El papel del palio del telencéfalo de los peces teleósteos en el control motor y en procesos motivacionales y emocionales

El papel del palio del telencéfalo de los peces teleósteos en el control motor y en procesos motivacionales y emocionales Blanca Quintero Vera Tesis Doctoral 2024 El papel del palio del telencéfalo de los peces teleósteos en el control motor y en procesos motivacionales y emocionales. Universidad de Sevilla Área de Psicobiología Trabajo presentado por Blanca Quintero Vera para optar al título de Doctora por la Universidad de Sevilla El Director, Dr. Cosme Salas García Agradecimientos A Cosme, por todo lo que me ha enseñado en estos años, por su apoyo y su comprensión. A Fernando, por haber sido como un segundo director, siempre dispuesto a ayudar dentro y fuera del laboratorio. Y a Antonia, por permitirme aprender de su forma de trabajar, por sus consejos y propuestas de mejora, siempre con una sonrisa. Sin vosotros este trabajo no hubiera sido posible. No me olvido de Cristina, quién nos transmitió su amor por la ciencia siempre con ese cariño especial hacia cada uno de nosotros. A Isabel Trujillo, por ser la persona con la que empecé en este mundo de la investigación. Gracias por tus sabios consejos y ser apoyo en todo momento. Y a Lauri, compañera y amiga con la que empecé a compartir laboratorio y a la que he echado tanto de menos estos años. A Carmen, Tamara(y Brunhilde) y Atieh(y Liam), compañeras, amigas y familia, gracias por vuestra amistad, por el apoyo para seguir adelante cuando las fuerzas flaqueaban y hacer que los días (e incluso noches) más duros de experimentos merecieran la pena. Por todos esos almuerzos, cafés, y meriendas. A todas esas personas que han hecho del laboratorio una segunda casa: A David Madrid, por tu ayuda en muchos de los experimentos de este trabajo, a Paco (técnico) por enseñarme y ayudarme con la histología, a Mehdi, a Patri, a Ana, a María, a Tono, a Lucas, a Sonia, a Parisa, a Jose, a Manuel, a Edu… A mi familia y amigos, gracias por vuestro apoyo y comprender sin juzgar muchas de mis ausencias por “tener experimento”: A Claudia, a Pedro, a Chema, a Clara, a Cristian, a Ana2, a Estrella, a Javi, a Elena, a Enrico, a Alejandro, a Manuel, a María José, a Jeni, a Carmen, a Judith, a Fran… A mis padres y hermana, por ser los pilares de mi vida. Gracias por vuestro cariño, comprensión y apoyo en todo momento. A Miguel, por ser mi compañero de vida. Gracias por tu amor, por el sacrificio y por las cervezas en la terraza. Este trabajo no hubiera sido posible sin el apoyo que me has dado durante estos años. A mis padres. A mi hermana y Cristian. A Miguel. “Si vivir es bueno , es mejor soñar. y mejor que todo, madre, despertar” Nuevas canciones: “Proverbios y cantares” Antonio Machado i Resumen La presencia de áreas especializadas en la generación de respuestas motoras y en el control motor es una característica definitoria del neocórtex de los mamíferos. Sin embargo, coexisten varias hipótesis contrapuestas acerca del origen evolutivo de estas áreas motoras corticales y las vías motoras descendentes. Mientras algunos autores defienden que los mecanismos corticales para el control motor son una adquisición reciente en los mamíferos, otros sostienen que la presencia de un palio somatomotor es un rasgo antiguo compartido por todos los vertebrados. Este trabajo tiene como principal objetivo aportar evidencias acerca de la evolución del sistema motor de los vertebrados mediante el estudio del papel del palio telencefálico de la carpa dorada en el control motor. En primer lugar, mediante la técnica de registro óptico con fluorocromos sensibles al voltaje, se identificó funcionalmente un área somatosensorial ubicada en la región más caudal del área Dm. Mediante estudios de lesión se observó que la lesión de esta área no produce déficits en el desempeño de una tarea motora compleja previamente aprendida que implicó el aprendizaje de una secuencia de ajustes posturales y movimientos coordinados de la musculatura axial del cuerpo, las aletas y la boca, ni tampoco se observaron déficits en el proceso de aprendizaje de esta tarea motora. Finalmente, mediante la técnica de microestimulación eléctrica intracerebral localizada, mostramos que el palio de la carpa dorada no está involucrado en la generación de respuestas motoras de manera similar a cómo lo están estructuras premotoras típicas como el techo óptico. Sin embargo, los resultados mostraron que la activación del palio de la carpa dorada produjo respuestas emocionales y viscerales, como alteraciones de la tasa cardíaca (bradicardia) y la adquisición del aprendizaje de evitación al lugar en el que se producía la estimulación. En conclusión, estos resultados, no respaldan la hipótesis del origen ancestral de las funciones motoras del palio de los teleósteos, sino que, por el contrario, apoyan la hipótesis alternativa de que esta característica es una adquisición reciente en la línea evolutiva que lleva RESUMEN / ABSTRACT ii hasta los mamíferos. Los presentes resultados sugieren también la ausencia de un sector palial en los peces teleósteos comparable al neocórtex de los mamíferos y apoyan la hipótesis de que el palio telencefálico de la carpa dorada tiene una naturaleza fundamentalmente límbica y paralímbica. RESUMEN / ABSTRACT iii The presence of specialized areas for the generation of motor responses and motor control is a defining feature of the mammalian neocortex. However, conflicting hypotheses exist regarding the evolutionary origin of these motor areas and descending motor pathways. While some authors propose that cortical mechanisms for motor control are a recent acquisition in mammals, others suggest that the presence of a somatomotor pallium is an ancient character shared by all vertebrates. The main objective of this work is to provide evidence about the evolution of the vertebrate motor system by studying the role of the telencephalic pallium of the goldfish in motor control. First, using voltage-sensitive fluorochrome neuroimaging techniques, a somatosensory area located in the most caudal region of the Dm area was functionally identified. Lesion studies revealed that damage to this area did not impair the performance or learning of a complex motor task involving coordinated postural adjustments and movements of the body, fins, and mouth. Finally, using localized intracerebral electrical microstimulation technique, we show that the goldfish pallium is not involved in the generation of motor responses in like typical premotor structures such as the optic tectum. However, the results showed that the activation of the goldfish pallium produced visceral emotional responses, such as alteration of the heart rate (bradycardia),and induced robust place avoidance learning. In conclusion, these findings do not support the hypothesis of an ancestral origin for pallium motor functions. Instead, they support the alternative hypothesis that this trait is a recent acquisition in the evolutionary lineage leading to mammals. The present results also suggest the absence of a pallial sector in teleost fishes comparable to the mammalian neocortex, and support the hypothesis of a fundamentally limbic and paralimbic nature of teleost telencephalic pallium. Abstract INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 2 1. Telencéfalo de los peces teleósteos Aunque históricamente el número de estudios en peces ha sido mucho menor que en aves y mamíferos, existen numerosas razones que hacen interesante el estudio de este grupo. Entre ellas destacan la posición clave que ocupa en la filogenia, ya que forman parte del clado de los peces actinopterigios, que a su vez son el grupo hermano de los sarcopterigios, grupo en el que se incluyen todos los vertebrados terrestres y los mamíferos en particular. A diferencia de otros vertebrados, en los que los hemisferios telencefálicos se forman mediante un proceso de evaginación, los hemisferios de los peces actinopterigios se forman mediante un proceso de eversión durante el desarrollo embrionario, lo cual produce notables divergencias morfológicas que han hecho que sean múltiples las interpretaciones sobre su homología (Nieuwenhuys, 2011; Nieuwenhuys et al., 1998; Northcutt, 2006, 2008; Northcutt & Braford, 1980; Northcutt & Kaas, 1995; Striedter & Northcutt, 2006). Se han propuesto diferentes modelos explicativos del proceso de eversión. Algunos autores han planteado la eversión como un proceso simple con desplazamiento de las proyecciones olfatorias (Butler, 2000; Nieuwenhuys, 2011), otros como un proceso de eversión con conservación de la topología (Braford, 2009), como un proceso de eversión parcial (Mueller & Wullimann, 2009) y como un proceso de eversión caudolateral y desplazamiento (Braford, 2009). 1.1. Descripción anatómica. Los hemisferios telencefálicos de los peces teleósteos se dividen en dos grandes regiones: el área dorsal o palio y el área ventral o subpalio (Nieuwenhuys, 2009; Northcutt & Braford, 1980; Northcutt & Davis, 1983; Schroeder, 1980), separadas ambas zonas por una banda libre de células. En el área dorsal o palio pueden diferenciarse varias zonas histológicamente diferentes en las que las células se encuentran relativamente lejos de la superficie ventricular y en ocasiones, dispuestas en capas. Sin embargo, en el área ventral o subpalio, las células se INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 3 organizan en núcleos que se localizan relativamente cercanos a la superficie ventricular. El área ventral o subpalio se subdivide en dos masas celulares periventriculares: la zona dorsal del área ventral (Vd) y la zona ventral del área ventral (Vv). El área Vd, a su vez, se subdivide en varias regiones: la subdivisión supracomisural o superior (Vs), ubicada dorsalmente a la comisura anterior; el área postcomisural o posterior (Vp), situada caudalmente a la comisura anterior; y el área lateral (Vl). En cuanto al área Vv se extiende a lo largo de la porción más ventral del ventrículo, hasta el nivel de la comisura anterior y está formado por células de pequeño tamaño, ordenadas en láminas verticales (Northcutt & Davis, 1983). El área dorsal del telencéfalo de los peces teleósteos ha sido dividida en cinco regiones: zona medial (Dm), zona dorsal (Dd), zona lateral (Dl), área posterior (Dp) (Northcutt, 2006) y se ha identificado una zona central de células grandes, zona dorsocentral (Dc). Alrededor de los dos tercios más rostrales del palio están ocupados por Dm y Dl mientras que Dp forma el polo caudal. La división dorsal (Dd) se localiza en el tercio medio del palio, se trata de la transición más caudal entre Dm y Dl. Algunos autores, suponen que Dd no es más que la extensión rostral y dorsal de Dc (Mueller et al., 2011; Porter & Mueller, 2020). Es posible diferenciar una división en profundidad en esta misma altura, que es la zona central (Dc), comprendido entre Dm y Dl y superficialmente a Dp (Northcutt, 2006). La división posterior (Dp) es el principal destino de las proyecciones olfatorias secundarias (Folgueira et al., 2004; Levine & Dethier, 1985). En conjunto, estos datos ponen de manifiesto cierta complejidad citoarquitectónica que ha dado lugar al establecimiento de diversas hipótesis sobre la homología entre estas regiones y las subdivisiones del palio en otros vertebrados (Butler, 2000; Mueller et al., 2011; Nieuwenhuys, 2011; Northcutt, 2006, 2008; Wullimann & Mueller, 2004; Yamamoto et al., 2007). INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 4 1.2. Hipótesis de homologías y organización funcional del palio telencefálico. El proceso de eversión durante el desarrollo embrionario implica que la localización topográfica de las diferentes áreas observadas en los vertebrados se encuentra invertida en los peces actinopterigios, lo cual ha dificultado enormemente el establecimiento de homologías con los vertebrados terrestres (Nieuwenhuys et al., 1998). Sin embargo, existen evidencias genéticas, neuroanatómicas, neuroquímicas, embriológicas y conductuales de que a pesar de las diferencias que puedan existir en la morfología y citoarquitectura en el palio telencefálico de los peces teleósteos, las subdivisiones del palio de los peces podrían tener una correspondencia con sectores del palio de otros vertebrados (Braford, 2009; Broglio et al., 2005; Northcutt, 1981; Northcutt & Braford, 1980; Northcutt & Kaas, 1995; Rodríguez, López, Vargas, Gómez, et al., 2002; Salas et al., 2003, 2008; Wullimann & Mueller, 2004). En base a criterios topológicos, citoarquitectónicos, de conectividad, histoquímicos, genéticos, de desarrollo y también funcionales, una hipótesis muy aceptada es la de que la región dorsomedial (Dm) del telencéfalo de los peces teleósteos podría considerarse homóloga a la amígdala palial de los vertebrados terrestres (Butler & Hodos, 2005; Ito & Yamamoto, 2009; Northcutt, 2006, 2008, 2011; Wullimann & Mueller, 2004). Debido al proceso de eversión, Dm correspondería topológicamente con el palio lateroventral de tetrápodos (Maximino et al., 2013; Nieuwenhuys, 2009; Northcutt, 2006). Sin embargo, la región Dm no es una región homogénea en términos citoarquitectónicos, histoquímicos ni hodológicos (Castro et al., 2003; Maximino et al., 2013; Northcutt, 2006; Porter & Mueller, 2020). Una hipótesis alternativa sugiere que una parte de Dm equivaldría a la amígdala palial, mientras que el resto de Dm estaría compuesto por regiones sensoriales y motoras homólogas al neocórtex de los mamíferos (Wullimann & Mueller, 2004; Yamamoto et al., 2007; Yamamoto & Ito, 2008). En mamíferos, diversos datos funcionales han puesto de manifiesto que la amígdala está implicada en diferentes formas de aprendizaje y memoria INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 5 emocional, jugando un papel fundamental en la atribución de la valencia afectiva a los estímulos y situaciones y en el condicionamiento emocional (Davis & Whalen, 2001; Fanselow & LeDoux, 1999; Janak & Tye, 2015; Kim & Jung, 2006; Lavond et al., 1993; LeDoux, 1993, 2000; Maren, 2001; Parkes & Westbrook, 2010; Phelps et al., 2004; Phelps & LeDoux, 2005). La estimulación eléctrica, produce respuestas comportamentales y autonómicas que se asemejan a la conducta del miedo (LeDoux, 1993). Así, la estimulación de determinadas zonas de la amígdala produce bradicardia, respuestas motoras y respuestas de congelación o escape (LeDoux, 2000; Maren, 2001; McGaugh, 2004). La amígdala de los mamíferos es una estructura del lóbulo temporal compleja y heterogénea que está formada por diferentes núcleos que difieren en su función, tipos celulares y conectividad. Se puede diferenciar: el núcleo basolateral (BLA), que comprenden el núcleo lateral de la amígdala (LA), el núcleo basal (BA) y el núcleo basomedial (BM); la amígdala extensa que incluye el núcleo central (CeA), el núcleo centromedial (CeM) y el núcleo del lecho de la estría terminal; y finalmente la masa de células intercaladas (ITC). La BLA recibe información multisensorial del entorno a través el tálamo sensorial y de las cortezas sensoriales y a su vez, mantiene conexiones recíprocas con regiones corticales como el hipocampo, corteza prefrontal orbitofrontal y áreas de asociación sensorial (Duvarci & Pare, 2014; Janak & Tye, 2015; Sah et al., 2003; Swanson & Petrovich, 1998). Además, la información ya procesada es enviada al estriado, específicamente al núcleo accumbens, núcleo del lecho de la estría terminal y al CeA, para modular la salida comportamental (Swanson & Petrovich, 1998). Estudios funcionales en peces teleósteos, indican que Dm desempeña un papel esencial en el procesamiento emocional. Experimentos de lesión del palio dorsomedial de la carpa dorada reflejan que la lesión de este área produce déficits significativos en la adquisición y retención de una tarea de evitación condicionada por un fallo en la recuperación de la respuesta de miedo anticipatoria o por la incapacidad del estado interno de miedo de inducir la respuesta de evitación (Portavella et al., 2003; Portavella, Torres, & Salas, 2004). En este paradigma los animales aprenden a evitar un estímulo aversivo o estímulo incondicionado INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 6 mediante la realización de una acción determinada, por ejemplo, saltar hacia una zona segura, en respuesta a la presentación de un estímulo condicionado (luz) que señala la llegada del estímulo incondicionado. Además, estudios de estimulación eléctrica intracerebral han evidenciado que la microestimulación de la porción caudal de Dm produce un efecto aversivo en un procedimiento de evitación al lugar (Salas-Peña, 2021). Por otro lado, en los peces teleósteos, en procedimientos de condicionamiento clásico de la tasa cardíaca, en los que se presenta de forma emparejada un estímulo condicionado (por ejemplo, una luz) con un estímulo incondicionado (por ejemplo, una descarga eléctrica) produce una desaceleración o bradicardia en la tasa cardiaca (Broglio et al., 2005, 2011). Animales con lesión en la región Dm, presentan un deterioro notable en la adquisición y retención de la respuesta de bradicardia condicionada. Además, la inactivación de Dm con muscimol, agonista selectivo de los receptores GABA, impide la adquisición de la respuesta de bradicardia condicionada, mientras que la información sensorial y motora es procesada correctamente (Rodríguez-Expósito, 2014). También se han realizado estudios de estimulación eléctrica de Dm que han puesto de manifiesto que la estimulación de esta región del palio evoca respuestas viscerales emocionales y de escape (Reiriz-Rojas, 2017). Además, estudios funcionales recientes que han utilizado genes de expresión temprana como índice de activación neural, muestran que la expresión de c-Fos se incrementa en la región Dm cuando los peces realizan tareas de evitación o se someten a tareas estresantes (Da Silva et al., 2014; Ghisleni et al., 2012; Lau et al., 2011; von Trotha et al., 2014; Wolkers et al., 2017). En cuanto a las conexiones, el área Dm de los peces teleósteos recibe información olfativa, gustativa, auditiva, visual y mecanosensorial (Folgueira et al., 2004b; Northcutt, 2006; Yamamoto et al., 2007; Yáñez et al., 2017, 2022) y recibe información de Dl, área considerada homóloga al hipocampo de los tetrápodos (Northcutt, 2006). En su conjunto, estos datos apoyan la implicación que Dm tiene en la formación de memorias emocionales, aprendizaje de aversión al sabor y la conducta de escape y su posible homología del área Dm de los INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 7 peces teleósteos con la amígdala palial de los vertebrados terrestres (Broglio et al., 2005; Maximino et al., 2013). La división lateral del palio dorsal de los peces teleósteos (Dl), puede ser subdividida en dos regiones principales: una región dorsal (Dld) y una región ventral (Dlv) (Burmeister et al., 2009; Demski, 2003, 2013; Northcutt, 2006; Yamamoto & Ito, 2008; Yamane et al., 1996). La región ventral (Dlv) es considerada homóloga al palio medial o hipocampo de los tetrápodos, ya que su posición topológica es compatible con la localización del hipocampo tras el proceso de eversión (Braford, 1995; Butler, 2000; Nieuwenhuys & Meek, 1990; Northcutt, 2006; Northcutt & Braford, 1980; Northcutt & Kaas, 1995). En cuanto a las conexiones, el área Dlv está recíprocamente conectada con el núcleo ventral del área ventral o subpalio (Vv), considerado homólogo al núcleo septal de tetrápodos, recibiendo una importante estrada colinérgica (Butler & Hodos, 2005). En cuanto a las conexiones externas al telencéfalo, el área lateral del telencéfalo de los peces teleósteos, al igual que ocurre con el hipocampo, proyecta al área preóptica y a otras regiones diencefálicas y recibe aferencias desde el núcleo superior del rafe, el núcleo coeruleus y el área preóptica. En base a las conexiones de Dld con determinados núcleos de Dc y con el complejo preglomeruloso (Northcutt, 2006; Yamamoto & Ito, 2008; Yáñez et al., 2022) y el registro de los potenciales evocados (Demski, 2003; Demski & Beaver, 2001), el área dorsal de Dl (Dld) puede ser considerada como el palio visual de los teleósteos (Demski, 2003, 2013; Demski & Beaver, 2001; Saidel et al., 2001). Además de información visual, en el caso de la carpa dorada, Dld recibe información del núcleo preglomerular lateral con información acústica, de la línea lateral, y posiblemente otras modalidades sensoriales (Northcutt, 2006, 2008; Striedter, 1992; Yamamoto & Ito, 2008). Evidencias derivadas de estudios de memoria espacial en peces teleósteos, han mostrado que éstos son capaces, al igual que los tetrápodos, de orientarse y navegar utilizando gran variedad de estrategias espaciales basadas en distintos sistemas de aprendizaje y memoria, desde estrategias de orientación egocéntricas y de asociación estímulo-respuesta a complejas representaciones alocéntricas del entorno (Broglio et al., 2011; Gómez, Ocaña, et al., 2022; Rodríguez et al., INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 8 2021; Salas et al., 2008). Resultados de los estudios conductuales, apoyan la hipótesis de homología entre la región Dlv del palio de los peces teleósteos y el hipocampo de los amniotas. Se ha demostrado que el palio lateral de los peces teleósteos, al igual que el palio medial o hipocampo del resto de los tetrápodos, está implicado en la cognición espacial (Broglio et al., 2005; Rodríguez et al., 2021; Rodríguez, López, Vargas, Gómez, et al., 2002; Salas et al., 2008). Los animales con lesión en Dlv, mostraron un déficit en el aprendizaje y la memoria espacial tan severo como el mostrado por los animales a los que se les había extirpado el telencéfalo completo (López et al., 2000; Rodríguez, López, Vargas, Broglio, et al., 2002; Rodríguez, López, Vargas, Gómez, et al., 2002; Salas et al., 1996). Es más, la participación de la región de Dlv en los procesos de cognición espacial alocéntrico se considera altamente selectiva puesto que la lesión de esta región no afecta a otros tipos de aprendizaje espacial como es el aprendizaje de guía u otras conductas espaciales en las que se establece un marco de referencia egocéntrico (Durán et al., 2010; López et al., 2000; Rodríguez et al., 2021; Rodríguez, López, Vargas, Broglio, et al., 2002; Salas et al., 1996, 2008). Actualmente, en mamíferos, se acepta que el hipocampo no sólo está implicado en el procesamiento de información espacial, sino que forma parte de un complejo sistema con un papel decisivo en la integración de información multimodal, por lo que tiene un papel importante en el aprendizaje de relaciones entre experiencias diferentes que implican otros estímulos además de los espaciales (Bunsey & Elchenbaum, 1996; Eichenbaum, 2000, 2004). Por ejemplo, el condicionamiento clásico de traza ha demostrado depender críticamente del hipocampo. En este procedimiento existe un periodo libre de estímulos entre el estímulo condicionado y el incondicionado (Kim et al., 1995; Moyer et al., 1990; Solomon et al., 1986; Thompson & Kim, 1996). En los peces teleósteos, una serie de trabajos han puesto de manifiesto que de igual manera que el hipocampo de los mamíferos, el área Dlv es crucial para el aprendizaje de una tarea de condicionamiento clásico, cuando se empleaba un procedimiento de traza en el que se introducía un intervalo temporal entre el estímulo condicionado e incondicionado (Broglio et al., 2010, 2011; Gómez, Ocaña, et al., 2022; Gómez, Rodríguez-Expósito, et al., 2022; INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 9 Salas et al., 2006). Estos resultados indican que, al igual que el hipocampo, Dlv no solo está implicado en el aprendizaje espacial, sino que también es importante para el procesamiento temporal del aprendizaje. En cuanto a la región dorsocentral (Dc), no existe consenso sobre si se trata de una región diferenciada o se trata de un conglomerado dispar formado por la zona más interna de las regiones adyacentes (Dl, Dm, Dp) y por tanto se trataría de subregiones de las mismas (Demski, 2013; Northcutt, 2006). En cuanto a las conexiones, recibe información de las áreas paliales y del bulbo olfatorio. Recibe información ascendente del complejo preglomeruloso y el tálamo relacionado con las modalidades acústicas, de la línea lateral, somatosensorial, visual, gustativa y olfativa (Demski, 2013; Northcutt, 2006; Yamamoto et al., 2007; Yamamoto & Ito, 2005, 2008). Especialmente interesante son los datos recientes que muestran que el palio de los peces presenta una organización sensorial similar a la que se encuentra en el palio de aves, reptiles y mamíferos, ya que recibe entradas sensoriales de todas las modalidades procedentes del diencéfalo y alcanzan regiones específicas de las divisiones medial y lateral del palio (Ito & Yamamoto, 2009; Northcutt, 2006, 2008; Yamamoto & Ito, 2005, 2008). Se puede afirmar que, aunque no está clara su homología con el tálamo dorsal de los amniotas, el complejo preglomeruloso de los peces teleóstoes constituye una gran estación de relevo sensorial y sensoriomotora localizada en el diencéfalo (Braford, 2009; Northcutt, 2006, 2008; Yamamoto & Ito, 2008) que guarda similitudes con la organización de las vías tálamo-corticales de mamíferos (Butler & Hodos, 2005; Ito & Yamamoto, 2009; Yamamoto et al., 2007; Yamamoto & Ito, 2005). Las principales aferencias desde el complejo preglomerular a regiones de Dm son somatosensoriales, auditivas y quimiosensoriales, mientras que las principales entradas en Dl son auditivas, de la línea lateral y visuales (Northcutt, 2006; Yamamoto & Ito, 2005, 2008) y las principales eferencias de Dm se centran en el hipotálamo y tubérculo posterior, guardando un patrón de conexiones muy similar al observado en la amígdala de otros vertebrados (Braford, 1995; Wullimann & Mueller, 2004). Las eferencias de la subdivisión dorsal de la división lateral (Dld) alcanzan el hipotálamo caudal, y INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 10 Dlv envía sus proyecciones hacia el homólogo del núcleo septal de tetrápodos y el área preóptica, por lo que su patrón de conexiones es muy similar al palio hipocámpico de los tetrápodos. En cuanto a las conexiones intrapaliales, tanto Dm como Dl están interconectadas y reciben aferencias de diferentes áreas paliales como Dp, Dc y Dd (Northcutt, 2006; Yáñez et al., 2022). Igualmente, existen estudios funcionales que demuestran que efectivamente existen áreas sensoriales en el telencéfalo de los peces teleósteos con una organización relativamente compleja y un alto grado de diferenciación. Por ejemplo, Prechtl et al., (1998), mediante registro electrofisiológico, identificaron en el palio de un pez mormírido áreas segregadas que responden a diferentes modalidades sensoriales, así como áreas parcialmente solapadas que responden a dos o más modalidades sensoriales. En nuestro laboratorio, los estudios realizados mediante la técnica de registro óptico, han demostrado la activación diferencial de diferentes áreas del palio ante la presentación de estímulos sensorialesde diferentes modalidades. Así, se ha descrito la activación de Dld ante estímulos visuales y la activación de diferentes regiones de Dm ante estímulos gustativos, auditivos y táctiles (Amores, 2024; del Águila, 2024; Ocaña, 2009). Tomando en consideración la presencia de áreas sensoriales en el telencéfalo de los peces teleósteos que reciben información procedentes de centros diencefálicos, algunos autores han hipotetizado que estas áreas sensoriales podrían ser homólogas a las del palio dorsal de los tetrápodos y al neocórtex de los mamíferos (Mueller & Wullimann, 2009; Striedter & Northcutt, 2020; Yamamoto et al., 2007). Siguiendo con este razonamiento y teniendo en cuenta que una característica definitoria del neocórtex de los mamíferos es la presencia de áreas motoras asociadas a la corteza somatosensorial y a otras áreas sensoriales, implicadas en el control motor directo, se podría hipotetizar también la presencia de áreas motoras en el palio del telencéfalo de los peces teleósteos. La presencia de funciones sensorio-motoras características del neocórtex de los mamíferos podría considerarse en este caso una característica primitiva del palio que podría haberse conservado en la evolución del telencéfalo de las diferentes radiaciones de vertebrados. En este sentido, Stein Grillner y sus colaboradores INTRODUCCIÓN 1. Telencéfalo de los peces teleósteos. 11 han propuesto recientemente la existencia de áreas sensoriales y motoras bien definidas en el palio de las lampreas, y estos investigadores afirman haber encontrado proyecciones tanto ascendentes como descendentes similares a las que se pueden encontrar en los mamíferos (Grillner, 1981, 2021; Ocaña et al., 2015; Suryanarayana et al., 2021, 2022). Estos autores han propuesto que estas áreas del palio de las lampreas son homólogas a las áreas motoras y sensoriales de la neocorteza de los mamíferos. Para estos autores, por tanto, la organización general del sistema motor de los vertebrados, incluidos los componentes paliales, son un rasgo primitivo que está conservado de los primeros vertebrados sin mandíbula. Sin embargo, hay numerosas evidencias de que el palio telencefálico de los peces teleósteos carece de una función relevante en el control motor directo de los centros reticulares y medulares similar a la que realizan las áreas corticales de los mamíferos a través de la vía piramidal (Striedter & Northcutt, 2019; Ten Donkelaar, 2001; Yamamoto et al., 2017). De hecho, Northcutt (2006, 2008) ha sugerido el origen exclusivamente límbico del palio telencefálico de los actinopterigios. Para este autor, toda la división dorsolateral del palio de los peces teleósteos sería homóloga al palio medial o hipocampo de los demás vertebrados, y toda la división dorsomedial del palio sería homóloga al palio ventral o amigdalino de los vertebrados terrestres, por lo que el palio de los peces carecería de una estructura homóloga al isocórtex. De la misma forma, estudios recientes de nuestro laboratorio han descrito que la estimulación de distintas regiones de Dm desencadena respuestas motoras con características diferentes a las que se producen por la estimulación de la corteza motora primaria en mamíferos, constituyendo más bien respuestas viscerales, emocionales y de escape (del Águila, 2024; Reiriz-Rojas, 2017). INTRODUCCIÓN 3. Evolución del sistema motor de los vertebrados. 18 vertebrados (Nieuwenhuys & Meek, 1990; Northcutt, 2006, 1981, 2008; Wicht & Northcutt, 1992). En relación con la evolución de los sistemas neurales del control motor, los diferentes patrones de locomoción desarrollados por los vertebrados a lo largo de la evolución, como la natación, el salto, el vuelo, la carrera, la marcha, la reptación, parecen derivar de un patrón de natación básico basado en un desplazamiento ondulatorio lateral (Carroll, 1988; Romer & Parson, 1977; Ten Donkelaar, 2001; Young, 1981). Este vertebrado ancestral, que se desarrolló en un ambiente acuático, probablemente se desplazaba mediante la musculatura axial (Carroll, 1988; Romer & Parson, 1977). A diferencia de los vertebrados sin mandíbulas que exhiben habilidades motoras limitadas, la aparición de los vertebrados con mandíbula supuso una mejoría en la estabilidad postural, propulsión y manipulaciones finas con la incorporación progresiva de nuevas adquisiciones motoras. Estas nuevas adquisiciones se lograron con la adición de nuevos circuitos rubroespinales y trigeminales (Ten Donkelaar, 2001). A lo largo de la historia evolutiva se desarrollaron también sofisticados mecanismos de manipulación de las extremidades anteriores y de control de la mirada, mediados por circuitos telencéfalo-espinales. Este proceso culminó con la aparición de las habilidades de manipulación complejas observadas en mamíferos y aves y, de manera más destacada, en los mecanismos neocorticales que apoyan al aprendizaje motor y la destreza en primates y humanos. Como consecuencia de esta continuidad en la evolución de los mecanismos de control motor, el patrón de organización de los sustratos neurales básicos de control y modulación de los movimientos medulares y troncoencefálicos presenta bastante semejanzas en los diferentes grupos de vertebrados y habrían aparecido muy temprano en la historia evolutiva, estando ya presente en los peces (Butler & Hodos, 2005; Grillner, 1981; Grillner & Matsushima, 1991; Ten Donkelaar, 2001). Progresivamente se irían añadiendo a estos circuitos otras jerarquías motoras, como los ganglios de la base, para culminar con la aparición de un sistema cortical de control motor, que tendría su mayor desarrollo en los mamíferos y en especial INTRODUCCIÓN 3. Evolución del sistema motor de los vertebrados. 19 en los primates, con la aparición de vías de proyección directas de la corteza a la médula. Numerosas evidencias indican que el palio dorsal (homólogo al isocórtex de los mamíferos), así como áreas subpaliales homólogas a los ganglios de la base, podrían estar presentes en todos los grupos de vertebrados (Ebbesson & Ito, 1980; Karten, 2015; Marín et al., 1998; Nieuwenhuys et al., 1998; Northcutt, 1981; Northcutt & Braford, 1980; Northcutt & Davis, 1983; Northcutt & Kaas, 1995; Reiner & Northcutt, 1992). En la organización funcional jerárquica del sistema motor de los vertebrados, la médula espinal se sitúa en el nivel inferior, recibiendo información procedente de las vías descendentes supraespinales, que constituyen los elementos básicos con los que el sistema nervioso dirige los movimientos. En el control neural de la locomoción, participan tres elementos claves: las entradas sensoriales, las vías descendentes del control supraespinal y los generadores de patrones centrales de la médula espinal o del tronco del encéfalo, capaces de evocar patrones de locomoción cíclicos y estereotipados (Grillner, 1981; Rossignol, 1996; Wetzel & Stuart, 1976). En todos los vertebrados están presentes vías descendentes que se originan en el tronco cerebral y en niveles más anteriores del encéfalo (Butler & Hodos, 2005; Nieuwenhuys et al., 1998; Ten Donkelaar, 1982, 2001). Además, hay estructuras como el cerebelo y los ganglios basales, que están implicadas en la modulación del control motor. El cerebelo desempeña un papel fundamental en la coordinación de los movimientos rítmicos entre los que se encuentra la locomoción (Arshavsky et al., 1993). Un movimiento se considera preciso y adaptado al entorno cuando se produce una reacción ante el efecto que dicho movimiento provoca en el entorno, por lo que es crucial la información sensorial sobre los movimientos que regresa hasta la médula espinal, y desde allí, hacia niveles superiores para ser corregidos si fuera necesario por mecanismos compensatorios (Butler & Hodos, 2005; Nieuwenhuys et al., 1998; Ten Donkelaar, 1982, 2001). En relación a las vías descendentes, las proyecciones reticuloespinales están presentes en todos los grupos de vertebrados, desde los ciclóstomos hasta los mamíferos, y se consideran uno de los elementos descendentes más antiguos INTRODUCCIÓN 3. Evolución del sistema motor de los vertebrados. 20 del sistema motor (Rovainen, 1979; Ten Donkelaar, 2001). A medida que aparecieron las extremidades, se desarrolló un sistema neural específico para controlar sus movimientos donde el tracto rubroespinal desempeña un papel importante (Nieuwenhuys et al., 1998; Ten Donkelaar, 1988). Parece que el tracto corticoespinal es una adaptación particular de los mamíferos, relacionada con la adquisición de habilidades motoras manipulativas, especialmente de las extremidades anteriores (Heffner & Masterton, 1983; Kuypers, 1981; Nudo & Masterton, 1990b, 1990a). Sin embargo, se ha descubierto también un circuito cortical descendente en aves, relacionado con la manipulación del alimento (Wild et al., 1985). En los condrictios, también se han identificado vías descendentes que provienen del telencéfalo y se proyectan directamente hacia la médula espinal (Ebbesson & Schroeder, 1971; Kuypers, 1981). Es importante señalar que la vía corticoespinal no siempre está presente en todos los mamíferos (Medina & Reiner, 2000). Control motor espinal Las motoneuronas de la médula espinal son capaces por sí mismas de generar actividad motora rítmica, incluso en ausencia de estímulos sensoriales gracias a un sistema generador central de patrones motores (Arshavsky et al., 1993; Cohen, 1988). En vertebrados ancestrales y posiblemente en anamniotas actuales, estos circuitos centrales de la médula espinal son responsables de iniciar patrones de locomoción independientemente de la retroalimentación sensorial y de los circuitos supraespinales (Grillner et al., 1988). No obstante, para lograr un correcto patrón de locomoción, la médula requiere de la influencia de centros superiores (Ten Donkelaar, 2001). Generalmente, la red neural espinal genera el patrón motor y las aferencias sensoriales transmiten la información sobre los movimientos que ocurren en cada instante. Control motor supraespinal La estimulación de las vías supraespinales originadas en el tronco también produce actividad motora. En los anamniotas, se observa una clara organización de las vías descendentes del tronco en dos tipos principales de proyecciones: INTRODUCCIÓN 3. Evolución del sistema motor de los vertebrados. 