Superando los límites del cultivo: taxogenómica y genómica comparativa de nuevas haloarqueas

Departamento de Microbiología y Parasitología Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Superando los límites del cultivo: taxogenómica y genómica comparativa de nuevas haloarqueas Tesis Doctoral Ana Durán Viseras Sevilla, 2020 FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Microbiología y Parasitología Memoria que presenta la Gda. en Farmacia Ana Durán Viseras para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla La doctoranda Fdo. Ana Durán Viseras FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Microbiología y Parasitología ANTONIO VENTOSA UCERO, CATEDRÁTICO DE UNIVERSIDAD Y CRISTINA SÁNCHEZ-PORRO ÁLVAREZ, PROFESORA TITULAR, DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA DE LA FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA. CERTIFICAN: Que la Tesis Doctoral titulada “Superando los límites del cultivo: taxogenómica y genómica comparativa de nuevas haloarqueas” presentada por la Graduada en Farmacia Dª. ANA DURÁN VISERAS para optar al grado de Doctor ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, reuniendo los requisitos exigidos. Y para que así conste, se expide el presente certificado en Sevilla, a 26 de Diciembre de 2019. Fdo.: Antonio Ventosa Ucero Fdo.: Cristina Sánchez-Porro Álvarez FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Microbiología y Parasitología MIGUEL ÁNGEL CAVIEDES FORMENTO, PROFESOR TITULAR Y DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA DE LA FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA, CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral titulada “Superando los límites del cultivo: taxogenómica y genómica comparativa de nuevas haloarqueas” presentada por la Graduada en Farmacia Dª. ANA DURÁN VISERAS para optar al grado de Doctor ha sido realizada en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, reuniendo los requisitos exigidos, bajo la dirección de los Doctores D. Antonio Ventosa Ucero y Dña. Cristina Sánchez-Porro Álvarez. Y para que así conste, se expide el presente certificado en Sevilla, a 26 de Diciembre de 2019. Fdo.: Miguel Ángel Caviedes Formento La realización de esta Tesis Doctoral ha sido financiada mediante los siguientes proyectos de investigación: “Biodiversidad microbiana de suelos salinos: una aproximación molecular y metagenómica” (P10-CVI-6226) subvencionado por la Junta de Andalucía durante el período 2012-2016. “De la metagenómica al cultivo puro: Spiribacter salinus ” (CGL2013-46941-P), subvencionado por el Ministerio de Ciencia e Innovación durante el período 2014-2017. “Microbiomas de ambientes hipersalinos: suelos versus salinas” (CGL2017-83385-P), financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad durante el período 2018-2020. III.2.I. Medio R2A 61 III.2.II. Medio piruvato 61 III.2.III. Medio glicerol 62 III.2.IV. Medios con extractos 62 III.3. Tratamiento de las muestras y aislamiento de cepas 62 III.4. Material biológico 63 III.4.I. Cepas aisladas 63 III.4.II. Cepas de colección 63 III.4.III. Cultivo, mantenimiento y conservación de las cepas 64 III.5. Estudio filogenético de las cepas aisladas 65 III.5.I. Extracción, purificación y determinación de la concentración y pureza del ADN 66 III.5.I.I. Método de Marmur modificado 66 III.5.I.II. Purificación del ADN genómico 67 III.5.I.III. Electroforesis en geles de agarosa 67 III.5.I.IV. Determinación de la concentración y pureza del ADN 68 III.5.II. Amplificación del ADN mediante PCR 68 III.5.III. Estudios de clonación 71 III.5.III.I. Protocolo de ligación 71 III.5.III.II. Transformación de células competentes por choque térmico 72 III.5.III.III. Extracción del ADN plasmídico 73 III.5.IV. Secuenciación de los productos de PCR 74 III.5.V. Análisis filogenético de las secuencias 76 III.5.V.I. ChromasPro 76 III.5.V.II. Blast y Ez-Biocloud 76 III.5.V.III. ARB 77 III.5.V.IV. BioEdit 78 III.5.V.V. MEGA 78 III.6. Caracterización quimiotaxonómica de las cepas aisladas 78 III.6.I. Extracción de lípidos polares 78 III.6.II. Análisis e identificación de lípidos polares por HPTLC 80 III.7. Caracterización fenotípica 81 III.7.I. Características morfológicas 81 III.7.II. Características fisiológicas 81 III.7.III. Características bioquímicas 82 III.7.III.I. Prueba de la oxidasa 82 III.7.III.II. Prueba de la catalasa 82 III.7.III.III. Producción de indol 83 III.7.III.IV. Prueba del rojo de metilo 83 III.7.III.V. Prueba de Voges-Proskauer 83 III.7.III.VI. Reducción de los nitratos y nitritos 84 III.7.III.VII. Producción de ácido sulfhídrico 85 III.7.III.VIII. Citrato de Simmons 85 III.7.III.IX. Prueba de la ureasa 86 III.7.III.X. Prueba de las descarboxilasas 86 III.7.III.XI. Producción de ácidos a partir de carbohidratos 86 III.7.III.XII. Hidrólisis del almidón, gelatina, ADN, esculina y Tween 80 87 III.7.IV. Pruebas nutricionales 88 III.7.IV.I. Utilización de carbohidratos, alcoholes y ácidos orgánicos como única fuente de carbono y energía 88 III.7.IV.II. Utilización de aminoácidos como única fuente de carbono, nitrógeno y energía 89 III.8. Estudios genómicos 89 III.8.I. Secuenciación del ADN genómico 89 III.8.II. Análisis bioinformático 90 III.8.II.I. Control de calidad y ensamblaje 90 III.8.II.II. Anotación de secuencias genómicas 91 III.8.III. Análisis genómico comparativo 93 III.8.III.I. Estimación de la posición filogenómica 93 III.8.III.II. Estimación de la semejanza genómica entre microorganismos 94 III.8.III.III. Representaciones genómicas 95 III.8.III.IV. Sintenia 95 III.8.III.V. Determinación del punto isoeléctrico y la frecuencia de aminoácidos 95 III.8.III.VI. Determinación de la presencia de secuencias víricas y sistemas de CRISPR/Cas 96 III.8.III.VII. Análisis de rodopsinas 96 III.8.IV. Ecología ambiental 96 III.8.IV.I. Abundancia de secuencias metagenómicas 96 III.8.IV.II. Reclutamiento metagenómicos 97 III.8.IV.III. Identificación de enzimas de interés en las bases de datos metagenómicas 98 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 99 IV.1. Aislamiento de nuevas cepas de haloarqueas y bacterias halófilas 101 IV.2. Estudio de cepas pertenecientes al orden Halobacteriales 107 IV.2.I. Aislamiento y caracterización de la cepa F13-25T 107 IV.2.I.I. Descripción de Halorientalis pallida sp. nov. 116 IV.2.I.II. Descripción corregida del género Halorientalis 116 IV.2.II. Aislamiento y caracterización de la cepa F20-122T 117 IV.2.II.I. Descripción de Natronomonas salsuginis sp. nov. 124 IV.2.III. Aislamiento y caracterización de la cepa F16-60 125 IV.2.III.I. Descripción de Haloglomus gen. nov. 133 IV.2.III.II. Descripción de Haloglomus irregulare sp. nov. 134 IV.2.III.III. Ecología y abundancia del género Haloglomus 135 IV.2.IV. Aislamiento, caracterización y análisis genómico de las cepas F12-1, F17-44, F18-79 y F19-13 137 IV.2.IV.I. Aislamiento, filogenia e índices de relatividad de los nuevos aislados 137 IV.2.IV.II. Caracterización fenotípica y quimiotaxonómica 141 IV.2.IV.III. Descripción de Halosegnis gen. nov. 145 IV.2.IV.IV. Descripción de Halosegnis longus sp. nov. 145 IV.2.IV.V. Descripción de Halosegnis rubeus sp. nov. 146 IV.2.IV.VI. Características genómicas de los nuevos aislados 147 IV.2.IV.VII. Ecología y distribución del género Halosegnis 151 IV.2.IV.VIII. Metabolismo del género Halosegnis 154 IV.2.IV.IX. Osmorregulación 157 IV.2.IV.X. Rodopsinas 160 IV.3. Estudio de cepas pertenecientes al orden Haloferacales 162 IV.3.I. Aislamiento y caracterización de la cepa F13-13 162 IV.3.I.I. Descripción de Halonotius aquaticus sp. nov. 167 IV.3.II. Aislamiento y caracterización de las cepas F15B y F9-27 168 IV.3.II.I. Descripción de Halonotius terrestris sp. nov. 175 IV.3.II.II. Descripción de Halonotius roseus sp. nov. 176 IV.3.II.III. Descripción corregida del género Halonotius 177 IV.3.III. Análisis genómico comparativo del género Halonotius 177 IV.3.III.I. Ecología, distribución y abundancia del género Halonotius 178 IV.3.III.II. Metabolismo 182 IV.3.III.III. Biosíntesis de cobalamina (vitamina B12) 185 IV.3.III.IV. Osmorregulación 188 IV.3.III.V. Análisis de rodopsinas 190 V. RESUMEN 193 VI. SUMMARY 199 VII. CONCLUSIONES 205 VIII. CONCLUSIONS 211 IX. BIBLIOGRAFÍA 217 X. ANEXO 275 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Categorías de microorganismos extremófilos y extremotolerantes según la naturaleza de su adaptación (adaptado de Torsvik y Øvreås, 2008). 4 Tabla 2. Tipos de transportadores implicados en el mecanismo de osmoadaptación saltin de la clase Halobacteria (adaptado de Jensen et al., 2015). 19 Tabla 3. Muestras estudiadas en este trabajo y sus características fisicoquímicas. 59 Tabla 4. Cepas de colección utilizadas en este trabajo. 63 Tabla 5. Cebadores utilizados para la amplificación de los genes ARNr 16S de bacterias y arqueas y del gen rpoB´ de arqueas. Las secuencias de los cebadores se muestran de acuerdo con el código de la IUPAC para la denominación de nucleótidos ambiguos. La posición de los cebadores se indica con respecto a la numeración de Escherichia coli. 69 Tabla 6. Cebadores utilizados para la secuenciación del gen ARNr 16S de bacterias y arqueas. Las secuencias de los cebadores se muestran de acuerdo al código de la IUPAC para la denominación de nucleótidos ambiguos. La posición de los cebadores se indica con respecto a la numeración de Escherichia coli. 75 Tabla 7. Resumen de las diferentes actividades hidrolíticas. 87 Tabla 8. Carbohidratos, alcoholes y ácidos orgánicos estudiados para determinar su utilización como única fuente de carbono y energía. Aminoácidos y derivados estudiados para determinar su utilización como única fuente de carbono, nitrógeno y energía. 89 Tabla 9. Bases de datos metagenómicas empleadas en este trabajo. 97 Tabla 10. Cepas aisladas (haloarqueas y bacterias halófilas) a partir de los diferentes ambientes estudiados. 102 Tabla 11. Número de cepas aisladas (haloarqueas y bacterias halófilas) ordenadas a nivel de género. 102 Tabla 12. Haloarqueas y bacterias halófilas seleccionadas como posibles nuevos taxones en base a la comparación de la secuencia casi completa del gen ARNr 16S. 106 Tabla 13. Características generales de los genomas de la cepa F13-25T y de las cepas tipo de las especies del género Halorientalis utilizadas en este estudio. 110 Tabla 14. Matriz con los porcentajes de ANI y DDH obtenidos entre la cepa F13-25T y las cepas tipo de las especies del género Halorientalis y otros géneros relacionados, de los que se dispone de sus genomas. 111 Tabla 15. Características que diferencian a la cepa F13-25T de las especies Halorientalis regularis JCM 16425T y Halorientalis persicus IBRC-M 10043T. Cepas: 1, F13-25T; 2, Halorientalis persicus IBRC-M 10043T; 3, Halorientalis regularis JCM 16425T. Todos los datos son de este estudio excepto los indicados con: a tomados de Amoozegar et al., (2014) y b tomados de Cui et al., (2011) y +, Reacción positiva; -, reacción negativa. 113 Tabla 16. Características generales de los genomas de la cepa F20-122T y de las especies del género Natronomonas utilizadas en este estudio. 119 Tabla 17. Matriz con los porcentajes de ANI y DDH obtenidos entre la cepa F20-122T y las especies del género Natronomonas y otros géneros relacionados. 120 Tabla 18. Características que diferencian a la cepa F20-122T de la especie Natronomonas moolapensis CECT 7526T. Cepas: 1, F20-122T; 2, Natronomonas moolapensis CECT 7526T. Todos los datos son de este estudio excepto los indicados con *, tomados de Burns et al., (2010a). +, Reacción positiva; -, reacción negativa; w, débilmente positivo. 122 Tabla 19. Características generales del genoma de la cepa F16-60T. 127 Tabla 20. Porcentajes de identidad aminoacídica media (AAI) entre la cepa F16-60T y los genomas de las especies tipo de los géneros del orden Halobacteriales. Cepas: 1, Halosimplex carlsbadense 2-9-1T; 2, Halorhabdus utahensis DSM 12940T; 3, Halorientalis regularis IBRC-M 10760T; 4, Haloarcula vallismortis ATCC 29715T; 5, Natronomonas pharaonis DSM 2160T; 6, Halobacterium salinarum NRC-1T; 7, Halomicrobium mukohatei DSM 12286T; 8, Natronomonas moolapensis 8.8.11T; 9, Halapricum salinum CBA 1105T; 10, Cepa F16-60T; 11, Halomarina oriensis SPP-AMP- 1T. 130 Tabla 21. Características diferenciales de la cepa F16-60T y Natronomonas moolapensis CECT 7526T. Cepas: 1, Cepa F16-60T; 2, Natronomonas moolapensis CECT 7526T. Todos los datos son de este estudio, excepto los indicados con *, datos tomados de Burns et al., (2010a). +, Reacción positiva; -, reacción negativa; w, débilmente positivo; ND, no determinado. 132 Tabla 22. Especies filogenéticamente más cercanas a las cepas F12-1T, F17-44T, F18-79 y F19- 13, en base a la comparación de secuencias del gen ARNr 16S. 137 Tabla 23. Especies filogenéticamente más cercanas a las cepas F12-1T, F17-44T, F18-79 y F19-13, en base a la comparación de secuencias del gen rpoB´. 137 Tabla 24. Porcentajes de hibridación ADN-ADN in silico (DDH) entre los nuevos aislados y los genomas de las cepas tipo de las especies de Natronomonas. 141 Tabla 25. Características fenotípicas diferenciales entre las cepas F12-1T, F17-44T, F18-79 y F19-13. Cepas: 1, cepa F12-1T; 2, cepa F7-44T; 3, cepa F18-79; 4, cepa F19-13. Todos 143 los datos son de este estudio. +, Reacción positiva; -, reacción negativa; w, débilmente positivo. Tabla 26. Características que diferencian las cepas F12-1T y F17-44T de Natronomonas moolapensis CECT 7526T. Cepas: 1, F12-1T; 2, F7-44T; 3, Natronomonas moolapensis CECT 7526T. Todos los datos son de este estudio, excepto los indicados con *, datos tomados de Burns et al., (2010a). +, Reacción positiva; -, reacción negativa; w, débilmente positivo. 144 Tabla 27. Características generales de los genomas de los cuatro aislados. 148 Tabla 28. Características que diferencian a la cepa F13-13T de las especie Halonotius pteroides. Cepas: 1, F13-13T; 2, Halonotius pteroides CECT 7525T. Todos los datos son de este estudio excepto los indicados con *, datos tomados de Burns et al., (2010b). +, Reacción positiva; -, reacción negativa; w, débilmente positivo. 164 Tabla 29. Matriz con los porcentajes de ANI y DDH obtenidos entre los genomas de las cepas pertenecientes al género Halonotius. 171 Tabla 30. Características que diferencian a las cepas F15BT y F9-27T de las especies descritas del género Halonotius. Cepas: 1, F15BT; 2, F9-27T; 3, Halonotius aquaticus F13-13T; 4, Halonotius pteroides CECT 7525T. Todos los datos son de este estudio excepto los indicados con *, datos tomados de Burns et al., (2010b). +, Reacción positiva; -, reacción negativa; w, débilmente positivo. 173 Tabla 31. Características generales de los genomas de las cepas tipo de las especies del género Halonotius secuenciados en este estudio. 178 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Ejemplos de ambientes extremos: A) Rio Tinto (Huelva), B) cuenca volcánica Dallol (Etiopía), C) lago Deep (Antártida). 3 Figura 2. Ejemplos de ambientes hipersalinos talasosalinos: A) salinas de Es Trenc (Mallorca), B) lago Tyrrell (Australia). Ejemplos de ambientes hipersalinos atalasosalinos: C) Mar Muerto (Israel/Jordania), D) lago Natron (Tanzania). 7 Figura 3. Ambientes hipersalinos estudiados: A) salinas de Isla Cristina (Huelva), B) salinas de Isla Bacuta (Huelva), C-D) suelos salinos localizados en las Marismas del Odiel (Huelva). 11 Figura 4. Esquema de los distintos órdenes, familias y géneros de la clase Halobacteria (adaptado de Amoozegar et al., 2017). 13 Figura 5. Representación de los ciclos glicolisis, gluconeogénesis y Entner-Doudoroff modificado para haloarqueas. Los nombres en verde corresponden a las enzimas únicas del ciclo glicolítico, en naranja las del ciclo gluconeogénico y en azul las enzimas comunes de ambos ciclos. En violeta se muestran las enzimas correspondientes a la ruta Entner-Doudoroff modificada para haloarqueas. 33 Figura 6. Representación de la ruta de las pentosas fosfato. Los nombres en azul corresponden a las enzimas. 34 Figura 7. Representación de: A) ciclo de los ácidos tricarboxílicos; B) ciclo del glioxilato. 35 Figura 8. Representación del metabolismo del nitrógeno (adaptado de Bonete et al., 2008). A) Ciclo del nitrógeno, B) Rutas para la formación de glutamato a partir del ion amonio. En azul se representan los nombres de las rutas (A) y las enzimas (B). 37 Figura 9. Representación de los diferentes tipos de rodopsinas microbianas (Vera-Gargallo, 2018). 40 Figura 10. Esquema general de las reacciones de PCR del gen ARNr 16S. 70 Figura 11. Esquema general de las reacciones de PCR del gen rpoB´. 70 Figura 12. Representación gráfica del vector de clonación pGEM® -T. 72 Figura 13. Observación de la apariencia coloreada de las colonias a las 24 horas. 72 Figura 14. Estrategia seguida para el solapamiento de los cebadores utilizados en la secuenciación del gen ARNr 16S. 75 volcanii NCIMB 2012T se ha utilizado como outgroup. La escala representa el número de sustituciones por nucleótido. Figura 53. Microfotografía en contraste de fases de las células de la cepa F13-13T. Escala, 10 μm. 164 Figura 54. Cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) del perfil de lípidos polares de la cepa F13-13T y otras especies de haloarqueas. La placa se reveló con ácido sulfúrico al 5 % en agua, seguido de calentamiento de la placa a 160 ºC. Carriles: 1, Halobacterium salinarum DSM 3754T; 2, Cepa F13-13T; 3, Halonotius pteroides CECT 7525T; 4, Halohasta litorea JCM 17270T; 5, Halohasta litchfieldiae JCM 15066T; 6, Halorubrum saccharovorum DSM 1137T. 166 Figura 55. A) Árbol filogenético obtenido por el método maximum-likelihood, basado en la comparación de secuencias del gen ARNr 16S, en el que se muestran las relaciones filogenéticas entre las cepas F15BT y F9-27T y las especies del género Halonotius y de otros géneros filogenéticamente cercanos. B) Árbol filogenético obtenido por el método maximum-likelihood, basado en la comparación de secuencias del gen rpoB´, en el que se muestran las relaciones filogenéticas entre las cepas F15BT y F9-27T y las especies del género Halonotius y de otros géneros filogenéticamente cercanos. Los números de acceso de las secuencias utilizadas se indican entre paréntesis. En los nodos, los círculos rojos indican los valores de bootstrap inferiores al 50 %, los amarillos los valores comprendidos entre 50 y 80 % y los verdes, los valores de bootstrap superiores al 80 %. Candidadus Nanosalinarum J07AB56 y Candidatus Nanosalina J07AB43 se han utilizado como outgroup. La escala representa el número de sustituciones por nucleótido. 169 Figura 56. Árbol filogenómico obtenido por el método maximum-likelihood, basado en la comparación de 257 genes core-orthologous, en el que se muestran las relaciones filogenéticas entre las cepas F15BT y F9-27T y las especies del género Halonotius y de otros géneros filogenéticamente cercanos. Los números de acceso de las secuencias utilizadas se indican entre paréntesis. En los nodos, los círculos rojos indican los valores de bootstrap inferiores al 50 %, los amarillos los valores comprendidos entre 50 y 80 % y los verdes, los valores de bootstrap superiores al 80 %. Candidadus Nanosalinarum J07AB56 y Candidatus Nanosalina J07AB43 han sido utilizadas como outgroup. La escala representa el número de sustituciones por nucleótido. 170 Figura 57. Agrupamientos jerárquicos entre los genomas de Halonotius cultivados y los genomas ambientales de Halonotius. Los valores de ANI y AAI se representan mediante mapas de calor, cuyos valores de semejanza vienen determinados por la escala de color situada en la parte superior de cada imagen. La designación de las cepas y sus números de acceso se encuentran detallados en el panel inferior. 171 Figura 58. Cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) del perfil de lípidos de las cepas F15BT y F9-27T y otras especies de haloarqueas. Las placas se 174 revelaron con A) ácido sulfúrico al 5 % en agua, seguido de calentamiento de la placa a 160 ºC, B) azul de molibdeno, C) ácido fosfomolíbdico. Figura 59. Abundancia de Halonotius. (A,B) Porcentaje de secuencias del gen ARNr 16S relacionadas con Euryarchaeota y Halonotius. Los metagenomas aparecen ordenados por gradiente de salinidad. (C-H) Reclutamientos de los genomas de las cepas F15BT, F9-27T y F13-13T frente a distintos metagenomas. Se ha utilizado un valor de corte del 95 % de identidad y una longitud de read ≥30 pb. La línea negra discontinúa representa el umbral de corte del 95 % a nivel de especie. 180 Figura 60. Reclutamientos de los genomas de las cepas F13-13T, Halonotius pteroides CECT 7525T, F15BT, F9-27T y frente al metagenoma SS37. Se ha utilizado un valor de corte del 95 % de identidad y una longitud de read ≥30 pb. La línea negra discontinúa representa el umbral de corte del 95 % a nivel de especie. 181 Figura 61. Distribución global de las secuencias del gen ARNr 16S. Los círculos de colores muestran los puntos donde se han localizado secuencias de Halonotius, según la base de datos de SILVA. La flecha señala el lugar de donde se aislaron las cepas descritas en este trabajo. La circunferencia negra en Australia representa el sitio de donde se han extraído los genomas ambientales (MAGs) de Halonotius. 