Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos

Equation Chapter 1 Section 1 Trabajo Fin de Grado Grado en Ingeniería Química Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Autor: Ana Belén Ortiz Flores Tutores: Laura Mª Roa Romero David Naranjo Hernández Dep. Teoría de la Señal y Comunicaciones Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2016 iii Trabajo Fin de Grado Grado en Ingeniería Química Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Autor: Ana Belén Ortiz Flores Tutores: Laura Mª Roa Romero Catedrática de Universidad David Naranjo Hernández Dep. de Teoría de la Señal y Comunicaciones Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2016 v Trabajo Fin de Grado: Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Autor: Ana Belén Ortiz Flores Tutores: Laura Mª Roa Romero David Naranjo Hernández El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2016 El Secretario del Tribunal vii A todos los que me han acompañado en este camino ix Agradecimientos Agradezco a la Catedrática Dña. Laura María Roa Romero por permitirme llevar a cabo este estudio y de ese modo tener mi primer contacto con la Ingeniería Biomédica, lo que ha creado en mi gran interés por seguir aprendiendo y desarrollándome es esta área científica. A David Naranjo Hernández le agradezco enormemente su gran ayuda; para hacerme entender lo que para mi era casi desconocido, por su amabilidad y disposición ante mis dificultades durante el desarrollo de este trabajo, y por guiarme hasta el final del mismo de la mejor forma. Infinitas gracias a mis padres, Carmen y Manuel, por brindarme la oportunidad de llegar hasta aquí, ayudándome a crecer profesional y personalmente, apoyándome incondicionalmente en todos estos años. Gracias a ti, Pablo, que llegaste cuando estaba cerca de la meta, pero cuando más impulso necesitaba. Gracias a todas las personas maravillosas que he conocido durante estos años, son la asignatura que jamás olvidaré. No puedo olvidar agradecerles a mis amigos, los de siempre. Los que no han dejado de apoyarme y felicitarme ante cada adversidad o triunfo en esta andadura. Ana Belén Ortiz Flores Sevilla, 2016 xvii ÍNDICE DE TABLAS Tabla 2–1 Composición de la solución de diálisis PHYSIONEAL 35 7! Tabla 2–2 Composición de la solución de diálisis PHYSIONEAL 35 7! Tabla 3–1 Biosensores para la determinación de Streptococcus pneumoniae 13! Tabla 3–2 Biosensores para la determinación de Streptococcus aureus 14! Tabla 4–1 Análisis de la influencia de R3 en el circuito 35! Tabla 4–2 Análisis de la influencia de L en el circuito 35! Tabla 4–3 Análisis de la influencia de C1 en el circuito 36! Tabla 4–4 Análisis de la influencia de C4 en el circuito 37! Tabla 4–5 Análisis de la influencia de C4 en el circuito 37! Tabla 4–6 Análisis de la influencia de C2 en el circuito 38! xix ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1-1. Procesos de difusión y osmosis en diálisis [4]. 2 Figura 2-1. Bolsa con solución de diálisis PHYSIONEAL 35 8 Figura 3-1. Disposición de las capas en estado normal. 15 Figura 3-2. Orientación del electrón cuando se aplica un campo magnético externo. 15 Figura 3-3. Gráfico obtenido en el test de sensibilidad del sensor GMR. 16 Figura 3-4. Dispositivo experimental. 16 Figura 3-5. Diagrama esquemático del sensor capacitivo CMOS. 17 Figura 3-6. Sección transversal de la interfaz sensorial. 18 Figura 3-7. Representación esquemática del CBCM. 18 Figura 3-8. Estructura de un bacteriófago. 18 Figura 3-9. Método de detección de capacitancia mutua. 19 Figura 3-10. Método de detección de auto capacitancia. 20 Figura 3-11. Procedimiento de dilución utilizando TSB. 20 Figura 3-12. Respuesta del sensor táctil en el contador RAW con el aumento de volumen. 21 Figura 3-13. Respuesta del sensor táctil en el contador RAW al líquido E.coli en diferentes concentraciones y al medio de cultivo. 21 Figura 3-14. Respuesta del sensor táctil en el contador RAW a muestra de orina mezclada con E.coli. 22 Figura 3-15. Proceso de fabricación del electrodo IDT. 23 Figura 3-16. Miniatura del sensor tipo película delgada basado en el sensor interdigital. 23 Figura 3-17. Impedancia característica del sensor interdigital con APTES y PmB. 24 Figura 3-18. Vista esquemática de la disposición de las bacterias en el electrodo. 25 Figura 3-19. Capacitancia según diámetro de bacteria. 25 Figura 3-20. Esquema electrodos. 26 Figura 3-21. Ejemplos de aplicación para sensores capacitivos. 27 Figura 3-22. Esquema partes de un sensor capacitivo. 28 Figura 3-23. Circuito para un oscilador discreto de Pierce de 1MHz. 29 Figura 3-24. Circuito para un oscilador de Pierce IC. 29 Figura 3-25. Circuito tanque LC: acción del oscilador y efecto del volante. 30 Figura 3-26. Forma de onda de salida 30 Figura 3-27. Esquemático del oscilador Colpitts 31 Figura 4-1. Esquema del circuito con oscilador de Colpitts 33 Figura 4-2. Esquemático del circuito con oscilador de Colpitts en Orcad Capture 34 Figura 4-3. Prototipo del circuito 39 Figura 4-4. Fresadora automática ProtoMatS62 39 Figura 4-5. Circuito impreso con pines soldados 40 Figura 4-6. Adaptación final del circuito conectado a la placa PIC32-PINGÜINO-OTG 40 Figura 4-7. Bolsa de desecho con agua destilada y electrodos conectados 41 Figura 4-8. Gráfico de la frecuencia obtenida añadiendo sal en distintas proporciones 42 Figura 4-9. Frecuencia medida en agua destilada frente a disolución con sal 43 Figura 4-10. Frecuencia medida en agua destilada frente a disolución con azúcar 43 Figura 4-11. Frecuencia medida en agua destilada frente a disolución con leche 44 Figura 4-12. Disolución agua destilada y urea 45 Figura 4-13. Disolución agua destilada y vinagre 46 Figura 4-14. Disolución de solución de diálisis y sal común 47 Figura 4-15. Disolución de solución de diálisis y azúcar 48 Figura 4-16. Disolución de solución de diálisis y leche 49 Figura 4-17. Disolución de solución de diálisis y vinagre 50 Figura 4-18. Disolución de solución de diálisis y urea 51 1 INTRODUCCIÓN a enfermedad renal crónica (ERC), es la situación en la cual los riñones son insuficientes para mantener de manera adecuada la homeostasis del medio interno a causa de una lesión estructural irreversible presente en un largo periodo de tiempo (más de tres meses). Los primeros síntomas pueden ser similares a los de otras muchas enfermedades menos serias, por ello es necesario realizar varios exámenes y pruebas médicas para asegurar la presencia de la enfermedad. La ERC es un problema de salud pública. La manifestación más grave de la ERC, la insuficiencia renal crónica terminal (IRCT) que es subsidiaria de tratamiento sustitutivo mediante diálisis o trasplante renal, presenta una incidencia y una prevalencia crecientes desde hace dos décadas [1]. Cuando se habla del IRCT, se refiere a la necesidad de comenzar tratamiento sustitutivo de la función renal y se corresponde en la clasificación con ERC estadio 5. La hemodiálisis (HD) es uno de los tratamientos sustitutivos de la función renal. La hemodiálisis convencional se basa en el transporte por difusión, la hemofiltración en el transporte convectivo y la hemodiafiltración combina ambas. Siempre que sea posible, se accederá mediante fístula arterio/venosa en muñeca no dominante. Consiste en técnicas continuas de lenta eficacia para pacientes inestables y técnica convencional intermitente en pacientes estables y a largo plazo. No tiene contraindicaciones aunque pueden darse complicaciones [2]. La diálisis peritoneal es otra de las alternativas de tratamiento sustitutivo de la función renal. Es un método que se utiliza para extraer las impurezas y los líquidos de la sangre, en pacientes con insuficiencia renal aguda y crónica; se utiliza como membrana dializante el propio peritoneo del paciente, que se considera un filtro natural [3]. El peritoneo es la membrana que cubre la mayor parte de los órganos del abdomen. Hay dos modalidades: - Diálisis peritoneal continua ambulatoria (DPCA): el más usado. El paciente cada 6 horas vacía la cavidad peritoneal (líquido sucio) y reemplaza el dializado. Los intercambios son continuos y el peritoneo nunca está vacío. No requiere equipo de diálisis. - Diálisis peritoneal automatizada (DPA): con recambios nocturnos por equipo automatizado. La diálisis peritoneal (DP), es una operación basada en la combinación de difusión y ósmosis. La difusión es el movimiento de partículas a través de una membrana semipermeable, desde una zona de mayor concentración hacia una zona de menor concentración. La ósmosis es un movimiento de líquidos, a través de una membrana semipermeable partiendo de una zona con alta concentración de soluto [3]. L Introducción 2 Figura 1-1. Procesos de difusión y osmosis en diálisis [4]. La DP consiste en una técnica intrabdominal, en la cual se utiliza el peritoneo como membrana dializante, por medio de un catéter que permite acceder a la cavidad peritoneal, permitiendo la realización de la técnica [5]. En la DP, la solución de diálisis que se administra en base acuosa, con características similares al plasma de la sangre; contiene glucosa, electrolitos normales y está libre de deshechos; por tanto, los productos de desecho y el exceso de electrolitos en la sangre cruzan el peritoneo, hacia el líquido de diálisis, produciéndose así un intercambio [5]. Los procesos infecciosos son unas de las complicaciones más frecuentes en la insuficiencia renal crónica, sin menospreciar otras afecciones no menos importantes, como las cardiovasculares, anemia y osteodistrofia [5]. Las infecciones son la principal causa de morbilidad y la segunda causa de mortalidad en los pacientes en diálisis. Un elevado porcentaje de pacientes incidentes en diálisis tienen un inicio no programado y el uso de catéteres venosos sigue siendo elevado. Cuando se emplean estos últimos, se multiplica de forma considerable el riesgo de bacteriemia y las tasas de mortalidad ajustada para todas las causas infecciosas. En los datos del US Renal Data System (USRDS) de diálisis se ha observado que el riesgo de septicemia es significativamente más bajo en pacientes que inician tratamiento sustitutivo renal (TSR) con DP comparando su tasa de infección por paciente y año con la de pacientes incidentes en HD a través de catéter [5]. Hay que destacar el peligro de una septicemia, que en cuestión de horas, si no se detecta, puede acabar con la vida del paciente. En la vida de cualquier persona la infección en general, acostumbra a tener un protagonismo fundamental por su repercusión en la vida diaria, dada la limitación que condiciona la fiebre, frecuente en la infección microbiana o en ausencia de ella, y la percepción de un estado físico con evidente decaimiento. Esta supone una de las razones principales por las que la población se ve obligada a acudir a consulta a un centro hospitalario. En pacientes con IRCT sometidos a DP donde nos hemos centrado, se presentan complicaciones infecciosas (respiratorias, renales, abdominales, cutáneas) semejantes al resto de la población sana, pero en ellos la diferencia es que su estado condiciona la respuesta a la agresión infecciosa, ya que es menor la capacidad de defensa al tener una inmunidad reducida y ser por ello más vulnerables. Dado que contraer infecciones es una complicación frecuente en pacientes sometidos a diálisis peritoneal, la duda de padecer la enfermedad conlleva un trastorno en la vida cotidiana del paciente tener que acudir a su centro médico más de lo inevitable. Es por ello que urge la existencia de un dispositivo que haga sencilla la detección de la patología para cualquier usuario . 3 3 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Entre los métodos de detección de bacterias, se encuentran los métodos tradicionales, que suelen englobar el examen directo, el cultivo y el antibiograma. Estos resultan tediosos y, en ocasiones, poco fiables, al ser muy sensibles y, por tanto, poco rentables por la necesidad de repetición de análisis. Los métodos basados en el empleo de anticuerpos, aplican una metodología rápida y simple, más rentables y menos sensibles que los anteriores, y con opción de automatización y multimuestreo. Pero existen limitaciones en este método debido a la baja selectividad ante ciertos estreptococos y bacterias patógenas, añadiendo la baja fiabilidad en niños [6]. El método más conocido, entre los métodos de detección sobre técnicas inmunológicas, es el método ELISA. Se trata de procedimientos sencillos, pero requieren tiempo, instrumentación costosa y personal especializado [6]. Los biosensores pueden llegar a competir con las técnicas clásicas de análisis al permitir una determinación rápida, selectiva y económica. Estos dan lugar a resultados tan fiables como los métodos convencionales pero en menor tiempo. Lo más atractivos son los inmunosensores y genosensores, por ser más sencillos, menos costosos que los tradicionales y más eficaces, pero aún son demasiado costosos. Se han desarrollado ya biosensores para la detección de bacterias como S. Aureus y S. Pneumoniae, basados en inmunoensayos acoplados a técnicas electroquímicas, aunque aún la sensibilidad conseguida no es suficiente para asegurar el cumplimiento de los reglamentos de la seguridad alimentaria. Aunque con estos métodos se obtienen buenos resultados, conllevan una serie de desventajas que no los hacen adecuados para satisfacer necesidades actuales como rapidez, sencillez y bajo coste. Los principales inconvenientes de los métodos actuales son: - Requieren largos tiempos de ensayos - Laboratorios especializados - Instrumentación costosa - Personal capacitado En los últimos años, el uso de las TIC ha crecido considerablemente en todos los ámbitos, resultando esto de gran utilidad en el de la salud. El uso de Internet u otros medios electrónicos para proporcionar servicios en el ámbito de la salud o crear y analizar información con la salud, engloba la e-Salud. La e-Salud supone numerosos beneficios para los pacientes y profesionales del sector sanitario, también para la organización de los centros hospitalarios [7]. La correcta utilización de estas herramientas en materia e prevención, diagnóstico, tratamiento, seguimiento o gestión de la salud, permiten ahorro de costes en el sistema sanitario con mayor eficacia del mismo. La e-Salud está potenciada en parte por el uso de las redes inalámbricas de sensores corporales, que permiten la monitorización del paciente en cualquier lugar y tiempo, así como un diagnóstico y detección precoz de enfermedades. Habitualmente casi cualquier actividad de monitorización requiere un esfuerzo, tanto por el paciente como por los colectivos sanitarios. En la realización de cualquier prueba, se precisa que el paciente se desplace hasta un centro médico, lo que implica que tenga que modificar su actividad cotidiana. Esta situación se agrava mucho más cuando la prueba a realizar no se reduce a unos minutos de monitorización, sino que se deben recopilar datos a lo largo de una noche o incluso a lo largo de uno o varios días con el fin de obtener la suficiente información para llevar a cabo un diagnóstico fiable. Estos casos suelen requerir la hospitalización del paciente, lo que implica un perjuicio para el mismo y para los servicios médicos encargados de realizar la prueba, ya que se produce una saturación de los centros hospitalarios y aumento de costes sanitarios [8]. Los continuos avances en materia de dispositivos y programas informáticos, en conjunto con las redes inalámbricas, nos han situado a las puertas de una nueva era en la que pequeños dispositivos inalámbricos nos proporcionarán acceso a la información en cualquier momento y en cualquier lugar. De este modo, los pacientes pueden ser monitorizados desde su hogar, ofreciendo un mayor control y mejor calidad de vida [8]. 1.1 Hipotesis y objetivos En el contexto Científico Tecnológico actual, se plantea la hipótesis de desarrollar un sensor inteligente, no Introducción 4 invasivo, económico, sencillo y fiable con capacidad para detectar presencia de bacterias en fluidos de pacientes sometidos a DP en un margen de tiempo aceptable para su tratamiento. El objetivo principal del presente proyecto es diseñar e implementar un prototipo preindustrial de un sensor para la detección precoz de bacterias que pueda ser aplicado en pacientes sometidos a diálisis peritoneal. Se espera que dicho prototipo sea una primera aproximación a un sensor económico y no invasivo. Para lograr el objetivo principal se trataran los siguientes subobjetivos: - Desarrollar un estudio del estado del arte de las tecnologías empleadas en la detección de bacterias, actuales y en fase de estudio o desarrollo. - Estudiar la tecnología más adecuada para la propuesta del proyecto. - Diseño y simulación de un circuito basado en la tecnología seleccionada para valorar su respuesta. - Diseño e implementación de las adaptaciones que se consideren necesarias, con la finalidad de realizar pruebas experimentales que permitan evaluar la tecnología propuesta. - Evaluación y experimentación del sensor diseñado. 1.2 Estructura de la memoria La memoria de este trabajo está dividida en cinco capítulos que se describen a continuación: § Capítulo 1. Introducción sobre la enfermedad renal y la problemática existente en pacientes renales. Se mencionan posibles infecciones que pueden aparecer en tratamientos subsidiarios de la enfermedad. También se explica la importancia de las nuevas tecnologías en el ámbito de la salud y la motivación para la realización de este trabajo así como la hipótesis y objetivos propuestos. § Capítulo 2. Materiales y métodos. Descripción de la tecnología utilizada, en este caso, la capacitiva. Describir la funcionalidad de los principales osciladores, Colpitts y Pierce. Explicando la metodología seguida para el desarrollo del trabajo y los materiales utilizados. § Capítulo 3. Estado del arte en la detección de bacterias. Se explica la importancia de detección de bacterias en pacientes renales sometidos a DP, así como las técnicas de detección de bacterias utilizadas en la actualidad ante la problématica existente en estos pacientes. Se analizan tecnologías de sensorización existentes y en fase de estudio o desarrollo. Se justifica y explica la utilización de la tecnología capacitiva en este trabajo. § Capítulo 4. Resultados. Se muestran los resultados obtenidos de la simulación del circuito seleccionado. Se muestan los resultados del diseño e implementación de la adaptación de un prototipo de circuito previo y los resultados de las pruebas experimentales realizadas con el sensor y la bolsa de drenado con la correspondiente disolución. § Capítulo 5. Conclusiones. Se exponen las conclusiones obtenidas de las distintas pruebas experimentales, proponiendo las mejoras a realizar en el futuro para el sensor. 