volver a incrementar, debido a que los antocianos reaccionan con los taninos extraídos en la fase fermentativa, formando complejos más estables y dando inicio a las reacciones de polimerización. La Figura 28 muestra la cinética de extracción de los distintos compuestos fenólicos durante el encubado, distinguiendo la maceración prefermentativa, fermentativa y postfermentativa, junto con los cambios en la intensidad colorante. INTRODUCCIÓN 35 Figura 28. Evolución de la extracción de los distintos compuestos fenólicos de la uva durante las distintas fases del encubado (Adaptado de Ribereau-Gayón et al., 2006). 2.3. Equilibrio de los antocianos en el vino Los antocianos del vino, debido a su carácter resonante, son compuestos químicos muy reactivos y, por tanto, muy sensibles a reacciones de modificación de su color. Entre los factores de la vinificación que afectan en mayor medida su estabilidad se encuentran las variaciones de pH, presencia de SO2 y O2, incrementos de temperatura y la asociación con otras moléculas mediante reacciones de copigmentación. Todas estas reacciones son reversibles con la única excepción de la reacción de oxidación que comportaría la pérdida irreversible del color del vino (Zamora, 2003).  Efecto del pH En disoluciones acuosas como el vino (hidroalcohólica, 12% etanol), los antocianos se encuentran en formas químicas con distintas propiedades cromáticas cuyo equilibrio depende directamente del pH, tal y como se muestra en la Figura 29 (Basilio & Pina, 2016). A pH muy ácido ( 1) predomina el catión flavilio (AH+), de color rojo y estable. Entre pH 2 y 4, la transferencia de protón, convierte la forma flavilio en la anhidrobase quinónica (A), de color azul. Entre pH 5 y 6, en una reacción más lenta, predominan dos especies, la forma hemiacetal (B2; formada por el ataque nucleofílico del agua al catión flavilio en posición 2), la cual se encuentra a su vez en equilibrio con las formas chalcona cis y trans (Cc y Ct), todas ellas incoloras. A valores de pH superiores a 7, las chalconas sufren oxidación, transformándose de manera irreversible hacia ácidos fenoles incoloros o de color pardo-amarillo, produciéndose por tanto la degradación del color rojo original. INTRODUCCIÓN 36 Figura 29. Equilibrio de las formas antociánicas en disoluciones acuosas en función del pH (Fuente: Basilio & Pina, 2016) Debido a este efecto, en el vino tinto, con valores medios de pH comprendidos entre 3 y 4, aproximadamente el 80% de los antocianos se encuentran en las formas hidratadas incoloras (Figura 30). Sin embargo, a esos valores de pH, el vino presenta una intensidad colorante mayor de la que le correspondería, debido al mecanismo de estabilización del catión flavilio en el equilibrio mediante interacciones no covalentes con otros componentes del vino (copigmentación), y a la formación de nuevos pigmentos (Zamora, 2003). Figura 30. Cambios en la proporción de las diferentes especies antociánicas de acuerdo al pH (Adaptado de Ribereau-Gayón, 2006).  Efecto del ion bisulfito De forma parecida, la presencia del anión bisulfito (HSO3-), procedente del dióxido de azufre utilizado como antioxidante y antiséptico durante la vinificación, también comporta una decoloración del catión flavilio por un mecanismo semejante, produciendo un complejo incoloro (Figura 31). Esta reacción explica la decoloración de pH del vino AH+ A B C INTRODUCCIÓN 37 los vinos tintos tras el sulfitado, aunque debido a la reversibilidad de la combinación, el color reaparece al ir disminuyendo los iones bisulfitos de forma natural en el vino. Figura 31. Formación de aductos incoloros antociano-iones bisulfito.  Efecto de la oxidación y la temperatura Los compuestos fenólicos son los principales componentes de los mostos y vinos capaces de oxidarse dando lugar a modificaciones de color (pardeamiento). Esta oxidación puede ocurrir por la acción de enzimas endógenas (destaca la polifenoloxidasa, PPO), exógenas de la uva (provienen de microorganismos o preparaciones enzimáticas enológicas), o bien por un proceso químico de autooxidación. Los antocianos son compuestos bastante inestables a la oxidación cuando se encuentran en forma libre, y su estabilidad parece aumentar con el número de grupos metoxilo del anillo B y disminuye al incrementar los grupos hidroxilo. La oxidación enzimática predomina más en los mostos, en los que existe una intensa actividad polifenoloxidásica puesto que la enzima PPO es liberada con el estrujado y prensado de las uvas. En cambio, en vinos las enzimas quedan prácticamente inactivas por lo que el proceso de oxidación química adquiere más importancia. Esta degradación se ve muy favorecida cuando se eleva la temperatura. Evidentemente la degradación de los antocianos comporta una pérdida irreparable de color del vino y por tanto es una de las reacciones que deben limitarse para favorecer la estabilización de la materia colorante del vino. Por estas razones, los vinos se deben conservar protegidos de luz, de la exposición al oxígeno, y a temperaturas moderadas.  Copigmentación En el vino tinto, la copigmentación es un proceso natural basado fundamentalmente en uniones no covalentes entre compuestos fenólicos. Generalmente, el fenómeno se produce en medio acuoso y entre los antocianos en su forma catión flavilio y otros compuestos fenólicos, usualmente no pigmentados, que actúan como copigmentos INTRODUCCIÓN 38 (Boulton, 2001; Trouillas et al., 2016). Estas uniones se producen a través de puentes de hidrógeno π–π entre los anillos aromáticos de los antocianos y de los copigmentos gracias a la estructura plana que tienen ambos, formándose una estructura tipo “sándwich” (Figura 32). Esta conformación impide que las moléculas de agua accedan a la estructura del catión flavilio y, en consecuencia, queda protegido ya que se imposibilita la hidratación hacia la forma incolora. La copigmentación es un fenómeno que ocurre naturalmente en vinos tintos debido a la coexistencia de antocianos de la uva y una gran cantidad y diversidad de otros fenoles procedentes del hollejo y semillas (flavonoles y flavanoles), así como de la pulpa (ácidos fenólicos como el caftárico). Estas reacciones estabilizan la forma coloreada de los antocianos a valores de pH en los que deberían predominar las formas incoloras, y por tanto contribuyen al color del vino de forma importante (hasta el 30-50% del color total), sobre todo en etapas iniciales de la vinificación (Trouillas et al., 2016). Figura 32. Mecanismo de copigmentación (Trouillas, 2016) La copigmentación produce además modificaciones en las propiedades espectrales del catión flavilio. Habitualmente lleva asociado un efecto hipercrómico y batocrómico, con un aumento de la intensidad de color y un cambio hacia tonos más azulados (Boulton, 2001). Estos efectos suelen caracterizar el color de vinos tintos jóvenes, que exhiben típicamente tonalidades rojo-azuladas de gran intensidad (Versari et al., 2007). La efectividad de estos efectos radica en factores externos como la temperatura y el pH, y también factores internos como la concentración y la naturaleza del pigmento y copigmento implicados en esta reacción (Gordillo et al., 2012; Trouillas et al., 2016). Así, como se ha podido comprobar en trabajos previos (Eiro & Heinonen, 2002), el efecto de copigmentación aumenta con el grado de metoxilación y glicosilación por lo INTRODUCCIÓN 39 que la malvidina 3-glucósido, antociano mayoritario en el vino, experimenta un importante efecto de copigmentación. Por otro lado, algunos flavonoles (miricetina y quercetina) y ácidos hidroxicinámicos (cumárico o cafeico) son compuestos que presentan una gran efectividad en la estabilización de los antocianos del vino (Gómez- Míguez et al., 2006). Esta efectividad se debe a la conformación más plana que poseen estos compuestos fenólicos y por ello, la proximidad y el apilamiento pimento/copigmento es mayor. Por otra parte, otros compuestos fenólicos como los flavanoles (epicatequina y catequina) generalmente no son tan eficaces como los flavonoles debido a su conformación menos planar (Gordillo et al., 2012). Sin embargo, dentro de esta familia, se ha podido comprobar que determinados flavan-3-oles monoméricos pueden tener un mayor contacto con los antocianos debido a factores como la presencia de un grupo hidroxilo adicional en el anillo B, tal y como sucede con la (−)- epigallocatequina. Igual que ocurre con la presencia con otros sustituyentes en el anillo B como el pirogalol (Teixeira, N. et al., 2013). La copigmentación en el vino tinto, además de establecerse entre antocianos y otros compuestos incoloros de distinta naturaleza (copigmentación intermolecular), también se puede producir entre distintas moléculas de antocianos entre sí (autoasociación) o entre el grupo acilado y el grupo cromóforo del mismo antociano (copigmentación intramolecular) (Figura 33). A su vez, se ha descrito que pigmentos derivados antociánicos como las oaklinas, propios de procesos de envejecimiento, también pueden participar en este tipo de reacciones favoreciendo la estabilidad del color del vino en etapas avanzadas de la vinificación (Sousa et al., 2014). Figura 33. Tipos de copigmentación, según las moléculas implicadas. IntramolecularAutoasociación Intermolecular INTRODUCCIÓN 40 2.4. Evolución y estabilización del color durante la vinificación. Coincidiendo con el final de los procesos fermentativos y tras el descube, junto con las reacciones descritas en el apartado anterior (decoloración por sulfitado, oxidaciones enzimáticas y copigmentación), la polimerización de los compuestos fenólicos es uno de los procesos predominantes en las fases de estabilización y/o envejecimiento del vino (Ribereau-Gayón et al., 2006). La polimerización engloba un conjunto de reacciones muy complejas que pueden establecerse entre distintos tipos de fenoles. Así, los flavanoles monoméricos y sus formas oligoméricas y poliméricas (procianidinas y taninos condensados), presentan una clara tendencia a condensar entre ellos o con los antocianos, de forma directa o bien con mediación de etanal. Como resultado de la polimerización, comienzan a formarse en el vino los denominados pigmentos antociánicos derivados (De Freitas & Mateus, 2011). Estos pigmentos de nueva formación se generan cuando se establecen enlaces covalentes en los complejos de copigmentación iniciales ente los pigmentos antociánicos monoméricos (originales de la uva) y los copigmentos. Los distintos tipos de pigmentos antociánicos derivados descritos en vinos incluyen los piranoantocianos (vitisinas y sus productos derivados, metilpiranoantocianinas, aductos antociano-vinilfenol, aductos antociano-vinilcatequina, portisinas, etc.), derivados antociano-flavanol por condensación directa, y derivados antociano-flavanol mediados por acetaldehído. Algunas de estas estructuras se muestran en la Figura 34. Figura 34. Estructura química de algunos pigmentos antociánicos derivados. Se estima que aproximadamente el 50% del color de vinos de más de un año de edad puede deberse a estos compuestos poliméricos, aumentando este porcentaje en vinos con mayor envejecimiento. Una característica común de los pigmentos derivados es su INTRODUCCIÓN 41 mayor grado de polimerización y resistencia a reacciones de degradación que los antocianos libres. Sus propiedades cromáticas también son distintas, mostrando la mayoría de ellos tonalidades rojo-anaranjadas y menor intensidad cromática. De esta forma, se explica la evolución del color desde etapas iniciales de la vinificación desde tonalidades rojo-azuladas (propias de antocianos libres y copigmentados) hacia colores rojo-anaranjados y más apagados o pardos, propios de la polimerización y oxidación de taninos, pero a su vez más estables (Khoo et al., 2017). La condensación de taninos y antocianos se puede producir a través de 3 mecanismos: condensación A-T, condensación T-A y condensación A-T con un puente etilado (He et al., 2008; Li & Sun, 2017). La condensación A-T está basada en la reacción en la que los antocianos se comportan como agentes electrófilos a través de la carga positiva del catión flavilio y los taninos presentan un carácter nucleofílico debido al exceso de electrones en los C6 y C8, posiciones en las que el antociano reacciona, generando un xantilio amarillo. Posteriormente, este compuesto evoluciona a un flaveno incoloro (A+-T) el cual puede presentar tonos rojos en presencia de oxígeno (AO-T), estableciéndose un estado de equilibrio entre ambas formas: A+-T ↔AO-T Por otro lado, la condensación T-A se basa en que a pH ácido los taninos se pueden hidrolizar formando un carbocatión, el cual puede reaccionar con antocianos bajo la forma carbinol (AOH). Esta reacción produce un complejo incoloro que se colorea seguidamente de rojo anaranjado después de su deshidratación. Esta reacción se produce en ambientes reductores y se ve favorecida por la temperatura y por la concentración de los antocianos en el vino. La condensación Antociano-Tanino con un puente etilado se produce gracias a la presencia de etanal o acetaldehído en el medio, producido a través de varios mecanismos como la oxidación de etanol, la actividad microbiana o por la descarboxilación del ácido pirúvico. Este aldehído puede reaccionar de manera irreversible con los taninos en las posiciones 4 y 8, igual que con los antocianos en la forma de carbinol neutra. El compuesto formado presenta un color carmesí estable evitando la oxidación, limitando la oxidación y por ello tonos amarillentos (Canuti et al., 2012). Esta unión entre antocianos y taninos puede producirse de menara similar a través del ácido glioxálico, el cual procede de la oxidación del ácido tartárico. A través de este mecanismo se pueden formar compuestos incoloros, que rápidamente evolucionan hacia compuestos que presentan color amarillo (Fulcrand et al., 1997; He et al., 2012). INTRODUCCIÓN 48 peso de la masa de vendimia comienza a fermentar produciendo CO2, que desplaza al O2 que hay en el depósito. Esta operación provoca que las levaduras pasen de una respiración aeróbica a anaeróbica, propiciando la atmósfera idónea para que cada grano inicie su propia fermentación intracelular (Gómez-Míguez & Heredia, 2004). El proceso produce una rotura de los hollejos, produciendo un vino con escasa graduación inicial. Una vez finalizada la fermentación intracelular, las partes sólidas son estrujadas para extraer el mosto restante y realizar una segunda fermentación, que puede durar entre 7 y 9 días, dando como resultado vinos más ligeros y afrutados. Con respecto a la composición fenólica, se ha confirmado que el contenido en antocianos en vinos elaborados por maceración carbónica es menor al de los elaborados por vinificación tradicional, siendo vinos con colores