Papel de la proteína de supervivencia de la motoneurona (SMN) en la maduración sináptica

FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA Papel de la Proteína de Supervivencia de la Motoneurona (SMN) en la Maduración Sináptica TESIS DOCTORAL JULIO FRANCO ESPÍN SEVILLA, 2021 DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE SEVILLA Avda. Sánchez Pizjuán, 4. 41009 Sevilla Dña. Lucía Tabares Domínguez, Catedrática de Fisiología del Departamento de Fisiología Médica y Biofísica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla. CERTIFICA: Que D. Julio Franco Espín ha realizado bajo su dirección el trabajo titulado “PAPEL DE LA PROTEÍNA DE SUPERVIVENCIA DE LA MOTOREURONA (SMN) EN LA MADURACIÓN SINÁPTICA”, que presenta para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Fdo. Lucía Tabares Domínguez Sevilla a 5 de mayo de 2021 El presente trabajo ha sido financiado por las siguientes entidades públicas y privadas: Ministerio de Economía y Competitividad. Proyecto BFU2013-43763-P Ministerio de Economía y Competitividad. Proyecto BFU2016-78934-P Ministerio de Economía y Competitividad. Proyecto PID2019-110272-R Fundación Tatiana Pérez de Guzmán El Bueno SMA-Europe Asociación El Camino de Elena Cuando empecé mi TFG sobre la AME, ni se me pasaba por la cabeza poder disfrutar de los entresijos de la labor científica ni acabar realizando una tesis doctoral sobre el tema. Sin embargo, como dicen algunos: “la cencia no se ace sola, ahí que acerla”. Y así hice. Tras casi cinco años, a pesar de las dificultades, de la falta de financiación, de largas jornadas pegado al microscopio o de experimentos que no salían he podido publicar esta tesis que, espero, disfruten los lectores. Y esto ha sido posible por la colaboración y apoyo de muchos que, en mayor o menor medida, directa o indirectamente, han contribuido a que este trabajo saliese adelante y a los que estaré eternamente agradecido. En primer lugar, gracias Lucía, mi directora Por confiar en mí y darme la oportunidad de formar parte de tu grupo. Por el apoyo que me has brindado estos años. Por haberme formado en la ciencia, no solo técnicamente, sino en valores como la honestidad, la constancia y la perseverancia. Por la confianza y el apoyo cuando las cosas no salían. De nuevo, gracias. A mi grupo, por el apoyo y los buenos momentos que hemos compartido estos años, gracias. A Rocío y Mario, por enseñarme todo lo que sé. Sin vosotros, esta tesis no podría haber sido posible. A Saravanan, por esas tostadas matutinas y esos cafés a media tarde. Y por toda la ayuda brindada tanto a mí como a mis compañeros. También a Ana, Albert y Andrea. Y, como no, a Mara, nuestra técnico, por enseñarme sobre la PCR y sobre la vida. Debo agradecer también al Prof. Michael Sendtner por haberme dado la oportunidad de formarme en la técnica FiSH en su laboratorio, así como por sus críticas constructivas al presente trabajo. A Mehri y Chunchu, por arroparme en Wurzburg y enseñarme las bases de los cultivos de motoneuronas y de la hibridación in situ. Os deseo lo mejor y os estaré siempre agradecido. Agradecer también a los profesores Armengol, por su ayuda y formación en microscopía electrónica y su colaboración en el estudio de los ribosomas, y Calderó, por la colaboración en los estudios en TA y la revisión crítica del trabajo. Tengo que agradecer también a la empresa Izasa, por cedernos el STEDYCON para los experimentos de superresolución, y a las asociaciones de pacientes y familiares. En especial, a la Asociación El Camino de Elena, no solo por la financión recibida, sino fundamentalmente por el apoyo necesario que brindan a las familias. También querría agradecer a mis compañeros del departamento, por hacer el día a día mas llevadero y por estar ahí para cualquier duda. A María, Mari, Eva, Juancho, Elisa, Jose Antonio, Judit, Ale. Gracias. A Mariluz y Juanjo, por vuestros consejos sobre inmunotransferencia. A Itziar e Ignacio, por su ayuda en el animalario. También a los profesores del departamento, especialmente a Guillermo por sus sabios consejos y ayuda, así como por el asesoramiento técnico y el macro para la descomposición de EPP complejos. A Loli, Carlos y Fernando, por hacer la burocracia mucho más sencilla. Gracias a mi gente del barrio. A Jose, Pakuky, Gonzalo, Guille, Antonio, Elena, Paco, Alicantino, Cuenca, Salas y Jona. Por las quedadas en el Rupe o en san Joaquín que me daban la vida. Porque siempre estáis ahí y sois lo más grande. Y, como no podía ser de otra manera, a mi familia. Os lo debo TODO. Por hacerme ser como soy. Por el amor que me habéis dado. Por los valores que me habéis inculcado. Por el apoyo incondicional. A mis padres, Luis y Josefina. A mis hermanos, Antonio y Luis. Y a Sara. Os quiero. PERTENENCIA A GRUPOS DE INVESTIGACIÓN o Grupo BIO209: Neurotransmisión y sinaptopatologías. Universidad de Sevilla CONTRATOS ASOCIADOS A PROYECTOS o 2016-2017: contrato de investigador asociado al proyecto “Variabilidad funcional de los terminales nerviosos motores y vulnerabilidad sináptica AME”. Ministerio de Economía y competitividad BFU2013-43763-P o 2017-2019: contrato de investigador asociado al proyecto “Regulación de la expresión de SV2B y Sinaptotagmina 1-2 y su alteración en la Atrofia Muscular Espinal”. Ministerio de Economía y competitividad BFU2016-78934-P o 2020: contrato de investigador asociado al proyecto “Spinal Muscular Atrophy. Mechanism implicated in the pertubation of calcium homeostasis and essay of a new therapeutic molecular target”. SMA Europe 2019/1007 o 2020: contrato de investigador asociado al proyecto “Modelo múrido de Atrofia Muscular Espinal”. SMA Europe 2019/1007 y El camino de Elena ESTANCIAS EN INSTITUCIONES DE INVESTIGACIÓN EXTRANJERAS o Marzo 2018 – Junio 2018: Instituto de Neurobiología Clínica, Universidad de Würzburg, Alemania. Tutorizado por el Prof. Michael Sendtner. PUBLICACIONES o Tejero, R., Lopez-Manzaneda, M., Franco-Espín, J., & Tabares, L. (2018) Maturation and heterogeneity of vertebrate motor synapses. Curr. Opin. Physiol., 4, 1–6. o Tejero, R., Balk, S., Appenzeller, S., Tabares, L., Jablonka, S., Tejero, R., Balk, S., Franco-Espin, J., Ojeda, J., Hennlein, L., Drexl, H., Dombert, B., Clausen, J., Torres-benito, L., Saal-bauernschubert, L., Blum, R., Briese, M., Appenzeller, S., Tabares, L., & Jablonka, S. (2020) R-Roscovitine Improves Motoneuron Function in Mouse Models for Spinal Muscular Atrophy R-Roscovitine Improves Motoneuron Function in Mouse Models for Spinal Muscular Atrophy. iScience, 23, 100826. o Lopez-Manzaneda, M., Franco-Espin, J., Tejero, R., Cano, R., & Tabares, L. (2021) Calcium is Reduced in Presynaptic Mitochondria of Motor Nerve Terminals during Neurotransmission in SMA Mice. Hum. Mol. Genet., doi: 10.1093/hmg/ddab065. CONTRIBUCIONES A CONGRESOS Comunicaciones Orales o Franco J., Tabares L. Role of SMN in synapse maturation. Workshop “Synapse Formation, Specification and Elimination: from Molecules to Circuits”. Baeza, España. Septiembre, 2017 Posters o Franco J., Tabares L. Estructural analysis of SMN granules in motor axons and presynaptic nerve terminals. 16th Congress of the Spanish Biophysical Society. Sevilla (España). Junio 2017 o Franco J., Tabares L. Role of SMN in synapse maturation. Workshop “Synapse Formation, Specification and Elimination: from Molecules to Circuits”. Baeza, España. Septiembre 2017 o Franco J., Tabares L. SMN colocalizes with the cytoskeleton in motor axons and nerve terminals. International Scientific Congress on Spinal Muscular Atrophy. Cracovia, Polonia. Enero 2018 o Franco-Espín J., Tabares L. Superresolution visualization of SMN particles in mouse motor nerve terminals. 23rd International SMA Researcher Meeting. Anaheim, California (EEUU). Junio 2019 Índice ABREVIATURAS ........................................................................................................ 1 RESUMEN ................................................................................................................... 7 SUMMARY ................................................................................................................ 10 INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 13 1. La Atrofia Muscular Espinal (AME) ...................................................................... 14 1.1. Tipos clínicos de AME ..................................................................................... 15 1.2. Genética de la AME ......................................................................................... 16 2. La proteína SMN .................................................................................................... 19 2.1. Estructura ......................................................................................................... 19 2.2. Isoformas de SMN ........................................................................................... 22 2.3. Funciones y localizaciones de la proteína SMN .............................................. 24 3. Impacto de la deficiencia de SMN en el sistema motor.......................................... 41 3.1. Patología de la motoneurona en la AME ......................................................... 41 3.2. ¿Es la AME una enfermedad de la motoneurona inferior o una enfermedad del sistema motor?......................................................................................................... 43 3.3. Patología de la NMJ ......................................................................................... 44 4. Perspectiva terapéutica............................................................................................ 47 4.1. Incremento de los niveles de SMN .................................................................. 47 4.2. Terapias complementarias ................................................................................ 50 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .......................................................................................... 52 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 55 1. Modelos animales ................................................................................................... 56 1.1. Características de los modelos murinos de AME............................................. 57 1.2. Genotipado de las líneas experimentales ......................................................... 61 1.3. Fenotipado ........................................................................................................ 68 2. Preparaciones neuromusculares y espinales ........................................................... 69 2.1. Materiales y soluciones de extracción y registro ............................................. 69 2.2. Músculo elevador largo de la oreja .................................................................. 71 2.3. Músculo transverso del abdomen ..................................................................... 72 2.4. Médula espinal ................................................................................................. 74 3. Inmunohistoquímica ............................................................................................... 76 3.1. Preparaciones neuromusculares ....................................................................... 76 3.2. Médula espinal ................................................................................................. 77 4. Inmunotransferencia de proteínas ........................................................................... 81 4.1. Dispositivo experimental.................................................................................. 81 4.2. Procedimiento experimental ............................................................................. 81 5. Hibridación in situ .................................................................................................. 85 6. Registros Electrofisiológicos .................................................................................. 88 6.1. Dispositivo experimental.................................................................................. 88 6.2. Procedimiento experimental ............................................................................. 90 6.3. Análisis de los registros electrofisiológicos ..................................................... 92 7. Registros de imagen dinámica ................................................................................ 96 7.1. Dispositivo experimental.................................................................................. 96 7.2. Registro en tiempo real de exo-endocitosis...................................................... 97 7.3. Registros en tiempo real del potencial de membrana mitocondrial ................. 98 8. Adquisición y Análisis de Imágenes ..................................................................... 100 8.1. Microscopía láser confocal............................................................................. 100 8.2. Microscopía láser de superresolución ............................................................ 103 8.3. Análisis de imágenes ...................................................................................... 105 9. Análisis Estadístico ............................................................................................... 107 9.1. Estudio de la normalidad y de la homogeneidad de varianzas ....................... 107 Abreviaturas 5 scaRNP – Ribonucleoproteína pequeña específica de los cuerpos de Cajal (del inglés “small cajal bodies-specific RiboNucleoProtein”) snRNP – Ribonucleoproteína pequeña nuclear (del inglés “small nuclear RiboNucleoProtein”) snoRNP – Ribonucleoproteína pequeña nucleolar (del inglés “small nucleorlar RiboNucleoProtein”) RBP – Proteína de unión a ARN (del inglés “RNA-Binding Protein”) ROI – Región de interés (del inglés “Region Of Interest”) SBP2 – Proteína de unión a SECIS 2 (del inglés, “SECIS-Binding Protein 2”) scAAV – del inglés “self-complementary Adeno-Associated Vector”, vector adenoasociado autocomplementario SDS – dodecilsulfato de sodio (del inglés “Sodium DodecilSulfate”) SFE – Solución fisiológica extracelular SG – gránulos de estrés (del inglés “Stress Granules”) Sm – Antígeno de Smith SMN – Proteína de supervivencia de la motoneurona humana (del inglés “Survival of Motor Neuron”) Smn – Proteína de supervivencia de la motoneurona no humana (ratón, pez cebra, etc.) SMN1 – Gen de supervivencia de la motoneurona 1 SMN2 – Gen de supervivencia de la motoneurona 2 SNC – Sistema nervioso central SNP1 – Esnurportina 1 SSC – Solución salina con citrato de sodio (del inglés “Saline-Sodium Citrate”) STD – Depresión a corto plazo (del inglés “Short-Term Depression”) STED – Depleción de emisión estimulada (del inglés “STimulated Emission Depletion”) SV2 – Proteína de la vesícula sináptica 2 (del inglés “Synaptic Vesicle 2”) Syt1 – Sinaptotagmina 1 Syt2 – Sinaptotagmina 2 TBS – Solución salina tamponada con Tris (del inglés “Tris-Buffered Saline”) TGS1 – Trimetilguanosina sintasa 1 Tris – Tris(hidroximetil)aminometano TVA – Transverso del abdomen (del latín “TransVersus Abdominis”) VGCC – Canal de calcio activado por voltaje (del inglés “Voltage-Gated Calcium Channel”) Abreviaturas 6 vGLUT2 – Transportador vesicular de glutamato 2 (del inglés “vesicular GLUtamate Transporter 2”) WB – Inmunotransferencia (del inglés “Western Blot”) ZPR1 – Proteína dedo de zinc 1 (del inglés, Zinc Protein Finger 1) Resumen Resumen 8 La atrofia muscular espinal (AME), la causa genética más frecuente de mortalidad infantil, es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la pérdida de neuronas motoras espinales. La AME causa debilidad muscular progresiva y parálisis y se debe a la pérdida o mutación de SMN1, que codifica la supervivencia de la proteína de la neurona motora (SMN). SMN se expresa de forma ubicua y participa en múltiples procesos del metabolismo del ARN. Aunque aún no se ha demostrado su función fisiológica en axones y terminales presinápticos, diferentes estudios in vitro sugieren que participa en la síntesis local de proteínas. La caracterización de las alteraciones estructurales, funcionales y moleculares en modelos de ratón SMA ha contribuido en gran medida a la comprensión de la fisiopatología de la enfermedad. El objetivo del presente trabajo ha sido doble. Primero, estudiar la organización espacial y temporal de SMN en axones motores y terminales y, segundo, investigar los mecanismos implicados en la disfunción sináptica de la unión neuromuscular (NMJ). Nuestros resultados revelan la existencia de gránulos de proteína SMN endógena y heteróloga a lo largo de los axones y dispuestos de manera ordenada dentro de el terminal nervioso motor. Demostramos que los gránulos de SMN coexisten con dos elementos de la maquinaria de síntesis de proteínas en el preterminal: los ribosomas y el ARNm. En ratones WT, los gránulos axonales y preterminales disminuyen durante las dos primeras semanas de vida, volviéndose imperceptibles en la edad adulta. Sin embargo, la expresión heteróloga de SMN permanece constante durante este período. Asi mismo, nuestros resultados revelan una posible asociación entre los gránulos y el citoesqueleto, especialmente con los NF. A medida que avanza la enfermedad, SMN y NF forman agregados en axones y terminales, posiblemente contribuyendo al colapso del terminal nervioso. Proponemos que SMN participa en la maduración de la sinapsis regulando el transporte y el metabolismo del ARNm en este compartimento. En la segunda parte de nuestro trabajo, investigamos las alteraciones funcionales del terminal motor en la AME mediante el análisis electrofisiológico de la neurotransmisión y registros de imagen dinámica de la exo-endocitosis y la función mitocondrial. Nuestros resultados muestran que la mitocondria es fundamental para mantener la neurotransmisión y reciclar las vesículas sinápticas, tanto en controles como en mutantes, y que la producción de ATP por la vía glucolítica no juega un papel importante en esta sinapsis. Finalmente, hemos investigado la capacidad de GV-58, un agonista de los canales de calcio dependiente del voltaje, para aumentar la liberación de Resumen 9 neurotransmisores. Encontramos que GV-58 prolonga la duración de los potenciales postsinápticos en ratones SMA de una manera dependiente