Análisis de la neurogénesis de neuronas inhibitorias durante el desarrollo embrionario en un modelo murino de activación inmune materna y su implicación en el trastorno del espectro autista

ANÁLISIS DE LA NEUROGÉNESIS DE NEURONAS INHIBITORIAS DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO EN UN MODELO MURINO DE ACTIVACIÓN INMUNE MATERNA Y SU IMPLICACIÓN EN EL TRASTORNO DEL ESPECTRO AUTISTA TRABAJO DE FIN DE MÁSTER MÁSTER UNIVERSITARIO EN FISIOLOGÍA Y NEUROCIENCIAS UNIVERSIDAD DE SEVILLA ROSA LÓPEZ DOMINGO TUTOR ACADÉMICO: Pablo García Miranda TUTOR EXTERNO: Diego García González (Instituto de Biomedicina de Sevilla) LUGAR DE REALIZACIÓN: Instituto de Biomedicina de Sevilla FECHA DE DURACIÓN: febrero-noviembre de 2023 FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 de noviembre de 2023 1 ÍNDICE RESUMEN ....................................................................................................................... 3 I. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 4 1. DESARROLLO DEL SISTEMA NERVIOSO EN MAMÍFEROS .......................... 4 1.1 Neurodesarrollo .................................................................................................... 4 1.2. Neurogénesis ....................................................................................................... 4 1.2.1 Neurogénesis de los diferentes tipos neuronales e interneuronas ................. 5 1.3 Neurogénesis de los ganglios basales .................................................................. 5 1.3.1 Funciones de los ganglios basales. ................................................................ 8 2. TRASTORNOS DEL NEURODESARROLLO: TRASTORNO DEL ESPECTRO AUTISTA .................................................................................................................... 10 2.1 Criterios diagnósticos ......................................................................................... 10 2.2 Prevalencia ......................................................................................................... 11 2.3 Etiología ............................................................................................................. 11 3. ACTIVACIÓN INMUNITARIA MATERNA ....................................................... 12 3.1 Modelos animales .............................................................................................. 13 4. ESTUDIOS PREVIOS DE MIA-TEA Y TEA-NEURODESARROLLO ESTRIATAL ............................................................................................................... 14 4.1 TEA y neurodesarrollo estriatal ......................................................................... 14 4.2 Influencia de la MIA en el TEA ......................................................................... 16 II. OBJETIVOS ............................................................................................................. 17 III. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 17 1. ANIMALES UTLIZADOS ...................................................................................... 17 2. MODELO DE MIA ................................................................................................. 18 3. DATACIÓN DE CÉLULAS ................................................................................... 18 4. PROCESAMIENTO DEL TEJIDO ........................................................................ 19 4.1. Anestesia, fijación del tejido y sacrificio .......................................................... 19 4.2 Corte del tejido ................................................................................................... 19 4.3 Anticuerpos ......................................................................................................... 19 4.4 Montaje .............................................................................................................. 21 4.5 Visualización en el microscopio y cuantificación neuronal ............................... 21 5. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS .................................................................................. 21 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 22 2 1. ESTUDIO PREVIO DE LA ANATOMÍA Y ORGANIZACIÓN NEURONAL DEL CUERPO ESTRIADO ........................................................................................ 22 2. INFLUENCIA DE LA MIA EN LA NEUROGÉNESIS DEL NAc ....................... 23 2.1 Neurogénesis de las neuronas medianas espinosas de proyección .................... 23 2.2 Neurogénesis de las interneuronas que expresan parvalbúmina ........................ 24 3. ESTUDIO DE DISTRIBUCIÓN NEURONAL EN EL EJE ROSTRO-CAUDAL25 V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO ........................................ 28 VI. BIBLIOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA ...................................................................... 