Regulación de la reparación de los cortes de doble cadena en el ADN: papel de la nedilación de proteínas

! Regulación de la reparación de los cortes de doble cadena en el ADN: Papel de la nedilación de proteínas MARÍA JESÚS FERNÁNDEZ ÁVILA Tesis Doctoral Universidad de Sevilla 2016 ! ! Índice General ÍNDICE GENERAL INTRODUCCIÓN………………………………………14 1. INESTABILIDAD GENÓMICA………………………………………….15 2. TIPOS DE DAÑOS EN EL ADN Y SUS CAUSAS……………………15 3. MECANISMOS DE REPARACIÓN DEL ADN………………………..19 3.1. REPARACIÓN DE EMPAREJAMIENTOS ERRÓNEOS (MMR, MISMATCH REPAIR)………………………………………………………………………………………....19 3.2. REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASES (BER, BASE EXCISION REPAIR)……….19 3.3. REPARACIÓN DE LOS DAÑOS DE CADENA SENCILLA (SSBR, SINGLE STRAND BREAKS REPAIR)…………………………………………………………………...19 3.4. REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS (NER, NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR)…………………………………………………………………………….20 3.5. TLS (TRANS-LESION SYNTESIS)………………………………………………………..21 3.6. REPARACIÓN DE LOS ENLACES INTERCATENARIOS……………………………..21 3.7. REPARACIÓN DE LOS DSBs……………………………………………………………21 4. MECANISMOS DE REPARACION DE LOS DSBs…………………..22 4.1. MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN DE LOS DSBs………………………………….22 4.2. REPARACIÓN POR UNIÓN DE EXTREMOS NO HOMÓLOGOS (NHEJ)………...28 4.2.1. Fase de Reconocimiento…………………………………………………….29 4.2.2. Procesamiento………………………………………………………………...31 4.2.3. Finalización…………………………………………………………………….32 4.3. MECANISMO DE REPARACIÓN POR NHEJ ALTERNATIVO (ALT-NHEJ) O UNIÓN DE EXTREMOS MEDIADOS POR MICROHOMOLOGÍA (MMEJ)…………..….33 4.4. RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA……………………………………………………...33 4.4.1. Resección………………………………………………………………………36 4.4.2. Invasión………………………………………………………………………...38 4.4.3. Resolución……………………………………………………………………..40 4.4.4. SSA……………………………………………………………………………..40 5. MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES (PTMs) EN LA REPARACIÓN DE LOS DSB…………………………..……………….41 5.1 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES CON UBIQUITINA………………..41 5.1.1 La ubiquitina y su conjugación a los sustratos……………………………..41 5.1.2 Función de la ubiquitinación en la reparación de los DSBs ……………..44 5.2 Modificaciones post-traduccionales con SUMO………………………………………45 5.3 Modificaciones post-traduccionales con NEDD8……………………………………..47 5.3.1 NEDD8………………………………………………………………………….47 5.3.2 Las denedilasas………………………………………………………………..50 5.3.3 Papel de la nedilación en la respuesta al daño en el ADN……………….52 OBJETIVOS…………………………………………………….56 Índice General ! ! RESULTADOS…………………………………………..59 1. CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA DE REPARACIÓN IN VIVO SEE-SAW REPORTER (SSR). DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE UN ESCRUTINIO CON UNA LIBRERÍA DE esiRNAs Y EL SISTEMA SSR2.0…………………………………….................61 1.1. DESCRIPCIÓN DEL SISTEMA SSR……………………………………………………..61 1.2. SENSIBILIDAD DEL SISTEMA SSR AL SILENCIAMIENTO DE GENES IMPLICADOS EN REPARACIÓN (NHEJ/HR)……………………………………………….65 1.3. EFECTO DE LA DEPLECIÓN DE GENES IMPLICADOS EN LA RESPUESTA AL DAÑO DEL ADN EN EL SISTEMAS SSR……………………………………………………68 1.4. DISEÑO Y PUESTA A PUNTO DE UN PROTOCOLO DE ESCRUTINIO MASIVO DE GENES QUE AFECTAN EL EQUILIBRIO NHEJ/HR USANDO UNA LIBRERÍA DE ESIRNAS EN UN FORMATO DE PLACA DE CULTIVO DE 96 POCILLOS…………………………………………………………………………………..72 1.5. ESTABLECIMIENTO DEL FLUJO DE TRABAJO PARA EL ESCRUTINIO (WORKFLOW)………………………………………………………………………………….78 2. PAPEL DE LA NEDILACIÓN EN LA REGULACIÓN DEL EQUILIBRIO ENTRE NHEJ Y HR………………………………..81 2.1. EFECTO DE UN CONJUNTO DE INHIBIDORES UTILIZADOS EN ENSAYOS CLÍNICOS Y RELACIONADOS CON LA DDR SOBRE EL BALANCE ENTRE REPARACIÓN POR NHEJ Y HR……………………………………………………………...81 2.2. LA NEDILACIÓN INHIBE LA RESECCIÓN DEL ADN Y POR TANTO LA RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA…………………………………………………………...83 2.3. LA NEDILACIÓN ES UN PROCESO QUE ESTÁ IMPLICADO EN LA RESECCIÓN MEDIADA POR CtIP…………………………………………………………...85 2.4. MEDIADA POR CtIP QUE AFECTA A LA VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS…………87 2.5. LA INTERACCIÓN ENTRE CtIP Y BRCA1 ESTÁ CONTROLADA POR NEDILACIÓN…………………………………………………………………………………..88 2.6. LA PROTEÍNA E3 LIGASA RNF111 Y LA PROTEÍNA E2 UBE2M BLOQUEAN LA RESECCIÓN DEL ADN GENERANDO UN DESEQUILIBRIO EN EL RATIO NHEJ/HR………………………………………………………………………………………..91 2.7. LAS DENEDILASAS CSN1 Y NEDP1 MEDIAN EN LA REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA DE LOS CORTES DE DOBLE CADENA…………….95 2.8. LA NEDILACIÓN ESTÁ IMPLICADA EN LA ELECCIÓN DE LA RUTA PARA REPARAR LOS DAÑOS PRODUCIDOS POR ROTURAS DE DOBLE CADENA………...99 DISCUSIÓN……………………………………………103 CONCLUSIONES…………………………………….120 Índice General ! ! MATERIALES Y MÉTODOS…………………………124 1. TÉCNICAS DE CULTIVO CELULAR…………………………………127 1.1 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO…………………………………………….127 1.1.1. Subcultivado…………………………………………………………………130 1.1.2. Crioconservación ……………………………………………………………130 1.1.3. Cultivo en presencia de inhibidores………………………………………130 1.2. TRANSFECCIÓN………………………………………………………………………..131 1.2.1. siRNAs………………………………………………………………………..131 1.2.2. DNA plasmídico……………………………………………………………..132 1.2.2.1. Fugene……………………………………………………………132 1.2.2.2. Fosfato Cálcico ………………………………………………….133 1.3. PRODUCCIÓN Y TRANSDUCCIÓN VIRAL…………………………………………..134 1.3.1. Transducción en dos pasos………………………………………………...134 1.3.2. Transducción en un paso…………………………………………………..135 1.4. ENSAYOS DE SUPERVIVENCIA CELULAR (CLONOGÉNICOS)…………………..135 1.5. CITOMETRÍA DE FLUJO……………………………………………………………….136 1.5.1. Análisis del Ciclo Celular…………………………………………………...136 1.5.2. Titulación de la producción lentiviral……………………………………..136 1.5.3. Análisis de proteínas fluorescentes por FACs……………………………137 1.6. ENSAYOS DE REPARACIÓN IN VIVO ……………………………………………….137 1.6.1. Descripción de los Sistemas de Reparación in vivo……………………..138 1.6.2. Ensayos de Reparación con el sistema SSR………………………………140 1.6.2.1. Con inhibidores…………………………………………...……..141 1.6.2.2. shRNAs……………………………………………………………141 1.6.2.3 siRNAs……………………………………………………………..141 1.6.3. Ensayos de Reparación con los Sistemas DR-GFP, EJ5 y SA-GFP en presencia de MLN4924…………………………………………………………….142 1.7. INDUCCIÓN DEL DAÑO CELULAR MEDIANTE IRRADIACIÓN…………...……..143 2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR…………………………..143 2.1. MANIPULACIÓN DEL ADN……………………………………………………………143 2.1.1. Amplificación de ADN plasmídico………………………………………...143 2.1.2. Electroforesis de ADN en geles de agarosa……………………………..144 2.1.3. Digestión del ADN con enzimas de restricción………………………….144 2.2. ANÁLISIS DEL ARN……………………………………………………………………..144 2.3.1. Extracción de ARN…………………………………………………………..144 2.3.2. Cuantificación de ARN total………………………………………………..144 2.3.3. Síntesis de cDNA……………………………………………………………145 2.3.4. PCR Cuantitativa…………………………………………………………….145 Índice General ! ! 2.3. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS……………………………………………………………..147 2.3.1. Extracción de proteínas en condiciones desnaturalizantes…………….147 2.3.2. Extracción de proteínas en condiciones nativas…………………………147 2.3.3. Cuantificación de proteínas mediante Nanodrop……………………….148 2.3.4. Cuantificación de proteínas mediante la técnica de Bradford…………148 2.3.6. Electroforesis de proteínas en SDS-PAGE………………………………..148 2.3.7. Transferencia de proteínas a membranas de PVDF……………………..148 2.3.8. Inmunodetección de proteínas (Western blot)…………………………..148 2.3.9. Inmunoprecipitación (IP) de proteínas……………………………………149 3. TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA………………………………………151 3.1. INMUNOFLUORESCENCIA PARA FOCOS DE RPA Y γH2AX……………………151 3.2. INMUNOFLUORESCENCIA PARA FOCOS DE RIF1………………………………..153 3.3. ESCRUTINIO MASIVO EN SISTEMA DE ADQUISICIÓN DE IMÁGENES IMAGEXPRESS MICRO (MOLECULAR DEVICES)………………………………………...154 3.3.1. Adquisición de imágenes en el microscopio IMAGEXPRESS………….154 3.3.2. Flujo de trabajo para el procesamiento y almacenaje de datos……….155 3.3.3. Análisis de imágenes mediante el software MetaXpress……………….155 4. AUTOMATIZACIÓN DEL PROCESAMIENTO CELULAR MEDIANTE EL ROBOT MICROLAB STAR DE HAMILTON……..157 4.1. PROTOCOLO DÍA 0: DILUCIÓN DE LOS esiRNA EN MEDIO OPTIMEM………157 4.2. PROTOCOLO DÍA1: TRANSFECCIÓN REVERSA…………………………………...157 4.3. PROTOCOLO DÍA1: RENOVACIÓN MEDIO DE CULTIVO………………………..158 4.4. PROTOCOLO DÍA 4: LAVADOS DE LOS CULTIVOS Y FIJACIÓN………………..158 5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO………………………………………………158 BIBLIOGRAFÍA……………………………………….159 ANEXO…………………………………………………180 Índice de Figuras y Tablas ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figura I1. Esquema de los agentes más comunes causantes de daños en el ADN y los tipos de reparación. Figura I2. La respuesta al daño en el ADN. Figura I3. Representación esquemática de los diferentes modificadores post-trasduccionales implicados en la señalización de los DBSs. Figura I4. El NHEJ en células de mamíferos. Figura I5. Mecanismos de reparación de los DBSs mediante homología de secuencia en células mamíferos. Figura I6. Modelo de circuito de control para la elección de reparación de los DSBs. Figura I7. Esquema del ciclo de la ubiquitina. Figura I8. Homología de secuencias de NEDD8 y el ciclo de nedilación/denedilación. Figura I9. Estructura química del MLN4924. Figura I10.Esquema sobre las distintas rutas moleculares según las enzimas E2-RING de la cascada de nedilación. Figura R1. Representación esquemática de los sistemas SSR1.0 y SSR2.0. Figura R2. Caracterización inicial de los sistemas SSR. Figura R3. Niveles de silenciamiento obtenidos por depleción con shRNAs de genes que afectan el equilibrio entre la reparación por NHEJ y HR. Figura R4. Sensibilidad de los sistemas SSR al silenciamiento de genes de reparación por NHEJ y de genes implicados en la resección del ADN. Figura R5. Distribución del ciclo celular en células U2OS deplecionadas para diversos genes mediante shRNAs. Figura R6. Niveles de silenciamiento obtenidos por depleción con shRNAs de genes que afectan a la respuesta al daño en el ADN. Figura R7. Sensibilidad de los sistemas SSR a defectos en la respuesta al daño en el ADN (DDR). Figura R8. Distribución del ciclo celular en células U2OS deplecionadas para diversos genes mediante shRNAs. Figura R9. Ensayos de transfección reversa para la optimización del protocolo y su aplicación en el escrutinio masivo de genes. Figura R10. Selección del tiempo de formación de los complejos (lipofectamina RNAimax+esiRNA). Figura R11. Ensayos de dispensación celular automatizados mediante el empleo del robot MicroLab Star de Hamilton. Figura R12. Representación esquemática del flujo de trabajo establecido para el escrutinio de una librería de esiRNAs. Figura R13. Escrutinio con pequeños inhibidores que alteran el ratio NHEJ/HR. Figura R14. Comprobación del tratamiento con MLN4924 mediante el análisis del ciclo celular y del patrón de nedilación global de las proteínas. Figura R15. Efecto del inhibidor de la nedilación MLN4924 sobre la resección del ADN. Introducción ! 16! Enfermedades asociadas a mutaciones en los genes de DDR y de reparación del ADN Síndromes asociados Genes mutados Xerodermia pigmentosa XPA-XPG, Pol η Síndrome Bloom BLM Predisposición a cáncer y linfomas (Deficiencia en la recombinación V(D)J) Ku70, Ku80 Síndrome Lig4, inmunodeficiencia con microcefalea Ligasa IV de ADN, XLF/Cerunnos RS-SCID (Inmunodeficiencia severa combinada radiosensible), linfomas Artemis Cáncer de mama y ovario (Deficiencia en la recombinación homóloga) BRCA1, BRCA2 Anemia de Fanconi FANCA-FANCM, BRCA2, FANCD2 (FANCD1) Síndrome de Lynch o HNPCC (cáncer colorecal no polipósico hereditario) MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, PMS2 Predisposición a cáncer de mama familiar (distinto BRCA1/2) Chk2, MRN, ATM, PALB2 Ataxia telangiectásica ATM Desorden similar a Ataxia telangiectásica MRE11 Síndrome Li-Fraumeni (sarcomas, cáncer mama y cerebro) p53, CHEK2 Síndrome Nijmegen (NBS) NBS1 Síndrome similar NBS RAD50 Síndrome RIDDLE (radiosensibilidad, inmunodeficiencia, distrofia y dificultades de aprendizaje) RNF168 Retinoblastoma Rb Síndrome de Seckel ATR, CtIP, SCKL3 Tabla I1. Enfermedades asociadas a defectos en los genes de DDR. Los defectos en genes implicados en las diferentes fases de la respuesta al daño conllevan la predisposición a padecer cáncer, enfermedades neurodegenerativas y otros síndromes. Tabla modificada a partir de Hartlerode & Scully 2009; Ciccia & Elledge 2010; Jackson & Bartek 2009; Aguilera & Gómez-González 2008. Los daños generados de manera endógena son los originados como consecuencia del propio metabolismo celular (Tabla I2). Las principales fuentes de este tipo de daño son el bloqueo de la replicación o la transcripción y procesos bioquímicos como la incorporación no correcta de los dNTPs durante la replicación, la interconversión de las bases nitrogenadas por reacciones de deaminación, la pérdida de dichas bases por procesos de depurinización, Introducción ! 17! reacciones de oxidación por las especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas como subproductos de la respiración oxidativa o reacciones redox y las alquilaciones de las bases nitrogenadas (Ciccia & Elledge 2010). Origen endógeno de los daños en el ADN Tipo de lesión generada Número de lesiones/Célula/día Depurinización Generación de sitio apurínico/apirimidínico 10.000 Deaminación de citosina Transición de bases 100-500 Metilación desde S-Adenosil metionina (SAM) 3meA, 7meG, O6meG 10-600 Oxidación 8oxoG 400-1500 Origen exógeno de los daños en el ADN Tipo de lesión generada Número estimado de lesiones/célula Picos de horas de luz Dímeros de pirimidinas (6-4) fotoproductos 100.000/día Humo de los cigarrillos Aductos aromáticos de ADN 45-1029 (1) Radiografía de pecho DSBs 0,0008 (2) Radiografía dental DSBs 0,0002 (2) Mamografía DSBs 0,016 (2) Tomografía computerizada de cuerpo DSBs 0,28 (2) Tomografía computerizada de cabeza DSBs 0,08 (2) Angioplastia coronaria DSBs 0,88 (2) PET scan (F18) DSBs 0,4 (2) Tratamiento con I131 DSBs 2.8-6 Radioterapia DSBs 72-80 (3) Viaje en avión DSBs 0.0002/hr Misión espacial (60 días) DSBs 2 Accidente de Chernobil DSBs 12 Bombas atómicas de Hiroshima y Nagasaki DSBs 0.2-160 (1) Aductos de ADN detectados en el pulmón de fumadores que tomaban entre 1-2 paquetes de cigarrillos al día durante aproximadamente 40 años. (2) Dosis efectiva recibida por la totalidad del cuerpo; la absorbida por un tejido específico sería más alta. (3) Dosis típica administrada por día en el tratamiento del cáncer. Tabla I2. Tipos de lesiones generadas en el ADN por agentes endógenos y exógenos. Clasificación de las fuentes de daño según su origen, los tipos de lesiones generadas y estimación del número de lesiones. Tabla modificada a partir de Ciccia & Elledge 2010. Introducción ! 18! Los daños generados por agentes exógenos son causados por agentes externos a la célula y al organismo en el que se encuentre dicha célula (Ciccia & Elledge 2010) (Tabla I2). Por lo general, dichos agentes tienen un carácter artificial como el tabaco, la exposición a rayos X durante las radiografías, la exposición por accidentes nucleares o a tóxicos medioambientales… Sin embargo, también hay agentes exógenos de origen natural como los rayos solares. Las radiaciones ionizantes (IR) y la radiación ultravioleta (UV) proveniente de la luz solar, son los agentes genotóxicos físicos más penetrantes y pueden inducir hasta 105 lesiones en el ADN (dímeros de pirimidinas y fotoproductos) por célula y hora de exposición (Jackson & Bartek 2009). La IR procedente de radiación cósmica y de tratamientos médicos que emplean rayos-X o radioterapia, puede inducir la oxidación de las bases nitrogenadas del ADN y generar roturas en una de las cadenas del ADN (SSBs, single-strand breaks) o en las dos (DSBs, double-strand breaks) (Hoeijmakers 2009) (Tabla I2). Hoy en día, los agentes químicos que causan cáncer más importantes y comunes actúan infligiendo daños en el ADN, como aquellos generados como subproductos del tabaco, ya que causan una variedad de daños oxidativos en el pulmón, cavidad oral y otros tejidos adyacentes. Muchos agentes químicos usados en quimioterapia contra el cáncer actúan causando lesiones en el ADN favoreciendo la muerte de las células tumorales dado que estas células suelen ser más sensibles al daño por su capacidad replicativa y porque en muchas ocasiones son tumorales por defectos en alguna ruta de reparación del daño en el ADN. Algunos agentes químicos empleados en quimioterapia dan lugar a alquilaciones, como ocurre con el metilmetanosulfonato (MMS) y la temozolomida, que ataca los grupos alquilos de las bases; agentes como la mitomicina C (MMC), el cisplatino, el psoraleno y el gas mostaza inducen enlaces covalentes entre bases dentro de la misma hebra de ADN (intrastrand crosslinks) o entre bases de diferentes hebras de ADN (interstrand crosslinks o ICLs) (Ciccia & Elledge 2010). Otros agentes químicos tales como los inhibidores de las topoisomerasas I y II, camptotecina (CPT) y etopósido respectivamente, inducen la formación de SSBs o DSBs por generación de una unión covalente entre el ADN y las topoisomerasas durante la replicación del ADN (Heisig 2009). Introducción ! 19! 3. MECANISMOS DE REPARACIÓN DEL ADN La amplia diversidad de tipos de lesiones en el ADN que se pueden producir hace que se necesiten múltiples y diversos mecanismos de reparación más o menos especializados (Figura I1) (Jackson & Bartek 2009). 3.1. REPARACIÓN DE EMPAREJAMIENTOS ERRÓNEOS (MMR, MISMATCH REPAIR) Los emparejamientos erróneos de bases pueden darse durante la replicación normal del ADN y repararse a través de la ruta de MMR mediante la cual, las bases erróneamente emparejadas son reemplazadas por las bases correctas. Una incisión en una de las cadenas elimina el lazo generado por el emparejamiento erróneo y posteriormente la acción de actividades nucleasa, polimerasa y ligasa reparan el ADN (Jiricny 2006). Defectos hereditarios en los genes de MMR dan lugar a patologías como el síndrome de Lynch o HNPCC (hereditary non-polyposis colorectal cancer) (Tabla I1) (Figura I1). 3.2. REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASES (BER, BASE EXCISION REPAIR) Pequeñas alteraciones químicas en las bases son reparadas escindiendo la base dañada. El daño en la base es reconocido por enzimas denominadas genéricamente glicosilasas que median la eliminación de la base antes de que una nucleasa, polimerasa y ligasa completen la reparación. Este mecanismo emplea algunas enzimas que solapan con las utilizadas en la reparación de los SSBs (ver más abajo) (Lindahl & Barnes 2000) (Figura I1). 3.3. REPARACIÓN DE LOS DAÑOS DE CADENA SENCILLA (SSBR, SINGLE STRAND BREAKS REPAIR) Las roturas de cadena simple (SSBs) son reconocidas por PARP (Poly ADP Ribose Polymerase), que sintetiza cadenas de PoliADP ribosa (PAR) en las proximidades del sitio de rotura y promueve el reclutamiento de factores de reparación como XRCC1 y LIG3. Los SSBs pueden ocurrir como resultado de la Introducción ! 20! IR o de tratamientos con agentes químicos y pueden aparecer también como intermediarios durante la reparación por BER y NER (Caldecott 2008). Figura I1. Esquema de los agentes más comunes causantes de daños en el ADN y los tipos de reparación. Ejemplos de lesiones en el ADN inducidas por agentes endógenos y exógenos que son reparadas por diversos mecanismos de reparación. Ver el texto para más detalle. Figura modificada a partir de Hoeijmakers 2001. 3.4. REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS (NER, NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR) Este tipo de reparación reconoce los dímeros de pirimidinas y los enlaces covalentes dentro de la misma hebra de ADN que generan lesiones que distorsionan la hélice. Las lesiones CPD (dímeros de ciclobutano pirimidina) y 6-4PP (pirimidina 6-4 primidina) son inducidas por luz UV y son objeto de reparación por NER (Figura I1). El arquetipo humano de la deficiencia en NER es el Xerodermia pigmentosa (XP) (Tabla I1). NER opera por dos rutas que difieren en el mecanismo de reconocimiento de la lesión. Por un lado, NER acoplado a transcripción (TC-NER, Transcription coupled repair- NER), es decir, que reconoce específicamente lesiones que conllevan el bloqueo de transcripción. Por otro lado, la otra ruta reconoce estas lesiones en Introducción ! 21! cualquier parte del genoma de manera global (GG-NER, Global genomic- NER). Las lesiones son corregidas mediante la eliminación y relleno de un oligonucleótido de aproximadamente 20-30 bases que contiene las bases dañadas (Fousteri & Mullenders 2008). 