más claros (Sun et al., 2001, Gómez-Míguez & Heredia, 2004). Con respecto al contenido fenólico total, se han descrito resultados variables según la variedad de uva con la que se aplicó la maceración carbónica (Pellegrini et al., 2000). En algunos casos, se ha observado que el contenido total de fenoles, así como de catequinas y procianidinas aumenta (Lorincz et al. 1998; Sun et al., 2001). Aparte de las técnicas basadas en la modificación de las condiciones de maceración, otros procedimientos para modular la extracción de fenoles se basan en el uso de enzimas pectolíticos. Estos enzimas han demostrado eficazmente aumentar el color de los vinos tintos gracias a su efecto de ruptura de las células de los hollejos, facilitando por tanto la liberación de los pigmentos. La pureza de estos enzimas es de gran importancia en los efectos conseguidos en el vino, ya que la presencia de B- glucosidasas puede provocar la hidrólisis de los antocianos en sus agliconas, las cuales son mucho menos estables. El uso de estos enzimas durante la maceración ha demostrado ser una técnica eficaz para el aumento de la concentración de antocianos en los vinos tintos, al igual que sucede con otros compuestos polifenólicos (Watson et al., 2000). El tipo de enzima, el momento de la adición y el tipo de uva son factores que determinan la efectividad de esta técnica (Guerrand & Gervais, 2002; Sacchi et al., 2005; González-Neves et al., 2016). Tecnologías no térmicas de procesado: Recientemente, se han probado el uso de tecnologías emergentes como los ultrasonidos, las altas presiones y el campo eléctrico pulsado, para desarrollar nuevas prácticas de vinificación en tinto, con el objetivo de aumentar el rendimiento mediante la reducción del tiempo de producción, que permite a la bodega optimizar recursos y espacios (Clodoveo et al., 2016) INTRODUCCIÓN 49 Adición de chips: Desde su aprobación por le UE (CE 1507/2006), los chips de roble (trozos o virutas procedentes de las barricas) se han usado en los últimos años como alternativa a la crianza tradicional en barrica en etapas avanzadas de la vinificación, como se ha podido comprobar en numerosos trabajos, obteniendo interesantes resultados en la estabilización del color (Cejudo et al., 2011; Baiano et al., 2016; Dumitriu et al., 2016). Con esta práctica se aportan al vino compuestos fenólicos como ácidos fenólicos (gálicos, elágico, vainíllico, entre otros) y fundamentalmente taninos hidrolizables; además, compuestos aromáticos como furfural, guaiacol y otros. Los taninos hidrolizables no se encuentran de forma natural en la uva, por lo que el único origen de su presencia en el vino es el contacto con la madera. Por otro lado, más recientemente, en otros trabajos se han utilizado chips de roble durante las etapas pre y postfermentativas para mejorar la posterior estabilización del color del vino en etapas más avanzadas. Este aporte suplementario de chips produjo vinos más oscuros y con tonos más azulados debido a la mejora de los procesos de copigmentación. Sin embargo, este efecto depende de la dosis y del momento de aplicación (Gordillo et al., 2013; Gordillo et al., 2016; Kyraleou et al., 2016). 4. APROVECHAMIENTO DE SUBPRODUCTOS DE LA UVA. LAS SEMILLAS La elaboración de vino produce diferentes subproductos que se generan en distintas etapas de la vinificación, como el despalillado (raspones), prensado y estrujado (orujos), decantación y clarificación (lías) y procesos de limpieza de los equipos y maquinaria que están en contacto con la materia prima (aguas residuales o lodos) (Figura 37). Figura 37. Principales subproductos generados por la industria vitivinícola. La industria enológica genera en Europa aproximadamente 14.5 millones de toneladas de residuos al año, y sólo en España entre 2 y 3 millones de toneladas (Ruggeri et al., 2009; Teixeira et al., 2014). Los orujos constituyen el 62% de los subproductos producidos, seguidos de las lías (14%), rapones (12%) y lodos (12%). Estos INTRODUCCIÓN 50 subproductos son ricos en compuestos orgánicos como proteínas, lípidos, carbohidratos, vitaminas, minerales, fibra, así como compuestos fenólicos (Mendes et al., 2013; Dwyer et al., 2014), cuyo contenido puede variar en función del tipo de subproducto, variedad de uva y proceso de vinificación (Bustamante et al., 2008).  Los orujos son el subproducto sólido mayoritario de la vinificación, y representa del 20 al 25% (p/p) de la masa de vendimia. Está constituido por la mezcla de hollejos, semillas, raspones y restos de pulpa, en proporciones variables, que se obtiene tras el estrujado y prensado de la uva (1 kg de orujo por 6 L de vino producido) (Mendes et al., 2013). Su composición se caracteriza por altos contenidos en agua (50-70%) y lignina (17-24%), y bajos en proteínas (4%), sustancias pécticas y celulosas como los polisacáridos mayoritarios (Teixeira et al., 2014). A su vez, destaca por ser rico en compuestos fenólicos, entre los que destacan flavonoles, flavanoles, ácidos fenólicos y resveratrol (Casas et al., 2010; Jara-Palacios et al., 2015; 2016). La composición del orujo de uva puede variar notablemente en función del tipo de vino, tinto o blanco, ya que se encuentran fermentados y no fermentados, respectivamente (Figura 38). El mosto de uva blanca no suele fermentar con las partes sólidas de la uva, por lo que su orujo es más rico en compuestos fenólicos (Jara-Palacios et al., 2014a). Sin embargo, el mosto de uva tinta fermenta junto con las partes sólidas de la uva, por lo que la composición fenólica de sus orujos dependerá de las condiciones de maceración (tiempo, temperatura, etc.), siendo, en general, menos rica que la de los orujos de uva blanca excepto, como es lógico, en contenido en antocianos. Estas diferencias son determinantes para su aprovechamiento y uso industrial (Pedroza et al., 2013). Figura 38. Orujo de uva procedente de uva tinta (a) y uva blanca (b). a) Orujo de uva tinta b) Orujo de uva blanca INTRODUCCIÓN 51 A su vez, cada uno de los componentes en que se puede fraccionar el orujo (restos de raspón, hollejos y semillas), constituyen, en sí mismos, subproductos de interés industrial.  El raspón representa sobre el 14% del total de los residuos sólidos y el 3-5% de la uva procesada (Figura 39). Es una materia prima fundamentalmente lignocelulósica (lignina, celulosa, hemicelulosa) y rica en taninos de grado medio de polimerización (16%). Como se explicó anteriormente, suele eliminarse antes del estrujado de la uva para evitar los sabores astringentes y aromas herbáceos no deseables. Aun así, algunos restos permanecen en la masa de vendimia, siendo por tanto un componente más del orujo. Actualmente, su valor comercial como subproducto es relativamente bajo, aprovechándose principalmente como alimento para animales o para tratamientos agronómicos de mejora del suelo, aunque puede ser una fuente interesante de fibra dietética y antioxidantes. Figura 39. Raspones de uva  El hollejo representa aproximadamente el 50% del orujo, aunque la proporción hollejo/semilla puede variar según diferentes factores como la variedad. En su composición destaca su contenido en proteínas (5-12%), cenizas (2-8%), azucares reductores (1-70% dependiendo del proceso de estrujado y prensado), y su contenido en fibra (60% en extracto seco). Además, es rico en fenoles como flavonoles, taninos de mayor grado de polimerización, pero menor de galoilación y, en uva tinta, distintos tipos de antocianos. Esta composición lo hace especialmente interesante como materia prima para obtener ingredientes bioactivos de origen natural, aunque tradicionalmente se han usado para elaborar compost o incluso eran desechados como residuos en áreas. Por tanto, el desarrollo de nuevas estrategias industriales para optimizar la extracción de estos compuestos es fundamental para un mejor aprovechamiento del hollejo de orujo de uva. INTRODUCCIÓN 52  Las semillas representan una proporción variable del orujo, desde el 15% hasta el 50%. Son ricas en fibra (hasta un 40%), grasas y aceites esenciales (16%), proteínas (12%), y compuestos fenólicos (7%), y otros compuestos minoritarios como carbohidratos o minerales (Garcia-Jares et al., 2015). La grasa de la semilla es un aceite de alto valor comercial, rica en ácidos grasos poliinsaturados, de gran interés nutricional, aunque también fácilmente enranciable. Es de especial interés su contenido fenólico, ya que contiene entre el 60 y el 70% del total de fenoles extraíbles de la uva, aunque durante la maceración solo se extrae una pequeña proporción. Así, las semillas se consideran una fuente rentable de antioxidantes naturales para diversas industrias como la farmacéutica, cosmética y alimentaria, que actualmente comercializan extractos de semilla ricos en fenoles. El aprovechamiento por separado de las semillas como subproducto enológico hace necesario el diseño de sistemas industriales de procesamiento y separación a partir del orujo, que garanticen un adecuado rendimiento económico y de tiempo de procesado. Ricas en compuestos antioxidantes naturales, las semillas secadas adecuadamente pueden almacenarse durante largos periodos de tiempo sin que se degraden significativamente (Harrington, 1972). Figura 40. Sistema industrial para la separación de semillas a partir de orujo de uva (Fuente: The GRAPEVINETM Magazine). Tradicionalmente, la valorización de los subproductos descritos se ha focalizado principalmente en usos directos sin prácticamente tratamiento previo, como la elaboración de fertilizantes para el suelo, la producción de biomasa o la producción de alimentos para el ganado. Sin embargo, se ha podido comprobar en relación a la alimentación animal que algunos taninos dificultan la digestibilidad de estos subproductos de uva (Frutos et al., 2004; Foiklang et al., 2016). En cuanto a la INTRODUCCIÓN 53 producción de fertilizantes, se ha demostrado que algunos polifenoles procedentes de las uvas presentan efectos antimicrobianos que dificultan el compostaje (Bustamante et al., 2007). A su vez, debido a las altas cantidades de residuos producidas durante los últimos años, su estacionalidad y a los problemas medioambientales que producen (contaminación de suelo, malos olores, desarrollo de plagas de insectos, etc.) se han buscado alternativas medioambientales más sostenibles. Existe una mayor concienciación por parte del sector público y privado por la sostenibilidad medioambiental junto a la búsqueda de la eficiencia operacional y, por lo tanto, económica en la eliminación de estos residuos. Así, una alternativa ha sido la utilización de los orujos de uva como materia prima para la extracción de diferentes compuestos como el aceite de las semillas, o los ácidos tartárico y cítrico, además para la producción de alcoholes para la generación de energía o la elaboración de bebidas espirituosas (Teixeira et al., 2014). Por su parte, los compuestos fenólicos obtenidos a partir de los orujos de uva poseen múltiples propiedades biofuncionales como su alto poder antioxidante, por lo que son aprovechados por la industria alimentaria y farmacéutica ya que su consumo prolongado disminuye el riesgo de enfermedades degenerativas (González-Paramás 2004). La extracción y la estabilidad de los compuestos responsables del color del vino puede modularse con determinadas prácticas enológicas como la adición suplementaria de copigmentos fenólicos en distintas fases de la vinificación (Parker et al., 2007; Harbertson et al., 2012), tanto en forma de extractos comerciales o mediante el uso de fuentes naturales que los contengan, como es el caso de las semillas. Las semillas y los extractos obtenidos de ellas son ricos en fenoles que, cedidos al vino, contribuyen de manera importante a las propiedades sensoriales de astringencia y amargor y, por su capacidad de estabilización de la materia colorante, al color (Lorrain et al., 2013; García-Estévez et al., 2017). El objetivo de la adición exógena de semillas o de sus extractos en las etapas iniciales de la vinificación es mejorar la proporción copigmentos/pigmentos en el vino e incrementar el tiempo de contacto entre ellos para, así, favorecer niveles iniciales de copigmentación más elevados, evitar pérdidas de pigmentos por oxidación y asegurar la formación de pigmentos más estables (Darías-Martín 2001; Álvarez et al., 2009). INTRODUCCIÓN 54 En algunas ocasiones, se utiliza la adición de taninos enológicos comerciales, procedentes de extractos de semilla. El Codex Alimentarius clasifica los taninos enológicos comerciales como aditivos, con el código E-181 (Codex Alimentarius Commission, 2009). Por otro lado, el Codex Enológico Internacional, donde se recopilan las descripciones de los principales productos químicos utilizados en la elaboración y conservación de vinos, los incluye con el código Oeno 12/2002 (OIV, 2006), y los clasifica para su uso en enología como coadyuvante de clarificación de vinos y mostos, y particularmente, en vinificación en tinto, como coadyuvante de afinado, buscando la estabilización de la materia colorante y la estructuración armónica de los vinos. Los taninos enológicos comerciales son extractos que pueden proceder de diferentes especies vegetales, como la agalla de nuez, de maderas ricas en taninos o de la piel o semillas de las uvas. Para que los taninos procedentes de hollejos y semillas de uva puedan tener el reconocimiento de tanino comercial, su contenido en catequina debe ser superior a 50 mg/g o poseer un contenido en taninos proantociánicos superior a 0.5 mg/g. La concentración de estos taninos depende de su origen botánico, de su proceso de obtención (atomización, liofilización, evaporación, etc.), del tipo de disolvente empleado (etanol, agua, etc.) y del tiempo de extracción aplicado. Estos compuestos están permitidos en un gran número de países y su uso está legalmente controlado por la normativa específica de cada uno (Galpin, 2006). En España, el uso de taninos enológicos se ajusta a la normativa de la Unión Europea, están permitidos como coadyuvante en la clarificación y afinamiento de mostos y vinos (OIV, 2006). Los taninos comerciales tienen una amplia aplicabilidad en la mejora de sensaciones gustativas y aromáticas, en la inhibición de enzimas con poder oxidante o en la mejora en la estabilidad del color a través de interacciones con los pigmentos antociánicos (Bautista-Ortín et al., 2005; Obradovic et al., 2005). El efecto sobre la estabilidad del color de los taninos comerciales depende en gran medida de su origen. Así, se pudo comprobar que los taninos provenientes de semillas de uva muestran mejores resultados en la estabilización e incremento del color del vino durante su envejecimiento que los procedentes de otras fuentes como el hollejo de la uva (Álvarez el al., 2009; Canuti