de la dosis. Summary Summary 11 Spinal muscular atrophy (SMA), the most frequent genetic cause of infant mortality, is a neurodegenerative disease characterized by spinal motoneuron loss. SMA causes progressive muscle weakness and paralysis, and it is due to the loss or mutation of the SMN1, which encodes the survival of motor neuron (SMN) protein. SMN is ubiquitously expressed and participates in multiple processes of RNA metabolism. Although its physiological function in axons and presynaptic terminals has not been demonstrated yet, different in vitro studies suggest that it participates in local protein synthesis. The characterization of the structural, functional, and molecular alterations in SMA mouse models contributes highly to understanding the disease's pathophysiology. The objective of the present work has been double. First, to study the spatial and temporal organization of SMN in motor axons and nerve terminals and, second, to investigate the mechanisms involved in the synaptic dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ). Our results reveal both endogenous and heterologous SMN protein granules distributed along the axons and arranged in an orderly manner inside the nerve motor terminal. We demonstrate that SMN granules coexist with two elements of the protein synthesis machinery at the preterminal: ribosomes and mRNA. In WT mice, the number of Smn granules decreases during the first two weeks of life, becoming imperceptible in adulthood. However, the heterologous expression of the SMN protein in the transgenic mice remains constant during this period. Likewise, our results reveal a potential association between Smn-SMN granules and the cytoskeleton, especially with NFs. As the disease progresses in the mouse SMA model, SMN and NFs form aggregates in axons and terminals, possibly contributing to the nerve terminal collapse. We propose that SMN participates in synapse maturation by regulating the transport to and metabolism of the mRNA at this compartment In the second part of our work, we investigated the functional alterations of the motor nerve terminal in SMA. We characterized neurotransmission defects with electrophysiological techniques and exoendocytosis and mitochondrial homeostasis alterations by dynamic imaging. Our results show that mitochondrial activity is critical for maintaining neurotransmission and recycling synaptic vesicles, both in controls and in mutants. ATP production by the glycolytic pathway does not play an important role in this synapse. Finally, we have investigated the capability of GV-58, a voltage-dependent calcium channel agonist, to increase neurotransmitter release. We found that GV-58 Summary 12 prolongs the duration of the post-synaptic potentials in SMA mice in a dose-dependent manner. Introducción Introducción 14 1. La Atrofia Muscular Espinal (AME) La Atrofia Muscular Espinal (AME) es una enfermedad genética de herencia autosómica recesiva caracterizada por la degeneración de α-motoneuronas del tronco encefálico y de la medula espinal. Desde el punto de vista clínico se caracteriza por debilidad y atrofia muscular, generalmente severa, de predominio axial y proximal. El gen responsable de la enfermedad se denomina SMN1 y fue identificado en 1995 (Lefebvre et al., 1995). Distintas alteraciones en SMN1 dan lugar a la deficiencia en una proteína ubicua denominada SMN o proteína de supervivencia de motoneuronas. Desde que hace 25 años SMN se identificó en el núcleo celular en asociación con los Cuerpos de Cajal (CB) (Liu & Dreyfuss, 1996) se ha desarrollado una vasta literatura que indica que SMN ejerce un papel central en el metabolismo del ARN a distintos niveles (Singh et al., 2017). Por ejemplo, a nivel de la transcripción interacciona con la ARN polimerasa II, evitando la formación de híbridos ADN-ARN. Así mismo, regula indirectamente la maduración de los pre-ARN puesto que dirige la formación de distintos tipos de ribonucleoproteínas (RNP) esenciales en este proceso, como las nucleares pequeñas (snRNP) o nucleolares pequeñas (snoRNP). Por otro lado, regula la estabilidad y tráfico de los ARNm participando en la formación de los gránulos de estrés y de las RNP mensajeras (mRNP). Recientemente, además, se ha demostrado que participa en la traducción a través de su interacción con los ribosomas. Aunque estas funciones son esenciales para la supervivencia de todas las células y aunque las neuronas pueden requerir una mayor actividad e integridad del metabolismo de los ARN, aún no está claro por qué las motoneuronas son tan sensibles a niveles bajos de SMN. En el último lustro, con el desarrollo de las técnicas ómicas, distintos grupos, entre los que destacan los dirigidos por el Prof. Sendtner, el Prof. Rossoll y la Prof. Viero, han postulado que SMN es necesaria para la síntesis de un subgrupo de ARNm y proteínas de especial importancia en las motoneuronas, como los relacionados con el desarrollo del sistema nervioso, el metabolismo energético y la función sináptica. Estos y otros puntos esenciales para comprender la etiología, fisiopatología, clínica y terapia de la AME se detallarán y discutirán en los siguientes apartados. Introducción 21 ciertas diferencias funcionales con el resto de dominios reales. Mientras la mayoría, como Chromo, MBT o Agenet, reconocen residuos de lisina metilados, el dominio Tudor de SMN está subespecializado en el reconocimiento de residuos metilados de arginina. Concretamente, reconoce dimetilargininas simétricas (sDMA, del inglés simmetric DiMethylArginine) de los motivos RG/RGG, ricos en arginina (R) y glicina (G), presentes en multitud de proteínas (Friesen & Dreyfuss, 2000; Friesen, Massenet, et al., 2001; Boisvert et al., 2002). A través de esta interacción, SMN reconoce ciertas proteínas implicadas en la regulación génica como la coilina, la fibrilarina, la ARN polimerasa II (Hebert et al., 2001; Pellizzoni, Baccon, et al., 2001; Pellizzoni, Charroux, et al., 2001; Zhao et al., 2016). Además, el dominio Tudor es especialmente relevante por tres motivos: (i) múltiples mutaciones productoras de AME se localizan en esta región (Burghes & Beattie, 2009), (ii) interacciona con las proteínas Sm, siendo necesario para la formación de las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP, small nuclear RiboNucleoProtein) (Buhler et al., 1999; Friesen & Dreyfuss, 2000; Selenko et al., 2001), y (iii) interacciona con múltiples proteínas de unión a ARNm (RBP, RNA-Binding protein) como, por ejemplo, HuD, IMP1, la proteína del retraso mental asociado X frágil (FMRP) o hnRNP R (Rossoll et al., 2002; Piazzon et al., 2008; Akten et al., 2011; Dombert et al., 2014; Donlin-Asp et al., 2016, 2017). Más adelante se explicará con mayor detalle el papel funcional de SMN y del dominio Tudor en el metabolismo del ARN y la formación de ribonucleoproteínas (RNP). El siguiente dominio funcional se denomina dominio P por ser rico en prolina (P). Este dominio abarca desde la parte final del exón 4 hasta la región proximal del exón 6 (Giesemann et al., 1999). Está involucrado en la interacción entre SMN y profilina 2. En este dominio también se ubica la región diana de la enzima proteolítica calpaína (Walker et al., 2008; de la Fuente et al., 2019) Finalmente, en la región distal del exón 6 y la región proximal del exón 7 se ubica el Dominio YG, rico en tirosina (Y) y glicina (G) (Talbot et al., 1997). Un gran número de mutación productoras de AME se localizan en este dominio (Wirth, 2000; Sun et al., 2005; Burghes & Beattie, 2009), lo que sugiere que es crítico para la funcionalidad de SMN. Entre otras funciones, el dominio YG está implicado en la interacción de SMN con Gemina 3 y ZPR1 (Charroux et al., 1999; Gangwani et al., 2001, 2005). Sin embargo, la importancia de este dominio radica en dos aspectos interrelacionados: (i) es fundamental Introducción 22 para la oligomerización de SMN y la estabilización de la proteína (Pellizzoni et al., 1999; Zhang et al., 2003; Martin et al., 2012), y (ii) la exclusión del exón 7 en la transcripción de SMN2 provoca que esté afectado parcialmente en la isoforma truncada SMNΔ7. La oligomerización de SMN se produce mediante la formación de una cremallera de glicina entre los dominios YG (Martin et al., 2012) y es esencial para la funcionalidad de SMN puesto que permite la formación de grandes complejos heteromultiméricos (ver más adelante). Además, la oligomerización de SMN enmascara un degrón, secuencia reguladora de la degradación de la proteína y substrato para su ubiquitinización (Cho & Dreyfuss, 2010; Gray et al., 2018), lo que aumenta la estabilidad de la proteína. 2.2. Isoformas de SMN Además del transcrito que da lugar a la proteína completa, SMN1 y SMN2 producen otros transcritos mediante cortes y empalmes alternativos. Se conocen al menos 7, siendo los principales exones afectados el 5 y el 7 (Jong et al., 2000), desconociéndose aún sus potenciales funciones. Actualmente, solo las proteínas de tres de estos transcritos han sido identificadas: SMNΔ7, a-SMN y SMN6B. A continuación, se describen sus características (Fig. 3). Figura 3. Representación esquemática de transcritos de SMN1 y SMN2. El nombre de cada transcrito se indica a la izquierda y el número del exón se indica sobre el recuadro de color correspondiente. La localización de los codones de parada está señalizada con puntas de flecha. Los intrones exonizados vienen representados por cajetines blancos. El número de aminoácidos codificados por el exón del extremo C-terminal están representados en el interior del cajetín correspondiente. Nótese que en SMNΔ7 un segmento del exón 8 se sitúa previo al codón de parada, correspondiendo con la secuencia codificante para los aminoácidos EMLA. UTR: región no traducida. Modificada de Singh et al., 2017. 5’UTR 5’UTR 5’UTR 5’UTR 1 1 1 1 2A 2B 3 4 5 6 7 2A 2B 3 4 5 6 2A 2B 3 2A 2B 3 4 5 6 8 8 3’UTR 3’UTR SMN fl SMNΔ7 a-SMN SMN6B 3’UTR 3x 6B 3’UTR 15 16 16 Introducción 23 La isoforma mejor conocida de SMN es SMNΔ7. Esta isoforma es el producto principal del gen SMN2 y presenta una secuencia idéntica a SMNfl en los primeros 278 aa. Sin embargo, la exclusión del exón 7 lleva a una pérdida de los últimos 16 aa. En su lugar, SMNΔ7 incorpora 4 aa, EMLA, codificados por el exón 8, lo que resulta en una secuencia final de 282 aa. Esta modificación del extremo C-terminal afecta de forma importante a las propiedades de la proteína. La pérdida parcial del dominio YG resulta en una menor capacidad de oligomerización tanto con SMNfl como consigo misma (Lorson et al., 1998). Ello impacta en la estabilidad de la proteína, puesto que el degrón localizado en exón 6 es enmascarado con la oligomerización y, además, la secuencia EMLA incrementa la actividad del mismo (Cho & Dreyfuss, 2010; Gray et al., 2018) Otra de las isoformas de SMN, a-SMN, resulta de la inclusión del intrón 3 en el transcrito. En la porción proximal del intrón 3 se localiza un codón de parada que induce la formación de una proteína de menor tamaño codificada por los exones 1-3, y parte del intrón 3 (Fig. 3). Esta isoforma únicamente se ha identificado en los axones, motivo por el cual se la nombró SMN axonal o a-SMN (Setola et al., 2007; Locatelli et al., 2012). In vitro, a-SMN parece estimular el crecimiento axonal y la motilidad celular, lo que sugiere que esta isoforma podría participar en el desarrollo del sistema nervioso. Sin embargo, aún no se ha confirmado esta función in vivo y se cree que tiene una repercusión limitada en la patogénesis de la AME puesto que mutaciones en el exón 6 producen la enfermedad a pesar de estar conservada la secuencia de a-SMN (Wirth, 2000; Sun et al., 2005; Burghes & Beattie, 2009). Por último, SMN6B es generada por la lectura e inclusión del intrón 6 (Fig. 3). De forma similar al intrón 3, la secuencia de este intrón presenta un codón de parada que provoca que la proteína resultante presente los exones 1-6 y parte del intrón 6 (Seo et al., 2016; Yoshimoto et al., 2016). Aunque se ha descrito una mayor estabilidad de esta isoforma que de SMN∆7, aún se desconoce con precisión su función fisiológica, así como su impacto en un contexto de deficiencia de SMN (Seo et al., 2016). Introducción 24 2.3. Funciones y localizaciones de la proteína SMN Como hemos explicado en el punto anterior, una característica fundamental de SMN es que es una proteína multidominio, lo que revela una propiedad esencial para comprender tanto el rol fisiológico como fisiopatológico de SMN: su multifuncionalidad (Espinosa- Cantú et al., 2020), como se desprende de su complejo interactoma y su participación en múltiples procesos relacionados con el metabolismo del ARN. Desde que se identificó la proteína en el núcleo en asociación con los Cuerpos de Cajal (CB) (Liu & Dreyfuss, 1996), se ha obtenido una gran cantidad de información en relación con la participación de SMN en múltiples procesos del metabolismo de ARN, donde parece ejercer un papel central (Singh et al., 2017). Estos van desde la regulación de la transcripción hasta la regulación de la traducción, pasando por el ensamblaje de distintas ribonucleoproteínas, como las nucleares pequeñas (snRNP), las nucleolares pequeñas (snoRNP) y mensajeras (mRNP), la formación de gránulos de estrés o el tráfico de mRNP (Fig. 4). No obstante, SMN también parece estar participando en otros procesos ajenos al ARN, como en la reparación y recombinación del ADN, en la vía de las quinasas activadas por mitógenos (MAPK), en la homeostasis de la ubiquitina o la autofagia (Takaku et al., 2011; Garcera et al., 2013; Wishart et al., 2014; Genabai et al., 2015), así como en ciertas funciones esenciales para las motoneuronas como el transporte de cargos, la regulación de la dinámica de la actina y la endocitosis (Nölle et al., 2011; Peter et al., 2011; Hensel & Claus, 2017). Algunas de estas funciones se explican con mayor detalle en los siguientes apartados en relación con su localización celular. Además, en consonancia con su expresión ubicua en todas las células, SMN es una proteína pleiotrópica, es decir, su expresión influye en múltiples rasgos fenotípicos. Así, su deficiencia produce alteraciones en neuronas, la glía, el músculo esquelético y cardíaco, hígado, páncreas y bazo, entre otros (Braun et al., 1995; Rudnik-Schöneborn et al., 2008; Martínez-Hernández et al., 2009; Bevan et al., 2010; Mentis et al., 2011; Bowerman et al., 2012; McGivern et al., 2013; Khairallah et al., 2017; Maxwell et al., 2018; Deguise et al., 2019; Berciano et al., 2020). Por ello, actualmente se concibe la AME como una enfermedad multisistémica, aunque con afectación predominante de la motoneurona inferior (Yeo & Darras, 2020). Introducción 25 Figura 4. Funciones nucleares y citosólicas relacionadas con el metabolismo del ARN atribuidas a SMN. SMN (circulo azul) es una proteína multifuncional nuclear y citoplasmática que actúa en asociación con otras proteínas. Su función mejor conocida, realizada en conjunción con otras 8 proteínas en el denominado complejo SMN, es en el ensamblaje citosólico de las snRNP de clase Sm (panel derecho) y de la snRNP U7 (panel izquerdo) y su posterior importación nuclear (1). En el núcleo se postula que SMN participa junto con diskerina y WRAP53 en el ensamblaje de las snoRNP y las telomerasas, concretamente en el nucleolo y en los CB (2), y en la transcripción génica (3). En el citosol, SMN parece participar en el metabolismo del ARNm, concretamente en la regulación de la síntesis de proteínas y selenoproteínas (4), en la formación de gránulos de estrés (5), y en el ensamblaje y tráfico de las mRNP, de especial relevancia en las neuronas (6). Adaptada de Singh et al., 2017. Introducción 26 Se han propuesto varias hipótesis, potencialmente complementarias, para explicar el pleiotropismo de SMN: (i) debido a su multifuncionalidad, algunos de sus roles son específicos de tejido (Walker et al., 2008; Khairallah et al., 2017; Deguise et al., 2019; Berciano et al., 2020), (ii) por su rol en la biogénesis de las snRNP, afecta la maduración de ciertos subgrupos de ARNm específicos de cada tipo celular (Gabanella et al., 2007; Pellizzoni, 2007) y (iii) por su participación en la regulación de ribosomal, modifica la traducción de ARNm específicos de tejido (Bernabò et al., 2017; Lauria et al., 2020). Por último, para entender las distintas funciones de SMN en el contexto espaciotemporal es necesario tener en cuenta tanto su localización subcelular y tisular como su expresión temporal. En los siguientes apartados se tratarán estos aspectos. 