2 MATERIALES Y MÉTODO n este capítulo se detallan los requisitos de diseño que debe tener el sensor, explicando la metodología que se lleva a cabo para el diseño del mismo. Por último, se describen las pruebas que se han realizado en el estudio experimental; detallando los programas informáticos, herramientas y materiales usados. 2.1 Requisitos de diseño Partiendo del objetivo del presente trabajo, se imponen una serie de requisitos de diseño que debe satisfacer el sensor detector de bacterias en pacientes sometidos a diálisis: - Capacidad de detectar cambios ante la presencia de distintas sustancias en un fluido en un corto periodo de tiempo. - Sencillo y manejable. - Económico. - Fiable y robusto en las mediciones. - No invasivo. - Accesible a cualquier usuario para uso doméstico. 2.2 Metodología Para llevar a cabo el diseño e implementación del sensor requerido se sigue una metodología cíclica, es decir, actuando de forma iterativa. En primer lugar, se hace un revisión bibliográfica con el fin de estudiar las tecnologías disponibles para la detección de bacterias. Tras no encontrar ninguna existente que resuelva la problemática planteada, para la detección precoz de bacterias en fluidos de pacientes sometidos a DP, se propone la tecnología capacitiva para el diseño de un sensor, basado en un circuito oscilador, detector de bacterias. Se estudia la tecnología propuesta y se selecciona el oscilador adecuado para el circuito, justificando su funcionalidad, así como sus ventajas e inconvenientes frente a otros tipos. Con el programa Orcad Capture, se realiza una simulación del circuito obteniendo una parametrización final que después se comprobará en un circuito real. Se prosigue, con la construcción del circuito elegido. Esto se ha hace mediante el el programa informático Orcad Layout. En este, se han especificado las pistas y capas necesarias para soldar los componentes requeridos. Teniendo dicha información, se ha generado un código que se envía a un equipo adecuado para la impresión del circuito, en este caso, una fresadora automática ProtoMat S62. Teniendo el prototipo final del circuito, se realizan pruebas reales mediante un osciloscopio, y se comprueba que el circuito no emite respuesta, por lo que finalmente se utiliza una adaptación. Para este trabajo se ha realizado una adaptación de un dispositivo previo desarrollado en el Grupo de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Sevilla, por Pablo Parodi Félix en su PFC “Mejora del diseño E Estado del arte en la detección de bacterias 12 ofrecen para satisfacer las demandas existentes como: - Necesidad de herramientas menos costosas. - Miniaturización de los dispositivos. - Simplicidad y eficiencia. - Medidas a tiempo real e in situ. Esta demanda es un importante motivo para seguir trabajando en la investigación y desarrollo de biosensores. Surgiendo a finales del siglo XX como una poderosa alternativa a las técnicas analíticas convencionales [15]. A continuación, se mostraran algunos ejemplos de biosensores que se han desarrollado hasta el momento. Un ejemplo, Zhang y col. [16] describen un método con gran sensibilidad basado en un inmunosensor electroquímico para detectar E.coli en aguas. Se trata de un sensor amperométrico, el cual presenta ciertas ventajas, como alta sensibilidad, tamaño, robustez, rapidez, bajo coste y versátil para realizar análisis in situ. Mediante el empleo de un inmunosensor amperométrico, Sharma y col. [17], lograron detectar Vibrio cholerae O1 en aguas subterráneas, de mar, aguas de grifo y fecales; en tan sólo 55 minutos. Otra aplicación desarrollada mediante un sensor amperométrico fue monitorizar el crecimiento de coliformes en leche, de forma rápida y selectiva, los investigadores fueron Lee y col. [18]. Se hace posible la determinación de concentración de bacterias E.coli debido a la variación de la corriente causada por la reacción redox del azul de metileno producida por el metabolismo bacteriano en las muestras. Se demostró que era posible ser aplicado en el análisis de muestras en las centrales lecheras. 3.3.2 Biosensores Algunos de los métodos de determinación bacteriana descritos siguen presentando ciertas limitaciones, como la de no alcanzar los niveles de detección que ofrecen los métodos convencionales. Aún así, el futuro de los métodos de detección e identificación de bacterias y otros tipos de microorganismos patógenos tiende hacia el desarrollo de biosensores que puedan competir con las técnicas clásicas de análisis al permitir una determinación rápida, selectiva y económica [12]. 3.3.2.1 Biosensores para la detección de Streptococcus pneumoniae El neumococo, Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), es una bacteria Gram-positiva encapsulada e inmóvil, perteneciente al grupo α-hemolítico del género Streptococcus. Tiene forma oval y extremo distal lanceolado y suele presentarse en forma de parejas, por lo que antiguamente se le denominaba Diplococcus pneumoniae. Se trata de un microorganismo microaerófilo, catalasa negativo y perteneciente al grupo de las bacterias ácido lácticas [11]. Este microorganismo, es el causante de importantes enfermedades e infecciones en humanos (neumonía, otitis, peritonitis, sinusitis…) y de procesos invasivos severos (meningitis, sepsis…). Los grupos más vulnerables ante este tipo de microorganismos patógenos son ancianos, niños y personas inmunodeprimidas. El hábitat preferida de este neumococo se sitúa en la nasofaringe. Es el principal microorganismo causante de Neumonia adquirida en la comunidad (NAC). Hasta el momento, los métodos para el diagnóstico de neumonía neumocócica se han basado en cultivos, estos análisis resultan complejos, tediosos y poco fiables. Requieren al menos 48h para obtener un resultado. Puesto que la neumonía neumocócica tiene una tasa de mortalidad de hasta el 30% dependiendo de la bacteriemia, edad y enfermedades subyacentes del paciente [20], se reitera más la necesidad de desarrollar un sistema de detección rápida, el cual permita iniciar cuanto antes un tratamiento adecuado. Los biosensores dan lugar a resultados tan fiables como los métodos convencionales pero en menor tiempo. Lo más atractivos son los inmunosensores y genosensores, por ser más sencillos, menos costosos y más eficaces. En la siguiente tabla se muestran algunos sistemas sensoriales descritas hasta el momento para la detección de esta bacteria: 13 13 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Tabla 3–1 Biosensores para la determinación de Streptococcus pneumoniae Metodología Técnica-Detección Muestra Características Analíticas Inmunoensayo basado en la conjugación del polisacárido de la pared celular de S. Pneumoniae y la posterior incubación con Abs específicos Inmunosensor de fibra óptica - - Sándwich dot-ELISA ELISA Líquido cefaloraquídeo LD: 1.25 µg mL-1 Genosensor basado la inmovilización de las sondas de DNA sobre SPCEs mediante interacción Biotina-Strp y marcaje con AP CV(−0.25 - +0.20 V) (3-IP) - LD: 0.49 fmol Genosensor basado la inmovilización de las sondas de DNA sobre SPCEs mediante interacción Biotina-Strp Amperometría (Eapp= −1.40 V vs. Ag/AgCl) - IL: 5 – 100 pg µL-1 LD: 5 pg µL-1 Inmunosensor para la toxina ply tipo sándwich basado en la inmovilización de los Abs sobre SPCEs mediante enlace Biotina- Strp y marcaje enzimático con AP CV(−0.25 - +0.20 V) (3-IP) Orina IL: 0.25 – 5.0 ng mL LD: 0.12 ng mL-1 Inmunosensor para detección de ply específica de S. pneumoniae basado en la inmovilización de Abs a la superficie de un electrodo de oro mediante el empleo de monocapas SWV (3-IP) -! ! IL: 0.1 – 10 ng mL -1 ! Test inmunocromatografía basado en Abs específicos para la detección del polisacárido C de S. pneumoniae Detección colorimétrica Esputo! ! LD:!0.75!ng!mL-1!! ! Genosensor basado en el empleo de SPCEs modificados con Strp y sondas biotiniladas para la determinación del gen lytA específico de S. pneumoniae ASV (3-IP/Ag+) -! ! IL:!7!–!700!fg!μL-1!LD:!7!fg! μL-1!! 