el al. 2012). A su vez, la efectividad de los taninos de semillas sobre el color del vino depende de otros factores como la naturaleza del tanino, la dosis aplicada y el momento de adición, dando lugar a diferentes resultados, en muchos casos contradictorios. Neves et al. (2010) estudiaron el efecto de dos tipos de taninos comerciales procedentes de semillas: GSE100 y GSE300, este último con mayor concentración en flavanoles monoméricos y procianidinas. Ambos productos se INTRODUCCIÓN 55 adicionaron antes y justo después de la fermentación, en dos proporciones (200 y 600 mg por litro de vino), obteniéndose resultados completamente diferentes sobre el color. El aumento de la intensidad de color fue más eficaz en adiciones de los taninos GSE300 posteriores a la fermentación y a concentraciones mayores (600 mg por litro de vino). Sin embargo, trabajos posteriores mostraron resultados no concordantes con este estudio, encontrándose que adiciones prefermentativas de taninos procedentes de semillas tuvieron un efecto más eficaz en la estabilización del color del vino durante procesos de envejecimiento que adiciones postfermentativas, principalmente en adiciones a alta concentración (Bautista-Ortín et al., 2007; Canuti et al., 2012; Liu et al., 2013). No obstante, la adición de taninos comerciales no siempre ha mostrado tener un efecto positivo en la estabilidad de los antocianos y el color del vino. Según Chen et al., (2016), la adición de taninos, principalmente a altas concentraciones, afectó negativamente a la concentración de pigmentos estables como vitisina A, vitisina A-Ac y vitisina B. De forma similar, Parker et al. (2007) mostraron cómo la adición pre y postfermentativa de taninos comerciales de semillas no produjo diferencias en las propiedades colorimétricas de vinos tras un proceso de envejecimiento de dos años. Por otro lado, Harbeston et al. (2012) encontraron que la adición en altas dosis de taninos comerciales de semillas produjo sensaciones gustativas negativas en vinos. La adición de semillas frescas, es decir, procedentes de orujos de uvas no agotados durante la vinificación, constituye otra posibilidad para enriquecer el vino con compuestos fenólicos. A pesar de que estas prácticas han sido poco estudiadas hasta el momento, parecen mostrar una considerable efectividad en la mejora de las características cromáticas de los vinos tintos. Tienen la ventaja de no necesitar tratamientos previos de extracción como ocurre con el uso de taninos comerciales, lo cual supone un ahorro económico y una mayor facilidad operacional en su aplicación (Versari et al., 2013). A su vez, en comparación con la adición del orujo de uva completo, la adición de semillas frescas podría disminuir las adsorciones de la materia colorante cuando la cantidad adicionada es elevada (Revilla et al. 1998; Gordillo et al, 2014) debido a su menor volumen, pero con el beneficio de aportar una importante riqueza fenólica (Nogales-Bueno et al., 2017c). En particular, con la adición de semillas se aporta al vino, fundamentalmente, flavan-3-oles monoméricos (catequina, epicatequina, galocatequina, y epigaloca- INTRODUCCIÓN 56 tequina), y polímericos (proantocianidinas y taninos condensados) (Monagas et al., 2003; Shi et al., 2003; Jackson, 2008). Un estudio realizado por Kovac et al. (1995) puso de manifiesto que la adición de semillas de uva mejoró la estabilización del color y aumentó la intensidad, mientras que, por el contrario, otros autores no encontraron una relación positiva entre la adición de mayores cantidades de semillas en la maceración y la posterior estabilización del color del vino (Canals et al., 2008). Sin embargo, estudios más recientes han confirmado la efectividad de la adición suplementaria de semillas en la mejora del color del vino en comparación con la adición de otras partes de la uva como los raspones, que producen una disminución de la intensidad de color y la cantidad de antocianos (Puskas & Miljić, 2012 ; VenuGopal et al., 2018). No obstante, factores como el estado de madurez de la uva o la variedad necesitan ser estudiados en mayor profundidad ya que determinan diferencias importantes en la concentración polifenólica total en las semillas, en la proporción de las formas monoméricas y poliméricas de los flavanoles, así como en su extractabilidad. Semillas sobremaduras En regiones de clima cálido como el sur de España, determinadas variedades de uva blanca (Pedro Ximénez, Moscatel o Palomino) son sometidas a un proceso de sobremaduración y/o deshidratación parcial o total, para la elaboración principalmente de vinos dulces tradicionales, que se caracterizan por presentar un contenido en azúcar superior a 50 g/L y contenidos en alcohol elevados. Tradicionalmente, el proceso de sobremaduración se realiza por exposición directa al sol de las uvas (“asoleo”) cuando estas alcanzan en la planta un grado de maduración de aproximadamente 16 °Bé. Estos racimos se vendimian y se extienden sobre el suelo en lugares adaptados para la pasificación denominados “paseras” (Figura 41), durante un tiempo variable entre 7 y 20 días, según las condiciones climáticas, la variedad de uva y el tipo de vino dulce que se desee elaborar. Durante el secado en las paseras, las temperaturas diurnas pueden superar los 40 °C y los valores nocturnos en pocas ocasiones están por debajo de 18 °C (Serratosa et al., 2008). INTRODUCCIÓN 57 Figura 41. Paseras de uva y proceso de pasificación. La pasificación de las uvas es un proceso complejo de deshidratación que induce numerosos cambios físicoquímicos en las bayas. Debido a la exposición a las altas temperaturas, se produce una pérdida de agua que conlleva una concentración de los componentes de la pulpa, alcanzando, en el caso del azúcar, los 20 a 24 °Bé. Durante el proceso, las uvas se voltean diariamente con el fin de obtener una concentración de los componentes uniforme en toda la baya. Es importante que la deshidratación sea moderada, con el fin de evitar una evaporación excesiva de la humedad de la pulpa, que dificultaría posteriormente el prensado de los granos. Paralelamente a este aumento en azúcares, se van produciendo cambios estructurales y sensoriales de la uva pasificada. Así, la pérdida progresiva de agua produce en la baya una reducción del volumen y un aumento de la fragilidad de los hollejos, acompañado de una modificación hacia colores más pardos y oscuros. Se generan aromas a café y caramelizados debidos a compuestos como la acetoína, 2-feniletanol, 4-butirolactona y isobutil e isoamil alcoholes (Moreno-Vigara & García-Mauricio, 2013). El producto final del proceso de pasificación son uvas pasas de las que se obtienen mostos muy oscuros con un elevado contenido en azúcar, mayor de 400 g/L (Ruiz et al., 2010). En relación a los metabolitos secundarios, se ha comprobado que, debido al estrés hídrico, las altas temperaturas y la radiación solar, durante el proceso de pasificación se activan en la planta enzimas involucrados en la síntesis de nuevos compuestos fenólicos y su polimerización, especialmente en algunos órganos como las semillas (Díaz et al., 2001; Muir et al., 2011; Dumitriu et al., 2015; Bontpart et al., 2016). La generación de estos nuevos compuestos depende de la intensidad con la que ocurre el proceso de pasificación, como el nivel de deshidratación de la uva y el grado de sobremaduración alcanzado (Bellincontro et al., 2004; López de Lerma et al., 2013; Peinado et al., 2013). Además de estos factores exógenos, también existen otros factores propios de la uva como puede ser la variedad Materiales y Métodos MATERIALES Y MÉTODOS 63 1. MUESTRAS Para realizar los estudios incluidos en esta Tesis Doctoral se emplearon muestras de diferentes tipos. A modo de resumen, destacar que se elaboraron 15 vinos, de los que se analizaron un total de 69 muestras. Como fuente de fenoles para las vinificaciones se emplearon semillas sobremaduras de una variedad de uva blanca, lo que supuso un total de 3 muestras de semillas analizadas. Asimismo, se realizaron ensayos en disoluciones modelo, para lo cual se utilizaron disoluciones de antocianos y extractos fenólicos de dos variedades de semillas, por lo que, en total fueron 6 extractos preparados y analizados y 21 disoluciones analizadas. Estas muestras se analizaron por diferentes técnicas. Los detalles de estas muestras se describen en este apartado. 1.1. Semillas sobremaduras Las semillas de uva blanca utilizadas en los diferentes ensayos que componen esta Tesis Doctoral se obtuvieron, principalmente, a partir de subproductos de vinificación proporcionados por diversas bodegas localizadas en zonas vitivinícolas de Andalucía. Las características de estas semillas fueron las siguientes: - semillas de variedad Pedro Ximénez, obtenidas a partir de orujos de uvas sobremaduras (24 °Bé) proporcionados por la Bodega La Aurora S.C.A (Montilla, Córdoba), perteneciente a la DOC Montilla-Moriles, generados en la elaboración del vino dulce típico de esta región, en las campañas 2014 y 2016. - semillas de variedad Moscatel, obtenidas a partir de orujos de uvas sobremaduras (24 °Bé), proporcionados por la Bodega Málaga Virgen S.L (Fuente de Piedra, Málaga), perteneciente a la DOC Málaga, generados en la elaboración de los vinos naturalmente dulces de esta DOC, en la campaña 2016. - semillas de variedad Zalema, obtenidas a partir de orujos de vinificación en blanco (10 °Bé), proporcionadas por la Cooperativa Vitivinícola Nuestra Señora del Socorro (Rociana del Condado, Huelva), perteneciente a la DOC Condado de Huelva, en la campaña 2016. En el caso de las variedades Moscatel y Pedro Ximénez, las semillas se separaron del resto de partes sólidas del orujo (hollejos y raspón) utilizando, consecutivamente, dos tamices de plástico de tamaño de luz de 4.5 x 4.5 mm y 2 x 2 mm, se limpiaron con agua sulfitada (1000 mg metabisulfito sódico/L) y se secaron cuidadosamente. Las MATERIALES Y MÉTODOS 64 semillas de Zalema se obtuvieron directamente de las uvas maduras, previo a ser sometidas a la acción del sol durante 16 días, en un proceso de exposición directa en pasera. Paralelamente, se tomaron racimos de uva y se sometieron a la misma acción directa del sol, comprobándose que alcanzaban una graduación de 27 °Bé. Posteriormente, y en función de su destino, en unos casos las semillas se utilizaron en fresco en vinificaciones de la misma campaña de recolección, y en otros se congelaron para ser utilizadas en vinificaciones u otros ensayos en campañas posteriores. 1.2. Extractos fenólicos de las semillas sobremaduras Las semillas de uva que constituyeron las muestras se sometieron a la extracción de su contenido fenólico para ser caracterizadas químicamente en función de la variedad o del grado de maduración, así como para su uso en ensayos modelo. Para ello, se liofilizaron, previa congelación a -80 °C y, posteriormente, se sometieron a molienda mediante sucesivas molturaciones (5x10 segundos) en un molino de pulverizado hasta obtener un polvo fino y homogéneo. A partir de este triturado de semilla, utilizando diferentes condiciones de extracción (tipo de disolvente, peso de muestra liofilizada, proporción de disolvente), se prepararon los extractos fenólicos utilizados en los ensayos. En concreto, se aplicaron los siguientes protocolos de extracción: - Jara-Palacios et al. (2014b) (método usado en los Capítulos 1 y 4 de esta Memoria): 5 g de polvo de semillas liofilizadas se maceran con 25 mL de metanol al 75% (v/v) durante 1 hora en agitación. La mezcla se centrifuga 15 minutos a 4190 g y se recoge el sobrenadante. Para asegurar la completa extracción, esta operación se repite 2 veces más, se unifican los sobrenadantes y se elimina el metanol a vacío en concentrador. El concentrado se disuelve hasta un volumen fijo (50 mL) con agua y finalmente se pasa a través de un filtro de Nylon de 0.45 µm antes de su análisis. - Jara-Palacios et al. (2014c) (método usado para los ensayos de copigmentación del Capítulo 3 de esta Memoria): 2 g de polvo de semilla liofilizada se maceran con 30 mL de vino sintético durante 12 horas en agitación. La mezcla se centrifuga 10 minutos a 4190 g. Se recoge el sobrenadante, se disuelve hasta un volumen fijo (50 mL) con vino sintético y se pasa a través de un filtro de Nylon de 0.45 µm. Material Instrumentos y equipos de laboratorio:  Balanza analítica de precisión Mettler Toledo AE-260 (Barcelona, España)  Liofilizador Cryodos-80, Telstar Varian DS 102 (Telstar Industrial, S.L., Barcelona, España)  Molino IKA A11-B (IKA®, Staufen, Alemania)  Centrífuga Allegra X-12R Centrifuge (Beckman Coulter, Barcelona, España) MATERIALES Y MÉTODOS 65  Concentrador Plus/Vacufuge Plus (Eppendorf Ibérica S.L.U., Madrid, España)  Agitador Vortex IKA Genios 3 (IKA®, Staufen, Alemania)  Agitador orbital (VWR, Barcelona, España)  pH-metro CRISON GLP 21 (Crison Instruments, S.A., Barcelona, España)  Micropipetas (Eppendorf Ibérica S.L.U., Madrid, España)  Tubos Falcon  Matraces aforados de 1 y 5 mL Reactivos:  Metanol 99.8% (v/v) (Panreac, Barcelona, España)  Etanol 96% (v/v) (Panreac, Barcelona, España)  Acido tartárico (Merck, Darmstadt, Alemania)  Cloruro de sodio (Panreac, Barcelona, España)  Ácido clorhídrico 37% (v/v) (Panreac, Barcelona, España)  Hidróxido de sodio (Panreac, Barcelona, España) Preparación de vino sintético (12% de etanol, pH 3.60): Disolver 5 g de ácido tartárico en 120 mL de etanol (96 %) en matraz de 1 L y enrasar con agua destilada. Ajustar el pH a 3.60 añadiendo ácido clorhídrico 0.5 M o hidróxido sódico 0.1 M. Ajustar la fuerza iónica con 11.68 g de cloruro sódico (0.2 mol/L, PM= 58.44). Confirmar el pH. 1.3. Vinos Los ensayos se realizaron sobre vinos monovarietales, para cuya elaboración se utilizaron uvas de la variedad tinta Syrah, vendimiadas en su estado óptimo de madurez glucoacídica (tecnológica). Todas las vinificaciones (campañas 2015 y 2016) se realizaron a escala semi-industrial, en la bodega experimental que el grupo de investigación Color y Calidad de Alimentos de la Universidad de Sevilla, tiene ubicada en las instalaciones de la Cooperativa Nuestra Señora del Socorro, en Rociana del Condado (Huelva). Tanto la uva Syrah utilizada como la bodega donde se elaboraron los vinos para los ensayos pertenecen a la Denominación de Origen Condado de Huelva. El grupo de investigación “Color y Calidad de Alimentos” mantiene una relación contractual (arts. 68 y 83 L.O.U.) desde 1993 con este Consejo Regulador, con el que también colabora en diversos trabajos de investigación sobre la mejora de la calidad de los vinos de esta denominación de origen, cubriendo, hasta la fecha, una buena parte de las etapas de la producción y elaboración de vinos que ha tenido una importante repercusión en la zona, como la implantación de nuevas técnicas o modificación sustancial de las actuales, y avances en la metodología de control enológico por medidas rápidas, objetivas y no destructivas. En la elaboración de los vinos para los diferentes estudios se siguieron pautas enológicas comunes, con las diferencias específicas que definieron cada uno de los MATERIALES Y MÉTODOS 66 ensayos. Así, de manera general, una vez despalilladas y estrujadas, las uvas se encubaron en depósitos de PVC, de 220 litros para realizar la fermentación, en todos los casos, los vinos se elaboraron por triplicado. La fermentación alcohólica se produjo, en unos casos espontáneamente con levaduras autóctonas y en otros por adición de levaduras del género Saccharomyces cerevisiae, realizándose un remontado diario durante esta etapa (entre 6 y 7 días). Tras la fermentación, se realizó el descubado del vino, con separación de las partes sólidas de la uva. El vino se trasegó a depósitos de acero inoxidable de 50 L, procurando un contenido homogéneo, posteriormente se realizó la fermentación maloláctica inoculando bacterias lácticas Oenococcus oeni en una concentración de 14 mL/hL. Al finalizar esta etapa, se realizó un segundo trasiego de los vinos a depósitos de acero inoxidable de 50 litros, ajustando los niveles de SO2 libre y total a 60 y 100 mg/L, respectivamente, donde se mantuvieron durante el correspondiente periodo de estabilización.  