Estudio de transmisión de periodontopatógenos entre parejas pre y postratamiento periodontal

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGÍA “ESTUDIO DE TRANSMISIÓN DE PERIODONTOPATÓGENOS ENTRE PAREJAS PRE Y POSTRATAMIENTO PERIODONTAL” Carmen Bernal Ortega Sevilla, 2015 Deseo expresar mi agradecimiento a los Profesores D. Pedro Bullón Fernández, Dª Lorena López Cerero y Dª María del Carmen Machuca Portillo de la Universidad de Sevilla por su dirección y orientación en el diseño y elaboración de este trabajo. Departamento de Estomatología Medalla y Encomienda Facultad de Odontología Orden Civil de Sanidad D. Pedro Bullón Fernández, Catedrático del Departamento de Estomatología de la Facultad de Odontología de la Universidad de Sevilla, Dña. Lorena López Cerero, Profesora Asociada del Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla, y Dña. María del Carmen Machuca Portillo, Profesora Titular del Departamento de Estomatología de la Facultad de Odontología de la Universidad de Sevilla, en calidad de directores del Proyecto de Tesis de la Licenciada en Odontología Dª. Carmen Bernat Ortega. CERTIFICAN: Que el presente trabajo de investigación “ESTUDIO DE TRANSMISIÓN DE PERIODONTOPATÓGENOS ENTRE PAREJAS PRE Y POSTRATAMIENTO PERIODONTAL”, ha sido realizado bajo nuestra dirección y cumple todos los requisitos para optar al Grado de Doctor. Lo que firman en Sevilla a 13 de Octubre de 2015 Prof. Pedro Bullón Fernández Profa. Lorena López Cerero Profa. Mª del Carmen Machuca Portillo ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN 1. DEFINICIÓN DE PERIODONTITIS………………………………………………1 2. CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES….………2 2. 1 Características de las principales formas clínicas 3. EPIDEMIOLOGÍA DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES…………9 3.1 Factores de riesgo y de susceptibilidad 3.2 Efectos sistémicos 4. ETIOLOGÍA………………………………………………………………………..21 4.1 Revisión histórica de las teorías sobre la etiología de las enfermedades periodontales 4.2 Microbiología de las enfermedades periodontales 4.2.1 Características de una bacteria periodontopatógena 4.2.2 Bacterias periodontopatógenas 5. DIAGNÓSTICO……………………………………………………………………42 5.1 Exploración clínica y radiológica 5.2 Importancia del diagnóstico microbiológico en Periodoncia 5.3 Métodos de diagnóstico microbiológico 6. TRANSMISIÓN DE LA ENFERMEDAD………………………………………..50 6.1 Modelos de infección 6.2 Mecanismos de transmisión 6.3 La periodontitis como una enfermedad transmisible 6.4 Posibles vías de transmisión de bacterias periodontales 6.5 Consecuencias de la transmisión 7. PREVENCIÓN……………………………………………………………………..64 II. OBJETIVOS……………………………………………………………………….67 III. HIPÓTESIS………………………………………………………………………..68 IV. PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO………………………………………..…69 V. MATERIAL Y MÉTODOS 1. SELECCIÓN DE PACIENTES…………………………………………………..70 1.1 Criterios de selección 1.2 Cronograma 2. EXPLORACIÓN DE LOS PACIENTES………………………………………...71 2.1 Exploración clínica 2.2 Estudio radiológico 2.3 Tratamiento periodontal 3. EXPLORACIÓN DE LAS PAREJAS…….……………………………………..73 3.1 Exploración clínica 3.2 Estudio radiológico 3.3 Tratamiento perodontal 4. TOMA DE MUESTRAS…………………………………………………………..74 4.1 Toma de muestras en la primera visita de los pacientes 4.2 Toma de muestras al mes y a los seis meses de los pacientes 4.3 Toma de muestras en la primera visita de las parejas 4.4 Toma de muestras a los seis meses de las parejas 5. PROCESADO DE LAS MUESTRAS………………………………….………..75 5.1 Procedimiento para cultivo microbiológico 5.1.1Composición de los medios 5.1.2 Inoculación en los medios de cultivo 5.1.3 Incubación 5.1.4 Lectura 5.2 Muestras para PCR 5.2.1. Extracción y purificación del ácido nucleico 5.2.2. PCR cuantitativa 5.2.3. Tipificación 6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO……………………………………………………….81 7. ANEXO: Consentimiento informado de los pacientes y sus parejas…..83 VI. RESULTADOS 1. CASUÍSTICA……………………………………………………………………..85 2. SITUACIÓN CLÍNICA PERIODONTAL INICIAL Y RESPUESTA AL TRATAMIENTO………………………………………………………………….87 3. RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS………………………………………..91 3.1. Resultados de cultivo bacteriano 3.1.1. Cuantificación de recuentos bacterianos en los pacientes y las parejas antes y después del tratamiento periodontal 3.2. PCR Cuantitativa 3.2.1. Detección y cuantificación de Aa Y Pg en los pacientes y las parejas antes y después del tratamiento 3.3. Comparación de los resultados de cultivo bacteriano y PCR cuantitativa VII. DISCUSIÓN 1. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS Y ESTADO CLÍNICO DE LAS PAREJAS SELECCIONADAS………………………………………………..113 2.1 . Características demográficas 2.2 . Estado clínico de las parejas seleccionadas 2. TÉCNICAS DE ESTUDIO EMPLEADAS: CULTIVO Y PCR CUANTITATIVA……………………………………………………………...…115 3. PRESENCIA DE PERIODONTOPATÓGENOS EN EL ÁREA SUBGINGIVAL Y EN LA SALIVA………………........................................118 4. COMPARACIÓN DE HALLAZGOS CLÍNICOS Y MICROBIOLÓGICOS EN ENFERMOS PERIODONTALES Y SUS CÓNYUGES…….......................120 VIII. CONCLUSIONES……………………………………………………………..128 IX. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………129 - 1 - I. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES 1. DEFINICIÓN DE PERIODONTITIS El término “periodonto” (estructura de sostén dental) engloba cuatro tejidos blandos y duros distintos: la encía, el cemento radicular, el hueso alveolar y el ligamento periodontal, que une las dos últimas estructuras. La periodontitis es una enfermedad inflamatoria del aparato de sostén dentario. Está caracterizada por una destrucción del tejido conectivo, ligamento periodontal y del hueso alveolar, que a menudo conlleva la pérdida de piezas dentarias. El signo de destrucción periodontal es la “bolsa periodontal” originada por la pérdida de inserción, con proliferación en profundidad del epitelio de unión y su transformación en epitelio de la bolsa (Müller-Glauser y Schroeder 1982). Los factores determinantes para la génesis y progresión de la destrucción periodontal son, por una parte las características patogénicas de microorganismos implicados, y por otra, la respuesta del huésped, considerando como tal su estado inmunitario y sus características genéticas. Y un aspecto adicional que es la presencia de factores de riesgo, tanto ambientales (por ejemplo el tabaquismo) como sistémicos (por ejemplo padecer diabetes) (Kornman y cols 1997a, Salvi y cols 1997). Las enfermedades periodontales son producidas por la interacción de un agente microbiano, único o múltiple, considerado como el factor etiológico primario necesario, pero no suficiente; un huésped más o menos susceptible, y unos factores de riesgo que van a modular la susceptibilidad o resistencia del huésped a desarrollar la enfermedad (Page y Kornman 1997). - 2 - 2. CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES Desde 1982 (Page y Schroeder), se reconocen bajo el concepto de “enfermedades periodontales” las alteraciones inflamatorias de la encía y del periodonto. La gingivitis y la periodontitis son infecciones bacterianas caracterizadas por la presencia de inflamación y destrucción tisular, reversible en el caso de la gingivitis e irreversible en la periodontitis. La clasificación de las enfermedades periodontales está en continua remodelación, debido a los nuevos hallazgos clínicos y a la investigación. Hasta hace poco se aceptaba universalmente la nomenclatura de la American Academy of Periodontology (AAP) de 1989, que establecía cinco clases: periodontitis del adulto (PA) (I), periodontitis de aparición temprana (EOP) (II), con otras subdivisiones [periodontitis prepuberal (PP), periodontitis juvenil (PJ), periodontitis rápidamente progresiva (PRP)], periodontitis asociada a enfermedades sistémicas (III), periodontitis ulcerativa necrotizante aguda (GUNA/PUNA) (IV) y la periodontitis refractaria resistente al tratamiento (PR) (V). La utilización de esta clasificación presentaba numerosos defectos, ya que no permitía diferenciar cuadros clínicos con evolución y necesidades terapeúticas diferentes debido a un considerable solapamiento de las diferentes enfermedades y un énfasis inapropiado en la edad y en la ratio de progresión de la enfermedad (Armitage 1999). A finales de 1999, durante un seminario en Oak-Brook (Illinois, EE.UU), miembros destacados de la Academia Americana de Periodoncia (AAP) y de la Federación Europea de Periodoncia (EFP) elaboraron la clasificación (tipos I- VIII) (Armitage 1999) que se muestra en las tablas 1 y 2. - 9 - anticuerpos específicos contra la leucotoxina de Actinobacillus actinomycetemcomitans (Tonetti y Mombelli 1999). 3. EPIDEMIOLOGÍA DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES La epidemiología de las enfermedades periodontales ha sido y continúa siendo un tema bastante controvertido. Un requisito fundamental para todo estudio epidemiológico es contar con una definición precisa de la enfermedad que se investiga. Uno de los problemas con el que nos enfrentamos para revisar la epidemiología de esta patología es la disparidad de criterios en la definición de periodontitis recogida en los estudios epidemiológicos durante la última década, por lo que los hallazgos de los diferentes grupos investigadores no son fáciles de evaluar. Resulta difícil comparar distintos estudios que emplean parámetros diferentes y métodos de medición no calibrados entre sí. Estas incongruencias en las definiciones afectan inevitablemente a las cifras conocidas sobre la distribución de la enfermedad. Las diferencias más importantes entre los diversos estudios radican en los parámetros y procedimientos de exploración clínica. Un examen clínico óptimo de las condiciones periodontales debe incluir el sondaje perimetral en torno a todos los dientes, sin embargo, por razones prácticas, la mayor parte de los estudios epidemiológicos han empleado métodos parciales de registro. La discrepancia entre los hallazgos obtenidos por medio del examen parcial o total de la boca puede ser sustancial. Por ejemplo, Baelum y cols (1993), utilizando datos de un estudio transversal de 1.121 kenyanos de entre 15 y 65 años, compararon los resultados de exámenes de la boca completa con los obtenidos por el uso de 10 dientes índice. El estudio mostró que el registro parcial infraestima la existencia de bolsas (moderadas o profundas) en todos los grupos. La proporción de pacientes con bolsas ≥ 6 m que hubieran sido excluidas si sólo se hubieran explorado los dientes índice fue del 55% en el grupo de 25-29 años, del 39% (40-44 años) y del 23% (50-54 años). Por ello el uso del sistema IPCNT (índice periodontal comunitario y de necesidades de tratamiento) en estudios epidemiológicos de la enfermedad periodontal ha sido - 10 - evaluado críticamente en numerosas publicaciones (Papapanou y Lindhe 2005, Borrell y Papapanou 2005, Jenkins y Papapanou 2001, Andriankaja y cols 2006). A la heterogeneidad de medidas exploratorias habría que añadir que la mayoría de los estudios epidemiológicos publicados son estudios transversales, y no longitudinales. Hay una clara necesidad de estudios longitudinales prospectivos que dirijan hipótesis a partir de datos de estudios transversales y que incluyan factores de riesgo establecidos como covariables junto con nuevas exposiciones de interés, particularmente de trabajos de investigación diseñados como ensayos controlados o a doble ciego (Borrell y Papapanou 2005). Los hallazgos de estudios epidemiológicos realizados en la década de 1950 sobre la periodontitis en adultos, muestran la alta prevalencia de la enfermedad periodontal destructiva en la población adulta en general y un claro aumento en la prevalencia de la enfermedad con el envejecimiento. Scherp en 1964, en una revisión sobre la epidemiología de la enfermedad periodontal, constató que 1º) la enfermedad periodontal parece ser un problema mayor de salud pública mundial que afecta a la mayoría de la población adulta después de los 35-40 años; 2º) la enfermedad comienza como gingivitis a edad temprana y si se deja sin tratar, termina en periodontitis destructiva progresiva; 3º) más del 90% de la variación en la severidad de la enfermedad periodontal en la población puede explicarse por la edad y por la higiene bucal. Los principios descritos dominaron hasta finales de la década de 1970. Los estudios realizados durante la década de 1980 brindaron una clasificación más completa de las características de especificidad por sitio de la enfermedad periodontal, y de la alta variación de estados periodontales entre distintas poblaciones y dentro de ellas. En 1986 Baelum y cols mostraron que la enfermedad periodontal avanzada no estaba distribuida uniformemente en la población. El 75% de las localizaciones con pérdida de inserción ≥ 7mm se encontraba en el 31% de los sujetos. La mayoría de los sujetos examinados mostraban problemas periodontales mínimos, mientras que un grupo limitado - 11 - estaba afectado por enfermedad avanzada. Estos mismos autores, en 1988, sugirieron que “la enfermedad periodontal destructiva no debe ser contemplada como una consecuencia inevitable de la gingivitis que en última instancia lleva a una pérdida de dientes considerable” y requiere una caracterización más precisa de los rasgos de destrucción periodontal en las personas particularmente susceptibles. Varios estudios epidemiológicos publicados en los últimos 20 años verifican los principios enunciados. Las formas severas de periodontitis afectan a una minoría de sujetos en los países, en proporciones que no superan el 10-15% de la población (Papapanou 1996, Albandar y cols 1999). El porcentaje de estos sujetos aumenta considerablemente con el envejecimiento y parece alcanzar su pico a los 50-60 años (Horning y cols 1990, Flemming 1999) (tabla 3). El aumento de pérdida de dientes que se registra en este grupo de edad explicaría la declinación ulterior de la prevalencia. Tabla 3. Prevalencia de la periodontitis crónica expresada en porcentajes en sujetos con pérdida de inserción clínica (PIC), comprendidos en diversos grupos erarios (Flemming 1999) Edad (años) PIC (3-4 mm) PIC ≥ 5 mm . 18-35 9-35 0,3-6 36-55 18-70 12-27 > 55 44-81 35-51 En un metaanálisis sobre 42 estudios realizados en Europa, Estados Unidos y en Latinoamérica que emplearon el IPCNT, Miyazaki y cols (1991 a,b) constataron que, en general, a pesar de la enorme variación en los resultados, las gingivitis y las periodontitis leves están muy extendidas; y en cambio los fenómenos de gran pérdida ósea sólo se observan en el 10-15% de la población. Papapanou y Lindhe (2005) resaltan la dificultad de evaluar hasta - 12 - que punto los resultados pueden estar influidos por las limitaciones del sistema de registro parcial empleado. La prevalencia de periodontitis severa no se distribuye de manera uniforme entre las diversas razas, etnias o grupos socioeconómicos. Hay estudios que parecen indicar una mayor prevalencia de la enfermedad periodontal en individuos de raza negra de hasta tres veces más (Grossi y cols 1994, 1995). Sin embargo, un análisis detallado de la literatura confirma que estos hallazgos se podrían achacar a condicionantes socioeconómicos y culturales en las poblaciones estudiadas. Hobdell (2001), en una revisión de la literatura, concluye que, el incremento de determinadas enfermedades orales, entre ellas las enfermedades periodontales destructivas, puede atribuirse en parte a la creciente disparidad entre poblaciones ricas y pobres, tanto en ámbitos nacionales como internacionales, que posiblemente se está exacerbando por la globalización económica. La enfermedad en los niños y en los adolescentes suele comportarse de otra forma. La información sobre variantes de periodontitis que afectan a la dentición primaria (periodontitis prepuberal localizada/generalizada) proviene de informes de casos clínicos y no hay datos disponibles sobre su prevalencia y distribución en la población general. Los criterios usados en estudios que incluyeron muestras de niños (Shlossman y cols 1986, Sweeney y cols 1987) no son uniformes, de ahí que los datos sobre prevalencia varíen de forma significativa. Shlossman y cols (1986) utilizaron un valor del nivel de inserción ≥ 2mm como punto de referencia y mostraron que en una muestra de indios pimes hubo una prevalencia de 7,7% en los de 5-9 años y de 6,1% en los de 10-14 años. Sweeney y cols (1987) examinaron radiografías de 2.264 niños de 5-11 años, derivados de una clínica universitaria para el tratamiento odontológico e informaron que existía una pérdida ósea clara en las radiografías en uno o más molares en 19 niños (0,8%), 16 de los cuales eran negros, 2 caucásicos y 1 asiático. En cambio, conocemos datos más precisos sobre la periodontitis localizada agresiva (LJP). Su prevalencia varía en poblaciones geográfica o racialmente diferentes. La mayoría de los estudios - 13 - muestran una incidencia entre el 0,1 y 0,5% (Saxén 1980, Löe y Brown 1991). En personas de raza blanca la enfermedad parece afectar más a las mujeres y la prevalencia es baja (aproximadamente 0’1%). En otras razas y en particular en la negra, su frecuencia es mayor (probablemente en niveles superiores al 1%) y la relación por sexo parece invertirse, afectando más a varones (Löe y Brown 1991, Melvin y cols 1991). En cuanto a la pérdida de dientes, numerosos trabajos publicados señalan que la gran mayoría de las extracciones hasta los 40-45 años se deben a caries. Sin embargo, en grupos de edad más avanzada, la enfermedad periodontal y la caries se igualan. En general, se estima que la periodontitis provoca el 30-35% de todas las extracciones dentales, mientras que la caries supone el 50% de estas. Stephens y cols (1991) examinaron las razones para la extracción dental en 909 pacientes de edades comprendidas entre 14 y 91 años. La caries fue la principal causa (63%), seguida de la periodontitis (34%). En los grupos de edad adulta, los porcentajes eran aproximadamente los mismos. Reich y Hiller (1993) llevaron a cabo un estudio para recoger información sobre las principales causas de pérdida dental en estados del este de Alemania. La caries fue el motivo de la exodoncia del 20,7% de todas las extracciones, mientras que la enfermedad periodontal fue la razón de extracción del 27,3%. De acuerdo con los 68 dentistas participantes en el estudio alemán, la enfermedad periodontal es el motivo más frecuente de extracción dental en personas con más de 40 años, mientras que para aquellos por debajo de esa edad, la caries y las extracciones de terceros molares eran las razones más frecuentes. En otro estudio, McCaul y cols (2001) observaron que la caries y sus secuelas era la principal razón de pérdida de todos los tipos de dientes salvo los incisivos inferiores cuya extracción se debía principalmente a razones periodontales. 