Sistemas de transporte molecular basados en ciclooligosacáridos y dendrímeros

Departamento de Química Orgánica Sistemas de transporte molecular basados en ciclooligosacáridos y dendrímeros Ana Isabel Carbajo Gordillo Sevilla, 2021 Departamento de Química Orgánica Sistemas de transporte molecular basados en ciclooligosacáridos y dendrímeros Memoria presentada por la graduada Ana Isabel Carbajo Gordillo para optar al grado de Doctor en Química Sevilla, 2021 El presente trabajo ha sido realizado por la graduada Ana Isabel Carbajo Gordillo en el Instituto de Investigaciones Químicas (CSIC _ Universidad de Sevilla), bajo la dirección de la Dra. Carmen Ortiz Mellet, Catedrática de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla, el Dr. José Manuel García Fernández, Profesor de Investigación del Instituto de Investigaciones Químicas (CSIC-Universidad de Sevilla) y el Dr. José Luis Jiménez Blanco, Profesor Titular de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla. Los directores del trabajo: Fdo.: Dra. Carmen Ortiz Mellet Fdo.: Dr. José Manuel García Fernández Fdo.: Dr. José Luis Jiménez Blanco FINANCIACIÓN Este proyecto ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (Sistemas nanométricos autoensamblados para el transporte de fármacos y material génico basados en carbohidratos: Aplicaciones contra el cáncer, CTQ2015-64425-C2-1- R), por Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Virus artificiales mediante síntesis de precisión: vectores no virales moleculares para el transporte de genes y fármacos, RTI2018-097609-B-C21), por el Fondo Europeo para el Desarrollo Regional (FEDER) y por el Fondo Social Europeo (FSE). La doctoranda ha sido financiada mediante un contrato predoctoral para la formación de personal investigador (BES-2016-076932) asociada al proyecto CTQ2015- 64425-C2-1-R del Ministerio de Economía y Competitividad durante el período 2017- 2021. Índice i ÍNDICE GENERAL Abreviaturas Relación de figuras Publicaciones Resumen 1. Introducción General…………….………………………….………………1 2. Objetivos……………………………………………………………………27 3. Vectores de genes basados en el disacárido a,a’-trehalosa………………47 3.1. Antecedentes……………………………………………………………47 3.2. Resultados y discusión……………………………………………….....53 3.2.1. Síntesis de derivados anfifílicos de a,a’-trehalosa………………53 3.2.2. Estudios de complejación de ADN de los anfifílicos siameses derivados de a,a’-trehalosa y caracterización de los nanocomplejos resultantes mediante dispersión dinámica de la luz (DLS), electroforesis en gel de agarosa y microscopía de transmisión electrónica (TEM)……….60 3.2.3. Evaluación de la eficiencia de transfección in vitro e in vivo…….69 3.3. Conclusiones…………………………………………………………....75 4. Sistemas anfifílicos basados en derivados macrocíclicos de trehalosa (ciclotrehalanas)……………………………………………………………77 4.1. Antecedentes……………………………………………………………77 4.2. Resultados y discusión………………………………………………….84 4.2.1. Síntesis de ciclotrehalanas policatiónicas anfifílicas CT2 de tipo Janus…………………………………………………………………….84 ii Índice 4.2.2. Síntesis de ciclotrehalanas policatiónicas anfifílicas CT3 “Mickey Mouse”………………………………………………………………….87 4.2.3. Estudios de complejación de ADNp y caracterización de los complejos mediante dispersión dinámica de la luz (DLS), microscopía de transmisión electrónica (TEM) y electroforesis en gel de agarosa……..105 4.2.4. Viabilidad celular y eficacia de transfección en células COS-7, HepG2, HeLa, BNL-CL2 y RAW 264.7……………………………….112 4.2.5. Evaluación de la eficacia de transfección in vivo de los derivados de CT3HL2 31 y 40 y de los derivados CT3H2L 43 y 48…………………118 4.3. Conclusiones…………………………………………………………..121 5. Sistemas policatiónicos de tipo “polímero estrella”…………………….127 5.1. Antecedentes…………………………………………………………..127 5.2. Resultados y discusión………………………………………………...135 5.2.1. Síntesis de derivados dendríticos de ciclotrehalanas……………135 5.2.2. Estudios de complejación de ADNp y caracterización de los CTplejos mediante DLS, electroforesis en gel de agarosa y TEM…….147 5.2.3. Eficiencia de transfección de los derivados dendríticos de ciclotrehalana en células COS-7, HepG2, HeLa, BNL-CL2 y RAW 264.7. 5.2.4. Efecto de la quelación de Zn2+ en la eficacia de transfección……151 5.2.5. Efecto de la preorganización supramolecular receptor-huésped en la capacidad de transfección de CTplejos……………………………..….157 5.2.6. Eficacia de transfección in vivo…………………………………160 5.3. Conclusiones…………………………………………………………..162 ! 6. Sistemas policatiónicos lineales de tipo estrella: conjugados de ciclotrehalanas-tetraetilenamina………………………………………...167 6.1. Antecedentes..........................................................................................16 Abreviaturas ix IR Espectroscopía infrarroja J J Constante de acoplamiento K K Kelvin Ka Constante de asociación kDa Kilodalton L L Lipófilo L3000 Lipofectamina3000 M M3-PALS Mixed Mode Measurement-Phase Analysis Light scattering MALDI-TOF MS Espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry) Man Manosa MD Dinámica molecular (Molecular Dynamics) x Abreviaturas Mir Miristoilo MM Mecánica molecular MMR Receptor de macrófagos en humanos MNP Nanopartícula molecular (Molecular nanoparticle) MTT Bromuro de 3(4,5-dimetil-2-triazoil)-2,5- tetrazólico m/z Relación masa/carga N NLS Nuclear localization signal sequence NMR Nuclear Magnetic Resonance NOESY Espectroscopía de RMN de efecto nuclear Overhauser (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) NPC Nuclear pore complex N/P Relación Nitrógeno/Fósforo NPs Nanopartículas O OEI Oligoetileneimina P paCD Ciclodextrina policatíonica anfifílica (polycationic amphiphilic cyclodextrins) pGaCD polycationic glycoamphiphilic CD PAMAM Poliamidoamina PBS Tampón fosfato salino (Phosphate buffer saline) PEI Polietilenimina PEG Polietilenglicol Abreviaturas xi PI Índice de polidispersidad (Polydispersity index) PLL Poli-L-lisina PTX Paclitaxel (taxol) PNA Peanut Agglutinin ppm Partes por millón R RAW 264.7 Línea celular de macrófagos de roedor RMN Resonancia magnética nuclear ROESY Rotating-frame Overhaused Effect Spectroscopy rt Temperatura ambiente (Room temperature) S SAR Estudios de relación estructura-actividad (Structureactivity relationship studies) siRNA ARN pequeño de interferencia (small interfering RNA) SD Desviación estándar SDS Dodecil sulfato de sodio T T Temperatura t.a. Temperatura ambiente TAE Tampón tris-acetato-EDTA TBE Tampón Tris-Borato/EDTA TEI Tetraetilenimina xii Abreviaturas TEM Microscopía de transmisión electrónica (Transmission Electron Microscopy) Tf Transferrina TFA Ácido trifluoroacético THF Tetrahidrofurano TLC Cromatografía de capa fina TNF Factor de necrosis tumoral TOCSY Totally Correlated Spectroscopy TPP Trifenilfosfina U URL Unidades relativas de luz UV Ultravioleta Figuras, tablas y esquemas xiii Relación de Figuras de la Tesis Capítulo 1 Figura 1.1. Representación esquemática de la Terapia Génica (modificada de https://genetherapy.isth.org). Figura 1.2. Ensayos clínicos de terapia génica aprobados entre 1989 y 2018 (izquierda) y distribución de las enfermedades en las que se han aplicado (derecha) (inspirado de abedia.com/wiley). Figura 1.3. Representación esquemática de las técnicas de suplementación (a) y supresión (b) génica, y de la edición del genoma (c) (adaptada de ref. 4). Figura 1.4. Ejemplos de métodos físicos empleados en terapia génica (adaptada de ref. 10b). Figura 1.5. Ejemplos de vectores virales empleados en terapia génica. Figura 1.6. Estructura química de algunos lípidos y polímeros catiónicos empleados como vectores de transfección. Figura 1.7. Ejemplos de CDs policatiónicas desarrolladas por el grupo de O’Driscoll (A) y de paCDs desarrolladas por nuestro grupo de investigación (B y C). Figura 1.8. Representación esquemática del autoensamblaje de las CDs funcionalizadas con grupos xilileno (A) y en presencia del huésped bisadamantano (B) (tomada de ref. 37). Figura 1.9. Representación esquemática del proceso de autocondensación y complejación de ADNp por calixarenos propuesto por Klychemlo y col (tomada de ref. 40). Figura 1.10. Estructura del FCAP y su autoensamblaje con DOX y siRNA (tomada de ref. 44). Figura 1.11. Representación de la formación del complejo ternario del fullereno TPFE, siRNA y las proteínas del suero sanguíneo (tomada de ref. 46). Figura 1.12. Representación esquemática del proceso de formación de nanofibras catiónicas y de transfección a la célula del plásmido GFP (tomada de ref. 48). xiv Figuras, tablas y esquemas Figura 1.13. Representación de las barreras extracelulares e intracelulares que limitan la terapia génica empleando vectores no virales (tomada de ref. 51). Figura 1.14. Representación de las vías endocíticas de entrada celular (tomada de ref. 53). Figura 1.15. Representación esquemática del mecanismo “esponja de protones” (modificada de ref. 63). Capítulo 3 Figura 3.1. Representación esquemática de la estructura básica de los surfactantes gémini. Figura 3.2. Surfactante gémini análogo a la cardiolipina (tomada de ref. 6). Figura 3.3. Ejemplos de surfactantes gémini de piridinio (tomada de ref. 7). Figura 3.4. Estructura de compuestos catiónicos anfifílicos multivalentes basados en bciclodextrinas (ADM70; panel superior) y calixarenos (panel inferior) (tomada de ref. 9). Figura 3.5. Estructura de b-CDs anfifílicas homodiméricas con distinta localización del espaciador junto con imágenes TEM de la morfología que adoptan. Figura 3.6. Representación esquemática de los surfactantes siameses derivados de a,a’- trehalosa. Figura 3.7. Estructura de los surfactantes siameses basados en a,a’-trehalosa ! preparados en esta Tesis. Figura 3.8. Estructura del catalizador de Cu(I) soportado sobre sílica Si-BPA-Cu+. Figura 3.9. Espectros de 1H y 13C RMN (300, 75.5 MHz, CDCl3) de 7. Figura 3.10. Representación esquemática de la formación de nanocomplejos a partir de la compactación del ADNp por derivados anfifílicos de a,a’-trehalosa. Figura 3.11. Representación esquemática del potencial z (tomada de ref 14). Figura 3.12. Electroforesis en gel de agarosa de las formulaciones de ADNp y los derivados 86, 3, 5, 7 y 9 a valores de N/P 20. Figuras, tablas y esquemas xv Figura 3.13. Ensayos de protección de ADNp frente a nucleasas mediante experimentos de electroforesis en gel de agarosa de las formulaciones de ADNp y los derivados 86, 3, 5, 7 y 9 a valores de N/P 20. Figura 3.14. Micrografías TEM de los derivados 86, 3 y 9, en ausencia de ADNp (A), formulados con ADNp a N/P 20 y pH 7 (B) y formulados con ADNp a N/P 10 y pH 5 (C). Figura 3.15. Diámetro hidrodinámico de los nanocomplejos formulados con ADNp y 86 (arriba) y 9 (abajo) a N/P 20 diluidas en 40 mM de buffer HEPES (línea roja, pH 7.3) o en agua (línea verde, pH 4.0). Figura 3.16. Valoración de pH de los compuestos 86, 3, 7 y 9 (1 mL, 50 mM en grupos aminos protonables) en presencia de NaCl (0.15 M). Se incluye la valoración del NaCl sólo como referencia. La región sombreada representa la ventana de pH 5 a 7. Figura 3.17. Eficacia de transfección in vitro de los complejos formulados con ADNp y los derivados 86, 3, 5, 7 y 9 a N/P 20 con células COS-7, HepG2, BNL-CL2 y RAW 264.7 en presencia de 10% de FBS. Figura 3.18. Reacción de reducción de la resazurina (reactivo de AlamarBlueTM) (tomada de creative-bioarray.com). Figura 3.19. Viabilidad celular de los complejos formulados con ADNp y los derivados 86, 3, 5, 7 y 9 a N/P 20 con células COS-7, HepG2, BNL-CL2 y RAW 264.7 mediante el ensayo AlamarBlue (arriba) y el ensayo MTT (abajo) en presencia de 10% de FBS. Figura 3.20. Eficacia de transfección celular in vitro a N/P 20 en células HepG2 de los complejos de ADNp formulados con PEI y el derivado 9 con plásmido pCMV-IL12, en presencia de 10% de FBS. Figura 3.21.!Eficacia de transfección in vivo de los complejos formulados con ADNp y los derivados 10 y 15 a N/P 20. Capítulo 4 Figura 4.1. Mecanismo de autoensamblaje jerarquizado de paCDs y ácidos nucleicos para la formación de CDplejos. xvi Figuras, tablas y esquemas Figura 4.2. Ejemplos de estructuras miméticas de CDs con enlaces alternativos. Figura 4.3. Disposición espacial de los dímeros de trehalosa para la formación del primer y segundo puentes de tiourea. Figura 4.4. Representación esquemática de los derivados de CT2 tipo Janus, con dominios catiónicos y lipófilos y del proceso de ensamblaje con ADNp para dar lugar a CTplejos (tomada de ref. 13). Figura 4.5. Estructuras de las CTs evaluadas con siARN y de las respectivas instantáneas de simulación en MD a 40 ns (tomada de ref. 14). Figura 4.6. Espectros de 1H and 13C RMN (500, 100.6 MHz, CDCl3, 333 K) de 22. Figura 4.7. Estructura general de los miembros de la familia de CTs. Figura 4.8. Representación esquemática de diferentes estructuras autoensambladas formadas a partir de surfactantes (en este caso, copoliméricos por bloques). El tipo de estructura que se forma depende de la curvatura intrínseca de la molécula, que puede estimarse a partir del cálculo del parámetro de empaquetamiento crítico CCP (adaptada de la ref. 20c). Figura 4.9. Estructura de los derivados policatiónicos de βCD con sustituyentes aromáticos descritos en la ref. 31 e imágenes de TEM mostrando la variedad de topologías accesibles para los correspondientes nanocomplejos con ADNp (adaptada de la ref. 31). Figura 4.10. Análisis retrosintético para la preparación de CTs triméricas de tipo CT3HL2 mediante una aproximación convergente. Figura 4.11. Mecanismo de autocondensación de isotiocianatos para dar tioureas simétricas. Figura 4.12. Espectro de masas en modo ESIMS del derivado hexanoilado 25. Figura 4.13. Espectros 1D TOCSY (irradiación en H-3 y H-3’) y 1H RMN (500 MHz, CDCl3, 323 K) de 26. Figura 4.14. Espectro de masas en modo ESIMS de la CT3HL2 Boc-protegida 29. Figura 4.15. Espectros de 1H y 13C RMN (500 MHz, 125.7 MHz, DMSO-d6, 343 K) de 33. Figuras, tablas y esquemas xvii Figura 4.16. Mecanismo de transformación de alquilazidas en alquilisotiocianatos mediante reacción de tipo tandem Staudinger―aza-Wittig. Figura 4.17. Espectro de masas en modo ESIMS de la CT3H2L 44. Figura 4.18. Representación del método de nanoprecipitación empleado para la preparación de CTplejos con ADNp. Figura 4.19. Micrografías de TEM de los compuestos 31, 32, 35 y 36, y de los correspondientes CTplejos con ADNp. El recuadro en el caso de 36/ADNp muestra un ejemplo de estructura filamentosa, a la misma escala que la estructura vesicular del recuadro principal (pCMV-Luc VR1216). Figura 4.20. Micrografías de TEM de los compuestos 38 y 40, y de los correspondientes CTplejos con ADNp (pCMV-Luc VR1216). Figura 4.21. Micrografías de TEM de los compuestos 43, 44, 47 y 48, y de los correspondientes CTplejos con ADNp (pCMV-Luc VR1216). Figura 4.22. Electroforesis en gel de agarosa de los complejos formulados con ADNp (pCMV-Luc VR1216) y las CTs 31, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 47 y 48 a valores de N/P 5 y 10. Se empleó ADNp libre sin tratar y tratado con nucleasas como referencia. Figura 4.23. Ensayos de protección frente a nucleasas de los complejos formulados con ADNp (pCMV-Luc VR1216) y 31, 35, 38, 40, 43, 44, 47 y 48 a N/P 5 y10. Se empleó ADNp libre sin tratar y tratado con nucleasas como referencia. Figura 4.24. Viabilidad determinada por el ensayo Alamar Blue® (izquierda) para las células COS-7 y HepG2, por el ensayo MTT para COS-7, Hep-G2, HeLa, BNL-CL2 y RAW 264.7 (derecha), para formulaciones de las nanopartículas moleculares de tipo CT3HL2 31, 35, 38 y 40 con ADNp (pCMV-Luc VR1216) a valores de N/P 5, 10 y 20. Los poliplejos con el vector de referencia comercial bPEI (25 kD) se formularon en todos los casos a N/P10, y los lipoplejos con Lipofectamina 3000® de acuerdo a las instrucciones óptimas indicadas por el fabricante. Figura 4.25. Viabilidad determinada por el ensayo Alamar Blue® (izquierda) para las células COS-7 y HepG2, por el ensayo MTT para COS-7, Hep-G2, HeLa, BNL-CL2 y xviii Figuras, tablas y esquemas RAW 264.7 (derecha), para formulaciones de las nanopartículas moleculares de tipo CT3H2L2 43, 44, 47 y 48 con ADNp (pCMV-Luc VR1216) a valores de N/P 5, 10 y 20. Los poliplejos con el vector de referencia comercial bPEI (25 kD) se formularon en todos los casos a N/P10, y los lipoplejos con Lipofectamina 3000® de acuerdo a las instrucciones óptimas indicadas por el fabricante. Figura 4.26. Estructura de las ciclotrehalanas “Mickey Mouse” CT3HL2 (31, 35, 38 y 40) y CT3H2L (43, 44, 47 y 49) evaluadas como vectores de ADNp in vitro en este capítulo. Figura 4.27. Eficacia de transfección en células COS-7, HepG2, HeLa, BNL-CL2 y RAW 264.7 de los CT complejos formulados a partir de ADNp (pCMV-Luc VR1216) y las ciclotrehalanas “Mickey Mouse” CT3HL2 (31, 35, 38 y 40) y CT3H2L (43, 44, 47 y 48) a valores de N/P 5, 10 y 20, en presencia de FBS (10%). Se incluyen, con fines comparativos, los datos obtenidos con lipoplejos de Lipofectamina 3000® y poliplejos formulados con PEI (N/P 10). Figura 4.28. Expresión génica in vivo tras administración intravenosa de ADNp (pCMV- Luc VR1216)!formulado con las ciclotrehalanas 31, 40, 43 y 48 a valores de N/P 5 y 10 en presencia de FBS (10%). (n = 4 animales). Capítulo 5 Figura 5.1. Representación del efecto EPR: a la izquierda, las moléculas pequeñas escapan del torrente sanguíneo y se difunden por todo el cuerpo. A la derecha, los materiales de tamaño manométrico no pueden escapar del torrente debido a su fisiología. Figura 5.2. Estructura general de dendrímeros con indicación de sus componentes principales. Figura 5.3. Representación esquemática de los métodos de síntesis de dendrímeros: (a) divergente y (b) convergente. Figura 5.4. Ejemplos de la estructura química de dendrímeros de poli(amidoamina) (PAMAM) y de poli(propilenimina) (PPI). Figuras, tablas y esquemas xxv Esquema 4.7. Síntesis de los derivados CT3HL2 38 y 40. Reactivos y condiciones: (a) DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 62%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, 91%-cuantitativo. (c) 98, DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 66%. Esquema 4.8. Síntesis de los precursores diméricos de trehalosa 20 y 28. Reactivos y condiciones: (a) TPP, CS2, dioxano, 24 h, 80%. (b) 10:1 piridina-H2O, 45 ºC, 4 h, 15% (27 % de rendimiento referido a la conversión; 45% de compuesto de partida recuperado). Esquema 4.9. Síntesis de los derivados CT3H2L 43, 44, 47 y 48. Reactivos y condiciones: (a) DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 40-52%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, cuantitativo. (c) 98, DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 71-99%. Capítulo 5 Esquema 5.1. Síntesis del derivado policatiónico CT2-G0 50. Reactivos y condiciones: (a) piridina, DMAP, 40 ºC, 16 h, 81%. (b) 1:1 TFA-DCM, 98%. Esquema 5.2. Síntesis del derivado policatiónico CT2-G0 50. Reactivos y condiciones: (a) piridina, DMAP, 40 ºC, 16 h, 81%. (b) 1:1 TFA-DCM, 99%. Esquema 5.3. Síntesis de los derivados policatónicos CT2-G1 y CT2-G2 52 y 54. Reactivos y condiciones: (a) 98, DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 45-70%. (b)1:1 TFADCM, t.a., 1 h, 90%-cuantitativo. Esquema 5.4. Síntesis de los derivados policatiónicos CT3-G1 y CT3-G2, 60 y 62. Reactivos y condiciones: (a) 98, DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 56-69%. (b)1:1 TFADCM, t.a., 1 h, cuantitativo. Capítulo 6 Esquema 6.1. Síntesis de los derivados policatiónicos de las ciclotrehalanas CT2-TEI y CT3-TEI (56 y 64). Reactivos y condiciones: (a) 10, DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 56-66%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, cuantitativo. Capítulo 7 xxvi Figuras, tablas y esquemas Esquema 7.1. Síntesis de los derivados de CT2 glicocatiónicos 74 y 77. Reactivos y condiciones: (a) DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 99%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, 96%. (c) ManNCS/LacNCS, NaHCO3, 1.5:1 acetona-H2O, t.a., 16 h, 60-74%. (d) HS(CH2)NHBoc, AIBN, l 254 nm, MeOH, t.a., 1 h, cuantitativo. (e) i. NaOMe (1M MeOH), MeOH, 0 ºC ® t.a., 30 min. ii. 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, cuantitativo. Esquema 7.2. Síntesis del precursor dimérico de trehalosa 69. Reactivos y condiciones: (a) HS(CH2)3SH, NaBH4, Et3N, iPrOH, 40 ºC, 6 h, 24-29%. (b) CSCl2, CaCO3, H2O-acetona, t.a., 2 h, 83%. (c) Et3N, piridina, 40 ºC, 24 h, 84%. (d) TPP, THF, NH4OH, 50 ºC, 16 h, 96%. Esquema 7.3. Síntesis de los derivados glicocatiónicos de CT3 82 y 85. Reactivos y condiciones: (a) DMAP, piridina, 40 ºC, 16 h, 91%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, 96%. (c) ManNCS/LacNCS, NaHCO3, 1.5:1 acetona-H2O, t.a., 24 h, 69-75%. (d) HS(CH2)NHBoc, AIBN, l 254 nm, MeOH, t.a., 1 h, 66-80%. (e) NaOMe (1M MeOH), MeOH, 0 ºC-t.a., 30 min. 2). 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, cuantitativo. Relación de Tablas de la Tesis Capítulo 3 Tabla 3.1. Tamaños hidrodinámicos (nm) y potenciales z (mV) para los nanoplejos formulados con los derivados 86, 3, 5, 7 y 9 y el ADNp (pCMV-Luc VR1216) a relaciones N/P 5,10 y 20. Figuras, tablas y esquemas xxvii Capítulo 4 Tabla 4.1. Tamaños hidrodinámicos (nm) y potenciales z (mV) para los nanocomplejos formulados con los derivados 31, 32, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 47 y 48 y el ADNp (pCMV- Luc VR1216) a relaciones N/P 5, 10 y 20. Capítulo 5 Tabla 5.1. Pesos moleculares teóricas (Mwteor), pesos moleculares promedio en número determinados mediante GPC (MnGPC) e índices de polidispersidad (PDI) para las CTs policatiónicas 50, 52, 54, 58, 60 y 62. Tabla 5.2. Tamaños hidrodinámicos (nm) y potenciales z (mV) para los CTplejos formulados con las CTs 50, 52, 54, 58, 60 y 62 y el ADNp (pCMV-Luc VR1216) a relaciones N/P 5,10 y 20. Capítulo 6 Tabla 6.1. Tamaños hidrodinámicos (Ø, nm) y potenciales z (mV) para los CTplejos formulados con las CT2-TEI y CT3-TEI (56 y 64) y el ADNp (pCMV-Luc VR1216) a relaciones N/P 5,10 y 20. Capítulo 7 Tabla 7.1. Tamaños hidrodinámicos (Ø, nm) y potenciales z (mV) para los CTplejos formulados con la CT2 glicocatiónica manosilada 74 y el ADNp (pCMV-Luc VR1216) a relaciones N/P 5,10 y 20. xxviii Publicaciones El trabajo desarrollado en esta Tesis ha dado lugar a las siguientes publicaciones científicas y comunicaciones en congresos: Publicaciones. 1. Trehalose-based Siamese twin amphiphiles with tunable self-assembling, DNA complexing and gene delivery properties. A. I. Carbajo-Gordillo, J. Rodríguez-Lavado, J. L. Jiménez Blanco, J. M. Benito, C. Di Giorgio, I. Vélaz, C. Tros de Ilarduya, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, Chem. Commun., 2019, 55, 8227-8230. 2. “Click” Synthesis of Size and Shape-Tunable Star Polymers with Functional Macrocyclic Cores for Synergistic DNA Complexation and Delivery. A. I. Carbajo Gordillo, J. L. Jimeńez Blanco, J. M. Benito, H. Lana, G. Marcelo, C. DiGiorgio, C. Przybylski, H. Hinou, V. Ceña, C. Ortiz Mellet, F. Mendicuti, C. Tros de Ilarduya, J. M. García Fernández, Biomacromolecules, 2020, accepted for publication. 3. Tuning the Topological Landscape of DNA-Cyclodextrin Nanocomplexes by Molecular Design. T. Neva, A. I. Carbajo-Gordillo, J. M. Benito, H. Lana, G. Marcelo, C. Ortiz Mellet, C. Tros de Ilarduya, F. Mendicuti, J. M. García Fernández, Chem. Eur. J., 2020, 26, 15259-15269. Comunicaciones en congresos. 1. Comunicación Oral. Siamese twin amphiphiles built on trehalose as tunable molecular vectors for in vitro and in vivo gene delivery. A. I. Carbajo-Gordillo, J. Rodríguez-Lavado, J. L. Jiménez Blanco, J. M. Benito, C. Di Giorgio, I. Vélaz, C. Publicaciones xxix Tros de Ilarduya, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández. 3er Congreso de Estudiantes de Doctorado en Química. Sevilla (España). Octubre 2019. 2. Comunicación Flash. Multifunctional cyclooligosaccharides: connecting nucleic acids and proteins. A. I. Carbajo-Gordillo, G. Rivero, J. L. Jiménez Blanco, J. M. Benito, C. Tros de Ilarduya, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández. 6th European Conference on Cyclodextrins – EURO CD 2019. Santiago de Compostela (España). Octubre 2019. 3. Comunicación Flash. Synthesis and evaluation of novel cationic facial dendrimers based on macrocyclic trehalose scaffolds as gene delivery system. A. I. Carbajo- Gordillo, J. L. Jiménez Blanco, C. Tros de Ilarduya, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández. XXXVII Reunión Bienal de la Real Sociedad Española de Química. San Sebastián (España). Mayo 2019. 4. Póster. Preparación de una nueva familia de dendrímeros policatiónicos de tipo “star” con núcleo de ciclotrehalana y su evaluación como vectores de genes no virales. A. I. Carbajo-Gordillo, J. L. Jiménez Blanco, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, C. Tros de Ilarduya. XIV Congreso de la Sociedad Española de Farmacia Industrial y Galénica (SEFIG 2019). Santiago de Compostela (España). Enero 2019. 5. Comunicación Flash. Delivery of therapeutic nucleic acids by new cyclooligosaccharides based on trehalose building blocks. A. I. Carbajo-Gordillo, J. L. Jiménez Blanco, C. Tros de Ilarduya, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández. xxx Publicaciones XV Simposio de Jóvenes Investigadores Químicos. Toledo (España). Noviembre 2018. Premio al mejor póster de la Asociación de Industria Navarra 6. Comunicación Oral. Trehalose-based nanoparticles for therapeutic gene delivery: synthesis, self-assembly and delivery properties. A. I. Carbajo Gordillo. 2º Congreso de Estudiantes de Doctorado en Química. Sevilla (España). Octubre 2018. 7. Comunicación Oral. Modular synthesis of multifaceted cyclooligosaccharides based on trehalose building blocks. J. L. Jiménez Blanco, A. I. Carbajo-Gordillo, C. Tros de Ilarduya, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández. 29th International Carbohydrate Symposium. Lisboa (Portugal). Julio 2018. 8. Póster. Nuevos sistemas de transporte de genes basados en ciclotrehalanas (CTs). A. I Carbajo-Gordillo. 1er Congreso de Estudiantes de Doctorado en Química. Sevilla (España). Diciembre 2017. Premio a mejor póster. 9. Póster. Trehalose-based giant surfactants as gene delivery systems: Mickey Mouse cyclotrehalanas. J. L. Jiménez Blanco, A. I. Carbajo Gordillo, M. González Cuesta, L. Blanco-Fernández, C. Tros de Ilarduya, I. Vélaz, T. Carmona, F. Mendicuti, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández. 