Materiales compuestos de vidrio bioactivo mesoporoso funcionalizados con zinc para aplicación en endodoncia regenerativa

Materiales Compuestos de Vidrio Bioactivo Mesoporoso Funcionalizados con Zinc para Aplicación en Endodoncia Regenerativa Memoria presentada por: María del Carmen Jiménez Sánchez Para optar al grado de: Doctor en Odontología Dirigida por: Dra. María Aránzazu Díaz Cuenca Dr. Juan José Segura Egea Dra. Jenifer Martín González Tutor: Dr. Juan José Segura Egea Departamento de Estomatología Universidad de Sevilla Instituto de Ciencia de Materiales CSIC-US Sevilla, 2019 Agradecimientos Comenzar mis agradecimientos a mis directores de tesis el Dr. Juan José Segura Egea, la Dra. Mª Aránzazu Díaz Cuenca y la Dra. Jenifer Martín González. A Juanjo le tengo que agradecer todo. Gracias Juanjo por confiar en mí, por apostar por mí, por no abandonarme nunca brindándome siempre todo tu apoyo, por siempre tener unas palabras alentadoras y de ánimo. Gracias por transmitirme tu sabiduría y tu amor por la endodoncia y la investigación. Sabes que hubiera sido imposible llegar aquí sin ti. Espero seguir trabajando mucho tiempo a tu lado, porque para mí es todo un placer. A Arantxa darle las gracias por haber llevado la gran carga de mi Tesis Doctoral. Arantxa me ha introducido en un mundo totalmente desconocido para mí como ha sido el mundo de los materiales. Muchas gracias por tu infinita paciencia, tu amabilidad y disposición para ayudarme en todo. También muchas gracias por confiar tanto en mí y por tus ánimos y esfuerzo, sobre todo en la recta final que tanto hemos trabajo. Pero lo que más debo agradecerte es que me hayas enseñado a pensar y a ser autocrítica y muy exigente con mi trabajo, no es fácil encontrar personas que se brinden a ello, muchas gracias, eres la mejor. A Jenifer agradecerle que sea mi amiga, mi compañera, mi consejera… Muchas gracias por ser mi ejemplo a seguir, por tu ayuda y tu disponibilidad siempre que la he necesitado… aún nos queda mucho camino por recorrer juntas… También quiero dar las gracias a mis compañeras del grupo del Instituto de Materiales Lilian, Sara y la nueva incorporación Xiaozhe. He conocido a tres chicas maravillosas que no han dudado un momento en transmitirme sus conocimientos y su ayuda. Lilian fue mis manos en mis comienzos y Sara siempre ha estado disponible incluso en la distancia. A Xiaozhe le deseo lo mejor en los próximos años porque estoy segura que con su actitud y su constante trabajo llegará muy lejos, gracias por tu gran ayuda durante mis últimos experimentos. A mis amigos de almuerzo Ángeles y Francisco por sus ánimos y su apoyo haciendo que por un momento me olvidara de todo y disfrutara de una buena charla. Al personal técnico del Instituto, Mª Carmen, José Carlos, Miguel Ángel, José Mari, Olga, Inma, Antonio de recepción… por ser personas súper agradables y estar siempre disponibles para ayudarme en lo que necesitara. A Ketama, Antonio, Carlos, Víctor Sánchez… por permitirme trabajar en el laboratorio del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina y adentrarme en el mundo celular. Ha sido un placer conocerlos a todos, en especial a mi Keti al que le deseo toda la suerte del mundo porque se la merece. A la Dra. Fionnuala T. Lundy por acogerme en su laboratorio de la Universidad de Queen en Belfast durante mis dos estancias. En Belfast me acogieron desde el primer momento como una integrante más del laboratorio. Gracias por hacer que mi estancia fuera maravillosa y por enseñarme tantas cosas. No puedo pasar sin mencionar a dos personas muy especiales como Marina Afami y Hayley McMillan que se convirtieron en mis amigas y que me ayudaron muchísimo cuando me encontraba perdida en un lugar que nada tenía que ver con Sevilla… También agradecer a la Dra. El Karim, a Catherine, Orla, Nicole, Banan, Harriet, Niall por su cariño y hacerme sentir la niña bonita española del laboratorio, los echo mucho de menos. A mis compañeros del Máster de Endodoncia, tanto profesores (Benito, Isa, Milagros, Carlos, Martín, Paloma) como alumnos, por su preocupación y sus ánimos siempre a la “ratita de laboratorio” como me llamaban en mi promoción. A Daniel Cabanillas por su ayuda y por amenizar las mañanas de los lunes, con él también me quedan muchas horas que pasar en el departamento… A mis chulitas (Marta, Maribel e Irene) por apoyarme en todo momento y darme todos los ánimos y fuerza del mundo en mis momentos de flaquezas, quiero mucho a estas tres personajas. A María Murillo le tengo que hacer un agradecimiento especial porque ella es especial. Mi amiga desde el primer día de carrera y una de las mejores personas que tengo, con la que he podido contar siempre, que jamás me ha fallado y me ha ayudado en todo momento. Con ella he vivido muchas cosas y en cada una de ellas ha sabido cómo responder. Vamos a por todas compañera!! A mis compañeras de clínica Loli, Rosario, Lourdes, Mª Ángeles, Miriam, Mª Carmen y Rubén. Muchas gracias Loli por tu apoyo y la gran flexibilidad que has tenido conmigo. Ellas hacen que si ya me gusta mi trabajo aún me guste más. Gracias por la simpatía, por el cero impedimento a nada, las meriendas, las risas y sacarle siempre el lado positivo a todo! A mis amigos de la cafetera, a los cuales es imposible nombrarlos todos porque somos una gran familia. Si que voy a mencionar a Mª Antonia y Rafi porque son nuestra mitad. No saben lo importante que es para mí tener su apoyo. Muchas gracias por todo amigos, ya queda menos para celebrarlo… Entre mis amigos tengo que hacer mención especial a Mercedes “la pollita”. Ha sido la única persona que me ha pedido aparecer en los agradecimientos de mi tesis, cosa que me encantó que me pidiera y aquí está. Muchas gracias Mer por tus ánimos, tus piropos y esas ganas de vivir que transmites, sabes que eres la mejor! A mis amiguísimas María, Mercedes y Mª Antonia. Siempre están cuando las necesito y cada día doy gracias por tenerlas a mi lado. Son tres chicas valientes, luchadoras, que saben lo que quieren y con mucho estilo… os quiero muchísimo! A mis amigas Mantis por ser las mejores amigas del mundo. A Ana, Siomara, Raquel, Rocío, Isa, María, Pepa, Ana, Carmen María, Elia. Sé que ellas se alegran por todo mi trabajo y mi esfuerzo y porque nadie como ellas sabe animarme y sacarme los colores. Gracias por ser mis amigas desde pequeñas, por quererme de verdad y por demostrarme tanto amor! Nunca nos vamos a separar… A la familia de Jaime, por su comprensión, apoyo y ánimos, muchas gracias por hacerme parte de vuestra bonita familia. A mi casa! Gracias a la mejor madre, hermana y hermanos del mundo. Gracias a mis cuatro tesoros de sobrinos, mi cuñado Jorge, mi tío Julio… ellos son los que realmente conocen todo el esfuerzo de estos cuatro años. Agradecer a mi madre y mi hermana su incondicional e infinito apoyo, su comprensión, sus palabras de aliento… gracias mamá por tu “tengo más ganas que tú que acabes la tesis”… creo que lo echaré de menos… son mi familia y no hay nada que me importe y quiera más que a ellos. Gracias por acompañarme siempre. Acabaré mis agradecimientos con Jaime. Gracias por enseñarme lo que es el verdadero amor, la incondicionalidad, la lealtad y honestidad. Muchas gracias por no abandonarme cuando estaba totalmente perdida, por llegar hasta el final costase lo que costase, gracias por quererme como me quieres, por ser el gran responsable de lo que soy hoy día… Muchas gracias por ser mi compañero, el mejor compañero, gracias mi amor. Perdóname. Te amo mi vida. A mi padre, por ser el responsable de todo… Trabajo, compasión, humildad, paciencia, honestidad y coraje… 1 Las siglas empleadas en esta Memoria de Tesis para hacer referencias a distintos términos corresponden a su traducción al inglés, tal y como se va detallando en el texto del trabajo. Se ha decidido así para mantener la nomenclatura conocida en el ámbito científico y con difusión internacional. Introducción general 1. Antecedentes La Endodoncia se define, según la Sociedad Americana de Endodoncia (American Association of Endodontists, AAE)1, como la rama de la odontología que trata de la morfología, fisiología y patología de la pulpa dental y los tejidos perirradiculares. Su estudio y práctica engloba las ciencias básicas y clínicas, incluyendo la biología de la pulpa normal y la etiología, diagnóstico, prevención y tratamiento de las patologías y lesiones de la pulpa y alteraciones perirradiculares asociadas (AAE 2019). Dada la fisiología de la pulpa dental, formativa e inductora de los tejidos de la dentina y esmalte, nutritiva y homeostática de las estructuras dentales, así como sensitiva y de defensa frente a la infección, se trata de una especialidad fundamental de la odontología como garante de la salud buco dental. En los último años, la investigación en endodoncia está consiguiendo el desarrollo de tratamientos avanzados en procedimientos de regeneración del complejo dentino-pulpar (Regenerative Endodontic Procedures, REPs) (Shamszadeh et al. 2019). Entre los avances más prometedores, cabe destacar el desarrollo de nuevos biomateriales sintéticos (i.e. matrices de andamiaje tisular y relleno, materiales de obturación y sellado) adaptados para aplicación clínica, que estimulen y promuevan el proceso de regeneración natural (Baras et al. 2019; Meschi et al. 2019; Nosrat et al. 2019). A pesar del reconocido éxito clínico de los tratamientos de conductos convencionales, es sabido que los dientes sometidos a este tipo de tratamiento, se vuelven desvitalizados, frágiles y susceptibles a fracturas postoperatorias u otras complicaciones como las reinfecciones (Kim et al. 2010). Estas complicaciones son inevitables debido a la desvitalización provocada durante el tratamiento, dando lugar a la pérdida de la homeostasis y mecanismos de defensa innatos del diente (Fristad et al. 2004; Kim et al. 2010; Landys et al. 2015; He et al. 2017; Prati et al. 2018). Pero además, complicaciones adicionales se producen cuando la patología pulpar afecta a un diente que se encuentra en etapa de desarrollo radicular incompleto. La pérdida de vitalidad pulpar por infección bacteriana, bien por caries o traumatismos en dientes permanentes jóvenes, provoca la detención de la formación de dentina, interrumpiéndose así el desarrollo radicular, cierre apical y posterior maduración de los dientes. Así, esta situación plantea ciertas dificultades a la hora de realizar un tratamiento clínico de endodoncia convencional (Wigler et al. 2013; Medina y Celiz 2019). Para hacer frente a las dificultades citadas, se han planteado alternativas de tratamiento como la apicoformación con hidróxido de calcio Ca(OH)2 (Frank 1966) o tapón apical de agregado de trióxido mineral (Mineral Trioxide Aggregate, MTA) (Torabinejab y Chivian 1999). A continuación, se describirán ambas técnicas. La apicoformación se define como el proceso de acondicionamiento tanto en el interior del canal radicular como en los tejidos periradiculares, para favorecer la formación