29 3 RESUMEN El trastorno del espectro autista (TEA) se origina durante el neurodesarrollo y se caracteriza por dificultades en las interacciones sociales, la comunicación y la presencia de patrones de movimiento repetitivos (estereotipias). Su etiología sigue siendo desconocida para la comunidad científica, aunque se sabe que el ambiente es uno de los factores que influyen en él. Si bien está muy estudiado el factor ambiental en el desarrollo de las áreas corticales implicadas en las características de este trastorno, apenas hay investigaciones centradas en las áreas subcorticales. Este trabajo estudió la influencia de las infecciones maternas como posible factor ambiental en el neurodesarrollo del núcleo accumbens, una de las regiones subcorticales encargadas del control de la actividad motora, con una posible implicación en las estereotipias del TEA. Para ello, se usó un modelo animal preclínico de activación inmune materna, al cual se le inyectó un compuesto para simular una infección viral. Mediante técnicas de imnunohistoquímica se estudió el neurodesarrollo de las neuronas inhibitorias de esta región en la descendencia y se determinó si esta perturbación en la gestación influyó en ella. Palabras clave: neurogénesis, factores ambientales, infecciones maternas, trastorno del espectro autista, núcleo accumbens, neuronas inhibitorias, estereotipias. 4 I. INTRODUCCIÓN 1. DESARROLLO DEL SISTEMA NERVIOSO EN MAMÍFEROS 1.1 Neurodesarrollo El neurodesarrollo es el proceso de formación del sistema nervioso (SN), que consta de varias etapas como son la neurogénesis, la sinaptogénesis, proceso en el cual se establecen conexiones sinápticas neuronales y posterior eliminación de las mismas en exceso, conocido como poda sináptica (Budday et al., 2015; Molnár et al., 2019), y la mielinización, etapa en la cual se produce la envoltura de los axones de mielina por los oligodendrocitos (células macrogliales) para dar lugar a la sustancia blanca (Budday et al., 2015; Molnár et al., 2019). En los mamíferos, el desarrollo del embrión empieza tras su implantación en el útero varios días después de la fecundación y, posteriormente, suceden una serie de procesos que dan lugar a las diferentes capas de tejido embrionario (ectodermo, mesodermo y endodermo), de las cuales se originan los órganos y tejidos del futuro individuo. En una de las fases, se produce la proliferación de las células del ectodermo que están en contacto con el mesodermo para dar lugar a la placa neural. Esta se pliega sobre sí misma formando lo que se denomina tubo neural. Este sufre un proceso de diferenciación que da lugar a las diferentes estructuras del sistema nervioso (Delhaye-Bouchaud, 2001; Silbereis et al., 2016). 1.2. Neurogénesis Tras la diferenciación del tubo neural, se produce la neurogénesis, que es la etapa en la cual se originan, proliferan y migran los diferentes tipos neuronales hacia sus lugares definitivos. El tubo neural está recubierto por un epitelio pseudoestratificado de células madre neuroepiteliales, formando la llamada zona ventricular (VZ), que presentan una gran capacidad de división. Conforme proliferan, se van colocando debajo de esta zona para formar otra capa de células también proliferativas, la zona subventricular (SVZ). Las células que salen de esta zona dan lugar a las neuronas de proyección. Las células de la VZ y SVZ, que se transformarán en células gliales radiales y se extienden hasta la pared cortical, son el origen de las futuras neuronas y macroglía. Presentan dos tipos de divisiones celulares: simétrica y asimétrica. En primer lugar, se produce la división simétrica, en la que una célula da lugar a dos nuevas células progenitoras, y así sucesivamente para autorrenovarse y aumentar el grosor de la zona ventricular. Posteriormente, cambian al 5 tipo de división asimétrica. En ella, una de las células hijas se queda en la zona ventricular como célula de glía radial y la otra se convierte en una célula progenitora intermedia que dará lugar a los neuroblastos (neuronas inmaduras) (Budday et al., 2015; Jiang and Nardelli, 2016). Los neuroblastos expresan la doblecortina (DCX) en su migración en el estadío embrionario y en la zona subventricular en el adulto (Yang et al., 2004). 1.2.1 Neurogénesis de los diferentes tipos neuronales e interneuronas El telencéfalo de los mamíferos se divide en dos regiones: el palio, correspondiente a la parte dorsal y que da lugar a las áreas corticales, y el subpalio, en la región ventral, que corresponde con las regiones subcorticales (tálamo, hipotálamo, ganglios basales, hipocampo, amígdala, cerebelo y el tronco del encéfalo) (Jiang and Nardelli, 2016). Del subpalio se originan los diferentes tipos neuronales, que, dependiendo del neurotransmisor que liberan en los procesos de sinapsis, pueden ser excitatorias o inhibitorias. Las neuronas excitatorias (piramidales), cuyo neurotransmisor es el glutamato, se originan en el palio y darán lugar a las seis capas corticales (Jiang and Nardelli, 2016). Las neuronas inhibitorias, cuyo neurotransmisor es el ácido γ-aminobutírico (GABA), se originan en el subpalio, en el cual se encuentran regiones neurogénicas como son las eminencias ganglionares y la región preóptica, y migran hacia las áreas corticales (Lim et al., 2018; Silbereis et al., 2016). En los ganglios basales y en la amígdala, hay neuronas inhibitorias de proyección que conectan regiones del cerebro, y las interneuronas, un tipo neuronal que modula la actividad de los circuitos locales (Budday et al., 2015). 