Estudio de mecanismos de resistencia “Non-Target-Site” en biotipos de "Papaver rhoeas" L. con resistencia múltiple

149 ESTUDIO DE MECANISMOS DE RESISTENCIA “NONTARGET-SITE” EN BIOTIPOS DE PAPAVER RHOEAS L. CON RESISTENCIA MÚLTIPLE Rey-Caballero J.1*, Menéndez J.2, Salas M.3, Torra J.1 1Malherbología y Ecología Vegetal, Dpto. HBJ, Agrotecnio, Universitat de Lleida, Avda. Rovira Roure 191, 25198 Lleida, España. 2Dpto. de Ciencias Agroforestales, Escuela Politécnica Superior Campus de la Rábida. Ctra. Huelva-Palos de la Frontera s/n, 21071 Palos de La Frontera, Huelva, España. 3DuPont de Nemours France SAS, 24 rue de Moulin, 68740 Nambsheim, France. * [email protected] 5HVXPHQ Hasta el momento en España no se han desarrollado es- WXGLRVD¿QGHHYDOXDUORVPHFDQLVPRVGHUHVLVWHQFLD³Non-Target-Site” en Papaver rhoeas. Tras constatar la resistencia múltiple de los biotipos empleados en este ensayo, los resultados de absorción y translocación obtenidos para 2,4-D y tribenuron-metil parecen arrojar conclusiones interesantes. Sobre todo, en el caso de la auxina sintética, donde una destacada menor translocación detectada en biotipos resistentes respecto a los sensibles está en sintonía con las más recientes teorías de mecanismos de resistencia a herbicidas hormonales. 3DODEUDVFODYHAmapola, 2,4-D, tribenuron-metil, absorción y translocación. 6XPPDU\ Non-Target-Site resistance mechanisms of Papaver rhoeas L. biotypes with multiple resistance. So far in Spain studies to evaluate the mechanisms of resistance “Non-Target-Site” on Papaver rhoeasKDYHQRWEHHQGRQH$IWHU¿QGLQJPXOWLSOHUHVLVWDQFHLQWKHELR- types used in this trial, absorption and translocation results obtained for 'DQGWULEHQXURQPHWK\OVHHPWRWKURZLQWHUHVWLQJ¿QGLQJV0DLQO\LQ the case of the synthetic auxin, where a lack of translocation was detected in resistant biotypes compared to the sensitive one. This could be related with the latest theories of mechanisms of resistance to synthetic auxin. .H\ZRUGV Corn poppy, 2,4-D, tribenuron-methyl, absorption and translocation. Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural 150 INTRODUCCIÓN Como consecuencia del monocultivo de cereal y de una sistemática aplicación de herbicidas para el control de amapola (Papaver rhoeas), se han terminado seleccionando biotipos de esta especie resistentes a herbicidas. En España, en 1992 se detectaron los primeros problemas de control de P. rhoeas con 2,4-D, una auxina sintética (Taberner et al., 1992), y en 1998 la presencia de biotipos con resistencia múltiple a 2,4-D y tribenurón-me- til, inhibidor de la acetolactato sintasa (ALS) (Claude et al., 1998). Pero esta especie no es solo un problema en nuestro país. Biotipos con resistencia a inhibidores de la ALS también han sido citados en Francia, Reino Unido, Alemania, Grecia, Bélgica y Polonia, mientras que poblaciones de P. rhoeas con resistencia múltiple (2,4-D y tribenuron-metil) también han sido detectadas en Italia (Heap, 2015). La resistencia de esta mala hierba a tribenuron-metil ha sido estudiada profundamente y son diversos los trabajos que han encontrado diferentes tipos de mutaciones en la posición Pro197 de la enzima ALS (Kaloumenos et al., 2009; Délye et al., 2011). Las diversas substituciones que se producen en esta posición del gen que co- GL¿FDGLFKDSURWHtQD$UJ197, His 197, Leu 197,Ser 197 y Thr 197) otorgan una resistencia fuerte a las sulfonilureas y resistencias intermedias a imidazolinonas y triazolopirimidinas (Délye et al., 2011). Por el contrario, hasta el