de una barrera de tejidos calcificados (Heithersay 1975). Para ello, es necesario la limpieza y desinfección del conducto, seguido de la colocación de un material adecuado para el ápice (O'Riordan et al. 1980). Diferentes compuestos y materiales han sido utilizados con tal fin, siendo el hidróxido de calcio el que ha presentado mayores tasas de éxito, debido a su acción biológica favorable, mecanismo antibacteriano y bajo coste (Frank 1966; Torneck y Smith 1970; Cvek et al. 1992; Rafter 2005). La apicoformación con Ca(OH)2 no sólo induce la curación de la patología apical, sino también el cierre del ápice radicular mediante la formación de un tejido calcificado que actúa como barrera apical, permitiendo así la colocación de un material de obturación en el interior del conducto sin que éste sea extruido al espacio periapical (Figura I.1). Los buenos resultados obtenidos, se han atribuido a su efecto antibacteriano al producir “in situ” un aumento del pH hasta valores de 12.5 (Gutmann y Heaton 1981, Granath 1987, Andreasen et al. 2002, Rafter 2005, Trope 2010, Mohammadi y Dummer 2011). El mecanismo de acción por el que el Ca(OH)2 favorece la formación de nuevo tejido calcificado no está totalmente claro. Se cree que la elevada alcalinidad producida neutraliza la acidosis provocada por la inflamación, favoreciendo así la mineralización. También se ha relacionado su acción con la gran cantidad de iones calcio liberados, creyéndose por tanto que la conjunción de un pH elevado y una alta concentración de iones de calcio son favorables para la proliferación celular y aposición de tejidos calcificados en el ápice radicular (Chong y Pitt 1992) Figura I.1. Esquema descriptivo de la técnica de apicoformación con Ca(OH)2. Sin embargo, esta técnica de apicoformación con Ca(OH)2 presenta varios inconvenientes. Andreasen (Andreasen et al. 2002) observó cómo la resistencia a la fractura de la dentina radicular se reducía de forma significativa después de un periodo de exposición al hidróxido entre 6 meses y un año (Doyon et al. 2005). Además, este procedimiento requiere de una excelente colaboración del paciente debido a la necesidad de visitas múltiples programadas durante varios meses (Kleier y Barr 1991; Mohammadi y Dummer 2011). En la década de los años 90, el agregado de trióxido mineral (MTA), fue propuesto por Torabinejab (Torabinejab y Chivian 1999), como un buen material alternativo para la creación de una barrera apical artificial en dientes con necrosis pulpar y ápices abiertos. Dicha barrera permite la compactación del material de obturación, Caries Tejido pulpar Ápice abierto Hueso Cavidad de acceso Desinfección NaOCl Colocación Ca(OH)2 Nuevo tejido apical 6-12 meses Gutapercha Resina compuesta Obturación Ca(OH)2 finalizando el tratamiento en sólo dos citas (Simon et al. 2007; Witherspoon et al. 2008; Mente et al. 2009). Así, son numerosos los estudios que han indicado que el tratamiento de apicoformación con MTA tiene una alta tasa de éxito con un número muy reducido de citas y tiempo (Rafter 2005; Simon et al. 2007; Mente et al. 2009; Chala et al. 2011; Torabinejab et al. 2018). Además, el MTA presenta buena capacidad de sellado (Torabinejab et al. 1995; Al-Kahtani et al. 2005), biocompatibilidad y bioactividad (Mitchell et al. 1999; Tomson et al. 2007), así como capacidad antibacteriana (Eldeniz et al. 2006) (Figura I.2). Estudios clínicos comparativos a corto plazo han informado una tasa de éxito para el tratamiento de apicoformación con Ca(OH)2 de entre 73 y 100%, y de entre 70 y 100% para MTA con o sin apósito de Ca(OH)2 intermedio (El-Meligy y Avery 2006, Pradhan et al.2006, Damle et al. 2012, Bonte et al.2015; Kandemir et al. 2019). Sin embargo, a pesar de las buenas tasas de éxito, ambos procedimientos carecen de potencial para restaurar la vitalidad del tejido pulpar dañado, no promoviendo así el desarrollo radicular que ha sido interrumpido, permaneciendo por tanto, las paredes radiculares muy cortas y delgadas, aumentándose la susceptibilidad a la fractura radicular (Cvek et al. 1992, Chala et al. 2011). Figura I.2. Esquema descriptivo de la técnica de apicoformación con MTA. Es por ello que surge la necesidad de buscar alternativas de tratamiento que solventen las carencias de los tratamientos tradicionales llevados a cabo en este tipo de lesiones, mediante el avance de las terapias regenerativas también en el ámbito de la odontología. Éste es el origen de la aplicación de terapias regenerativas en endodoncia, que actualmente ya ofrecen ventajas biológicas como son, la promoción de la neoformación de tejido duro con el consiguiente desarrollo y maduración del ápice, así como el engrose de las paredes radiculares (Neha et al. 2011). 2. Procedimientos de regeneración en endodoncia (Regenerative Endodontic Procedures, REPs) Las terapias de regeneración en endodoncia consisten en tratamientos con fundamentos biológicos diseñadas para reparar estructuras dañadas o enfermas, incluyendo dentina o cemento, así como células del complejo dentino-pulpar, Caries Tejido pulpar Ápice abierto Hueso Cavidad de acceso Desinfección NaOCl Colocación MTA MTA 4 horas MTA Gutapercha Resina compuesta mediante la utilización de tejidos viables, preferentemente del mismo origen, que permitan restaurar las funciones fisiológicas normales del complejo dentinopulpar” (Wigler et al. 2013). Entre los autores pioneros que introdujeron el concepto de regeneración para los tejidos dentales, cabe mencionar al Profesor Nygaard-Østby quién, en los años 70, evaluó un método para restablecer la funcionalidad del complejo pulpo-dentinario en un diente permanente inmaduro con necrosis pulpar (Nygaard-Østby y Hjortdal 1971). El procedimiento llevado a cabo consistía en provocar un sangrado en el interior del canal radicular al pasar una lima de endodoncia más allá del ápice, revelando el examen histológico realizado posteriormente, que se formaba tejido conectivo fibroso y cemento en los dientes cuyo diagnóstico previo era de pulpa vital, no ocurriendo en los casos de pulpas necróticas. 2.1. Evolución en REPs Los primeros avances de regeneración tisular en endodoncia han venido de la mano de la utilización de una serie de procedimientos clínicos encaminados a la revascularización, siendo el resultado muy limitado respecto a la restauración de las estructuras fisiológicas propiamente dichas. El término revascularización fue utilizado por primera vez por Iwaya y colaboradores en 2001 (Iwaya et al. 2001). Iwaya se basó para sus primeros casos en los experimentos de revascularización de reimplantes de dientes inmaduros de perros (Skoglund et al. 1978, Skoglund y Tronstad 1981), a los que añadió la desinfección del conducto radicular con una mezcla de antibióticos de ciprofloxacino y metronidazol (Hoshino et al. 1996, Sato et al. 1996). Este tratamiento dio como resultado la resolución de los signos y síntomas clínicos y promovió el engrosamiento de las paredes del canal radicular y cierre apical de los dientes permanentes inmaduros. Posteriormente, el protocolo de revascularización fue propuesto por Banchs y Trope (Banchs y Trope 2004). Este protocolo se basa en los experimentos de revascularización (Kling et al. 1986), desinfección del conducto radicular (Hoshino et al. 1996) e inducción de sangrado en el espacio del canal radicular (Nygarrd- OstbyyHjortdal1971). Banchs y Trope añadieron la minociclina a la pasta antibiótica utilizada por Iwaya y cols. (Iwaya et al. 2001), siendo conocida como triple pasta antibiótica (Triple Antibiotic Paste; TAP). Además, como sellado coronal se utilizó el MTA en lugar del ionómero de vidrio. Este protocolo ha sido ampliamente adoptado en muchos estudios posteriores en la literatura, ya que también demostró resolución de síntomas y signos clínicos, además de promover engrosamiento de las paredes del canal y cierre apical de dientes permanentes inmaduros. Ya en 2007, el concepto de endodoncia regenerativa como terapia capaz de remplazar de forma predecible estructuras dañadas, enfermas o perdidas, a través de tejidos viables, restaurando las funciones fisiológicas normales del complejo dentino-pulpar, fue adoptado por la AAE (Murray et al. 2007) como terapia alternativa de tratamiento a la tradicional apicoformación con Ca(OH)2 o MTA en dientes permanentes inmaduros con pulpas necróticas (Hargreaves et al. 2008). 2.2. Bases biológicas de la ingeniería de tejidos en endodoncia Desde una perspectiva biológica, el objetivo de la endodoncia regenerativa aplicada en clínica actualmente es el de prevenir (terapia pulpar vital) y/o tratar la periodontitis apical (Hargreaves y Cohen 2011). Los procedimientos actuales de regeneración pulpar están basados en la conservación de las células y moléculas de señalización supervivientes en el complejo dentino-pulpar, mediante el reclutamiento, multiplicación y diferenciación de las mismas a células formadoras de tejidos que sean capaces de restablecer la función fisiológica perdida (Sonoyama et al. 2008). Aún no es bien conocido qué ocurre a nivel celular tras la aplicación de los diferentes protocolos de tratamiento propuestos, pero se conoce que al igual que en el tratamiento de conductos convencional, es de crucial importancia la reducción de la infección mediante el uso de una combinación de medicamentos (Chen et al. 2012; Fouad 2017). Las bases biológicas de la ingeniería de tejidos implican el correcto ensamblaje de una triada de elementos, entre los que se encuentran: células madre progenitoras, moléculas señalizadoras y biomateriales (Figura I.3). Esto implica el estudio y comprensión de los distintos eventos biológicos y fisiológicos asociados al proceso de regeneración que orienten la selección adecuada de los elementos implicados (Tatullo et al. 2019). Distintos tipos de células madre adultas han sido identificados en los tejidos dentales. Entre ellas, las células madre de la pulpa dental (Dental Pulp Stem Cells; DPSCs) han sido las más utilizadas en los estudios por su demostrada capacidad de diferenciación y formación de nuevo tejido pulpar (Bakhtiar et al. 2018) El reclutamiento de células madre / precursoras, así como su diferenciación a células generadoras de tejido pulpar, requiere la acción de moléculas señalizadoras que, bien pueden ser liberadas por los biomateriales o proceder de la matriz de dentina (Hilkens et al. 2015). Entre estas moléculas, es conocido que el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-2), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) promueven la angiogénesis y la regeneración de tejido pulpar (Kim et al. 2010). Tratamiento de células madre mesenquimales (Mesenchymal Stem Cells; MSC) con FGF-2 antes de su implantación mejora la angiogénesis en construcciones de tejidos a través de VEGF (Gorin et al. 2016). En cuanto a la diferenciación celular, proteínas morfogenéticas óseas BMP-2 y BMP-4 promovieron sinérgicamente la diferenciación de odontoblastos y la formación de dentina (Nakashima 1994; Prescott et al. 