19th European Carbohydrate Symposium – EUROCARB. Barcelona (España). Julio 2017. Resumen xxxi La terapia génica es una modalidad de medicina molecular que consiste en transferir al interior celular, material génico capaz de interferir en la biosíntesis de proteínas implicadas, bien por su presencia o por su ausencia, en el desarrollo de una enfermedad. La principal limitación de la terapia génica se debe a propiedades inherentes al ADN libre, que presenta baja permeabilidad para atravesar la membrana plásmatica e inestabilidad metabólica, por lo que resulta imprescindible el desarrollo de vectores de genes capaces de compactar y proteger el material génico. Actualmente, los que mejor eficacia de transfección presentan son los vectores virales; sin embargo, aún presentan problemas asociados a su bioseguridad. Como consecuencia de esto, cada vez son más los vectores sintéticos recogidos en la literatura. La mayoría se basan en sistemas lipídicos o poliméricos, cuya naturaleza dispersa representa una desventaja importante para los estudios y aplicaciones fundamentales. Como alternativa, en esta Tesis hemos desarrollado nuevos vectores moleculares para la complejación y transporte de ácidos nucleicos que explotan la química y propiedades estructurales del disacárido a,a’-trehalosa. La rigidez y simetría de la a,a’- trehalosa, en la que los hidroxilos primarios y secundarios, equivalentes en las dos unidades de glucosa constituyentes, están orientados en direcciones opuestas, permite generar fácilmente anfifilia facial y acceder a sistemas con dominios policatiónicos y lipófilos bien diferenciados. De esta manera, los centros catiónicos pueden interaccionar de forma cooperativa con los grupos fosfatos del esqueleto oligonucleotídico, mientras que las cadenas grasas promoverán la autoasociación y compactación mediante interacciones hidrófobas. La disposición de las posiciones primarias en la molécula de a,a’-trehalosa es, además, especialmente adecuada para la construcción de sistemas macrocíclicos denominados ciclotrehalanas (CTs). Las CTs pueden prepararse mediante aproximaciones convergentes, compatibles con la incorporación de elementos funcionales que pueden llevarse a cabo en las etapas iniciales de la síntesis, lo que permite acceder a estructuras con una orientación predeterminada de los sustituyentes. xxii Resumen De manera general, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral ponen de manifiesto el potencial del disacárido a,a’-trehalosa para el diseño de nuevos sistemas no virales para el transporte de material génico. Empleando secuencias de reacciones muy eficaces, en especial reacciones click de macrociclación y de multiacoplamiento, es posible acceder a una variedad de arquitecturas policatiónicas (macro)moleculares sin precedentes en el campo de los vectores moleculares, manteniendo la pureza diastereomérica. Estas incluyen: (a) derivados policatiónicos anfifílicos construidos sobre la propia molécula de a,a’-trehalosa que combinan elementos de los compuestos vectores multivalentes y de los surfactantes gémini, que denominamos surfactantes siameses; (b) nanopartículas moleculares disimétricas (patchy), con dominios catiónicos anfifílicos de tipo Janus (con dos caras diferentes) o Mickey Mouse (tres dominios, dos de ellos idénticos y diferentes del tercero); (c) polímeros estrella de estructura dendrítica con un núcleo funcional de CT dimérica (CT2) o trimérica (CT3); el primero aporta la capacidad de quelatar eficazmente el catión zinc(II) mientras que el segundo puede formar complejos de inclusión con derivados de adamantano, propiedades ambas que permiten potenciar la transfección; (d) polímeros estrella lineales con brazos de tetraetilenimina; (e) CTs de tipo patchy con dominios catiónicos y glicosídicos en caras diferentes (Janus) o con un tercer domino lipófilo; hemos denominado a este nuevo prototipo con tres caras funcionales diferentes “derivados Hecate” (de la diosa homónima de la mitología grecorromana). El control sobre la estructura del vector ha permitido la realización de estudios de estructura/actividad rigurosos, combinando técnicas de caracterización de nanocomplejos, estudios computacionales y evaluación de la eficacia de transfección tanto in vitro como in vivo. Los resultados demuestran que tanto la naturaleza de los diferentes elementos funcionales en el vector como su número o su geometría pueden definirse en la escala molecular y modular así las propiedades supramoleculares, la topología de los nanocomplejos co-ensamblados con ADNp, sus capacidades de transfección in vitro y el tropismo in vivo. Capítulo 1 Introducción General 6 Capítulo 1 § Capacidad para permitir la liberación del material génico. § Presentar una toxicidad e inmunogenicidad bajas y la posibilidad de adaptarse a diferentes cargas y dianas. 1.3. Vectores virales para tranfección génica Los virus son los vectores de transfección más eficientes, por lo que se han empleado extensivamente tras la sustitución de su genoma propio por un ácido nucleico terapéutico.17 Entre los vectores virales utilizados en terapia génica encontramos los retrovirus, los adenovirus, los lentivirus, los adenovirus asociados y el herpes simplex (Figura 1.5). Figura 1.5. Ejemplos de vectores virales empleados en terapia génica. Los productos terapéuticos basados en vectores virales se aprobaron a partir de 2012 por distintas agencias reguladoras como la EMA (European Medicines Agency) y la FDA (Food and Drug Administration). Un ejemplo es el Luxturna®, que emplea un adenovirus asociado (AAV), destinado al tratamiento de la distrofia retiniana, una Retrovirus Adenovirus Adenovirus-asociados Lentivirus Herpes-Simplex Capítulo 1 7 enfermedad que produce una progresiva pérdida de la visión e incluso ceguera total.18 Otro ejemplo más reciente es el Zolgensma®, basado en un vector viral adenoasociado para el tratamiento de atrofia muscular espinal (AME) en enfermos menores de dos años; a día de hoy es el fármaco más caro.19 A pesar de su éxito, los vectores virales siguen presentando problemas de toxicidad, inmunogenicidad y mutagénesis, además de los elevados costes asociados a su producción a gran escala.20 1.4. Vectores sintéticos para transfección génica 1.4.1. Sistemas lipídicos y poliméricos La mayoría de las formulaciones no virales para transfección génica se basan en vectores que corresponden a dos familias: los lípidos y los polímeros catiónicos (Figura 1.6). Ambos son capaces de formar complejos con los ácidos nucleicos dirigidos por interacciones electrostáticas, originando complejos denominados lipoplejos y poliplejos, respectivamente. Las primeras estrategias utilizadas para introducir material génico mediante vectores no virales se basaron en el empleo de lípidos catiónicos. El primer lípido catiónico empleado fue el cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N- trimetilamonio (DOTMA), capaz de encapsular y liberar el ADN de manera eficiente en varias líneas celulares de mamíferos.21 Otro vector lipídico eficaz in vivo es el N-[1-(2,3- dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio metil sulfato (DOTAP).22 Los polímeros catiónicos presentan gran eficacia en transfección génica. Algunos de los más empleados son la poli-L-lisina (PLL), el primer polímero catiónico evaluado como vector de ADN,23 o la polietilenimina (PEI)24, que ha dado lugar a diversos sistemas comerciales para transfección in vitro, como el Jet-PEI o el ExGen500. 8 Capítulo 1 Figura 1.6. Estructura de lípidos y polímeros catiónicos empleados como vectores de transfección. Una limitación importante de estos sistemas de transfección es que no presentan una estructura y conformación definidas a nivel molecular, lo que impide realizar estudios de estructura-actividad (SAR) rigurosos que permitan la optimización. De hecho, los lípidos catiónicos no actúan en forma molecular, sino como liposomas, y en general se utilizan en poliformulación. Lo polímeros catiónicos por su parte son sistemas intrínsecamente polidispersos. 1.4.2. Nanopartículas moleculares (MNPs) Como alternativa a los lípidos y polímeros catiónicos, en los últimos años se han desarrollado sistemas moleculares monodispersos capaces de co-ensamblarse con ácidos O N O OO O N OO O O OO P O O O H3N N O O NH2 H2N H3N NH3 DOTAP DOTMA DOPE DOGS RHN H N N H NH3 O NH3 O O NH3 NH3 n H3N H N N H2 NH2 n H3N H2 N N NH3 n NH H3N o m O NH O O HN O NH O On PLL PEI%lineal PEI%ramificado RHN H N N H NH3 O NH3 O O NH3 NH3 n H3N H N N H2 NH2 n H3N H2 N N NH3 n NH H3N o m O NH O O HN O NH O On Capítulo 1 9 nucleicos formando nanocomplejos estables con capacidad de transfección. En general, se trata de compuestos de dimensiones nanométricas (nanopartículas moleculares; MNPs), diastereoméricamente puros, contruidos sobre un núcleo rígido que permite incorporar elementos funcionales con una orientación espacial bien definida. Entre estos cabe destacar los derivados de ciclodextrinas, calixarenos, pilarenos, fulerenos o glicopéptidos cíclicos.25 Entre las plataformas más utilizadas hasta la fecha para la preparación de vectores moleculares se encuentran las ciclodextrinas (CDs), oligosacáridos cíclicos formados por seis (aCD), siete (bCD) u ocho (gCD) unidades de a-(1,4)-D- glucopiranosilo. La estrutura macrocíclica de las CDs se caracteriza por una geometría troncocónica toroidal en la que las bases menor y mayor alojan los hidroxilos primarios y secundarios, respectivamente, impartiendo hidrofilicidad. Las paredes interiores están constituidas por grupos metino y tienen, por tanto, carácter hidrófobo. Esto hace que en medio acuoso las CDs pueden incluir moléculas hidrófobas de tamaño adecuado en su cavidad interna, aumentando la solubilidad del huésped y protegiéndolo del medio. Esta cualidad ha sido ampliamente estudiada y ha encontrado aplicación en la formulación de fármacos.26 En 2004, Darcy, O’Driscoll y col. describieron que la incorporación de grupos aminos en la cara primaria de la bCD producía MNPs catiónicas capaces de condensar ADN plasmídico (ADNp) formando nanocomplejos (CDplejos) capaces de mediar el transporte de genes in vitro.27 Posteriormente, en 2008, nuestro grupo de investigación, desarrolló la preparación de ciclodextrinas policatiónicas anfifílicas (paCDs) y confirmó que la incorporación de un dominio hidrofóbico opuesto a los grupos cargados positivamente mejoraba muy significativamente la eficacia de transfección (Figura 1.7).28 10 Capítulo 1 Figura 1.7. Ejemplos de CDs policatiónicas desarrolladas por el grupo de O’Driscoll (A) y de paCDs desarrolladas por nuestro grupo de investigación (B y C). Estudios de estructura-actividad (SAR) realizados sobre una serie amplia de ciclodextrinas policatiónicas anfifílicas permitieron extraer algunas conclusiones generales acerca de las características estructurales necesarias para que las paCDs exhiban una capacidad de transfección alta. Los puntos que se enumeran a continuación se aplican a un prototipo en el que las cabezas catiónicas se disponen sobre todas las posiciones primarias y las cadenas grasas sobre todas las posiciones secundarias: a) Los derivados de bCDs son, en general, superiores a sus homólogos derivados de aCD o de gCD.29 b) Las paCDs con grupos amino en disposición dendrítica son más eficaces que aquellas con una disposición lineal del mismo número de grupos amino cationizables.30 c) La incorporación de segmentos de etielenimina aumenta la eficacia.31 d) La incorporación de segmentos de tiourea mejora las capacidades de transfección.32 A B C Capítulo 1 11 e) El balance hidrofílico/lipofílico idóneo para garantizar una capacidad de autoensamblaje adecuada para la formación de CDplejos estables implica una longitud de cadena hidrofóbica de al menos cuatro átomos de carbono.33 La estrategia basada en el uso de paCDs como vectores de genes es compatible con la incorporación de elementos de reconocimiento biológico, tales como ligandos sacarídicos, en el dominio hidrófilo, siempre y cuando se conserve una densidad de centros catiónicos suficiente para garantizar la interacción eficaz con el ácido nucleico. Se han preparado, por ejemplo, glico-paCDs que incorporan residuos de manosa unidos mediante un espaciador a algunos de los grupos amino periféricos de manera estadística y se ha estudiado cómo la presencia de los azúcares interfiere en la formación de CDplejos.34 En otros ejemplos, se sintetizaron derivados en los que cada rama del dominio catiónico incorpora, además de la cabeza catiónica correspondiente, una unidad de monosacárido, preservando la pureza diastereoisomérica. Para el correspondiente conjugado catiónico de manosa se demostró la capacidad de unirse selectivamente al receptor de manosa de macrófagos (MMR) y de promover una transfección eficiente en células de macrófagos de roedor (RAW264.7).35 Las CDs policatiónicas son capaces de utilizar la cadena de polifosfato de los oligonucleótidos como plantilla para autoensamblarse en bicapas, dando lugar a una compactación y complejación muy efectiva. Basados en esta observación, nuestro grupo de investigación preparó CDs policatiónicas funcionalizadas con un grupo xilileno, en lugar de cadenas grasas, en su cara secundaria. La presencia del anillo aromático permite la dimerización de las CDs, mejorando la eficacia de complejación y transfección de ADNp tanto in vitro como in vivo (Figura 1.8, A).36 Una estrategia alternativa basada en el empleo de un huésped de bisadamantano, que presenta una elevada afinidad por la cavidad de la bCD, ha permitido igualmente el autoensamblaje de las CDs catiónicas con ácidos nucleicos, reduciendo el esfuerzo sintético que requieren las paCDs (Figura 1.8, B).37 12 Capítulo 1 Figura 1.8. Representación esquemática del autoensamblaje de las CDs funcionalizadas con grupos xilileno (A) y en presencia de huésped de bisadamantano (B) (tomada de ref. 37). Los calixarenos (CAs) son, junto a las ciclodextrinas, una de las familias de MNPs macrocíclicas más empleadas, debido a su topología bien definida y modulable. En 1999, Shi y Schneider mostraron el potencial de los CAs poliaminados en la nanocomplejación de ADN.38 En 2007, Matthews y col. prepararon multicalixarenos dendríticos que mostraron una elevada capacidad de complejación y transfección del ADNp en células de ovario de hámster chino (CHO), de riñón embrionario humano (HEK293) y en la línea celular monocítica humana (THP-1).39 Klychemko y col. propusieron un mecanismo para el ensamblaje de calixarenos policatiónicos anfifílicos (paCAs) en agua que implica micelas de 6 nm capaces de condensar electrostáticamente el ácido nucleico en nanopartículas de 50 nm. Este proceso jerárquico esta favorecido en el caso de calixarenos catiónicos funcionalizados con cadenas lipofílicas relativamente largas (Figura 1.9).40 A B Capítulo 1 13 Figura 1.9. Representación esquemática del proceso de autocondensación y complejación de ADNp por calixarenos propuesto por Klychemlo y col (tomada de ref. 40). En 2015, Sakurai y col. mostraron que el mecanismo de condensación determina de manera crítica las capacidades de transfección del plásmido. Tras evaluar un conjunto de calix[4]arenos anfifílicos provistos de cadenas alquílicas de diferente longitud en su borde inferior (de C3 a C15), los autores observaron que los derivados de C6 exhibían la máxima eficiencia de transfección, disminuyendo ligeramente el rendimiento para los homólogos de C9 y C12. Los derivados con cadenas más cortas o más largas, de C3 y C15, apenas mostraron expresión génica debido a su baja capacidad de condensación del ADNp.41 Recientemente, se han descrito derivados de calix[4]arenos anfifílicos aminoglucosídicos, con una capacidad de transfección de ADNp en células HeLa (derivadas de una muestra de cáncer cérvico-uterino) y una línea celular de gliobastoma humano (U87-MG) superior a la del agente comercial PEI y con una citotoxicidad muy baja.42 Los pillar[n]arenos (PAs) son compuestos macrocíclicos que presentan un núcleo aromático con dos caras fenólicas. Nierengarten y col. implementaron una estrategia para la incorporación de unidades dendríticas terminadas en grupos aminos en pillarenos, dando lugar a pillarenos policatiónicos que forman nanocomplejos estables en presencia R"="(CH2)2OH n"="2 14 Capítulo 1 de ADN y promueven la transfección, aunque con menor eficiencia que el polímero de referencia Jet-PEI, en células HeLa.43 Siguiendo una estrategia sintética similar, el grupo de Chang y col. preparó un derivado de pilar[5]areno en el que las posiciones fenólicas presentan brazos alifáticos funcionalizados con unidades de ferroceno catiónicas (FCAP, ferrocenium-capped amphiphilic pillarene). Estos sistemas presentan capacidad de autoensamblaje en medio acuoso, dando lugar a vesículas catiónicas capaces de atrapar simultáneamente el fármaco anticancerígeno doxorrubicina (DOX) y un siRNA que actúa como silenciador génico de resistencia a los medicamentos para su distribución conjunta en células cancerosas (Figura 1.10).44 Figura 1.10. Estructura del FCAP y su autoensamblaje con DOX y siRNA (tomada de ref. 44). El fulereno C60 (Buckminsterfullereno), constituido por anillos hexagonales y pentagonales de carbono (20 y 12, respectivamente) en el que ninguno de los pentágonos que lo componen comparten un borde, es una de las nanopartículas moleculares más populares. Su estructura es la de un icosaedro truncado que se asemeja a un balón de fútbol. Investigaciones recientes han demostrado que un derivado de fullereno C60 FCAP DOX siRNA Liberación4de4DOX4y4siRNA Capítulo 1 15 catiónico soluble en agua, el tetrapiperazino epóxido de fulereno (TPFE), permite el transporte de ADN y siRNA in vivo al pulmón.45 El TPFE mostró un mecanismo de autoensamblaje jerárquico, formando primero micelas y luego un complejo ternario de tipo proteínas del suero sanguíneo-TPFE-siRNA de tamaño inferior a 10 nm, resistente a la degradación enzimática. Además, la formación de este complejo ternario favorece la eliminación rápida in vivo, por vía renal, después de la liberación del siRNA en el citoplasma (Figura 1.11).46 Figura 1.11. Representación de la formación del complejo ternario del fulereno TPFE, siRNA y las proteínas del suero sanguíneo (tomada de ref. 46). El desarrollo de vectores de transfección basados en ciclopéptidos presenta gran interés debido a la facilidad de su preparación, su biocompatibilidad y las posibilidades de funcionalización.47 Con objeto de mejorar las propiedades de autoensamblaje de los ciclopéptidos, Li y col. incorporaron una cadena de guanidiniocarbonilpirrol (GCP), lo que permitió la organización en nanofibras catiónicas con capacidad de condensación de ADNp codificante de la proteína fluorescente verde fluorescente (GFP; Figura 1.12).48 1)#siRNA Micela Proteínas# plasmáticas Complejo# siRNA-TPFE Complejo# TPFE-siRNA -proteínas# plasmáticas TPFE Époxido de tetrapiperazinio fullereno Auto-ensamblaje# en#agua 2)#Proteínas#del#suero 22 Capítulo 1 datos de SAR más rigurosos. Esta Tesis se enmarca en un proyecto de investigación que aborda este desafío desde la química de carbohidratos, aprovechando la polifuncionalidad de estas biomoléculas y el control sobre la incorporación de elementos funcionales que permiten sus particulares propiedades configuracionales y conformacionales. En concreto, se aborda el diseño, síntesis, caracterización y estudio de propiedades de autoensamblaje y transfección in vitro e in vivo de nuevos vectores moleculares basados en el disacárido α,α’-trehalosa. Los antecedentes que justifican esta elección y las estructuras concretas planteadas se describen en los capítulos que siguen. Referencias 1 A. del Pozo-Rodríguez, M. A. Solinís, A. Rodríguez-Gascón, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2016, 109, 184-193. 2 K. B. Kaufmann, H. Büning, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, EMBO Mol. Med., 2013, 5, 1-20. 3 R. M. Blaese, K. W. Culver, A. D. Miller, C. S. Carter, T. Fleisher, M. Clerici, G. Shearer, L. Chang, Y. Chiang, P. Tolstoshev, J. J. Greenblatt, S. A. Rosenberg, H. Klein, M. Berger, C. A. Mulle, W. J. Ramsey, L. Muul, R. A. Morgan, W. F. Anderson, Science, 1995, 270, 475- 480. 4 X. M. Anguela, K. A. High, Annu. Rev. Med., 2019, 70, 273-288. 5 C. Uherek, W. Wels, Adv. Drug Deliv. Rev., 2000, 44, 153-166. 6 S. T. Crooke, Biochim. Biophys. Acta., 1999, 1489, 31-43. 7 R. A. Stull, F. C. Szoka Jr., Pharm. Res., 1995, 12, 465-483. 8 S. D. Jayasena, Clin. Chem., 1999, 45, 1628-1650. 9 (a) W. Cai, M. Wang, Sci. Bull., 2019, 64, 1841-1849. (b) L. Wang, W. Zheng, S. Liu, B. Li, X. Jiang, ChemBioChem, 2019, 20, 634-643. (c) P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang, Cell, 2014, 157, 1262-1278. (d) H. Yin, K. J. Kauffman, D. G. Anderson, Nat. Rev. Drug Discov., 2017, 16, 387-399. 10 (a) D. Ibraheem, A. Elaissari, H. Fessi, Int. J. Pharm., 2014, 459, 70-83. (b) M. Ramamoorth, A. Narvekar, J. Clin. Diagn. Res., 2015, 9, 1-7. 11 N. Dujardin, V. Préat, Methods Mol. Biol., 2004, 245, 215-226. 12 T. Suzuki, B.C. Shin, K. Fujikura, T. Matsuzaki, K. Takata, FEBS Lett., 1998, 3, 436-440. 13 C. Watkins, J. Hopkins, G. Harkiss, Vaccine, 2005, 23, 4247-4256. 14 Y. Matsuno, H. Iwata, Y. Umeda, H. Takagi, Y. Mori, J. Miyazaki, A. Kosugi, H. Hirose, Asaio J. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 2003, 49, 641-644. 15 G. Zhang, M. E. Selzer, Exp. Neurol., 2001, 167, 304-311. Capítulo 1 23 16 G. Zhang, X. Gao, Y. K. Song, R. Vollmer, D. B. Stolz, J. Z. Gasiorowski, D. A. Dean, D. Liu, Gene Ther., 2004, 11, 675-682. 17 (a) M. A. Kotterman, T. W. Chalberg, D. V. Schaffer, Annu. Rev. Biomed. Eng., 2015, 17, 63-89. (b) L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, New Microbiol., 2013, 36, 1-22. 18 J. J. Darrow, Drug Discov. Today, 2019, 24, 949-954. 19 A. M. Keeler, T. R. Flotte, Annu. Rev. Virol., 2019, 6, 601-621. 20 J. L. Shirley, Y. P. de Jong, C. Terhost, R. W. Herzog, Mol. Ther., 2020, 28, 709- 722. 21 P. L. Felgner, T. R. Gadek, M. Holm, R. Roman, H. W. Chan, M. Wenz, J. P. Northrop, G. M. Ringold, M. Danielsen, Proc. Natl, Acad. Sci., 1987, 84, 7413-7417. 22 Z. Ma, J. Zhang, S. Alber, J. Dileo, Y. Negishi, D. Stolz, S. Watkins, L. Huang, B. Pitt, S. Li, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2002, 27, 151-159. 23 U. K. Laemmli, Proc. Natl. Acad. Sci., 1975, 72, 4288-4292.! 24 S. Ferrari, E. Moro, A. Pettenazzo, J. P. Behr, F. Zacchello, M. Scarpa, Gene Ther., 1997, 4, 1100-1106. 25 J. L. Jiménez Blanco, J. M. Benito, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, J. Drug Deliv. Sci. Tec., 2017, 42, 18-37. 26 C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernandez, J. M. Benito, Cyclodextrins for pharmacological and biomedical applications. In Supramolecular Systems in Biomedical Fields; Schneider, H.- J. (Ed.) Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2013, Chapter 5, pp. 94-139. 27 S.-A. Cryan, A. Holohan, R. Donohue, R. Darcy, C. M. O’Driscoll, Eur. J. Pharm. Sci., 2004, 21, 625-633. 28 A. Díaz-Moscoso, P. Balbuena.Oliva, M. Gómez-García, C. Ortiz Mellet, J. M. Benito- Hernández, L. Le Gourrierec, C. Di Giorgio, P. Vierling, A. Mazzaglia, N. Micali, J. Defaye, J. M. García Fernández, Chem. Commun., 2008, 17, 2001-2003. 29 C. Bienvenu, A. Martínez, J. L. Jiménez Blanco, C. Di Giorgio, P. Vierling, C. Ortiz Mellet, J. Defaye, J. M. García Fernández, Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 5570-5581. 30 A. Díaz-Moscoso, L. Le Gourrièrec, M. Gómez-García, J. M. Benito, P. Balbuena, F. Ortega-Caballero, N. Guilloteau, C. Di Giorgio, P. Vierling, J. Defaye, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, Chem. Eur. J., 2009, 15, 12871-12888. 31 A. Martínez, C. Bienvenu, J. L. Jiménez Blanco, P. Vierling, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, C. Di Giorgio, J. Org. Chem., 2013, 78, 8143-8148. 32 A. Méndez-Ardoy, N. Guilloteau, C. Di Giorgio, P. Vierling, F. Santoyo-González, C. Ortiz Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, J. Org. Chem., 2011, 76, 5882-5894. 33 I. Pflueger, C. Charrat, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, C. Di Giorgio, J. M. Benito, Org. Biomol. Chem., 2016, 14, 10037-10049. 34 A. Méndez-Ardoy, A. Díaz-Moscoso, C. Ortiz Mellet, C. Di Giorgio, P. Vierling, J. M. Benito, J. M. García Fernández, RSC Adv., 2015, 5, 76464-76471. 24 Capítulo 1 35 A. Díaz-Moscoso, N. Guilloteau, C. Bienvenu, J. L. Jiménez Blanco, J. M. Benito, L. Le Gourriérec, C. Di Giorgio, P. Vierling, J. Defaye, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández Fernández, Biomaterials, 2011, 32, 7263-7273. 36 L. Gallego-Yerga, M. J. González Álvarez, N. Mayordomo, F. Santoyo-González, J. M. Benito, C. Ortiz Mellet, F. Mendicuti, J. M. García Fernández, Chem. Eur. J., 2014, 22, 6622- 6627. 37 L. Gallego-Yerga, L. Blanco-Fernández, K. Urbiola, T. Carmona, G. Marcelo, J. M. Benito, F. Mendicuti, C. Tros de Ilarduya, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, Chem. Eur. J., 2015, 21, 12093-12104. 38 Y. Shi, H.-J. Schneider, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1999, 2, 1797-1803. 39 R. Lalor, J. L. DiGesso, A. Mueller, S. E. Matthews, Chem. Commun., 2007, 46, 4907- 4909. 40 R. V. Rodik, A. S. Klymchenko, N. Jain, S. I. Miroshnichenko, L. Richert, V. I. Kalchenko, Y. Mély, Chem. Eur. J., 2011, 17, 5526-5538. 41 S. Mochizuki, K. Nishina, S. Fujii, K. Sakurai, Biomater. Sci., 2015, 3, 317-322. 42 N. Bono, C. Pennetta, A. Sganappa, E. Giupponi, F. Sansone, A. Volonterio, Int. J. Pharm., 2018, 549, 436-445. 43 I. Nierengarten, M. Nothisen, D. Sigwalt, T. Biellmann, M. Holler, J.-S. Remy, J.-F. Nierengarten, Chem. Eur. J., 2013, 19, 17552-17558.! 44 Y. Chang, K. Yang, P. Wei, S. Huang, Y. Pei, W. Zhao, Z. Pei, Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 13126-13130. 45 (a) R. Maeda-Mamiya, E. Noiri, H. Isobe, W. Nakanishi, K. Okamoto, K. Doi, T. Sugaya, T. Izumi, T. Homma, E. Nakamura, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107, 5339-5334. (b) K. Minami, K. Okamoto, K. Doi, K. Harano, E. Noiri, E. Nakamura, Sci. Rep., 2015, 4, 4916- 4922. 46 L. Minami, K. Okamoto, K. Harano, E. Noiri, E. Nakamura, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2018, 10, 19347-1935. 47 (a) M. A. Mintzer, E. E. Simanek, Chem. Rev., 2009, 109, 259-302. (b) H. Margus, K. Padari, M. Pooga, Mol. Ther., 2012, 20, 525-533. 48 M. Li, M. Ehlers, S. Schlesiger, E. Zellermann, S. K. Knauer, C. Schmuck, Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 598-601. 49 D. A. Dean, D. D. Strong, W. E. Zimmer, Gene Ther., 2015, 12, 881-890. 50 M. Ariful Islam, J. Firdous, Y.-J. Choi, C.-H. Yun, C.-S. Cho, J. Biomed. Nanotechnol., 2014, 10, 67-80. 51 I. Lostalé, J. Montenegro, Nat. Rev. Chem., 2018, 2, 258-277. 52 S. D. Conner, S. L. Schmid, Nature, 2003, 422, 37-44. 53!S. Mayor, R. E. Pagano, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2007, 8, 603-612.! 54 K. Takei, V. Haucke, Trends Cell Biol., 2001, 11, 385-391. 55 F. R. Maxfield, T. E. McGraw, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2004, 5, 121-132. Capítulo 1 25 56 (a) J.-S. Shin, S. N. Abraham, Science, 2001, 293, 1447-1448. (b) L. Pelkmans, A. Helenius, Traffic, 2002, 3, 311-320. 57 C. G. Lau, R: S. Zukin, Nat. Rev. Neurosci., 2007, 8, 413-426. 58 M. B. Bally, P. Harvie, F. M. Wong, S. Kong, E. K. Wasan, D. L. Reimer, Adv. Drug Deliv. Rev., 1999, 38, 291-315. 59 J. Gruenberg, F. van der Goot, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2006, 7, 495-504. 60 (a) J. Fominaya, W. Wels, J. Biol. Chem., 1996, 271, 10560-10568. (b) S. Gottschalk, J. T. Sparrow, J. Hauer, M. P. Mims, F. E. Leland, S. L. C. Woo, L. C. Smith, Gene Ther., 1996, 3, 448-457. 61 R. B. Arote, S. K. Hwang, M. K. Yoo, D. Jere, H. L. Jiang, Y. K. Kim, Y. J. Choi, J. W. Nah, M. H. Cho, C. S. Cho, J. Gene Med., 2008, 10, 1223-1235. 62 J. E. DiGiccio, B. E. Steinberg, J. Gen. Physiol., 2011, 137, 385-390. 63 T. Bus, A. Traeger, U. Schubert, J. Mater. Chem. B, 2018, 6, 6904-6918. 64 I. A. Khalil, K. Kogure, H. Akita, H. Harashima, Pharmacol. Rev., 2006, 58, 32-45. 65 (a) D. W. Pack, D. Putnam, R. Langer, Biotechnol. Bioeng., 2000, 67, 217-223. (b) C. Moreira, H. Oliveira, L. R. Pires, S. Simoes, M. A. Barbosa, A. P. Pêgo, Acta Biomater., 2009, 5, 2995-3006. 66 C. Lin, J. F. Engbersen, J. Control. Release, 2008, 132, 267-272. 67 M. A. Islam, J. Y. Shin, J. Firdous, T. E. Park, Y. J. Choi, M. H. Cho, C. H. Yun, C. S. Cho, Biomaterials, 2012, 33, 8868-8880. 68 M. R. Capecchi, Cell, 1980, 22, 479-488. 69 M. E. Dowty, P. Williams, G. Zhang, J. E. Hagstrom, J. A. Wolff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 10, 4572-4576. 70 M. A. E. M. van der Aa, E. Mastrobattista, R. S. Osting, W. E. Hennink, G. A. Koning, D. J. A. Crommelin, Pharm. Res., 2006, 23, 447-459. Capítulo 2 Objetivos Capítulo 2 27 2. Objetivos. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en el desarrollo de nuevos vectores moleculares para la complejación y transporte de ácidos nucleicos que explotan la química y propiedades estructurales del disacárido α,α’-trehalosa. La rigidez y simetría de la α,α’- trehalosa, en la que los hidroxilos primarios y secundarios, equivalentes en las dos unidades de glucosa constituyentes, están orientados en direcciones opuestas, permite generar fácilmente anfifilia facial y acceder a sistemas con dominios policatiónicos y lipófilos bien diferenciados. De esta manera, los centros catiónicos pueden interaccionar de forma cooperativa con los grupos fosfatos del esqueleto oligonucleotídico, en tanto que las cadenas grasas promoverán la autoasociación y compactación mediante interacciones hidrófobas. La disposición de las posiciones primarias en la molécula de α,α’-trehalosa es, además, especialmente adecuada para la construcción de sistemas macrocíclicos denominados ciclotrehalanas (CTs). Las CTs pueden prepararse mediante aproximaciones convergentes, compatibles con la incorporación de elementos funcionales iguales o distintos sobre los hidroxilos secundarios de los diferentes módulos disacarídicos. Una parte importante de los esfuerzos realizados en esta Tesis se han dirigido al diseño de derivados de CTs con una disposición en estrella de las cadenas que emanan del núcleo macrocíclico central y en los que los diferentes brazos pueden ser iguales o distintos, con total control sobre la arquitectura final y garantizando su carácter monodisperso. El proyecto planteaba alcanzar este objetivo mediante estrategias compatibles con la diversidad molecular, que permitan modificar tanto la propia estructura de la CT como aportar multifuncionalidad (reconocimiento biomolecular, propiedades de auto- y coasociación, capacidad de inclusión, complejación de metales) con un coste sintético asumible. La idea subyacente es que la disponibilidad comercial de la α,α’-trehalosa y su carácter biocompatible la hacen especialmente atractiva para su aplicación en el desarrollo de sistemas no virales para transfección génica. 