PRPHQWRQRHVWiQGHOWRGRFODURVORVPHFDQLVPRVTXHFRQ¿HUHQUHVLV- tencia al 2,4-D en esta especie. En el presente trabajo (1) se caracteriza la resistencia a tribenuron-metil y 2,4-D de algunos biotipos de P. rhoeas donde se sospecha dicha resistencia, así como (2) se estudian los mecanismos de resistencia “Non-Target-Si- te” (NTS) de absorción y translocación a tribenuron-metil y 2,4-D en estos mismos biotipos. MATERIAL Y MÉTODOS Material vegetal Se recolectaron las semillas de tres poblaciones de amapola (F- 0213, B-0313 y S-0114) que sobrevivieron a la aplicación de diferentes inhibidores de la ALS o mezclas de estos con auxinas sintéticas 'ÀRUDVXODP7RGRVHVWRVELRWLSRVSURFHGHQGH¿QFDVFR- merciales de cereal localizados en Noreste de España. Junto a estos biotipos, también se empleó un estándar sensible de Herbiseed (HR- S13). Las semillas de estos biotipos se colocaron en placas Petri (1.4% agar complementado con 0.2% KNO3 y 0.02% GA3) y éstas a su vez en cámaras de germinación (20/10ºC y fotoperiodo 16/8 h). Catorce días más tarde las plántulas fueron trasplantadas a macetas de 7x7x7 cm que contenían una mezcla de turba (40%), arena (30%) y perlita XV Congreso de la Sociedad Española de Malherbología. Sevilla 2015 151 'LFKDVPDFHWDVVHFRORFDURQHQXQLQYHUQDGHURHQ/OHLGD ¶1¶2\VHUHJDURQSHULyGLFDPHQWH Caracterización de la resistencia Inicialmente se trasplantaron cinco plántulas en cada una de las macetas y posteriormente se redujo a un total de tres plantas por maceta. Cuando alcanzaron la fenología de seis-ocho hojas (5-6 centímetros) se aplicaron con tribenuron-metil y 2,4-D. En los biotipos donde se sospechaba la resistencia el tribenuron-metil (Granstar 50 SX, Du- Pont, 50%) se aplicó a: 1200, 600, 150, 75, 37.5, 18.7, 9.3, 4.6 y 0 g i.a.·haíy el 2,4-D (Esteron 60, Dow AgroSciences, 60%) a: 4800, 1200, 600, 300, 150, 75 y 0 g i.a.·ha í . En el estándar sensible sin embargo, el Granstar 50 SX se aplicó a: 18.7, 9.3, 4.6, 2.3, 1.1, 0.5, 0.25 y 0 g i.a.·haí y el Esteron 60 a: 600, 300, 150, 75, 37.5, 18.7, 9.3 y 0 g i.a.·haí. Se emplearon un total de cuatro repeticiones para cada una de las dosis. Cuatro semanas después de la aplicación se evaluó el peso fresco y seco (48 h a 65ºC) de cada una de las macetas. Los datos de este experimento fueron analizados con modelos de regresiones no lineales. La dosis de herbicida que causa el 50% de la reducción del peso seco (RD50) se calculó gracias a la curva Log-logistic de cuatro parámetros. A partir de la RD50 se calcularon los factores de resistencia (FR) para cada uno de los biotipos y productos. Absorción y translocación Para los experimentos de absorción-translocación se empleó 2,4-D y tribenurón-metil marcados con 14C. Cada uno de estos productos se mezcló con su correspondiente homólogo comercial a la dosis de registro. Se desarrollaron dos experimentos independientes (uno para cada producto). Cada una de las repeticiones recibió cuatro gotas (2L) de la mezcla de herbicida marcado y herbicida comercial a la dosis de registro (18.7 y 600 g i.a.