3.3.2.2 Biosensores para la determinación de Staphylococcus aureus El estafilococo aureus, es una bacteria anaerobia facultativa, gram positiva, productora de coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulada [21]. Está distribuida por todo el mundo, se estima que una de cada tres personas están colonizadas por ella, aunque no quiere decir que estén infectadas. Forma parte de la flora de la piel y se acomoda en la cavidad oral, nariz y tracto gastrointestinal; hasta el 30-50% de la población humana es portadora. Puede producir enfermedades, que van desde infecciones cútaneas y de las mucosas, mayormente benignas, tales como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades graves como meningitis, endocarditis, Estado del arte en la detección de bacterias 14 sepsis o neumonía. Si la bacteria se ingiere, puede afectar al aparato gastrointestinal. Las cepas de este microorganismo son resistentes a la penicilina, siendo necesario antibióticos como aminoglucósidos, cefalosporinas, oxacilina o nafcilina; para combatirlos. Si el origen de la infección parte de catéteres venosos permanentes o drenajes quirúrgicos, será conveniente eliminar estas puertas de entrada. Esta bacteria es capaz de vivir y crecer en condiciones extremas, a temperaturas de entre 15-45°C, en intervalos de pH de 4.2-9,3 o a concentraciones de NaCl (Cloruro de sodio) elevadas (15%), estas condiciones favorecen el crecimiento en muchos alimentos [22]. Son diversos los motivos que hacen necesario el desarrollo de sistemas para su detección. Actualmente, la identificación se realiza mediante métodos convencionales tales como cultivo bacteriano y pruebas bioquímicas. Se han desarrollado ya biosensores para la determinación de esta bacteria, basados en inmunoensayos acoplados a técnicas electroquímicas, aunque aún la sensibilidad conseguida no es suficiente para asegurar el cumplimiento de los reglamentos de la seguridad alimentaria. En la siguiente tabla se muestran algunos sistemas de detección desarrollados para detectar esta bacteria: Tabla 3–2 Biosensores para la determinación de Streptococcus aureus Metodología Técnica-Detección Muestra Caract. Analíticas Inmunosensor basado en el empleo de MBs modificadas con grupos aldehído y Abs específicos de la ProtA IMS-MS/SPR - IL: 1.0x106 – 1.0x107 cfu mL-1 LD: 106 cfu mL-1 Inmovilización de anti- SEB marcado con HRP en superficie modificada con nAu, quitosan y MWCNT Conductimetría Leche IL: 0.5 – 83.5 ng mL-1 LD: 0.5 ng mL-1 Identificación del carácter catalasa positivo del S. aureus Espectrofotometría UV/Vis (450 nm)-test cromatográfico para la determinación de H2O2 Tofu LD: 2x10 cfu mL Inmovilización de aptámeros anti S. aureus en superficie modificada con SWCNT Potenciometría Piel de cerdo LD: 8x102 cfu mL-1 Inmovilización de anti S. aureus sobre electrodo de Pt mediante entrecruzamiento con PEIGA Amperometría (Eapp= 0.80 V vs. Ag/AgCl) (NADP- K3Fe(CN)6) Leche, queso y carne IL: 101 – 108 cfu mL-1 LD: 10 cfu mL-1 ! ! 3.3.2.3 Biosensores basados en técnicas no electroquímicas: 3.3.2.3.1 Deteccio+n- y- cuantificacio+ nde- bacteriaspato+ genas.- Usandosensor- de-gran- resistenciamagne+tica.- Actualmente, como se ha mencionado en secciones anteriores, existen métodos como: - Método ELISA (análisis de inmunoabsorción enzimática) - PCR - Método óptico (el cual sufre mucho ruido causado por la luz parásita) El GMR (giant magnetic resistance sensor) es sensible, barato y pequeño en comparación con otros sensores. Estos biosensores proporcionan ventajas con respecto a las técnicas de fluorescencia. En este las bacterias son marcadas con nano partículas magnéticas de 40nm recubiertas con un anticuerpo 15 15 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos adecuado. Entonces, cuando un campo magnético externo se aplica a las nano partículas magnéticas se produce un campo magnético local y este provocará cambios en la resistencia del GMR. Por tanto, mediante la cantidad de campo magnético producido puede cuantificarse la cantidad de bacterias [23]. Las partículas nano magnéticas se recubren con un anticuerpo adecuado para conseguir la unión con la bacteria. Debido al campo magnético local creado se disminuirá la resistividad del sensor, y de este modo podrá cuantificarse el número de bacterias [23]. La resistencia estándar de los sensores GMR tienen una resistencia estándar de 5kW, la salida es insensible a frecuencias de 1MHz, producen una salida de campo constante y pueden operar hasta temperaturas de 125 ºC. El principio de trabajo del sensor consiste en alternar distintas capas de material ferromagnético y anti ferromagnético. Se forma de tres capas: - Capa fija: donde la orientación (“spin”) de los electrones es fijo. - Capa de conducción. - Capa libre: donde los electrones se mueven libremente. Figura 3-1. Disposición de las capas en estado normal. La dirección de magnetización de las capas magnéticas en la película del GMR tendrá un acoplamiento anti ferromagnético. Los electrones en las capas magnéticas y no magnéticas de la película tendrán opuestas orientaciones de giro. Los electrones de conducción en los materiales magnéticos tienen características especiales de giro. Cuando el material es material es magnetizado en una dirección, y el electrón gira hacia abajo en el material es magnetizado en dirección opuesta. Si un campo externo es aplicado, la dirección de giro del electrón en la capa libre cambiará y se alineará con la dirección de giro del electrón en la capa fija, disponiéndose del siguiente modo: Figura 3-2. Orientación del electrón cuando se aplica un campo magnético externo. Como podemos ver en la figura, cuando un campo magnético externo es aplicado la orientación de giro del electrón en la capa libre se alinea con la capa fija. Ahora los electrones de la capa fija pueden moverse a la Estado del arte en la detección de bacterias 16 capa libre y viceversa ya que la orientación es la misma. Entonces, el camino libre de los electrones aumenta e indica que hay más flujo de corriente debido a la resistencia del sensor GMR cuando un campo magnético externo es aplicado. En el siguiente gráfico puede observervarse la sensibilidad del sensor. Figura 3-3. Gráfico obtenido en el test de sensibilidad del sensor GMR. Se proponen sensores magnéticos, para actuar como núcleo para sensores basados en la inmovilización de antígenos (a través de una reacción antígeno-anticuerpo) sobre la superficie del sensor. Es esencial inmovilizar los agentes biológicos para su detección [23]. Una vez que las bacterias se han unido a la superficie del sensor, el anticuerpo específico recubierto con super perlas paramagnéticas circula a través del sistema uniendo de nuevo los antígenos, y se obtiene una estructura anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Se aplica un campo magnético externo y las nano partículas magnéticas producen un dipolo magnético local y esta respuesta es medida por el sensor GMR [23]. Las nano partículas magnéticas ofrecen atractivas posibilidades en el campo de la biomedicina. Abarcan un amplio rango de tamaños, desde unos pocos nanómetros hasta cientos de nanómetros, se podrían comparar con células (10-100µm), virus (20-450nm) y proteínas (5-50nm) o un gen (2nm ancho, 10-100nm longitud) [23]. El proceso de muestreo se basa en colocar la muestra a medir en el fondo del recipiente sostenedor, este previamente recubierto con un anticuerpo artificial. Los antígenos se asociaran al anticuerpo artificial y la bacteria será inmoviliada en la superficie del recipiente. Ahora las nano partículas magnéticas se asocian a la bacteria. Cada una se marca con una nano partícula magnética. Para atraer todas las partículas al fondo del recipiente, se aplicará un campo magnético apropiado. Como las nano partículas no atacan a las bacterias podrán ser retiradas mediante una técnica de limpieza adecuada [23]. Figura 3-4. Dispositivo experimental. Concluyendo, las diferencias de concentraciones de nano partículas magnéticas han sido mezcladas con hexano y centrifugadas para posteriormente testearlas con el sensor GMR. El dispositivo tiene gran sensibilidad, y la superficie sensorial ha sido cubierta con diferentes materiales como óxido de silicona, nitruro de silicona y poliestireno. Los resultados indican que el mu-metal (aleación de Fe-Ni de alta permeabilidad) puede reducir el ruido debido a los factores ambientales. En el futuro se espera trabajar en este proyecto para marcar las bacterias y cuantificar la cantidad de ellas que viven en la muestra [23]. 17 17 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos 3.3.2.3.2 Sistema-de-deteccio+ n-de-bacterias-mediante-sensor-capacitivo-con-tecnologı+a-CMOS.- En esta sección se trata el diseño e implementación de un Semiconductor Oxido-Metal Complementario (CMOS) basado en un sistema sensorial integrado empleando bacteriófagos (virus que infectan exclusivamente a las bacterias) u organismos bacteriófagos como elementos de reconocimiento para la detección de bacterias letales como E.Coli y Salmonella [24]. El sistema se basa en monitorear los cambios en las señales de capacitancia que se dan cuando las bacterias objeto atacan la interfaz sensorial. El sistema se ha diseñado según la tecnología DALSA 0.8µm, que consiste en inter-digitalizar la estructura del condensador y la detección de la señal y procesar el circuito. La detección de la señal y el procesamiento se hacen mediante Carga Basada en la Medida de la Capacitancia (CBCM). Los organismos bacteriófagos son inmovilizados en la superficie del condensador y juntos forman la interfaz sensorial. Se puede lograr una sensibilidad de 29.3mV/fF. El sistema opera con 5V en DC y consume un promedio de 1,7 mW [24]. Existen numerosos casos de intoxicación alimentaria en personas y animales domésticos, por ello es necesaria la vigilancia de organismos bacterianos como E.coli y Salmonella tanto en productos de la agricultura como en comida preparada. Una posible metodología para hacer frente a la problemática es el desarrollo de un pequeño, simple y práctico sistema sensorial para monitorizar a tiempo real el organismo bacteriano. Se describe un microsistema sensor de bacterias a tiempo real que promete una gran versatilidad y aplicabilidad en seguridad alimentaria, seguridad nacional y diagnósticos clínicos. Este sistema sensorial confía en el uso de bacteriófagos específicos, los