3.5. TLS (TRANS-LESION SYNTESIS) El TLS es un mecanismo de reparación de transición que evita el colapso de la horquilla de replicación. Emplea polimerasas con baja fidelidad especializadas, principalmente de la familia Y y es un mecanismo mutagénico (Fousteri & Mullenders 2008). 3.6. REPARACIÓN DE LOS ENLACES INTERCATENARIOS Los enlaces intercatenarios (ICLs, interstrand crosslink) son enlaces covalentes que se establecen entre hebras de ADN diferentes. Suelen provocar el bloqueo de la horquilla de replicación siendo tal vez uno de los daños más peligrosos, ya que conducen a la incapacidad completa del cromosoma para duplicarse y pueden conllevar una “catástrofe mitótica”, reordenamientos cromosómicos y muerte celular. Mediante este mecanismo de reparación se tiene que restaurar la horquilla colapsada. La reparación ocurre con la activación de las proteínas de la familia FANC, cuyo mal funcionamiento causa el síndrome de Anemia de Fanconi (FA) en humanos seguida por un evento de recombinación homóloga (ver apartado 4.4) (Deans & West 2011). 3.7. REPARACIÓN DE LOS DSBs Las roturas de doble cadena son aquellas en las que ambas cadenas del ADN se rompen simultáneamente y son reparadas tanto por el mecanismo de unión de extremos no homólogos (NHEJ, nonhomologous end joining) como por recombinación homóloga (HR, homologous recombination) (Figura I1). Mientras el NHEJ promueve la religación de los DSBs sin un mecanismo que controle la fidelidad de la reparación, la HR restaura, en principio de manera precisa, la secuencia genómica de los extremos rotos cuando utiliza la Introducción ! 22! cromátida hermana como molde para reparar. Los DSBs no ocurren tan frecuentemente como otros tipos de lesiones pero son difíciles de reparar y extremadamente tóxicos (Jackson & Bartek 2009). En el siguiente apartado se hará una descripción más completa de la maquinaria molecular implicada en la reparación de los DSBs, ya que son las lesiones cuya reparación es el objeto de estudio de esta tesis. 4. MECANISMOS DE REPARACION DE LOS DSBs Los DSBs son lesiones en el ADN muy perjudiciales para la viabilidad de la célula y cuya reparación es llevada a cabo por una red compleja de múltiples rutas de reparación interconectadas. Al menos cuatro rutas independientes pueden reparar los DSBs: HR, NHEJ clásico, alt-NHEJ (alternative Nonhomologous DNA End Joining) y el SSA o alineamiento de cadena simple (Single Strand Annealing). El principal elemento que influye en la elección de la ruta de reparación es la magnitud de la extensión del procesamiento de los extremos de ADN dañados, la llamada resección del ADN (Huertas 2010), una degradación en sentido 5’-3’ de una de las cadenas a cada lado del corte (ver apartado 4.4.1). El NHEJ clásico no necesita reseccionar el ADN, mientras que el alt-NHEJ (también conocido como MMEJ o unión de extremos mediado por microhomología), la HR y el SSA dependen de que ocurra la resección del ADN en el DSB (Brandsma & Gent 2012). En el caso del alt-NHEJ, la resección está limitada a 5-25 nucleótidos, mientas que en el SSA y la HR es mucho más extensa, por encima de 100-200 (Hartlerode & Scully 2009). 4.1. MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN DE LOS DSBs Los mecanismos de respuesta al daño actúan rectificándolo, minimizando la probabilidad de letalidad y de que este daño sea permanente. Esta respuesta está coordinada a través de varias cascadas de señalización mediadas por kinasas, lo que se conoce como DDR (DNA damage Response) (Smith et al. 2010) (Figura 2I). Introducción ! 23! Figura I2. La respuesta al daño en el ADN. Tras la inducción de una rotura de cadena sencilla o doble (SSB y DSB), una serie de proteínas se encargan de sensar el daño ocasionado. El complejo MRN detecta los DSBs y la proteína RPA se une a las regiones de cadena sencilla que son expuestas con motivo del colapso de la horquilla de replicación o después de la resección inicial del ADN. MRN y RPA median en el reclutamiento de ATM y ATR respectivamente y la activación de las respectivas rutas de señalización para la coordinación del ciclo celular y la reparación del daño. Por otra parte, el heterodímero KU70/80 (Ku) compite con MRN por la unión a los DSBs. El complejo Ku reclutará a DNA-PKcs como principal componente de la maquinaria de reparación mediante NHEJ. Por otro lado, MRN inicia la reparación del DBS mediante HR. La cascada de señalización del daño se inicia mediante múltiples fosforilaciones principalmente sobre las kinasas de control del ciclo celular CHK1 y CHK2. Sus señales convergen en efectores como el supresor de tumores p53 y las fosfatasas de la familia CDC25. Como resultado la actividad de la CDK es inhibida y la progresión del ciclo celular retardada en las fases G1 a S (checkpoint G1/S) o en las fases de G2 a M (chekpoint G2/M) para facilitar la reparación de las lesiones en el ADN Introducción ! 24! En mamíferos, el complejo MRN desempeña un papel crítico en la respuesta temprana a los DSBs puesto que es el sensor principal de los DSBs junto con el heterodímero Ku (KU70 y KU80) (Lee & Dunphy 2013) (Figura I2). MRN compite con el complejo Ku por la unión a los DSBs (Brown et al. 2015). Mientras el heterodímero Ku ejerce su papel exclusivamente en reparación, el complejo MRN actúa tanto en la reparación como en la señalización del daño (Figura I2). El complejo MRN está formado por las proteínas MRE11-RAD50- NBS1 (Williams et al. 2007). RAD50 es un miembro de la familia SMC, y contiene un dominio ATPasa que interacciona con MRE11 y se asocia a los extremos del ADN en el DSB (Hopfner et al. 2002). MRE11 tiene actividades endonucleasa y exonucleasa 3’-5’ y 5’-3’ importantes para los pasos iniciales de la resección y por tanto es esencial para la HR (Williams et al. 2007). La tercera subunidad del complejo MRN es NBS1 que interacciona con MRE11 y contiene un dominio adicional de interacción proteína-proteína importante para la función de MRN en la respuesta al daño en el ADN (Tauchi et al. 2002). Una unidad del complejo se une a cada extremo del ADN roto y se establece un puente que conecta ambos trozos de ADN a través de la homodimerización de RAD50 (Williams et al. 2008; Hopfner et al. 2002). El complejo MRN se recluta al DSB y este reclutamiento se puede ver favorecido en algunos casos por PARP1, la histona fosforilada γH2AX (ver en detalle más adelante) y MDC1 (Haince et al. 2008) (Figura I3). El complejo MRN además recluta y activa la función catalítica de la proteína kinasa ATM llevándola al DSB a través de una interacción directa con la región C-terminal de NBS1 (Lee & Paull 2005) (Figuras I2 y I3). La activación de ATM es potenciada por otros factores (Falck et al. 2005; Uziel et al. 2003; Lee & Paull 2005). PARP1 también se encarga de reclutar a ATM de manera independiente y podría contribuir a la cascada de fosforilaciones que se da posteriormente. Se ha comprobado que en ausencia de PARP1 hay un retraso en la fosforilación de los sustratos de ATM. De cualquier forma, PARP1/2 y ATM tienen funciones independientes ya que al delecionar PARP1 (o PARP2) en ratones deficientes para ATM se observa un fenotipo de letalidad sintética (Huber et al. 2004). Al igual que ATM, la proteína kinasa ATR es miembro de la familia de las PIKKs (phosphatidyl inositol 3-kinase-like kinases) y es ,además junto a ATM y un tercer miembro de la familia, DNA-PKCS (Figura I2), otra de las kinasas Introducción ! 25! fundamentales en la señalización del daño en el ADN. ATR responde a estrés replicativo y a la presencia de ADN de cadena sencilla (Jazayeri et al. 2006) (Figura I2). Mutaciones en la línea germinal en ATM y ATR resultan en ataxiatelangiectasica (Shiloh 2014) y en el síndrome de Seckel (O’Driscoll et al. 2003; O’Driscoll et al. 2004), respectivamente. ATR es reclutada al daño mediante ATRIP (ATR-interacting protein) para su interacción con RPA (replication protein A) (Sung & Klein 2006) cuando ésta se encuentra formando un nucleofilamento con el ssDNA. RPA es un complejo heterotrimérico formado por RPA1, RPA2 y RPA3 que estabiliza las regiones de ssDNA generadas ya sea durante la replicación o bien cuando se ha realizado un procesamiento inicial del ADN Figura I3. Representación esquemática de los diferentes modificadores posttrasduccionales implicados en la señalización de los DBSs. Representación de las fosforilaciones críticas realizadas por ATM sobre la histona H2AX, MDC1 y HERC2. MDC1 y γ H2AX forman una plataforma para el reclutamiento de otros modificadores implicados en la señalización. Se esquematiza la interacción entre MDC1, RNF8, UBC13 y HERC2. La ubiquitinación llevada a cabo por RNF168 sobre la histona H2AX conlleva el reclutamiento de la proteína 53BP1 y del complejo BRCA1-BARD1-RAP80 a los sitios de daño. Existen múltiples niveles en los que PIAS1 y PIAS4 realizan sumoilaciones en respuesta a los DSBs. Las líneas horizonales representan el ADN. Las esferas grises representan los nucleosomas; P, fosforilación; Ub, ubiquitinación; Me, metilación; S, sumoilación. Figura modificada de Brown et al. 2015 y Jackson & Durocher 2013. Introducción ! 32! El procesamiento de lesiones complejas puede generar huecos en el ADN que deben ser rellenados previamente por ADN polimerasas para llevar a cabo la reparación por NHEJ. En células de mamíferos, la familia de la polimerasas X (pol X) se compone de las polimerasas β, μ, λ y la deoxiribonucleotidiltransferasa terminal (TdT). Las tres últimas contienen dominios BRCT y tienen un papel en el NHEJ rellenando los huecos, mientras que pol β no (Nick McElhinny & Ramsden 2004; Lieber 2008). 4.2.3. Finalización La reparación por NHEJ se completa con la ligación de los extremos de ADN, un paso que es llevado a cabo por el complejo X4-L4, que contiene XRCC4, la Ligasa IV (Grawunder et al. 1997) y el factor estimulante XLF/Cernunnos (Hentges et al. 2006) (Figura I4). XRCC4 forma un homodímero que funciona como andamiaje interaccionando con el complejo Ku y con el ADN (Nick McElhinny et al. 2000; Modesti et al. 1999). El complejo ADN-Ku es estabilizado por XRCC4 y estimulado por XLF/Cernunnos para llevar a cabo el paso de ligación y completar así la reparación (Grawunder et al. 1997; Lieber 2008). La Ligasa IV es activada por XRCC4 y XLF (Gu, Lu, Tsai, et al. 2007) (Figura I4) y puede ligar extremos romos y extremos sobresalientes compatibles (Grawunder et al. 1997). El complejo X4-L4 es capaz de ligar una cadena que tiene sólo un mínimo de emparejamiento de bases con su cadena antiparalela, lo que podría permitir un procesamiento simultáneo de la maquinaria de procesamiento y ligación (Ma et al. 2004). Además de esta capacidad, el complejo puede ligar dejando huecos compuestos por varios nucleótidos y también puede ligar algunos extremos de ADN incompatibles con extremos cortos sobresalientes (Gu, Lu, Tippin, et al. 2007). Se ha comprobado que el NHEJ ocurre incluso en ausencia del complejo X4-L4 sugiriendo que otra ligasa puede sustituir al menos parcialmente a la Ligasa IV (Yan et al. 2007). Introducción ! 33! 4.3. MECANISMO DE REPARACIÓN POR NHEJ ALTERNATIVO (ALT-NHEJ) O UNIÓN DE EXTREMOS MEDIADOS POR MICROHOMOLOGÍA (MMEJ) Es un mecanismo alternativo al NHEJ que opera en ausencia de alguno de los factores clásicos para el NHEJ como el complejo Ku, XRCC4 o la Ligasa IV. Funciona como un mecanismo de seguridad al NHEJ clásico en la reparación de los DSBs que actúa cuando éste está bloqueado (Wang et al. 2006). Estos eventos de reparación implican frecuentemente pequeñas deleciones y requieren de tramos de homología cortos (unas pocas bases) en el punto de rotura (Bennardo et al. 2008). El MMEJ explica una proporción de los eventos de recombinación V(D)J en las células silvestres (Corneo et al. 2007). Es interesante el hecho de que las levaduras que han perdido MRX realizan menos reparación por MMEJ, indicando la implicación de este complejo también en este mecanismo de reparación. El conjunto de genes que participan en alt-NHEJ en células de mamíferos es aún desconocido. Se ha comprobado que PARP1, PARP2, XRCC1, LIG3, LIG1 y CtIP desempeñan una función en el alt-NHEJ (Frit et al. 2014). La reparación por alt-NHEJ parece contribuir a la inestabilidad genómica asociada al cáncer (McVey & Lee 2008). 4.4. RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Se han identificado varios mecanismos de reparación dependientes de homología de secuencia. Estos incluyen la HR clásica, alineamiento de cadena sencilla (SSA, single-strand annealing), el alineamiento de cadena dependiente de síntesis (SDSA, synthesis-dependent strand annealing) y la replicación inducida por rotura (BIR, break-induced replication). Mientras que la HR clásica y el SDSA son, en principio, una reparación de los DSBs conservativa, tanto SSA como BIR son rutas intrínsecamente mutagénicas. El siempre produce deleciones entre las secuencias homólogas usadas, mientras que el BIR produce pérdida de heterozigosidad e incluso GCRs (gross chromosomal rearrangements). Aún así, tanto la recombinación clásica como el SDSA también pueden producir mutaciones, siempre que la secuencia utilizada como donadora de información no corresponda a la cromátida hermana. Aunque estos mecanismos de reparación son claramente diferentes, todos comparten Introducción ! 34! una serie de pasos comunes. En concreto, todos ellos se inician con la resección de los extremos del ADN para generar extremos 3’ sobresalientes de cadena sencilla. En el mecanismo de reparación por SSA, la resección iniciada a partir de un DSB localizado entre dos repeticiones directas conduce a la exposición de las secuencias homólogas y el posterior alineamiento de las cadenas complementarias de cada secuencia repetida. En todos los casos, este mecanismo provoca la deleción de una de las repeticiones y la zona situada entre ambas secuencias homólogas (Figura I5-d). Recombinación clásica, SDSA y BIR también comparten el siguiente paso, el emparejamiento de la cadena reseccionada con una secuencia homóloga mediado por RAD51 y un posterior intercambio de cadena (Figura I5-e,-f). Entonces se inicia un periodo de síntesis, usando la cadena invadida como molde. El destino final de esta cadena sintetizada es lo que diferencia a estos tres procesos. En la recombinación clásica la síntesis de ADN llega hasta el final de la zona reseccionada, generándose unas estructuras en forma de X denominadas estructuras de Holliday (HJs), en honor a su descubridor Robin Holliday (Figura I5-g). En el SDSA, las cadena sintetizadas a ambos lados del corte son desplazadas del molde y alinean entre sí (Figura I5-e). En el BIR, la síntesis de ADN prosigue hasta el final del cromosoma (Figura I5-f). A diferencia de lo que ocurre en la HR clásica y el SDSA, en el BIR en levaduras se requiere la síntesis de la cadena retrasada y esto parece ser mediado por la formación de una horquilla de replicación similar a la canónica (Lydeard et al. 2013). Como consecuencia, el BIR implica la copia extensiva del donador conduciendo a diversas alteraciones cromosómicas, según la posición de la secuencia usada como molde, como translocaciones no recíprocas y a otros tipos de reorganizaciones genómicas (Figura I5). Aunque el BIR ha sido utilizado para explicar algunos ejemplos de inestabilidad genómica en células de mamíferos, cada vez hay más dudas de la contribución real que tiene esta ruta de reparación. 4.4.1. Resección La resección es el proceso por el que los extremos 5’ del DSB son degradados obteniéndose extremos 3’ sobresalientes (Figura I5-b,-c). Dichos Introducción ! 35! Figura I5. Mecanismos de reparación de los DBSs mediante homología de secuencia en células mamíferos. La inducción de un DSB (a) es reconocido por el complejo MRN que mantiene los extremos de ADN unidos y participa de su procesamiento (b). El complejo CtIP-BRCA1-BARD1 coopera con MRN en la resección. La proteína RPA se une al ssDNA evitando la formación de estructuras secundarias (b). EXO1 y DNA2 con ayuda de BLM expanden la resección (c). BRCA1/BARD1 promueve la acumulación de BRCA2 y ésta cataliza la formación de un nucleofilamento (ssDNA-RAD51). Una vez ensamblado RAD51 se realiza la búsqueda de homología. A continuación se podrá llevar a cabo el SSA (d), el SDSA (e), la HR clásica (g), el BIR (f). En la recombinación clásica la formación de las estructuras de Holliday pueden resolverse con o sin entrecruzamiento de las cadenas de ADN. Figura modificada a partir de Hartlerode & Scully 2009. Introducción ! 36! extremos serán usados para invadir la cadena molde y para actuar de cebadores para la síntesis de ADN. La resección la inicia el complejo MRN el cual se une directamente al DSB, tal y como se ha mencionado con anterioridad en el apartado 4.1 (Figura I5-b). Sin embargo, para que se inicie la resección es necesario que el proceso se active por CtIP (Sartori et al. 2007), que interacciona con MRN y BRCA1 formando un complejo (Huen et al. 2010) (Figura I5-b). CtIP es una proteína esencial para la resección con actividad nucleasa, aunque no se ha demostrado si dicha actividad participa en el proceso directamente o simplemente estimula la actividad del complejo MRN (Aparicio et al. 2014 y Sartori 2007). In vivo, no basta con la interacción de estas proteínas, sino que la resección de los DSBs está controlada por otros factores. Por un lado, ATM estimula la resección y por otro, este proceso se induce fundamentalmente durante las fases S y G2 del ciclo celular cuando las cromátidas hermanas pueden ser utilizadas para llevar a cabo la HR. Sin embargo, existe una limitada y mínima resección que ocurre en la fase G1 de una manera independiente de BRCA1 para realizar la reparación por alt-NHEJ (You & Bailis 2010). En las fases S y G2, la resección se estimula por la fosforilación de CtIP por la CDK en diversas posiciones (Wang et al. 2013), destacando los residuos T847 y S327 de CtIP, que aumentan su actividad y la interacción con BRCA1 respectivamente (Huertas & Jackson 2009; Yu & Chen 2004). BRCA1 ubiquitina a CtIP y facilita su asociación a los sitios de daño (Huen et al. 2010). En Schizosaccaromyces pombe se ha observado que el reclutamiento de Ctp1 (el ortólogo de CtIP) es además dependiente del complejo MRN (a través de su interacción con NBS1) y de la actividad kinasa de ATM (Aparicio et al. 2014). Se han identificado dos y siete sitios de fosforilación por ATM en CtIP y en BRCA1 respectivamente, pero su función precisa está en estudio (You & Bailis 2010). Las kinasas ATM y ATR modulan las actividades de otros factores de resección incluyendo MRE11, RAD50, DNA2 y EXO1 (Jasin & Rothstein 2013; Symington & Gautier 2011). CtIP y el complejo MRN son suficientes para la resección de unas pocas decenas de bases, la llamada resección de tramo corto. Sin embargo, in vivo la resección ocurre a lo largo de distancias mucho mayores, la denominada resección de tramo largo, que requiere o bien la actividad nucleasa de EXO1 o bien la acción conjunta de la helicasa BLM y de la nucleasa dependiente de estructura DNA2 (Symington & Gautier 2011) (Figura I5-c). También Artemis, cuyo principal Introducción ! 37! papel está en la reparación por NHEJ (como se ha descrito en el apartado 4.1) es reclutada por ATM, lo que sugiere que pueda tener un papel en la resección de los DSBs (Beucher et al. 2009). Una forma precisa de elegir una ruta de reparación en lugar de otras es potenciando dicha ruta o bien regulando negativamente las contrarias. Cuando se producen alteraciones en el equilibrio natural entre las diversas rutas de reparación se puede generar inestabilidad genómica. Existe un circuito regulador dependiente del ciclo celular que controla que los DSBs sean o no reseccionados, y en consecuencia la forma en la que son reparados (Figura I6) (Escribano-Díaz et al. 2013; Chapman et al. 2013). Este circuito está compuesto por dos parejas antagónicas: BRCA1-CtIP y 53BP1-RIF1. BRCA1 está presente ya en la fase G1 del ciclo, pero es incapaz de formar focos inducidos por IR por la presencia de RIF1 unido a 53BP1 fosforilado por ATM. Por tanto, RIF1 es un efector crítico de 53BP1 que favorece la reparación por NHEJ (Chapman et al. 2012). De hecho, RIF1 regula el mecanismo de cambio de clase de las inmunoglobulinas por recombinación (CSR) (Di Virgilio et al. 2013). Por otra parte, la acumulación de RIF1 está restringida a la fase G1 del ciclo, y es suprimida en S/G2 por la Figura I6. Modelo de circuito de control para la elección de reparación de los DSBs. La selección de la ruta de reparación de los DSBs es determinada en parte por la presencia en el sitio de rotura de RIF1 o BRCA1-CtIP. RIF1 estimula el NHEJ mientras que BRCA1-CtIP promueve la resección. La decisión está influida por el ciclo celular, en G1, RIF1 es capaz de mantener a BRCA1 lejos del sitio de rotura y en S/G2 la activación del complejo BRCA1-CtIP manteniene a RIF1 fuera del sitio de rotura. Figura modificada de Escribano-Díaz et al. 2013. Introducción ! 