3. 1 Factores de riesgo y de susceptibilidad El término “factor de riesgo” hace referencia a un aspecto del comportamiento o del estilo de vida, una exposición al medio ambiente o una - 14 - característica congénita o heredada que acompaña a una enfermedad determinada, según demuestran los estudios epidemiológicos. Puede asociarse con una mayor probabilidad de manifestación de una enfermedad en particular, sin que sea necesariamente un factor causal y es, por definición, modificable. A diferencia de los “factores de riesgo modificables”, los factores inmodificables o de fondo, como la edad, el sexo o el genotipo son reconocidos como “factores de susceptibilidad”. En general hay un consenso en la literatura reciente sobre la identificación de factores de riesgo de periodontitis; sin embargo hay una falta de ensayos específicamente dirigidos a la distinción entre factores de riesgo que afectan al comienzo de la enfermedad (factores de riesgo verdaderos) y aquellos que afectan a su progresión, o incluso factores pronóstico determinantes del curso de la enfermedad bajo tratamiento. Las principales características individuales, condiciones clínicas, y enfermedades sistémicas que han sido investigadas en estudios epidemiológicos como supuestos factores de susceptibilidad y factores de riesgo modificables, incluyen edad, sexo, raza, polimorfismos genéticos específicos, estatus socioeconómico, placa dental, microbiota subgingival específica, tabaco, diabetes mellitus, obesidad, infección por VIH, osteoporosis y factores psicosociales (Genco 1996a, Albandar 2002, Borrell y Papapanou 2005). El tabaco (Gelskey 1999), la diabetes mal controlada (Grossi y Genco 1998) y altos niveles de colonización por bacterias específicas (Genco y Kornman 1996b) se han señalado como verdaderos factores de riesgo (Papapanou 1996), mientras que un gran número de factores putativos, incluyendo polimorfismos genéticos específicos, han sido identificados en estudios de asociación (Schenkein 2002). Vamos a revisar a continuación los llamados factores inmodificables o de fondo. Aunque la prevalencia de la enfermedad periodontal aumenta con la edad, la relación entre ésta y la periodontitis no está clara. Todos los estudios que han examinado grandes poblaciones respecto a prevalencia, extensión y avance de la enfermedad periodontal, han encontrado más enfermedad periodontal en grupos de edad avanzada (Grossi y cols 1994, 1995). Así por ejemplo, Mumghamba y cols (1995) en un estudio sobre 1.764 sujetos en - 15 - Tanzania, que evaluó la asociación entre la enfermedad periodontal y diversos factores de riesgo, mostró que una de los factores principales asociados con la enfermedad periodontal era la edad, con una odds ratio de 4.06 y 5.05 para los grupos de edad más avanzados, de 35-44 años y ≥ 45 años respectivamente. Aunque la pérdida de inserción y de hueso alveolar moderada es común en personas mayores, la periodontitis severa no es una consecuencia natural del envejecimiento. La repercusión de la edad puede representar el efecto acumulativo de la exposición prolongada a verdaderos factores de riesgo (Papapanou y cols 1991). Borrell y Papapanou (2005), en una revisión de la literatura, afirman que la “susceptibilidad individual” a la enfermedad periodontal parece ser más importante que la edad, y sujetos con elevada susceptibilidad manifiestan la enfermedad a una edad más temprana. Aunque no hay diferencias inherentes establecidas entre hombres y mujeres en la susceptibilidad a la periodontitis, los hombres muestran peor salud periodontal que las mujeres (Burt 1999). En la Third Nacional Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III), U.S., Albandar y cols (1999), observaron que los umbrales de pérdida de inserción ≥3mm, ≥ 4mm y ≥5mm se observaron, respectivamente, en el 23%, 44% y 55% más de hombres que mujeres. Cuando los porcentajes de dientes con pérdida de inserción se compararon en los dos grupos de género, los porcentajes correspondientes fueron de 48%, 65% y 93%, respectivamente. Un patrón similar de una incidencia más elevada de enfermedad en hombres que en mujeres, se observó en las medidas de profundidad de sondaje y recesión gingival del mismo estudio. Esto parece ser un reflejo de mejores prácticas de higiene oral entre las mujeres (Christensen y cols 2003, Albandar y cols 1999). En la NHANES III, Albandar y cols (1999) encontraron que los hombres como media tenían un 21% más de dientes con cálculo dental que las mujeres. Borrell y Papapanou (2005) señalan que es biológicamente posible que existan diferencias en la respuesta inmuno-inflamatoria del huésped, pero no ha sido demostrado. No se han documentado diferencias consistentes entre grupos étnicos cuando se tienen en cuenta la edad y la higiene oral (Burt 1999). Además la - 16 - raza/etnia y el estado socioeconómico están fuertemente relacionados. En un estudio reciente, encontraron que los sujetos de raza blanca que vivían en barriadas con nivel socioeconómico bajo tenían cuatro veces más probabilidad de tener trastornos de salud oral que sus equivalentes en barriadas de alto nivel (Borrell y cols 2004). La periodontitis afecta en mayor grado a determinadas familias (en algunas, el porcentaje de hermanos afectados alcanza el 40-50% [Boughman y cols 1992]), sobre todo las formas agresivas. En general, se considera que hay suficiente base científica a favor de la presencia de factores genéticos en la aparición de periodontitis agresivas, aunque no se dispone de datos de gemelos y hermanos adoptados que permitan separar la influencia genética del riesgo de exposición al mismo entorno familiar. En las periodontitis crónicas, en cambio, la evidencia de la participación genética es menos manifiesta y es dificíl de discriminar dado el sesgo de la posible existencia de reservorios en el hogar y transmisión intrafamiliar. En los últimos años ha habido un incremento exponencial en el número de publicaciones que examinan una multitud de polimorfismos genéticos (variaciones del gen IL-1, IL-10, TNF, etc.) como factores de severidad y susceptibilidad de periodontitis (Schenkein 2002). Entre las citocinas que regulan las reacciones inflamatorias figura la IL-1, cuya producción está regulada por los genes IL-1A e IL-1B. Las mutaciones de un único par de bases son bastante frecuentes; la secuencia de bases normal en el gen se denomina alelo 1, y la modificada, alelo 2. La mutación donde la base citosina es sustituida por la timina en la posición del nucleótido -889 (IL-1A) y en la posición del nucleótido +3953 (IL-1B) da lugar a una propensión acentuada a la inflamación. Se da el nombre de “genotipo IL-1 positivo” al genotipo que posee esta mutación en los dos alelos del gen, o al menos, heterocigóticamente en ambos genes IL (genes IL-1A e IL-1B). El primer estudio que describió una relación entre los polimorfismos codificantes de los genes IL-1 y la periodontitis fue presentado por Kornman y cols en 1997b, mostrando una asociación con la severidad de la periodontitis - 17 - en pacientes de raza blanca no fumadores (OR 18,9 en grupos de edad comprendidos entre 40 y 60 años). Sin embargo, la falta de asociación entre el genotipo IL-1 compuesto también ha sido comunicada para pacientes con periodontitis crónica y agresiva (Hodge y cols 2001, Rogers y cols 2002). Cullinam y cols (2001) realizaron un estudio en 295 sujetos con gingivitis y periodontitis moderada, que fueron seguidos durante 5 años y en quienes se determinó el genotipo IL-1 compuesto. El 39% de los individuos era portador de este genotipo. En los no fumadores mayores de 50 años, con genotipo IL-1 compuesto se observaron profundidades de sondaje mayores que en los negativos para este genotipo. Además se encontró una interacción significativa entre el genotipo IL-1 compuesto y la edad, el hábito de fumar y la presencia de Porphyromonas gingivalis, hecho que sugiere que ese genotipo es un factor de susceptibilidad contribuyente, pero no esencial para la progresión de la enfermedad periodontal. Sin embargo, Borrell y Papapanou (2005) afirman que no hay suficiente evidencia epidemiológica que establezca de forma convincente ninguno de los polimorfismos genéticos estudiados como un verdadero factor de riesgo. A diferencia de los factores de fondo, existen otros que son adquiridos, ambientales y de conducta/comportamiento. Así, el nivel socioeconómico o educacional bajo se ha relacionado con mayores índices de enfermedad periodontal; su papel puede atribuirse a diferencias en la posibilidad de acceder a medios y oportunidades que faciliten comportamientos preventivos (Albandar 2002, Borrell y Papapanou 2005). Por otra parte, un hábito tóxico como el tabaquismo está considerado hoy en día como un factor de riesgo verdadero (Machuca y cols 2000); el fumador severo tiene 2,5 a 7 veces más probabilidad de desarrollar una periodontitis crónica (Kinane y Chestnutt 2000). En un estudio de Haber y cols (1993) encontraron que en una población joven (19 a 30 años), el 51-56% de las periodontitis se asociaban con el hábito de fumar. Entre las enfermedades sistémicas, la diabetes mellitus es un factor de riesgo verdadero de periodontitis, especialmente en sujetos con mal control metabólico y larga duración de la enfermedad (Grossi y Genco 1998, Taylor y cols 1998, Lalla y cols 2004). En un estudio longitudinal de dos años Taylor y - 18 - cols (1998) evaluaron el riesgo de pérdida de hueso alveolar mediante radiografías panorámicas en 14 diabéticos no-insulinodependientes mal controlados, en 7 con diabetes mejor controlada y 338 no diabéticos, y encontraron que la odds ratio de desarrollar pérdida ósea a lo largo del tiempo era 2.2 en los diabéticos mejor controlados comparados con los individuos no diabéticos, y 5.3 en los diabéticos mal controlados comparados con los mejor diabéticos controlados. Lalla y cols (2004) estudiaron la asociación entre diabetes mellitus y enfermedad oral en 150 adultos con diabetes y 150 sujetos control, procedentes de una población urbana con bajo nivel socioeconómico, y hallaron un incremento del 50% de pérdida ósea alveolar en los diabéticos comparados con el grupo control. Aunque numerosas publicaciones de la pasada década señalan un incremento en la prevalencia y la severidad de la periodontitis en sujetos VIH- seropositivos (Robinson y cols 1996, McKaig y cols 1998), otros, o no apoyan esta idea o indican que las diferencias en el estado periodontal entre sujetos VIH-seropositivos y VIH-seronegativos son mucho más limitadas de lo que se creía en un principio. Lamster y cols (1997) concluyeron que la progresión de la enfermedad periodontal en presencia de infección por HIV depende de la competencia inmunitaria del huésped y de la respuesta inflamatoria local a la microbiota subgingival típica y atípica. Datos de su laboratorio demuestran una respuesta alterada de mediadores de la inflamación (beta-glucoronidasa e interleuquina-1 beta). La alteración se manifiesta como la ausencia de la fuerte correlación esperada entre la actividad de los leucocitos polimorfonucleares en el surco gingival y las mediciones clínicas de la enfermedad periodontal existente, así como niveles elevados de interleukina-1 beta en localizaciones con profundidades de sondaje aumentadas. Hofer y cols (2002) demostraron que sujetos HIV-positivos que cumplían cuidadosamente el tratamiento periodontal, podían mantenerse periodontalmente, de manera similar a los sujetos no infectados. El examen de las muestras de placa tomadas de localizaciones con periodontitis en individuos seropositivos indicó que la microbiota subgingival era muy similar a la observada en los sujetos con periodontitis no infectados con el VIH, excepto que se encuentren ocasionalmente microorganismos no frecuentes (Rams y cols 1991). Rams y - 25 - Las enfermedades periodontales son, junto a la caries, las enfermedades infecciosas más comunes que afectan al ser humano. La característica más destacada de estas enfermedades es que están causadas por microorganismos que residen en biocapas externas al organismo (placa dental supra y subgingival) que se organizan/adhieren sobre los dientes o las superficies periodontales. Estas biopelículas están formadas por microcolonias de células bacterianas (15-20% del volumen), no distribuidas de manera aleatoria, que se encuentran rodeadas por una densa matriz de exopolisacáridos –sobre la cual se pueden depositar otros materiales tanto orgánicos como inorgánicos (Socransky y Haffajee 2002). La biopelícula promueve propiedades metabólicas que no serían posibles si las bacterias se encontraran en estado planctónico, y proporciona un medio protector para la colonización y multiplicación de microorganismos, aumentando la resistencia de estos a los mecanismos defensivos del huésped y a los agentes antimicrobianos (Socransky y Haffajee 200a). Por lo general se desconoce el reservorio de los patógenos. En su mayor parte las especies encontradas en los seres humanos son específicas de ese entorno y, no suelen hallarse en el ambiente ni en la microbiota subgingival de otras especies animales y se considera que el reservorio podría ser el ser humano (Van Winkelhoff y Boutaga 2005). Por ello se cree que la transmisión en las familias o entre personas no emparentadas desempeña un papel esencial en la transmisión de estos patógenos (Petit y cols 1993ab, Saarela y cols 1993, Preus y cols 1994). La formación de una biocapa sobre una superficie limpia, dura y no descamativa, como el diente, tras su inmersión en un medio líquido, como la cavidad oral, se desarrolla en varias fases. Inmediatamente después de su inmersión o después de la limpieza, se produce la adsorción de macromoléculas hidrófobas [glucoproteínas salivales e inmunoglobulinas] a la superficie formando una biopelícula (la película adquirida). La adhesión bacteriana a esta capa supone la incorporación de los formadores primarios de la placa: cocos y bacilos grampositivos facultativos. Este fenómeno se produce - 26 - en dos etapas: la primera, reversible, en la que las bacterias se adhieren débilmente, y a continuación se alcanza un status irreversible en el que la unión se consolida. Los colonizadores primarios se multiplicarán para formar colonias favoreciendo el crecimiento de la matriz extracelular. Sobre receptores de estas bacterias se producirá la adición secuencial de más especies, entre ellas gramnegativos anaerobios estrictos, hasta formar una biocapa más compleja y madura, cuya heterogeneidad se incrementará con el tiempo (Marshall 1992) (Fig 1.). Estos aspectos los desarrollamos con mayor detalle al describir los efectos sinérgicos de los periodontopatógenos (4.2.2 Bacterias periodontopatógenas). Fig 1. Etapas de la formación de una biocapa. La formación de esta estructura tan compleja necesita tiempo, que, en función de las condiciones ambientales del surco gingival y las características patogénicas de los componentes de la flora subgingival, explicarían la asociación encontrada en los estudios epidemiológicos entre la edad y la gravedad de las lesiones. La composición de la flora supra e infragingival difiere, ya que se observan diferencias de composición y de cantidad. El aporte sanguíneo local y los componentes del líquido gingival facilitan el crecimiento de las especies bacterianas gramnegativas con mayor potencial periodontopático. Debido a la dificultad de obtener muetras de placa subgingival preservada en su posición - 27 - entre la encía y los tejidos duros del diente, sólo se dispone de algunos estudios sobre su estructura interna (Listgarten 1976, Westergaard y cols 1978). La estructura de la placa supra y subgingival es similar, en particular, en casos de gingivitis sin bolsas profundas. Las bacterias incluyen cocos gramnegativos y grampositivos, bacilos y microorganismos filamentosos. Se observan espiroquetas y bacterias flageladas, especialmente en la zona más apical de la placa. La capa superficial suele ser menos densa, con leucocitos interpuestos entre la placa y la superficie epitelial del surco (Listgarten 1976). En la bolsa periodontal, la estructura de la placa adquiere mayor complejidad. Se distinguen cuatro nichos ecológicos subgingivales de composición probablemente diferente: a) la superficie del diente (placa adherida), b) el medio líquido del exudado gingival (placa laxamente adherida), c) la pared blanda de la bolsa y d) la superficie del epitelio de unión (Listgarten y cols 1975, 1976). Aún no se ha investigado en profundidad la composición bacteriana de estos reservorios, desconociéndose la influencia de cada uno de ellos en la patogenia de la enfermedad. Los estudios de Listgarten y cols (1975, 1976 y 1979) mostraron que la superficie orientada hacia el tejido blando almacena una cantidad mayor de espiroquetas, bacterias flageladas y cocos y bacilos gramnegativos. Estos estudios llevaron a la teoría de los complejos de Sokransky y su disposición espacial en el surco. Estudios posteriores han detectado la presencia de grandes cantidades de bacterias periodontopatógenas en la biocapa que recubre la superficie epitelial (P. gingivalis, Tr. denticola y T. forsythia) (Kigure y cols 1995, Dibart y cols 1998). 