cuales son virus que reconocen los receptores específicos en la superficie de la bacteria con extrema selectividad y sensibilidad. Los fagos se atan ala superficie bacteriana e inyectan su material genético. En muchos casos, la inyección del material genético también causa la muerte en la bacteria. La tecnología CMOS capacitiva ofrece, para este sensor, algunas ventajas como su pequeño tamaño, rápida respuesta y bajo coste en la producción en masa [24]. En la siguiente figura se puede ver como sería el diseño del sensor capacitivo CMOS: Figura 3-5. Diagrama esquemático del sensor capacitivo CMOS. El sensor emplea una arquitectura con diferentes condensadores usando condensadores sensoriales y condensadores de referencia para lograr mejorar la resolución y el ruido. Tanto el sensorial como el de referencia tienen idénticas estructuras inter-digitalizadas requeridas para la inmovilización de los fagos y proteger contra la hidratación. Las bacterias objeto consiguen asociarse a los fagos inmovilizados del condensador sensorial, el cual cambia la capacitancia del conjunto de condensadores interrumpiendo el campo eléctrico existente entre las agujas inter-digitalizadas como se muestra en la figura. Estado del arte en la detección de bacterias 18 Figura 3-6. Sección transversal de la interfaz sensorial. De este modo el circuito mide la diferencia de capacitancia entre el condensador sensorial y de referencia y prevé al circuito de un voltaje de salida. El circuito CMOS está diseñado para convertir los cambios en las señales de capacitancia, con una resolución de unos pocos de femtoFaradio en señales de voltaje medibles. Se usa un circuito basado en la Medida de la Carga Basada en la Capacitancia (CBCM), teóricamente el circuito puede detectar hasta 1aF de cambio en la capacitancia [24]. Figura 3-7. Representación esquemática del CBCM. Los transistores son conducidos por dos señales de no solapamiento (Vp y Vn) para evitar la corriente cruzada entre la fuente de alimentación (Vdd) y la tierra. Tradicionalmente, la tecnología de fagos es centralizada en la descontaminación y hoy en día se usan como receptores de reconocimiento de bacterias. Figura 3-8. Estructura de un bacteriófago. Los bacteriófagos son virus que reconocen receptores específicos con extrema selectividad y sensibilidad en la superficie de las bacterias. Se ha aprovechado la ventaja de estos virus para reconocer las bacterias objeto 19 19 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos mediante los receptores funcionales localizados en sus colas. Los fagos son ubicuos en la naturaleza, inofensivos a los seres humanos, mucho más baratos y más fáciles producir que los anticuerpos, presentan una vida útil más larga que estos últimos. Pueden ser inmovilizados de manera semejante los anticuerpos o pruebas de ADN. Por esta razón, el dispositivo presentado es simple, rápido y de bajo coste comparado con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el método ELISA [24]. 3.3.2.3.3 Estudio-experimental-a-la-respuesta-se-un-sensor-capacitivo-ta+ ctil-a-la-bacteria-E.Coli.-- La Escherichia coli o E.Coli es el patógeno dominante en Infecciones del Tracto Urinario (UTIs) en más del 80% de los casos. Como se ha mencionado ya, los métodos tradicionales para detectar este tipo de infecciones son caros y lentos. En esta sección se estudia la posilibidad de diagnosticar UTIs mediante el uso de un sensor capacitivo [25]. Las infecciones del tracto urinario (UTIs) son las infecciones bacterianas más comunes en las cuales una o más partes del tracto urinario se acaban infectando. La bacteria intestinal E.coli, infecta entorno al 80%-85% de todas las infecciones del tracto urinario. Staphylococcus saprophyticus es encontrada en el 15% de los casos. Otras como Klebsiella pneumonia, Enterococcus, Proteus mirabilis y Pseudomonas aeruginosa también con causantes de UTIs [25]. El diagnóstico de UTIs se realizada normalmente con métodos convencionales de análisis. Pero la concentración mínima de la bacteria para su detección es 105 colonias/mL. Es un método costoso, lento (24- 48h) y tedioso. Existen tiras medidoras, pero no tienen suficiente sensibilidad. Estas tiras detectan una enzima llamada leukocyte esterase que indica alta actividad de leucocitos. UTIs pueden causar serias secuelas si no se tratan. Por lo tanto, es de vital importancia un dispositivo capáz de detectar rápidamente este tipo de infecciones. Las pruebas experimentales se realizan con un líquido de laboratorio con crecimiento de bacterias E.coli. Los sensores táctiles capacitivos se han ido haciendo populares por razones de usabilidad, robustez, coste y eficiencia. Actualmente, se usan en un amplio rango de aplicaciones para ordenadores, dispositivos industriales y teléfonos móviles. Este tipo de sensor trabaja en detectar el cambio de la capacitancia cuando un objeto, tal como un dedo humano, toca el sensor. Hay dos tipos principales de métodos sensoriales capacitivos, capacitancia mutua y auto-capacitancia. En el siguiente capítulo se estudia con más detalle la tecnología capacitiva. Figura 3-9. Método de detección de capacitancia mutua. En capacitancia mutua, un campo electromagnético es generado y detectado en el receptor cuando una corriente eléctrica es aplicada en el transmisor. Cuando un objeto toca el área del sensor, algunos campos son absorbidos y, la capacitancia disminuye. Este tipo de capacitancia, permite medir al sistema cada nodo individualmente y detectar múltiples toques. Este método se usa con algunos materiales (dieléctricos), los cuales permiten la carga si están juntos. Si un dedo u otro objeto conductor vuelve a cerrar los dos objetos conductores, la carga entre campos de los dos objetos cambiará [25]. En auto-capacitancia, Cp es una capacitancia parásita. Cuando un objeto se aproxima al área del sensor, CT (capacitancia táctil) se añade al sensor. Cuando un dedo o un dieléctrico toca la pantalla, cambia la auto- Estado del arte en la detección de bacterias 20 capacitancia del electrodo. Cada electrodo representa diferentes pares coordinados y están conectados individualmente al controlador. Este decide la posición del toque según que fila o columna está más cerca de la localización del toque [25]. Figura 3-10. Método de detección de auto capacitancia. Las pruebas experimentales llevan a utilizar la auto-capacitancia en este tipo de sensor. Para la preparación de la muestra objeto se usa un medio de cultivo compuesto de una solución enriquecida usada para el crecimiento de organismos, en este caso para Escherichia coli. En este experimento se usa caldo tríptico de soja (TSB). La E.coli se mezcla con el medio de cultivo a 150 rpm durante 24 horas antes de su uso. Se hacen diluciones de la muestra con TSB para adquirir la dilución deseada [25]. Figura 3-11. Procedimiento de dilución utilizando TSB. Se utilizó un regulador universal CY3280-20x66 CapSense y un módulo simple de pantalla táctil CY3280- BSM Cypress, instalando el software adecuado en un ordenador. Se cubren los componentes electrónicos de la pantalla táctil con polipropileno (PP). Un paciente voluntario cede muestra de orina, la cual es testeada 3 horas después de ser obtenida [25]. Con una pipeta, se echa gota a gota cada solución en la superficie de la pantalla táctil. Mediante un contador (RAW Count value) se compara cada muestra con el estado inicial del contador. Se realiza seis veces la prueba para cada muestra, con el fin de obtener resultados concluyentes. Cuando la capacitancia se mantiene constante (para 100 microlitros), se puede determinar la sensibilidad del sensor [25]. Se realizaran pruebas con el medio de cultivo, con el liquido E.coli y con la muestra de orina tomada, para poder comparar los resultados. A) Medio de cultivo: 21 21 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Se estudia en primer lugar la respuesta del sensor táctil al medio de cultivo usado para diluir la muestra. El resultado será comparado con la respuesta del sensor al líquido E.coli. En la siguiente figura puede verse como el contador RAW aumenta según aumenta el volumen. Se observa que la capacitancia cambia exponencialmente hasta un volumen de 100 microlitros donde se mantiene constante. Figura 3-12. Respuesta del sensor táctil en el contador RAW con el aumento de volumen. B) Líquido E.coli: El líquido E.coli fue cultivado en caldo tríptico de soja (TSB). Fueron necesarias 10-1 diluciones para obtener el número de colonias E.coli usadas en esta prueba. La respuesta del sensor al líquido E.coli, como puede verse en la siguiente figura, es idéntica a la respuesta con el medio de cultivo. Entonces, el contador RAW se incrementa según aumenta la concentración E.coli. Figura 3-13. Respuesta del sensor táctil en el contador RAW al líquido E.coli en diferentes concentraciones y al medio de cultivo. C) Muestra de orina con líquido E.coli: Ahora se mezclan 9900 microlitros de orina con 100 microlitros de E.coli en cuatro concentraciones diferentes. En la siguiente figura puede verse como la muestra de orina mezclada con E.coli da resultados más altos comparando con el líquido E.coli. La respuesta es similar a las pruebas anteriores. La sensibilidad calculada fue de 22 conteos por pF. Estado del arte en la detección de bacterias 28 - Ante