38! interacción BRCA1-CtIP, que es promovida por la fosforilación de CtIP por la CDK (Figura I6). Así, RIF1 suprime la resección y la formación del nucleofilamento de RAD51 en células deficientes en BRCA1. La acumulación de 53BP1 es dependiente de la actividad kinasa de ATM e independiente de BRCA1 (Silverman et al. 2004; Xu & Blackburn 2004). Además de por fosforilaciones, el reclutamiento tanto de 53BP1 como de BRCA1 es dependiente de ubiquitinación y sumoilación (Jackson & Durocher 2013). El papel de estas modificaciones post-traduccionales se describe más ampliamente en el apartado 5 de la introducción. En cuanto al papel de BRCA1 en la resección, se ha demostrado que este proceso puede ocurrir en su ausencia, sin embargo se ha comprobado que la interacción entre BRCA1 y CtIP controla la velocidad con la que se resecciona (Cruz-García et al. 2014). 4.4.2 Invasión Una vez terminada la resección, la proteína RPA unida al ADN de cadena sencilla es sustituida por la recombinasa RAD51 que se une al ADN con menos afinidad que RPA in vitro (Peterson et al. 2011). Se requieren por tanto, actividades adicionales para la formación del nucleofilamento ADN-RAD51 (Figura I5). De entre estas actividades, cabe destacar a BRCA2, ayudada por las proteínas PALB2 y RAD52, los parálogos de RAD51 y el complejo BRCA1/BARD1 (West 2003). Todas estas proteínas son necesarias para la formación de focos de RAD51 tras IR, pero la función directa de cargar RAD51 al nucleofilamento es de BRCA2 (Figura I5). La interacción entre RAD51 y el carboxilo terminal de BRCA2 es importante para la HR, y está limitada a las fases S y G2 del ciclo celular mediante la fosforilación de BRCA2 dependiente de CDK (Esashi et al. 2005). Además, RAD51 es fosforilado por CHK1 y esta fosforilación es necesaria para el reclutamiento de RAD51 al sitio de daño. Por otro lado, ATM y/o ATR también fosforilan a BRCA2 (Matsuoka 2007). Además, tanto RPA1 como RPA2 sufren modificaciones post-traducionales necesarias para promover la HR (D.-H. Lee et al. 2010). Así, RPA2 sufre fosforilaciones y defosforilaciones, y RPA1 es sumoilada facilitando el reclutamiento de RAD51 (Dou et al. 2010). Introducción ! 39! Seguidamente, la reparación por homología de secuencias puede continuar por diferentes rutas de reparación; las mencionadas SDSA, BIR y la HR clásica. La invasión de una cadena en una secuencia homóloga forma un intermediario en forma de lazo denominado D-loop (Figura I5), en el que el extremo 3’ OH de la cadena invasora es extendido por una polimerasa y entonces realineado para procesar el segundo extremo de la rotura (West 2003). Esta ruta es lo que se conoce como SDSA y se piensa que está promovida por la helicasa RTEL (Figura I5-e). Aunque los datos indican que la ruta SDSA es la principal vía de la reparación por HR en células somáticas de mamíferos, los HJs probablemente aumentan durante otros procesos de recombinación. La resolución correcta de las estructuras de Holliday es importante en la HR de células somáticas y para la estabilidad genómica. La ruta de reparación por BIR ocurre cuando el extremo 3’ de la cadena que invade conduce a la formación de una horquilla de replicación que potencialmente puede copiar tramos largos desde la molécula de ADN donadora (Figura I5-f). Cuando se forman los HJs se genera una región de heteroduplex, es decir, la molécula de ADN está formada por una cadena de la molécula invasora y otra que actúa de donadora de información (Figura I5). Los HJs pueden desplazarse a lo largo del ADN, en un proceso dependiente de ATP denominado migración. Esta migración incrementa o disminuye la longitud del heteroduplex de ADN dependiendo de la dirección del deslizamiento. Si los DSBs han ocurrido durante las fases S o G2 del ciclo celular, se usará la cromátida hermana como molde para realizar una reparación, en teoría, totalmente libre de errores (Johnson & Jasin 2000). Sin embargo, cuando se usa otro donador de información, este heteroduplex puede presentar pequeñas zonas en los que las bases no aparean correctamente. Su posterior reparación explica el fenómeno de conversión génica. En la mayoría de los eventos de HR, ya sea en levaduras o en células de mamíferos, se copia un fragmento pequeño de la molécula donadora y es lo que se denomina STGC (short tract gene conversion). Una pequeña proporción de eventos de HR en mamíferos copia un fragmento superior de varias kilobases y se denomina LTGC (long tract gene conversion) (Puget et al. 2005). Se ha descrito que Introducción ! 40! mutaciones en algunos parálogos de RAD51 como XRCC3, RAD51C y XRCC2 favorecen la HR con LTGC (Nagaraju et al. 2009). 4.4.3. Resolución Una vez formados los HJs, ambas moléculas de ADN, la molde y la invasora, quedan unidas entre sí. Por ello, los HJs deben ser procesados enzimáticamente. La resolución de los HJs es ejecutada por varios complejos enzimáticos. BLM (Bloom´s syndrome), formando un complejo con la topoisomerasa IIIα, puede disolver los HJs y dar lugar a unos productos siempre sin entrecruzamiento (Wu & Hickson 2003). Alternativamente, estos pueden ser cortados por nucleasas dependientes de estructuras, que pueden generar entrecruzamientos (Figura I5). Existen al menos tres factores con esta actividad: el complejo MUS81-EME1 (Wyatt et al. 2013), GEN1, que promueve la resolución de los HJs por un corte simétrico y SLX4 (Fekairi et al. 2009). Recientemente se ha especulado que estas tres nucleasas puedan cooperar in vivo (Sarbajna & West 2014). 4.4.4. SSA En la ruta de reparación por SSA la rotura del ADN ocurre en o entre dos secuencias repetidas en orientación directa. Tras la resección, las zonas homólogas quedan expuestas, lo que conduce al alineamiento de las cadenas de las secuencias repetidas. Este alineamiento del ssDNA puede ser favorecido por RAD52, de una manera independiente de RAD51. Posteriormente, es necesaria la eliminación de los extremos colgantes por XPF/ERCC1 (Hartlerode & Scully 2009; Motycka et al. 2004). El producto de este evento de reparación deja una única copia de la secuencia repetida y se produce una deleción de las secuencias intermedias. 5. MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES (PTMs) EN LA REPARACIÓN DE LOS DSBs Las modificaciones post-traduccionales consisten en la alteración de las proteínas tras su traducción mediante transformaciones químicas de sus Introducción ! 41! aminoácidos, ya sea la adición covalente de grupos funcionales o péptidos, o la lisis parcial de la proteína. Así mismo, estas modificaciones pueden ser reversibles o irreversibles. Entre las modificaciones que se pueden realizar se encuentran la fosforilación, glicosilación, nitrosilación, metilación, acetilación, lipidación, ubiquitinación, sumoilación y la nedilación. Las modificaciones post-traduccionales son valoradas hace muchos años como importantes mecanismos para la regulación de la actividad celular y por su papel en el tratamiento y en la prevención de enfermedades. Históricamente, en la DDR, los estudios se han centrado en las fosforilaciones producidas por las kinasas estructurales de los punto de control del ciclo (ATM, ATR, CHK1, CHK2) (Figura I2). Sin embargo, en los últimos años, las investigaciones de diversos grupos han puesto de manifiesto el papel integral de otras modificaciones, entre las que destacan las mediadas por ubiquitina y otros UBLs (ubiquitin-like proteins) como SUMO. Sólo recientemente se ha empezado a entender la función de otros UBLs como NEDD8 (Meir et al. 2015). Al igual que se da una fuerte integración entre los sistemas regulados por SUMO y los regulados por ubiquitina durante la respuesta a los DSBs (Jackson & Durocher 2013), se espera un nivel similar de comunicación entre la ubiquitinación y la nedilación. De hecho, la función predominante de la nedilación es regular la actividad ubiquitinasa de las CRLs (ligasas E3 de ubiquitina de tipo RING-culinas) (Chung & Dellaire 2015). Es por ello que es de gran relevancia determinar cómo la actividad de las CRLs es regulada en el contexto de la respuesta al daño en el ADN. 5.1 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES CON UBIQUITINA 5.1.1 La ubiquitina y su conjugación a los sustratos La ubiquitina es una proteína altamente conservada evolutivamente, de tamaño pequeño, 76 aminoácidos, y originariamente identificada por su capacidad para inducir la degradación de proteínas en extractos de reticulocitos de manera dependiente de ATP (Ciehanover et al. 1978). Cuatro genes codifican ubiquitina en humanos: UBC, UBB, UBA52 y UBA80. La ubiquitina se sintetiza en forma de un precursor que sufre un corte sobre un Introducción ! 48! como un precursor que es procesado en un residuo conservado de Gly76 en el extremo carboxilo por una actividad hidrolasa de enzimas denedilasas y como resultado expone un motivo diglicina que es requerido para la unión covalente de NEDD8 a sus sustratos (Figura I8B). NEDD8 es conjugado a un residuo de lisina del sustrato mediante una cascada enzimática de tres pasos similar a lo que ocurre con la ubiquitina, con enzimas específicas de nedilación E1, E2 y E3 (Figura I8B). En células humanas, la inhibición de la conjugación de NEDD8 a sus proteínas dianas hipersensibiliza a las células a agentes que dañan el ADN como por ejemplo la mitomicina C, el cisplantino y la IR (Garcia et al. 2014; Yang et al. 2012). La enzima E1, denominada NAE (NEDD8 activating enzyme), es un heterodímero compuesto por NAE1-UBA3 en el que ambos monómeros son muy parecidos a UBE1, una E1 de ubiquitina. La especificidad de unas E1 por la ubiquitina o NEDD8 viene determinada por el residuo 72 de ambas (Figura I8A). Se ha desarrollado un inhibidor específico de la nedilación, denominado MLN4924 (Figura I9) que se une a la proteína NAE1 en lugar del ATP, bloqueando la nedilación por lo que es muy útil para investigar las consecuencias de la inhibición a nivel celular. El MLN4924 se encuentra actualmente en fase III de ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer (Soucy et al. 2009). Se conocen dos enzimas E2 de NEDD8: UBE2M y UBE2F (Liakopoulos et al. 1998; Gong & Yeh 1999; Huang et al. 2009). UBE2M tiene, preferencialmente, como ligasa E3 a RBX1 (ROC1) y UBE2F tiene a la ligasa E3 RBX2 (también llamada ROC2 o RNF7) (Huang et al. 2009). RBX1 y -2 son ligasas E3 de tipo RING que se unen a su sustrato y catalizan la transferencia Figura I9. Estructura química del MLN4924. Para su comparación se muestra la estructura del AMP. Figura modificada a partir de Soucy et al. 2009. Introducción ! 49! de NEDD8 desde la E2 UBE2M/F (Scott et al. 2010) sin que la E2 y el sustrato interaccionen. Tanto RBX1 como RBX2 pueden funcionar como ligasas E3 de ubiquitina (Kamura et al. 1999; Petroski & Deshaies 2005) (Figura I10). Así mismo, RNF168 y RNF111 pueden funcionar como ligasas de NEDD8 (Ma et al. 2013; Li et al. 2014). El sustrato principal conocido de la nedilación son un grupo de proteínas denominadas culinas. Se han identificado ocho miembros: CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5, 7 y PARC (Figura I10) y todos tienen un dominio evolutivamente conservado característico de las culinas y un sitio diana de nedilación en el carboxilo terminal. Las culinas constituyen el andamio sobre el que se montan los complejos CRLs (cullin-RING ligases). Las CRLs son responsables de hasta el 20% de toda la degradación de las proteínas vía proteosoma mediada por ubiquitina (Lydeard et al. 2013; Sarikas et al. 2011; Soucy et al. 2009). Las CRLs son responsables de la poli-ubiquitinación y consiguiente degradación de muchas proteínas reguladoras del ciclo celular, de la transducción de señales y del desarrollo. La especificidad por el sustrato se define a nivel de la E2/E3, así Figura I10. Esquema sobre las distintas rutas moleculares según las enzimas E2-RING de la cascada de nedilación. Las enzimas E2-RING (UBE2M y UBE2F) durante la nedilación tienen como enzimas diana las ligasas E3 RBX1 y RBX2 respectivamente y determinan qué culinas son sustratos de nedilación. Figura modificada de Huang et al. 2009. Introducción ! 50! UBE2M/RBX1 nedila preferencialmente las CUL1-4 y UBE2F/RBX2 la CUL5 (Huang et al. 2009) (Figura I10). Como en el caso de la ubiquitina, NEDD8 contiene un residuo de lisina concreto para la formación de cadenas de NEDD8, sin embargo sólo se ha podido observar in vitro la formación de cadenas cadenas de NEDD8 en sustratos distintos a las culinas y bajo la sobreexpresión de NEDD8, por tanto, la relevancia fisiológica de las cadenas de NEDD8 está actualmente cuestionada (Leidecker et al. 2012; Xirodimas et al. 2008; Jones et al. 2008). 5.3.2 Las denedilasas Como otras modificaciones post-traduccionales, la nedilación es un proceso reversible y puede ser revertida por la acción de una isopeptidasa de NEDD8 (denedilasa). En el año 2005, se describieron las denedilasas signalosoma COP9 y NEDP1 (SENP8) como las isopeptidasas capaces de eliminar NEDD8 (Figura I8) (Watson et al. 2011). El signalosoma COP9 (CSN) es un complejo formado por 8 subunidades que fueron designadas como CSN1 a CSN8 (Deng et al. 2000) y que originariamente se aisló como un supresor de la fotomorfogénesis en plantas (Chamovitz & Deng 1995). Posteriormente, se redescubrió en los glóbulos rojos (Seeger et al. 1998) y en el bazo (Wei & Deng 1998) vislumbrándose que el papel de estas proteínas iba más allá de su función en plantas. Se ha identificado en otros tipos de eucariotas como S. cerevisiae, S. pombe, A. nidulans, C. elegans y D. melanogaster (Hannss & Dubiel 2011). La función biológica principal del CSN es la regulación de las proteínas CRLs (Petroski & Deshaies 2005). CSN es la única isopeptidasa que corta NEDD8 desde las culinas de manera eficiente in vivo, aunque hay otras proteínas que poseen también actividad isopeptidasa sobre NEDD8 in vitro (Rabut & Peter 2008). Cada subunidad CSN se caracteriza por ser una superficie de unión capaz de interaccionar con proteínas reguladoras diferentes. La deleción de los genes de cualquiera de estas subunidades en ratón es letal en estadíos tempranos del desarrollo embrionario. Sin embargo, esto no es así en eucariotas de complejidad inferior como las levaduras o algunos hongos, lo que indica que estas proteínas han ido ganando importancia durante la evolución (Yan et al. 2003). Se ha comprobado que el Introducción ! 51! complejo CSN tiene que estar completo para su correcta actividad enzimática in vitro (Sharon et al. 2009), aunque es la subunidad CSN5 la que tiene un motivo JAMM (dominio Jab1/MPN) que es crítico para la actividad denedilasa del complejo CSN. En S. pombe el CSN participa en la DDR, ya que los mutantes Csn1 y Csn2 tienen un retraso en la progresión de la fase S y son hipersensibles a UV y a radiación gamma (Mundt et al. 1999). Esta relación también existe en A. nidulans (Lima et al. 2005) y en D. Melanogaster (Tomoda et al. 2004). En mamíferos, Groisman et al. (2003) demostraron que el complejo CSN regula las CRLs implicadas en los procesos de reparación. Otra denedilasa bien caracterizada es NEDP1, también llamada Denedilasa 1 (DEN1) y SENP8 (llamada así por su homología con la deconjugasa de SUMO Ulp1/SENP). NEDP1 es capaz de unirse selectivamente al precursor de NEDD8 (-G75G76GGLRQ) e hidrolizar su carboxilo terminal resultando la forma funcional de NEDD8 (-G75G76) para su conjugación con las culinas. NEDP1 también es capaz de eliminar NEDD8 de su sustrato, pero con una eficiencia inferior al signalosoma COP9 (Wu et al. 2003). NEDP1 puede eliminar NEDD8 de las culinas tanto in vitro como in vivo, es altamente específica para NEDD8, no actúa sobre SUMO ni sobre ubiquitina y es una proteína altamente conservada a lo largo de la evolución (Mendoza et al. 2003). Un aumento en la actividad NEDP1 resultaría en la denedilación de las culinas y en un incremento en la disponibilidad del NEDD8 maduro, por tanto si el procesamiento de NEDD8 es limitante, es una forma de generar NEDD8 libre (Jackson & Durocher 2013). El aumento de la actividad de NEDP1 implica el bloqueo de la degradación de proteínas ubiquitinada por las culinas y un bloqueo en la progresión del ciclo celular. Con respecto a su papel en la DDR, se ha comprobado que NEDP1 funciona como denedilasa de la histona H2A y es la responsable también de la denedilación de RNF168 (Li et al. 2014) . 5.3.3 Papel de la nedilación en la respuesta al daño en el ADN De todas las culinas, CUL4A y CUL4B son las que se han relacionado más con la DDR. A nivel celular, existe bastante redundancia funcional entre ambas culinas. Tienen un papel bien definido en la reparación por NER además de intervenir en la respuesta al daño en el ADN a nivel del control del Introducción ! 52! ciclo celular y de la reparación de los DSBs (Rizzardi & Cook 2012). Hay diversos ejemplos que explican la importancia de las ligasas RING-culina en controlar el ciclo celular en respuesta a daños en el ADN. Por ejemplo, CRL4CDT2 promueve la degradación de CDT1 de una manera dependiente de la unión de PCNA a la cromatina. Otro ejemplo es CDC25A, que es una fosfatasa requerida para la activación de kinasas dependientes de ciclinas capaces de llevar a cabo la progresión del ciclo celular y que tras el daño en el ADN es fosforilada de una manera dependiente de CHEK1/CHEK2, conduciendo a su ubiquitinación por SCFβTRCP, degradación y en consecuencia la parada del ciclo (Sancar et al. 2004). En células humanas, la inhibición de la conjugación de NEDD8 hipersensibiliza a las células a los agentes que dañan el ADN tales como la mitomicina C, el cisplatino y la IR (Garcia et al. 2014; Koinuma et al. 2003). Dado el amplio rango de efectos causados por la inhibición de la nedilación, es probable que la sinergia observada sea de origen multifactorial y específico según el tipo celular. Recientes estudios han relacionado la nedilación con la reparación de los DSBs de una forma más directa ya que NEDD8 se concentra en los sitios de daño (Ma et al. 2013). En este estudio se concluyó que RNF111 funciona como una ligasa E3 de NEDD8 responsable de la acumulación de NEDD8 en los sitios de daño y que la proteína UBE2M es la ligasa E2 para NEDD8 en respuesta a la DDR. La nedilación de la histona H4 mediada por RNF111 es esencial para el reclutamiento de RNF168 a lo sitios de daño (Ma et al. 2013). Otro estudio reciente muestra que la nedilación es importante para la ubiquitinación de NBS1 y, por tanto, para la activación de ATM (Wu et al. 2012). Por otro lado, se ha propuesto que las histonas H2A, H2B y H4 son sustratos de nedilación (Li et al. 2014). Aunque RNF168 predominantemente conjuga ubiquitina a H2A en los estadios tempranos de la reparación (a los 10 minutos de producirse el daño), RNF168 también es capaz de funcionar como una ligasa E3 de NEDD8 nedilando a la histona H2A. La nedilación de RNF168 decae a los 30 minutos del daño, coincidiendo con una disminución en su interacción con la enzima E2 UBC13 por lo que su actividad ligasa de ubiquitina sobre H2A disminuye. La histona H2A es tanto ubiquitinada como nedilada. Tras el daño, la histona H2A es predominantemente ubiquitinada y Introducción ! 53! su nedilación es reducida para favorecer los procesos de reparación (Li et al. 2014). En estadios posteriores a la reparación, la nedilación de H2A aumenta y la ubiquitinación disminuye a un nivel basal por lo que se piensa que el proceso de reparación del daño en el ADN está regulado negativamente por la nedilación de la H2A. La nedilación por RNF168 de la histona H2A regula negativamente su ubiquitinación dando como resultado una disminución en el reclutamiento de BRCA1 a los sitios de daño (Li et al. 2014). ! OBJETIVOS ! Objetivos 57# Los objetivos de esta tesis son: 1. Caracterizar y validar los sistemas SSR en sus versiones 1.0 y 2.0 para su utilización en la medición del balance entre la ruta de reparación por NHEJ y por recombinación homóloga de los DSBs en células humanas bajo diferentes condiciones experimentales. 2. Establecer un flujo de trabajo para la realización de un escrutinio con una librería de esiRNA de genoma completo usando el sistema SSR2.0. 3. Analizar el efecto de una minilibrería de inhibidores con potencial terapéutico en el equilibrio entre NHEJ y HR. 4. Determinar cómo los mecanismos de nedilacion/denedilación regulan la reparación de cortes de doble cadena en células humanas. Resultados ! ! 