2008). El tercer componente consiste en un biomaterial diseñado específicamente para promover la adhesión, supervivencia, proliferación, migración y / o diferenciación de las células. Sus propiedades se adaptarán en función de la naturaleza del tejido a regenerar (Mele et al. 2016). A diferencia de los tratamientos de revascularización, los tratamientos de regeneración requieren la incorporación de un biomaterial, con o sin células madre precursoras, en el espacio endodóncico. En el caso de los tratamientos sin trasplante celular, el biomaterial debe funcionalizarse incorporando moléculas bioactivas que se difundirán a través del canal radicular, para atraer células necesarias para el proceso de regeneración. Así, aunque ya se han propuesto algunos biomateriales como quitosano, gelatina o colágeno entre otros (Albuquerque et al. 2014; Conde et al. 2015), existe un gran interés en el diseño y desarrollo de materiales avanzados que mimeticen las estructuras naturales de la matriz extracelular. De acuerdo con los postulados del Prof. Williams, la ingeniería de tejidos es la creación de nuevos tejidos para la reconstrucción terapéutica del cuerpo humano, mediante la estimulación deliberada y controlada de células diana seleccionadas a través de una combinación sistemática de moléculas señalizadoras (Williams 2014). Aunque esto no implica directamente la utilización de biomateriales, es obvio que la vehiculización de estas moléculas hasta la células no tiene lugar en el vacío por lo que debe existir un agente trasportador que controle, con una precisión espacio-temporal, los procesos relevantes. De lo anterior, se puede concluir que el primer y segundo objetivo pueden ser alcanzados con la aplicación de los protocolos REPs actuales, sin embargo, la regeneración propiamente dicha correspondiente a un tejido pulpo-dentinario plenamente estructurado y funcional aún no se ha conseguido tras aplicación de los citados protocolos (El-Ashiry et al. 2018). Por tanto, esto sugiere que los procedimientos REPs utilizados no son plenamente satisfactorios, reclamando la investigación nuevos desarrollos en ingeniería de tejidos considerando los tres pilares fundamentales en los que se basa: el estudio del aislamiento y potencial de células progenitoras tanto exógenas como endógenas (Egusa et al. 2012), la comprensión y actuación de los distintos factores de crecimiento y biomoléculas responsables de una adecuada señalización (Kuashik et al. 2016; Marí-Beffa et al. 2017), y el desarrollo de biomateriales que estimulen la formación del microambiente (nicho) adecuado para asistir el proceso de regeneración (Gupta y Kumar 2008; Piva et al. 2014; Schmalz et al. 2016). Este trabajo de Tesis se centra en el tercer pilar mencionado, el desarrollo de un biomaterial biomimético, es decir, específico para el tejido a tratar como plantilla temporal a modo de matriz extracelular artificial, para asistir el proceso de regeneración del complejo dentino-pulpar. 3. Biomateriales diseñados para REPs Como se ha indicado, el biomaterial es un elemento esencial para que se produzca regeneración tisular, al actuar como una plantilla temporal simulando a la matriz extracelular del tejido a regenerar. Estudios para aplicaciones en endodoncia regenerativa, han ensayado la utilización de varios tipos de biomateriales como: i) el plasma rico en plaquetas (Platelet-Rich Plasma; PRP) (Bezgin et al. 2015; Kawase 2015), fibrina rica en plaquetas (Platelet-Rich Fibrin; PRF) (Hiremath et al. 2012; Chen et al. 2015; Torabinejab et al. 2015); ii) biopolímeros naturales como el colágeno (Nevins et al. 2015; Kontakiotis et al. 2015), ácido hialurónico (Ferroni et al. 2015), quitosano (Shresthe et al. 2014), hidrogeles peptídicos (Piva et al. 2014); iii) polímeros sintéticos tales como ácido poliláctico (Polylactic Acid; PLA) (Ling et al. 2015) y ácido poliláctico-co-glicólico (Poly Lactic-co-Glycolic Acid; PLGA) (Zhou et al. 2014; Chen et al. 2015) y iv) bioceramicos como hidroxiapatito de calcio (Yang et al. 2013; Ling et al. 2015; Nevins et al. 2015), fosfato tricálcico (Zheng et al. 2011; Varalakshmi et al. 2013), vidrios bioactivos (Zhang et al. 2015) y varias composiciones de agregado de trióxido mineral (Kontakiotis et al. 2015; Lee et al. 2015). Actualmente, la aplicación de estos biomateriales se encuentra en estudio, no pudiendo confirmar con la escasa evidencia disponible que algunas de las combinaciones utilizadas hasta el momento en distintos modelos animales sea capaz de regenerar un tejido pulpo-dentinario bien estructurado y plenamente funcional. La cantidad y la calidad del tejido tipo pulpa recién formado depende de varios factores, como el tipo de biomaterial y su lugar de implantación o el modelo animal utilizado (Fukushima et al. 2019). Por ello, y con el objetivo de avanzar, la tendencia de las últimas investigaciones están dirigidas a la hipótesis de que si la composición del complejo dentino-pulpar está constituida mayoritariamente por hidroxiapatito de calcio y colágeno (dentina) y fibras de colágeno (pulpa), lo ideal sería el diseño y fabricación de configuraciones de biomateriales avanzados que integren estos componentes. El colágeno tipo I es el principal componente de la matriz extracelular (Extracellular Matrix; ECM) orgánica de la dentina (Feng et al. 2003; Prescott et al. 2008) y proporciona una microestructura fibrilar que permite el anclaje y migración de las células madre, así como su posterior proliferación y la diferenciación a odontoblastos (Fukushima et al. 2019). Además, el colágeno tiene alta afinidad por las moléculas de agua y presenta por tanto propiedades hemostáticas, baja respuesta inflamatoria (inmunogénica) del huésped y ausencia de toxicidad (Ramshaw 2016), por lo que resulta un material muy indicado para su utilización, por ello que se trate del material más utilizado en las investigaciones sobre REPs (Fukushima et al. 2019). Por su parte, el componente inorgánico de la dentina, el hidroxiapatito de calcio presenta alternativas muy interesantes como los vidrios bioactivos (Bioactive Glass, BG) (Hench y Jones 2015) que exhiben propiedades únicas para esta aplicación, ya que muestran capacidad de unirse a los tejido blando y a tejido duro mediante la formación de una capa de hidroxiapatita carbonatada (HAC) cuando entran en contacto con fluido fisiológico (Kokubo y Takadama 2006). Como versión avanzada de los BG, los materiales mesoporosos basados en sílice como los vidrios bioactivos mesoporosos (Mesoporous Bioactive Glass; MBG) son sólidos nanoporosos ordenados con un volumen de poro y área de superficie muy altos que han surgido como materiales prometedores para su uso en la liberación de fármacos, regeneración ósea y nanomedicina (Fernandes et al. 2018). Además, se están investigando nuevos enfoques para mejorar la bioactividad de los biomateriales introduciendo en su composición iones con propiedades terapéuticas. A este respecto, el elemento de Zinc (Zn) se ha propuesto como muy interesante para asistir en el proceso de regeneración, ya que puede actuar como un inhibidor de las metaloproteinasas de la matriz (matrix metalloproteinases; MMP) (Toledano et al. 2012). Además, también se ha descrito que este elemento puede influir en las vías de señalización y producir una estimulación metabólica promotora de los procesos de remineralización (Toledano et al. 2013). Se ha demostrado que el Zn inhibe la desmineralización de la dentina y de alguna manera facilita la remineralización del esmalte. Además, se conoce que muchos de los elementos que son liberados por estos materiales durante su degradación en el lugar de implantación (silicio, calcio, sodio, fósforo, magnesio, cobre, zinc) participan en las vías de señalización e interacciones intracelulares (O’Conner et al 2001; Hoppe et al. 2011). En particular, se ha demostrado que el Zn afecta a la bioactividad, biocompatibilidad y propiedades antimicrobianas cuando se incorporan a la estructura de varios vidrios (Goel et al. 2013; Liu et al. 2014; Bakopoulou et al. 2016). A pesar de las propiedades mencionadas, un reto importante en el desarrollo de los MBG es su procesado en estructuras funcionales adecuadas para asistir y guiar la formación de nuevo tejido tridimensional (3D), así como facilitar la vascularización. Además, en el caso de la regeneración pulpar, el biomaterial debe tener una geometría y requerimientos mecánicos específicos para su manipulación e implantación dentro de la cavidad pulpar. Por lo tanto, la fabricación de biomateriales híbridos formados por colágeno y MBG con estructura porosa interconectada que actúen como plantilla temporal tridimensional capaces de liberar iones Zn con propiedades señalizadoras para las células progenitoras, se postulan altamente interesantes para mejorar los resultados en REPs actuales. Así, podrían diseñarse para utilizarse de la misma forma que los rellenos dentales, colocados en contacto con la pulpa para estimular la población de células madre nativas. Por otra parte, el uso de materiales del tipo cementos endodónticos bioactivos (Bioactive Endodontic Cements; BECs) en los REPs es determinante para proporcionar un sellado coronal que separe el tratamiento realizado intraconducto de la reconstrucción coronal (Torabinejad et al. 2018). Estos materiales, presentan el potencial de interactuar con las células madre y los biomateriales utilizados en REPs debido a su capacidad conductiva (Torabinejad y Parirokh 2010, Kontakiotis et et al. 2015). Por todo ello también han sido estudiados en la presente Tesis Doctoral. Así, los estudios realizados han demostrado la bioactividad de los BECs (Jiménez et al. 2018) y la conductividad del tejido duro (Parirokh et al. 2011); sin embargo, hay pocas investigaciones basadas en evidencia sobre la efectividad de las barreras coronales en REPs utilizando estos materiales. El agregado de trióxido mineral (MTA) ha sido el material más popular para el sellado coronal en los procesos de REPs debido a su biocompatibilidad, capacidad de sellado y adaptación marginal; de hecho, más del 85% de los estudios han usado MTA para este propósito (Torabinejab et al. 2018). No hay estudios de resultados a largo plazo de procedimientos REPs en humanos. De los estudios disponibles, la mayoría ha utilizado como se ha comentado anteriormente el MTA como material para el sellado coronal, siendo por ello el material de elección debido a su mayor evidencia científica en comparación con otros materiales BECs (Wigler et al. 2013, Kontakiotis et al. 2015). Los resultados clínicos en REPs podrían mejorar y ser más predecibles si se consigue reconstruir el microambiente favorable para las células que intervienen en el proceso de regeneración. Este objetivo, se conseguirá con protocolos estandarizados y el uso de materiales que estimulen la actividad de las células supervivientes a través de la liberación tanto de factores intrínsecos de la dentina como de la liberación controlada por los biomateriales utilizados en cada caso. 4. Referencias Andreasen JO, Farik B, Munksgaard EC. Long-term calcium hydroxide as a root canal dressing may increase risk of root fracture. Dent Traumatol 2002;18:134-7. 