vibraciones, cambios de temperatura, cambión de tensión de alimentación u otros factores externos; la frecuencia se mantiene estable. Un sensor capacitivo está compuesto por distintos elementos, los cuales se pueden ver en el esquema siguiente: Figura 3-22. Esquema partes de un sensor capacitivo. El primer elemento, el oscilador, consiste en un circuito electrónico, que utilizando componentes activos (transistor, circuito operacional) y una red resonante (bobina, condensador), produce una señal electrónica repetitiva que puede ser una onda senoidal, cuadrada, triangular, etc. El circuito que forma el oscilador permite, a través de una fuente de baja frecuencia o corriente continua, obtener señales de corriente alterna. La esencia del oscilador es generar una señal periódica propia, sin necesidad de tener que aplicar señal de entrada [29]. Mediante cambios en la capacidad producida entre los electrodos, se pueden obtener variaciones en la frecuencia de trabajo aprovechando la sensibilidad del sensor. La capacidad medida se compone de dos partes, electrodos y dieléctrico existente entre ellos. Son componentes esenciales para determinar aplicaciones y sensibilidad del sensor. - Electrodos: en un sensor capacitivo, los electrodos se describen como dos placas metálicas con forma geométrica y tamaño determinado, conectados a la salida del oscilador. Según la señal alterna emitida por el oscilador variará la capacidad medida. Tienen la función de crear un condensador entre las dos placas. - Dieléctrico: se trata de un aislante que tiene la propiedad de formar dipolos eléctricos en su interior bajo la acción de un campo eléctrico. Evita el paso de corriente, y tiene la función de aumentar la capacitancia del condensador formado entre los electrodos. Tras describir la composición de un oscilador y sus elementos, se estudian los osciladores de radiofrecuencia que son los más adecuados a las exigencias del presente trabajo. Los osciladores de radiofrecuencia más adecuados son los siguientes: - Osciladores Pierce - Osciladores Colpitts (LC) 3.4.2.1 Osciladores Pierce Las configuraciones más comunes para osciladores, usando cristales, son; el discreto, de circuito integrado (IC) y el medio puente RLC. El discreto de Pierce es adecuado si se requiere buena estabilidad en la frecuencia y un circuito sencillo. Si prevalece la necesidad de bajo coste y capacidad de interface digital sencilla, será mejor opción un oscilador Pierce con circuito integrado. La mejor opción, para asegurar estabilidad de la frecuencia, es el medio puente RCL [29]. La principal ventaja del oscilador discreto de Pierce es que, este diseño desarrolla alta potencia de la señal de salida mientras que disipa poca potencia en el cristal, lo cual es una ventaja. Otra ventaja es que la estabilidad de frecuencia a corto plazo es muy buena (la carga Q en el circuito de entrada es casi tan alta como la Q interna). La única desventaja es que, el oscilador requiere un amplificador de alta ganancia, es necesario Oscilador Capacidad medida Electrodos Dieléctrico 29 29 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos utilizar un solo transistor de alta ganancia o amplificador de etapas múltiples. Figura 3-23. Circuito para un oscilador discreto de Pierce de 1MHz. El oscilador con circuitos integrados de Pierce, proporciona menos estabilidad de frecuencia, pero implantándolo con un diseño digital sencillo de IC reduce el costo sobre los diseños discretos. Para asegurar que empiecen las oscilaciones, se invierte la entrada y salida del primer amplificador, y el segundo amplificador convierte la salida del primero a una oscilación completa del punto de corte de saturación, reduciendo los tiempos de descarga y crecimiento como el búfer de la salida del primer amplificador. Figura 3-24. Circuito para un oscilador de Pierce IC. Resumiendo, los osciladores Pierce utilizan un cristal de cuarzo, el cual confiere al circuito gran estabilidad en frecuencia una vez que está en resonancia. Por esa razón, es complicado obtener osciladores con frecuencia variable, lo que hace que sea poco adecuado para la aplicación que se estudia, en la que se necesita un amplio margen de frecuencia donde el sensor capacitivo pueda operar correctamente. Puede usarse un componente cerámico en vez de cristal de cuarzo, mejora el rango de frecuencia donde operar pero pierde estabilidad en frecuencia. Destacar también que tienen gran sensibilidad a la temperatura ambiental, otro factor a tener en cuenta para descartar en la aplicación que se quiere. 3.4.2.2 Oscilador de Colpitts (LC). Este tipo de osciladores utilizan un circuito tanque LC para los componentes que determinan el valor de la frecuencia. La operación de este circuito tanque involucra un intercambio de energía entre cinética y potencial. En la figura se muestra la secuencia de operación del circuito tanque LC. La corriente se inyecta en el circuito (instante t1), intercambiándose la energía entre inductor y capacitor, produciendo el voltaje de salida de corriente alterna correspondiente (desde t2 a t4). En la figura se muestra la onda de voltaje de salida. Estado del arte en la detección de bacterias 30 Figura 3-25. Circuito tanque LC: acción del oscilador y efecto del volante. Figura 3-26. Forma de onda de salida La frecuencia de operación de un circuito tanque LC es la frecuencia de resonancia de la red LC en paralelo, y el ancho de banda es una función del factor de calidad Q del circuito [29]. Para un circuito tanque LC con Q=10 la frecuencia de resonancia se puede aproximar por la siguiente ecuación de la frecuencia de resonancia. 𝑓 "=1 2𝜋 (𝐿𝐶) (3–1) Entre los osciladores LC los más utilizados son el oscilador Colpitts y el oscilador Hartley. A continuación, se estudia en detalle el circuito de Colpitts por ser el que más se ajusta a las necesidades del sensor. 31 31 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos El oscilador Colpitts se basa en la utilización de un divisor capacitivo en lugar de bobina con punto intermedio variable. En la figura se puede ver como Q1 proporciona la amplificación, Cc proporciona la ruta para la retroalimentación regenerativa, L1, C1a y C1b son los componentes para determinar frecuencia, Vcc es la fuente de voltaje de c.c. Figura 3-27. Esquemático del oscilador Colpitts La frecuencia de oscilación del oscilador Colpitts se puede aproximar con la ecuación anterior 1, siendo C: 𝐶 = 𝐶+,𝐶+- 𝐶+, + 𝐶+- 3.4.3 Elección de circuito oscilador para el estudio (3–2) El circuito elegido para este trabajo es el oscilador de Colpitts. Como ya se dijo anteriormente, se trata de un circuito electrónico, basado en un oscilador LC, que genera señales alternas de alta frecuencia (superiores a 400Hz). La señal generada tendrá forma senoidal. Este circuito obtiene una señal de salida sin necesidad de que exista una señal de entrada. Los cambios en la capacidad del circuito tanque provocan que la frecuencia de oscilación se modifique, ya que la frecuencia depende directamente de los valores de bobina y capacidad, como se ha mostrado en las ecuaciones. 4 RESULTADOS n este capitulo se explica el procedimiento seguido en el diseño y experimentación del sensor. En primer lugar, se muestran los resultados obtenidos del diseño del circuito; en segundo lugar, se realiza una primera simulación del circuito con oscilador de Colpitts; y por último, se muestran los resultados experimentales que llevaran a obtener conclusiones sobre el estudio realizado en este trabajo. 4.1 Resultados de simulación El circuito elegido para el estudio ha sido con el oscilador de Colpitts. Ya se comparó en capítulos anteriores frente a otros osciladores, determinando que este es el más adecuado para el objeto de este estudio. Un esquema del oscilador sería el siguiente: Figura 4-1. Esquema del circuito con oscilador de Colpitts Para realizar la simulación del circuito, se dibuja con el programa informático Orcad Capture, como se muestra en la siguiente figura: E Resultados 34 Figura 4-2. Esquemático del circuito con oscilador de Colpitts en Orcad Capture Partiendo de los siguientes valores para cada elemento del circuito: - Transistor Q2N3904 - Condensador 1, C1=5pF - Condensador 2, C2=10nF - Condensador 3, C3=100nF - Condensador 4, C4=50pF - Resistencia 1, R1=6kΩ - Resistencia 2, R2=4kΩ - Resistencia 3, R3=200kΩ - Bobina, L1=330uH - Fuente de tensión, VDC=5Vdc Se realiza un análisis englobando la variación de valores de cada elemento, hasta llegar al punto de operación más óptimo del circuito. En primer lugar, se analiza si la presencia de R3 es importante y su sensibilidad a distintos valores. Se comienza eliminando esta resistencia, y se comprueba que el circuito pierde la señal, por lo que no es viable prescindir de R3. Para el valor inicial, resulta una señal con tiempo de estabilización aceptable, esto se cumple hasta 100kΩ. Con valores menores (50kΩ, 40kΩ, 20kΩ…) la señal va empeorando, hasta que se pierde. Por lo tanto, se sabe que a valores bajos se obtiene una mala señal, y quitar la resistencia no es una opción. Lo más acertado es mantener la resistencia con el valor inicial, 200kΩ, para obtener una buena señal y respuesta. 