64! por: i) células que no han reparado el daño, o que lo han reparado tan recientemente que no les ha dado tiempo a acumular suficiente proteína para visualizarla por FACS; ii) células que aún manteniendo la resistencia han perdido el sistema y por tanto no son ni verdes ni rojas; iii) células que han Figura R2. Caracterización inicial de los sistemas SSR. (A) Análisis por citometría de los sistemas SSR. Gráfico representativo de células que expresan de manera estable el sistema SSR2.0, transfectadas o no con partículas lentivirales que contienen la construcción BFP-I-SceI. El análisis por citometría determina las células que emiten fluorescencia azul (BFP) y son agrupadas en una ventana para separarlas de las que carecen de dicha fluorescencia. Las células de la ventana 1 se analizaron para la presencia de fluorescencia verde o roja definiendo dos regiones R1 (rojas) y R2 (verdes). (B) Cuantificación del porcentaje de células que expresan GFP o RFP después de la infección lentiviral con BFP-I- SceI. Células con el sistema SSR1.0 y células con el sistema SSR2.0 fueron infectadas con partículas lentivirales que contenían la proteína BFP y la meganucleasa I-SceI. Como control se incluyó un shRNA sin diana conocida. Tras la reparación del corte de doble cadena, se cuantificó por citometría de flujo el porcentaje que se obtenía de células con fluorescencia que eran verdes o rojas en cada uno de lo sistemas. (C) Imágenes obtenidas de los sistemas SSR mediante el microscopio ImageXpress Micro. Tras la inducción del corte de doble cadena por la meganucleasa I-SceI, las células que repararon por NHEJ se visualizan en verde y las células que repararon por HR se observan en rojo. Los núcleos fueron teñidos con Hoechst 33342. Resultados ! ! 65! reparado el daño pero no consiguen expresión de la RFP ni de la GFP, como aquellas reparadas por el alt-NHEJ. En el análisis se tuvo en cuenta que las células en las que la enzima I- SceI no había cortado permanecerían verdes afectando al conteo del número de eventos de reparación por NHEJ. Para analizar sólo las células que expresaban la enzima I-SceI, y que por tanto se había producido un DSB, se usó la proteína BFP que se expresa en el mismo plásmido de la I-SceI y se seleccionaron exclusivamente las células azules (ver materiales y métodos apartado 1.2.2). Dos días después de la infección, las células fueron preparadas y analizadas como se describe en los materiales y métodos apartados 1.5.3 y 1.6.2. Así, para calcular el balance entre HR y NHEJ, se cuantificó el porcentaje de células verdes y el porcentaje de células rojas de la población azul (Figura R2). Este análisis se puede hacer mediante FACS o por microscopia (Figura R2). Considerando exclusivamente las células azules que expresaban GFP o RFP, el porcentaje de células verdes en el sistema SSR1.0 fue del 38,2% y para el sistema SSR2.0 fue del 41.4% (Figura R2B). Unas imágenes representativas de la apariencia de las células con los sistemas se encuentran en la Figura R2C, donde los núcleos están teñidos con Hoechst 33258 (azul), las células que han reparado por NHEJ fluorescen en verde y las que han reparado por SSA fluorecen en rojo. 1.2. SENSIBILIDAD DEL SISTEMA SSR AL SILENCIAMIENTO DE GENES IMPLICADOS EN REPARACIÓN (NHEJ/HR). Para validar los sistemas SSR analizamos el impacto en ellos de la depleción mediante shRNAs de genes que se conocen que afectan el equilibrio entre NHEJ y HR (Tabla M2). En concreto, genes estructurales de NHEJ y de la reseción del ADN. Se cuantificó el nivel de depleción obtenida con los diferentes shRNAs mediante PCR cuantitativas (Figura R3). Para facilitar la comparación entre los sistemas SSR1.0 y SSR2.0 y entre experimentos, normalizamos el ratio NHEJ/HR a un shRNA control cuya secuencia diana está ausente en el genoma humano (Tabla M2). De este modo, un valor cercano a 1 significa que el equilibrio entre ambos sistemas de reparación es similar al control. Valores inferiores a 1 que hay un aumento de células rojas, o sea, más Resultados ! ! 66! recombinación homóloga. Finalmente, un aumento del NHEJ se visualiza con valores superiores a 1. Previamente, se había descrito en varios organismos que bloquear el mecanismo de reparación por NHEJ conduce a las células a aumentar la resección del ADN y por tanto la recombinación homóloga (Huertas 2010; Chapman et al. 2013; Clerici et al. 2008; Fradet-Turcotte et al. 2013; Munoz- Galvan et al. 2013). Así, silenciamos diversos genes que desempeñan un papel clave en la reparación por NHEJ como las tres subunidades del complejo DNA-PK (DNA-PKcs, KU70 y KU80) y la proteína Ligasa 4 (LIG4). Observamos una desviación en el equilibrio NHEJ/HR hacia un incremento en la reparación mediada por homología en ambos sistemas SSR (Figura R4). Estos resultados están en concordancia con resultados previamente publicados que indican que en ausencia de NHEJ, los extremos del ADN se encuentran desprotegidos, ocurre la resección y los cortes tienden más a ser reparados por recombinación homóloga. Por otro lado, y como cabría esperar, la depleción de genes implicados tanto en la resección de tramo corto como en la de tramo largo (CtIP, BLM o EXO1) inclinó el equilibrio de los sistemas SSR hacia la reparación por NHEJ. Figura R3. Niveles de silenciamiento obtenidos por depleción con shRNAs de genes que afectan el equilibrio entre la reparación por NHEJ y HR. Se realizaron RT-PCR cuantitativas a partir de ARNm de células transfectadas de manera estable con los shRNAs indicados en la figura. El nivel de cDNA de cada gen se normalizó con el cDNA del gen de la actina. La expresión relativa se cuantificó mediante un shRNA control. Se representa la media y el error de un mínimo de tres experimentos independientes por triplicado. Resultados ! ! 67! Por tanto, estos sistemas han sido eficaces a la hora de detectar defectos en estos genes sobre los mecanismos de reparación. MRE11 tiene un papel esencial en la resección de tramo corto pero además ha sido implicada en otros procesos, tales como el NHEJ, manteniendo unidos ambos extremos de la rotura, detectando la presencia de DSB y activando el checkpoint (Stracker & Petrini 2011). Por tanto, podría parecer difícil a priori predecir el resultado de la depleción de MRE11 en la elección entre los mecanismos de reparación de DBSs. Sin embargo con nuestros sistemas se ha podido observar como la depleción de MRE11 desvió el equilibrio hacia el NHEJ (Figura R4), demostrando que la función principal de MRE11 es favorecer la reparación Figura R4. Sensibilidad de los sistemas SSR al silenciamiento de genes de reparación por NHEJ y de genes implicados en la resección del ADN. (A) Efecto de la depleción de varios genes implicados en la reparación por NHEJ y en el proceso de resección del ADN sobre el sistema SSR1.0. Sobre una línea de U2OS que portaba de manera estable el sistems SSR1.0 se transdujo con lentivirus que portaban diferentes shRNAs para los genes indicados. Se generaron diversas líneas estables y se sometieron a la inducción de daño mediante un corte de doble cadena en el sistema SSR1.0 mediante la meganucleasa I-SceI. Tras llevar a cabo la reparación, se cuantificó la variación en el balance entre reparación independiente o dependiente de homología mediante el calculo del ratio entre células verdes y rojas. Para facilitar la comparación entre experimentos, este ratio se normalizó con un shRNA control. Aquellos shRNAs que inclinaban el equilibrio hacia un aumento en la reparación independiente de homología eran de valor mayor de 1 (verde), mientras que aquellos que aumentaban la HR el valor era menor de 1 (rojo). Los datos representan un mínimo de tres conjuntos de experimentos con duplicados. (B) Igual que en (A) pero sobre el sistema SSR2.0. A B Resultados ! ! 68! mediada por homología de secuencia. Dicho efecto es probablemente debido al papel que desempeña MRE11 en la resección. Aunque no se observó diferencias cualitativas en ningún caso entre el sistema SSR1.0 y el SSR2.0, sí observamos claramente diferencias cuantitativas (Figura R4). Los resultados son más claros en el caso del sistema SSR2.0 probablemente porque sólo hay un ciclo de corte-reparación. Como control adicional, deplecionamos una proteína relacionada con la reparación de los DSBs en el intercambio de cadena, RAD51, que no debía tener efecto en la elección de la ruta de reparación dado que RAD51 está implicada en pasos posteriores a la decisión entre reparación por HR o por NHEJ y lo más importante, RAD51 no participa en el mecanismo de reparación por SSA (Hartlerode & Scully 2009). Comprobamos que en concordancia con esto, la depleción de RAD51 no tuvo efecto en los sistemas SSR (Figura R4). Se ha demostrado que el ciclo celular es el principal regulador en la elección entre reparación independiente o dependiente de homología. Mientras las células en G1 sólo pueden reparar mediante NHEJ, las células en S y G2 pueden activar la reparación por HR a través de la resección del ADN mediada por la ciclina dependiente de kinasa (CDK) (Huertas et al. 2008; Ira et al. 2004). Por tanto, analizamos los perfiles de ciclo celular de las células deplecionadas con los diferentes shRNAs empleados anteriormente. No se observaron diferencias en los perfiles del ciclo celular que pudieran explicar el fenotipo observado (Figura R5). 1.3. EFECTO DE LA DEPLECIÓN DE GENES IMPLICADOS EN LA RESPUESTA AL DAÑO DEL ADN EN LOS SISTEMAS SSR. El contexto en el que se encuentra la célula determina el tipo de respuesta al daño en el ADN que se activa y la manera en la que se va a reparar dicho daño. Se requiere una coordinación entre el metabolismo celular y la reparación del ADN mediante una compleja cascada de transducción de señales, lo que es conocido como DDR (Ciccia & Elledge 2010; Jackson & Bartek 2009). Con objeto de validar nuestro sistema decidimos comprobar el efecto de la depleción de varios factores implicados en la DDR que podían influir en Resultados ! ! 69! el equilibrio entre HR y NHEJ. En la Figura R6 se muestra la comprobación de las depleciones de dichos genes mediante RT-PCR. La DDR se activa mediante una serie de fosforilaciones de proteínas iniciadas por dos kinasas, ATM y ATR (Ciccia & Elledge 2010; Jackson & Bartek 2009). El silenciamiento mediado por shRNAs de ATM y ATR resultó en un desequilibrio en los sistemas SSR hacia la reparación independiente de homología (Figura R7). Estos resultados están en consonancia con un papel de ATM y ATR a favor de la resección del ADN y de la recombinación homóloga. La cascada de fosforilaciones que se da durante la DDR, conlleva el reclutamiento de una serie de proteínas en la proximidades del lugar donde ha Figura R5. Distribución del ciclo celular en células U2OS deplecionadas mediante shRNAs para diversos genes. En la figura se muestran los gráficos representativos del análisis por citometría de flujo de la depleción de los genes diana para la obtención del perfil del ciclo celular en cada caso. Resultados ! ! 70! ocurrido el daño, entre ellas las ligasas E3 de ubiquitina, RNF8, RNF168 y BRCA1. La actividad de estas tres ligasas es fundamental para la DDR y la reparación del ADN. Observamos que la depleción de estas proteínas inclinó el equilibrio hacia la reparación mediante NHEJ (Figura R7). El efecto obtenido fue similar para las tres ligasas de ubiquitina (RNF8, RNF168 y BRCA1) y fue más pronunciado en el caso de la ligasa E2 de ubiquitina UBC13. Además, este efecto fue específico, ya que al perjudicar de manera global el proceso de ubiquitinación mediante el inhibidor del proteosoma MG132, no se alteró de manera significativa el equilibrio entre NHEJ/HR (Figura R7). Se ha descrito que tienen lugar en los sitios de rotura procesos de sumoilación (Galanty et al. 2009). Quisimos comprobar el efecto que tendría la depleción de la ligasa E2 de sumo UBC9 y las ligasas E3 PIAS1 y PIAS4 en los sistemas SSR. Como se puede ver en la Figura R7 la depleción de estas ligasas alteró el equilibrio entre NHEJ/HR favoreciendo la reparación por NHEJ. Por tanto, defectos en diversas modificaciones post-traduccionales dependientes del checkpoint como fosforilaciones, ubiquitinaciones y sumoilaciones alteran el balance entre NHEJ/HR, favoreciendo el NHEJ, y los sistemas SSR fueron capaces de detectarlo. De nuevo, para asegurarnos que los resultados obtenidos no se debían a la alteración del ciclo celular, se analizó el perfil del ciclo celular en cada una de las depleciones realizadas Figura R6. Niveles de silenciamiento obtenidos por depleción con shRNAs de genes que afectan a la respuesta al daño en el ADN. Se realizaron RT-PCR cuantitativas a partir de ARNm de células transfectadas de manera estable con los shRNAs indicados en la figura. El nivel de cDNA de cada gen se normalizó con el cDNA del gen de la actina. La expresión relativa se cuantificó mediante un shRNA control. Se representa la media y el error de un mínimo de tres experimentos independientes. Resultados ! ! 71! (Figura R8). En ninguno de los casos se observó alteración en el ciclo celular, por lo que concluimos que el desequilibrio observado hacia la reparación por NHEJ no se debió a defectos en el ciclo celular (Figura R8). Figura R7. Sensibilidad de los sistemas SSR a defectos en la respuesta al daño en el ADN (DDR). (A) Efecto de la depleción de varios genes implicados en DDR sobre el sistema SSR1.0. En una línea de U2OS que portaba de manera estable el sistema SSR1.0 se llevó a cabo la infección con diferentes shRNAs para los genes indicados en la figura. Se generaron diversas líneas estables y se sometieron a la inducción de daño mediante un corte de doble cadena mediante la meganucleasa I-SceI. Tras llevar a cabo la reparación, se cuantificó la variación en el balance entre reparación independiente o dependiente de homología mediante el cálculo del ratio entre células verdes y rojas. Para facilitar la comparación entre experimentos, este ratio se normalizó con un shRNA control. Aquellos shRNAs que inclinaban el equilibrio hacia un aumento en la reparación independiente de homología eran de valor mayor de 1, mientras que aquellos que aumentaban la HR el valor era menor de 1. Los datos representan un mínimo de tres conjuntos de experimentos. (B) Igual que en (A) pero sobre el sistema SSR2.0. Resultados ! ! 72! 1.4. DISEÑO Y PUESTA A PUNTO DE UN PROTOCOLO DE ESCRUTINIO MASIVO DE GENES QUE AFECTAN EL EQUILIBRIO NHEJ/HR USANDO UNA LIBRERÍA DE esiRNAS EN UN FORMATO DE PLACA DE CULTIVO DE 96 POCILLOS. En esta tesis se optimizó un protocolo de escrutinio para buscar genes que estuvieran implicados en mantener el equilibrio entre los mecanismos de reparación por recombinación homóloga y los mecanismos de reparación por unión de extremos no homólogos. El escrutinio propiamente dicho no se incluye en esta tesis, sólo su optimización, ya que ha sido un proyecto general Figura R8. Distribución del ciclo celular en células U2OS deplecionadas para diversos genes mediante shRNAs. En la figura se muestran los gráficos representativos del análisis por citometría de flujo de la depleción de los genes diana para la obtención del perfil del ciclo celular en cada caso. Resultados ! ! 73! en el que han participado varios miembros del laboratorio. Se adquirió una librería de 16.920 esiRNAs de genes humanos y organizados en 177 placas de 96 pocillos. Cada placa incluía un esiRNA contra el gen de la luciferasa como control negativo. Para el escrutinio se decidió usar la línea de U2OS que contenía el sistema SSR2.0 integrado (en adelante SSR). El objetivo era medir el ratio entre NHEJ/HR que se obtenía al transfectar con los diferentes esiRNAs. Se diseñó y desarrolló el protocolo a utilizar. Dicho protocolo necesitó una serie de ensayos de optimización: i) Elección de las condiciones de transfección: concentración esiRNA, nivel de toxicidad durante la transfección y los tiempos de formación de los complejos (esiRNA + agente transfección) ii) Condiciones óptimas de infección viral iii) Proceso de fijación y tinción celular iv) Procesamiento de las imágenes, incluyendo la adquisición, el análisis y almacenamiento de dichas imágenes. Para definir el número de células de partida se usó el dato inicial de 4000 células empleadas en ensayos de transfección directa realizados en placas de 96 pocillos previos a la optimización del escrutinio. Dado que en el escrutinio se iba a emplear un protocolo de transfección reversa, se incrementó el número de células de partida como recomiendan las especificaciones de la solución de transfección RNAiMax. Si bien las especificaciones recomendaban un incremento de 2,5 veces, solamente lo incrementamos 1,75 veces ya que la duración de nuestro protocolo era de cuatro días y no de 48-72 horas como en las transfecciones convencionales y así evitar que las células crecieran hasta la confluencia, parando el ciclo celular y afectando a los resultados. Finalmente, el número de células del que partimos para realizar la transfección reversa fue de 7000. Para optimizar las condiciones de la transfección, quisimos comprobar la eficiencia de dos agentes de transfección distintos: lipofectamina RNAimax (Invitrogen) y N-Ter (Sigma) (Figura R9). Nos basamos en las especificaciones del reactivo de transfección (ver materiales y métodos apartado 1.2.1.). Para evaluar la concentración óptima de esiRNA en los ensayos de transfección reversa, se utilizó un esiRNA para el gen GFP a diferentes concentraciones (5- 100 nM), en células con el sistema SSR y que por tanto expresaban de manera constitutiva la proteína GFP. Los ensayos se realizaron en placas de 96 pocillos Resultados ! ! 80! eran transducidas y por tanto portaban la construcción BFP-I-SceI. A las 24 horas (Día 3) se renueva el medio de cultivo para retirar los lentivirus. El Día 4 se fijan las células con paraformaldehido al 4% y se tiñen sus núcleos con Hoechst 33258 para su posterior adquisión al microscopio y así mejorar la reproducibilidad entre ensayos (Figura R12). Las cuantificaciones se realizaron mediante el software MetaXpress (más detalles en los materiales y métodos apartado 4.4). Resultados ! 81! 2. PAPEL DE LA NEDILACIÓN EN LA REGULACIÓN DEL EQUILIBRIO ENTRE NHEJ Y HR. 2.1. EFECTO DE UN CONJUNTO DE INHIBIDORES UTILIZADOS EN ENSAYOS CLÍNICOS Y RELACIONADOS CON LA DDR SOBRE EL BALANCE ENTRE REPARACIÓN POR NHEJ Y HR. Para investigar los mecanismos que pueden estar implicados en la elección de la ruta para reparar el daño, analizamos el efecto de un conjunto de pequeñas moléculas inhibidoras de diferentes procesos celulares, que están actualmente en fase de ensayos clínicos contra el cáncer y y que están relacionadas con la DDR, con el sistema SSR (Tabla M3). Como se puede ver en la Figura R13A, tres de los inhibidores inclinaron el equilibrio hacia la reparación por HR: TSA (inhibidor de las histonas Figura R13. Efecto de pequeños inhibidores que alteran el ratio NHEJ/HR. (A) Análisis del efecto sobre el equilibrio entre NHEJ y HR de varias moléculas inhibitorias medido mediante el sistema SSR. Se cuantificó el número de células verdes y rojas obtenidas en cada condición. Se calculó el ratio y se normalizó con respecto al control (DMSO). Aquellas condiciones que inclinaban el balance hacia un aumento en NHEJ resultaban con un valor mayor de 1 (verde). Por el contrario, una disminución de este ratio (valores menores a 1) representaban un desequilibrio del sistema hacia la HR (rojo). Los datos representan un mínimo de tres grupos de experimentos por duplicado. El asterisco representa una significancia estadística de una P<0,05 como se describe en materiales y métodos. (B) Efecto de la sobreexpresión de NEDD8 en el balance NHEJ/HR. Células de U2OS con el sistema SSR fueron transfectadas con HA-NEDD8 o con HA como control. Otros detalles como en (A). Resultados ! 