28 Capítulo 2 Para poner en práctica las ideas avanzadas y alcanzar los objetivos propuestos, en esta Tesis se plantearon objetivos parciales consistentes en el desarrollo de metodologías eficaces para la síntesis de tipos de compuestos que permitiesen la realización de estudios de estructura/actividad. En concreto, las tareas se han centrado en las siguientes familias: 1. Una familia de surfactantes “siameses” basados en el disacárido α,α’- trehalosa. 2. Una colección de CTs policatiónicas anfifílicas en las que puede definirse el número y naturaleza tanto de los centros cationizables como de las cadenas grasas, permitiendo variaciones sistemáticas del balance hidrofílico/hidrofóbico. 3. Una nueva familia de polímeros catiónicos tipo estrella con un núcleo central de CT y brazos dendríticos de tipo poliaminotiourea que combinan diferentes tipos de interacciones supramoleculares (electrostáticas, puentes de hidrógeno, complejación de catión Zn2+, inclusión) capaces de actuar de manera sinérgica para la complejación y transporte de ADN. 4. Como extensión de la estrategia para acceder a polímeros estrella con núcleo de CT, la preparación de derivados con brazos lineales de tipo oligoetileimina. 5. Un prototipo original de CTs multifuncionales, CTs glicocatiónicas anfifílicas, con capacidad de reconocimiento simultáneo de ácidos nucleicos y lectinas, y propiedades de autoasociación, manteniendo su carácter monodisperso. Además de la síntesis y caracterización de los compuestos a nivel molecular, se han llevado a cabo: • Estudios de relaciones estructura-capacidad de autoensamblado-capacidad de condensación de ácidos nucleicos. Capítulo 2 29 • Determinación de la capacidad de amortiguación de pH. • Evaluación de las capacidades de transferencia de genes in vitro en diferentes líneas celulares, así como ensayos in vivo. • Estudios in silico de la interacción con ácidos nucleicos por mecánica molecular (MM) y dinámica molecular (DM). • Estudios comparativos mediante microscopía de transmisión electrónica (TEM), así como medidas del tamaño hidrodinámico y potencial z para la caracterización de los sistemas. El desarrollo de esta Tesis ha dado lugar a la preparación de una serie de nuevos compuestos y precursores cuyas estructuras se presentan a continuación: Surfactantes siameses basados en a,a ´-trehalosa 36 Capítulo 2 Ciclotrehalanas policatiónicas CT2 tipo estrella Capítulo 2 37 38 Capítulo 2 Capítulo 2 39 Ciclotrehalanas policatiónicas CT3 tipo estrella 40 Capítulo 2 Capítulo 2 41 42 Capítulo 2 Ciclotrehalanas glicocatiónicas CT2 tipo Janus Unit 1 Unit 1’ O O O O O O O O O X N3 65, X = NH2 66, X = NCS O O O O O O O O S O S S S S S NH2 N3 BocHN NHBoc NHBoc NHBoc BocHN NHBoc 67 Unit 1 Unit 1’ O O O O O O N H NH S HN O O O OO O O OO O O O S S S S S S RHN RHN RHN RHN RHN NHR S H N 70, R = Boc 71, R = H·HCl Unit 1 Unit 1’ Capítulo 2 43 O O O O O O N H NH S HN O O O OO O O OO O O O S S S S S S NH H N H N N H HN NH S H N H N S H N S N H S NH S NH HN S S O AcO AcO AcO OAc O AcO AcO AcO OAc O AcO AcO AcO AcO O AcO AcO OAc AcO O AcO AcO OAc AcO O AcO AcO OAc AcO 72 Unit 1’ Unit 1 O O O O O O N HNH S HN O O O OO O O OO O O O S S S S S S NH H N H N N H HN NH S H N H N S H N S N H S NH S NH HN S S O R’O R’O R’O R’O O R’O R’O R’O R’O O R’O R’O R’O R’O O R’O R’O OR' R’O O R’O R’O OR’ R’O O R’O R’O OR' R’O 73, R = Boc; R’ = Ac 74, R = H·HCl; R = H S S S S NHR NHR NHR NHR Unit 1’ Unit 1 SNHR SNHR 44 Capítulo 2 Ciclotrehalanas glicocatiónicas CT3 tipo Hecate Capítulo 2 45 Capítulo 3 49 Singh et al. mostraron que la capacidad de tensioactivos gémini con grupos piridinio como cabezas catiónicas para formar de complejos con ADN se incrementa con el aumento de la longitud de las cadenas lipídicas, al mismo tiempo que la toxicidad disminuye, mejorando sus propiedades como vectores de genes (Figura 3.3).7 En cuanto a la longitud del segmento espaciador, las propiedades de transfección comienzan a disminuir a partir de una longitud de ocho átomos de carbono. Figura 3.3. Ejemplos de surfactantes gémini de piridinio (tomada de ref. 7). Los tensioactivos gémini permiten un mayor control sobre la concentración de agregación en comparación con los surfactantes clásicos y, además, sobre la topología de los agregados que se forman (micelas, vesículas, bicapas), por lo que pueden considerarse superiores a los lípidos catiónicos monoméricos como vectores de genes. Sin embargo, al igual que estos, requieren generalmente el uso de multiformulaciones que incorporan “lípidos auxiliares” adicionales, como el DOPE (dioleilfosfatidilcolina), para que la transfección sea eficaz. Estos lípidos auxiliares son capaces de cambiar la morfología del complejo ADN/lípido catiónico (lipoplejo) de lamelar a hexagonal invertido al pH ácido del endosoma, lo que facilita el escape endosomal.4,8 Por otra parte, tanto las formulaciones basadas en los lípidos catiónicos como las que utilizan surfactantes gémini dan lugar inicialmente a liposomas, y son estas entidades nanométricas, no las moléculas individuales, las que interaccionan con las moléculas de ácido nucleico para formar los complejos. Esto implica limitaciones sobre el control de la estructura que son propias de cualquier sistema nanoparticular, por ejemplo, en relación a la composición en diferentes puntos de la superficie de la partícula o a la homogeneidad en tamaño y morfología. S S NN 2Br ( ) n ( ) n NN (CH2) y 2PF6 n = 8, 10, 12, 14 y = 2-8 ( )12 ( )12 50 Capítulo 3 El desarrollo de sistemas moleculares bien definidos capaces de complejar, proteger y transportar ácidos nucleicos en monoformulación, promoviendo la transfección, supone un reto considerable. La implementación del concepto de “anfifilia facial”, inspirado en la estructura de los péptidos catiónicos de tipo poliarginina, con capacidades únicas de atravesar la membrana celular, ha supuesto un avance decisivo en este campo. La idea inicial consiste en funcionalizar de manera diferenciada las dos caras de una plataforma molecular rígida, normalmente un derivado macrocíclico de tipo calixareno o ciclodextrina, incorporando centros catiónicos en una de ellas y cadenas lipófilas en la opuesta, en una disposición tipo “Janus” (Figura 3.4). Se obtienen así compuestos catiónicos anfifílicos multivalentes que, a pesar de alcanzar dimensiones nanométricas, mantienen el carácter molecular (“nanopartículas moleculares”). A condición de que el control sobre la reactividad y la regioselectividad sea total, es posible acceder a vectores moleculares intrínsecamente monodispersos para la realización de estudios de estructura/actividad.9 Figura 3.4. Estructura de compuestos catiónicos anfifílicos basados en b-ciclodextrinas (ADM70; panel superior) y calixarenos (panel inferior) (tomada de ref. 9). Centros(catiónicos Cadenas(Lipófilas ADM70 O O O O S O O O O S O O OS O O O OO S O OO O S O O O S O O O O S O NH N S H3NNH3 NH N S NH3 NH3 N HN S NH3 NH3 HN N S H3N NH3 NH N S H3N NH3 H N N S H3N H3N HN NS H3N NH3 O O O O O O O O O O O OO O O OO O HN NH O NH ONH O NH2 NH H3N HN N H NH3 O NH2 NH NH3 HN NH2 NH H2N HN NH3 HN Capítulo 3 51 El mecanismo de formación de nanocomplejos entre vectores moleculares multivalentes y ADN implica, inicialmente, interacciones electrostáticas seguidas de interacciones hidrófobas entre los dominios lipófilos de los vectores. Este proceso facilita la desolvatación de la biomolécula y su nanocondensación, originando una estructura lamelar en la que se alternan segmentos de ADN y bicapas del vector (Figura 3.5). La formación de las bicapas implica, a su vez, la aproximación de los clústeres policatiónicos, que experimentarán repulsiones más o menos intensas dependiendo de su grado de protonación. La estabilidad del nanocomplejo supramolecular depende, por tanto, del pH: al aumentar la acidez en el endosoma, las moléculas del vector tienden a separarse, pudiendo entonces interferir con la membrana del endosoma y promover la liberación de la carga genética en el citoplasma. Figura 3.5. Estructura de b-CDs anfifílicas homodiméricas con distinta localización del espaciador junto con imágenes TEM de la morfología que adoptan. O RO RO O N O RO RO OH N O RO RO N O OR OR OO N O OOR OR N O OR OR N O OR OR O N O N N NN NN N N N N NN N N N N N N ClH3N NH3Cl NH3Cl NH3Cl ClH3NNH3Cl ClH3N NH3Cl ClH3N ClH3N H N O N H O O OR OR O N O OR OR O N H O OR OR N O RO RO O O N O O RO RO N O RO RO N O RO RO O N O N N N N N N N N N N N N N N N N N N NH3Cl ClH3N ClH3N ClH3N NH3Cl ClH3N NH3Cl ClH3N NH3Cl ClH3N NH3Cl NH3Cl R = ClH3NNH3Cl O RO RO O N O RO O O N O RO RO N O OR OR OO N O OOR OR N O OR OR N O OR OR O N O N N NH3Cl N NNH3Cl N N N N NN N N NH3Cl ClH3N ClH3N ClH3N O OR O O N O OR OR O N O OR OR N O RO RO O O N O O RO RO N O RO RO N O RO RO O N O N N ClH3N N N ClH3N N N N N N N N N ClH3N NH3Cl NH3Cl NH3Cl R = N N ClH3N NN N N NN NH3Cl N N O 52 Capítulo 3 Sin embargo, mantener la pureza diastereomérica en arquitecturas relativamente sofisticadas implica el desarrollo de métodos de síntesis de precisión altamente eficaces y procedimientos de purificación de macromoléculas que conllevan una dificultad considerable, lo que supone una limitación importante para su desarrollo práctico. Con el propósito de reducir estas limitaciones, en esta Tesis nos planteamos la posibilidad de utilizar el disacárido α,α’-trehalosa como estructura base para el desarrollo de surfactantes de tipo gémini. La molécula de α,α’-trehalosa presenta simetría C2, con dos unidades monosacarídicas compartiendo un átomo de oxígeno glicosídico. La conjunción de los efectos anomérico y exoanomérico le confiere rigidez, con los dos grupos hidroxilo primarios orientados en la misma dirección, contraria a la de los hidroxilos secundarios, de manera análoga a como sucede en las ciclodextrinas. La funcionalización selectiva con grupos catiónicos y lipófilos debe permitir generar diferenciación facial y acceder a sistemas con el carácter dimérico propio de los surfactantes gémini. Puesto que se trata de una unión directa entre monómeros, hemos denominado a esta nueva familia de compuestos “surfactantes siameses” (Figura 3.6). Figura 3.6. Representación esquemática de los surfactantes siameses derivados de α,α’-trehalosa. En este capítulo se presenta la estrategia implementada para la preparación de surfactantes siameses de estructura definida a partir de la α,α’-trehalosa y se analiza la influencia de las distintas modificaciones estructurales en sus propiedades de autoensamblaje y co-ensamblaje con ADN plasmídico (ADNp), las características de los nanocomplejos resultantes y su capacidad para promover la transfección in vitro e in vivo. Capítulo 3 53 3.2 Resultados y Discusión 3.2.1. Síntesis de derivados anfifílicos de α,α’-trehalosa. Estudios anteriores de relación estructura/actividad de transfección en sistemas policatiónicos anfifílicos, como las paCDs, indican que es particularmente favorable la presencia de cadenas de hexanoilo en las posiciones secundarias y una disposición multivalente de grupos aminos en las posiciones primarias. Esta combinación de elementos funcionales proporciona un equilibrio hidrófílo/hidrófobo apropiado y una densidad óptima de centros cationizables para una interacción eficiente con el esqueleto de polifosfato del ácido nucleico. Basándonos en estos antecedentes, nos propusimos la preparación de surfactantes siameses basados en α,α’-trehalosa con la misma disposición relativa de centros catiónicos y cadenas de hexanoilo. En concreto, los primeros objetivos sintéticos fueron los compuestos 3, 5, 7 y 9 que, junto al compuesto 86 previamente descrito10, se someterían posteriormente a evaluación como sistemas de transfección (Figura 3.7). En el diseño sintético consideramos la incorporación de diferentes espaciadores flexibles (segmentos de cisteaminilo o de etileno), grupos amortiguadores del pH (triazol, aminas terciarias), grupos donadores de enlace de hidrógeno para favorecer interacciones cooperativas con los grupos fosfato (tiourea) y grupos amino primarios periféricos en disposición linear o dendrítica. 54 Capítulo 3 Figura 3.7. Estructura de los surfactantes siameses basados en α,α’-trehalosa preparados en esta Tesis. Para la preparación de los compuestos 86 y 3, se siguió la secuencia de reacciones que se presenta en el Esquema 3.1. El acoplamiento de tipo “click”, haciendo uso de la reacción de acoplamiento azida-alquino catalizada por cobre(I) (CuAAC) entre el azidoderivado hexanoilado 8711 y el derivado propargilado bis[2-(terc-butoxicarbonil- amino)etil]propargilamina 8811, en una mezcla tBuOH-H2O, permitió aislar el compuesto Capítulo 3 55 89 con un rendimiento del 91%. La diazida de partida 87 se obtuvo previamente a partir de la 6,6’-didesoxi-6,6’-diyodo-α,α’-trehalosa,12 mediante esterificación de los hidroxilos secundarios con anhídrido hexanoico y 4-(N,N-dimetilamino)piridina (DMAP) y posterior desplazamiento nucleofílico de los grupos yodo por grupos azida. Esquema 3.1. Síntesis de los derivados anfifílicos siameses 86 y 3. Reactivos y condiciones: (a) 88, Si-BPA-Cu+, 9:1 H2O-tBuOH, 85 ºC, 36 h, 91%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, 94%- cuantitativo. (c) 90, Et3N, DCM, 16 h, 69%. Para el acoplamiento CuAAC se utilizó una sílica funcionalizada con bis(piridil)amina (BPA), un agente quelatante de Cu(I) (Si-BPA-Cu+), como catalizador heterogéneo (Figura 3.8).13 La hidrólisis ácida de los grupos carbamato se realizó con una mezcla 1:1 de ácido trifluoroacético (TFA) y diclorometano (DCM), aislándose el conjugado 86 como el correspondiente tetrahidrocloruro tras la liofilización de una disolución en HCl acuoso. El acoplamiento nucleofílico de la tetraamina 86 con el 2-(tercbutoxicarbonilamino)etil isotiocianato 9011, en presencia de Et3N, dio lugar al derivado 2 56 Capítulo 3 con un 69% de rendimiento. Tras hidrólisis ácida de los grupos carbamato y liofilización de una disolución acuosa de HCl, se aisló el derivado 3 con un 94% de rendimiento. Figura 3.8. Estructura del catalizador de Cu(I) soportado sobre sílica Si-BPA-Cu+. Con objeto de obtener derivados con mayor grado de flexibilidad, nos propusimos seguidamente la síntesis de análogos que incorporan un espaciador de cisteamina en las posiciones primarias. Para ello, partimos de la diamina 91 y la diazida 1. El derivado 91 se sintetizó mediante sustitución nucleofílica de los átomos de yodo de la 6,6’-didesoxi-6,6’- diyodo-α,α’-trehalosa con 2-(terc-butoxicarbonilamino)etanotiol (cisteamina Boc), en DMF y en presencia de CsCO3, seguido de la desprotección de los grupos carbamato. La diazida 1 se sintetizó a partir de 91, mediante una reacción de transferencia de grupo diazo con trifil azida (TfN3) y CuSO4·10H2O como catalizador.11 El acoplamiento entre la diamina 91 y el isotiocianato 90, en presencia de Et3N y a temperatura ambiente, condujo a la bis(cisteaminiltiourea) 4 con un 73% de rendimiento (Esquema 3.2). Tras la desprotección ácida de los grupos carbamato y posterior liofilización, se obtuvo el compuesto 5, con dos funciones tiourea y dos grupos amino primarios, con rendimiento cuantitativo. H N S O2 N N N Cu+Cl- SiO2 Si-BPA-Cu+ Capítulo 3 57 91 a O O O O O O O O O S S OO O O O O H2N NH2 O O O O O O O O O S S OO O O O O HN NH HN NHR NH NHR S S 4, R = Boc 5, R = H·HCl b Esquema 3.2. Síntesis del derivado anfifílico de trehalosa 5. Reactivos y condiciones: (a) 90, Et3N, DCM, 16 h, 73%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, cuantitativo. Para la preparación de 7 y 9, se comenzó con una reacción de cicloadición CuAAC entre 1 y el derivado de propargilo 88, utilizando CuI·P(OEt3) como catalizador en tBuOH- acetona 9:1, seguido de la hidrólisis ácida de los grupos carbamato. Esta secuencia condujo, con rendimiento cuantitativo, al derivado 7, que incorpora dos anillos de triazol y cuatro grupos amino primarios. Por acoplamiento nucleofílico de 7 con el isotiocianato 90, seguido de la hidrólisis ácida de los grupos carbamato y liofilización de una disolución de HCl acuoso, se aisló el derivado 9, que incorpora dos anillos de triazol, cuatro funciones tiourea y cuatro grupos amino primario, con un 96% de rendimiento (Esquema 3.3). 58 Capítulo 3 Esquema 3.3. Síntesis de los derivados anfifílicos de trehalosa 7 y 9. Reactivos y condiciones: (a) 88, CuI·P(OEt3), DIPEA, 9:1 tBuOH-acetona, 85 ºC, 24 h, 63%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, cuantitativo. (c) 90, Et3N, DCM, 24 h, 80%. Las estructuras de los compuestos preparados se confirmaron mediante espectroscopía de IR, 1H y 13C RMN, EM y análisis elemental. Los espectros de 1H y 13C corroboraron la homogeneidad de los derivados en todos los casos. A modo de ejemplo, en la Figura 3.9 se muestran los espectros del compuesto 7, en los que se aprecia un único sistema de spin de acuerdo con la simetría C2 de estos derivados. Las señales correspondientes al grupo CH2S del espaciador de cisteamina se encuentran a 3.15 ppm en el espectro de 1H y a 34.9 ppm en el espectro de 13C RMN. Otras señales características son las correspondientes a los carbonos de los anillos aromáticos C-4 y C-5 (126.1 y 143.4 ppm, respectivamente) y al protón aromático (8.09 ppm) de los anillos de triazol. Capítulo 3 65 nanopartículas esféricas de 80-100 nm de diámetro, con una estructura fina acorde con una disposición alternada de bicapas de surfactante y cadenas de plásmido (Figura 3.14 B). La inserción del espaciador flexible de cisteaminilo entre la plataforma de α,α’- trehalosa y las cabezas catiónicas en los compuestos 5, 7 y 9 reduce drásticamente la predisposición a formar agregados autoensamblados bien definidos en ausencia de plásmido. En contraste, en presencia de ADNp los compuestos 5 y 7 formaron nanocomplejos esféricos similares a los obtenidos con el compuesto 3. Sin embargo, el compuesto 9 mostró un comportamiento singular. En ausencia de plásmido, da lugar a estructuras lamelares de tipo bicapa características de compuestos anfifílicos con arquitectura tubular. Tras la co-formulación con el plásmido, se originaron nanopartículas esféricas de tipo núcleo-corona (“core-shell”) con niveles variables de ordenamiento interno (Figura 3.14, A y B); aproximadamente el 50% de las nanopartículas mostraron una estructura en capas alternadas mientras que en el 50% restante el ADNp se encuentra encapsulado en el núcleo de la nanopartícula y recubierto por la corona lipídica, probablemente en forma de bicapa, de manera desordenada. 66 Capítulo 3 Figura 3.14. Micrografías TEM de los derivados 86, 3 y 9, en ausencia de ADNp (A), formulados con ADNp a N/P 20 y pH 7 (B) y formulados con ADNp a N/P 10 y pH 5 (C). pADN pH&7 pADN pH&7 pADN pH&7 pH&5pH&5pH&5 86 39 200&nm 200&nm 200&nm 200&nm 200&nm 200&nm 200&nm 200&nm 200&nm A B C Capítulo 3 67 Este escenario sugiere un mecanismo de compactación del ADNp en dos etapas, análogo al que caracteriza el co-ensamblaje de los virus “envueltos” (“enveloped viruses”). En primer lugar, ocurriría la interacción directa de las moléculas del tensioactivo siamés con el ácido nucleico dirigida por fuerzas electrostáticas y, en una segunda etapa, se originaría la corona externa consistente en una bicapa del derivado anfifílico.16 Cabe señalar que nanoestructuras de este tipo obtenidas por otros autores mediante multiformulaciones complejas son particularmente eficaces para el transporte específico de ácidos nucleicos a células diana.17 Es importante insistir en que la eficacia de transfección de un vector no sólo depende de la estabilidad de los complejos que forma con el ácido nucleico en el medio extracelular (pH ≈ 7), sino también de su capacidad para promover el escape endosomal y la liberación de la carga tras la internalización celular (pH ≈ 5). Los compuestos con anfifilia facial experimentan un aumento de las repulsiones electrostáticas tras la acidificación, lo que desestabiliza los complejos con el ADN. Los componentes individuales pueden entonces interaccionar con la membrana de los endosomas, provocando su disrupción y la liberación del material génico en el citoplasma. En principio, es esperable que los nuevos surfactantes siameses desarrollados en esta Tesis se comporten de la misma manera. De hecho, las micrografías de TEM obtenidas a pH 5 muestran disposiciones internas de los agregados co-ensamblados mucho menos definidas (Figura 3.14, C). Además, las medidas de DLS a pH 5 mostraron un aumento significativo de la polidispersidad y la aparición de poblaciones de nanopartículas de mayor tamaño, lo que apoya la disminución de la estabilidad (Figura 3.15). La capacidad de amortiguación del pH de estos compuestos se evaluó adicionalmente mediante potenciometría (Figura 3.16). Para ello se determinó el número de mEq de NaOH requerido para cambiar una solución de concentración 50 mM del vector (referidos al nº total de grupos aminos protonables en la molécula) de pH 5 a pH 7. Los compuestos 3 y 9, que presentan el motivo aminoetiltioureido en su estructura, exhiben capacidades de amortiguación mucho más fuertes (181.6 y 195.0 mEq, respectivamente) 68 Capítulo 3 en la ventana biológica de interés en comparación con sus homólogos 86 y 7 (61.2 y 85.6 mEq). La valoración del compuesto 5 no se pudo llevar a cabo debido a la solubilidad limitada del compuesto en las condiciones experimentales. Los datos obtenidos para 3 y 9 indican un poder de amortiguación del pH mayor incluso que el de la polietilenimina ramificada (bPEI 25 kDa; 134.4 mEq),18 un polímero catiónico utilizado como referencia en múltiples estudios de transporte de genes.19 Para el PEI se ha postulado un mecanismo de esponja de protones, que conduciría a un aumento del volumen de los endosomas y su disrupción al progresar del estado temprano al estado tardío, y que probablemente también facilitaría la liberación del ácido nucleico de los poliplejos formulados con PEI.20 Es probable que un mecanismo similar también opere en el presente caso. Figura 3.15. Diámetro hidrodinámico de los nanocomplejos formulados con ADNp y 86 (arriba) y 9 (abajo) a N/P 20 en buffer HEPES (línea roja, pH 7.3) o en agua (línea verde, pH 4.0). 0 2 4 6 8 10 0.1 110 100 1000 10000 Intensity (%) Size (nm) Intensity (%) Size (nm) 0 2 4 6 8 10 0.1 110 100 1000 10000 Capítulo 3 69 Figura 3.16. Valoración de pH de los compuestos 86, 3, 7 y 9 (1 mL, 50 mM en grupos aminos protonables) en presencia de NaCl (0.15 M). Se incluye la valoración del NaCl como referencia. La región sombreada representa la ventana de pH 5 a 7. 3.2.3. Evaluación de la eficiencia de transfección in vitro e in vivo. La capacidad de transfección de estos vectores se evaluó empleando un gen reportero que codifica la luciferasa. Las luciferasas son una familia de proteínas capaces de catalizar la reacción de oxidación de luciferinas (Esquema 3.4), proceso en el cual se produce luz en el rango de 440 a 479 nm (bioluminiscencia) que puede ser cuantificada por diferentes métodos. La eficacia de transfección se puede determinar midiendo la cantidad de luz producida al añadir el sustrato de la enzima luciferasa que codifica el gen utilizado en el ensayo. Esquema 3.4. Reacción de oxidación de la luciferina catalizada por luciferasa. 86 3 7 9 61.2 195.0 181.5 85.6 70 Capítulo 3 Los ensayos de transfección se realizaron en el laboratorio de la Profesora Tros de Ilarduya, en el Departamento de Tecnología Farmacéutica y Química de la Escuela de Farmacia y Nutrición, en la Universidad de Navarra, en el marco de una estancia predoctoral, y en el laboratorio del Dr. Di Giorgio, de le Université Côte d’Azur, Niza. Se seleccionaron para ello cuatro líneas celulares: las células COS-7 (células de riñón de primate), las células HepG2 (células de hepatocarcinoma humano), las células BNL-CL2 (células hepáticas de roedor) y las células RAW 264.7 (macrófagos de ratón). Los dos primeros tipos celulares suelen responder bien a la transfección con vectores no virales, mientras que los dos últimos son notablemente más resistentes a la transfección. Como controles positivos, se emplearon PEI (polietilenimina, una formulación de polímeros catiónicos comerciales)21, L3000 (Lipofectamina 3000, una formulación de lípidos catiónicos comerciales)22 y ADM70 (uno de los vectores moleculares multivalentes basados en ciclodextrinas más eficiente reportados hasta la fecha),23 y como control negativo ADNp desnudo. En todos los casos, los ensayos se llevaron a cabo en presencia de un 10% de suero fetal bovino (FBS). Las eficacias de transfección para las formulaciones preparadas a partir de los derivados 3 y 9 fueron netamente superiores a las elaboradas a partir de los derivados 86 o 7 (Figura 3.17), poniendo de manifiesto la eficacia del motivo aminoetiltioureido en el diseño de vectores de genes no virales. Además, se observa que los derivados que incorporan el espaciador de cisteamina entre el núcleo de α,α’-trehalosa y las cabezas catiónicas presentan una mayor eficacia de transfección que aquellos que no incluyen dicha cadena en su estructura. El compuesto 9, que presenta los motivos de aminoetiltioureido y de cisteamina, presentó una mayor eficacia de transfección en todas las líneas celulares ensayadas, superando incluso la de los vectores de referencia comerciales (PEI y L3000) y compitiendo, en algunos casos favorablemente, con el derivado de ciclodextrina ADM70. Capítulo 3 71 Figura 3.17. Eficacia de transfección in vitro de los complejos formulados con ADNp y los derivados 86, 3, 5, 7 y 9 a N/P 20 con células COS-7, HepG2, BNL-CL2 y RAW 264.7 en presencia de 10% de FBS. La citotoxicidad de las formulaciones que emplean los nuevos surfactantes siameses se determinó mediante dos ensayos diferentes: el ensayo AlamarBlueTM (Invitrogen) y el ensayo MTT. La viabilidad celular se calcula en base a la relación entre la cantidad de proteínas producidas por las células del ensayo con respecto a células control, cultivadas en las mismas condiciones, que no han sido tratadas con el sistema de transfección. El ensayo AlamarBlueTM aprovecha el alto poder reductor de las células vivas para cuantificar la supervivencia de las células y establecer la viabilidad durante la transfección. El reactivo utilizado es azul en su forma oxidada (resazurina) y permite determinar las células vivas, ya que al entrar en contacto con el citoplasma de éstas pasa a su forma reducida, de color rosa fluorescente (resorufina; Figura 3.18). En el ensayo MTT ocurre algo similar, el bromuro de 3(4,5-dimetil-2-tiazoil)-2,5-difeniltetrazólico (MTT) es captado por las células y reducido por la enzima succinato deshidrogenasa en las mitocondrias de las células viables a su forma insoluble (formazán); esto conlleva un cambio de color de amarillo a azul, lo que permite su cuantificación mediante métodos colorimétricos. 