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Las hipótesis de partida: - El biomaterial juega un papel importante en el proceso de regeneración del complejo dentino-pulpar, al reconstruir el nicho favorable para las células progenitoras encargadas de asistir la formación de nuevo tejido. - Los materiales de vidrio bioactivo mesoporoso (MBG) en el sistema composicional SiO2-CaO-P2O5 han mostrado propiedades promotoras de la mineralización a fases de fosfato de calcio. Su alta superficie y volumen de nanoporo les brinda excelentes propiedades para la adsorción de factores, biomoléculas y otros agentes terapéuticos. Por otra parte, el Zinc se ha propuesto como un elemento estimulante de la mineralización, además de presentar propiedades antiinflamatorias así como antibacterianas entre otras. La ruta de síntesis sol-gel permite la incorporación del elemento Zn en su composición para obtener materiales en el sistema SiO2-CaO- P2O5-ZnO. - Los tejidos presentes en el complejo dentino-pulpar son una combinación de estructuras con distinto contenido en biopolímero colágeno y compuestos biocerámicos en forma de fosfatos de calcio. Por tanto, la utilización de biomateriales compuestos de biopolímero-MBG se aproxima en composición a la matriz extracelular natural. - Los resultados clínicos en REPs podrían mejorar y ser más predecibles si se consigue reconstruir el microambiente favorable para las células que intervienen en el proceso de regeneración. Este objetivo, se conseguirá con protocolos estandarizados y el uso de biomateriales que estimulen la actividad de las células supervivientes. Objetivo: Síntesis y caracterización de biomateriales MBG incorporando Zn (MBG-Zn) y su integración en estructuras híbridas colágeno-MBG-Zn y cementos bioactivos MTAMBG-Zn para su aplicación en REPs. El objetivo general de esta investigación es el desarrollo de biomateriales avanzados que estimulen el proceso de regeneración. Para ello, se va a estudiar la síntesis y caracterización de biomateriales MBG incorporando Zn (MBG-Zn) y su integración en estructuras híbridas colágeno-MBG-Zn y cementos bioactivos MTA-MBG-Zn. El trabajo realizado se ha presentado organizado en los siguientes capítulos: Introducción general Revisión del estado actual de los procedimientos REPs, con detalle de los materiales y protocolos existentes, como pautas de tratamiento para dientes inmaduros con necrosis pulpar. Justificación de nuevos tratamientos avanzados mediante la implementación de nuevos biomateriales basados en la utilización de vidrio bioactivo mesoporoso (MBG). Capítulo 1 Síntesis y caracterización físico-química de materiales MBG con la incorporación del ion Zinc, en el sistema composicional SiO2-CaO-P2O5-ZnO. Capítulo 2 Procesado y caracterización físico-química de estructuras híbridas compuestas de colágeno y MBG, así como colágeno y MBG-Zn, con el fin de obtener biomateriales avanzados con propiedades biomiméticas con el tejido del complejo pulpo-dentinario. Capítulo 3 Ensayos in vitro de viabilidad y diferenciación celular de los biomateriales colágeno-MBG y colágeno-MBG-Zn con el fin de evaluar la biocompatibilidad de los materiales con las células madre de la pulpa dental (hDPSCs). Capítulo 4 Desarrollo de una formulación de cemento endodóncico bioactivo (BEC) incorporando MBG-Zn a un cemento comercial, y estudio de sus propiedades físico-químicas, el efecto en el tiempod e fraguado, respuesta bioactiva in vitro, así como ensayos in vitro con el fin de evaluar la biocompatibilida y diferenciación celular de los materiales con hDPSCs. Colilla y Vallet 2009). Al variar la naturaleza química y la concentración de los componentes del MBG, nuevas propiedades biológicas importantes se pueden agregar, siendo así el material adaptado a aplicaciones clínicas específicas (Oudadesse et al 2011). El proceso de biodegradación in vivo de estos materiales basados en sílice se produce principalmente por su disolución al entrar en contacto con los fluidos fisiológicos. Así, el estudio de los productos iónicos de disolución de los MBGs, concentración de las distintas especies iónicas, influencia en el pH y el equilibrio químico para la formación de HA es clave para entender el comportamiento in vitro e in vivo de los MBGs (Gómez et al. 2018; Vallet y Salinas 2018). Como se ha indicado previamente, la bioactividad y la capacidad de los MBGs para estimular la regeneración del tejido a nivel celular se ha relacionado con su cinética de disolución y formación superficial de una capa de HA (Linati et al. 2005; Oudadesse et al 2011). En este sentido, una línea de investigación prometedora es la introducción de elementos químicos adicionales en su composición que puedan liberarse en el proceso de biodegradación del material y aplicarse como iones terapéuticos. Se ha encontrado que la liberación de distintos productos iónicos en un entorno fisiológico puede promover la mineralización de la dentina, mejorar la respuesta biológica de células progenitoras en la dentinogénesis y la angiogénesis, promover la diferenciación celular a odontoblastos, así como proporcionar un efecto antibacteriano (Hoppe et al. 2011; Zhang et al. 2014; Rabiee et al. 2015). El elemento Zinc (Zn) tiene un particular interés en odontología por su actividad bacteriostática o bactericida (Balamurugan et al. 2007; Bini et al. 2009; Pasquet et al. 2014; Sánchez et al. 2014; Atkinson et al. 2015; Riaz et al. 2015; Wajdaa et al. 2019). Se ha demostrado su papel en la estimulación de la proliferación y diferenciación celular (Brandäo-Neto et al. 1995), así como su actuación como cofactor en la activación para enzimas (Tapiero y Tew 2003; Lázaro et al. 2014). Interviene en la síntesis de proteínas y la replicación del ADN y ARN (Coleman 1992; Tang et al. 2001; Maret 2007; Popp et al. 2007; Lázaro et al. 2014; Li et al. 2015; Rabiee et al. 2015). Los estudios han demostrado que el Zn aumenta la mineralización mediante la estimulación de la fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase; ALP), enzima clave para la calcificación ósea y colágeno tipo I en la matriz extracelular. Por otra parte, la deficiencia en Zn ha sido asociada con retraso en el crecimiento esquelético y alteraciones en la calcificación del tejido óseo (Holloway et al. 1996; Kwun et al. 2010). Además, la incorporación de Zn en materiales vítreos puede tener otras propiedades interesantes a considerar como son prolongar su durabilidad química, retrasando su disolución y mejorando las propiedades mecánicas del material (Lusvardi et al. 2002; Karthika et al. 2015). Los estudios de Osorio y cols., entre otros demuestran que el Zn reduce la degradación del colágeno mediada por las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) (Toledano et al. 2016), actúa como vía de señalización produciendo un efecto estimulante en la mineralización de los tejidos duros (Hoppe et al. 2011), estimulando la remineralización de la dentina (Toledano et al. 2013) a la vez que inhibe la desmineralización de la misma (Takatsuka et al. 2005). Otro de los efectos descritos para el Zn, es su capacidad antiinflamatoria, lo cual es esencial para que pueda llevarse a cabo el proceso de regeneración del tejido dañado (Lang et al. 2007). Además, se han relacionado a las partículas de ZnO con efectos antibacterianos, lo cual es bastante interesante para aplicaciones en REPs (Wang et al. 2014; Liu et al. 2015). Sin embargo, también hay que tener en cuenta que un alto número de iones Zn dará lugar a citotoxicidad (Huang et al. 2017) por lo que para mantener las funciones celulares en equilibrio con un efecto antibacteriano, va a ser fundamental identificar tanto las propiedades de biodegradación de los materiales de Zn, así como las proporciones indicadas para su aplicación terapéutica. En la búsqueda de un material avanzado para su aplicación en nuevas terapias REPs, un primer objetivo del presente trabajo de Tesis Doctoral ha sido la incorporación del elemento Zn a un material MBG en el sistema composicional SiO2-CaO-P2O5. En este Capítulo se presenta el estudio de la síntesis de un material MBG y composiciones relacionadas funcionalizadas con distinto contenido en Zn (MBG-Zn). Igualmente, se analiza el efecto de la incorporación de Zn en distintos parámetros físico-químicos del material mesoporoso. 2. Procedimiento experimental 2.1. Síntesis de los materiales de vidrio bioactivo mesoporoso MBG y MBG-Zn La síntesis del sol MBG, en el sistema composicional 80SiO2 - 15CaO - 5P2O5, se realizó según el protocolo descrito por Yan y cols. (Yan et al. 2004). La síntesis consiste en disolver 4 g del polímero director de estructura P-123 Pluronic® (Sigma-Aldrich) en 60 mL de etanol absoluto (AnalaR Normapur) y 1 mL de solución de HCl 0.5 M (Panreac, PA-ACS-ISO 37%) durante 1 hora. Una vez completada la disolución del P123, se procede a la adición de 1.4 g de nitrato de calcio tetrahidratado, Ca(NO3)24H2O (C4955 Sigma-Aldrich), 685 L de trietil fosfato, TEP, (C2H5O)3PO (538725 Sigma-Aldrich) y 7.125 L de tetraetilortosilicato (TEOS, Si(OC2H5)4 (14082 Alfa-Aesar). Los reactivos se añadieron de forman consecutiva con intervalos de 1 h para cada reactivo y se mantuvieron en agitación constante a 500 rpm durante 24 horas a temperatura ambiente. Para las preparaciones MBG-Zn se siguió el mismo procedimiento que para MBG, con la variación de que parte de sal de calcio se sustituyó por diferentes cantidades de nitrato de zinc hexahidratado, Zn (NO3)26H2O (96482 Sigma-Aldrich). Las sales de nitrato de Ca y Zn, se añadieron al mismo tiempo. La Tabla 1.1.1 detalla las composiciones nominales de los materiales sintetizados y la tabla 1.1.2 las cantidades de reactivos añadidos para cada caso. Tabla 1.1.1 Nomenclatura y composición nominal de los materiales MBG y MBG- Zn. Proporción de los reactivos precursores para la síntesis por el método sol-gel. Tabla 1.1.2 Proporción de los reactivos precursores para los materiales MBG y MBG-Zn sintetizados por el método sol-gel. Nomenclatura Composición nominal (mol) MBG 80SiO2:15CaO:5P2O5 MBG-2.5Zn 80SiO2:12.5CaO:5P2O5:2.5ZnO MBG-5Zn 80SiO2:10CaO:5P2O5:5ZnO MBG-7.5Zn 80SiO2:7.5CaO:5P2O5:7.5ZnO Nomenclatura TEOS (mL) TEP (µL) Ca(NO3)2 4H2O (g) Zn (NO3)2 6 H2O (g) MBG 7.125 685 1.400 - MBG-2.5Zn 7.125 685 1.166 0.297 MBG-5Zn 7.125 685 0.933 0.594 MBG-7.5Zn 7.125 685 0.700 0.891 La mezcla (sol) se mantuvo a temperatura ambiente y sometida a un proceso de evaporación inducida por auto-ensamblaje (Evaporation Induced Self Assembly; EISA) para formar un gel durante 72 horas. Posteriormente, los geles se envejecieron a 80 ºC en la estufa durante 24 horas. Finalmente, para eliminar los nitratos de las sales percusores de Ca y Zn y los restos orgánicos de la molécula de surfactante, se realizó un tratamiento térmico a 700 ºC en atmosfera de aire durante 2 h usando una rampa de calentamiento de 1 ºC min-1. Los sólidos obtenidos se molieron ligeramente para homogeneización y se tamizaron por debajo de 32 µm. 2.2. Caracterización físico-química de los materiales Para la caracterización de los materiales se emplearon las siguientes técnicas: Análisis de tamaño de partícula por espectrometría de difracción por rayos láser (Laser Difraction; LD), microscopía electrónica de barrido (Field Emission Gun- Scanning Electron Microscopy; FEG-SEM), análisis de dispersión de energía de rayos X de dispersión de energía (EDX), fluorescencia de rayos X (X-Ray Fluorescence; XRF), difracción de rayos X en condiciones de rutina (Wide Angle X-Ray Diffraction; WAXRD); difracción de rayos X de bajo ángulo ( Small Angle X-ray difraction, SAXRD), fisisorción de N2, análisis termogravimétrico (Thermogravimetric Analysis; TGA), análisis térmico diferencial (Differential Thermal Analysis; DTA), y espectroscopia infrarroja (Fourier-Transform Infrared Spectroscopy; FT-IR). Las técnicas y las condiciones de medida utilizadas se detallan en el Anexo I. 3. Resultados Los materiales obtenidos son sólidos en forma de partículas. El aspecto macroscópico se muestra en la Figura 1.2. Figura. 