82! deacetilasas de clase I y II), afidicolina (inhibidor de la replicación del ADN) y el inhibidor de la nedilación MLN4924. Ni el inhibidor de MRE11 (Mirina) ni un inhibidor de PARP (Olaparib) dieron lugar a un efecto significativo en el sistema SSR. El compuesto NAM (Nicotinamida), que inhibe PARP-1 e incrementa los niveles de NAD+ y NADP+ disponible en la célula, incrementó el ratio hacia la reparación por NHEJ. El desequilibrio observado hacia la reparación por HR por el inhibidor de la nedilación fue opuesto al observado por la falta de sumoilación y ubiquitinación (ver capítulo anterior, Figura R7). La nedilación, la sumoilación y la ubiquitinación han sido descritas como procesos que ocurren en los sitios de rotura del ADN y, en principio, con funciones similares (Jackson & Durocher 2013; Ma et al. 2013; Li et al. 2014; Yang et al. 2012), por lo que este resultado fue sorprendente. Dado que habíamos obtenido un incremento en la recombinación homóloga por inhibición de la nedilación, quisimos comprobar el efecto que obtendríamos en el sistema SSR al sobreexpresar NEDD8. En principio esperaríamos obtener el resultado contrario, es decir, debíamos obtener un incremento en el NHEJ (un ratio mayor de 1). Para esto llevamos a cabo la sobreexpresión de la proteína NEDD8 unida a un antígeno de HA y como control el plásmido con HA (Tabla I5) mediante transfección en células U2OS-SSR2.0 (materiales y métodos apartado 1.2.2.1.). Como esperábamos, la sobreexpresión de HA-NEDD8 dio como resultado un ligero aumento del ratio NHEJ/HR o lo que es lo mismo una disminución en la HR (Figura 13B). Considerando que el ciclo celular es el principal punto de control para la reparación de los DSB, quisimos descartar que el efecto observado al tratar las células con MLN4924 fuera debido a cambios en el perfil del ciclo celular (Figura R14A). Para ello, las células fueron tratadas con MLN4924 a una concentración de 0,2 μM durante 1, 2 y 24 horas. Sólo en el tratamiento largo (24h) se observó un cambio en la distribución del ciclo celular. Por tanto, restringimos los tratamientos con el inhibidor MLN4924 en nuestros experimentos a tiempos cortos para evitar los efectos mediados por el ciclo celular. Para asegurarnos que el tratamiento con MLN4924 estaba modificando el patrón de nedilación global, realizamos tratamientos a diferentes tiempos, 0, 1 y 2 horas con el inhibidor y, mediante detección por western blot de la Resultados ! 83! proteína NEDD8, pudimos observar que el nivel de nedilación global de las proteínas disminuía significativamente en ambos tiempos (Figura R14B). Es decir, 1 o 2 horas de tratamiento con el inhibidor de la nedilación MLN4924 eran suficientes para alterar el patrón de nedilación sin afectar el ciclo celular. 2.2. LA NEDILACIÓN INHIBE LA RESECCIÓN DEL ADN Y POR TANTO LA RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA. El principal punto de control entre NHEJ y HR es la resección del ADN (Huertas 2010), por tanto, decidimos comprobar si la nedilación de las proteínas tenía un impacto en dicho proceso. La eficiencia de la resección puede ser medida como el porcentaje de células positivas para focos de la proteína RPA tras inducir daño en el ADN. Para ello, células de la línea U2OS se preincubaron durante 1 hora con el inhibidor de la nedilación MLN4924 o DMSO como control, fueron irradiadas y se analizó la formación de focos de RPA mediante inmunofluorescencia (Figura R15). DMSO 0 DMSO 1h DMSO 2h DMSO 24h MLN4924 0 MLN49241h MLN4924 2h MLN4924 24h 0 50 100 G1 S/G2 % células 0 1h 1h 2h 2h DMSO MLN492 Anti-NEDD8 Anti-Tubulina BA Figura R14. Comprobación del tratamiento con MLN4924 mediante el análisis del ciclo celular y del patrón de nedilación global de las proteínas. (A) Análisis del ciclo celular. Las células fueron cultivadas y tratadas con 0,2 μM de MLN4924 o con DMSO (control) durante 1, 2 ó 24 horas. Después fueron recogidas y procesadas para el análisis del ciclo celular mediante FACS como se describe en los materiales y métodos. Al menos 10.000 células fueron cuantificadas en cada condición experimental. Las barras representan la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. (B) Detección mediante western de proteínas nediladas. Células de U2OS fueron tratadas con DMSO como control o MLN4924 a 0,2 μM durante 1 o 2 horas. Se realizaron los extractos de proteínas y mediante el anticuerpo específico anti-NEDD8 y se inmunodetectaron las proteínas nediladas. Como control de carga se inmunodetectó la proteína alfa-tubulina. Resultados ! 84! Se pudo observar que el tratamiento con MLN4924 incrementó de manera significativa el porcentaje de células con focos de RPA. También Figura R15. Efecto del inhibidor de la nedilación MLN4924 sobre la resección del ADN. (A) Eficiencia de la resección medida como porcentaje de células positivas para focos de RPA. Células U2OS fueron pretratadas con DMSO o con el inhibidor de la nedilación MLN4924 a una concentración de 0,2 μM durante 1 hora, irradiadas a 10 Gy y tras una hora de recuperación, sometidas a inmunofluorescencia para la detección de focos de la proteína RPA. A la derecha se puede observar un ejemplo representativo de las imágenes obtenidas. La fluorescencia de los focos de RPA aparece en rojo y la tinción de núcleos con DAPI en azul. La gráfica representa la media y la desviación estándar del porcentaje de células positivas para focos de la proteína RPA de tres experimentos independientes. El asterisco representa una significancia estadística de una P<0,05 como se describe en materiales y métodos. (B) Inmunodetección de focos de RIF1. Al igual que en (A), las células fueron tratadas con DMSO o MLN4924 e irradiadas. La gráfica representa la media y la desviación estándar del número medio de focos de RIF1 por célula de tres experimentos independientes. El asterisco representa una significancia estadística de una P<0,05 como se describe en materiales y métodos. Una imagen representativa de los focos de RIF1 en verde y de los núcleos con DAPI en azul se muestra a la derecha. Resultados ! 85! quisimos conocer si se obtenía una disminución en proteínas que promueven el NHEJ y bloquean la resección mediante el análisis de la proteína RIF1 (Chapman et al. 2013; Escribano-Díaz et al. 2013). Se cuantificó el número medio de focos de RIF1 que aparecían tras inducir el daño por irradiación en las células con o sin MLN4924 (Figura R15B). Como se puede observar en la figura el número medio de focos de RIF1 disminuyó significativamente al tratar con MLN4924. 2.3. LA NEDILACIÓN ES UN PROCESO QUE ESTÁ IMPLICADA EN LA RESECCIÓN MEDIADA POR CtIP. En los apartados anteriores hemos comprobado que la nedilación tiene una implicación en la recombinación y la resección y la proteína CtIP es fundamental en ambos procesos (Sartori et al. 2007; Escribano-Díaz et al. 2013). Quisimos comprobar el efecto que podía tener la depleción de CtIP en combinación con la inhibición de la nedilación sobre la resección. Para ello analizamos los focos de RPA generados tras irradiar células U2OS que habían sido infectadas con partículas lentivirales portadoras de shRNAs para CtIP y para un shRNA control (shScr). Como se puede observar en la Figura R16A, la hiper-resección obtenida por el tratamiento con MLN4924 se vio disminuida por la depleción de CtIP. En cada réplica experimental se comprobó la depleción de CtIP mediante western-blot. En la Figura R16B se muestra un ejemplo de la depleción obtenida mediante shRNA para la proteína CtIP. La observación de que la nedilación de proteínas regula negativamente la resección del ADN podría explicar por qué el tratamiento con MLN4924 inclina el equilibrio NHEJ/HR hacia HR. Para probar que el posible desequilibrio entre ambos mecanismos de reparación era causado por una resección excesiva mediada por CtIP, medimos el balance entre ambas rutas de reparación usando el sistema SSR en células que habían sido tratadas con DMSO o bien con MLN4924 con o sin la depleción de CtIP (Figura R16C). Como se puede ver en el gráfico, las células fueron tratadas con diferentes concentraciones del inhibidor (0.05, 0.2 y 1 μM) y se calculó el ratio entre NHEJ/HR normalizado con el DMSO de los controles. Se pudo observar en todos los casos una supresión del fenotipo hiper-recombinogénico debido al tratamiento con el MLN4924 al deplecionar CtIP. Resultados ! 86! Figura R16. La nedilación de proteínas inhibe la resección y la recombinación homóloga del ADN mediadas por CtIP. (A) Eficiencia en la resección como porcentaje de células positivas para focos de RPA. Células U2OS que expresan un shRNA control (shScr) o un shRNA contra CtIP fueron pretratadas con 0,2 μM de MLN4924 o con DMSO durante 1 hora, irradiadas (10 Gy) e incubadas durante una hora adicional en presencia del inhibidor. Otros detalles como en la Figura R15. (B) Niveles de CtIP analizados mediante western blot tras su depleción mediante shRNA. (C) Efecto sobre el sistema SSR de la depleción de CtIP y del tratamiento con MLN4924 a diferentes concentraciones. Células con el sistema SSR integrado fueron infectadas con un shRNA control (Scr) y con un shRNA para CtIP (shCtIP) y tratadas con diferentes dosis de MLN4924 (0.05, 0.2 y 1 μM). Se calculó el ratio entre HR y NHEJ y se normalizó con respecto al control (DMSO). Otros detalles experimentales son los mismos que en (A). Las barras representan las medias y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. Las significación estadística se calculó con un análisis doble de la varianza (Two-ways ANOVA). Resultados ! 87! 2.4. EL INHIBIDOR DE LA NEDILACIÓN MLN4924 CAUSA UNA HIPER-RESECCIÓN MEDIADA POR CtIP QUE AFECTA A LA VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS. El MLN4924 está actualmente en fase de ensayos clínicos por su capacidad para matar células tumorales. Para estudiar si parte de esa letalidad se podría deber a la hiper-resección observada por la inhibición de la nedilación, analizamos la viabilidad de las células tratadas con MLN4924 en combinación con la depleción de CtIP. Pudimos comprobar que la viabilidad de las células tratadas con MLN4924 aumentaba ligera pero significativamente en las células con CtIP deplecionado (Figura R17A). Podemos concluir que la toxicidad provocada por la inhibición de la nedilación es, al menos parcialmente, debida a una hiper-resección mediada por CtIP. Para apoyar estos resultados analizamos la sensibilidad de estas células a la radiación cuando eran tratadas con MLN4924 y de qué manera cambiaba su capacidad de supervivencia en los casos en los que a su vez se deplecionó CtIP. Como se puede observar en la Figura R17B las células con CtIP deplecionado eran Figura R17. La depleción de CtIP aumenta la supervivencia de células tratadas con el inhibidor de la nedilación MLN4924. (A) Efecto de la depleción de CtIP sobre la superviviencia de células tratadas con MLN4924. Células transfectadas con un shRNA contra CtIP o control fueron tratadas durante 12 días con MLN4924 a 0,1 μM o con DMSO. El número de colonias formadas en presencia de MLN4924 se normalizó con respecto al DMSO. Las barras representan la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. (B) Supervivencia celular tras la irradiación de células tratadas con MLN4924 con o sin CtIP deplecionado. Células con los shRNAs indicados fueron irradiadias con 2 Gy, con 1h de pre-incubación con 0,2 μM de MLN4924 o DMSO, respectivamente. ! Resultados ! 88! menos sensibles al daño después de un tratamiento corto con MLN4924. Es decir, la supervicencia de las células tratadas con MLN4924 era mayor cuando éstas tenían a su vez deplecionada la proteína CtIP. Por tanto, nuestros datos sugieren que un empeoramiento de la resección por una reducción en los niveles de CtIP es parcialmente corregido por un fenotipo de hiper-resección debido a una inhibición de la nedilación. 2.5. LA INTERACCIÓN ENTRE CtIP Y BRCA1 ESTÁ CONTROLADA POR NEDILACIÓN. Para entender el mecanismo molecular que controla la inhibición de la resección del ADN mediante la nedilación de proteínas, inmunoprecipitamos las proteínas nediladas utilizando un anticuerpo anti-NEDD8 (Tabla M7) y realizamos un western-blot para detectar CtIP y BRCA1 que son claves en la resección del ADN (Cruz-García et al. 2014; Chapman et al. 2013; Escribano- Díaz et al. 2013). Observamos que tanto CtIP como BRCA1 fueron coinmunoprecipitadas con el anticuerpo anti-NEDD8 (Figura R18A). Empleamos una IgG control para validar la especificidad de la inmunoprecipitación (IP). También comprobamos que al hibridar estas membranas con el anticuerpo de NEDD8 detectabamos señal debido a nedilación, pero dicho anticuerpo no reconoció ni a CtIP ni a BRCA1. Concluimos que ni CtIP ni BRCA1 eran nedilados o que su nivel de nedilación era tan bajo que no la pudimos detectar, pero que podían interaccionar con proteínas nediladas. Para asegurarnos que la interacción que estábamos observando se debía realmente a proteínas nediladas, repetimos la IP realizando un tratamiento con el inhibidor de la nedilación MLN4924 y observamos mediante western blot una reducción del 38% en la aparición tanto de CtIP como de BRCA1 (Figura R18B). Llevamos a cabo varias repeticiones experimentales y pudimos obtener una cuantificación del porcentaje de proteínas inmunoprecipitadas tanto de CtIP como de BRCA1 (Figura R18C). Por tanto, concluimos que CtIP y BRCA1 de manera independiente o bien formando un complejo, interactúan con proteínas nediladas. Considerando que la nedilación de proteínas es un importante inhibidor de la resección del ADN, decidimos analizar la interacción de CtIP y BRCA1 con proteínas nediladas después de inducir daño en el ADN. Resultados ! 89! Para ello sometimos a las células a irradiación y cuantificamos la cantidad de CtIP y BRCA1 que era inmunoprecipitada con el anticuerpo anti-NEDD8 a los 0, 30 ó 60 minutos de realizar el daño (Figura R19). Observamos que tanto CtIP como BRCA1 fueron inmunoprecipitadas en las células no tratadas. Además se comprobó que en ambos casos, la cantidad de inmunoprecipitado se reducía después del daño. Este resultado apoyaba la idea de que tanto CtIP como BRCA1 interaccionan con proteínas nediladas antes de la inducción del daño y que esta interacción disminuye tras la aparición del mismo. Figura R18. CtIP y BRCA1 interaccionan con proteínas nediladas. (A) Inmunoprecipitación de CtIP y BRCA1 mediante anticuerpo anti-NEDD8. Extractos de proteínas fueron divididos en dos e inmunoprecipitados con un anticuerpo anti-NEDD8 o bien con IgG control. Se realizó la detección de CtIP y BRCA1 mediante western blot. (B) Inmunoprecipitación de CtIP y BRCA1 con anti-NEDD8 en extractos tratados con MLN4924. Extractos de proteínas de células pretratadas con MLN4924 o DMSO fueron inmunoprecipitadas con el anticuerpo anti-NEDD8. Se muestra en la figura un western blot representativo. (C) Cuantificación de la cantidad de proteína inmunoprecipitada con el anticuerpo anti-NEDD8, del apartado B, relativa al input y normalizada al DMSO, tomado como el 100%. Se representa la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. Resultados ! 96! incremento en NHEJ como estaba descrito (Gomez-Cabello et al. 2013) (parte primera de esta tesis). Para analizar el efecto que tenían sobre la resección las depleciones de estas proteínas realizamos experimentos de visualización de focos de RPA tras la inducción del daño por irradiación mediante inmunofluorescencia. Se deplecionaron con siRNAs específicos las subunidades del complejo COP9 signalosoma CSN1 y CSN5. Se analizó el número de células positivas para focos de RPA y se pudo comprobar que aunque tanto en la depleción de CSN1 como la de CSN5 el número de focos disminuyó, en ambos caso lo hizo Figura R24. Silenciamiento de las denedilasas COP9 signalosoma y NEDP1 mediante siRNAs. Control de las depleciones de CSN1 y CSN5. Células U2OS fueron transfectadas con siRNAs para las subunidades CSN1 y CSN5 de la denedilasa COP9 signalosoma como se describe en los materiales y métodos. Se muestra un western blot representativo de las depleciones obtenidas. Como control interno se inmunodetectó la proteína alfa-tubulina. Figura R25. Papel del COP9 signalosoma en la elección de la ruta de reparación de los DSBs. Células U2OS con el sistema SSR fueron transfectadas con siRNAs para las subunidades CSN1 y CSN5 de la denedilasa COP9 signalosoma. Como controles positivo y negativo se emplearon un siCtIP y un siRNA control sin diana conocida, respectivamente. Para medir la desviación en el balance entre NHEJ y HR, se midió el ratio entre células verdes y rojas, más detalles como en la Figura R13 y materiales y métodos. Resultados ! 97! de manera sutil (Figura R26A). Este efecto reducido parecía indicar que otras denedilasas podrían compensar la falta del signalosoma COP9. La otra denedilasa mejor descrita e implicada en diversos procesos celulares es NEDP1 también llamada DEN1 (Mendoza et al. 2003). En el caso de la NEDP1 Figura R26. Papel del COP9 signalosoma y la denedilasa NEDP1 en la resección del ADN. (A) Eficiencia de la resección medida como porcentaje de células positivas para focos de RPA en células U2OS con CSN1, CSN5, NEDP1 o CSN1 y NEDP1 deplecionados. Las células fueron transfectadas con siRNAs para CSN1, CSN5, NEDP1, una mezcla de CSN1 y NEDP1 y un control negativo. 48 horas después, las células fueron irradiadas a 10 Gy y, tras una hora de recuperación, sometidas a inmunofluorescencia para la detección de focos de la proteína RPA. La gráfica representa el porcentaje de células positivas a focos de RPA. (B) Efecto de la depleción de CSN1+NEDP1 en el número medio de focos de RIF1. Al igual que en (A), las células fueron transfectadas con la mezcla de siRNAs para CSN1 y NEDP1, irradiadas y se procedió a la inmunodetección de los focos de RIF1. Se cuantificó el número medio de focos de RIF1 por célula y se hizo relativo al control negativo. La gráfica representa la media y la desviación estándar del número de focos por célula de tres experimentos independientes. El asterisco representa una significancia estadística de una P<0,05 como se describe en materiales y métodos. (C) Imágenes representativas de las inmunofluorescencias realizadas para la detección de los focos de RPA (rojo) y RIF1 (verde). Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). Resultados ! 98! su actividad metaloproteolítica es dual ya que también participa en la transformación del precursos de NEDD8 en un NEDD8 activo además de retirarlo de las proteínas diana (Mendoza et al. 2003). Comprobamos, en extractos crudos de proteínas, que al deplecionar NEDP1 se incrementó el nivel global de proteínas nediladas mediante western blot con anti-NEDD8 (Figura R27). Analizamos la implicación que podría tener la denedilasa NEDP1 en la resección silenciando el gen en cuestión mediante un siRNA y realizando el protocolo para la detección de focos de RPA. Se observó que el porcentaje de células con focos de RPA disminuyó aproximadamente un 25% y por tanto la resección se vio desfavorecida (Figura R26). También quisimos comprobar el efecto que tendría la depleción simultánea de CSN1 y NEDP1 y pudimos comprobar que el número de focos de RPA disminuyó aproximadamente un 45% con respecto al control (Figura R26A). Para contrastar estos resultados analizamos el número de focos de la proteína RIF1 al realizar la doble depleción CSN1/NEDP1. Aunque se observó un ligero incremento en el número de focos de RIF1, éste no fue significativo (Figura R26B y R26C). La nedilación tiene como sustratos principales las culinas (ver apartado 5 de la introducción). Quisimos comprobar si las culinas podrían tener una función en el equilibrio NHEJ/HR. Se ha descrito que la CUL4A se recluta al sitio de daño y que el tratamiento con MLN4924 atenúa dicho reclutamiento Figura R27. Niveles de nedilación tras la depleción de NEDP1. Mediante western blot se comprobaron los niveles de nedilación utilizando un anticuerpo anti- NEDD8. Las células fueron transfectadas con un siRNA para la denedilasa NEDP1 y con un siRNA control (siScr). Como control interno se inmunodetectó la proteína alfa-tubulina. Resultados ! 99! (Meir et al. 2015). Por tanto, mediante el sistema SSR analizamos el efecto que sobre el equilibrio NHEJ/HR causaría la depleción de CUL4A con un siRNA específico. Observamos que se inclinó el equilibrio hacia la reparación por HR y paralelamente comprobamos la depleción mediante western blot (Figura R28). Este estudio fue preliminar y debería ser completado más adelante. 2.8. LA NEDILACIÓN ESTÁ IMPLICADA EN LA ELECCIÓN DE LA RUTA PARA REPARAR LOS DAÑOS PRODUCIDOS POR ROTURAS DE DOBLE CADENA. El conjunto de resultados obtenidos sugieren que la nedilación de algunas proteínas desempeña un papel en la resección del ADN y por tanto en la reparación por HR. Para estudiar cómo afecta la nedilación a dicha reparación utilizamos el sistema DR-GFP para medir específicamente reparación por HR in vivo (Pierce et al. 2001). En este sistema, dos repeticiones directas (DR) mutadas del gen de la GFP están separadas 3,7 kb por un gen de marcador de selección (Figura R29A). Al tratar con MLN4924, se observó una disminución acusada en la reparación por HR (Figura R28B). Esta aparente Figura R28. Efecto de la depleción de CUL4A sobre el sistema SSR. (A) Análisis del efecto sobre el equilibrio entre NHEJ y HR de la depleción de CUL4A. Como control se empleó un siRNA sin diana conocida. Otros detalles como en la Figura R13. (B) Western blot para la comprobación de la depleción de CUL4A. Resultados ! 