En la elaboración de los vinos tintos para el estudio de adición prefermentativa de semillas sobremaduras Pedro Ximénez (Capítulo 1 de esta Memoria) se utilizaron, aproximadamente, 900 kg de uvas tintas de la variedad Syrah, con las que se obtuvieron 2 tipos de vinos, por triplicado: un vino control y un vino con adición de semillas sobremaduras (3 g/L). Para este ensayo se utilizaron semillas obtenidas en la vendimia anterior, que se conservaron en congelación a -20°C hasta su uso. La fermentación se realizó espontáneamente y, una vez acabada, el vino se descubó a 9 depósitos de acero inoxidable más pequeños. Los vinos permanecieron en estos depósitos durante un periodo de 5 meses de estabilización, tras el cual se embotellaron y se pasaron otros 5 meses de estabilización en botella. Durante todo el proceso se tomaron muestras (100 mL) para el seguimiento analítico: al inicio de la maceración fermentativa (día 1 desde el encubado), a mitad de la fermentación alcohólica (día 4 desde el encubado), en el momento después del descube (día 7 desde el encubado) y muestras durante el periodo de estabilización y envejecimiento en botella (días 20, 135, 225 y 315 desde el encubado). En total se midieron 42 muestras.  Para el ensayo de adición postfermentativa de semillas sobremaduras Pedro Ximénez (Capítulo 2 de esta Memoria) se utilizaron 900 kg de uva con las que se elaboraron 6 vinos monovarietales Syrah. La fermentación se realizó con levaduras seleccionadas (25 g/L Saccharomyces cerevisiae), tras lo cual, el vino limpio pasó a 9 depósitos de acero inoxidable más pequeños para obtener 3 tipos de vinos, por triplicado: un vino control, un vino con MATERIALES Y MÉTODOS 67 adición de semillas sobremaduras (12 g/L) durante 30 días y un vino con adición de semillas sobremaduras (12 g/L) durante 30 días más una segunda adición de semillas sobremaduras (12 g/L) durante 30 días. Para este ensayo se utilizaron semillas frescas, obtenidas en la misma vendimia. Tras este proceso, los vinos sufrieron un nuevo trasiego a depósitos de acero inoxidable de 50 L, donde se mantuvieron durante 150 días de estabilización, contados desde la primera adición postfermentativa de las semillas sobremaduras. Se tomaron muestras (50 mL) en 4 puntos del proceso: inicial (día 0, adición de semillas), al retirar las semillas (día 30 para SW y 60 para DW) y al final del periodo de estabilización (día 150). En total se analizaron 27 muestras. Material y productos  Depósitos de PVC de 220 litros (In Vía, Barcelona, España) para fermentación.  Depósitos de acero inoxidable 50 L (In Vía, Barcelona, España) para estabilización.  Bomba Novax 30M (Rover Pompe SNC, Polverara, Italia)  Levaduras Saccharomyces cerevisiae (Viniferm BY, Agrovin, Ciudad Real, España)  Bacterias lácticas Oenococcus oeni (VINIFERM Oe 104, Agrovin, Ciudad Real, España) 1.4. Disoluciones modelo Los ensayos de copigmentación se llevaron a cabo en sistemas modelo, mediante mezclas de una disolución antociánica con diferentes extractos fenólicos procedentes de 2 variedades de semillas sobremaduras: Pedro Ximénez y Moscatel. Para este ensayo se utilizaron semillas obtenidas en la vendimia anterior, que se conservaron en congelación a -20°C hasta su uso. La disolución de antocianos se preparó a partir de hollejos de uva tinta comerciales liofilizados y molidos, que se disolvieron en vino sintético (12% de etanol, pH 3.60). A esta disolución antociánica se añadieron los extractos procedentes de las semillas para obtener diferentes concentraciones de compuestos fenólicos (100, 200 y 400 mg/L). En todos los casos, la concentración final de antocianos en la disolución modelo fue la misma (50 mg/L). Todas las disoluciones se prepararon por triplicado en viales de vidrio de 5 mL, y se almacenaron en oscuridad a 25 °C durante 2 horas para asegurar que se alcanzara el equilibrio antes de tomar la primera medida espectrofotométrica. Las disoluciones preparadas se guardaron en ausencia de luz durante 90 días, realizándose 8 muestreos a lo largo de este periodo: a las 2 horas y en los días 1, 6, 13, 20, 34, 56, y 90 desde el comienzo de la reacción. MATERIALES Y MÉTODOS 68 Material Instrumentos y equipos de laboratorio:  Viales vidrio de 5 mL  pH-metro CRISON GLP 21 (Crison Instruments, S.A., Barcelona, España)  Micropipetas (Eppendorf Ibérica S.L.U., Madrid, España) Reactivos:  Etanol 96% (v/v) (Panreac, Barcelona, España)  Acido tartárico (Merck, Darmstadt, Alemania)  Cloruro de sodio (Panreac, Barcelona, España)  Ácido clorhídrico 37% (v/v) (Panreac, Barcelona, España)  Hidróxido de sodio (Panreac, Barcelona, España)  Antocianos de uva tinta (IFC Solutions, New Jersey, USA) 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 2.1. Parámetros físico-químicos En el seguimiento y control enológico de las muestras de mosto y vino se aplicaron técnicas de análisis fisicoquímico general (densidad, azúcares reductores, acidez total, pH, anhídrido sulfuroso total y libre, acidez volátil y fenoles totales). Todos los análisis se realizaron por triplicado, expresando el resultado como la media aritmética y desviación estándar. 2.1.1. Densidad relativa (CEE, 1990; OIV, 1990) La densidad relativa de un mosto o un vino a 20 °C (d20 C) es la relación entre su masa volúmica y la del agua a esa misma temperatura. La medida directa de la densidad relativa se realizó por el método aerométrico, basado en la flotabilidad que presenta un cuerpo de peso constante. Para ello, se utilizó un densímetro o aerómetro (el usado en enología se denomina mostómetro) formado por un cuerpo cilíndrico central hueco, de vidrio, con un bulbo en su extremo inferior que contiene un material pesado (generalmente plomo) que le permite flotar en posición vertical, y una escala en el extremo superior, graduada en unidades de masa volúmica a 20 °C. Mediante la correspondiente conversión del valor de la densidad relativa, empleando tablas específicas, se pudo conocer la cantidad de azúcares totales existentes en el mosto o el vino, expresada en grados Baumé (°Bé) o g/L. Material Instrumentos y equipos de laboratorio:  Probeta 250 mL  Mostómetro PROTON 10119, GAB SISTEMATICA ANALITICA SL (Barcelona, España), calibrado a 20 °C, escala densidad: 0.999-1.130 MATERIALES Y MÉTODOS 69  Termómetro OPAL -10+35 °C, con apreciación de 0.5 °C, GAB Sistemática Analítica SL (Barcelona, España) Procedimiento analítico Llenar una probeta de 250 mL con mosto o vino. Introducir el termómetro en la probeta y realizar la lectura al cabo de 1 minuto. Retirar el termómetro e introducir el mostómetro en la probeta, con un movimiento giratorio y dejar reposar. Una vez en reposo, leer en la escala la densidad. En caso de que la muestra contenga cantidades importantes de CO2, se debe eliminar por agitación o ultrasonidos, antes de realizar la medida de la densidad. Cálculos Realizar la medida por triplicado para considerar la media aritmética como resultado. Utilizar las tablas específicas de conversión para la transformación del dato de densidad en grados Baumé o g/L de azúcares totales. 2.1.2. Azúcares reductores (Rebelein, 1973; CEE, 1990; OIV, 1990) Este análisis se realizó con el objetivo de conocer la concentración residual de azúcares que presentaron los vinos para determinar el final de la fermentación alcohólica. En términos generales, se considera que un contenido en azúcares reductores ≤ 2 g/L es indicativo de que la fermentación alcohólica ha finalizado. El fundamento del método de Rebelein (1973) se basa en las propiedades reductoras de glucosa y fructosa sobre las sales cúpricas. Estos azúcares, a la temperatura de ebullición, son oxidados por un exceso de solución alcalina de Cu2+ que contiene tartrato para mantener el metal en solución, al tiempo que el Cu2+ se reduce a Cu+. El exceso de Cu2+ se valora por yodometría, con adición de un exceso de KI en medio ácido. Las reacciones que tiene lugar son las siguientes: Material Instrumentos y equipos de laboratorio:  Balanza analítica de precisión METTLER TOLEDO AE-260 (Barcelona, España)  Placa calefactora Agimatic (Selecta, Barcelona, España)  Matraz aforado 100 mL  Erlenmeyer de 50, 100, y 250 mL  Bureta graduada de 50 mL  Pipetas graduadas de 0.5, 2, 5, 10 mL Reactivos:  Acetato neutro de plomo (Merck, Darmstadt, Alemania)  Carbonato de sodio (Sigma Aldrich, Madrid, España)  Hidróxido sódico 0.1M (Panreac, Barcelona, España) Azúcar + Cu 2+ Azúcar ox. + Cu++ Cu2+ 2Cu2+ exc + 2e-2Cu+ 2 I-I2-+ 2e- 2Cu 2+ + 2 I-2Cu+ + I2 MATERIALES Y MÉTODOS 76 Procedimiento analítico Rectas de calibrado Antocianos: Disolución patrón de malvidina-3-O-glucósido (500 mg/L): Pesar con exactitud 0.05 g de malvidina-3-O-glucósido, llevarlo a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con agua ácida (ajustando el pH a 1.5 con HCl). A partir de esta disolución, preparar disoluciones patrón de 10, 25, 50, 100, 200, 350 y 500 mg/L, y analizar mediante HPLC, por triplicado. Obtener la recta de calibrado representando el área de cada disolución patrón frente a su concentración. Flavonoles: Disolución patrón de quercetina (1 g/L): Pesar con exactitud 0.1 g de patrón de quercetina, llevarlo a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con la fase móvil A. A partir de esta disolución, preparar disoluciones patrón de 0, 20, 30, 40, 50, 60, y 70 mg/L, y analizar mediante HPLC, por triplicado. Obtener la recta de calibrado representando el área de cada disolución patrón frente a su concentración. Análisis de la muestra Filtrar la muestra de vino por filtros de nylon de 0.45 μm de tamaño de poro y analizar mediante HPLC. Cálculos Llevar el valor de área obtenido en el análisis cromatográfico a la recta de calibrado y calcular la concentración de los pigmentos antociánicos y flavonoles, expresada en mg/L 2.2.2. Determinación de pigmentos antociánicos y derivados por HPLC-DAD-MS La determinación de la composición de antocianos y pigmentos derivados en el ensayo con disoluciones modelo (Capitulo 3) se llevó a cabo en colaboración con el Grupo de Investigación en Polifenoles de la Universidad de Salamanca. La separación e identificación de los antocianos y pigmentos antociánicos derivados se llevó a cabo según el método descrito por Alcalde-Eon et al. (2014). Se utilizó un cromatógrafo líquido Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) acoplado a espectrómetro de Masas API 3200 Qtrap (Applied Biosystems Sciex, Darmstadt, Alemania), equipado con una fuente de ionización por electrospray (ESI), un analizador de masas triple cuádruplo, y un software Analyst 5.1 para el tratamiento de datos. Como fase estacionaria se utilizó una columna de fase reversa AQUA C18 de 150 x 4.6 mm de diámetro interno y tamaño de partícula de 5 µm (Phenomenex®, Torrance, CA, USA). Las fases móviles utilizadas y las condiciones cromatográficas empleadas para conseguir la separación de los distintos compuestos se muestra en la Tabla 5. Las muestras se diluyeron (1/5) en agua ácida (ajustando el pH a 1 con HCl, y se pasaron a través de filtros de nylon de 0.45 μm de tamaño de poro. Los espectros se registraron entre 220 y 600 nm, con detección de antocianos a 520 nm. Se adquirieron los espectros en modo de ion positivo entre 150 y 1100 m/z. El espectrómetro de masas fue programado para hacer una serie de barridos MATERIALES Y MÉTODOS 77 consecutivos: uno del espectro total de masas (full mass), otro correspondiente al espectro total de masas generado tras la ruptura del ion mayoritario del primer barrido (MS2), y el tercero correspondiente al espectro de masas generado tras la ruptura del fragmento mayoritario obtenido en el MS2 (MS3). Tabla 5. Condiciones del análisis cromatográfico Fase móvil A Agua / ácido trifluoroacético (99.9: 0.1 v:v) Fase móvil B Acetonitrilo Temperatura 35 °C Flujo 0.5 mL/min Material Instrumentos y equipos de laboratorio:  Cromatógrafo líquido HPLC Agilent Technologies HP 1100 (Palo Alto, CA, USA)  API 3200 Qtrap (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania)  Columna AQUA C18 (5μm, 150 mm×4.6mm ) Phenomenex (Torrance, CA, USA)  Software Analyst 5.1  Filtros de jeringa de nylon 13 mm x 0.45 μm Millipore (Billerica, MA, USA)  Microviales 2 mL de Agilent Technologies  Micropipetas (Eppendorf Ibérica S.L.U., Madrid, España) Reactivos:  Acetonitrilo calidad HPLC (Merck, Darmstadt, Alemania)  Ácido tricloroacético (Merck, Darmstadt, Alemania)  Agua Milli-Q 2.2.3. Determinación de flavan-3-oles y ácidos fenólicos mediante RRLC-DAD La separación, identificación y cuantificación de flavanoles (monoméricos, procianidinas y oligoméricos) y ácidos fenólicos (benzoicos e hidroxicinámicos) en las muestras (Capítulos 1, 2, 3 y 4 de esta Memoria) se llevó a cabo según el método descrito por Jara Palacios et al. (2014b). Para ello se utilizó un cromatógrafo líquido de resolución rápida (RRLC) Agilent 1290 Series (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), con bomba cuaternaria, desgasificador de vacío, compartimento termostatizado para la columna, inyector automático, detector de diodos y software ChemStation. Como fase estacionaria se utilizó una columna Poroshell C18 (2.7 µm, 5 cm x 4.6 mm). Las fases móviles y las condiciones cromatográficas empleadas se muestra en la Tabla 6. Previo al análisis cromatográfico, las muestras se pasaron a través de filtros de nylon de 0.45 μm de tamaño de poro. MATERIALES