0 1 2 3 4 5 6 7 DNA PEI L3000 ADM70 86 3579 Expresión;de;luciferasa log;[fg;luciferase/mg;prot] COS-7 HepG2 BNL-CL2 RAW1264.7 72 Capítulo 3 Figura 3.18. Reacción de reducción de la resazurina (reactivo de AlamarBlueTM) (tomada de creative-bioarray.com). En la Figura 3.19, se recogen las correspondientes gráficas de viabilidad celular. Los compuestos 5 y 9, que son los más eficaces en transfección, muestran una viabilidad próxima al 100% para las 4 líneas celulares evaluadas. En general, todas las formulaciones presentaron bajas citotoxicidades tanto en el ensayo AlamarBlueTM como en el MTT. Todos estos ensayos, como los de transfección, se realizaron en presencia de un 10% de suero fetal bovino (FBS). El derivado 9, que fue el que mostró mayor eficacia in vitro, se seleccionó para evaluar su capacidad de complejar un gen terapéutico que codifica la interleuquina-12 (IL- 12) y transfectar células de hepatocarcinoma humano HepG2. La IL-12 es una proteína proinflamatoria con un papel fundamental en la inmunidad innata y adaptativa. Su expresión induce la diferenciación de células NK (natural killer), células NKT y linfocitos T y la producción de factores como IFN-g (interferón-g), TNF (tumor necrosis factor) u otras citoquinas que tienen un efecto citotóxico o citostático en las células tumorales. En la gráfica de la Figura 3.20 se observa que los niveles de expresión de IL-12 en células HepG2 transfectadas con los nanocomplejos formulados con el compuesto 9 son superiores a los que se alcanzan con al agente de transfección de referencia PEI. Estos resultados ilustran el potencial de los surfactantes siameses como vectores no virales en terapia génica contra el cáncer. Capítulo 3 73 Figura 3.19. Viabilidad celular de los complejos formulados con ADNp y los derivados 86, 3, 5, 7 y 9 a N/P 20 con células COS-7, HepG2, BNL-CL2 y RAW 264.7 mediante el ensayo AlamarBlue (arriba) y el ensayo MTT (abajo) en presencia de 10% de FBS. Figura 3.20. Eficacia de transfección in vitro en células HepG2 de los complejos de ADNp formulados con PEI y el derivado 9 con plásmido pCMV-IL12 (N/P 20; 10% FBS). 86 3 5 79 86 3 5 7 9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 DNA* PEI 9 Expresión*IL-12*(ng/mL) 74 Capítulo 3 La posibilidad de modificar las propiedades topológicas de los complejos vector/ADN a nivel de nanoescala actuando sobre la estructura molecular del vector ofrece oportunidades únicas para afectar al tropismo de las nanopartículas in vivo. Para explorar esta posibilidad en el caso de los nuevos surfactantes siameses, los nanocomplejos formulados con 5 y 9 a N/P 20 se inyectaron sistémicamente en ratones sanos Balb-C y se comparó su capacidad de transfección con la del tampón fosfato salino (PBS) y el ADNp desnudo como controles negativos. Los resultados, basados en la expresión del gen reportero luciferasa, indicaron que 24 h después de la administración intravenosa la transfección ocurrió principalmente en el hígado en el caso del compuesto 5, lo que es consistente con datos previos de vectores con una topología lamelar esférica similar. Sin embargo, el compuesto 9, que forma nanocomplejos de tipo núcleo-corona, promovió la transfección en el pulmón de manera muy selectiva, un objetivo importante en terapia génica,24 con luminiscencia insignificante en el resto de los órganos (Figura 3.21). Los poliplejos obtenidos con bPEI exhibieron un 100% de mortalidad en este ensayo, mientras que todos los ratones sobrevivieron al tratamiento con formulaciones que contienen los derivados anfifílicos siameses basados en α,α’-trehalosa. Figura 3.21. Eficacia de transfección in vivo de los complejos formulados con ADNp y los derivados 10 y 15 a N/P 20. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 DNA 5 9 pg1luciferasa/mg1prot Bazo Hígado Pulmón Corazón Capítulo 4 77 4. Sistemas anfifílicos basados en derivados macrocíclicos de trehalosa (ciclotrehalanas) 4.1. Antecedentes Los derivados policatiónicos anfifílicos de ciclodextrinas (paCDs) son los vectores de genes moleculares, en el sentido estricto del término (sistemas perfectamente monodispersos, diastereoméricamente puros y efectivos en monoformulación), más estudiados. La combinación de metodologías de funcionalización química selectiva con estudios de estructura-actividad indica que su eficacia de transfección está relacionada con la capacidad de ordenamiento alrededor del ácido nucleico en forma de bicapa lipídica.1 El proceso de ensamblaje tiene lugar en dos etapas: primero intervienen las interacciones electrostáticas entre el esqueleto de polifosfato del ácido nucleico y los dominios catiónicos de las paCDs y, posteriormente, se establecen interacciones hidrofóbicas entre las cadenas grasas que promueven la deshidratación y la compactación del material génico. Los nanocomplejos resultantes (CDplejos) protegen el ácido nucleico de la degradación en el medio biológico y facilitan la internalización al interior celular (Figura 4.1).!! Figura 4.1. Mecanismo de autoensamblaje jerarquizado de paCDs y ácidos nucleicos para la formación de CDplejos. + + + + + + + Interacciones electrostáticas Interacciones hidrofóbicas CDplejo + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + O O O S N H N H SN H NH3 NH3 O OO 7 BICAPA + + + + + + + + + + + + + + 78 Capítulo 4 El acceso comercial a las CDs nativas ha facilitado de manera significativa la investigación en sistemas de transfección génica basados en paCDs. Sin embargo, existe una limitación importante: las CDs están disponibles sólo en tres tamaños diferentes (α, β, y γCD) que comparten una topología toroidal de cono truncado.2 Remodelar el tamaño y la forma mediante síntesis ciclooligosacarídica3 o imponiendo restricciones de distancias intramoleculares por vía química4 implica secuencias de reacción complejas con rendimientos modestos, lo que en la práctica complica enormemente su aplicación. La sustitución de uniones glicosídicas por otro tipo de uniones más estables y menos problemáticas en lo que al control estereoquímico se refiere, es una alternativa interesante. Se han descrito, por ejemplo, familias de macrociclos derivados de carbohidratos que incorporan uniones intersacarídicas de tipo tioéter, amida, amina, 1,2,3-triazol o fosfato (Figura 4.2).3 Sin embargo, hasta la fecha estos ciclooligosacáridos permanecen como curiosidades científicas: su química no se ha desarrollado y ninguno ha sido estudiado en el campo de la transfección génica. Figura 4.2. Ejemplos de estructuras miméticas de CDs con enlaces alternativos. O O HO OH O OH HO O O OPh P O O O P O O PhO n n = 1-3 O BnO OH HO NH O NH O O OH OH OBn O OH HO OBn NH O n n = 0-2 O BnO OH HO NH NH O OH OH OBn O OH HO OBn NH n n = 0-2 O HO HO OOH OH O HO HO O OH OH OH S OH S HO S HO S O HO HO O N N N H O OO O O O N NN H O O O O OH HO HO OH OH OH HO OH OH HO HO OH OH OH OH OH 1,2,3-triazol Amida Amina FosfatoTioéter Capítulo 4 79 En nuestro grupo de investigación, se ha desarrollado una metodología eficaz para acceder a análogos ciclooligosacarídicos originales en los que grupos funcionales de tipo pseudoamida (urea, tiourea, guanidinas) conectan unidades de a,a’-trehalosa, denominados genéricamente ciclotrehalanas (CTs; Figura 4.3).5 En estos compuestos, la forma de la cavidad central y sus propiedades supramoleculares dependen del número de unidades disacarídicas y pueden determinarse a priori mediante procedimientos sintéticos, superando así el canon rígido que implica el uso de CDs. La combinación de los efectos anoméricos y exoanoméricos en la molécula de a,a’-trehalosa6 determinan una conformación rígida alrededor de los enlaces C1―O1―C1’ que hace que las posiciones primarias queden orientadas hacia la misma región del espacio. Esta configuración facilita las reacciones de macrociclación entre precursores que portan grupos reactivos complementarios sobre las mismas.7 Figura 4.3. Estrategia de síntesis de una ciclotrehalana, en este caso dimérica, en el que se muestra la disposición espacial de los grupos reactivos en el intermedio lineal que favorece la ciclación. La utilización de derivados que incorporan grupos isotiocianato y grupos amino es especialmente eficaz para la preparación de ciclotrehalanas. El correspondiente acoplamiento para dar tioureas presenta una quimioselectividad completa, transcurre en ausencia de catalizadores y no es sensible ni a la presencia de oxígeno ni a la humedad, cumpliendo los requerimientos de la química “click”.8 Tras la formación del primer O O O O O O N H NH S HN RO RO OR RO OR OR RO RO OR OR OR RO S H N O O O O O O NNH S NCS RO RO OR RO OR OR RO RO OR OR OR OR H2N H ZE O O RO O RO OR OR OR OR H2N H2N O O OR O OR RO OR OR SCN RO SCN R"="Ac 80 Capítulo 4 puente de tiourea, la macrociclación está fuertemente favorecida frente a la formación de oligómeros lineales debido al establecimiento de un enlace de hidrógeno intramolecular que estabiliza el rotámero Z/E y dispone los grupos isotiocianato/amina en el aducto lineal intermedio próximos en el espacio (Figura 4.3). Una diferencia importante entre las CDs y las CTs es que mientras que las primeras presentan dos caras diferentes (definidas por los hidroxilos primarios y secundarios, respectivamente), es decir, son sistemas intrínsecamente “Janus”, en las CTs canónicas las diferentes caras son químicamente equivalentes (exponen en cualquier caso los hidroxilos secundarios de las unidades de glucopiranosa). El término Janus, adaptado de la mitología romana, fue sugerido por primera vez en 1991 por Pierre-Gilles de Gennes, en su discurso de recepción del Premio Nobel, para describir materiales con una distribución disimétrica de propiedades físico-químicas.9 Las partículas Janus, debido a su asimetría morfológica y química, son capaces de ensamblarse formando superestructuras que no pueden obtenerse mediante el ensamblaje de partículas homogéneas.10 Las estructuras moleculares de tipo Janus son particularmente interesantes. Su tamaño reducido, unos pocos nanómetros, y la posibilidad de funcionalización química precisa las hace ideales para la incorporación de elementos discretos que pueden desempeñar diferentes funciones de manera jerarquizada. La mayoría de las entidades moleculares de tipo Janus descritas se basan en estructuras dendríticas11 o poliméricas,12 con un alto grado de flexibilidad conformacional que reduce la disimetría propia de los materiales tipo Janus. En principio, el hecho de que las CTs puedan sintetizarse mediante estrategias convergentes permite elaborar las caras “a priori”, incorporando elementos diversos en las posiciones secundarias de los módulos de a,a’-trehalosa antes de construir la estructura macrocíclica. Se generan así objetos Janus “perfectos”, formalmente resultantes de la diferenciación de caras indistinguibles, a partir de un precursor único (la a,a’-trehalosa). Recientemente, el grupo de investigación en el que se ha desarrollado esta Tesis ha demostrado este concepto mediante la preparación de derivados anfifílicos de tipo Janus con un núcleo de ciclotrehalana Capítulo 4 81 dimérico (CT2) que incorpora seis antenas hidrofóbicas y seis cabezas catiónicas segregadas por caras. Estos compuestos son capaces de condensar de manera reversible el ADNp en nanocomplejos autoensamblados (CTplejos) que muestran una estructura lamelar y presentan capacidad de transfección tanto in vitro como in vivo (Figura 4.4).13 Figura 4.4. Representación esquemática de los derivados de CT2 tipo Janus, con dominios catiónicos y lipófilos, y del proceso de ensamblaje con ADNp para dar lugar a CTplejos (tomada de ref. 13). Derivados anfílicos de tipo Janus (Figuras 4.5, A y B), en los que las dos caras del núcleo de CT2 están funcionalizadas con 6 cadenas de miristoilo y 6 grupos cisteaminilo (A; 6 grupos amino primarios protonables) o una distribución dendrítica de tipo poli(aminotiourea) (B; 12 grupos amino primarios y 6 terciarios protonables) se han evaluado como sistemas de complejación de ARN interferente pequeño (small interfering RNA; siARN). En este caso, los experimentos de electroforesis en gel de agarosa pADN Auto-ensamblaje Nanocomplejo (CTplejo) CT5Janus O O O O O O N H NH S HN O O O OO O O OO O O O S H N O O O O O O NCS H2N NCS O O O OO O O OO O O O H2N O S NH3 82 Capítulo 4 mostraron diferencias significativas entre ambos, siendo el compuesto B el único capaz de proteger completamente el siARN de la degradación por nucleasas. Cálculos de dinámica molecular (MD) adicionales apoyaron que una protección eficiente del siARN requiere, además de grupos catiónicos que neutralicen la carga, que el vector minimice la superficie de siARN expuesta al disolvente, como puede observarse en las instantáneas de la Figura 4.6, obtenidas tras 40 ns de simulación.14 Figura 4.5. Estructuras de las CT2 tipo Janus evaluadas con siARN y de las respectivas instantáneas de simulación en MD a 40 ns (tomada de ref. 14). Los resultados anteriores ponen de manifiesto la eficacia de la metodología basada en la reacción de macrociclación mediante formación de enlaces de tipo tiourea para la preparación de CTs anfifílicas tipo Janus, su capacidad como vectores de O O O O O O N HNH S HN O O O OO O O OO O O O S H N S NH3 S S NH3 SNH3 NH3 O O OO O O ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 9 9 9 9 9 ( ) 9 SNH3 S NH3 O O O O O O N HNH S HN O O O OO O O OO O O O S H N S HN S S N H O O OO O O ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) N H S N HN S N NH3 NH3 NH3 H3N S NH NH SN H N H N N S S NH3 NH3 NH3 NH3 H NH N N S NH3 NH3 S HN HN S N NH3 NH3 9 9 9 9 9 9 A B Capítulo 4 83 transfección y la importancia del desarrollo de estrategias que permitan modular la estructura para optimizar aplicaciones concretas. En esta Tesis hemos ampliado el repertorio de CTs anfifílicas con la preparación de nuevos ejemplos de derivados de CT2 y, sobre todo, de compuestos con un núcleo central de CT3. En este último caso, la presencia de tres caras expande las posibilidades para ajustar el balance hidrofílicohidrofóbico, la densidad de carga y la flexibilidad del sistema. La posibilidad de manipular de manera semiagrupada o independiente las tres caras en derivados de CT3 permite, en principio, acceder a macrociclos con patrones anisotrópicos más complejos que el de tipo Janus (bifacial), reproduciendo a nivel molecular las características de las partículas coloidales irregulares (patchy particles) con valencia 3.15 En concreto, en este capítulo, hemos preparado derivados en los que una de las tres unidades de a,a’-trehalosa está diferentemente sustituida de las otras dos. Dado que los tres dominios (patches) tienen una disposición relativa angular, hemos adoptado el término “nanopartículas moleculares tipo Mickey Mouse” para referirnos a su topología, por analogía a la expresión “Mickey Mouse shaped particles” utilizada en la bibliografía para partículas coloidales trilobuladas angulares en las que dos de los lóbulos son de naturaleza diferente al tercero.16 Su síntesis ha requerido la puesta a punto de procedimientos originales que permiten definir los sustituyentes sobre cada uno de los módulos de a,a’-trehalosa en la CT con un control estricto sobre el carácter monodisperso de los compuestos finales. Esto nos ha permitido realizar un estudio amplio de relación estructura/capacidad de nanocondensación y protección de ADNp/eficacia de transfección de los correspondientes CTplejos. 84 Capítulo 4 4.2. Resultados y Discusión 4.2.1. Síntesis de ciclotrehalanas policatiónicas anfifílicas CT2 tipo Janus. En relación con los derivados de CT2 tipo Janus, y para completar el conjunto de estructuras ya disponibles en el laboratorio, abordamos la incorporación de cadenas de tetraetilenimina (TEI) como cabezas catiónicas. Esta distribución de grupos amino en brazos lineales ha proporcionado anteriormente eficacias elevadas de transfección en sistemas policatiónicos anfifílicos basados en CDs.17 En concreto, se ha llevado a cabo la preparación de ciclotrehalanas CT2 de tipo Janus con cadenas hidrofóbicas de tipo éster hexanoilo y miristoilo en una cara y, en la otra, segmentos cationizables de TEI unidos mediante enlaces de tipo tiourea al núcleo de CT2. Para la incorporación de las cadenas de TEI, se utilizó el isotiocianato tetra-Boc protegido 10, que se obtuvo por reacción de isotiocianación de la correspondiente amina 9218 con tiofosgeno y carbonato cálcico con un 80% de rendimiento (Esquema 4.1). Esquema 4.1. Síntesis del tetraetilenamino-Boc isotiocianato 10. Reactivos y condiciones: (a) CSCl2, CaCO3, DCM, 2 h, 80%. El acoplamiento nucleofílico múltiple del monoisotiocianato 10 con los grupos amino de las CT2 cisteaminiladas 93 y 94,16 preparadas con anterioridad en nuestro grupo de investigación, se llevó a cabo en piridina y en presencia de DMAP a 40 ºC durante 24 h, obteniéndose los ciclooligosacáridos 21 y 22 con rendimientos del 30 y 74% (para 22 y 21, respectivamente; Esquema 4.2). H2N N N Boc 92 Boc N Boc NHBoc SCN N N Boc Boc N Boc NHBoc 10 a Capítulo 4 85 Esquema 4.2. Síntesis de los derivados anfifílicos CT2-TEI 23 y 24. Reactivos y condiciones: (a) 10, DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 30-74%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, cuantitativo. La desprotección en medio ácido de los grupos carbamato con el sistema TFA- diclorometano condujo de modo cuantitativo a los derivados desprotegidos correspondientes, 23 y 24, que incorporan 6 grupos aminos primarios y 18 grupos aminos secundarios. Los productos finales se aislaron como los correspondientes perhidrocloruros tras liofilización de disoluciones en ácido clorhídrico diluido (Esquema 4.2). Las estructuras de estos derivados disimétricos se confirmaron mediante datos espectroscópicos y analíticos. En la Figura 4.6 se muestran los espectros de 1H y 13C RMN, registrados en CDCl3 a 500 MHz, de la CT2 miristoilada Boc-protegida 22, donde se identifican claramente la presencia de la señal del grupo tiocarbonilo de la función tiourea C=S a 182.9 ppm en el espectro de 13C RMN así como las señales de los carbonos anoméricos C-1 y C-1’ de los dos sistemas de spin diferentes a 92.5 y 91.2 ppm, respectivamente. 86 Capítulo 4 Figura 4.6. Espectros de 1H y 13C RMN (500, 100.6 MHz, CDCl3, 333 K) de 22. Capítulo 4 93 diferenciación de las posiciones primarias en la trehalosa y la incorporación de grupos amino e isotiocianato en una misma molécula, la metodología resulta muy conveniente. Esquema 4.3. Síntesis de los precursores diméricos de trehalosa 25 y 26. Reactivos y condiciones: (a) 10:1 piridina-H2O, 45 ºC, 4 h, 20% (se recupera 47% y 33% de producto de partida, respectivamente). El mecanismo propuesto para la reacción de dimerización de isotiocianatos en medio acuoso (Figura 4.11)26 comienza con la adición nucleófila de una molécula de agua al compuesto A, formándose el ácido tiocarbámico B, que actúa como nucleófilo frente a una segunda molécula de isotiocianato generando el anhídrido ditiocarbámico C. Esta especie es inestable y se reordena intramolecularmente mediante la eliminación de sulfuro de óxido de carbono (COS) dando lugar a la tiourea simétrica D. Figura 4.11. Mecanismo de autocondensación de isotiocianatos para dar tioureas simétricas. 25, n = 1 26, n = 9 O O O O O O N N H H S NCS SCN O O O OO O O OO O O O O O O O O O O O O O O O ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n Unit 1 Unit 1’ O O O O O O O O O NCS SCN OO O O O O nn n n n n 95, n = 1 96, n = 9 a NC S R A H2OH NCOH R S B RNC S H NCO R S C H N S R C H NC R S H NR D -COS 94 Capítulo 4 La espectrometría de masas y las técnicas espectroscópicas (IR y RMN), junto con los datos de análisis elemental, permitieron confirmar las estructuras propuestas. A título de ejemplo, en la Figura 4.12 se recoge el espectro de masas en modo electroespray (ESIMS) del derivado hexanoilado 25, en el que se observa una señal para una relación m/z 2006.9 correspondiente al ión pseudomolecular [M + Na]+. Figura 4.12. Espectro de masas en modo ESIMS del derivado hexanoilado 25 En la figura 4.13 se muestran los experimentos TOCSY, registrados a 500 MHz en CDCl3 para el compuesto miristoilado 26, donde se identifican de manera inequívoca señales independientes para los protones de los dos sistemas de spin; por ejemplo, las señales de los protones H-3´y H-3 a 5.56 y 5.49 ppm, o las correspondientes a H-4´y H-4 a 5.13 y 4.97 ppm, respectivamente. Con objeto de aumentar la resolución espectral, que está comprometida debido a la rotación restringida alrededor de los enlaces NH―C(=S) de los grupos tiourea, los espectros se registraron en todos los casos a 323 K. . Capítulo 4 95 Figura 4.13. Espectros 1D TOCSY (irradiación en H-3 y H-3’) y 1H RMN (500 MHz, CDCl3, 323 K) de 26. El acoplamiento entre los diisotiocianatos tetrasacarídicos 25 y 26 y la diamina disacarídica 97,27 funcionalizada con seis segmentos de cisteamina protegidos como los O O O O O O N N H H S NCS SCN O O O OO O O OO O O O O O O O OO O O O O O ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 ( ) 9 Unit 1 Unit 1’ O 96 Capítulo 4 correspondientes Boc-carbamatos, se llevó a cabo en piridina en presencia de DMAP a 40 ºC, aislándose las ciclotrehalanas CT3HL2 29 y 30 con rendimientos del 48 y 44%, respectivamente. La desprotección en medio ácido de los grupos carbamato, empleando TFA, condujo a los derivados desprotegidos 31 y 32, que se caracterizaron como los hexahidrocloruros correspondientes (Esquema 4.4). Esquema 4.4. Síntesis de los derivados CT3HL2 31, 32, 35 y 36. Reactivos y condiciones: (a) DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 44-48%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, cuantitativo. (c) 98, DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 71-75%. Capítulo 4 97 En la Figura 4.14. se presenta el espectro de masas en modo ESI del derivado 29, observandose un pico a m/z 3652.0 correspondiente al ión pseudomolecular [M + Na]+. Figura 4.14. Espectro de masas en modo ESIMS de la CT3HL2 Boc-protegida 29. Trabajos anteriores han mostrado que la incorporación de grupos tiourea, que puedan actuar como donadores de enlace de hidrógeno frente a los grupos fosfato, en sistemas policatiónicos promueve la complejación reversible de los ácidos nucleicos, mejorando la eficacia de transfección. Con objeto de acceder a derivados con grupos de tipo poli(aminotiourea) y aumentar la densidad de grupos protonables, se llevó a cabo el acoplamiento múltiple de los derivados CT3HL2 31 y 32 con el isotiocianato dendrítico 98,28 aislándose los correspondientes aductos 33 y 34 con 71-75% de rendimiento. La hidrólisis ácida de los grupos carbamatos con TFA en diclorometano proporcionó los derivados 35 y 36, que conservan la arquitectura de tipo CT3HL2 con doce cadenas lipófilas de hexanoilo o miristoilo y doce grupos amino terminales, con excelentes rendimientos (Esquema 4.4). En la Figura 4.15 se muestran los espectros de RMN del derivado protegido 33, registrados a 500 MHz en DMSO-d6 a 343 K. En estos compuestos, el aumento del tamaño molecular conlleva una reducción drástica de la movilidad en la zona central, provocando un aumento importante de los tiempos de relajación. En consecuencia, las señales correspondientes en el espectro de 13C RMN presentan intensidades mucho menores que las de las cadenas externas. Se identifican, no obstante, las señales de los grupos tiourea a 183.2 ppm (CS) y las correspondientes a los grupos carbamato-Boc a 156.1 ppm (CO carbamato), 79.2 (CMe3), y 28.7 ppm (CMe3). 98 Capítulo 4 Figura 4.15. Espectros de 1H y 13C NMR (500 MHz, 125.7 MHz, DMSO-d6, 343 K) de 33. Capítulo 4 99 • Derivados CT3HL2 con cadenas lipófilas de tipo éter. La síntesis de derivados de tipo CT3HL2 que incorporan cadenas grasas (C6 y C14) mediante uniones de tipo éter siguió una secuencia análoga a la comentada para los derivados de tipo éster. La primera etapa consistió en la preparación de los diisotiocianatos derivados de a,a’-trehalosa, alquilados en los hidroxilos secundarios, 15 y 16. Para ello, se sometió a alquilación exhaustiva la 6,6’-diazido-6,6’-didesoxi-a,a’- trehalosa (99)29 con el correspondiente bromoalcano (1-bromohexano o 1- bromotetradecano) en presencia de NaH a 60 ºC (→ 11, 12) y a continuación se llevó a cabo la reacción de isotiocianación (Staudinger―aza-Wittig) de los grupos azido en presencia de trifenilfosfina (TPP) y disulfuro de carbono. Se obtuvieron así los derivados 15 y 16, con 90 y 60% de rendimiento, respectivamente (Esquema 4.5). La banda a 2087 cm-1 en los espectros de IR confirma la presencia del grupo heterocumulénico N=C=S. Esquema 4.5. Síntesis de los derivados de trehalosa 13-16. Reactivos y condiciones: (a)1-Bromohexano o 1-bromotetradecano, NaH, DMF, 60 ºC, 24 h, 75-87%. (b) TPP, THF, NH4OH, 50 ºC, 24 h, 58-59%. (c) TPP, CS2, dioxano, 24 h, 60-90%. La transformación directa de azidas en isotiocianatos presenta ventajas importantes respecto a la reducción a amina seguida de isotiocianación en nuestra 100 Capítulo 4 secuencia de síntesis, ya que reduce la posibilidad de formación de oligómeros de tiourea que podrían generarse en el segundo caso. El mecanismo implica la formación de un iminofosforano, resultante de la reacción de la azida con TPP (reacción de Staüdinger) que actúa como nucleófilo y reacciona con CS2, con eliminación de sulfuro de trifenilfosfina, para dar lugar al correspondiente isotiocianato (reacción de aza-Wittig). La reacción también puede transcurrir a través de la fosfazida intermedia, que conduce al mismo resultado a través de un intermedio cíclico30 (Figura 4.16). Figura 4.16. Mecanismo de transformación de alquilazidas en alquilisotiocianatos mediante reacción de tipo tándem Staüdinger―aza-Wittig. La reacción de autocondensación del diisotiocianato de a,a’-trehalosa hexahexilado 15 en una mezcla piridina-H2O (10:1) a 45 ºC durante 4 h, permitió aislar el derivado dimérico de trehalosa 27 con un 30% de rendimiento, recuperándose un 51% de material de partida (Esquema 4.6). En cambio, la misma reacción sobre el derivado de tetradecilo 16 condujo a una mezcla inseparable, no pudiendo en este caso aislarse el tetrasacárido deseado. Capítulo 4 101 Esquema 4.6. Síntesis del derivado dimérico de trehalosa 27. Reactivos y condiciones: (a) 10:1 piridina-H2O, 45 ºC, 4 h, 30%. Esquema 4.7. Síntesis de los derivados CT3HL2 38 y 40. Reactivos y condiciones: (a) DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 62%. (b) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, 91%-cuantitativo. (c) 98, DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 66%. • Derivados “Mickey Mouse” de tipo CT3H2L. El siguiente objetivo en este capítulo consistió en la preparación de derivados policatiónicos anfifílicos de CT3 con una distribución inversa de caras catiónicas y 27 O O O O O O N N H H S NCS SCN O O O OO O O OO O O O Unit 1 Unit 1’ O O O O O O O O O NCS SCN 15 a 27 37, R = Boc 38, R = H·HCl 39, R = Boc 40, R = H·HCl O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O H N S H N N H S HN NH NH S SS S S S S Unit 1 Unit 1’ Unit 1’’ RHN NHR NHR NHR NHR NHR O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O H N S H N N H S HN NH NH S NH S HN S NH S NH S NH S NH S HN NH NH NH NH H N SS S S S SN N N N N NNHR NHR Unit 1 Unit 1’ Unit 1’’ RHN NHR RHN NHR NHR RHN RHN NHR RHN NHR 97 b a b c 102 Capítulo 4 lipófilas; es decir, compuestos incorporando grupos hidrófilos cationizables en dos de las unidades de trehalosa y cadenas lipófilas en la tercera (derivados CT3H2L). Por cuestiones prácticas, derivadas de la tendencia de compuestos que portan simultáneamente grupos ésteres y grupos amino a sufrir reacciones de migración de acilo, nos hemos limitado en este caso a derivados en los que la unión de las cadenas lipófilas al núcleo de CT3 es de tipo éter. La estrategia de síntesis es similar a la descrita para los derivados análogos de CT3HL2, y comienza con la transformación de la diazida disacarídica 100,15 funcionalizada con seis grupos Boc-cisteaminilo en los hidroxilos secundarios, en el correspondiente diisotiocianato 20 por reacción con TPP y CS2, (80% de rendimiento). La autocondensación de 20 en una mezcla 10:1 de piridina-H2O a 45 ºC proporcionó el diisotiocianato tetrasacarídico 28 (Esquema 4.8). Esquema 4.8. Síntesis de los precursores diméricos de trehalosa 20 y 28. Reactivos y condiciones: (a) TPP, CS2, dioxano, 24 h, 80%. (b) 10:1 piridina-H2O, 45 ºC, 4 h, 15% (27 % de rendimiento referido a la conversión; 45% de compuesto de partida recuperado). Los derivados de trehalosa 13 y 14 se prepararon mediante una secuencia de reacciones que comienza con la reducción de Staüdinger de las diazidas 11 y 12 con TPP en una mezcla de THF y NH4OH a 50 ºC, para dar lugar a las diaminas disacarídicas 13 y 14 con 58 y 59% de rendimiento, respectivamente (Esquema 4.6). El acoplamiento de las O O O O O O O O S O S S S S S X X BocHN NHBoc NHBoc NHBoc BocHN NHBoc 100, X = N3 20, X = NCS O O O O O O N N H H S NCS SCN O O O OO O O OO O O O S S S S S S S S S S NHBoc NHBoc NHBoc NHBoc NHBoc BocHN BocHN BocHN BocHN BocHN 28 Unit 1 Unit 1’ S NHBoc S NHBoc b a Capítulo 7 199 Esquema 7.2. Síntesis del precursor dimérico de trehalosa 69. Reactivos y condiciones: (a) HS(CH2)3SH, NaBH4, Et3N, iPrOH, 40 ºC, 6 h, 24-29%. (b) CSCl2, CaCO3, H2O-acetona, t.a., 2 h, 83%. (c) Et3N, piridina, 40 ºC, 24 h, 84%. (d) TPP, THF, NH4OH, 50 ºC, 16 h, 96%. La reacción de macrociclación entre 69 y el derivado hexa-O-alilado de 6,6’- didesoxi-6,6’-diisotiocianato-a,a´-trehalosa 19, para cerrar la plataforma macrocíclica de CT3, se llevó a cabo en piridina a 40 ºC y condujo, con un 91% de rendimiento, al compuesto deseado 78. Seguidamente, la hidrólisis ácida de las funciones carbamato (®79) y la reacción click de formación de tiourea con los glicosil isotiocianatos ManNCS y LacNCS proporcionó los correspondientes conjugados 80 y 83. La adición radicalaria asistida por AIBN de la cisteamina N-Boc protegida a los grupos alilo (®81 y 84, respectivamente) y la posterior desprotección de los grupos ésteres y carbamatos permitió aislar las CT3 glicocatiónicas anfifílicas tipo Hecate objetivo 82 y 85 como los correspondientes perhidrocloruros tras liofillización de una disolución acuosa diluida de HCl (Esquema 7.3). 