1.3 Neurogénesis de los ganglios basales Los ganglios basales son un conjunto de núcleos en el subpalio de los mamíferos que están formados por el cuerpo estriado (en su parte dorsal contiene a los núcleos caudado y lenticular [putamen y globo pálido] y en su parte ventral, al núcleo accumbens (Nac) [en esta región se centró centrar este trabajo] y al tubérculo olfatorio), los núcleos subtalámicos y la sustancia nigra (Thabault et al., 2022). El cuerpo estriado está compuesto por una matriz y por los compartimentos del estriosoma. La matriz contiene a las neuronas medianas de proyección espinosas GABAérgicas (MSN) que reciben la información procedente de las vías corticales. Estas neuronas son de dos tipos principales: las pertenecientes a la vía directa (promueven la actividad motora), que expresan los receptores de dopamina D1 y proyectan hacia la parte interna del globo pálido y la 12 A pesar de que se han citado algunos ejemplos de posibles factores implicados en el origen del TEA, no se puede aportar ningún dato definitivo, ya que es en estos últimos años cuando las investigaciones científicas de las bases neurobiológicas del TEA, y de otros trastornos del neurodesarrollo, han cobrado amplitud. 3. ACTIVACIÓN INMUNITARIA MATERNA A nivel inmunitario, la gestación es un periodo muy especial. Para que sea llevado a término y evitar que el embrión sea rechazado, durante todo el proceso debe alcanzarse un equilibrio entre el sistema inmune materno y el del descendiente desde el momento de la implantación hasta el parto (Zawadzka et al., 2021). Esto es lo que se denomina tolerancia inmunitaria, y en ella participan las hormonas sexuales (los estrógenos inducen la producción de anticuerpos y reduce la liberación de las células natural killers y factores de necrosis tumoral), citoquinas, anticuerpos, proteínas inmunomoduladoras y células inmunocompetentes (linfocitos T reguladores, células natural killer y células dendríticas) (Barañao, 2011; Zawadzka et al., 2021). Por todo ello, cualquier perturbación de este equilibrio puede desencadenar un parto prematuro (Hall et al., 2023) y producir alteraciones en el neurodesarrollo del descendiente (Figura 2). Por tanto, la activación inmunitaria materna (MIA, por sus siglas en inglés) se define como la respuesta inmunitaria materna durante la gestación provocada por la infección por agentes patógenos (virus, bacterias o parásitos) (Hall et al., 2023), o la exposición a otros factores como el estrés, así como tener un índice de masa corporal alto que produce un estado inflamatorio en este periodo (Boulanger-Bertolus et al., 2018), entre otros. En consecuencia, se produce un aumento en los niveles de péptidos antimicrobianos proinflamatorios maternos (citoquinas y quimiocinas), que son capaces de atravesar la placenta y llegar al cerebro del embrión, ya que la barrera hematoencefálica en esta fase es muy permeable. Los péptidos más relevantes son la interleucina 6 (IL-6), la interleucina-17 (IL-17), la interleucina-1β, la interleucina-10 (IL-10), la interleucina-4 (IL-4), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y el interferón β (IFN-β) (Bergdolt and Dunaevsky, 2019; Massarali et al., 2022; Zawadzka et al., 2021). 13 Figura 2: Principales tipos de perturbaciones de origen materno que afectan al desarrollo cerebral del feto (Vasistha and Khodosevich, 2021) . 3.1 Modelos animales Se han documentado en muchos estudios la existencia de una relación entre la MIA y las alteraciones del neurodesarrollo en humanos. Los datos que se tienen hasta la fecha son epidemiológicos, pero los mecanismos fisiológicos que hay detrás de ello siguen siendo desconocidos. En la actualidad, la investigación biomédica trata de aclarar esta incógnita mediante el uso de modelos animales (Brown and Meyer, 2018; Massarali et al., 2022). Los primeros modelos se desarrollaron a partir de la exposición de ratones gestantes a virus como el de la influenza o a Toxoplasma gondii (Brown and Meyer, 2018; Massarali et al., 2022), pero hoy en día, se emplean compuestos que mimetizan infecciones virales o bacterianas como son: - Ácido poliinosinico-policitidilico (Poly I:C): ARN de doble cadena sintético que se utiliza para simular una infección viral. Se une al receptor 3 de tipo Toll (TLR3) y provoca una cascada de reacciones que acaba con la activación de varios factores. Esto produce una 14 respuesta del sistema inmunitario que libera citoquinas para inhibir la replicación de este material genético (Hall et al., 2023; Massarali et al., 2022). - Lipopolisacárido (LPS): endotoxina bacteriana que es componente de la pared celular de las bacterias Gram negativas, que produce una respuesta inmune al unirse al receptor 4 de tipo Toll (TLR4) de igual manera que lo hace el Poly I:C (Massarali et al., 2022). 4. ESTUDIOS PREVIOS DE MIA-TEA Y TEA-NEURODESARROLLO ESTRIATAL 4.1 TEA y neurodesarrollo estriatal Como se ha mencionado anteriormente, el TEA se caracteriza por alteraciones en las áreas social, emocional y comunicativa, y en el control del movimiento corporal (presencia de patrones de movimientos repetitivos o estereotipias, que son movimientos rítmicos, prolongados y predecibles de alguna parte del cuerpo sin ninguna finalidad, y que cesan con la distracción del sujeto). Al tratarse de un trastorno del neurodesarrollo, diversos estudios han tratado de buscar alguna respuesta en la neurobiología del desarrollo cerebral para estas características. Hasta la fecha, los datos que se tienen para ello son los adquiridos a través de la realización de pruebas de imagen a niños con TEA. La mayoría de ellos están enfocados a las primeras características, relacionadas con las áreas corticales. Pero hay muy pocos estudios centrados en las alteraciones del movimiento, que han sido asociadas a las áreas subcorticales, entre las que se encuentran los ganglios basales (Figura 3). Figura 3: Principales funciones propuestas del estriado y las alteraciones de las mismas que se pueden encontrar en el trastorno del espectro autista (Fuccillo, 2016). 