182 Figura 62. Reconstrucción metabólica de las cepas aisladas Halonotius sp. F13-13T, Halonotius sp. 15BT y Halonotius sp. F9-27T. El panel turquesa representa la ruta de síntesis de la vitamina B12 simplificada, en negrita se han representado los nombres de los genes presentes en los genomas, en gris los ausentes en arqueas y rodeados por un cuadrado rojo los ausentes en los genomas estudiados. Las flechas horizontales indican homología entre las enzimas de las rutas aerobia y anaerobia. Las líneas discontinuas corresponden a partes completas de la ruta no representadas en la figura. El recuadro verde oscuro representa la glicolisis (Embden-Meyerhof- Parnas), mientras que el verde claro la ruta Entner-Doudoroff modificada para haloarqueas. El color naranja representa el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, el rosa la síntesis de isoprenos: isoprenos C5 (naranja oscuro) e isoprenos C10-C20 (naranja claro). El recuadro violeta claro corresponde con la biosíntesis de dTDP-L-ramnosa, el color amarillo refleja la ruta asimilatoria para la reducción de los nitratos, el violeta oscuro la degradación de L-glutamato por la enzima glutamato deshidrogenasa (GdhA). La enzima alfa-amilasa para la degradación de la glucosa también ha sido representada con su número KO. 184 Figura 63. Comparación del cluster de genes de los genomas de Halonotius (n=4) implicados en la síntesis de cobalamina. A) Representación de los genes implicados en la primera parte de la ruta, desde uroporfirinógeno III hasta a,c-diamina. B) Representación de los genes implicados en la segunda parte de la ruta, desde a,c-diamina hasta vitamina B12. Las estrellas rojas muestran los qenes que presentan dos copias. En blanco se han 187 representado los genes no conservados en el cluster. La escala indica la longitud del gen en pb. Figura 64. Comparación del perfil isoeléctrico del proteoma de las especies de Halonotius y el de otros procariotas, calculado para cada genoma traducido y mostrado como porcentaje de distribución. B) Comparación del perfil isoeléctrico del proteoma de las especies de Halonotius cultivadas y de las secuencias ambientales de Halonotius, calculado para cada genoma traducido y mostrado como porcentaje de distribución. 189 Figura 65. Comparación del alineamiento de las secuencias de rodopsinas de las especies del género Halonotius y otras haloarqueas analizadas. Los números de acceso de los genomas utilizados se muestran entre paréntesis. En negrita aparecen las secuencias correspondientes a las cepas de Halonotius cultivadas; el azul se corresponde con las bombas de protones de haloarqueas y el verde con las rodopsinas sensoriales. La caja verde muestra el aminoácido situado en la posición 199. B) Árbol filogenómico obtenido por el método maximum-likelihood basado en la comparación de 220 secuencias de rodopsinas. Los triángulos con transparencia resaltan las secuencias de Halonotius (ver leyenda en la parte inferior de la figura). En los nodos, los círculos rojos indican los valores de bootstrap inferiores al 50 %, los amarillos los valores comprendidos entre 50 y 80 % y los verdes, los valores de bootstrap superiores al 80 %. La escala representa el número de sustituciones por nucleótido. 192 Introducción 3 I.1. La vida en ambientes extremos A pesar de que durante mucho tiempo se ha pensado que el desarrollo de la vida solo era posible en condiciones fisicoquímicas “normales”, hoy sabemos que ésta se abre camino hasta en los rincones más inhóspitos del planeta. Estos lugares se conocen como ambientes extremos y en ellos podemos encontrar condiciones ambientales limitantes tales como pH, temperatura, presión hidrostática, radiaciones, concentración de nutrientes, oxígeno, metales pesados, toxinas y compuestos xenobióticos, potencial redox o salinidad (Figura 1) (Rodríguez-Valera, 1988). Dado que la vida en estos ambientes requiere una serie de adaptaciones específicas de los organismos que los habitan, la diversidad que podemos encontrar en ellos es menor que la que se podría esperar en cualquier otro ambiente no extremo y solo un número limitado de grupos taxonómicos se encuentran bien adaptados a los mismos (Brock, 1979; Ventosa, 2006). Estos microorganismos reciben el nombre de extremófilos (Mesbah & Figura 1. Ejemplos de ambientes extremos: A) Rio Tinto (Huelva), B) cuenca volcánica Dallol (Etiopía), C) lago Deep (Antártida). A B C Ana Durán Viseras 4 Wiegel, 2008, 2012) y se dividen en diferentes categorías en función de la naturaleza fisicoquímica de su adaptación (Tabla 1). Estos términos no son excluyentes, ya que podemos encontrar microorganismos capaces de crecer óptimamente en ambientes en los que coexisten varios factores ambientales extremos; así a los microorganismos que son capaces de crecer en condiciones extremas en las que la vida está limitada al menos por tres factores ambientales, se los denomina poliextremófilos (Bowers et al., 2009; Mesbah & Wiegel, 2012). Asimismo, se ha acuñado el término extremotrofo o extremotolerante para definir a aquellos microorganismos capaces de sobrevivir en estas condiciones limitantes aunque sus condiciones óptimas de crecimiento sean otras más moderadas (Torsvik & Øvreås, 2008). Condición ambiental extrema Denominación Temperatura Baja Psicrófilo, psicrotrofo o psicrotolerante Alta Termófilo, hipertermófilo pH Ácido Acidófilo Alcalino Alcalófilo Radiación Radio-resistente, radio-tolerante Metales pesados Metalo-resistente, metalo-tolerante Toxinas Toxi-resistentes, toxi-tolerantes Compuestos xenobióticos Degradador de xenobióticos Alta presión hidrostática Barófilo, piezófilo o piezotolerante Desecación Xerófilo, xerotolerante Salinidad Halófilo, halotolerante Oscilaciones bruscas de condiciones fisicoquímicas Poiquilotrofo, poiquilotolerante Desde su descubrimiento, la peculiaridad de los microorganismos extremófilos y de los ambientes en los que se encuentran, ha despertado una gran fascinación por parte de la comunidad científica de todo el mundo, especialmente en el campo de la astrobiología. La peculiar fisiología de estos microorganismos y sus inusuales mecanismos de adaptación, hacen prometedora su exploración como modelo de vida en otros sistemas exteriores a la Tierra (Horikoshi et al., 2011; Cray et al., 2013; Fox-Powell et al., 2016; Introducción 5 Pontefract et al., 2017). Así, por ejemplo, en el laboratorio situado en la mina de Boulby (Reino Unido), una mina de sal ubicada a 1,1 km bajo la superficie de la Tierra, se llevan a cabo estudios en colaboración con la NASA, sobre la Materia Oscura en el Universo, sobre geología y geofísica o sobre la vida en ambientes extremos de nuestro planeta y en otros sistemas (Danielson et al., 2019; Gluyas et al., 2019). Asimismo, los microorganismos extremófilos poseen un gran potencial biotecnológico, especialmente en los sectores de la biotecnología y la biomedicina (Rodriguez-Valera, 1992; Ventosa & Arahal, 2002; Mellado & Ventosa, 2003; Oren, 2005, 2010; Barnard et al., 2010; Pastor et al., 2010; Abriouel et al., 2011; Wang et al., 2011; Pérez et al., 2011; Gabani & Singh, 2013; Dalmaso et al., 2015; Coker, 2016; Dumorné et al., 2017; Jin et al., 2019; Jorquera et al., 2019; Wang et al., 2019). I.2. Ambientes hipersalinos y microorganismos halófilos Los ambientes hipersalinos son típicos ambientes extremos que se caracterizan por presentar elevadas concentraciones de sal. No obstante, éste no es el único factor que limita su biodiversidad; así, en estos ambientes pueden coexistir otros factores físico-químicos como son: altas o bajas temperaturas, altos o bajos valores de pH, fuerte irradiación solar, baja disponibilidad de nutrientes o de oxígeno, o la posible presencia de metales pesados y de otros compuestos tóxicos (Rodríguez-Valera, 1988). En estos ecosistemas viven y conviven una gran cantidad de microorganismos, denominados halófilos, que se encuentran bien adaptados a la alta salinidad del ambiente y en muchos casos, también a algunos de los otros factores mencionados (Mesbah & Wiegel, 2012). Para lidiar con estas condiciones, los microorganismos halófilos han desarrollado diferentes mecanismos de supervivencia, como la síntesis de sustancias osmoprotectoras o solutos compatibles, distintos mecanismos de reparación del ADN o fotoliasas para sobrellevar la radiación UV, entre otros (Kurth et al., 2017). Los ambientes hipersalinos están representados en su mayoría por sistemas acuáticos y por suelos salinos, entre los que se encuentran los lagos salados, las salinas solares o las cuencas marinas anóxicas hipersalinas, así como los sendimentos de dichos ecosistemas y los suelos con alto contenido en sales (Ventosa et al., 2008). También se incluyen las minas y los depósitos de sal subterráneos, las pieles curtidas, el interior y superficie de las plantas xerófitas del desierto y una enorme diversidad de alimentos en salmuera, salazón o fermentados (Grant et al., 1998; Ventosa et al., 2008; Oren, 2011b). Ana Durán Viseras 6 Los ambientes hipersalinos acuáticos han sido estudiados en gran profundidad, y se definen como aquellos ambientes que tienen concentraciones de sales más elevadas que las del agua del mar, es decir, superiores a un 3,5 % (p/v) de sales totales, aproximadamente (Edgerton & Brimblecombe, 1981; Rodríguez-Valera, 1988). Atendiendo a su origen, la composión salina de los hábitats acuáticos hipersalinos puede diferir o no de la del agua del mar, clasificándose, en base a esto, en sistemas acuáticos talososalinos o atalasosalinos (Ventosa, 2006). Mientras que los ambientes acuáticos talasosalinos tienen un origen marino y por tanto una composición salina similar a la del agua del mar, caracterizada por la predominancia de iones monovalentes Cl- y Na+, y por la presencia en menor proporción de otros iones como Mg2+, SO42-, K+, Ca2+, HCO3-, Br- y F- (Ventosa & Arahal, 2002); los ambientes acuáticos atalasosalinos provienen principalmente de la disolución de depósitos minerales de origen continental, y su composición salina, por tanto, refleja la geología, topología y condiciones climáticas del entorno en cuestión, conformando así sistemas con diversas composiciones iónicas. Algunos contienen mayoritariamente cationes divalentes, como Ca2+ y Mg2+ (Rodriguez‐Valera, 1993), mientras que en otros predominan los aniones CO3- y Cl-, dando lugar a masas de agua alcalinas con valores de pH superiores a 8 (Grant & Tindall, 1986). Las salinas marinas constituyen un ejemplo típico de ambientes talasosalinos, los cuales además, constituyen un excelente modelo para el estudio de la biodiversidad microbiana y ecología en hábitats con salinidades crecientes. Son numerosos los estudios llevados a cabo en este tipo de sistemas en diversos puntos del planeta (Pašić et al., 2005, 2007, Baati et al., 2008, 2011; Oh et al., 2010; Trigui et al., 2011; Boujelben et al., 2012a, 2012b; Zhaxybayeva et al., 2013; Dillon et al., 2013; Fernández et al., 2014a; Plominsky et al., 2014; Ballav et al., 2015; Di Meglio et al., 2016; Kambourova et al., 2017; Barghini et al., 2018; Viver et al., 2019; Isaji et al., 2019), siendo probablemente las salinas solares “Bras del Port”, Santa Pola (Alicante), las mejor estudiadas desde el punto de vista microbiológico (Rodriguez-Valera et al., 1981, 1985; Ventosa et al., 1982, 2014; Quesada et al., 1985; Benlloch et al., 1995, 1996, 2001, 2002; Guixa-Boixareu et al., 1996; Antón et al., 1999, 2000; Pedrós-Alió et al., 2000; Casamayor et al., 2000, 2002; Papke et al., 2004; Estrada et al., 2004; Santos et al., 2010; Ghai et al., 2011; Fernández et al., 2014a; Gomariz et al., 2015; Ramos-Barbero et al., 2019). Otros ejemplos de sistemas talasosalinos son la mayoría de las cuencas hipersalinas de los fondos marinos, como las denominadas Medee, Bannock y Introducción 7 l´Atalante en el Mediterráneo Oriental y Atlantis II Deep y Discovery Deep en el Mar Rojo (Antunes et al., 2011; Ferrer et al., 2012; Bougouffa et al., 2013; Yakimov et al., 2013; Oren, 2015), así como el Gran Lago Salado en Utah (EE.UU) (Jones et al., 2009), el lago Tyrrell (Australia) (Podell et al., 2014), los lagos Urmía, Meyghan y Aran-Bidgol en Irán (Alipour, 2006; Makhdoumi-Kakhki et al., 2012; Naghoni et al., 2017) y el lago Ocnei en Rumanía (Baricz et al., 2014). Por otro lado, dentro de los sistemas acuáticos atalasosalinos encontramos el Mar Muerto, el cual podríamos considerar el ejemplo mejor conocido de este tipo de ambientes (Volcani, 1940; Nissenbaum, 1975; Oren, 1983, 1988; Arahal et al., 1996; Arahal, 1997; Oren et al., 2005; Oren, 2006c; Bodaker et al., 2010, 2012; Romanovskaia et al., 2013; Thomas et al., 2014; Oren, 2015; Jacob et al., 2017), aunque también se encuentran otros como los lagos Vanda y Don Juan, en la Antártida (Siegel et al., 1979; Dickson et al., 2013; Laybourn-Parry & Wadham, 2014; Sumner et al., 2016), los lagos salinos y alcalinos Mono, Big Soda y Soap (EEUU) (Jones et al., 1998; Hawley & Hess, 2014), Magadi (Kenia) (Kambura et al., 2016), Natron (Tanzania) (Yakimov et al., 2001), Wadi An Natrun (Egipto) (Imhoff et al., 1979; Jones et al., 1998), lagos hipersalinos de los Andes (Viver et al., 2018; Galisteo et al., 2019; Portero et al., 2019; Zannier et al., 2019) y algunos otros de India, China o Rusia (Siegel et al., 1979; Imhoff et al., 1979; Upasani & Desai, 1990; Jones et al., 1998; Yakimov et al., 2001; Pagaling et al., 2007; Banciu et al., 2008; Pagaling et al., 2009; Grant et al., 2011; Antony et al., 2013; Dickson et al., 2013; Hawley & Hess, 2014; Laybourn-Parry & Wadham, 2014; Paul et al., 2016; Sumner et al., 2016; Vavourakis et al., 2016; Kambura et al., 2016; Timmers et al., 2018). Figura 2. Ejemplos de ambientes hipersalinos talasosalinos: A) salinas de Es Trenc (Mallorca), B) lago Tyrrell (Australia). Ejemplos de ambientes hipersalinos atalasosalinos: C) Mar Muerto (Israel/Jordania), D) lago Natron (Tanzania). A B C D Ana Durán Viseras 14 donde hasta las últimas revisiones, incluyen más de 57 géneros y 233 especies distintas (de la Haba et al., 2011; Parte, 2014; Gupta et al., 2015; Arahal et al., 2017). Dentro del phylum Euryarchaeota, aunque en menor proporción que las haloarqueas, también encontramos un número reducido de arqueas metanógenas halófilas, las cuales hasta la fecha, se engloban dentro de cinco géneros de las clases Methanomicrobia (Methanohalobium, Methanohalophilus y Methanosalsum del orden Methanosarcinales, y Methanocalculus del orden Methanomicrobiales) y “Methanonatronarchaeia” (“Methanonatronarchaeum thermophilum”) (de la Haba et al., 2011; Sorokin et al., 2017, 2018a; Ferrer et al., 2018). Durante mucho tiempo todas las arqueas halófilas aisladas en cultivo puro pertenecían al phylum Euryarchaeota. No ha sido hasta muy recientemente cuando el grupo de las nanohaloarqueas, pertenecientes al superphylum “DPANN”, ha conseguido ser cultivado (Hamm et al., 2019). Este grupo de arqueas halófilas, relacionadas con la clase Halobacteria, ha suscitado gran interés por parte de la comunidad científica desde que por métodos independientes de cultivo se puso de manifiesto su existencia en diversos ambientes hipersalinos (Grant et al., 1999; Casanueva et al., 2008; Ghai et al., 2011; Narasingarao et al., 2012; Zhaxybayeva et al., 2013; Baricz et al., 2014; Martínez-García et al., 2014; Gomariz et al., 2015; Di Meglio et al., 2016; Vavourakis et al., 2016; Rubin et al., 2017; Finstad et al., 2017; Vogt et al., 2018). Se trata de un grupo de arqueas halófilas con bajo contenido en G+C y de tamaño muy pequeño (0,3-1 µm). Aunque algunos estudios sugerían que pudiera tratarse de entidades de vida libre (Narasingarao et al., 2012), se ha descrito que poseen un carácter simbionte y que necesitan asociarse a un hospedador, ya que carecen de la maquinaria necesaria para llevar a cabo los procesos metabólicos indispensables para la vida como la síntesis de lípidos, aminoácidos, nucleótidos o cofactores (Hamm et al., 2019). Asimismo, también se ha propuesto que las nanohaloarqueas poseen una diversidad filogenética similar a la ya descrita para las haloarqueas (Narasingarao et al., 2012; DeMaere et al., 2013). Hasta la fecha, aunque la única nanohaloarquea cultivada, Candidatus Nanohaloarchaea antharticus, se encuentra asociada a Halorubrum lacusprofundi como hospedador, se estima que los otros posibles géneros de “Nanohaloarchaeota” existentes, se asocien específicamente a otros grupos de haloarqueas abundantes en los ambientes hipersalinos (Hamm et al., 2019). Introducción 15 I.2.IV.II.2. Bacterias Dentro de las bacterias halófilas encontramos una gran variedad de taxones, los cuales, a su vez, conforman un grupo muy heterogéneo de microorganismos caracterizados por una gran diversidad de actividades metabólicas (desde fotótrofas a heterótrofas), respiración (aerobia o anaerobia), composición de la pared celular y morfología (Oren, 2002; Ventosa, 2006; de la Haba et al., 2011). Dentro de este grupo podemos encontrar representantes tanto halófilos moderados como extremos, englobados en diferentes ramas filogenéticas: Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes, Tenericutes, Thermotogae y Verrucomicrobia (de la Haba et al., 2011). Estos phyla no son exclusivos de especies halófilas, contienen además otros representantes no halófilos o halotolerantes. A diferencia de las haloarqueas, la mayoría de las bacterias halófilas se encuentran adaptadas a salinidades más bajas (10-20 % NaCl), siendo representantes de los géneros Halomonas, Chromohalobacter o Salinivibrio algunos ejemplos de bacterias halófilas moderadas más frecuentemente aislados en el laboratorio mediante métodos tradicionales de cultivo, o el género Spiribacter uno de los más abundantes en estos ambientes a salinidades intermedias (Ventosa et al., 2014). Existen también algunos ejemplos de bacterias con requerimientos más elevados de sales. Sin duda los ejemplos mejor conocidos en ambientes hipersalinos son los géneros Salinibacter y Salinivenus (clase Rhodothermaeota) (Antón et al., 2017; Viver et al., 2018), aunque también encontramos otras especies como Actinopolyspora halophila (clase Actinobacteria) (Gochnauer et al., 1975), Halorhodospira halophila (reclasificada como Ectothiorhodospira halophila) (Hirschler-Réa et al., 2003), Ectothiorhodospira halochloris (Imhoff & Trüper, 1977), Halovibrio denitrificans, Halospina denitrificans (Sorokin et al., 2006), todas ellas en la clase Gammaproteobacteria, y por último Halanaerobium lacusrosei (Cayol et al., 1995); Acetohalobium arabaticum (Zhilina & Zavarzin, 1990) o Halobacteroides lacunaris (Zhilina et al., 1991), del phylum Firmicutes. I.2.IV.II.3. Eucariotas Si bien la población mayoritaria en ambientes hipersalinos son procariotas, también encontramos en menor medida algunos organismos del dominio Eukarya, fundamentalmente a salinidades más bajas (Ventosa, 2006). Los ejemplos más conocidos de eucariotas halófilos son el crustáceo Artemia salina y el alga unicelular Dunaliella. Esta última constituye el principal productor primario en los ambientes hipersalinos acuáticos Ana Durán Viseras 16 (Stephens & Gillespie, 1976; Post, 1977; Javor, 1989; Oren, 2005, 2014), donde además es capaz de alcanzar densidades poblacionales elevadas incluso en ambientes acuáticos conteniendo hasta un 30 % de sales totales (Rodriguez-Valera et al., 1985). Dunaliella posee gran valor biotecnológico, gracias a su capacidad para acumular grandes cantidades de beta-carotenos, lo que además contribuye a proporcionar la coloración rojiza característica de los ambientes hipersalinos donde se encuentra (Oren, 2005). Por otro lado, aunque en una proporción más reducida, en los ambientes hipersalinos podemos encontrar otros eucariotas como larvas de la mosca del género Ephydra, el alga flagelada fotosintética Asteromonas gracilis, hongos filamentosos de los géneros Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Chaetomiun, Cladosporium, Eurotium, Gymnascella, Penicillium, Scopulariopsis, Stachybotrys, Ulocladiumy o Wallemia; levaduras halófilas y halotolerantes como Aureobasidium pullulans, Candida parapsilosis, Debaryomyces hansenii, Hortaea werneckii, Phaeotheca triangularis, Pichia guilliermondii, Rhodosporidium sphaerocarpum, Rhodosporidium babjevae, Rhodotorula laringes, Trimmatostroma salinum y Yarrowia lipolytica, así como varios tipos de protozoos ciliados y flagelados (Cho, 2005; Butinar et al., 2005a, 2005b, 2005c; Ventosa, 2006; Triadó-Margarit & Casamayor, 2013; Jančič et al., 2015, 2016; Martinelli et al., 2017; Gostinčar et al., 2019). I.2.IV.II.4. Virus Los virus constituyen las entidades biológicas más diversas y abundantes del planeta, estimándose alrededor de 1031 virus en todo el mundo (Breitbart & Rohwer, 2005), lo que resulta en un orden de magnitud mayor al número de células procariotas totales (Kallmeyer et al., 2012). Curiosamente, los ambientes hipersalinos presentan las mayores concentraciones de partículas similares a virus por mililitro (VLP/mL) y de ratios virus/célula, alcanzándose hasta 1010 VLP/mL y ratios superiores a los 100 virus/célula (Santos et al., 2012). Atendiendo a su morfología, se han descrito principalmente cuatro tipos diferentes: cabeza-cola, esféricos, filamentosos y fusiformes (en forma de huso o limón) (Santos et al., 2012), aunque otro tipo de morfologías poco frecuentes también han sido observadas en un estudio del lago Retba, Senegal (Sime-Ngando et al., 2011). Los genomas de estos virus presentan un rango de tamaño que varía desde 10 hasta 533 kb (Santos et al., 2012). En los ambientes hipersalinos se observa como la comunidad vírica varía de forma paralela con la comunidad celular en función del gradiente de salinidad, de tal forma que, a medida que aumenta la salinidad, la concentración vírica se incrementa desde los 107 VLP/mL del agua de mar (3,5 % de salinidad) (Wigington et al., 2016) hasta los 1010 VLP/mL que se Introducción 17 pueden encontrar en ambientes con salinidades superiores al 30 % (Guixa-Boixareu et al., 1996; Santos et al., 2012). Asimismo, la morfología de los virus también varía acorde a los cambios de salinidad, siendo los fusiformes en tipo de huso poco abundantes a bajas salinidades pero alcanzando