200 Capítulo 7 Esquema 7.3. Síntesis de los derivados glicocatiónicos de CT3 82 y 85. Reactivos y condiciones: (a) CS2, TPP, dioxano, t.a., 24 h, 80%. (b) DMAP, piridina, 40 ºC, 24 h, 91%. (c) 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, 96%. (d) ManNCS/LacNCS, NaHCO3, 1.5:1 acetona-H2O, t.a., 24 h, 69-75%. (e) HS(CH2)NHBoc, AIBN, l 254 nm, MeOH, t.a., 1 h, 66-80%. (f) NaOMe (1M MeOH), MeOH, 0 ºC-t.a., 30 min. 2). 1:1 TFA-DCM, t.a., 1 h, cuantitativo. En la Figura 7.11 se recogen los espectros de 1H y 13C RMN para el derivado glicosilado de tipo Hecate 84 en el que se confirma la presencia de las unidades Capítulo 7 201 lactosiladas mediante las señales correspondientes a los carbonos anoméricos a dC 5.74 ppm dC 99.1 ppm así como la presencia de los grupos tiocarbonilo de las uniones de tipo tiourea (dC 183.3 ppm). Figura 7.11. Espectros 1H y 13C RMN (600, 150.9 MHz, CDCl3) de 84. 202 Capítulo 7 7.2.3. Estudios de complejación de ADNp con la ciclotrehalana manosilada 74 y caracterización de los correspondientes glicoCTplejos por DLS, TEM y electroforesis en gel de agarosa. Originalmente, el propósito de los trabajos desarrollados en este capítulo de la Tesis era la puesta a punto de estrategias de síntesis para acceder a derivados de CT glicocatiónicos de tipo Janus y Hecate. El estudio de sus interacciones con ácidos nucleicos y lectinas, las propiedades (topológicas, de respuesta al pH, etc.) de los posibles nanoagregados y la evaluación de las propiedades de transfección requieren un horizonte temporal más largo y se completarán más adelante. No obstante, se han realizado ya determinaciones preliminares sobre la capacidad de la CT2 glicocatiónica hexamanosilada 74 para condensar ADNp en colaboración con la Profesora Tros de Ilarduya (Universidad de Navarra), empleando el plásmido que codifica la luciferasa (pCMV-Luc VR1216, 6934 bp). Para ello, se han preparado los correspondientes glicoCTplejos a valores de N/P 5, 10 y 20, siguiendo para ello el mismo procedimiento que en los capítulos anteriores y que se detalla en la Parte Experimental. Los datos de diámetro hidrodinámico (Ø) y potencial ζ de los nanocomplejos coensamblados 74/ADNp se recoge en la Tabla 7.1. En todos los casos se obtuvieron partículas sensiblemente más grandes (Ø > 150 nm) que las que clásicamente se forman con vectores moleculares policatiónicos anfifílicos (Ø ~80 nm), con carga superficial positiva (15.9-23.4 mV). El mayor tamaño de los glicoCTpejos 74/ADNp quedó también de manifiesto en las correspondientes micrografías de TEM para formulaciones a N/P 20. Se observan mayoritariamente nanopartículas globulares de unos 150 nm de diámetro, que parecen originarse por agregación de otras más pequeñas y que, a su vez, pueden agregarse para dar nanoobjetos multiglobulares mayores (Figura 7.12). Capítulo 7 203 Tabla 7.1. Tamaños hidrodinámicos (Ø, nm) y potenciales z (mV) para los CTplejos formulados con la CT2 glicocatiónica manosilada 74 y ADNp (pCMV-Luc VR1216) a relaciones N/P 5,10 y 20. Figura 7.12. Micrografía de TEM representativa de los glicoCDplejos formulados con la CT2 glicoanfifílica 74 y ADNp (pCMV-Luc VR1216, 6934 bp). Los experimentos de electroforesis en gel de agarosa se llevaron a cabo usando GelRed® como agente intercalante fluorescente, comparando la migración catódica del ADNp libre y de las formulaciones con la CT glicoanfifílica 74. Como puede comprobarse en la Figura 7.13, A la neutralización del ácido nucleico y la inaccesibilidad del agente intercalante al ADNp en los glicoCTplejos es total para los tres valores de N/P ensayados. Por otra parte, en la figura 7.13, B puede observarse el gel de electroforesis N/P 510 20 74 Ø(nm) z (mV)Ø(nm) z (mV)Ø(nm) z (mV) 190)±16 19)± 1 153)± 8 16)± 2 184 ±10 23 ± 1 1 µm 204 Capítulo 7 que confirma la integridad del ADNp en los nanocomplejos y su protección frente a la degradación por enzimas. Tras incubar las formulaciones con la DNAasa I y provocar la disociación de los complejos con dodecilsulfato de sodio, puede confirmarse que el comportamiento electroforético es similar en todos los casos al del ADNp sin tratar (control, primera calle del gel). Este experimento permite concluir que la ciclotrehalana hexamanosilada 74 es capaz de condensar y proteger eficazmente el material génico manteniendo su integridad. Figura 7.13. (A). Electroforesis en gel de agarosa de los complejos preparados a partir de ADNp y la CT glicopolicatiónica 74 a valores de N/P 5, 10 y 20. Se empleó ADNp libre como control negativo. (B) Ensayos de protección frente a nucleasas de los complejos formulados con ADNp y 74 a N/P 5, 10 y 20. Se empleó ADNp libre sin tratar y tratado con nucleasas como referencia. 7.2.4. Viabilidad celular y eficacia de transfección en células COS-7 y HepG2.! Los ensayos de viabilidad celular y de transfección para el compuesto 74 se han llevado a cabo empleando un gen reportero que codifica la luciferasa (pCMV-SV40) a valores de N/P 10 y 20. Se han empleado dos líneas celulares diferentes: COS-7 (riñón de mono verde) y HepG2 (hepatoblastoma humano). Como control positivo hemos utilizado poliplejos formulados con PEI (bPEI, 25 kDa), en sus condiciones óptimas (N/P 10, HEPES con un 10% de suero). En general, la toxicidad de los nanocomplejos (método del pDNA pDNA pDNA + DNAsas N/P 5 N/P 10 N/P 20 N/P 5 N/P 10 N/P 20 A B Capítulo 7 205 Alamar Blue®) fue inferior a la del PEI para las dos líneas celulares ensayadas a valores de N/P 10. A N/P 20, la toxicidad fue ligeramente inferior (aunque superior al 60%) en el caso de la línea celular COS-7 (Figura 7.14). En cuanto a la eficacia de transfección de los glicoCTplejos 74/ADNp, esta fue claramente inferior a la de los poliplejos de PEI, entre uno y más de dos órdenes de magnitud, en ambas líneas celulares. Figura 7.14. Viabilidad celular y eficacia de transfección en células COS-7 (A) y HepG2 (B) de los complejos de ADN formulados a partir la ciclotrehalana glicocatiónica 74 a valores de N/P 20 en presencia de FBS (10%). ! Este resultado no es inesperado. Aunque son necesarios más estudios para determinar la estructura de los nanocomplejos, es previsible que la superficie de los mismos exponga una proporción considerable de residuos monosacarídicos, muy polares, que apantallen la carga positiva y dificulten el paso a través de la membrana celular. El efecto apantallante 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 PEI 74 % Viability N/P 10 N/P 20 A 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 PEI 74 log pg Luc/mg prot N/P 10 N/P 20 0 20 40 60 80 100 120 PEI 74 % Viability N/P 10 N/P 20 B 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 PEI 74 log pg Luc/mg prot N/P 10 N/P 20 206 Capítulo 7 de los carbohidratos es similar al del polietilenglicol, para el que se ha comprobado que tiene un efecto negativo sobre la eficacia de la transfección de los CDplejos, salvo que se instalen ligandos específicos de receptores presentes en las células diana. El objetivo es, justamente, que la transfección esté desfavorecida en células que no expresen lectinas complementarias del carbohidrato expuesto en el vector glicocatiónico.13 Los estudios con macrófagos RAW 264.7, que expresan el MMR en su superficie, permitirán confirmar si la transfeción se produce en mayor medida en estas células. 7.3 Conclusiones Los resultados comentados en este capítulo ilustran el potencial de la estrategia basada en la preparación de CTs a partir de precursores de α,α’-trehalosa diferentemente funcionalizados, en combinación con la adición de tioles a dobles enlaces (reacción tioleno) y el acoplamiento amina-isotiocianato (reacción de formación de tioureas), para preparar nanopartículas moleculares tipo “patchy” con dominios multivalentes catiónicos y glicosídicos. La versatilidad de la aproximación nos ha permitido acceder a sistemas con doble funcionalización en caras diferenciadas sobre un núcleo de CT2 (Janus) y a un nuevo prototipo en el que las tres caras del macrociclo de CT3 soportan elementos funcionales diferentes (catiónico, glicosídico y lipofílico), que hemos denominado CTs tipo Hecate. Resultados preliminares obtenidos para el compuesto 74, que porta sustituyentes de manosa y aminas primarias, han puesto de manifiesto su capacidad para formar nanocomplejos globulares con ADNp. Aunque los estudios de transfección en células que expresen receptores específicos de manosa están por completar, la oportunidad que ofrece este diseño para modificar la naturaleza de los sustituyentes glucídicos, la estructura de las cabezas catiónicas y, en el caso de los compuestos Hecate, el balance hidrófilo/hidrófobo es única y abre nuevas expectativas para el transporte dirigido de genes con vectores moleculares. Referencias Capítulo 7 207 1 (a) P. Mi, H. Cabral, K. Kataoka, Adv. Mater., 2019, 32, 1902604-1902632. (b) Z. Zhao, A. Ukidve, J. Kim, S. Mitragotri, Cell, 2020, 181, 151-167. (c) L. Cai, Z. Gu, J. Zhong, D. Wen, G. Chen, L. He, J. Wu, Z. Gu, Drug Discov. Today, 2018, 23, 1126-1138. 2 C. Aranda, K. Urbiola, A. Méndez Ardoy, J. M. García Fernández, C. Ortiz Mellet, C. Tros de Ilarduya, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2013, 85, 390-397. 3 (a) F. Cheng, G. Huang, H. Huang, Future Med. Chem., 2020, 12, 161-171. (b) F. Cheng, G. Huang, Eur. J. Med. Chem., 2019, 182, 111612. (c) S. Kawakami, M. Hashida, J. Control. Release, 2014, 190, 542-555. (d) H. Yan, K. Tram, Glycoconjugate J., 2007, 24, 107-123. 4 (a) G. Yilmaz, C. Remzi Becer, Polym. Chem., 2015, 6, 5503-5514. (b) T. Yau, X. Dan, C. C. Wing Ng, T. Bun Ng, Molecules, 2015, 20, 3791-3810. 5!A. C. Roche, I. Fajac, S. Grosse, N. Frison, C. Rondandino, R. Mayer, M. Monsigny, Cell Mol. Life Sci., 2003, 60, 288-297.! 6 Y. Aoyama, Trends Glycosci. Glycotechnol., 2005, 17, 39-47. 7 (a) G. Y. Wu, C. H. Wu, J. Biol. Chem., 1987, 262, 4429-4432. (b) G. Y. Wu, C. H. Wu, J. Biol. Chem., 1988, 263, 14621-14624. 8 K. Naicker, M. Ariatti, M. Singh, Eur. J. Lipid. Sci. Technol., 2016, 118, 1730-1742. 9 M.-A. Zanta, O. Boussif, A. Adib, J.-P. Behr, Bioconjugate Chem., 1997, 8, 839-844.! 10 C. Rondanino, M.-T. Bousser, M. Monsigny, A.-C. Roche, Glycobiology, 2003, 13, 509-519. 11 A. McMahon, M. J. O’Neill, E. Gomez, R. Donohue, D. Forde, R. Darcy, C. M. O’Driscoll, J. Pharm. Pharmacol., 2012, 64, 1063-1073. 12 N. Symens, A. Méndez-Ardoy, A. Díaz-Moscoso, E. Sánchez-Fernández, K. Remaut, J. Demeester, J. M. García Fernández, S. C. De Smedt, J. Rejman, Bioconjugate Chem., 2012, 23, 1276-1289. 13 N. Guilloteau, C. Bienvenu, C. Charrat, J. L. Jiménez Blanco, A. Díaz-Moscoso, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, P. Vierling, C. Di Giorgio, RSC Adv., 2015, 5, 29135-29144. 14 A. Díaz-Moscoso, N. Guilloteau, C. Bienvenu, A. Mendez-Ardoy, J. L. Jiménez Blanco, J. M. Benito, L. Le Gourriérec, C. Di Giorgio, P. Vierling, J. Defaye, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, Biomaterials, 2011, 32, 7263-7273. 15 J. M. García Fernández, C. Ortiz Mellet, J. L. Jiménez Blanco, J. Fuentes Mota, A. Gadelle, A. Coste-Sarguet, J. Defaye, Carbohydr. Res., 1995, 268, 57-71. 16 (a)!D. Rodríguez-Lucena, J. M. Benito, E. Álvarez, C. Jaime, J. Pérez-Mirón, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, J. Org. Chem., 2008, 73, 2967-2979. (b) J. Katajisto, T. Karskela, P. Heinonen, H. Lönnberg, J. Org. Chem., 2002, 67, 7995-8001.! Chapter 9 Experimental Part Experimental Part 213 9. Experimental Part. 9.1. General Methods. Reagents and solvents were purchased from commercial sources and used without further purification. Thin-layer chromatography was carried out on aluminum sheets coated with Silica Gel 60 F254 Merck (0.25 mm), with visualization by UV light (l 254 nm) and by charring with 10% H2SO4 in ethanol; ninhydrin 0.1% in ethanol; Mostain (20 g of ammonium (VI) molibdate·4 H2O; 0.4 g of Ce(SO4)2·H2O and 10% H2SO4 in 400 mL of H2O); 5% phosphomolybdic acid in EtOH and heating at 100 ºC. Column chromatography was carried out on Silica Gel 60 AC.C (63−200 mm, Sigma-Aldrich) and Geduran Si 60 Merck (40−63 mm). Optical rotations were measured at room temperature in 1 cm or 1 dm tubes on a Jasco P-2000 polarimeter using Na line (l 589 nm), 0.5-1% (w/v) solutions. Elemental analyses were performed using an elemental analyser Leco CHNS- 932 from vacuum-dried samples. The analytical results for C, H, N, and S were within ±0.4 of the theoretical values. IR spectra were recorded on a Jasco FT/IR-4100 (ATR) spectrometer. UV spectra were recorded in 1 cm tubes on a Jasco UV-630 spectrometer at 25 ºC. 1H and 13C NMR spectra were recorded on Bruker 300 (300 and 75.5 MHz), Bruker 400 (400 and 100.6 MHz), Bruker Ascend 500 (500 and 125.7 MHz) and Bruker Ascend 600 (600 and 150.8 MHz) spectrometers. 2D COSY (Correlated Spectroscopy), 1D and 2D TOCSY (Totally Correlated Spectroscopy), HSQC (Heteronuclear Single- Quantum Coherence Spectroscopy), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation) and 2D NOESY (Nuclear Overhauser Spectroscopy) experiments were employed to assist NMR assignments. CDCl3, CD3OD, DMSO-d6 and D2O have been used as solvent. 214 Experimental Part Chemical shifts (d) are reported in parts per million (ppm) relative to the residual solvente peak. The values of the coupling constants (J) are measured in Hz. The abbreviations to indicate the multiplicity of the signals are: s (singlet), d (doublet), t (triplet), c (quartet), q (quintet) and m (multiplet). The abbreviation “b” indicates that the signal is “broad”. For electrospray mass spectra (ESI-MS), sub-µM sample concentrations in MeCN, MeOH or H2O-MeOH were used, the mobile phase consisting of 50% aq MeOH at 0.1 mL·min-1 and were obtained with a Bruker Esquire 6000. The electrospray ionization-high resolution mass spectrometry (ESIHRMS) experiments were performed using a LTQ-Orbitrap XL ETD instrument from Thermo Scientific operated in positive ionization mode with a spray voltage at +3.6 kV. Samples were prepared at 20 µg·mL-1 in methanol/water (20:80 or 70:30 v/v). Once prepared, the fresh solutions were continuously infused at 3 µL·min-1 using a 250-µL syringe. The applied voltages were 45 and 120 V for the ion transfer capillary and the tube lens, respectively. The ion transfer capillary was held at 275 °C. The resolution level was set to 30000 (m/z = 400) for all studies, while the m/z range was set to m/z 200—2000 in the profile mode and in the normal mass ranges. The spectra were analysed using XCalibur 2.0.7 acquisition software (Thermo Scientific) without smoothing and background subtraction. The automatic gain control (AGC) allowed accumulation up to 2 × 105 ions. The maximum injection time was set to 500 ms using 1 µscan count. MALDI-TOF mass spectra were registered in a Bruker Daltonics Autoflex instrument in the linear positive mode with pulse ion extraction; 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) was used as desorption matrix. Matrix were prepared in 0.6 M in 50% aq. acetonitrile and diluted in an equal volume of the sample. Sample and matrix was cocrystalized on to the target plate. In certain cases, addition of aq. 30 mM NaCl to the mixture resulted in an improvement of the signal-to-noise ratio. Characterization of CT Star Polymer-DNAi Complexes by MALDI-TOF experiments. Single strand oligodeoxyribonucleotide (DNAi), with the following sequence 5’-AAGCCCGCCCAA-3’ (MW: 3584.4 g.mol-1) was purchased from Experimental Part 215 Eurogentec (Seraing, Belgium). Ammonium acetate ≥99.9%, ammonium citrate dibasic ≥99.0%, 2’,6’-dihydroxyacetophenone (DHAP) >99.5% and 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) >99.0%were purchased from Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France). !Sample preparation. Stock solution of DNAi was made at 100 µM in aqueous ammonium acetate (100 mM). Then, the solution was further diluted to 20µM in 100 mM ammonium acetate. Several mixture involving various N/P ratio (i.e. various molar equivalent of CT and DNAi, respectively) from 1 to 30 were tested. Matrix solutions of DHAP or DHB at 100 mM mixed with ammonium citrate at 10 mM were prepared in 50/50 (v/v) water/methanol. Just before MS analysis, equal volumes of matrix solution and sample solutions at different N/P were mixed, and let during 15 min at 37°C. Then, mixture was spotted onto MALDI plate by the dried droplet method and allowed to dry at room temperature during 15 min before analysis. MALDI-TOF analysis. MALDI-TOF MS experiments were performed using an Autoflex III MALDITOF/TOF spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). This instrument was equipped with a Nd:YAG SmartBeam laser (λ= 355 nm) pulsed at a 200 Hz frequency. The mass spectrometer was operated in the linear mode with an accelerating potential of 19 kV. Mass spectra were recorded with extraction delay was optimised from 0 to 300 ns. Mass spectra were obtained by accumulation of 1000 laser shots and processed using Flex Analysis 3.0 software (Bruker Daltonics). The instrument was calibrated using standard peptide and protein mixtures provided by the manufacturer. For samples, both positive and negative ionization mode were investigated, but only spectra acquired in positive polarity have given exploitable signal. Gel permeation chromatography (GPC) was performed on a Wyatt GPC/SECMALS system equipped with a DAWN® HELEOS® II 18-angle static light scattering detector and an Optilab® T-rEXTM refractive index detector. The separation conditions reported for PAMAM G0 to G7 dendrimers were used.1 Briefly, the chromatograph was equipped with a TosoHaas TSK GEL guard PWH 06762 (7.5 × 7.5 cm, 12 µm) (DS 1140), G 2000 PW 05761 (30 × 7.5 cm, 10 µm) (DS 1014), G 3000 PW 05762 (10 µm) 216 Experimental Part (DS 1016), and G 4000 PW 05763 (17 µm) (DS 1017) columns. A 0.1 N citric acid solution, containing 0.025 wt % sodium azide (pH was adjusted to 2.72 by sodium hydroxide), was used as the mobile phase and for making CT star dendrimer sample solutions for SEC analysis. A nominal flow rate setting of 1.0 mL/min and injection volume of 50 µL of 1 × 10-4 g/mL sample solutions were used. Data were recorded and processed with ASTRA v6.0 software. The computational calculations were carried out in collaboration with Prof. F. Mendicuti (Univ. Alcalá de Henares). Molecular Mechanics (MM) and Molecular Dynamics (MD) calculations were performed with Sybyl X2.0.2 and the Tripos Force Field.3 A relative permittivity ε = 3.5 (ε = 1) was used in the vacuum (in the presence of water). Charges for bCD derivatives were obtained by MOPAC.4 Formulation of pDNA nanocomplexes using nanoprecipitation method. The quantity of each vector used in each formulation was calculated according to the desired DNA concentration, the N/P ratio, the molecular weight and the number of protonable nitrogen atoms in the corresponding cationic derivative. Typically, pDNA was diluted in HEPES (10 mM, pH 7.4) to the desired final concentration as specified hereinafter, and then the desired amount of CD derivative was dispersed in this solution from a stock solution in DMSO (typically 1-10 mM). The resulting mixture (with a final DMSO content below 1% in all cases) was instantly vortexed thoroughly and the complexes were incubated for 1 h prior to subjecting them to characterization or transfection experiments. Electrophoresis mobility shift assay (EMSA). Each vector:pDNA nanocomplex (20 µL, 0.4 µg of pDNA) was submitted to electrophoresis using a Gel Doc XR instrument (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) for about 45 min under 100 V through a 0.8% agarose gel (with 2.5 µL of ethidium bromide) in TBE 1X (Tris-borate-EDTA). The DNA was then visualized after photographing on an Alphaimager Mini UV transilluminator. The fluorescence spectroscopy conditions were excitation at 482 nm and emission at 616 nm. The plasmid integrity in each sample was confirmed by Experimental Part 217 electrophoresis after decomplexation with sodium dodecyl sulfate (SDS, 8%) and compared with that of the untreated DNA as a control. pDNA condensation/protection assays. Nanocomplex samples (50 µL of 50 µg/mL preparations) were electrophoresed for 30 min under 150 mV in 0.8% agarose gel. For protection assays, DNAase I (1U/µg pDNA) was added to each sample and stirred for 30 min at 37 ºC. 20 µL of 0.25 M EDTA was added to inactivate DNAase and the sample was vortexed and incubated for 5 min. 20 µL of 25% SDS was then added and further incubated for 5 min. Samples were electrophoresed as described above. Plasmid integrity was compared with free pDNA both treated and untreated. Particle size and ζ-potential measurements. A Malvern Zetasizer Nano ZS instrument with back scattering detector (173°, 633 nm laser wavelength) was used for measuring the hydrodynamic size (diameter) in batch mode at 25 °C in a low volume quartz cuvette (pathlength 10 mm). CT star polymer samples were prepared at a concentration of 1 mg/mL in HEPES 10 mM, pH 7.4, and filtered through a 0.02 µm filter. A minimum of twelve measurements per sample were made. CTplex samples were prepared in the same buffer hydrodynamic size is reported as volume distribution of the major population by the mean diameter with its standard deviation (Tables S1 and S2). ζ-potential provides a measure of the electrostatic potential at the surface of the electrical double layer and the bulk medium, which is related to the nanoparticle surface charge. ζ-potential measurements on the star polymers and CTplexes were made using Malvern Zetasizer Nano ZS instrument with “mixed-mode measurement” phase analysis light scattering (M3-PALS). M3 consists of both slow field reversal and fast field reversal measurements, hence the name “mixed-mode measurement”; it improves accuracy and resolution. The following specifications were applied: sampling time, automatic; number of measurements, 12 per sample; medium viscosity, 1.054 cP; medium dielectric constant, 80; temperature, 25 °C. Before each series of experiments, the performance of the instruments was checked with either a 90 nm monodisperse latex beads (Coulter) for DLS or with DTS 50 standard solution (Malvern) for ζ-potentials (Tables S1 and S2)." 218 Experimental Part Transmission Electron Microscopy (TEM). Formvar-carbon coated grids previously made hydrophilic by glow discharge were placed on top of small drops of the nanocomplexes (DNA 303 µM phosphate) prepared as describe above using N/P 20 ratios. After 1-3 min, grids were negatively stained with a few drops of 1% aqueous solution of uranyl acetate. The grids were then dried and observed with a Philips CM12 electron microscope working under standard conditions. All these experimentes were reproduced twice on each formulation. pH Buffering capacity. pH Buffering capacities were potentiometrically determined using an adapted acid-base titration procedure over a pH range between ca. 2 and 9. In a typical experiment, the appropriate amount of the hydrochloride salt of each compound was accurately weighted to prepare a 50 mM solution (based on the protonable amino groups) in 150 mM NaCl aqueous solution. 1 mL of the solution was transferred to the titration cell and the pH was adjusted (if necessary) below 2 by adding the aliquots of a 0.10 M HCl solution. Then, 10 µL aliquots aq. 0.10 M NaOH (standardized using 2% w/v aq. potassium hydrogen phthalate) were successively added and the pH value was measured after each addition with a conventional pH-meter. The process was repeated until the pH shifted over 9. A solution of aq. NaCl (150 mM) was used as blank under the same experimental conditions. The buffering capacity is graphically determined as the NaOH amount (meq) consumed to switch pH in the biologically relevant window. In vitro transfection activity. Cells (COS-7, HepG2, HeLa, BNL-CL2 or RAW 246.7) were seeded in medium in 48-well plates (Iwaki Microplate, Japan), and incubated for 24 h at 37 °C in 5% CO2. The medium was removed and 0.3 mL of complete medium (activated FBS) and 0.2 mL of CTplexes (containing 1 µg of pDNA) were added to each well. After 4 h incubation the medium was replaced for complete medium and the cells were further incubated for 48 h. Cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and lysed with 100 µL of Reporter Lysis Buffer (Promega, Madison, WI, USA) at room temperature for 10 min, followed by a freeze-thaw cycle. 20 µL of the supernatant was assayed for total luciferase activity using the luciferase assay reagent (Promega), Experimental Part 219 according to the manufacturer’s protocol. A luminometer (Sirius-2, Berthold Detection Systems, Innogenetics, Diagnóstica y Terapéutica, Barcelona, Spain) was used to measure luciferase activity. The protein content of the lysates was measured by de DC protein Assay Reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) using bovine serum albumin as the standard. The data were expressed as nano(pico)grams of luciferase (based on a standard curve for luciferase activity) per milligram of protein. Samples were analyzed in a plate spectrophotometer Power Wave XS and a data processor KC junior, BioTek® for determination of the transfection efficiency in the presence of ZnCl2, Cell viability, Alamar blue® assay. Cell viability (COS-7 and HepG2 cell lines) was quantified by a modified Alamar blue® assay (Invitrogen). Briefly, 1 mL of 10% (v/v) Alamar blue dye in complete medium was added to each well 48 h posttransfection. After 2.5 h of incubation at 37 ºC, 200 µL of the supernatant was assayed by measuring the absorbance at 570 and 600 nm. Cell viability (as percentage of control cells) was calculated according to the formula (A570 - A600) of treated cells × 100/(A570 - A600) of control cells. All CT star polymer/pDNA formulations showed cell viabilities over 70% in this assay. Cell viability, MTT assay. For MTT assay 3·103 cells (COS-7, HepG2, BNLCL2 or RAW 264.7) were seeded in 96 well plates and incubated at 37 °C, in a humidified atmosphere containing 5% CO2 till confluence. 50 µL per well of the selected dilution of the vector (or the controls PEI, Lipofectamine 3000® or ADM70) formulations were then added. The plates were incubated for 24 hours at 37 °C and 5% CO2. 10 µL per well of MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) were then added at the final concentration of 5 mg/mL (MTT can be diluted in sterile PBS or in medium) and after an incubation of 6 h, 100 µL per well of a lysant (10% SDS and 0.01 M HCl in H2O) were added. Plates were sealed and incubated overnight at 37 °C and 5% CO2. The absorbance of the color complex was read at 620 or 540 nm after shaking of the plates. The rate of toxicity/survival was determined respect to the corresponding cell line incubated in absence of the compound. 