1.2. Fotografía digital correspondiente a 100 mg de material MBG y MBG-7.5Zn. Columna derecha muestra los materiales antes de ser tamizados y la columna izquierda muestra los materiales tamizados por debajo de 32 µm. Las cantidades de reactivo para las distintas preparaciones indicadas en la Tabla 1.1.2 dan lugar a una masa de material final de 1.7; 1.8; 1.7; y 1.9 g para MBG; MBG-2.5Zn; MBG-5Zn y MBG-7.5Zn respectivamente. El análisis de tamaño de partícula de los materiales realizado por espectrometría de difracción por láser (LS) se presenta en la Figura 1.3. Todos los materiales presentan una distribución ancha con un máximo principal en torno a los 20 µm y otro menos intenso con máximo en el rango entre 4.2-5.3 µm. Se observa que el a) MBG MBG-7.5Zn MBG MBG-7.5Zn aumento en la incorporación de Zn produce un ligero desplazamiento de los valores máximos de tamaño de partícula. Figura. 1.3. Distribución LS del tamaño de partícula de los materiales MBG y MBG-Zn. La Figura 1.4 muestra micrografías FEG-SEM de las partículas de los materiales con tamaños en el rango similar a los obtenidos por LS. Figura 1.4. Imagen FE-SEM de los materiales MBG y MBG-Zn precursores en formato de partículas En la Figura 1.5 se muestran los análisis de EDX en los que se confirma los distintos contenidos en Zn para los distintos materiales funcionalizados. 20µm 20µm MBG MBG-2.5Zn MBG-5Zn MBG-7.5Zn 20µm 20µm La Tabla 1.3 presenta un resumen de los parámetros texturales obtenidos por adsorción de N2, incluyendo los valores de superficie específica, SBET, volumen total de poro y tamaño de poro correspondiente al valor máximo de las distribuciones BJH. Como puede observarse, la incorporación de valores crecientes de Zn da lugar a una disminución de la superficie específica y el volumen total de poro. Tabla 1.3. Parámetros texturales de los materiales MBG y MBG-Zn obtenidos a partir las medidas de fisisorción de N2. Muestra SBETa (m2 g-1) VT porob (cm3 g-1) dp (nm)c MBG 353 0.33 4.3 MBG-2.5Zn 340 0.33 3.9 MBG-5Zn 304 0.27 3.6 MBG-7.5Zn 286 0.25 3.6 a Superficie específica calculada mediante el método BET. b Volumen total de poro estimado a partir de la cantidad adsorbida a la presión relativa de 0.99. c Diámetro de mesoporo obtenido a partir del máximo de las distribuciones BJH de tamaño de poro correspondiente a la isoterma de adsorción. La foto FEG-SEM que se muestra en la Figura 1.9 confirma la microestructura nanoporosa ordenada y los valores de nanoporo de 4 nm para el caso del material MBG. Figura 1.9. Micrografía FEG-SEM de alta resolución del materila MBG mostrando la microsestructura nanoporosa ordenada. El análisis TG y DTA de los materiales estudiados se presenta en la Figura 1.10. En general, se observa una primera pérdida de masa más importante para temperaturas inferiores a 200 ºC y por tanto correspondiente a la pérdida de humedad. Se aprecia que la pérdida de masa es más grande, en torno al 8 % para el caso del material libre de Zn, MBG. En los materiales con contenido en Zn, la perdida de humedad medida a baja temperatura no supera el 4%. MBG 100 nm Las curvas de DTA muestran las reacciones exotérmicas con máximos a 70 ºC y 170ºC correspondientes a la eliminación del agua adsorbida por el material. En todos los casos, se observa una única temperaturas característica de cristalización, Tc, para el rango de temperatura analizado. El máximo varía entre los 933 ºC para el material sin Zn, MBG y 912ºC para el caso del MBG-7.5Zn, lo que sugiere que la temperatura de cristalización depende del contenido en Zinc (Kamitakahara et al. 2006). Figura 1.10. Análisis TG (línea azul) y DTA (línea negra), en atmósfera de aire, para los materiales MBG y MBG-Zn. El análisis de FT-IR de todos los vidrios se presenta la Figura 1.11. En todos los casos el espectro aparece dominado por las bandas características de los enlaces Si- O de la matriz vítrea. Se muestran bandas de adsorción intensas en 1080 y 460 cm-1 que corresponden a la flexión asimétrica de vibración del enlace de Si-O-Si y una banda a 800 cm-1 que se atribuye al estiramiento simétrico del enlace Si-O-Si (Martínez et al. 2000). Se observa un ensanchamiento y ligera disminución de intensidad de las bandas principales a 1080 y 460 cm-1 correspondientes a los enlaces Si-O-Si con el aumento en el contenido en Zn. Figura 1.11. Espectros FT-IR para para los materiales MBG y MBG-Zn. 4. Discusión En este capítulo se ha presentado la síntesis por el método sol-gel y caracterización físico-química de un material mesoporoso ordenado al que se han añadido distintas cantidades del elemento Zinc. Tanto las cantidades como el aspecto macroscópico del material obtenido son muy similares para todos los materiales con o sin Zn, aunque se observa un ligero aumento en el tamaño de partícula con la incorporación de Zinc. En el análisis cuantitativo de la composición química elemental se observa cierta discrepancia entre la composición nominal, calculada a partir de los reactivos precursores de la síntesis, y la composición molar real. Esto ocurre tanto para el material MBG como para los materiales con Zn, en los que los valores bajos de contenido en fósforo (P) indican que la retención del mismo en el material es poco efectiva con el proceso de síntesis utilizado. Se observa que, el aumento en el contenido en Zn produce disminución en la intensidad, aumento de anchura y ligero desplazamiento del pico de bajo ángulo hacia valores 2Theta mayores, lo cual se puede correlacionar con deterioro en el orden de la estructura mesoporosa (Sánchez et al. 2014). Como cabría esperar para un material mesoporoso ordenado, los resultados de fisisorción de N2 para los cuatro materiales presentan isotermas de tipo IV y en todas ellas se puede apreciar la curva de histéresis tipo H1, características de canales de poros cilíndricos con una distribución de diámetro de nanoporo estrecha. Esto nos indica que la incorporación de ZnO hasta un 7.5% no provoca un colapso de la nanoestructura. En cuanto a los parámetros texturales, se observa una tendencia a disminuir de la superficie específica calculada por el método BET (SBET) y el volumen y el diámetro de poro, conforme aumenta la cantidad de Zn incorporada. Esta diminución en los parámetros texturales puede atribuirse a un deterioro del nivel de organización en la polimerización de la red de sílice por la presencia de Zn, que podría estar causando alteraciones debido a la diferencia de valencia y diámetro del átomo de Zn (Ma et al. 2017). El análisis de FT-IR también apunta en esta dirección con el aumento en la anchura de las bandas Si-O-Si. El estudio TG / DTA permite una cuantificación comparativa de la humedad adsorbida en la superficie de los vidrios. Se observa que la estabilidad frente a la adsorción de agua del vidrio mesoporoso aumenta con el aumento del contenido de Zn, obteniéndose una variación en la pérdida de masa desde un 14% para el vidrio MBG sin Zn hasta sólo el 4% para MBG-7.5Zn (Salinas et al. 2011) En cuanto al análisis DTA, los materiales muestran un único pico exotérmico en el rango 900-950 ºC, sin pérdida de masa, que corresponde por tanto a un evento de la cristalización de la muestra (Mak et al. 2000). Los resultados han indicado que esta temperatura de cristalización disminuye con el aumento en el contenido en Zn, como también ha sido indicado previamente por Kamitakahara et al. 2006. Este comportamiento podría explicarse debido a que la incorporación de Zn puede distorsionar la estructura de los enlaces siloxanos Si-O-Si, tal y como se aprecia por el aumento en la anchura de estas bandas en el infrarrojo, lo que podría producir una mayor fluidificación del material con el aumento de temperatura que favorecería la consecución de la organización necesaria para la formación de dominios cristalinos. 5. Conclusiones Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de incorporación del elemento Zn en un material de biovidrio mesoporoso ordenado hasta un porcentaje del 7.5%. Si bien, se observa una disminución de un 4% (entre MBG y MBG-2.5Zn), 14% (entre MBG-MBG7.5Zn) y 19% (entre MBG y MBG-7.5Zn) en la superficie específica con el aumento en la incorporación de Zn, los valores para estos parámetros siguen siendo muy altos en comparación con los vidrios convencionales obtenidos por fundido. Los resultados obtenidos son muy interesantes para el propósito de este trabajo, ya que proporcionan un material vítreo de composición biocompatible y con propiedades texturales avanzadas donde se ha incorporado Zn. Estas propiedades texturales van a proporcionar “a priori” a los materiales una mayor reactividad y la capacidad de incorporar biomoléculas y agentes terapéuticos para asistir a los procesos de regeneración. Tras comprobar que con la adicción de un 7.5% de Zn las propiedades físicoquímicas del material no son alteradas de forma significativa, se decide que ésta composición (MBG-7.5Zn), será la utilizada en el siguiente capítulo para la síntesis de biomateriales colágeno-cerámico. 6. Referencias Aguiar H, Serra J, González P. Los vidrios bioactivos en el mundo de los biomateriales. An Quím 2011;107:237-42. Arcos D; Vallet-Regí M. Sol-Gel Silica-Based Biomaterials and Bone Tissue Regeneration. Acta Biomater 2010;6:2874-88. Atkinson I, Anghel EM, Predoana L, Mocioiu OC, Jecu L, Raut I, Munteanu C, Culita D, Zaharescu M. Influence of ZnO addition on the structural, in vitro behavior and antimicrobial activity of sol–gel derived CaO–P2O5–SiO2 bioactive glasses. Ceram Int 2016;42:3033-45. Balamurugan A, Balossier G, Kannan S, Michel J, Rebelo HS, Ferreira JM. Development and in vitro characterization of sol–gel derived CaO-P2O5-SiO2-ZnO bioglass. Acta Biomater 2007;3:255-62. 