concentraciones de hasta el 25 % en cristalizadores de salinas mediterráneas (Guixa-Boixareu et al., 1996) e incluso hasta el 46 % en el lago Retba (Sime-Ngando et al., 2011). Por otro lado, la diversidad en el tamaño de los genomas víricos se reduce al incrementar la salinidad (Díez et al., 2000; Sandaa et al., 2003; Santos et al., 2007), donde a salinidades comprendidas entre el 4-15 % de NaCl, el tamaño de los genomas víricos oscila entre 32 y 533 kb; a salinidades entre el 15 y el 20 %, entre 32 y 63 kb; mientras que a salinidades superiores del 20 % hasta la saturación de NaCl, se observa principalmente una banda de 37 kb. Cabe destacar la importancia de los virus en el control poblacional de las comunidades microbianas en estanques cristalizadores, ya que a salinidades superiores al 25-30 % no se encuentran eucariotas bacteriótrofos, y por lo tanto son los virus los únicos agentes biológicos responsables del control poblacional (Guixa-Boixareu et al., 1996). A pesar de la enorme cantidad de virus presentes en los ambientes hipersalinos, solo ha sido posible cultivar alrededor de 100 fagos, la mayoría de ellos infectando a especies del phylum Euryarchaeota como Halorubrum, Halobacterium, Haloarcula, Haloferax, Natrialba y Natrinema (Atanasova et al., 2012, 2015, 2018; Demina et al., 2016, 2017; Fu et al., 2016; Dyall-Smith et al., 2019; Mizuno et al., 2019). Sorprendentemente, hasta la fecha no se ha podido cultivar ningún virus relacionado con la haloarquea cuadrada Haloquadratum walsbyi o del phylum Nanoarchaeota, microorganismos dominantes en muchos ambientes hipersalinos, aunque si se ha podido obtener información sobre estos virus mediante clonaje en fósmidos o single cell genomics (Garcia-Heredia et al., 2012; Martínez-García et al., 2014). En lo que respecta a virus de bacterias halófilas, apenas 20 bacteriófagos han podido ser aislados en cultivo los cuales infectan a especies de géneros como Halomonas, Salicola, Salinivibrio o Salinibacter (Kauri et al., 1991; Seaman & Day, 2007; Kukkaro & Bamford, 2009; Villamor et al., 2018). Tampoco se han aislado ni identificado virus del alga Dunaliella salina ni de hongos halófilos. La mayoría de los virus cultivados, independientemente de si infectan bacterias o arqueas halófilas, presentan morfología de cabeza-cola, aunque también se han aislado algunos virus de arqueas con morfología pleomórfica y de tipo limón (Atanasova et al., 2015). Ana Durán Viseras 18 Las elevadas concentraciones de sal a las que se encuentran expuestos los microorganismos que habitan en los ambientes hipersalinos, ha propiciado el desarrollo de diferentes estrategias que les permitan obtener el balance osmótico necesario no sólo para vivir en estas condiciones, sino también para poder adaptarse a los posibles cambios bruscos de las mismas. Dado que la mayoría de las membranas biológicas son permeables al agua, no es posible el desarrollo de ningún mecanismo basado en el bombeo activo de agua a través de éstas ante los cambios de osmolaridad en el medio externo, y por tanto, son necesarias otras adaptaciones para mantener la alta presión osmótica intracelular. Básicamente los microorganismos halófilos presentan dos estrategias; la denominada salt-in, que se caracteriza por la acumulación de iones inorgánicos en el interior celular, y la denominada salt-out, donde éstos se expulsan al exterior y en su lugar se compilan compuestos orgánicos denominados solutos compatibles (Gunde-Cimerman et al., 2018). Los microorganismos que utilizan el mecanismo de osmorregulación salt-in acumulan fundamentalmente K+ en el interior celular, mientras que el Na+ es expulsado en la medida de lo posible de la célula, dado el carácter tóxico que supone para ésta cuando se encuentra a elevadas concentraciones (Carden et al., 2003; Munns & Tester, 2008). El ion Clpor su parte, es el anión importado por excelencia. Se estima que las concentraciones de K+ en el citosol oscilan entre 300 y 500 mM en organismos procariotas no halófilos, y que éstas alcanzan valores superiores a 1 M en los microorganismos que habitan en ambientes hipersalinos (Epstein, 2003; Gunde-Cimerman et al., 2018); mientras que por su parte el Na+ se reduce hasta un tercio de la concentración externa (Gunde-Cimerman et al., 2018). Algunos autores indican que la acumulación preferencial de K+ se encuentra relacionada con la compatibilidad de este ion con el agua y con la estructura de las proteínas incluso a altas concentraciones, dado su radio iónico, la magnitud del campo eléctrico en su superficie y la estructura de su capa de hidratación (Eisenman, 1961; Clarkson & Hanson, 1980). El movimiento de iones a través de la membrana para poder alcanzar las concentraciones intracelulares necesarias requiere de mecanismos de transporte activo. La energía exigida para ello procede del gradiente de protones generado en la respiración a través de la cadena transportadora de electrones o de las bombas de protones de las bacteriorrodopsinas dependientes de la luz. El Na+ puede ser excluido de la célula por medio de sistemas antiportadores Na+/H+, mientras que el K+ puede atravesar Introducción 19 pasivamente la membrana, a través de canales a favor de gradiente eléctrico, aunque también se han descrito otros sistemas de transporte de K+ dependientes de energía (Gunde-Cimerman et al., 2018). Al igual que en el caso del metabolismo, los avances en el análisis genómico han mostrado que existe una diversidad considerable de transportadores de potasio en arqueas halófilas (Jensen et al., 2015), algunos de los cuales se muestran en la Tabla 2. La acumulación del anión Clpuede producirse por cotransporte con Na+ o mediante la proteína halorrodopsina, un canal de cloruros que emplea la luz solar para importar este ion al citoplasma (Duschl & Wagner, 1986; Gunde-Cimerman et al., 2018). Transportador Función Especie identificada NapA Antiportador Na+/H+ Haloarcula marismortui Haloferax volcanii Halobacterium sp. Nha Antiportador Na+/H+ Haloarcula marismortui Haloferax volcanii Halobacterium sp. Trk Simportador K+/H+ Haloarcula marismortui Haloferax volcanii Halobacterium sp. Kdp ATPasa transportadora de K+ Halobacterium sp. Mth Canal de K+ dependiente de Ca2+ Haloarcula marismortui Haloferax volcanii Halobacterium sp. Pch Canal de K+ Haloarcula marismortui Haloferax volcanii Halobacterium sp. Nad Simportador Na+/Cl- Haloarcula marismortui Haloferax volcanii Halobacterium sp. Nac Simportador Na+/Cl- Haloarcula marismortui Haloferax volcanii Halobacterium sp. Halorrodopsina Halorrodopsina para el transporte de Cl- Haloarcula marismortui Haloferax volcanii Halobacterium sp. La mayoría de los microorganismos con estrategia salt-in son halófilos extremos, requieren al menos un 15-20 % (p/v) de sal para crecer y su crecimiento se encuentra muy limitado a salinidades inferiores. Las arqueas de la clase Halobacteria son los microorganismos con una estrategia de tipo salt-in por excelencia, siendo concretamente Halobacterium salinarum, Haloferax volcanii y Haloarcula marismortui los organismos Ana Durán Viseras 20 modelo para el estudio de adaptaciones osmóticas dentro de este grupo (Youssef et al., 2014). Otros microorganismos halófilos conocidos con estrategia salt-in son las arqueas metanógenas de la clase “Methanonatronarchaeia”, las bacterias pertenecientes al orden Halanaerobiales, el género Salinibacter y la especie bacteriana fotótrofa Halorhodospira halophila (Raymond & Sistrom, 1969; Antón et al., 2002; Elevi Bardavid & Oren, 2012a; Deole et al., 2013; Sorokin et al., 2017; Gunde-Cimerman et al., 2018). Para adaptarse a las altas concentraciones iónicas que se acumulan en el citoplasma ante los cambios de salinidad del ambiente, los microorganismos halófilos con esta estrategia requieren una serie de adaptaciones enzimáticas, lo que limita el rango salino en el que estos pueden vivir (Lanyi, 1974; Oren, 2008; Deole et al., 2013). Los microorganismos salt-in se caracterizan por presentar un proteoma fundamentalmente ácido con un mayor predominio de aminoácidos cargados negativamente (aspartato, glutamato), así como de aminoácidos hidrofóbicos (fenilalanina, isoleucina, leucina), frente a los básicos (lisina y arginina) y los menos hidrofóbicos (glicina, alanina, serina y treonina) (Kastritis et al., 2007; DasSarma & DasSarma, 2015). La superficie cargada negativamente hace a las proteínas más solubles y flexibles a las condiciones de alta salinidad, en las cuales las de los microorganismos no halófilos se agregarían, volviéndose más rígidas y finalmente precipitando (Elcock & McCammon, 1998; Bolhuis, 2002; Gunde-Cimerman et al., 2018). Los microorganismos con estrategia salt-out por su parte, se caracterizan por expulsar estas sales iónicas desde el citoplasma al exterior celular para conseguir lidiar con las concentraciones salinas del medio externo. Para ello, acumulan moléculas no iónicas altamente solubles en agua y de bajo peso molecular denominadas solutos compatibles, sin que se produzcan en este caso, cambios en la actividad enzimática de la célula, aportándoles una mayor flexibilidad que les permite adaptarse a un rango de salinidades mucho más amplio que los organismos con estrategia salt-in. En algunos extremófilos además, estos compuestos no solo les permiten adaptarse a las concentraciones salinas, sino también a otras situaciones de estrés ambiental como cambios bruscos de temperatura. Dada la versatilidad de esta estrategia de osmoadaptación y a pesar de que la síntesis de novo de estos compuestos es un proceso energéticamente más costoso que la estrategia salt-in, este mecanismo es el más extendido en los tres dominios de la vida (Oren, 1999, 2008). Se han descrito diferentes compuestos orgánicos que pueden actuar como solutos compatibles, entre los que se encuentran polioles, azúcares, aminoácidos, betaínas, ectoínas, diaminoácidos N-acetilados o carboxamidas N-derivadas de la glutamina Introducción 21 (Galinski, 1993, 1995; da Costa et al., 1998; Kempf & Bremer, 1998; Martin et al., 1999; Roberts, 2005). Un mismo microorganismo puede acumular diferentes tipos de solutos compatibles empleando uno u otro en función de las condiciones externas (Oren et al., 2009; Czech & Bremer, 2018). La acumulación intracelular de estos compuestos puede ser el resultado de la síntesis de novo o del transporte desde el exterior a través de proteínas específicas de alta afinidad (Nau-Wagner et al., 1999; Hoffmann et al., 2013). Cuando la salinidad desciende, estos compuestos son excretados al exterior a través de canales mecanosensitivos o bien son catabolizados, es decir, descompuestos gracias a la acción de enzimas específicas, para su posterior utilización como fuente de carbono y/o energía (Czech & Bremer, 2018; Czech et al., 2018). Si la salinidad vuelve a aumentar, algunos de estos microorganismos pueden acumular de manera transitoria iones inorgánicos hasta la síntesis de nuevos solutos compatibles (Wood et al., 2001). Este mecanismo de osmoadaptación es el más extendido entre los microorganismos halófilos moderados y halotolerantes, siendo la estrategia utilizada por los eucariotas halófilos y por la gran mayoría de las bacterias halófilas. El glicerol y otros polioles son generalmente empleados por protistas, algas y hongos, mientras que las bacterias fundamentalmente utilizan la ectoína y la glicina betaína (Gunde-Cimerman et al., 2018). Por otro lado, aunque las haloarqueas han sido tradicionalmente descritas como un grupo coherente de microorganismos salt-in, recientemente también se ha visto que miembros de la clase Halobacteria son capaces de sintetizar trehalosa y acumular algunos solutos compatibles, como la glicina betaína, la ectoína y la prolina (Anderson et al., 2011; Becker et al., 2014; Youssef et al., 2014). El transporte de solutos compatibles, no obstante, no implica el uso del mecanismo salt-out, ya que, como se ha mencionado, estos compuestos pueden servir como fuente de carbono y nitrógeno o como termoprotectores (Holtmann & Bremer, 2004; Tschapek et al., 2011; Orellana et al., 2013). Además, las variaciones de salinidad en el medio externo provocan cambios en la composición lipídica de la membrana de la célula. En bacterias halófilas y halotolerantes, principalmente disminuye la proporción de lípidos neutros de tipo fosfatidiletanolamina, mientras que se incrementa la cantidad de lípidos aniónicos como fosfatidilglicerol (PG) y cardiolipinas (Russell & Kogut, 1985; Russell, 1989; Sutton et al., 1991; Gunde-Cimerman et al., 2018). Los estudios llevados a cabo en haloarqueas, por su parte, son mucho menos numerosos. Entre los efectos observados destaca la formación de cardiolipinas a expensas de fosfatidilglicerol (PG), un descenso en el contenido de fosfatidilglicerol fosfato métil éster (PGP-Me) y un aumento del contenido de lípidos C25C20 a expensas de los C20C20 (Gunde-Cimerman et al., 2018). Ana Durán Viseras 22 Las aplicaciones biotecnológicas de los microorganismos halófilos son muy variadas y han resultado de gran interés en diversos procesos industriales, dada la plasticidad metabólica de estos microorganismos y su capacidad para adaptarse a las condiciones ambientales extremas de los ecosistemas en los que habitan. Algunos de los procesos en los que estos microorganismos intervienen en la industria alimentaria se conocen desde la antigüedad, como el proceso de obtención de la sal común mediante salinas solares, la producción de alimentos fermentados (salsas de pescado o de soja típicas de países asiáticos), los salazones o las aceitunas de mesa (Sinsuwan et al., 2008; Oren, 2010a; Abriouel et al., 2011; Lucena-Padrós & Ruiz-Barba, 2016; Medina et al., 2016; Park & Park, 2016) Son numerosas las aplicaciones biotecnólogicas que presentan las enzimas de las haloarqueas, desde su empleo en la industria alimentaria, la textil o la papelera, hasta su uso en el desarrollo de la biomedicina, la industria farmacéutica o la producción de detergentes (Rao et al., 1998; Tanuja et al., 2000; Beg et al., 2001; Eichler, 2001; Elms et al., 2003; Gomes & Steiner, 2004; Hutcheon et al., 2005; Najafi et al., 2005; Sukumaran et al., 2005; Hatori et al., 2006; Butt et al., 2008; Ozcan et al., 2009; Zhong et al., 2009; Souza & Magalhães, 2010; Wang et al., 2010; Fu & Kim, 2010; Hung et al., 2011; Bajpai et al., 2015; Amoozegar et al., 2017). Asimismo, se han descrito otros usos de las haloarqueas, como su papel en procesos de biorremediación, la síntesis de polímeros para la producción de plásticos biodegradables o mejorar los procesos de recuperación de petróleo, el uso de las bacteriorodopsinas en terapia génica u optoelectrónica, o el de las halocinas en la industria textil (Fernandez-Castillo et al., 1986; Rodriguez-Valera, 1992; Ding & Lai, 2010; Poli et al., 2011; Cai et al., 2012; Bott et al., 2013; Srivastava & Kowshik, 2015; Wang et al., 2015; Charlesworth & Burns, 2015; Pecher et al., 2016; Amoozegar et al., 2017, 2019; Ashwini et al., 2017; Malik & Furtado, 2019; Menasria et al., 2019). Por otro lado, las bacterias halófilas moderadas también poseen un enorme potencial, dado su mecanismo de adaptación a la salinidad del ambiente y a su capacidad para sintetizar solutos compatibles. Destaca la aplicación industrial de la ectoína como estabilizador de enzimas y productos cosméticos (Graf et al., 2008; Czech et al., 2018) a partir de Halomonas elongata y Marinococcus (Oren, 2002). Otras aplicaciones de la ectoína que se están investigando son el efecto contrarrestante de la luz ultravioleta sobre la piel (Buenger & Driller, 2004), la inhibicion de la agregación y la neurotoxicidad de las placas β-amieloides y su papel en la enfermedad de Alzheimer (Kanapathipillai et al., 2005) y en otras patologías por mal plegamiento de proteínas (Furusho et al., 2005). También se han Introducción 23 realizado ensayos clínicos con ectoína para el tratamiento de la dermatitis atópica leve o moderada (Marini et al., 2014) y se estima que pueda resultar de gran utilidad en procesos de biología molecular como PCRs y microarrays de ADN (Mascellani et al., 2007). Otra utilidad biotecnológica de los microorganismos halófilos es la producción de polímeros de interés económico, como son los exopolisacáridos. Estos compuestos tienen un enorme interés en campos como la medicina, la farmacia, la industria cosmética, alimentaria o petrolífera, donde se utilizan como agentes gelificantes o emulsionantes (Freitas et al., 2011). La empresa LIPOTEC por ejemplo, utiliza exopolisacáridos producidos por bacterias halófilas moderadas para desarrollar productos cosméticos (Soley, 2013). Algunos microorganismos halófilos considerados para su explotación industrial por la producción de estos compuestos en grandes cantidades son Haloferax mediterranei, varias especies de los géneros Halomonas, Idiomarina y Chromohalobacter, y la cianobacteria Aphanothece halopytica (Béjar et al., 1998; Arias et al., 2003; Llamas et al., 2006, 2012; Mata et al., 2006, 2008; Oren, 2010; Radchenkova et al., 2018). Por otra parte, entre los eucariotas halófilos destaca el alga halófila Dunaliella salina por la producción de β-caroteno, el cual es extensamente utilizado industrialmente como antioxidante, como colorante alimentario y como fuente de provitamina A (retinol) (Ma’Or et al., 2000; Oren, 2002, 2005). Los numerosos estudios llevados a cabo en los ambientes hipersalinos acuáticos y terrestres, han permitido conocer la diversidad microbiana que habita en los mismos, especialmente en los últimos años con los avances recientes en las técnicas de secuenciación masiva (Oren, 2015; Ventosa et al., 2015). Las salinas solares constituyen excelentes modelos para el estudio de la biodiversidad y ecología de microorganismos a diferentes concentraciones de sales gracias al sistema de estanque múltiple, donde la salinidad varía desde aquellos con menor cantidad de sales (concentradores) a los estanques donde precipita la sal por evaporación del agua del mar (cristalizadores). Es por eso que se han realizado un elevado número de estudios en diferentes salinas solares localizadas a lo largo de la geografía (Benlloch et al., 1996, 2001; Sandaa et al., 2003; Pašić et al., 2005, 2007; Pedrós-Alió, 2005; Baati et al., 2008, 2011; Oh et al., 2010; Ghai et al., 2011; Trigui et al., 2011; Boujelben 2012a, 2012b; Dillon et al., 2013; Ana Durán Viseras 30 Resultados similares a los de muchos de estos trabajos se obtuvieron en otros estudios sobre diversidad en otros puntos del planeta. Bacillus, Halomonas y Shewanella fueron los géneros más frecuentemente aislados por Irshad y colaboradores (2014) al analizar suelos costeros en varias regiones de Corea. Mientras que, Halorubrum, Natrinema, Natronorubrum, Haloterrigena y Natronococcus constituyen los géneros más abundantes, mediante técnicas independientes de cultivo, en un suelo transitoriamente salino en Salt Spring (Columbia Británica, Canadá) (Walsh et al., 2005). Secuencias afiliadas a los géneros Haloferax y Natronomonas fueron identificadas por Wang y colaboradores (2011) en suelos salinos contaminados de un yacimiento petrolífero en China, mientras que en diferentes muestras de suelos salinos de la meseta del Tíbet, Halorubrum y Natronomonas fueron los géneros principales de la clase Halobacteria encontrados por Liu y colaboradores (2016) mediante pirosecuenciación. Por otro lado, nuestro grupo de investigación ha analizado mediante técnicas metagenómicas la diversidad taxonómica existente en dos muestras de suelos salinos localizado en el Paraje Natural Marismas del Odiel, otro de los lugares estudiados también en la presente Tesis Doctoral. Los resultados de este trabajo revelaron que la diversidad procariota que podemos encontrar en suelos salinos es mucho mayor a la que existe en muestras de agua. Las secuencias encontradas en estas bases de datos metagenómicas han revelado que los microorganismos procariotas que habitan en dicho sistema pertenecen a los phyla Euryarchaeota, Bacteroidetes, Balneolaeota y Rhodothermaeota¸ siendo los géneros mayoritariamente representados Halorubrum, Haloarcula, Natronomonas, Salinibacter, Fodinibius y Salinimicrobium. En estos suelos además, se han identificado secuencias del phylum Nanohaloarchaeota, no identificadas anteriormente en ningún otro suelo salino. Asimismo, se han encontrado una gran cantidad de secuencias asignadas a microorganismos no cultivados, así como, otros grupos minoritarios que incluyen especies no halófilas o halotolerantes (Vera-Gargallo, 2018). En un estudio posterior en estos mismos suelos, se analizaron diversos parámetros ambientales relacionados con la distribución de la comunidad procariota y su diversidad. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que la salinidad no constituye un factor muy relevante en la determinación de la estructura o diversidad procariota en el rango salino analizado. En cambio, otras propiedades geoquímicas del suelo, como la textura, la humedad, carbono, azufre y metales sí se relacionaban con cambios en la distribución espacial de la comunidad procariota en estos sistemas (Vera-Gargallo, 2018). Introducción 31 Aunque la mayoría de las haloarqueas comparten características comunes, como la presencia de un proteoma ácido, cadena respiratoria o rodopsinas, la diversidad metabólica que podemos encontrar entre los organismos halófilos es muy variada, existiendo diferentes procesos mediante los cuales los microorganismos halófilos obtienen carbono y energía. Las arqueas halófilas no sólo difieren en lo que a rutas metabólicas se refiere, también en sus requerimientos nutricionales (Falb et al., 2008). La gran mayoría de las haloarqueas descritas son heterótrofas y aerobias, capaces de crecer en un amplio rango de sustratos, entre los que se incluyen aminoácidos y carbohidratos, aunque también encontramos algunas con un metabolismo más limitado (Anderson et al., 2011; Andrei et al., 2012). Así, Haloferax mediterranei, Halorubrum saccharovorum, Haloarcula marismortui y Halococcus saccharolyticus pueden catabolizar hexosas (glucosa, fructosa), pentosas (arabinosa, xilulosa), sacarosa y lactosa, mientras que Halobacterium salinarum o Natronomonas pharaonis en cambio, son incapaces de crecer a partir de azúcares (Rawal et al., 1988; Altekar & Rangaswamy, 1992; Johnsen et al., 2001; Johnsen & Schönheit, 2004). Haloferax volcanii por su parte, requiere ácidos orgánicos y glicerol para su crecimiento (Kauri et al., 1990). Se han descrito haloarqueas capaces de degradar polímeros, gracias a la producción de enzimas como amilasas, DNAsas, lipasas y proteasas (Oren, 2006a). Algunos representantes del grupo utilizan un número de sustratos poco comunes, como hidrocarburos aromáticos y alifáticos (Bertrand et al., 1990; Zvyagintseva et al., 1995). Se ha demostrado que una cepa de Haloferax aislada a partir de suelo contaminado con petróleo, crecía sobre diferentes compuestos aromáticos, incluyendo benzoato, cinamato y 3-fenilpropionato, como única fuente de carbono y energía (Emerson et al., 1994). Asimismo, Zhao y colaboradores (Zhao et al., 2017) aislaron una cepa relacionada con el género Halorientalis capaz de crecer y utilizar hexodecanos como fuente de carbono. Más recientemente, también han sido descritas varias haloarqueas alcalófilas capaces de utilizar sustratos como la celulosa o la quitina (Sorokin et al., 2015, 2019a, 2019b). En lo que respecta al metabolismo del carbono, los polisacáridos son la principal fuente empleada. Su utilización implica la captación por medio de transportadores específicos de membrana y su hidrólisis intracelular para generar hexosas (glucosa, galactosa, manosa o fructosa) y pentosas (xilosa o arabinosa), las cuales serán oxidadas por una serie de rutas metabólicas centrales. Ana Durán Viseras 32 Podemos encontrar una gran variedad de rutas para la degradación de la glucosa a piruvato, siendo la ruta de Embden-Meyerhof (EM) o glicolisis la más extendida en los tres dominios de la vida (Figura 5). Esta ruta sin embargo, no es funcional en haloarqueas ya que las actividades hexoquinasa y fosfofructoquinasa son bajas y se inhiben a elevadas concentraciones salinas (Rawal et al., 1988). Aunque estudios recientes basados en métodos moleculares han detectado actividad hexoquinasa o fosfofructoquinasa en haloarqueas, los genes codificantes de estas enzimas no han podido ser identificados (Williams et al., 2019). Además, estos autores indican que la presencia de una u otra actividad es excluyente de la otra, lo que reafirma la carencia de funcionalidad de esta vía (Williams et al., 2019) Este grupo por tanto, emplea otras formas alternativas, como la ruta Entner-Doudoroff (ED) modificada o la ruta de las pentosas fosfato (PP), entre otras (Melendez-Hevia et al., 1997). En la ruta ED modificada que presentan las haloarqueas (Figura 5), el paso de la fosforilación está postpuesto. La glucosa es oxidada a 2-ceto-3-desoxigluconato (KDG) y después fosforilada a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato (KDPG), el cual se escinde en piruvato y gliceraldehído-3-fosfato (Tomlinson et al., 1974). Finalmente, converge en la vía denominada de tres átomos de carbono de la ruta EM para llegar a producir piruvato (Danson, 1993; Fothergill-Gilmore & Michels, 1993). Esta última parte de la ruta parece ser ubicua en arqueas, lo que sugiere un origen ancestral (Ronimus & Morgan, 2003), a diferencia de lo que ocurre en la primera parte, donde la existencia de diferentes variantes de las enzimas glicolíticas refleja una evolución independiente. Las enzimas conservadas (3-fosfoglicerato a piruvato) probablemente son el resultado de la transferencia horizontal de genes, mientras que las enzimas únicas lo son de la evolución independiente (de glucosa a 3-fosfoglicerato) (Verhees et al., 2003). La gluconeogénesis, por su parte, es la ruta biosintética en la cual el piruvato es convertido de nuevo en fructosa 6-fosfato o glucosa 6-fosfato, en algunos casos incluso, llegando hasta glucosa (Figura 5). Parece estar presente en la mayoría de las haloarqueas, siendo Halorhabdus utahensis una de las pocas excepciones (Anderson et al., 2011). La vía gluconeogénica comparte muchas enzimas con la de EM, por lo que se puede considerar la parte reversible de esta ruta. Solo tres enzimas son específicas de la misma: piruvato carboxilasa, fructosa-1,6-bifosfatasa y glucosa-6-fosfatasa. Además, muchos de los Introducción 33 intermediarios de esta ruta sirven como precursores de un gran número de rutas anabólicas, incluida la de las PP. Generalmente, las arqueas con un metabolismo autótrofo o heterótrofo son capaces de generar pentosas, las cuales participan en la biosíntesis de nucleótidos y de ciertos aminoácidos, para las que se necesitan determinadas enzimas implicadas en el metabolismo de éstas (Verhees et al., 2003). Una ruta general para la obtención de las pentosas es la de las PP, que consta de una parte oxidativa y de otra no oxidativa (Figura 6). A través de la parte oxidativa, la glucosa fosforilada es oxidada a gluconato 6-fosfato (C6) y posteriormente convertido en ribulosa 5-fosfato (C5) mediante descarboxilación oxidativa. En la vía no oxidativa, por su parte, la fructosa 6-fosfato (C6) y el gliceraldehído 3-fosfato (C3) son convertidos en ribulosa 5-fosfato (C5) en un proceso que consta de cinco reacciones enzimáticas (Falb et al., 2005). En el dominio Archaea, la vía oxidativa tradicional de las PP parece estar ausente, ya que carecen de los genes codificantes de estas enzimas. No obstante, Aitken y Brown (1969) describieron actividad glucosa 6-fosfato deshidrogenasa en haloarqueas, lo que sugiere la presencia de homólogos de esta enzima e indicando así, la existencia de una ruta oxidativa de las PP modificadas en haloarqueas. Del mismo modo, el conjunto de genes codificantes de las enzimas de la parte no oxidativa tampoco parece estar muy extendido en haloarqueas, aunque sí se estima que puedan existir otras rutas alternativas a través de las cuales esta vía opere en algunos grupos (Soderberg, 2005). Figura 5. Representación de los ciclos glicolisis, gluconeogénesis y Entner-Doudoroff modificado que presentan las haloarqueas. Los nombres en verde corresponden a las enzimas únicas del ciclo glicolítico, en naranja las del ciclo gluconeogénico y en azul las enzimas comunes de ambos ciclos. En violeta se muestran las enzimas correspondientes a la ruta Entner-Doudoroff modificada de haloarqueas. Ana Durán Viseras 34 Una vez generado el piruvato tras el proceso glicolítico, este es convertido en acetil-CoA por la enzima piruvato-ferredoxin oxidorreductasa (porAB) para posteriormente entrar en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) o ciclo de Krebs (Figura 7A). Aunque este ciclo dentro del dominio Archaea es muy variable y a menudo aparece incompleto, las haloarqueas en cambio sí codifican todos los genes de las enzimas participantes en el mismo (Huynen et al., 1999). No obstante, aunque las haloarqueas codifican el complejo 2-oxoácido dehidrogenasa, es la enzima 2-oxoacid-ferredoxina oxidorreductasa (porAB y korAB), como se ha mencionado, la que actúa sobre el piruvato y el 2-oxoglutarato, respectivamente (Kerscher & Oesterhelt, 1981a, 1981b), por lo que Falb y colaboradores (2008) sugieren que este complejo juegue un papel dentro de la degradación de los aminoácidos de cadena ramificada. El ciclo del glioxilato constituye una variante metabólica de esta ruta, concretamente de las etapas descarboxilantes (Figura 7B). Este ciclo ha sido descrito para Haloferax volcanii en presencia de acetato, mediante las enzimas isocitrato liasa y un tipo de malato sintetasa (Serrano & Bonete, 2001), así como se han detectado homólogos de estas enzimas en Natronomonas pharaonis y Haloquadratum walsbyi (Falb et al., 2008). Figura 6. Representación de la ruta de las pentosas fosfato. Los nombres en azul corresponden a las enzimas. Abreviaciones: G6P, glucosa-6-fosfato; G6PDH, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; 6PGL, 6-fosfoglucono-δ-lactona; 6PGLasa, 6-fosfoglucono-δ-lactonasa; 6PG, 6-fosfogluconato; 6PGDH, 6-fosfogluconato deshidrogenasa; Ru5P, ribulosa-5-fosfato; Ru5PE, ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa; R5PI, ribosa-5-fosfato isomerasa; R5P, ribosa-5-fosfato; X5P, xilulosa-5-fosfato; TK, transcetolasa; S7P, sedoheptulosa-7-fosfato; GAP, gliceraldehído-3-fosfato; TAL, transaldolasa; E4P, eritrosa-4-fosfato y F6P, fructosa-6-fosfato. Introducción 35 Por otro lado, el uso de los carbohidratos está asociado habitualmente a la producción de ácidos, ya que la oxidación de cada sustrato es incompleta (Hochstein et al., 1978; Hochstein, 1988). Cuando Halorubrum saccharovorum crece en un medio con glucosa, se ha demostrado que excreta acetato y piruvato (Tomlinson & Hochstein, 1972; Tomlinson et al., 1978). Con otros azúcares se pueden formar ácidos aldónicos: Halorubrum saccharovorum produce ácido galactónico en presencia de galactosa (Hochstein et al., 1976); y a partir de lactosa se forma ácido lactobiónico (Tomlinson et al., 1978); asimismo la arabinosa, la ribosa y la xilosa se oxidan a sus correspondientes ácidos aldónicos (Hochstein et al., 1978; Hochstein, 1988). En cultivos de diversas especies de Haloferax y Haloarcula que crecen en presencia de glicerol se ha identificado acetato, piruvato y D-lactato (Oren & Gurevich, 1994). Figura 7. Representación de: A) ciclo de los ácidos tricarboxílicos; B) ciclo del glioxilato. Ana Durán Viseras 36 En relación con el nitrógeno, existe una gran diversidad metabólica. El nitrógeno es uno de los elementos esenciales de las células, siendo concretamente el ion amonio, la fuente de nitrógeno inorgánico más comúnmente asimilado. Este compuesto puede ser incorporado directamente a la célula a través del transportador Amt, o bien obtenerse de forma indirecta a través del ciclo del nitrógeno. Dentro del ciclo del nitrógeno pueden tener lugar diferentes procesos como la fijación de dinitrógeno (N2) o la reducción de nitratos por las vías asimilatoria o desasimilatoria (Bonete et al., 2008). Existen, asimismo, otros transportadores implicados en la captación de compuestos nitrogenados, ya sea en forma de nitratos, aminoácidos o derivados nitrogenados como la taurina, urea, putrescina o espermidina (Bonete et al., 2008; Michael, 2018). Algunas haloarqueas son fijadoras de dinitrógeno, el cual pasa a ion amonio mediante la enzima nitrogenasa. Este amonio así generado puede ser utilizado de diferentes maneras, bien para sintetizar biomoléculas que contengan nitrógeno, o bien, para su oxidación a nitrato y posteriormente a nitrito (proceso denominado nitrificación) (Figura 8A) (Bonete et al., 2008). En la vía asimilatoria, el nitrato es reducido secuencialmente a nitrito y éste, a su vez, a amonio, mediado por las enzimas nitrato (Nas) y nitrito (Nir) reductasas, respectivamente. Este amonio será utilizado para la síntesis de compuestos nitrogenados, mediante la formación de glutamato (Figuras 8A y 8B). Este proceso puede darse mediante dos vías. La primera de ellas se da preferentemente a altas concentraciones de amonio y tiene lugar mediante una única reacción reversible en la cual los compuestos 2-oxoglutarato, amonio y NADPH+ dan lugar a glutamato y NADP+, mediada por la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH). En la segunda, en cambio, tienen lugar dos reacciones enzimáticas irreversibles que ocurren de forma secuencial, catalizadas por las enzimas glutamina sintetasa (GS) y glutamato sintasa (GOGAT), respectivamente. En primer lugar, los compuestos glutamato, amonio y ATP dan lugar a glutamina, ADP y fosfato inorgánico. Seguidamente, la glutamina así generada junto con 2-oxoglutarato generan dos moléculas de glutamato con la subsecuente formación de energía. Esta segunda vía es particularmente importante ya que favorece la asimilación de amonio cuando sus concentraciones citosólicas son bajas (Bonete et al., 2008). En ambos casos, una vez sintetizado el glutamato, el grupo α-amino puede ser transferido a otros esqueletos de carbono mediante reacciones de transaminación, dando lugar así a los diferentes aminoácidos (Reitzer, 2005). Introducción 37 En la vía desasimilatoria, el nitrato es reducido a nitrito y éste puede reducirse a su vez a amonio, que podrá ser excretado al medio (amonificación) o secuencialmente reducido a óxido nítrico, óxido nitroso y dinitrógeno (desnitrificación), volviendo este último de nuevo a la atmósfera (Figura 8A) (Zumft, 1997). Figura 8. Representación del metabolismo del nitrógeno (adaptado de Bonete et al., 2008). A) Ciclo del nitrógeno, B) Rutas para la formación de glutamato a partir del ion amonio. En azul se representan los nombres de las rutas (A) y las enzimas (B). En relación con los aminoácidos, el metabolismo que podemos encontrar es también muy versátil. Son numerosas las haloarqueas capaces de sintetizar estos compuestos o de crecer a partir de ellos empleándolos como fuente de nitrógeno y energía. Así, existen diferentes variantes para la síntesis de los mismos, procesos que, en muchos casos, se Ana Durán Viseras 38 encuentran interrelacionados unos con otros. Las haloarqueas pueden también obtener otros compuestos nitrogenados a través de procesos como la degradación de aminoácidos mediante enzimas específicas o en el catabolismo de la urea (Falb et al., 2008). Uno de los factores que puede limitar el desarrollo de las haloarqueas en los ambientes hipersalinos es la disponibilidad de oxígeno, debido fundamentalmente a la baja solubilidad del mismo en altas concentraciones de sales. Por este motivo, algunas haloarqueas pueden compensar esta limitación produciendo vesículas de gas que les permite flotar hacia la interfase aire-agua (Oren, 2006). Muchas arqueas halófilas, además, son capaces de crecer en anaerobiosis, utilizando aceptores de electrones diferentes al oxígeno, o mediante la fermentación de compuestos orgánicos. Otras incluso, pueden llevar a cabo procesos estrictamente anaerobios como la metanogénesis, la homoacetogénesis o la desasimilación de azufre (Oren, 2002, 2011a; Sorokin et al., 2016a, 2016b). Entre los aceptores finales de electrones alternativos al oxígeno utilizados por las haloarqueas se encuentran el nitrato, el dimetilsulfóxido, la trimetilamina N-oxidada o el fumarato (Oren, 2006, 2008). La capacidad de reducción del nitrato se encuentra ampliamente distribuida entre los miembros de la clase Halobacteria. Haloarcula marismortui, Haloarcula vallismortis y Haloferax mediterranei son algunos ejemplos de haloarqueas capaces de crecer anaeróbicamente utilizando el nitrato como aceptor final de electrones (Mancinelli & Hochstein, 1986). Hochstein y colaboradores (1991) describieron la presencia de enzimas nitrato reductasas en Haloferax denitrificans y Haloferax mediterranei, y, años más tarde, diversos estudios también revelaron la presencia del complejo NarGH (nitrato reductasa respiratoria) en Haloarcula marismortui y Haloferax mediterranei, entre otras, permitiéndoles reducir el nitrato en condiciones anaerobias (Yoshimatsu et al., 2002; Lledó et al., 2004; Martínez-Espinosa et al., 2006). El nitrato generalmente es reducido a N2, aunque también se ha visto en otras especies la formación de N2O (Hochstein & Tomlinson, 1985; Mancinelli & Hochstein, 1986; Tomlinson et al., 1986). Considerando las bajas concentraciones de nitrato que se encuentran generalmente en los sistemas hipersalinos, y la aparente ausencia del proceso regenerativo del mismo (nitrificación) a elevadas concentraciones salinas, cabe esperar que este proceso solo ocurra de forma limitada en la naturaleza (Oren, 1994). Introducción 39 Otros aceptores de electrones alternativos para la respiración en muchas especies son el dimetilsulfóxido (DMSO), la trimetilamina N-oxidada (TMAO) y el fumarato. Mientras que Halobacterium salinarum, Haloferax mediterranei, Haloarcula marismortui y Haloarcula vallismortis crecen en anaerobiosis en presencia de DMSO o TMAO; Haloferax volcanii, por su parte, crece en anaerobiosis en presencia de DMSO, pero no de TMAO (Oren & Trüper, 1990). Por otro lado, aunque la importancia ecológica de la reducción de DMSO no está bien definida, TMAO, sin embargo, parece estar disponible como aceptor de electrones en pescados en salazón (Oren & Trüper, 1990). En los últimos años, también se ha descrito el uso de nuevos aceptores de electrones en grupos de arqueas halófilas y haloalcalófilas, anaerobias estrictas o facultativas, como los géneros Halanaeroarchaeum, Halalkaliarchaeum y alguna especie de Natronolimnobius (Sorokin et al., 2016a, 2016b, 2019b). Estos grupos son capaces de crecer por oxidación del acetato, formiato o butirato utilizando el azufre como aceptor de electrones (Sorokin et al., 2016a, 2016b, 2018b, 2019c). Destaca especialmente el uso del acetato como donador de electrones, ya que este no había sido identificado previamente en ningún otro grupo del dominio Archaea (Sorokin et al., 2016b). Asimismo, se han descrito que las haloarqueas puedan participar también en procesos fermentativos. Halobacterium salinarum es capaz de fermentar L-arginina hasta citrulina, permitiéndole el crecimiento en anaerobiosis, así como otras haloarqueas fermentan la arginina dando lugar a ornitina, amonio o dióxido de carbono (Hartmann et al., 1980; Oesterhelt, 1982; Bickel-Sandkötter et al., 1996; Ruepp & Soppa, 1996; Oren, 2006). En la mayoría de los ambientes hipersalinos, el glicerol es una fuente de carbono muy abundante, el cual es producido en grandes cantidades por el alga Dunaliella (Borowitzka et al., 1977; Phadwal & Singh, 2003). Se ha descrito la capacidad de varios grupos de haloarqueas para catabolizar el glicerol mediante su fosforilación a glicerol 3-fosfato con la subsecuente formación de dihidroxiacetona fosfato (DHAP). La arquea haloalcalófila Natronomonas pharaonis carece de esta ruta de degradación, lo que podría estar relacionado con los ambientes alcalinos en los que habita donde Dunaliella no es productor primario. Cabe mencionar que el glicerol 3-fosfato derivado del metabolismo del glicerol no es el mismo utilizado en la síntesis del esqueleto glicerofosfato de los lípidos de haloarqueas, por lo que se trata de rutas metabólicas independientes entre sí (Nishihara et al., 1999). Ana Durán Viseras 46 relacionadas, utilizando en todos los casos las mismas condiciones experimentales (Schleifer, 2009; Tindall et al., 2010). Aunque la caracterización fenotípica esté cayendo en desuso y tenga muchos detractores (los cuales recomiendan la obtención de estos datos a partir del genoma), no podemos olvidar que ésta sigue siendo importante, ya que algunos de los genes, aunque presentes, puede que no se expresen en determinadas condiciones o no ser funcionales, por tanto estas características sólo son demostrables de manera experimental. Asimismo, el estudio del genoma permite contrastar la veracidad de los resultados obtenidos experimentalmente por lo que lo más recomendable sería llevar a cabo una exhaustiva comparación del genoma vs el fenoma. Por otro lado, la caracterización morfológica y fisiológica de los microorganismos a describir debe ser requisito indispensable, ya que permite conocer el aspecto del nuevo taxón en cuestión y los requerimientos para su crecimiento en condiciones óptimas. I.5. Grupos estudiados para la descripción de nuevos taxones En esta Tesis Doctoral se han caracterizado y descrito varios nuevos grupos de arqueas halófilas, pertenecientes a dos órdenes y familias diferentes: Halobacteriales y Haloferacales, y Haloarculaceae y Halorubraceae, respectivamente. Actualmente el orden Halobacteriales se encuentra constituido por tres familias Halobacteriaceae, Halococcaceae y Haloarculaceae (Gupta et al., 2016). Los miembros de este orden han sido aislados a partir de diferentes ambientes hipersalinos, entre los que se incluyen lagos salados y alcalinos, salinas solares, agua de mar, aguas sulfurosas y sedimentos, entre otros (Gupta et al., 2015; Oren et al., 2017). La mayoría son arqueas halófilas extremas y requieren al menos 2,5 M de NaCl para su crecimiento. Aunque la mayoría de los miembros de este orden necesitan pH neutro para crecer, algunos lo hacen a pH ácido o alcalino. Son quimiorganotrofos, aerobios estrictos en su mayoría, pueden ser móviles o no, y exhiben morfologías de tipo bacilar, cocoide o pleomórfica. El contenido en G+C de los representantes de este orden varía entre 52 y 67 moles% (Oren et al., 2017). Introducción 47 El género Halorientalis fue propuesto por Cui y colaboradores (2011) para acomodar a dos cepas aisladas de la salina solar Taibei, al este de China, descritas como Halorientalis regularis (Cui et al., 2011). El género Halorientalis, incluye además, otras dos especies: Halorientalis persicus (Amoozegar et al., 2014), aislada del lago hipersalino Aran-Bidgol (Irán) y Halorientalis brevis (Yuan et al., 2015), aislada del lago hipersalino Yuncheng (China). Este género se incluye en la familia Haloarculaceae, orden Halobacteriales, clase Halobacteria y phylum Euryarchaeota (Amoozegar et al., 2017; Oren et al., 2017). Las células de las especies de este género son bacilos o pleomórficas, móviles y Gram-negativas. Poseen un metabolismo estrictamente aerobio y heterótrofo. Halófilas extremas, capaces de crecer en un rango de salinidad entre 15 y el 30 % de NaCl, de temperatura entre 20 y 50 ºC y de pH entre 6,0 