Y MÉTODOS 78 La identificación de los compuestos individuales se realizó por comparación con los tiempos de retención y los espectros de absorción UV-visible de patrones comerciales, así como por comparación con datos bibliográficos obtenidos a través de técnicas cromatográficas con detección por espectrometría de masas (Jara-Palacios et al., 2014b). La cuantificación de los ácidos benzoicos, flavanoles monoméricos, procianidinas, y flavanoles oligoméricos se realizó a 280 nm, y la de ácidos cinámicos y sus derivados a 320 nm, mediante el método de calibración externa, usando diferentes patrones fenólicos (catequina, procianidinas B1 y B2, ácidos gálico y p-cumárico), y expresando los resultados en mg/L para vinos y en mg/100 gramos de materia seca en semillas. La catequina se utilizó como patrón para cuantificar los flavanoles monoméricos y procianidinas de los vinos y semillas del ensayo desarrollado en el Capítulo 1 de esta Memoria. Por otra parte, patrones de catequina y de procianidinas B1 y B2 se utilizaron respectivamente para cuantificar los flavanoles monoméricos y las procianidinas presentes en los vinos y semillas de los ensayos desarrollados en los Capítulos 2, 3 y 4 de esta Memoria. Tabla 6. Condiciones del análisis cromatográfico Fase móvil A Agua / ácido fórmico (99.9: 0.1 v:v) Fase móvil B Acetonitrilo Temperatura 25 °C Flujo 1.5 mL/min Volumen inj. 0.5 μL Gradiente Fase móvil A Fase móvil B 0-5 min 95% 5% 5-20 min 50% 50% 20-25 min 100% 0% Material Instrumentos y equipos de laboratorio:  Cromatógrafo líquido UPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA): bomba cuaternaria (G4204A), desgasificador de vacío (G1316C), compartimento termostatizado para columna (G1330B), inyector automático (G4226A), detector de diodos (G4212A), ChemStation  Columna C18 Poroshell 120 (2.7μm, 5cm×4.6mm) Agilent (Palo Alto, CA, USA)  Balanza analítica de precisión METTLER TOLEDO AE-260 (Barcelona, España)  Equipo de filtración para fases móviles Millipore (Billerica, MA, USA) MATERIALES Y MÉTODOS 79  Filtros HN-0.45 μm Millipore (Billerica, MA, USA)  Filtros de jeringa de nylon 13 mm x 0.45 μm Millipore (Billerica, MA, USA)  Microviales 2 mL Agilent Technologies  Micropipetas (Eppendorf Ibérica S.L.U., Madrid, España) Reactivos:  Acetonitrilo calidad HPLC (Merck, Darmstadt, Alemania)  Ácido fórmico 98% (v7v) ( Panreac, Barcelona, España)  Patrones fenólicos individuales (Extrasynese, SIGMA y Fluka)  Agua Milli-Q Procedimiento analítico Recta de calibrado Como ejemplo representativo de la recta de calibrado de los distintos patrones fenólicos, se muestra el procedimiento correspondiente a la catequina. Disolución madre de catequina (1 g/L): Pesar con exactitud 0.1 g de patrón de catequina, llevarlo a un matraz aforado de 100 mL y enrasar con la fase móvil A. A partir de la disolución madre, preparar 5 disoluciones patrón de 0, 5, 10, 20, y 100 mg/L, y analizar mediante UPLC, por triplicado. Análisis de la muestra Filtrar la muestra de extracto de semilla/ vino mediante filtros de nylon de 0.45 μm de tamaño de poro y analizar mediante UPLC. Cálculos Llevar el valor de área obtenido en el análisis cromatográfico a la recta de calibrado y calcular la concentración de los fenoles, expresada en mg/L. 2.3. Medida del color por Colorimetría Triestímulo. Espacio CIELAB. La medida del color se realizó por aplicación de la Colorimetría Triestímulo, a partir del espectro de transmisión en el rango visible (380-770 nm). Para registrar los espectros se utilizó un espectrofotómetro UV-visible Agilent 8453 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), con detector de fotodiodos. Material Instrumentos y equipos de laboratorio:  Espectrofotómetro UV-vis Agilent 8453 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).  Conjunto filtración Millipore (Billerica, MA, USA): jeringa, portafiltro y filtros AP20 13 mm.  Cubetas de vidrio de 2 y 10 mm de paso de luz.  Centrífuga Orto Alresa (Madrid, España).  Tubos de centrífuga.  Micropipetas (Eppendorf Ibérica S.L.U., Madrid, España) Procedimiento analítico Antes de realizar la medida de color en vino es necesario centrifugarlo durante 5 minutos en centrífuga a 3500 rpm, y filtrar el sobrenadante a través de un filtro Millipore AP20. Para muestras con carbónico es necesario desgasificar en baño de ultrasonido para eliminar burbujas que interfieren en la medida. Medida espectrofotométrica: llenar una cubeta de vidrio de 2 mm de paso de luz para vino o 10 mm de paso de luz para soluciones modelo con la muestra filtrada. Registrar el espectro de MATERIALES Y MÉTODOS 80 absorción en la región visible (380-780 nm), a intervalos constantes de 2 nm, utilizando agua destilada como blanco de referencia. Cálculos Se ha considerado el espacio uniforme CIE 1976-(L*a*b*) (CIELAB). Para su cálculo, los espectros se integran utilizando el programa de cálculo original CromaLab (Heredia et al., 2004), que tiene en cuenta las recomendaciones de la Comisión Internacional de Iluminación (CIE, 2004). Aplicando el método de ordenadas ponderadas, el espectro de transmisión visible de la muestra se pondera en intervalo constantes de 2 nm, según los factores característicos de las condiciones visuales de referencia elegidas (Wyszecki y Stiles, 1982): Observador patrón de 10° e Iluminante estándar D65, que se corresponde con la luz de día natural. Mediante las ecuaciones propuestas por la CIE, se obtienen los valores triestímulo X, Y, Z, que definen el color de la muestra y que son el punto de partida para calcular el resto de las variables cromáticas del espacio de color CIELAB (L*, a*, b*, C*ab, y hab) y el parámetro colorimétrico diferencia de color ΔE*ab. La coordenada L* recibe el nombre de claridad y puede tomar valores entre 0, correspondiente al negro, y 100, para el blanco. Las coordenadas colorimétricas a* y b* forman un plano perpendicular a la claridad. La coordenada a* define la desviación del punto acromático correspondiente a la claridad, hacia el rojo si a* > 0, hacia el verde si a* < 0. Análogamente la coordenada b* define la desviación hacia el amarillo si b* > 0, hacia el azul si b* < 0. A partir de ellas se definen dos magnitudes colorimétricas nuevas mediante las expresiones siguientes: El croma, C*ab, es el atributo de la percepción visual conforme al que un área parece saturada respecto a un determinado color o tonalidad. Tiene valor 0 para estímulos acromáticos y, por lo general, no pasa de 150 aunque puede superar ese valor para estímulos monocromáticos El tono, hab, es el color básico de un objeto (azul, amarillo, etc.) definido por su posición angular en un espacio de color cilíndrico. Los valores, por tanto, varían entre 0° y 360°, y para estímulos no cromáticos (a*=0, b*=0) es una magnitud no definida. El parámetro colorimétrico diferencia de color (ΔE*ab), se calcula como la distancia Euclídea entre dos puntos en el espacio tridimensional definido por L*, a*, y b*: ΔE*ab = ((a*)2 + (b*)2)1/2. 2.4. Medida de la copigmentación 2.4.1. Medida por espectrofotometría El método espectrofotométrico para la evaluación del efecto de la copigmentación considera las diferencias de absorbancia que se producen a 520 nm. Material Instrumentos y equipos de laboratorio:  Espectrofotómetro UV-vis Agilent 8453 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).  Cubetas de vidrio de 2 mm y 10 mm de paso de luz.  Conjunto filtración Millipore (Billerica, MA, USA): jeringa, portafiltro y filtros AP20 13 mm  pH-metro CRISON GLP 21 con electrodo combinado de vidrio Ag/AgCl (Crison Instruments, S.A., Barcelona, España)  Balanza analítica ST-510 (Gram Precision, Barcelona, España)  Pipetas graduadas de 5 y 10 mL  Vaso precipitado 50 mL  Matraz aforado de 1 L C*ab = a*2+ b*2 hab = arctg (b*/a*) C*ab = a*2+ b*2 hab = arctg (b*/a*) MATERIALES Y MÉTODOS 81  Micropipetas (Eppendorf Ibérica S.L.U., Madrid, España)  Viales de 5 mL Reactivos:  Disolución hidróxido sódico 0.1 M (Panreac, Barcelona, España)  Disolución ácido clorhídrico 0.5N (Panreac, Barcelona, España)  Disolución tampón de pH 4.00 (Merck, Darmstadt, Alemania)  Disolución tampón de pH 7.00 (Merck, Darmstadt, Alemania)  Disolución de mantenimiento del electrodo del pH-metro (Merck, Darmstadt, Alemania)  Metabisulfito de sodio (Panreac, Barcelona, España)  Acetaldehído puro (Merck, Darmstadt, Alemania)  Disolución acuosa de acetaldehído al 10% (v/v)  Acido tartárico (L+) PRS (Panreac, Barcelona, España)  Etanol 96% (v/v) (Panreac, Barcelona, España)  Cloruro Sódico (Merck, Darmstadt, Alemania) Vinos: se determinó la contribución de antocianos libres, copigmentados y pigmentos poliméricos al color total (Boulton, 1996). Procedimiento analítico Ajuste del pH del vino Calibrar el pH-metro con las disoluciones tampón de pH 7.0 y 4.0. Una vez calibrado, tomar un volumen aproximado de 20 mL de vino y ajustar el pH a 3.6 unidades, añadiendo gota a gota ácido clorhídrico 0.5 M o hidróxido sódico 0.1 M. Preparación de reactivos: Metabisulfito sódico al 20% (m/v): Disolver 2 g de metabisulfito sódico (también puede utilizarse metabisulfito potásico) en 100 mL de agua destilada. Acetaldehído al 10% (v/v): Disolver 2.55 mL de acetaldehído puro en 18 mL de agua destilada. Tratamiento con metabisulfito sódico al 20% Llenar una cubeta de vidrio de 2 mm con la muestra de vino (pH 3.60), aproximadamente 0.5mL, y añadir 10 μL de metabisulfito sódico al 20%. Agitar la cubeta, esperar 1 minuto y medir la absorbancia a 520 nm (A520-S) por espectrofotometría. Tratamiento con acetaldehído al 10% Tomar 2 mL de muestra de vino (pH 3.60) y añadir 20 μL de acetaldehído al 10%. Mantener 45 minutos a 25 C en un vial cerrado, filtrar la muestra y medir la absorbancia a 520 nm (A520-A) por espectrofotometría. Tratamiento de dilución con vino sintético Tomar 100 µL de vino (pH 3.60) y diluir con 1900 µL de vino sintético. Mantener a 25 C durante 45 minutos en un vial cerrado y medir la absorbancia a 520 nm (A520-D). Cálculos A partir de los valores de absorbancia a 520 nm medidos (A520-A, A520-D, y A520-S) se calculan los siguientes índices: contribución de los antocianos copigmentados (%AC), pigmentos poliméricos (%PP), y antocianos libres (%AL) al color total del vino, según las siguientes expresiones: % AC = ((A520-A - (A520-D x 20))/ A520-A) x 100 % PP = (A520-S / A520-A) x100 % AL = (A520-A - (A520-S + (A520-D x 20)))/ A520-A) x100 MATERIALES Y MÉTODOS 82 Disoluciones modelo: se determinó la contribución de la copigmentación al color total en disoluciones de antocianos en vino sintético. Procedimiento analítico Medir la absorbancia a 520 nm (A520-D) de las disoluciones de antocianos con y sin copigmentos añadidos, usando cubeta de vidrio de 10 mm, frente a agua destilada como blanco de referencia. Cálculos La contribución de la copigmentación al color de la disolución de antociano (% copigmentación) se calculó por comparación de la absorbancia a 520 nm de la disolución del pigmento puro (A0) y de sus correspondientes que contenían distintos copigmentos (A), según la siguiente expresión: % copigmentación = (A-A0/A0) x100 2.4.2. Medida por Colorimetría Diferencial La evaluación por Colorimetría Diferencial considera los cambios espectrales en el intervalo completo de longitudes de onda visibles y, por tanto, describe la variación de color completa de manera correcta. La técnica permite medir con exactitud la diferencia de color (E*ab) debida al fenómeno de la copigmentación y, además, interpretar el sentido de esta modificación en términos de variaciones de los atributos psicofísicos del color (tono, claridad y saturación). Procedimiento analítico Registrar el espectro visible completo (380-770 nm) de las muestras (vinos y disoluciones modelo), usando cubeta de vidrio de 2 o 10 mm, frente a agua destilada como blanco de referencia. Cálculos colorimétricos Según la metodología descrita por Gordillo et al. (2012), se aplica la Colorimetría Diferencial y se proponen distintas variables para la evaluación del efecto de la copigmentación. Se define Color Total (E) como la diferencia ΔE*ab entre un color (L*, a*, b*) y el blanco de referencia (L*=100, a*=0, b*=0): Color Total: E= ((L*-100)2 + (a*-0)2 + (b*-0)2)1/2 A partir de los espectros, se obtienen los valores de color total de las muestras con copigmentación (Ec) y sin ella (E0). La comparación de la variación entre pares de muestras, expresada como porcentaje, permite cuantificar la magnitud en que ocurre el fenómeno de copigmentación desde un punto de vista colorimétrico: Magnitud de copigmentación colorimétrica = ((EC-E0)/E0)  100 2.5. Espectroscopia Raman La espectroscopía Raman es una técnica fotónica de alta resolución que proporciona información química y estructural de prácticamente cualquier compuesto orgánico o inorgánico, de manera rápida y no destructiva, permitiendo su identificación. Se realiza directamente sobre la muestra a analizar, sin necesidad de tratamiento previo. Los MATERIALES Y MÉTODOS 83 análisis Raman fueron realizados en colaboración con el Laboratorio de Sensores Fótónicos del Instituto de Física Aplicada Nello Carrara (CNR), en Florencia (Italia). La técnica consiste en un examen de la luz que dispersa un compuesto químico cuando sobre él incide un haz de luz monocromática. La luz sufre una dispersión inelástica y experimenta ligeros cambios de frecuencia característicos del compuesto analizado, e independientes de la frecuencia de la luz incidente. Se utilizó un espectrómetro Raman BaySpec modelo BRAM-HR-1064 (San José, CA, USA), con una excitación de 1064 nm, cuyo esquema de configuración se muestra en la Figura 42. La potencia del láser se limitó a 300 mW para evitar el daño de la muestra, y fue ligeramente desenfocado sobre la superficie del vial para minimizar la influencia de la heterogeneidad de las semillas trituradas. El tiempo de integración se estableció a 20 segundos y se realizaron 3 lecturas por cada punto para el promedio de cada medida. En este caso, se utilizó un detector con esquema dispersivo que proporciona mayor compactación que las configuraciones de transformada de Fourier, normalmente utilizadas en otros instrumentos Raman. Se empleó un detector InGaAs a -55 °C con resolución espectral de 4 cm-1. Además, se utilizaron simultáneamente tres espectrofotómetros, lo que permitió escanear el rango completo del Raman desde 300 a 3200 cm-1 cada 2 cm-1. Figura 42. Configuración del equipo Raman. Detalles de la iluminación y la detección de la señal retrodispersada. Material Instrumentos y equipos de laboratorio:  Espectrómetro Raman BaySpec modelo BRAM-HR-1064 (San José, CA , USA)  Viales de vidrio de 5 mL Preparación de la muestra  Molino automático IKA A11-B (IKA®, Staufen, Alemania)  Mortero MATERIALES Y MÉTODOS 84 Procedimiento analítico Análisis de la muestra Se trituran las muestras (10 grupos de semillas sobremaduras de uvas de PX, MO y ZA) usando un molino automático, y un posterior molido en mortero para homogeneizar al máximo el triturado. Para este ensayo se utilizaron semillas obtenidas en la vendimia anterior, conservadas en congelación a -20 °C hasta su uso. El resultado de cada grupo se introduce en un vial para su análisis mediante espectroscopía Raman. La medida de cada muestra se realiza en ocho puntos diferentes para contemplar en las medidas la heterogeneidad, y posteriormente, se obtiene el promedio. 