4.2.1 Características de una bacteria periodontopatógena En la cavidad oral se ha detectado hasta ahora la presencia de más de 700 microorganismos distintos, empleando técnicas de cultivo y métodos moleculares, y más de 400 de ellos se hallan en las bolsas periodontales (Paster y cols 2006), los cuales normalmente se mantienen en un equilibrio ecológico fisiológico con el organismo huésped. Lo que conocemos hasta - 28 - ahora es que del conjunto de bacterias orales, un subgrupo de especies bacterianas, las denominadas especies periodontopatógenas, son capaces de desencadenar la destrucción del periodonto. El desequilibrio que produce este subgrupo suele corregirse espontáneamente o tras la aplicación de medidas terapéuticas (Socransky y Haffajee 2005a). Debido a la complejidad de la flora subgingival, fue necesario establecer la relación causal, para lo cual Haffajee y Socransky (1994) adaptaron los postulados de Koch para utilizarlos en la identificación de patógenos periodontales y propusieron los siguientes criterios: 1. Asociación: elevadas odds ratios en enfermedad al compararlo con sujetos sanos. 2. Eliminación: conversión de enfermedad a salud cuando las bacterias son eliminadas. 3. Desarrollo de una respuesta inmunitaria específica del huésped. 4. Presencia de factores de virulencia. 5. Evidencia de estudios en animales corroborando las observaciones en humanos: la inoculación en animales desarrolla la enfermedad. 6. Apoyo de estudios de evaluación de riesgo. En conjunto, estos apartados señalan que la consideración de una especie como periodontopatógena, no se basa en un solo criterio, sino en el “peso de la evidencia” de una evaluación. No sólo es importante su asociación con la enfermedad, sino la mejora de la enfermedad tras la “eliminación” de los patógenos con el tratamiento, la activación de la respuesta del huésped a la infección específica, la constatación de la presencia de factores de virulencia, la creación de cuadros clínicos similares a la periodontitis en la experimentación animal y el apoyo de estudios prospectivos en los que puede evaluarse el riesgo de progresión de la enfermedad por la presencia de un microorganismo en determinados niveles. - 29 - 4.2.2 Bacterias periodontopatógenas Basándose en los criterios descritos por Socransky, el Congreso Mundial de Periodoncia (Genco y Kornman 1996b) identificó tres especies como patógenos periodontales: Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), P.gingivalis (Pg) y Tannerella forsythia (Tf) (anteriormente conocida como Bacteroides forsythus). Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aggregatibacter actinomycetemcomitans): Fue la primera especie reconocida en el “consenso de patógenos periodontales”, inicialmente por su asociación con lesiones de LJP, y más tarde por la reducción de sus niveles en sujetos tratados con éxito, la respuesta elevada de anticuerpos para esta especie, la inducción de la enfermedad en animales de experimentación y la presencia de numerosos factores de virulencia (Haffajee y Socransky 1994). Actinobacillus actinomycetemcomitans pertenece al género Actinobacillus, de la familia Pasteurellaceae. Es un bacilo pequeño, gramnegativo, capnofílico, no móvil, sacarolítico, de extremos redondeados, que crece en medios de cultivo formando colonias pequeñas y convexas con un centro en “forma de estrella” (Murray y cols 1999). El nicho ecológico primario de Aa es el área subgingival (Slots y cols 1980), aunque se encuentra frecuentemente en superficies dentales supragingivales, en las mucosas de la cavidad oral y también puede aparecer en saliva (Socransky y cols 1999). Recientemente se ha propuesto la reclasificación de este microorganismo en función del gen que codifica la nicotinamida fosforibosil transferasa (enzima que permite a Aa y algunos Haemophilus crecer sin factor V). La propuesta englobaría a Aa dentro del género Aggregatibacter junto con H. aphrophilus y H. segnis (Norskov-Lauritsen y Kilian 2006). Numerosas líneas de investigación apoyan su papel etiológico como un verdadero patógeno periodontal, sobre todo en relación con periodontitis agresivas (Slots y Ting 1999, Fives-Taylor y cols 1999, Socransky y cols 1999). - 30 - Aa no sólo ha sido encontrado en diferentes formas de periodontitis, sino también en sujetos periodontalmente sanos. Asikainen y cols (1991) obtuvieron muestras de placa subgingival y de saliva estimulada de 293 sujetos, 232 con periodontitis y 61 periodontalmente sanos, y detectaron Aa en el 62,5% de las muestras de los sujetos sanos y en el 71,9% de las muestras de los individuos con periodontitis. Aa es una especie heterogénea en cuanto a su capacidad patogénica. Se han reconocido seis serotipos de Aa (Henderson y cols 2002). El serotipo b es el más frecuentemente asociado con periodontitis agresiva localizada, y el considerado más virulento y patogénico (Henderson y cols 2002). Zambon y cols (1983a) estudiaron 29 pacientes con PJL y observaron que la incidencia del serotipo b era aproximadamente dos veces superior que los serotipos a o c, sugiriendo un mayor potencial patógeno de este serotipo. Por otra parte, Haraszthy y cols (2000b), empleando una técnica de PCR, detectaron este tipo clonal virulento en 39 de 71 sujetos con LJP. Este serotipo es muy homogéneo genéticamente, se han detectado pocos clones diseminados en grandes áreas geográficas, a diferencia de los otros serotipos que son muy heterogéneos (Haubek y cols 1996) El serotipo a, ha sido implicado en formas adultas de la enfermedad periodontal destructiva, pero su papel está menos claro (Zambon 1983b). En esta especie se han identificado varios factores de virulencia: una leucotoxina, una toxina de distensión celular, mecanismos de adherencia como la producción de pili y proteínas específicas y, por último los carbohidratos extracelulares. La leucotoxina es una toxina de la familia RTX, a la que pertenecen la alfa-hemolisina de Escherichia coli y la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis (Lally y cols 1999). Esta toxina interfiere con el funcionamiento de los polimorfonucleares humanos, induce la apoptosis de los leucocitos y, a altas concentraciones, es capaz de formar poros transmembrana provocando la muerte celular (Baehni y cols 1979). En estudios recientes se planteó la posibilidad de que sólo un subgrupo de tipos clonales de Aa fuera el causante de la PJL. En un estudio, DiRienzo y - 31 - McKay (1994) sobre 800 aislamientos de miembros de 18 familias con al menos un miembro con PJL activa o una historia documentada de la enfermedad y uno o más hermanos, menores de 13 años, sin evidencia clínica de LJP y 32 sujetos control, identificaron un genotipo específico de Aa que parecía estar asociado con la PJL y fue asociado con la conversión de salud periodontal a enfermedad. Identificaron también dos clones que fueron aislados exclusivamente en sujetos periodontalmente sanos (RFLP Tipo XIII y XIV). Brogan y cols (1994) y otros evidenciaron que el tipo clonal virulento (JP2) mostraba una producción 10 a 20 veces aumentada de leucotoxina respecto a una cepa de Aa mínimamente tóxica (652) y se hallaba frecuentemente en pacientes de origen norteafricano (Haubek y cols 1996, 2002). Haubek y cols (2001) estudiaron 217 muestras de placa de niños marroquíes con EOP, 131 (60,4%) fueron positivas en el cultivo para Aa. En los pacientes que fueron postivos para Aa, se recuperaron 19 aislados en los que se observó una delección de 530 bp en la zona del promotor del gen que codifica la leucotoxina, ltx. La consecuencia de esta delección es una producción aumentada de la toxina. Se halló una fuerte asociación entre la presencia del clon JP2 de Aa y EOP (OR=29,4). Además, se ha identificado la producción de uan seguna toxina, cdt, capaz de inducir la apoptosis de linfocitos T y B, pero no afecta a los fibroblastos (Shenker y cols 1982). Esta toxina de distensión celular es similar a la asociada a Campylobacter jejuni, E. coli y Shigella spp (Pickett y Whitehouse 1999). El efecto más significativo de ambas toxinas es la interrupción de la actividad leucocitaria y linfocitaria, produciéndose un mayor reclutamiento de células inflamatorias. Como consecuencia de esta hiperreactividad, se produce el daño tisular del tejido conectivo y óseo. El grupo clonal JP2 tiene una capacidad de colonización persistente no observada en otras variantes genéticas de esta especie. En un estudio realizado en 365 niños marroquíes, Haubek y cols (2009) observaron que casi la mitad de los pacientes estaban infectados de forma continua por este microorganismo y que esto estaba relacionado (RR = 13.9) con una forma agresiva de la enfermedad. En este tipo de aislados se ha identificado una “isla - 32 - de colonización extendida” (widespread colonization island o WCI). Esta isla, denominada complejo WCI, es un conjunto de 14 genes que codifican proteinas (flp-rcp-tad) responsables de la adherencia, autoagregación y formación de la biocapa (Planet y cols 2003). Adicionalmente a este complejo, se ha detectado en esta especie la producción de un polímero extracelular de D-glucosamina, demnominado PGA, que actúa en la formación de la biocapa como cemento que facilita la autoagregación (Kaplan y cols 2003). Por último, los pacientes con periodontitis juvenil presentan niveles de anticuerpos séricos contra Aa claramente elevados en comparación con los de sujetos sanos (Listgarten y cols 1981, Ebersole y Taubman 1994). Listgarten y cols (1981) determinaron los niveles de anticuerpos séricos contra cuatro cepas de Aa utilizando una técnica de inmunofluorescencia indirecta en tres grupos de 21 pacientes cada uno con periodontitis juvenil, periodontitis crónica y sin periodontitis y encontraron que los niveles medios de anticuerpos contra Aa estaban significativamente elevados (p<0.05) en el grupo de periodontitis juvenil para tres de las cepas que contenían una leucotoxina. Porphyromonas gingivalis: Es un miembro del género Porphyromonas, de la familia Bacteroidaceae; pertenece al grupo de los Bacteroides de pigmentación negra que forman colonias de color negro-amarronado. Es un coco-bacilo gramnegativo, anaerobio estricto, no móvil, y asacarolítico, que forma pequeñas colonias convexas (1-2mm) con una típica pigmentación marrón oscura o negra (Murray y cols 1999). El nicho ecológico de Pg es el área subgingival (Slots 1979, Danser y cols 1995), aunque se puede encontrar de manera ocasional en las mucosas orales y en saliva. Van Winkelhoff y cols (1988) encontraron Pg en seis de ocho muestras de saliva de pacientes con periodontitis sin tratar en recuentos de 6 a 20 x 106 UFC/ml. Es considerado un verdadero patógeno periodontal, más comúnmente asociado con la periodontitis crónica (Slots y Ting 1999, Socransky y cols 1999, Holt y cols 1999). - 33 - Madianos y cols (1997), en un estudio in vitro, observaron que Pg puede inhibir la migración de los PMN a través de la barrera epitelial. Además en otro estudio in vitro, Sandros y cols (2000) demostraron que Pg afecta a la producción o degradación de citocinas por células de mamíferos. Esta especie se ha encontrado en escasa cantidad en sujetos sanos o con gingivitis, y se detecta con mayor frecuencia en las formas destructivas de la enfermedad (Haffajee y Socransky 1994). Wolf y cols (1993) observaron que la OR de encontrar altos niveles de Pg era de 3.9 en bolsas > 5mm. También se ha demostrado que aumenta su número o frecuencia de detección en localizaciones deterioradas. Así, en un estudio sobre 16 pacientes con EOP se detectó mediante PCR la presencia de Pg en el 71,9% de las localizaciones activas (Kamma y cols 2001). Además se ha asociado con un riesgo elevado de gravedad y progreso de la enfermedad. Grossi y cols (1995) encontraron que la colonización subgingival por Pg estaba asociada con una pérdida ósea severa (OR 1,73). El hecho de que pueda estar presente Pg en bolsas periodontales activas y en surcos gingivales sanos sugiere que es una especie heterogénea con subpoblaciones de elevada y baja patogenicidad (Frandsen y cols 2001). Se han empleado diversos métodos de tipificado molecular para la caracterización de clones patógenos. Sin embargo, el poder discriminatorio y la reproducibilidad de estos métodos son variables. Estudios basados en la secuenciación de varios genes esenciales, metodología denominada Multilocus Type Sequencing o MLST, sugieren que esta especie es panmítica. En este sentido llama la atención que el 7% del genoma de esta especie contiene secuencias repetitivas, especialemente secuencias de inserción o IS. Estas secuencias originan una alta frecuencia de recombinación intraespecífica, aunque con escasa repercusión a nivel proteico, pero que produce un alto grado de polimorfismo (Koehler y cols 2003). En esta especie bacteriana se observa una mayor variabilidad en el especio intergénico de los genes codificantes de ribosomas (ISR) que en el propio gen 16S ARNr que se usa habitualmente para determinar filogenia. (Rumpf y cols 2000). Griffen y cols (1999) analizando las secuencias IRS, - 34 - determinaron la existencia de 11 heteroduplex o variantes genéticas mientras que en otros estudios, com o el de Ley y cols (Leys y cols 1999), se han encontrado hasta 22 variantes clonales. En ambos estudios se detectó Pg en el 79% de los sujetos con periodontitis y en el 25% de los individuos sanos (p< 0,0001), pero lo más interesante fue la asociación de algunas variantes genéticas, como la HW83, la h49417 y la hHG1691, que estaban significativamente asociadas a enfermedad. La probabilidad de encontrar hW83 y h49417 fue (para cada una de ellas) casi diez veces superior en pacientes con periodontitis que en sujetos sanos, pero el intervalo de confianza del 95% fue menor para la hW83. Estos datos indican que la virulencia en la periodontitis humana varía entre las cepas de Pg, e identifican un subgrupo muy virulento. En un estudio de Enersen y cols (2006) se analizaron un total de cuarenta cepas de Pg procedentes de 9 países de 4 continentes mediante MLST (multilocus sequence typing); 38 de pacientes con periodontitis crónica y 2 de un estudio en monos Macaca fascicularis con periodontitis. Utilizando esta metodología se identificaron un total de 33 patrones, y se hallaron clones idénticos o relacionados en aislamientos de diferentes regiones geográficas. Estos resultados mostraron signos de una estructura poblacional clonal, con un nivel de recombinación no tan elevado como el que se había sugerido previamente para esta especie. Este estudio proporciona evidencia adicional de una alta diversidad genética de la especie, pero a pesar de la amplia recombinación, existe algún grado de clonalidad en la subpoblación patógena de Pg. En esta especie se han identificado varios determinantes de patogenicidad: el polisacárido capsular, o antígeno K, las hemaglutininas, la fimbria y las gingipaínas. Únicamente los clones virulentos están capsulados y poseen los genes codificantes de los enzimas responsables de la síntesis de la cápsula (Aduse-Opoku y cols 2006). Los anticuerpos producidos por los pacientes periodontales están dirigidos frente a esta estructura polisacárida (O´Brien-Simpson y cols 2000) y se ha observado que es responsable de reducir la respuesta inmune de los fibroblastos (Brunner y cols 2010) Las - 41 - Figura 3. Esquema representativo de la coagregación bacteriana en la placa subgingival (Kolebrander y cols 2002). - 42 - 5. DIAGNÓSTICO 5.1 Diagnóstico de la periodontitis En el diagnóstico debemos considerar tres aspectos: el motivo de consulta, los cambios inflamatorios de la encía y los signos de destrucción periodontal. Los motivos de consulta son, con frecuencia, signos y síntomas tardíos de la enfermedad e incluyen la movilidad y migraciones dentarias, recesiones gingivales, abscesos periodontales y halitosis. El grado de inflamación gingival se evalúa mediante un examen visual y el sangrado al sondaje, que detecta la presencia de inflamación subgingival. La lesión inflamatoria destructiva del periodonto da lugar a una migración apical del epitelio de unión y a una afectación de los tejidos periodontales profundos (cemento radicular, ligamento periodontal y hueso alveolar). Las manifestaciones clínicas principales de la enfermedad son la presencia de profundidades de sondaje superior a 3 mm y la recesión gingival. La pérdida de inserción clínica (suma de la recesión gingival más la profundidad de bolsa al sondaje) junto con el estudio radiológico, mediante serie periapical, nos permite valorar la pérdida de soporte óseo y realizar un diagnóstico completo de la afectación periodontal. Las bolsas con mayor profundidad de sondaje tienen mas riesgo de progresión que las poco profundas, tanto en pacientes tratados como en los no tratados; además, cuanto mayores son las profundidades de sondaje mayor es el riesgo de progresión de la enfermedad en el futuro (Greenstein 1997a). El sangrado al sondaje es el indicador más preciso de actividad de la lesión (Lang y cols 1986), sin embargo, hay que tener en cuenta que los signos de inflamación pueden estar ausentes en períodos de inactividad o ser signos inespecíficos de inflamación gingival. Lang y cols (1990), en un estudio prospectivo de dos años y medio de duración concluyeron que el hecho de que el valor predictivo positivo de progresión de enfermedad fuera sólo del 6% y el valor predictivo negativo del 98% hace que la ausencia contínua de “sangrado al sondaje” sea un predictor fiable del mantenimiento de la salud periodontal. - 43 - Es necesario además, valorar otros aspectos como la edad de comienzo y la tasa de progresión del proceso (si tenemos datos clínicos o radiológicos anteriores del mismo paciente). La extensión del proceso indicará si un caso es diagnosticado como localizado o generalizado, y la severidad de la destrucción periodontal nos indicará si estamos ante un caso inicial, moderado o avanzado. Es importante determinar la presencia de factores de susceptibilidad y de riesgo que pueden influir negativamente en el resultado del tratamiento y en la evolución durante el mantenimiento. 