2.3.1. Requerimiento espaciotemporal de SMN Para entender las funciones de SMN y las consecuencias de su deficiencia en la AME es crítico conocer los requerimientos específicos que distintos tejidos tienen de la proteína desde las primeras etapas del desarrollo hasta la edad adulta. Como se ha mencionado anteriormente, SMN es una proteína ubicua y necesaria en la mayoría de células del organismo, sin embargo, investigaciones en un modelo murino de AME del grupo liderado por Arthur Burghes mostraron que el requerimiento de SMN del tejido nervioso es mayor que el de otros tejidos (Gavrilina et al., 2008). Por ejemplo, mientras los niveles de SMN alcanzados con dos copias de SMN2 son insuficientes para la supervivencia de las motoneuronas inferiores, la mayoría de tejidos sobreviven en ese contexto. Así mismo, Groen y colaboradores mostraron en dos modelos murinos que la expresión en el sistema nervioso central es mayor que en el resto de sistemas del organismo (Groen et al., 2018). Sin embargo, aún se desconoce los mecanismos moleculares que median esta expresión diferencial en los distintos tejidos y por qué el sistema nervioso, en especial las motoneuronas, requieren una mayor expresión de SMN. La expresión de SMN está, así mismo, regulada temporalmente (Jablonka & Sendtner, 2017; Ojala et al., 2021). La Figura 5 muestra de forma esquemática la expresión y requerimientos murinos de SMN desde la fase embrionaria hasta la edad adulta en las motoneuronas inferiores. Los niveles de expresión de SMN son más altos durante el desarrollo embrionario y postnatal temprano, pero disminuye bruscamente tras Introducción 27 Figura 5. Requerimiento temporal de SMN en las motoneuronas inferiores murinas. Durante el desarrollo embrionario y coincidiendo con el desarrollo de la NMJ, la expresión y requerimientos de SMN en las motoneuronas alcanza su cenit para descender posteriormente (representado por el gradiente de naranja a blanco). Tras el periodo crítico de maduración postnatal de la NMJ (P0-P10), su expresión desciende bruscamente, siendo viables estas sinapsis a partir de entonces con niveles bajos de proteína, como los producidos por SMN2 (línea discontinua). En la edad adulta, la remodelación y estabilización de la NMJ después de una lesión requiere niveles elevados de proteína. Por tanto, la ventana de tratamiento con fármacos que incrementen los niveles de SMN se restringe al periodo postnatal temprano. Adaptada de Kariya et al., 2014 y Ojala et al., 2021. la primera semana de vida hasta alcanzar un nivel basal que se mantiene a lo largo de la vida (Gabanella et al., 2005; Liu et al., 2010; Lutz et al., 2011). Los niveles máximos de SMN en la médula espinal se producen durante la embriogénesis temprana y coinciden temporalmente con el crecimiento, búsqueda de dianas y mielinización de los axones de las motoneuronas (Burlet et al., 1998; Jablonka et al., 2000; Gabanella et al., 2005). Tras la formación de la NMJ, prenatalmente, se produce un primer descenso de la expresión de SMN (Ling et al., 2012). Posteriormente, entre los días postnatales (P) 5 y 15, se produce un segundo descenso, más acusado, que coincide con el periodo de maduración Ventana de tratamiento actual Desarrollo y Maduración de la NMJ Remodelado de la NMJ Daño nervioso Requerimiento de SMN ≥ 1 SMN1 2 SMN2 E10 E15 P0 P5 P20 P10 P15 Adulto Requerimiento de SMN Alto Bajo Introducción 28 y mantenimiento de la NMJ (Jablonka et al., 2000). Finalmente, tras la maduración de la NMJ se mantienen niveles basales bajos de proteína que persisten durante la edad adulta. Distintos estudios de expresión condicional de SMN han demostrado que el patrón temporal de expresión se adecua a los requerimientos de las motoneuronas. Por ejemplo, la inducción de la expresión de SMN durante el periodo embrionario o la fase sintomática temprana previene la patología neuromuscular y el desarrollo del fenotipo motor (Gavrilina et al., 2008; Le et al., 2011; Lutz et al., 2011; Hao et al., 2013). Tras la maduración de la NMJ (P17-20), las motoneuronas se vuelven insensibles a los niveles bajos de la proteína, como demuestra los escasos efectos que produce la depleción de SMN a partir de ese momento (Kariya et al., 2014). En la edad adulta, únicamente vuelven a requerirse niveles altos de SMN en caso de daño nervioso y el subsiguiente remodelado de la NMJ (Fig. 5). Estos datos demuestran una mayor efectividad de la inducción temprana en la expresión de SMN en la recuperación del fenotipo, lo que tiene una importancia capital desde un punto de vista terapéutico (ver más adelante). 2.3.2. SMN en la biogénesis de las snRNP SMN se asocia con sí misma y con otras proteínas formando distintos tipos de complejos heteromultiméricos cuya composición varía en los distintos compartimentos subcelulares. El complejo mejor caracterizado, tanto bioquímica como funcionalmente, es el denominado complejo SMN localizado tanto en el núcleo, concretamente en las estructuras denominadas Gems, como en el citoplasma de todas las células (Fischer et al., 1997; Liu et al., 1997; Zhang et al., 2006; Burghes & Beattie, 2009; Lafarga et al., 2017). Los Gems, o Gemelos de los Cuerpos de Cajal (del inglés Gemini of Cajal’s Bodies), son unas estructuras nucleares íntimamente asociadas a los Cuerpos de Cajal (CB). Ambas estructuras están asociadas al nucleolo y contienen SMN (Lafarga et al., 2017). Sin embargo, presentan importantes diferencias en su composición molecular que indican funciones distintas. Los CB contienen coilina y snRNP, motivo por el cual se le ha atribuido un rol en el metabolismo y maduración de los ARN y RNP nucleares. Los Gems, sin embargo, carecen de estos componentes. La función concreta de los Gems y su relación con los CB aún no se conoce con precisión. Introducción 29 En el citosol, el complejo SMN está formados por nueve proteínas distintas: SMN, Geminas 2-8 y UNRIP (Liu et al., 1997; Charroux et al., 1999, 2000; Baccon et al., 2002; Gubitz et al., 2002; Pellizzoni, Baccon, et al., 2002; Carissimi et al., 2005, 2006). Aunque la estequiometría y arquitectura exacta del complejo SMN es aún desconocida, existen modelos estructurales del complejo con base en las interacciones entre sus componentes (Fig. 6) (Otter et al., 2007; Cauchi, 2010). SMN, Gemina 7 y Gemina 8 forman una plataforma sobre la que se incorporan el resto de las proteínas. SMN interactúa directamente con Gemina 2, Gemina 3 y Gemina 8, mientras que Gemina 4 y Gemina 5 interaccionan con Gemina 3 y Gemina 2, respectivamente. Gemina 8 permite la incorporación del heterodímero Gemina 6-Gemina 7, el cual, a su vez, media la incorporación de otro componente del complejo conocido como UNRIP. Esta composición prototípica del complejo SMN se conserva en el citoplasma y en los Gems del núcleo, excepto que en el núcleo carece de Gemina 5 y UNRIP (Carissimi et al., 2005; Hao et al., 2007). Figura 6. Mapa propuesto de interacciones proteicas en el complejo SMN humano. Las interacciones proteína-proteína identificadas mediante dos o más sistemas experimentales independientes están indicadas mediante flechas negras, mientras que las identificadas mediante un solo sistema experimental están identificadas mediante flechas de distintos colores, azules (experimento de captura mediante GST), rojas (coinmunoprecipitacion) o amarillas (técnica de doble híbrido en levadura). Modificada de Cauchi, 2010. SMN Gemina 3 Gemina 4 Gemina 2 Gemina 5 Gemina 8 Gemina 7 Gemina 6 UNRIP Introducción 30 Al ser SMN una proteína de pequeño tamaño, es poco probable que todas las interacciones con las geminas se produzcan en una misma molécula. Posiblemente la capacidad de SMN de oligomerizar permite la formación de complejos de orden superior (Pellizzoni et al., 1999). Esta capacidad está alterada en pacientes con AME (Lorson et al., 1998; Pellizzoni et al., 1999), lo que implica que la oligomerización probablemente tenga un papel fundamental en la arquitectura del complejo SMN mediante la reunión de los diferentes componentes dentro de la misma entidad macromolecular. La función mejor conocida del complejo SMN es en el ensamblaje de las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP) de tipo Sm en el citosol de todas las células (Kolb et al., 2007; Burghes & Beattie, 2009; Cauchi, 2010; Raimer et al., 2017; Singh et al., 2017). Las snRNP se componen de un ARN pequeño nuclear rico en uridina (ARNpn U) y un anillo heteroheptamérico de proteínas de la familia LSM (del inglés Smlike), a la que pertenecen las proteínas Sm (B/B’, D1, D2, D3, E, F y G) y una plétora de proteínas Lsm (homónimo de la familia proteica) (Fischer et al., 2011). Actualmente, se conocen 10 tipos de snRNP tipo U: U1, U2, U4, U4atac, U5, U6, U6atac, U7, U11 y U12 (Matera et al., 2007; Wahl et al., 2009; Gruss et al., 2017). Todos los ARNpn, menos U6, U6atac y U7, son sintetizados por la ARN polimerasa II y exportados al citosol, donde se asocian al anillo de proteínas Sm gracias a la acción del complejo SMN (Pellizzoni, 2007; Burghes & Beattie, 2009; Fischer et al., 2011; Matera & Wang, 2014). Los ARNpn U6 y U6atac, en cambio, son sintetizadas por la ARN polimerasa III y se asocian en el núcleo a un anillo de proteínas Lsm (Matera et al., 2007; Fischer et al., 2011). Finalmente, las ARNpn U7 se asocian a un anillo compuesto por proteínas Sm, salvo D1 y D2 que son sustituidas por las proteínas Lsm10 y 11(Schümperli & Pillai, 2004). Excepto U7, que participa en el procesamiento del extremo 3’ del ARNm de histonas (Schümperli & Pillai, 2004), las snRNP son constituyentes esenciales del espliceosoma, macrocomplejos riboproteicos encargados de la maduración del ARNm mediante el proceso de corte y empalme (Wahl et al., 2009; Fischer et al., 2011; Matera & Wang, 2014). Son fundamentales para el reconocimiento de los sitios de corte y empalme y actúan como soporte estructural para el resto de proteínas implicadas. Las snRNP U1, U2, U4, U5 y U6 forman parte del complejo mayor del espliceosoma, participando en el procesamiento de la mayoría de los intrones (intrones tipo U2). El resto Introducción 37 (Mobarak et al., 2000; Akten et al., 2011; Yoo et al., 2013). Estos transcritos están relacionados con fenómenos de crecimiento, arborización y regeneración axonal (Anderson et al., 2003; Karamoysoyli et al., 2008; Akten et al., 2011). Cpg15, además, parece participaren tanto en la sinaptogénesis como en la estabilidad, plasticidad y maduración sináptica (Fujino et al., 2003, 2011; Javaherian & Cline, 2005; Picard et al., 2014). En larvas de Xenopus, por ejemplo, cpg15 promueve la formación y maduración in vivo de la NMJ, aunque se desconoce si también está implicada en este proceso en mamíferos (Javaherian & Cline, 2005). hnRNP R e IMP1, por otro lado, se asocian al ARN de β-actina (Glinka et al., 2010) en los axones, principal isoforma de la actina en los axones y esencial para procesos tales como el crecimiento y arborización axonal, la búsqueda de dianas, la sinaptogénesis (Rathod et al., 2012; Donnelly et al., 2013; Moradi et al., 2017), así como para la endocitosis y el ciclo vesicular en el terminal sináptico (Cingolani & Goda, 2008; Spence & Soderling, 2015; Yan et al., 2016), procesos que están alterados en distintos modelos de AME (Torres-Benito et al., 2012; Hosseinibarkooie et al., 2016; Hensel & Claus, 2017; López-Manzaneda et al., 2021). Además de los transcritos mencionados, la deficiencia en SMN altera específicamente la localización axonal de mensajeros implicados en procesos esenciales para supervivencia y funcionalidad de la motoneurona y la sinapsis. En células NSC-34, SMN coinmunoprecipita con mensajeros enriquecidos en los axones (Rage et al., 2013) y estudios transcriptómicos en motoneuronas deficientes en SMN en cultivos han mostrado una reducción mensajeros axonicos asociados a la regulación del citoesqueleto y a la actividad sináptica (Saal et al., 2014). Así mismo también se han observado en motoneuronas procedentes de ratones AME alteraciones en la expresión de genes relacionados con el metabolismo energético mitocondrial, esencial para la actividad sináptica (Miller et al., 2016). Introducción 38 Figura 9. Los gránulos axonales de SMN contienen RBP. A. Cultivo primario de motoneuronas embrionarias transfectadas con constructos de SMN y HuD para complementación bifluorescente (BiFC, verde), que muestra la coexistencia de ambas proteínas en un mismo complejo, y marcados para SMN (rojo). Los gránulos así identificados están presentes en el soma y en el axón de la motoneurona. Barra de escala: 10 µm. B. Registro de imagen dinámica que muestra el movimiento bidireccional de lo gránulos positivos para HuD y SMN en el axón. Se observaron trayectorias anterógradas (flechas) y retrógradas (puntas de flechas). Ambos gránulos se movieron a una velocidad media de 1 µm/s. Las flechas y puntas de flecha rojas indican la posición inicial de los gránulos analizados. Barra de escala: 5 µm. Modificada de Fallini et al., 2011. A B Introducción 39 2.3.5. SMN y traducción del ARNm Recientemente se ha postulado la participación de SMN en el proceso de traducción ya que SMN no solo se asocia mRNP, sino también a polisomas en cultivos de motoneuronas (Sanchez et al., 2013). Bernabò y colaboradores confirmaron in vivo la asociación entre SMN y los polisomas en muestras de cerebro y medula espinal (Bernabò et al., 2017). También determinaron una disminución de la fracción ribosomal que conforma los polisomas en ambos tejidos durante el periodo presintomático en un modelo murino de AME, lo que sugiere una alteración de la traducción desde etapas iniciales de la enfermedad. Estos defectos son celularmente autónomos, dependiente de los niveles de SMN y correlacionan con la historia natural de la enfermedad. Al igual que en el tráfico axonal, la deficiencia de SMN parece alterar la traducción de ciertos contingentes de ARNm, incluido algunos relacionados con la biología de los ribosomas. Aunque previamente se había descrito regulación negativa in vitro por parte SMN en la traducción de una proteína relacionada con la regulación del ARN, un reciente estudio in vivo sugiere que mayoritariamente SMN regula positivamente la traducción (Lauria et al., 2020). Según el modelo propuesto por los Prof. Viero y Gillingwater, SMN se asocia y modula un pequeño contingente específico de ribosomas que se caracteriza por participar en la traducción de un subconjunto especifico de ARNm y por asociarse con estos en los primeros 5 codones de la secuencia codificante. Esta asociación ribosoma-mensajero requiere de SMN y está afectada en la AME. Estos transcritos codificarían para proteínas implicadas en la fisiología axonal, sináptica, ribosomal, de los ácidos grasos y de la cromatina, procesos afectados característicamente en la AME y otras patología neuromusculares como la ELA. También se ha postulado una posible participación de SMN en la traducción de un contingente de proteínas relacionadas con la regulación del estado de estrés oxidativo celular, las selenoproteínas, a tenor de la asociación de SMN con el ARNm de una de ellas y de su interacción con las proteínas TGS1 y SBP2, esenciales en este proceso (Wurth et al., 2014). En este sentido, se ha demostrado que SMN es necesaria para la traducción in vivo de GPx1 y que la homeostasis de las selenoproteínas está alterada específicamente en la medula espinal de ratones modelo de AME (Gribling-Burrer et al., 2017). Introducción 40 Finalmente, algunos estudios in vitro sugieren la participación de SMN en la regulación de la síntesis local, proceso esencial durante el desarrollo del sistema nervioso para el crecimiento axonal y la búsqueda de dianas (Giuditta et al., 2008; Lin & Holt, 2008; Di Liegro et al., 2014; Shigeoka et al., 2016). En cultivos de motoneuronas, por ejemplo, la deficiencia de SMN induce una menor síntesis local de proteínas en el axón y en el cono de crecimiento (Fallini et al., 2016). Aunque se desconoce el mecanismo subyacente, se ha postulado que pueda estar mediado por la vía del ARN interferente, ya que distintos micro ARN (miARN) que participan en la síntesis local, como miR-183 o miR-431, se han encontrado desregulados en estos estudios in vitro (Kye et al., 2014; Wertz et al., 2016). Complementariamente, como hemos mencionado previamente, también pudiera estar mediado este efecto por una disminución de la regulación de actividad ribosomal por la deficiencia en SMN (Lauria et al., 2020). En este sentido, se ha observado que SMN media el anclaje de los ribosomas a la membrana plasmática de fibroblastos en cultivo, siendo esta asociación necesaria para el remodelado de la actina submembranal (Gabanella et al., 2016). Sin embargo, poco se sabe acerca de la síntesis local in vivo en las motoneuronas durante la maduración postnatal y la edad adulta más allá de su implicación en la regeneración axonal (Jung et al., 2012; Tasdemir-Yilmaz & Segal, 2016), por lo que es de interés conocer el rol de SMN en la traducción local in vivo en axones y terminales motores. Postnatalmente, los axones motores presentan unas estructuras íntimamente asociadas a la membrana plasmática que contienen elementos de la maquinaria de síntesis proteica tales como ribosomas, ARNm y RBP (Koenig & Martin, 1996; Koenig et al., 2000; Kun et al., 2007; Sotelo-Silveira et al., 2008). En un modelo de ratón de AME, se ha descrito una disminución de ribosomas axonales (Lauria et al., 2020), sin embargo, aún se desconoce si esta maquinaria está activa durante la maduración del circuito motor o simplemente cumple una función reactiva en casos de daño axonal. Del papel de la síntesis local en la NMJ se conoce menos aún, de hecho, hasta la fecha no se ha descrito la presencia de RBP, ARNm o ribosomas en el terminal presináptico motor durante la maduración postnatal. Introducción 41 3. Impacto de la deficiencia de SMN en el sistema motor Como se ha mencionado previamente, los hallazgos patológicos fundamentales en la AME pueden resumirse en: i) alteración del gen SMN1 y la subsiguiente reducción de los niveles de proteína SMN, ii) alteración histológica de la medula espinal con pérdida de motoneuronas, y iii) alteración funcional del sistema motor, con debilidad y atrofia muscular simétrica predominante en la musculatura proximal y axial. En los puntos anteriores hemos tratado los tipos clínicos de AME, la genética de la enfermedad y las complejas funciones de SMN. A continuación, se resumen los hallazgos fisiopatológicos que la deficiencia de SMN genera en el circuito motor. 