15 En modelos animales se ha demostrado que las anomalías en los circuitos corticoestriatales dan como resultado un mayor número de acicalamientos (patrones repetitivos) (Hegarty et al., 2020). En otro experimento, se generaron ratones mutantes knock-out para neuroligina-3 (una proteína de adhesión celular presente en las conexiones sinápticas que se ha asociado con el TEA) en MSNs del NAc, y se les puso en una barra giratoria (rotarod) para inducirles un patrón motor automático (colocación de las patas traseras para la marcha). En comparación con los ratones silvestres, los knock-out mostraron mayor rapidez de producir el patrón de marcha estereotipado (colocaron las patas traseras más rápido). A nivel molecular, en ellos se detectó que el déficit de conexiones sinápticas inhibitorias producido por la mutación alteraron el equilibrio sináptico excitatorio/inhibitorio en la región cerebral estudiada (Fuccillo, 2016). En cuanto a los estudios realizados en niños, las pruebas de resonancia magnética muestran volúmenes del núcleo putamen y Nac aumentados en los niños TEA estudiados de hasta un 34 % con respectos a controles neurotípicos (Thabault et al., 2022). También se midieron los volúmenes del núcleo caudado y del NAc, y ambos aumentaron conforme avanzó el neurodesarrollo en los pacientes en el espectro autista en comparación con los sujetos controles, que en ellos disminuyó con la edad (Langen et al., 2009). Otros estudios obtuvieron resultados contrarios a los comentados anteriormente: en una muestra procedente del grupo ENIGMA (Mejora de la genética de neuroimagen a través del metaanálisis) compuesta por 1.571 personas en el espectro y 1.651 personas controles (entre 2 a 64 años), se obtuvo unos volúmenes de núcleo putamen, globo pálido y núcleo accumbens más pequeños en TEA con respecto a los controles (Van Rooij et al., 2018). En otra investigación compuesta por 81 niños en el espectro autista menores de tres años y 45 niños neurotípicos utilizados como controles, recopilaron 85 imágenes de resonancia magnética y obtuvieron unos volúmenes del Nac más pequeños, así como unos ventrículos laterales aumentados en los niños autistas (Shiohama et al., 2022). Por todo ello, a pesar de que en algunos casos se han obtenido resultados significativos, de forma global no son concluyentes, por lo que se debería de seguir investigando el neurodesarrollo del área subcortical en este trastorno, así como los diferentes factores que lo pueden alterar. 16 4.2 Influencia de la MIA en el TEA Aparte de los estudios sobre las alteraciones en la morfología cerebral en el TEA, otras líneas de investigación tratan de analizar la influencia de los factores ambientales en este trastorno del neurodesarrollo. Entre ellos se encuentran las perturbaciones intrauterinas, como la MIA. Los primeros datos de los que se tienen constancia de la relación entre la MIA y los trastornos del espectro autista en la descendencia se remontan a los años sesenta del siglo pasado. Después de la epidemia de rubéola que azotó EE-UU. en esa década, de los niños expuestos al patógeno durante el primer trimestre de embarazo, entre un 8% y 13% fueron diagnosticados de TEA tiempo después. Más adelante, otros estudios relacionaron las infecciones virales o bacterianas en el embarazo con un aumento en la probabilidad de la descendencia de tener TEA de un 12% (Zawadzka et al., 2021). A nivel molecular, se han analizado diversas muestras de suero sanguíneo tanto en niños en el espectro como a sus madres en busca de posibles alteraciones. Se encontraron niveles de varias quimiocinas elevadas en estos niños, entre las que destacan IL-6, IL-17, IL-1b y IL-8 (que se relacionaron con patrones de conducta alterados entre los que se encuentran las interacciones sociales reducidas y los movimientos repetitivos), así como también el factor de necrosis tumoral alfa y la proteína C reactiva (PCR) (Boulanger-Bertolus et al., 2018; Hall et al., 2023; McLellan et al., 2022; Zawadzka et al., 2021). También se han encontrado estas interleucinas aumentadas en muestras de tejido cerebral post-mortem y de líquido cefalorraquídeo de pacientes en el espectro. Estos compuestos aumentan la permeabilidad y vulnerabilidad de la barrera hematoencefálica del embrión en desarrollo, provocando un desequilibrio entre las citoquinas maternas y fetales y, por consiguiente, alteraciones en el desarrollo cerebral (McLellan et al., 2022). Los modelos animales de MIA confirman aún más esta relación. Aquellos animales que han sido expuestos a Poly I:C o a LPS durante la gestación, muestran niveles elevados de IL-6 (Hall et al., 2023; Patterson, 2011; Zawadzka et al., 2021), y en los test de comportamiento realizados posteriormente muestran pautas de comportamientos similares a la sintomatología TEA: reducción en la interacción social, aumento de las estereotipias (mayor acicalamiento o enterramiento de canicas), déficit en la comunicación y elevados niveles de ansiedad (Bergdolt and Dunaevsky, 2019; Carlezon et al., 2019; Hall et al., 2023; McLellan et al., 2022; Patterson, 2011). Es importante destacar que, a pesar de la obtención de estos resultados, los efectos de la MIA en otras regiones del sistema nervioso central, así como los mecanismos fisiopatológicos que 17 induce durante el desarrollo del sistema nervioso del embrión, siguen siendo desconocidos en su mayor parte, y los estudios en humanos no permiten observar con detalle todo el proceso inmunitario. Por tanto, la investigación biomédica básica con los animales resulta esencial (Hall et al., 2023; Zawadzka et al., 2021) . II. OBJETIVOS Partiendo de la existencia de una posible disfunción estriatal en el TEA (presencia de movimientos repetitivos), y la relación de este trastorno del neurodesarrollo con la MIA como uno de los posibles factores ambientales que contribuyen a su etiología, la hipótesis de este trabajo fue estudiar la neurogénesis de las MSNs e interneuronas inhibitorias del NAc en ratón, para ver si la MIA influyó en ellos, como posible causa de las estereotipias en el trastorno del espectro autista. III. MATERIALES Y MÉTODOS. 