2.6. Métodos estadísticos En el tratamiento de los datos químicos, espectroscópicos y colorimétricos se aplicaron técnicas estadísticas univariantes y multivariantes para la obtención de resultados. 2.6.1. Análisis de la Varianza (ANOVA) En general, el propósito del Análisis de la Varianza (ANOVA) es encontrar diferencias significativas entre los valores medios de un conjunto de datos mediante la comparación de las varianzas. El porcentaje de variabilidad explicada por un efecto nos da una medida adecuada de la influencia de dicho efecto en la respuesta. ANOVA es un análisis univariante (para una sola variable) y MANOVA es multivariante (tiene en cuenta el efecto de más de una variable dependiente, simultáneamente). El valor del nivel de significación estadística p representa un índice de descenso de la fiabilidad del resultado, de manera que cuanto mayor es su valor menos se puede confiar que la relación observada entre las variables en la muestra es un indicador fiable de la relación entre las respectivas variables en la población. El valor p representa la probabilidad de error que implica aceptar como válido el resultado observado, es decir, representativo de la población. En la aplicación del ANOVA se asume que las variables incluidas en la comparación presentan una distribución normal. Cuando los datos de la variable no se ajustan a una distribución normal, existen alternativas al ANOVA, como el test de Kruskal-Wallis para comparar diferencias entre grupos de muestras independientes, y el test de Friedman cuando se quiere comparar variables medidas en la misma muestra Para la prueba ANOVA se ha empleado el programa Statistica® vs. 8.0. (StatSoft Inc.: Tulsa, OK, 2007). MATERIALES Y MÉTODOS 85 2.6.2. Análisis de componentes principales (PCA) Habitualmente, al recoger datos de una muestra se toma un elevado número de variables para conseguir la mayor cantidad de información posible. Sin embargo, demasiadas variables obligan a considerar numerosos coeficientes de correlación en el tratamiento estadístico, lo que hace difícil visualizar las relaciones entre las variables, incluso, puede que midan lo mismo bajo distintos puntos de vista. Se hace necesario, entonces, reducir el número de variables. El Análisis de Componentes Principales (PCA) es una técnica estadística multivariante que genera nuevas variables como resultado de la combinación lineal de las variables originales. Consiste en agrupar la mayor parte de la variación observada posible para reducir el número de variables (normalmente a 2 o 3). Las nuevas variables originadas reciben el nombre componentes principales. Están relacionadas entre sí y pueden ordenarse de acuerdo con la información que representan. La primera componente agrupa la mayor parte de variación, la segunda algo menos, y así sucesivamente. Gracias a la reducción de la dimensionalidad de la información, esta herramienta estadística también es adecuada para la visualización de datos. Los tratamientos multivariantes de PCA se llevaron a cabo mediante el software MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, USA). RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 1 90 g), y EC-galato (20.4 mg/100 g). Se comprobó que la concentración de algunos de estos fenoles fue superior a la de semillas no sobremaduras cultivadas en clima cálido, como es el caso de las procianidinas B2, B7 y el tetrámero 1. Cabe destacar que estos compuestos se consideran importantes copigmentos debido a su complejidad estructural y, por ello, notables para proteger los pigmentos del vino tinto. Con respecto a los vinos, los resultados ponen de manifiesto que aquéllos elaborados con adición de semillas sobremaduras presentaron un mayor contenido de antocianos y procianidinas al final de la etapa de maceración, que los elaborados de manera tradicional (12% y 50% más, respectivamente). Durante las fases de estabilización en depósito y crianza en botella, la degradación de los antocianos fue ligeramente mayor en los vinos control. Aunque la diferencia en el contenido antociánico tendió a disminuir entre los vinos durante la crianza en botella, aquellos elaborados con semillas sobremaduras adicionadas presentaron una mayor cantidad de pigmentos al final del proceso de vinificación (tras 5 meses de crianza). Este comportamiento está en concordancia con la concentración de procianidinas, que evitan la degradación de los pigmentos al actuar como copigmentos. Durante la estabilización, se observó que esta concentración fue mayor en los vinos con semillas añadidas. A su vez, se observó la disminución de procianidinas al final de la crianza en botella, debido posiblemente, a reacciones de condensación tanino-tanino y taninoantociano. Con el objetivo de evaluar si las diferencias observadas en la composición fenólica entre los vinos elaborados con y sin adición de semillas sobremaduras fueron significativas a nivel global, se compararon los valores medios de todos los compuestos considerando de forma conjunta los periodos de estabilización y crianza en botella (media± DS, n=12 para cada vino). Estos parámetros se estudiaron junto al porcentaje de copigmentación (%) y a los fenoles totales (mg GAE/L). Se detectaron diferencias significativas globales para los antocianos y procianidinas totales, con contenidos mayores en los vinos de los ensayos con semillas. También se observaron en éstos mayores cantidades de flavanoles totales, aunque en este caso las diferencias no fueron significativas con respecto al vino control. Respecto a compuestos fenólicos individuales, se encontraron diferencias significativas para los pigmentos malvidina-3 glucósido, malvidina-3 acetil glucósido, y los derivados cumaroilados, así como para los copigmentos epicatequina y procianidina B2 3-O- galato. Todos estos compuestos presentaron mayores valores en los vinos con adición de semillas. Otros copigmentos como la catequina y las procianidinas B2 y B7, también RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 1 91 fueron mayoritarias en los vinos elaborados con semillas sobremaduras, aunque estas diferencias no fueron significativas respecto al control. En el caso de los ácidos fenólicos, las cantidades fueron similares en los diferentes vinos debido, posiblemente, a la cinética de extracción, ya que estos compuestos necesitan largos periodos para ser extraídos (Zou et al., 2002). Respecto a la evolución del color durante las fases de maceración fermentativa y estabilización, la tendencia de la claridad L* y el croma C*ab fue similar en ambos vinos. Sin embargo, el comportamiento del tono hab difirió entre ellos. Durante la maceración, el tono de los vinos con semillas adicionadas mantuvo valores más estables, mientras que en los vinos control incrementó. Tras la maceración, se observó que los valores aumentaron progresivamente en ambos vinos, indicando una pérdida de los matices azulados. Este efecto en el tono puede ser debido, en parte, a la transformación progresiva de los antocianos monoméricos de la uva en pigmentos poliméricos en etapas más avanzadas de la vinificación (Gutiérrez et al., 2005), lo que también podría explicar la disminución observada en los valores de C*ab en el tiempo. En términos globales, durante el periodo de estabilización y crianza en botella, los vinos con semillas añadidas mostraron mayores valores de C*ab y menores de hab que los vinos control. Este comportamiento indica que los vinos mantuvieron durante más tiempo una mayor intensidad de color y los matices azulados propios de etapas iniciales de la vinificación, lo que se pudo deber al mayor efecto de la copigmentación en los vinos elaborados con adición de semillas sobremaduras. La copigmentación también podría explicar el diferente comportamiento de la claridad durante las últimas etapas de envejecimiento en botella, ya que los valores de L* se mantuvieron más estable en los vinos con semillas sobremaduras. Con el objetivo de evaluar si las diferencias observadas en los atributos de color individuales eran visualmente apreciables, se calculó la diferencia de color (E*ab) entre los vinos al final de la crianza en botella. El valor obtenido fue de 3.5 u. CIELAB, pudiéndose considerar visualmente apreciable según Martínez et al. (2001). Por otro lado, con el fin de evaluar la estabilidad de color en el tiempo, se calcularon las diferencias de color global (E*ab) para cada vino entre el descube (día 7) y el final de la crianza en botella (día 315). A su vez, también se calcularon las diferencias de claridad, croma y tono (∆L*, ∆C*ab, y ∆hab) para evaluar el sentido de las modificaciones del color en el tiempo. Se comprobó que las diferencias de color globales fueron menores para los vinos elaborados con semillas sobremaduras (E*ab = 10 vs. 11 en vinos control) indicando una menor modificación del color y por tanto una RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 1 92 mayor estabilidad. La modificación global del color en ambos vinos fue debida a mayores cambios en el tono que en el croma y claridad (mayores valores de ∆hab respecto a ∆C*ab y ∆L*). En particular, la magnitud de estos cambios fue menor en los vinos elaborados con semillas, lo cual indica mayor estabilidad de los atributos de color cuantitativo y cualitativo. Estos valores confirmaron el efecto positivo de las mayores cantidades de pigmentos y copigmentos en los vinos tras ser adicionados con semillas sobremaduras. Como principales conclusiones de estos resultados se puede decir: - que las semillas sobremaduras de Pedro Ximénez tienen una gran riqueza en compuestos fenólicos, con importantes cantidades de ácido gálico, epicatequina y procianidina B2 3-O-galato. - que la adición de las semillas sobremaduras en la fase fermentativa de la elaboración de vinos tintos produce un aumento del contenido en compuestos fenólicos en los vinos, que actúan como copigmentos y producen una estabilización química de los antocianos durante las últimas etapas de vinificación. - que esta mayor estabilidad de los pigmentos provocan un efecto cromático positivo, obteniendo vinos tintos con un color más estable, más oscuros y con tonos más azulados durante el proceso de vinificación. RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 2 93 CAPÍTULO 2. IMPACTO EN EL COLOR Y LA ESTABILIDAD DE VINOS TINTOS DE LA MACERACIÓN POST-FERMENTATIVA CON SEMILLAS DE UVA SOBREMADURAS. En: Impact of a post-fermentative maceration with overripe seeds on the color stability of red wines. Food Chemistry. 2019. Vol. 272. Pag. 329-336. Posfermentative second maceration with overripe seeds from white grape by products. Differential colorimetric assessment of the impact on the colour stability of red wine. Poster en Congreso. 10th In Vino Analytica Scientia Symposium. Salamanca (España). 2017 La etapa de maceración es una de las más importantes en la elaboración de vinos tintos. Es la fase en la que el mosto se mantiene en contacto con las materias sólidas de la uva (semillas y hollejos) y, por lo tanto, cuando se extraen compuestos relevantes para el proceso de vinificación. Es el caso de los fenoles, compuestos determinantes de la calidad del vino tinto al estar implicados en su estructura organoléptica (Santos- Buelga & de Freitas, 2009). Sin embargo, la extractabilidad no es igual para los diferentes compuestos fenólicos. Por ejemplo, los antocianos y los flavanoles de bajo peso molecular se extraen en medio acuoso, en las primeras etapas de la maceración, mientras que los flavanoles de mayor peso molecular, los flavonoles y los ácidos fenólicos, son más solubles en soluciones alcohólicas, por lo que se extraen con posterioridad, cuando ya se ha iniciado la fermentación. En algunos casos, además, estos compuestos necesitan largas maceraciones para lograr una correcta extracción, dependiendo su extracción, por tanto, no sólo del medio extractante sino también del tiempo de extracción. No obstante, las maceraciones prolongadas pueden conducir a problemas organolépticos debido al aporte de compuestos responsables de sensaciones amargas y astringencia, fundamentalmente flavanoles monoméricos y procianidinas, aunque estas sensaciones se pueden suavizar a lo largo del tiempo. Por otro lado, estos compuestos fenólicos son fundamentales en la estabilización de las antocianidinas a través de las reacciones de copigmentación. Por lo tanto, es fundamental conseguir los copigmentos apropiados, además de las adecuadas proporciones pigmento/copigmento en el medio para la protección del antociano (Berké & de Freitas, 2007). RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 2 94 Estudios previos han puesto de manifiesto que el porcentaje de copigmentación decrece aproximadamente en un 20% en los primeros 6 meses de vinificación, que cerca del 15% de los antocianos monoméricos desaparecen en los 3 primeros meses y que este porcentaje de degradación aumenta en etapas posteriores (Bimpilas et al., 2016; Rivero et al., 2017). Por otro lado, como se ha podido comprobar en el capítulo anterior la adición de semillas sobremaduras en una etapa temprana de la vinificación como la fermentación aporta copigmentos como epicatequina, ácido gálico y procianidina B2-3-O-galato que protegen los antocianos monoméricos y previenen su degradación durante las etapas posteriores al favorecer el fenómeno de copigmentación, y originan vinos de color más intenso y azulado. No obstante, esta técnica presenta ciertas limitaciones operacionales como obtener semillas de uva blanca en fresco para la vinificación de los vinos tintos. A pesar de estar muy próximas en el tiempo, existe una diferencia temporal de las vendimias de uvas blancas y tintas, lo que obliga a conservar en congelación las semillas de la cosecha anterior. Otro factor es que el tiempo que se mantienen en contacto las semillas durante la fermentación está condicionado por la duración de la propia fermentación, tras la cual se efectúa el descube y eliminación de las partes sólidas, incluidas las semillas que se adicionan, sin que se haya llevado a cabo la extracción completa de algunos fenoles. En este estudio, se ha planteado la evaluación de semillas sobremaduras de Pedro Ximénez (PX) como fuente de