3.1. Patología de la motoneurona en la AME Actualmente la AME está considerada una enfermedad multisistémica ya que no solo afecta a las motoneuronas sino también al metabolismo y a ciertos órganos y sistemas como el vascular, hígado, músculo esquelético, corazón y páncreas (Yeo & Darras, 2020). Las motoneuronas intrafusales son susceptibles al déficit de SMN pero no las γmotoneuronas y otras neuronas colinérgicas espinales (Powis & Gillingwater, 2016). Así mismo, las α-motoneuronas presentan una gran heterogeneidad en su susceptibilidad a los niveles bajos de SMN, pudiéndose encontrar incluso contingentes totalmente respetados durante el transcurso de la enfermedad como las que inervan los músculos extraoculares. Dentro de las motoneuronas vulnerables, las que inervan a los músculos axiales y proximales, en general, se afectan antes que las que inervan a los músculos distales y el diafragma. Esto tiene un reflejo topográfico en la médula, mostrando una vulnerabilidad diferencial en función del segmento medular. Por ejemplo, los contingentes de motoneuronas localizados en L1 y en la columna motora medial, encargados de inervar a los músculos proximales y axiales, están más afectados que los localizados en L5 y en la columna motora lateral, encargados de los músculos distales (Mentis et al., 2011). Aunque, el mecanismo subyacente a esta heterogeneidad aún no se conoce con exactitud, se han postulado varias hipótesis al respecto. Por un lado, puesto que las células Introducción 42 del asta dorsal espinal, respetadas, presentan mayores niveles de inclusión del exón 7 en los transcritos de SMN2 que la motoneuronas del asta ventral, es posible que entre los distintos contingentes de motoneuronas también varíe la eficiencia de este proceso y presente niveles variables de proteína completa (Ruggiu et al., 2012). No obstante, aún no se ha confirmado una inclusión diferencial entre distintos contingentes de motoneuronas ni su correlación con la patología. Por otro lado, es posible que exista una heterogeneidad en los niveles de ciertos ARNm y/o proteínas entre los distintos contingentes de motoneuronas y que, teniendo en cuenta la función de SMN en el metabolismo del ARN, puedan determinar la distinta vulnerabilidad. Experimentos realizados en nuestro laboratorio (Tejero, 2016; Tejero et al., 2016) han demostrado que durante el desarrollo postnatal de la NMJ existe una transición entre dos de las isoformas de sinaptotagmina (Syt) que actúan como sensor de calcio para la exocitosis en el terminal presináptico motor. Durante el periodo postnatal de maduración de la NMJ Syt-1 se regula a la baja y Syt-2 al alza, siendo esta última la isoforma relevante tras este periodo. Fisiológicamente la velocidad de este cambio varía temporalmente entre distintos músculos. Dado que los terminales motores en AME los niveles de Syt-2 están significativamente disminuidos en relación con los terminales controles (Tejero, 2016; Tejero et al., 2016), en los músculos donde Syt-1 desaparece más rápidamente se produce un gran déficit de ambos sensores de calcio que correlaciona con el déficit en la neurotransmisión en los músculos vulnerables. Por otro lado, no se conocen con exactitud los mecanismos subyacentes a la degeneración y muerte de las α-motoneuronas, aunque distintas líneas de investigación sugieren que es secundaria a fenómenos apoptóticos. Por un lado, un estudio de silenciamiento selectivo del gen Smn en las motoneuronas de C. elegans ha demostrado que la reducción en proteína Smn provoca la muerte de las mismas in vivo por fenómenos apoptóticos (Gallotta et al., 2016). En este sentido, SMN parece tener un efecto modulador en la apoptosis. Por ejemplo, la sobreexpresión de SMN in vivo en un modelo proapoptótico murino reduce los fenómenos de apoptosis en las neuronas del córtex (Kerr et al., 2000). En una serie de estudios recientes, Mentis y colaboradores demostraron que la muerte y degeneración motoneuronal en el modelo SMNΔ7 es secundaria a una mayor activación del factor proapoptótico p53 debida a su fosforilación. De hecho, se observa una correlación directa entre el grado de fosforilación de p53 y el grado de vulnerabilidad de la motoneurona (Simon et al., 2017). Aunque el mecanismo molecular de la Introducción 43 sobreactivación de p53 aún no se conoce con precisión, un estudio posterior mostró que era secundaria a una desregulación de la maduración de los ARNm de Mdm2 y Mdm4, sus principales proteínas reguladoras, debido a la menor formación de snRNP provocada por los niveles reducidos de SMN (Van Alstyne et al., 2018). De estos datos se deriva que la heterogeneidad en la supervivencia de las motoneuronas puede ser debida a defectos en el corte y empalme de ARNm fundamentales para ciertos contingentes. Por otro lado, distintos grupos han postulado que la muerte de las motoneuronas se produce por autofagia. En motoneuronas en cultivo, por ejemplo, existe un incremento de los factores autofágicos Beclina 2, LC3-II y p63, así como de la ubiquitinación de proteínas, y un menor aclaramiento de los autofagosomas (Garcera et al., 2013; Periyakaruppiah et al., 2016; Rodriguez-Muela et al., 2018). La inhibición farmacológica de la autofagia incrementa la supervivencia de las motoneuronas y la esperanza de vida en modelos de ratón (Periyakaruppiah et al., 2016; Piras et al., 2017; Rodriguez-Muela et al., 2018). 3.2. ¿Es la AME una enfermedad de la motoneurona inferior o una enfermedad del sistema motor? Aunque no se conoce con exactitud el impacto funcional que la muerte de las motoneuronas en la AME produce en el sistema motor, diversas evidencias señalan que la muerte de las motoneuronas no explica totalmente el fenotipo motor en la AME. Por ejemplo, aunque la restauración selectiva de SMN en las motoneuronas revierte tanto la muerte de éstas como los defectos sinápticos típicos de la enfermedad (ver más adelante), la función motora se recupera sólo moderadamente (Gogliotti et al., 2012; Martinez et al., 2012; McGovern et al., 2015; Fletcher et al., 2017). Además, estudios en modelos de ratón han mostrado que la restauración selectiva y simultanea de la expresión de SMN en las células gliales, motoneuronas y otras neuronas induce una mayor recuperación del fenotipo motor y supervivencia que cuando se restaura exclusivamente en las motoneuronas (Gavrilina et al., 2008; McGovern et al., 2015). Así mismo, la expresión selectiva de SMN en los mocitos solo mejora ligeramente la función motora y la supervivencia in vivo (Gogliotti et al., 2012). Introducción 44 En conjunto, estos y otros estudios demuestran que el déficit de SMN en células del sistema motor distintas a las neuronas motoras, como astrocitos (Rindt et al., 2015), células de Schwann (Hunter et al., 2014), neuronas sensoriales (Jablonka et al., 2006; Mentis et al., 2011) y miocitos (Gogliotti et al., 2012), influye en la severidad de la enfermedad, lo que hace necesario una mayor compresión del estado de estos circuitos en la AME 3.3. Patología de la NMJ La pérdida de motoneuronas en la AME viene precedida por alteraciones en la neurotransmisión (Kong et al., 2009; Ruiz et al., 2010). Los mecanismos que median la patología sináptica aún no se conocen en su totalidad. En los modelos de AME en ratones, la capacidad de las motoneuronas para inervar sus músculos diana no está alterada (Murray et al., 2008) y los terminales nerviosos son funcionales durante el desarrollo postnatal temprano (Ruiz et al., 2010), lo que sugiere que el fenotipo motor no es secundario a defectos en la sinaptogénesis, sino en la maduración y mantenimiento de la sinapsis. Conforme la maduración postnatal progresa, las NMJ deficientes en SMN desarrollan diversos defectos tanto estructurales y como funcionales. Sin embargo, de forma similar a lo que se produce en la médula, el grado de afectación de la sinapsis es heterogéneo, observándose en ciertos músculos una mayor vulnerabilidad, como en el transverso abdominal (TVA), que en otros, como el diafragma (Kariya et al., 2008; Ling et al., 2012; Tejero, 2016; Tejero et al., 2016). A continuación se describirán las alteraciones más importantes de las NMJ descritas en la AME. En los ratones deficientes en SMN del modelo SMNΔ7, el citoesqueleto presináptico presenta signos de retraso madurativo, como la ausencia de reorganización y ramificación de los microtúbulos (MT) y una menor arborización y persistencia de estructuras en lazo de los neurofilamentos (NF) en sus segmentos finales (Torres-Benito et al., 2011; Torres-Benito, 2012). Los microfilamentos también están afectados, con una disminución de la F-actina (Ackermann et al., 2013). Así mismo, se observa defectos madurativos en la placa terminal, como son una disminución del área, número de perforaciones y desarrollo de los pliegues postsinápticos, así como retraso en la transición de la subunidad embrionaria γ-AChR a la madura ε-AChR (Kariya et al., 2008). Aún se Introducción 45 desconocen los mecanismos que median este retraso madurativo y así como la posible función de SMN en este proceso. En estadíos tardíos, se observan también acúmulos anómalos de NF, que alteran la morfología del terminal (Cifuentes-Diaz et al., 2002), y denervación de numerosas fibras musculares (Ling et al., 2012). No obstante, aún es objeto de debate si estas alteraciones degenerativos son producto primario de la deficiencia de SMN o una consecuencia del estado patológico del terminal. Tampoco está claro si estas alteraciones contribuyen a los defectos en la neurotransmisión observados en los modelos animales. De los estudios electrofisiológicos realizados en preparaciones neuromusculares de modelos de ratón se extrae una conclusión clara, la deficiencia de SMN altera de forma importante la neurotransmisión en la NMJ. En estos modelos se ha demostrado que la amplitud y cinética de las respuestas postsináptica esta alterada (Kong et al., 2009; Ruiz et al., 2010). En el modelo SMNΔ7, por ejemplo, existe una disminución del contenido cuántico (QC; número de cuantos liberados por el terminal presináptico tras la llegada de un potencial de acción) (Kong et al., 2009; Ruiz et al., 2010; Tejero et al., 2016). Sin embargo, el origen de la disfunción sináptica aún no se conoce con precisión. La reducción del QC puede ser secundaria a una menor liberación de neurotransmisor por vesícula (tamaño cuántico), una menor probabilidad de liberación (pr) o un menor número de sitios activos de liberación (n). El estudio de las corrientes de placa en miniatura ha mostrado valores similares en los terminales motores controles y deficientes en SMN, lo que demuestra que el tamaño cuántico no está alterado en la AME (Kong et al., 2009). Por otro lado, aunque se han descrito disminuciones en la probabilidad de liberación en diferentes modelos AME (Kong et al., 2009; Ruiz et al., 2010; Ling et al., 2012), en nuestro laboratorio hemos constatado que, a concentraciones fisiológicas de calcio extracelular, la reducción de QC es secundaria a un menor número de sitios de liberación activos (Tejero, 2016). En este sentido, se ha descrito mediante microscopía electrónica un menor número de vesículas ancladas a la membrana en la membrana plasmática (Cifuentes-Diaz et al., 2002; Kong et al., 2009). También se ha descrito un menor número de vesículas sinápticas y zonas activas, así como una desorganización de estas, en los terminales motores AME (Torres-Benito et al., 2011, 2012; Torres-Benito, 2012). El mecanismo que media la disminución del número de sitios activos y el déficit funcional del terminal motor es todavía desconocido, aunque distintas evidencias sugieren que alteraciones tanto el estado de la maquinaria exocítica como el de la Introducción 46 homeostasis del calcio en el terminal pueden estar participando en este proceso. Para fundirse de forma sincrónica, las vesículas sinápticas deben sufrir un proceso de cebado y anclaje a las zonas activas del terminal. En modelos murinos y de pez cebra se ha descrito una disminución de proteínas SV2 en los terminales motores mutantes, especialmente de la isoforma SV2B, a las que se les ha atribuido una participación en la regulación del cebado de las vesículas (Tejero, 2016; Tejero et al., 2016, 2018). Además, existe una correlación entre el contenido en SV2B de la NMJ y la vulnerabilidad de los terminales de distintos músculos en la enfermedad. Otras de las funciones atribuidas a SV2 es la regulación de la endocitosis de Syt1 y Syt2 y en la regulación de la concentración de Ca2+ citosólico en el terminal. En esta línea, distintas evidencias han sugerido la coexistencia de una alteración de la homeostasis del calcio en este compartimento. Hipótesis y Objetivos 53 En neuronas en cultivo SMN se transporta por el axón en forma de gránulos que contienen ARNm y proteínas de unión a ARNm (Fallini et al., 2011, 2014; Donlin-Asp et al., 2017; Price et al., 2018). Así mismo, se ha demostrado la presencia de SMN en las terminaciones presinápticas de la NMJ durante el periodo perinatal (Dombert et al., 2014). Nuestra hipótesis de partida es que durante el periodo de maduración sináptica se produce traducción local en el terminal presináptico y que SMN participa en este proceso. Así mismo, postulamos que la sobreexpresión de SMN2 puede dar lugar a la acumulación de proteína SMN en los terminales, cuya persistencia en el tiempo puede verse aumentada por las alteraciones citoesqueléticas que se producen tanto en los axones cómo en los terminales motores en AME. Por otro lado, postulamos que las alteraciones funcionales en los terminales motores en los modelos de AME, como son el déficit en la neurotransmisión y la alteración en el reciclado de las vesículas sinápticas (Kariya et al., 2008; Murray et al., 2008; Kong et al., 2009; Ruiz et al., 2010; Ling et al., 2012), se producen en el contexto de la pérdida en la homeostasis del calcio y que la mitocondria participa en este proceso. También proponemos que el déficit en la neurotransmisión puede ser aminorado mediante potenciadores farmacológicos de los canales de calcio dependientes de potencial. Partiendo de las hipótesis expuestas previamente, en el presente trabajo establecimos los siguientes objetivos generales: 1. Determinar la organización de SMN y su posible asociación con el citoesqueleto y con elementos de la maquinaria de traducción local en los terminales presinápticos motores durante la maduración postnatal sináptica en ratones silvestres y en modelos de AME. 2. Investigar los posibles mecanismos implicados en el déficit funcional de los terminales presinápticos motores 3. Investigar el posible efecto de un potenciador de la neurotransmisión en AME. Hipótesis y Objetivos 54 Para abordar estos objetivos, establecimos los siguientes objetivos específicos: 1.1. Definir las características de los granos de SMN en axones y terminales presinápticos motores en ratones silvestres y modelos de AME. 1.2. Determinar el curso temporal de la expresión de SMN en axones y terminales presinápticos motores durante la maduración postnatal. 1.3. Determinar la relación entre el citoesqueleto y los granos de SMN en axones y terminales presinápticos motores. 1.4. Determinar el impacto de la sobreexpresión de SMN en los modelos murinos AME. 1.5. Estudio de la posible relación de SMN con elementos de la maquinaria de traducción local en el terminal nervioso motor durante la maduración postnatal. 2.1. Determinar la afectación de la exo- y endocitosis en el modelo de AME Taiwanés y la posible implicación de la mitocondria en el déficit funcional del terminal. 2.2. Investigar los mecanismos que median el déficit en el incremento de calcio en la matriz mitocondrial y su posible implicación funcional en los terminales presinápticos motores en AME. 3. Determinar el efecto sobre la neurotransmisión de un modificador de los canales de calcio dependiente de potencial en ratones controles y deficientes en SMN. Materiales y Métodos Materiales y Métodos 56 1. Modelos animales Para este trabajo se han utilizado 4 modelos murinos con base genética en la cepa FVB/N, Por un lado, ratones silvestres para el estudio de las características fisiológicas del citoesqueleto y de la proteína SMN (Fig. 10A) y, por otro, tres modelos de AME; el modelo “SMA∆7” (Fig. 10B, panel izquierdo), el modelo “Taiwanés” (Fig. 10B, panel derecho) y el modelo “Taiwanés/SypHy”. Los ratones se mantuvieron en condiciones estándares (12:12 horas luz:oscuridad y alimentación ad libitum) en el animalario de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación vigente según las directrices del Consejo Europeo sobre Cuidado de Animales de Laboratorio. Figura 10. Modelos murinos. A. Ejemplos representativos de ratones silvestres a distintas edades postnatales (P3, P6, P8 y P10). B. Diferencias morfológicas a P9 entre ratones controles y mutantes en el modelo murino SMA∆7 (izquierda) y Taiwanés (derecha). Nótese que en modelo Taiwanés los ratones mutantes pueden presentar un fenotipo severo o leve. P3 P8 P6 P10 A Control Mutante Control Leve Severo Modelo SMAΔ7 Modelo Taiwanés B Materiales y Métodos 57 1.1. Características de los modelos murinos de AME 1.1.1. Modelo SMAΔ7 El modelo SMA∆7 fue desarrollado por Le y colaboradores (Le et al., 2005) y fue cedido a nuestro laboratorio por el Prof. Arthur Burghes (Department of Molecular Genetics, College of Biological Sciences, The Ohio State University, Columbus, OH, USA) y por el Prof. Jordi Calderó (Departamento de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Universidad de Lleida e Instituto de Investigación Biomédica de Lleida). El modelo se caracteriza por tener interrumpido el gen Smn murino a nivel del exón dos y expresar dos transgenes humanos en homocigosis: SMN2 (dos copias) y SMN∆7 (seis copias). El transgén SMN∆7 produce exclusivamente proteína SMN truncada La colonia se mantuvo mediante cruces de parejas portadoras de Smn en heterocigosis (Smn+/-, SMN2+/+, SMN∆7+/+; Fig. 11). Las camadas obtenidas presentaron tres genotipos (Tabla II): animales controles, mutantes y heterocigotos. Estos últimos se emplearon para el mantenimiento de la línea. Para los experimentos se emplearon ratones controles y mutantes con una edad comprendida entre los 9 y los 11 días postnatales (P9-11). La identificación de los mismos se realizó mediante PCR (ver más adelante). Figura 11. Esquema de cruces y destino de los ratones en el modelo SMA∆7. Experimento Mutante; 25% Control; 25% Heterocigoto; 50% Heterocigoto Heterocigoto X Mantenimiento de la línea Materiales y Métodos 58 Tabla II. Genotipos y destino de los ratones del modelo SMA∆7. 1.1.2. Modelo Taiwanés El modelo de AME Taiwanés fue desarrollado por Hsieh-Li y colaboradores (Hsieh-Li et al., 2000) y fue adquirido directamente a los laboratorios Jackson (The Jackson Laboratory, Ref.: #005058). Se caracteriza por presentar una mutación en el exón siete del gen Smn murino que hace inviable la traducción de la proteína murina y contener el transgén humano SMN2. Una característica especialmente interesante del modelo es que los animales nulos para el gen Smn muestran diferente severidad fenotípica. Los animales hemicigotos para SMN2 presentan dos fenotipos (Fig. 10B). Severo, no superan los 2 g de peso corporal, presentan una importante afectación motora y sobreviven menos de 10 días. Leve, con menor afectación en peso, mejor función motora y con una supervivencia máxima menor a 15 días (véase Resultados). Por otro lado, los homocigotos positivos para SMN2, con cuatro copias del transgén, son viables y fértiles, aunque desarrollan necrosis de la cola y las orejas. Nombre Gen Smn Transgén SMN2 Transgén SMNΔ7 Destino Heterocigoto +/- +/+ +/+ Mantenimiento de la línea Mutante -/- +/+ +/+ Experimento Control +/+ +/+ +/+ Experimento Materiales y Métodos 59 En la Figura 12 se muestra la sistemática de cruce y selección de animales experimentales y de mantenimiento. Los animales de experimentación se obtuvieron mediante cruces de progenitores heterocigotos para Smn (Smn+/-, SMN2o/o) con homocigotos negativos para Smn y positivos para SMN2 (Smn-/-, SMN2+/+), llamados sin cola. Así, se obtuvieron animales controles (Smn+/-, SMN2+/o) y mutantes (Smn-/-, SMN2+/o) (Tabla III). Figura 12. Esquema de cruces y destino de los ratones en el modelo Taiwanés. Para el mantenimiento de la línea, se realizaron cruces de animales controles (Smn+/-, SMN2+/o; Fig. 12). Así se obtuvieron, entre otros (Tabla III), hetrocigotos para Smn (Smn+/-, SMN2o/o), identificados mediante PCR de ambos genes, y homocigotos negativos para Smn y positivos para SMN2 (Smn-/-, SMN2+/+), identificados fenotípicamente por la necrosis de la cola y las orejas. Mutante; 50% Control; 50% Heterocigoto s Sin cola X Experimento Control Control X Heterocigotos 6,66 % Sin Cola 6,66 % Otros Genotipos; 86,66 % Sacrificio CRUCE EXPERIMENTAL CRUCE MANTENIMIENTO Materiales y Métodos 60 Tabla III. Genotipos y destino de los ratones del modelo Taiwanés. 