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Introducción Las técnicas terapéuticas de regeneración basadas en la ingeniería de tejidos incluyen el uso de biomateriales, a modo de estructuras tridimensionales (3D) que proporcionan el microambiente físico-químico adecuado para las células responsables de la regeneración de los tejidos dañados o enfermos. Estos biomateriales 3D son denominados frecuentemente en la literatura como andamios (traducción del término inglés “scaffolds”), y tanto su composición química como sus propiedades físicas son críticas para la respuesta celular. Varias son las propiedades que deben cumplir estos biomateriales, según distintos autores (Liu and Bhatia 2004; Hollister 2005; Prescott et al. 2008; O´Brien 2011; Gathani y Raghavendra 2016; Matoug-Elwerfelli et al. 2018): a) Biocompatibilidad. b) Permitir la adhesión celular, así como promover su proliferación, transporte y diferenciación. c) Ser biodegradable, para poder ser sustituido por el nuevo tejido formado sin necesidad de extracción quirúrgica. d) La estructura debe ser altamente porosa, de poros abiertos e interconectados, de forma que permita la vascularización y la distribución uniforme de células para facilitar la formación de tejido homogéneo. e) Permitir el transporte efectivo de nutrientes, oxígeno y los productos de desecho. f) Tener la resistencia física y mecánica adecuada para su función en el lugar de implantación. g) Desde el punto de vista de su producción para la aplicación clínica deben ser biomateriales que se puedan obtener de forma reproducible y rentable. Hasta el momento, como se ha expuesto en la introducción, no existen pautas de tratamiento aplicables en clínica que promuevan la regeneración del complejo dentino-pulpar de forma predecible (Diógenes et al. 2016; Altaii et al. 2017). Según los últimos avances en ingeniería de tejidos, la verdadera innovación en el desarrollo de nuevas terapias de endodoncia regenerativa aplicables en clínica involucran el uso de materiales que faciliten la regeneración de la pulpa dental a partir de cualquier resto de tejido vital, apoyando así la capacidad innata de auto reparación de dicho tejido (Colombo et al. 2014). Es por ello, que gracias a la amplia gama de biomateriales, nos debemos preguntar hasta qué punto podemos optimizar nuestras estrategias para la regeneración del complejo de dentina y pulpa con la ayuda de los mismos, los cuales son versátiles, permitiendo su ajuste para cada enfoque terapéutico específico (Rambhia y Ma 2015). 1.1. Biomateriales utilizados en REPs Según los protocolos de actuación aceptados por la AAE y la Sociedad Europea de Endodoncia (European Society of Edodontology; ESE) (Galler et al. 2016; Staffoli et al. 2019), ante casos candidatos a REPs, está estandarizado el uso del coágulo sanguíneo, plasma rico en plaquetas (Platelet Rich Plasma, PRP) (Torabinejad y Turman 2011; Jadhav et al. 2012; Gomes et al. 2013; Jadhav et al. 2013; Lata et al. 2015; Sachdeva et al. 2015), fibrina rica en plaquetas (Platelet Rich Fibrin, PRF) (Nagaveni et al. 2016; Meza et al. 2019) o una matriz de fibrina autóloga (Autologous Fibrin Matrix, AFM), por parte de la AAE, mientras que la ESE sólo recoge en su manuscrito el uso del coágulo sanguíneo para tratamientos REPs (Galler et al. 2016). En multitud de casos clínicos, ha sido comprobado, que estas opciones de tratamiento proporcionan capacidad de desarrollo y engrosamiento de las paredes radiculares, así como resolución de signos y síntomas de patología periapical (Banchs y Trope 2004; Hargreaves et al. 2008; Shah et al. 2008; Nosrat et al. 2011; Chen et al. 2013; El Ashiry et al. 2016; Altaii et al. 2017; Ulusoy et al. 2019), refiriendo tasas de supervivencia del 100% (Jeeruphan et al. 2012). Sin embargo, los estudios histológicos en animales tras tratamiento de revascularización, no afirman que se forme un nuevo tejido dentino-pulpar que reproduzca la arquitectura y la funcionalidad del tejido original (Wang et al. 2010; Shimizu et al. 2013). Lo que realmente se forma es un tejido compuesto de cemento y hueso que puede interpretarse por radiografía como continuación de formación radicular, pero el verdadero objetivo de regeneración funcional del complejo dentino-pulpar puede no lograrse, no encontrándose diferencia en los resultados tras tratamientos realizados con coágulo de sangre, PRP, PRF o AFM (Torabinejad y Turman 2011; Jadhav et al. 2012; Martin et al. 2013; Zhu et al. 2013; Bezgin et al. 2014; Narang et al. 2015; Sachdeva et al. 2015; Galler 2018). Se ha argumentado que las limitaciones de la aplicación de los anteriores biomateriales se derivan principalmente de una composición indefinida, presencia de células inmunes o biodegradación desconocida, entre otros. Esto es, los citados biomateriales carecen de control temporal y espacial específico sobre la señalización biológica necesaria para la localización y diferenciación de las células progenitoras. Además, la comprensión de los resultados logrados con la aplicación de estos biomateriales son bastante escasas (Schmalz y Smith, 2014). Es por ello, que la falta de evidencia científica impida el uso extensivo de un protocolo de tratamiento predecible en el entorno clínico (Alagl et al. 2017). En consecuencia, las últimas investigaciones en odontología regenerativa están siendo dirigidas a la fabricación de biomateriales que solventen las carencias de los ya aplicados en clínica. Según Palma y cols. (Palma et al. 2017), hasta ahora, sólo esponjas de colágeno reticuladas insolubles se han asociado con mejores resultados en la formación de nuevo tejido (Yamahuchi et al. 2011). Recientemente, Galler y cols. (Galler et al. 2018) han comparado hidrogeles de distintos tipos de biomateriales, naturales versus sintéticos, con o sin modificaciones funcionales, aplicados in vitro e in vivo para ingeniería de tejidos de pulpa dental. Los biomateriales naturales consistían en colágeno o fibrina y se compararon con dos grupos de biomateriales sintéticos basados en polietilenglicol (Polyethylene Glicol; PEG) y péptidos autoensamblados (Self-Assembling Peptide; SAP). El uso de materiales naturales como el colágeno en formato hidrogel, condujo a una mayor viabilidad de las células madre de la pulpa dental y la formación de tejido similar a la pulpa en comparación con todos los materiales sintéticos. Por otra parte, los avances más recientes están siendo centrados en la posibilidad de biomateriales compuestos en los que se incorporan una fase inorgánica en una matriz polimérica, ya sea sintética o natural (Pérez et al. 2013) con el objetivo de mejorar las propiedades del biomaterial (Baino et al. 2017). En general, cabe esperar que el empleo de biomateriales compuestos (híbridos polímero-cerámico), presenten un equilibrio entre las ventajas y desventajas de sus componentes individuales y proporcionen por tanto propiedades mejoradas (Liu y Bhatia 2004). En este sentido, los tejidos presentes en el complejo dentino-pulpar son una combinación de estructuras con distinto contenido en biopolímero (colágeno) y compuestos biocerámicos en forma de fosfatos de calcio. Por tanto, la utilización de biomateriales compuestos de biopolímero-cerámico parece la más indicada para una aproximación biomimética con la matriz extracelular natural de los tejidos del complejo dentino-pulpar. La síntesis de biomateriales compuestos de biopolímero-cerámico está más extendida para el caso de aplicaciones en regeneración ósea. Concretamente, son numerosos los estudios recientes que desarrollan biomateriales que incluyen la integración de cerámicas bioactivas para facilitar los procesos de regeneración. Particularmente, si nos centramos en estudios con versiones avanzadas de vidrio bioactivo, como los vidrios bioactivos mesoporosos (MBGs), encontramos la combinación de MBG con PLGA (Li et al. 2009; Wu et al. 2009), alginato (Wu et al. 2010; Yun et al. 2011; Luo et al. 2013), seda (Wu et al. 2011; Chandrasekaran et al. 2016), quitosano (Jia et al. 2011; Zhu et al. 2019) o colágeno (Montalbano et al. 2018), entre otros. Estos estudios encuentran que al añadir el material MBG al polímero, la bioactividad in vitro en SBF mejora, así como la versatilidad para incorporar medicamentos o factores funcionales que pueden ser liberados en el lugar de implantación. Entre estos estudios, cabe destacar el estudio de El-Fiqui y cols. (El-Fiqui et al. 2013). Estos autores producen mezclas de una determinada cantidad de MBG que han funcionalizado con grupos aminas en su superficie (para permitir enlaces con grupos aminas del colágeno) con hidrogel de colágeno. Al comparar dicho material compuesto con el colágeno sin cerámico, encuentran que la incorporación de MBG a la matriz de colágeno mejora la estabilidad mecánica, reduce la degradación hidrolítica y enzimática, aumenta la rigidez y previene la contracción al contactar con las células. Además, en los ensayos in vitro con MSCs de ratas encuentran que el biomaterial con MBG aumenta la viabilidad celular y la extensión del citoesqueleto al ser visualizado con microscopía confocal de fluorescencia. Concluyen así que, los hidrogeles compuestos de colágeno y MBG, presentan una gran promesa para desarrollar biomateriales aplicables a la ingeniería de tejidos duros. Sin embargo, hasta el momento, los estudios de este tipo de biomateriales compuestos para explorar su utilización en la regeneración del complejo dentinopulpar son escasos. Moonsei y cols. (Moonsei et al. 2019) fabrican estructuras tridimensionales a base de gelatina con contenido en un 10-20% de vidrio bioactivo funcionalizado con boro. Las estructuras se prepararon mediante métodos de liofilización / prensado de moldes metálicos y observaron que la bioactividad in vitro en SBF mejoró con la adicción del vidrio bioactivo modificado con boro, así como la viabilidad celular, actividad de la fosfatasa alcalina y capacidad de mineralización de hDPSCs, siendo necesario futuros estudios in vivo. Por lo anterior, así como por la escasa literatura al respecto, este trabajo de Tesis pretende el desarrollo de un biomaterial avanzado para REPs, que aporte nuevas propiedades para estimular el proceso de regeneración del complejo dentinopulpar. La aproximación es mediante el diseño y procesado de un biomaterial con características, composición, estructura y formato biomimético con el tejido dentino-pulpar. Para ello se van a ensayar varias composiciones basadas en una matriz porosa de biopolímero (colágeno de tipo I) a la que se va a integrar MBG en forma de micropartículas. Se van a estudiar distintas variables como la proporción de los componentes colágeno/MBG y la modificación de la composición del material MBG, el cual va a ser funcionalizado con un elemento con propiedades terapéuticas, como es el Zinc (Zn). Se han diseñado composiciones que incluyen un contenido de MBG en el rango entre el 5 y el 15 % en peso, que permitan obtener estructuras finales con una consistencia más bien elástica (blanda, “soft”), para que puedan ser introducidas adecuadamente en el restringido espacio de trabajo que ofrece el canal radicular. 