21 la vía reticuloespinal, que representa la vía descendente más ancestral de los vertebrados y, la vía vestibuloespinal, la cual parece estar implicada en el equilibrio y el control postural (Rovainen, 1979; Shapovalov, 1972, 1975). Las proyecciones reticuloespinales en vertebrados tienen su origen en el mesencéfalo, específicamente en el núcleo del fascículo longitudinal medial y en la formación reticular mesencefálica. Un rasgo característico de la vía reticuloespinal en anamniotas es la predominancia de grandes neuronas cuyos axones conducen información rápida y directamente a las motoneuronas e interneuronas de la médula espinal, desempeñando un papel crucial en comportamientos de orientación y respuesta de escape (Eaton et al., 2001; Shapovalov, 1972, 1975). Este sistema reticuloespinal que está vinculado con la acción postural y la marcha, representa un sistema fundamental a través del cual el sistema nervioso central ejerce control sobre los movimientos. Sus neuronas pueden ser activadas por estructuras del tronco, o bien por información sensorial. Tras una activación inicial, la mayoría de las neuronas reticuloespinales son moduladas mediante la información ascendente de los circuitos locomotores espinales (Ten Donkelaar, 2001). El sistema rubroespinal, que se origina en el núcleo rojo, parece desempeñar un importante papel en el potencial manipulativo de ciertos vertebrados (Ten Donkelaar, 1982). Existen datos que relacionan la presencia del tracto rubroespinal y la aparición de apéndices pares o aletas que son útiles para la locomoción, la estabilidad postural y el control de los movimientos del cuerpo a baja velocidad (Webb, 1982). Esto podría explicar el motivo por el cual los anfibios sin miembros no presentan un tracto rubroespinal bien desarrollado, mientras que en los vertebrados terrestres se encuentra claramente definido y forma el sistema lateral de las vías descendentes que terminan en la parte lateral y dorsal de la zona intermedia de la sustancia gris medular y es responsable del control de los movimientos de las extremidades distales de los tetrápodos. En primates, especialmente en los seres humanos, el tracto rubroespinal se reduce a favor del tracto piramidal (Rosslenbroich, 2014). Según Heffner y Masterton (1983) Aunque tradicionalmente se consideraba que las vías descendentes de la corteza INTRODUCCIÓN 3. Evolución del sistema motor de los vertebrados. 22 cerebral, relacionadas con la adquisición de destrezas motoras, son únicas de los mamíferos, se han identificado proyecciones telencéfalo-espinales tanto en el tiburón (Ebbesson & Schroeder, 1971; Kuypers, 1981) como en algunas aves (Wild et al., 1985). Además, existen otras vías supraespinales que controlan al sistema motor de los vertebrados, como las proyecciones serotoninérgicas desde el núcleo del rafe y las noradrenérgicas desde el locus coeruleus, presentes en todos los vertebrados (Nudo & Masterton, 1988). Por otro lado, el cerebelo, junto con el núcleo rojo, conforma una red que parece estar relacionada con la ejecución de movimientos dirigidos a una meta (Keifer & Houk, 1994). Las señales sensoriales que van desde el núcleo rojo hasta la corteza cerebelosa intervienen en preseleccionar los programas motores, que una vez iniciados, se mantienen a través de un mecanismo de retroalimentación positiva entre el tronco, el cerebelo y el núcleo rojo. Por su parte, los ganglios de la base también tienen una función esencial en el control motor de los vertebrados, forman parte del subpalio y no establecen conexiones ni aferentes y eferentes directas con la médula espinal. Los ganglios de la base se encuentran en todos los vertebrados. Por ejemplo, en peces y anfibios, es una estructura pequeña y las influencias corticales son escasas. En los amniotas, los ganglios de la base son más numerosos y sus proyecciones hacia la corteza son mayores. En los seres humanos y primates, la neocorteza domina las entradas y salidas de los ganglios basales (Dudel et al., 2001; Heldmaier & Neuweiler, 2003; Neuweiler, 2008; Rosslenbroich, 2014). En los mamíferos, todos estos centros moduladores del control motor están cada vez más subordinados a la influencia del neocórtex. Los ganglios de la base y el cerebelo están conectados con la neocorteza a través de diferentes tractos y forman circuitos de retroalimentación independientes para controlar y evaluar el resultado de las acciones planificadas desde la neocorteza (Rosslenbroich, 2014). La corteza permite principalmente la iniciación consciente de los movimientos y la generación de nuevas combinaciones de movimientos. Sin embargo, a medida que las acciones son dominadas y no necesitan correcciones INTRODUCCIÓN 4. Organización del sistema motor de los mamíferos. 23 adicionales, los movimientos se ejecutan de manera inconsciente, asumiendo un papel fundamental estructuras como los ganglios basales. 4. Organización del sistema motor de los mamíferos. En el palio dorsal o isocórtex de los mamíferos existen áreas sensoriales y motoras que reciben información ascendente desde determinados núcleos del tálamo y proyectan al hipocampo, amígdala y otras regiones como el estriado y diferentes núcleos del tronco del encéfalo (Northcutt & Kaas, 1995). Igualmente, tanto el hiperpalio de las aves como el córtex dorsal de los reptiles muestran un patrón de conexiones similares con el tálamo lo que sugiere la existencia de áreas primarias visuales, auditivas y somatosensoriales en el córtex dorsal de los reptiles y el hiperpalio de las aves (Medina & Reiner, 2000). Respecto al isocórtex o palio dorsal de los mamíferos, se puede afirmar que contiene al menos un área visual primaria (V1), un área somatosensorial primaria (S1), un área auditiva primaria (A1) y un área motora primaria (M1) (Kaas, 1995; Krubitzer, 1995; Northcutt & Kaas, 1995). Estas áreas funcionales primarias están presentes en la mayoría de los mamíferos y mantienen la misma posición relativa al palio dorsal, estando siempre las áreas M1 y S1 situadas rostralmente al área V1, además presentan la misma organización topográfica y poseen interconexiones y características citoarquitectónicas similares, lo que sugiere que la presencia de estas áreas funcionales estuviese presente en el ancestro común de los mamíferos y hayan sido heredadas de él (Kaas, 2004; Krubitzer, 1995; Medina & Reiner, 2000). El área M1 recibe entradas de las zonas motoras del tálamo ventral y envía proyecciones descendentes a la formación reticular del trono y al núcleo intersticial del fascículo longitudinal medial y a la médula espinal (Humphrey et al., 1977; Jones & Wise, 1977). El área M1 es un centro importante para la iniciación y el control del movimiento, cuya actividad está modulada por los ganglios de la base a través de la vía pálido-tálamo- cortical (Albin et al., 1989; Reiner et al., 1984). Sin embargo, datos recientes sugieren que mamíferos primitivos como los monotremas no poseen un área INTRODUCCIÓN 4. Organización del sistema motor de los mamíferos. 24 cortical exclusiva dedicada al control motor, lo que podría reflejar que este área habría tenido una aparición más tardía (Kaas, 2004, 2011a, 2011b). Así, la presencia de un área M1 en el isocórtex de los mamíferos puede ser considerado un carácter derivado que habría aparecido en los mamíferos placentarios en los que las áreas S1 y M1 se segregaron (Kaas, 2004, 2011a, 2011b). De modo que el caracter primitivo presente en los amniotas ancestrales sería la presencia de un área somatosensorial y un área motora (somatomotora) total o parcialmente solapadas (Kaas, 2004; Karlen & Krubitzer, 2007; Medina & Reiner, 2000). En este contexto, la presencia de un área somatomotora solapada en el hiperpalio de las aves y córtex dorsal de los reptiles, similar a lo que presentan los mamíferos marsupiales, nos permite afirmar que la condición primitiva en lo referente a las áreas somatosensoriales y motoras del palio dorsal de los tetrápodos es la presencia de un área somatosensorial/somatomotora (S1/M1). Una visión más actual sobre el funcionamiento del córtex motor de los primates determina que éste está constituido por un mosaico de áreas diferenciadas con funciones específicas en el control motor. Estas áreas también realizan funciones de transformación sensorio-motora y funciones tradicionalmente atribuidas a áreas corticales asociativas (Rizzolatti et al., 1998; Rizzolatti & Luppino, 2001; Schieber, 1999). A nivel cortical se pueden diferenciar: Córtex motor primario (M1). Consiste en una banda situada en el polo más caudal del lóbulo frontal. En cuanto a su organización, muestra una representación somatotópica bien definida. Las partes más cercanas al cuerpo, como el tronco están representadas en la superficie cortical expuesta mientras que las partes distales de las extremidades están representadas en la parte más rostral del surco central (Huntley & Jones, 1991; Penfield & Boldrey, 1937; Penfield & Rasmussen, 1952; Strick & Preston, 1978; Woolsey et al., 1952). La estimulación eléctrica de baja intensidad (<20 μA) en regiones específicas del área motora primaria, provoca movimientos rápidos y de baja latencia (Graziano, Taylor, Moore, et al., 2002; Rizzolatti et al., 1998, 2002). INTRODUCCIÓN 4. Organización del sistema motor de los mamíferos. 25 Área motora suplementaria (SMA). En experimentos de microestimulación realizados en el córtex del mono, además de poner de manifiesto un mapa corporal somatotóptico completo en M1 (“homúnculo motor”, (Penfield & Rasmussen, 1952), también revelaron una representación motora adicional o suplementaria sobre la superficie cortical medial, ubicada en el límite rostral de M1. Los umbrales de excitación son superiores a los encontrados en M1 (10-30 μA). A pesar de que la velocidad y el tiempo de respuesta de los movimientos son similares (los movimientos provocados son rápidos y de baja latencia), la naturaleza de los movimientos es diferente, bajando la proporción de movimientos simples provocados en comparación con el área M1. Así, el área SMA está más implicada en el control de movimientos complejos y de iniciación interna que en el control de los movimientos simples (Alexander & Crutcher, 1990; Kurata & Wise, 1988; Tanji et al., 1980). Córtex premotor dorsolateral. Se ha dividido en un área premotora dorsolateral caudal y rostral. Los circuitos en los que participa el área premotora dorsolateral caudal podrían estar implicados en la planificación y control de los movimientos de las extremidades superiores e inferiores, en función de la información somatosensorial y visual. Específicamente, estos circuitos podrían estar relacionados con la monitorización y el control de la posición de las extremidades durante la fase de desplazamiento hacia un punto concreto del espacio. Por otro lado, se plantea que los circuitos que involucran el área premotora dorsolateral rostral podrían estar relacionados con la localización espacial de estímulos, como paso previo a la ejecución de los movimientos de agarre. Además, podría desempeñar un papel en el control de los movimientos oculares que se realizan en conjunto con los movimientos de la cabeza (Geyer et al., 2000; Olson & Gettner, 1995, 1996). Córtex premotor ventrolateral. Se distingue una región caudal y otra rostral (Barbas & Pandya, 1987; Geyer et al., 1997; Matelli et al., 1985; Matelli & Luppino, 1996; Petrides, 2000; Von Bonin & Bailey, 1947). La región rostral podría formar parte de un circuito encargado de realizar la codificación de las propiedades geométricas intrínsecas de los objetos y transformar esta información en INTRODUCCIÓN 4. Organización del sistema motor de los mamíferos. 26 movimientos dirigidos a metas específicas, podría convertir las características visuales de los objetos en actos motores aparentemente almacenados en esos circuitos (Graziano, Taylor, & Moore, 2002; Jeannerod et al., 1995; Rizzolatti et al., 1998, 2002; Rizzolatti & Luppino, 2001). La región caudal podría formar parte de un circuito cortical implicado en la codificación del espacio peripersonal y en la transformación de las posiciones de los objetos en el espacio en movimientos apropiados dirigidos hacia ellos (Rizzolatti et al., 1998, 2002). En el control motor subcortical, los ganglios basales, compuestos por distintos núcleos subcorticales interconectados entre sí, desempeñan funciones conductuales motoras, cognitivas emocionales y relacionadas con la memoria. Cada circuito se origina en un área específica de la corteza cerebral e implica a diferentes partes de los ganglios basales y del tálamo, es decir, cada área de la neocorteza envía, de forma topográfica, proyecciones a una región determinada del cuerpo estriado (Webster, 1961, 1965; Wise et al., 1996). Los núcleos de los ganglios de la base reciben sus principales aferencias del tálamo y del córtex cerebral, y envían sus señales eferentes hacia el córtex, el tálamo, y algunos núcleos tronco-encefálicos. Parece que tienen un papel importante en la realización de movimientos secuenciales y automáticos, en el aprendizaje motor y en los mecanismos que participan en los aspectos motores de recompensa (Doya, 2000; Kimura, 1995; Schultz, 1994; White, 1997). Los principales núcleos de los ganglios basales son: el cuerpo estriado, el globo pálido, la sustancia negra y el núcleo subtalámico. El cuerpo estriado constituye el principal centro receptor de señales nerviosas de los ganglios de la base y envía información al globo pálido y a la sustancia negra. A su vez, desde el globo pálido y sustancia negra se originan las principales eferencias de los ganglios basales hacia otras estructuras como el tálamo (Ewert, 1970; Gonzalez & Russchen, 1988; Luppino et al., 1993; Marín et al., 1998; Masino & Grobstein, 1990; Parent, 1986, 1990; Smeets & Medina, 1995). En cuanto al sistema de control oculomotor en los mamíferos y la presencia de campos oculomotores frontales en el neocórtex, la estimulación eléctrica INTRODUCCIÓN 4. Organización del sistema motor de los mamíferos. 27 de determinadas áreas del córtex frontal prearcuado, lóbulo parietal inferior y córtex preoccipital en primates y otros mamíferos, provoca movimientos oculares conjugados contralaterales. Estas regiones parecen estar estructuradas en dos sistemas de control para la generación de movimientos oculares (Schiller & Tehovnik, 2001): el sistema anterior, constituido por el campo oculomotor frontal y el campo oculomotor dorsomedial o suplementario y el sistema posterior, integrado por áreas del lóbulo parietal y occipital. Antes de llevar a cabo movimientos oculares dirigidos, ambos sistemas se activan en paralelo (Leichnetz & Goldberg, 1988). En cuanto al área oculomotora frontal (AOF), Bruce y colaboradores (1985) ubicaron la frontera del córtex oculomotor frontal en el segmento más caudal del margen rostral del surco arqueado, usando como criterio las regiones desde las cuales era posible inducir movimientos oculares en primates con una intensidad inferior a 50μA. En humanos, aunque existen ligeras diferencias en cuanto a su localización, se ha identificado el córtex oculomotor mediante técnicas de emisión de positrones y de resonancia magnética funcional (Luna et al., 1998; Paus, 1996). La estimulación eléctrica del córtex oculomotor evoca movimientos oculares sacádicos que consisten en vectores fijos cuya dirección y amplitud no dependen de la posición inicial del ojo en la órbita (Robinson & Fuchs, 1969). Cuando se estimula el AOF con trenes largos de pulsos eléctricos, se produce una cascada de sacadas de la misma amplitud, alternadas con fijaciones (Robinson & Fuchs, 1969), lo que se ha interpretado como un indicio de codificación retinotópica del movimiento. Tanto la intensidad de estimulación requerida como las latencias de los movimientos oculares que se generan por la estimulación del córtex oculomotor frontal son menores que en otras regiones del córtex cerebral. Y la ablación del AOF o su inactivación con muscimol provoca graves alteraciones en la realización de algunas tareas como la selección de dos blancos presentados simultáneamente, la ejecución de movimientos oculares secuenciales dirigidos a una serie sucesiva de blancos y movimientos oculares hacia un blanco presentado durante un breve periodo de tiempo (Tehovnik et al., 2000). En cuanto al área oculomotora suplementaria (AOS), en el lóbulo frontal existe otro campo oculomotor denominado campo oculomotor frontal dorsomedial 1. Métodos 34 Experimento 1: Delimitación y caracterización funcional del área somatosensorial del palio del telencéfalo mediante la técnica de registro óptico con fluorocromos sensibles al voltaje. En un primer experimento nos propusimos identificar y caracterizar las regiones del palio de la carpa dorada implicadas en el procesamiento somatosensorial. Experimentos previos realizados en nuestro laboratorio sugieren la presencia de una área especializada en el procesamiento somatosensorial localizada en la región más caudal de Dm (Ocaña, 2009; Reiriz-Rojas, 2017). En el presente experimento registramos la actividad del palio del telencéfalo de la carpa dorada en respuesta a la estimulación con diferentes tipos de estímulos somatosensoriales con objeto de localizar las zonas activadas por esta modalidad, así como su correspondencia con fronteras macroscópicas y citoaquitectónicas. Así mismo nos propusimos analizar otras características funcionales del área somatosensorial, como la posible codificación de la intensidad del estímulo o su posible organización somatotópica. Dado que las áreas motoras en el palio de mamíferos y aves están frecuentemente asociadas con áreas receptoras somatosensoriales, la identificación de un área somatosensorial en el palio de carpa dorada podría ser utilizada también como un punto de partida en la búsqueda de una posible área somatomotora del palio de los teleósteos. 1. Métodos. 1.1. Sujetos. Para este experimento se utilizaron un total de 14 carpas doradas (Carassius auratus) suministradas por el Servicio de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. Los peces tenían un tamaño de entre 12 y 16 cm de longitud y fueron alojados, al menos una semana antes de los experimentos, en pequeños grupos en tanques de 150L de agua filtrada y aireada a una temperatura constante de 19ºC±1ºC y un ciclo de iluminación de 12 horas de luz y 12 horas Experimento 1. 1. Métodos 35 de oscuridad y fueron alimentados dos veces al día con pellets de comida seca (TetraPond PondSticks, Alemania). Todos los procedimientos experimentales de este trabajo se realizaron conforme a las normas de experimentación animal reguladas por el Real Decreto 53/2013 y las recomendaciones de la Directiva 2010/63/UE del Consejo de la Comunidad Europea. 