100! contradicción entre estos resultados y los datos que habíamos obtenido mediante el sistema SSR (Figura R13B) y el aumento en los focos de proteína RAD51 observados por otros autores (Cukras et al. 2014), nos hizo pensar que el inhibidor de la nedilación MLN4924 podría estar afectando a la reparación por recombinación homóloga dependiendo de la longitud del tramo de resección. La longitud del ADN reseccionado va a definir como de largo es el ADN que va a ser copiado durante el proceso de recombinación, el denominado tramo de conversión. En el sistema DR-GFP, sólo la reparación por recombinación homóloga de tramo corto sin entrecruzamiento genera un gen GFP funcional mediante conversión génica. El tramo de conversión observable está limitado por el tamaño de la zona de homología, de unos cientos de pares de bases. Sin embargo un evento de tramo más largo, haría DMSO MLN4924 0.0 0.5 1.0 1.5 *** Eficiencia de la Conversión Génica (relativo al DMSO) GFP iGFP GFP iGFP GFP iGFP AB Sitio diana I-SceI DR-GFP Figura R29. Efecto de la inhibición de la nedilación de proteínas en el sistema de reparación in vivo DR-GFP. (A) Esquema representativo del sistema DRGFP. Este sistema se compone de dos repeticiones directas (DR) mutadas del gen de la GFP y separadas 3,7 kb. Uno de los genes contiene un sitio de reconocimiento para la endonucleasa I-SceI. Como resultado de la reparación por recombinación homóloga la secuencia iGFP actúa de donador de información en un fenómeno de conversión génica. (B) Efecto del inhibidor MLN4924 sobre el sistema DR-GFP. Células U2OS con el sistema DR-GFP integrado fueron tratadas con 0,2 μM del inhibidor de la nedilación MLN4924 y con DMSO como control. Se midió la eficiencia de la conversión génica por cuantificación del número de células verdes en la condición con MLN4924 y relativizado al control con DMSO. Las barras representan la media y las desviación estándar de tres experimentos independientes. Más información en la sección de materiales y métodos. Resultados ! 101! que se mantuviera sólo el extremo 5' de la GFP, y codificaría una proteína truncada. Es decir, un aumento de eventos de tramo largo (causados por una resección más larga) se observa como una caída en el número de células fluorescentes verdes en el sistema DR-GFP. Puede ser que éste fuera el motivo por el que el resultado en el sistema SSR nos indicara un aumento en la HR y sin embargo el sistema DR-GFP nos daba un resultado opuesto. Para comprobar esto, decidimos utilizar el sistema SA-GFP (Figura R30A), el cual mide directamente reparación por SSA (Bennardo et al. 2008). En este sistema dos repeticiones directas del gen de la GFP que comparten homología, tras la indución del corte con I-SceI y su reparación por SSA, resultan en un gen funcional de la GFP. En este tipo de reparación la resección es de tramo largo. Como se aprecia en la Figura R30B, la inhibición de la nedilación incrementó de manera significativa esta ruta, por tanto, la nedilación estaba implicada en controlar la longitud del proceso de resección. Figura R30. Efecto de la inhibición de la nedilación de proteínas en el sistema de reparación in vivo SA-GFP. (A) Esquema representativo del sistema SAGFP. Este sistema consiste en dos fragmentos del gen de la GFP separados 2,7 kb que comparten 266 pb de homología. La inducción del corte de doble cadena por la endonucleasa I-SceI y su reparación por SSA resulta en un gen funcional de la GFP y las células son verdes. (B) Efecto del inhibidor de MLN4924 sobre la reparación por SSA. Células U2OS con el sistema SA-GFP integrado fueron sometidas a tratamiento con 0,2 μM de MLN4924 y con DMSO como control. Se midió la eficiencia en SSA al cuantificar el número de células verdes en la condición con MLN4924 y relativizar a la condición con DMSO. Las barras representan la media y las desviación estándar de tres experimentos independientes. Más información en la sección de materiales y métodos. Resultados ! 102! De manera inversa a lo que habíamos obtenido con el sistema SA-GFP, al tratar con MLN4924, la reparación por NHEJ debía estar perjudicada. Para comprobar esto, utilizamos el sistema de reparación EJ5 que detecta diversos tipos de reparación por NHEJ y que por tanto sirve para medir la reparación por NHEJ total (Bennardo et al. 2008). En este sistema, se forma un gen de la GFP funcional cuando las células reparan por NHEJ tanto si se restaura o no la diana I-SceI (Figura R31A). Como esperábamos, al tratar con MLN4924, la reparación por NHEJ disminuyó significativamente debido a un incremento en la resección del ADN (Figura R31A). Estos resultados en los que el tratamiento con el inhibidor de la nedilación incrementó la reparación por SSA y disminuyó la reparación mediante NHEJ corroboraba el desequilibrio observado en el sistema SSR hacia la reparación por recombinación homóloga por el aumento de la resección al inhibir la nedilación. Figura R31. Efecto de la inhibición de la nedilación de proteínas en el sistema de reparación in vivo EJ5. (A) Esquema representativo del sistema EJ5. Este sistema consiste en un promotor separado del gen que codifica para la GFP por el gen para la puromicina y está flanqueado por dos sitios de corte para la endonucleasa I-SceI. Tras la inducción de los DSBs y su reparación por NHEJ se restaura la expresión de la GFP. Tanto si la diana es restaurada o no se obtiene la expresión del gen de la GFP. (B) Efecto del inhibidor MLN4924 sobre la reparación por NHEJ. Células U2OS con el sistema EJ5 fueron tratadas con 0,2 μM del inhibidor de la nedilación MLN4924 y con DMSO como control. Se cuantificó el número de células verdes y se hizo relativo a las células tratadas con DMSO. Las barras representan la media y las desviación estándar de tres experimentos independientes. Más información en la sección de materiales y métodos. DISCUSIÓN ! Discusión( ! 105! Esta tesis se centra en el estudio de los mecanismos que regulan la elección entre la recombinación homóloga (HR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ), y como eje de esta regulación el proceso de resección, el cual determina qué tipo de reparación se llevará a cabo. Para ello, diseñamos los sistemas SSR1.0 y SSR2.0, del inglés SeeSaw Reporters (SSR), sensibles a la resección y que son capaces de medir el equilibrio NHEJ/HR. Nuestro objetivo con estos sistemas fue detectar cambios en el equilibrio entre ambas rutas de reparación independientemente de si este cambio es causado por un incremento en la HR y disminución en el NHEJ, o viceversa. La alteración del equilibrio puede depender del aumento o disminución en un sentido de un mecanismo de reparación en concreto o bien de una combinación entre ambos. La expresión constitutiva del gen de la GFP hace a estos sistemas diferentes a los convencionales (DR-GFP, SA y EJ) los cuales disponen de la diana I-SceI al comienzo del gen. Con estos sistemas sólo se pueden observar eventos de reparación cuando dicha reparación es mutagénica y se restaura la pauta abierta de lectura. Los sistemas SSR detectan la reparación por NHEJ clásico libre de errores y la mutagénica. La expresión de la proteína BFP (azul) en conjunción con la I-SceI permite seguir la eficacia del corte para que la detección de los eventos de reparación por NHEJ sea fiable. Una posibilidad adicional de reparación es que venga mediada por alt- NHEJ, en cuyo caso tendría lugar la resección, pero las células podrían perder la región intermedia del gen de la GFP, dejando de ser funcional y además no se habría llegado a restaurar el gen de la RFP, por lo que las células no serían fluorescentes ni en el verde ni en el rojo. A la hora de cuantificar los desequilibrios hacia la HR o hacia el NHEJ el sistema SSR2.0 presenta menos variabilidad experimental que el SSR1.0. Esto se debe a que, en el sistema SSR2.0, hay dos dianas para la enzima I-SceI con secuencias invertidas no palindrómicas y cuando se produce el corte, éste es reparado y la diana I-SceI queda destruida, es decir, sólo se da un fenómeno de reparación. Sin embargo en el sistema SSR1.0 hay una única diana para I- SceI que puede ser reparada y cortada sucesivas veces hasta que desaparece por HR o bien por NHEJ mutagénico. Así, en cada experimento realizado con el sistema SSR1.0, el porcentaje de células que pueden terminar reparando por Discusión( ! 112! reseccionan, sino que incrementa la longitud de ADN reseccionado (Jimeno et al. 2015). Mientras realizamos estos experimentos se publicó el artículo de Cukras et al. (2014) en el que se analizaba el impacto que tenía la ligasa E2 de NEDD8, UBE2M sobre la DDR y el papel de las culinas en este proceso. UBE2M es una de las dos ligasa E2 de NEDD8 descritas en mamíferos junto a UBE2F por Huang et al (2009). Cada una de ellas presentan patrones de nedilación distintos para las culinas. Dado que UBE2M se asoció con la DDR (Cukras et al. 2014), analizamos el efecto de la depleción de UBE2M en el equilibrio NHEJ/HR y en la aparición de los focos de RPA tras inducir daño mediante IR. Al igual que el tratamiento con MLN4924, la depleción de UBE2M inclinó el equilibrio hacia la reparación por HR e incrementó el número de células con los focos de RPA. Estos datos estaban de acuerdo con el incremento en focos de RAD51 que se había observado al tratar la células con MLN4924 (Cukras et al. 2014). Dado el efecto que tiene la nedilación en resección y dado que la interacción entre BRCA1-CtIP es importante para dicho proceso (Yu & Chen 2004; Cruz-García et al. 2014), decidimos comprobar si la inhibición de la nedilación estabilizaba la interacción entre BRCA1 y CtIP (Figura R18, Figura R19 y Figura R20). Nuestros datos experimentales sugieren que la nedilación mediada por UBE2M de una o varias proteínas desconocidas regula la interacción entre CtIP y BRCA1. Esta hipótesis está en consonancia con la idea de que la interacción BRCA1-CtIP modula la extensión y la velocidad de la resección del ADN (Cruz-García et al. 2014). Aunque nuestros datos apoyan que la nedilación inhibe la resección mediada por CtIP, no podemos descartar que alguno de los fenotipos observados dependan además posibles funciones de la nedilación en otros pasos de la HR, tales como la resección de tramo largo dependiente de BLM/EXO1, la reacción de alineamiento de la cadena, etc. Por otro lado la inhibición de la nedilación al tratar con MLN4924 activa ATR y por tanto sería otra forma de incrementar la HR (Soucy et al. 2009) Se ha descrito previamente que la nedilación en los sitios de daños del ADN depende de la actividad de RNF111, una ligasa E3 de ubiquitina que se ha propuesto actúa también como ligasa E3 de NEDD8 (Ma et al. 2013). La actividad de RNF111 aumenta tras el daño en el ADN y actúa localmente en las proximidades del mismo. Por un lado, RNF111 y NEDD8 se localizan Discusión( ! 113! rápidamente en los sitios de daño, con un pico de reclutamiento a los 10 minutos después del daño y de manera dependiente de UBE2M (Ma et al. 2013). Después, su acumulación se disipa lentamente con el tiempo. Entonces, la nedilación de proteínas en el entorno del daño es una rápida respuesta que encaja bien con un papel en el mecanismo de reparación por NHEJ. Por otro lado, la depleción de RNF111 disminuye los focos de BRCA1 y de RAD51 tras el daño (Ma et al. 2013). Nosotros hemos comprobado además que la depleción de RNF111 incrementa la cantidad relativa de CtIP que coinmunoprecipita con BRCA1 (Figura R23). Aunque no podemos excluir el papel de la ubiquitinación realizada por RNF111 en el fenotipo observado, el hecho es que efectos similares se observaron con la depleción de UBE2M, que es la E2 que se ha propuesto que actúa junto a RNF111 en nedilación, lo que nos conduce a proponer que la nedilación mediada por RNF111/UBE2M está implicada en la resección del ADN, y por consiguiente en la HR (Figuras R21 y R22). Además este incremento de la cantidad relativa de CtIP coinmunoprecipitada observado al deplecionar RNF111 y UBE2M también se obtuvo cuando se inhibió la nedilación tratando las células con el MLN4924 (Figura R20). Cualitativamente, la depleción de RNF111 y UBE2M muestran fenotipos similares tanto en el sistema SSR como en la medición de focos de RPA y RIF1 (Figuras R21 y R22 respectivamente) pero, cuantitativamente, el efecto de UBE2M es mayor que el de RNF111, lo cual podría sugerir que ambas proteínas tienen papeles adicionales e independientes controlando la resección del ADN. Por ejemplo, la depleción de RNF111 disminuye los focos de NEDD8 y la cascada de ubiquitinación inducida por daño se ve afectada porque se afecta el reclutamiento de RNF168 al daño (Ma et al. 2013). El motivo es que RNF168 reconoce a la histona H4 polinedilada y si RNF111 es silenciado no es capaz de unirse a la cromatina (Ma et al. 2013). Existe cierta controversia sobre si RNF168 también actúa como una ligasa E3 de NEDD8 encargada de llevar a cabo la nedilación de la histona H2A (Li et al. 2014) o si su función en la DDR es exclusivamente a través de su actividad ligasa de ubiquitina y su relación con NEDD8 se limita a reconocer la histona H4 polinedilada (Ma et al. 2013). Por otra parte, no podemos descartar la participación en DDR de los sustratos naturales de la nedilación: las culinas. Existe una correlación entre la CUL7 y CtIP en una determinada patología, el enanismo primoridal, de manera Discusión( ! 114! que mutaciones específicas tanto en la CUL7 como en CtIP muestran fenotipos similares (Shaheen et al. 2014; Qvist et al. 2011). En colaboración con el grupo de investigación del Dr. Yosef Shiloh hemos estudiado el papel del CSN y CUL4, en la reparación de los DSBs. CSN es reclutado al sitio de daño de una manera dependiente de nedilación y que este reclutamiento era acompañado por la CUL4A (Meir et al. 2015). El tratamiento con MLN4924 atenúa el reclutamiento de la CUL4A al DSB sin que se afecte el reclutamiento de otras proteínas como 53BP1 o RNF168 (Meir et al. 2015). En el sistema SSR observamos un desequilibrio hacia el NHEJ indicando una función del complejo CSN en la reparación por recombinación homóloga (Figura R25). Además comprobamos si obteníamos el mismo efecto al deplecionar la CUL4A y vimos una tendencia a la reparación por HR (Figura R28). Esto se debía a una reducción en el número de células positivas para focos de RPA al deplecionar las subunidades CSN1 y CSN5. El efecto fue más claro cuando realizamos el silenciamiento de otra de las denedilasas, NEPD1, y aún más cuando combinamos la depleción de la subunidad CSN1 con la de NEPD1 (Figura R26). Esto nos hizo pensar en un posible efecto epistático entre el complejo CSN y la denedilasa NEPD1. El resultado obtenido al analizar RPA fue coincidente con los datos obtenidos mediante el sistema SSR (Figura R25) y mediante el análisis de los focos de RIF1 (Figura R26). Estos datos indican que no sólo la nedilación está implicada en la reparación de los DSBs, sino que el proceso inverso también, la denedilación, tanto a nivel de la DDR como directamente en el mecanismo de reparación por recombinación homóloga, como se ha podido observar a nivel de resección (Figura R26) y con el papel que tiene la nedilación en la interacción entre CtIP y BRCA1 (Figura R20) (Jimeno et al. 2015). Posteriormente se ha relacionado la nedilación con la liberación del heterodímero Ku desde los sitios de daño (Brown, Lukashchuk, et al. 2015). La nedilación promueve la ubiquitinación de Ku y esto desencadena su salida del DSB. También observaron que la depleción de UBE2M reducía la supervivencia celular, del mismo modo que nosotros habíamos observado para los tratamientos con MLN4924 (Figura R17A). Mediante un ensayo de integración al azar de un plásmido deplecionando UBE2M describieron un defecto en el NHEJ, que sería compatible con nuestras observaciones de un aumento de la HR. El conjunto de nuestros experimentos señalan una función Discusión( ! 115! de la nedilación/desnedilación en la resección y por tanto afectan a la reparación por HR, pero no es descartable que la reparación por NHEJ también se vea afectada al inhibir la nedilación y el resultado obtenido mediante el sistema SSR sea la suma de ambos efectos. En cuanto a la cinética de nedilación/desnedilación observan un rápido reclutamiento de NEDD8 al sitio de daño (Brown, Lukashchuk, et al. 2015), observación que cuadra con el modelo propuesto por nosotros y que se representa en la Figura D1, ya que planteamos que a través de RNF111 se da una rápida oleada de nedilación tras la inducción del daño, reduciéndose la resección y promoviendo el NHEJ. Por tanto, proponemos un modelo de regulación de la reparación de los DSB basado en que la nedilación podría estar actuando como un reloj molecular (Figura D1). Tras la aparición del DSB, rápidamente, la acumulación de RNF111 podría obstaculizar la resección del ADN favoreciendo el NHEJ. Después, las proteínas nediladas perderían NEDD8 debido a mecanismos activos y pasivos. Por una parte, RNF111 sería excluido de la cromatina dañada (Ma et al. 2013). Por otra parte, la acción del complejo CSN y la denedilasa NEDP1 contribuirían activamente a la desnedilación de las proteínas. En consonancia con este modelo, se ha visto que ambas denedilasas se activan como respuesta al daño en el ADN. De hecho, dos de las subunidades de complejo COP9 signalosoma son sustrato de ATM (Matsuoka 2007). Además, RNF168 es nedilada después del daño, pero esta nedilación es transitoria y comienza a decaer a los 30 minutos debido a la acción de la denedilasa NEDP1 (Li et al. 2014). Este reloj molecular dependiente de nedilación regularía el tipo de reparación del DSB que tendría lugar mediante el control de la extensión de la resección del ADN. Esto estaría de acuerdo con la idea de que la nedilación modula la interacción entre BRCA1-CtIP, interacción que controla la longitud de la resección (Cruz-García et al. 2014). Primero, la acumulación de la nedilación mediada por RNF111 favorecería el NHEJ clásico. Algunas de aquellas roturas que no fueran adecuadas para la reparación por NHEJ, probablemente debido a modificaciones en los extremos del ADN, permanecerían sin ser reparadas durante más tiempo. En estas roturas, es posible que la propia nedilación facilite la ubiquitinación y salida de Ku para permitir otros tipos de reparación (Brown, Lukashchuk, et al. 2015). Tan pronto como la nedilación de las proteínas comienza a desaparecer, probablemente Discusión( ! 116! debido a la retirada del DSB de RNF111 y la activación de CSN y NEDP1, comenzaría a tener lugar la resección en algunos extremos dañados del ADN. Este limitado procesamiento dejaría extremos “limpios” que permitiría su reparación mediante la reparación por MMEJ (Figura D1). Incluso entonces algunas roturas podrían quedar sin reparar. La progresiva caída en nedilación facilitaría la interacción entre CtIP y BRCA1, aumentando paulatinamente la procesividad y la longitud de la resección por la eliminación de RIF1 (Cruz- García et al. 2014). Sólo entonces los extremos de ADN de cadena sencilla serían tomados para la HR, primero por conversión génica de tramo corto y después por SSA. Una caída total de los niveles de proteínas nediladas provocaría un proceso de hiper-resección de los extremos, lo que podría tener consecuencias mutagénicas. Durante la recombinación con una secuencia ectópica, como en la recombinación medida por el sistema DR-GFP, es esencial que la resección esté limitada a la región homóloga (Figura D2). Sólo entonces, tienen lugar los subtipos no mutagénicos de recombinación como el DSBR y el SDSA (Figura D2, ag-g,e). De otra forma, en ausencia completa de Figura D1. La nedilación actúa como un reloj molecular para la resección y la elección de la ruta de reparación. Primero, una alto nivel de nedilación, en el entorno de la rotura, debido a la actividad de RNF111 inhibe la resección favoreciendo el NHEJ. Después, la activación de NEDP1 y CSN reduce la nedilación permitiendo que tenga lugar la resección. La mayoría de las roturas serán reparadas por conversión génica. Finalmente, la nedilación es lo suficientemente reducida como para permitir la hiper-resección, favoreciendo mecanismos de reparación como el SSA que requiere tramos largos de ADN reseccionado. ! Discusión( ! 