2. Procedimiento experimental 2.1. Procesado de biomateriales compuestos colágeno-MBG (C-MBG) y colágeno-MBG-Zn (C-MBG-Zn). El procesado de los distintos biomateriales requiere la realización de varias etapas. En una primera etapa se sintetiza el material biocerámico MBG y MBG modificado con Zn, MBG-Zn. El procedimiento de síntesis de las distintas composiciones MBG se ha detallado en el capítulo 1. Para las preparaciones de este capítulo se van a utilizar los materiales MBG y MBG-7.5Zn. Se decidió la elección del material MBG-7.5Zn frente al MBG-2.5Zn y MBG-5Zn también sintetizados en el capítulo anterior, porque se comprobó que a su más alto contenido en Zn se C C-5MBG C-5MBG-Zn 100 µm C-15MBG 100 µm 100 µm C-15MBG-Zn 100 µm 100 µm Figura 2.3. Micrografías FEG-SEM de los biomateriales estudiados C-MBG y C-MBG-Zn. Las flechas indican la distribución de las micropartículas del material cerámico MBG. Las micrografías muestran una microestructura donde destaca un entramado fibrilar y con estructura porosa formada por el material de colágeno. Distribuidas en el entramado de colágeno se distinguen las micropartículas (señaladas en la micrografías con flechas) de MBG y MBG-Zn para los biomateriales compuestos. Estas micropartículas, se aprecian más claramente para los materiales con más contenido en cerámico C-15MBG y C-15MBG-Zn. Las partículas presentan una distribución homogénea, con un tamaño entre 2-20 µm en buen acuerdo con los tamaños de partículas medidos por LD (ver Figura 1.3. capítulo 1). Los histogramas de la distribución de tamaño de poro obtenidos por porosimetría de Hg se presentan en las Figura 2.3. Figura 2.3. Distribución de tamaño de poro obtenidos por porosimetría de mercurio para los biomateriales estudiados. Todas las gráficas muestran la existencia de dos poblaciones de poro. Una correspondiente a poros macro entre 1 y 1000 µm, y otra de nanoporos entre 5 y 10 nm. Los resultados de la distribución de macroporos son consistentes con el tamaño de las cavidades observadas por FEG-SEM (Figura 2.2). Como cabría esperar, se observa un incremento significativo en el volumen correspondiente a poros en el rango nanométrico para los materiales con contenido en cerámico nanoporoso MBG y MBG-Zn. Los resultados de capacidad de absorción de medio líquido por los biomateriales para distintos tiempos de ensayo, expresada en porcentaje se muestran en la Figura 2.4. Figura 2.4. Capacidad de absorción de medio de cultivo por parte de los materiales C; C-5 MBG; C-15MBG; C- 5MBG-Zn y C-15MBG-Zn a los tiempos 0; 0.5; 1; 2; 4; 10; 24; 72; 120 y 168 h. Como puede observarse, la capacidad de absorción de líquido de los biomateriales está entre 200 y 350 %. Prácticamente esta capacidad de absorción se produce en su totalidad en los 30 primeros minutos del tratamiento, aunque puede darse un incremento de hasta otro 100% hasta las 24 h. A partir de este tiempo no se observa ningún aumento, más bien una disminución que puede estar producida por la disminución de masa debida al comienzo de degradación del biomaterial. Se obtiene que el material constituido únicamente por colágeno es el que presenta mayor capacidad de absorción llegando hasta el 350 %. Así, la incorporación de MBG reduce la cantidad de masa de liquido retenida, especialmente para los biomateriales con contenido en MBG-Zn. Entre las composiciones ensayadas, destaca el comportamiento del biomaterial C-15MBG-Zn, con alto contenido en MBG-Zn, que presenta la absorción de liquido más baja y menos fluctuante durante todo el tiempo de tratamiento. La Figura 2.5 muestra la biodegradación del biomaterial en medio de cultivo celular en los tiempos 0.5; 1; 2; 4; 10; 24; 72; 120 y 168 h. Figura 2.4. Biodegradación en medio de cultivo de los materiales C; C-5MBG; C-15MBG; C-5MBG-Zn y C- 15MBG-Zn a los tiempos 0; 0.5; 1; 2; 4; 10; 24; 72; 120 y 168 h. Todos los biomateriales presentan un máximo de biodegradación con una pérdida de masa entre el 40 y 60 % a las 24 h de tratamiento. El material de colágeno alcanza el máximo, un 50 %, con más tiempo de tratamiento, 72 h. Todos los materiales presentan un patrón de degradación similar, presentando en torno a un 20% de pérdida en la primera media hora. Dicha pérdida se estabiliza hasta las 24 o 72 h, momento en el que aumenta para volver a estabilizarse hasta el final del periodo de tiempo ensayado, 168 h. Los materiales compuestos con mayor contenido en MBG son los que presentan mayor estabilidad frente a la degradación, manteniéndose en el límite más bajo, en torno al 40 % de pérdida de masa. 4. Discusión El colágeno bovino de tipo I es quizás el material biológico más utilizado para aplicaciones terapéuticas debido a sus numerosas y exitosas aplicaciones en biomedicina (Gómez et al. 2011). Sin embargo, la rápida biodegradación a menudo requiere la estabilización de este biomaterial (Montalbano 2018). Ha sido demostrado que la combinación de colágeno y MBG presenta excelente biocompatibilidad y propiedades biomecánicas (El-Fiki et al. 2013) en estudios para regeneración de tejidos duros. En este trabajo, la fabricación de las piezas de biomaterial se ha realizado utilizando un proceso de liofilización. Este procedimiento consigue separar el agua (u otro solvente) de una mezcla de biopolímero en agua mediante la previa congelación de la mezcla y posterior sublimación del agua en forma sólida, utilizando un tratamiento a vacío. Mediante este método, se consigue el mantenimiento de la estructura expandida del biopolímero en solución, sin que se produzca, por el secado, el colapso o plegamiento de las fibras poliméricas para formar una película densa (Sachlos y Czernuszka 2003). Así, los resultados de cuantificación por porosimetria de Hg muestran la generación de biomateriales porosos con un entramado fundamental de cavidades entre las 10 y las 1000 micras, y por tanto adecuado para facilitar la migración celular. Según la bibliografía, los tamaños de poro más óptimos para la osteoconducción se encuentran entre 100 y 350 µm (Yang et al. 2001), no encontrándose una referencia concreta para los tejidos dentarios (El-Backly et al. 2008). Como parte del procedimiento de procesado para estabilizar y mejorar las propiedades mecánicas de las piezas (Mehta et al. 2015) se ha utilizado un entrecruzamiento físico mediante tratamiento hidrotermal a vacío (Haugh et al. 2009). Esto supone una ventaja frente a otros procesos que se emplean habitualmente para este tipo de preparaciones (Fathima et al. 2004) y que conllevan la utilización de agentes químicos con distintos grado de toxicidad asociada como el glutaraldehído, la carbodiimida, formaldehído, genipina y otros (Sung et al. 2003; Angele et al. 2004) La porosidad, el tamaño de los poros y la estructura interna juegan un papel importante en el diseño de biomateriales en la ingeniería de tejidos blandos, ya que estos factores pueden influir directamente en la absorción de agua, propiedades mecánicas y penetración celular (Yang 2017). Las observaciones FEG-SEM, y la cuantificación de la nanoporosidad de los biomateriales indican que la incorporación del material MBG y MBG-Zn en sus diferentes proporciones del 5 y el 15% no modifican sustancialmente la interconexión y estructura fibrilar de la matriz polimérica de los biomateriales. Todas las composiciones exhiben una red Jadhav GR, Shah N, Logani A. 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Understanding the interfacial interactions of bioinspired chitosan-calcite nanocomposites by first principles molecular dynamics simulations and experimental FT-IR spectroscopy. CarbohydrPolym 2019;223:1150. Capítulo 3 Evaluación in vitro de los biomateriales C-MBG y C- MBG-Zn utilizando células madre de pulpa dental (hDPSCs) 1. Introducción Como se ha indicado en la Introducción General (Figura I.3.), la práctica actual en ingeniería de tejidos implica la combinación de células y/o moléculas de señalización con biomateriales (Chen et al. 2010; Volponi et al. 2010; Egusa et al. 2012; Zhai et al. 2019). Según esta aproximación, la implementación de las distintas terapias de ingeniería de tejidos va a requerir la disponibilidad estandarizada y segura de células con capacidad de auto renovación y diferenciación en los múltiples tipos celulares. Es reconocido en la bibliografía que las células madre mesenquimales (Mesenchymal Stem Cells; MSC) representan una gran promesa para la medicina regenerativa, debido a su capacidad para diferenciarse en tejidos específicos (Prescott et al. 2008). Entre otros factores, los tipos celulares utilizados van a condicionar el éxito del tratamiento regenerativo (Langer y Vacanti 1993; Bakhtiar et al. 2018). En la región maxilar de los humanos, se han descrito al menos 5 fuentes de células madre mesenquimales postnatales con capacidad de diferenciación a células similares a odontoblastos, entre las que se encuentran: células madre de la pulpa dental (human Dental Pulp Stem Cells; hDPSCs), células madre de los dientes deciduos exfoliados (Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth, SHEDs), células madre de la papila apical (Stem Cells of the developing root Apical Papilla, SCAPs), células progenitoras de los folículos dentales (Dental Follicle Stem Cells, DFSCs) y células madre del ligamento periodontal (PerioDontal Ligament Stem Cells, PDLSCs) (Egusa et al. 2012). Entre ellas, las hDPSCs son las más fáciles de obtener; presentando una mayor capacidad de diferenciación a odontoblasto (Nuti et al. 2016). Estas células madre de la pulpa, identificadas por primera vez por Gronthos (Gronthos et al. 2000; Gronthos et al. 2002), se encuentran tanto en la corona como en la raíz del diente y son células multipotentes que pueden proliferar extensamente (Miura et al. 2003). Se ha visto que tienen propiedades inmunosupresoras y presentan la capacidad de diferenciarse in vitro en odontoblastos, osteoblastos, adipocitos, células neuronales, cardiomiocitos, miocitos y condrocitos (Volponi et al. 2010; Rodríguez et al. 2011; Egusa et al. 2012). Además, presentan la capacidad de ser criopreservadas de forma segura. Estas células poseen capacidad de auto-renovación (Barry 2003), diferenciación multilinaje y eficiencia clonogénica, además de demostrarse que, pueden regenerar ectópicamente un complejo parecido a la pulpa con una disposición similar a la de la dentina natural (Bakhtiar et al. 2018). Por tanto, las células madre postnatales de la pulpa dental pueden diferenciarse en odontoblastos y generar dentina reparadora en el proceso de regeneración de la pulpa (Huang et al. 2010). Además, exhiben múltiples potenciales en la osteogénesis, neurogénesis, angiogénesis e incluso en la regeneración de las glándulas endocrinas (Chen et al. 2019). Algunos estudios han demostrado que las hDPSCs representan una promesa considerable para la ingeniería de tejidos dentales debido a su capacidad para diferenciarse en odontoblastos funcionales