1.2. Cirugía y preparación del animal para el procedimiento de registro óptico. Para la cirugía, los animales fueron anestesiados mediante inmersión en una solución 1:20.000 (peso/volumen) de metanosulfato de tricaína (MS222, Sigma- Aldrich Chemie Gmbh, Steinheim, Alemania), dicha solución se tamponó con bicarbonato sódico hasta alcanzar el pH original del agua del tanque de residencia. La cirugía se realizó en una pecera quirúrgica de metacrilato transparente en la que los animales quedaban inmovilizados mediante dos palas curvadas que se ajustaban al cuerpo del animal. Para hidratar la piel se emplearon gasas de algodón y una película de polietileno entre el cuerpo del animal y las palas. Se garantizó la respiración del animal mediante un tubo conectado a un sistema de bombeo que proporcionaba un flujo constante de agua aireada en la boca del animal. La concentración de anestésico en el circuito de agua se mantuvo constante y al nivel requerido hasta que concluyó el procedimiento quirúrgico. El nivel de oxígeno diluido se mantuvo mediante un aireador sumergido en el agua de la pecera. Todo el procedimiento quirúrgico se realizó bajo control visual con un microscopio binocular (SZ-61, Olympus). Inicialmente se retiró la piel de la región del cráneo, previa aplicación de un antiséptico tópico (povidona yodada, Betadine). En concreto, se retiró la piel necesaria para acceder a la porción del cráneo dorsal a los hemisferios telencefálicos y se aplicó cianocrilato para mejorar la adherencia de la superficie durante la posterior fijación de los elementos necesarios para la preparación del registro óptico. Una vez retirada la piel, se realizó una craneotomía a nivel del telencéfalo siguiendo las referencias anatómicas de las cisuras craneales, las narinas, los ojos y el conducto vestibular. El tejido graso Experimento 1. 1. Métodos 36 de la cavidad craneal fue aspirado mediante una pipeta de vidrio unida a un sistema de vacío controlado manualmente. Finalmente, el tejido meníngeo se retiró cuidadosamente de modo que los dos hemisferios telencefálicos quedaban totalmente expuestos y accesibles para su manipulación. Previo a la recuperación del animal, se fijó la cabeza del animal con unas barras de fijación laterales ancladas en la pecera quirúrgica. Tras la cirugía, el agua con anestésico que irrigaba las agallas fue sustituida por agua del acuario de residencia, de modo que en un plazo máximo de 45 minutos los animales mostraban claros signos de recuperación (movimientos espontáneos oculares, operculares y de las aletas). Todos los experimentos de registro óptico se realizaron con el animal despierto. Una vez comprobada la recuperación total del animal, los sujetos fueron paralizados con una inyección intramuscular de curare (0,002mg/g de peso del animal; cloruro de d-tubocurarina, Sigma-Aldrich) para evitar los artefactos que pudieran darse en el registro óptico por los movimientos del animal. Se utilizó Di-2-ANEPEQ (JPW 1114; Molecular Probes) como fluorescente sensible al voltaje por su solubilidad en agua y su alta resolución temporal, que permite detectar rápidamente los cambios en el potencial de membrana de las células. Se diluyó la solución stock (0,5 mg/ml) al 0,1% en 225µl de una solución de Ringer (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2 y 5 mM HEPES, pH = 7.2; todos los compuestos de Sigma- Aldrich), a una concentración final de 55µg/ml. El fluorescente se aplicó mediante un baño de un volumen de 200 µl durante 45 minutos seguidos de 3 lavados en Ringer para eliminar el exceso de fluorescente no fijado a las membranas celulares. Experimento 1. 1. Métodos 37 Leve descarga eléctrica Chorro de agua Videocámara de alta velocidad Luz fría Luz de excitación Filtro de excitación (530±10nm) Espejo dicroico Filtro de absorción (>590nm) Figura 1. Vista esquemática de la preparación experimental utilizada para el registro óptico de la actividad palial ante estímulos somatosensoriales. La imagen muestra el animal en la pecera experimental, el sistema de registro óptico con los filtros de excitación y absorción, la videocámara de alta velocidad, así como la disposición de los estímulos somatosensoriales empleados (chorro de agua y leve descarga eléctrica). 1.3. Registro óptico de la actividad neural. Los cambios en la fluorescencia de Di-2-ANEPQ producidos en respuesta a los cambios de potencial de membrana fueron registrados mediante un equipo comercial de registro óptico (MiCAM01, Scimedia Ltd., USA), que consiste en un microscopio de epifluorescencia (THT; Scimedia) acoplado a la fuente de iluminación (con alto poder de iluminación) (MHF-G150LR; Moritex) y a una cámara de alta resolución con un sensor CCD (ICX076AL, Sony Inc, Tokyo) conectada al software de adquisición (MiCAM01; Scimedia, Brain Vision, 2000; Figuras 1 y 2). El microscopio de epifluorescencia se colocó sobre una mesa antivibratoria (63-540; TMC) con el objetivo de minimizar los artefactos debidos a la vibración de la preparación. Las imágenes fueron adquiridas con el software MICAM a 166 Hz (6 ms/fotograma). El campo de imagen se focalizó en la superficie dorsal del telencéfalo, de forma perpendicular a ésta. La excitación del tejido neural se llevó a cabo mediante un haz de luz emitido por la fuente de iluminación, que pasó Experimento 1. 1. Métodos 38 a través de un filtro de excitación de 530±3nm. La iluminación del telencéfalo y la recogida de la fluorescencia emitida por la señal neural palial se realizaron a través del mismo microscopio gracias a un espejo dicroico. El microscopio estaba equipado con un objetivo 0.63x (PLAN APO; Leica Microsystems) y con una lente condensadora de 0.63x o de 1x (PLAN APO; Leica Microsystems) en función de la amplitud de campo deseada. Para evitar que los sujetos detectaran la luz verde que excitaba el fluorescente se fijó una tela opaca alrededor de la abertura del cráneo que posteriormente se extendió alrededor de la pecera experimental impidiendo la estimulación de las retinas del animal por la luz procedente del sistema de registro óptico. Además, el animal fue iluminado con una luz blanca situada en los laterales de la pecera experimental la cual impedía que la luz verde del sistema se reflejase en las paredes de la pecera contribuyendo a enmascarar la luz procedente del sistema de registro óptico. La adquisición de las señales ópticas se realizó mediante el software ‘Experimenter’ (MiCAM01, Scimedia Ltd, USA) con el cual se pueden controlar todos los parámetros de la videocámara (frecuencia de muestreo, número de fotogramas, luminosidad, contraste, etc) y los del proceso de adquisición (número de promediados, tiempo entre ensayos, etc). Para evitar el ruido mecánico de la apertura del obturador, se programó la adquisición de la señal 300ms después de que éste se abriese, además, los estímulos se presentaron siempre respetando una línea base de 300ms desde el inicio del registro. Cada ensayo consistió en películas de 341 fotogramas con una frecuencia de adquisición de 166Hz por lo que la señal de fluorescencia se registró durante un periodo de 2.046 ms. La sincronización de los estímulos con la señal de registro óptico se realizó a través de una señal TTL que se enviaba para disparar el estimulador (Cygnus P400, A-M Systems) desde el que se controlaban los parámetros de duración y frecuencia de los estímulos somatosensoriales. Experimento 1. 1. Métodos 39 Dm4 Dm2 Dm1 Dm3 Dldm Dm4 Dm1 Dld Dm4m Dm4l Dm1 Dm1 Dm2 Dm3 Dm4 Dld A B C Dldr Dldc Dldm Dldr Dldc Figura 2. A. Representación esquemática de la ventana craneal practicada para el registro óptico. B. Fotografía de la visión dorsal del telencéfalo de la carpa dorada. Se indican las principales subdivisiones anatómicas del palio del telencéfalo. C. Fotografía de la visión dorsal de los hemisferios telencefálicos obtenida con el sistema de registro óptico tras la tinción de la superficie palial. Los datos obtenidos fueron tratados con el programa de análisis BV_Analyzer (Scimedia Ltd., USA). Las imágenes obtenidas fueron filtradas con un filtro espacial de 9x9, filtro mediano de 3x3 y filtro cúbico de 3x3. Para evaluar los cambios de intensidad de la señal óptica, se utilizó dF (F-F0), definida como la diferencia de fluorescencia en cada momento respecto al valor de fluorescencia inicial (F0). En los mapas de calor obtenidos, la magnitud de la respuesta fue desde el color rojo que corresponde a la mayor despolarización de la membrana hasta el color verde que representa la menor despolarización y los tonos azules indican hiperpolarización. Los descensos de fluorescencia se representaron en las curvas de actividad como deflexiones positivas. Se promediaron 10-15 ensayos para aumentar la relación señal-ruido. 1.4. Estímulos somatosensoriales. Se emplearon dos tipos de estímulos somatosensoriales, una leve estimulación eléctrica en la piel y una estimulación táctil mediante un chorro de agua dirigido al cuerpo del animal. Ambos estímulos se aplicaron en la base de la aleta dorsal en su extremo rostral (Figura 1). En los experimentos realizados para determinar la posible existencia de una organización somatotópica los estímulos se ubicaron en la boca, lomo y base de la aleta caudal. Experimento 1. 2. Resultados. 40 Estímulo eléctrico en la piel. El estímulo eléctrico consistió en una leve estimulación eléctrica aplicada mediante un electrodo bipolar de acero inoxidable de 100μm de diámetro situado próximo a la raíz de la aleta dorsal. El electrodo estaba conectado a una unidad de aislamiento de corriente continua (SIU9A, A-M Systems) controlada por un estimulador digital (Cygnus P400, A-M Systems) desde los que se programaba la intensidad y duración del estímulo, respectivamente. La duración del estímulo fue de 150μs y se emplearon intensidades de corriente de 0,1 a 1 mA. Estimulación táctil de la piel mediante un chorro de agua. El estímulo consistió en un chorro de agua aplicado en la superficie de la piel mediante un catéter de 0.8x25mm de diámetro conectado a una jeringa de 60 ml. El estímulo se situó próximo al electrodo bipolar utilizado para la estimulación eléctrica. El estímulo era activado por una bomba programable (Aladdin, WPI, USA) que estaba conectada al estimulador. La duración del estímulo fue de 200 ms. En ambos tipos de estimulación el intervalo entre estimulaciones fue de 60 seg. La sincronización de los estímulos con la señal de registro óptico se realizó a través de una señal TTL que se enviaba al estimulador (Cygnus P400, A-M Systems). 2. Resultados. Identificación y delimitación del área somatosensorial. Para identificar y delimitar el área somatosensorial en el palio telencefálico de la carpa dorada, se emplearon los dos tipos de estímulos anteriormente descritos, un chorro de agua y un estímulo eléctrico en la piel. Los resultados ponen de manifiesto la existencia de un área somatosensorial ubicada en la región Dm4 del palio telencefálico de la carpa dorada. La estimulación somatosensorial, tanto mediante el choque eléctrico como mediante un chorro de agua en la base de la aleta dorsal provocó un patrón espacio-temporal de actividad neural de características similares. Experimento 1. 2. Resultados. 41 En todos los sujetos experimentales se observó una activación inicial de la zona medial de la región Dm4, que se extendió más tarde a través de toda la mitad medial de Dm4, pero se mantuvo siempre circunscrita dentro de los límites anatómicos de Dm4 (Figura 3). El análisis de las curvas de actividad mostró una fase inicial que concluyó con la despolarización máxima seguida del descenso de la señal óptica (Figura 3). Dm4 contra Dm4 ipsi 00.5 1 dF -2 2 6 10 00.5 1 dF -2 2 6 10 00.5 1 -2 2 6 Estim. Tiempo(s) min max Chorro de agua Chorro de agua dF 00.5 1 -2 2 6 dF Contra Ipsi * * * * Choque eléctrico leve Choque eléctrico leve * * * * 198ms 318ms 390ms 720ms 294ms 450ms 534ms 810ms210ms 84ms 108ms 192ms 210ms 300ms 78ms 204ms 306ms 432ms 474ms #221124 #221124 #221207 #221207 Figura 3. Actividad somatosensorial evocada en el palio telencefálico. La secuencia de fotogramas muestra la actividad palial evocada tras la estimulación con un choque eléctrico leve y con un chorro de agua en dos animales experimentales. Nótese como en todos los sujetos la mayor despolarización ante la presentación de ambos tipos de estímulos somáticos se observa en la región medial del área Dm4. A la derecha de cada fila se muestran las curvas de actividad (dF) de la región medial de Dm4 (asterisco) en los hemisferios ipsi- y contralateral al lado de presentación del estímulo. La flecha azul señala el momento de la estimulación. Para un análisis más detallado de la actividad somatosensorial evocada en todo el palio telencefálico, se procedió a delimitar distintas regiones de interés (RDI), Dm1, Dm2, Dm3, Dm4 y Dldm, en el hemisferio ipsi- y contralateral al lado de presentación del estímulo somatosensorial eléctrico y se cuantificó en cada Experimento 1. 2. Resultados. 42 una de ellas la pendiente de la curva de actividad evocada y la amplitud de la actividad pico. Para la medida de amplitud pico se estableció una línea base de 100ms previos a la presentación del estímulo. Se calculó la amplitud pico como el valor máximo menos el valor medio de la línea base. Para ello, se extrajo el valor de amplitud máxima de cada región promediando sus píxeles. Para la medida de pendiente de la actividad, se estableció una ventana temporal de 200ms tras la presentación del estímulo y se calculó en esa ventana la media de la derivada instantánea. Los valores de amplitud pico y pendiente se normalizaron mediante la estandarización de puntuaciones Z a todos los píxeles que conformaban cada región. Los valores de cada una de las regiones se compararon mediante un ANOVA de un factor con correcciones de Bonferroni y se graficaron en matrices de comparación. Las comparaciones post-hoc mostraron que la amplitud pico de la respuesta evocada y la pendiente de la actividad fueron significativamente mayores en la región Dm4 medial contralateral que la observada en las otras regiones paliales (Dm1, Dm2, Dm3, Dm4 lateral y Dldm; todas las p<0.05; Figura 4), indicando que la actividad evocada en el palio ante la estimulación somatosensorial se circunscribe a una región específica de la parte medial del área Dm4 del hemisferio contralateral al lado de estimulación (Figura 4). También se adquirieron las imágenes de registro óptico con una lente objetivo de 1x para delimitar con mayor precisión la ubicación y extensión máxima de la respuesta evocada por la estimulación somatosensorial. Los resultados confirmaron que la actividad inicial tras la estimulación somatosensorial se localizaba en la región medial de Dm4 en todos los sujetos extendiéndose posteriormente por toda la mitad medial de la región Dm4 (Figura 5). Experimento 1. 2. Resultados. 43 Dldm Dm4m Dm4l Dm3 Dm2 Dm1 Dldm Dm4m Dm4l Dm3 Dm2 Dm1 Dm4m Dm4l Dm3 Dm2 Dm1 Dm4m Dm4l Dm1 Dm3 Dm2 Dldm Dm4m Dm4l Dm3 Dm2 Dm1 Dldm Dm4m Dm4l Dm3 Dm2 Dm1 Dm4m Dm4l Dm3 Dm2 Dm1 Dm4m Dm4l Dm1 Dm3 Dm2 Amplitud pico (dF) Contra Ipsi Dm4m Dm4l Dm3 Dm2 Dm1 DldmDm4mDm4l Dm3 Dm2 Dm1 Pendiente (dF) Contra Ipsi Dm4m Dm4l Dm3 Dm2 Dm1 Dldm Dm4mDm4l Dm3 Dm2 Dm1 0 2 4 6 0 2 4 n.s. p<0.05 p<0.001 p<0.0001 n.s. p<0.01 p<0.001 p<0.0001 Contra Ipsi Contra Ipsi A B Figura 4. Actividad somatosensorial en las diferentes áreas paliales. Las gráficas muestran la amplitud pico (A) y la pendiente (B) de la actividad palial evocada por la estimulación somatosensorial en las diferentes RDI de los hemisferios ipsi- y contralateral a la estimulación. En la parte inferior se representan esquemáticamente las comparaciones estadísticas de las variables amplitud pico y pendiente entre las distintas regiones de ambos hemisferios. Dm4m y Dm4l, partes medial y lateral de la región Dm4, respectivamente. Dm3 Dm4 Inicial Máxima #210318 #210405 #210526 #210604 Max Min Dm3 Dm4 Figura 5. Localización de la actividad inicial y máxima de la respuesta evocada por la estimulación somatosensorial mediante un estímulo eléctrico leve. Los fotogramas en la fila superior muestran el momento en el que la despolarización alcanza el umbral (20% de la actividad máxima registrada) y los de la fila inferior el momento en el que se alcanza la despolarización máxima en cuatro sujetos experimentales representativos. En la parte derecha de la figura se representan superpuestos los contornos de la actividad inicial y máxima de los cuatro sujetos. Nótese cómo la actividad somatosensorial se circunscribe a los límites de Dm4 sin rebasar el surco que separa Dm4 de Dm3 e invadir la región Dm3. 1. Métodos. 50 Experimento 2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Figura 9. Set experimental. Se muestra el acuario experimental con el comedero en su posición habitual y un ejemplo ilustrativo de la trayectoria de aproximación de un animal al comedero. 1.3. Procedimiento experimental. Entrenamiento en la tarea motora. Cuatro días antes del inicio de las sesiones experimentales, los animales se mantuvieron en privación de alimento. El entrenamiento comenzaba con una fase de manipulación y una fase de habituación, tras la cual los animales pasaban a la fase de entrenamiento en la tarea. Una vez adquirida la destreza motora para una eficiente extracción del pellet de comida los animales fueron sometidos al procedimiento quirúrgico: ablación bilateral de Dm4 o control de operación (n=5, cada uno) y tras un periodo de recuperación fueron nuevamente entrenados en una fase de entrenamiento postquirúrgica (Figura 10). Uno de los animales del grupo control de operación desarrolló una infección y fue retirado del experimento por lo que el tamaño final de los grupos fue: ablación bilateral de Dm4 (n= 5) y control de operación (n=4). 1. Métodos. 51 Experimento 2. Días 1-3 Test campo abierto EntrenamientoHabituación Días 4-7 Día 7 Lesión Recuperación Test campo abiertoRe-entrenamiento Días 13-16 Día 8 Días 9-12 Día 16 Días 1-3 EntrenamientoHabituación Días 9-12 Lesión Recuperación Día 4 Días 5-8 Figura 10. Secuencia temporal del procedimiento experimental. Habituación. Esta fase se realizó en dos etapas. En una primera etapa, los animales se familiarizaron con el contacto físico repetido con las manos del experimentador durante una sesión de 25 minutos. Esta sesión de manipulación de los sujetos experimentales se realizó durante un solo día y se llevó a cabo en un pequeño acuario con medidas de 42x41x25cm (largo x ancho x alto). El objetivo de esta primera etapa en la fase de habituación fue acostumbrarlos al contacto con el experimentador para así reducir al máximo posible el estrés al que pudieran estar expuestos estos animales durante el experimento. En una segunda etapa se expuso gradualmente a cada animal tanto al acuario experimental como al comedero de forma que se fueran habituando al aparato experimental y familiarizando con el procedimiento de extracción del pellet. Esta etapa de la habituación fue dividida en tres fases: La primera fase, de un único ensayo, consistía en habituar a los animales a un comedero en el que se colocaban 5 pellets en el borde del vaso de cristal. En una segunda fase de habituación se utilizó ya el comedero experimental habitual con el tubo de látex insertado en el centro del vaso, pero de forma que el pellet que contenía sobresalía un centímetro del borde del comedero. Finalmente, en una tercera fase el extremo superior del pellet quedó enrasado con el borde del vaso. A diferencia de la fase I, en las fases II y III de la habituación se realizó una sesión de cuatro ensayos. Se estableció como criterio para determinar que el animal se había habituado al set experimental y al comedero que en cada ensayo el sujeto comiera 4 de los 5 pellets a los que tenía acceso en la primera fase de la habituación. En la segunda 1. Métodos. 