1.1.3. Modelo Taiwanés/SypHy En una serie de experimentos se empleó una variante del modelo Taiwanés, la línea Taiwanés/SypHy. Este modelo se obtuvo mediante el cruce de la línea Taiwanés y la línea SypHy, generada en nuestro laboratorio (Cano, 2014), que se caracteriza por expresar el transgén SypHy. Este transgén codifica a la proteína sinaptofisina fusionada en su dominio intravesicular a la fluorina, una GFP supereclíptica dependiente de pH. Las fluorinas fluorecen en ambientes con un pH > 6 (Fig. 13) y se apaga en ambientes de mayor acidez (Sankaranarayanan et al., 2000). Esta propiedad permite realizar registros dinámicos de la actividad exo-endocítica en la sinapsis (Tabares et al., 2007; López- Manzaneda et al., 2021). Nombre Gen Smn Transgén SMN2 Destino Sin cola -/- +/+ Cruce experimental Heterocigoto +/- 0/0 Cruce experimental Otros genotipos +/+ +/+ Sacrifico +/- +/+ Sacrificio +/+ +/0 Sacrificio +/- +/0 Sacrificio -/- +/0 Sacrificio +/+ 0/0 Sacrificio -/- 0/0 No nace Nombre Gen Smn Transgén SMN2 Destino Mutante -/- +/0 Experimento Control +/- +/0 Experimento y cruce de mantenimiento Crías del Cruce Experimental Crías del Cruce Mantenimiento Materiales y Métodos 61 Figura 13. SypHy como indicador de la exoendocitosis en tiempo real. El ambiente ácido propio del interior de las vesículas sinápticas ( 4) impide que la pHluorina fluorezca, pero al producirse la exocitosis (1) el interior de la vesícula se expone al pH del medio extracelular ( 7.4) y el flouróforo se enciende. Al endocitarse SypHy (2), la nueva vesícula vuelve a acidificarse (3) y la fluorescencia se apaga. El encendido y apagado de SypHy indican, por tanto, la exocitosis y la endocitosis, respectivamente, y permite estudiar en tiempo real ambos procesos. Nótese que existe una pequeña cantidad de SypHy en la membrana plasmática, lo que permite, además, una mejor identificación al microscopio de los terminales en reposo. Syphy: Sinaptofisina-fluorina, ACh: Acetilcolina, H+: Protones. Adaptada de Sankaranarayanan et al., 2000. 1.2. Genotipado de las líneas experimentales El genotipado de los animales de experimentación, así como el de los animales de mantenimiento de las líneas, se realizó mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de biopsias digitales o caudales. Las resecciones se emplearon para la identificación posterior de los animales, siguiendo el código indicado en la Figura 14. 1. Exocitosis 2. Endocitosis 3. Reacidificación y recarga vesicular SypHy encendida (pH > 6) SypHy apagada (pH < 6) Sinaptofisina endógena ACh H+ Bomba de H + Intercambiador ACh-H + Materiales y Métodos 62 Figura 14. Código de identificación de los ratones. La biopsia de los dedos de los miembros anteriores y el quinto dedo del pie derecho indican las unidades. El resto de dedos indican las decenas. El extremo distal de la cola sirve de unidad nula. Como ejemplo, un código 66 vendría indicado por la exéresis del segundo dedo de la mano izquierda (valor 6) y el mismo dedo del pie izquierdo (valor 60). 1.2.1. Protocolo de extracción de ADN Tras la resección del tejido, la muestra se centrifugó con una centrífuga de mesa (Eppendorf, modelo 5424) a 14000 rpm durante un minuto a temperatura ambiente. A continuación, se le añadió 50 µl de solución de lisis alcalina (25 mM NaOH; 0,2 mM EDTA) y se sometió a un choque térmico en un termobloque (Thermomixer Compact, Ref. 05-400-200, EppendorfTM) a una frecuencia de mezcla de 1000 rpm y 65 ºC durante 30 minutos seguidos de otros 18 minutos a 98 ºC, lo que permitió la rotura y disgregación del tejido. El tubo conteniendo la muestra lisada se colocó en hielo durante un minuto para evitar la evaporación y se añadió 50 µl de solución tampón (40 mM Tris-HCl, pH 4) para neutralizar la alcalinidad. Finalmente, las muestras se centrifugaron de nuevo a 14000 rpm durante un minuto y se recolectó 50 µl de sobrenadante de cada tubo, rico en material genético, conservándose a 4 ºC. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 Materiales y Métodos 69 2. Preparaciones neuromusculares y espinales 2.1. Materiales y soluciones de extracción y registro Para las disecciones se empleó un microscopio estereoscópico (Nikon SMZ1500) (Fig. 16B) y el siguiente material quirúrgico (Fine Science Tools; Fig. 16A): o Dos pinzas Dumont Nº 3 (Ref. 11231-30) o Dos pinzas Dumont Nº 55 (Ref. 11255-20) o Una pinza Dumont Nº 5SF (Ref. 11252-00) o Tijeras (Ref. 14060-11) o Microtijeras (Ref. 15019-10) Durante la disección y extracción, las preparaciones se mantuvieron en todo momento bañadas por solución fisiológica extracelular (SFE) estándar (Tabla IV) con una osmolaridad comprendida entre 290-310 mOs/Kg. La solución estuvo constantemente gaseada con carbógeno (5% CO2, 95% O2) para mantener el pH en torno a valores fisiológicos (~7,35). En ciertos tipos de experimentos, la composición de la SFE se varió como se muestra en la Tabla IV. Figura 16. Material empleado en las disecciones neuromusculares. A. Instrumental de disección (de izquierda a derecha): pinzas Nº 3, pinzas Nº 55, pinzas Nº 5SF, tijera y microtijera. B. Microscopio estereoscópico. A B Materiales y Métodos 70 SFE sin calcio añadido SFE estándar Nombre 135 135 [NaCl] 12 12 [NaHCO3] 5 5 [KCl] 1 1 [MgCl2] 0 2 [CaCl2] 0,330 0,330 [Na2HPO4] Inmunohistoquímica FISH Imagen dinámica Inmunohistoquímica FISH Inmunotransferencia Electrofisiología Imagen dinámica Técnica Tabla IV. Composición y uso de las soluciones fisiológicas empleadas. Las concentraciones de lo compuestos se encuentran en mM. Materiales y Métodos 71 2.2. Músculo elevador largo de la oreja El músculo elevador largo de la oreja (Levator auris longus, LAL) es un músculo plano formado por fibras esqueléticas de tipo rápido. Es un músculo bilateral situado en la parte posterior del cuello, siendo el más externo de los músculos del cuello, insertándose medialmente a nivel de la línea media cervical y, lateralmente, a nivel de la base de cada pabellón auricular en su borde medial y medio-caudal. Está inervado por la rama auricular posterior del nervio facial (VII), la cual inicia su recorrido en el músculo por su borde caudal. Interviene fundamentalmente en la movilidad auricular, permitiendo la elevación de la oreja. Se divide morfológicamente en dos regiones, una rostral y otra caudal. La afectación del músculo en el modelo murino de la AME varía, siendo más resistente la región rostral y más vulnerable la región caudal (Ling et al., 2012). Para la disección del músculo, el ratón se sacrificó mediante exposición a CO2 en una cámara cerrada tras lo cual se desangró mediante sección carotídea y masaje cardíaco. Posteriormente, se inmovilizó en decúbito ventral y se afeitó el cuello, desde el cráneo hasta el tórax. La disección comenzó con una sección transversal a nivel del cuello, lo más cercano al tórax posible para evitar dañar la inserción de los músculos craneales. Una vez contactada la columna vertebral se amplió el corte a ambos lados, para aislar la musculatura craneal del tórax, y se separó del hueso la musculatura del cuello y cráneo avanzando en sentido rostral. Finalmente, se seccionó lateralmente a cada pabellón auricular y transversalmente a la altura de la línea interocular, extrayéndose el bloque de músculos, junto con la piel. El tejido extraído se colocó en una placa de Petri con la base cubierta de elastómero de silicona (Sylgar), de forma que la piel quedase en la base de la placa, se fijó mediante alfileres de 0,2 mm de diámetro, se añadió solución fisiológica extracelular y se procedió a la disección por planos del músculo con ayuda del microscopio estereoscópico. Tras la retirada cuidadosa de la piel, respetando las regiones próximas a los pabellones auriculares, quedó un bloque central opaco donde se encuentra la línea media y las inserciones mediales de los músculos de ambos lados (Fig. 17; 1), dos masas laterales opacas que contienen la piel de los pabellones auriculares y las inserciones laterales de los músculos (Fig. 17; 2), y los músculos, translúcidos, entre los que se encuentra el LAL derecho e izquierdo (Fig. 17; 3). Materiales y Métodos 72 Figura 17. Disección bilateral del músculo LAL. A. Esquema del protocolo de disección del LAL y los distintos pasos a seguir en la disección por planos. B. Visión de ambos LAL mediante microscopía estereoscópica. Se ha retirado la piel y la musculatura profunda para su correcta identificación y visualización. La preparación cuenta con una masa central (1) que corresponde a las inserciones mediales de la musculatura posterior del cuello, dos masas laterales (2), que corresponde con piel y parte del cartílago auricular, y ambos músculos LAL (3). Nótense las regiones rostral (a) y caudal (b), así como la llegada del nervio facial al músculo (c). Los distintos músculos en la región 3 se pudieron identificar por la dirección de sus fibras, la situación de sus inserciones y el plano en el que se situaban. Posteriormente, se pasó a diseccionar y retirar sucesivamente los músculos interescutular (Interscutularis), abductor largo de la oreja (Abductor auris longus) y auricular superior (Auricularis superior). Una vez aislado el LAL, se limpió bien de tejido conectivo y de tejido adiposo, teniendo especial precaución con no dañar el nervio. 2.3. Músculo transverso del abdomen El músculo transverso del abdomen (Transversus abdominis; TVA) es un músculo bilateral plano compuesto mayoritariamente por fibras esqueléticas de tipo lento y que está especialmente afectado en la AME. Está situado en el plano más profundo de la región ventral de la pared abdominal, insertándose lateralmente en el borde inferior de la parrilla costal y medialmente en la línea alba. Está inervado por los nervios intercostales 1 3 2 2 3 a b c Materiales y Métodos 73 procedentes de T7-T11, así como por los nervios iliohipogástrico e ilioinguinal (procedentes de L1), situándose los terminales nerviosos en el tercio muscular más cercano al reborde costal. Para la disección del músculo, el ratón se sacrificó mediante decapitación y se desangró mediante masaje cardíaco. Posteriormente, se inmovilizó en decúbito dorsal y se retiró la piel abdominal. Se diseccionó toda la musculatura abdominal, retirando las vísceras abdominales y el diafragma, así como la caja torácica, mediante corte de las costillas en dirección paravertebral. El bloque de caja torácica y musculatura abdominal se colocó en una placa de Petri con Sylgar (Fig. 18), se añadió solución fisiológica extracelular y se fijó mediante alfileres de 0,2 mm. La disección por planos se realizó con ayuda de un microscopio estereoscópico. Ésta se inició con un corte en la musculatura superficial de la parrilla costal a la altura del tercio medio del esternón, tras lo cual se prolongó el corte oblicuamente hasta el reborde caudal de la parrilla costal. Una vez hecho esto, se continuó el corte en dirección paralela a los nervios intercostales hasta alcanzar la arteria hipogástrica. Finalmente, se terminó de retirar el plano muscular superficial con un corte paralelo a la línea alba hasta el punto donde se realizó la incisión inicial. Así, se dejó al descubierto una superficie triangular en la que se encuentra el TVA (Fig. 18). Caudalmente encontramos el músculo oblicuo interno del abdomen (OIA), que se puede diferenciar del TVA por las trayectorias de las fibras musculares (transversales y craneocaudales que se entrecruzan y transversales paralelas, respectivamente). Finalmente se limpió el músculo de tejido conectivo y adiposo. Para la realización de registros electrofisiológicos y de imagen dinámica en el TVA, tras la disección y limpieza del tejido, se identificó, aisló y limpió la rama intercostal que lo inerva. Finalmente, el músculo se inmovilizó en una cámara de registro de metacrilato con un volumen de 3 ml, con base de Sylgar y un sistema intercambiador de solución. Materiales y Métodos 74 Figura 18. Disección del músculo TVA. Visión del TVA izquierdo (área señalada) a través del microscopio estereoscópico. Se ha retirado la piel y la musculatura superficial su correcta identificación visualización. Nótese el nervio intercostal que inerva la mayoría de las fibras del músculo (*). 2.4. Médula espinal Para la disección de médula espinal, los ratones se sacrificaron mediante decapitación y se desangraron mediante masaje cardíaco. Posteriormente, se inmovilizaron en decúbito dorsal y se retiró la piel abdominal. Se retiró toda la musculatura abdominal, vísceras y diafragma, así como la caja torácica, mediante corte de las costillas en dirección paravertebral. En la columna vertebral se realizaron dos cortes paralelos a ambos lados del cuerpo vertebral y se prolongaron caudalmente hasta la región lumbar, concretamente hasta la zona de inserción del psoas. Así, se pudo retirar la cara ventral de la columna vertebral dejando a la vista el canal medular y la medula espinal. En función del experimento a realizar, se siguieron dos procedimientos de extracción de médula. Por un lado, para la obtención de muestras para inmunotransferencia, se seccionó la medula a nivel de los segmentos intervertebrales C7-T1 y L2-L3 y se extrajo cuidadosamente la medula torácico-lumbar. La muestra se transfirió a una placa de Petri con Sylgar, se añadió solución fisiológica extracelular y se fijó mediante alfileres de 0,2 mm a nivel del extremo rostral. Posteriormente, se eliminaron cuidadosamente las * Materiales y Métodos 75 meninges, las raíces dorsales y la porción rostral que había sido fijada con pines. Finalmente, las muestras fueron sometidas a un proceso de extracción de proteínas (ver más adelante, Inmunotransferencia) Por otro lado, para la obtención de tejido para inmunohistoquímica, se realizaron cortes transversales a nivel de los segmentos intervertebrales T13-L1 y L2-L3 y se extrajeron los segmentos L1-L2 de medula espinal. Una vez extraída, se inició la fijación del tejido (ver más adelante, Inmunohistoquímica). Materiales y Métodos 76 3. Inmunohistoquímica 3.1. Preparaciones neuromusculares Mediante inmunofluorescencia se estudió la expresión y distribución de las proteínas citoesqueléticas, SMN y proteínas relacionadas con el proceso de traducción local en los axones y terminales sinápticos motores presentes en los músculos TVA y LAL. El protocolo de marcaje inmunohistoquímico (IHQ) fue el siguiente: 1. Tras la disección del músculo, la preparación se mantuvo durante 30 minutos en solución fisiológica extracelular con carbógeno (95% O2: 5% CO2). A continuación, se cambió la solución por solución fisiológica sin calcio añadido, para evitar la exocitosis por parte del tejido nervioso, y se mantuvo en ésta 10 minutos. 2. Fijación por inmersión durante 90 minutos con paraformaldehído (PFA) al 4% preparado en PBS, manteniéndose a 4 ºC. Después, se lavó el tejido 3 veces con PBS y se conservó en esta solución a 4 ºC hasta el día siguiente. 3. Los músculos fueron colocados en una placa multipocillos y se incubaron en PBS con glicina 0,1 M durante 30 minutos. La glicina se une a los grupos aldehídos generados por la fijación con PFA, evitando así la aparición de autofluorescencia por las interacciones alhdehído-proteína. 4. Permeabilización de las preparaciones mediante lavados seriados con Tritón X-100 en PBS (PBS-T) al 1% (v/v), primero dos lavados de 5 minutos, luego otros dos de 10 minutos y, finalmente, otros dos de 30 minutos. 4. Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos para los anticuerpos mediante incubación con BSA al 5% (m/v) en PBS-T al 1%. 5. Incubación con los anticuerpos primarios (Tabla V) diluidos en una disolución de BSA al 2,5% en PBS-T al 1%. Se mantuvo incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente y, posteriormente, durante toda la noche a 4ºC. 6. Tras 30 minutos a temperatura ambiente, la preparación se lavó con PBS-T al 0,05%, realizando primero tres lavados rápidos y después cinco lavados de 10 minutos. Materiales y Métodos 77 7. Incubación con el el anticuerpo secundario (Tabla VI) diluido en una disolución de BSA al 5% en PBS-T al 0,05% durante una hora a temperatura ambiente. Además, se añadieron 0,5 µl/ml de bungarotoxina-rodamina (BTX-rho; Sigma-Aldrich, Ref. T0195) que se une a los receptores nicotínicos de acetilcolina y, por tanto, marca la placa postsináptica. A partir de este momento, las preparaciones se cubrieron con papel de aluminio para protegerlas de la exposición directa a la luz. 8. Lavados con PBS-T al 0,05%, primero durante 30 minutos y después se realizaron 6 de 10 minutos cada uno. 9. Finalmente, en una habitación oscura o con poca luz, el músculo se montó en un portaobjetos con ayuda de un microscopio estereoscópico. Se añadieron unos 10-15 µl de medio de montaje Slowfade (Invitrogen; Ref. S36936), se cubrió el músculo con un portaobjeto y se sellaron los bordes con laca de uñas. Todas las preparaciones se conservaron en cajas opacas a 4 ºC. 3.2. Médula espinal El proceso de fijación, procesamiento y tinción inmunohistoquímica de los segmentos lumbares (L1-L2) de las médulas espinales se llevó a cabo siguiendo el protocolo que se detalla a continuación. 