117! nedilación, como con el tratamiento con MLN4924 se daría hiper-resección, siendo la resección del ADN más larga (Figura D2, h). Entonces tanto DSBR como SDSA serían bloqueados (Figure D2, i-k). Esto explica nuestra observación de que la conversión génica de tramo corto con el sistema DRGFP se reduce al inhibir la nedilación (Figura R28). De acuerdo con esto, se ha mostrado que la depleción de RNF111 y UBE2M reduce la conversión génica en el sistema DR-GFP a pesar del aumento posterior de la formación de los focos de RAD51 (Ma et al. 2013; Cukras et al. 2014). Entonces, la hiperresección causada por la pérdida de la nedilación reduciría no sólo el NHEJ sino la conversión génica de tramo corto, y cambiaría el perfil de reparación hacia rutas que son favorecidas por la resección de tramo largo como el SSA (Figura D2, l). Adicionalmente, la reparación por BIR podría ocurrir independientemente de la extensión del ADN reseccionado (Figura D2, d y m). En cualquier caso, la hiper-resección favorece las rutas de recombinación mutagénicas y podría potencialmente conducir a deleciones y pérdida de heterozigosidad. En principio, esta limitación en la extensión del ADN reseccionado requerida para la conversión génica no se aplicaría en la recombinación entre cromátidas hermanas, ya que las moléculas aceptoras y donadoras son idénticas. De cualquier forma, incluso en este caso, la hiper-resección reduciría las oportunidades de que el ADN sintetizado recientemente diera alcance al extremo 5’ reseccionado para formar una HJ (Prado & Aguilera 2003). Además, aumentaría la probabilidad de que secuencias repetidas queden expuestas y puedan ser sustrato de la recombinación por SSA. Entonces, una fuerte denedilación, tal y como ocurre con la adición de MLN4924 no bloquearía completamente la conversión génica cuando la cromátida hermana es usada como molde, pero sí que facilitaría la ruta del SSA mutagénica incluso en esta situación. Por tanto, proponemos que la nedilación controla la elección de la ruta de reparación para los DSB, es decir, no sólo la decisión entre NHEJ y HR sino también la elección entre las diferentes rutas de recombinación homóloga. Acorde con resultados previos y con nuestras observaciones, proponemos que una ola de nedilación y desnedilación controla los tiempos de la resección del ADN, estableciendo una organización temporal entre los diferentes tipos de reparación (Figura D1). Discusión( ! 118! Esta relación entre nedilación y reparación de los DSB puede explicar la potente actividad anticancer mostrada por el MLN4924 en estudios preclínicos (Soucy et al. 2009). Además, considerando que la HR es defectiva en muchos tumores humanos, podríamos especular que el MLN4924 sería especialmente exitoso en el tratamientos de esos cánceres. En ellos, el MLN4924 canalizaría las roturas endógenas del ADN hacia una perjudicada HR. Entonces, pensamos que los tumores deficientes en HR serían hipersensibles a MLN4924. Por otra parte, esto no se aplicaría en aquellos cánceres cuyas células son defectuosas en los pasos de la HR que tienen lugar durante la resección del ADN. De hecho, nuestros datos sugieren que las Figura D2. La extensión de la resección determina la reparación por homología de secuencia realizada.Un corte de doble cadena que va a ser reparado por recombinación es reseccionado (a) antes de que el extremo 3’OH sobresaliente sea usado para invadir (b) una región homologa (lineas rojas) localizada en otro lugar (lineas grises). Para sintetizar el ADN (lineas discontinuas) se usará el ADN homólogo como molde (c) y se podría continuar hasta el final del cromosoma (d; BIR), el nuevo ADN sintetizado puede realinear (e; SDSA) o puede ser ligado con el ADN reseccionado para formar dos estructuras de Holliday (f; DSBR). Dependiendo de cómo estas estructuras sean resueltas, la recombinación conducirá o no a la formación de entrecruzamientos (g). De cualquier forma, la hiper-resección (a la derecha) podría conducir a la exposición de regiones de ADN de cadena sencilla muy largas (h; negro versus lineas grises). En tal escenario, aunque la invasión del ADN (i) y la síntesis de ADN (j-k) podrían ocurrir, un ADN no homólogo sería empleado como molde para la síntesis de ADN (k; líneas discontinuas grises). Entonces, el ADN síntetizado de novo no podría hacer un realineamiento más largo con el ADN aceptor (line negra sólida), bloqueando de manera efectiva el SDSA y la formación de los HJ. Si existen secuencias repetidas localizadas en las proximidades de la rotura (lineas verdes), el corte puede ser sellado usando una ruta adicional de recombinación como es el SSA (l). Otra alternativa sería que la síntesis de ADN continue hasta el final del cromosoma (m; BIR). Discusión( ! 119! células que tienen perjudicada la resección del ADN, tales como las deplecionadas con CtIP, podrían ser resistentes a tratamientos con MLN4924 (Figura R17A). Interesantemente, se ha observado una reducción en la toxicidad del MLN4924 cuando otras proteínas implicadas en la resección del ADN como BLM o BRCA1 son deplecionadas (Blank et al. 2013; Liao et al. 2011). Además, nuestros datos sugieren que en fondos deficientes en resección el MLN4924 protege a las células de la irradiación (Figura R17B). Entonces, postulamos que los tratamientos con MLN4924 en tumores con cantidades reducidas de proteínas implicadas en resección como CtIP o BRCA1 reducirían la eficacia de la radioterapia. Como se conoce que ambas proteínas están disminuidas en ciertos tumores (Narod & Foulkes 2004; Soria- Bretones et al. 2013), sería importante conocer la contribución genética de los diferentes genes de recombinación para cada tumor específicamente y así poder evaluar el efecto potencial del MLN4924 como droga anticáncer. ! CONCLUSIONES Materiales y Métodos ! 128! Línea Celular Características Resistencias Referencia U2OS Línea de osteosarcoma humano Ninguna ATCC HTB-96 293T Embrionaria de riñón humano Neomicina Kanamicina ATCC CRL-11268 U2OS-SSR1.0 Línea de U2OS que lleva integrado el sistema SSR1.0 (Balance HR/NHEJ) G-418 Kanamicina Generada en nuestro laboratorio por el Dr. Gómez- Cabello (Gomez-Cabello, Jimeno et al. 2013) U2OS-SSR2.0 Línea de U2OS que lleva integrado el sistema SSR2.0 (Balance HR/NHEJ) G-418 Kanamicina Generada en nuestro laboratorio por el Dr. Daniel Gómez-Cabello (Gomez- Cabello, Jimeno et al. 2013) U2OS-DRGFP Línea de U2OS que lleva integrado el sistema DR-GFP (Conversion Génica) Puromicina Ampicilina Cedida por Dra. María Jasin (Pierce et al. 1999) U2OS-SAGFP Línea de U2OS que lleva integrado el sistema SAGFP (Qvist, Huertas et al.) Puromicina Ampicilina Generada en nuestro laboratorio por Ana López- Saavedra a partir del plásmido hprtSAGFP (Addgene 41594) U2OS-EJ5 Línea de U2OS que lleva integrado el sistema EJ5 (NHEJ Total) Puromicina Ampicilina Generada en nuestro laboratorio por Ana López- Saavedra a partir del plásmido pimEJ5GFP (Addgene 44026) Tabla M1. Líneas celulares utilizadas en esta tesis. A las 48 horas las células se utilizaron para realizar los ensayos de correspondientes o se recogieron para su conservación en nitrógeno líquido. 1.1.1. Subcultivado Las células fueron plaqueadas en diferentes formatos de placa (6- pocillos, 24-pocillos, 96-pocillos, 6 cm, 10 cm y 15 cm) y dependiendo del ensayo, el nº del que se partía oscilaba entre 4000-250.000 indicándose en cada caso. Para cuantificar el número de células, se empleó un contador celular automático (Cell Counter Z2 de Beckman Coulter). Los pases se realizaban según las necesidades experimentales o cada dos días de crecimiento para el mantenimiento de los cultivos. Materiales y Métodos ! 129! Gen diana Descripción Comercial Referencia Scramble pLKO.1-puro shRNA sin diana conocida (Plásmido control) Sigma SHC016 CtIP (RBBP8) TRCN0000005403 Sigma NM_0022894.1-3008s1c1 DNAPKcs TRCN0000006255 Sigma NM_006904.6- 12460S1C1 Ku70 TRCN0000009846 Sigma NM_001469.X2578S1C1 Ku80 TRCN0000010467 Sigma NM_021141.X-1707S1C1 LIG4 TRCN0000009847 Sigma NM_002312.X-1633S1C1 MRE11A TRCN0000039872 Sigma NM_005591.2-598s1c1 BLM TRCN0000004906 Sigma NM_000057.1-3578s1c1 EXO1 TRCN0000010331 Sigma NM_130398.x-2736s1c1 RAD51 TRCN0000018877 Sigma NM_002875.2-1224s1c1 ATM TRCN0000010299 Sigma NM_000051.x-9530s1c1 ATR TRCN0000010300 Sigma NM_001184.x-1254s1c1 BRCA1 TRCN0000009823 Sigma NM_007294.x-7048s1c1 PIAS1 TRCN0000010853 Sigma NM_016166.x-1699s1c1 PIAS4 TRCN0000004118 Sigma NM_015897.x-467s1c1 RNF168 TRCN0000034136 Sigma NM_152617.2-757s1c1 RNF8 TRCN0000003438 Sigma NM_003958.x-1079s1c1 UBC13 TRCN0000007213 Sigma NM_003348.3-2012s1c1 UBC9 TRCN0000320374 Sigma NM_003345.3-373s21c1 HDAC1 TRCN0000004814 Sigma NM_004964.2-1717s1c1 HDAC2 TRCN0000004819 Sigma NM_001527.1-1678s1c1 PARP3 TRCN0000052983 Sigma NM_001003931.1- 2109s1c1 Tabla M2. shRNAs utilizados en esta tesis. Materiales y Métodos ! 130! Para pasar las células de una placa a otra, se empleó tripsina al 0,25% (T4049, Sigma) en una proporción 1/10 del volumen final de la placa y se neutralizó con 9/10 de volumen de medio completo. 1.1.2. Crioconservación Para la conservación de las celulas, un mínimo de 106 células/ml fueron tripsinizadas y centrifugadas a 500g durante 5 minutos a temperatura ambiente y resuspendidas en 1 ml de solución de congelación (suero fetal bovino y DMSO al 10%), se realizaron alícuotas en tubos y se depositaban en contenedores MrFrosty (C1562, Sigma). Los contenedores se guardaron a - 80ºC durante 24 horas (este sistema permite el descenso gradual de la temperatura 1ºC/minuto) lo que permitió una congelación óptima de los cultivos para su almacenamiento durante largos periodos de tiempo. Finalmente los viales se trasladaron a tanques con nitrógeno líquido para la conservación a largo plazo. Los viales de células congelados se descongelaron en un baño a 37ºC, e inmediatamente tras su descongelación se añadieron 10 ml de medio de cultivo completo para diluir el DMSO. Tras su centrifugación se pasaron a una placa con medio nuevo. 1.1.3. Cultivo en presencia de inhibidores Se realizaron una serie de ensayos en la línea U2OS con el sistema SSR2.0 para analizar una minilibrería de inhibidores en las condiciones que se reflejan en la Tabla M3. Todos los inhibidores fueron preparados en DMSO. 1.2. TRANSFECCIÓN 1.2.1. siRNAs Se procedió a silenciar diversos genes objeto de estudio para lo cual, se empleó el sistema de silenciamiento génico mediante siRNAs y el reactivo de transfección Lipofectamina RNAiMax (Invitrogen, 13778). El listado de los siRNA utilizados aparece en la Tabla M4. Materiales y Métodos ! 131! Inhibidor Diana Concentración Marca Referencia Tricostatina A (TSA) Deacetilasas de histonas I y II 1.3 mM Sigma T8552 Afidicolina ADN polimerasas A y D 1 mM Sigma A0781 MLN4924 NAE 1 mM Vitro I-502-01M Mirina Mre11 25 mM Tocris 3190 PARPi PARP 1 mM AstraZeneca Olaparib NAM PARP-1 25 mM Sigma N0636 Tabla M3. Información sobre los inhibidores que componen la minilibrería de compuestos químicos con potencial terapéutico utilizados en esta tesis. Para transfectar se emplearon diferentes volúmenes para placas de 96- pocillos, 6 cm o 10 cm de diámetro, según las necesidades experimentales. En el caso concreto de la placa de 6 cm, el día anterior a la transfección se sembraron 250.000 células en 3 ml de medio DMEM completo. Al día siguiente se procedió a cambiar el medio y se añadieron 2 ml de medio DMEM completo sin los antibióticos. Se prepararon 150 μl de Opti-MEM (Gibco, 31985-062) y 9 μl de lipofectamina. Por otro lado, se prepararon 150 μl de Opti-MEM y 9 μl de siRNA (10 μM). Se procedió a mezclar 150 μl de cada tubo para la formación de los complejos siRNA-lipofectamina y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación se mezcló una vez por pipeteo y se añadió 250 μl de la mezcla sobre la placa gota a gota, y la placa se mantuvo en agitación para conseguir una distribución homogénea y minimizar la toxicidad de la lipofectamina. Los cultivos se incubaron durante 6 horas en el incubador tras lo cual se retiró el medio de cultivo que contenía la solución de transfección y se añadió 3 ml de medio DMEM completo. Las células se recogieron a las 24 o 48 horas de la transfección. Materiales y Métodos ! 132! Gen diana Descripción Comercial Referencia Control ON-Targetplus Non-targeting pool Dharmacon D-001810-10 GFP esiRNA1 Sigma EHUEGFP RNF111-1 GCGCUUCCAUUAACAAUUC Dharmacon J-007002-07 RNF111-2 GAGUUGAGAUGAUUAAUAG Dharmacon J-007002-07 hUBE2M-1 CAGAGGUCCUGCAGAACAA Sigma (Ma et al. 2013) hUBE2M-2 GGGCUUCUACAAGAGUGGGAAGUUU Sigma (Cukras et al. 2014) CSN1 On-Targetplus Human Smartpool Dharmacon L-012272-00 CSN5 ACUGUCUUUCAGGUAAAGUACUUCUCA Sigma Yosef Shiloh NEDP1 ON-Targetplus Human SENP8 Dharmacon L-004071-00 CtIP CUL4A GCUAAAACAGGAACGAAUC On-Targetplus Human Smartpool Sigma Dharmacon (Huertas & Jackson 2009) L-012610-00 Tabla M4. siRNAs utilizados en esta tesis. 1.2.2 ADN plasmídico Los plásmidos usados en esta tesis se describen en la Tabla M5. Se utilizaron dos métodos de transfección diferentes: 1.2.2.1. Fugene Las células U2OS fueron transfectadas con los plásmidos necesarios en cada caso. Se sembraron 5x105 células en una placa de 100 mm y se incubaron 24 horas. Se realizó una mezcla de 336 μl de OptiMEM (Gibco, 11058-021) con 7,2 μg de ADN, al que posteriormente se le añadió 21 μl de Fugene HD Transfection Reagent (Promega, E2312). Se mezcló suavemente por pipeteo y se incubó durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente la mezcla se añadió gota a gota sobre el medio con las células mientras la placa era agitada suavemente para conseguir una distribución homogénea y minimizar el efecto tóxico del reactivo de transfección. Materiales y Métodos ! 133! Plásmido Características Resistencias Referencia pVSVG Expresión proteínas envuelta viral Ampicilina Cedido por el Dr. Felipe Cortés p8.91 Expresión proteínas cápsida Ampicilina Cedido por el Dr. Felipe Cortés pRRLsEF1aHA.NL S.SceOPT.T2A.Ta gBFP (pBFP- ISceI) Expresión la proteína azul fluorescente y la enzima de restricción I-SceI Ampicilina Cedido por el Dr. Andrew M. Scharenberg HA-pcDNA3.1(-) Expresión del antígeno HA Ampicilina Cedido por el Dr. Steve Jackson HA-NEDD8 Expresión del gen Nedd8 con el antígeno HA Ampicilina Addgene 18711 Tabla M5. Plásmidos utilizados en esta tesis. 1.2.2.2. Fosfato Cálcico Se sembraron 2,7x106 células de la línea 293T en placas de 100 mm veinticuatro horas antes de la transfección. Las células debían tener una confluencia del 40-50% en el momento de la transfección. El medio de cultivo se renovó 30 minutos antes de comenzar la transfección. Se preparó una mezcla con tres plásmidos (Tabla M5, el vector de interés (pBFP-ISceI), el vector con los genes de la cápsida del virus (p8.91) y el vector con los genes de la envuelta del virus (pVSVG) en un ratio 3:2:1 respectivamente y hasta tener 30 μg de ADN total. Se añadió 64 μl CaCl2 y se completó el volumen hasta 500 µl con agua milliQ. Por otro lado, se prepararon tubos de 15 ml con 500 µl de una solución 2XHBS (Tampón Hepes Salino, Sigma 51558). El resto del procedimiento se realizó en la sala de cultivos P2. Se añadió la mezcla de los plásmidos y el CaCl2 gota a gota sobre la solución 2XHBS mientras se burbujeaba. Se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. El precipitado que apareció se resuspendió con golpes suaves y se fue añadiendo a las células gota a gota mientras la placa se mantenía en agitación, así la mezcla de transfección se distribuyó de manera homogénea. Los cultivos se incubaron a 37ºC en la sala de cultivos P2 hasta el día siguiente. Se procedió a lavar las células con 10 ml de PBS y a añadir 8 ml de medio nuevo. Se incubaron a 37ºC durante 48 horas. Materiales y Métodos ! 134! 1.3. PRODUCCIÓN Y TRANSDUCCIÓN VIRAL Para introducir un corte de doble cadena en el ADN y realizar diferentes ensayos de reparación in vivo se utilizó el plásmido pRRLsEF1aHA.NLS.SceOPT.T2A.TagBFP (Tabla M4), en adelante pBFP-ISceI, que sirve para expresar la enzima de restricción I-SceI y la proteína fluorescente azul (BFP). Para ello, se produjeron partículas lentivirales que llevaban el mencionado plásmido mediante la cotransfección en células 293T con los plásmidos pVSVG (para la envuelta) y p8.91 (para la cápsida viral). Estas células tienen una alta capacidad para producir elevados títulos (nº unidades infectivas/ml) y alta transfectabilidad. Se caracterizan por tener una baja adherencia y para mejorar su eficiencia en la producción viral deben ser cultivadas como mínimo una semana antes de su uso. Los plásmidos fueron transfectados como se describe el apartado 1.2.3 (Transfección con Fosfato Cálcico). Después de incubar las células 293T durante 48 horas, se procedió a recoger los virus presentes en el medio de cultivo mediante ultracentrifugación (Avanti 301 Rotor JS 24-15). Para ello, se recogió el medio de cultivo con jeringas y se procedió a filtrarlo con filtros de PVDF de 0,45 μm. Las muestras se centrifugaron a 22.000 rpm durante 1.5 horas a 4ºC, tras lo cual se procedió a retirar el sobrenadante y a resuspender el pellet (no visible) en 500 ul de DMEM por placa de 100 mm. Se realizaron alícuotas de 50, 100, 200 y 500 μl. Se conservaron hasta su empleo a -80ºC. Se realizaron dos protocolos de transducciones diferentes según las necesidades experimentales: 1.3.1.Transducción en dos pasos Las células fueron sembradas 24 horas antes de la transducción. El día de la transducción se preparó una mezcla de medio DMEM con hexadimetrina a 8 μg/ml, en 1/3 del volumen final, y partículas lentivirales a una MOI (Multiplicity of Infection; ver titulación lentiviral 1.6.2) de 5 o 10 (según los ensayos). Es decir, se utilizaron 5 o 10 veces el número de partículas necesarias para infectar el 100% de las células utilizadas. A las 6 horas de incubación se Materiales y Métodos ! 135! completó el volumen final con medio DMEM completo. Al día siguiente se procedió a realizar un lavado con PBS y a añadir medio nuevo. 1.3.2. Transducción en un paso Las células fueron sembradas 24 horas antes de la transducción. El día de las transducción se preparó una mezcla de medio DMEM con partículas lentivirales a una MOI de 5 o 10 (según los ensayos) y hexadimetrina a 4 μg/ml, se añadió el volumen total de esta mezcla y se incubó toda la noche. Al día siguiente se procedió a realizar un lavado con PBS y a añadir medio nuevo. 1.4. ENSAYOS DE SUPERVIVENCIA CELULAR (CLONOGÉNICOS) Se realizaron dos tipos de tratamiento (agudo o crónico) para el estudio de la supervivencia celular. Para ambos, se sembraron las células U2OS que expresaban un shRNA de CtIP y células que expresaban un shRNA control (shScr) en placas de 6 pocillos a razón de 500 y 1000 células por triplicado. Al día siguiente, en el ensayo de tratamiento agudo se preincubaron durante 1 hora con MLN4924 (0.2 µM) o con DMSO antes de irradiar con 2 Gy, a continuación se incubaron durante 2 horas más en presencia del inhibidor. Posteriormente, se cambió el medio y se mantuvieron en medio normal sin inhibidores durante 12 días. En el tratamiento crónico, las células que expresaban un shRNA de CtIP o shRNA control fueron tratadas durante 12 días con 0,1 μM de MLN4924 o bien con DMSO. Tras la formación de las colonias, se procedió a su visualización mediante una tinción con cristal violeta. Para ello, se retiró el medio de cultivo, se lavó con PBS y se tiñeron las células con una solución de cristal violeta al 0,5% y etanol al 20%. Cuando las colonias se habían teñido, la solución de cristal violeta fue retirada y se realizaron varios lavados con agua destilada. Cuando las placas estuvieron secas, se contaron las colonias de los tratamientos con MLN4924 y se referenciaron a los tratamientos con DMSO (100%). Para cada ensayo se hicieron tres réplicas. Materiales y Métodos ! 136! 1.5. CITOMETRÍA DE FLUJO 1.5.1. Análisis del Ciclo Celular Se sembraron 50.000 células de U2OS en placas de 12 pocillos en medio de cultivo normal. Tras ser sometidas a los tratamientos experimentales necesarios, las células fueron recogidas por tratamiento con tripsina (Sigma, T4049). Las muestras se centrifugaron a 500g durante 5 minutos y se lavaron con PBS. Las células se resuspendieron en 200 μl de PBS frío y se fijaron añadiendo 5 ml de etanol al 70% gota a gota agitando suavemente el tubo. Se incubaron durante al menos 2 horas a 4ºC y a continuación se centrifugaron a 500g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se realizó un lavado con PBS y se resuspendieron en un volumen de 200 μl de dicho tampón. Se procedió a tratar las muestras con RNasa A a 0,2 mg/ml (Sigma, R5503) y yoduro de propidio a 1 μ/μl (P4864). Se incubaron a 37ºC durante 15-30 minutos y se conservaron en oscuridad a 4ºC hasta su análisis. Se empleó un citómetro de flujo "BS FACSCaliburTM Flow Cytometer" (BD Biosciences, 342975) y el software "Cell Quest Pro". 