5.2 Importancia del diagnóstico microbiológico en Periodoncia La utilidad del diagnostico microbiológico persigue varios objetivos en la consecución final de una eficacia terapéutica. En primer lugar se trata de distinguir tipos microbiológicos de infecciones periodontales, para seleccionar a los pacientes que deben recibir tratamiento antibiótico sistémico (periodontitis agresiva, refractaria, recurrente, combinadas con enfermedades sistémicas, periodontitis crónica muy avanzada e implantología). La elección del tratamiento óptimo pretende la eliminación de los gérmenes y trata de evitar la aparición de resistencias. Varios estudios han probado la utilidad de la identificación microbiológica como ayuda en el plan de tratamiento, como el trabajo de Rosenberg y cols (1993) que investigaron la eficacia de obtener datos basales de cultivo y datos de sensibilidad en pacientes con periodontitis del adulto. Individuos diagnosticados de PC, PRP o PR fueron seguidos durante un período de 6 años. Más del 95% de los pacientes con PC fueron tratados con éxito únicamente con terapia mecánica; aproximadamente la mitad de los pacientes con PRP fueron tratados con éxito sin antibióticos y, todos los pacientes con PR necesitaron antibióticos sistémicos. La mayoría de los sujetos con PC mostraban una o dos especies de microorganismos al inicio, y éstas eran eliminadas o reducidas a niveles muy bajos mediante la terapia mecánica. Por el contrario, los pacientes con PRP o PR presentaban múltiples especies y - 44 - requerían antibióticos sistémicos junto con la terapia mecánica para detectar descensos de recuentos de bacterias en la microflora subgingival. Asimismo el diagnóstico microbiológico ayuda a establecer cuando se debe terminar el tratamiento periodontal activo, y contribuye a definir la frecuencia del mantenimiento. Renvert y cols (1996) evaluaron el efecto clínico del tratamiento dirigido a la supresión de Aa y Pg por debajo de los niveles de detección, y Pi por debajo del 5% de la flora cultivable de la bolsa periodontal. La presencia de Aa, Pg y Pi, solos o en combinación, se correlacionó con cambios en el nivel de inserción a nivel individual. Chaves y cols (2000) demostraron que la presencia de Pg tenía un valor predictivo en su progresión y en la pérdida de hueso alveolar (valor predictivo positivo 84%, valor predictivo negativo 85%, odds ratio 31.9, p<0.0001). En el mismo sentido, Tran y cols (2001) comprobaron que los pacientes en los que persistía Tf tenían 5.3 veces más probabilidades de desarrollar pérdida de inserción que aquellos que no lo tenían. En otro estudio (Dahlen y Rosling 1998) se evaluó si la presencia de Aa, Pg y Pi, detectados por cultivo podía discriminar entre pacientes con enfermedad periodontal recurrente, con enfermedad periodontal tratada o sujetos periodontalmente sanos. Aunque los tres microorganismos se encontraban significativamente más frecuentemente en sitios enfermos, se concluyó que una muestra positiva para los tres indicaría una falsa señal de actividad de la enfermedad. Sin embargo, una muestra negativa para las tres bacterias indica fuertemente ausencia de actividad de la enfermedad. Por último, las técnicas de diagnóstico microbiológico permiten seleccionar pacientes con necesidad de tratamiento periodontal previo a la colocación de implantes (especialmente si tienen historia de periodontitis) (Van WinKelhoff 2000a), y aportan información sobre la transmisión horizontal y vertical de patógenos periodontales (Van Winkelhoff 2005a). - 45 - 5.3 Métodos de diagnóstico microbiológico La variabilidad que se observa en los diferentes estudios que analizan la prevalencia de periodontopatógenos en diferentes grupos de pacientes se debe en parte a los diferentes métodos de detección empleados. Las tres especies cultivables, y especialmente Pg y Tf, son bacterias difíciles de obtener con medios habituales en el laboratorio. La incorporación de métodos moleculares específicos para estas bacterias, no dependientes del cultivo, ha permitido incrementar la sensibilidad en la detección. 1. Tipos de pruebas microbiológicas A. Cultivos: La obtención de cultivos bacterianos es uno de los métodos de diagnóstico clásicos más antiguos, dirigido a caracterizar la composición de la microflora subgingival, y continúa siendo el método de referencia (gold standard) para determinar la utilidad de nuevas pruebas diagnósticas en microbiología. Mediante cultivos selectivos y no selectivos obtenemos colonias de Aa, Pg y Tf (Liébana 2002). Las técnicas de cultivo presentan sin embargo algunas limitaciones: Las bacterias deben mantenerse vivas durante el transporte; los periodontopatógenos suelen ser anaerobios, y pueden causar problemas en la toma y las condiciones de transporte al laboratorio (O2, temperatura, medio nutritivo); el cultivo requiere tiempo, conocimientos microbiológicos y un equipamiento adecuado de laboratorio con los costes correspondientes. Además las bacterias anaerobias orales crecen muy lentamente, y, en ocasiones, hay que esperar unas tres semanas para obtener un resultado definitivo. Por otra parte algunas especies bacterianas son difíciles de cultivar (Sakamoto y cols 2002), a lo que hay que añadir que la sensibilidad del cultivo puede ser muy baja, especialmente en medios no selectivos, con límites de detección entre 103 - 104 bacterias, por lo que patógenos específicos que se encuentren en pequeñas cantidades pueden no ser detectados. - 46 - B. Pruebas inmunológicas: La identificación inmunológica de las bacterias se efectúa mediante anticuerpos monoclonales (Ac) que deben reaccionar frente a determinados antígenos (Ag) específicos (estructuras como pili, fimbrias; mayoritariamente hidratos de carbono y glucoproteínas). Para hacer visible la unión Ag-Ac se emplean sustancias colorantes o fluorescentes. La inmunofluorescencia permite observar la reacción Ag-Ac en el microscopio de fluorescencia (luz ultravioleta). Las bacterias fijadas en el portaobjetos se ligan, mediante sus antígenos superficiales específicos para cada tipo, a los anticuerpos específicos añadidos, que llevan adheridas moléculas fluorescentes. En los procedimientos con inmunofluorescencia directa el Ac está marcado con una enzima fluorescente, y se acopla sin intermediarios al antígeno bacteriano. En las técnicas indirectas, en un primer tiempo se forma un complejo Ag bacteriano / Ac específico, y en un segundo tiempo se añade un segundo Ac, esta vez marcado con un fluorocromo, que se fija sobre el primer Ac (Wolf y cols 2005c). Zambon y cols (1985) mostraron que las técnicas de inmunofluorescencia indirecta eran comparables con el cultivo bacteriano en su capacidad para identificar Aa y Pg en muestras de placa subgingival. La sensibilidad de la inmunofluorescencia indirecta comparada con el cultivo fue del 91 al 100% mientras que la especificidad varió del 87 al 89%. Listgarten y cols (1995) compararon la utilidad diagnóstica de las técnicas indirectas y el cultivo para la detección de Aa, mostrando una sensibilidad más alta de las técnicas indirectas (41,8%) y una tasa de detección significativamente más elevada (39,4% para el cultivo frente al 81,8% para las técnicas indirectas). Las pruebas de ELISA (enzimo-inmunoanálisis) se basan en una reacción cromática. A diferencia de los métodos anteriores que usan el microscopio, en este caso la lectura es automática y en un autoanalizador. Quizás su principal ventaja reside en el examen simultáneo de numerosas muestras, o para la valoración de titulaciones (Liébana 2002). Las pruebas inmunológicas para bacterias orales proporcionan una estimación cuantitativa o semicuantitativa de los microorganismos marcadores. - 47 - Estos métodos han mostrado una mayor sensibilidad y especificidad que el cultivo bacteriano en la detección de Aa, Pg y Tf; sin embargo requieren el uso de anticuerpos monoclonales para asegurar una elevada especificidad y los límites de detección son similares o inferiores que los del cultivo (103 - 104). Snyder y cols (1996) encontraron un límite de detección de 105 para Aa y 106 para Pg. Tienen además la ventaja de que no exigen una toma de muestras rigurosa y un transporte metodológico para asegurar la viabilidad de las bacterias. Sin embargo están limitadas por el número de anticuerpos que se ponen a prueba, no sirven para estudiar la susceptibilidad a los antibióticos y hay una falta de estudios clínicos bien controlados que los validen (Sanz y cols 2004). C. Pruebas bacterianas enzimáticas. Test BANA Determinadas bacterias periodontopatógenas como Tf, Pg, Td o Capnocytophaga spp, producen una enzima similar a la tripsina capaz de degradar el sustrato sintético N-α-benzoilo-DL-arginina-2-naftilamida o BANA. Uno de los productos de descomposición es la β-naftilamida, que puede hacerse visible mediante una reacción cromática y utilizarse para la identificación de gérmenes. El test BANA (Perioscan®), aunque es relativamente barato y rápido, no sirve para detectar Aa, y se ha visto que otros gérmenes de la bolsa poco patógenos también pueden ser BANA positivos. Loesche y cols (1992) propuso el empleo de esta reacción BANA en las muestras de placa subgingival para detectar la presencia de cualquiera de estos patógenos periodontales y así servir como un marcador de actividad de la enfermedad, mostrando que las bolsas poco profundas tenían solo un 10% de reacciones BANA positivas, mientras que las bolsas profundas (7mm) mostraban un 80-90% de reacciones BANA positivas. - 48 - D. Técnicas de biología molecular Son técnicas directas que permiten realizar el diagnóstico microbiológico a partir de la muestra clínica, mediante la amplificación de un componente bacteriano, el ácido nucleico, hasta un nivel detectable en unas pocas horas. La metodología comprende las siguientes fases: obtención del ácido nucleico a partir de la muestra clínica, amplificación por un procedimiento enzimático (reacción en cadena de la polimerasa: PCR) y, por último, detección del producto amplificado. Pueden emplearse diferentes técnicas para su detección (sondas, checkerboard DNA-DNA, PCR), lo cual es necesario para identificar la especie bacteriana que posee el ADN aislado. Socransky y cols (1994) describieron una técnica de hibridación de ADN en dámero que permitía detectar y determinar los niveles de un gran número de especies bacterianas subgingivales simultáneamente a partir de una o varias muestras de placa; “checkerboard DNA-DNA”. Para ello emplearon sondas de ADN de genoma completo marcadas con digoxigenina, consiguiendo la hibridación simultánea del ADN desnaturalizado de 43 muestras con 43 sondas diferentes de ADN. Papapanou y cols (1997) analizaron 283 muestras de placa subgingival y compararon este método con el cultivo para la identificación de bacterias subgingivales (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia/Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens, Bacteroides forsythus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Streptococcus sanguis and Streptococcus mutans). Tomando el cultivo como referencia, la sensibilidad de detección de la técnica checkerboard oscilaba entre 0,17 y 0,86, con una especificidad de 0,17 a 1.0, y una fiabilidad diagnóstica de 0,51 a 0,81 dependiendo de la especie bacteriana. El método más sensible disponible para la detección de secuencias de ADN es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ashimoto y cols (1996) desarrollaron un método de detección por PCR basado en las secuencias 16s del ARNr para determinar la prevalencia de Aa, Tf, Cr, Rc, Pg, Pi, Pn, y Td. Los - 49 - resultados en cultivo y PCR coincidían en el 28% (Tf) y en el 71% (Aa) de las muestras. La mayor discrepancia ocurrió en los casos de muestras PCR- positivo, cultivo-negativo. Esto se debió al menor límite de detección de la PCR, entre 25 y 100 células, en comparación con el cultivo (104-105 UFC/ml). Eick y Pfister (2002) compararon una PCR comercial de la secuencia 16s del ARNr para Aa, Pg, Pi, Tf y Td con el cultivo bacteriano. La PCR era capaz de detectar Pg y Tf más frecuentemente que el cultivo, con una sensibilidad del 86% y una especificidad del 76% para Pg. Aa era detectado de forma similar con ambos métodos. De igual manera Riggio y cols (1996) estudiaron la detección de Aa y Pg en muestras de placa subgingival de pacientes periodontales mediante PCR y cultivo en un total de 170 muestras de placa de 43 pacientes. Aa y Pg fueron detectados, cada uno de ellos en 40 (24%) de las muestras mediante PCR, mientras que por cultivo se detectó Aa y Pg en 25 (15%) y 18 (11%) de las muestras, respectivamente. Sin embargo, la PCR estándar proporciona sólo información cualitativa sobre las bacterias estudiadas, y por tanto, su uso es limitado. La PCR en tiempo real con cebadores especie-específicos es un método preciso y sensible para una cuantificación fiable de especies bacterianas individuales (Sanz y cols 2004). Los cebadores principalmente empleados en métodos diagnósticos basados en PCR para la detección de bacterias periodontales son normalmente las secuencias 16s ARNr (Ashimoto y cols 1996). Lyons y cols (2000) empleando un sistema TaqMan determinaron la cantidad de Pg en muestras de placa subgingival. Usando cebadores especieespecíficos y una sonda fluorescente, la detección de ADN de diluciones seriadas de células de Pg fue lineal en un amplio rango de concentraciones de ADN (coeficiente de correlación = 0,96). Shelbourne y cols (2000) usaron también una sonda TaqMan para cuantificar Tf con cebadores basados en las secuencias 16s del ARNr. Al comparar esta PCR cuantitativa con el test de ELISA observaron idénticos resultados en 36 de las 54 muestras estudiadas y obtuvieron un falso positivo y 17 falsos negativos con el test de ELISA usando la PCR como método estándar. Sin embargo cada bacteria puede contener una cantidad variable de secuencias 16s del ARNr, y por tanto, estos cebadores pueden no ser adecuados para un análisis cuantitativo. Por ello, el empleo de - 50 - cebadores basados en una copia única de una secuencia genética es más adecuado. Morillo y cols (2004) desarrollaron un método para la cuantificación de Aa, Pg y Tf de muestras de placa subgingival basado en la tecnología de la “PCR en tiempo real Taq-man”. Para ello se obtuvieron estas especies bacterianas tras el cultivo de cepas de referencia y se llevó a cabo el recuento microscópicamente. Los cebadores para la PCR fueron seleccionados de las secuencias de los genes LktC (Aa), Arg-gingipain (Pg) y BspA antigen (Tf) para la obtención de amplicones por debajo de los 100 pares de bases. La PCR en tiempo real basada en la Taq-man se ajustó para cuantificar cada especie separadamente. Se calcularon los valores de los umbrales de los ciclos para cada especie de acuerdo al número inicial de copias. Se obtuvo una elevada sensibilidad (101 copias para Aa y Tf y 102 para Pg) y especificidad para la detección de las tres especies bacterianas (no se demostró reacción cruzada con ninguna de las especies estudiadas). Además, la técnica demostró una buena “repetibilidad” en los valores umbrales de ciclo obtenidos para cada número inicial de copias, mostrando coeficientes de variación por debajo del 5% para cada bacteria. 