y 9,0. Catalasa y oxidasa positivas. Los lípidos polares de los miembros de este género son fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilglicerol fosfato métil éster (PGP-Me) y un glicolípido cromatográficamente idéntico a sulfato diglicosil diéter (S-DGD-1). El contenido en G+C del ADN genómico varía entre 61,5 y 61,9 moles%, determinado experimentalmente (Cui et al., 2011). Algunos estudios realizados mediante técnicas independientes de cultivo han demostrado la presencia de representantes del género Halorientalis en otros ambientes, como muestras de sedimentos y otros ambientes acuáticos hipersalinos (Youssef et al., 2012; Al-Mailem et al., 2014). El género Natronomonas se engloba dentro de la familia Haloarculaceae, en el orden Halobacteriales, de la clase Halobacteria y del phylum Euryarchaeota. La especie tipo del género es Natronomonas pharaonis, aislada a partir de salmueras alcalinas en Egipto. Esta especie fue inicialmente descrita como Halobacterium pharaonis (Soliman & Trüper, 1982) y reclasificada posteriormente como Natronobacterium pharaonis (Tindall et al., 1984), hasta su clasificación actual dentro del género Natronomonas (Kamekura et al., 1997). Además de la especie tipo, actualmente el género solo cuenta con otras dos especies descritas, Natronomonas moolapensis (Burns et al., 2010a) y Natronomonas gomsonensis (Kim et al., 2013), aisladas de salinas solares de Australia y Corea, respectivamente. El género Natronomonas es uno de los géneros de haloarquea más antiguos y mejor conocidos, en él se han realizado numerosos estudios sobre sus rodopsinas, las Ana Durán Viseras 48 aplicaciones de éstas o el potencial biotecnológico de sus enzimas, entre otros (Stan-Lotter et al., 1999; Cao et al., 2008a, 2008b; Gradinaru et al., 2008; Chen et al., 2016; Kato et al., 2016; Amtul & Aziz, 2017; Sakajiri et al., 2018; Fujisawa et al., 2019). Se trata de un género bastante peculiar: aunque dos de sus especies son neutrófilas, Natronomonas pharaonis, sin embargo, es alcalófila e incapaz de crecer a valores de pH por debajo de 8,0, siendo además la primera especie halófila y alcalófila descrita. Son células Gram-negativas, presentan una morfología muy variada de bacilos muy cortos, formas cocoides y también pleomórficas. Las colonias poseeen pigmentación roja. Quimiorganotrofos y aerobios, requieren al menos una concentración de 12,5 % de NaCl para crecer. Los lípidos polares mayoritarios son fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilglicerolfosfato metil éster (PGP-Me) y ácido fosfatídico, algunos otros fosfolípidos o glicolípidos también pueden estar presentes (Burns et al., 2010a). El contenido en G+C del ADN oscila entre 61,0-64,0 moles% (Kim et al., 2013). Su presencia ha sido identificada mediante técnicas independientes de cultivo en diversos ambientes hipersalinos, y en algunos casos también alcalinos, como lagos salados y alcalinos, salinas solares, suelos y sedimentos, yacimientos petrolíferos, etc. (Burns et al., 2004; Sime-Ngando et al., 2011; Wang et al., 2011; Ghai et al., 2011; Boujelben et al., 2012a; Oueriaghli et al., 2013; Fernández et al., 2014a; Sankaranarayanan et al., 2014; Tazi et al., 2014; Sun et al., 2015; Navarro-Noya et al., 2015; Dalvi et al., 2016; Haferburg et al., 2017; Han et al., 2017; Vera-Gargallo & Ventosa, 2018b; Couto-Rodríguez & Montalvo-Rodríguez, 2019). El orden Haloferacales ha sido establecido en el año 2015 (Gupta et al., 2015) y recibe su nombre del género tipo Haloferax (Torreblanca et al., 1986). En él actualmente se incluyen dos familias, Halorubraceae y Haloferacaceae (Gupta et al., 2016; Oren et al., 2017). Los miembros de este orden se encuentran ampliamente distribuidos en los ambientes hipersalinos. Se caracterizan por presentar diversas morfologías, entre las que se incluyen bacilos, cocos, células pleomórficas e incluso formas cuadradas. Crecen óptimamente a un pH neutro, y muestran un metabolismo tanto heterótrofo como quimiorganotrofo. Además, algunos de los representantes de este orden son móviles o contienen vesículas de gas. El contenido en G+C del ADN de este grupo es de 55-66 moles% (Oren et al., 2017). Introducción 49 El género Halonotius se encuentra clasificado dentro de la familia Halorubraceae, del orden Haloferacales y de la clase Halobacteria (Amoozegar et al., 2017), fue descrito por Burns y colaboradores en el año 2010, y, hasta la fecha, contaba con una única especie descrita, Halonotius pteroides. Esta especie fue descrita a partir de un grupo de cepas aisladas de las salinas de Cheetham en Australia, filogenéticamente relacionadas con secuencias abundantes en el lago Deep en la Antártida (Bowman et al., 2000). Numerosos estudios llevados a cabo mediante técnicas independientes de cultivo han identificado la presencia de este género en diversos ambientes hipersalinos, tanto acuáticos como suelos (Makhdoumi-Kakhki et al., 2012; Podell et al., 2013, 2014; Çınar & Mutlu, 2016; Rubin et al., 2017; Haferburg et al., 2017; Han et al., 2017; Vera-Gargallo & Ventosa, 2018; Ramos‐Barbero et al., 2019). A partir del metagenoma del Lago Tyrrell, en Australia, incluso se han conseguido extraer dos genomas ambientales relacionados con dicho género (Podell et al., 2013). La única especie del género Halonotius se caracteriza por presentar una morfología de bacilo aplanado con bordes redondeados, Gram-negativos y móviles. Son aerobios y heterótrofos, además de catalasa y oxidasa negativos (Burns et al., 2010b). Objetivos 53 Los ambientes hipersalinos constituyen excelentes modelos de hábitats extremos, los cuales se caracterizan por presentar un alto contenido en sales, factor entre otros, que limita la biodiversidad presente en ellos. Estos hábitats están representados fundamentalmente por sistemas acuáticos y por suelos hipersalinos. El estudio de los mismos ha dado lugar a un extenso conocimiento sobre la diversidad filogenética y funcional de los microorganismos halófilos, sus mecanismos de adaptación a altas concentraciones de sales y sus interacciones, entre otros. Asimismo, los numerosos estudios realizados, han permitido tras muchos esfuerzos, aislar y caracterizar un elevado número de los microorganismos halófilos que allí habitan, algunos de los cuales constituyen una proporción importante de las comunidades microbianas de estos ambientes. Por otro lado, el desarrollo de las nuevas técnicas de secuenciación masiva y la realización de estudios metagenómicos, tanto en salinas solares como en suelos hipersalinos, han demostrado su gran potencial en el campo de la ecología microbiana, permitiendo la descripción de la comunidad de estos hábitats, así como las relaciones entre su diversidad, estructura y diversos parámetros ambientales y edáficos. Estos estudios por su parte, también han puesto de manifiesto que existe una gran biodiversidad por conocer en estos ambientes, debido fundamentalmente a la dificultad de su cultivo. Aunque los estudios metagenómicos aporten un nivel de detalle sin precedentes, no podemos olvidar que el cultivo de microorganismos sigue siendo imprescindible, ya que establece la prueba tangible de la existencia de esos microorganismos. Además, la posibilidad de disponer de dichos microorganismos en cultivo puro constituye el método más fiable para poder llevar a cabo la caracterización completa de los mismos. Asimismo, permite obtener información detallada sobre su filogenia, metabolismo y relevancia ecológica y resulta absolutamente indispensable para el desarrollo de aplicaciones biotecnológicas. En base a estos precedentes, en el presente trabajo nos propusimos continuar realizando tareas de aislamiento de nuevos microorganismos halófilos que pudieran aportar luz a esa fracción de microorganismos que aún se desconocen, con un enfoque diferente a los que se han venido utilizando hasta el momento. De este modo, se han diseñado numerosos medios y condiciones de cultivo que satisficieran los requerimientos nutricionales y de tiempo de crecimiento de las especies microbianas que pudieran estar presentes, con la finalidad de aislar y caracterizar esos grupos microbianos predominantes en los ambientes hipersalinos no descritos hasta la fecha. Material y Métodos 59 III.1. Muestreos y tratamiento de las muestras Para el aislamiento de nuevos grupos microbianos de arqueas y bacterias halófilas se llevaron a cabo en total tres muestreos en diferentes ambientes hipersalinos localizados en la provincia de Huelva. Dichos muestreos se realizaron en septiembre de 2014 y en junio de 2016. Las muestras fueron tomadas a partir de un suelo hipersalino localizado en el Paraje Natural Marismas del Odiel (37°12´26´´N 6°57´58´´O) y de agua de las salinas de Isla Cristina (37°12´30´´N 7°19´41´´O) y de Isla Bacuta (37°15´26´´N 6°58´50´´O) (Tabla 3). Punto de muestreo Tipo de muestra Designación de la muestra Salinidad (%) CE1:5 (mS/cm) pH Fecha muestreo Marismas del Odiel Suelo SMO1 - 24,00 7,80 Septiembre 2014 Marismas del Odiel Suelo SMO2 - 54,50 8,90 Septiembre 2014 Marismas del Odiel Suelo S1 - 26,4 7,98 Junio 2016 Marismas del Odiel Suelo S2 - 20,3 7,90 Junio 2016 Marismas del Odiel Suelo S3 - 49,8 7,74 Junio 2016 Marismas del Odiel Suelo S4 - 39,9 7,72 Junio 2016 Isla Cristina Agua F1 23 - 7,56 Junio 2016 Isla Cristina Agua F2 34 - 7,26 Junio 2016 Isla Cristina Agua F3 23 - 7,5 Junio 2016 Isla Cristina Agua F4 23 - 7,43 Junio 2016 Isla Cristina Agua F5 32 - 7,56 Junio 2016 Isla Cristina Agua F6 31 - 7,47 Junio 2016 Isla Cristina Agua F9 31 - 7,13 Junio 2016 Isla Cristina Agua F10 10 - 7,79 Junio 2016 Isla Cristina Agua F11 19 - 7,72 Junio 2016 Isla Cristina Agua F12 31 - 7,35 Junio 2016 Isla Cristina Agua F13 27 - 7,53 Junio 2016 Isla Cristina Agua F14 30 - 7,46 Junio 2016 Isla Cristina Agua F15 31 - 7,49 Junio 2016 Isla Cristina Agua F16 32 - 7,52 Junio 2016 Isla Cristina Agua IC14 14 - 7,48 Junio 2016 Isla Cristina Agua IC17 16 - 7,59 Junio 2016 Isla Cristina Agua IC23 23 - 7,34 Junio 2016 Isla Cristina Agua IC37 32 - 7,47 Junio 2016 Isla Cristina Agua IC28 0,22µ 28 - 7,39 Junio 2016 Isla Cristina Agua IC30 0,22µ 29 - 7,38 Junio 2016 Isla Cristina Agua IC36 0,22µ 33 - 7,45 Junio 2016 Isla Bacuta Agua F7 20 - 7,71 Junio 2016 Ana Durán Viseras 60 Punto de muestreo Tipo de muestra Designación de la muestra Salinidad (%) CE1:5 (mS/cm) pH Fecha muestreo Isla Bacuta Agua F8 32 - 7,46 Junio 2016 Isla Bacuta Agua F17 19 - 7,83 Junio 2016 Isla Bacuta Agua F18 27 - 7,51 Junio 2016 Isla Bacuta Agua F19 19 - 7,82 Junio 2016 Isla Bacuta Agua F20 17 - 7,76 Junio 2016 Isla Bacuta Agua IB35 30 - 7,39 Junio 2016 Isla Bacuta Agua IB32 0,22µ 31 - 7,68 Junio 2016 La concentración salina de las muestras de agua se determinó con un refractómetro Atago S-28, mientras que la de las muestras de suelo con un conductímetro CRISON 35+ (Hach Lange Spain) en un extracto 1:5 con agua destilada. El pH en todos los casos se determinó mediante un pHmetro CRISON GLP 21. En cada punto de muestreo se recogieron aproximadamente 50 ml de agua o 200 g de suelo en recipientes estériles y se trasladaron al laboratorio en un corto plazo de tiempo. Una vez allí, se procedió a su siembra en diferentes medios de cultivo. III.2. Medios de aislamiento Con el objetivo de aislar la mayor representación posible de nuevos grupos de haloarqueas y de bacterias halófilas no descritas hasta la fecha, se utilizaron medios de cultivo previamente descritos en la literatura, utilizando en todos los casos dos salinidades diferentes, 15 y 25 %. Para conseguir la salinidad deseada en cada caso, se realizaron diluciones a partir de una solución de sales al 30 %, denominada Sw30. A la vez que se diseñaron nuevos medios de cultivo utilizando directamente el agua de las salinas. Se trata de una solución de sales cuya composición mantiene proporciones relativas similares a las del agua de mar (Subov, 1931) con una pequeña disminución en las concentraciones de CaCl2 y NaHCO3, que se añaden por separado para evitar su precipitación. A partir de esta solución se prepararon algunos de los medios de cultivo utilizados, realizando diluciones para obtener las salinidades deseadas en cada caso. Material y Métodos 61 La composición de esta solución de sales es: La composición de los medios empleados en esta Tesis Doctoral se detalla a continuación. Todos ellos se esterilizaron en autoclave a una temperatura de 121 °C durante 20 minutos. Se trata de un medio rico diseñado por Reasoner & Geldreich. (1985), que contiene diferentes fuentes de carbono. Este medio se preparó a dos salinidades diferentes, 15 y 25 %. Su composición para 100 ml es la siguiente: Se trata de un medio suplementado con piruvato sódico (0,1 %) y digerido de caseína (0,5 %) como únicos nutrientes. Este medio se preparó a dos salinidades diferentes, 15 y 25 %. NaCl 234,0 g MgCl2·6H2O 39,0 g MgSO4·7H2O 61,0 g *CaCl2 1,0 g KCl 6,0 g *NaHCO3 0,2 g NaBr 0,7 g Agua destilada c.s.p 1000 ml *Se disuelven por separado Extracto de levadura 0,05 g Proteosa peptona n°.3 0,05 g Casaminoácidos 0,05 g Dextrosa 0,05 g Almidón soluble 0,05 g Piruvato sódico 0,03 g Fosfato dipotásico 0,03 g Sulfato de magnesio 0,005 g Agua destilada c.s.p 15 % ó 25 % SW30 c.s.p 15 % ó 25 % Ana Durán Viseras 62 Se trata de un medio suplementado con extracto de levadura (0,01 %) y glicerol (0,1 %) como únicos nutrientes. Este medio se preparó a dos salinidades diferentes, 15 y 25 %. En estos tres casos el pH del medio se ajustó a 7,5 con NaOH 1 M y se añadió agar purificado (Oxoid) a una concentración del 2 %, cuando fue necesario. Se trata de una serie de medios empleados en este trabajo con el propósito de aislar nuevos grupos microbianos. Para ello, se emplearon diferentes metodologías en función del tipo de extracto utilizado (agua o suelo), con el objetivo de que la composición química de los medios de cultivo fuera lo más parecida posible a la ambiental. En el caso de los medios preparados con agua salinas, se utilizó agua de las salinas filtrada (0,22 µm), a la cual se le añadió extracto de levadura (0,05 %) como nutriente. El pH y la salinidad original de la muestra se mantuvieron. En el caso de los medios preparados con extracto de suelo, se siguió la metodología descrita por Hamaki et al., 2005. Se pesaron 250 g de suelo y se disolvieron en 500 ml de NaOH 50 mM, dejándose decantar toda la noche. Transcurrido ese tiempo, se filtró, y se añadieron las sales necesarias para obtener una salinidad del 15 y del 25 %. El pH de la muestra se mantuvo. En estos casos, los medios se solidificaron utilizando agarosa (Seaken, LE Agarose) al 2 %. III.3. Tratamiento de las muestras y aislamiento de cepas Una vez en el laboratorio, se procedió a la siembra de las muestras en los diferentes medios de cultivo preparados. Para ello se actuó de diferente manera en función del tipo de muestra. Muestras de agua: Se realizaron diluciones seriadas al décimo a partir de las muestras hasta la dilución 10-2, en solución salina estéril al 15 y 25 %, en función del medio de cultivo en el que iban a ser sembradas. Dichas diluciones, al igual que las muestras directas, se inocularon en los diferentes medios de cultivo mediante siembra con espátula (100 µl/placa). Material y Métodos 63 Muestras de suelo: Se pesó un gramo de muestra y se suspendió en 5 ml de solución salina estéril al 15 y 25 %, en función del medio de cultivo en el que iban a ser sembradas, y se agitó mediante Vortex durante cinco minutos. Posteriormente, se realizaron diluciones seriadas al décimo hasta la dilución 10-3 para cada una de las salinidades, y se inocularon 100 µl de cada una de las diluciones en los distintos medios de cultivo mediante siembra con espátula (100 µl/placa). Las placas ya inoculadas se incubaron a 37 °C durante más de dos meses, protegidas en bolsas de plástico perfectamente cerradas, con el fin de evitar la evaporación y desecación del medio. A lo largo del período de incubación, se fueron observando los distintos tipos de colonias y marcando aquellas de crecimiento más rápido y primera aparición. Tras dicho período, se seleccionaron aquellas colonias de crecimiento más tardío, que no habían sido marcadas previamente y que además pudieran pasar desapercibidas a simple vista debido a su menor tamaño y apenas pigmentación. Dichas colonias se purificaron mediante siembras sucesivas en el mismo medio de aislamiento hasta obtener cultivos puros. III.4. Material biológico Durante el presente trabajo se aislaron un total de 2085 cepas en cultivo puro, de las cuales han sido identificadas un total de 254, donde 209 corresponden a cepas de haloarqueas y 45 a cepas de bacterias halófilas. El resto de cepas se conservan en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia (Universidad de Sevilla) para futuros estudios. En este trabajo se han utilizado como referencia un total de 13 cepas provenientes de diferentes colecciones de cultivo, que se muestran en la Tabla 4. Cepa Referencia Halonotius pteroides CECT 7525T Burns et al. (2010b) Natronomonas pharaonis CECT 4578T Soliman & Truper (1982) Natronomonas moolapensis CECT 7526T Burns et al. (2010a) Halorientalis persicus IBRC-M 10043T Amoozegar et al. (2014) Halorientalis regularis JCM 16425T Cui et al. (2011) Halomicroarcula pellucida CECT 7537T Echigo et al. (2013) Ana Durán Viseras 64 Cepa Referencia Halomicroarcula limicola JCM 18640T Zhang & Cui (2014) Halomicroarcula salina JCM 18369T Zhang & Cui (2015) Halobacterium salinarum DSM 3754T Harrison & Kennedy (1922) Halorubrum saccharovorum DSM 1137T Tomlinson & Hochstein (1976) Halovenus aranensis IBRC-M 10015T Makhdoumi-Kakhki et al. (2012) Halohasta litorea JCM 17270T Mou et al. (2012) Halohasta litchfieldeiae JCM 15066T Mou et al. (2012) Todas las cepas aisladas y caracterizadas en este trabajo, a excepción de las cepas F16-60T y F13-25T, se han cultivado rutinariamente en medio R2A al 25 % de sales (ver apartado III.2.II.). Dichas cepas se cultivaron en los medios DBCM2 (detallado a continuación) y en el suplementado con glicerol al 25 % de sales (ver apartado III.2.IV), respectivamente. Medio DBCM2 Debido a que la cepa F16-60T, objeto de estudio en este trabajo, se aisló a partir de uno de los medios preparados con extractos, su posterior cultivo y mantenimiento no pudo llevarse a cabo en el mismo al no disponerse de más muestra. El cultivo rutinario de esta cepa se llevó a cabo en el medio DBCM2, cuya composición se detalla a continuación: Dónde la composición del medio MHE 25 es: El pH se ajustó a 7,2. Se añadió agar (iNtRON Biotechnology®) al 2 % cuando fue necesario. Piruvato sódico 0,11 g Medio MHE 25 2,5 ml Agua destilada 16,67 ml SW30 83,33 ml Glucosa 0,1 g Peptona 0,5 g Extracto de levadura 0,5 g Agua destilada 16,67 ml SW30 83,33 ml Material y Métodos 65 La conservación de todas las cepas se llevó a cabo de forma rutinaria mediante siembras en tubos de agar inclinado en los diferentes medios de cultivo óptimos para cada microorganismo. Asimismo, paralelamente, para su conservación a largo plazo, las cepas se congelaron a -80 °C en el medio adecuado conteniendo glicerol al 20 %, en relación 1:1 cultivo/glicerol 40 %. III.5. Estudio filogenético de las cepas aisladas En primer lugar, con el objetivo de determinar la posición filogenética de cada una de las cepas aisladas, se realizó la amplificación y secuenciación parcial del gen ARNr 16S, únicamente con un cebador, el F27 en el caso de bacterias halófilas y el F21 en el caso de las haloarqueas (ver apartado III.5.II.). Una vez obtenidas las secuencias parciales, de aproximadamente 700 pb, estas se compararon con las secuencias disponibles en las bases de datos con la ayuda del programa BLAST (Altschul et al., 1990) del servidor NCBI (National Center for Biotechnology Information) y la aplicación Ez-BioCloud (Yoon et al., 2017) (ver apartado III.5.V.II.). Los resultados de estos análisis se utilizaron para llevar a cabo el estudio sobre la biodiversidad cultivable. Para la representación gráfica de estos resultados se utilizó el software Krona (Ondov et al., 2011). Aquellas cepas cuyas secuencias parciales del gen ARNr 16S presentaron valores de semejanza con respecto a las secuencias disponibles de las cepas tipo de especies ya descritas, inferiores al 97-98 % o al 95 % (valores límites para considerar una cepa como una posible nueva especie [Stackebrandt y Goebel, 1994] o un nuevo género [Ludwig et al. 1998], respectivamente), se preseleccionaron con el objetivo de llevar a cabo un estudio más exhaustivo de cada una de ellas. Para determinar la posición filogenética más detallada de estas cepas preseleccionadas, se procedió a la amplificación y secuenciación completa del gen ARNr 16S de las mismas. Dichas secuencias, volvieron a ser comparadas con las disponibles en las bases de datos, siendo finalmente seleccionadas para este estudio aquellas cepas cuyas secuencias completas del gen ARNr 16S (de aproximadamente 1400 pb) presentaron un porcentaje de semejanza igual o inferior al 98,6 %. Posteriormente, debido a las limitaciones del gen ARNr 16S en el caso de las haloarqueas (Boucher et al., 2004; Sun et al., 2013), a estas cepas preseleccionadas se les realizó la secuenciación del gen esencial (housekeeping) rpoB´ (ver apartado III.5.II.). Ana Durán Viseras 66 Para la extracción del ADN genómico que se utilizó tanto para la amplificación del gen ARNr 16S o rpoB´ como para la secuenciación del genoma de las diferentes cepas, se utilizó una modificación a pequeña escala del método Marmur (1961). El protocolo seguido fue el que se muestra a continuación: 1. Obtención de células: centrifugar aproximadamente 3 ml de cultivo durante 2 minutos a 13.000 rpm y eliminar el sobrenadante 2. Lavado de células: añadir al pellet 500 µl de EDTA salino, pH 