1.5.2. Titulación de la producción lentiviral Tras la producción lentiviral, se calculó la cantidad de virus producidos para lo cual se cultivaron 25.000 células por pocillo en placas de 12 pocillos. Al día siguiente se realizó una dilución 1/10 del stock lentiviral en medio DMEM. Se preparó medio de cultivo DMEM completo con 8 µg/ml de hexadimetrina (Sigma, H9268). Se retiró el medio anterior y se añadió 300 µl de dicha mezcla a todos los pocillos. A continuación se añadieron 0, 5, 10 y 20 µl de la dilución 1/10 del stock lentiviral. Se mezcló suavemente y se incubaron durante 6 horas, tras las cuáles se completó hasta un volumen de 1 ml con medio DMEM completo. Al día siguiente se realizó un lavado con PBS y se dejaron incubando hasta un total de 72 horas desde el día de la transducción. El análisis del número de células infectadas se cuantificó mediante citometría con el equipo FACSAria (Shaheen, Faqeih et al.). Se contaron 10.000 eventos (células) y se cuantificó cuántas expresaban la proteína fluorescente azul (BFP). Materiales y Métodos ! 137! El título (nº de unidades infectivas/ml) se calculó en base al número de partículas infectivas en el rango de 25-50% azules. 1.5.3. Análisis de proteínas fluorescentes por FACs Se sembraron 50.000 células en cada pocillo. Al día siguiente, las células fueron infectadas con partículas lentivirales que contenían el plásmido pBFP- ISceI el cual expresaba la proteína azul fluorescente y la enzima de restricción I- SceI (BFP-ISceI). La infección se realizó a una MOI 5 y hexadimetrina a 8 μg/ml tal como se describe en los apartados 1.3.1 y 1.3.2. Para los experimentos con los diferentes inhibidores se empleó como control el DMSO que fue el vehículo de los mismos. En los ensayos con los diferentes shRNAs, el control fue un shRNA sin diana conocida (scramble). Después de 16-18 horas de la infección, las células fueron lavadas con PBS, tripsinizadas, neutralizadas con medio DMEM completo y centrifugadas en tubos para citometría a 500g. Se realizó un lavado con PBS y se fijaron con paraformaldehido al 4% durante 20 minutos a 4ºC. Las muestras se centrifugaron, se realizaron dos lavados con PBS y finalmente, se resuspendieron en 100-200 µl de PBS para su análisis mediante citometría en un equipo BD FACSAria. Los datos fueron recogidos y análizados mediante el software FACSDiva v5.0.3. Se consideraron cinco parámetros, side scatter (SSC), forward scatter (FSC), la fluorescencia azul (láser BP 407 nm y filtro 450/40), la fluorescencia verde (láser BP 488 nm y filtro 530/30) y la fluorescencia roja (láser BP 488 nm y filtro 575/26). Se contabilizaron 10.000 eventos azules (células que expresaban la proteína BFP) y se cuantificó el número de células fluorescentes verdes y rojas del total de células positivas para la fluorescencia azul. Se realizaron duplicados de cada condición experimental y se realizaron triplicados de cada experimento. 1.6. ENSAYOS DE REPARACIÓN IN VIVO Se emplearon varios sistemas con construcciones genéticas diferentes para tratar de identificar el tipo de mecanismo de reparación implicado según la condición experimental. Los sistemas SSR1.0 y SSR2.0 fueron utilizados con diferentes inhibidores y también realizando silenciamientos génicos para su Materiales y Métodos ! 144! concentración del ADN en solución fue estimada por el espectrofotómetro ND-1000 (Nanodrop) según la absorbancia a 260 nm. 2.1.2. Electroforesis de ADN en geles de agarosa La electroforesis del ADN se realizó en geles de agarosa al 0,8% en tampón TAE 1X teñido con RedSafe (21141, Intron Biotechnology). A las muestras se les añadió tampón de carga (10X Loading buffer, Takara). La imagen fue visualizada mediante el software Quantity One (Bio-Rad). 2.1.3. Digestión del ADN con enzimas de restricción Para la digestión de fragmentos de ADN se usaron endonucleasas de restricción de la empresa Takara siguiendo las instrucciones del fabricante. Las digestiones se emplearon para comprobar por análisis de los fragmentos de restricción los plásmidos que aparecen en la Tabla M5. En concreto, para comprobar el plásmido BFP-ISceI, se diseñó una digestión con la enzima PvuII que daba como resultado cinco fragmentos de ADN de 2574, 2518, 1576, 776 y 477 pares de bases. 2.2. ANÁLISIS DEL ARN 2.3.1. Extracción de ARN Las células cultivadas en placas fueron lavadas con PBS y tripsinizadas. Posteriormente centrifugadas a 500g durante 5 min. El pellet fue congelado a - 80ºC o directamente se procedió a la extracción mediante el kit RNeasy mini kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.3.2. Cuantificación de ARN total La concentración del ARN en solución fue estimada por el espectrofotómetro ND-100 (Nanodrop) según la absorbancia a 260 nm. Para visualizar la calidad del ARN, se realizaron geles de agarosa al 0,8% en tampón Materiales y Métodos ! 145! TAE1X teñidos con RedSafe y se sometieron a un campo eléctrico constante de 5 V/cm de longitud del gel. 2.3.3. Síntesis de cDNA Para la obtención del cDNA a partir del ARN se utilizó el kit Quantitec Reverse Transcription Kit (Qiagen) y el sistema Super-Script TM First strand (Invitrogen) siguiendo en ambos casos las instrucciones del fabricante. 2.3.4. PCR Cuantitativa Para comparar el nivel de expresión de diversos ARN mensajeros, se realizaron PCRs cuantitativas en un equipo ABI 7500FAST. Se utilizó como reactivo para la PCR el iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 172- 5124) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos para amplificar los diferentes cDNAs se encuentran en la Tabla M6. Los valores Ct medios de cada triplicado en cada condición se normalizaron con respecto a la expresión del gen de la β-actina como control endógeno. El valor relativo para el ΔΔCt se calculó en base al control endógeno y las condiciones de expresión de los diferentes shRNAs respecto al shRNA control. 2.3. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS 2.3.1. Extracción de proteínas en condiciones desnaturalizantes Para la realización de la técnica se obtuvieron los extractos de proteínas a partir de células cultivadas en placas de 6, 10 o 15 cm usando el tampón de lisis Laemmli 2X (4% SDS, 20% glicerol, 125 mM Tris-HCl pH 6.8) sobre las placas a las que previamente se les había realizado dos lavados con PBS frío. Los extractos fueron recogidos mediante rascadores y, para romper la cromatina, fueron pasados al menos 10 veces por unas jeringas con aguja de 0,5x16 mm (BD Platipak). Materiales y Métodos ! 146! Nombre Oligonucleótido Secuencia (5´-3´) Fw DNA-PKcs CCGGACGGACCTACTACGACT Rv DNA-PK AGAACGACCTGGGCATCCT Fw Ku70 CCTTTTGACATGAGCATCCA Rw Ku70 ATACCGTGGCTCTTTCTGTT Fw Ku80 CCTTTTGACATGAGCATCCA Rw Ku80 AGCATGGTGGACATCTGCTTT Fw LIG4 GCTGTGCTCTTCATCTAGACCCA Rw LIG4 CTCGTTTAACTAGCTGGCCTCGG human_CtIP_Q-PCR.Forward AGAAATTGGCTTCCTGCTCAAG human_CtIP_Q-PCR.Reverse GAAAACCAACTTCCCAAAAATTCTC Fw MRE11A CGAAAGGGGTTGATTTTGAA Rv MRE11A CTTGCATGTTTCTCAGTGCC Rv BLM TGTTCTGGCTGAGTGACGTT Fw BLM AGTTTGGATCCTGGTTCCGT Rv Exo1 AGGCTGGATGCTCACTTTGT Fw Exo1 AGTGGTGCAGTTGTGGTTCC Rv Rad51 TATCCAGGACATCACTGCCA Fw Rad51 GGTGAAGGAAAGGCCATGTA Rv ATM TTCAAAGGATTCATGGTCCAG Fw ATM GCTGTGAGAAAACCATGGAA Rv ATR AACATTCGTGGCATTGACTG Fw ATR CCCATGGTCACAGACAACAA Rv BRCA1 TGTGAAGGCCCTTTCTTCTG Fw BRCA1 TCCCATCTGTCTGGAGTTGA Rv RNF168 CCCCAGGTTTACTGAGCAGA Fw RNF168 AACACTATCCCAGGGAGTGC Rv RNF8 CTCGCACTACCTGGCAGTCT Fw RNF8 TCAGAAGTGAAAGAACGACGAA Rv UBC13 CTCTCATCTGGTTCGGCTTT Fw UBC13 CTCGGGTTCTGACAAGATGG Rv Pias1 CGCTGACTGTTGTCTGATGC Fw Pias1 CAGCTCTTCACCCAGTCCAT Rv Pias4 AAGCTTCTCGTTGTTCTGTGG Fw Pias4 CAAGACCCTCAAGCCAGAAG Rv UBC9 AAGGGTACACATTCGGGTGA Fw UBC9 GTGGGAAGGAGGCTTGTTTA Fw ActB ACGAGGCCCAGAGCAAGA RV ActB GACGATGCCGTGCTCGAT Tabla M6. Oligonucleótidos utilizados en esta tesis.! Materiales y Métodos ! 147! 2.3.2. Extracción de proteínas en condiciones nativas Las proteínas extraídas en condiciones nativas, se utilizaron en los protocolos de inmunoprecipitación de proteínas. Se preparó un tampón de lisis (50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 7.5 y 0,2% Tritón) con inhibidores de proteasa (11873580001,Roche), inhibidores de fosfatasas (P0044, Sigma) e inhibidor de proteasas de sumo N-Ethylmaleimide (NEM) a 3,125 mg/ml (34115, Calbiochem). Las células fueron recogidas desde una placa de 15 cm de diámetro al 50-70% de confluencia para impedir que estuvieran en G0. Se realizaron dos lavados de PBS frío y se retiró asegurándose de eliminar el mayor volúmen de lavado y evitar la dilución del extracto. Se añadieron 150 μl de tampón de lisis con los inhibidores y las células se levantaron de la placa mediante rascadores. El extracto se pasó 10 veces por una jeringa con aguja de 0,5x16 mm (BD Platipak). Se centrifugó durante 5 minutos a 13.000 rpm a 4ºC y se recogió el sobrenadante. 2.3.3. Cuantificación de proteínas mediante Nanodrop La cuantificación de las proteínas se realizó con 1 μl de muestra mediante el espectrofotómetro ND-100 (Nanodrop), el cual daba el resultado de cuantificación en μg/μl directamente. 2.3.4. Cuantificación de proteínas mediante la técnica de Bradford Se partió de una solución de BSA (albúmina serobovina) a 1 mg/ml con la que se prepararon muestras con 0, 1, 2, 5, 10 y 20 μg de BSA en 100 μl de agua destilada y se añadieron 900 μl del reactivo Bradford (B6916, Sigma). De igual forma, se prepararon muestras con 3 μl de los extractos a cuantificar. La medición de la densidad óptica se llevó a cabo a una longitud de onda de 595 nm en un espectrofotómetro DU 800 (Beckman Coulter). Con las muestras de cantidad conocida de BSA se realizó una recta de regresión para obtener una curva patrón que se utilizó para calcular la concentración de proteína en μg/ μl de cada extracto. Materiales y Métodos ! 148! 2.3.6. Electroforesis de proteínas en SDS-PAGE Para separar las proteínas por tamaño se utilizó el método de geles de SDS-poliacrilamida desarrollado por Laemmli. Los geles se prepararon con una solución de acrilamida:bisacrilamida (29:1) a diferentes porcentajes según el tamaño de las proteínas a analizar. La zona de empaquetamiento se preparó con el tampón Tris-Hcl 125 mM pH 6.8, 0.1% SDS y la zona de separación en tampón Tris-HCl 375 mM pH 8.8, 0.1% SDS. Para desencadenar la polimerización se añadió APS a una concentración final de 0,1% y 0,04% (v/v) de TEMED. Las muestras se prepararon con tampón de carga 4X y en cada gel se cargaron 50-70 μg de proteína total, previamente hervidos a 100ºC durante 5 minutos. Los geles se corrieron en un tampón 25 mM Tris-HCl pH 8,3; 194 mM glicina; 0,1% SDS, a un voltaje constante de 200V en un sistema Mini- Protean TetraCell (Bio-Rad). 2.3.7. Transferencia de proteínas a membranas de PVDF Las proteínas separadas en geles de SDS-poliacrilamida se transfirieron a una membrana de PVDF de baja fluorescencia (Immobilon-FL, IPFL00010) previamente activada con metanol durante 5 minutos y equilibrada en tampón de transferencia (25 mM Tris-HCl pH 8,3; 194 mM glicina; 0,1% SDS; 20% metanol) al menos 5 minutos. Se utilizó el sistema Mini Trans-Blot de Bio-Rad. La transferencia se realizó a 400 mA durante 1 hora a 4ºC o bien, a 30 V durante toda la noche. 2.3.8. Inmunodetección de proteínas (Western blot) La inmunodetección de proteínas se realizó utilizando el sistema Odyssey de Li-Cor para lo cual la membrana de PVDF se incubó con una solución de bloqueo comercial (Solución de Bloqueo para Odyssey, 927- 40003) durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. Los anticuerpos primarios (Tabla M7) se prepararon en la solución de bloqueo con 0,1% de Tween y se incubaron a 4ºC en agitación toda la noche. (Cruz-Garcia, Lopez- Saavedra et al. 2014). Materiales y Métodos ! 149! Posteriormente, se realizaron 3 lavados de 5 minutos con TBS-Tween 0,1% y la membrana se incubó con los anticuerpos secundarios (Tabla M8) diluidos en solución de bloqueo durante 40 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados de 5 minutos con TBS-Tween 0,1%. Finalmente, las membranas se escanearon en un equipo ODYSSEY CLx (Li-Cor) a dos longitudes de onda del infrarrojo (700 y 800 nm). El tratamiento y las cuantificación de imágenes se realizó con el software Image Studio v.2.1, siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.3.9. Inmunoprecipitación (IP) de proteínas Las células U2OS se sembraron en una placa de 10 cm al 10-15% de confluencia para cada condición experimental. Al día siguiente, se realizó la transfección de diversos siRNAs (apartado 1.2.2) o bien, se trataron con 0,2 μM de MLN4924 o DMSO durante 1 h. Según las necesidades experimentales, pasadas 24 horas, las células fueron recogidas y sembradas en una placa de 15 cm para evitar la confluencia de las células en el momento de la realización de los extractos de proteínas para la IP. En los experimentos en los que las células eran irradiadas con 10 Gy, la irradiación se efectúo a 0, 30 y 60 minutos antes de la realización de los extractos de proteínas. Se retiró el medio de cultivo y se realizó un lavado con PBS frío antes de recoger las células y extraer las proteínas. La extracción de proteínas en estado nativo se realizó como se describe en el apartado 2.3.3. La cuantificación de la concentración de proteínas de los diferentes extractos se realizó como se describe en el apartado 2.3.4. Para las IPs, se utilizaron bolitas magnéticas Dynabead Protein A (70 µl por ensayo;, Novex for Life Technologies) previamente pre-equilibradas en 1 ml de tampón de lisis. Se incubaron en rotación durante 5 minutos a 4ºC, tras lo cual se eliminó el sobrenadante mediante el uso de un rack magnético. Posteriormente, se realizaron dos lavados con 1 ml de tampón de lisis y tras el último lavado, se resuspendieron en 70 µl por muestra de tampón de lisis con inhibidores. Se prepararon los extractos con 1 mg de proteína total a los que se añadieron 20 μl de bolitas equilibradas. Se incubaron en rotación durante 1 Materiales y Métodos ! 150! hora a 4ºC para eliminar as proteínas que interaccionaban de manera inespecífica con las bolitas (pre-clarado). Se recuperó el sobrenadante mediante el gradilla magnética, y se le añadió 10 µl de una mezcla 1:1 de dos anticuerpos anti-Brca1, 10 µl de un anticuerpo anti-Nedd8 o, como control para las interacciones inespecíficas, 1 µg de IgG (ratón y/o conejo según el caso; Tabla M7). Proteína diana Aplicación Fuente Referencia Dilución NEDD8 IP, WB GeneTex GTX61205 10 μl, 1:500 RNF111 WB Abnova H00054778-M05 1:5000 BRCA1 IP Santa Cruz sc-642 5 μl BRCA1 IP, WB Santa Cruz sc-6954 5 μl, 1:500 HSP70 WB Santa Cruz sc-24 1:10.000 Tubulina WB Sigma T9026 1:25.000 RPA32 IF Abcam ab2175 1:500 RIF1 IF Bethyl Laboratories A300-568A 1:100 Non related Rabbit IgG IP Sigma I8140 1 μg Non related Mouse IgG IP Sigma I8765 1 μg CtIP WB Grupo de Invest. R. Baer 1:5000 CSN1 WB Bethyl Laboratories A300-26A 1:1000 CSN5 WB Bethyl Laboratories A300-014A 1:5000 UBE2M WB Bostom Biochem A-655 1:500 CUL4A WB Grupo de Invest. Thimo Kurz 1:3500 Table 7. Anticuerpos primarios utilizados en esta tesis. IF, inmunofluorescencia. WB Western blotting. IP, Inmunoprecipitación Las muestras se incubaron en rotación durante 30 minutos a 4ºC. Se añadieron 50 μl de bolitas preequilibradas y se incubaron durante toda la noche a 4ºC en Materiales y Métodos ! 151! rotación. Al día siguiente se realizaron 3 lavados con 1 ml tampón de lisis con inhibidores durante 5 minutos a 4ºC con la ayuda de un gradilla magnética. Finalmente las bolitas se resuspendieron en 30 μl de tampón de carga 4X (250 mM Tris-HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% glicerol, 20% β-mercaptoetanol, 0,008% azul de bromofenol) y se hirvieron durante 5 minutos a 100ºC. 50 μg de los extractos de proteínas iniciales (input) y el total de los extractos resultantes de la IP fueron sometidos a electroforesis e inmunodetección como se describen en los apartados 2.3.5 y 2.3.7, respectivamente. Anticuerpos Fuente Aplicación Dilución Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón Invitrogen IF 1:1000 Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo Invitrogen IF 1:1000 Alexa Fluor 647 cabra anti-ratón IgG Invitrogen IF 1:1000 Alexa Fluor 568 cabra anti-conejo Invitrogen IF 1:1000 IR-Dye 680 RD cabra anti-ratón IgG (H+L) Li-Cor WB 1:5000-1:20.000 IR-Dye 800CW cabra anti-conejo IgG (H+L) Li-Cor WB 1:5000 IR-Dye 800CW burro anti-cabra IgG (H+L) Li-Cor WB 1:5000-1:20.000 Tabla M8. Anticuerpos Secundarios usados en esta tesis. IF, Inmunofluorescencia, WB Western blotting. 3. TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA 3.1. INMUNOFLUORESCENCIA PARA FOCOS DE RPA Y γH2AX Para detectar los focos de RPA y γH2AX, se sembraron 200.000 células de U2OS en placas de 6 cm de diámetro en las que previamente se habían Materiales y Métodos ! 152! depositado varias lamelas. El número de células sembradas se estimó para que al irradiar el cultivo no se encontrara confluente. Si procedía, al día siguiente, se transfectaron las células como se describe en el apartado 1.2.2. Se incubaron 24 horas. Se realizó el tratamiento con radiación ionizante con una dosis de 10 Gy (ver apartado 1.7) y tras una hora de incubación, se realizaron dos lavados con PBS frío. Cuando el experimento lo requirió, 1 hora antes de la irradiación las células se trataron con MLN4924 o DMSO. Para la detección de los focos fue necesario realizar un tratamiento de pre-extracción para eliminar la fracción de proteína no unida a cromatina. Las lamelas fueron cubiertas con 500 µl de Tampón de pre-Extración (25 mM Tris- HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 3 mM MgCl2, 300 mM sacarosa, 0,2% Tritón X-100) y se incubaron durante 5 minutos en hielo. Se realizó un lavado con PBS frío, se añadió PFA al 4%, para fijar las células y se incubó durante 15-20 minutos en frío. Se realizaron tres lavados con PBS. Se añadieron 500 µl de una Solución de Bloqueo (5% suero fetal bovino y PBS) y se incubaron durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadió entre 20-30 µl por lamela de los anticuerpos primarios preparados en solución de bloqueo, anti-RPA (1:500) y anti γH2AX (1:500). La incubación con los anticuerpos primarios se realizó en cámara húmeda con las lamelas hacia abajo en una superficie recubierta por parafilm y se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Posteriormente, las lamelas se ubicaron en una placa de 24 pocillos con las células hacia arriba y se realizaron tres lavados con PBS frío. Los anticuerpos secundarios, anti-ratón Alexa Fluor 594 (1:1000) para RPA y anti-conejo Alexa Fluor 488 (1:1000) para γH2AX, se prepararon en solución de bloqueo y se incubaron también en cámara húmeda durante 1 hora en oscuridad a temperatura ambiente. Para terminar, se realizaron 3 lavados con PBS frío, un lavado con etanol 50%, un lavado con etanol 70% y un lavado con etanol 100% para deshidratar la muestra progresivamente. El montaje de las muestra se realizó con 4 µl por lamela de una solución de Vectashield con Dapi (H-1200, Vector Laboratories) sobre portaobjetos. Se retiró el exceso de solución de montaje y se sellaron los bordes de los cristales con esmalte de uñas. Las muestras se conservaron en oscuridad a 4ºC hasta su observación. Para visualizar las señales de fluorescencia de los focos de γH2AX y RPA se utilizó un microscopio de fluorescencia Leica DM6000, con un objetivo Materiales y Métodos ! 153! HCX PL APO 63x/1.4 húmedo. Las imágenes se obtuvieron y procesaron con el software LASAF. 3.2. INMUNOFLUORESCENCIA PARA FOCOS DE RIF1 Para detectar los focos de RIF1, las células se prepararon como se describe en el apartado anterior. Después de una hora de incubación tras la irradiación, se realizó un lavado con PBS a temperatura ambiente. Se retiraron las lamelas de las placas de cultivo y se pasaron a una placa de 12 pocillos. El resto del cultivo fue recogido y se realizó una extracción de proteínas como se describe en el apartado 2.3.1. Se realizó un lavado de las lamelas con PBS y las células se fijaron con PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se realizaron 2-3 lavados con PBS y se añadió una solución de Tritón X-100 al 0,25% en PBS para permeabilizar las células. Se incubaron en la solución de permeabilización durante 15 minutos a temperatura ambiente, se realizaron 2-3 lavados con PBS. Se añadió una solución de bloqueo (5% suero fetal bovino en PBS) y se incubó durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4ºC. Las incubaciones con los anticuerpos primario anti-RIF1 (1:100), anticuerpo secundario anti-cabra Alexa Fluor 594 (1:1000) y el montaje de los cristales en portaobjetos para su visualización al microscopio, se realizaron como se ha descrito previamente en el apartado 3.1. para las inmunofluorescencias de RPA y γH2AX, (ver Tablas 7 y 8). Para la visualización de las imágenes, se utilizó un microscopio de fluorescencia Leica DM6000, con un objetivo HCX PL APO 63x/1.4 húmedo. Las imágenes se obtuvieron y procesaron con el software LASAF. La cuantificación de los focos de RIF1 se realizó mediante el software Metamorph utilizando el módulo Granularity. Se estableció una máscara para cuantificar los núcleos exclusivamente y se fijaron los valores para los parámetros min with, max with y Intesity above local background.