3.2.1. Criopreservación, criogenización y procesamiento de las muestras Inmediatamente después de extracción de la región lumbar de la médula espinal, se procedió a su fijación por inmersión en PFA al 4% preparado en PBS, manteniéndose a 4 ºC durante 4-6 h. Después, se lavó el tejido 3 veces con PBS y se dejó en esta solución a 4 ºC. Entre las 24-48 h posteriores, las médulas se incubaron en PBS con sacarosa al 30% (m/v) a 4 ºC durante 48-72 h para criopreservar el tejido. Posteriormente, las médulas fueron criogenizadas en Tissue-Tek® OCTTM (Ref. 4583, Sakura Finetek) mediante inmersión en isopentano ultrafrío por contacto con N2 líquido. Los bloques resultantes se conservaron a –80 ºC hasta su procesado posterior en el criostato (Modelo HM 525, Microm International). Se realizaron cortes transversales secuenciales de 20 µm de espesor en los segmentos L1-L2 y se transfirieron series de 10 cortes a 10 portas. Los portaobjetos se conservaron a –80 ºC hasta su tratamiento IHQ. Materiales y Métodos 78 3.2.2. Tratamiento inmunohistoquímico Para el marcaje IHQ de las proteínas de interés, todos los pasos se realizaron en una cámara húmeda. Tras el marcaje, las preparaciones se conservaron a 4 ºC. El protocolo empleado fue el siguiente: 1. Permeabilización de los cortes mediante incubación con PBST al 0,5%. Se realizaron 3 incubaciones de 10 minutos cada una. Posteriormente, se realizaron 3 lavados de 10 minutos con PBS. 2. Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos mediante incubación con PBST 0.5% BSA 5% durante 1h a temperatura ambiente. 3. Incubación durante toda la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario (Tabla V) diluido en solución de bloqueo 4. Realización de 3 lavados de 10 minutos con PBS. 5. Incubación durante 2 h en oscuridad y a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario diluido (1:500) en PBST 0,05% y BSA 2,5%. Posteriormente, se realizaron 3 lavados de 10 minutos con PBS. 6. Finalmente, se realizó un lavado rápido de los cortes con agua destilada, se dejó secar, se añadió medio de montaje y se cubrieron y sellaron las preparaciones. Materiales y Métodos 85 5. Hibridación in situ La técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) se llevó a cabo en preparaciones neuromusculares del músculo TVA procedente de ratones silvestres a P6. Simultáneamente, se llevó a cabo marcaje inmunohistoquímico complementario para identificar los axones y las uniones neuromusculares. La técnica FISH empleada en este trabajo consiste en la hibridación del ARN de interés con una sonda de oligonucleótidos específica de tipo LNA (ácido nucleico bloqueado), conjugada con el péptido digoxigenina (DIG) (Fig. 20). Una vez realizada la hibridación, el proceso seguido fue el de una inmunohistoquímica tradicional, siendo la proteína objetivo el péptido DIG. El protocolo empleado se expone a continuación. Figura 20. Esquema simplificado de la técnica FISH de tipo LNA. El ARNm en su estado nativo no es reconocible por la sonda debido a su asociación con una RBP (1). Por ello, debe tratarse el tejido con una proteinasa que desenmascare el transcrito (2). Así, el ARNm puede ser reconocido por la sonda (3) y puede iniciarse un protocolo de identificación de la sonda por IHQ o ICQ contra el péptido DIG (4-6). 1. Tras la disección de la preparación neuromuscular, ésta se mantuvo durante 30 minutos en solución fisiológica extracelular con carbógeno (95% O2: 5% CO2). A continuación, se cambió la solución por solución fisiológica externa sin calcio añadido durante 10 minutos. Materiales y Métodos 86 2. El tejido se fijó por inmersión durante 90 minutos en solución fijadora periodato-lisina- paraformaldéhido (PLP; tampón de fosfato 50 mM pH 7,4, NaIO4 10 mM, lisina 75 mM, PFA 4%), manteniéndose a 4 ºC. Debido a la potencial degradación del ARN presente en las preparaciones por acción de ARNasas exógenas, a partir de este momento todo el material empleado fue tratado con solución descontaminante RNase Away® (Ref. 83913, Sigma Aldrich), o bien habían sido tratado por el fabricante para eliminar dichas enzimas, y las manipulaciones de los reactivos y preparaciones se realizaron en ambientes libres de ARNasa (cabina de flujo laminar, incubadora exclusiva para experimentos de ARN, etc.). Después, se lavó el tejido 3 veces con PBS y se permeabilizó con PBS-T al 1% durante 90 minutos a temperatura ambiente. 3. Dado que los ARNm están enmascarados por proteínas de unión a ARNm, fue necesario realizar una digestión del tejido con proteasas para hacer accesibles los ARNm dianas. Por ello, para la detección de transcritos en las uniones neuromusculares, las preparaciones se incubaron con proteinasa K en PBST a una dilución final de 2 mg / ml durante 15 minutos a 37 °C. 4. Nueva fijación con PLP durante 20 minutos a temperatura ambiente y lavado con PBST al 0,1% durante 20 min. 5. Prehibridación para evitar uniones inespecíficas de la sonda de ARN. Para ello, la preparación se incubó durante 3 horas en tampón de hibridación HM (formamida 50%, tampón salino SSC de citrato de sodio 5X, triton-X 0,1%, ácido cítrico 9,2 mM, heparina 50 μg/ml, ARNt de E.coli 500 μg/ml) a la temperatura de hibridación (40 ºC). 6. Incubación con la sonda contra 3'-UTR del transcrito de β-actina (Exiqon), diluida en HM a una concentración final de 40 nM, durante la noche a 40 ºC. 7. Los músculos se transfirieron a una solución de SSC 2X con Triton-X 100 (SSCT) al 0.1% (v/v) mediante cuatro incubaciones sucesivas en HM / SSCT 2X (75% / 25%; 50% / 50%; 25% / 75%; 0% / 100%) de 15 minutos cada una y luego se lavaron con SSCT 0,2X durante 1 hora. Materiales y Métodos 87 8. El mismo proceso se siguió para transferir a PBST 0.1%, con cuatro incubaciones graduadas sucesivas en SSCT 0,2X / PBST 0.1% (75% / 25%; 50% / 50%; 25% / 75%; 0% / 100%) de 15 minutos cada una. Posteriormente, se realizó un marcaje inmunohistoquímico contra la proteína tau y el péptido DIG usando el protocolo estándar descrito anteriormente con modificaciones menores: 9. Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos mediante incubación en PBS-T al 0,1% con suero de cabra al 10% (v/v) y BSA al 5% (v/v) durante 3 horas a temperatura ambiente. 10. Incubación con los anticuerpos primarios, diluidos en solución de bloqueo, durante 30 minutos a temperatura ambiente y, posteriormente, toda la noche a 4°C. Posteriormente, se realizaron tres lavados con PBST al 0,1% de 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. 11. Incubación con los anticuerpos secundarios, diluidos en solución de bloqueo con BSA al 2,5% (v/v) durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizaron tres lavados con PBST al 0,1% de 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. 12. Finalmente, en una habitación oscura o con poca luz, el músculo se montó en un portaobjetos con ayuda de un microscopio estereoscópico. Se añadieron unos 10-15 µl de medio de montaje Aqua Poly / Mount (Polysciences, Ref. 18 606) para cubrir el músculo y se selló la preparación con un cubreobjetos. Todas las preparaciones se conservaron en cajas opacas a 4 ºC. Materiales y Métodos 88 6. Registros Electrofisiológicos Los experimentos de registro intracelular mediante microelectrodos de vidrio se realizaron en el músculo TVA de ratones controles y mutantes Taiwaneses con edades comprendidas entre los 7-11 días postnatales. Todos los registros se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22-25 ºC). 6.1. Dispositivo experimental Los registros electrofisiológicos se llevaron a cabo los siguientes elementos: ▪ Microscopio de transmisión directa (Olympus, modelo BX50WI; Fig. 21A, 1) ▪ Cámarita de registro ▪ Sistema de intercambio de soluciones ▪ Sistema de gaseo de soluciones con carbógeno (5% CO2, 95% O2) ▪ Mesa antivibratoria (Newport; Fig. 21A, 4) ▪ Jaula de Faraday ▪ Electrodo de succión para la estimulación del nervio (Fig. 21B) ▪ Electrodos de registro (Fig. 21A, 2) ▪ Micromanipulador (Narishige, modelo MHV-3 (Fig. 21A, 5) ▪ Estimulador de pulsos aislados (AM-Systems, modelo 2100 (Fig. 21A, 6) ▪ Amplificador de registro intracelular (Npi electronic GmbH, modelo TEC-05X; Fig. 21A, 7) ▪ Interfase (PowerLab 4SP; Fig. 21A, 8) ▪ Estirador de vidrio horizontal (Sutter, modelo P-97; Fig. 21C) ▪ Ordenador y software Chart 5 para la adquisición y monitorización de señales (ADInstruments; Fig. 22) Materiales y Métodos 89 Figura 21. Elementos del dispositivo experimental empleado en los registros electrofisiológicos. A. Visión general del dispositivo experimental y los dispositivos electrónicos que muestra el microscopio de transmisión directa Olympus BX50WI (1), los electrodos de registro (2a y (2b) y la situación del electrodo de succión del nervio (3), la mesa antivibratoria (4), el micromanipulador (5), estimulador de pulsos aislados (6), amplificador (7) e interfase (8). Imágenes 6-8 tomadas de www.a-msystems.com , www.npielectronic.de y AD Instruments, respectivamente. B. Detalle del electrodo de succión. C. Estirador de vidrio horizontal P-97. Tomada de www.sutter.com. A B C 1 2a 2b 3 4 5 6 7 8 Materiales y Métodos 90 6.2. Procedimiento experimental Tras la disección del músculo TVA (ver punto 2.2) junto con el nervio intercostal que lo inerva y se trasladó la preparación neuromuscular a la cámara de registro con solución fisiológica. El nervio se estimuló mediante un electrodo de succión conectado a un estimulador de pulsos aislado mediante un cable coaxial. El electrodo de succión (Fig. 21B) se compone de dos hilos de plata clorurados (Ag-AgCl), que actúan como cátodo y ánodo para la estimulación del nervio. El cátodo se introdujo en un tubo de polietileno de aproximadamente 2 mm de diámetro interno que sirvió para atrapar el nervio. En el exterior del mismo tubo se enrolló el ánodo, teniendo especial cuidado que llegase al extremo final del tubo, en contacto con la solución de registro. Este dispositivo se montó sobre un imán que permitió su fijación a la pletina del microscopio y se acopló a un sistema de succión, compuesto por una jeringa, un tubo de polietileno y una llave de tres pasos. Las micropipetas se fabricaron a partir de capilares de borosilicato con filamento incorporado (A-M Systems, diámetro externo: 1 mm, diámetro interno 0,75 mm) con un estirador horizontal configurado (Fig. 21C) con los siguientes parámetros:  Calor: 540-730  Velocidad 80  Fuerza de estirado: 200  Tiempo: 200 La resistencia de los microelectrodos fue de 10-25 MΩ una vez llenos con solución conductora de KCl 3 M. Las micropipetas se conectaron al seguidor de voltaje situado en la proximidad de la preparación mediante un electrodo de plata clorurado alojado en un porta-pipetas de metacrilato y, a su vez, conectado con la unidad central del amplificador de registro. Como electrodo de referencia se utilizó un hilo de plata clorurado conectado a tierra y en contacto con la solución de la cámara de registro. Para la penetración en las fibras musculares se empleó un micromanipulador (21A, 5). Antes de bloquear la contracción e iniciar los registros se determinó el umbral de estimulación del nervio mediante pulsos cuadrados de 0,2 ms de amplitudes crecientes hasta apreciar bajo el microscopio la contracción de las fibras musculares. Para los Materiales y Métodos 91 registros se utilizaron pulsos de al menos dos veces la amplitud umbral, normalmente de entre 1-15V. La preparación se incubó durante con µ-conotoxina GIIIB (2-3 µM, C-270, Alomone Laboratories), un bloqueante específico de los canales de sodio voltajedependientes musculares (Nav 1.4) que inhibe la contracción muscular. Una vez bloqueada la contracción, se procedió a realizar los registros intracelulares. Para ello se aproximó el electrodo de registro a la superficie de la fibra muscular, evidenciable por un aumento de la resistencia del electrodo, y se procedió a penetrar en la fibra mediante el penetrador eléctrico o manualmente con el micromanipulador. Al comienzo de cada registro se aplicaron pulsos cuadrados de 200 pA y 5 ms de duración para posteriormente calcular la resistencia de entrada de la fibra muscular. A continuación, se registraron los potenciales evocados en respuesta a un tren de 100 pulsos a 0,5 Hz (ver más adelante). En función del experimento a realizar, se aplicaron el mismo número de potenciales de acción en trenes de pulsos a frecuencias mayores: 5, 10 y 20 Hz. En cualquier caso, entre trenes de estimulación en una misma fibra se esperó, al menos, 30 segundos. Materiales y Métodos 92 6.3. Análisis de los registros electrofisiológicos El análisis de la amplitud, frecuencia y cinética de los potenciales de placa evocados (EPP) y espontáneos o en miniatura (mEPP) de las fibras musculares se realizó con el programa Chart5 (Fig. 22). Figura 22. Registros electrofisiológicos con el programa Chart5. Ejemplos de registros mediante trenes de pulsos a 0,5 Hz (panel superior) y 20 Hz (panel inferior). A baja frecuencia se han señalado los de potenciales de placa evocados (EPP) y en miniatura (mEPP). Frecuencia de estimulación: 0,5 Hz Frecuencia de estimulación: 20 Hz EPP mEPP Materiales y Métodos 93 6.3.1. Análisis de la amplitud de los potenciales y del contenido cuántico Inicialmente, la amplitud de los EPP (Fig. 23, 1) fue corregida por la sumación no lineal (Boyd & Martin, 1955; Kretschmannová & Zemková, 2004): (1) 𝐸𝑃𝑃𝑐𝑛𝑙 = 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑡𝑢𝑑 𝐸𝑃𝑃 1−𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑡𝑢𝑑 𝐸𝑃𝑃 −(𝑉𝑚−𝐸𝑟) Donde EPPcnl es la amplitud del potencial postsináptico corregida, Vm es el potencial de membrana registrado y Er es el potencial de reversión de la corriente a través de los receptores de acetilcolina (en nuestro caso, se consideró Er con un valor de -5 mV). Esta corrección no fue aplicada a los mEPP (Fig. 23, 2) puesto que éstos corresponden a liberaciones de una única vesícula y, por tanto, no se produce el fenómeno de sumación de potenciales. Tampoco se analizó la amplitud de los mEPP coincidentes con artefactos de contracción o EPPs. A continuación, se calculó el factor de normalización, f, a un potencial de membrana en reposo de -70 mV (potencial de membrana teórico), siguiendo la siguiente fórmula: (2) 𝑓 = −70−𝐸𝑟 𝑉𝑚−𝐸𝑟 Finalmente, se obtuvo la amplitud de los EPP corregida y normalizada (EPPcnl&70): (3) 𝐸𝑃𝑃𝑐𝑛𝑙&70 = 𝑓 ∗ 𝐸𝑃𝑃𝑐𝑛𝑙 Una vez normalizadas las amplitudes de los EPP y mEPP, se calculó el contenido cuántico (m; número de cuantos que se liberan tras la llegada de un potencial de acción al terminal) siguiendo el método directo (Del Castillo & Katz, 1954): (4) 𝑚 = 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝐸𝑃𝑃 (𝑚𝑉) 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑚𝐸𝑃𝑃 (𝑚𝑉) Materiales y Métodos 94 6.3.2. Análisis de mEPP Se midió la frecuencia, la amplitud y la cinética de los mEPP. Para la frecuencia, se contabilizaron los eventos en registros de al menos 100 s, generalmente durante la estimulación a 0,5 Hz. La amplitud al pico obtenida se corrigió por el potencial de membrana como se mencionó anteriormente. Los parámetros cinéticos se determinaron igual que para los potenciales evocados y se explican en el siguiente apartado. 6.3.3. Análisis de los EPP Se analizó tanto las amplitudes máximas como los parámetros cinéticos mediante el complemento “parámetros del pico” del programa Chart5. Tiempo de subida (Fig. 23, 3): Corresponde al intervalo entre el instante en el que el EPP alcanza el 10% y el 90% de su amplitud máxima. Ancho un-medio (FWHM o T1/2; Fig. 23, 4): Corresponde al intervalo de tiempo comprendido entre el instante en el que el EPP alcanza el 50% de su amplitud máxima durante la fase de subida y la de bajada. Constante de tiempo (τ) (Fig. 23, 5): Equivale al tiempo que tarda la señal en decaer un ~63,21 % de su amplitud máxima ((1-e-1)*100 %). Materiales y Métodos 101 1. Menú de control con un sistema de pestañas con las distintas opciones de captura (Fig. 26). 2. Visualización de imágenes. Figura 26. Ejemplo de parámetros de captura utilizados para la adquisición de imágenes mediante el programa FV10-ASW. Las imágenes obtenidas para detectar una proteína concreta fueron adquiridas con los mismos parámetros para los distintos genotipos. En la Tabla VII se muestra los valores de intensidad usados en los distintos experimentos en función de la proteína estudiada. El voltaje del fotomultiplicador (HV; ganancia) se mantuvo constante entre hermanos de camada y genotipos. Solo el offset fue modificando en función de la saturación de las imágenes adquiridas, intentando mantener el parámetro entre hermanos de camadas y siempre en el intervalo 13-30%. En la Tabla VIII vienen indicados otros parámetros de adquisición de imágenes en función del experimento realizado. Materiales y Métodos 102 Tabla VII. Parámetros de excitación láser en función de la proteína estudiada. Tabla VIII. Parámetros de adquisición de imágenes en función del experimento. Materiales y Métodos 103 8.2. Microscopía láser de superresolución Las imágenes de superresolución se adquirieron utilizando un sistema STEDYCON (Abberior Instruments; Fig. 27A), cortesía de la empresa Izasa, acoplado a nuestro sistema confocal o a un microscopio Nikon. Este sistema emplea la técnica de depleción de emisión estimulada (STED, STimulated Emision Depletion), la cual mejora la resolución óptica del sistema mediante minimización del área de iluminación en el punto focal gracias la desactivación selectiva de la fluorescencia con un láser de depleción (Fig. 27B y C). En nuestro sistema, el láser empleado para la depleción fue de 775 nm. Se adquirieron secciones ópticas seriadas en el eje Z (Z-stacks) e imágenes de un solo plano utilizando un objetivo de inmersión en aceite 60x tipo PlanApo N (PLAPON60xO, Olympus) con una apertura numérica (NA) de 1,42. Las imágenes fueron deconvolucionadas con el programa Huygens Essenstials® y procesadas y analizadas usando el software ImageJ (W. Rasband, National Institutes of health, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/). Se sustrajo la señal de fondo y se aplicó un suavizado antes de los análisis. El análisis del tamaño de los gránulos SMN se realizó mediante la medición de ancho un medio (FWHM) con el complemento de ImageJ "Adrian’s FWHM" y la estimación del área suponiendo que los gránulos son círculos perfectos. Para el análisis de la señal de SMN, la intensidad media, la intensidad máxima y la densidad integrada se midieron en regiones de interés (ROI) potencialmente equivalentes a gránulos individuales. El número de gránulos SMN se estimó mediante la rutina "analizar partículas". La densidad de los gránulos se estimó en planos individuales que se normalizaron al área NF-M correspondiente. Para detectar diferencias estadísticas, se aplicó un t-test y solo se consideraron significativas aquellas con valores p <0.05. Materiales y Métodos 104 Figura 27. Sistema STEDYCON y principios de la técnica STED. A. El dispositivo consta de sistema de control de los láseres (1) y un sistema de estimulación y de detección (2). Imagen tomada de https://www.abberior-instruments.com/products/compactline/stedycon/. B. Diagrama de Jablonski y el fenómeno de depleción estimulada. La fluorescencia se produce por una serie de transiciones en el estado electrónico de una molécula. En primer lugar, la energía aportada por un fotón (excitación) es absorbida por un electrón del fluoróforo que pasa del estado fundamental (S0) a un estado electrónico de mayor energía (S1) (flecha verde). A continuación, el electrón pierde energía dentro del mismo spin (relajación vibracional sin radiación, flecha azul) y vuelve a S0 (flecha ocre) emitiendo un fotón (fluorescencia). El láser de depleción hace que el electrón excitado vuelva a un estado vibracional más alto en el spin fundamental por lo que libera un fotón de mayor longitud de onda (λ) que será filtrado. C. Comparación de la microscopía confocal y STED. El STED depleciona la fluorescencia alrededor de un punto focal central de emisión de fluorescencia, lo que permite disminuir el tamaño de la función de dispersión de puntos (PSF) e incrementar la resolución. 