1. ANIMALES UTLIZADOS. Antes de empezar el experimento de este trabajo, se llevó a cabo un estudio previo de la anatomía y organización neuronal del cuerpo estriado. Para ello se utilizó un modelo de ratón de tipo GAD67-EGFP de 15 días de edad postnatal. El GAD (ácido glutámico descarboxilasa) es la enzima responsable de la síntesis del GABA (ácido γ-aminobutírico), principal neurotransmisor inhibitorio del cuerpo estriado. Para el experimento de la influencia de la MIA en la neurogénesis estriatal, se utilizaron ratones de 22 días de edad postnatal (P22) descendientes de hembras silvestres (wild type, WT) consanguíneas de la cepa C57BL/6J. Dado que la ratio de diagnóstico del TEA por sexos es de 1 de cada 4, este estudio fue realizado en cuatro hembras gestantes, dos de las cuales fueron sometidas al tratamiento experimental y las otras dos, a una solución fisiológica como control. Hay que aclarar que una de las hembras no estuvo preñada, por lo que los resultados obtenidos son en base a las camadas de tres hembras. A continuación, se detallan los sexos de los descendientes de cada camada: - Camada 1: 4 machos y 3 hembras. - Camada 2: 4 machos y 3 hembras. - Camada 3: 6 machos y 1 hembra. 18 2. MODELO DE MIA La inducción de la MIA se llevó a cabo con el ácido polinosinico-policitidílico (Poly I:C) para simular una infección viral. Para control, se empleó una solución de tampón fosfato salino (PBS 1X) que mantiene la osmolaridad celular y tisular. 3. DATACIÓN DE CÉLULAS Para estudiar el efecto de la MIA en el origen y proliferación neuronal en la etapa postnatal, tras la inyección de Poly I:C se puso una inyección de 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU), un análogo de la timidina, el nucleósido resultante de la unión de la base nitrogenada timina con el anillo de desoxirribosa en la molécula de ADN. Con un marcaje específico por inmunohistoquímica, permite determinar las neuronas que se han originado tras el momento de la inyección, ya que se incorpora en la doble hélice en sustitución de la timina conforme las neuronas replican su material genético en sus procesos de división. En la siguiente tabla se muestra el momento de las inyecciones tanto de Poly I:C como de BrdU, las dosis de los mismos y el momento del sacrificio de las crías (Tabla 1): Tabla 1: Resumen de los tiempos, dosis y vías de administración de los tratamientos de Poly I:C y PBS a las ratonas gestantes y el momento de sacrificio de sus crías. INYECCIÓN DE POLY I:C/PBS EN MADRES (10 mg/Kg peso) INYECCIÓN DE BrdU EN MADRES (50 mg/Kg peso) SACRIFICIO DE CRÍAS E13,5 (vena de la cola) E13,5 (intraperitoneal) P 22 Se eligió E13,5 como una edad de gestación intermedia para las inyecciones, en base a la información recopilada en los apartados interiores sobre el momento cuando se originan los diferentes tipos neuronales del cuerpo estriado. 19 4. PROCESAMIENTO DEL TEJIDO 4.1. Anestesia, fijación del tejido y sacrificio Tanto los ratones GAD67-GFP como las hembras gestantes del modelo de MIA y posteriormente sus crías, fueron anestesiados profundamente con una solución anestésica compuesta por xilacina, ketamina en solución de cloruro sódico. En todo momento se siguió el protocolo de bienestar animal durante la experimentación. Posteriormente se llevó a cabo una perfusión intracardíaca con una bomba peristáltica, en la que primero se lavó el circuito con PBS durante dos minutos, seguido de paraformaldehído (PFA) al 4%, un compuesto fijador tisular, durante siete minutos aproximadamente. Posteriormente, se extrajeron los cerebros y fueron inmersos en PFA 4% hasta el día siguiente. 4.2 Corte del tejido Los cerebros fueron introducidos en moldes hechos con una solución de agarosa al 4% y se dejaron enfriar a 4ºC. A continuación, fueron cortados con el vibratomo LEICA VT100S a un grosor de 60 μm en el plano coronal. Los cortes se colocaron de forma seriada en placas de pocillos con solución de mantenimiento compuesta por PBS con antifúngico azida 0,02%. Se mantuvieron a 4ºC a la espera de la realización de la técnica de inmunohistoquímica. 