8,0 3. Incubar durante 30 minutos a 37 °C en un termobloque 4. Lisis celular: a) Añadir 50 µl de SDS al 25 % en agua destilada b) Incubar en un termobloque a 60 °C durante 10 minutos c) Añadir 120 µl de perclorato sódico 5M 5. Desproteinización: a) Añadir 800 µl de una mezcla de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) b) Agitar vigorosamente durante 30 minutos mediante Vortex c) Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 rpm d) Extraer el sobrenadante et alocar en un tubo limpio 6. Precipitación del ADN: a) Añadir 1,2 ml de etanol puro frío b) Invertir el tubo 3 o 4 veces c) Centrifugar durante 15 minutos a 13.000 rpm d) Desechar el sobrenadante 7. Lavado del ADN: a) Añadir 500 µl de etanol al 70 % b) Centrifugar durante 3 minutos a 13.000 rpm c) Desechar el sobrenadante 8. Dejar secar el pellet unos minutos 9. Resuspender el pellet en 50 µl de agua miliQ estéril EDTA salino: EDTA, 33,62 g; NaCl, 8,7 g; agua destilada, c.s.p. 1000 ml. pH 8,0 SDS 25 %: Solución de dodecil sulfato sódico al 25 % (p/v) en agua destilada NaClO4 5 M (perclorato sódico): NaClO4 702,3 g; agua destilada c.s.p.1000 ml Material y Métodos 67 Una vez extraído, el ADN fue purificado utilizando un kit comercial de purificación MEGAquick-spinTM plus (iNtRON Biotechnology), siguiendo las instrucciones del fabricante. La electroforesis de ADN en geles horizontales de agarosa es una técnica ampliamente utilizada que nos permite visualizar la integridad del ADN extraído, así como separar e identificar los distintos fragmentos de ADN en función de su tamaño, para poder comprobar la amplificación por PCR de dichos fragmentos. El fundamento de la técnica de electroforesis se basa en la carga negativa que poseen las moléculas de ADN en los grupos fosfato, propiedad por la cual migran hacia el polo positivo cuando se someten a un campo eléctrico. El gel de agarosa actúa como una matriz que permite separar estas moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. De este modo, los fragmentos pequeños de ADN migrarán más rápido hacia el polo positivo mientras que las moléculas más grandes quedarán más cerca del polo negativo. Para llevar a cabo la electroforesis, se prepararon geles de agarosa (Seaken, LE Agarose) a una concentración 1 % (p/v) en tampón TAE 1x (preparado a partir de TAE 50x) y sumergidos en ese mismo tampón en la cubeta de electroforesis. Los geles de agarosa se tiñeron con 3 µl de RedSafe 20.000x (iNtRON Biotechnology) para la visualización del ADN, el cual se intercala en la doble cadena del ADN y permite su visualización tras la exposición del gel a la luz UV a 360 nm (Sambrook & Russell, 2001), mediante el uso de un transiluminador (TFP-M/WL). Para cargar las muestras de ADN en el gel, se realizaron diluciones de las muestras en tampón de carga 6x en una proporción 2:4; se utilizó un patrón de pesos moleculares de 1 kb (Invitrogen) y se aplicó una corriente eléctrica de 60 V durante 40 minutos. Tampón TAE 50x: ácido acético glacial, 57,1 ml; EDTA 50 mM, pH 8,0; tris-base, 242 g; agua destilada, c.s.p. 1000 ml. Tampón TAE 1x: TAE 50x, 20 ml; agua destilada, 980 ml. Tampón de carga 6x: Azul de bromofenol 0,25 % (p/v); sacarosa 40 % (p/v); xilén-cianol 0,25 % (p/v). Ana Durán Viseras 74 colonias que se quieren analizar y se incuban a 37 °C en agitación durante 10-15 horas 2. Una vez crecido, el cultivo se centrifuga a temperatura ambiente a 7000 rpm durante 3 minutos. Seguidamente, se desecha el sobrenadante y se añade al tubo 200 µl de una mezcla compuesta por 10 ml de solución de lisis y 750 µl de lisozima (10 mg/ml) 3. Resuspendemos las células en la solución de lisis con la ayuda de un agitador Vortex durante 30 segundos 4. A continuación, se hierve el conjunto durante 40 segundos y se centrifuga 5 minutos a 12000 rpm y temperatura ambiente 5. Eliminamos el sedimento mucoso con un palillo estéril 6. A cada tubo se añaden 20 µl de acetato sódico 3 M y seguidamente se precipita el ADN con 250 µl de isopropanol 7. La mezcla se incuba a -20 °C durante 15 minutos y a continuación se centrifuga 20 minutos a 12000 rpm y a 4 °C 8. El precipitado se lava con 1 ml de etanol al 70 % a temperatura ambiente, se seca al vacío y se resuspende finamente en 30 µl de tampón TE Solución de lisis: Sacarosa 1 M, 23,39 ml, Tritón X-100, 0,5 ml, EDTA 0,5 M pH 8,0, 10 ml, Tris HCl 1 M pH 8,0, 1 ml, agua destilada c.s.p. 100 ml Tampón TE: Tris HCl 10 mM pH 9,0, EDTA, 1 mM pH 8,0 Medio LB: Bacto triptona (10 g/l), extracto de levadura (5 g/l), NaCl (10 g/l) y H2O estéril c.s.p. 1000 ml Una vez se extrajo el ADN plasmídico, se comprobó su extracción mediante electroforesis en gel de agarosa (apartado III.5.I.III.) y se procedió a su digestión con la enzima de restricción Eco R1 para comprobar el éxito de la clonación. Se seleccionaron las colonias que presentaban el inserto de PCR (1500 pb), y se volvió a extraer el ADN plasmídico de todas ellas, utilizando en este caso el kit DNA-spinTM (iNtRON Biotechnology), que permite obtener ADN purificado de mejor calidad. Posteriormente, este ADN fue secuenciado por la empresa STABVida (Oeiras, Portugal), utilizando los cebadores T7 (5´ TAATACGACTCACTATAGGG 3´) y SP6 (5´ ATTTAGGTGACACTATAG 3´). Las secuencias así obtenidas se analizaron como se describe en los apartados III.5.V.I., III.5.V.II y III.5.V.III. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR en este trabajo han sido secuenciados por las empresas NBT-NewBiotechnic (Sevilla) y STABVida (Oeiras, Portugal), mediante el uso de secuenciadores automáticos ABI 3130XL y ABI 3730 XL (Applied Biosystems), respectivamente. Material y Métodos 75 Los cebadores utilizados para la secuenciación de estos fragmentos de ADN se detallan en la Tabla 6. En primer lugar, se realizó la secuenciación parcial del gen ARNr 16S, para la que se utilizó el cebador F27 en el caso de bacterias halófilas, y F21 en el caso de las haloarqueas. Para las cepas de interés seleccionadas, se realizó la secuenciación completa del gen ARNr 16S, utilizando adicionalmente los cebadores R1488, F530 y R343 (Tabla 6), en el caso de bacterias halófilas, y R1492, B36 y D34 (Tabla 6), en el caso de haloarqueas. Los cebadores utilizados para la secuenciación del gen rpoB´ fueron los mismos que se utilizaron para su amplificación (rpoBF y rpoBR), ya detallados en la Tabla 5. La secuenciación de estos cebadores permite obtener un solapamiento completo de las secuencias parciales y poder de esta forma obtener la secuencia completa del gen (Figuras 14 y 15). Cebador Especificidad Orientación Secuencia 5´→3´ Posición 16F21 Arqueas Directo TTC CGG TTG ATC CTG CCG GA 7-26 16R1492 Universal Reverso GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 1509-1491 16FB36 Arqueas Reverso GGA CTA CCA GGG TAT CTA 789-806 16FD34 Arqueas Reverso GGT CTC GCT CGT TGC CTG 1096-1113 16F27 Bacterias Directo AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 8-27 16R1488 Bacterias Reverso CGG TTA CCT TGT TAG GAC TTC ACC 1511-1488 F530 Bacterias Directo GTG CCA GCA GCC GCG G 515-530 R343 Bacterias Reverso ACT GCT GCC TCC CGT A 358-343 Figura 14. Estrategia seguida para el solapamiento de los cebadores utilizados en la secuenciación del gen ARNr 16S. Figura 15. Estrategia seguida para el solapamiento de los cebadores utilizados en la secuenciación del gen rpoB´. 21F 5’ ? ` ARN 16S de haloarqueas 1500 nucleótidos aprox. 3’ B36 R1492R D34 3’ 5’ ? ` F530 16F27 R343 ARN 16S de bacterias 1500 nucleótidos aprox. R1492 3’ 5’ ? ` rpoBR rpoBF rpoB´ 500 nucleótidos aprox. Ana Durán Viseras 76 Para realizar el estudio filogenético se utilizaron tanto las secuencias obtenidas en este trabajo como las secuencias disponibles en las bases de datos públicas (EMBL, GenBank, DDBJ y Silva). En concreto, siempre que fue posible, se utilizaron las secuencias correspondientes a las cepas tipo de las especies cuyos nombres habían sido válidamente publicados. Para el análisis filogenético se utilizaron diferentes programas bioinformáticos que se detallan a continuación. ChromasPro es un programa de edición y análisis de secuencias. Entre otras funciones, permite abrir y guardar secuencias en múltiples formatos (Fasta, fastq, EMBL, GenBank o SwissProt, entre otros), para conseguir el solapamiento de varias secuencias en una única secuencia consenso, mostrando automáticamente ambigüedades que pueden ser editadas manualmente, generar secuencias reversas y/o complementarias y crear cromatogramas de una secuencia dada. De esta forma, las secuencias parciales obtenidas de los genes ARNr 16S y rpoB´ se ensamblaron con la ayuda del programa ChromasPro versión 1.5 (Technelysium Pty Ltd.), corrigiéndose manualmente aquellas indeterminaciones o posiciones ambiguas, obteniéndose así la secuencia completa de dichos genes. Las secuencias parciales o completas del gen ARNr 16S y del gen rpoB´obtenidas se analizaron mediante la comparación de las mismas con las secuencias disponibles en las bases de datos públicas (EMBL, GenBank y DDBJ), con la ayuda del programa BLAST (Altschul et al., 1990) del servidor NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Asimismo, en el caso del gen ARNr 16S también se utilizó la aplicación Ez-BioCloud (Yoon et al., 2017) (https://www.ezbiocloud.net/identify). Material y Métodos 77 El análisis filogenético de las secuencias del gen ARNr 16S se llevó a cabo empleando el programa ARB (Ludwig et al., 1998, 2004), a través de la plataforma virtual NX Client 3.5.0.0. Se trata de un proyecto creado en 1992 como una iniciativa entre el Departamento de Microbiología y la Facultad de Informática de la Universidad Técnica de Múnich y que actualmente continúa en colaboración con el grupo “Microbial Genomics and Bioinformatics” en el Max-Planck Institute for Marine Microbiology, en Bremen. El software ARB es un paquete bioinformático orientado de una forma gráfica que comprende varias herramientas para el manejo de bases de datos de secuencias y análisis de los datos (Ludwig et al., 2004). Se nutre de la base de datos de secuencias de ARNr 16S de Silva (http://www.arb-silva.de/), la cual es periódicamente actualizada y contiene secuencias de calidad comprobada. Con la ayuda del programa integrado en el paquete ARB, Fast Aligner v.1.03., las secuencias del gen ARNr 16S se alinearon con las de las cepas tipo de las especies filogenéticamente más relacionadas, atendiendo tanto a la estructura primaria como a la estructura secundaria de la molécula de ARNr 16S (Woese et al., 1983; Gutell et al., 1985; Ludwig & Schleifer, 1994, 1999). Posteriormente, estos alineamientos se revisaron de forma manual. Una vez revisados los alineamientos, se construyeron los correspondientes árboles filogenéticos y se obtuvieron las matrices de distancia. Para ello se empleó el filtro termini, que elimina las posiciones conservadas en menos de un 50 %. Los valores de distancia se corrigieron por cambios de bases múltiples en posiciones sencillas mediante la fórmula de Jukes & Cantor, 1969. Los árboles fueron construidos en base a tres algoritmos: neighbour-joining (Saitou & Nei, 1987), maximum-parsimony (Kluge & Farris, 1969) y maximum-likelihood (Felsenstein, 1981), y enraizados utilizando una secuencia de referencia como outgroup. Cada uno de estos algoritmos presenta argumentos a favor y en contra; sin embargo, el método maximum-likelihood muestra una serie de ventajas frente a los otros dos, ya que analiza de un modo más eficiente la información filogenética contenida en el alineamiento múltiple, generando así un resultado más real (Serdoz et al., 2017; Wiebel et al. 2017). La importancia de realizar un estudio multimetodológico radica en que a pesar de que cada uno de estos algoritmos presenta un modelo evolutivo diferente, la topología de los árboles construidos en base a ellos debe mantenerse estable. La estabilidad de cada una de las ramas filogenéticas se calculó mediante una estimación de los valores de bootstrap (Felsenstein, 1985). Ana Durán Viseras 78 Para el alineamiento de las secuencias del gen rpoB´ de las cepas estudiadas con las de las cepas tipo de las especies filogenéticamente más relacionadas, se empleó el programa BioEdit versión 3.3.19.0 (Hall, 1999). BioEdit es un programa de interfaz gráfica que ofrece una gran variedad de herramientas para el alineamiento de secuencias de aminoácidos o proteínas, el cual permite realizar modificaciones manuales. Acepta una gran variedad de formatos y cuenta con la integración de ClustalW y BLAST. La construcción de los árboles filogenéticos en base al gen rpoB´, se llevó a cabo utilizando el programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versión 6.0 (Tamura et al., 2013). El programa MEGA permite la construcción de árboles filogenéticos a partir de alineamientos de secuencias de ADN o de proteínas, permitiendo así, llevar a cabo análisis evolutivos moleculares y determinar la historia filogenética del organismo en cuestión. III.6. Caracterización quimiotaxonómica de las cepas aisladas El estudio comparativo de la composición de los lípidos polares de las haloarqueas ha resultado ser una herramienta quimiotaxonómica útil para la clasificación de este grupo, especialmente a nivel de género, ya que el tipo de glicolípido presente es constante en la mayoría de las especies (Kates, 1986; Torreblanca et al., 1986; Grant & Larsen, 1989; Oren et al. 2009). La extracción de los lípidos polares de las cepas objeto de estudio se llevó a cabo siguiendo el método descrito por Bligh & Dyer (1959) y modificado para haloarqueas (Corral, 2013). Material y Métodos 79 Protocolo de extracción de lípidos polares 1. Centrifugar 1 litro de cultivo líquido bien crecido a 7000 rpm durante 10 minutos, eliminar el sobrenadante y mantener el pellet 2. Resuspender las células en solución salina basal, volver a centrifugar y eliminar el sobrenadante 3. Resuspender las células en un pequeño volumen de solución salina basal (1-2 ml) 4. Para extraer los lípidos es necesario crear una monofase: medir el volumen de las células resuspendidas y hacer la siguiente proporción: 0,8:2:1 (suspensión de células/metanol/cloroformo, respectivamente) 5. Agitar durante 15 minutos por inversión, para homogeneizar lo máximo posible. 6. Centrifugar a 6000 rpm durante 6 minutos 7. Recolectar el sobrenadante (sobrenadante 1) cuidadosamente con una pipeta Pasteur de cristal 8. El resto celular residual que queda en el tubo se resuspende en 0,8 ml de solución salina basal, y posteriormente se añaden 2 ml de metanol y 1 ml de cloroformo, con el fin de extraer lípidos residuales 9. Mezclar y centrifugar a 6000 rpm durante 6 minutos 10. Recolectar el sobrenadante (sobrenadante 2). Unir al sobrenadante 1 obtenido en el paso 7 Si el resto celular sigue aún pigmentado se debe repetir la extracción (pasos 8 y 9), para extraer la máxima cantidad posible de lípidos. 11. Añadir al sobrenadante (sobrenadantes 1 y 2): 2 ml de cloroformo y 2 ml de KCl 0.2 M (el KCl se utiliza para reducir y compactar la interfase que aparece al añadir el cloroformo) 12. Agitar y centrifugar a 6000 rpm durante 6 minutos 13. En el tubo aparece claramente una bifase. Extraemos con una pipeta de vidrio la fase inferior (cloroformo) donde están los lípidos 14. Secar el extracto de lípidos totales disueltos en cloroformo en una centrífuga de vacío “speed-vac” 15. Resuspender el extracto seco de lípidos con cloroformo a una concentración conocida 16. Almacenar a -20 ºC Solución salina basal: NaCl, 250 g, KCl, 2 g, MgSO4, 9,8 g, agua destilada, c.s.p. 1000 ml Ana Durán Viseras 80 La identificación de los lípidos polares se llevó a cabo mediante la técnica de cromatografía en capa fina de alta resolución (High Performance Thin-Layer Chromatography, HPTLC). Los extractos lipídicos extraídos de las cepas objeto de estudio, se aplicaron utilizando jeringas Hamilton serie 700, de 10 µl sobre placas Merck HPTLC sílica gel 60 (Art. 5641) de máxima pureza en soporte de cristal, previamente lavadas con cloroformo/metanol (1:1, v/v) y activadas a 180 °C. Tras la aplicación de las muestras, las placas se eluyeron en un sistema de solventes: cloroformo, ácido acético 90 %, metanol (65:30:4, v/v) (Figura 16). Una vez eluídas, las placas fueron reveladas utilizando tres métodos de tinción diferentes: Ácido sulfúrico al 5 % en agua: tinción universal, que permite visualizar todos los lípidos tras un calentamiento suave a 160 °C. Ácido fosfomolíbdico: revelador universal, que permite visualizar todos los lípidos polares, tras un calentamiento suave a 160 °C. Azul de molibdeno: tinción específica para fosfolípidos, revelado inmediato tras aplicación. Figura 16. Cromatografía en capa fina: A) Extractos lipídicos obtenidos; B) Aplicación de la muestra en la placa de HPTLC; C) Desarrollo de la cromatografía. A B C Material y Métodos 81 III.7. Caracterización fenotípica Para la determinación de las propiedades macroscópicas de las cepas objeto de estudio se empleó la caracterización clásica basada en la apariencia de la colonia en la placa de Petri, prestando atención al tamaño, la forma, la pigmentación, la consistencia, el tipo de borde, la superficie y la elevación de la misma. La determinación de la morfología celular y la motilidad se llevó a cabo mediante microscopía de contraste de fases, empleando un microscopio Olympus BX41 provisto de una cámara digital DP70, a partir de cultivos líquidos en fase exponencial. Para la determinación del rango de crecimiento a distintas concentraciones de sal, pH y temperatura de cada cepa estudiada, las células se cultivaron en medio sólido a distintas concentraciones salinas (0,9, 3, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 %), pH (5,0, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 y 10,0) y temperatura (4, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50, 55 y 60 °C). En cada ensayo el resto de los parámetros se mantuvo constante. Los medios se prepararon a partir de la solución de sales al 30 % (SW30) a la cual se añadió extracto de levadura al 0,5 %. Una vez inoculadas, las placas se dejaron incubar durante 14 días durante los cuales se realizaron observaciones periódicas a distintos intervalos de tiempo (1, 3, 5, 7, 10 y 14 días). Para la determinación del requerimiento de Mg2+, el cual posee un importante valor taxonómico para las haloarqueas (Oren et al., 1997), se emplearon placas con el medio base que se detalla a continuación: Extracto de levadura 5,0 g Glucosa 2,0 g NaCl 195,0 g CaCl2 0,83 g KCl 5,0 g NaHCO3 0,17 g NaBr 0,58 g KSO4 35,0 g Agua destilada c.s.p 1000 ml Agar 20,0 g Ana Durán Viseras 82 A este medio se le añadieron cantidades crecientes de MgCl2 para dar lugar a las siguientes concentraciones de magnesio: 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 y 25 %. Al igual que en el caso anterior, las placas se inocularon y se dejaron incubar durante 14 días, durante los cuales se realizaron observaciones periódicas a distintos intervalos de tiempo (1, 3, 5, 7, 10 y 14 días). Se considera que el requerimiento mínimo de magnesio de un microorganismo dado es la menor concentración de magnesio a la cual es capaz de crecer dicho microorganismo. El crecimiento en anaerobiosis se determinó en placa, en su medio óptimo en presencia de nitrato potásico al 3 %, arginina al 4 % o dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 %. Los cultivos se incubaron durante 14 días a 37 °C en campanas de anaerobiosis y se utilizó AnaeroGen (Oxoid) para la generación de la atmósfera anaerobia y un indicador de anaerobiosis (Oxoid) para verificarla. Las pruebas bioquímicas permiten, de forma experimental, determinar las características metabólicas de las cepas objeto de caracterización. Para la determinación de las características bioquímicas se empleó como medio base el medio óptimo para cada microorganismo y se le adicionó el sustrato en cuestión, cuando fue necesario. Esta prueba permite determinar si el microorganismo en cuestión posee el complejo enzimático citocromo C oxidasa, donde el citocromo C, el primer componente en la cadena respiratoria, es capaz de cambiar el color del reactivo tetrametil-p-fenilendiamina, que es incoloro en su estado reducido y de color azul intenso en su estado oxidado (Kovacs, 1956). Con ayuda de un palillo estéril, se extiende sobre un papel de filtro limpio, un inóculo de cultivo joven del microorganismo en cuestión, al que le añadiremos unas gotas del reactivo tetrametil-p-fenilendiamina al 1 % (Difco). La reacción se considera positiva cuando aparece un color azul intenso antes de 10 segundos (Kovacs, 1956). La prueba de la catalasa permite determinar si el microorganismo posee la enzima catalasa, la cual es capaz de descomponer el agua oxigenada en agua y oxígeno. Esta enzima está presente en la mayoría de las haloarqueas que crecen en condiciones aerobias. Material y Métodos 83 La prueba se realizó añadiendo unas gotas de agua oxigenada al 3 % (v/v) sobre un cultivo joven del microorganismo estudiado. Se considera positiva si aparece un burbujeo inmediato, como consecuencia del desprendimiento de oxígeno (Cowan & Steel, 1982). Con esta prueba se pretende determinar si el microorganismo posee la enzima triptofanasa, capaz de actuar sobre el triptófano dando lugar a indol y alanina. Para ello, se utilizó el medio óptimo para el crecimiento de la cepa objeto de estudio al que se le añadió triptona al 1 % (Cowan & Steel, 1982). El medio se inoculó a partir de un cultivo líquido reciente y se incubó a 37 °C durante 14 días. Transcurrido ese tiempo, para detectar la presencia de indol, se añadieron unas gotas de reactivo de Kovacs (1928), se agitó y al cabo de un minuto, se observó el color del mismo. La prueba se consideró positiva al observar un anillo rojo en la