220 Experimental Part In vivo transfection activity. Female Balb-c mice (6-8 weeks of age, 20-25 grams weigh) were purchased from Harlan Ibérica Laboratories. All animals were studied in accordance with guidelines established by Directive 86/609/EEC and with the approval of the Committee on Animal Research at the University of Navarra. Individual mice in groups of eight were injected via the tail vein with 200 µL of nanoplexes containing 60 µg of pCMV-Luc VR1216 plasmid DNA at N/P 5 and 10. Naked DNA was injected as control. Twenty-four hours after injection the mice were sacrificed. The liver, heart, lungs and spleen were collected and washed with cold PBS. The organs were homogenized with 1 mL lysis buffer using a homogenizer at 5000 rpm (Mini-Beadbeater; BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK, USA) and centrifuged at 10000 rpm for 3 min. 20 µL of the supernatant were analysed for luciferase activity following the same procedure as for in vitro assays. Boc cleavage was achieved by treatment the N-Boc protected derivatives with 1:1 DCM-TFA at rt for 1 h. Then, the solvent was eliminated under pressure and coevaporated several times with toluene. The residue was dissolved in a diluted aqueous solution HCl and freeze-dried to yield the product as hydrochloride. 8.2. Starting Materials. The following starting materials were prepared according to reported procedures: • 6,6’-[4-(2,2-Diaminoethylaminomethyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl]-6,6’-dideoxy- 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-hexanoyl]-a,a’-trehalose tetrahydrochloride (86).5 • 6,6’-Diazido-6,6’-dideoxy-2,2’,3,3’,4,4’-hexa-O-hexanoyl-a,a’-trehalose (87).5 • N,N-Bis(tert-butoxycarbonylaminoethyl)propargylamine (88).6 • 6,6’-Di-[4-(2-N’-(2-(N-tert-butoxycarbonyl)aminoethyl)-thioureido))methyl-1H- 1,2,3-triazolyl]-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-hexanoyl)-6,6’-dideoxy-a,a’-trehalose (89).5 Experimental Part 227 Boc-protected trehalose derivative 6. To a solution of 1 (281 mg, 0.25 mmol) and N,N-bis(tert-butoxycarbonylaminoethyl)propargylamine (88) (192 mg, 0.56 mmol) in a 9:1 tBuOH-acetone mixture (15 mL), CuI·P(OEt)3 (17.8 mg, 0.05 mmol) and DIPEA (102 µL, 0.6 mmol) were added and the reaction mixture was refluxed for 24 h at 85 ºC. The catalyst was filtered off, the solvent was removed and the residue was purified by column chromatography (1:1 EtOAc-cyclohexane ® 15:1 DCM-MeOH). Yield: 281 mg (63%). Rf = 0.67 (9:1 DCM-MeOH). [a]D = +55.1 (c 1.0, DCM). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.57 (s, 2 H, =CH), 5.47 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 9.5 Hz, H-3), 5.28 (d, 2 H, J1,2 = 4.0 Hz, H-1), 5.17 (bs, 2 H, NHBoc), 5.02 (dd, 2 H, H-2), 4.98 (t, 2 H, J4,5 = 9.8 Hz, H-4), 4.48 (t, 4 H, 3JH,H = 6.9 Hz, CH2N), 3.91 (m, 2 H, H-5), 3.80 (s, 4 H, CH2-triazole), 3.21 (bd, 8 H, CH2NHBoc), 3.06 (m, 4 H, CH2S), 2.55 (t, 8 H, 3JH,H = 5.6 Hz, CH2CH2NHBoc), 2.49 (m, 4 H, H-6a, H-6b), 2.38-2.13 (m, 12 H, H-2Hex), 1.55 (m, 12 H, H-3Hex), 1.43 (s, 36 H, CMe3), 1.27 (m, 24 H, H-4Hex, H-5Hex), 0.87 (m, 18 H, H-6Hex). 13C NMR (75.5 MHz, CDCl3): δ = 172.5 (CO ester), 156.2 (CO carbamate), 144.4 (C-4 triazole), 123.4 (C-5 triazole), 88.2 (C-1), 79.1 (CMe3), 71.3 (C-4), 70.9 (C- 2), 69.6 (C-5), 69.4 (C-3), 53.1 (CH2NHBoc), 50.0 (CH2N triazole), 38.2 (CH2-triazole), 33.6 (CH2S), 34.1 (C-2Hex), 33.1 (C-6), 31.3 (C-4Hex), 28.6 (CMe3), 24.3 (C-3Hex), 22.3 (C- 5Hex), 13.8 (C-6Hex). ESIMS: m/z = 1806.8 [M + Na]+. Anal. Calcd for C58H98N8O15S2: C, 57.85; H, 8.14; N, 7.94; S, 4.54. Found: C, 57.76; H, 8.19; N, 7.76; S, 4.32. Trehalose gemini facial amphiphile 7. Treatment of 6 (412 mg, 0.23 mmol) with 1:1 TFA-DCM (6 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 7. Yield: 359 mg (quantitative). [a]D = +45.3 (c 1.0, MeOH). 1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ = 8.09 (s, 2 H, =CH), 5.49 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 9.7 Hz, H-3), 5.36 (d, 2 H, J1,2 = 4.0 Hz, H-1), 5.09 (dd, 2 H, H-2), 5.04 (t, 2 H, J4,5 = 9.7 Hz, 228 Experimental Part H-4), 4.61 (t, 4 H, 3JH,H = 6.5 Hz, CH2N), 4.00 (m, 2 H, H-5), 3.90 (s, 4 H, CH2-triazole), 3.15 (m, 12 H, CH2S, CH2CH2NH2), 2.81 (t, 8 H, 3JH,H = 6.0 Hz, CH2CH2NH2), 2.63 (m, 4 H, H-6a, H-6b), 2.42-2.21 (m, 12 H, H-2Hex), 1.58 (m, 12 H, H-3Hex), 1.31 (m, 24 H, H- 4Hex, H-5Hex), 0.91 (m, 18 H, H-6Hex). 13C NMR (75.5 MHz, CD3OD): δ = 174.8, 173.8 (CO), 143.4 (C-4 triazole), 126.1 (C-5 triazole), 92.3 (C-1), 72.6 (C-4), 72.3 (C-2), 71.3 (C-5), 71.1 (C-3), 52.0 (CH2NH2), 51.2 (CH2N-triazole), 47.2 (CH2-triazole), 38.2 (CH2CH2NH2), 35.1 (C-2Hex), 34.9 (CH2S), 34.0 (C-6), 32.5 (C-4Hex), 25.6 (C-3Hex), 23.1 (C-5Hex), 14.0 (C-6Hex). ESIMS: m/z = 1384.0 [M]+, 692.5 [M + H]2+. Anal. Calcd for C66H118N12O15S2·4 HCl: C, 51.82; H, 8.04; N, 10.99; S, 4.19. Found: C, 51.59; H, 8.12; N, 10.68; S, 3.82. Boc-protected trehalose derivative 8. To a solution of 7 (182 mg, 0.12 mmol) and Et3N (47 µL, 0.71 mmol) in DCM (10 mL), 90 (144 mg, 0.71 mmol) was added, and the mixture was stirred at rt for 24 h. The mixture was washed with aqueous diluted HCl (2 x 10 mL) and the organic phase was dried (MgSO4), filtered and concentrated. The residue was purified by column chromatography (4:1 EtOAc-cyclohexane ® 9:1 DCM- Experimental Part 229 MeOH). Yield: 184 mg (80%). Rf = 0.51 (9:1 DCM-MeOH); [a]D = +26.6 (c 0.7, DCM); UV (DMF-H2O 0.4% v/v): lmax = 247 nm (emM 21.9). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 8.05 (s, 2 H, =CH), 7.59, 7.36 (bs, 4 H, NHCS), 6.80 (s, 2 H, NHBoc), 5.35 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 9.5 Hz, H-3), 5.25 (d, 2 H, J1,2 = 3.7 Hz, H-1), 5.07 (dd, 2 H, H-2), 5.02 (t, 2 H, J4,5 = 9.5 Hz, H-4), 4.49 (bt, 4 H, 3JH,H = 6.4 Hz, CH2N), 3.88 (m, 2 H, H-5), 3.78 (s, 2 H, CH2-triazole), 3.60-3.50 (m, 16 H, CH2CH2NHCS, CH2CH2NHBoc), 3.04 (m, 12 H, CH2S, CH2NHBoc), 2.73-2.50 (m, 12 H, NCH2CH2NHCS, H-6a, H-6b), 2.42-2.10 (m, 12 H, H-2Hex), 1.58 (m, 12 H, H 3Hex), 1.39 (s, 36 H, CMe3), 1.25 (m, 24 H, H-4Hex, H-5Hex), 0.85 (m, 18 H, H-6Hex). 13C NMR (75.5 MHz, DMSO-d6): δ = 172.5, 172.0 (CO ester), 155.6 (CO carbamate), 141.2 (C-4 triazole), 124.5 (C-5 triazole), 90.5 (C-1), 78.7 (CMe3), 70.7 (C- 4), 70.5 (C-2), 69.3 (C-5), 69.0 (C-3), 52.0 (NCH2CH2NHCS), 49.0 (CH2N-triazole), 47.5 (CH2-triazole), 43.3 (NCH2CH2NHCS), 42.1 (CH2CH2NHBoc), 33.5 (C-2Hex), 32.5 (CH2S), 32.0 (C-6), 31.9 (C-4Hex), 28.5 (CMe3), 23.5 (C-3Hex), 21.5 (C-5Hex), 13.5 (C- 6Hex). ESIMS: m/z = 2255.9 [M + Cu]+. Anal. Calcd for C98H174N20O23S6: C, 53.67; H, 8.00; N, 12.77; S, 8.77. Found: C, 53.49; H, 7.88; N, 12.54; S, 8.39. Trehalose gemini facial amphiphile 9. Treatment of 8 (193 mg, 0.23 mmol) with 1:1 TFA-DCM (4 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 9. Yield: 167 mg (quantitative). [a]D = +28.6 (c 1.0, MeOH); UV (MeOH): lmax = 244 nm (emM 47.3). 1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ = 8.43 (s, 2 H, =CH), 5.50 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 9.5 Hz, H-3), 5.35 (d, 2 H, J1,2 = 3.7 Hz, H-1), 5.12 (dd, 2 H, H-2), 5.07 (t, 2 H, J4,5 = 9.5 Hz, H-4), 4.49 (bt, 4 H, 3JH,H = 6.2 Hz, CH2N), 4.07 (bs, 8 H, NCH2CH2NHCS), 3.98 (m, 2 H, H-5), 3.87 (bt, 8 H, CH2NH2), 3.22 (bt, 8 H, NCH2CH2NHCS), 2.67 (m, 4 H, H-6a, H- 230 Experimental Part 6b), 2.32 (m, 12 H, H-2Hex), 1.59 (m, 12 H, H-3Hex), 1.32 (m, 24 H, H-4Hex, H-5Hex), 0.91 (m, 18 H, H-6Hex). 13C NMR (75.5 MHz, CD3OD): δ = 174.8, 173.8 (CO), 143.4 (C-4 triazole), 126.1 (C-5 triazole), 92.3 (C-1), 72.6 (C-4), 72.3 (C-2), 71.3 (C-5), 71.1 (C-3), 52.0 (CH2NH2), 51.2 (CH2N-triazole), 47.2 (CH2-triazole), 38.2 (CH2CH2NH2), 35.1 (C-2Hex), 34.9 (CH2S), 34.0 (C-6), 32.5 (C-4Hex), 25.6 (C-3Hex), 23.1 (C-5Hex), 14.0 (C-6Hex). ESIMS: m/z = 1793.0 [M + H]+, 896.9 [M + 2H]2+. Anal. Calcd for C78H142N20O15S6·4 HCl: C, 48.33; H, 7.59; N, 14.45; S, 9.93. Found: C, 47.97; H, 7.22; N, 14.11; S, 9.55. Janus-type amphiphilic CT2 cyclotrehalans SCN N N Boc Boc N Boc NHBoc 10 2-{NI,NII,NIII,NIV-[triethylenetetra(tert-butoxycarbonyl)amino]}ethaneisothiocyanate (10). To a heterogeneous mixture of 92 (430 mg, 0.72 mmol) in H2O- DCM (1:1, 10 mL), CaCO3 (219 mg, 2.19 mmol) and CSCl2 (83 µL, 1.0 mmol) were added at 0 ºC. The mixture was stirred 2 h at rt and diluted with DCM. The organic phase was separated, dried (MgSO4), concentrated, and the residue was purified by column chromatography (1:2 ® 3:2 EtOAc-cyclohexane). Yield: 367 mg (80%). IR (ATR): umax = 2108, 1698 cm-1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 6.67 (s, 1 H, NH), 3.78 (t, 2 H, CH2NCS), 3.45 (t, 6 H, CH2CH2NCS), 3.17 (m, 6 H, CH2CH2NHBoc), 3.06 (m, 2 H, CH2NHBoc), 1.42 (s, 36 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, DMSO-d6): δ = 155.1, 155,0 (CO), 132.9 (NCS), 79.8, 79.3, 79.1 (CMe3), 46.7, 45.3, 43.7 (CH2), 28.6 (CH3). Experimental Part 231 ESIMS: m/z = 654.4 [M + Na]+. Anal. Calcd for C29H53N5O8S: C, 55.13; H, 8.46; N, 11.08; S, 5.07. Found: C, 55.34; H, 8.62; N, 10.81; S, 4.79. O O O O O O O O O X X ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n 11, n = 1, X = N3 12, n = 9, X = N3 13, n = 1, X = NH2 14, n = 9, X = NH2 15, n = 1, X = NCS 16, n = 9, X = NCS 6,6’-Diazido-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-hexyl- a , a ’-trehalose (11). To a solution of 99 (471 mg, 1.20 mmol) in dry DMF (9.50 mL), NaH (777 mg, 32.4 mmol) was added and the mixture was stirred at 0 ºC for 10 min. 1-Bromohexane (4.54 mL, 32.4 mmol) was added dropwise, under Ar atmosphere, and the mixture was stirred 24 h at 60 ºC. The reaction was quenched with MeOH (5 mL) and stirred for 10 min. Solvents were removed and the resulting residue was suspended in DCM (50 mL). The suspension was washed with H2O (3 x 15 mL) and the organic layer was dried (MgSO4), filtered, concentrated and purified by column chromatography (1:20 EtOAc-cyclohexane). Yield: 1.15 g (75%). Rf = 0.57 (1:10 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +97.0 (c 1.0, DCM). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d = 5.11 (d, 2 H, J1,2 = 3.5 Hz, H-1), 4.04 (ddd, 2 H, J4,5 = 9.5 Hz, J5,6a = 4.2 Hz, J5,6b = 2.9 Hz, H-5), 3.81 (m, 4 H, CH2O), 3.64-3.34 (m, 14 H, CH2O, H-3, H-6a, H-6b), 3.25 (dd, 2 H, J2,3 = 9.5 Hz, H-2), 3.16 (t, 2 H, J3,4 = 9.5 Hz, H-4), 1.62-1.48 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.34-1.24 (bs, 36 H, CH2), 0.88 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (75.5 MHz, CDCl3): d = 93.5 (C-1), 81.6, 80.3 (C-3, C-2), 78.7 (C-4), 73.5, 73.3, 71.9 (CH2O), 70.6 (C-5), 51.5 (C-6), 31.8, 31.7, 30.6, 30.3, 30.2, 25.9, 25.8, 22.6 (CH2), 14.0 (CH3). ESIMS: m/z = 919.8 [M + Na]+. Anal. Calcd for C48H92N6O9: C, 64.25; H, 10.33; N, 9.37. Found: C, 64.31; H, 10.27; N, 9.17. 232 Experimental Part 6,6’-Diazido-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-tetradecyl- a , a ’-trehalose (12). To a solution of 99 (399 mg, 1.01 mmol) in dry DMF (24 mL), NaH (439 mg, 18.3 mmol) was added and the mixture was stirred at 0 ºC for 10 min. 1-Bromotetradecane (5.45 mL, 18.3 mmol) was dropwise added, under Ar atmosphere, and the mixture was stirred 24 h at 60 ºC. Solvents were removed and the resulting residue was suspended in DCM (50 mL). The suspension was washed with H2O (3 x 15 mL) and the organic layer was dried (MgSO4), filtered, concentrated and purified by column chromatography (1:100 EtOAc-cyclohexane). Yield: 193 mg (87%); Rf = 0.26 (1:40 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +68.0 (c 1.0, DCM). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d = 5.11 (d, 2 H, J1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.04 (ddd, 2 H, J4,5 = 9.7 Hz, J5,6a = 4.4 Hz, J5,6b = 2.9 Hz, H-5), 3.81 (m, 4 H, CH2O), 3.70-3.47 (m, 10 H, CH2O, H-3), 3.40 (m, 4 H, H-6), 3.25 (dd, 2 H, J2,3 = 9.7 Hz, H-2), 3.16 (t, 2 H, J3,4 = 9.7 Hz, H-4), 1.60-1.48 (m, 12 H, CH2), 1.26 (bs, 132 H, CH2), 0.88 (t, 18 H, 3JH,H = 6.7 Hz, CH3). 13C NMR (75.5 MHz, CDCl3): d = 93.5 (C-1), 81.0 (C-3), 80.3 (C-2), 78.7 (C-4), 73.6, 73.4, 71.7 (CH2O), 70.5 (C-5), 51.4 (C-6), 31.9, 30.7, 30.4, 30.2, 29.7, 29.6, 29.4, 26.3, 26.2, 22.7 (CH2), 14.1 (CH3). ESIMS: m/z = 1592.4 [M + Na]+. Anal. Calcd for C96H188N6O9: C, 73.42; H, 12.07; N, 5.35. Found: C, 73.61; H, 12.12; N, 5.27. 6,6’-Diamino-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-hexyl- a , a ’-trehalose dihydrochloride (13). To a solution of 11 (250 mg, 0.278 mmol) in THF (22.5 mL), TPP (293 mg, 0.39 mmol) was added and the mixture was stirred at rt for 15 min. Then NH4OH (2.5 mL) was added and the solution was stirred 24 h at 50 ºC. The mixture was concentrated, the resulting residue purified by column chromatography (EtOAc → 45:5:3 AcOEt-EtOH-H2O → 5:1 DCM-MeOH) and freeze-drying from 1N HCl solution affording 13. Yield: 137 mg (58%). Rf = 0.40 (5:1 DCM-MeOH); [a]D = +95.0 (c 1.1, DCM). Experimental Part 233 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d = 5.06 (d, 2 H, J1,2 = 3.5 Hz, H-1), 3.79 (m, 6 H, CH2O, H-5), 3.71-3.46 (m, 8 H, CH2O), 3.59 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 9.5 Hz, H-3), 3.19 (dd, 2 H, H-2), 3.09 (t, 2 H, J4,5 = 9.5 Hz, H-4), 2.93 (dd, 2 H, J6a,6b = 13.5 Hz, J5,6a = 2.4 Hz, H- 6a), 2.77 (dd, 2 H, J5,6b = 5.5 Hz, H-6b), 1.59-1.49 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.34-1.27 (m, 36 H, CH2), 0.90-0.84 (m,18 H, CH3). 13C NMR (75.5 MHz, CDCl3): d= 93.0 (C-1), 81.2 (C-3), 80.5 (C-2), 79.2 (C-4), 73.4, 73.2 (CH2O), 71.8 (C-5), 71.6 (CH2O), 42.7 (C-6), 31.8, 30.4, 30.6, 30.2, 25.9, 25.8, 22.6 (CH2), 14.0 (CH3). ESIMS: m/z = 845.6 [M + H]+. Anal. Calcd for C48H98Cl2N2O9: C, 62.79; H, 10.76; N, 3.05. Found: C, 62.43; H, 10.41; N, 2.87. 6,6’-Diamino-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-tetradecyl- a , a ’-trehalose dihydrochloride (14). To a solution of 12 (447 mg, 0.285 mmol) in THF (23 mL), TPP (105 mg, 0.40 mmol) was added and the mixture was stirred at rt for 15 min. Then NH4OH (2.6 mL) was added and the solution was stirred 16 h at 50 ºC. The mixture was concentrated, the resulting residue purified by column chromatography (EtOAc → 45:5:3 AcOEt-EtOH-H2O → 5:1 DCM-MeOH) and freeze-drying from 1 N HCl solution affording 14. Yield: 137 mg (59%); Rf = 0.47 (9:1 DCM-MeOH); [a]D = +24.4 (c 1.0, DCM). 1H NMR (300 MHz, 10:1 CDCl3-CD3OD): d = 4.97 (d, 2 H, J1,2 = 3.5 Hz, H-1), 3.70 (m, 6 H, CH2O, H-5), 3.61-3.37 (m, 8 H, CH2O), 3.47 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 9.4 Hz, H- 3), 3.12 (dd, 2 H, H-2), 2.95 (t, 2 H, J4,5 = 9.4 Hz, H-4), 2.88 (dd, 2 H, J6a,6b = 13.8 Hz, J5,6a = 3.3 Hz, H-6a), 2.73 (dd, 2 H, J5,6b = 5.6 Hz, H-6b), 1.49-1.37 (m, 12 H, CH2), 1.15 (bs, 132 H, CH2), 0.77, 0.76 (2 t, 18 H, 3JH,H = 6.7 Hz, CH3). 13C NMR (75.5 MHz, 10:1 CDCl3-CD3OD): d = 92.7 (C-1), 80.9 (C-3), 79.9 (C- 2), 78.8 (C-4), 73.4, 73.1, 71.6 (CH2O), 69.8 (C-5), 41.2 (C-6), 31.8-22.5 (CH2), 13.9 (CH3). 234 Experimental Part ESIMS: m/z = 1519.4 [M + 2 H]2+, 1541.4 [M + H + Na]+. Anal. Calcd for C96H194Cl2N2O9: C, 72.45; H, 12.29; N, 1.76. Found: C, 72.13; H, 11.95; N, 1.51. 6,6’-Dideoxy-6,6’-diisothiocyanato-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-hexyl- a , a ’-trehalose (15). To a solution of 11 (1.19 g, 1.32 mmol) in dioxane (50 mL), TPP (761 mg, 2.90 mmol) and CS2 (1.94 mL, 26.4 mmol) were added, under Ar atmosphere. The solution was stirred at rt for 24 h. Then the solvents were evaporated and the residue was purified by column chromatography (cyclohexane ® 1:100 EtOAc-cyclohexane). Yield: 1.10 g (90%); Rf = 0.64 (1:10 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +63.7 (c 1.0, DCM); IR(ATR): umax = 2087 cm-1. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): d = 5.23 (d, 2 H, J1,2 = 3.2 Hz, H-1), 4.09-4.03 (m, 2 H, H-5), 3.92-3.52 (m, 18 H, CH2O, H-3, H-6a, H-6b), 3.30 (dd, 2 H, J2,3 = 10.1 Hz, H-2), 3.15 (t, 2 H, J3,4 = 8.0 Hz, H-4), 1.63-1.53 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.33 (bs, 36 H, CH2), 0.91 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ = 133.1 (NCS), 93.5 (C-1), 81.3 (C-3), 80.4 (C-2), 78.8 (C-4), 73.5 (CH2O), 69.5 (C-5), 46.1 (C-6), 31.5, 30.9, 26.3, 22.5 (CH2), 14.3 (CH3). ESIMS: m/z = 951.6 [M + Na]+. Anal. Calcd for C50H92N2O9S2: C, 64.62; H, 9.98; N, 3.01; S, 6.90. Found: C, 64.77; H, 10.21; N, 2.86; S, 6.69. 6,6’-Dideoxy-6,6’-diisothiocyanato-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-tetradecyl- a , a ’- trehalose (16). To a solution of 12 (3.46 g, 2.20 mmol) in dioxane (80 mL), TPP (1.26 g, 4.84 mmol) and CS2 (3.24 mL, 44 mmol) were added, under Ar atmosphere. The solution was stirred at rt for 24 h. Then the solvents were evaporated, and the residue was purified by column chromatography (cyclohexane ® 1:100 EtOAc-cyclohexane). Yield: 2.15 g (60%); Rf = 0.67 (1:6 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +44.7 (c 1.0, DCM). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): d = 5.04 (d, 2 H, J1,2 = 3.2 Hz, H-1), 3.97 (m, 2 H, H-5), 3.85-3.40 (m, 18 H, CH2O, H-3, H-6a, H-6b), 3.27 (dd, 2 H, J2,3 = 10.0 Hz, H-2), Experimental Part 235 3.05 (t, 2 H, J3,4 = 9.0 Hz, H-4), 1.49 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.21 (bs, 144 H, CH2), 0.82 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3): δ = 133.5 (NCS), 93.6 (C-1), 80.9 (C-3), 80.1 (C-2), 78.9 (C-4), 73.6 (CH2O), 69.2 (C-5), 46.3 (C-6), 31.7, 29.7, 29.4 26.1, 22.7 (CH2), 14.1 (CH3). ESIMS: m/z = 1625.3 [M + Na]+. Anal. Calcd for C98H188N2O9S2: C, 73.44; H, 11.82; N, 1.75; S, 4.00. Found: C, 73.18; H, 11.71; N, 1.56; S, 3.74. O O O O O O O O O X X 17, X = N3 18, X = NH2 19, X = NCS 2,3,4,2’,3’,4’-Hexa-O-allyl-6,6’-diazido-6,6’-dideoxy- a , a ’-trehalose (17). To a solution of 99 (340 mg, 0.85 mmol) in DMF (12 mL) at 0 ºC, NaH (95%) (122 mg, 5.10 mmol) was added. After 5 min, allyl bromide (0.44 mL, 5.10 mmol) was dropwise added, and the reaction mixture was stirred at rt for 24 h. The reaction was quenched by adding MeOH, concentrated and the residue was dissolved in DCM (10 mL), washed with H2O (2 x 10 mL) and with brine (10 mL). The organic layer was dried (MgSO4), filtered and concentrated. The resulting residue was purified by column chromatography (1:6 EtOAccyclohexane). Yield: 325 mg (60%). Rf = 0.51 (1:6 EtOAc-cyclohexane); [α]D = +185.7 (c 1.0, DCM). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 5.99-5.88 (m, 6 H, =CH), 5.31-5.19 (m, 12 H, =CH2), 5.12-5.11 (d, 2 H, J1,2 = 3.5 Hz, H-1), 4.38-4.22 (m, 12 H, CH2O), 4.14-4.10 (m, 2 H, H-5), 3.71 (t, 2 H, J3,4 = 7.5 Hz, H-3), 3.42-3.40 (m, 12 H, H-6), 3.39-3.37 (dd, 2 H, J2,3 = 5.6 Hz, H-2), 3.28 (t, 2 H, H-4). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3): δ = 134.6 (=CH), 116.9 (=CH2), 93.9 (C-1), 80.9 (C-3), 79.0 (C-2), 78.0 (C-4), 74.2, 72.0 (CH2O), 70.3 (C-5), 51.4 (C-6). 236 Experimental Part ESIMS: m/z = 655.4 [M + Na]+. Anal. Calcd for C30H44N6O9: C, 56.95; H, 7.01; N, 13.28. Found: C, 57.12; H, 6.87; N, 12.94. 2,3,4,2’,3’,4’-Hexa-O-allyl-6,6’-diamino-6,6’-dideoxy- a , a ’-trehalose (18). To a solution of diazide 17 (400 mg, 0.62 mmol) in THF (40 mL), TPP (650 mg, 2.48 mmol) was added. The reaction was stirred at rt for 1 h. Then, NH4OH (4 mL) was added, and the reaction mixture was stirred for 24 h at 50 ºC. Solvents were evaporated at reduced pressure, and the resulting residue was purified by column chromatography (1:6 EtOAccyclohexane → EtOAc). Yield: 333 mg (93%). [α]D = +119.6 (c 1.0, DCM). 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 5.95-5.82 (m, 6 H, =CH), 5.28-5.12 (m, 12 H, =CH2), 5.05 (d, 2 H, J1,2 = 5.4 Hz, H-1), 4.34-4.08 (m, 12 H, CH2O), 3.90-43.88 (m, 2 H, H-5), 3.72 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 11.5 Hz, H-3), 3.32 (dd, 2 H, H-2), 3.16 (t, 2 H, J4,5 = 11.5 Hz, H-4), 2.98 (m, 2 H, H-6a), 2.79 (m, 2H, H-6b). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3): δ = 134.7 (=CH), 116.8 (=CH2), 93.7 (C-1), 81.2 (C-3), 79.1 (C-2), 78.4 (C-4), 74.1, 73.7 (CH2O), 72.1 (C-5), 53.8 (C-6). ESIMS: m/z = 581.3 [M + H]+. Anal. Calcd for C30H48N2O9: C, 62.05; H, 8.33; N, 4.82. Found: C, 62.23; H, 8.60; N, 4.49. 2,3,4,2’,3’,4’-Hexa-O-allyl-6,6’-dideoxy-6,6’-diisothiocyanato- a , a ’-trehalose (19). To a solution of 17 (0.244 g, 0.38 mmol) in dry dioxane (15 mL) TPP (222 mg, 0.84 mmol) and CS2 (0.56 mL, 7.7 mmol) were added under Ar atmosphere. The solution was stirred at rt for 24 h. Then the solvents were evaporated, and the residue was purified by column chromatography (1:20®1:10 EtOAc-cyclohexane). Yield: 206 mg (80%); Rf = 0.44 (1:6 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +129.4 (c 1.0, DCM); IR (ATR): umax = 2091 cm-1. 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 5.99-5.85 (m, 6 H, =CH), 5.33-5.17 (m, 12 H, =CH2), 5.16 (d, 2 H, J1,2 = 3.4 Hz, H-1), 4.42-4.38 (m, 12 H, CH2O), 4.17-4.09 (m, 2H, H-5), 3.76-3.73 (m, 2 H, H-3), 3.73-3.69 (m, 12 H, H-6), 3.41 (dd, 2 H, J2,3 = 5.6 Hz, H- 2), 3.27 (t, 2 H, J3,4 = J4,5 = 7.5 Hz, H-4). Experimental Part 243 J5,6b = 8.0 Hz, H-5), 3.64 (bdd, 2 H, J6’a,6’b = 14.6 Hz, H-6’a), 3.54 (dd, 2 H, H-6’b), 3.33 (ddd, 2 H, JNH,6b = 3.4 Hz, H-6b), 2.37-2.23 (m, 24 H, CH2CO), 1.67-1.55 (m, 24 H, CH2),1.37-1.28 (m, 48 H, CH2), 0.94-0.90 (m, 36 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 184.7 (CS), 173.6, 172.3, 172.2, 172.1 (CO), 136.6 (NCS), 92.2 (C-1), 91.9 (C-1’), 70.7 (C-2’), 69.8 (C-5), 69.7 (C-3, C- 2, C-4’), 69.3 (C-4), 69.1 (C-3’), 68.6 (C-5’), 46.0 (C-6), 45.1 (C-6’), 33.9 (CH2), 31.2 (CH2), 24.4 (CH2), 22.2 (CH2), 13.8 (CH3). ESIMS: m/z = 2006.9 [M + Na]+. Anal. Calcd for C99H162N4O30S3: C, 59.92; H, 8.23; N, 2.82; S, 4.85. Found: C, 60.17; H, 8.38; N, 2.67; S, 4.63. NI,NII-Bis-[6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-myristoyl-6’-isothiocyanato- α,α'-trehalos-6-yl]thiourea (26). Compound 26 was obtained from 96 (0.395 mmol) following the general procedure above described. Column chromatography (cyclohexane → 1:6 acetone-cyclohexane). Yield: 87 mg (20%) and 33% of starting material. Rf = 0.25 (1:6 EtOAc-cyclohexane); [α]D = +77.1 (c 1.0, DCM); IR (ATR): υmax = 2082 cm-1; UV (DCM): λmax 249 nm (εmM = 18.0). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 6.18 (m, 2 H, NH), 5.62 (d, 2 H, J1,2 = 3.5 Hz, H-1), 5.56 (t, 2 H, J2’,3’ = J3’,4’= 9.5 Hz, H-3’), 5.49 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 9.5 Hz, H- 3), 5.40 (d, 2 H, J1’,2’ = 3.0 Hz, H-1’), 5.13 (dd, 2 H, H-2), 5.04 (t, 2 H, J4’,5’ = 9.5 Hz, H- 4’), 4.97 (t, 2 H, H-4), 4.92 (dd, 2 H, J2’,3’ = 9.5 Hz, H-2’), 4.06-4.02 (m, 2 H, H-5), 3.96 (m, 2 H, H-6a), 3.89-3.85 (m, 2 H, H-5’), 3.67-3.62 (m, 2 H, H-6a’), 3.57-3.53 (m, 2 H, H-6b’), 3.34 (m, 2 H, H-6b), 2.38-2.25 (m, 24 H, CH2CO), 1.62-1.55 (m, 24 H, CH2CH2CO), 1.30 (m, 240 H, CH2), 0.91 (m, 36 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3, 323K): δ = 184.7 (CS), 172.2 (CO), 135.5 (NCS), 92.3 (C-1), 91.8 (C-1’), 70.7 (C-2’), 69.7 (C-2), 69.8 (C-4’), 69.7 (C-5), 69.7 (C-3), 69.2 (C-4), 69.1 (C-3’), 68.6 (C-5’), 46.0 (C-6’), 45.1 (C-6), 34.0 (CH2CO), 24.8 (CH2CH2CO), 13.9 (CH3). 244 Experimental Part MALDITOFMS: m/z = 3354.9 [M + Na]+. Anal. Calcd for C195H354N4O30S3: C, 70.31; H, 10.71; N, 1.68; S, 2.89. Found: C, 70.52; H, 10.88; N, 1.46; S, 2.61. O O O O O O N N H H S NCS SCN O O O OO O O OO O O O 27 Unit 1 Unit 1’ NI,NII-Bis-[6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-hexyl-6’-isothiocyanato- a , a '- trehalos-6-yl]thiourea (27). Compound 27 was obtained from 15 (0.395 mmol) following the general procedure above described. Column chromatography (cyclohexane ® 1:10 EtOAc-cyclohexane). Yield: 153 mg (30%) and 51% of starting material. Rf = 0.19 (1:10 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +49.0 (c 1.0, DCM); IR (ATR): umax = 2085 cm-1; UV (MeOH): λmax 247 nm (εmM = 4.1). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 5.12 (d, 4 H, J1,2 = J1’,2’ = 3.2 Hz, H-1, H-1’), 4.08-4,00 (m, 4 H, H-5, H-5’), 3.90-3.53 (m, 36 H, CH2O, H-3, H-3’, H-6, H-6’), 3.29- 3.25 (dd, 4 H, J2,3 = J2’,3’ = 9.0 Hz, H-2, H-2’), 3.21-3.08 (m, 4 H, H-4, H-4’), 1.59 (m, 24 H, CH2CH2O), 1.36 (bs, 72 H, CH2), 0.94-0.82 (m, 36 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ = 93.5 (C-1, C-1’), 81.5 (C-3, C-3’), 80.1 (C-2, C-2’), 78.9 (C-4, C-4’), 73.5, 72.4 (CH2O), 69.5 (C-5, C-5’), 46.4 (C-6, C-6’), 31.9, 30.5, 25.9, 22.5 (CH2), 14.1 (CH3). ESIMS: m/z = 1839.1 [M + Na]+. Anal. Calcd for C99H186N4O18S3: C, 65.45; H, 10.32; N, 3.08; S, 5.29. Found: C, 65.58; H, 10.40; N, 2.91; S, 5.14. Experimental Part 245 O O O O O O N N H H S NCS SCN O O O OO O O OO O O O S S S S S S S S S S NHBoc NHBoc NHBoc NHBoc NHBoc BocHN BocHN BocHN BocHN BocHN 28 Unit 1 Unit 1’ S NHBoc S NHBoc NI,NII-Bis-[6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-2-N-tert-butoxicarbonylaminoethyl- thiopropyl-6’-isothiocyanato- a , a '-trehalos-6-yl]thiourea (28). Compound 28 was obtained from 20 (0.395 mmol) following the general procedure above described. Column chromatography (1:1 EtOAc-cyclohexane). Yield: 87 mg (15%) and 45% of starting material. Rf = 0.40 (1:1 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +50.33 (c 1.0, DCM); IR (ATR): umax = 2089, 1697 cm-1; UV (MeOH): λmax 245 nm (εmM = 13.6). 1H NMR (400 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 5.13-5.03 (m, 4 H, H-1, H-1’), 4.08 (ddd, 4 H, J5,6a = 6.3 Hz, J5,6b = 3.7 Hz, H-5, H-5’), 3.95-3.68 (m, 6 H, H-6, H-6’, CH2O), 3.61 (t, 4 H, J2,3 = J3,4 = 9.7 Hz, H-3, H-3’), 3.34-3.29 (m, 24 H, CH2N), 3.27 (dd, 4 H, H- 2, H-2’), 3.13-3.076 (m, 4 H, H-4, H-4’), 2.68-2.60 (m, 48 H, SCH2CH2NHBoc, CH2S), 1.93-1.83 (m, 24 H, CH2CH2O), 1.46-1.44 (3 s, 108 H, CMe3). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 184.4 (CS), 155.8 (CO), 133.5 (NCS), 92.8 (C-1), 92.7 (C-1’), 81.2 (C-3), 81.0 (C-3’), 80.2 (C-2, C-2’), 79.3 (C-4), 79.1 (C-4’), 71.6 (CH2O), 70.2 (C-5, C-5’), 46.6 (C-6), 45.6 (C-6’), 40.1 (CH2N), 32.3, 32.3 (SCH2CH2NHBoc), 31.4 (CH2CH2O), 29.6 (CH2S), 28.6 (CMe3). ESIMS: m/z = 3436.5 [M + Na]+. Anal. Calcd for C147H270N16O42S15: C, 51.71; H, 7.97; N, 6.56; S, 14.08. Found: C, 51.90; H, 8.12; N, 6.29; S, 13.73. 246 Experimental Part General procedure for the preparation of Mickey mouse amphiphilic CT3 cyclotrehalans 29, 30, 37, 41, 42) To a solution of the corresponding diamine trehalose derivative (13, 14, and 97) (0.045 mmol) and DMAP (17 mg, 0.135 mmol) in pyridine (4 mL), a solution of the corresponding isothiocyanato trehalose derivative (25, 26, 27, 28) (0.045 mmol) in pyridine (4 mL) was slowly added and the mixture was stirred 24 h at 40 ºC. The mixture was concentrated, and the resulting residue purified by column chromatography using the solvent indicated in each case O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O H N S H N N H S HN NH NH S SS S S S S 29, n = 1, R = Boc 30, n = 9, R = Boc 31, n = 1, R = H·HCl 32, n = 9, R = H·HCl Unit 1 Unit 1’ Unit 1’’ RHN NHR NHR NHR NHR NHR O OO O O O O O O O O ( )n ( )n ( )n ( )n ( )n ( )n ( )n ( )n ( )n ( )n ( )n ( )n Unit 1,1’-(dodeca-O-hexanoyl)-unit 1’’-[hexa-O-(2-tert-butoxycarbonyl- aminoethylthiopropyl)]-CT3 (CT3 HL2 Boc-protected) (29). Compound 29 was obtained from 97 (0.045 mmol) and 25 (0.045 mmol) following the general procedure above described. Column chromatography (1:1→ 2:1 EtOAc-cyclohexane). Yield: 100 mg (48%). Rf = 0.55 (1:1 EtOAc-cyclohexane); [α]D = +89.0 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 246 nm (εmM = 30.4). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 6.37, 6.21 (2 bs, 6 H, NHCS), 5.51 (m, 4 H, H-3’, H-3”), 5.43 (bs, 2 H, H-1’), 5.38 (bs, 2 H, H-1”), 5.23-5.03 (m, 6 H, NHBoc), 5.06 (bs, 2 H, H-1), 4.99-4.91 (m, 8 H, H-2’, H-2”, H-4’, H-4”), 4.04 (m, 4 H, H-6’a, H- Experimental Part 247 6”a), 3.98-3.62 (m, 12 H, CH2O), 3.92-3.87 (m, 6 H, H-5, H-5’, H-5”), 3.83 (m, 2 H, H- 6a), 3.68 (m, 2 H, H-6b), 3.60 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 9.7 Hz, H-3), 3.44 (bs, 4 H, H-6’b, H- 6”b), 3.32 (m, 12 H, CH2N), 3.28 (dd, 2 H, J1,2 = 2.5 Hz, H-2), 3.07 (t, 2 H, J4,5 = 9.7 Hz, H-4), 2.70-2.63 (m, 24 H, SCH2CH2NHBoc, CH2S), 2.38-2.23 (m, 24 H, CH2), 1.92- 1.83 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.65-1.56 (m, 24 H, CH2), 1.47, 1.48, 1.46 (3 s, 54 H, CMe3), 1.36-1.29 (m, 48 H, CH2), 0.94-0.90 (m, 36 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 184.6, 184.2 (CS), 173.7, 173.4, 172.4, 172.1 (CO ester), 156.0, 155.7 (CO carbamate), 92.9 (C-1), 91.9 (C-1’, C-1”), 81.0 (C-3), 80.1 (C-2), 79.5 (C-4), 79.3 (CMe3), 71.7, 71.6 (C-5, CH2O), 70.6, 70.4 (C-2’, C- 2”), 69.9, 69.8 (C-5’, C-5’’, CH2O), 69.4 (C-3’, C-3”), 68.9 (C-4’, C-4”), 45.4, 44.8, 44.6 (C-6, C-6’, C-6”), 40.1 (CH2N), 34.1, 34.0 (CH2), 32.3 (SCH2CH2NHBoc), 31.2 (CH2), 30.7, 30.3, 30.1, 29.6 (CH2CH2O), 28.6 (CH2S), 28.4 (CMe3), 24.5, 24.4, 22.2 (CH2), 13.7, 13.6 (CH3). ESIMS: m/z = 3652.0 [M + Na]+, 1836.8 [M + 2 Na]2+. Anal. Calcd for C171H300N12O51S9: C, 56.60; H, 8.33; N, 4.63; S, 7.95. Found: C, 56.73; H, 8.47; N, 4.45; S, 7.52. Unit 1,1’-(dodeca-O-myristoyl)-unit 1’’-[hexa-O-(2-tert-butoxycarbonyl- aminoethylthiopropyl)]-CT3 (CT3 HL2 Boc-protected) (30). Compound 30 was obtained from 97 (0.045 mmol) and 26 (0.045 mmol) following the general procedure above described. Column chromatography (1:4→ 1:1 EtOAc-cyclohexane). Yield: 83 mg (44%); Rf = 0.65 (1:1 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +61.0 (c 1.0, DCM); UV (DCM): λmax 248 nm (εmM = 44.0). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 333 K): δ = 6.34, 6.16 (2 bs, 6 H, NHCS), 5.51 (m, 4 H, H-3, H-3’), 5.42, 5.38 (2 d, 4 H, H-1, H-1’), 5.19 (m, 6 H, NHBoc), 5.06 (bs, 2 H, H-1”), 4.99-4.90 (m, 8 H, H-2, H-2’, H-4, H-4’), 4.03 (m, 4 H, H-6a, H-6’a), 3.92-3.85 (m, 12 H, CH2O), 3.87-3.81 (m, 6 H, H-5, H-5’, H-5”), 3.68 (m, 4 H, H-6’’a, H-6’’b), 3.60 (t, 2 H, J2’’,3’’ = J3’’,4’’ = 9.7 Hz, H-3’’), 3.44 (bs, 4 H, H-6b, H-6’b), 3.32 (m, 12 H, CH2N), 248 Experimental Part 3.27 (dd, 2 H, J1’’,2’’ = 2.5 Hz, H-2’’), 3.07 (t, 2 H, J4’’,5’’ = 9.7 Hz, H-4”), 2.71-2.64 (m, 24 H, SCH2CH2NHBoc, CH2S), 2.40-2.35 (m, 24 H, CH2CO), 1.93-1.87 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.62-1.59 (m, 24 H, CH2CH2CO), 1.48 (s, 54 H, CMe3), 1.30 (m, 240 H, CH2), 0.93-0.90 (m, 36 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3): δ = 184.2 (CS), 173.9, 173.5, 172.4, 172.3 (CO ester), 156.0, 155.8 (CO carbamate), 91.5 (C-1, C-1’, C-1”), 80.8 (C-3’’), 79.9 (C-2’’), 79.6 (C-4’’), 79.3 (CMe3), 71.7, 71.6 (C-5’’, CH2O), 70.3 (C-2, C-2’), 69.6 (C-5, C-5’, CH2O), 69.2 (C-3, C-3’), 68.7 (C-4, C-4’), 45.2, 44.4 (C-6, C-6’, C-6”), 39.9 (CH2N), 34.1, 34.0 (CH2CO), 31.9 (SCH2CH2NHBoc), 29.7, 29.6, 29.5, 29.4 (CH2CH2O, CH2CH2CO), 29.2 (CH2S), 28.4 (CMe3), 24.8, 22.7 (CH2), 14.1 (CH3). ESIMS: m/z = 2509.92 [M + 2 Na]2+. Anal. Calcd for C267H492N12O51S9: C, 64.46; H, 9.97; N, 3.38; S, 5.80. Found: C, 64.70; H, 10.18; N, 3.26; S, 5.63. Unit 1,1’-(dodeca-O-hexanoyl)-unit 1’’-[hexa-O-(2-aminoethylthiopropyl)]- CT3 (CT3 HL2) (31). Treatment of 29 (80 mg, 0.022 mmol) with 1:1 TFA-DCM (4 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 31. Yield: 71 mg (quantitative). [α]D = +72.5 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 246 nm (εmM = 22.9). 1H NMR (500 MHz, 5:1 CD3OD-CDCl3, 333 K): δ = 5.28 (m, 4 H, H-3’, H-3”), 5.25 (d, 2 H, J1’,2’ = 4.0 Hz, H-1’), 5.19 (d, 2 H, J1’’,2’’ = 4.0 Hz, H-1”), 5.09 (bd, 2 H, H- 1), 4.88-4.81 (m, 4 H, H-2’, H-2”) 4.72-4.67 (m, 4 H, H-4’, H-4”), 4.21 (bd, 4 H, H-6’a, H-6”a), 3.90 (bd, 2 H, H-6a), 3.81-3.42 (m, 12 H, CH2O), 3.74 (bd, 2 H, H-6b), 3.69-3.56 (m, 4 H, H-5’, H-5”), 3.52 (m, 2 H, H-5), 3.38 (t, 2 H, J2,3 = J3,4 = 9.1 Hz, H-3), 3.12 (dd, 2 H, J1,2 = 3.4 Hz, H-2), 2.99-2.91 (m, 16 H, H-6’b, H-6”b, CH2N), 2.83 (t, 2 H, J4,5 = 9.7 Hz, H-4), 2.67-2.64 (m, 12 H, SCH2CH2N), 2.53-2.40 (m, 12 H, CH2S), 2.21-1.98 (m, 24 H, CH2), 1.72-1.59 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.46-1.31 (m, 24 H, CH2), 1.14-1.07 (m, 48 H, CH2), 0.72-0.67 (m, 36 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, 5:1 CD3OD-CDCl3, 333 K): δ = 183.7, 183.4 (CS), 172.6, 172.5, 172.4, 172.3 (CO), 90.9 (C-1), 90.3, 90.1 (C-1’, C-1”), 80.7 (C-3), 79.7 (C-2), 79.5 Experimental Part 249 (C-4), 71.1, 70.9 (C-5, CH2O), 70.1, 70.0, 69.8 (C-2’, C-2”, C-5’, C-5’’), 69.7, 69.5, 69.3 (CH2O, C-3’, C-3”), 69.1, 68.9 (C-4’, C-4”), 45.0, 44.5, 44.1 (C-6, C-6’, C-6”), 38.9, 38.8 (CH2N), 33.8- 33.6 (CH2), 30.9 (CH2), 30.8 (C-4Hex), 30.2, 30.1, 29.9 (CH2CH2O), 29.1, 28.7, 28.6 (SCH2CH2NH), 28.5, 28.3, 28.2 (CH2S), 24.1, 24.0, 21.7 (CH2), 13.1, 13.0 (CH3). ESIMS: m/z = 1514.8 [M + 2 H]2+. Anal. Calcd for C141H252N12O39S9·6 HCl: C, 52.16; H, 8.01; N, 5.18; S, 8.89. Found: C, 51.85; H, 7.78; N, 4.81; S, 8.50. Unit 1,1’-(dodeca-O-myristoyl)-unit 1’’-[hexa-O-(2-aminoethylthiopropyl)]- CT3 (CT3 HL2) (32). Treatment of 30 (44 mg, 8.8 µmol) with 1:1 TFA-DCM (8 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 32. Yield: 40 mg (quantitative); Rf = 0.15 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [a]D = +39.4 (c 1.0, DCM); UV (DCM): λmax 244 nm (εmM = 71.7). 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 5.57-5.50 (m, 4 H, H-3, H-3’), 5.48 (m, 2 H, H-1), 5.39 (m, 2 H, H-1’), 5.14-5.07 (m, 4 H, H-2, H-2’), 5.00-4.93 (m, 4 H, H- 4, H-4’), 4.45 (m, 4 H, H-6a, H-6a’), 4.21 (m, 4 H, H-6b, H-6b’), 3.94-3.67 (m, 24 H, CH2O, H-5, H-5’, H-5”, H-6a’’, H-6b’’, H-3’’), 3.42-3.40 (m, 2 H, H-2’’), 3.33 (m, 12 H, CH2N), 3.10-3.06 (t, 2 H, H-4’’), 2.90-2.86 (m, 12 H, SCH2CH2NH), 2.77-2.66 (m, 12 H, CH2S), 2.43-2.24 (m, 24 H, CH2CO), 1.95-1.86 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.64-1.60 (m, 24 H, CH2CH2CO), 1.33 (m, 240 H, CH2), 0.94-0.93 (m, 36 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 183.4 (CS), 172.4 (CO), 90.2 (C-1, C-1’, C-1”), 81.1 (C-3’’), 79.7 (C-2’’), 79.6 (C-4’’), 71.1, 70.9 (C-5’’, CH2O), 70.1 (C-2, C-2’), 69.6 (C-5, C-5’, CH2O), 69.0 (C-3, C-3’), 68.6 (C-4, C-4’), 45.1 (C-6, C-6’, C-6”), 39.1 (CH2N), 34.1, 34.0 (CH2CO), 31.6 (SCH2CH2NHBoc), 30.2 (SCH2CH2CH2O), 29.7, 29.5, 29.2, 29.0, 28.9 (CH2CH2CO, CH2), 28.1 (NCH2CH2S), 27.9 (CH2S), 24.5 (CH2CH2O), 22.3 (CH2), 13.1 (CH3). ESIMS: m/z = 2187.12 [M + 2 H]2+. Anal. Calcd for C237H444N12O39S9·6 HCl: C, 61.97; H, 9.87; N, 3.66; S, 6.28. Found: C, 61.72; H, 9.95; N, 3.41; S, 5.99. 250 Experimental Part 33, n = 1, R = Boc 34, n = 9, R = Boc 35, n = 1, R = H·HCl 36, n = 9, R = H·HCl O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O H N S H N N H S HN NH NH S NH S HN S NH S NH S NH S NH S HN NH NH NH NH NH SS S S S SN N N NN NNHR NHR O O O O O O O OO O O ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n O ( ) n Unit 1 Unit 1’ Unit 1’’ RHN NHR RHN NHR RHN RHN RHN NHR NHR NHR Unit 1,1’-(dodeca-O-hexanoyl)-unit 1’’-[hexa-O-(2-N,N-di-(2-tert-butoxy- carbonylaminoethyl)ethylthioureidoethylthiopropyl)]-CT3 (CT3 HL2 Boc-protected) (33). Compound 33 was obtained from 31 (0.045 mmol) and 98 (0.045 mmol) following the general procedure above described. Column chromatography (2:1 EtOAccyclohexane → 45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 75 mg (71%). Rf = 0.68 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [a]D = +38.0 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 245 nm (εmM = 17.1). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 343 K): δ = 6.33 (s, 18 H, NHCS), 5.39 (m, 8 H, H-3, H-3’, H-1, H-1’), 5.24 (d, 2 H, H-1”), 5.11-5.08 (dd, 4 H, J1,2 = 2.5 Hz, H-2, H-2’), 4.95 (t, 2 H, J4,5 = 9.7 Hz, H-4, H-4’), 4.09-4.22 (m, 4 H, H-6”a, H-6”b), 3.80 (m, 4 H, H- 5, H-5’), 3.62-3.58 (m, 18 H, H-5”, H-6, H-6’, CH2O), 3.43 (m, 14 H, H-3”, CH2NHCS), 3.30 (m, 2 H, H-2”), 3.00 (m, 14 H, H-4”, CH2NHBoc), 2.69-2.52 (m, 48 H, SCH2CH2, SCH2, NCH2CH2), 2.53-2.48 (m, 24 H, CH2N), 2.31-2.19 (m, 24 H, H-2Hex), 1.85-1.70 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.57-1.49 (m, 24 H, CH2), 1.41 (3 s, 108 H, CMe3), 1.31-1.24 (m, 48 H, CH2), 0.89-0.85 (m, 36 H, CH3). Experimental Part 251 13C NMR (125.7 MHz, DMSO-d6, 323 K): δ = 183.2 (CS), 172.2, 171.9 (CO ester), 156.1 (CO carbamate), 90.4 (C-1, C-1’, C-1”), 81.1, 80.0, 79.7 (C-2”, C-3”, C-4”), 79.2 (CMe3), 71.6, 70.4 (C-5, C-5”), 70.0, 69.7, 69.4 (C-4, C-4’, C-3, C-3’, C-2, C-2’, CH2O), 54.39 (CH2N), 44.3, 44.0, 42.3 (C-6, C-6’, C-6”, CH2NHCS), 40.0, 39.8, 39.1 (CH2NHBoc), 33.9, 33.8 (CH2), 31.2, 31.1, 31.0 (CH2, CH2S, CH2CH2O), 28.7, 28.6 (CMe3, SCH2CH2), 24.4, 24.2, 22.0 (CH2), 14.0, 13.9 (CH3). ESIMS: m/z = 5726.1 [M + Na]+. Anal. Calcd for C243H444N36O63S15: C, 54.46; H, 8.35; N, 9.41; S, 8.97. Found: C, 54.81; H, 8.63; N, 9.06; S, 8.59. Unit 1,1’-(dodeca-O-myristoyl)-unit 1’’-[hexa-O-(2-N,N-di-(2-tert-butoxy- carbonylaminoethyl)ethylthioureidoethylthiopropyl)]-CT3 (CT3 HL2 Boc-protected) (34). Compound 34 was obtained from 32 (0.045 mmol) and 98 (0.045 mmol) following the general procedure above described. Column chromatography (2:1 EtOAccyclohexane → 1:2 acetone-cyclohexane). Yield: 110 mg (75%); Rf = 0.48 (2:3 acetonecyclohexane); [a]D = +41.5 (c 1.0, DCM); UV (DCM): λmax 248 nm (εmM = 135.0). 1H NMR (500 MHz, 3:1 CDCl3-CD3OD, 323 K): δ 5.49 (m, 4 H, H-3, H-3’), 5.44 (bs, 2 H, H-1), 5.33, 5.23 (2 bs, 4 H, H-1’, H-1”), 4.89 (bs, 4 H, H-2, H-2’), 4.80 (bd, 4 H, H-4, H-4’), 4.49-3.78 (m, 18 H, H-6a, H-6’a, H-6”a, H-6b, H-6’b, H-6”b, H-5, H-5’, H-5”), 3.92-3.82 (m, 12 H, CH2O), 3.45-3.39 (m, 14 H, H-3”, CH2NHCS), 3.19 (m, 2 H, H-2”), 2.98 (bt, 2 H, H-4’’), 2.77 (m, 24 H, CH2NHBoc), 2.69-2.47 (m, 70 H, SCH2CH2, SCH2, NCH2CH2NHBoc, NCH2CH2NHCS), 2.39-2.25 (m, 24 H, CH2CO), 2.03-1.85 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.63-1.57 (m, 24 H, CH2CH2CO), 1.47-1.44 (m, 108 H, CMe3), 1.34-1.28 (bs, 240 H, CH2), 0.89 (t, 36 H, 3JH,H = 6.5 Hz, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, 3:1 CDCl3-CD3OD, 323 K): δ = 182.7 (CS), 172.5 (CO ester), 157.0 (CO carbamate), 90.9 (C-1, C-1’, C-1”), 79.1 (CMe3), 69.9 (CH2O), 54.4- 53.5 (SCH2CH2, CH2S, NCH2CH2NHBoc), 44.8, 43.8, 42.1 (CH2NHCS), 38.7 (CH2NHBoc), 34.0, 33.9 (CH2CO), 29.5, 29.3, 29.2 (CH2), 27.9, 27.8 (CMe3), 24.7, 24.8, 24.6 (CH2CH2O), 22.4 (CH2), 13.4 (CH3). 252 Experimental Part ESIMS: m/z = 2278.4 [M +2 Na]3+. Anal. Calcd for C340H637N35O63S15: C, 60.91; H, 9.58; N, 7.31; S, 7.17. Found: C, 60.58; H, 9.30; N, 6.98; S, 6.83. Unit 1,1’-(dodeca-O-hexanoyl)-unit 1’’-[hexa-O-(2-N,N-di-(2-aminoethyl)- ethylthioureidoethylthiopropyl)]-CT3 (CT3 HL2) (35). Treatment of 33 (75 mg, 0.014 mmol) with 1:1 TFA-DCM (4 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 35. Yield: 55 mg (quantitative). [a]D = +16.9 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 243 nm (εmM = 54.8). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 343 K): δ = 5.36 (m, 10 H, H-3, H-3’, H-3”, H-1, H-1’, H-1”), 5.23 (bs, 18 H, NHCS), 5.08 (m, 4 H, H-2, H-2’), 4.90 (m, 4 H, H-4, H-4’), 4.26 (dd, 2H, H-6a”), 4.15 (dd, 2H, H-6b”), 3.85 (m, 4 H, H-5, H-5’), 3.80-3.53 (m, 44 H, H-6, H-6’, H-1Hex, CH2O, CH2NHCS), 3.70 (m, 2 H, H-5”), 3.20 (s, 24 H, CH2NH2HCl), 2.83 (s, 24 H, CH2N), 2.75 (m, 2 H, H-4”), 2.72-2.53 (m, 36 H, CH2S, NCH2CH2N, SCH2CH2NH2), 2.27 (m, 24 H, H-2Hex), 1.83 (s, 12 H, CH2CH2O), 1.50 (m, 24 H, H-3Hex), 1.27 (m, 24 H, H-4Hex, H-5Hex), 0.83 (bt, 36 H, H-6Hex). 13C NMR (125.7 MHz, DMSO-d6, 343 K): δ = 184.7 (CS), 172.8, 172.3 (CO), 91.1 (C-1, C-1’, C-1”), 71.38, 70.35 (C-3, C-3’, C-3”, CH2O), 69.5, 69.4, 69.2 (C-2, C-2’, C-2”, C-4, C-4’, C-4”, C-5, C-5’, C-5”), 62.3 (C-6a”, C-6b”), 51.6 (CH2N), 44.4, 44.1 (C- 6, C-6’), 37.5 (CH2NH2), 34.0, 33.8 (C-2Hex), 31.0, 30.9 (CH2CH2O), 29.3, 28.8 (CH2S), 27.1 (C-4Hex), 24.8 (SCH2CH2NH2), 24.2 (C-3Hex), 22.1 (C-5Hex), 13.9 (C-6Hex). ESIMS: m/z = 1385.7 [M + 3 H]3+. Anal. Calcd for C183H348N36O39S15·12 HCl·6 H2O: C, 46.73; H, 7.97; N, 10.72; S, 10.22. Found: C, 46.75; H, 7.90; N, 10.47; S, 10.01. Unit 1,1’-(dodeca-O-myristoyl)-unit 1’’-[hexa-O-(2-N,N-di-(2-aminoethyl)- ethylthioureidoethylthiopropyl)]-CT3 (CT3 HL2) (36). Treatment of 34 (70 mg, 0.010 mmol) with 1:1 TFA-DCM (4 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 36. Yield: 59 mg (quantitative). Rf = 0.15 (4:1:1 CH3CN-H2O-NH4OH); [a]D = +18.4 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 244 nm (εmM = 35.4). Experimental Part 259 indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 43. Yield: 60 mg (quantitative). [α]D = +47.1 (c 1.0, MeOH); UV (MeOH): λmax 242 nm (εmM = 36.5). 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 5.35 (m, 6 H, H-1, H-1’, H-1”), 3.95- 3.90 (m, 6 H, H-5, H-5’, H-5”), 3.90-3.60 (m, 42 H, H-6, H-6’, H-6”, CH2O), 3.64-3.6 (m, 6 H, H-3, H-3’, H-3”), 3.31 (m, 6 H, H-2, H-2’, H-2”), 3.21 (m, 24 H, CH2N), 3.05- 3.01 (m, 6 H, H-4, H-4’, H-4”), 2.91-2.86 (m, 24 H, SCH2CH2N), 2.79-2.68 (m, 24 H, CH2S), 1.96-1.86 (m, 24 H, CH2CH2O), 1.63-1.55 (m, 12 H, CH2), 1.45-1.31 (m, 36 H, CH2), 0.95-0.90 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 183.4 (CS), 91.4, 91.1 (C-1, C-1’, C-1”), 80.9 (C-3, C-3’, C-3”), 80.5 (C-2, C-2’, C-2”), 80.1, 79.8 (C-4, C-4’, C-4”), 73.0, 72.4, 71.3, 71.1 (C-5, C-5’, C-5”, CH2O), 70.0, 69.5 (CH2O), 38.8 (CH2N), 31.7, 31.5 (CH2), 30.2 (SCH2CH2NH), 29.2 (CH2CH2O), 28.5, 28.4, 28.2 (CH2S), 25.6 (CH2), 22., 22.3 (CH2), 13.1, 13.01, 12.9 (CH3). ESIMS: m/z = 3059.0 [M + H]+, 1529.9 [M + 2 H]2+. Anal. Calcd for C135H270N18O27S15·12 HCl: C, 46.38; H, 8.13; N, 7.21; S, 13.76. Found: C, 46.02; H, 7.73; N, 6.86; S, 13.39. Unit 1,1’-[dodeca-O-(2-aminoethylthiopropyl)]-unit 1’’-(hexa-O-tetradecyl)- CT3 (CT3 H2L) (44). Treatment of 42 (70 mg, 0.016 mmol) with 1:1 TFA-DCM (4 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 44. Yield: 51 mg (quantitative). [α]D = +17.2 (c 1.0, MeOH); UV (MeOH): λmax 241 nm (εmM = 41.1). 1H NMR (400 MHz, 5:1 CD3OD-D2O, 323 K): δ = 5.40-5.37 (m, 6 H, H-1, H- 1’,H-1”), 3.92-3.86 (m, 6 H, H-5, H-5’, H-5’’), 3.84-3.74 (m, 48 H, H-6, H-6’, H-6”, CH2O, H-1Hex), 3.59-3.51 (m, 6 H, H-3, H-3’, H-3”), 3.31 (m, 6 H, H-2, H-2’, H-2”), 3.21 (m, 24 H, CH2N), 3.05-3.01 (m, 6 H, H-4, H-4’, H-4”), 2.93-2.88 (m, 24 H, SCH2CH2N), 2.78-2.69 (m, 24 H, CH2S), 1.97-1.89 (m, 24 H, CH2CH2OCys), 1.44-1.42 (m, 12 H, CH2CH2OMyr), 1.32 (s, 132 H, CH2), 0.94 (t, 18 H, CH3). 260 Experimental Part 13C NMR (100.6 MHz, 5:1 CD3OD-D2O, 323 K): δ = 91.0 (C-1, C-1’, C-1”), 80.7 (C-3, C-3’, C-3”), 79.9 (C-2, C-2’, C-2”), 79.8 (C-4, C-4’, C-4”), 71.5, 71.4 (C-5, C- 5’, C-5”, CH2O), 69.7 (C-1Myr), 38.8 (CH2N), 31.8 (C-2Myr), 30.2 (SCH2CH2NH), 30.0 (CH2CH2O), 29.6 (CH2S), 29.5, 29.3, 28.9, 28.4, 27.9, 26.5, 26.4, 26.3, 26.0, 22.5 (CH2), 13.5 (CH3). ESIMS: m/z = 1865.8 [M + 2 H]2+. Anal. Calcd for C183H366N18O27S15·12 HCl: C, 52.72; H, 9.14; N, 6.05; S, 11.53. Found: C, 52.40; H, 8.87; N, 5.69; S, 11.16. O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O H N S H N N H S HN NH NH S S S S S S N H NH NH HN NH NH N HN N S NHR S NH NH NH S S N RHN N RHN N H N S RHN S H N H N S S NHR NH N S NHR S NH NH S N SNH N H SN S N HN H S N 45, n = 1, R = Boc 46, n = 9, R = Boc 47, n = 1, R = H·HCl 48, n = 9, R = H·HCl Unit 1 Unit 1’ Unit 1’’ S H N H N S N RHN RHN N RHN RHN RHN RHN RHN RHN RHN NHR NHR NHR NHR NHR ( ) n( ) n ( ) n ( ) n ( ) n ( ) n NHR NHR S H NHN S N NHR NHR Unit 1,1’-[dodeca-O-(2-N,N-di-(2-tert-butoxycarbonyl-aminoethyl)ethylthioureidoethylthiopropyl]-unit 1’’-[hexa-O-hexanoyl)-CT3 (CT3 H2L Bocprotected) (45). Compound 45 was obtained from 43 (0.045 mmol) and 98 (0.045 mmol) following the general procedure above described. Column chromatography (3:1 EtOAccyclohexane → 45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 55 mg (71%). Rf = 0.70 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [a]D = +19.4 (c 1.0, MeOH); UV (MeOH): λmax 243 nm (εmM = 201.5). Experimental Part 261 1H NMR (400 MHz, CDCl3, 333 K): δ = 5.11 (m, 6 H, H-1, H-1’, H-1’’), 3.96- 3.68 (m, 60 H, CH2O, NCH2CH2NHCS), 3.59 (m, 48 H, NCH2CH2NHCS), 3.18 (m, 24 H, NCH2CH2NH2), 2.80 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.70 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.61 (m, 24 H, CH2S), 1.95 (m, 24 H, CH2CH2OCys), 1.61 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.48 (m, 216 H, CMe3), 1.35 (m, 36 H, CH2), 0.93 (s, 18 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ = 182.3 (CS), 157.1 (CO), 79.8 (CMe3), 55.4 (NCH2CH2), 53.9 (CH2N), 43.9 (CH2NHCS), 39.1 (CH2NHBoc), 31.4 (CH2CH2O), 30.4 (SCH2CH2NHBoc), 29.8 (CH2S), 28.5 (CMe3), 25.8 (CH2), 14.2 (CH3). ESIMS: m/z = 2595.8 [M + 3 Na]3+. Anal. Calcd for C339H654N66O75S27: C, 52.74; H, 8.54; N, 11.97; S, 11.21. Found: C, 52.49; H, 8.37; N, 11.81; S, 10.94. Unit 1,1’-[dodeca-O-(2-N,N-di-(2-tert-butoxycarbonyl-aminoethyl)ethylthioureidoethylthiopropyl]-unit 1’’-[hexa-O-myristoyl)-CT3 (CT3 H2L Bocprotected) (46). Compound 46 was obtained from 44 (0.045 mmol) and 98 (0.045 mmol) following the general procedure above described. Column chromatography (3:1 EtOAccyclohexane → 45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 116 mg (99%). Rf = 0.55 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [a]D = +17.3 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 243 nm (εmM = 275.1). 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 333 K): δ = 5.19 (m, 6 H, H-1, H-1’, H-1’’), 3.97- 3.83 (m, 36 H, CH2O), 3.75 (m, 24 H, NCH2CH2NHCS), 3.54 (m, 48 H, NCH2CH2NHCS), 3.15 (m, 24 H, NCH2CH2NH2), 3.09 (m, 6 H, H-2, H-2’, H-2’’), 2.98 (m, 6 H, H-4, H-4’, H-4’’), 2.80 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.72 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.62 (m, 24 H, CH2S), 1.95 (m, 24 H, CH2CH2Ocys), 1.60 (m, 12 H, CH2CH2Omyr), 1.47 (m, 216 H, CMe3), 1.32 (bs, 132 H, CH2), 0.91 (t, 18 H, 3JH,H = 6.5 Hz, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 182.0 (CS), 158.3 (CO), 91.3 (C-1, 1’, 1’’), 81.2 (C-3, C-2, C-4), 80.2 (CMe3), 71.8 (CH2O), 70.5 (C-5, 5’, 5’’), 54.4 (NCH2CH2NHCS), 54.1 (CH2N), 43.9 (CH2NHCS), 35.8 (CH2NHBoc), 31.6 (CH2CH2O), 30.6 (SCH2CH2NHBoc), 29.4 (CH2S), 28.4 (CH2), 27.5 (CMe3), 22.3 (CH2), 13.1 (CH3). 262 Experimental Part ESIMS: m/z = 1679.6 [M + 5 H]5+, 2099.2 [M + 4 H]4+. Anal. Calcd for C387H750N66O75S27: C, 55.37; H, 9.01; N, 11.01; S, 10.31. Found: C, 55.18; H, 8.79; N, 10.71; S, 9.97. Unit 1,1’-[dodeca-O-(2-N,N-di-(2-aminoethyl)ethylthioureidoethylthiopropyl)]-unit 1’’-(hexa-O-hexanoyl)-CT3 (CT3H2L) (47). Treatment of 45 (55 mg, 0.010 mmol) with 1:1 TFA-DCM (3 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 47. Yield: 38 mg (quantitative); [a]D = +11.4 (c 0.8, MeOH); UV (DCM): λmax 242 nm (εmM = 142.0). 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δ = 3.87-3.41 (m, 108 H, CH2O, NCH2CH2NHCS, NCH2CH2NHCS), 3.05 (m, 24 H, NCH2CH2NH2), 2.80 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.67 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.65 (m, 24 H, CH2S), 1.82 (m, 24 H, CH2CH2OCys), 1.51 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.24 (m, 36 H, CH2), 0.83 (s, 18 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CD3OD): δ = 52.7 (NCH2CH2NHCS), 52.2 (CH2N), 42.5 (CH2NHCS), 38.7 (CH2NH2HCl), 31.7 (SCH2CH2NH) 30.7 (CH2CH2O), 29.7 (CH2S), 27.2, 23.8 (CH2), 14.5 (CH3). ESIMS: 2660.6 [M + H]2+. Anal. Calcd for C219H462N66O27S27·24 HCl: C, 42.47; H, 7.91; N, 14.93; S, 13.98. Found: 42.52; H, 7.59; N, 14.67; S, 13.60. Unit 1,1’-[dodeca-O-(2-N,N-di-(2-aminoethyl)ethylthioureidoethylthiopropyl)]-unit 1’’-(hexa-O-myristoyl)-CT3 (CT3 H2L) (48). Treatment of 46 (71 mg, 0.010 mmol) with 1:1 TFA-DCM (4 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 48. Yield: 61 mg (quantitative); [a]D = +16.8 (c 1.0, MeOH); UV (DCM): λmax 242 nm (εmM = 125.9). 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 5.34 (m, 6 H, H-1, H-1’, H-1’’), 3.94 (m, 36 H, CH2O), 3.85 (m, 24 H, NCH2CH2NHCS), 3.74 (m, 48 H, NCH2CH2NH2), 3.69 (m, 24 H, NCH2CH2NHCS), 3.15 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.90 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.80 Experimental Part 263 (m, 24 H, CH2S), 1.94 (m, 24 H, CH2CH2Ocys), 1.62 (m, 12 H, CH2CH2Omyr), 1.33 (bs, 132 H, CH2), 0.92 (t, 18 H, 3JH,H = 6.5 Hz, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, D2O): δ = 51.9 (NCH2CH2NHCS), 50.0 (CH2N), 44.7 (CH2NHCS), 36.5 (CH2NH2), 32.1 (SCH2CH2), 30.0 (CH2CH2O), 29.6 (CH2S), 28.1, 26.6, 22.7 (CH2), 14.1 (CH3). Anal. Calcd for C267H558N66O27S27·24 HCl·6 H2O: C, 45.98; H, 8.58; N, 13.25; S, 12.41. Found: 46.03; H, 8.64; N, 13.18; S, 12.33. Polycationic star-type CT2 cyclotrehalans General procedure for the preparation of Boc-protected star-type CT2 and CT3 cyclotrehalans. To a solution of the diamine trehalose derivative 97 and DMAP (2 equiv) in pyridine, a solution of the corresponding diisothiocyanato trehalose derivative (20, 28 para CT2-G0 y CT3-G0, respectivamente) in pyridine was slowly added and the mixture was stirred at 40 ºC overnight. The mixture was concentrated and the resulting residue purified by column chromatography using the solvent indicated in each case. 264 Experimental Part Boc-protected CT2-G0 (49). To a solution of the diamine 97 (250 mg, 0.15 mmol) and DMAP (329 mg, 2.7 mmol) in pyridine (16 mL), diisothiocyanate 20 (254 mg, 0.15 mmol) was slowly added and the mixture was stirred at 40 ºC overnight. The mixture was concentrated and the resulting residue purified by column chromatography (3:2 → 3:1 EtOAc-cyclohexane). Yield: 405 mg (81%). Rf = 0.45 (3:2 EtOAccyclohexane); [a]D = +104.7 (c 1.0, DCM); UV (DCM): λmax 251 nm (εmM = 34.9). 1H NMR (400 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 6.80 (bs, 4 H, NHCS), 5.18-4.96 (m, 12 H, NHBoc), 5.04 (d, 4 H, J1,2 = 3.7 Hz, H-1), 3.88-3.42 (m, 32 H, CH2O, H-6ab), 3.85 (m, 4 H, H-5), 3.57 (t, 4 H, J2,3 = J3,4 = 9.1 Hz, H-3), 3.31 (m, 24 H, CH2N), 3.23 (dd, 4 H, H-2), 3.13 (bt, 2 H, J4,5 = 9.1 Hz, H-4), 2.68-2.60 (m, 48 H, SCH2CH2NHBoc, CH2S), 1.91-1.83 (m, 24 H, CH2CH2O), 1.45 (bs, 108 H, CMe3). 13CNMR (100.6 MHz, CDCl3): δ = 181.8 (CS), 155.8 (CO), 92.0 (C-1), 81.1 (C- 3), 80.2 (C-2), 79.3 (CMe3), 78.0 (C-4), 71.8 (C-5, CH2O), 70.4 (CH2O), 40.1 (CH2NHBoc, C-6), 32.3, 32.2 (SCH2CH2), 30.6, 30.1 (CH2CH2O), 28.6, 28.5 (CH2S), 28.4 (CMe3). Experimental Part 265 ESIMS: m/z = 3395.8 [M + Na]+, 1709.9 [M + 2 Na]2+. Anal. Calcd for C146H272N16O42S14: C, 51.99; H, 8.13; N, 6.64; S, 13.31. Found: C, 51.75; H, 7.88; N, 6.39; 12.99. Polycationic CT2-G0 (50). Treatment of 49 (235 mg, 0.069 mmol) with 1:1 TFA-DCM (3 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage) yielded 50. Yield: 182 mg (98%). Rf = 0.50 (4:1 CH3CN-H2O-NH4OH); [a]D = +50.7 (c 1.0, MeOH); UV (MeOH): λmax 247 nm (εmM = 19.2). 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 333 K): δ = 5.19 (d, 4 H, J1,2 = 3.3 Hz, H-1), 3.96- 3.84 (m, 24 H, CH2O), 3.93 (m, 4 H, H-5), 3.74 (bt, 4 H, H-4), 3.66 (t, 4 H, J2,3 = J3,4 = 9.2 Hz, H-3), 3.33 (m, 4 H, H-2), 3.22-3.17 (m, 32 H, CH2N, H-6a, H-6b), 2.90-2.86 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.76-2.71 (m, 24 H, CH2S), 1.97-1.90 (m, 24 H, CH2CH2O). 13CNMR (125.7 MHz, CD3OD, 333 K): δ = 187.2 (CS), 94.2 (C-1), 83.7 (C-3), 82.7 (C-2), 81.4 (C-4), 74.0 (CH2O), 73.8 (C-5), 72.7 (CH2O), 48.0 (C-6), 41.6, 41.5 (CH2NH2), 32.9, 32.7, 32.6 (SCH2CH2), 31.2, 30.8, 30.6 (CH2CH2O, CH2S). HR-ESIMS: m/z = 1085.97 [M + 2 H]2+, 724.65 [M + 3 H]3+, 543.74 [M + 4 H]4+, 435.19 [M + 5 H]5+. Anal. Calcd for C86H176N16O18S14·12HCl: C, 39.59; H, 7.26; N, 8.59; S, 17.20. Found: C, 39.31; H, 7.00; N, 8.26; S, 16.90. 266 Experimental Part Boc-protected CT2-G1 (51). To a solution of 50 (84 mg, 0.03 mmol) and DMAP (94 mg, 0.768 mmol) in pyridine (10 mL), 98 (165 mg, 0.42 mmol) was slowly added and the mixture was stirred 24 h at 40 ºC. The mixture was concentrated and the resulting residue purified by column chromatography (1:1 EtOAccyclohexane®EtOAc®45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 150 mg (70%). Rf = 0.82 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [a]D = +31.3 (c 1.0, DCM). 1H NMR (400 MHz, CDCl3, 333 K): δ = 7.28-7.00 (m, 28 H, NHCS), 5.22-5.01 (m, 24 H, NHBoc), 5.06 (bd, 4 H, H-1), 3.88 (m, 4 H, H-5), 3.87-3.51 (m, 76 H, CH2N, CH2O, H-3, H-6), 3.27 (m, 4 H, H-2), 3.13 (bs, 52 H, CH2NHBoc, H-4), 2.77 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.68 (m, 48 H, CH2S, NCH2CH2NHCS), 2.58 (m, 48 H, CH2N), 1.90 (m, 24 H, CH2CH2O), 1.46 (bs, 216 H, CMe3). 13CNMR (100.6 MHz, CDCl3, 333 K): δ = 183.1 (CS), 156.5 (CO), 92.2 (C-1), 81.1 (C-3), 79.6, 79.5 (C-2, CMe3), 77.8 (C-4), 71.8 (C-5), 71.8, 70.5 (CH2O), 55.2, 55.0, Experimental Part 267 54.1, 54.0 (CH2N, NCH2CH2NHCS), 44.0, 43.9, 42.6 (CH2NHCS), 39.3 (CH2NHBoc), 31.5 (SCH2CH2), 30.8, 30.3, 29.5 (CH2CH2O), 28.7, 28.5 (CH2S, CMe3). ESIMS: m/z = 3459.8 [M + 2 Na]2+. Anal. Calcd for C290H560N64O66S26: C, 50.97; H, 8.26; N, 13.12; S, 12.20. Found: C, 50.81; H, 7.98; N, 12.75; S, 11.70. Polycationic CT2-G1 (52). Compound 52 was obtained by treatment of 51 (148 mg, 0.022 mmol) with 1:1 TFA-DCM (4 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage). Yield: 116 mg (quantitative). [a]D = +35.0 (c 1.0, MeOH); UV (H2O): λmax 239 nm (εmM = 195.3). 1H NMR (400 MHz, D2O, 343 K): δ = 5.59 (bs, 4 H, H-1), 4.37 (bs, 4 H, H-5), 4.34-4.13 (m, 28 H, CH2O, H-3), 4.09 (m, 24 H, CH2NHCS), 4.04 (bt, 24 H, CH2NHCS), 3.85 (m, 4 H, H-2), 3.68 (m, 4 H, H-4), 3.61 (t, 24 H, 3JH,H = 6.4 Hz, CH2NH2), 3.56 (m, 4 H, H-6a), 3.43 (m, 4 H, H-6b), 3.40 (m, 48 H, CH2N), 3.30 (m, 24 H, NCH2CH2NHCS), 3.21 (bt, 24 H, SCH2CH2), 3.12 (bt, 24 H, CH2S), 2.34 (m, 24 H, CH2CH2O). 13CNMR (100.6 MHz, D2O, 343 K): δ = 181.5 (CS), 92.1 (C-1), 80.6 (C-3), 80.0, 78.7 (C-2, C-4), 72.2 (CH2O), 71.4 (C-5), 71.1 (CH2O), 52.1 (NCH2CH2NHCS), 51.1 (CH2N), 44.2, 41.4 (CH2NHCS), 37.4 (CH2NH2), 31.0 (SCH2CH2, CH2), 30.5, 30.3 (CH2CH2O), 28.6, 28.5 (CH2S), 24.7, 24.6, 24.5 (CH2), 22.3, 22.2 (CH2), 13.1, 13.0 (CH2). ESIMS: m/z = 866.4 [M + 5 H]5+, 633.7 [M + 7 H]7+. Anal. Calcd for C170H368N64O18S26·24 HCl·12 H2O: C, 34.26; H, 7.24; N, 15.04; S, 13.99. Found: C, 34.21; H, 7.33; N, 14.91; S, 13.64. 268 Experimental Part Boc-protected CT2-G2 (53). To a solution of 52 (80 mg, 0.02 mmol) and DMAP (105 mg, 0.86 mmol) in pyridine (8 mL), 98 (183 mg, 0.47 mmol) was slowly added and the mixture was stirred 24 h at 40 ºC. The mixture was concentrated, and the resulting residue purified by column chromatography (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 112 mg (45%). Rf = 0.71 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [a]D = +53.2 (c 1.0, MeOH). UV (MeOH): λmax 242 nm (εmM = 174.7). 1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.13 (m, 4 H, H-1), 3.88 (m, 4H, H-5), 3.80- 3.50 (m, 456 H, NCH2CH2NH2, NCH2CH2NHCS, NCH2CH2NH2, CH2O, NCH2CH2NHCS), 3.17 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.69 (m, 24 H, SCH2CH2), 2.61 (m, 24 H, CH2S), 1.88 (m, 24 H, CH2CH2O), 1.44 (s, 432 H, CMe3). 13C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 182.7 (CS), 156.7 (CO), 92.2 (C-1), 79.4 (CMe3), 71.8 (CH2O), 54.6 (NCH2CH2NH2), 53.8 (NCH2CH2NHCS), 52.9 (SCH2CH2), Experimental Part 275 (CH2CH2NHBoc), 39.2 (CH2NHBoc), 31.5 (SCH2CH2), 31.5 (CH2CH2O), 30.8 (CH2), 29.2 (CH2S), 28.1 (CMe3). Anal. Calcd for C435H840N96O99S39: C, 50.97; H, 8.26; N, 13.12; S, 12.20. Found: C, 50.62; H, 7.90; N, 12.76; S, 11.89 Polycationic CT3-G1 (60). Compound 60 was obtained by treatment of 59 (70 mg, 0.007 mmol) with 1:1 TFA-DCM (2 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage). Yield: 46 mg (quantitative); [α]D = +2.55 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 242 nm (εmM = 122.4). 1H NMR (500 MHz, 5:1 DMSO-D2O 333 K): δ = 5.26 (m, 6 H, H-1), 3.73 (m, 6 H, H-5), 3.62 (m, 36 H, CH2O), 3.54 (m, 72 H, NCH2CH2NH, NHCH2), 3.23 (m, 6 H, H- 3), 3.09 (m, 6 H, H-2), 2.94 (m, 36 H, CH2N), 2.86 (m, 6 H, H-4), 2.73 (m, 36 H, CH2NHBoc), 2.62 (m, 36 H, CH2CH2N), 1.77 (m, 36 H, SCH2CH2), 1.67 (m, 36 H, CH2S), 1.45 (m, 36 H, CH2CH2O). 13C NMR (125.7 MHz, D2O): δ = 72.3 (CH2O), 50.6 (CH2N), 44.6 (NCH2CH2NH), 38.9 (CH2N), 37.6 (CH2CH2NH2), 36.6 (CH2NH2), 35.4 (SCH2CH2NH), 29.9 (CH2CH2O), 28.1 (CH2S). ESIMS: m/z = 950.49 [M + 7 H]7+. Anal. Calcd for C255H552N96O27S39·36 HCl·18H2O: C, 34.26; H, 7.24; N, 15.04; S, 13.99. Found: C, 34.18; H, 7.36; N, 14.87; S, 13.81. 276 Experimental Part Boc-protected CT3-G2 (61). To a solution of 60 (70 mg, 0.01 mmol) and DMAP (46 mg, 0.38 mmol) in pyridine (8 mL), 98 (153 mg, 0.40 mmol) was slowly added and the mixture was stirred 24 h at 40 ºC. The reaction mixture was stirred at rt for 24 h, the solvents were evaporated and the residue was purified by column chromatography (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 143 mg (69%) Rf = 0.33 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [a]D = +12.4 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 255 nm (εmM = 110.2). 