1 2 A B C Materiales y Métodos 105 8.3. Análisis de imágenes El análisis de los somas, axones y terminales motores se llevó a cabo con el programa ImageJ. Las imágenes presentadas en este trabajo son una proyección máxima en el eje Z de las secciones individuales obtenidas en cada serie, a menos que se especifique lo contrario. El único tratamiento de las imágenes fue un suavizado, consistente en un filtro que difumina la imagen o selección activa reemplazado cada píxel por el promedio de su vecindario 3 × 3. 1. Área del soma de las motoneuronas. En primer lugar, se delimitó el ROI con la proyección máxima de las imágenes correspondientes al marcaje del anticuerpo antiacetilcolin-transferasa (ChAT). A continuación, la imagen se convirtió de 16 bits (RGB) a 8 bits (escala de grises) y se estableció un umbral de forma semiautomática. Finalmente se delimitó el perfil de superficie generado por el umbral y se midió el área englobada por este perfil. 2. Cuantificación de la fluorescencia de las proteínas de interés en el soma de las células del asta ventral espinal. En primer lugar, se delimitó el ROI con el marcaje del anticuerpo anti-ChAT. Para ello, las imágenes de los 3 planos centrales de la célula, identificados por el núcleo, se convirtieron de 16 bits (RGB) a 8 bits (escala de grises) y se estableció un umbral de forma semiautomática, se delimitaron los perfiles de superficie generados y se midió el área englobada por cada uno de estos perfiles. Posteriormente, en el canal de la proteína de interés se seleccionaron los mismos planos y se convirtieron a 8 bits. Finalmente, se estableció un umbral de forma manual (manteniéndose constante entre células y ratones) y se midieron el área y la intensidad de las señales contenidas en los ROI. 3. Cuantificación del número de contactos sinápticos excitatorios en las motoneuronas espinales. En primer lugar, se identificaron las motoneuronas por su ubicación en el asta ventral y su inmunoreactividad al anticuerpo anti-ChAT. Así mismo, las imágenes se convirtieron de 16 bits (RGB) a 8 bits (escala de grises), se estableció un umbral de forma semiautomática y se delimitaron los perfiles de superficie generados. A continuación, se realizó la proyección máxima del canal para vGLUT2 y se contaron de Materiales y Métodos 106 forma manual los contactos sinápticos, identificados por su inmunoreactividad y por localizarse en intima aposición con el perfil de ChAT. Para evitar una infraestimación de los contactos, se comprobaron los contactos contabilizados en cada plano de la célula. 4. Área postsináptica. Se delimitó el ROI con la proyección máxima de las imágenes correspondientes al marcaje con BTX-Rho. A continuación, la imagen se convirtió a 8 bits y se estableció un umbral de forma semiautomática. Finalmente se midió el área total de los pixeles por encima del umbral y se delimitó el perfil de esta área para los estudios del resto de proteínas. 5. Área de las proteínas de interés en la NMJ. Para el análisis de la expresión de SMN en los terminales de los ratones silvestres se delimitó el perfil del área postsináptica mediante la proyección máxima del canal para la BTX. Este perfil se trasladó a las proyecciones máximas de los canales para SMN y NF, y se aplicó un “umbral” común para las distintas muestras, obteniéndose las intensidades medias y áreas. 6. Análisis de granos. Para el análisis del tamaño de los gránulos de SMN en los axones se aplicó la opción “perfil del trazo” en el eje mayor del gránulo, obteniéndose la distribución de intensidad en ese eje. Finalmente se midieron las longitudes de los anchos medios de estas distribuciones. Para medir las interdistancias entre granos se realizó un suavizado de las imágenes y se aplicó la opción “perfil del trazo” a través de los centros de los granos y se midió la distancia entre picos de intensidad. Para determinar la colocalización entre SMN, NF y MAP1B en los axones y terminales motores se aplicó la opción “perfil del trazo” en el eje transversal de los axones o de las ramas citoesqueléticas intraterminales, atravesando el punto medio de algún grano. Materiales y Métodos 107 9. Análisis Estadístico Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el programa informático GraphPad Prism 5. Para todas las variables se siguió diagrama de flujo expuesto en la Figura 28. 9.1. Estudio de la normalidad y de la homogeneidad de varianzas Se emplearon dos tests de normalidad según el tamaño muestral (n) de la variable: 1. Test de Shapiro-Wilk: se empleó en aquellos casos en los que n ≤ 50 2. Test de Kolmogorov-Smirnov: se empleó en aquellos casos en los que n > 50 La obtención de un valor de significación (p) mayor a 0,05 permitió la aceptación de la hipótesis de normalidad. En caso contrario, se rechazó la hipótesis de normalidad. En los casos en los que los datos seguían una distribución normal, se empleó el test de Levene para estudiar la homocedasticidad u homogeneidad de las varianzas, situación que se aceptó cuando test arrojase una p > 0,05. 9.2. Estudio de las diferencias entre grupos experimentales para variables cuantitativas En los experimentos en los que había dos grupos experimentales, las diferencias estadísticas entre variables se evaluaron mediante la prueba t de Student siempre que se pudiese aceptar la hipótesis de normalidad, asumiendo varianzas iguales o desiguales en función del test de Levene. En los casos en los que se rechazase la hipótesis de normalidad, la evaluación de las diferencias estadísticas se realizó mediante el test no paramétrico U de Mann-Whitney. En los experimentos en los que había más de dos grupos experimentales las diferencias estadísticas se evaluaron mediante uno de los siguientes test: 1. ANOVA: Se empleó cuando las variables estudiadas seguían una distribución normal y presentaban homogeneidad de varianzas. Valores de p < 0,05 implica la existencia de diferencias significativas entre los grupos experimentales, es decir, la existencia de al menos dos poblaciones distintas de datos en función de la Materiales y Métodos 108 variable estudiada. Para identificar entre qué grupos existían las diferencias, se empleó posteriormente un test de comparaciones múltiples: test de Bonferroni o de Tamhane si presentaban homogeneidad de varianzas o no, respectivamente. Figura 28. Diagrama de flujo de los análisis estadísticos realizados. ANALISIS ESTADÍSTICO CUANTITATIVO ¿La variable sigue una distribución normal? •n ≤ 50 → Saphiro-Wilk •n > 50 → Kolmogorov-Smirnov Tests Paramétricos Tests No Paramétricos SI NO t de Student ANOVA SI NO ¿Más de 2 grupos experimentales? Asumiendo homocedasticidad Sin homocedasticidad Post-hoc: Test de Bonferroni Post-hoc: Test de Tamhane SI NO ¿Presenta la variable homocedasticidad? Test de Levene SI NO U de Mann- Whitney Kruskal- Wallis SI NO ¿Más de 2 grupos experimentales? Post-hoc: U de Mann- Whitney con corrección de Bonferroni Materiales y Métodos 109 2. Test de Kruskal-Wallis: Se empleó cuando las variables estudiadas no seguían una distribución normal, siendo el test no paramétrico equivalente al ANOVA. Para identificar entre qué grupos existían las diferencias, se empleó posteriormente un test no paramétrico U de Mann-Whitney aplicándole la llamada corrección de Bonferroni. Esta corrección se basa en la consideración de significación estadística en aquellos casos en los que se cumpla que: 𝑝 < 2𝛼 ∗ (𝑁 − 2)! 𝑁! Siendo p el valor de significación estadística, α el error de tipo I asumido (0,05 en el presente trabajo) y N el número de grupos experimentales analizados. Todos los datos presentes en esta tesis vienen representados, salvo que se indique expresamente lo contrario, como la media ± error estándar de la media, siendo n el número de eventos analizados y N el número de experimentos realizados. Excepto en caso de aplicación de la corrección de Bonferroni, la significación estadística siguió el siguiente patrón: *p < 0,05; **p < 0,005; ***p < 0,0005. Resultados Resultados 117 Figura 32 (página anterior). Características de los granos axonales de Smn. A. Proyección de intensidad máxima de la preparación neuromuscular del músculo TVA de un ratón silvestre a P3. La inmunofluorescencia de Smn (magenta) presenta un patrón granular, especialmente claro en los axones más finos (recuadro y paneles inferiores). Nótese en los paneles inferiores la disposición en fila india de los granos de Smn en los axones, identificados mediante marcaje anti-NF (verde). Barras de escala: 5 µm (panel superior) y 3 µm (paneles inferiores). B. Ejemplo de perfil de intensidad, correspondiente a la línea punteada en el panel central de A. Las líneas verticales grises indican el centro de cada grano. C. Histograma de frecuencia de las interdistancias entre los granos axonales. D. Ejemplo de análisis de perfil de intensidad en un grano para el estudio de su diámetro aparente. E. Histograma de frecuencia del diámetro de los granos y valor medio. 1.1.4. La señal de Smn en los terminales nerviosos de ratones silvestres disminuye con la edad Aunque SMN es una proteína ubicua esencial para funciones celulares básicas, diversos estudios han mostrado que sus niveles descienden en la mayoría de los tejidos tras el periodo de desarrollo y la maduración postnatal, manteniéndose relativamente elevados, no obstante, en el soma de las motoneuronas (Groen et al., 2018). En el presente trabajo hemos investigado si se produce o no un descenso fisiológico de la proteína en los axones y terminales motores durante el periodo de maduración postnatal. Para ello, realizamos marcajes inmunohistoquímicos de preparaciones neuromusculares de TVA procedentes de animales silvestres a distintas edades: P3, P6, P8, P10 y P60. Durante la primera semana postnatal, la señal de Smn obtenida fue intensa tanto en los axones como en los terminales motores, como muestra los ejemplos de la Figura 33A y B. Sin embargo, la señal se redujo significativamente durante la segunda semana de vida (p <0,0001, test de Kruskal-Wallis). La evolución temporal del área de la señal anti-Smn se representa en la Figura 33D. El área de marcaje de Smn en el terminal fue estable durante la primera semana, representando un 7,37 ± 0,61 % del área postsináptica a P3 (38 terminales, 3 ratones) y un y 7,18 ± 3,52 % a P6 (28 terminales, 2 ratones). Sin embargo, durante la segunda semana postnatal se produjo una reducción significativa de la señal, representando un 3,34 ± 0,28 y 1,17 ± 0,1 % del área postsináptica a P8 (24 terminales, 2 ratones) y P10 (22 terminales, 2 ratones), respectivamente (p <0,005 y < 0,0005, post-hoc: test de Bonferroni respecto a P3). Durante la edad adulta, la señal de Smn no fue detectable con la misma intensidad laser y parámetros de adquisición utilizados a edades perinatales (Fig. 33C). Sin embargo, aún pudieron detectarse vestigios de señal en el terminal a mayores intensidades de estimulación láser. Resultados 118 P3 P8 P10 P6 NF BTX A Smn B P3 P6 P8 P10 Smn D C P60 Smn Smn BTX 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 010 20 30 40 50 60 Área Smn / Área BTX (%) Edad postnatal (días) NF BTX Resultados 119 Figura 33 (página anterior). Smn disminuye progresivamente en los axones y terminales nerviosos motores de los ratones silvestres durante las dos primeras semanas de vida. Proyecciones de máxima intensidad de axones y terminales motores de músculos TVA procedente de ratones silvestres a distintas edades. Las uniones neuromusculares fueron identificadas mediante marcaje para NF-M y BTX (verde y rojo, respectivamente). A. Imágenes a bajo aumento de una región del músculo. La señal de Smn (magenta) es intensa a P3 y a P6 (paneles izquierdos), pero débil a P8 y P10 (paneles derechos). B. Detalle de la expresión de Smn en los terminales motores a distintas edades. Nótese la escasa señal a P8 y P10. C. Señal de Smn en la edad adulta. D. Evolución con la edad del área de Smn normalizada al área postsináptica. Barras de escala: 50 (A) y 10 (B y C) µm. Estos datos indican que los axones y terminales motores presentan altos niveles de Smn solo durante las primeras etapas de la maduración postnatal, siendo muchos menores durante la edad adulta. 1.1.5. Impacto de la sobreexpresión de SMN en axones y terminales presinápticos motores Los resultados obtenidos en el modelo silvestre fueron contrastados en el modelo murino de AME SMAΔ7. Estos ratones poseen en cada alelo dos copias del transgén humano SMN2 y dos copias del transgén SMNΔ7, junto con una copia (controles) o ninguna (mutantes) del gen murino Smn. Podemos, por tanto, presuponer que la expresión de los dos transgenes dará lugar mayoritariamente a proteína truncada. Este hecho planteó dos cuestiones: i) ¿sigue la expresión de la proteína SMN heteróloga en los axones y terminales motores el mismo curso temporal que la expresión de la proteína endógena Smn? ii) ¿forma la proteína SMN completa y truncada granos de características morfológicas y distribución similares a los formados por proteína Smn? Para responder a estas cuestiones realizamos inmunomarcaje en iguales condiciones experimentales y con los mismos parámetros de adquisición que en los ratones silvestres. Para abordar la primera pregunta estudiamos la expresión en los ratones modelo de AME a P9 y P10, una edad a la que la señal en los ratones silvestre había disminuido ya un 87% (Fig. 33D). En estos experimentos, además del TVA, también se estudió otro músculo que presenta un grado afectación menor en los modelos de AME, el LAL. Resultados 120 Sorprendentemente, tanto en controles como en mutantes se observó señal intensa de SMN y con un patrón granular en los axones de ambos músculos (Fig. 34). El contenido en granos fue variable en función del grosor del axón, como en los ratones silvestres. Así mismo, en ambos genotipos, se identificaron gran cantidad de granos en el terminal presináptico (Fig. 35). Figura 34. SMN conserva el patrón granular en los axones de ratones controles y mutantes SMA7. Proyecciones de máxima intensidad de axones motores de músculos vulnerables (TVA) y menos vulnerables (LAL) de ratones controles y mutantes a P9. Los paneles inferiores muestran con mayor detalle las regiones delimitadas, observándose el patrón granular. Barras de escala: 5 µm (imágenes superiores) y 2 µm (recuadros inferiores). A continuación, cuantificamos el área de SMN normalizada al área postsináptica en controles y mutantes y la comparamos con la existente en ratones silvestres (Fig. 36). Los valores en las preparaciones del modelo fueron 6,34 ± 1,63 % en control (n=16 terminales, N=1) y 9,40 ± 2,22 % (n = 14 terminales, N = 1) en mutantes. Estos valores, fueron significativamente distintos (p = 0,0003, test de ANOVA; post-hoc: test de Bonferroni, p < 0,05 y < 0,0005, en control y mutante, respectivamente) de los obtenidos a una edad similar (P10) en los ratones silvestres, representando un 540 % y 800 % de incremento, respectivamente. Control SMA∆7 TVA LAL Control SMAΔ7 SMN Resultados 121 Figura 35. SMN conserva el patrón granular en los terminales motores de ratones controles y mutantes SMA7. Proyecciones de máxima intensidad de terminales motores del músculo TVA en ambos genotipos a P9. La placa motora fue identificada mediante marcaje con BTX-Rodamina (rojo). Barras de escala: 10 µm. Figura 36. Cuantificación de la sobreexpresión de SMN en los terminales presinápticos motores de ratones del modelo SMAΔ7. Comparación del área de SMN (o Smn) normalizada al área postsináptica (BTX) entre ratones silvestres, controles y mutantes SMAΔ7. El análisis se realizó en ratones de edades comprendidas entre P9-P10. SMN SMN BTX Control SMA∆7 0 2 4 6 8 10 12 Silvestre P10 Control SMNΔ7 Área SMN / Área BTX Silvestre Control SMAΔ7 * ** NS Resultados 122 Posteriormente, comparamos las características morfológicas aparentes de los granos procedentes de ratones silvestre con las de los granos de ratones que sobreexpresan proteína truncada (Fig. 37). El análisis del diámetro mediante perfil de intensidad reveló un diámetro medio significativamente mayor en los ratones que sobreexpresan proteína truncada, con un incremento del 20-28% respecto al diámetro medio observado en los ratones silvestre (p = 0,0024, test de ANOVA; post-hoc: test de Bonferroni, p < 0,005 y < 0,05, en mutante y control, respectivamente). Por otro lado, los granos en animales mutantes y controles presentaban un diámetro medio similar (post-hoc: test de Bonferroni, p > 0,05), con unos valores medios de 451,7 ± 11,6 nm (n = 70 granos, 26 axones, N = 3) y 424,9 ± 14,5 nm (n = 90 granos, 25 axones, N = 4), respectivamente (Fig. 37A). La comparación de los rangos de diámetros de los granos en los ratones silvestres (300-500 nm) y en el modelo se muestra en el histograma de frecuencias en la (Fig. 37B). Figura 37. Los granos de SMN son de menor tamaño en los ratones silvestres que en el modelo de AME. Análisis del diámetro de los granos positivos en Smn/SMN mediante ancho un-medio en ratones silvestres P3 y en ratones controles y mutantes del modelo SMAΔ7 a P9. A. Cuantificación del diámetro medio de los granos. *: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,005. B. Histograma de frecuencias del diámetro de los granos en los tres genotipos. 