superficie, y negativa si el anillo era de color amarillo (Cowan & Steel, 1982). La prueba del rojo de metilo permite identificar si el microorganismo en cuestión utiliza la glucosa por la vía ácido-mixta, mediante la cual se produce una mezcla de ácidos fuertes que bajan el pH del medio considerablemente. El medio de cultivo utilizado fue: Glucosa 0,5 g SW30 83,33 ml Agua destilada c.s.p 100 ml El medio se inoculó a partir de un cultivo líquido reciente y se incubó a 37 °C durante 14 días. El cambio de pH se detecta añadiendo el indicador rojo de metilo; la aparición de un color rojo al añadir el indicador indica que la prueba es positiva y amarillo, negativa (Cowan & Steel, 1982). La prueba de Voges-Proskauer permite identificar si el microorganismo en cuestión utiliza la glucosa por la vía butanodiólica, mediante la que se producen pequeñas cantidades de ácidos y una gran cantidad de butanodiol, el cual al ser incoloro no es detectable en el medio. La acetoína, un compuesto intermediario de esta ruta degradativa, es capaz de Ana Durán Viseras 90 La secuenciación de los genomas fue llevada a cabo por la empresa STABVida (Oeiras, Portugal) mediante el uso de la plataforma de secuenciación Illumina Hiseq 4000, generando lecturas de tipo paired end de 150 pb. Una vez secuenciados los genomas, para el análisis bioinformático de las secuencias obtenidas se utilizaron diversos programas bioinformáticos alojados en un servidor virtual disponible en la Universidad de Sevilla y en el servidor virtual del Departamento de Hidrobiología de la Academia Checa de Ciencias en České Budějovice (República Checa), durante la estancia realizada por la doctoranda en dicho laboratorio. Para el acceso a ambos servidores se utilizó el intérprete SSH (Secure Shell). La plataforma virtual NX Client 3.5.0.0. fue también utilizada ocasionalmente para el acceso al servidor de la Universidad de Sevilla. Para el filtrado previo y la eliminación de las secuencias de baja calidad se utilizaron los programas FastQC versión 0.10.1 (Andrews, 2010) y una combinación de herramientas informáticas implementadas dentro del proyecto BBMap (Bushnell, 2016), donde el script bbduk.sh permitió: a) eliminar las secuencias de baja calidad a partir del archivo con los reads interlineados (qtrim = rl trimq = 18), b) renombrar los reads, c) identificar y eliminar los controles phiX y p-Fosil2 y d) eliminar los adaptadores de Illumina. Posteriormente el script bbmerge.sh se utilizó para la identificación de novo de cualquier otro adaptador que pudiera estar presente. Una vez depuradas las secuencias genómicas, éstas fueron ensambladas. El proceso de ensamblaje consiste en el solapamiento de las secuencias cortas generadas tras la secuenciación (reads), para dar lugar a secuencias más largas (contigs). Existen diferentes estrategias de ensamblaje. Una de ellas se basa en grafos De Bruijn (DBG), y permite el ensamblaje eficiente de secuencias cortas (Compeau et al., 2011; Nagarajan & Pop, 2013; Vollmers et al., 2017). Esta estrategia divide los reads en segmentos cortos solapantes de longitud fija (k-mers) que se organizan en un gráfico De Bruijn, en el cual hay un nodo por cada uno de estos k-mers y un conector por cada solapamiento entre los mismos, los cuales indican que k-mers adyacentes se solapan por “k-1 letras”. En este método por tanto, la longitud del k-mer se relaciona con la del solapamiento que el ensamblador es capaz de detectar (Nagarajan & Pop, 2013). En concreto, los genomas secuenciados en este trabajo se ensamblaron de novo utilizando el ensamblador Spades v.3.9.1 o v.3.12.0 Material y Métodos 91 (Bankevich et al., 2012), en función de la versión instalada en un servidor u otro, que utiliza este tipo de estrategia. El proceso de ensamblaje presenta algunas limitaciones debido al método de secuenciación elegido, a la frecuencia y longitud de las regiones repetitivas o a la generación de una cobertura de secuenciación no uniforme por razones arbitrarias (Miller et al., 2010), por lo que se debe evaluar la calidad del ensamblaje. Por norma general, un buen resultado sería aquel que maximiza la precisión (menor número de errores de ensamblaje e indeterminaciones) y el tamaño final del ensamblado (resultando en un menor número de contigs y de la mayor longitud posible) (Miller et al., 2010; van der Walt et al., 2017). Los parámetros más utilizados para evaluar estas propiedades son el N50 (definido como el tamaño de contig tal que considerando todos los de igual o mayor tamaño se recupera la mitad de las bases del ensamblaje), el porcentaje de lecturas o bases incluidas en los contigs obtenidos, cantidad de errores de ensamblaje y número o densidad de los marcos abiertos de lectura (ORFs) en los contigs obtenidos como resultado (Miller et al., 2010; Nagarajan & Pop, 2013; Olson et al., 2017). En este trabajo la calidad del ensamblaje en base a estos parámetros se evaluó empleando QUAST v.2.3 (Gurevich et al., 2013). Finalmente, para determinar el porcentaje del genoma ensamblado, así como su nivel de contaminación y heterogeneidad, se utilizó el programa CheckM v.1.0.5, que estima dicho porcentaje en base a la presencia de genes conservados en el grupo filogenómico al que puede ser asignado el genoma con mayor exactitud, y el grado de contaminación mediante la determinación del número de copias de estos genes que se encuentran y su grado de similitud, calculado mediante identidad aminoacídica media (AAI) (Parks et al., 2015). La anotación es el proceso computacional mediante el cual se asigna la información biológica a una secuencia genómica (Cuccuru et al., 2014; Ekblom & Wolf, 2014), mediante su comparación con las secuencias disponibles en las bases de datos. El proceso de anotación genómica incluye la detección de los genes, su estructura y organización, así como la asignación de la probable función que ejercen. El éxito de la anotación depende en gran parte de la calidad del ensamblaje, ya que, solo genomas prácticamente completos darán resultados satisfactorios. Ana Durán Viseras 92 Las anotaciones pueden realizarse de forma automática o manual. La anotación automática es un proceso rápido que procesa los datos de forma consistente y no necesita de grandes equipos de anotadores. Sin embargo, presenta algunas limitaciones, sus resultados son más generales, menos exactos y más propensos a errores, pudiendo predecir menos genes de los que realmente existen (Tripp et al., 2015). Por esta razón, para conseguir anotaciones automáticas fiables, éstas deberían ser revisadas manualmente. Durante este estudio, los genomas han sido anotados de forma automática utilizando, en el caso de los genomas de las cepas objeto de estudio F13-25T y F16-60T, las herramientas RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology) (Aziz et al., 2008) y PGAAP (Prokaryotic Genome Automatic Annotation Pipeline) (Tatusova et al., 2016), desarrollada por NCBI. En el caso de los genomas de las demás cepas estudiadas se utilizó Prokka para su anotación automática (Seemann, 2014). RAST identifica los marcos abiertos de lectura y los anota basándose en los subsistemas SEED (Overbeek et al., 2005) para reconstruir redes metabólicas. Permite además, la corrección manual de estas anotaciones (Edwards & Holt, 2013; Brettin et al., 2015). PGAAP combina el modelo oculto de Markov (HMM, hidden Markov model) con varios algoritmos para la predicción de genes, entre los que se encuentran GeneMark (Lukashin & Borodovsky, 1998) y Glimmer (Salzberg et al., 1998). Aquellos genes que tras esta primera aproximación no hayan sido anotados correctamente, son buscados en bases de datos de proteínas en formato clusters, entre las que se encuentran los clusters de Grupos Ortólogos (base de datos COG) (Tatusov et al., 2001) y la base de datos de clusters de organismos procariotas de NCBI (Klimke et al., 2009). Prokka identifica los genes y describe su función, comparándolos con una gran base de datos de secuencias conocidas. Una vez identificados los genes presentes en estos genomas, se les asignó un número K que permitiera identificarlos para lo que se utilizó BlastKOALA (Kanehisa et al., 2016). Por último para la visualización y reconstrucción de las rutas metabólicas en base a esos número K, se utilizó KEGG pathways y KEGG modules. Todos estos resultados pueden ser visualizados y comparados con los de otros genomas en la misma plataforma. Adicionalmente, dado que la anotación manual genera datos más fiables y de mayor calidad, las proteínas de interés seleccionadas se revisaron manualmente utilizando jackhmmer (Finn et al., 2015), CDD (Marchler-Bauer et al., 2015) y Phobius (Kall et al., 2007). Material y Métodos 93 Con el propósito de identificar la posición filogenómica exacta de los microorganismos aislados en esta Tesis Doctoral y su relación con otros microorganismos ya descritos, se llevó a cabo la construcción del árbol filogenómico para cada uno de los grupos aislados en base al conjunto de genes correspondientes al core-genoma. El core-genoma se define como el conjunto de genes compartidos por el grupo de genomas objeto de estudio; el variable-genoma, constituido por los genes presentes en dos o más genomas; y el conjunto de genes únicos, que son aquellos específicos de cada genoma en particular. En conjunto, el core-genoma, el variable-genoma y los genes únicos de cada cepa constituyen el pangenoma, siendo así éste el conjunto de todos los genes de todas las cepas de un grupo de microorganismos. La matriz del core-genoma de Halorientalis pallida, Haloglomus irregulare y Natronomonas salsuginis, se obtuvo utilizando la herramienta enveomics (Rodriguez-R & Konstantinidis, 2016). Para el alineamiento y posterior concatenación de dichos genes se utilizó el programa MUSCLE v.3.8.31. (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation) (Edgar, 2004) con optimización diagonal y un valor máximo de interacciones de 1, seguidamente, se construyó el árbol filogenómico utilizando el programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versión 6.0 (Tamura et al., 2013), con el algoritmo neighbour-joining y la corrección Jukes-Cantor (Jukes & Cantor, 1969). De acuerdo al modus operandi de trabajo del grupo del Dr. Ghai, en el Departamento de Hidrobiología de la Academia Checa de Ciencias en České Budějovice (República Checa), donde se analizaron los genomas de los géneros Halonotius y Halosegnis, se utilizaron otros programas para este mismo fin. En estos casos, el conjunto de proteínas conservadas se obtuvo en base a anotaciones con la base de datos COG (Tatusov et al., 2001). Posteriormente, estas secuencias se alinearon utilizando el software Kalign (empleando para ello los parámetros por defecto) (Lassmann & Sonnhammer, 2005), se filtraron con la ayuda de trimAl (Capella-Gutierrez et al., 2009) y por último se concatenaron. Con el alineamiento obtenido, se construyeron los árboles filogenómicos utilizando el programa FastTree2 (Price et al., 2010), en base al modelo JTT + CAT, aproximación Gamma y 100 replicaciones de bootstrap. En el caso concreto de Halonotius esta metodología no dio tan buenos resultados, y en su lugar se emplearon PRANK v.150803 (Löytynoja, 2014) (-protein +F) y BMGE (Block Mapping and Gathering Ana Durán Viseras 94 with Entropy) (Criscuolo & Gribaldo, 2010) (-m BLOSUM30 –t AA –g 0,5), para el alineamiento y filtración de las secuencias, respectivamente. Asimismo, el árbol filogenético en este caso se construyó con ayuda del programa IQ-TREE v.1.6.7 (Nguyen et al., 2015), con una matriz de tipo LG (Le & Gascuel, 2008), frecuencia de bases empírica y Gamma heterogeneidad. La tipología del árbol se comprobó utilizando SH-Alrt y UFBoot. Hoy en día, la genómica ha revolucionado el mundo de la taxonomía bacteriana, donde la hibridación in silico y el cálculo de los parámetros de ANI (Average Nucleotide Identity) y AAI (Average Amino Acid Identity) han sustituido por completo a la técnica tradicional de hibridación ADN-ADN (DDH) para la delineación de especie procariota. Con la finalidad de determinar si los microorganismos aislados en este trabajo constituían nuevos taxones, se realizó el cálculo de todos estos valores. La hibridación in silico es una herramienta altamente fiable que calcula las distancias filogenéticas entre genomas con resultados más fidedignos que los obtenidos tradicionalmente de forma experimental. El valor límite establecido del 70 % para la delineación de especies procariotas según la técnica de hibridación ADN-ADN (Stackebrandt et al., 2002) se mantiene y se sigue tomando como referencia para la hibridación in silico. Resultados iguales o superiores a este valor indica que se trata de cepas pertenecientes a la misma especie. En este trabajo los porcentajes de hibridación in silico se obtuvieron por medio de la herramienta online GGDC v.2.1. (Genome-to-Genome Distance Calculator) (Meier-Kolthoff et al., 2013), utilizando como referencia la fórmula 2 (Auch et al., 2010b). Por otro lado, el cálculo de los índices de ANI (Average Nucleotide Identity) y AAI (Average Amino Acid Identity), los cuales representan el promedio de identidad de secuencia de nucleótidos o de aminoácidos respectivamente, que muestran todos los genes ortólogos compartidos, constituyen hoy también parámetros muy robustos para la taxonomía de procariotas. En el caso del ANI (Average Nucleotide Identity) el valor que se toma como referencia para delimitar especies es del 95 % (Konstantinidis & Tiedje, 2005a; Klappenbach et al., 2007; Richter & Rosselló-Móra, 2009; Konstantinidis et al., 2017). Debido a las diferencias evolutivas entre secuencias nucleotídicas y aminoacídicas, los valores de AAI (Average Amino Acid Identity) presenta un nivel de resolución diferente al ANI (Average Nucleotide Identity), siendo el AAI (Average Amino Acid Identity), útil para microorganismos más distantes filogenéticamente (Konstantinidis & Tiedje, 2005b; Material y Métodos 95 Rodríguez-R & Konstantinidis, 2014). Aunque no existe un criterio tan definido como en el caso de las especies, por norma general, se puede considerar que dos organismos pertenecen a géneros diferentes cuando sus valores de AAI (Average Amino Acid Identity) son inferiores al 60-65 % (Rodríguez-R y Konstantinidis, 2014; Konstantinidis et al., 2017). Para el cálculo de los porcentajes de ANI se utilizó el software OAT v.0.93.1 (Lee et al., 2016), mientras que para el cálculo de los valores de AAI se empleó la herramienta online AAI calculator (Rodríguez-R & Konstantinidis, 2014). Para poder visualizar con mayor detenimiento las características de algunos de los genomas, se llevaron a cabo representaciones circulares de los mismos empleando la herramienta de libre acceso R v.3.6.1. y el paquete específico Circlize v.0.4.6. (Gu et al., 2014). En el caso de clusters de interés, también se obtuvieron representaciones lineares utilizando, en este caso, la herramienta de libre acceso R v.3.6.1. y concretamente el paquete específico GenoPlotR versión 0.8.9. (Guy et al., 2010). La sintenia determina que los organismos relacionados no sólo tienen una elevada homología de las secuencias de los genes individuales, sino que además, la organización espacial de dichos genes sea similar, es decir, conservan el mismo orden a excepción de pequeñas diferencias (Blom et al., 2009). Para llevar a cabo el estudio de la sintenia en los genomas de las cepas del género Halosegnis se utilizó el programa Easyfig versión 2.2.3 (Sullivan et al., 2011). El cálculo del proteoma predicho para las secuencias de los distintos genomas analizados en este trabajo se calculó utilizando el programa iep (isoelectric point), implementado en el paquete EMBOSS (Rice et al., 2000), a partir del archivo del genoma con las secuencias traducidas a aminoácidos obtenidas mediante Prodigal (Hyatt et al., 2010). Para el cálculo de la frecuencia de uso de aminoácidos, también se partió del archivo del genoma con las secuencias traducidas a aminoácidos; éstos fueron analizados mediante Ana Durán Viseras 96 el lenguaje de programación Perl, para descartar las secuencias menores de 100 aminoácidos y calcular el porcentaje de uso de cada aminoácido. Para llevar a cabo la búsqueda de posibles secuencias víricas en los genomas de interés, se empleó la herramienta virtual PHASTER (Arndt et al., 2016), mientras que para la determinación de la presencia de sistemas CRISPR/Cas, se utilizó CRISPRCasFinder (Couvin et al., 2018). Para el análisis de las rodopsinas presentes en los genomas estudiados se llevó a cabo una búsqueda de estas secuencias en los mismos, utilizando para ello la herramienta hmmsearch (Eddy, 2011) y el modelo oculto de Markov (HMM, hidden Markov model) de la familia de proteínas de bacteriorodopsinas (Pfam: PF01036). Una vez identificadas las secuencias, éstas fueron alineadas utilizando como referencia una base de datos compuesta de una colección de rodopsinas tipo-1, mediante el software MAFFT v7.055b y el método L-INS-i (Katoh & Standley, 2013). Por último, para la construcción del árbol basado en estas secuencias se empleó la herramienta FastTree2 v2.1.7. (Price et al., 2010). Con el objetivo de calcular la abundancia y la distribución de las especies y géneros estudiados en esta Tesis Doctoral en diferentes ambientes hipersalinos a distintas salinidades, se calculó el porcentaje de secuencias del gen ARNr 16S relacionadas con los mismos en diferentes bases de datos metagenómicas. Los metagenomas utilizados en este trabajo se detallan en la Tabla 9. Una vez descargados los metagenomas de las bases de datos públicas, se utilizó el programa UBLAST (Edgar, 2010) para enfrentarlos a la base de datos de SILVA SSURef_NR99_132 (Pruesse et al., 2007), cuyas secuencias se agruparon al 85 % de identidad empleando UCLUST (Edgar, 2010). A continuación, se eliminaron las secuencias de ARNr 16S con un e-value menor a 1e-5, utilizando para ello SSU-ALIGN (Nawrocki, 2009). Material y Métodos 97 Las secuencias bona fide de ARNr 16S resultantes, se enfrentaron a la base de datos de SILVA SSURef_NR99_132 (Pruesse et al., 2007) mediante BLASTN (e-value < 1e-5). Solo se consideraron aquellas secuencias con identidad superior o igual al 80 % y con una longitud mínima de 90 pb. Para calcular la abundancia concreta de cada cepa estudiada en un ambiente natural concreto se realizaron reclutamientos de secuencias metagenómicas relacionadas con los distintos genomas estudiados en este trabajo frente a los mismos metagenomas detallados en la Tabla 9. En primer lugar, para evitar resultados sesgados, los contigs de cada uno de los genomas se concatenaron en uno solo y se enmascaró la secuencia de los genes ARN ribosómicos. En segundo lugar, se llevaron a cabo búsquedas mediante el programa BLASTN, empleando como base de datos el genoma del microorganismo cuya abundancia se quiere determinar y como query los metagenomas de dicho ambiente. Se consideraron hits aquellas secuencias con una longitud superior o igual a 30 nucleótidos, con identidad mayor del 95 % y con un e-value<=1e-5. La representación gráfica de estos resultados se llevó a cabo a través de un programa en Perl. Metagenoma Hábitat Localización Salinidad Número de acceso Referencia G Lago Irán 5 % NaCl ERS1455389 Naghoni et al., (2017) ChVmed Salina Estados Unidos 12 % NaCl 4440425.3 Rodriguez-Brito et al., (2010) SS13 Salina Alicante 13 % NaCl SRX328504 Fernández et al., (2014a) R Lago Irán 18 % NaCl ERS1455390 Naghoni et al., (2017) Kebrit DUI Cuenca hipersalina Mar Rojo 18,2 % NaCl 3300006156 Ngugi et al., (2016) Kebrit DLI Cuenca hipersalina Mar Rojo 18,2 % NaCl 3300006157 Ngugi et al., (2016) SS19 Salina Alicante 19 % NaCl SRX090228 Ghai et al., (2011) IC21 Salina Huelva 21 % NaCl SRX352042 Fernández et al., (2014b) ChVhigh1 Salina Estados Unidos 27 % NaCl 4440430.3 Rodriguez-Brito et al., (2010) ChVhigh2 Salina Estados Unidos 27 % NaCl 4440429.3 Rodriguez-Brito et al., (2010) ChVhigh3 Salina Estados Unidos 27 % NaCl 4440438.3 Rodriguez-Brito et al., (2010) Tyrrell 0.1 Lago Australia 29 % NaCl SRR5637210 Podell et al., (2014) Tyrrell 0.8 Lago Australia 29 % NaCl SRR5637211 Podell et al., (2014) S7 Lago Rumania 30 % NaCl SRR8921445 Unpublished W Lago Irán 30 % NaCl ERS1455391 Naghoni et al., (2017) SS33 Salina Alicante 33 % NaCl SRX347883 Fernández et al., (2014a) SS37 Salina Alicante 37 % NaCl SRX090229 Ghai et al., (2011) Ana Durán Viseras 98 Metagenoma Hábitat Localización Salinidad Número de acceso Referencia Cáhuill Laguna Chile 34 % NaCl SRX680116 Plominsky et al., (2014) Gujarat Suelo India ND ERP005612 Patel et al., (2015) SMO1 Suelo Huelva 24.0 dS / m SRR5753725 Vera-Gargallo et al., (2018) SMO2 Suelo Huelva (España) 54.4 dS / m SRR5753724 Vera-Gargallo et al., (2018) En el caso concreto del análisis genómico del género Halonotius, fue necesario probar la existencia de enzimas dependientes de vitamina B12 en las bases de datos metagenómicas donde este género resultó abundante. Para el ensamblaje de las secuencias de las bases de datos metagenómicas se utilizó el software MEGAHIT v.1.1.5 (Li et al., 2015), con los siguientes tamaños de k-mer: 49, 69, 89, 109, 129 y 149 y el resto de parámetros por defecto. Los genes codificantes de proteínas fueron predichos con MetaProdigal v2.6.2 (Hyatt et al., 2012) y para llevar a cabo la identificación de las enzimas dependientes de vitamina B12 en estas bases de datos ya ensambladas, se utilizó la herramienta hmmsearch (-E -evalue 1e-5 -prcov 50 -hmcov 50) (Eddy, 2011). Ana Durán Viseras 106 Lugar de aislamiento Dominio Designación de la cepa Especie filogenéticamente más relacionada Semejanza (%) Salina de Isla Cristina Archaea F13-25 Halorientalis persicus IBRC-M 10043T 97,6 Salina de Isla