6. TRANSMISIÓN DE LA ENFERMEDAD 6.1 Modelos de infección Para poder entender las diferencias entre las diversas bacterias periodontopatógenas hay que distinguir la infección oportunista de la endógena. Microorganismos comensales, constituyentes de la flora normal de las personas, pueden causar enfermedades infecciosas cuando se diseminan desde sus nichos ecológicos normales a zonas del cuerpo estériles. Estos microorganismos pueden sobrevivir en el nuevo medio si son capaces de unirse a la superficie del huésped y de resistir su respuesta inmune. La enfermedad se desarrolla especialmente en personas con mecanismos defensivos alterados (p. ej., por intervenciones quirúrgicas, enfermedades sistémicas, utilización incorrecta de antibióticos,…) y se denomina “infección oportunista”. - 57 - todos los aislamientos bacterianos pueden ser tipificados usando sondas dirigidas a las secuencias de ADN con lugares de ARNr. Alaluusua y cols (1993) estudiaron 54 aislamientos de Aa obtenidos a partir de 9 familias (12 niños y 11 padres). En 5, los aislamientos pertenecientes a la misma familia tenían idénticos patrones de hibridación. En otras 3 familias, cada miembro albergaba sólo un ribotipo de Aa. Sólo en un grupo familiar la madre tenía dos ribotipos, uno común con la hija y uno diferente. Este estudio confirma resultados previos sobre la transmisión intrafamiliar de Aa.  Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE): El genoma bacteriano es digerido con una enzima de restricción que tiene relativamente pocos sitios de reconocimiento, y así genera aproximadamente 10-30 fragmentos que son separados por electroforesis de campo pulsante para producir un patrón de bandas. Valcarcel y cols (1997) aplicaron este método para el tipificado de 19 cepas de Aa y obtuvieron un alto grado de polimorfismo con 13 perfiles distintos.  Reacción en cadena de la polimerasa con cebadores (primers) arbitrarios (Arbitrarily primed [AP-PCR]): Este tipo de técnica de PCR usa un cebador corto que no está dirigido a amplificar ninguna secuencia específica del ADN bacteriano. Los productos resultantes representarán una variedad de fragmentos de ADN de diferente tamaño según las bases. Asikainen y cols (1996) emplearon esta técnica para tipificar aislamientos de Aa de miembros de las mismas familias. En 11 de 12 grupos familiares encontraron idénticos genotipos de Aa, sugiriendo la transmisión de este microorganismo.  Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP): Es una PCR de una secuencia común, seguida de una restricción que proporciona fragmentos diferentes. Van Winkelhoff y cols (2000b), empleando esta técnica demostraron que los aislamientos de Aa de un padre y su hijo que padecía periodontitis eran indistinguibles, sugiriendo la transmisión del microorganismo. Los marcadores fenotípicos o genéticos únicos entre aislamientos bacterianos independientes son un prerrequisito para estudiar la distribución de distintas cepas bacterianas entre individuos. Las cepas de una misma especie pueden mostrar una virulencia variable, y tipificar estas cepas puede ayudar a distinguir entre representantes patogénicos y menos patogénicos de una especie. - 58 - Estudios de transmisión: La información referida a la transmisión de periodontopatógenos por contactos humanos puede ser relevante para determinar factores de riesgo de la enfermedad y desarrollar estrategias preventivas. Se ha señalado que los dos patógenos periodontales principales, Aa y Pg, se agrupan en familias (Zambon y cols 1983b, Gunsolley y cols 1990, van der Velden y cols 1993, Petit y cols 1994), sin embargo las casuísticas que apoyan estos datos son cortas y las metodologías no han sido uniformes. Mediante la utilización de métodos de tipificación molecular, se ha podido evidenciar que padres e hijos pueden compartir clones idénticos de Aa y Pg o bien estar infectados por cepas diferentes. Se encontraron patrones distintos para las cepas aisladas de familias diferentes (DiRienzo y Slots 1990, Alaluusua y cols 1993, Petit y cols 1993a, b). Petit y cols (1993a, b) observaron que Aa podía transmitirse entre miembros de una misma familia, pero con una baja frecuencia, un 15% para los niños y un 8% entre parejas. Preus y cols (1994) al comparar las cepas de Aa mediante AP-PCR, detectaron en seis de siete familias diferentes genotipos de Aa en ambos conyugues. En cambio en los hijos se aisló un genotipo idéntico al de uno de sus padres. Se ha descrito también que ambos miembros de la pareja comparten los mismos clones, lo que indica que estas especies pueden ser transmitidas entre parejas. Van Steenbergen y cols (1993) demostraron que, en seis de ocho parejas, los pacientes periodontales y sus cónyuges compartían los mismos clones aislados de Pg, ya que mostraban patrones de restricción indiferenciables. Saarela y cols (1993) encontraron en dos de cuatro parejas los mismos serotipos y ribotipos de Aa, y dos de cuatro parejas que compartían los mismos ribotipos de Pg. Tuite-McDonnell y cols (1997) en un estudio sobre transmisión de Pg en 104 familias, empleando una técnica de detección por PCR, demostraron que el contacto con un miembro familiar infectado incrementa sustancialmente el riesgo relativo de colonización de los cónyuges (4), de los niños y sus padres - 59 - (3), los niños y sus madres (4.7), adultos y sus madres (2.4), y hermanos (2.4). Los cónyuges de individuos infectados tenían casi cuatro veces más probabilidad de ser colonizados que los cónyuges de sujetos no colonizados. Esto sugiere la posibilidad de transmisión entre parejas. Sin embargo, no observaron ninguna relación entre la transmisión y el tiempo de casados, lo que indica que la transmisión probablemente ocurre en los primeros años de matrimonio. Asikainen y cols (1996) estudiaron la frecuencia de transmisión entre parejas casadas, y de padres a hijos de Aa (47 familias) y Pg (31 familias) comparando mediante AP-PCR. La transmisión entre las parejas de Aa se produjo en el 36% de las mismas y de Pg en el 20%. La transmisión de padres a hijos de Aa tuvo lugar en el 32% de las familias. Pg no se transmitió de padres a hijos en ninguna de las familias estudiadas. Aunque disponemos de pocos estudios, no sólo se ha podido evidenciar la transmisión, sino que además se ha observado que los clones compartidos entre las parejas poseen factores de patogenicidad implicados en una colonización más eficaz. Asano y cols (2003) demostraron que el gen que codifica las fimbrias de las cepas de Pg pertenece al tipo II, más eficaz en la unión a células epiteliales, en 5 de seis parejas cuyos patrones de PFGE eran idénticos. Esto sugiere que sólo aquellos clones con determinados factores de virulencia tienen capacidad de colonización y y transmisión entre individuos con una relación estrecha. Van Winkelhoff y Boutaga (2005b), en una revisión de la literatura que incluye ocho estudios de transmisión, señalan que la frecuencia de transmisión vertical de Aa oscila entre el 30% y el 60%, mientras que la transmisión vertical de Pg sólo se observa ocasionalmente. La frecuencia de transmisión horizontal entre parejas de Aa varía entre el 14% y el 60%, y entre el 30% y el 75% para Pg. - 60 - 6.4 Posibles vías de transmisión de bacterias periodontales Aa y Pg pueden encontrarse en el área subgingival, en la saliva, en la placa supragingival y en la mucosa de la cavidad oral de pacientes con periodontitis (Van Winkelhoff y cols 1988, Socransky y cols 1999). En pacientes con periodontitis la placa supragingival normalmente contiene una mayor proporción de Pg que en sujetos sanos. Socransky y cols (1999) encontraron recuentos de 0,6 x 105 y 0,1 x 105 UFC/ml en la placa supragingival de sujetos enfermos y sanos respectivamente; e igualmente de 1,4 x 105 y de 0,1 x 105 UFC/ml en la subgingival. Ambas especies se diseminan intraoralmente a través de saliva contaminada, y colonizan la placa supragingival antes de afectar el área subgingival (Socransky y cols 1999). La infección subgingival ocurre en sitios con y sin pérdida de inserción periodontal. Se ha especulado que las bolsas profundas de sujetos con la enfermedad actúan como reservorios para diseminar la infección a zonas sanas (Riviere y cols 1996). No hay evidencia de que las bacterias periodontales puedan ser transmitidas a través de aerosoles, pero sí parece probable que la saliva y el contacto mucoso directo sean vías de transmisión de estas bacterias. Los objetos inanimados (instrumentos odontológicos, cepillos dentales) también pueden servir como vehículo de transmisión (Christersson y cols 1985, Glass y Lare 1986). Aa y Pg pueden ser cultivados a partir de la saliva de pacientes con periodontitis (Van Winkelhoff y cols 1988). La transmisión de bacterias orales de un individuo a otro depende de la cantidad de bacterias transmitidas, de su virulencia y capacidad intrínseca de colonización y del número de veces que son transmitidas. El contacto mucoso a través de los besos puede ser por tanto una vía posible de inoculación directa de estos patógenos en otra persona. La supervivencia de patógenos periodontales en la saliva fuera de la cavidad oral no se conoce. La inoculación indirecta puede ocurrir cuando un cepillo de dientes contaminado se utiliza durante las siguientes horas a su uso. Müller y cols (1989), empleando técnicas de cultivo, examinaron los cepillos de dientes de 21 pacientes con enfermedad periodontal destructiva, todos tenían Aa en - 61 - cuantía moderada a elevada en la placa subgingival. El 29% de los cepillos contenían cantidades detectables de Aa. Inmediatamente después del cepillado esta cifra se elevaba al 62%, pero disminuía al 50% después de una hora. Quirynen y cols (2001), investigaron el índice de supervivencia de especies periodontopatógenas y cariogénicas en cepillos dentales, con y sin pasta de dientes, y en cepillos interdentales de 12 pacientes con periodontitis, y demostraron que los detergentes de la pasta de dientes disminuían el índice de supervivencia de especies patógenas en los cepillos (2 logaritmos a nivel basal, otros 2 logaritmos a las 4 horas y un logaritmo adicional a las 8 horas para las especies aerobias y anaerobias), pudiendo así limitar el riesgo de traslado de las bacterias. La dosis mínima de infección y el número de exposiciones requeridas para la transmisión de Aa o Pg de una persona a otra se desconoce, pero parece probable que ambos parámetros influyan en la odds ratio de transmisión. 6.5 Consecuencias de la transmisión Las consecuencias clínicas de la transmisión de Aa o Pg de una persona enferma a otra no se conocen. En ocasiones, a pesar de poseer el agente infectante, las parejas de los pacientes con periodontitis no desarrollan la enfermedad. Esto puede ser atribuido a la respuesta del huésped, a sus mecanismos de defensa frente a las bacterias, a un antagonismo entre bacterias, aunque también cabe la posibilidad de que se deba a una menor patogenicidad de las bacterias infectantes (Greenstein 1997b). Por ejemplo, Christersson y cols (1985) demostraron que las sondas periodontales eran capaces de distribuir patógenos desde localizaciones enfermas a sanas en pacientes con PJL. Sin embargo, la monitorización de 16 localizaciones mediante cultivo que fueron contaminadas por Aa tras la inserción de una sonda, reveló que Aa persistió en sólo 8 localizaciones tras una semana, 2 localizaciones después de 2 semanas, y no se halló en ninguna localización transcurridas 3 semanas. Por tanto, a pesar de la transmisión microbiológica, - 62 - los pacientes fueron capaces de resistir al desarrollo de nuevas localizaciones colonizadaspor Aa. Los autores sugirieron que esto se puede haber debido al efecto de limpieza de las bolsas por el fluido crevicular gingival, a un antagonismo bacteriano, o, con más probabilidad, a la respuesta inmune del paciente. Numerosos trabajos indican que Aa y Pg pueden ser encontradas en sujetos sin destrucción periodontal manifiesta (Petit y cols 1993a,b, Van Steenbergen 1993, Van Winkelhoff 2002). Estas especies probablemente pueden persistir en equilibrio con el huésped y la microflora residente durante años, sin embargo, no está claro qué factores microbiológicos o del huésped determinan el inicio de la destrucción periodontal a partir de la infección por estos patógenos. Hay estudios que sugieren que la cohabitación con una persona con periodontitis puede influenciar el estado periodontal de la pareja (Petit y cols 1994, Von Troil-Linden y cols 1995; Van Winkelhoff y Boutaga 2005b). Aunque no se pueden descartar factores causales ambientales comunes, los resultados de varios estudios sugieren que la transmisión de microorganismos virulentos es un factor importante (Tuite-McDonnell y cols 1997; Asano y cols 2003) sin embargo, son necesarios más estudios para probar esta hipótesis. Petit y cols (1994) investigaron la prevalencia de microorganismos periodontopatógenos y la destrucción periodontal en las parejas y los hijos de pacientes adultos con periodontitis, en un grupo de 24 familias, con 49 niños. Por debajo de los 5 años, ninguno de los niños tenía CAL, mientras que entre los 5-15 años, el 26,5% tenían 1-5 sitios con 1-3 mm de CAL. Un total de 16 parejas tenían una forma leve a moderada de periodontitis, con al menos un sitio con 1 a 4 mm de CAL y 5 parejas tenían destrucción periodontal severa con sitios que mostraban al menos 8 mm de CAL. En 18 de 24 pacientes los resultados confirmaron Pg. Este microorganismo se encontró en un niño de 5 años y en 11 de las parejas. Por otra parte, Aa se detectó en 13 pacientes, 5 niños y 5 de las parejas. Si un niño albergaba uno de los periodontopatógenos, al menos uno de los padres era también positivo para esa bacteria. - 63 - Von Troil-Linden y cols (1995), llevaron a cabo un examen clínico, radiológico y microbiológico de las condiciones periodontales en dos grupos de parejas casadas para valorar similitudes entre marido y mujer. Los sujetos enfermos (n=10) tenían una periodontitis avanzada y los sanos (n=10) presentaban un estado periodontal normal. Las muestras fueron cultivadas para Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus and Peptostreptococcus micros. La media de frecuencia de detección de bolsas moderadamente profundas (4-5 mm) y profundas (≥6 mm) fue significativamente mayor en las parejas de los sujetos enfermos que en las parejas de los sanos. Se hallaron bolsas profundas en seis parejas de los individuos enfermos y sólo en dos parejas de los sujetos sanos. Los enfermos y sus cónyuges tenían Aa, Pg, P. intermedia, C. rectus and P. micros en 4, 6, 9, 9 y 4 parejas respectivamente. Los sanos y sus parejas tenían estos patógenos en 0, 1, 9, 5 y 3 parejas, respectivamente. Pg se encontró en 7 parejas de los individuos enfermos y sólo en 2 de los sujetos sanos. Aunque se ha demostrado la transmisión intrafamiliar (Petit y cols 1994, Von Troil-Linden y cols 1995; Asikainen y cols 1996), parece probable que también se produzca entre individuos no relacionados, hasta por un contacto casual. Cabe destacar que ya a principios de 1900 algunos autores sugirieron que los brotes severos de GUNA después de la primera guerra mundial se debieron a la transmisión de bacterias virulentas, lo que respalda la idea de que los patógenos periodontales pueden transmitirse con facilidad de una persona a otra, especialmente cuando se trata de clones muy virulentos de Aa y Pg. Así, parece probable que nuevas especies o diferentes cepas de la misma especie pueden ser adquiridas con relativa frecuencia por un individuo en diferentes etapas de su vida. La posibilidad de que halla una recidiva o una nueva infección podría repercutir en el enfoque terapéutico (Von Troil-Lindén y cols 1996). - 64 - 7. PREVENCIÓN La eficacia de la actuación odontológica sobre la enfermedad y su prevención requiere la colaboración del paciente, que debe ser formado e informado en el mantenimiento de su salud. El odontólogo, no sólo necesita unos conocimientos actualizados en el diagnóstico periodontal y en su terapéutica, sino también capacidad de comunicación con el paciente. La prevención primaria trata de la información, instrucción en higiene oral y de medidas profilácticas (oral y antibiótica si procede). El principal agente desencadenante de la gingivitis y de la periodontitis es la placa bacteriana, sin la cual no se desarrolla la inflamación marginal. Por lo tanto, la prioridad recae sobre la prevención y la eliminación de la placa y el tártaro dental, y en la motivación del paciente para mantener una higiene oral adecuada. Además se debe actuar sobre los elementos locales que favorecen el depósito de placa: factores iatrogénicos (restauraciones, prótesis inadecuadas), apiñamientos, etc. Eliminar