compuestos fenólicos en la elaboración de vinos tintos cuando se adicionan en etapas postfermentativas. El propósito es tener la posibilidad de usar las semillas sobremaduras en fresco y de prolongar el tiempo de contacto de las semillas con el vino para mejorar la extracción de fenoles y la proporción copigmento/pigmento en el vino Los objetivos del estudio han sido determinar las condiciones óptimas de la maceración postfermentativa (tiempo de contacto de las semillas y cantidad de semillas), identificar y cuantificar la composición fenólica de los diferentes vinos durante la elaboración por técnicas cromatográficas y espectrofotométricas, así como aplicar la Colorimetría Diferencial Triestímulo para evaluar el efecto de la maceración postfermentativa de las semillas sobremaduras PX sobre el color y la copigmentación de los vinos tintos a lo largo del tiempo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 2 95 PARTE EXPERIMENTAL Para el estudio, se elaboraron 6 vinos tintos de variedad Syrah, cultivadas en la D.O.C “Condado de Huelva”, en la campaña 2016. La fermentación se realizó con inoculación de levaduras seleccionadas Saccharomyces cerevisiae, durante 6 días, a temperatura controlada (20-25 °C) y con remontados diarios. Tras la fermentación alcohólica, el vino se descubó y trasegó a 9 depósitos de menor volumen, en los que se inocularon bacterias lácticas para inducir la fermentación maloláctica. En ese mismo momento, a de los 6 depósitos se adicionaron 12 g/L de semillas sobremadras Pedro Ximénez, dejando otros 3 depósitos sin adicionar, que servirían como vino control (CW) de vinificación tradicional. Los 6 depósitos con semillas se dividieron en dos triplicado de sendos tipos de vinos: 3 depósitos con adición simple postfermentativa de semillas (maceración de semillas durante 30 días, 12 g/L) (SW) y 3 depósitos con adición doble postfermentativa (maceración de semillas durante 30 días, 12 g/L y una segunda maceración posterior de semillas (renovación) durante otros 30 días, 12 g/L) (DW). El control analítico de los vinos se realizó en el momento de la adición de las semillas (día 0), al final de la maceración simple (30 días), al final de la maceración doble (60 días) y al final del proceso de estabilización (150 días desde la primera adición de las semillas). La composición fenólica de los vinos se determinó por técnicas cromatográficas: pigmentos antociánicos y flavonoles mediante HPLC-DAD según Cejudo-Bastante et al. (2016); ácidos fenólicos (benzóicos e hidroxicinámicos) y flavanoles (monoméricos, procianidinas, y oligoméricos) mediante RRLC-DAD, según Jara-Palacios et al. (2014b). El contenido en fenoles totales se determinó mediante el método espectrofotométrico de Folin-Ciocatelteu (Singleton et al., 1965). El porcentaje de copigmentación (%AC) en los vinos se determinó según el método de Boulton (1996). El efecto de la maceración postfermentativa con semillas sobremaduras sobre el color del vino se analizó mediante técnicas espectrofotométricas, obteniéndose las coordenadas de color CIELAB a través del software CromaLab (Heredia et al., 2004). La evaluación del color se llevó a cabo mediante la aplicación de la Colorimetría Triestímulo. Las posibles diferencias significativas entre los vinos con y sin adición de semillas, en relación a la composición fenólica, la copigmentación y el color, se establecieron a través de tratamiento estadístico de los datos (ANOVA, Tukey test, p<0.05). RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 2 96 En los diferentes vinos se identificaron y cuantificaron distintos compuestos fenólicos, en concreto 10 antocianidinas, 6 ácidos fenólicos, 2 flavan-3-oles monoméricos, 4 procianidinas y 7 flavonoles. El efecto sobre el contenido en fenoles en el proceso de maceración se evaluó en el momento del descube de las semillas: 30 días para SW y 60 días para DW. Los vinos macerados con semillas sobremaduras presentaron mayor riqueza en flavanoles, ácidos benzoicos y procianidinas que los vinos elaborados de manera tradicional, CW. Considerando las diferentes familias fenólicas, las que presentaron un mayor incremento de su concentración en los vinos macerados con semillas (% respecto a los vinos control) en el momento del descube fueron: flavanoles (22% en DW y 8% en SW), procianidinas (10% en DW y 8% en SW) y ácidos benzoicos (5% en DW y 2% en SW). También se encontraron diferencias en compuestos individuales como epicatequina, catequina y ácido gálico, siendo mayores sus concentraciones en los vinos DW y SW que en CW. Con respecto a las procianidinas, los vinos DW y SW mostraron una mayor concentración en las procianidinas B1 y B2, y también en la procianidina B2 3-O-galato, pero este último compuesto sólo en los vinos con doble adición de semillas, DW. Estas diferencias en la composición fenólica pudieron ser debidas a la cinética de extracción específica de cada compuesto. Los flavanoles y los ácidos benzoicos necesitan largas maceraciones para su completa extracción en el vino (más extensas en el caso de los ácidos benzoicos). Por esta razón, la técnica de maceración postfermentativa de semillas resultó adecuada para lograr una correcta extracción de flavanoles y, aunque la extracción de ácidos benzoicos fue más limitada, también se lograron incrementos en su concentración. Al final de las maceraciones postfermentivas, los vinos SW y DW mostraron menores cantidades de antocianos monoméricos que los vinos control, CW. Posiblemente, esto se debió a la formación de antocianos poliméricos en reacciones de condensación con otros compuestos que se extraen de las semillas sobremaduras (Gordillo et al., 2014), así como a otros efectos como la adsorción de los antocianos por las semillas sobremaduras adicionadas (Gordillo et al., 2014; 2016). Posteriormente, durante la estabilización, los antocianos monoméricos disminuyeron en todos los vinos debido a reacciones de oxidación, hidratación, adsorción y polimerización (Cejudo-Bastante et al., 2017). Así, al final del periodo de estabilización, los vinos macerados con semillas (SW y DW) presentaron mayor grado de polimerización, lo que significa una mayor concentración de antocianidinas más estables. Flavanoles monoméricos, flavonoles y procianidinas fueron los compuestos RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 2 97 fenólicos no coloreados cuyos contenidos se vieron más afectados en el periodo de estabilización, posiblemente debido a la mayor implicación de estos fenoles en las reacciones de polimerización tanto con las antocianidinas, como con compuestos de su misma naturaleza, como en el caso de flavanoles y procianidinas. Los diferentes tratamientos de maceración con semillas condujeron a diferencias en las características del color del vino, así como su evolución y estabilidad. En este sentido, durante la maceración con semillas sobremaduras, en los vinos SW y DW se produjo un aumento de la claridad (L*) y una disminución del croma (C*ab), de manera que estos vinos en el momento de la eliminación de las semillas (30 y 60 días, respetivamente) presentaron mayores valores de L* y menores de C*ab con respecto a los vinos control, CW. Estos datos están en concordancia con las concentraciones cuantificadas de antocianos monoméricos. Sin embargo, durante la fase de estabilización se produjo el efecto contrario en los vinos con semillas adicionadas, de manera que, al final del proceso de vinificación, los vinos con doble adición de semillas sobremaduras presentaron un color ligeramente más oscuro y más vivo que los vinos control (L*=72.31 vs 74.55 u.; C*ab=25.66 vs 24.23 u., respectivamente), mientras que en los vinos con adición simple de semillas presentaron unos valores intermedios. En cuanto al tono (hab), aunque todos los vinos presentaron valores correspondientes a rojos netos (cercanos a 0°) al final de la vinificación, fueron algo más altos en los vinos elaborados de manera tradicional, siendo significativa (p<0.05) la diferencia con respecto a los vinos de doble maceración. Esto podría ser debido a que la mayor proporción copigmento/pigmento conseguida en los vinos elaborados con adición de semillas sobremaduras conduce a un mayor efecto de copigmentación y, por tanto, protección de los antocianos. Teniendo en cuenta la evolución de todos los parámetros colorimétricos, se calcularon las diferencias de color CIELAB (ΔE*ab) entre los vinos. Tras el periodo de maceración postfermentativa (30 y 60 días para los vinos SW y DW, respectivamente), se produjeron diferencias visualmente apreciables entre los vinos elaborados con semillas añadidas y los vinos control, considerablemente mayores en el caso de los vinos de doble adición (4.1 y 14.9 unidades CIELAB para los pares CW30-SW30 y CW60-DW60, respectivamente). La comparación de los vinos al final de proceso de vinificación (150 días) permitió evaluar el efecto de la adición de semillas sobremaduras sobre el color. Los vinos elaborados mediante maceración postfermentativa con semillas sobremaduras RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 2 98 (SW150 y DW150) presentaron diferencias de color respecto al vino control (CW150), que además fueron visualmente perceptibles (ΔE*ab=3.25 u.) en el caso de DW. Considerando la contribución de cada variable colorimétrica individual a este cambio de color, se comprobó que el tratamiento de doble adición de semillas (DW) produjo, principalmente, cambios en la claridad (%ΔL=77%), seguidos de modificaciones del croma (%ΔC=20%) y del tono (%ΔH=3%). Por otro lado, se evaluó la evolución del color de cada vino en el proceso global de vinificación, desde el momento de la adición de las semillas (día 0) hasta el final de la etapa de estabilización (día 150). El croma disminuyó en todos los vinos (ΔC*ab), con menor modificación en DW. La claridad (ΔL*) aumentó ligeramente en CW y SW y disminuyó en DW (vinos más oscuros). El tono (Δhab) mostró una tendencia ascendente para todos los ensayos, algo menor en SW. En general, las menores diferencias, por tanto la mayor estabilidad, se dio en los vinos con doble maceración. Como principales conclusiones extraídas de los ensayos de la adición postfermentativa de semillas sobremaduras se puede decir: - que permite llevar a cabo periodos más prolongados del contacto entre el vino tinto y las semillas, para mejorar la extracción de los compuestos fenólicos, lo que se pone de manifiesto en los mejores resultados obtenidos en los vinos con doble adición de semillas (DW) que los de adición simple (SW). - que los fenoles extraídos durante la maceración postfermentativa actúan como copigmentos, y evitan la degradación de los antocianos a través de reacciones de copigmentación y polimerización, siendo catequina, epicatequina, acido gálico y las procianidinas B1 y B2, los principales compuestos extraídos mediante esta técnica. - que la adición postfermentativa de semillas sobremaduras tiene efectos positivos sobre el color, produciendo vinos más oscuros, más vivos y rojos más netos, con respecto a los que se elaboran de manera tradicional sin adición de semillas. - que, fundamentalmente en el caso de la doble adición, debido a la acción de los copigmentos extraídos de las semillas sobremaduras se promueve la estabilización del color del vino a lo largo del tiempo y, por lo tanto, se favorece la aptitud para la crianza. RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 3 99 CAPÍTULO 3. EVALUACIÓN DEL POTENCIAL DE COPIGMENTACIÓN DE SEMILLAS SOBREMADURAS POR COLORIMETRÍA DIFERENCIAL En: Copigmentation potential of overripe seeds from sun-dried white grapes on anthocyanins colour and stability by Differential Colorimetry. International Journal of Food Science & Technology Evaluación Colorimétrica Diferencial de la copigmentación entre flavanoles de semilla de uva sobremaduras y antocianos del vino. Poster en Congreso. XII Congreso Nacional de Color. Linares, Jaén (España), 25-27 Sep., 2019 La copigmentación es un fenómeno típico en los vinos tintos que produce, principalmente, dos efectos positivos sobre el color de los antocianos: 1) un aumento de la absortividad del grupo cromóforo, generalmente acoplado aun efecto batocrómico en la max visible, y 2) la estabilización de éstos en su forma coloreada catión flavilio (Trouillas et al., 2016). Además, la copigmentación se considera el primer paso en la formación de pigmentos poliméricos más estables (pigmentos antociánicos derivados) a través de enlaces covalentes. Entre otros constituyentes del vino, los compuestos fenólicos se consideran buenos copigmentos debido a que poseen una estructura plana, por lo que pueden acoplarse de manera más eficaz a la molécula de antociano, también plana, produciéndose la reacción de copigmentación intermolecular. Por lo tanto, la búsqueda de fuentes alternativas de copigmentos fenólicos destinados a mejorar la estabilidad química y colorimétrica de los antocianos del vino es una de las principales áreas de investigación en enología. Como se ha comentado en capítulos anteriores, los procesos de deshidratación postcosecha mediante exposición directa de los racimos al sol a los que se someten algunas variedades de uva blanca, activan mecanismos que favorecen la biosíntesis fenólica y la polimerización de estos compuestos químicos, y, en consecuencia, su concentración progresiva en distintas partes de la uva, como las semillas (Dumitriu et al., 2015). Sin embargo, hasta la fecha, pocos estudios han evaluado el uso de las semillas sobremaduras en la estabilización del color de los antocianos. El potencial de copigmentación de las semillas sobremaduras, relacionado con su composición fenólica, depende de la intensidad y duración del proceso de deshidratación, ya que RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 4 106 reducir la fluorescencia, se desarrollan equipos que funcionan con excitación a 1064nm, lo que lleva a una mayor resolución espectral y con ello, mejores resultados. En este estudio se aplica la espectroscopía Raman con excitación a 1064 nm, como método rápido y no destructivo, con el objetivo de evaluar la capacidad de esta técnica para discriminar semillas sobremaduras en función de su composición fenólica, y predecir su contenido en los principales compuestos fenólicos durante el proceso de sobremaduración. PARTE EXPERIMENTAL Para el estudio se utilizaron semillas de tres variedades de uva blanca sobremaduras, cultivadas en tres zonas vitivinícolas del sur de España: Pedro Ximénez (PX) (D.O. Montilla-Moriles, Córdoba), Moscatel (MO) (D.O. Málaga, Málaga) y Zalema (ZA) (D.O. Condado de Huelva, Huelva), todas ellas con 10 días de sobremaduración. Las semillas se separaron a mano y, una vez limpias, se tomaron 10 grupos de semillas al azar, para cada variedad (PX, MO y