1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.44 (m, 6 H, H-1), 3.89 (m, 6 H, H-5), 3.65 (m, 324 H, NCH2CH2NH, NCH2CH2NHCS, CH2O, CH2NH), 3.20 (m, 108 H, CH2NHBoc, CH2CH2NHBoc, CH2N), 2.68 (m, 108 H, CH2S, SCH2CH2NH), 1.89 (m, 36 H, CH2CH2O), 1.45 (m, 648 H, CMe3). Experimental Part 277 13C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 182.7 (CS), 156.9 (CO), 79.4 (CMe3), 71.6 (CH2O), 54.6 (CH2N), 53.8 (NCH2CH2NH), 44.0 (CH2CH2NHBoc), 42.2 (CH2N), 39.6 (C-6), 38.7 (CH2NHBoc), 30.9 (SCH2CH2), 30.7 (CH2CH2O), 29.6 (CH2S), 28.4 (CMe3). Anal. Calcd for C867H1704N240O171S75: C, 50.47; H, 8.32; N, 16.29; S, 11.65. Found: C, 50.19; H, 7.95; N, 15.90; S, 11.32. Polycationic CT3-G2 (62). Compound 62 was obtained by treatment of 61 with 1:1 TFA-DCM (4 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage). Yield: 75 mg (quantitative). [a]D = +3.5 (c 1.0, MeOH); UV (MeOH): λmax 258 nm (εmM = 107.5). 1H NMR (500 MHz, D2O, 323 K): δ = 5.49 (bs, 6 H, H-1), 4.51 (m, 6 H, H-5), 4.20 (m, 144 H, NCH2CH2NH2), 4.04 (m, 6 H, H-3), 4.00 (m, 144 H, NCH2CH2NHCS), 3.80 (m, 144 H, NCH2CH2NH2), 3.66 (m, 6 H, H-2), 3.53 (m, 6 H, H-4), 3.29 (m, 180 H, NCH2CH2NHCS), 3.14 (m, 36 H, SCH2CH2), 3.00 (m, 36 H, SCH2CH2), 2.89 (m, 36 H, CH2S), 2.12 (m, 36 H, CH2CH2O). 13C NMR (125.7 MHz, D2O, 323 K): δ = 182.6 (CS), 71.2 (CH2O), 53.9 (NCH2CH2NH2), 52.4 (NCH2CH2NHCS), 50.3 (SCH2CH2), 39.7 (NCH2CH2NHCS), 39.3 (NCH2CH2NH2), 35.0 (SCH2CH2), 29.7 (CH2CH2O), 28.0 (CH2S). MALDI-TOF MS, m/z calculated for [M + 5’-AAGCCCGCCCAA-3’ (DNAi)]+: 13425.76. Found: 13426.15. Mass accuracy: 29 ppm. 278 Experimental Part Boc-protected TEI CT3!(63).!To a solution of 58 (59 mg, 0.02 mmol) and DMAP (87 mg, 0.72 mmol) in pyridine (8 mL), 10 (224 mg, 0.35 mmol) was slowly added and the mixture was stirred 24 h at 40 ºC. The mixture was concentrated, and the resulting residue purified by column chromatography column chromatography (1:1 EtOAc-cyclohexane ® EtOAc ® 45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 149 mg (56%). Rf = 0.41 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [a]D = +13.4 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 254 nm (εmM = 54.7). 1H NMR (600 MHz, CD3OD): δ = 5.99 (m, 42 H, NHCS), 5.32 (m, 6 H, H-1), 5.21 (m, 18 H, NHBoc), 4.34 (m, 6 H, H-6), 4.20 (m, 6 H, H-5), 3.87 (m, 36 H, CH2O), 3.82 (m, 6 H, H-3), 3.56 (m, 72 H, NCH2CH2NHBoc), 3.39 (m, 36 H, NCH2CH2NHCS), 3.34 (m, 144 H, NCH2CH2N), 3.26 (m, 36 H, NCH2CH2NHCS), 3.16 (m, 36 H, SCH2CH2), 2.98 (m, 6 H, H-4), 2.72 (m, 72 H, CH2S, SCH2CH2), 1.88 (m, 36 H, CH2CH2O), 1.54 (bs, 162 H, NHCMe3), 1.44 (bs, 486 H, CMe3). Experimental Part 279 13C NMR (150.9 MHz, CD3OD): δ = 183.1 (CS), 155.9 (CO), 92.0 (C-1), 81.0 (C-3), 80.4 (C-2), 80.1 (CMe3), 79.5 (C-4), 71.6 (CH2O), 70.0 (C-5), 51.1 (CH2CH2N), 46.6 (NCH2CH2N), 44.8 (NCH2CH2NHCS), 42.4 (NCH2CH2NHCS), 39.7 (C-6), 38.4 (CH2N), 34.0 (SCH2CH2), 31.7 (SCH2CH2), 30.5 (CH2CH2O), 28.1 (CH2S), 27.9 (CMe3). Anal. Calcd for C651H1218N114O171S39: C, 53.45; H, 8.39; N, 10.91; S, 8.55. Found: C, 53.62; H, 8.57; N, 11.26; S, 8.74. Polycationic TEI CT3 (64). Compound 64 was obtained by treatment of 63 with 1:1 TFA-DCM (4 mL) as indicated in general methods (Boc cleavage). Yield: 102 mg (quantitative). [a]D = +9.2 (c 1.0, MeOH); UV (MeOH): λmax 250 nm (εmM = 48.0). 1H NMR (500 MHz, D2O, 353 K): δ = 5.79 (m, 6 H, H-1), 4.68 (m, 6 H, H-5), 4.53 (m, 36 H, NHCH2CH2NH2), 4.47 (m, 36 H, CH2O), 4.40 (m, 6 H, H-3), 4.28 (m, 36 H, NHCH2CH2NH2), 4.04 (m, 36 H, NHCH2CH2NHCS), 3.96 (m, 144 H, NHCH2CH2NH), 3.90 (m, 36 H, NHCH2CH2NHCS), 3.87 (m, 36 H, SCH2CH2), 3.69 (m, 6 H, H-2), 3.44 (m, 6 H, H-4), 3.36 (m, 36 H, SCH2CH2), 3.27 (m, 36 H, CH2S), 2.49 (m, 36 H, CH2CH2O). 13C NMR (125.7 MHz, D2O): δ = 72.1 (CH2O), 48.0 (NHCH2CH2NH2), 44.8 (NHCH2CH2NH), 43.6 (NHCH2CH2NHCS), 43.5 (NHCH2CH2NHCS), 40.2 (NHCH2CH2NH2), 35.4 (SCH2CH2), 30.2 (SCH2CH2), 29.8 (CH2CH2O), 27.9 (CH2S). MALDI-TOF MS, m/z calculated for [M + 5’-AAGCCCGCCCAA-3’ (DNAi)]+: 11006.86. Found: 11008.04. Mass accuracy: 24 ppm. 280 Experimental Part Janus-type glycocationic cyclotrehalans Unit 1 Unit 1’ O O O O O O O O O X N3 65, X = NH2 66, X = NCS 6’-Amino-6-azido-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-hexyl- a , a '-trehalose (65). To a mixture of 11 (1.7 g, 2.0 mmol), Et3N (0.55 mL, 3.9 mmol) and propane-1,3- dithiol (13 µL, 0.2 mmol) in propanol (17 mL), NaBH4 (82 mg, 2.2 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at 40 ºC for 6 h, and then H2O (2 mL) was added and the solvents were evaporated at reduced pressure. The residue was purified by column chromatography (1:10 → 1:2 EtOAc-cyclohexane). Yield: 412 mg (24%). Rf = 0.38 (1:2 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +83.3 (c 1.0, DCM); IR (ATR): umax = 2099 cm-1. 1H NMR (500 MHz, CDCl3): d = 5.11 (d, 2 H, J1,2 = 3.7 Hz, H-1, H-1’), 4.10 (m, 1 H, H-5), 4.06 (m, 1 H, H-5’) 3.89-3.51 (m, 12 H, CH2O), 3.44-3.41 (m, 2 H, H-3, H-3’), 3.28-3.11 (m, 4 H, H-6a, H-6a’, H-6b’, H-6b), 3.25 (dd, 2 H, J2,3 = 9.7 Hz, H-2, H-2’), 2.97 (dd, 2 H, J4,3 = J4,5 = 9.7 Hz, H-4, H-4’), 1,68 (s, 2 H, NH2), 1.62-1.55 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.33 (m, 18 H, CH2), 0.92 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3): d = 93.3 (C-1, C-1’), 81.0 (C-3, C-3’), 80.9 (C-2, C-2’), 78.5 (C-4, C-4’), 74.6, 73.0, 71.2 (CH2O), 69.9 (C-5, C-5’), 51.5 (C-6, C-6’), 31.2, 30.9, 25.5, 22.5 (CH2), 13.9 (CH3). ESIMS: m/z = 871.30 [M + H]+. Anal. Calcd for C48H94N4O9: C, 66.17; H, 10.87; N, 6.43. Found: C, 65.93; H, 11.00; N, 6.28. 6-Azido-6,6’-dideoxy-6’-isothiocyanato-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-hexyl- a , a '- trehalose (66). To a mixture of monoamine 65 (80 mg, 0.09 mmol) and CaCO3 (27 mg, Experimental Part 281 0.27 mmol) in H2O-acetone (1:1, 3 mL), CSCl2 (10 µL, 0.14 mmol) was added. The reaction was stirred vigorously for 2 h. The organic layer was decanted, dried (MgSO4), filtered and concentrated. The resulting residue was purified by column chromatography (1:60 EtOAc-cyclohexane). Yield: 70 mg (83%). Rf = 0.53 (1:10 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +114.3 (c 1.0, DCM); IR (ATR): umax = 2099 cm-1. 1H NMR (500 MHz, CDCl3): d = 5.16 (d, 2 H, J1,2 = 3.7 Hz, H-1, H-1’), 4.06 (m, 2 H, H-5, H-5’), 3.89-3.52 (m, 16 H, CH2O, H-6a, H-6’a H-6b, H-6’b), 3.43-3.41 (m, 2 H, H-3, H-3’), 3.30-3.26 (m, 2 H, H-2, H-2’), 3.21-3.14 (m, 2 H, H-4, H-4’), 1.65-1.54 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.33 (m, 36 H, CH2), 0.99 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3): d = 93.3 (C-1, C-1’), 81.0 (C-3, C-3’), 80.9 (C-2, C-2’), 78.5 (C-4, C-4’), 74.6, 73.0, 71.2 (CH2O), 69.9 (C-5, C-5’), 51.5 (C-6, C-6’), 31.2, 30.9, 25.5, 22.5 (CH2), 13.9 (CH3). ESIMS: m/z = 935.58 [M + Na]+. Anal. Calcd for C49H92N4O9S: C, 64.44; H, 10.15; N, 6.13; S, 3.51. Found: C, 64.71; H, 10.21; N, 5.88; S, 3.20. O O O O O O O O S O S S S S S NH2 N3 BocHN NHBoc NHBoc NHBoc BocHN NHBoc 67 Unit 1 Unit 1’ 6’-Amino-6-azido-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-(3-(2-N-tert-butoxy- carbonylaminoethylthio)propyl)-α,α'-trehalose (67). To a mixture of 100 (200 mg, 0.12 mmol), Et3N (0.03 mL, 0.23 mmol) and propane-1,3-dithiol (0.81 µL, 0.01 mmol) in propanol (14 mL), NaBH4 (5 mg, 0.13 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at 40 ºC for 6 h, and then H2O (1 mL) was added and the solvents were evaporated at reduced pressure. The residue was purified by column chromatography (1:1 EtOAc- 282 Experimental Part cyclohexane). Yield: 114 mg (29%). Rf = 0.30 (1:1 EtOAc-cyclohexane). [a]D = +45.5 (c 1.0, DCM); IR (ATR): umax = 2099, 1690 cm-1. 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 5.15 (d, 2 H, J1,2 = 3 Hz, H-1, H-1’), 5.01 (bs, 6 H, NH), 3.90 (m, 2 H, H-5, H-5’), 3.89-3.65 (m, 12 H, CH2O), 3.60-3.58 (m, 2 H, H-3, H-3’), 3.47 (dd, 2 H, J6a,6b = 12.1 Hz, J5,6a = 3.5 Hz, H-6a, H-6’a), 3.41 (dd, 2 H, J5,6b = 3.7 Hz, H-6b, H-6’b), 3.33 (m, 12 H, CH2N), 3.19 (dd, 2 H, J2,3 = 9.1 Hz, H-2, H- 2’), 3.08 (m, 2 H, H-4, H-4’), 2.69-2.60 (m, 24 H, SCH2CH2NHBoc, CH2S), 1.92-1.83 (m, 12 H, CH2CH2O), 1.47 (s, 54 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3): δ = 156.4 (CO), 93.2 (C-1, C-1’), 81.4 (C-3, C- 3’), 80.9 (C-2, C-2’), 79.6 (CMe3), 79.0 (C-4, C-4’), 71.8, 71.2 (CH2O), 70.5 (C-5, C-5’), 51.6 (C-6, C-6’), 40.2 (CH2N), 32.0 (SCH2CH2NHBoc), 30.1 (CH2CH2O), 28.5 (CMe3), 27.9 (CH2S). ESIMS: m/z = 1669.28 [M + H]+. Anal. Calcd for C72H136N10O21S6: C, 51.77; H, 8.21; N, 8.39; S, 11.52. Found: C, 52.01; H, 8.29; N, 8.23; S, 11.19. NI-[6’-Azido-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-(3-(2-N-tert-butoxycarbonyl- aminoethylthio)propyl)-α,α'-trehalos-6-yl]-NII-[6-azido-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’- hexa-O-hexyl- a , a '-trehalos-6-yl]thiourea (68). To a solution of 67 (250 mg, 0.15 mmol) and Et3N (0.06 mL, 0.45 mmol) in pyridine (15 mL), a solution of 66 (146 mg, 0.15 mmol) in pyridine (15 mL) was slowly added and the mixture was stirred 24 h at 40 ºC. The mixture was concentrated and the resulting residue purified by column Experimental Part 283 chromatography (1:2 EtOAc-cyclohexane). Yield: 324 mg (84%). Rf = 0.73 (1:1 EtOAccyclohexane); [a]D = +114.6 (c 1.0, DCM); IR (ATR): nmax = 1709 cm-1; UV (MeOH): λmax 241 nm (εmM = 13.3). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 5.09-5.04 (m, 4 H, H-1), 4.13-3.96 (m, 4 H, H-5), 3.88-3.77 (m, 12 H, CH2OCys), 3.72-3.61 (m, 12 H, CH2OHex), 3.59-3.50 (m, 4 H, H-3), 3.47-3.39 (m, 8 H, H-6), 3.38-3.28 (m, 12 H, CH2N), 3.26-3.28 (m, 4 H, H-2), 3.08- 3.03 (m, 4 H, H-4), 2.68-2.61 (m, 24 H, SCH2CH2NHBoc, CH2S), 1.91-1.85 (m, 12 H, CH2CH2Ocys), 1.61-1.57 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.56 (s, 54 H, CMe3), 1.34 (m, 36 H, CH2), 0.91 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 155.7 (CO), 93.2 (C-1), 81.0 (C-3), 80.2 (C-2), 79.3 (CMe3), 78.9 (C-4), 73.4, 73.3 (CH2OHex), 71.9, 71.7 (CH2OCys), 70.8 (C- 5), 51.5 (C-6), 40.1 (CH2N), 32.3 (SCH2CH2NHBoc), 31.7 (CH2CH2OHex), 31-6 (CH2), 30.5 (CH2CH2OCys), 25.8, 22.5 (CH2), 28.4 (CMe3), 26.9 (CH2S), 13.9 (CH3). ESIMS: m/z = 2605.5 [M + Na]+. Anal. Calcd for C121H228N14O30S7: C, 56.25; H, 8.90; N, 7.59; S, 8.69. Found: C, 56.43; H, 9.03; N, 7.25; S, 8.41. NI-[6’-Amino-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’-hexa-O-(3-(2-N-tert-butoxycarbonyl- aminoethylthio)propyl)-α,α'-trehalos-6-yl]-NII-[6-amino-6,6’-dideoxy-2,3,4,2’,3’,4’- hexa-O-hexyl- a , a '-trehalos-6-yl]thiourea (69). To a solution of 68 (137 mg, 0.05 mmol) in THF (8 mL) was added TPP (55 mg, 0.21 mmol). The reaction was stirred at rt for 1 h. Then, NH4OH (0.8 mL) was added, and the reaction mixture was stirred for 16 h at 50 ºC. Solvents were evaporated at reduced pressure, and the resulting residue was purified by column chromatography (1:1 EtOAc-cyclohexane → EtOAc → 45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 128 mg (96%). Rf = 0.44 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [α]D = +53.3 (c 1.0, DCM); IR (ATR): υmax = 1701 cm-1; UV (MeOH): λmax 242 nm (εmM = 69.4). 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 5.21-5.16 (m, 4 H, H-1), 4.01-3.96 (m, 4 H, H-5), 3.95-3.78 (m, 12 H, CH2OCys), 3.78-3.76 (m, 8 H, H-6), 3.71-3.64 (m, 12 H, CH2OHex), 3.62-3.58 (m, 4 H, H-3), 3.34-3.31 (m, 4 H, H-2), 3.26-3.21 (m, 12 H, CH2N), 284 Experimental Part 3.19-3.10 (m, 4 H, H-4), 2.69-2.65 (m, 24 H, SCH2CH2NHBoc, CH2S), 1.94-1.89 (m, 12 H, CH2CH2Ocys), 1.64-1.58 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.47 (s, 54 H, CMe3), 1.39-1.36 (m, 36 H, CH2), 0.94 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (125.7 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 183.9 (CS), 156.8 (CO), 92.5 (C-1), 80.9 (C-3), 80.1 (C-2), 79.2 (CMe3), 78.2 (C-4), 73.0, 72.7 (CH2OHex), 71.5, 70.9 (CH2OCys), 70.7 (C-5), 45.2 (C-6), 40.3 (CH2N), 31.5 (SCH2CH2NHBoc), 30.2 (CH2CH2OHex), 30.1 (CH2), 30.5 (CH2CH2Ocys), 28.1 (CH2S), 27.5 (CMe3), 25.6, 22.3, 22.2 (CH2), 12.9 (CH3). ESIMS: m/z = 1266.28 [M + 2 H]2+. Anal. Calcd for C121H232N10O30S7: C, 57.41; H, 9.24; N, 5.53; S, 8.86. Found: C, 57.60; H, 9.32; N, 5.36; S, 8.55. General procedure for the preparation of Janus-type Glycocationic CT2 and Hecate Glycocationic CT3 cyclotrehalans. To a solution of the corresponding diamine trehalose derivative (18, 69) (0.045 mmol) and DMAP (17 mg, 0.135 mmol) in pyridine (4 mL), a solution of the corresponding diisothiocyanato trehalose derivative (20, 19) (0.045 mmol) in pyridine (4 mL) was slowly added and the mixture was stirred 24 h at 40 ºC. The mixture was concentrated, and the resulting residue purified by column chromatography using the solvent indicated in each case. Experimental Part 291 pressure and the residue was purified by column chromatography (4:1 EtOAccyclohexane). Yield: 192 mg (60%). [α]D = +28.0 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 249 nm (εmM = 44.1). 1H NMR (400 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 7.58-6.77 (m, 16 H, NHCS), 6.01-5.84 (m, 6 H, =CH), 5.70 (m, 12 H, H-1Lac, H-1’Lac), 5.37 (m, 12 H, H-2Lact, H-2’Lac), 5.24-5.11 (m, 24 H, H-4Lac, H-4’Lac, H-5Lac, H-5’Lac), 5.05 (m, 12 H, H-2Lact, H-2’Lac), 5.33-5.17 (m, 12 H, =CH2), 4.95 (dd, 2 H, J1’,2’ = 5 Hz, H-1’), 4.93 (m, 2 H, J1,2 = 5 Hz, H-1), 4.55 (m, 4 H, H-5, H-5’), 4.36-4.08 (m, 12 H, CH2OAllyl), 4.13 (m, 12 H, CH2OCys), 4.09 (m, 24 H, H- 6Lac, H-6’Lac), 3.81-3.57 (m, 24 H, H-3, H-3’, CH2N, H-6, H-6’), 3.35 (m, 2 H, H-2), 3.29 (m, 2 H, H-4), 3.25 (m, 2 H, H-4’), 3.22 (m, 2 H, H-2’), 2.74 (m, 12 H, SCH2CH2NH), 2.68 (m, 12 H, CH2S), 2.10 (7s, 126 H, CH3-Lac), 1.98 (m, 12 H, CH2CH2O). 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 184.4 (CS), 171.0-168.8 (CO), 135.4- 134.5 (=CH), 117.6-116.3 (=CH2), 82.8 (C-1Lac, C-1’Lac), 81.1 (C-3Lac, C-3’Lac), 75.9 (C- 4Lac, C-4’Lac), 71.1 (CH2OAllyl), 70.6 (CH2OCys), 70.3 (C-5, 5’), 69.3 (C-2Lac, C-2’Lac), 66.7 (C-5Lac, C-5’Lac), 60.5 (C-6Lac, C-6’Lac), 44.6 (C-6, C-6’), 44.5 (CH2N), 30.6 (SCH2CH2NH), 29.6 (CH2CH2O), 28.7 (CH2S), 20.8 (CH3-Lac). ESIMS: m/z = 2909.0 [M + Na]2+. Anal. Calcd for C236H344N16O120S14: C, 49.09; H, 6.01; N, 3.88; S, 7.77. Found: C, 48.87; H, 5.79; N, 3.62; S, 7.50. 292 Experimental Part Unit 1-[hexa-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl- a -D-lactosylthioureidoethylthio- propyl]-unit 1’-[hexa-O-(2-tert-butoxycarbonylaminoethylthiopropyl)]-CT2 (76). To a mixture of 75 (68 mg, 0.011 mmol) and 2-(tert-butoxycarbonylamino)ethanethiol (62 mg, 0.351 mmol) in MeOH (10 mL), AIBN (4 mg, 0.004 mmol) was added. The reaction mixture was irradiated at l = 254 nm under stirring at rt for 1h, and then the solvents were evaporated at reduced pressure. The residue was purified by column chromatography (1:1 EtOAc-cyclohexane ® 1:1 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 79 mg (quantitative). [α]D = +20.6 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 249 nm (εmM = 130.8). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 7.76-7.39 (m, 18 H, NHCS), 5.73 (m, 12 H, H-1Lac, H-1’Lac), 5.38 (m, 12 H, H-5Lac, H-5’Lac), 5.29-5.22 (m, 12 H, H-4Lac, H-4’Lac), 5.17-5.11 (m, 12 H, H-3Lac, H-3’Lac), 5.08-5.02 (m, 12 H, H-2Lac, H-2’Lac), 5.01-4.97 (m, 12 H, H-1, H-1’), 4.55 (m, 4 H, H-5, H-5’), 4.44-4.32 (m, 24 H, H-6Lac, H-6’Lac), 4.14-3.69 (m, 36 H, CH2OLac, CH2OCys, H-3, H-3’, H-6, H-6’), 3.74-3.57 (m, 8 H, H-2, H-2’, H-4, H- Experimental Part 293 4’), 3.32 (m, 12 H, CH2N), 2.74 (m, 24 H, SCH2CH2NH), 2.67 (m, 24 H, CH2S), 2.08 (7s, 126 H, CH3-Lac), 1.89 (m, 24 H, CH2CH2O),1.47 (s, 54 H, CMe3). 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ = 184.4 (CS), 171.7-169.0 (CO), 82.7 (C-1Lac, C-1’Lac), 79.4 (C-3Lac, C-3’Lac), 76.0 (C-4Lac, C-4’Lac), 71.1 (CH2OCys), 70.4 (CH2OLac), 69.0 (C-2Lac, C-2’Lac),"66.5 (C-5Lac, C-5’Lac),"62.0 (C-6Lac, C-6’Lac),"44.4 (C-6, C-6’), 39.9 (CH2N), 32.1 (SCH2CH2NH), 30.6 (CH2CH2O), 29.6 (CH2S), 28.4 (CH3-Lac), 20.7 (CMe3). ESIMS: m/z = 2301.4 [M + 3Na]3+. Anal. Calcd for C278H434N22O132S20: C, 48.83; H, 6.40; N, 4.51; S, 9.38. Found: C, 48.70; H, 6.18; N, 4.29; S, 9.11. Unit 1-[hexa-O- a -D-lactosylthioureidoethylthiopropyl]-unit 1’-[hexa-O-(2- aminoethylthiopropyl)]-CT2 (77). To a solution of 76 (92 mg, 0.013 mmol) in MeOH (5 mL), methanolic NaOMe (1M) in MeOH (56 µ L, until pH 9) was added at 0 ºC. The reaction mixture was further stirred for 30 min, and then neutralized with Amberlite IR- 120 (H+) ion-exchange resin. The resin was filtered off and the solution was concentrated. Compound 77 was obtained by further treatment of the resulting crude with 1:1 TFADCM (1mL) following the procedure described in general methods (Boc cleavage). Yield: 61 mg (quantitative). [α]D = +27.8 (c 1.0, MeOH); UV (MeOH): λmax 246 nm (εmM = 64.6). 1H NMR (600 MHz, 10:1 CD3OD-D2O): δ = 5.99 (m, 12 H, H-1Lac, H-1’Lac), 5.39 (m, 12 H, H-5Lac, H-5’Lac), 5.36-5.18 (m, 24 H, H-4Lac, H-4’Lac, H-3Lac, H-3’Lac), 5.14 (m, 12 H, H-2Lac, H-2’Lac), 5.01 (m, 4 H, H-1, H-1’), 4.50 (m, 4 H, H-5, H-5’), 4.34 (m, 24 H, H- 6Lac, H-6’Lac), 3.94-3.55 (m, 36 H, CH2OLac, CH2OCys, H-3, H-3’, H-6, H-6’), 3.51-3.42 (m, 8 H, H-2, H-2’, H-4, H-4’), 3.21 (m, 12 H, CH2N), 2.79 (m, 24 H, SCH2CH2NH), 2.73 (m, 24 H, CH2S), 1.93 (m, 24 H, CH2CH2O). 13C NMR (150.9 MHz, 10:1 CD3OD-D2O): δ = 182.3 (CS), 102.4 (C-1Lac, C- 1’Lac), 75.6 (C-3Lac, C-3’Lac), 73.0 (C-4Lac, C-4’Lac), 71.2 (CH2OCys), 71.0 (CH2OLac), 68.9 (C-2Lac, C-2’Lac),"67.5 (C-5Lac, C-5’Lac),"61.2 (C-6Lac, C-6’Lac),"44.1 (C-6, C-6’), 38.5 (CH2N), 30.0 (SCH2CH2NH), 29.3 (CH2CH2O), 27.9 (CH2S). 294 Experimental Part ESIMS: m/z = 1182.2 [M + 3 Na]4+. Anal. Calcd for C164H302N22O78S20·6 HCl: C, 42.00; H, 6.62; N, 6.57; S, 13.67. Found: C, 41.71; H, 6.39; N, 6.26; S, 13.37. Hecate-type glycocationic cyclotrehalans Unit 1,1’-Bis-[tri-O-allyl-tri-O-hexyl]-unit 1’’-[hexa-O-(2-tert-butoxy- carbonylaminoethylthiopropyl)]-CT3 (78). To a solution of 69 (83 mg, 0.03 mmol) and DMAP (16 mg, 0.13 mmol) in pyridine (4 mL), 19 (22 mg, 0.03 mmol) was slowly added and the mixture was stirred at 40 ºC overnight. The mixture was concentrated and the resulting residue purified by column chromatography (1:1 → 6:1 EtOAc-cyclohexane). Yield: 96 mg (91%). Rf = 0.43 (6:1 EtOAc-cyclohexane); [a]D = +56.5 (c 1.0, DCM); IR (ATR): nmax = 1706 cm-1; UV (MeOH): λmax 243 nm (εmM = 26.5). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 7.72-7.40 (m, 6 H, NHCS), 6.00-5.83 (m, 6 H, =CH), 5.33-5.16 (m, 12 H, =CH2), 5.03-5.00 (m, 6 H, H-1), 4.35-3.98 (m, 36 H, H-5, CH2O) 3.83-3.53 (m, 18 H, H-3, H-6), 3.35-3.27 (m, 12 H, CH2N), 3.22-3.15 (m, 6 H, H-2), 3.08-3.01 (m, 6 H, H-4), 2.69-2.59 (m, 24 H, SCH2CH2NHBoc, CH2S), 1.92- 1.82 (m, 12 H, CH2CH2Ocys), 1.62-1.52 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.47 (s, 54 H, CMe3), 1.34 (m, 36 H, CH2), 0.92 (m, 18 H, CH3). Experimental Part 295 13C NMR (125.7 MHz, CDCl3, 323 K): δ = 184.1 (CS), 155.8, 155.7 (CO), 135.1, 134.8, 134.6 (=CH), 117.4, 117.3, 117.0, 116.9, 116.3 (=CH2), 94.0, 92.9, 92.8 (C-1), 81.0 (C-3), 80.9 (C-2), 78.8 (C-4), 78.4 (CMe3), 74.1, 74.0 (CH2OAllyl), 73.9, 73.5 (CH2OHex), 72.2, 71.9 (CH2OCys), 71.7, 71.6, 69.9 (C-5), 45.4 (C-6), 40.0 (CH2N), 32.2 (CH2), 32.1 (SCH2CH2NHBoc), 30.2 (CH2CH2OHex), 30.1 (CH2CH2Ocys), 28.1 (CH2S), 28.4 (CMe3), 25.6, 22.5 (CH2), 13.8 (CH3). ESIMS: m/z = 1620.9 [M + Na]+. Anal. Calcd for C154H279N12O39S9: C, 57.60; H, 8.76; N, 5.23; S, 8.98. Found: C, 57.31; H, 8.56; N, 4.97; S, 8.69. Unit 1,1’-Bis-[tri-O-allyl-tri-O-hexyl]-unit 1’’-[hexa-O-(2-aminoethylthio- propyl)]-CT3 (79). Compound 79 was obtained by treatment of 78 (152 mg, 0.05 mmol) with 1:1 TFA-DCM (2 mL) following the procedure described in general methods (Boc cleavage). Yield: 117 mg (96%). Rf = 0.42 (4:1:1 CH3CN-H2O-NH4OH); [α]D = +57.6 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 243 nm (εmM = 19.9). 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 7.68-7.55 (m, 6 H, NHCS), 6.02-5.89 (m, 6 H, =CH), 5.41-5.26 (m, 12 H, =CH2), 5.17-5.12 (m, 6 H, H-1), 4.39-3.88 (m, 36 H, H-5, CH2O) 3.85-3.58 (m, 6 H, H-3), 3.46-3.35 (m, 12 H, H-6), 3.32 (m, 12 H, CH2N), 3.16-3.10 (m, 6 H, H-2), 3.08-3.01 (m, 6 H, H-4), 2.88 (m, 12 H, SCH2CH2NH), 2.78- 2.68 (m, 12 H, CH2S), 1.95-1.88 (m, 12 H, CH2CH2Ocys), 1.62-1.57 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.42-1.35 (m, 36 H, CH2), 0.94 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, CD3OD): δ = 183.6 (CS), 135.5, 135.0, 134.7 (=CH), 116.0, 115.6, 115.0 (=CH2), 92.3, 91.9, 91.6 (C-1), 81.2 (C-3), 80.1 (C-2), 79.1 (C-4), 73.7 (CH2OAllyl), 73.0, 72.9 (CH2OHex), 71.7, 71.4 (CH2OCys), 69.6 (C-5), 38.8 (CH2N), 31.9 (CH2), 32.5 (SCH2CH2NH), 30.3 (CH2CH2OHex), 30.1 (CH2CH2Ocys), 28.4 (CH2S), 25.6, 22.3 (CH2), 13.1 (CH3). ESIMS: m/z = 1298.4 [M + 2 H]2+. Anal. Calcd for C123H234Cl6N12O27S9: C, 52.49; H, 8.38; N, 5.97; S, 10.25. Found: C, 52.22; H, 8.19; N, 5.64; S, 9.93. 296 Experimental Part Unit 1,1’-Bis-[tri-O-allyl-tri-O-hexyl]-unit 1’’-[hexa-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl- a -D-mannopyranosylthioureidoethylthiopropyl)]-CT3 (80). To a solution of JLJB328 (117 mg, 0.04 mmol) in H2O (5 mL) NaHCO3 until pH 8 was added. After 5 min at rt, mannopyranosyl isothiocyanate (ManNCS) (115 mg, 0.30 mmol) in acetone (8 mL) was added. The reaction mixture was stirred at rt for 24 h, then the solvents were evaporated, and the residue was purified by column chromatography (2:1 EtOAc-cyclohexane). Yield: 95 mg (69%). Rf = 0.55 (8:1 EtOAc-cyclohexane); [α]D = +67.3 (c 1.0, DCM); IR (ATR): υmax = 1746 cm-1; UV (MeOH): λmax 248 nm (εmM = 19.3). 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 323 K): δ = 6.01-5.89 (m, 12 H, =CH, H-1Man), 5.39-5.12 (m, 50 H, CH2O, =CH2, H-2Man, H-3Man, H-4Man, H-5Man, H-1), 4.42-4.13 (m, 24 H, H-6Man, H-6), 4.03-3.90 (m, 6 H, H-5), 3.88-3.86 (m, 12 H, CH2O), 3.84-3.78 (m, 12 H, CH2N), 3.76-3.56 (m, 30 H, CH2O, H-3), 3.40-3.28 (m, 6 H, H-23.21-3.04 (m, 6 H, H-4), 2.88-2.83 (m, 24 H, SCH2CH2NH), 2.74-2.72 (m, 24 H, CH2S), 2.18-2.03 (4s, 72 H, CH3- Man), 1.97-1.92 (m, 24 H, CH2CH2OCys), 1.62-1.59 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.34 (m, 36 H, CH2), 0.93 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, CD3OD): δ = 183.4 (CS), 170.1,169.0 (CO), 135.3-134.6 (=CH), 115.2 (=CH2), 91.9 (C-1), 80.8 (C-1Man), 80.1 (C-3), 79.8 (C-2), 79.4 (C-4), 73.8, Experimental Part 297 73.1 (CH2OAllyl), 71.8, 71.4 (CH2OHex), 71.3, 71.1 (CH2OCys), 69.7, 69.1 (C-5), 67.4 (C- 3Man), 66.3 (C-2Man), 63.4 (C-4Man), 62.3 (C-5Man), 62.1 (C-6Man), 43.9 (C-6), 35.6 (CH2N), 31.6 (SCH2CH2NH), 30.2 (CH2CH2O), 28.0 (CH2S), 25.9, 22.7, 22.4 (CH2), 19.6-19.1 (CH3-Man), 13.3 (CH3). ESIMS: m/z = 2488.18 [M + Na]2+. Anal. Calcd for C213H342N18O81S15: C, 51.87; H, 6.99; N, 5.11; S, 9.75. Found: C, 52.02; H, 7.11; N, 4.87; S, 9.46. Unit 1,1’-Bis-[tri-O-(2-tert-butoxycarbonylaminoethylthiopropyl)-tri-O- hexyl]-unit 1’’-[hexa-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl- a -D-mannopyranosylthioureidoethyl- thiopropyl)]-CT3 (81). To a solution of 80 (116 mg, 0.023 mmol) in degassed MeOH (3 mL), 2-(tert-butoxycarbonylamino)ethanethiol (0.116 mL, 0.69 mmol) and AIBN (4 mg, 0.027 mmol) were added and the mixture was irradiated at l = 254 nm and stirred at rt for 1 h. Solvent was evaporated and the residue purified by column chromatography (3:1 EtOAc-cyclohexane). Yield: 110 mg (80%). Rf = 0.46 (8:1 EtOAc-cyclohexane); [α]D = +40.1 (c 1.0, DCM); IR (ATR): υmax = 1746 cm-1; UV (MeOH): λmax 245 nm (εmM = 22.5). 1H NMR (400 MHz, 10:1 CDCl3-CD3OD, 323 K): δ = 7.63-7.44 (m, 18 H, NHCS), 5.42 (s, 6 H, H-1Man), 5.31-5.23 (m, 12 H, H-2Man, H-3Man), 5.21-5.14 (m, 12 H, H- 4Man, H-5Man), 5.09-4.99 (m, 6 H, H-1), 4.30-4.08 (m, 12 H, H-6Man), 4.02-3.94 (m, 6 H, H- 298 Experimental Part 5), 3.90-3.49 (m, 54 H, CH2O, H-3, H-6), 3.27-3.25 (m, 24 H, CH2N), 3.22-3.14 (m, 6 H, H-2), 3.07-2.94 (m, 6 H, H-4), 2.79-2.68 (m, 24 H, CH2S), 2.68-2.54 (m, 24 H, SCH2CH2NH), 2.18-1.93 (4s, 72 H, CH3-Man), 1.93-1.78 (m, 24 H, CH2CH2OCys), 1.56- 1.54 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.41 (s, 54 H, CMe3), 1.28 (m, 36 H, CH2), 0.87 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (100.6 MHz, 10:1 CDCl3-CD3OD, 323 K): δ = 183.7 (CS), 170.8-169.6 (CO ester), 156.0 (CO carbamate), 80.8 (C-1Man), 80.5 (C-3), 80.2 (C-2), 80.1 (CMe3), 79.4 (C-4), 73.7, 73.5 (CH2OCys), 72.4, 72.2 (CH2OHex), 71.8, 71.6 (CH2OMan), 69.1, 68.7 (C-5), 65.7 (C-3Man), 64.3 (C-2Man), 62.4 (C-4Man), 62.1 (C-5Man), 60.3 (C-6Man), 44.5 (C-6), 40.3 (CH2N), 33.3 (SCH2CH2NH), 31.2 (CH2CH2O), 30.0 (CH2S), 28.0 (CH3-Man), 22.4, 22.0, 20.5 (CH2), 20.5-20.2 (CMe3), 13.8 (CH3). ESIMS: m/z = 3019.7 [M + Na]2+. Anal. Calcd for C255H432N24O93S21: C, 51.08; H, 7.26; N, 5.61; S, 11.23. Found: C, 50.78; H, 6.96; N, 5.30; S, 10.89. Unit 1,1’-Bis-{[tri-O-hexa-(2-aminoethylthiopropyl)]-tri-O-hexyl}-unit 1’’- [hexa-O-( a -D-mannopyranosylthioureidoethylthiopropyl)]-CT3 (82). To a solution of 81 (100 mg, 0.016 mmol) in MeOH (3 mL) and NaOMe (1M) in MeOH (0.192 mL, until pH 9) was added. The reaction mixture was further stirred for 30 min, and then neutralized with Amberlite IR-120 (H+) ion-exchange resin. The resin was filtered off and the solution was concentrated. Compound 82 was obtained by further deprotection of the crude with 1:1 TFA-DCM following the procedure described in general methods (Boc cleavage). Yield: 75 mg (quantitative). [α]D = +30.75 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 245 nm (εmM = 43). 1H NMR (500 MHz, 5:1 CD3OD-D2O, 323 K): δ = 6.40 (s, 6 H, H-1Man), 5.84- 5.54 (m, 30 H, H-2Man, H-3Man, H-4Man, H-5Man, H-1), 4.59 (m, 6 H, H-5), 4.40 (m, 12 H, H- 6Man), 4.35-3.87 (m, 54 H, CH2O, H-3, H-6), 3.84 (m, 6 H, H-2), 3.68 (m, 24 H, CH2N), 3.48 (m, 6 H, H-4), 3.23 (m, 24 H, CH2S), 3.12 (m, 24 H, SCH2CH2NH), 2.35 (m, 24 H, CH2CH2OCys), 1.98 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.75 (m, 36 H, CH2), 1.32 (m, 18 H, CH3). Experimental Part 299 13C NMR (100.6 MHz, D2O): δ = 182.3 (CS), 77.5 (CH2OCys, CH2OHex), 73.5 (CH2OMan), 72.0 (C-3Man), 70.7 (C-6Man), 60.7 (C-2Man), 69.7 (C-4Man), 66.4 (C-5Man), 60.9 (C-6Man), 44.2 (C-6), 38.6 (CH2N), 31.8 (SCH2CH2NH), 30.3 (CH2CH2O), 28.2 (CH2S), 25.9, 22.8 (CH2), 14.2 (CH3). ESIMS: m/z = 1461.48 [M + 3 H]3+. Anal. Calcd for C177H336N24O57S21·6 HCl: C, 46.17; H, 7.49; N, 7.30; S, 14.62. Found: C, 45.91; H, 7.16; N, 6.88; S, 14.33. Unit 1,1’-Bis-[tri-O-allyl-tri-O-hexyl]-unit 1’’-[hexa-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl- a -D-lactosylthioureidoethylthiopropyl)]-CT3 (83). To a solution of 79 (25 mg, 0.01 mmol) in H2O (1 mL), NaHCO3 until pH 8 was added. After stirring for 5 min at rt, lactosyl isothiocyanate (LacNCS) (42 mg, 0.06 mmol) in acetone (2 mL) was added. The reaction mixture was further stirred at rt for 24 h, the solvents were evaporated, and the residue was purified by column chromatography (1:1 EtOAc-cyclohexane → 45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O). Yield: 50 mg (75%). Rf = 0.66 (45:5:3 EtOAc-EtOH-H2O); [α]D = +20.7 (c 1.0, DCM); UV (MeOH): λmax 245 nm (εmM = 98.2). 300 Experimental Part 1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.97 (m, 12 H, H-1Lac), 5.32 (m, 18 H, =CH, H- 5Lac), 5.29-5.22 (m, 24 H, H-4Lac, H-3Lac), 5.14 (m, 12 H, H-2Lac), 5.01 (m, 12 H, H-1), 4.55 (m, 16 H, =CH2, H-5), 4.36 (m, 24 H, H-6Lac), 4.17-3.54 (m, 48 H, CH2O, H-3, H-6), 3.23 (m, 6 H, H-2), 3.04 (m, 6 H, H-4), 2.75 (m, 24 H, SCH2CH2NH), 2.69 (m, 24 H, CH2S), 2.17-1.99 (7s, 126 H, CH3-Lac), 1.91 (m, 24 H, CH2CH2OLac), 1.63-1.57 (m, 12 H, CH2CH2OHex), 1.35-1.28 (m, 36 H, CH2), 0.93 (m, 18 H, CH3). 13C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 184.0 (CS), 170.4 (CO), 100.9 (C-1Lac), 82.7 (C-3), 80.9 (C-2), 80.0 (C-4), 76.0 (C-3Lac), 71.0 (CH2O), 70.5 (C-5), 69.0 (C-2Lac), 68.1 (C-4Lac), 66.5 (C-5Lac), 61.9 (C-6Lac), 44.5 (C-6), 38.7 (CH2N), 30.3 (CH2CH2O), 29.7 (SCH2CH2NH), 28.9 (CH2S), 23.7, 23.0, 22.7, 23.7 (CH2), 20.6 (CH3-Lac), 14.4 (CH3). ESIMS: m/z = 3351.3 [M + Na]2+. Anal. Calcd for C285H438N18O129S15: C, 51.39; H, 6.63; N, 3.78; S, 7.22. Found: C, 51.57; H, 6.81; N, 3.57; S, 6.92. Unit 1,1’-Bis-[tri-O-(2-tert-butoxycarbonylaminoethylthiopropyl)-tri-O- hexyl]-unit 1’’-[hexa-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl- a -D-lactosylthioureidoethylthio-