el 100% de placa es prácticamente imposible, por lo que hay que procurar obtener un grado óptimo de higiene oral (índice de placa), para impedir sus efectos patológicos, y mantenerlo en el tiempo. Tradicionalmente, el abordaje terapéutico de las periodontitis se hacía desde la visión del paciente de forma aislada, sin considerar el entorno de relación personal. En la actualidad debemos incluir el criterio de riesgo de la transmisión derivado de la convivencia con personas afectadas. Por ello, estaría justificada la revisión rutinaria de las parejas de pacientes periodontales, y la recomendación de tener especial precaución con sus hijos. - 65 - Para cortar estas vías de transmisión se deben adoptar diversas medidas como la revisión odontológica de los individuos y su tratamiento cuando proceda, y uso higiénico individual de los utensilios, tanto para la limpieza bucodental como los de la alimentación. Basándonos en los conocimientos actuales, la realización de técnicas microbiológicas de screening (despistaje) y la prevención de la transmisión de clones específicos virulentos de Aa puede ser viable y efectivo para prevenir algunas formas de enfermedad periodontal. Pg es recuperada frecuentemente de sujetos adultos enfermos, y la transmisión de este patógeno parece estar restringida a individuos en ese grupo de edad. La transmisión horizontal de Pg puede ser controlada mediante el tratamiento periodontal, que engloba la eliminación o supresión significativa del patógeno en individuos enfermos, y con un alto nivel de higiene oral (Van Winkelhoff y Boutaga 2005b). La respuesta del huésped a la infección es determinante en la aparición y evolución de una periodontitis, La actuación sobre factores de riesgo modificables que a su vez influyen en la susceptibilidad y en la microflora subgingival, tales como el tabaco, el estrés o enfermedades sistémicas que MADRE HIJO PADRE HIJO TRANSMISIÓN HORIZONTAL TRANSMISIÓN HORIZONTAL TRANSMISIÓN VERTICAL - 66 - favorecen o contribuyen a causar una periodontitis es también una parte destacada de la prevención (Albandar 2002). La prevención secundaria trata del diagnóstico precoz de la enfermedad y del tratamiento antiinfeccioso, mientras que la prevención terciaria incluye la detección y prevención de la reaparición de la enfermedad tratada (necesidad de un mantenimiento periodontal). - 73 - Al mes de finalizar el tratamiento se reevaluó a los pacientes con una nueva exploración periodontal con especial atención al sangrado. En esta evaluación se decidió si el paciente era dado de alta para pasar a controles periódicos, o si debía volver a tratar alguna zona, e incluso plantear la indicación de cirugía periodontal en sitios que sangraban al sondaje y con profundidades de bolsa ≥5 mm (Kaldahl y cols 1993). Seis meses después del tratamiento se exploraron los mismos parámetros clínicos. 3. EXPLORACIÓN DE LAS PAREJAS 3.1 Exploración clínica: Idéntica a la del paciente 3.2 Estudio radiológico: Se realizó una serie periapical completa sólo en las parejas que padecían periodontitis (según el punto 2). [Toma de muestra (ver apartado 4)] 3.3 Tratamiento periodontal: Los cónyuges que presentaban periodontitis recibieron el mismo tratamiento que los pacientes, y a los sujetos periodontalmente sanos se les hizo una tartrectomía con cureta y pulido. Al mes de completar el tratamiento en las parejas con periodontitis, se llevó a cabo una reevaluación, decidiendo darles de alta para pasar a controles periódicos, tratar nuevamente alguna zona o bien someterlos a cirugía periodontal. Seis meses después del tratamiento se exploraron los mismos parámetros clínicos. - 74 - 4. TOMA DE MUESTRAS Muestras periodontales: 1) El procedimiento seguido consistió en aislar la zona con rollos de algodón, retirar la placa supragingival con una cureta y secar el exceso de saliva con una gasa (sin usar chorro de aire). 2) Se introducía una punta de papel absorbente estéril del nº 50 (Maillefer®) hasta el fondo de la bolsa durante 30 segundos y se extraía evitando que entrara en contacto con saliva o con la mucosa oral. 3) Se incluía en 2 ml de VMGA-III que se destinaba a procesamiento por cultivo. 4) Se tomaba otra muestra de la misma bolsa para efectuar los métodos moleculares, durante el mismo periodo de tiempo, y se introducía en un tubo Eppendorf estéril. Muestras de saliva: 1) El paciente segregaba saliva durante 5 minutos y se recogía en un recipiente estéril. 2) Se tomaban 2 mililitros de saliva con una pipeta estéril, añadiendo uno en un tubo Eppendorf estéril y otro en el medio VMGA-III. 4.1 Toma de muestras microbiológicas en la primera visita de los pacientes En cada enfermo se obtuvieron:  Cuatro muestras de placa subgingival de 2 bolsas con una profundidad de sondaje  5mm  Dos muestras de un punto con una profundidad de sondaje  3 mm,  2 ml de saliva 4.2 Toma de muestras microbiológicas al mes y a los seis meses de los pacientes - 75 - El procedimiento se repitió al mes y a los seis meses de finalizar el tratamiento. 4.3 Toma de muestras microbiológicas en la primera visita de las parejas En la pareja, si padecía periodontitis se seguía una metodología igual que el enfermo, y si era periodontalmente sana se obtenían cuatro muestras de dos dientes que hubiesen sido sondados y 2 ml de saliva. 4.4 Toma de muestras microbiológicas a los seis meses de las parejas El procedimiento se repitió a los seis meses de finalizar el tratamiento. 5. PROCESADO DE LAS MUESTRAS 5.1 Procedimiento para cultivo microbiológico 5.1.1 Composición de los medios  Medio VMGA-III (Möller 1966) Objetivo: Permitir la viabilidad de la muestra durante el tiempo de traslado al laboratorio. El medio contiene Bacto gelatina (5 %), Thiona peptona (0,05 %), Bacto agar (0,002 %), L-cisteína-HCL (0,05 %), azul de metileno (0,003 %), CaCl2.6H2O (0,024 %), KCl (0,042 %), NaCl (0,1 %), Ácido tioglicólico (0,05 %), Na glicerofosfato (1 %), Acetato fenilmercúrico (0,0005 %), MgSO4.7H2O (0,01 %).  Medio VMG-1 (Murray y cols 1999) Objetivo: Medio para diluir las muestras. - 76 - Contenido: triptosa (0,25 %), thiona E peptona (0,25 %) y ClNa 0,5 %).  Agar Brucella selectivo (Murray y cols 1999) Objetivo: Crecimiento de anaerobios. Contenido: Agar Brucella (4,5 %), Bacto agar (0,3 %), vitamina K (0,005 %), sangre desfibrinada al 5%, hemina (0,005 %), vancomicina (0,002 %) y gentamicina (0,02 %).  Agar Brucella (Murray y cols 1999) Objetivo: Cultivo de anaerobios. Contenido: Agar Brucella (4,5 %), Bacto agar (0,3 %), vitamina K (0,005 %), sangre desfibrinada al 5%, hemina (0,005 %).  Medio TSBV (Tryptic soy-serum-bacitracin-vancomycin) (Slots 1982) Objetivo: Cultivo de A. actinomicetemcomitans Contenido: Tryticase Soy Agar (4 %), extracto de levadura (0,1 %), suero de caballo (10 %), bacitracina (0,075 %), y vancomicina (0,005 %).  Medio Dentaid-1 (Alsina y cols 2001) Objetivo: Cultivo de A. actinomicetemcomitans Contenido: Brain heart infusion agar (BHIA), extracto de levadura (0,5 %), fumarato sódico (0,15 %), formato sódico (0,1 %) y vancomicina (0,009 %). - 77 - 5.1.2 Inoculación en los medios de cultivo Las muestras se inoculaban en los medios de cultivo en un plazo máximo de 2 horas. 1. Los tubos que contienen las puntas de papel incluidas en el medio de transporte se agitan durante 30” en un vórtex para liberar los microorganismos de las puntas de papel al medio. 2. Se efectúan diluciones seriadas 1/10, 1/100, 1/1.000 y 1/10.000 y se siembran en TSBV, Dentaid-1, Agar Brucella y Agar Brucella selectivo. 5.1.3 Incubación Las placas sembradas en medios específicos para anaerobios (Agar- Brucella y Agar Gentamicina-Vancomicina) se introducen y se reincuban en condiciones de anaerobiosis utilizando jarras OXOID de 2,5 l con el sistema AnaeroGenTM (OXOID Ltd.). Las jarras se incuban en una estufa a 35ºC +/- 2ºC. Los medios específicos para Aa (TSBV y Dentaid-1) se incuban en una atmósfera de 10% de CO2 a 37ºC. 5.1.4 Lectura - Para determinar si existe crecimiento de anaerobios se examinan las placas a los 7 y 14 días empleando una lupa estereoscópica. - Para efectuar el recuento se selecciona la dilución en la que se visualiza crecimiento de 5-100 colonias. - Las colonias con morfología compatible con Pg, Aa y Tf se subcultivan en medio sin antibiótico y se conservan congeladas a - 80ºC - 78 - 5.2 MUESTRAS PARA PCR 5.2.1. Extracción y purificación del ácido nucleico Durante la primera fase el objetivo principal es conseguir romper o lisar la célula bacteriana, sin destruir o deteriorar los ácidos nucleicos, bien el ácido desoxirribonucleico (ADN) o bien el ácido ribonucleico (ARN). Se han utilizado diferentes métodos químicos, enzimáticos y físicos para obtener ADN en suficiente cantidad y calidad para su análisis con sondas de ADN o PCR que permiten detectar y en algunos casos cuantificar las bacterias marcadoras periodontopatógenas. Para el empleo de técnicas de diagnóstico molecular es necesario extraer y purificar el ADN bacteriano de las muestras, liberándolo de otras sustancias, principalmente proteínas, que puedan interferir en las siguientes fases. La extracción del ADN se llevó a cabo con el kit QIAamp DNA (Qiagen®) según las indicaciones del fabricante. Procedimiento: 1. Preparar dos baños de agua caliente, uno a 70 ºC y otro a 95 ºC. 2. Centrifugar las muestras de saliva a 13.000 rpm durante 15min a 4ºC. y desechar el sobrenadante, dejando el “pellet”. 3. Añadir a la muestra 200 µl de tampón de lisis ATL para romper las membranas y 20 µl de proteinasa K para destruir los componentes proteicos de las células. Agitar en el vórtex 30” para asegurar una lisis eficaz. Incubar a 70ºC durante 10 minutos para activar la proteinasa K. Centrifugar brevemente para eliminar las gotas de la parte interna de la tapa. 4. Añadir 200 µl de tampón de lisis AL y mezclar de nuevo en el vórtex 15”. Incubar 5 minutos a 95ºC (se inactiva la proteinasa K) y centrifugar brevemente. - 79 - 5. Añadir 200 µl de etanol y agitar en el vórtex 15”. Incubar 5 minutos a 95ºC y centrifugar brevemente. 6. Transferir los 620 µl del tubo eppendorff a la columna QIAmp Spin en un tubo colector de 2 ml sin mojar el borde, cerrar la tapa para evitar la formación de aerosoles y centrifugar 1min a 8.000 rpm. 7. Colocar la columna QIAmp Spin en un tubo colector de 2 ml limpio y desechar el colector que contiene el fluido filtrado. 8. Añadir 500 µl de tampón AW1 sin mojar el borde. Cerrar la tapa y centrifugar dos minuto a 8.000 rpm. 9. Colocar un tubo colector nuevo y desechar el que contiene el fluido filtrado. 10. Añadir 500 µl de tampón AW2 sin mojar el borde, cerrar la tapa y centrifugar 3 minutos a 13.000 rpm 11. Colocar la columna QIAmp spin en un tubo eppendorff de 1,5 ml y desechar el colector con el fluido filtrado. 12. Añadir 250 µl de tampón de elución AE y centrifugar 2 minutos a 8.000rpm. 13. El ADN purificado se almacena a -80ºC. 5.2.2 PCR cuantitativa Se llevará a cabo mediante PCR en tiempo real Amplificación de fragmentos específicos - 80 - Cebadores A. actinomycetemcomitans: cebadores específicos del gen lktC (leucotoxina) previamente descritos (Morillo y cols 2003) que amplifica un fragmento de 77 pb entre la posición 736 a 812. Aa-forward 5´-ACGCAGACGATTGACTGAATT-TAA-3´ Aa-reverse 5´-GATCTTCACAGCTATA-TGGCAGCTA-3´ P. gingivalis: cebadores específicos del gen ARg-gingipaina previamente descritos (Morillo y cols 2003) que amplifica un fragmento de 71 pb de la posición 1308 a 1379 Pg-forward 5´CCTACGTG-TACGGACAGAGCTATA-3´ Pg-reverse 5´-AGGATCGCTCAGCGTAGCATT-3´ Amplificación Se utilizará la Taq polimerasa de Invitrogen siguiendo las instrucciones del fabricante en un volumen final de reacción de 25 ml conteniendo 3 ml de ADN molde y buffer y nucleótidos ajustados al volumen. La reacción se llevará a cabo de cada microorganismo por separado utilizando un ABI Prism 7700 con el siguiente programa:  2 minutos a 50º C  10 min a 95º C  40 ciclos de 15 segundos a 95º C y 1 minuto a 60º C Cuantificación Se realizará por comparación de las curvas de disociación de las muestras respecto a cantidades conocidas de los fragmentos amplificados clonados en un vector. - 81 - 6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO En este estudio estadístico, para cada una de las tablas que aparecen, fue necesario realizar contrastes del tipo H0: μA = μB H1: μA ≠ μB o la generalización del mismo con n variables/muestras en lugar de 2; salvo para la tabla “9B”, para la que se realizó un contraste del tipo H0: πA = πB H1: πA ≠ πB, Se utilizó, para ambos tipos de contrastes, el programa estadístico SPSS. Contraste (1) El primer paso para realizar el contraste (1) fue comprobar la normalidad de las variables/muestras cuyas medias se comparaban. Para verificar dicha propiedad se usó el Test de Normalidad de Shapiro-Wilk, asumiendo normalidad si tanto para la variable/muestra A como para la variable/muestra B (o para todas las variables/muestras, en su versión general), se obtenía un p > 0’05. A partir del resultado de dicho test, se continuó de dos formas:  Si p ≤ 0’05, se usaron técnicas no paramétricas.  Si p > 0’05, se usaron técnicas paramétricas. Tanto a la hora de realizar contrastes paramétricos como no paramétricos, se tuvo en cuenta si las variables/muestras a comparar eran independientes o relacionadas. Así, se obtuvieron realmente cuatro formas de proceder a partir de la comprobación de normalidad: (1) (2) - 82 -  No paramétricas: o Muestras independientes: Test U de Mann-Whitney (H de Kruskal- Wallis en la versión general del contraste) o Muestras relacionadas: Test de Wilcoxon (Friedman en la versión general del contraste)  Paramétricas: o Muestras independientes: Prueba T para muestras independientes (ANOVA de un factor en la versión general del contraste) o Muestras relacionadas: Prueba T para muestras relacionadas Asímismo, cuando se realizaron las comprobaciones paramétricas anteriores, se debió observar, antes de tomar el p-valor correspondiente al contraste que interesaba desde un principio (1), el valor de p resultante del Test de Levene para igualdad de varianzas, para saber si se debía tomar el p-valor correspondiente a la suposición de varianzas iguales o varianzas desiguales. Hecho esto, se pudieron recopilar los distintos p-valores resultantes. Contraste (2) Por su parte, para el contraste (2), el primer paso a seguir fue construir una Tabla de Contingencia (tabla 2x2) para cada contraste, y tras ello, realizar la prueba Chi cuadrado, recogiendo el p-valor correspondiente para el contraste deseado. - 89 - Tabla 4. Características clínicas de las 16 parejas (antes del tratamiento). Media (% Localizaciones) (Exploración Inicial) Parejas Enfermas (n=6) Parejas Sanas (n=10) Profundidad de Sondaje ≤ 3 mm 80,86 93,22 4-5mm 17,90 6,78 ≥ 6 mm 1,23 0,00 Nivel de inserción clínico Leve PIC=1-2mm 37,04 65,08 Moderada PIC=3- 4mm 46,30 34,05 Avanzada PIC≥5mm 16,67 0,87 Sangrado al sondaje Positivo 39,04 23,38 Negativo 60,96 76,62 Índice de placa 0 30,25 59,02 1 19,91 25,40 2 24,54 13,71 3 25,31 1,88 Al mes de finalizar el tratamiento mecánico mediante raspado y alisado radicular se reevaluó a los pacientes con una nueva exploración periodontal. De los 22 pacientes, 10 recibieron cirugía periodontal y tratamiento antibiótico con Amoxicilina 875 mg/8h, 7 días durante el período postoperatorio.Seis meses después del tratamiento se exploraron los mismos parámetros clínicos. La tabla 5 muestra la respuesta clínica al tratamiento periodontal, al mes y a los 6 meses, de los 12 pacientes que completaron el estudio, y la tabla 6 expone la evolución clínica de los 4 cónyuges enfermos (los 8 restantes estaban sanos y no recibieron tratamiento periodontal). Los parámetros clínicos muestran una disminución progresiva del pocentaje de localizaciones con profundidad de sondaje de 4-5 mm y ≥ 6mm, un descenso de las localizaciones con pérdida de inserción clínica moderada y avanzada, así como de los índices de sangrado al sondaje y placa bacteriana. - 90 - Tabla 5. Evolución clínica de los pacientes (n=12) Media (% Localizaciones) Pacientes (n=12) Exploración Inicial Exploración 2 (1 mes) Exploración 3 (6 meses) Profundidad de Sondaje ≤ 3 mm 55,38 77,70 87,92 4-5mm 35,48 19,52 11,59 ≥ 6 mm 9,14 2,79 0,50 Nivel de inserción clínico Leve PIC=1-2mm 23,66 36,18 32,53 Moderada PIC=3-4mm 40,74 33,94 35,38 Avanzada PIC≥5mm 35,60 29,88 32,09 Sangrado al sondaje Positivo 45,70 29,88 20,94 Negativo 54,30 70,12 79,06 Índice de placa 0 36,74 58,18 48,39 1 21,74 19,39 25,46 2 22,52 14,61 16,05 3 19,00 7,82 10,10 Tabla 6. Evolución clínica de las parejas enfermas (n=4) Media (% Localizaciones) Parejas (n=4) Exploración Inicial Exploración 2 (1 mes) Exploración 3 (6 meses) Profundidad de Sondaje ≤ 3 mm 26,64 27,33 29,68 4-5mm 3,29 2,42 1,43 ≥ 6 mm 0,18 0,06 0,12 Nivel de inserción clínico Leve PIC=1-2mm 13,44 15,33 15,43 Moderada PIC=3-4mm 13,20 12,00 11,71 Avanzada PIC≥5mm 3,46 2,48 4,09 Sangrado al sondaje Positivo 9,98 8,73 7,99 Negativo 20,13 21,09 23,23 Índice de placa 0 10,63 13,33 13,38 1 6,33 7,15 4,96 2 7,47 5,58 6,63 3 5,68 3,76 6,26 - 91 - 3. RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS 3.1. Resultados de cultivo bacteriano 3.1.1. Cuantificación de recuentos bacterianos en los pacientes y las parejas, antes y después del tratamiento periodontal En la comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados, según el tipo de sujeto estudiado (paciente y pareja), antes del tratamiento (muestras 1), se observan recuentos bacterianos totales superiores en los pacientes al compararlos con las parejas, siendo estas diferencias significativas en el recuento de anaerobios pigmentados. Esto puede ser debido a que la mayoría de las parejas estaban sanas (el 62,5% no padecían peridontitis crónica) (tabla 7). Tabla 7. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados, según el tipo de sujeto estudiado (paciente y pareja), antes del tratamiento (muestras 1) *diferencias significativas (p<0.05) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1) Medios Paciente (n=64) Pareja (n=55) p TSBV 2,0 1,6 0,199 Dentaid 2,1 2,0 0,63 Medio no selectivo para anaerobios totales 4,3 3,9 0,118 Medio no selectivo para anaerobios pigmentados 1,6 1,5 0,81 Medio selectivo para anaerobios totales 3,4 2,8 0,089 Medio selectivo para anaerobios pigmentados 2,1 1,3 0,01* - 92 - Al estimar los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados según la profundidad de bolsa de los dientes (< / ≥ 4mm) antes del tratamiento (muestras 1), se demuestran valores significativamente mayores de anaerobios pigmentados en las muestras subgingivales profundas (tabla 8). Tabla 8. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados según la profundidad de bolsa de los dientes (< / ≥ 4mm) antes del tratamiento (muestras 1) **diferencias muy significativas (p<0.01) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1) < 4mm ≥ 4mm Medios (n = 70) (n=49) P TSBV 2,2 1,3 0,064 Dentaid 2,4 1,5 0,038 Medio no selectivo para anaerobios totales 4,1 4,1 0,838 Medio no selectivo para anaerobios pigmentados 1,1 2,1 0,002** Medio selectivo para anaerobios totales 2,7 3,7 0,073 Medio selectivo para anaerobios pigmentados 1,4 2,3 0,07 - 93 - En las tablas 9, 10 y 11 se obtuvieron recuentos de anaerobios significativamente mayores, tanto de cifras totales como de colonias pigmentadas, al aumentar el índice de placa y si existía sangrado. En la muestra examinada el hábito tabáquico no afectaba significativamente al recuento de anaerobios. Tabla 9. Comparación de los recuentos bacterianos de anaerobios totales y pigmentados en relación con la posibilidad de tabaquismo (fumador, no fumador y ex-fumador) antes del tratamiento (muestras 1) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1) Fumar Medios Sí (n=38) No (n=77) Ex Fumadores (n=4) P Medio no selectivo para anaerobios totales 4,1 4,1 3,9 0,928 Medio no selectivo para anaerobios pigmentados 1,9 1,4 1,9 0,314 Medio selectivo para anaerobios totales 3,0 3,2 2,8 0,629 Medio selectivo para anaerobios pigmentados 1,4 1,9 0,7 0,208 Tabla 10. Comparación de los recuentos bacterianos de anaerobios totales y pigmentados según las características clínicas de la localización de la toma de muestra (sangrado al sondaje) antes del tratamiento (muestras 1) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1) Sangrado al sondaje Medios Positivo (n=38) Negativo (n=49) P Medio no selectivo para anaerobios totales 3,5 3,6 0,687 Medio no selectivo para anaerobios pigmentados 1,6 1,6 0,826 Medio selectivo para anaerobios totales 3,1 2,3 0,063 Medio selectivo para anaerobios pigmentados 1,9 1,3 0,057 - 94 - Tabla 11. Comparación de los recuentos bacterianos de anaerobios totales y pigmentados según las características clínicas de la localización de la toma de muestra (índice de placa bacteriana) antes del tratamiento (muestras 1) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1) Placa Bacteriana Medios 0 (n=37) 1 (n=20) 2 (n=17) 3 (n=13) P Medio no selectivo para anaerobios totales 3,3 3,6 3,5 4,2 0,041* Medio no selectivo para anaerobios pigmentados 1,6 1,5 1,7 1,8 0,946 Medio selectivo para anaerobios totales 2,0 2,6 3,2 3,6 0,041* Medio selectivo para anaerobios pigmentados 1,1 1,3 2,3 2,4 0,021* *diferencias significativas (p<0.05) Se miden valores superiores de recuentos bacterianos en individuos enfermos respecto a sujetos sanos, en los diferentes medios de cultivo estudiados en las muestras tomadas antes del tratamiento periodontal, siendo estas diferencias estadísticamente significativas para los anaerobios totales y pigmentados (muestras 1) (tabla 12) Tabla 12. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados en sujetos sanos y enfermos antes del tratamiento (muestras1) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1) Medios Sanos (n=32) Enfermos (n=87) P TSBV 1,4 2,0 0,08 Dentaid 1,9 2,1 0,487 Medio no selectivo para anaerobios totales 3,7 4,2 0,07 Medio no selectivo para anaerobios pigmentados 1,5 1,6 0,699 Medio selectivo para anaerobios totales 2,4 3,4 0,008** Medio selectivo para anaerobios pigmentados 1,1 2,0 0,026* *diferencias significativas (p<0.05); **diferencias muy significativas (p<0.01) - 95 - En la tabla 13 se observa que se esquiparan los valores de los recuentos bacterianos de los sujetos enfermos a los valores de los individuos sanos 6 meses después del tratamiento. Tabla 13. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados en sujetos sanos y enfermos postratamiento (muestras 3) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 3) Medios Sanos (n=26) Enfermos (n=64) P TSBV 1,5 1,1 0,366 Dentaid 1,8 1,3 0,246 Medio no selectivo para anaerobios totales 3,4 3,5 0,596 Medio no selectivo para anaerobios pigmentados 1,9 2,5 0,177 Medio selectivo para anaerobios totales 2,0 2,3 0,378 Medio selectivo para anaerobios pigmentados 0,7 0,7 0,735 - 96 - El seguimiento de los sujetos sanos y enfermos, entre la evaluación inicial y 6 meses tras el tratamiento, demostró que había diferencias muy significativas en los recuentos bacterianos de los enfermos, que disminuían con el tratamiento. En los sujetos sanos estas diferencias eran casi significativas en el recuento de anaerobios totales, que se reducía por el tratamiento en los enfermos (tabla 14). Tabla 14. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados en sujetos sanos y enfermos, antes y después (6 meses) del tratamiento (muestras 1 y muestras 3) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1 vs Muestras 3) Antes (M1) Después (M3) p(sanos) p(enfermos) Medios Sanos (n=26) Enfermos (n=64) Sanos (n=26) Enfermos (n=64) TSBV 1,5 2,0 1,5 1,1 0,758 0,001** Dentaid 2,0 2,1 1,8 1,3 0,476 0,001** Medio no selectivo para anaerobios totales 3,8 4,2 3,4 3,5 0,096 0,001** Medio no selectivo para anaerobios pigmentados 1,4 1,6 1,9 2,5 0,538 0,004** Medio selectivo para anaerobios totales 2,8 3,5 2,0 2,3 0,055 0,001** Medio selectivo para anaerobios pigmentados 1,2 2,1 0,7 0,7 0,246 0,001** **diferencias muy significativas (p<0.01) - 97 - Como se puede ver hay una disminución muy significativa en los recuentos de anaerobios totales al comparar las muestras tomadas antes del tratamiento periodontal (muestras1) y 6 meses después (muestras3) tanto en los pacientes como en las parejas (tabla 15, gráfico 1). Tabla 15. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios totales a lo largo del tiempo en Medio no selectivo (muestras 1 y muestras 3) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1 vs Muestras 3) Tipo de sujeto Medio no selectivo para anaerobios Totales - M1 (n=90) Totales - M3 (n=90) P Pacientes 4,2 (n=48) 3,6 (n=48) 0,008** Parejas 3,9 (n=42) 3,4 (n=42) 0,007** **diferencias muy significativas (p<0.01) Gráfico 1. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios totales a lo largo del tiempo en Medio no selectivo (muestras 1 y muestras 3) - 98 - Los recuentos de anaerobios pigmentados se incrementan despues del tratamiento periodontal (muestras 3) únicamente en los pacientes y no en las parejas (tabla 16, gráfico 2). Tabla 16. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios pigmentados a lo largo del tiempo en Medio no selectivo (muestras 1 y muestras 3) Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1 vs Muestras 3) Tipo de sujeto Medio no selectivo para anaerobios Pigmentados - M1 (n=90) Pigmentados - M3 (n=90) P Pacientes 1,5 (=48) 2,4 (n=48) 0,014* Parejas 1,5 (n=42) 2,2 (n=42) 0,161 *diferencias significativas (p<0.05) Gráfico 2. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios pigmentados a lo largo del tiempo en Medio no selectivo (muestras 1 y muestras 3) - 105 - La tabla 26 contrasta la media de Log de PCR Pg y PCR Aa en muestras de saliva y muestras periodontales 1 mes después de la terapéutica. Se observan unos valores similares en la media de Log de PCR Pg y en la media de Log de PCR Aa, en las muestras de saliva y en las muestras periodontales, no observándose diferencias significativas (tabla 26). Tabla 26. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en saliva y dientes 1 mes después del tratamiento (muestras 2 PCR) Saliva Dientes P Media de PCRPG-LOG (M2) 2,2 (n=17) 2,0 (n=17) 0,726 Media de PCRAA-LOG (M2) 0,5 (n=17) 0,3 (n=17) 0,902 En la valoración a los 6 meses del tratamiento se observó que la media de Log de PCR Pg continuó siendo inferior en los pacientes al compararla con la de las parejas. La media de Log de Aa fue similar en ambos grupos (tabla 27). Tabla 27. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en pacientes y parejas 6 meses después del tratamiento (muestras 3 PCR) Pacientes Parejas p Media de PCRPG-LOG (M3) 1,3 (n=22) 1,8 (n=22) 0.248 Media de PCRAA-LOG (M3) 0,4 (n=22) 0,4 (n=22) 0.953 - 106 - Al comparar la media de Log de PCR Pg y de PCR Aa en las muestras de saliva y muestras periodontales tomadas 6 meses después del tratamiento, no se observaron diferencias significativas en ambos tipos de muestras (tabla 28). Tabla 28. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en saliva y dientes 6 meses después del tratamiento (muestras 3 PCR) Saliva Dientes P Media de PCRPG-LOG (M3) 1,7 (n=22) 1,5 (n=22) 0,697 Media de PCRAA-LOG (M3) 0,5 (n=22) 0,3 (n=22) 0,89 Al cotejar los datos de los sujetos sanos y enfermos 6 meses después del tratamiento se pudo comprobar que los valores de la media de Log Pg y de la media de Log Aa eran similares en individuos sanos y enfermos (tabla 29). Tabla 29. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en sujetos sanos y enfermos 6 meses después del tratamiento (Muestras 3 PCR) Sanos Enfermos P Media de PCRPG-LOG (M3) 2,0 (n=14) 1,4 (n=30) 0,192 Media de PCRAA-LOG (M3) 0,7 (n=14) 0,3 (n=30) 0,281 - 107 - En la tabla 30 el seguimiento reveló una disminución de la media de Log de Pg y de Aa en los pacientes. Esta disminución fue estadísticamente significativa para la media de Log de Pg de las muestras periodontales de los pacientes. Tabla 30. Seguimiento cuantitativo por PCR antes y después del tratamiento (1 mes y 6 meses) (muestras 1, 2 y 3 PCR). Log PCR Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3 p p Saliva Diente Saliva Diente Saliva Dientes Saliva Dientes Paciente PG 2,7 3,4 1,8 1,8 1,4 1,4 0,103 0,026* AA 0,8 1,0 0,4 0,0 0,6 0,2 0,926 0,368 Pareja PG 3,0 2,4 3,6 2,7 2,0 2,0 0,148 0.717 AA 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 - - *diferencias significativas (p<0.05) Número de muestras en cada caso Log PCR Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3 Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente Paciente PG 10 10 10 10 10 10 AA 10 10 10 10 10 10 Pareja PG 3 3 3 3 3 3 AA 3 3 3 3 3 3 - 108 - El seguimiento cualitativo mostró que no había diferencias significativas en el porcentaje de positivos de Pg y Aa en los pacientes y las parejas al evaluar las tres muestras a la vez (tabla 31). No se aisló Aa inicialmente en las muestras de ningún sujeto, paciente o pareja, por cultivo, pero se evidenció por PCR en 2 enfermos, persistiendo en ellos tras el tratamiento. Se observa como Pg se detecta al diagnóstico por PCR en 87.5% de los pacientes, y en 81.25% de las parejas (43,75% “portadoras” sanas, 37.5% parejas enfermas). Tabla 31. Seguimiento cualitativo por PCR: porcentaje de positivos antes y después del tratamiento (1 mes y 6 meses): Muestras 1, frente a 2 y 3 PCR % PCR Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3 p p Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente Paciente PG 80,0% 90,0% 60,0% 60,0% 50,0% 60,0% 0,366 0,240 AA 20,0% 20,0% 10,0% 0,0% 20,0% 10,0% 0,787 0,329 Pareja PG 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 66,7% 100,0% 0,325 - AA 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% - - % PCR Número de muestras POSITIVAS en cada caso Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3 Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente Paciente PG 8 9 6 6 5 6 AA 2 2 1 0 2 1 Pareja PG 3 3 3 3 2 3 AA 0 0 0 0 0 0 % PCR Número de muestras NEGATIVAS en cada caso Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3 Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente Paciente PG 2 1 4 4 5 4 AA 8 8 9 10 8 9 Pareja PG 0 0 0 0 1 0 AA 3 3 3 3 3 3 - 109 - 3.3. Comparación de los resultados de cultivo bacteriano y PCR cuantitativa Al examinar los resultados del cultivo frente a los de PCR en los pacientes y las parejas antes del tratamiento, constatamos unos recuentos superiores de Pg en los pacientes respecto a las parejas, tanto en cultivo como en PCR, siendo estas diferencias estadísticamente significativas. Los valores de Aa son similares (tabla 32). Tabla 32. Cultivo frente a PCR respecto a pacientes y parejas antes del tratamiento (Muestras 1 PCR) Log (Muestras 1) Paciente Pareja P Recuento de Pg Cultivo Medio Selectivo Pigmentados (Log) 2,1 (n=64) 1,3 (n=55) 0,01* PCR (Log) 3,2 (n=30) 2,0 (n=30) 0,002** Recuento Aa Cultivo TSBV (Log) 2,0 (n=64) 1,6 (n=55) 0,199 Dentaid (Log) 2,1 (n=64) 2,0 (n=55) 0,63 PCR (Log) 0,8 (n=30) 0,7 (n=30) 0,624 *diferencias significativas (p<0.05); **diferencias muy significativas (p<0.01) - 110 - El análisis de regresión mostró que los recuentos obtenidos por PCR fueron superiores a los del cultivo (gráfico 5). Gráfico 5. Análisis de regresión de recuento de anaerobios pigmentados en medio selectivo frente a PCR Pg en los pacientes (muestras 1) Los resultados del cultivo frente a los de PCR en fumadores y no fumadores antes del tratamiento, no presentan diferencias significativas ni en los recuentos de Pg ni en los de Aa (tabla 33). Tabla 33. Cultivo frente a PCR respecto a fumadores y no fumadores antes del tratamiento (Muestras 1 PCR) Log (Muestras 1) Fumadores No fumadores P Recuento de Pg Cultivo Medio Selectivo Pigmentados (Log) 1,4 (n=38) 1,9 (n=77) 0,176 PCR (Log) 2,1 (n=20) 2,8 (n=40) 0,188 Recuento Aa Cultivo TSBV (Log) 1,8 (n=38) 1,9 (n=77) 0,973 Dentaid (Log) 1,7 (n=38) 2,3 (n=77) 0,14 PCR (Log) 0,7 (n=20) 0,7 (n=40) 0,875 - 111 - Los datos de cultivo frente a los de PCR en muestras de saliva y periodontales antes del tratamiento, muestran que por cultivo se obtienen valores muy superiores de anaerobios totales y pigmentados en las muestras de saliva al compararlas con las de localizaciones periodontales. Sin embargo las cuantificaciones por PCR de Pg no reflejan diferencias entre las muestras de saliva y las periodontales. La media de recuento por PCR Pg fue inferior (diferencia muy significativa) a la media de recuento de anaerobios totales en muestras de saliva y fue superior a la media de recuento de anaerobios pigmentados en muestras periodontales (diferencia muy significativa) (tabla 34). Tabla 34. Cultivo (anaerobios totales y pigmentados) frente a PCR Pg respecto a saliva y dientes antes del tratamiento (Muestras 1 PCR) Cultivo PCR (Muestras 1) p P Log MST Log MSP PCRPG-LOG Saliva 4,4 2,1 2,5 0.001** 0.806 Dientes 2,6 1,6 2,7 0.625 0.001** MNST: medio no selectivo anaerobios totales; MNSP: medio no selectivo anaerobios pigmentados; MST: medio selectivo anaerobios totales; MSP: medio selectivo anaerobios pigmentados. **diferencias muy significativas (p<0.01) - 112 - El seguimiento evolutivo en las medias de cultivo y en las medias y porcentajes de positivos de PCR antes del tratamiento y 6 meses después del mismo, pone de manifiesto un descenso de los recuentos bacterianos y del porcentaje de positivos a Pg y Aa transcurridos 6 meses del tratamiento periodontal (tabla 35). Tabla 35. Comparación de medias de cultivo y medias y porcentaje de positivos de PCR antes y después del tratamiento (Muestras 1 y Muestras 3) Cultivo PCR Log TSBV Log Dent Log MST Log MNSP Log MST Log MSP PCR PGLOG PCRAALOG %+Pg %+Aa M 1 1,9 2,1 4,1 1,5 3,3 1,9 2,5 0,8 78,57% 16,67% M 3 1,2 1,4 3,5 2,3 2,2 0,7 1,6 0,4 61,90% 14,29% Número de muestras en cada caso Cultivo PCR Log TSBV Log Dent Log MST Log MNSP Log MST Log MSP PCR PGLOG PCRAALOG %+Pg %+Aa M 1 90 90 90 90 90 90 42 42 42 42 M 3 90 90 90 90 90 90 42 42 42 42 MNST: medio no selectivo anaerobios totales; MNSP: medio no selectivo anaerobios pigmentados; MST: medio selectivo anaerobios totales; MSP: medio selectivo anaerobios pigmentados. - 113 - VII. DISCUSIÓN A continuación pasamos a discutir los hallazgos más relevantes encontrados en la tesis. La discusión se ha estructurado en función de los datos clínicos y microbiológicos. 1. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS Y ESTADO CLÍNICO DE LAS PAREJAS SELECCIONADAS. 