52 Experimento 2. y tercera fases de habituación, se estableció como criterio que el animal ingiriera 2 pellets de los 4 posibles de cada sesión. Entrenamiento. Una vez alcanzado el criterio establecido en la fase de habituación los animales pasaron a la fase de adquisición de la tarea motora. Durante esta fase se realizaron 4 sesiones de 4 ensayos diarios, cada una de ellas con una duración máxima de 5 minutos por ensayo. En los ensayos de entrenamiento se expuso al animal al comedero con el pellet situado a un centímetro por debajo del borde del vaso, lo que requería una secuencia más compleja de movimientos para conseguir extraerlo. Esta nueva posición del pellet de comida requería que el animal adoptase una postura vertical formando un ángulo de 90º con el fondo del acuario para introducir la cabeza en el vaso, sujetar el pellet con la boca y realizar un movimiento lateral brusco de la cabeza para extraerlo. Esta fase de entrenamiento prequirúrgico tenía como finalidad que los animales adquirieran destreza en la ejecución y coordinación de esta secuencia de movimientos. La tarea motora de extracción del pellet del comedero implicó el mantenimiento sostenido de la posición vertical durante varios segundos, lo que requería un juego compensatorio de las aletas pectorales y caudal en combinación con la musculatura axial para realizar un buen ajuste de sus movimientos corporales y de protrusión de la boca para poder agarrar el pellet y extraerlo con éxito. Una vez que los animales conseguían extraer el pellet permanecían en el acuario experimental durante 30 segundos. Si transcurría el tiempo máximo de 5 minutos sin extraer el pellet se retiraba al animal del acuario experimental y con esto se consideraba finalizado el ensayo. Exploración y locomoción en campo abierto. Para el estudio de los posibles efectos de la lesión del área Dm4 sobre la conducta locomotora se programaron dos sesiones de registro en campo abierto. La primera se llevó a cabo al finalizar el entrenamiento prequirúrgico y la segunda al finalizar el entrenamiento postquirúrgico (Figura 10). Cada una de las sesiones 1. Métodos. 53 Experimento 2. consistió en el registro de la conducta del animal durante dos bloques consecutivos de quince minutos cada uno (30 minutos en total cada sesión). El registro de la conducta locomotora en campo abierto se llevó a cabo en un tanque cuadrado de 85.5 cm de lado y 28 cm de altura situado en una habitación experimental aislada de estímulos externos. Las paredes del tanque estaban cubiertas con planchas de metacrilato blanco. La conducta del animal se analizó mediante un sistema de Videotracking (Any-Maze Stoelting) conectado a una videocámara situada en el techo sobre el centro del tanque. Para el análisis del patrón exploratorio el área del campo abierto se dividió en dos regiones, una periférica y otra central. La región central se definió como un área cuadrada de 40.5cm de lado situado en el centro del tanque experimental. La región periférica se definió como el espacio comprendido entre las paredes del tanque y los límites del cuadrado central. Finalizada la fase de entrenamiento y de test en el campo abierto, se procedió a realizar la cirugía. Reentrenamiento tras lesión. Para evaluar el efecto de la lesión sobre la ejecución de la tarea motora previamente aprendida, tras los cuatro días establecidos para la recuperación de la cirugía, los animales fueron reentrenados en las mismas condiciones que en la fase de entrenamiento previa. Esta fase de reentrenamiento constó de 4 sesiones de 4 ensayos diarios cada una con una duración máxima de 5 minutos por ensayo (Figura 10). Procedimiento quirúrgico. La fase inicial del procedimiento quirúrgico, que consistió en la preparación del animal y la craneotomía para dejar expuestos los hemisferios telencefálicos, se realizó de la misma manera que la descrita en el experimento anterior (véase Experimento 1, apartado 1.2.). Una vez expuestos los hemisferios, se procedió a la ablación bilateral de la región Dm4 bajo control visual mediante una pipeta de vidrio conectada a un sistema manual de vacío. Las referencias anatómicas empleadas para realizar la ablación fueron los surcos ipsiliforme y caudal. 1. Métodos. 54 Experimento 2. Dichas referencias fueron usadas también con posterioridad en la determinación de la localización y extensión de las lesiones. El grupo de animales control de operación fue sometido al mismo procedimiento quirúrgico, pero sin dañar el tejido neural. Una vez finalizada la cirugía se procedió a la reposición del hueso retirado en la craneotomía y a sellarlo con adhesivo quirúrgico (cianocrilato). Tras finalizar el procedimiento quirúrgico el agua con anestesia que irrigaba las agallas fue sustituida por agua del acuario de residencia, hasta que los animales mostraron claros signos de recuperación de la sedación (movimientos espontáneos operculares, oculares y de las aletas). Tras la recuperación los peces fueron devueltos al acuario de residencia en el que permanecieron durante un periodo post operatorio de 4 días antes del inicio de la fase de entrenamiento postquirúrgico. Análisis histológico de la localización y extensión de las lesiones. Tras finalizar los procedimientos experimentales se procedió a realizar el análisis histológico de la localización y extensión de las lesiones. Para ello, los animales fueron sometidos a perfusión transcardíaca tras sobredosis de anestésico en una solución 1:5000 de metanosulfato de tricaína (MS222, Sigma-Aldrich) en agua tamponada del acuario de residencia. Una vez alcanzado el punto de no recuperacion se procedió a la perfusión con una solución tamponada de fosfato salino (1M TFS, pH= 7.4) seguida de una solución fijadora compuesta por metanol, acetona y agua destilada (MAW) en una proporción 2:2:1. Tras la perfusión se realizó la extracción de los cerebros y se postfijaron en la misma solución fijadora antes de su inclusión en parafina. Tras su inclusión en parafina, los cerebros fueron cortados en secciones sagitales de 20 μm de grosor con un microtomo rotatorio (Leica RM-2125RT). Las secciones fueron montadas en orden seriado en portaobjetos gelatinizados, teñidas mediante el método de Nissl con acetato de cresilo al 5% y cubiertas con resina (DPX) y con cubreobjetos. Para el análisis de la localización y extensión de las lesiones se delimitó el área dañada en cada sujeto sobre un atlas de secciones sagitales consecutivas de 20 μm de grosor del telencéfalo de la carpa dorada (Figura 11). 1. Métodos. 55 Experimento 2. TO Tel Dm4 TO Tel Dm4Dm4 A CB d c ba d c b a Dm3 Dm2 Dm1 Dld TO Figura 11. Análisis histológico. A. Reconstrucción de la localización y extensión máxima (azul oscuro) y mínima (azul claro) de las lesiones del área Dm4 sobre una visión dorsal y sobre 4 secciones parasagitales. B-C. Fotomicrografía de un cerebro con lesión en el área Dm4 (B) y de otro animal control de operación (C). Las flechas señalan el tejido lesionado. Tel, telencéfalo; TO, techo óptico. Las reconstrucciones mostraron que las lesiones eran homogéneas en su tamaño y que todas ellas afectaban a la región Dm4, sin afectar a la región Dm3 ni a la región dorsoposterior (Dp). Por otra parte, no se observaron daños en el palio telencefálico en los sujetos del grupo control de operación. En la Figura 11a,b se muestra una fotomicrografía representativa del telencéfalo de un animal lesionado y de un animal control, así como una reconstrucción de la extensión máxima y mínima de las lesiones. 2. Resultados. 56 Experimento 2. 2. Resultados. Para presentar los resultados, en primer lugar, se detallará el proceso de adquisición de la tarea motora, a continuación, se comparará la ejecución postquirúrgica en la tarea motora de los animales con lesión en Dm4 y los animales control de operación con la ejecución prequirúrgica y finalmente se analizarán los efectos de la lesión sobre la actividad en el campo abierto. Adquisición de la tarea motora. Para el análisis del proceso de adquisición de la secuencia coordinada de movimientos corporales y bucales para agarrar y extraer el pellet de comida, así como de los posibles efectos de la lesión del área Dm4 sobre esta destreza motora, se seleccionaron y analizaron una serie de variables representativas. Las variables analizadas fueron: número de errores de alcance del pellet, duración de la respuesta de extracción, tiempo hasta adoptar la posición vertical necesaria para la extracción del pellet, tiempo que se mantenía la posición vertical y ángulo de inclinación del cuerpo durante la extracción del pellet. Los análisis cualitativos y cuantitativos de estas variables se realizaron mediante la visualización y análisis fotograma a fotograma (30 fotogramas por segundo) de las grabaciones de cada ensayo, mediante el programa de reproducción Windows media. El análisis de las variables ‘número de errores de alcance del pellet’, ‘duración de la respuesta de extracción’ y ‘tiempo hasta adoptar la posición vertical necesaria para la extracción del pellet’ mostró que la adquisición de la secuencia de movimientos coordinados de la musculatura axial, las aletas y la boca necesarios para la extracción del pellet de comida es el resultado de un proceso gradual de aprendizaje desde orientaciones corporales horizontales al comedero hasta el mantenimiento de orientaciones casi completamente verticales (Figura 12). En la Figura 12 se puede observar cómo el ajuste de los movimientos necesarios para la extracción del pellet ocurrió de forma gradual. En las primeras sesiones de entrenamiento la trayectoria que seguía el animal hasta el comedero y la orientación que adoptaba para la extracción del pellet eran prácticamente horizontales y por 2. Resultados. 57 Experimento 2. tanto muy poco eficientes para conseguir extraer el pellet, ya que esta postura horizontal no permitía introducir la cabeza en el vaso y alcanzar el pellet. Sin embargo, conforme avanzaron las sesiones experimentales, en su aproximación al vaso comedero, el animal fue adquiriendo una postura cada vez más vertical hasta finalmente posicionarse en un ángulo de aproximadamente 90º respecto al suelo, lo que les permitía introducir la cabeza en el vaso para agarrar el pellet con la boca y realizar un movimiento lateral brusco de la cabeza que requería la coordinación precisa de musculatura axial, aletas y boca y así conseguir extraer el pellet. Se realizó un ANOVA de medidas repetidas para comprobar si existían diferencias significativas en la orientación hacia el pellet a lo largo de las sesiones de entrenamiento (F(2,12)=365,29, p=.000). Al realizar las comparaciones múltiples post-hoc con las correcciones de Bonferroni se encontraron diferencias significativas entre todas las sesiones (todas las p<0.001). Por tanto, se puede concluir que a lo largo de las sesiones de entrenamiento se produjo un progresivo perfeccionamiento de la postura hasta alcanzar aproximadamente los 90º de orientación con el comedero necesarios para poder introducir la cabeza y extraer el pellet. 2. Resultados. 58 Experimento 2. 231015C 021215F 101115E 0º 60º 90º Inicio 30º Entrenamiento Final 0º 60º 30º 0º 60º 90º 30º 0º 60º 30º 0º 60º 90º 30º 0º 60º 30º A C B231015C 231015C 101115E 101115E 021215F 021215F Figura 12. Ejemplos ilustrativos de la adquisición y perfeccionamiento de las destrezas motoras y de ajuste postural a lo largo de las sesiones de entrenamiento (A-C). Las columnas de fotogramas muestran la evolución en la aproximación al comedero a lo largo de las sesiones de aprendizaje en tres animales representativos. Los esquemas de la derecha muestran ejemplos ilustrativos de la orientación del cuerpo de los animales (líneas azules) al comedero al inicio (arriba) y al final (abajo) de las sesiones de entrenamiento. Las líneas representan el ángulo de orientación del cuerpo, medido desde el extremo más rostral del cuerpo hasta el inicio de la aleta caudal. Igualmente, a lo largo de las sesiones de entrenamiento se observó una progresiva mejoría en el ajuste y precisión de la secuencia de movimientos bucales relevantes para la aproximación, agarre y extracción del pellet. En la Figura 13 se muestran ejemplos ilustrativos de los errores de alcance más típicos que solían cometer los animales en los primeros ensayos de entrenamiento, en los que era habitual que colisionaran con el borde del vaso (Figura 13A), o que al introducir la cabeza en el comedero ésta no se orientara con precisión hacia el pellet y por tanto no consiguieran agarrarlo (Figura 13B). Sin embargo, en las últimas sesiones de entrenamiento, una vez que el animal alcanzaba el comedero conseguía dirigir la boca con precisión para agarrar el pellet y realizar 2. Resultados. 59 Experimento 2. un movimiento lateral brusco de la cabeza para extraerlo exitosamente (Figura 13C). Inicio Final Entrenamiento B B A B C 231015C 231015C 231015C 101115D 101115D 101115D 270116i 270116i 270116i Figura 13. Ejemplos ilustrativos de errores de alcance del pellet en las sesiones iniciales de entrenamiento (A-B) y de orientaciones exitosas en la fase final (C). Se realizaron análisis estadísticos de las variables ‘número de errores de alcance’, ‘duración de la respuesta de extracción’ y ‘tiempo hasta adoptar la posición vertical’ mediante pruebas t para muestras relacionadas, una vez cumplidos los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas. Para cuantificar los errores de alcance se computó el número de veces que el animal se orientó erróneamente hacia el pellet antes de conseguir la extracción, bien colisionando con el filo del vaso, o bien introduciendo la cabeza en el interior del vaso, pero sin orientarla hacia el pellet (véase Figura 13A-B). El análisis de esta variable mostró una reducción significativa en el número de errores de alcance a lo largo de las sesiones de entrenamiento siendo estadísticamente significativa la 1. Métodos. 66 Experimento 3: Efectos de la lesión de la región Dm4 en el aprendizaje de la tarea motora. Los resultados del experimento anterior indican que la lesión del área Dm4 del palio de la carpa dorada, que contiene un área somatosensorial organizada en un mapa somatotópico, no produce déficits en la ejecución de una tarea motora compleja previamente aprendida, que requiere ajustes posturales complejos y la coordinación de los movimientos finos y graduados de aletas, musculatura axial y del aparato bucal. Estos resultados indican, por tanto, que el área somatosensorial de Dm4 no tiene funciones motoras y no participa en el control de los movimientos coordinados aprendidos requeridos para realizar dicha tarea motora. No obstante, aún cabría la posibilidad de que aunque el área Dm4 no fuera imprescindible para la ejecución de la tarea motora aprendida, sí tuviera un papel relevante en el aprendizaje de nuevas habilidades motoras, más que en el propio desempeño de las habilidades motoras aprendidas previamente. En mamíferos se ha propuesto que las áreas premotoras del neocórtex podrían tener un papel importante en el aprendizaje de nuevas destrezas motoras, más que en el propio desempeño motor (Bures & Bracha, 1990; Buresová et al., 1958; Burešová & Bureš, 1969; Castro, 1972b, 1972a, 1977; Islam & Burešová, 1975; Kolb & Whishaw, 1983; Price & Fowler, 1981; Whishaw et al., 1990, 1986). Para comprobar esta posibilidad alternativa, llevamos a cabo un experimento adicional en el que se evaluaron los posibles efectos de la lesión de Dm4 sobre el proceso de aprendizaje y perfeccionamiento de la tarea motora compleja anteriormente descrita. Para ello, en el presente experimento, se realizó la lesión bilateral en Dm4 antes de la fase de entrenamiento. Por lo tanto, si el área Dm4 estuviese implicada en algún aspecto del aprendizaje motor, debería esperarse un déficit en el aprendizaje de la tarea en los sujetos del grupo de lesión en Dm4 en comparación con los sujetos del grupo control. 1. Métodos. 67 Experimento 3. 1. Métodos. 1.1. Sujetos. Para llevar a cabo los experimentos del presente trabajo se emplearon 8 carpas doradas (Carassius auratus) suministradas por distribuidores locales, con una longitud de entre 12 y 14 cm medidos desde el extremo rostral a la base de la aleta caudal. Los peces permanecieron en pequeños grupos en acuarios de cristal en los que fueron mantenidos en las mismas condiciones que en el experimento anterior. Todos los procedimientos experimentales de este trabajo se realizaron conforme a las normas de experimentación animal reguladas por el Real Decreto 53/2013 y las recomendaciones de la Directiva 2010/63/UE del Consejo de la Comunidad Europea. 1.2. Equipamiento experimental. Las sesiones de entrenamiento se realizaron en un acuario experimental idéntico al empleado en el experimento anterior. El acuario experimental contenía un comedero idéntico al descrito en el experimento anterior. La conducta del animal se grabó con una cámara digital Canon (EOS 500D) montada sobre un trípode y situada en frente del acuario. La duración de los ensayos y el tiempo hasta la extracción del pellet se registraron con un cronómetro. 1.3. Procedimiento quirúrgico y análisis histológico. Antes de comenzar el experimento, los animales se dividieron en un grupo de lesión bilateral de la región Dm4 (n=4) y un grupo control de operación (n=4). El procedimiento quirúrgico que conllevaba la preparación del animal, la craneotomía para dejar expuesto los hemisferios cerebrales y la realización de la ablación bilateral fueron idénticos a los realizados en el experimento anterior (véase apartado 1.3 del experimento 2). 1. Métodos. 68 Experimento 3. Dm4Dm4 dcba d c b a Dm3 Dm2 Dm1 Dld Figura 19. Análisis histológico. Reconstrucción de la extensión máxima (verde oscuro) y mínima (verde claro) de las lesiones del área Dm4 sobre una visión dorsal y sobre 4 secciones parasagitales. Tras finalizar el procedimiento experimental se procedió a realizar el análisis histológico de la localización y extensión de las lesiones. El análisis histológico mostró que las lesiones eran homogéneas en su tamaño y que todas ellas se localizaban en la región Dm4, sin afectar a la región Dm3 ni a la región Dp. Por otra parte, no se observaron daños en el palio telencefálico de los sujetos del grupo control de operación. En la Figura 19 se muestra una reconstrucción de la extensión máxima y mínima de las lesiones. Días 1-3 Test campo abiertoEntrenamientoHabituación Días 4-7 Día 7 Lesión Recuperación Test campo abiertoRe-entrenamiento Días 13-16 Día 8 Días 9-12 Día 16 Días 1-3 EntrenamientoHabituación Días 9-12 Lesión Recuperación Día 4 Días 5-8 Figura 20. Secuencia temporal del procedimiento experimental. 2. Resultados 69 Experimento 3. 