0 10 20 30 40 50 60 70 B 0 100 200 300 400 500 A ** * NS FWHM (nm) Frecuencia (%) Silvestre Control SMAΔ7 FWHM (nm) Resultados 123 1.1.6. Los granos SMN visualizados con superresolución Para aumentar la precisión de la medida del tamaño y distribución de los granos de SMN usamos microscopía de superresolución STED con un sistema compacto STEDYCON (Abberior) acoplado al nuestro microscopio confocal FV1000. El análisis de las imágenes STED en controles y mutantes confirmó el patrón granular del inmunomarcaje y permitió una mejor caracterización de los granos. En la Figura 38 se muestra un ejemplo donde se compara las imágenes confocales convencionales y STED en ratones controles y AME. La identificación de las estructuras granulares fue mucho mejor con STED y aún pudo mejorarse más la imagen cuando se le aplicó una rutina de deconvolución (Huygens). Figura 38. Granos de SMN con microscopía de superresolución en terminales nerviosos motores de ratones controles y mutantes SMA7. Comparación de las señales de inmunofluorescencia de SMN (blanco) con superresolución y microscopía confocal en terminales nerviosos motores del músculo TVA a P9. Las ramas axonales intraterminales se marcaron con anticuerpos contra NF (verde). Nótese la estructura en forma de anillo al final de la ramificación en el control y la estructura en forma de placa en el mutante (recuadros) ampliadas en los paneles de la derecha en cada genotipo. Barras de escala: 5 μm y 1 μm (recuadros). Control SMAΔ7 SMN NF SMN SMN Confocal Decon STED Original Resultados 124 El análisis del diámetro de los granos con superresolución se realizó del mismo modo que en la microscopía confocal convencional (Fig. 39A). El tamaño medio de los granos fue similar entre ratones controles y mutantes (Fig. 39B) (p = 0,3; test de la t de Student de dos colas), con un valor medio de 103,4 ± 2,32 nm (73 granos, 2 terminales) y 100,31 ± 1,93 nm (77 granos, 2 terminales), respectivamente, coincidente con la resolución óptica que obtuvimos en estos experimentos. Figura 39. El análisis mediante microscopía de superresolución pone de manifiesto que los granos de SMN son similares morfológicamente en ratones controles y AME. A. Ejemplo de análisis de perfil de intensidad en dos granos (paneles izquierdos) para el estudio de su diámetro. El panel derecho muestra un esquema conceptual del ancho unmedio (FWHM) sobre los perfiles de intensidad de los granos de los paneles izquierdos. B. Histograma de frecuencias de diámetros de granos en terminales nerviosos de ratones controles y mutante. C. Densidad media de los granos en las ramas axónicas extra e intraterminales. 0 5 10 15 20 25 30 42 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 Frecuencia FWHM (nm) B 0 2 4 6 8 10 12 14 WT Número de granulos / μm2 Control SMAΔ7 C A Intensidad de fluorescencia (N) Distancia (nm) Control SMAΔ7 Resultados 125 Así mismo, la densidad media de granos fue similar en ambos casos, con un valor medio en los acúmulos de 12 granos/µm2 (Fig. 39C). Sin embargo, aunque no se encontraron diferencias significativas en la intensidad máxima de los granos (p = 0,76, test de la U de Mann-Whitney), sí se observaron diferencias significativas en la intensidad media de los granos entre genotipos (Fig. 40A; p = 0,0021, test de la U de Mann-Whitney de dos colas), con unos valores medios de 499,3 ± 32,13 en control (73 granos, 2 terminales) y 418,9 ± 34,41 en mutantes (77 granos, 2 terminales). Finalmente, la intensidad media de los granos no correlacionaba con su diámetro (Fig. 40B; R2 = 0,08 y 0,019 en control y mutante, respectivamente). Figura 40. Los granos de SMN presentan una menor intensidad media en los terminales presinápticos de ratones mutantes SMAΔ7. A. Valores medios de intensidad de los granos de SMN en ratones controles (control) y AME (SMNΔ7). B. Gráfica de intensidad-ancho un-medio que muestra la ausencia de correlación entre ambas variables. **: p < 0,005 0 6000 WT D7 Intensidad (u.a.f.) 500 400 300 200 100 0 0 SMAΔ7 Control 600 A B 0 50 100 150 200 250 050 100 150 200 Intensidad (u.a.f.) FWHM (nm) Control Δ7 Control 500 2500 1000 0 1500 2000 SMAΔ7 R2 = 0,08 R2 = 0,019 ** Resultados 126 1.2. Relación entre SMN y el citoesqueleto 1.2.1. Bases de la distribución espacial intraterminal de los granos de SMN Tras estudiar tanto las características morfológicas de los granos de SMN en ratones silvestres y modelo de AME, como su distribución espacial, investigamos el posible soporte estructural de su localización en el terminal presináptico motor. Como se puede apreciar en las imágenes, el primer hallazgo notable fue que los granos de SMN, a diferencia de otras proteínas de la NMJ como la proteínas SV, no se distribuyen homogéneamente en el terminal sino formando básicamente dos tipos de estructuras: cúmulos (Fig. 41, puntas de flechas azules) y agrupaciones lineales (Fig. 41, puntas de flechas amarillas). Ambas estructuras aparecieron generalmente interconectadas entre sí en el terminal y, a su vez, con la porción distal del axón. También se observaron estructuras circulares de granos, generalmente en las porciones distales del terminal (Fig. 38). En de la porción más distal del axón motor se observó en algunos casos un cúmulo de granos (Fig. 41, flechas blancas), siendo más frecuente éste fenómeno en los ratones mutantes que en los controles o silvestres (véase más adelante). La característica distribución de los granos planteó la posibilidad de una asociación entre éstos y el citoesqueleto. Esta posibilidad cobra aún más interés si se tiene en cuenta que el citoesqueleto es uno de los elementos característicamente alterado en AME. Resultados 133 Figura 44. Lo axones periféricos presentan un contenido heterogéneo de MAP1B y NF. A. Proyecciones de máxima intensidad de axones procedentes de ratones silvestres y controles y mutante del modelo de AME Taiwanés que muestras la existencia de axones con distinta inmunoreactividad para MAP1B (gris) y NF-M (verde). Barra de escala: 10 µm. B. Perfiles de intensidad de los segmentos indicados en A que muestran la correlación inversa entre las señales normalizadas de MAP1B (trazo gris) y NF (trazo verde). Mutante Control Silvestre A NF MAP1B MAP1B NF B Silvestre Control MAP1B & NF MAP1B & NF 0 50 100 0 2 4 6 8 10 Intensidad (u.a.f.) Distancia (µm) 0 50 100 02468 Intensidad (u.a.f.) Distancia (µm) Mutante MAP1B & NF 0 50 100 0246810 Intensidad (u.a.f.) Distancia (µm) Resultados 134 Figura 45. Los granos de SMN presentan un mayor grado de coincidencia con la señal de NF que con la de MAP1B. A. Proyección de máxima intensidad de una banda de axones procedentes de un ratón control del modelo Taiwanés marcados para MAP1B (magenta), NF (verde) y SMN (rojo). Nótese la heterogeneidad de los axones en cuanto a su inmunorreactividad para cada una de estas proteínas. Barra de escala: 10 µm. B. Perfiles de intensidad de los segmentos indicados en A que muestra la mayor coincidencia de SMN (trazos rojos) con axones con alta intensidad para NF (trazos verdes) (puntas de flecha) que con axones con alto contenido en MAP1B (trazos magenta) (flecha). 0 50 100 0 5 10 15 Intensidad (u.a.f.) Distancia (µm) SMN 0 50 100 0 5 10 15 Intensidad (u.a.f.) Distancia (µm) SMN & MAP1B A NF SMN MAP1B MAP1B NF 0 50 100 0 5 10 15 Intensidad (u.a.f) Distancia (µm) SMN & NF 0 50 100 0 5 10 15 Intensidad (u.a.f.) Distancia (µm) MAP1B & NF B Resultados 135 Finalmente, investigamos la distribución espacial de MAP1B y los NF en el terminal nervioso motor. En ratones silvestres y controles, ambas proteínas colocalizaron en gran medida tanto en la porción distal de los axones como en los terminales presinápticos (Fig. 46). En los mutantes, sin embargo, MAP1B presentó un patrón difusogranular (Fig. 46, recuadro). Es de destacar que en los terminales mutantes la señal de MAP1B coincidió con los acúmulos anómalos de NF (Fig. 46, punta de flecha, véase apartado 2.5). No obstante, no existió concordancia de intensidades entre ambas señales, puesto que, si bien eran las regiones más intensas para NF, no era así para MAP1B. Estos datos, en su conjunto, sugieren una asociación más estrecha de los granos de SMN con los NF que con MAP1B, tanto en los axones como en el terminal presináptico motor. Figura 46. Disposición de MAP1B y NF en los terminales motores silvestres, controles y modelo de AME. Proyecciones de máxima intensidad representativas de la expresión y distribución de MAP1B (magenta) y NF (verde). En los terminales de ratones silvestres y controles, la señal de MAP1B colocaliza con la de NF. En los terminales mutantes, MAP1B se dispersa, observándose cierto patrón granular (recuadro). Nótese que los acúmulos de NF no coinciden con una mayor densidad de MAP1B (puntas de flechas). Barra de escala: 10 µm. Control Mutante Silvestre MAP1B NF Superposición + BTX Resultados 136 1.2.5. Los acúmulos de NF presentan una alta densidad de granos de SMN Los NF en los terminales presinápticos de los ratones mutantes SMAΔ7 presentaron acúmulos junto con un bajo número de ramas intraterminales (Fig. 47A), tanto en las porciones terminales (lazos) como en las proximales. Es más, aproximadamente un 20% los terminales presentaron un único acúmulo de NF que ocupaba la mayor parte del terminal (Fig. 47B). Hay que destacar la gran abundancia de granos de SMN en los acúmulos de NF (Fig. 47A y B). Estas estructuras no se observaron ni en los ratones controles ni en el modelo silvestre. En los axones, también se encontraron acumulaciones de granos de SMN coincidiendo con acúmulos de NF, especialmente abundantes en los ratones mutantes. (Fig. 48, paneles derechos). En los ratones controles, que sobreexpresan SMN, los acúmulos de NF en los axones fueron muy poco frecuentes, uno de los pocos ejemplos observados se muestra en la Figura 48 (paneles izquierdos). No obstante, es de resaltar que también en estos casos se observó una mayor densidad de granos de SMN, lo que indica la estrecha relación entre ambas proteínas. Estos resultados sugieren un compromiso en el tráfico retrógrado o en la degradación de los granos de SMN en los ratones AME. Resultados 137 Figura 47. Los terminales motores mutantes presentan acúmulos anómalos de NF y SMN en el modelo SMAΔ7. Proyecciones de máxima intensidad de terminales motores del TVA procedentes de ratones SMAΔ7 a P9. A. Ejemplos de terminales motores con escasas ramificaciones y distintos acúmulos de NF (verde). Se observan acumulaciones de granos de SMN (blanco) coincidentes con los acúmulos de NF. B. Terminal mutante muy degenerado, con una única acumulación masiva de NF que ocupa gran parte del terminal, conteniendo un abundante número de granos de SMN. La línea verde discontinua representa el contorno de los NF y la roja delimita el contorno del terminal postsináptico. Barras de escala: 10 µm B A NF SMN NF SMN SMN NF BTX NF SMN Resultados 138 Figura 48. Los axones presentan acúmulos de NF a lo largo de su recorrido en el modelo SMAΔ7. Los acúmulos axonales de NF coinciden con acumulaciones de granos de SMN, tanto en controles como en mutantes del modelo SMAΔ7. Los paneles inferiores (recuadros) muestran detalles de la superposición de los granos de SMN con los acúmulos de NF. Barra de escala: 40 y 2 µm (paneles izquierdos) y 15 y 5 µm (paneles derechos). NF Control P9 SMN SMN Superposición SMAΔ7 P9 NF SMN SMN Superposición BTX Superposición Resultados 139 1.3. Estudio de proteínas potencialmente asociadas a SMN Puesto que diversos estudios in vitro en modelos de AME han mostrado una alteración en la localización axonal de SMN y de distintas proteínas asociadas, como IMP1, hnRNP- R o HuD en motoneuronas y en neuronas centrales (Akten et al., 2011; Fallini et al., 2011, 2014, 2016; Hubers et al., 2011; Donlin-Asp et al., 2017), hipotetizamos que in vivo la composición de los gránulos de SMN en los axones motores se encuentra alterada en el contexto de la AME. Con el objetivo de poder contrastar esta hipótesis, estudiamos la expresión de distintas proteínas potencialmente asociadas a los gránulos de SMN mediante marcaje inmunohistoquímico en preparaciones neuromusculares y de médula espinal. Concretamente, realizamos inmunomarcaje de tres proteínas: Gemina 2, Gemina 3 y HuD, en ratones silvestres y modelo SMAΔ7 (Tabla IX y X). Además, testamos la presencia de una cuarta proteína, Cpg15 que, aunque no ha sido demostrado que interaccione con SMN in vitro, la incluimos en nuestro estudio ya que está implicada en el neurodesarrollo y su ARNm es estabilizado por HuD. Como la expresión de algunas de estas proteínas potencialmente se regula a la baja a lo largo de la maduración del sistema nervioso, optamos por realizar los marcajes a una edad temprana (P3). No obstante, ninguna de las cuatro proteínas fue detectada en las preparaciones neuromusculares. También se realizó inmunomarcaje a P0, tanto en el TVA como en el diafragma, con iguales resultados (Tabla IX). En principio, interpretamos estos resultados cómo un problema de accesibilidad de los anticuerpos a los epítetos correspondientes, más que a la ausencia de estas proteínas en el axón y el terminal nervioso (véase más adelante Discusión). Así mismo, investigamos la expresión de Gemina2, Gemina3, HuD y Cpg15 en el soma de las motoneuronas espinales de ratones de 9 días de edad. Para ello realizamos marcajes inmunohistoquímicos en cortes de médula espinal lumbar (L1-L2), identificando estas neuronas por su localización en el asta ventral de la medula e inmunoreactividad a un anticuerpo específico contra la acetil-colin transferasa (ChAT; AB144P, Merck Millipore) (Tabla X). No obstante, únicamente HuD pudo ser identificado de forma clara en estos experimentos. Resultados 140 Tabla IX. Experimentos realizados para la identificación por IHQ de proteínas potencialmente asociadas a SMN en axones y terminales nerviosos motores. Tabla X. Experimentos realizados para la identificación por IHQ de proteínas potencialmente asociadas a SMN en secciones de médula espinal lumbar L1-L2. Genotipo Anticuerpo Muestra Edad IHQ [Gemin2] [Gemin3] [HuD] [Cpg15] [SMN] Silvestre 1:500 1:500 - - - TVA P3 Estándar Silvestre 1:50 1:50 - - - TVA P3 Estándar Silvestre 1:50 - - - 1:200 TVA P3 SDS Silvestre - - 1:500 1:500 - TVA P3 Estándar Silvestre - - 1:500 1:500 - TVA P3 Estándar Silvestre - - 1:50 1:50 - TVA P3 Estándar Silvestre - - 1:50 - - Diafragma P0 Estándar Silvestre - - 1:50 - - TVA P0 Estándar Control - - - 1:50 - TVA P3 Estándar Genotipo Anticuerpo Edad IHQ [Gemin2] [Gemin3] [HuD] [Cpg15] [ChAT] Control 1:50 1:250 P9 Estándar Control 1:50 1:250 P9 Estándar Control 1:50 1:250 P9 Estándar Mutante 1:50 1:250 P9 Estándar Control 1:50 1:250 P9 Estándar Resultados 141 1.3.1. La expresión de HuD en las motoneuronas de la médula espinal no está disminuida en ratones SMAΔ7 La señal de HuD fue intensa en los cortes de médula espinal lumbar (L1-L2), tanto en ratones controles como mutantes. La señal se localizó fundamentalmente en la sustancia gris, tal y como se muestra en las secciones transversales de controles y mutantes de la Figura 50A. Se marcaron todas las regiones de la sustancia gris, es decir, las astas dorsales, intermediolaterales, comisura central y astas ventrales. En las astas ventrales, se identificó inmunorreactividad para HuD tanto en las motoneuronas, identificadas mediante inmunomarcaje contra ChAT (Fig. 49A y B), como en otras células ChAT negativas de menor tamaño, posiblemente interneuronas (Fig. 49B, flechas). En las motoneuronas, la señal de HuD fue particularmente intensa en el soma y en la región más proximal de las neuritas (Fig. 49C, puntas de flechas). Puesto que experimentos previos en pez cebra han descrito los niveles de HuD son dependientes de SMN (Hao et al., 2017), hipotetizamos que los niveles de expresión de HuD pudieran estar disminuidos en las motoneuronas de los ratones mutantes del modelo SMAΔ7. Para contrastar esta hipótesis se realizó un análisis comparativo de la señal de HuD en las neuronas del asta ventral entre ratones controles y mutantes SMAΔ7 (Fig. 50) La intensidad media de la señal en las motoneuronas fue similar en ambos genotipos, con unos valores medios de 1247 ± 70,92 u.a.f en el control (n = 158 neuronas, N = 4 ratones) y de 1203 ± 769,1 u.a.f. en el mutante AME (n = 162 neuronas, N = 4 ratones) (p = 0,886, prueba de la U de Mann-Whitney). Así mismo, tampoco se observó una diferencia significativa entre las motoneuronas y las células ChAT negativas del asta ventral en ambos genotipos (p = 0,0796, ANOVA de dos factores), aunque sí una tendencia a presentar estas últimas una menor intensidad, con unos valores medios de 920,5 ± 101,3 u.a.f. en el control (n = 69, N = 3) y de 994,9 ± 172,4 u.a.f en el mutante AME (n = 62, N = 3). La Figura 50C muestra el histograma de frecuencia de intensidades medias en ambos tipos celulares en control (izquierda) y mutante AME (derecha), pudiéndose observar la tendencia a una menor señal en las neuronas ChAT negativas (gris) que en las motoneuronas (negro) así como una mayor variabilidad en la expresión de HuD, identificada como un aplanamiento del histograma, en los ratones mutantes AME. Resultados 142 Figura 49. Presencia de HuD en la médula espinal. Proyecciones de máxima intensidad de cortes de médula espinal lumbar procedente de ratones controles y mutantes SMAΔ7 a P9, tras inmunomarcaje con anticuerpos anti-HuD (verde) y anti-ChAT (blanco). A. La señal de HuD se concentra fundamentalmente en los cuerpos celulares de la sustancia gris medular en los dos genotipos. Nótese que tanto las motoneuronas (recuadros) como otras células presentan señal. B. Imágenes con mayor resolución de los recuadros en A donde puede identificarse la señal para HuD tanto en células ChAT positivas como negativas (flechas). C. Ampliación de los recuadros en B. La señal es más intensa en el citosol y en la porción proximal de las neuritas (puntas de flecha). Barras de escala: 400 µm (A), 50 µm (B) y 20 µm (C). Control HuD HuD ChAT ChAT SMAΔ7 Control SMAΔ7 HuD ChAT HuD ChAT A B C