Cristina Archaea F12-7 Halorientalis brevis YC89T 95,9 Suelo M. Odiel Archaea F13 Halomicroarcula limicola YGHS32T 96,5 Suelo M. Odiel Archaea F24A Halomicroarcula pellucida BNERC31T 95,3 Suelo M. Odiel Archaea F27 Halomicroarcula salina YGHS18T 94,4 Suelo M. Odiel Archaea F28 Halomicroarcula pellucida BNERC31T 95,3 Suelo M. Odiel Archaea F22B Halomicroarcula salina YGHS18T 95,3 Salina de Isla Cristina Archaea IC30-61 Halomicroarcula limicola YGHS32T 96,7 Salina de Isla Bacuta Archaea F20-122 Natronomonas moolapensis 8.8.11T 97,7 Salina de Isla Cristina Archaea F2-12 Natronomonas moolapensis 8.8.11T 97,9 Salina de Isla Cristina Archaea F16-60 Natronomonas moolapensis 8.8.11T 92,8 Salina de Isla Cristina Archaea F12-1 Natronomonas moolapensis 8.8.11T 93,1 Salina de Isla Bacuta Archaea F17-44 Natronomonas moolapensis 8.8.11T 93,1 Salina de Isla Bacuta Archaea F18-79 Natronomonas moolapensis 8.8.11T 93,4 Salina de Isla Bacuta Archaea F19-13 Natronomonas moolapensis 8.8.11T 92,8 Salina de Isla Bacuta Archaea F20-229 Natronomonas moolapensis 8.8.11T 93,4 Salina de Isla Cristina Archaea F12-61 Halonotius pteroides 1.15.5T 96,4 Salina de Isla Cristina Archaea F13-13 Halonotius pteroides 1.15.5T 96,7 Suelo M. Odiel Archaea F15B Halonotius aquaticus F13-13T 96,4 Salina de Isla Cristina Archaea F9-27 Halonotius pteroides 1.15.5T 96,9 Salina de Isla Cristina Archaea F2-221B Halonotius aquaticus F13-13T 97,9 Salina de Isla Cristina Archaea F3-133 Haladaptatus pallidirubidus YIM93656T 86,2 Salina de Isla Cristina Archaea F16-84 Haloplanus rallus MBLA0036T 96,6 Suelo M. Odiel Archaea S1-172 Halobellus inordinatus YC20T 95,9 Salina de Isla Cristina Archaea F14-81 Halovenus aranensis EB27T 94,2 Salina de Isla Cristina Bacteria F14-71 Salinibacter ruber DSM 13855T 97,5 Salina de Isla Cristina Bacteria F2-10 Salinibacter ruber DSM 13855T 97,5 Salina de Isla Cristina Bacteria F9-2 Salinibacter ruber DSM 13855T 97,4 Salina de Isla Cristina Bacteria F1-7 Salinibacter ruber DSM 13855T 97,6 Salina de Isla Cristina Bacteria F7-160 Salinibacter ruber DSM 13855T 97,8 Resultados y Discusión 107 IV.2. Estudio de cepas pertenecientes al orden Halobacteriales La cepa F13-25T se aisló en cultivo puro a partir de una muestra de agua de las salinas de Isla Cristina (Huelva), que presentaba una salinidad del 27 % (p/v) y un pH de 7,5. Esta cepa se aisló en el medio de cultivo suplementado con glicerol (detallado en el apartado III.2.IV. de Material y Métodos), el cual también se utilizó para la conservación y el crecimiento rutinario de esta cepa. Como se ha mencionado anteriormente, en primer lugar se procedió a la amplificación del gen ARNr 16S de esta cepa mediante PCR. Ante la posibilidad de que las cepas del género Halorientalis pudieran poseer más de una copia diferente del gen ARNr 16S, como ocurre con cepas de otros géneros descritos del orden Halobacteriales, el producto de PCR amplificado se clonó mediante el vector de clonación pGEM-T (ver apartado III.5.III. de Material y Métodos). El estudio filogenético de la cepa F13-25T, basado en experimentos de clonación, reveló la existencia de dos copias divergentes del gen ARNr 16S, designadas como rrnA y rrnB¸ con un porcentaje de semejanza entre ellas de un 93,1 %. La comparación de dichas secuencias, con las secuencias disponibles en las bases de datos públicas, mostró que la cepa F13-25T se encontraba estrechamente relacionada con las especies del género Halorientalis. Mientras que la secuencia rrnA se encontraba filogenéticamente más relacionada con Halorientalis persicus D108T, Halorientalis regularis TNN28T y Halorientalis brevis YC89T, con porcentajes de semejanza de 99,2, 98,8 y 96,0 %, respectivamente, la secuencia rrnB lo estaba con Halorientalis persicus IBRC-M 10043T y Halorientalis regularis IBRC-M 10760T, con valores de 97,6 y 95,9 %, respectivamente. Más alejadas filogenéticamente se encontraban especies de otros géneros como Halapricum, Halorhabdus y Halomicrobium con porcentajes de semejanza de 94,2, 93,4 y 92,9 %. Hasta la fecha, no se había descrito la presencia de multicopia divergente de este gen en las especies del género Halorientalis. Sin embargo, el hecho de que en nuestra cepa se detectara la presencia de dos copias divergentes nos hizo pensar que podrían también estar presentes en las especies de Halorientalis. De hecho, las secuencias experimentales correspondientes a la segunda copia (rrnB) de las especies ya descritas de este género no se encontraban en las bases de datos y para poder incluirlas en nuestro estudio, fue necesario obtenerlas del genoma de estas especies. Ana Durán Viseras 108 El árbol filogenético obtenido en base a dicho gen se muestra en la Figura 19. La construcción del mismo se llevó a cabo empleando tres algoritmos diferentes, neighbour-joining, maximum-parsimony y maximum-likelihood. Como se puede observar, la secuencia rrnA de la cepa F13-25T se encuentra formando una rama parafilética con las secuencias rrnAs de Halorientalis, pero se sitúa en una rama independiente reforzada con valores de bootstrap de 99 %; por otro lado, la secuencia rrnB de la cepa F13-25T se agrupa monofiléticamente con aquellas secuencias rrnBs de Halorientalis, situándose una vez más en una rama independiente, con valores de bootstrap de 100 %. Esta topología hace pensar que pueda tratarse de una nueva especie dentro de dicho género. Figura 19. Árbol filogenético obtenido por el método maximum-parsimony, basado en la comparación de secuencias del gen ARNr 16S, en el que se muestran las relaciones filogenéticas entre la cepa F13-25T y las especies del género Halorientalis y de otros géneros filogenéticamente cercanos. Los números de acceso de las secuencias utilizadas se indican entre paréntesis. En los nodos se muestran los valores de bootstrap iguales o superiores al 70 %. Los círculos negros representan los nodos igualmente obtenidos con los algoritmos maximum-likelihood y neighbour-joining. La especie Haloferax mediterranei ATCC 33500T se ha utilizado como outgroup. La escala representa el número de sustituciones por nucleótido. Resultados y Discusión 109 El estudio filogenético basado en la comparación de secuencias del gen rpoB´ ayudó a resolver las limitaciones que existen para el género Halorientalis en el caso del gen ARNr 16S. La construcción del árbol filogenético en base al gen rpoB´ (Figura 20), muestra que la cepa F13-25T se agrupa con Halorientalis persicus IBRC-M 10043T y Halorientalis regularis TNN28T con porcentajes de semejanza entre dichas secuencias de 89,9 y 92,3 %, respectivamente, pero se sitúa en una rama diferente, lo suficientemente separada de las otras como para constituir una nueva especie dentro de este género. Asimismo, se procedió a la secuenciación del genoma de la cepa F13-25T, cuyas principales características, junto a las de los genomas de las cepas tipo de las especies de Halorientalis más estrechamente relacionadas, se muestran en la Tabla 13. Estos parámetros se encuentran en concordancia con los estándares mínimos requeridos para el uso de genomas en taxonomía de procariotas (Chun et al., 2018). Figura 20. Árbol filogenético obtenido por el método neighbour-joining, basado en la comparación de secuencias del gen rpoB´, en el que se muestran las relaciones filogenéticas entre la cepa F13-25T y las especies del género Halorientalis y de otros géneros filogenéticamente cercanos. Los números de acceso de las secuencias utilizadas se indican entre paréntesis. En los nodos se muestran los valores de bootstrap iguales o superiores al 70 %. Los círculos negros representan los nodos igualmente obtenidos con el algoritmo maximum-likelihood. La especie Haloferax mediterranei ATCC 33500T se ha utilizado como outgroup. La escala representa el número de sustituciones por nucleótido. Ana Durán Viseras 110 Característica del genoma Cepa F13-25T Halorientalis regularis IBRC-M 10760T Halorientalis persicus IBRC-M 10043T Tamaño (Mb) 4,09 4,03 4,87 N°de contigs 25 55 121 G+C (moles%) 65,7 65,0 63,5 N50 580694 245352 157375 N°de rRNAs 5 8 8 N°de tRNAs 48 64 75 Números de acceso RDFA00000000 GCF_900102305 GCF_900110215 El contenido en G+C descrito para las especies Halorientalis regularis TNN28T y Halorientalis persicus D108T, inicialmente calculado mediante HPLC, era de 61,9 y 62,8 moles%, respectivamente (Cui et al., 2011; Amoozegar et al., 2014). Sin embargo, el calculado a partir del genoma fue de 65,0 y 63,5 moles%, respectivamente. El contenido en G+C de la cepa F13-25T, determinado en este estudio a partir del genoma es de 65,7 moles%, valor que se encuentra dentro del rango descrito para las otras especies del género Halorientalis. Con el propósito de confirmar si la cepa F13-25T efectivamente constituía una nueva especie dentro del género Halorientalis, se calcularon los valores de identidad nucleótidica media (ANI) y los de hibridación ADN-ADN in silico (DDH) (siguiendo la metología descrita en el apartado III.8.III.II. de Material y Métodos) entre la cepa objeto de estudio, las especies del género Halorientalis y otros géneros relacionados (Tabla 14). Los valores de ANI y DDH obtenidos entre la cepa F13-25T y Halorientalis regularis IBRC-M 10760T fueron de 88,8 % y 36,2 %, respectivamente, mientras que los de la cepa F13-25T y Halorientalis persicus IBRC-M 10043T de 88,0 % y 34,6 %, respectivamente. Estos valores, al igual que los obtenidos frente a las otras especies de los géneros relacionados confirman que efectivamente se trata de una nueva especie dentro del género Halorientalis. Gracias a la secuenciación del genoma de la cepa F13-25T y a la existencia de los genomas disponibles para otras especies de géneros relacionados, se construyó un árbol filogenómico en base al número de genes compartidos (core-orthologous) entre todas ellas, en total 367 genes, y cuya representación se muestra en la Figura 21. Se puede observar que la cepa F13-25T una vez más, aparece agrupada con las especies Halorientalis regularis IBRC-M 10760T y Halorientalis persicus IBRC-M 10043T con un valor de bootstrap de 100 %, pero situada en una rama diferente, lo suficientemente separada de las mismas, también con un valor de bootstrap de 100 %, confirmando nuevamente su condición de nuevo taxón dentro de este género. Resultados y Discusión 111 In silico DDH ANI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1. Halorientalis sp. F13-25T - 88,8 88,0 74,0 73,0 74,4 74,3 73,0 74,6 72,2 2. Halorientalis regularis IBRC-M 10760T 36,2 - 89,1 73,9 73,0 74,5 74,2 73,3 74,6 72,3 3. Halorientalis persicus IBRC-M 10043T 34,6 37,2 - 73,7 72,9 74,6 73,9 73,8 74,6 72,3 4. Halapricum salinum CBA 1105T 19,6 20,5 20,0 - 73,8 74,0 73,8 72,9 74,0 71,5 5. Halorhabdus utahensis DSM 12940T 19,3 20,0 20,2 19,8 - 73,0 72,6 72,0 73,2 71,1 6. Halomicrobium mukohatei DSM 12286T 20,6 20,5 20,3 20,2 19,8 - 75,6 74,8 75,0 72,0 7. Halomicroarcula pellucida CECT 7537T 20,1 20,1 20,1 19,8 19,3 20,4 - 78,0 74,7 72,0 8. Haloarcula vallismortis ATCC 29715T 19,9 20,3 21,6 19,8 19,3 20,6 21,8 - 73,9 71,6 9. Halosimplex carlsbadense 2-9-1T 20,5 20,6 20,7 20,4 19,9 20,9 20,5 20,7 - 72,2 10. Natronomonas pharaonis DSM 2160T 20,0 20,1 20,4 19,5 19,4 19,8 19,2 19,4 19,7 - Figura 21. Árbol filogenómico obtenido por el método neighbour-joining, basado en la comparación de 367 genes core-orthologous, en el que se muestran las relaciones filogenéticas entre la cepa F13-25T y las especies del género Halorientalis y de otros géneros filogenéticamente cercanos de los que se dispone de genomas. Los números de acceso de las secuencias utilizadas se indican entre paréntesis. En los nodos se muestran los valores de bootstrap iguales o superiores al 70 %. La escala representa el número de sustituciones por nucleótido. Ana Durán Viseras 112 Adicionalmente, se elaboró un diagrama de Venn para comparar el número de genes compartidos entre los genomas de la cepa F13-25T y las cepas tipo de las especies de Halorientalis de las que se dispone de sus genomas (Figura 22). En total, Halorientalis persicus IBRC-M 10043T, Halorientalis regularis IBRC-M 10760T y la cepa F13-25T comparten 2680 genes, Halorientalis persicus IBRC-M 10043T y la cepa F13-25T comparten un total de 272, mientras que 256 son los genes compartidos entre Halorientalis regularis IBRC-M 10760T y la cepa F13-25T. Por último, se identificaron 1003 genes como únicos para la cepa F13-25T. Para la descripción de la cepa F13-25T como una nueva especie del género Halorientalis se prosiguió con su caracterización fenotípica. En este estudio se utilizaron las cepas tipo de las especies Halorientalis regularis JCM 16425T y Halorientalis persicus IBRC-M 10043T como cepas de referencia. La determinación de las características morfológicas y fisiológicas de la cepa F13-25T se llevó a cabo siguiendo los requerimientos mínimos para la descripción de nuevos taxones del orden Halobacteriales (Oren et al., 1997). Figura 22. Diagrama de Venn que representa el número de genes compartidos entre los genomas de la cepa F13-25T y de las cepas tipo de las especies de Halorientalis estudiadas. Resultados y Discusión 113 Las células de la cepa F13-25T se caracterizan por ser pequeñas formas cocoides, inmóviles y con un tamaño comprendido entre 1,1-2,8 x 0,5 µm (Figura 23). Se tiñen como Gram-negativas y en medio sólido crecen formando colonias con pigmentación rosácea, con borde entero y de aproximadamente 1 mm de tamaño. La cepa F13-25T es capaz de crecer entre un 15 y un 30 % de sales totales, un pH de 6,5 a 8,5 y un rango de temperatura entre 30 y 50 °C, siendo su crecimiento óptimo a 25 % de sales, pH 7,5 y 37 °C. Presenta actividad oxidasa y catalasa y puede crecer en anaerobiosis en presencia de arginina, aunque no en presencia de dimetilsulfóxido o nitrato potásico. Hidroliza el Tween 80 pero no la gelatina ni el almidón. Las características diferenciales de esta cepa con respecto a las de las especies de Halorientalis utilizadas como referencia se detallan en la Tabla 15. Características 1 2 3 Morfología Cocoide Bacilos pleomórficosa Bacilosb Tamaño celular (µm) 1,1–2,8 x 0,5 0,7–1,0 x 1,0–2,0a 0,5–1,0 x 1,0–6,0b Motilidad - +a +b Pigmentación de la colonia Rojo Cremaa Rojob NaCl óptimo (%, p/v) 25 25a 15b Requerimiento de Mg2+ - -a +b Temperatura óptima (°C) 37 40a 37b pH óptimo 7,5 7,5a 7,0–7,5b Crecimiento en anaerobiosis en presencia de L-arginina + -a -b Hidrólisis del almidón - - + Contenido en G+C del ADN (moles%) (genoma) 65,7 63,5 65,0 Figura 23. Microfotografía en contraste de fases de las células de la cepa F13-25T. Escala, 10 μm. Ana Durán Viseras 114 En cuanto a la caracterización quimiotaxonómica, se llevó a cabo siguiendo la metodología descrita en el apartado III.6. de Material y Métodos. Las especies Halobacterium salinarum DSM 3754T, Halorientalis regularis JCM 16425T, Halorientalis persicus IBRC-M 10043T y Halovenus aranensis IBRC-M 10015T se utilizaron como referencia en este estudio. Con respecto al análisis de los lípidos polares, el resultado de la cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) reveló la presencia de fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilglicerol fosfato metil éster (PGP-Me) y un glicolípido cromatográficamente idéntico a sulfato manosil glucosil diéter (S-DGD-1) en la cepa F13-25T (Figura 24), siendo éstos además, los lípidos mayoritarios descritos para el género Halorientalis y demostrando una vez más su pertenencia a este género. Por otro lado, los resultados obtenidos muestran la presencia de dos fosfolípidos, fosfatidilglicerol (PG) y bifosfatidilglicerol (BPG) en las especies Halorientalis regularis JCM 16425T y Halorientalis persicus IBRC-M 10043T, no detectados previamente en sus descripciones originales. Para verificar estos resultados, se realizó nuevamente una cromatografía HPTLC utilizando en este caso azul de molibdeno como revelador, el cual es específico para fosfolípidos (Figura 25) y confirmando así la presencia de ambos fosfolípidos para las mencionadas especies. Este hallazo, además de otras características relevantes determinadas en este estudio, nos ha permitido realizar una modificación de la descripción del género Halorientalis. Los resultados obtenidos en este estudio referentes a la caracterización polifásica y genómica de la cepa F13-25T, aislada a partir de una muestra de agua de las salinas de Isla Cristina, confirman que se trata de una nueva especie dentro del género Halorientalis, para la cual se propone el nombre de Halorientalis pallida sp. nov. La descripción de esta nueva especie ha sido publicada en 2019 en el International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (Durán-Viseras et al., 2019a). Resultados y Discusión 115 Figura 24. Cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) del perfil de lípidos polares de la cepa F13-25T y otras especies de haloarqueas. Las placas se revelaron con ácido sulfúrico al 5 % en agua, seguido de calentamiento de la placa a 160 ºC. Carriles: 1, Halobacterium salinarum DSM 3754T; 2, Cepa F13-25T; 3, Halorientalis persicus IBRC-M 10043T; 4, Halorientalis regularis JCM 16425T; 5, Halovenus aranensis IBRC-M 10015T. Abreviaciones: BPG, bifosfatidilglicerol; PG, fosfatidilglicerol; PGP-Me, fosfatidilglicerol fosfato metil éster; PGS, fosfatidilglicerol sulfato; S-DGD-1, sulfato diglicosil diéter; S-TGD-1-PA, ácido sulfato galactosil manosil glucosil diéter fosfatídico; S-TeGD, sulfato tetraglicosil diéter. Figura 25. Cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) del perfil de fosfolípidos de la cepa F13-25T y otras especies de haloarqueas. Las placas se revelaron con azul de molibdeno. Carriles: 1, Cepa F13-25T; 2, Halorientalis persicus IBRC-M 10043T; 3, Halorientalis regularis JCM 16425T; 4, Halovenus aranensis IBRC-M 10015T; 5, Halobacterium salinarum DSM 3754T. Abreviaciones: PG, fosfatidilglicerol; PGP-Me, fosfatidilglicerol fosfato metil éster; PGS, fosfatidilglicerol sulfato. Bibliografía 219 A Abriouel, H., Benomar, N., Lucas, R. & Gálvez, A. (2011). Culture-independent study of the diversity of microbial populations in brines during fermentation of naturallyfermented Aloreña green table olives. Int J Food Microbiol 144: 487–496. Abrol, I.P., Yadav, J.S.P. & Massoud, F.I. (1988). Salt-affected soils and their management. FAO soils bulletin 39. Rome. Acinas, S.G., Marcelino, L.A., Klepac-Ceraj, V. & Polz, M.F. (2004). Divergence and redundancy of 16S rRNA sequences in genomes with multiple rrn operons. J Bacteriol 186: 2629–2635. Aitken, D.M. & Brown, A.D. (1969). Citrate and glyoxylate cycles in the halophil, Halobacterium salinarium. 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Abreviaciones: G - Metagenoma del lago Meyghan (Irán), 5 % salinidad, ChVmed- Metagenoma de las salinas de Chula Vista (California, EE.UU.), 12 % salinidad, SS13 – Metagenoma de las salinas de Santa Pola (Alicante), 13 % salinidad, R - Metagenoma del lago Meyghan (Irán), 18 % salinidad, Kebrit-DUI - Metagenoma del Mar Rojo, 18,2 % salinidad, Kebrit-DLI - Metagenoma del Mar Rojo, 18,2 % salinidad, ChVhigh2 - Metagenoma de las salinas de Chula Vista (California, EE.UU.), 27 % salinidad, ChVhigh4 - Metagenoma de las salinas de Chula Vista (California, EE.UU.), 27 % salinidad, Tyrrell 0.1 – Metagenoma del lago Tyrrell (Victoria, Australia), 29 % salinidad, Tyrrell 0.8 – Metagenoma del lago Tyrrell (Victoria, Australia), 29 % salinidad, S7 – Metagenoma del lago Fara Fund (Rumania), 30 % salinidad, W – Metagenoma del lago Meyghan (Irán), 30 % salinidad, SS33 – Metagenoma de las salinas de Santa Pola (Alicante), 33 % salinidad, Cahuill – Metagenoma de la laguna Cahuil (Chile), 34 % salinidad, SS37 – Metagenoma de las salinas de Santa Pola (Alicante), 37 % salinidad. Anexo 279 Figura S3. Reclutamientos genómicos de la cepa F17-44T frente a distintos metagenomas ordenados por gradiente de salinidad. Se ha utilizado un valor de corte del 95 % de identidad y una longitud de read <30 pb. La línea negra discontinúa representa el umbral de corte del 95 % a nivel de especie. Abreviaciones: G - Metagenoma del lago Meyghan (Irán), 5 % salinidad, ChVmed- Metagenoma de las salinas de Chula Vista (California, EE.UU.), 12 % salinidad, SS13 – Metagenoma de las salinas de Santa Pola (Alicante), 13 % salinidad, R - Metagenoma del lago Meyghan (Irán), 18 % salinidad, Kebrit-DUI - Metagenoma del Mar Rojo, 18,2 % salinidad, Kebrit-DLI - Metagenoma del Mar Rojo, 18,2 % salinidad, ChVhigh2 - Metagenoma de las salinas de Chula Vista (California, EE.UU.), 27 % salinidad, ChVhigh4 - Metagenoma de las salinas de Chula Vista (California, EE.UU.), 27 % salinidad, Tyrrell 0.1 – Metagenoma del lago Tyrrell (Victoria, Australia), 29 % salinidad, Tyrrell 0.8 – Metagenoma del lago Tyrrell (Victoria, Australia), 29 % salinidad, S7 – Metagenoma del lago Fara Fund (Rumania), 30 % salinidad, W – Metagenoma del lago Meyghan (Irán), 30 % salinidad, SS33 – Metagenoma de las salinas de Santa Pola (Alicante), 33 % salinidad, Cahuill – Metagenoma de la laguna Cahuil (Chile), 34 % salinidad, SS37 – Metagenoma de las salinas de Santa Pola (Alicante), 37 % salinidad. Ana Durán Viseras 280 Figura S4. Relación entre diferentes características genómicas entre los genomas de Halonotius y otros procariotas seleccionados, relevantes en ambientes hipersalinos. Se ha representado una regresión linear para mostrar la relación existente entre el tamaño del genoma y el número total de secuencias de ADN codificantes. Anexo 281 Posición en el genoma (nt) Secuencia Longitud (pb) p-value ORB1 F12-1T 1128943-1128965 1129107-1129129 CGACGCCCTTATACGTAACAGG 22 7.35E-12 ORB2 F12-1T 1129017-1129036 1129100-1129119 TCCAATCCGACGCCCTTAT 19 1.76E-10 ORB1 F18-79 689558-689580 689641-689660 CCAATCCGACGCCCTTATACGT 22 3.00E-12