1.4. Procedimiento experimental. Al igual que en el experimento anterior, el procedimiento experimental comenzó con la fase de habituación y continuó con una fase de entrenamiento en la tarea motora (Figura 20). La fase de entrenamiento constó de 4 sesiones de 4 ensayos cada una con una duración máxima de 5 minutos por ensayo. Al igual que en el experimento anterior, en los ensayos de entrenamiento se expuso al animal al comedero con el pellet situado a 1 centímetro por debajo del borde del vaso, lo que requería el aprendizaje de una secuencia compleja de cambios posturales y movimientos coordinados de la musculatura axial, aletas y aparato bucal para conseguir sujetarlo con la boca y extraerlo. 2. Resultados. Para analizar el posible efecto de la lesión bilateral de Dm4 en el aprendizaje y perfeccionamiento de la destreza motora que posibilitaba la extracción del pellet, se cuantificó el ‘el tiempo hasta adoptar la posición vertical’, ‘el tiempo hasta que se extraía con éxito el pellet’, ‘la duración de la respuesta de extracción’, y ‘número de errores de alcance’, en las cuatro sesiones de entrenamiento. Para cada una de estas variables se realizó un ANOVA de medidas repetidas a lo largo de las 4 sesiones de entrenamiento y para cada uno de los grupos, lesión de Dm4 y control. Se realizó un análisis intergrupo para determinar si existían diferencias significativas entre los grupos en cada una de las variables analizadas. Se comprobó que la reducción en las puntuaciones en cada variable analizada a lo largo de las sesiones de entrenamiento fue similar en ambos grupos, no existiendo diferencias entre ellos (todas las p>0.05), lo que indica que la progresión del aprendizaje fue similar en los animales lesionados y control. Los análisis realizados muestran que existe un proceso de aprendizaje y perfeccionamiento de las destrezas motoras tanto en el grupo control como en el de lesión en Dm4. La reducción de las puntuaciones a lo largo de las sesiones de entrenamiento 2. Resultados 70 Experimento 3. fueron estadísticamente significativas en las variables tiempo hasta alcanzar la posición vertical (F(3,18)=13.90, p=.006; Figura 21), tiempo hasta extraer el pellet con éxito (F(3,18)=7.024, p=.003), duración de la respuesta de extracción (F(3,18)=7.786 p=.024) y número de errores alcance (F(3,18)=6.824, p=.003). 2 6 10 14 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 2 6 10 14 Sesiones Tiempo hasta la verticalidad (s) Tiempo hasta el éxito (s) Nº de errores de alcance Respuesta de extracción (s) n.s n.s n.s n.s 0 0 2 6 10 14 2 6 10 14 18 10 30 50 70 20 40 60 80 0 Nº de errores de alcance Respuesta de extracción (s) Tiempo hasta el éxito (s) Tiempo hasta la verticalidad (s) 1 2 3 4 Sesiones 1 2 3 41 2 3 41 2 3 4 SesionesSesiones Dm4 Control 80 20 40 60 Dm4 Control Figura 21. La lesión del área Dm4 no afecta al proceso de aprendizaje y perfeccionamiento de la destreza motora necesaria para realizar la tarea. Comparación de los efectos de las sesiones de entrenamiento sobre el tiempo hasta alcanzar la posición vertical, en el tiempo hasta la extracción del pellet con éxito, en la duración de la respuesta de extracción, y en el número de errores de alcance, en las cuatro sesiones de la fase de adquisición para el grupo control y el grupo de lesión en la región Dm4. No se observaron diferencias significativas en ninguna de las variables estudiadas. Finalmente se realizó un análisis estadístico mediante una prueba t para muestras independientes de las distintas variables en las dos últimas sesiones de entrenamiento (Figura 22). Los resultados mostraron nuevamente la ausencia de diferencias estadísticamente significativas en las variables analizadas, tiempo hasta la posición vertical (t(30)=.556 p=.583), tiempo hasta extraer el pellet (t(30)=.319 p=.752), duración de respuesta de extracción (t(30)=-.405 p=.688) y número de errores de alcance (t(30)=.482 p=.633), por lo que puede concluirse, que los niveles de adquisición alcanzado por los animales del grupo lesionado y el grupo control fueron similares. 2. Resultados 71 Experimento 3. 2 6 10 14 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 2 6 10 14 Sesiones Tiempo hasta la verticalidad (s) Tiempo hasta el éxito (s) Nº de errores de alcance Respuesta de extracción (s) n.s n.s n.s n.s 0 0 2 6 10 14 2 6 10 14 18 10 30 50 70 20 40 60 80 0 Nº de errores de alcance Respuesta de extracción (s) Tiempo hasta el éxito (s) Tiempo hasta la verticalidad (s) 1 2 3 4 Sesiones 1 2 3 41 2 3 41 2 3 4 SesionesSesiones Dm4 Control 80 20 40 60 Dm4 Control Figura 22. La lesión de la región Dm4 no produjo efectos significativos en el nivel de eficiencia de la tarea alcanzado en relación a los animales control. Las gráficas muestran la media del valor alcanzado en las dos últimas sesiones de entrenamiento en las diferentes variables analizadas. n.s., diferencias no significativas estadísticamente. 1. Métodos. 72 Experimento 4: Efectos motores de la microestimulación intracerebral localizada en el techo óptico y en el área Dm4 del palio mediante electrodos implantados crónicamente en el animal con libertad de movimientos. Los resultados de los experimentos 2 y 3 del presente trabajo mostraron que las lesiones localizadas en la región Dm4 del palio de la carpa dorada, que contiene un mapa somatosensorial, no produce ningún déficit ni alteración observable en el aprendizaje ni en la ejecución de una tarea motora aprendida en un procedimiento similar a los utilizados para estudiar las áreas motoras del neocórtex de los mamíferos. Por lo tanto, estos resultados sugieren que, a diferencia de las áreas somatosensoriales y somatomotoras del neocórtex de los mamíferos, la representación somatosensorial del palio de la carpa dorada no está implicada en el control motor directo ni en funciones premotoras. Con el objetivo de contrastar y verificar estas conclusiones, en el presente experimento pusimos de nuevo a prueba la posibilidad de que el área Dm4 pudiera estar implicada en funciones de control del movimiento utilizando un abordaje metodológico diferente y complementario al empleado en los experimentos anteriores: la microestimulación intracerebral focalizada. La microestimulación intracerebral localizada es una técnica que se ha empleado exhaustivamente en roedores, felinos, primates y otros mamíferos para estudiar la presencia y organización interna de los mapas motores corticales (Asanuma & Rosén, 1972; Asanuma & Sakata, 1967; Asanuma & Ward, 1971; Bury & Jones, 2002; Kleim et al., 1998, 2002; Monfils et al., 2005; Nudo et al., 1990; Rosén & Asanuma, 1972; Watson et al., 2016; Young et al., 2011). Esta técnica también ha sido empleada previamente en nuestro laboratorio para investigar la organización e implicación del techo óptico de la carpa dorada en el control motor (Herrero et al., 1998; Rodríguez, 1996; Salas et al., 1995, 1996, 1997) Dado que estos trabajos previos proporcionaron una visión completa y detallada de la participación del techo óptico de la carpa dorada en la generación del movimiento, en el presente experimento 1. Métodos. 73 Experimento 4. se implantaron también electrodos de estimulación en el techo óptico, además de en el área Dm4 del palio, a efectos de comparación y control. 1. Métodos. 1.1. Sujetos. Para el experimento se utilizaron 5 carpas doradas (Carassius auratus) de un tamaño de entre 12 y 16 cm de longitud medidos desde el extremo rostral a la base de la aleta dorsal. Los peces permanecieron en pequeños grupos en acuarios de cristal en las mismas condiciones de alojamiento y alimentación que en los experimentos anteriores. Todos los procedimientos experimentales de este trabajo se realizaron conforme a las normas de experimentación animal reguladas por el Real Decreto 53/2013 y las recomendaciones de la Directiva 2010/63/UE del Consejo de la Comunidad Europea. 1.2. Cirugía y procedimiento de implantación de electrodos. El procedimiento quirúrgico fue similar al utilizado en experimentos anteriores (véase Apartado 1.2. del Experimento 1). En el presente experimento se practicó una craneotomía con el objetivo de dejar expuesto tanto los hemisferios telencefálicos como el techo óptico y se realizó un orificio en el cráneo para colocar un tornillo de acero inoxidable soldado a un hilo de cobre y a un conector que serviría como electrodo indiferente durante la estimulación. Bajo control visual mediante un esteromicroscopio (SZ-61, Olympus) y utilizando un micromanipulador (Narishige Scientific Instruments, Tokio) se implantaron los electrodos de hilo de tungsteno de 15 micras de grosor aislados con vidrio y con un rango de impedancia entre 100 y 700 kΩ. En todos los sujetos se colocaron dos electrodos, uno en la región palial de Dm4 y otro en el techo óptico. Los electrodos se fijaron a la pared de la ventana del cráneo con cemento dental y a continuación se cerró toda la ventana también con cemento dental. Posteriormente, se soldaron los hilos de los electrodos a un conector, como precaución, para 1. Métodos. 74 Experimento 4. interrumpir la transmisión de calor hacia el cerebro, se rodeó el hilo con algodón húmedo. Los hilos de los electrodos y el hilo de cobre del tornillo se recubrieron también con cemento dental dejando únicamente libres los conectores alineados perpendicularmente a la cabeza del animal. Finalmente, se protegieron los conectores con silicona hasta el momento del experimento. Una vez terminada la implantación de los electrodos, los animales fueron trasladados a sus acuarios de residencia durante un periodo de postoperatorio de 1 a 2 días para asegurar la completa recuperación del animal antes de la sesión experimental. 1.3. Equipamiento experimental. Las sesiones de estimulación se llevaron a cabo en un tanque cuadrado de 83 cm de lado por 27 cm de alto. En el techo de la habitación, justo en el centro del tanque, se colocó una cámara de vídeo (WebCam Microsoft LifeCam Sudio HD) conectada a un ordenador para poder controlar y registrar las sesiones experimentales (Figura 23). En un lateral del tanque, fuera del campo visual del animal, se instaló un LED conectado al estimulador que se activaba simultáneamente a la aplicación del estímulo eléctrico, de forma que señalizaba en la grabación el comienzo y la duración de la estimulación. Las características del estímulo eléctrico (duración y frecuencia) se controlaron mediante un estimulador (Cygnus P400, A-M Systems) conectado a una unidad de aislamiento generadora de corriente constante (SIU9A, A-M Systems). La duración e intensidad del estímulo se monitorizó en un osciloscopio digital (Tektronix) midiendo el voltaje a través de una resistencia de 1 MΩ. 1. Métodos. 75 Experimento 4. A B Figura 23. A. Vista del tanque cuadrado con el animal durante una sesión experimental de microestimulación en libertad de movimientos. El círculo rojo señala el LED conectado al estimulador B. Fotografía de un animal con los electrodos implantados. 1.4. Estimulación eléctrica intracerebral. El día de la sesión experimental, los animales se colocaron de nuevo en la pecera de cirugía con agua procedente de su pecera de residencia y se conectaron los cables de estimulación. Se utilizaron cables finos (0,20mm) de hilo de cobre esmaltado para el segmento del cable de conexión más cercano al animal. Una vez conectados se aislaron e impermeabilizaron las conexiones con un adhesivo impermeabilizante. Los cables se conectaron mediante un conector 2. Resultados. 82 Experimento 4. 120 140 200 210 220 Intensidad ( μ A) 120 140 200 210 220 Intensidad ( μ A) Duración (mseg) 0 100 200 300 400 500 600 Amplitud (cm) 0 5 10 15 20 25 30 200 250 300 350 400 Frecuencia (Hz) 200 250 300 350 400 Frecuencia (Hz) Amplitud (cm) 0 5 10 15 20 A Duración (mseg) 0 100 200 300 400 500 B TO Dm4 TO Dm4 Figura 27. Las características métricas de los movimientos evocados por la estimulación del techo óptico dependen de los parámetros de estimulación. La estimulación en el área Dm4 no produjo efectos motores. Se muestra la amplitud y duración media del movimiento provocado con los diferentes valores de frecuencia (A) e intensidad (B). 1. Métodos. 83 Experimento 5: Efectos motores de la microestimulación intracerebral en el techo óptico y en el área Dm4 del palio en una preparación aguda. Para investigar en mayor profundidad y detalle la posible implicación del área Dm4 de la carpa dorada en el control motor, se utilizó un procedimiento experimental complementario al utilizado en el Experimento 4, consistente en el empleo de una preparación aguda. Este procedimiento, que ha sido utilizado previamente de forma exhaustiva en nuestro laboratorio para investigar la participación del techo óptico en el control motor en la carpa dorada (Herrero et al., 1998; Rodríguez, 1996; Salas et al., 1995, 1997), permite un mayor control en la aplicación de la microestimulación eléctrica intracerebral, así como una medición precisa de los movimientos oculares y de las aletas producidos por la estimulación, mediante un sistema de sensores magnéticos de efecto Hall (Rodríguez et al., 2001). Este sistema de registro permite medir con precisión parámetros como la dirección y velocidad de los movimientos y posibilita la medición precisa de las características métricas y cinéticas de movimientos rápidos, como los movimientos de tipo sacádicos. Los peces teleósteos muestran un completo repertorio de movimientos sacádicos, cuyos circuitos neurales son bien conocidos. Los movimientos sacádicos son un tipo de movimientos balísticos rápidos que cambian abruptamente el punto de fijación de la mirada. En los mamíferos, los campos oculares frontales neocorticales y el colículo superior tienen acceso a los circuitos premotores y, por tanto, pueden generar movimientos sacádicos de cabeza y los ojos. El techo óptico de los teleósteos, que es homólogo al colículo superior, también tiene acceso a los centros premotores del tronco para generar movimientos sacádicos oculares y corporales. Investigaciones previas de nuestro laboratorio han estudiado en profundidad los mecanismos del techo óptico implicados en la generación de los movimientos sacádicos en la carpa dorada mediante técnicas de microestimulación eléctrica focalizada (Herrero et al., 1998; Rodríguez, 1996; Salas et al., 1997). Estos estudios pusieron de manifiesto que el techo óptico de la carpa dorada realiza transformaciones sensoriomotoras 1. Métodos. 84 Experimento 5. necesarias para cambiar la dirección de la mirada en respuesta de la estimulación sensorial y puede codificar adecuadamente la dirección y otros parámetros de los movimientos sacádicos. En el presente experimento comparamos la posible capacidad de control motor del área Dm4 del palio de la carpa dorada con los bien conocidos mecanismos tectales de generación y modulación de los movimientos. 1. Métodos. 1.1. Sujetos. Para este experimento se utilizaron 8 carpas doradas (Carassius auratus) suministradas por servicios locales. Los animales tenían un tamaño de entre 12 y 16 cm de longitud medidos desde el extremo rostral a la base de la aleta dorsal. Los peces permanecieron en pequeños grupos en acuarios de cristal en las mismas condiciones de alojamiento y alimentación que en los experimentos anteriores. Todos los procedimientos experimentales de este trabajo se realizaron conforme a las normas de experimentación animal reguladas por el Real Decreto 53/2013 y las recomendaciones de la Directiva 2010/63/UE del Consejo de la Comunidad Europea. 1.2. Cirugía y preparación del animal para el procedimiento de registro óptico con fluorocromos sensibles al voltaje y la microestimulación eléctrica localizada. El procedimiento quirúrgico para la preparación del animal, la sedación, y la craneotomía para dejar expuesto los hemisferios cerebrales y la preparación para realizar el registro óptico de la actividad neural mediante fluorocromos sensibles al voltaje fueron similares a los realizados en el Experimento 1 (véase Apartado 1.2 del Experimento 1). Adicionalmente, se realizó un orificio en el hueso frontal del cráneo para colocar un tornillo de acero inoxidable que sirvió como electrodo indiferente durante la estimulación. Una vez se implantó el tornillo, se cubrieron con cemento dental los bordes craneales expuestos y se fijó la cabeza del animal 1. Métodos. 85 Experimento 5. a la pecera quirúrgica con unas barras de fijación laterales siguiendo el mismo procedimiento empleado en el experimento de registro óptico anterior. 1.3. Registro de las respuestas motoras. Para el registro de las respuestas motoras en el animal se utilizó un sistema de registro magnético desarrollado en nuestro laboratorio (Rodríguez et al., 2001), consistente en un conjunto de sensores de efecto Hall de alta sensibilidad que detectan la posición en el espacio de pequeños magnetos que proporcionan un campo magnético constante de considerable intensidad. Este sistema de medida suministra una señal de la posición de los ojos y de los apéndices de alta calidad, fiable y muy estable en el tiempo. La señal de salida de los sensores consiste en una señal analógica de amplitud proporcional a la distancia entre el sensor y el magneto. Este sistema de registro está prácticamente libre de deriva a lo largo de la sesión con una alta relación señal-ruido (un nivel de ruido de aproximadamente 0.02 mV) y permite el registro simultáneo de un elevado número de canales (en este trabajo se utilizaron 5 canales de registro simultáneo). Tras el procedimiento quirúrgico se colocaron los magnetos que forman parte del sistema de registro de los movimientos de los ojos y de las aletas durante la sesión experimental. En concreto se colocaron cinco magnetos (2x2x1mm) mediante sutura quirúrgica y cianocrilato. Dos se colocaron en el margen temporal de la esclerótica de los ojos, otros dos se colocaron en la base de las aletas pectorales y un último magneto se colocó en la base de la aleta caudal mediante una pequeña sutura. A continuación, se colocaron los sensores de efecto Hall en la proximidad de los magnetos. La señal analógica generada por los sensores de efecto Hall fue adquirida por una interfaz (CED Power1401,CED, Cambridge Electronic Design Limited) que ejecutaba el software Spike 2 versión 8.10 (Cambridge Electronic Design, 2016) para su posterior análisis. Una vez implantados los magnetos y situados los sensores en sus posiciones definitivas se realizaron las calibraciones para los movimientos de los ojos y de cada uno de los apéndices. Cuando el set experimental para registro magnético estuvo listo, se sustituyó el agua con anestésico de la pecera quirúrgica por agua del acuario de residencia y se 1. Métodos. 86 Experimento 5. esperó en torno 45 minutos hasta que los animales mostraron claros signos de recuperación (movimientos espontáneos operculares, oculares y de las aletas) para comenzar la sesión experimental. B A C Figura 28. Preparación experimental aguda para la microestimulación eléctrica intracerebral focalizada y registro de los movimientos de ojos y apéndices mediante sensores magnéticos de efecto Hall. A. Sensores de efecto Hall; B. Electrodos de registro de la frecuencia cardíaca; C. Craneotomía. 