in vitro y para formar estructuras complejas de dentina-pulpa in vivo cuando se trasplantan junto con biomateriales (Zhang et al. 2006; Atalayin et al. 2016; Chamieh et al. 2016; Yu et al. 2019). Hay estudios que muestran resultados histológicos satisfactorios tras el uso de hDPSCs (Iohara et al. 2011; Ishizaka et al. 2012; Iohara et al. 2013; Chen et al. 2015) en REPs. Por todo lo anterior, desde su descubrimiento, las hDPSCs se han investigado exhaustivamente con respecto a su potencial como fuentes celulares óptimas para la regeneración de la pulpa, ya que son distintivamente ventajosas para la aplicación clínica debido a su origen en el tejido pulpar, su fácil aislamiento, y el mantenimiento de su capacidad de regeneración después de la crioconservación (Kim et al. 2015; Sui et al. 2019), proporcionado una posibilidad clínica realista en la regeneración de la pulpa (Prescott et al. 2008; Yu et al. 2019). Por otra parte, en los últimos años se han conseguido avances en la formación de tejido con características específicas de pulpa tras la combinación de células hDPSCs con diferentes biomateriales. Los nuevos tejidos formados presentan nueva vascularización, células similares a odontoblastos, deposición de calcio, fibrillas de colágeno y formación de tejido similar a la dentina (Ohara et al. 2010; Ravindran et al. 2014; Hayashi et al. 2015; Iohara et al. 2016). El ensayo de actividad de fosfatasa alcalina intracelular (Alkaline Phosphatase, ALP) es usado para evaluar el desarrollo de fenotipo odontoblástico durante la inducción de la diferenciación de las MSCs. Para realizar este ensayo las células fueron sembradas directamente sobre la superficie de los biomateriales, no haciendo uso por tanto del medio condicionado utilizado en los ensayos anteriores. Las células fueron sembradas en una placa de 12 sobre los biomateriales a una densidad de 1 x 105 en 25 µL de medio y se mantuvo a 37 ºC durante 30 min para asegurar la adhesión celular a la superficie del material. Pasados los 30 min se añadieron 750 µL de medio α-MEM suplementado con 10% FBS, 1% L-glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina a cada pocillo. Los resultados de actividad ALP fueron recogidos a los 3, 7 y 14 días. El medio celular fue cambiado cada dos días. El experimento fue realizado por triplicado. En cada uno de los tiempos a estudiar del experimento, el medio fue retirado y las estructuras de material fueron lavadas dos veces con PBS, para luego lisar las células utilizando 600 mL de tampón de lisis (0,2% Triton X-100), durante un período de incubación de 15 minutos a 37 ºC. Las células lisadas fueron recogidas en un eppendorf, el cual fue agitado y centrifugado a 4 ºC durante 10 min. El sobrenadante de cada muestra se recogió en un nuevo eppendorf estéril y fue almacenado a -20 ºC. Para llevar a cabo la cuantificación de ALP se utilizó el kit de detección de dietanolamina (Sigma- Aldrich, Reino Unido), siguiendo las instrucciones del fabricante, para lo cual las muestras fueron descongeladas a 37ºC y se utilizó una solución de pNPP 0.67M que se preparó con agua Milli-Q (Merck, UK) y fue protegida de la luz. También se utilizó el ALP buffer proporcionado por el fabricante (1M diethalnolamine y 0.5M cloruro de magnesio a 9.8 pH), siendo el resultado final en cada pocillo de 90 µL de ALP buffer, 5 µL de pNPP 0.67M y 5 µL de muestra y fue incubada durante 15 min a 37 ºC. A continuación se registraron lecturas cinéticas durante 20 ciclos midiendo la densidad óptica a 405 nm en cada punto utilizando el lector de placas (Tecan GENios, MTX Lab Systems, US). El software Magellan fue utilizado para determinar el índice lineal máximo (ΔAbsorbancia405nm/minuto). Los cálculos fueron realizados con la siguiente fórmula: (ΔA405nm/ min Test-ΔA405nm/ min Blanco) (df) (Vf) (18.5) (VE) df : Factor de dolución Vf : Volumen (en mililitros de ensayo) 18.5 : coeficiente milimolar de extinción de pNPP a 405 nm VE : volumen (en mililitros) de la enzima utilizada Los valores obtenidos fueron normalizados con el contenido total de proteínas de las muestras que fue determinado utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.). Se preparó un estándar de concentraciones conocidas de albúmina diluidas de entre 20-2000 µg mL-1. A continuación se preparó un reactivo de trabajo mezclando 50 partes del reactivo A con 1 parte del reactivo B proporcionados por el kit. Tanto las muestras como el estándar de diluciones de albúmina fueron registrados por cuadriplicado. El contenido de cada pocillo en una placa de 96 era de 200 µL del reactivo de trabajo preparado y 25 µL de muestra. La placa fue agitada durante 30 segundos y se incubó a 37 ºC durante 30 min para favorecer la reacción. Finalmente, la densidad óptica fue medida a 562 nm utilizando el lector de placas (Tecan GENios, MTX Lab Systems, US). Se realizó una ecuación lineal con los valores del estándar de las distintas concentraciones de albúmina que permitió la determinación de la concentración de proteínas para las muestras. Finalmente, la actividad de ALP determinada anteriormente, se normalizó al contenido total de proteínas, por lo que los resultados fueron expresados como ŋmol PNPP / min / mg de proteína. 2.2.4. Inmunofluorescencia y microscopía fluorescente. Para observar los microfilamentos de actina del citoesqueleto, las hDPSC se fijaron con paraformaldehído al 4% (30 minutos) y se permeabilizaron durante 20 minutos. Se aplicó una solución de BSA al 5% a las muestras para bloquear sitios de unión no específicos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Microfilamentos de actina se tiñeron con Texas Red-X Phallodin (Thermo Fisher Scientific) durante 2 horas a temperatura ambiente en una habitación sin luz. La tinción de los núcleos se visualizó usando 0,5 \ mu M 4 ', 6 - diamidino - 2 - fenilindol (DAPI) durante 20 minutos a temperatura ambiente. La tinción fue realizada tras 72 h de cultivo de 5 x 104 células/100 µL sobre los distintos biomateriales. Las muestras tratadas para inmunocitoquímica se visualizaron con un microscopio fluorescente SP8 (Leyca) con una lente objetivo de agua 40x. Las imágenes fueron analizadas con el software LAS X Life Science 3.5.2.18963. 2.3. Análisis estadístico Datos de viabilidad MTT, tinción rojo de alizarina y actividad de ALP de los diferentes biomateriales en diferentes puntos de tiempo fueron analizados por un análisis de varianza de una vías (ANOVA) seguida por la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Los experimentos se realizaron por triplicado y fueron repetidos tres veces. El nivel de significación estadística se estableció en p<0.05. Los gráficos se realizaron usando software OriginPro 8. 3. Resultados Los perfiles de concentración de los iones analizados en los medios condicionados en función del tiempo de tratamiento (24 h, 72 h y 168 h), fueron determinados por ICP-AES y se muestran en la Figura 3.1. Figura 3.1. Perfiles de concentración de los iones Si, Ca, P y Zn liberados al medio de cultivo condicionado en función del tiempo de tratamiento 24 h, 72 h y 168 h, determinado por ICP-AES. Como cabría esperar, los análisis realizados para el biomaterial control de colágeno C, muestran unos valores muy similares a los medidos para el medio de cultivo sin tratamiento. La mayor liberación de iones de Si se produce para los biomateriales C-15MBG y C-15MBG-Zn, ya que son los que contienen mayor cantidad de material vítreo, yendo ésta en aumento con el tiempo de tratamiento. El Zn sólo es detectado para aquellos biomateriales que lo incorporan en su composición. Por otra parte, la concentración liberada tanto de Ca como de P disminuye para los biomateriales que incorporan MBG, mientras que los biomateriales con contenido en Zn, hacen que los niveles de Ca y P se mantengan. Esto es, los biomateriales que presentan MBG adsorben estos iones en superficie mientras que esto no ocurre en los biomateriales con Zn. La Figura 3.2 muestra el pH medido en el medio de cultivo tras la incubación de los distintos biomateriales a los tiempos 0.5, 1, 2, 4, 10, 24, 72, 120 y 168 horas. Figura 3.2. pH de los distintos medios condicionados en diferentes tiempos. Se observa que todos los biomateriales producen un aumento del pH respecto al medio sin condicionamiento (medio control; pH = 8.0) que puede elevarse hasta un valor de 8.6. Los valores de pH medidos para las muestras condicionadas con biomateriales oscilan entre 8.3 y 8.6. Para estudiar la influencia de los productos iónicos liberados por los distintos biomateriales, en la Figura 3.3 se representa la viabilidad de las células hDPSC tras la exposición de las mismas durante 24 h a los distintos medios condicionados (24 h, 72 h y 168 h). Figura 3.3. Viabilidad celular de hDPSCs tras exposición en cultivo durante 24 h a los medios condicionados para distintos tiempos, MC-24, MC-72 y MC-168. Se representa el porcentaje de células cuantificadas respecto al grupo de control (células expuestas a medio de cultivo sin condicionar), junto con el análisis estadístico de ANOVA de dos vías (post-hoc Turkey), * p <0.05 y ** p <0.001. Los resultados anteriores muestran el porcentaje de viabilidad celular relativo al que muestran las células expuestas al medio sin condicionar (que se considera el 100%). Las células fueron cultivadas durante 24 h con los medios condicionados MC-24, MC-72 y MC-168 para los distintos tiempos de 24, 72 y 168 horas, respectivamente. Para los ensayos realizados con los medios condicionados con el tratamiento más corto de 24 h la viabilidad de las células disminuye algo respecto al grupo de control, observándose que la disminución es más importante, hasta un 20 %, para el caso de los medios acondicionados con los biomateriales con mayor contenido en MBG. Se observa además que la funcionalización con Zn tiene un efecto adicional aumentando este efecto respecto al biomaterial con MBG libre de Zn. Es interesante que para el caso de las células cultivadas con los medios condicionados 72 h, la viabilidad relativa entre los diferentes grupos se invierte, observándose un efecto positivo para los medios condicionados con biomateriales compuestos con MBG y MBG-Zn respecto al biomaterial de colágeno como único componente. Esta tendencia se confirma para los ensayos de cultivo con los medios condicionados 168 h, en los que la viabilidad celular es mayor para los medios de los materiales con contenido en MBG, particularmente los de alto contenido del 15%. Además para este ensayo se observa que los medios con biomateriales compuestos de MBG promueven mayor viabilidad y que el efecto es mayor para el caso del material con alto contenido en MBG funcionalizado con Zn, C-15MBG- Zn. Los medios condicionados durante 168 h por los biomateriales C-5MBG y C- 5MBG-Zn presentan tasas de viabilidad celular similares. En la Figura 3.4 se muestran los resultados para la formación de nódulos de mineralización por las células tras ser expuestas a los distintos medios condicionados durante 10 días.