ZA). También se realizó el seguimiento de semillas de Zalema durante un proceso de sobremaduración por exposición directa al sol, de 16 días. Se seleccionó esta variedad para el estudio ya que, a pesar de ser la uva autóctona y mayoritaria en la DO Condado de Huelva, y una de las variedades con mayor extensión de cultivo en Andalucía, su conocimiento es aún limitado. El seguimiento se realizó a diario, separando 3 grupos de muestras en cada toma. Las muestras se sometieron a análisis espectroscópico Raman y, como método de referencia, la determinación de fenoles se llevó a cabo mediante RRLC-DAD según Jara- Palacios et al. (2014b). Los datos químicos y espectroscópicos se procesaron mediante MATLAB, aplicando un análisis de componentes principales (PCA) para evaluar diferencias entre variedades, así como a lo largo de la sobremaduración. En el estudio de variedades, la primera fase del análisis Raman incluyó el pretratamiento de los espectros mediante suavizado (media móvil de 5 puntos, repetido 5 veces) y la corrección de la línea de base (entre 2120 y 2820 cm-1, intervalo donde no se generaron bandas espectrales Raman). Para el análisis se seleccionó la región espectral 500-2000 cm-1, donde estuvieron contenidas las mayores bandas Raman. Para las medidas espectroscópicas, las semillas se trituraron y se introdujeron en viales de vidrio. El aspecto granular de la superficie de la muestra (triturado de semillas) causó fuerte variabilidad en la intensidad de la señal Raman, dificultando la extracción RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 4 107 de la información de los espectros. Para minimizar este efecto, realizó una etapa adicional de pretratamiento, restringiendo el análisis a la región 1240-1850 cm-1 y eliminando el fondo del espectro mediante un ajuste polinómico de 3er grado. Los espectros Raman se caracterizaron por tener una banda intensa alrededor de 1600 cm-1, que se ha relacionado en bibliografía con los modos vibratorios del anillo aromático, específicamente de los flavonoides. (Larkin, 2011). De hecho, como se describió en estudios anteriores, esta señal podría deberse a la influencia de flavanoles monoméricos como epicatequina y catequina, o de taninos, compuestos muy abundantes en las semillas de uvas sobremaduras (Nogales et al., 2017b; Mazurek et al., 2018). Las bandas a 1360, 1450 y 1650 cm-1 también se pueden atribuir al efecto de la catequina, principalmente a la vibración de los enlaces C-OH, C-O, -OH y de los anillos aromáticos. Las bandas generadas en la región de 1630 a 1500 cm-1 se pueden atribuir a vibración de ambos anillos aromáticos, mientras que la mayoría de las bandas en longitudes de onda inferiores se pueden atribuir principalmente a la vibración de uno de ellos (Torregiani et al, 2008). Los espectros más intensos se dieron en la variedad ZA y, aunque, en general, el promedio de los espectros de las semillas PX, MO y ZA fueron similares, se observaron diferencias en las absorbancia en determinadas longitudes de onda. ZA y PX mostraron un contraste relativamente más débil que MO entre la intensidad de la señal de Raman a 1619 cm-1 y las señales a 1590 y1657 cm-1 A través de técnicas cromatográficas, se detectaron diferencias cuantitativas entre las diferentes variedades de semillas sobremaduras, siendo las semillas MO las de mayor riqueza fenólica, seguidas por las semillas de ZA y por último de PX (281 ,179 y 108 mg/100 g de extracto seco, respectivamente). Por familia fenólica, los mayoritarios fueron flavanoles totales, con diferentes estados de polimerización (monoméricos, procianidinas y oligoméricos). Las diferencias en la concentración de flavanoles totales estuvieron en concordancia con la intensidad de las bandas Raman a 1360, 1450, 1600 and 1650 cm-1, aunque estas bandas también podrían deberse a otros enlaces como C=C, CH2, HCC, HCO y HOC, procedentes de compuestos químicos de otra naturaleza (polisacáridos, lignina y lípidos) también presentes en las semillas (Nogales et al., 2017a). A partir de los datos Raman, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para el reconocimiento de patrones, con el objetivo de diferenciar las semillas según la variedad, consiguiendo discriminar las variedades con un 96% de varianza total. El PC1 (92%) presentó valores positivos para las semillas de ZA, mientras que fueron RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 4 108 negativos para PX y MO, por lo que este componente principal pudo discriminar con bastante éxito las semillas ZA. Por otro lado, el PC2 (4%) consiguió discriminar las semillas de MO, con valores positivos, de las ZA y PX con valores negativos. Los resultados mostraron que la primera componente principal (PC1) estaba relacionada con la intensidad global del espectro, sobre la que tiene una mayor influencia la banda en la zona de 1600 cm-1, mientras que en la segunda (PC2), la mayor influencia procede de las bandas a 1590, 1619 y 1657 cm-1. El seguimiento del proceso de sobremaduración de 16 días de las semillas ZA también se evaluó mediante espectroscopía Raman. Se comprobó que el espectro Raman obtenido para algunas de estas muestras mostraba una distorsión debido a la irregularidad de las muestras. Por ello, se realizó una criba a través de pretratamientos espectrales (PCA y estadística T-cuadrado de Hotelling), eliminándose un 8% de las medidas (outliers). Posteriormente, análogo al estudio anterior, los espectros se suavizaron y se eligió para el análisis la banda 1240-1850 cm-1, corrigiéndose también el fondo del espectro. La intensidad del espectro Raman, con mayor influencia de la banda a 1600 cm-1, tendió a crecer durante los primeros 8 días, para luego decrecer entre los días 9 y 12, y volver a aumentar desde el día 13 hasta el final del proceso de sobremaduración. La correlación entre los datos espectrales (Raman) y los datos químicos (composición fenólica) de las semillas sobremaduras se estudió por aplicación de la estadística multivariante mediante análisis de componentes principales (PCA), para establecer fases de sobremaduración en las semillas en relación a la información espectral. En cuanto a la información espectral, en una primera evaluación se clasificaron las muestras en 4 niveles de maduración, correspondientes con los intervalos de días [0-3], [4-9], [10-12] y [13-16]. Sin embargo, se observó una mejor clasificación al realizar una división en 2 niveles, concretamente en los intervalos [0-12] y [13-16]. En cuanto a la información química a lo largo del proceso de sobremaduración, se observó que catequina y epicatequina fueron más abundantes al inicio del estudio (semillas menos maduras). Por el contrario, la concentración de ácido gálico aumentó durante la sobremaduración. Al correlacionar los datos espectrales y químicos, se observó un comportamiento similar de PC1 con los flavanoles monoméricos (catequina y epicatequina) durante las primeras etapas del proceso de sobremaduración (0-10 días). A partir de este momento se observó un aumento brusco del PC1 desde el día 11 hasta el final del RESULTADOS Y DISCUSIÓN – Capítulo 4 109 proceso de sobremaduración, coincidiendo esta tendencia con el comportamiento del ácido gálico. De manera exploratoria, con fines cuantitativos, se utilizaron los valores espectrales (PC1 de los espectros Raman) para predecir las concentraciones de los principales compuestos fenólicos. Se encontraron coeficientes de correlación inferiores a 0.4 para la catequina y epicatequina, pero se obtuvieron mejores resultados para el ácido gálico, donde el coeficiente fue de 0.73. Como principales conclusiones de estos resultados se puede decir: - que la espectroscopia de Raman es una técnica rápida y no destructiva, eficaz para la valorización de semillas de uva sobremaduras, cuyos espectros están fuertemente influenciados por los flavanoles monoméricos (catequina y epicatequina), y se logra la discriminación por variedades mediante análisis de componentes principales (PCA). - que la espectroscopia Raman puede utilizarse para clasificar las semillas de la variedad Zalema por estados de sobremaduración, principalmente entre etapas tempranas (0-12 días de sobremaduración) y tardías (13-16 días de sobremaduración). - que la información obtenida de los espectros Raman se pueden utilizar para predecir de una manera relativamente satisfactoria las concentraciones de algunos compuestos fenólicos, en particular del ácido gálico. Conclusiones CONCLUSIONES 111 CONCLUSIONES Se ha evaluado el aprovechamiento de semillas sobremaduras por exposición directa al sol, procedentes de la elaboración de vinos dulces, como fuentes de fenoles para la mejora del color de vinos tintos en clima cálido. A partir de los resultados obtenidos, ha sido posible extraer las siguientes conclusiones: PRIMERA: Las semillas de uva blanca de la variedad Pedro Ximénez sometida a sobremaduración postcosecha por exposición directa al sol, constituyen un subproducto agrícola con gran potencial para su aprovechamiento enológico por su riqueza en copigmentos fenólicos tales como ácido gálico, epicatequina, procianidinas B2, B2 3-O-galato, y otros flavanoles oligoméricos (trímeros y tetrámeros). SEGUNDA: La adición de 3 g/L de semillas sobremaduras Pedro Ximénez durante la fase fermentativa conduce a vinos tintos con una mejor estructura fenólica, un mayor grado de copigmentación y una mayor calidad y estabilidad del color y por tanto es una técnica de vinificación eficaz para la elaboración de vinos tintos en climas cálidos. TERCERA: La adición de semillas tras el descube de los hollejos permite controlar el tiempo de contacto vino-semillas. Los vinos tintos con adición postfermentativa doble (maceración de 12 g/L de semillas durante 30 días, y una segunda adición de 12 g/L de semillas durante otros 30 días) presentaron la mayor concentración de copigmentos flavanólicos y la mayor calidad y estabilidad cromática (tonos rojo neto, más oscuros y más vivos) CUARTA: Los extractos de semillas sobremaduras de Moscatel y Pedro Ximénez, ricos en compuestos fenólicos, inducen efectos químicos y colorimétricos positivos (cualitativos y cuantitativos) en disoluciones modelo de antocianos obtenidos de hollejos tintos. Los extractos de Moscatel, con más alta proporción de ácido gálico, catequina y procianidina B1, dieron lugar a los mayores efectos inmediatos de copigmentación y, en consecuencia, colores visualmente más apreciados, más oscuros y saturados. CONCLUSIONES 112 QUINTA: Los extractos de Moscatel y Pedro Ximénez mejoraron la estabilidad química de los antocianos, favoreciendo la formación de pigmentos derivados, más estables, como malvidina 3,5-diglucosido-etil-(epi)-catequina y malvidina 3-p-cumaril glucosido-5-glucosido-etil-(epi)-catequina. SEXTA: La aplicación de la Colorimetría Triestímulo Diferencial ha permitido verificar la estabilidad en el tiempo del color de las disoluciones. Con extractos de Moscatel, las disoluciones antociánicas fueron más estables, presentando menores diferencias de color (E*ab) a lo largo de la fase de estabilización. SÉPTIMA: La espectroscopía Raman con excitación a 1064 nm ha permitido analizar y discriminar con éxito semillas sobremaduras de distintas variedades de uva. Determinadas bandas espectrales cercanas a los 1600 cm-1 están fuertemente influenciadas por los flavanoles monoméricos presentes en las semillas (catequina y epicatequina), permitiendo una óptima discriminación por variedades mediante análisis de componentes principales. OCTAVA: En el caso de la variedad Zalema, mediante la espectroscopía Raman se pudieron clasificar las semillas según su estado de sobremaduración, principalmente entre etapas tempranas (0-12 días de sobremaduración) y tardías (13-16 días de sobremaduración). NOVENA: El análisis multivariante de la información espectral Raman no logró una predicción precisa del contenido en compuestos fenólicos, como indicadores de calidad, debido a que la técnica está condicionada por factores físicos y químicos propios de la muestra (falta de homogeneidad e interferencia de otros compuestos). CONCLUSIONS 113 CONCLUSIONS The use of overripe seeds obtained from grapes submitted to direct exposure to the sun for elaborating sweet wines has been evaluated as a source of phenols for the improvement of the color of red wines produced in warm climate. It has been possible to draw the following conclusions from the results: FIRST: The seeds of white grape Pedro Ximénez variety subjected to post-harvest overripening by direct exposure to the sun, constitute an agricultural by-product with great potential for its oenological use due to its richness in phenolic copigments such as gallic acid, epicatechin, procyanidins B2, B2-3-O-gallate, and other oligomeric flavanols (trimers and tetramers). SECOND: The addition of 3 g/L of Pedro Ximénez overripe seeds for macerating during the fermentation leads to red wines with a better phenolic structure, a higher levels of copigmentation and quality and stability of color; therefore, it is an efficient winemaking technique for the production of red wines in warm climates. THIRD: The addition of seeds after removing skins allows controlling the wine-seed contact time. Red wines obtained with double post-fermentative addition of seeds (maceration of 12 g/L of seeds for 30 days, and a second addition of 12 g/L of seeds for another 30 days) showed the highest concentration of flavanol copigments and the highest quality and chromatic stability (red tones, darker and more vivid) FOURTH: Extracts of Moscatel and Pedro Ximénez overripe seeds, rich in phenolic compounds, induce positive chemical and colorimetric effects (both qualitative and quantitative) in model solutions of anthocyanins from red grape skins. The Moscatel extracts, with a higher proportion of gallic acid, catechin and procyanidin B1, gave rise to the greater and quick effects of copigmentation and, consequently, colors visually more appreciated, darker and saturated. FIFTH: Moscatel and Pedro Ximénez extracts improved the chemical stability of the anthocyanins, favoring the formation of more stable derivative pigments, such as malvidin 3,5-diglucoside-ethyl-(epi)-catecholine and malvidin 3-p-coumaryl glucoside- 5-glucoside-ethyl-(epi)-catechol. REFERENCIAS 118  Cejudo-Bastante, M.J.; Rivero-Granados, F.J.; Heredia, F.J. (2017). Improving the color and aging aptitude of Syrah wines in warm climate by wood-grape mix maceration. Eur. Food Res. Technol, 243(4), 575-582.  Chamkha, M.; Cathala, B.; Cheynier, V.; Douillard, R. (2003). Phenolic Composition of Champagnes from Chardonnay and Pinot Noir Vintages. J. Agric. Food Chem., 51, 3179−3184.  Chang, X.; Heene, E.; Qiao, F.; Nick, P. (2011). 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