4.3 Anticuerpos Debido a la presencia del marcador BrdU en el ADN celular, antes de proceder a la incubación tisular con los anticuerpos, los tejidos fueron sumergidos en 1mL de ácido clorhídrico (HCl) 1N durante 45 minutos a 37ºC en agitación para desnaturalizar el material genético y permitir así que el anticuerpo anti-BrdU acceda fácilmente al ADN. Tras ello, el tejido se renaturalizó con una solución de tampón borato 0,1 M a temperatura ambiente durante 45 minutos. Posteriormente, los cortes fueron incubados durante 1 hora con una solución de bloqueo para evitar uniones inespecíficas de la membrana celular, compuesta por 5% BSA (proteína albúmina de suero bovino) y 0,5% Triton (detergente), a temperatura ambiente. Tras ello, fueron incubados durante toda la noche en agitación a 4ºC con una solución formada por la solución de bloqueo anteriormente descrita y los anticuerpos primarios utilizados para identificar los diferentes marcadores de los tipos neuronales, que fueron: - Anti- DARPP-32 (hecho en conejo (rabbit, Rb)) a una concentración de 1:500: para el marcaje de las MSNs en los modelos de ratones GAD67-GFP y en experimentos de MIA. 20 - Anti-DCX (hecho en cabra (goat, Go)) a una concentración de 1:500 en el modelo de GAD67-GFP. - Anti-GFP (hecho en pollo (chicken, Ch)) a una concentración de 1:1000: las interneuronas del modelo de ratón GAD67-GFP expresa la proteína verde fluorescente (GFP). - Anti-BrdU (hecho en rata (rat)), a una concentración de 1:500 en experimentos de MIA. - Anti-Parvalbúmina (PV) (hecho en ratón (mouse, ms)) a una concentración de 1:500: para el marcaje de la interneurona inhibitoria que expresan parvalbúmina en experimentos de MIA. Posteriormente, las muestras fueron lavadas durante 5 minutos con PBS en agitación e incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente, agitación y oscuridad (para no alterar la sensibilidad a la luz de los fluoróforos de los anticuerpos secundarios) con una solución compuesta por la solución de bloqueo y los siguientes anticuerpos secundarios, todos a una concentración de 1:1000 recomentada por el fabricante: - Donkey anti-rabbit (647): para el anticuerpo primario anti-DARPP-32 en el modelo de ratón GAD67-GFP. - Donkey anti-goat (555): para el anticuerpo primario anti-DCX en el modelo de ratón GAD67-GFP. - Donkey anti-chicken (488): para el anticuerpo primario anti-GFP en el modelo de ratón GAD67-GFP. - Donkey anti-rat (555): para el anticuerpo primario anti-BrdU en los modelos de ratones GAD67-GFP y en experimentos de MIA. - Donkey anti-rabbit (488): para el anticuerpo primario anti-DARPP-32 en experimentos de MIA. - Donkey anti-mouse (647): para el anticuerpo primario anti-PV en el modelo de ratón MIA. Por último, los cortes fueron lavados durante 5 minutos con PBS para eliminar el exceso del anticuerpo secundario e incubados durante 10 minutos en agitación y oscuridad, con una solución compuesta por PBS y DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol), un marcador fluorescente que se intercala entre las regiones ricas en adenina y timina del ADN, tiñendo así los núcleos celulares. Posteriormente, los cortes fueron lavados durante 5 minutos con PBS y se procedió a su montaje. 21 4.4 Montaje Los cortes fueron colocados en portaobjetos biselados y se dejaron secar para eliminar el exceso de PBS. Posteriormente se les administró el medio de montaje acuoso Inmumont y se colocaron encima los cubreobjetos. 4.5 Visualización en el microscopio y cuantificación neuronal Los marcajes inmunohistoquímicos se analizaron en el microscopio Leica Thunder y se tomaron fotografías con el objetivo de 20X. Las imágenes obtenidas del experimento de la MIA, en formato tif, fueron procesadas con el programa FIJI para cuantificar las neuronas doble positivas para BrdU y DARPP-32 y para BrdU y PV en un área determinada en el NAc (mm2). 5. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Se calcularon las densidades de neuronas DARPP-32+/BrdU+ relativas a las áreas determinadas del núcleo accumbens (nºcélulas/mm2) de cada corte (cada individuo tuvo aproximadamente entre 3 y 4 cortes) para luego obtener los datos medios por individuos y por camada. Con los datos medios por camada, fueron agrupadas según tenían aplicados el tratamiento con Poly I:C o el tratamiento de PBS usado como control y se calcularon los datos medios de los dos grupos. Una vez obtenidos, con el programa estadístico PRISM se realizaron los test de normalidad (Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk) para determinar si los datos seguían una distribución normal. Posteriormente se empleó el test estadístico t-Student para dos grupos (Poly I:C y control) para determinar si existen o no diferencias entre los mismos. Para ello, dependiendo del resultado del test de normalidad, se utilizaron los datos de las medias (si los datos siguieron una distribución normal) o los datos de las medianas (si no siguieron una distribución normal). La hipótesis nula (Ho) fue la existencia de diferencias significativas entre los grupos de tratamientos, y la alternativa (H1), lo contrario. También quisimos estudiar si existen o no diferencias en las densidades neuronales en el Nac a lo largo de su eje rostro-caudal. Para ello, con el mismo programa estadístico, se calcularon los test de normalidad ya citados anteriormente. Posteriormente, se empleó el test estadístico ANOVA para varios grupos y el análisis post-hoc de Kruskall-Wallis. 