1.1 Características demográficas La selección de las parejas que se incluyeron en el estudio se basó en la situación clínica periodontal de los pacientes. Los pacientes periodontales fueron 16 individuos con periodontitis crónica no tratada, al menos durante el año precedente, sin enfermedades sistémicas, con una edad superior a 35 años, un mínimo de 20 dientes, y que no habían recibido tratamiento antibiótico en los 3 meses previos. El único criterio que debían cumplir los cónyuges era que hubiesen mantenido una relación de al menos 2 años de cohabitación con los pacientes periodontales para asegurar que hubiese transcurrido un tiempo suficiente para la transmisión horizontal de las bacterias, y para el desarrollo de la periodontitis en los cónyuges. Finalmente el tiempo de relación de las parejas fue muy superior al mínimo que se estableció, entre 6 años y 40 años. Por tanto en el momento de la selección se desconocían las características demográficas y el estado periodontal de los cónyuges. Se utilizaron criterios de selección muy estrictos para conseguir que el estudio se llevase a cabo sobre un grupo homogéneo, y se consiguió que pacientes y parejas acudiesen a sus citas en los plazos establecidos. Una de las mayores dificultades del estudio fue la fidelización de pacientes y parejas, y lograr su asistencia permanente a citas y controles clínicos, terapéuticos y tomas de muestras. Por este motivo, de 16 parejas completaron el estudio 12. - 114 - La media de edad de los pacientes y las parejas era muy similar, 45,6 (rango: 37 a 63) y 42,9 años (rango: 26 a 60) respectivamente, y el porcentaje de fumadores era el mismo en ambos grupos (31,3%), así como el porcentaje de individuos ocupados (62,5%). 1.2 Estado clínico de las parejas seleccionadas Cuando se comparó el estado clínico de los pacientes periodontales y sus cónyuges, se observó que de las 16 parejas, 6 padecían periodontitis crónica, y 10 estaban sanas periodontalmente. Cuando se compararon los hallazgos clínicos de los pacientes y los cónyuges enfermos, se observó que los pacientes enfermos tenían proporciones medias superiores de localizaciones con PS 4-5mm y ≥ 6mm, y de localizaciones con pérdida de nivel de inserción clínico avanzado (≥ 5mm). Así mismo, al comparar las características clínicas de todos los sujetos enfermos con las de los cónyuges sanos, se comprobó que los enfermos tenían proporciones medias muy superiores de localizaciones con PS 4-5mm y ≥ 6mm, y de localizaciones con pérdida de nivel de inserción clínico moderado y avanzado. De igual forma, la proporción media de localizaciones que mostraban sangrado al sondaje eran superiores en los pacientes periodontales respecto a los cónyuges, enfermos o sanos. Sin embargo, el índice de placa bacteriana era similar entre pacientes y cónyuges enfermos, y superior en los sujetos enfermos respecto a los cónyuges sanos. Las diferencias en hábitos de higiene personales pueden explicar en parte los resultados clínicos, puesto que los sujetos sanos mostraban índices de placa bacteriana y sangrado muy inferiores a los de los enfermos. En nuestro trabajo, a diferencia de otros publicados, sólo el 37,5% de las parejas padecía periodontitis. Petit y cols (1994) investigaron la prevalencia de destrucción periodontal en 24 parejas que habían permanecido unidas durante al menos 8 años. Un total de 16 parejas tenían una forma leve a moderada de periodontitis, con al menos una localización con pérdida de inserción clínica de - 121 - crónica). El seguimiento evolutivo de los recuentos de anaerobios totales y pigmentados a lo largo del tiempo (antes del tratamiento y 6 meses después) demostró un descenso significativo de los recuentos, tanto en los pacientes como en las parejas, transcurridos 6 meses del tratamiento periodontal. Al agrupar los pacientes y las parejas según su estado periodontal en la evaluación inicial (enfermos y sanos), se pudo comprobar que los individuos enfermos mostraban valores superiores de recuentos bacterianos en todos los medios de cultivo empleados, siendo estas diferencias estadísticamente significativas para los anaerobios totales y pigmentados. Transcurridos 6 meses del tratamiento periodontal se observa que se equiparan los valores de los recuentos bacterianos de los sujetos enfermos a los valores de los individuos sanos. Cabe resaltar que en el seguimiento evolutivo de las parejas sanas, entre la evaluación inicial y 6 meses tras el tratamiento del enfermo, se demostró que había diferencias muy significativas en los recuentos bacterianos, y casi significativas en el recuento de anaerobios totales, que se reducía por el tratamiento en los enfermos. Por otro lado, el estudio microbiológico mediante PCR cuantitativa en los pacientes y las parejas en el examen inicial mostró recuentos de Pg y Aa superiores en los pacientes. Al agrupar a estos y a las parejas en sujetos sanos y enfermos la media del recuento por PCR de Pg fue muy superior en sujetos enfermos (diferencia muy significativa), sin embargo el recuento de Aa fue similar en ambos grupos. En la evaluación a los 6 meses del tratamiento se observó que la media de recuento por Pg fue inferior en los pacientes al compararla con la de las parejas. También en esta ocasión, el recuento de Aa fue similar en ambos grupos. Al comparar los sujetos sanos y los enfermos 6 meses después del tratamiento se pudo comprobar que los valores de los recuentos por PCR de Pg y de Aa eran similares en sanos y enfermos. Estos hallazgos microbiológicos concuerdan con la respuesta clínica al tratamiento de los pacientes periodontales, en los que se pudo apreciar una - 122 - disminución progresiva del pocentaje de localizaciones con profundidad de sondaje de 4-5 mm y ≥ 6mm, un descenso de las localizaciones con pérdida de inserción clínica moderada y avanzada, así como de los índices de sangrado al sondaje y placa bacteriana. Numerosos trabajos indican que Aa y Pg pueden ser encontradas en sujetos sin destrucción periodontal manifiesta (Petit y cols 1993a,b, Van Steenbergen 1993, Van Winkelhoff 2002). Estas especies probablemente pueden persistir en equilibrio con el huésped y la microflora residente durante años, sin embargo, no está claro qué factores microbiológicos o del huésped determinan el inicio de la destrucción periodontal a partir de la infección por estos patógenos. El hecho de que se sigan detectando recuentos de Pg tanto en las parejas como en los pacientes tras el tratamiento también puede deberse al tipo de clones que están colonizando a estos individuos y a la variable patogenicidad de cada uno de los clones. Desde 2006, se dispone de un sistema de clasificación de clones mediante Multi Locus Type Sequence (MLST) para Pg. Este esquema, vigente hoy en día, fue definido por el grupo de Enersen y col. en la Universidad de Oslo (Enersen y cols 2006). El esquema propuesto por Enersen reducía el número de genes conservados a analizar de 10 que proponía Koehler y cols (Koehler y cols 2003) a 8 debido a que dos de los genes que se incluyen en el esquema de Koehler creaban problemas de amplificación (EFE-Tu y dnaK). Finalmente el esquema que ha prevalecido es el siguiente: ftsQ, hagB, gdpxJ, pepO, mcmA, recA, and pga. Al estudiar 40 aislados de diferente origen y obtenidos tanto de seres humanos como de animales, se constató que las especies de animales correspondían a otra especie (P. gulae) y que Pg coloniza exclusivamente al hombre. Utilizando el método MLST para estudiar la distribución de la población de Pg, se observó que la población bacteriana de esta especie en parte tiene una estructura panmítica, con alto nivel de recombinación, y en parte clonal (Enersen y cols 2006, Enersen 2011). Los tres tipos de poblaciones se muestran en la figura 1. Por el momento hay descritos hasta 183 - 123 - secuenciotipos (STs) en la base de Pg. Los dendogramas realizados con estos STs muestran agrupamientos o clusters entre aislados detectados en áreas geográficas muy distantes y en diferentes periodos temporales, demostrando con esto la existencia de una parte de la población con un comportamiento clonal. Cuando se han analizado factores de patogenicidad como la fimbria mayor o FimA, responsable de la adhesión y activación de la endocitosis en el interior de las células endoteliales humanas, se ha distinguido 6 secuencias distintas (I-VI) (Fujiwara y cols 1993). En los casos con peridontitis crónica, los aislados más frecuentes son aquellos con fimA del tipo II, IV y Ib. En cambio, en los pacientes sanos periodontalmente predominan los del tipo I, III y V (Amano 2003). Algunos clones se encuentran más asociados a enfermedad, determinados por la secuencia de fimA y por la agrupación de secuenciotipos. Esto demuestra la existencia de clones virulentos que no se encuentran en pacientes sanos. Dentro del mismo individuo se han encontrado varios clones, aunque no suele ser un fenómeno muy frecuente y parece está circusncrito a pacientes con periodontitis crónica. En un estudio llevado a cabo en 15 pacientes con periodontitis crónica, se detectaron entre 1 y 8 secuenciotipos diferentes por bolsa (Enersen y cols 2008). Esto puede ser debido al intercambio genético dentro de la misma bolsa a lo largo del tiempo, considerandose más una “deriva genética” que una colonización múltiple. Esta deriva iría conducida tanto por el estrés de supervivencia en las bolsas como por el estrés producido por el sistema inmunitario del huésped. - 124 - Figura 1. Modificada de Enersen M. (47). A=clonal; B=panmítica; C=panmítica con diseminación clonal Hay estudios que sugieren que la cohabitación con una persona con periodontitis puede influenciar el estado periodontal de la pareja (Petit y cols 1994, Von Troil-Linden y cols 1995). Aunque no se pueden descartar factores causales ambientales comunes, los resultados de varios estudios sugieren que la transmisión de microorganismos virulentos es un factor importante (Tuite- McDonnell y cols 1997; Asano y cols 2003) sin embargo, son necesarios más estudios para probar esta hipótesis. Petit y cols (1994) investigaron la prevalencia de microorganismos periodontopatógenos y la destrucción periodontal en las parejas y los hijos de pacientes adultos con periodontitis, en un grupo de 24 familias, con 49 niños. Por debajo de los 5 años, ninguno de los niños tenía CAL, mientras que entre los 5-15 años, el 26,5% mostraban 1-5 sitios con 1-3 mm de CAL. Un total de 16 parejas presentaban una forma leve a moderada de periodontitis, con al menos un sitio con 1 a 4 mm de CAL, y 5 parejas evidenciaban destrucción periodontal severa con sitios que poseían al menos 8 mm de CAL. En 18 de 24 pacientes los resultados confirmaron Pg. Este microorganismo se encontró en un niño de 5 años, y en 11 de las parejas. Por otra parte, Aa se detectó en 13 pacientes, 5 niños y 5 de las parejas. Si un niño albergaba uno de los - 125 - periodontopatógenos, al menos uno de los padres era también positivo para esa bacteria. Von Troil-Linden y cols (1995), llevaron a cabo un examen clínico, radiológico y microbiológico de las condiciones periodontales en dos grupos de parejas casadas para valorar similitudes entre marido y mujer. Los sujetos enfermos (n=10) tenían una periodontitis avanzada, y los sanos (n=10) presentaban un estado periodontal normal. Las muestras fueron cultivadas para Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus and Peptostreptococcus micros. La media de frecuencia de detección de bolsas moderadamente profundas (4-5 mm) y profundas (≥6 mm) fue significativamente mayor en las parejas de los sujetos enfermos que en las parejas de los sanos. Se hallaron bolsas profundas en seis parejas de los individuos enfermos, y sólo en dos parejas de los sujetos sanos. Los enfermos y sus cónyuges poseían Aa, Pg, P. intermedia, C. rectus and P. micros en 4, 6, 9, 9 y 4 parejas respectivamente. Los sanos y sus parejas tenían estos patógenos en 0, 1, 9, 5 y 3 parejas, respectivamente. Pg se encontró en 7 parejas de los individuos enfermos, y sólo en 2 de los sujetos sanos. Tuite-McDonnell y cols (1997) en un estudio sobre transmisión de Pg en 104 familias, empleando una técnica de detección por PCR, demostraron que el contacto con un miembro familiar infectado incrementa sustancialmente el riesgo relativo de colonización de los cónyuges (4), de los niños y sus padres (3), los niños y sus madres (4.7), adultos y sus madres (2.4), y hermanos (2.4). Los cónyuges de individuos infectados tenían casi cuatro veces más probabilidad de ser colonizados que los cónyuges de sujetos no colonizados. Esto sugiere la posibilidad de transmisión entre parejas. Sin embargo, no observaron ninguna relación entre la transmisión y el tiempo de casados, lo que indica que la transmisión probablemente ocurre en los primeros años de matrimonio. Asano y cols (2003) demostraron que el gen que codifica las fimbrias de las cepas de Pg pertenece al tipo II, más eficaz en la unión a células epiteliales, en - 126 - 5 de seis parejas cuyos patrones de PFGE eran idénticos. Esto sugiere que sólo aquellos clones con determinados factores de virulencia tienen capacidad de colonización y y transmisión entre individuos con una relación estrecha. Aunque se ha demostrado la transmisión intrafamiliar (Petit y cols 1994, Von Troil-Linden y cols 1995; Asikainen y cols 1996), parece probable que también se produzca entre individuos no relacionados, hasta por un contacto casual. Asikainen y cols (1996) estudiaron la frecuencia de transmisión entre parejas casadas, y de padres a hijos de Aa (47 familias) y Pg (31 familias) comparando mediante AP-PCR. La transmisión entre las parejas de Aa se produjo en el 36% de las mismas y de Pg en el 20%. La transmisión de padres a hijos de Aa tuvo lugar en el 32% de las familias. Pg no se transmitió de padres a hijos en ninguna de las familias estudiadas. Por otra parte, cabe destacar que ya a principios de 1900 algunos autores sugirieron que los brotes severos de GUNA después de la primera guerra mundial se debieron a la transmisión de bacterias virulentas, lo que respalda la idea de que los patógenos periodontales pueden transmitirse con facilidad de una persona a otra, especialmente cuando se trata de clones muy virulentos de Aa y Pg. Así, parece probable que nuevas especies o diferentes cepas de la misma especie pueden ser adquiridas con relativa frecuencia por un individuo en diferentes etapas de su vida. La posibilidad de que halla una recidiva o una nueva infección podría repercutir en el enfoque terapéutico (Von Troil-Lindén y cols 1996). Existen varios aspectos en el desarrollo de este trabajo que deberían ser el inicio de estudios posteriores. El número de parejas captadas, con las características de cohabitación que requeríamos para este estudio, es limitado. Por este motivo, teniendo en cuenta que la prevalencia de infección por Aa es muy baja en nuestro país en individuos de esta edad, no hemos podido analizar el efecto de transmisión ni del tratamiento sobre pacientes con Aa. Sería necesario aumentar el número de parejas estudiadas o seleccionarlas previamente en función de la detección previa de Aa. Por otra parte, existen pocos trabajos que analicen de forma cuantitativa el efecto del tratamiento - 127 - periodontal entre parejas y que además comparen mediante tipado molecular la existencia de la misma cepa en ambos miembros de la pareja. Otra línea que debería ser explorada es el impacto de la presencia de clones clasificados como virulentos y la evolución que presentan a lo largo del tratamiento y la repercusión que tiene sobre la pareja. Todos estos aspectos permitirían mejorar el diseño de los tratamientos periodontales. De los datos obtenidos en esta Tesis se desprende que, dado que la terapéutica periodontal reduce las cifras de periodontopatógenos en los sujetos enfermos, y que en las parejas sanas estas cifras también se reducen de manera correlativa, en la práctica clínica el tratamiento de los pacientes ayudaría a prevenir el desarrollo de periodontitis en los cónyuges sanos. Asi mismo, al tratar a un paciente con periodontitis crónica será necesaria la revisión odontológica del cónyuge, y su tratamiento cuando proceda. - 128 - VIII. CONCLUSIONES 1. Los resultados obtenidos en saliva demuestran que este tipo de muestra, mucho menos invasiva y fácil de obtener, es válida para la monitorización mediante técnicas moleculares. 2. Existe una buena correlación del recuento de anaerobios pigmentados y del recuento específico de Pg con la mejoría obtenida durante el tratamiento. 3. Podemos determinar un nivel de recuento de periodontopatógenos, tanto por cultivo como por PCR, indicador de enfermedad o de salud periodontal. Esto puede servir como herramienta adicional para la monitorización del tratamiento. 4. Los recuentos de Pg en saliva indican la colonización homogénea general de la boca y la posibilidad de transmisión a través del contacto con saliva. 5. La terapéutica periodontal reduce las cifras de periodontopatógenos en los sujetos enfermos con mejoría de los parámetros clínicos, y globalmente se reducen las tasas bacterianas en sus parejas, tanto por PCR cuantitativa como en los cultivos microbiológicos. - 129 - IX. 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