35 35 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Por otro lado, se analiza C3. Este elemento tiene influencia en el tiempo de estabilización del circuito. Para el valor inicial, 100nF, el tiempo de estabilización es bueno, pero si se disminuye a 50nF, mejora notablemente. Al seguir disminuyendo, hasta 10nF, la señal de respuesta empeora y el tiempo no mejora considerablemente. Entonces, se opta por perder algo de tiempo de estabilización y no perder calidad en la señal de respuesta. Se establece un valor de 50nF para este condensador. Las resistencias R1 y R2 permiten establecer tensión continua en el circuito. Forman el punto de polarización del transistor. La suma entre ambas resistencias se fija en 10kΩ, y se comprobará a continuación que es recomendable que R1 sea mayor que R2. En la siguiente tabla se puede ver como responde el circuito, según las distintas combinaciones de valores para R1 y R2. Tabla 4–1 Análisis de la influencia de R3 en el circuito R2 (kΩ) R1(kΩ) Respuesta 1 9 Tiempo de estabilización casi inexistente. Buena señal. 2 8 Tiempo de estabilización aumenta. Buena señal. 3 7 Tiempo de estabilización aumenta. Señal empeora ligeramente. 4 6 La señal de respuesta transitoria aumenta y el error de estabilización es mayor. 5 5 La señal de respuesta transitoria aumenta y la respuesta estacionaria tarda más en alcanzarse. 6 4 Ídem. 7 3 Ídem. 8 2 Ídem. 9 1 La señal de respuesta estacionaria es muy pequeña y la señal de respuesta transitoria muy grande. Para la combinación de valores, R2=1kΩ y R1=9kΩ; se obtiene el mejor resultado. La variación del valor de la bobina, afecta directamente a la frecuencia de oscilación. Por lo tanto se toman valores por encima y por debajo del inicial, y se recopilan datos de frecuencia. En la siguiente tabla se muestran los resultados de la frecuencia resultante: Tabla 4–2 Análisis de la influencia de L en el circuito L (uH) f (MHz) 2000 0,47 1500 0,55 750 0,75 Resultados 36 550 0,9 480 0,95 450 1 420 1,02 390 1,08 360 1,11 330 1,16 300 1,22 280 1,26 260 1,32 240 1,36 220 1,43 200 1,5 180 1,57 160 1,65 170 1,6 Se puede observar que para valores altos de inductancia, la frecuencia tiende a cero; y para valores bajos de inductancia la bobina consigue altas frecuencias. Adoptando un valor de 330uH para L1, se analizaran los condensadores presentes en el circuito. El condensador encargado de asegurar la oscilación, será C1. A continuación, se estudia como afecta al circuito con distintos valores, y se valorará la posibilidad de eliminarlo. Tabla 4–3 Análisis de la influencia de C1 en el circuito C1 (pF) Respuesta 5 Buena. 4 No afecta, la respuesta sigue siendo buena. 3 No afecta, la respuesta sigue siendo buena. 2 No afecta, la respuesta es buena y la frecuencia es más limpia. 1 Afecta a la respuesta, produciendo frecuencia 37 37 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos con ruido. 0 (Se elimina) Se produce resonancia en el circuito. Se descarta la opción de eliminar dicho condensador, debido a la resonancia. Por lo que se deduce que debe existir, aunque tenga un valor bajo. La capacidad que se creará entre las placas, debida a la presencia de bacterias en el líquido ascítico, será la correspondiente a C4. Se analizará la respuesta del circuito a distintos valores y la sensibilidad entre cada transición. Para la sensibilidad se aplicará la siguiente fórmula: 𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 =|9 :;9 <| =:>=< : (4–1) Tabla 4–4 Análisis de la influencia de C4 en el circuito C4 (pF) Respuesta 10 Se produce resonancia. 20 La oscilación no es correcta. 30 La respuesta transitoria aumenta y el circuito oscila peor, f>2MHz. 40 La respuesta es buena, la frecuencia aumenta. 50 La respuesta es buena y el circuito oscila correctamente. 60 El circuito oscila correctamente, pero la frecuencia disminuye. 75 El circuito oscila correctamente, pero la frecuencia disminuye. 100 El circuito oscila correctamente, pero la frecuencia disminuye. Si se varía el valor de L a 90uH, frecuencia aumenta. Para el análisis de sensibilidad, se tomarán valores de 50pF a 100pF, con transiciones de 5pF. Se observará entorno a que valores se produce una mayor sensibilidad. Tabla 4–5 Análisis de la influencia de C4 en el circuito C4 (pF) f1 (MHz) C4 (pF) f2 (MHz) Sensibilidad 50 1,67 55 1,6 0,043 55 1,6 60 1,54 0,038 60 1,54 65 1,46 0,053 65 1,46 70 1,43 0,021 Resultados 44 Figura 4-11. Frecuencia medida en agua destilada frente a disolución con leche La frecuencia media obtenida para cada concentración es: - Agua destilada y leche al 20%pp: 293,339 kH - Agua destilada y leche al 15%pp: 294,232 kH - Agua destilada y leche al 10%pp: 293,484 kH - Agua destilada y leche al 5%pp: 294,160 kH - Agua destilada y leche al 2%pp: 299,571 kH - Agua destilada y leche al 1%pp: 293,691 KH La disolución obtenida con leche tiene un tono blanquecino y turbio. El resultado para esta prueba no presenta una tendencia lineal. Aún así, el resultado obtenido proporciona información útil para determinar las zonas de mayor sensibilidad del sensor, en este caso, a altas y bajas frecuencia. Sería una aplicación de utilidad para que, teniendo un valor de frecuencia de oscilación medido, se pueda saber en el rango de concentración que se encuentra la disolución. Se repite el experimento con una crema de manos que contiene 5% de urea, con el fin de probar la sensibilidad del dispositivo a esta sustancia. Se consigue una disolución blanquecina y densa. Como puede observarse en el gráfico, para altas concentraciones la frecuencia medida es mayor que en bajas concentraciones, siguiendo una tendencia en descenso de los valores medidos según se hacen diluciones. 292800 293000 293200 293400 293600 293800 294000 294200 294400 20 15 10 5 2 1 Agua!Destilada!y!Leche 45 45 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Figura 4-12. Disolución agua destilada y urea La frecuencia media obtenida para cada concentración es: - Agua destilada y urea al 20%pp: 299,307 kH - Agua destilada y urea al 15%pp: 298,573 kH - Agua destilada y urea al 10%pp: 297,778 kH - Agua destilada y urea al 5%pp: 296,063 kH - Agua destilada y urea al 2%pp: 296,540 kH - Agua destilada y urea al 1%pp: 296,192 KH El resultado que se obtiene es semejante a la disolución compuesta por sal y agua, pero en este caso el máximo de frecuencia medida se da a concentraciones altas y el mínimo a la concentración menor. En el caso de 5% pp se obtiene un valor que se aleja de la tendencia de la recta, se puede deber a un error en el momento de la medición o perturbaciones externas, es por ello que no influencia la conclusión sacada del conjunto de puntos en general. En el siguiente caso, se muestra la experiencia realizada con vinagre, con el fin de obtener una disolución con pH ácido y observar el comportamiento sensorial del circuito ante estas condiciones. La disolución tiene un tono levemente amarillento. En el siguiente gráfico puede observarse como a concentraciones altas de vinagre la frecuencia de oscilación es más baja que a concentraciones menores, en las cuales se sigue una tendencia más lineal teniendo el máximo a la menor concentración. Esta prueba ha resultado de utilidad para analizar la influencia de la modificación del pH en la disolución, consiguiendo, con la adición de vinagre, una disolución ácida. 294000 295000 296000 297000 298000 299000 300000 20 15 10 5 2 1 Agua!Destilada!y!Urea Resultados 46 Figura 4-13. Disolución agua destilada y vinagre La frecuencia media obtenida para cada concentración es: - Agua destilada y urea al 20%pp: 268,050 kH - Agua destilada y urea al 15%pp: 286,882 kH - Agua destilada y urea al 10%pp: 288,631 kH - Agua destilada y urea al 5%pp: 287,955 kH - Agua destilada y urea al 2%pp: 289,580 kH - Agua destilada y urea al 1%pp: 289,987 KH El resultado muestra que a altas concentraciones la medida de frecuencia es más sensible a distintas concentraciones, puede pensarse que en disoluciones por debajo del 20%pp el sensor no tendrá buena sensibilidad. Habiendo tomado un primer contacto en el circuito experimentando con agua destilada, compuesto fácil de conseguir, se repiten los experimentos con solución de diálisis. El procedimiento seguido es el mismo, con la misma parametrización en el circuito y toma de medidas para los mismos puntos de concentración. Se comienza con una disolución compuesta por solución de diálisis y sal común, en las mismas proporciones que se la prueba realizada en el caso de agua destilada y sal común, explicado con anterioridad. En el gráfico puede observarse como la frecuencia de oscilación disminuye a concentraciones bajas de sal, lo que muestra un comportamiento contrario al caso del agua destilada. 