28 conseguir reproducirlas lo más fielmente posible. Los que suelen presentar un mayor grado de validación a nivel conductual son los que han sido creados en base a las alteraciones genéticas humanas de este trastorno, pero el problema reside en la no consideración de la etiología multifactorial del TEA y en la no existencia de pruebas comportamentales sólidas que sean realmente análogas entre humanos y ratones. Con respecto al estudio en estos modelos de los factores ambientales implicados en el TEA, a pesar de tener un coste económico bajo y reaccionar de manera rápida, sencilla a los fármacos utilizados para este fin, solo manifiestan algunos rasgos de este trastorno (Bey and Jiang, 2014; Li et al., 2021; Silverman et al., 2022). Todo ello debería de tenerse en cuenta de cara a futuras investigaciones neurocientíficas sobre el TEA. V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO Las alteraciones que afectan a la neurogénesis, generando trastornos del neurodesarrollo como el TEA, son de origen multifactorial, por lo que su estudio no debe centrarse en una sola variable. La obtención de resultados negativos con respecto a la influencia de la MIA en la neurogénesis de MSN a E13,5 no descarta los posibles efectos que sí pueda tener en otras edades gestacionales y tipos neuronales, en un estudio diferencial por sexos, así como en el análisis de su efecto en los progenitores neuronales. Por ello, estas variables dejan paso a ampliar este estudio con otras líneas de investigación. Por un lado, se puede continuar la línea de estudio postnatal de este trabajo, pero realizando las inyecciones a edades más tempranas, entre E10 y E12, en las cuales tendría más efecto el tratamiento de cara a la neurogénesis. Asimismo, se podrían realizar análisis de comportamiento a las crías de las madres a las que se les aplicaría tanto la inyección de Poly I:C como las del tratamiento de control para verificar si manifiestan patrones de movimientos repetitivos. Por otro lado, cabría ampliar el número de crías para que el análisis por sexos sea más contrastado, pues se ha demostrado que la ratio de diagnóstico diferencial del TEA difiere por sexos. Por último, se puede abrir una nueva línea de trabajo basada en el análisis de los progenitores de las neuronas de nuestro estudio, para verificar si los resultados obtenidos en estos concuerdan con los resultados de los estudios postnatales. Todas estas posibles vías de investigación podrían dar respuestas al origen neurobiológico de los trastornos psiquiátricos. 29 VI. BIBLIOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA Baj J, Flieger W, Flieger M, Forma A, Sitarz E, Skórzyńska-Dziduszko K, et al. Autism spectrum disorder: Trace elements imbalances and the pathogenesis and severity of autistic symptoms. Neurosci Biobehav Rev 2021;129. https://doi.org/10.1016/j.neubiorev.2021.07.029. Barañao RI. Inmunología del embarazo. Invest Clin 2011;52. https://doi.org/10.31403/rpgo.v43i1019. Bergdolt L, Dunaevsky A. Brain changes in a maternal immune activation model of neurodevelopmental brain disorders. Prog Neurobiol 2019;175. https://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2018.12.002. Bey AL, Jiang Y hui. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Curr Protoc Pharmacol 2014;2014. https://doi.org/10.1002/0471141755.ph0566s66. Boulanger-Bertolus J, Pancaro C, Mashour GA. Increasing role of maternal immune activation in neurodevelopmental disorders. Front Behav Neurosci 2018;12. https://doi.org/10.3389/fnbeh.2018.00230. Brown AS, Meyer U. Maternal immune activation and neuropsychiatric illness: A translational research perspective. American Journal of Psychiatry 2018;175. https://doi.org/10.1176/appi.ajp.2018.17121311. Budday S, Steinmann P, Kuhl E. Physical biology of human brain development. Front Cell Neurosci 2015;9. https://doi.org/10.3389/fncel.2015.00257. Carlezon WA, Kim W, Missig G, Finger BC, Landino SM, Alexander AJ, et al. Maternal and early postnatal immune activation produce sex-specific effects on autism-like behaviors and neuroimmune function in mice. Sci Rep 2019;9. https://doi.org/10.1038/s41598-019-53294-z. Cattaneo S, Zaghi M, Maddalena R, Bedogni F, Sessa A, Taverna S. Somatostatin- Expressing Interneurons Co-Release GABA and Glutamate onto Different Postsynaptic Targets in the Striatum. BioRxiv 2019. https://doi.org/10.1101/566984. Cauli B, Zhou X, Tricoire L, Toussay X, Staiger JF. Revisiting enigmatic cortical calretininexpressing interneurons. Front Neuroanat 2014;8. https://doi.org/10.3389/fnana.2014.00052. Chen L, Chatterjee M, Li JYH. The mouse homeobox gene Gbx2 is required for the development of cholinergic interneurons in the striatum. Journal of Neuroscience 2010;30. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3742-10.2010. Delhaye-Bouchaud N. Développement du système nerveux central chez les mammifères. Neurophysiologie Clinique 2001;31. https://doi.org/10.1016/S0987-7053(01)00249-0. Fuccillo M V. Striatal circuits as a common node for autism pathophysiology. Front Neurosci 2016;10. https://doi.org/10.3389/fnins.2016.00027. Ganglia B, Revisión B, Ospina-García N, Pérez-Lohman C, Vargas-Jaramillo JD, Cervantes- Arriaga A, et al. Ganglios Basales y Conducta. Revista Mexicana de Neurociencia 2017;18. Greengard P, Allen PB, Nairn AC. Beyond the dopamine receptor: The DARPP-32/protein phosphatase-1 cascade. Neuron 1999;23. https://doi.org/10.1016/S0896- 6273(00)80798-9. Hall MB, Willis DE, Rodriguez EL, Schwarz JM. Maternal immune activation as an epidemiological risk factor for neurodevelopmental disorders: Considerations of 30 timing, severity, individual differences, and sex in human and rodent studies. Front Neurosci 2023;17. https://doi.org/10.3389/fnins.2023.1135559. Hegarty JP, Lazzeroni LC, Raman MM, Hallmayer JF, Cleveland SC, Wolke ON, et al. Genetic and environmental influences on corticostriatal circuits in twins with autism. Journal of Psychiatry and Neuroscience 2020;45. https://doi.org/10.1503/jpn.190030. HervásA, Maraver N. Trastornos del Neurodesarrollo. Trastornos del espectro autista. Editorialmédica Panamericana. 