1.4. Microestimulación eléctrica. La microestimulación eléctrica se llevó a cabo mediante microelectrodos monopolares, construidos con hilo de acero inoxidable de 25 μm de grosor, aislados con vidrio y con impedancias entre 300 y 800 KΩ medidas a una frecuencia de 1KHz. Como electrodo indiferente se utilizó el tornillo de acero inoxidable implantado en el hueso frontal. El estímulo eléctrico típico de referencia consistió en un tren de pulsos catódicos de 70mseg de duración. La duración de cada pulso fue de 200μseg y se utilizó una frecuencia de 384Hz. La estimulación se realizó utilizando un estimulador (Cygnus P400) conectado a una unidad de aislamiento (Neurodata, SIU 90). En algunos de los ensayos se mantuvieron constantes las características del estímulo y en otros experimentos se variaron sistemáticamente cada uno de los parámetros (frecuencia, duración 1. Métodos. 87 Experimento 5. e intensidad del estímulo) mientras permanecían constantes los valores de los demás parámetros para analizar los efectos de estas variaciones sobre las respuestas provocadas. Los rangos que se estudiaron de cada parámetro de estimulación fueron los siguientes: intensidad (5-300μA), frecuencia (25-400Hz) y duración del tren (30-240ms). Los distintos valores de estimulación fueron presentados en orden semialeatorio. La duración e intensidad del estímulo se monitorizó en un osciloscopio digital (Tektronix) midiéndose el voltaje a través de una resistencia de 1 MΩ. El posicionamiento del microelectrodo de estimulación en el palio telencefálico o techo óptico se realizó mediante un micromanipulador (Narishige Scientific Instruments, Tokio) bajo control visual con un microscopio binocular (SZ-61, Olympus) hasta una profundidad de 150 micras. En cada lugar de estimulación se realizaron al menos cinco estimulaciones por cada valor de estimulación manteniendo un intervalo entre estimulaciones de al menos 60 segundos. 1.5. Registro óptico de la actividad neural durante la microestimulación eléctrica. Para una descripción detallada de las características del equipo de registro óptico, del procedimiento de adquisición y análisis de la señal óptica de fluorescencia véase el apartado 1.3 del experimento 1 (Figuras 1 y 2). En este experimento se sincronizó la microestimulación eléctrica intracerebral con la señal de registro óptico a través de una salida TTL que se envió al estimulador (Cygnus P400, A-M Systems) mediante el que se controlaron los parámetros de los estímulos (duración y frecuencia). 2. Resultados. 88 Experimento 5. 2. Resultados. Registro óptico de la actividad neural provocada en Dm4 y en el techo óptico por la microestimulación eléctrica localizada. En el Experimento 4 la actividad eléctrica intracerebral localizada en el área Dm4 no provocó movimientos observables, mientras que la estimulación en el techo óptico sí provocó claras respuestas motoras cuyas características métricas y cinéticas estaban relacionadas con los parámetros de estimulación. Una posibilidad que es necesaria contemplar como posible explicación de los resultados negativos obtenidos en el caso de Dm4 es la de que el rango de parámetros de estimulación que es óptimo para activar al techo óptico no fuera el idóneo para activar las redes neurales de Dm4. Esta posibilidad parece poco probable dado que se empleó un amplio rango de intensidades y de frecuencias para comprobar la posible implicación de Dm4 y del techo óptico en funciones de control motor. A pesar de ello en el presente experimento pudimos poner a prueba esta posibilidad, comprobando empíricamente si los parámetros de estimulación empleados son o no idóneos para producir la activación del área Dm4 y comparar sus efectos con los producidos en el techo óptico. El empleo de una preparación aguda permite el uso simultáneo de la técnica de registro óptico durante la microestimulación eléctrica localizada, lo que posibilitó analizar el patrón espacio-temporal de la actividad neural evocada por la estimulación eléctrica de la región palial de Dm4 y compararla con la provocada en el techo óptico (Figura 29). Mediante el sistema de neuroimagen por registro óptico se registraron las respuestas evocadas por la microestimulación eléctrica con diferentes intensidades tanto en el área Dm4 como en el techo óptico. Mediante el programa de análisis BV_Analyzer (Scimedia Ltd., USA) se analizaron las curvas de actividad de la señal óptica dF (F-F0) y se cuantificó el área activada (mm2) en ambas regiones con cada uno de los valores de intensidad probados. El área activada se estableció como el área que se activó por encima del 20% de la amplitud máxima. El incremento de la intensidad de corriente (30 a 100 μA) produjo un incremento 2. Resultados. 89 Experimento 5. sistemático de la magnitud de la respuesta evocada tanto en Dm4 como en el techo óptico (Figura 29). Para el análisis del tamaño del área activada en cada región ante los diferentes valores de intensidad, se realizó una correlación de Pearson. Este análisis mostró que tanto en Dm4 (r=.942, p=.000) como en el techo óptico (r=.877, p=.000) existe una alta correlación positiva entre el tamaño del área activa y la intensidad del estímulo eléctrico. Este resultado sugiere que la microestimulación eléctrica intracerebral provoca un patrón espacio-temporal de actividad similar en Dm4 y en el techo óptico (Figura 29). Por lo tanto, el análisis reveló la ausencia de diferencias en la actividad neural evocada en ambas regiones tras la microestimulación eléctrica. Estos resultados permiten descartar la posibilidad de que la ausencia de respuestas motoras provocadas por la estimulación de Dm4 pudiera deberse a una diferencia en las propiedades de excitabilidad del tejido de Dm4 con respecto al del techo óptico y que como consecuencia los parámetros de estimulación empleados no fueran los idóneos para activar los circuitos neurales de Dm4. Los resultados muestran que no hay diferencias significativas en las propiedades de excitabilidad de los circuitos neurales del área Dm4 en comparación con el techo óptico, y que el rango de parámetros de estimulación utilizados son idóneos para activar al área Dm4. Figura 29. Registro óptico de la actividad neural evocada por la microestimulación eléctrica del área Dm4 y del techo óptico. Se muestran los fotogramas de la actividad máxima tras la microestimulación eléctrica con intensidades de corriente de 30 a 100 μA en Dm4 y en el techo óptico. Las curvas muestran la actividad en ambas regiones tras la estimulación eléctrica con los diferentes valores de intensidad. La flecha azul 30uA 60uA 90uA 15uA25Hz 150Hz 250Hz 300Hz 400Hz 30uA 40uA 70uA50Hz 150Hz 200Hz 300Hz 400Hz Stim 30μA 50μA 60μA Dm4 80μA100μA 30μA 50μA 60μA80μA100μA Techo óptico Max Min Max Min 30 μA 50 μA 60 μA 80 μA 100 μA 30 μA 50 μA 60 μA 80 μA 100 μA 0 1 2 Estim. -2 2 6 10 dF 0 1 2 Tiempo (seg) Estim. -2 6 10 dF 2 40 60 80 100 120 r = .942, p<.001 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 Área activa (mm2) Intensidad (μA) 40 60 80 100 120 r = .877, p<.001 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 Área activa (mm 2) Dm4 TO Dm4 TO 2. Resultados. 90 Experimento 5. señala el momento del estímulo. A la derecha se muestra la correlación obtenida entre el tamaño del área activada y la intensidad del estímulo eléctrico en ambas regiones. Respuestas motoras generadas por la microestimulación eléctrica localizada del telencéfalo y techo óptico en el animal inmovilizado. Una vez determinado mediante la técnica de registro óptico que la estimulación eléctrica de Dm4 y el techo óptico produce un grado de activación neural similar en ambas estructuras, procedimos a analizar la posible implicación de la región Dm4 en el control motor registrando las respuestas oculomotoras y somatomotoras producidas por la estimulación de esta región, utilizando un amplio rango de parámetros de estimulación, y comparando los efectos de la estimulación en Dm4 con las respuestas generadas por la estimulación del techo óptico . Los resultados mostraron que mientras que la microestimulación eléctrica del techo óptico provocó movimientos sacádicos coordinados de los ojos y de las aletas pectorales con latencias homogéneas y de amplitud graduada según las variaciones de intensidad y frecuencia del estímulo eléctrico, la estimulación con esos mismos parámetros en la región Dm4 resultó ineficiente para generar respuestas motoras (Figura 30). Se probaron un amplio rango de valores de intensidad (5-300μA), frecuencia (25-400Hz) y duración del tren (30-240ms) de estimulación. La estimulación del techo óptico produjo movimientos de tipo sacádico incluso con valores bajos de las escalas de intensidad, frecuencia y duración de los estímulos empleados, pero mostraron ser completamente ineficaces para evocar movimientos desde la región Dm4 en todo el rango de valores de estimulación empleados. Así, los incrementos en estos parámetros produjeron un incremento significativo en la amplitud de las respuestas somatomotoras y oculares tras la estimulación en el techo óptico, pero ninguno de esos valores produjo movimientos al estimular la región Dm4 (Figuras 30 y 31). 2. Resultados. 91 Experimento 5. Los incrementos en los parámetros de intensidad, frecuencia y duración de la microestimulación eléctrica produjeron incrementos en la amplitud de las sacadas provocadas por la estimulación del techo óptico (Figura 31). Así, para un tren de estimulación de duración (70ms) y frecuencia (384Hz) constantes, los incrementos de la intensidad de corriente de 30μA a 240μA produjeron un notable incremento en la amplitud de los movimientos provocados en el ojo y en la aleta pectoral. La amplitud de los movimientos oculares y de la aleta pectoral alcanzó un nivel asintótico cuando la intensidad de corriente superó los 200μA y 120μA, para el movimiento ocular y de la aleta pectoral, respectivamente (Figura 31). Igualmente, cuando la duración del tren (70ms) y la intensidad de corriente 200 μA se mantuvieron fijos y la frecuencia del estímulo se varió de 25Hz a 400Hz se observó un marcado y graduado incremento en la amplitud del movimiento provocado del ojo y de la aleta pectoral (Figura 31), que alcanzaron un nivel asintótico una vez que la frecuencia de estimulación excedió 350Hz y 250Hz, para el ojo y la aleta pectoral, respectivamente. De una forma similar, cuando la intensidad de corriente y la frecuencia de estimulación se mantuvieron constantes en 200μA y 384Hz, respectivamente, pero la duración del tren se incrementó de 25ms a 220ms se observó un incremento sistemático en la amplitud del movimiento ocular y de la aleta pectoral (Figura 31). En resumen, la microestimulación eléctrica en el techo óptico produjo movimientos de tipo sacádico graduados, cuyas características métricas y cinéticas dependieron de los parámetros de estimulación. Por el contrario, la microestimulación eléctrica en Dm4 no produjo ningún tipo de respuestas motoras en el amplio rango de intensidades, frecuencias y duraciones de estimulación probadas. 1. Métodos. 98 Experimento 6. diferentes niveles de profundidad (250µm, 500µm, 1000µm y 1500µm). Como región control se estimuló en el techo óptico, estructura que ha demostrado tener una clara implicación en la generación y control de los movimientos en la carpa dorada en experimentos previos (Herrero, 1998; Rodríguez, 1996; Salas, 1995, 1997). Se analizó el umbral de estimulación para la producción de respuestas motoras, definido como aquel valor de intensidad de corriente con el que se provocó una respuesta motora en al menos 3 de las 5 estimulaciones. Un determinado punto de estimulación se consideró inefectivo para producir movimiento si con ninguno de los valores de intensidad se provocaba un movimiento de al menos 2º de amplitud con una latencia inferior a 200ms. 1.4. Localización de los puntos de estimulación. Para reconstruir la posición de los tractos y los puntos de estimulación, se realizaron pequeñas lesiones electrolíticas (corriente continua, a un 60% menos de la intensidad umbral de estimulación, durante 10 seg) antes de que los animales fueran sometidos a perfusión transcardiaca tras sobredosis de anestésico en una solución 1:5000 de metanosulfato de tricaína (MS222, Sigma- Aldrich) en agua tamponada del acuario de residencia. Tras la perfusión se extrajeron los cerebros y se postfijaron en la misma solución fijadora antes de su inclusión en parafina. Tras su inclusión en parafina, los cerebros fueron cortados en secciones sagitales de 20 μm de grosor con un microtomo rotatorio (Leica RM-2125RT). Las secciones fueron montadas en orden seriado en portaobjetos gelatinizados, teñidos mediante el método de Nissl con acetato de cresilo al 5% y fueron cubiertas con resina (DPX) y con cubreobjetos. Además de las lesiones electrolíticas, las marcas de la penetración de los electrodos en el tejido nervioso y las anotaciones de la posición de hitos anatómicos en relación a la localización de los electrodos, facilitaron la reconstrucción y localización de los tractos y de los puntos de estimulación. 2. Resultados. 99 Experimento 6. A B Figura 33. Análisis histológico de la localización de los electrodos de estimulación. Sección sagital del telencéfalo de un animal representativo mostrando dos lesiones electrolíticas de dos puntos de estimulación a diferentes profundidades (A y B). 2. Resultados. Los resultados de este experimento de cartografía exhaustiva mediante microestimulación eléctrica indican la ausencia de áreas motoras para la generación de respuestas motoras en toda la extensión del palio telencefálico de la carpa dorada. En la figura 34 se muestra la reconstrucción de las posiciones de los puntos de estimulación sobre un atlas estándar de 16 sujetos experimentales. Se observa que todas las posiciones de estimulación probadas en toda la extensión del palio telencefálico y a todas las profundidades fueron ineficaces para producir respuestas motoras incluso con valores de intensidad de corriente de hasta 800μA. En total se probaron, 245 puntos de estimulación entre todos los sujetos experimentales. Además, debido a que una de las principales hipótesis que va ganando aceptación en los últimos años es la propuesta por 2. Resultados. 100 Experimento 6. Thomas Mueller (Mueller et al., 2011; Porter & Mueller, 2020) que sostiene que el área dorsocentral (Dc) del palio de los teleósteos es un sector histogenético independiente que podría considerarse homólogo al neocórtex de los mamíferos, mapeamos específicamente el área Dc para probar si esta región tenía alguna implicación en la generación de movimientos, una función prominente en la neocorteza de los mamíferos. Los resultados que se obtuvieron también fueron negativos, ya que todas las posiciones de estimulación ubicadas en la región de Dc fueron ineficaces para producir movimientos en la carpa dorada incluso con valores de intensidad elevados (300-350 μA; Figura 35). Como puede observarse en las figuras 34 y 36, la única ubicación positiva para la generación de movimientos se localizó a una profundidad de 1500 micras y en una posición medial correspondiente con la región pretectal. En esta región pretectal se obtuvieron respuestas motoras de tipo sacádico con valores mínimos de estimulación (entre 50-100 μA), similares a los obtenidos tras la estimulación en el techo óptico (Figuras 34 y 36). 250μm 500μm 1000μm 1500μm TO TO 250μm X X XXX X X X X XXX X XX XX X X XX X X X XX X X XX X X X X X XX X X XX X X X X X X XX X X X X X X X X X X XX X X X X X X X XX X XXX X X X X X X X X X X XXX X XXX X X XXXX X X X X XXX X X X X X X X X X X XXX X X XX X X X XX X XX XX X X X X X XX X X XX X X X X X X X X X X XXX X X X X X X X X X X X XX X X X X X X X XX X XXX X X X X X X X X X XXX X XXX X XXXX X X X X XXX X XX X X X X X X XX XX XXX X X X XX X X X X XX X XX XX X X X X X XX X X XX X X X X X X X X X X XX X X X X X X X X X X X XX X X X X X X X XX X XXX X X X X X X X XX X XXX X X XXXX X X X X XX X X X X X X XXX XXX X X X X X X XX X X X X X XX X X XX X X X X X X X X X X XX X X XX X X X X X X X X XXX X XXX X X X X XXXX X X X X XXX X XX X X X X X X XX X X X X XXX X X X XX X X X X X X X X XXX XX X X X X X XX X X XX X X X X X X X X X X XXX X X X X X X X X X X X X X XX X X X X X X X XX X XXX X X X X X X X X X x Inefectivo <50 μA <80 μA <110 μA 500μm 1000μm 1500μm Figura 34. Localización de los puntos de estimulación y sus umbrales de intensidad para la producción de respuestas motoras. Se muestra la reconstrucción de todas las posiciones de estimulación en superficie (izquierda) y en cuatro secciones horizontales del telencéfalo a diferentes profundidades. Se representan colapsados todos los puntos de estimulación analizados en los 16 sujetos utilizados en este experimento. El diámetro de los círculos indica el valor umbral de intensidad en μA para la producción de movimientos. Nótese como todos los puntos de estimulación del telencéfalo resultaron inefectivos para producir movimientos incluso con valores 2. Resultados. 101 Experimento 6. elevados de intensidad (hasta 800μA). Sin embargo, los puntos de estimulación situados en el techo óptico y en los núcleos pretectales (profundidad 1500 μm) produjeron movimientos tras la estimulación con valores de intensidad inferiores a 100 μA. x x x x x Dc Dm Dld Dlv ol om Vd 0 10 20 30 40 50 60 70 Dc TO 350μA 300μA 250μA 200μA 150μA 100μA 50μA Amplitud (º) Vd Vv om Dm Dc Dld Dlv ol 0,5mm Estimulación x Inefectivo <50 μA <80 μA <110 μA Umbral respuesta motora Figura 35. Reconstrucción de un tracto de estimulación a través de la región dorsocentral (Dc). Sobre una sección transversal del telencéfalo a nivel de la región Dc se muestra una reconstrucción de un tracto de estimulación indicando cómo las diferentes profundidades resultaron inefectivas para producir movimientos sacádicos. La gráfica de la derecha muestra una comparación de los umbrales de estimulación y la amplitud de las respuestas de la aleta pectoral provocadas por la estimulación en el techo óptico (TO) y en Dc. x x x x Dm1 Dm2 Dm3 pt Dc tom Dm4 Dp 250μm 500μm 1000μm 1500μm TO 0 10 20 30 40 50 60 70 350μA 300μA 250μA 200μA 150μA 100μA 50μA Dm4 Amplitud (º) Dp pt Dm1 Dm2 Dm3 Dm4 Dp pt Dc tom 0,5mm Estimulación x Inefectivo <50 μA <80 μA <110 μA Umbral respuesta motora Figura 36. Reconstrucción de un tracto de estimulación en la región caudal del telencéfalo mostrando que en la región pretectal se obtienen respuestas motoras a bajo umbral de estimulación. Sobre una sección sagital del telencéfalo, próxima a la línea media, se muestra una reconstrucción de un tracto de estimulación (línea roja) indicándose el valor umbral de intensidad para movimiento de la aleta pectoral a las diferentes profundidades. Se muestran los resultados obtenidos para un sujeto en el que se ha mantenido constante la frecuencia del estímulo (384Hz) y duración del tren (70mseg), variándose la intensidad de corriente. La gráfica de la derecha muestra 2. Resultados. 