255000 260000 265000 270000 275000 280000 285000 290000 295000 20 15 10 5 2 1 Agua!Destilada!y!Vinagre 47 47 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Figura 4-14. Disolución de solución de diálisis y sal común Se compara, este caso concreto, con la frecuencia que se obtiene cuando la bolsa contiene únicamente solución de diálisis, correspondiente al punto 0% pp del eje horizontal. La frecuencia media medida para la solución de diálisis al 0% pp ha sido de 284,188 kH. La frecuencia media medida para cada concentración ha sido de: - Solución de diálisis y Sal común al 20%pp: 290,888 kH - Solución de diálisis y Sal común al 15%pp: 289,365 kH - Solución de diálisis y Sal común al 10%pp: 288,641 kH - Solución de diálisis y Sal común al 5%pp: 288,643 kH - Solución de diálisis y Sal común al 2%pp: 288,764 kH - Solución de diálisis y Sal común al 1%pp: 268,837 kH La tendencia opuesta entre las diferentes disoluciones, puede deberse a la composición de la solución de diálisis. Esta solución contiene diferentes sales a diferencia del agua destilada, a la cual se le han eliminado las impurezas e iones mediante destilación. Para la adición de azúcar, el dispositivo muestra una alta sensibilidad en el rango comprendido entre 2% pp y 20% pp. Cabe destacar, que la solución de diálisis contiene glucosa lo que justifica la diferencia con la disolución de agua destilada y glucosa. Es posible que la concentración de azúcar deba ser mayor, que en el caso del agua destilada, para que el sensor pueda detectar esta sustancia, premisa que en este caso se cumple ya que la solución de diálisis contiene glucosa. En el siguiente gráfico pueden verse los resultados obtenidos. 280000 282000 284000 286000 288000 290000 292000 20 15 10 5 2 1 0 Solución!de!diálisis!y!Sal!común Resultados 48 Figura 4-15. Disolución de solución de diálisis y azúcar La frecuencia media medida para cada concentración ha sido de: - Solución de diálisis y Azúcar al 20%pp: 287,563 kH - Solución de diálisis y Azúcar al 15%pp: 287,295 kH - Solución de diálisis y Azúcar al 10%pp: 287,292 kH - Solución de diálisis y Azúcar al 5%pp: 288,531 kH - Solución de diálisis y Azúcar al 2%pp: 290,176 kH - Solución de diálisis y Azúcar al 1%pp: 289,740 kH En la siguiente prueba, a la solución de diálisis se le añade leche. A diferencia del caso anteriormente explicado, para la disolución de agua destilada y leche, ahora puede verse una clara tendencia al aumento de la frecuencia de oscilación medida al disminuir la concentración de soluto. Esta contrariedad muestra que la composición de la solución de diálisis provoca un cambio en la frecuencia medida con respecto a la disolución de agua destilada. En la siguiente gráfica puede observarse el comportamiento del circuito ante este cambio. En este caso la zona más sensible para la detección está en las altas concentraciones de azúcar. 285500 286000 286500 287000 287500 288000 288500 289000 289500 290000 290500 20 15 10 5 2 1 Solución!de!diálisis!y!Azúcar 49 49 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Figura 4-16. Disolución de solución de diálisis y leche La frecuencia media medida para cada concentración ha sido de: - Solución de diálisis y Leche al 20%pp: 287,563 kH - Solución de diálisis y Leche al 15%pp: 287,295 kH - Solución de diálisis y Leche al 10%pp: 287,292 kH - Solución de diálisis y Leche al 5%pp: 288,531 kH - Solución de diálisis y Leche al 2%pp: 290,176 kH - Solución de diálisis y Leche al 1%pp: 289,740 kH En la siguiente prueba, se añade vinagre (de uso culinario) a la solución de diálisis. La resultados obtenidos no permiten sacar conclusiones certeras, ya que a medida que disminuye la concentración disminuye la frecuencia media de oscilación pero a valores intermedios empieza a seguir una tendencia positiva hacia concentraciones menores. Teniendo en cuenta el resultado antes obtenido, en el caso del agua destilada, y el resultado obtenido con solución de diálisis, puede parecer que el sensor resulta muy sensible en disoluciones ácidas, ya que la tendencia es menos lineal que en el caso de disoluciones ligeramente ácidas, como en el caso de la leche. Puede observarse en el siguiente gráfico. 297000 298000 299000 300000 301000 302000 303000 304000 305000 20 15 10 521 Solución!de!diálisis!y!Leche Resultados 50 Figura 4-17. Disolución de solución de diálisis y vinagre La frecuencia media medida para cada concentración ha sido de: - Solución de diálisis y Vinagre al 20%pp: 301,807 kH - Solución de diálisis y Vinagre al 15%pp: 301,385 kH - Solución de diálisis y Vinagre al 10%pp: 301,389 kH - Solución de diálisis y Vinagre al 5%pp: 301,272 kH - Solución de diálisis y Vinagre al 2%pp: 301,586 kH - Solución de diálisis y Vinagre al 1%pp: 301,492 kH La última prueba que se realiza es adicionando crema de manos con un contenido en urea del 5%. Los resultados obtenidos muestran baja frecuencia de oscilación medida a altos valores de concentración y alta frecuencia de oscilación medida a valores menores de concentración, aunque en valores muy bajos resultan valores de frecuencia media medida menor que en concentraciones intermedias. En la siguiente gráfica pueden verse los resultados comentados. 301000 301100 301200 301300 301400 301500 301600 301700 301800 301900 20 15 10 5 2 1 Solución!de!diálisis!y!Vinagre 51 51 Diseño y desarrollo de un sensor inteligente para la detección de bacterias en fluidos Figura 4-18. Disolución de solución de diálisis y urea Se observa que el resultado obtenido no permite obtener una conclusión certera sobre la sensibilidad del dispositivo en estas condiciones, lleva a pensar que la composición de la solución de diálisis altera la medida con respecto a la disolución compuesta con agua destilada. Otra posible causa del resultado puede ser la difícil homegeneización de la crema que contiene urea con la solución, por su textura y diferencia de densidad. Por lo que, es posible que el sensor no resulte de gran utilidad para la detección de algunas sustancias presentes en la solución de diálisis. Sin embargo, este comportamiento podría indicar que el dispositivo es sensible a concentraciones en torno al 5%. Este hecho permitiría su empleo en una aplicación cuyo objetivo no fuera detectar la concentración en sí, sino la detección de una determinada concentración. 307000 307500 308000 308500 309000 309500 310000 310500 311000 20 15 10 5 2 1 Solución!de!diálisis!y!Urea 5 CONCLUSIONES ara finalizar, en este capitulo, se extraen conclusiones sobre el estudio llevado a cabo en la importancia de la enfermedad renal y sus complicaciones, así como de la revisión bibliográfica de los métodos actuales de detección de bacterias. Finalmente se sacan conclusiones en relación con los resultados obtenidos tras haber realizado el estudio experimental. También se proponen algunas mejoras futuras para el diseño y la funcionalidad del sensor. Teniendo presente la importancia de la enfermedad renal, la problemática que supone el insistente riesgo de infección en pacientes sometidos a tratamientos subsidiarios, como diálisis peritoneal, y la carencia de métodos de detección que solucionen los problemas que presentan los actuales como son largos tiempos de ensayos, laboratorios especializados, instrumentación costosa y personal capacitado [1]. Se reitera la necesidad de trabajar en el diseño de un dispositivo que permita la detección de bacterias en un fluido, cumpliendo requisitos como rapidez, sencillez, bajo coste, sensibilidad y accesibilidad. En esta primera aproximación de un sensor detector de bacterias utilizando la tecnología capacitiva, se demuestra que el sensor tiene capacidad para detectar distintas sustancias presentes en un fluido. Para el caso de la sal se obtienen muy buenos resultados ya que permite obtener datos en todo el rango de frecuencia y sigue una tendencia lineal en todo momento, tanto para el agua destilada como para la solución de diálisis, siendo de utilidad para fluidos con contenido en sales. La respuesta del sensor para soluciones ácidas es muy sensible, lo que resulta positivo para detección de bacterias en fluidos con pH ácido como es el líquido ascítico de un paciente sometido a diálisis que presenta infección. En disoluciones ligeramente ácidas como es la del disolvente con adición de leche, la respuesta lleva a la necesidad de comprobación con otras sustancias similares, debido a la obtención de resultados muy distintos en las dos disoluciones tratadas. Aunque la respuesta con picos de frcuencia en el agua destilada permite establecer una zona de gran sensibilidad del sensor a altas y bajas frecuencias. Para la detección de urea se tiene un primer resultado favorable, en el que se muestra linealidad para las distintas concentraciones y posibilidad de determinar estas en todo el rango de frecuencias. En el segundo caso el resultado no es tan favorable, pero se atribuye este a la difícil homegeneización de esta sustancia en la solución de diálisis, lo que puede llevar a falsas medidas en la frecuencia resultante. En general, el resultado de esta primera aproximación es positivo. El sensor muestra sensibilidad ante la presencia de sustancias con distintas propiedades, simulando las condiciones en las que se mediría un fluido con presencia de metabolitos procedentes de las bacterias contenidas. Como trabajo futuro, se propone la continuación de pruebas experimentales con sustancias más específicas y semejantes a los metabolitos que desechan las principales bacterias causantes de las infecciones más comúnes en pacientes sometidos a diálisis con riesgo de contraer infecciones, así como la aplicación en líquido ascítico real. Por ello, se puede concluir que el sensor desarrollado cumple con los requisitos de diseño mencionados, al ser capaz de detectar cambios en la frecuencia medida ante la presencia de distintas sustancias, no invasivo, cómodo y fácil de usar, presentando un bajo coste y posibilidad de mejora encuanto a la especificidad de sustancias y sensibilidad ante cada una de ellas. P