2021; Vol 5. Hervás A, Maristany M, SalgadoM, Sánchez Santos L. Los trastornos del espectro autista. Pediatr Integral.2012;16(10):780-94. Jiang X, Nardelli J. Cellular and molecular introduction to brain development. Neurobiol Dis 2016;92. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2015.07.007. Kaminer J, Espinoza D, Bhimani S, Tepper JM, Koos T, Shiflett MW. Loss of striatal tyrosine-hydroxylase interneurons impairs instrumental goal-directed behavior. European Journal of Neuroscience 2019;50. https://doi.org/10.1111/ejn.14412. Knowles R, Dehorter N, Ellender T. From progenitors to progeny: Shaping striatal circuit development and function. Journal of Neuroscience 2021;34. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0620-21.2021. Langen M, Schnack HG, Nederveen H, Bos D, Lahuis BE, de Jonge M V., et al. Changes in the Developmental Trajectories of Striatum in Autism. Biol Psychiatry 2009;66. https://doi.org/10.1016/j.biopsych.2009.03.017. Li W, Pozzo-Miller L. Dysfunction of the corticostriatal pathway in autism spectrum disorders. J Neurosci Res 2020;98. https://doi.org/10.1002/jnr.24560. Li Z, Zhu YX, Gu LJ, Cheng Y. Understanding autism spectrum disorders with animal models: Applications, insights, and perspectives. Zool Res 2021;42. https://doi.org/10.24272/J.ISSN.2095-8137.2021.251. Lim L, Mi D, Llorca A, Marín O. Development and Functional Diversification of Cortical Interneurons. Neuron 2018;100. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2018.10.009. Massarali A, Adhya D, Srivastava DP, Baron-Cohen S, Kotter MR. Virus-Induced Maternal Immune Activation as an Environmental Factor in the Etiology of Autism and Schizophrenia. Front Neurosci 2022;16. https://doi.org/10.3389/fnins.2022.834058. Matsushima A, Graybiel AM. Combinatorial Developmental Controls on Striatonigral Circuits. Cell Rep 2020;31. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107778. McLellan J, Kim DHJ, Bruce M, Ramirez-Celis A, Van de Water J. Maternal Immune Dysregulation and Autism–Understanding the Role of Cytokines, Chemokines and Autoantibodies. Front Psychiatry 2022;13. https://doi.org/10.3389/fpsyt.2022.834910. Mi D, Li Z, Lim L, Li M, Moissidis M, Yang Y, et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science (1979) 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aar6821. Molnár Z, Clowry GJ, Šestan N, Alzu’bi A, Bakken T, Hevner RF, et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. J Anat 2019;235. https://doi.org/10.1111/joa.13055. Morris-Rosendahl DJ, Crocq MA. Neurodevelopmental disorders-the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci 2020;22. https://doi.org/10.31887/DCNS.2020.22.1/macrocq. Nahar L, Delacroix BM, Nam HW. The Role of Parvalbumin Interneurons in Neurotransmitter Balance and Neurological Disease. Front Psychiatry 2021;12. https://doi.org/10.3389/fpsyt.2021.679960. 31 Patterson PH. Maternal infection and immune involvement in autism. Trends Mol Med 2011;17. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2011.03.001. Paxinos G, Franklin KBJ. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 2nd edition. Academic Press 2001. Van Rooij D, Anagnostou E, Arango C, Auzias G, Behrmann M, Busatto GF, et al. Cortical and subcortical brain morphometry differences between patients with autism spectrum disorder and healthy individuals across the lifespan: Results from the ENIGMA ASD working group. American Journal of Psychiatry 2018;175. https://doi.org/10.1176/appi.ajp.2017.17010100. Shiohama T, Ortug A, Warren JLA, Valli B, Levman J, Faja SK, et al. Small Nucleus Accumbens and Large Cerebral Ventricles in Infants and Toddlers Prior to Receiving Diagnoses of Autism Spectrum Disorder. Cerebral Cortex 2022;32. https://doi.org/10.1093/cercor/bhab283. Silbereis JC, Pochareddy S, Zhu Y, Li M, Sestan N. The Cellular and Molecular Landscapes of the Developing Human Central Nervous System. Neuron 2016;89. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2015.12.008. Silverman JL, Thurm A, Ethridge SB, Soller MM, Petkova SP, Abel T, et al. Reconsidering animal models used to study autism spectrum disorder: Current state and optimizing future. Genes Brain Behav 2022;21. https://doi.org/10.1111/gbb.12803. Thabault M, Turpin V, Maisterrena A, Jaber M, Egloff M, Galvan L. Cerebellar and Striatal Implications in Autism Spectrum Disorders: From Clinical Observations to Animal Models. Int J Mol Sci 2022;23. https://doi.org/10.3390/ijms23042294. Vasistha NA, Khodosevich K. The impact of (ab)normal maternal environment on cortical development. Prog Neurobiol 2021;202. https://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2021.102054. Yang HKC, Sundholm-Peters NL, Goings GE, Walker AS, Hyland K, Szele FG. Distribution of Doublecortin Expressing Cells Near the Lateral Ventricles in the Adult Mouse Brain. J Neurosci Res 2004;76. https://doi.org/10.1002/jnr.20071. Zawadzka A, Cieślik M, Adamczyk A. The role of maternal immune activation in the pathogenesis of autism: A review of the evidence, proposed mechanisms and implications for treatment. Int J Mol Sci 2021;22. https://doi.org/10.3390/ijms222111516. WEBGRAFÍA • página web CDC prevalencia TEA: https://www.cdc.gov/ncbddd/spanish/autism/addmcommunity- report/arkansas.html#:~:text=En%20el%202018%2C%20el%20AR,8%20a%C3%B1os %20en%20el%202018 • página web de la OMS prevalencia TEA: https://www.who.int/es/news-room/factsheets/detail/autism-spectrum-disorders