·ha í para el tribenuron-metil y 2,4-D res - pectivamente). En caso del 2,4-D cada una de las muestra recibió una radioactividad de 500 Bq mientras que en el tribenurion-metil cada planta recibió 166,5 Bq. La absorción y translocación de estos productos fue evaluada en cinco tiempos diferentes 0, 12, 24, 48 y 96 horas después de la aplicación. Para cada tiempo y biotipo se emplearon 5 repeticiones (una planta por repetición). Posteriormente se calculó el porcentaje de radioactividad absorbida respecto al total de radioactividad aplicada y la partición de la radiactividad translocada en: hoja tratada (HT), resto de la parte aérea de la planta (PA) y en la raíz (R). Para cada tiempo y producto los datos se sometieron a un análisis de Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural 152 varianza (ANOVA) y las medias de cada uno de los biotipos empleados se separaron empleando el test de Tukey (P RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los tres biotipos de P. rhoeas ensayados resultaros ser resistentes a tribenuron-metil y 2,4-D. Los FR para tribenuron-metil fueron de 778, 393 y 320 (biotipos B-0313, S-0313 y F-0213, respectivamente) (Tabla 1). Algunas de las plantas empleadas en este ensayo toleraron 64 veces la dosis de tribenuron-metil empleada en campo. Los FR obtenidos por Kaloumenos et al. (2009) en amapola resistente a tribenuron-metil oscilaron entre 137 y 2400. La población más resistente a 2,4-D obtuvo un FR de 18 (B-0313) mientras que los otros dos biotipos (S-0313 y F-0213) alcanzaron FR de 13 y 12 (Tabla 1). En todos estos biotipos la dosis de 2,4-D que causo en 100% de mortalidad fue 4800 g i.a.ha-1. Tabla 1. Factores de resistencia para tribenuron-metil y 2,4-D de los biotipos de P. rhoeas F-0213, B-0313 y S-0114. Biotipo Factor de resistencia (RD 50 R / RD 50 HR-S13) Tribenuron-metil 2,4-D F-0213 320 12 B-0313 778 18 S-0114 393 13 1RVHGHWHFWDURQGLIHUHQFLDVVLJQL¿FDWLYDVHQODDEVRUFLyQGHOWULEHQX- ron-metil marcado entre las plantas R y S. Los valores de penetración de este producto fueron inferiores a los detectados para el 2,4-D, alcanzándose valores que oscilaron entre el 21 y el 40%. La translocación de este producto hasta las raíces fue mínima en todos los biotipos ensayados. Las diferencias en la translocación, únicamente se detectaron 96 horas después de la aplicación en la parte aérea. Los biotipos resistentes translocaron más tribenuron-metil a la parte aérea respecto al biotipo sensible (Tabla 2). En los ensayos con 2,4-D marcado tampoco se detectaron diferencias en el patrón de absorción entre plantas R y S. Toda la absorción parece producirse en las 12 primeras horas después de la aplicación, ya que los valores establecidos entre el primer y el último tiempo de valoración (12 y 96 h.) son muy parecidos (oscilando del 62 al 78%). Las diferencias en este producto aparecieron cuando se estudió la translocación. El biotipo sensible translocó mucho más [14C]-2,4-D a la parte aérea y raíces. A las 12, 24, 48 y 96 h. los biotipos resistentes en promedio XV Congreso de la Sociedad Española de Malherbología. Sevilla 2015 153 translocaron un 76, 72, 80 y 85% menos de 2,4-D marcado a la parte aérea que el biotipo sensible (Tabla 3). Otros trabajos parecidos también detectaron resultados de la misma naturaleza en Lactuca serriola L. para el 2,4-D (Riar et al., 2011). Tabla 2. Absorción (% radioactividad recuperada) y translocación (% de la radioactividad absorbida) del 14C-tribenuron-metil en los biotipos de P. rhoeas HR-S13, F-0213, B-0313 y S-0114. Biotipo 12 h 24 h 48 h 96 h Absorción HR-S13 34.1 ± *5.7 †ab 36.1 ± 3.7 ab 36.12 ± 5.7 a 30.59 ± 6.7 a F-0213 43.7 ± 6.2 a 25.3 ± 3.5 b 29.47 ± 3.6 a 32.77 ± 5.6 a B-0313 24.3 ± 3.1 ab 31.0 ± 3.1 ab 28.34 ± 3.4 a 31.31 ± 3.6 a S-0114 21.4 ± 3.0 b 40.0 ± 1.2 a 32.37 ± 4.4 a 32.77 ± 5.3 a Radioactividad medida en hoja tratada (HT) HR-S13 83.3 ± 2.5 a 69.8 ± 7.1 a 72.2 ±6.6 a 70.9 ± 5.2 a F-0213 80.7 ± 7.9 a 71.7 ± 6.7 a 54.0 ±3.2 a 49.3 ± 1.1 b B-0313 64.5 ± 7.9 a 68.6 ± 10.1 a 60.1 ±3.5 a 27.6 ± 1.9 c S-0114 78.1 ± 2.5 a 65.7 ± 1.1 a 56.4 ±1.8 a 47.4 ± 6.5 b Radioactividad medida en el resto de la parte aérea (PA) HR-S13 13.6 ± 2.5 a 28.9 ± 7.8 a 25.2 ± 6.4 a 25.6 ± 4.4 c F-0213 16.1 ± 1.5 a 24.8 ± 6.3 a 42.7 ± 3.2 a 46.8 ± 0.9 b B-0313 31.2 ± 7.2 a 28.6 ± 10.2 a 36.1 ± 3.9 a 68.9 ± 2.1 a S-0114 17.4 ± 3.4 a 30.4 ± 1.3 a 40.1 ± 2.3 a 49.1 ± 6.8 b Radioactividad medida en raíz (R) HR-S13 3.1 ± 0.4 a 2.44 ± 0.5 a 2.4 ± 0.3 a 3,4 ± 0.7 a F-0213 3.2 ± 0.4 a 3.37 ± 0.6 a 3.2 ± 0.2 a 3,7 ± 0.3 a B-0313 4.2 ± 0.8 a 2.71 ± 0.2 a 3.8 ± 0.4 a 3,4 ± 0.4 a S-0114 4.3 ± 1.2 a 3.82 ± 0.6 a 3.4 ± 0.5 a 3,4 ± 0.7 a * Error estándar de la media. † /HWUDVGLIHUHQWHVHVWDEOHFHQGLIHUHQFLDVVLJQL¿FDWLYDVHQWUHELRWLSRVHQODHOSRUFHQWDMHGHUDGLRDF- tividad absorbida y translocada para cada uno de los tiempos evaluados mediante el Test de Tukey 3 Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural 154 Tabla 3. Absorción (% radioactividad recuperada) y translocación (% de la radioactividad absorbida) del 14C-2,4-D en los biotipos de P. rhoeas HR-S13, F-0213, B-0313 y S-0114. Biotipo 12 h 24 h 48 h 96 h Absorción HR-S13 70.9 ± *3.3 †a 78.1 ± 5.7 a 62.7 ± 5.6 65.8 ± 5.5 a F-0213 65.8 ± 9.1 a 78.2 ± 8.7 a 70.5 ± 7.4 76.9 ± 7.8 a B-0313 68.4 ± 3.3 a 67.1 ± 2.9 a 76.5 ± 5.7 62.5 ± 5.6 a S-0114 75.7 ± 6.1 a 77.4 ± 6.1 a 75.2 ± 4.6 78.2 ± 4.5 a Radioactividad medida en hoja tratada (HT) HR-S13 93.7 ± 1.2 a 83.6 ± 3.1 a 78.3 ± 3.8 a 70.1 ± 6.5 a F-0213 99.1 ± 0.1 b 96.2 ± 1.5 ab 98.2 ± 0.4 b 97.4 ± 0.2 b B-0313 98.9 ± 0.2 b 98.4 ± 0.5 b 95.6 ± 1.7 b 95.4 ± 1.2 b S-0114 97.7 ± 0.5 b 88.2 ± 6.1 ab 94.3 ± 1.2 b 93.4 ± 1.6 b Radioactividad medida en el resto de la parte aérea (PA) HR-S13 4.2 ± 0.9 a 12.7 ± 2.5 a 15.1 ± 3.3 a 22.2 ± 6.1 a F-0213 0.3 ± 0.04 b 2.6 ± 1.2 b 0.5 ± 0.1 b 1.1 ± 0.2 b B-0313 0.7 ± 0.2 b 1.1 ± 0.5 b 3.8 ± 1.6 b 3.1 ± 1.1 b S-0114 1.9 ± 0.5 ab 6.3 ± 2.7 ab 4.5 ± 1.3 b 6.1 ± 1.5 b Radioactividad medida en raíz (R) HR-S13 1.9 ± 0.4 a 3.6 ± 0.5 a 6.5 ± 0.5 a 7.7 ± 1.1 a F-0213 0.5 ± 0.1 b 1.1 ± 0.3 a 1.1 ± 0.3 b 1.4 ± 0.1 b B-0313 0.2 ± 0.01 b 0.3 ± 0.06 a 0.5 ± 0.1 b 1.4 ± 0.2 b S-0114 0.3 ± 0.06 b 5.4 ± 3.7 a 1.1 ± 0.4 b 0.4 ± 0.1 c * Error estándar de la media. † /HWUDVGLIHUHQWHVHVWDEOHFHQGLIHUHQFLDVVLJQL¿FDWLYDVHQWUHELRWLSRVHQODHOSRUFHQWDMHGHUDGLRDF- tividad absorbida y translocada para cada uno de los tiempos evaluados mediante el Test de Tukey 3 CONCLUSIONES 6HKDQREVHUYDGRGLIHUHQFLDVVLJQL¿FDWLYDVHQODWUDQVORFDFLyQGHDP- bos productos entre biotipos resistentes y sensibles. El hecho de que el biotipo HR-S13 transloque menos tribenuron-metil que el resto de pobla- FLRQHVSXHGHVHUGHELGRDOSURSLRHIHFWR¿WRWy[LFRGHHVWHSURGXFWR3RU el contrario, la menor translocación de 2,4-D observada en biotipos resistentes respecto a los sensibles es una evidencia indirecta de la presencia de un mecanismo de resistencia de estas plantas al herbicida hormonal. AGRADECIMIENTOS (VWHHVWXGLRVHKDUHDOL]DGRJUDFLDVDOD¿QDQFLDFLyQ\FRODERUDFLyQGH la empresa Du Pont de Nemours S.A.S y dentro del programa de becas predoctorales AGAUR (Generalitat de Cataluña). Además agradezco la XV Congreso de la Sociedad Española de Malherbología. Sevilla 2015 155 ayuda prestada por parte de Eva Edo, Laia Mateu y Daniel Camacho en la propagación y preparación del material vegetal empleado en estos experimentos. BIBLIOGRAFÍA CLAUDE JP, GABARD J, DE PRADO R & TABERNER A (1998) An ALS-re- sistant population of Papaver rhoeas in Spain. 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