102 Experimento 6. una comparación de los umbrales de estimulación y amplitud de las respuestas evocadas tras la estimulación en el techo óptico (TO) y en los diferentes niveles de profundidad desde la región superficial de Dm4 hasta el área palial dorso posterior (Dp) y los núcleos pretectales (pt). Tom, tracto olfatorio medial. En conjunto, de los resultados descritos hasta el momento se desprenden dos ideas principales: En primer lugar, la región Dm4, implicada en la codificación de información somatosensorial en la carpa dorada, carece de funciones de control motor y en segundo lugar, no se ha encontrado ninguna región palial de la carpa dorada que esté implicada en el control motor de manera similar a cómo lo está el neocórtex de los mamíferos. Por tanto, podríamos concluir que el palio telencefálico de la carpa dorada no está implicado en el control motor directo de forma similar a como lo están las áreas motoras características del neocórtex de los mamíferos. 1. Métodos. 103 Experimento 7: Cartografía mediante microestimulación eléctrica de las áreas del palio telencefálico de la carpa dorada implicadas en la generación de respuestas de tipo emocional (respuestas de escape con un componente de activación visceral). Los resultados de los experimentos anteriores del presente trabajo de investigación sugieren que el palio del telencéfalo de la carpa dorada no está implicado en el control motor y que no contiene áreas motoras similares a las que están presentes en el neocórtex de los mamíferos. Por el contrario, trabajos previos demuestran que el palio del telencéfalo de los teleósteos está involucrado en la representación de la información visceral y del estado corporal (Butler & Hodos, 2005; Domenici & Hale, 2019; Dunlop & Laming, 2005; Gómez, Rodríguez- Expósito, et al., 2022; Kato et al., 2012; Northcutt, 2006; Rodríguez-Expósito et al., 2017; Shimizu et al., 1999; Striedter & Northcutt, 2020; Wullimann & Rink, 2002; Yáñez et al., 2017; Yoshimoto & Yamamoto, 2010). Así, por ejemplo, la estimulación sensorial inesperada o aversiva produce respuestas viscerales y activación neural en el palio de los teleósteos, especialmente en la región Dm, y la estimulación eléctrica del palio de baja intensidad, particularmente también en Dm, provoca respuestas emocionales, acompañadas de cambios viscerales, como bradicardia y alteraciones de la frecuencia respiratoria (Broglio et al., 2005; Demski, 2013; Dunlop & Laming, 2005; Laming & McKee, 1981; Reiriz-Rojas, 2017; von Trotha et al., 2014). Así mismo, la lesión del palio del telencéfalo, y en especial de la región Dm produce importantes déficits en el procesamiento emocional, en el condicionamiento clásico de miedo y en procedimientos de evitación condicionada (Laming & McKee, 1981; Lau et al., 2011; Overmier & Papini, 1986; Portavella et al., 2003; Portavella, Torres, & Salas, 2004). Estos resultados previos indican que el palio de los peces teleósteos, y en especial la región Dm, desempeña un papel importante en el control visceromotor, en la atribución del componente afectivo de la experiencia, y en la generación de las respuestas emocionales. Estos datos sugieren que el palio de los teleósteos 1. Métodos. 104 Experimento 7. podría tener una naturaleza límbica y paralímbica, desempeñando funciones más similares a estructuras como la amígdala palial, la ínsula, o la corteza cingulada anterior, que al neocórtex de los mamíferos. En el presente experimento evaluamos la posible presencia de representaciones viscerales en el palio de la carpa dorada. En este experimento analizamos si la microestimulación eléctrica del palio, ineficaz para generar respuestas puramente motoras en el palio de la carpa dorada, puede generar respuestas viscerales y visceromotoras. Para ello se cartografió exhaustivamente mediante microestimulación eléctrica focalizada toda la superficie dorsal del palio con el fin de identificar las áreas que, al ser estimuladas, desencadenan alteraciones de la tasa cardíaca y respuestas motoras de tipo emocional. 1. Métodos. 1.1. Sujetos. Este experimento de cartografía se realizó en 3 carpas doradas (Carassius auratus) de un tamaño de entre 12 y 16 cm de longitud medidas desde el extremo rostral a la base de la aleta dorsal. Los peces permanecieron en pequeños grupos en acuarios de cristal en las mismas condiciones de alojamiento y alimentación que en los experimentos anteriores. Todos los procedimientos experimentales de este trabajo se realizaron conforme a las normas de experimentación animal reguladas por el Real Decreto 53/2013 y las recomendaciones de la Directiva 2010/63/UE del Consejo de la Comunidad Europea. 1. Métodos. 105 Experimento 7. 1.2. Cirugía y preparación del animal para la microestimulación eléctrica localizada y registro de las respuestas de tipo emocional. El procedimiento quirúrgico que conlleva la preparación del animal, la craneotomía para dejar expuesto los hemisferios cerebrales, la implantación del tornillo de tierra, el posicionamiento de los electrodos de estimulación y la colocación de los magnetos que forman parte del sistema de registro de sensores de efecto Hall para el registro de los movimientos de las aletas pectorales y cola fueron idénticos a los realizados en el experimento 5 (véase apartado 1.3). 1.3. Registro y análisis de la frecuencia cardiaca. Para registrar la frecuencia cardiaca la pecera experimental contaba con dos palas de sujeción provistas de dos electrodos de copa de plata bipolares situados en el extremo anterior de las mismas, de forma que ambos electrodos quedaban próximos a las aletas pectorales a ambos lados de la cavidad torácica ventral. La señal electrocardiográfica (ECG) se amplificó (50.000x), se filtró paso de banda (0,1-50Hz) mediante un amplificador diferencial (NL905, Digitimer). La señal ECG fue monitorizada en tiempo real por un sistema de adquisición CED Power 1401 y almacenada mediante el software Spike 2 (CED, Cambridge) para su posterior análisis. 1.4. Microestimulación eléctrica. La microestimulación eléctrica se llevó a cabo mediante microelectrodos monopolares, construidos con hilo de acero inoxidable de 25 μm de grosor, aislados con vidrio y con impedancias entre 300 y 800 KΩ medidas a una frecuencia de 1KHz, similares a los empleados en los experimentos anteriores. Como electrodo indiferente se utilizó el tornillo de acero inoxidable implantado en el hueso frontal del cráneo. El estímulo eléctrico típico de referencia consistió en un tren de pulsos catódicos de 2s de duración. La duración de cada pulso fue de 0.2ms y se utilizó una frecuencia de 50 Hz. La estimulación fue realizada mediante un estimulador 1. Métodos. 106 Experimento 7. (Cygnus P400) conectado a una unidad de aislamiento (Neurodata, SIU 90). La posición del microelectrodo de estimulación en la superficie (150 micras de profundidad) del telencéfalo se realizó mediante un micromanipulador (Narishige Scientific Instruments, Tokio) bajo control visual con un microscopio binocular (SZ-61, Olympus). En cada punto de estimulación se realizaron al menos cinco estimulaciones por cada valor de estimulación manteniendo un intervalo entre estimulaciones de al menos 90 segundos. La duración e intensidad del estímulo se monitorizó en un osciloscopio digital (Tektronix) midiendo el voltaje a través de una resistencia de 1 MΩ. Se registraron las coordenadas de cada punto de estimulación en los ejes anteroposterior y lateromedial. El umbral de estimulación para una respuesta de bradicardia se estableció como aquel valor de intensidad de corriente más bajo con el que se provoca una respuesta de bradicardia en 3 de las 5 estimulaciones. Se consideró una respuesta de bradicardia cualquier desaceleración de la tasa cardíaca respecto a la línea base de al menos un 15%. Como línea base se consideró un periodo de 10 segundos inmediatamente anterior a la estimulación. 1.5. Mapas de umbrales de respuestas de escape y de bradicardia. El objetivo de este experimento fue identificar las áreas paliales desde las cuales se podrían provocar respuestas emocionales de escape y bradicardia con una mínima intensidad de corriente. Para generar los mapas de estimulación se reconstruyó la ubicación de los puntos de estimulación sobre una imagen de la superficie dorsal del hemisferio telencefálico y se indicó la menor intensidad de corriente efectiva para provocar las respuestas de escape y bradicardia desde cada uno de los sitios estimulados. Se realizó un análisis de varianza ANOVA de un factor (intensidad x área) con ajustes de Bonferroni para comparaciones múltiples. 2. Resultados. 107 Experimento 7. 2. Resultados. El análisis de los umbrales de estimulación reflejó que las intensidades mínimas necesarias para provocar respuestas de bradicardia eran estadísticamente diferentes entre las diferentes áreas analizadas (Dm1, Dm2, Dm3, Dm4 y Dld) (F(4,124)= 27,029 p=.000). Los análisis post hoc revelaron que los valores umbral de Dm2 (media = 30 μA) fueron significativamente más bajos que los observados en Dm1, Dm3, Dm4 y Dld (todos p<0.05). Sin embargo, si se observa la figura 37 puede verse que los valores más altos se encuentran en Dm1 y Dld, de hecho la comparación de los umbrales de ambas áreas no fue estadísticamente significativa (p>0.05). En un segundo análisis quisimos corroborar que el umbral encontrado en las subregiones de Dm (Dm2, Dm3 y Dm4) son estadísticamente diferentes a los encontrados el Dld (t(106)=-10,249 p=.000). Estos resultados sugieren que el área Dm, a diferencia de Dl, está especialmente relacionada con las respuestas emocionales de tipo visceral como es la bradicardia. Estos resultados son coincidentes con los obtenidos por (Reiriz-Rojas, 2017), donde describió que la estimulación de Dm en general y Dm2 en particular, provoca respuestas de bradicardia y respuestas motoras emocionales de escape. Por ello, en este experimento también se cartografió el palio de la carpa dorada con el fin de identificar las áreas desde las cuales se provocan este tipo de respuestas motoras que se caracterizan por ser respuestas de alta latencia (hasta 5 segundos después de la estimulación) y presentar alta variabilidad. Los análisis ANOVA de un factor (intensidad x área) mostraron que la diferencia en los umbrales encontrada entre las diferentes áreas de Dm (Dm1, Dm2, Dm3, Dm4) y Dl fueron estadísticamente significativa (F(4,124)=31,993 p=.000). Los análisis post hoc revelaron que los valores umbral de Dm2 fueron significativamente menores que los observados en Dm1, Dm3, Dm4 y Dld (todos p<0.05). Sin embargo, al igual que ocurre con la respuesta de bradicardia, los umbrales más altos se encuentran en Dm1 y Dld, no existiendo diferencias significativas entre ambas (p>0.05). Para las respuestas motoras de tipo emocional, también quisimos analizar si la diferencia en los valores de umbral encontrados en las subregiones de Dm (Dm2, Dm3 y 1. Métodos. 114 Experimento 8. 1.4. Estimulación eléctrica intracerebral. El día de la sesión experimental, los animales se colocaron inicialmente en la pecera de cirugía con agua procedente de su pecera de residencia, con el fin de conectar los cables de estimulación. Se utilizaron cables finos (0,20mm de hilo de cobre esmaltado) para el segmento del cable de conexión más cercano al animal. Una vez conectados se aislaron e impermeabilizaron las conexiones con un adhesivo impermeabilizante. Los cables se conectaron mediante un conector situado en el techo de la habitación experimental al estimulador que controlaba las características de los estímulos eléctricos. El estímulo eléctrico consistió en un tren de pulsos de 2 segundos de duración y 50Hz de frecuencia. La duración de cada pulso fue de 0.2ms. La intensidad del estímulo se ajustó para cada electrodo a una intensidad un 25% inferior al umbral de una respuesta mínimamente observable (160μA ± 60μA). A CB D E F G Figura 39. Representación esquemática del tanque y el equipamiento experimental para el experimento de aversión condicionada al lugar mediante microestimulación eléctrica intracerebral. A, tanque experimental; B, cámara de video; C, ordenador equipado con un sistema de videotracking; D, interfaz de control de estímulos; E, estimulador; F, unidad de aislamiento; G, osciloscopio. 1. Métodos. 115 Experimento 8. 1.5. Procedimiento de evitación condicionada al lugar. El procedimiento experimental de entrenamiento consistió en tres fases que se representan esquemáticamente en la Figura 40. Este procedimiento se siguió consecutivamente con cada uno de los dos electrodos implantados en cada animal. Antes de empezar el entrenamiento se conectó aleatoriamente uno de los dos electrodos (Dm2 o techo óptico) y, a continuación, los animales fueron entrenados en las tres fases consecutivas del experimento. Posteriormente, se conectó el otro electrodo y el animal fue nuevamente entrenado en otras tres fases. Se estableció un intervalo de descanso de al menos una hora entre la estimulación de cada electrodo. Para cada animal y cada electrodo, en la primera fase se eligió al azar el compartimento del tanque en el que se estimulaba (compartimento A o compartimento B). En la segunda fase se invirtió el compartimento en el que el animal fue estimulado con respecto a la primera fase y en la tercera fase se realizó de nuevo una inversión con respecto a la segunda fase. Cada fase de entrenamiento tenía una duración de 30 minutos y la estimulación eléctrica se aplicaba cada vez que la cabeza del animal entraba en el compartimento de estimulación y cada 5 segundos mientras el animal permaneciera dentro de ese compartimento. Tras la finalización de cada fase, el animal era trasladado a un pequeño tanque opaco en el que permanecía por un periodo de descanso de 5 minutos. Fase 1 5’ 5’ Fase 2 Fase 3 Compartimento A Compartimento B Compartimento A Compartimento B Compartimento A Compartimento B Figura 40. Representación esquemática del procedimiento de aversión condicionada al lugar. Se representan las tres fases de estimulación consecutivas que se realizaron para cada uno de los dos electrodos. Cada fase tiene una duración de 30 minutos, con un intervalo de descanso de 5 minutos entre cada fase. Nótese que en las fases 2 y 3 se invierte el compartimento del tanque en la que el animal era estimulado (símbolo de descarga). 1. Métodos. 116 Experimento 8. 1.6. Análisis histológico de la localización de los electrodos. Al finalizar el procedimiento de aversión condicionada al lugar y con el objetivo de determinar la localización de los electrodos, se realizó para cada punto de estimulación una lesión aplicando un pulso continuo de 10 segundos con una intensidad de corriente un 50% inferior al valor umbral de estimulación. Transcurrido 24 horas los animales fueron sometidos a perfusión transcardíaca siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 1.3 del experimento 2. Tras la perfusión se realizó la extracción de los cerebros que fueron postfijados en la solución fijadora durante 24 horas y seccionados con un micrótomo rotatorio (Leica RM-2125RT). Las secciones fueron montadas en orden seriado en portaobjetos, teñidos mediante el método Nissl con acetato de cresilo al 5% y cubiertas con resina (DPX) y con cubreobjetos. Con la ayuda de un atlas del cerebro de la carpa dorada (Carassius auratus), se determinó la localización de la punta de los electrodos de estimulación. Los resultados mostraron que la punta de los electrodos implantados en la región Dm2 se encontraban dentro de los límites de esta región palial y a una profundidad entre 50-250 μm. Los electrodos implantados en el techo óptico se localizaban en las capas profundas a una profundidad aproximada de 350 micras, donde las respuestas motoras se provocan fácilmente. BA TO VCb Figura 41. Localización de los microelectrodos. A. Fotomicrografía de una sección sagital del techo óptico que muestra un ejemplo de una lesión electrolítica producida por el microelectrodo implantado. B. Fotomicrografía de una sección coronal del telencéfalo en el que se muestra un ejemplo de lesión electrolítica de un electrodo 2. Resultados. 117 Experimento 8. implantado en Dm2. Para la lesión se utilizó un pulso continuo de 10 segundos. Los círculos indican la localización de la lesión electrolítica. 2. Resultados. El principal resultado de este experimento es que la microestimulación eléctrica de Dm2 parece tener efectos aversivos, ya que los animales evitaron sistemáticamente los compartimentos del tanque que se emparejaban con la estimulación intracerebral de esta región palial. Sin embargo, la estimulación en el techo óptico no provocó cambios sobre la preferencia del animal. En la Figura 42 se muestra el porcentaje medio de evitación en el conjunto de las tres fases de entrenamiento tras la estimulación en Dm2 y en el techo óptico. Como puede observarse cuando los animales fueron estimulados en Dm2 tendían a evitar el compartimento del tanque emparejado con la estimulación, sin embargo, la estimulación del techo óptico no produjo ningún cambio de preferencia de compartimento. El análisis estadístico mediante una prueba t para muestras independientes mostró diferencias significativas en el porcentaje de evitación tras la estimulación en Dm2 frente a la estimulación en el techo óptico (t(46)=-10,570, p=.000), lo que permite confirmar el efecto aversivo de la estimulación en Dm2, pero no en el techo óptico. Se realizó un análisis más detallado del porcentaje de evitación que se observaba tras la estimulación en la región Dm2 y en el techo óptico a lo largo de las tres fases de estimulación que implicaban dos inversiones sucesivas respecto al compartimento del tanque donde los animales eran estimulados. En la Figura 43 se muestra el porcentaje de tiempo que los animales pasaron en el compartimento en el que eran estimulados en cada una de las fases del entrenamiento. Como puede verse, cuando los animales fueron estimulados en el techo óptico no evitaron el compartimento en el que eran estimulados en ninguna de las tres fases, permaneciendo en dicho compartimento aproximadamente el mismo tiempo que en el compartimento donde no fueron estimulados. Una prueba t permitió confirmar que cuando se estimulaba mediante el electrodo situado en el techo óptico no se encontraron diferencias significativas en ninguna de las tres fases entre el tiempo que pasaban 2. Resultados. 118 Experimento 8. los animales en el compartimento en el que eran estimulados y lo esperado por azar (Pruebas t para una muestra, t(8)=-1,971, p=0.089; t(8)=-.606, p=0.561; t(8)=1,458, p=183, para las fases 1, 2 y 3, respectivamente). En cambio, cuando los peces fueron estimulados mediante el electrodo situado en la región Dm2 evitaron sistemáticamente el compartimento en el que fueron estimulados en las tres fases del experimento, resultando significativamente inferior a lo esperado por azar el tiempo que pasaban en el compartimento en el que eran estimulados, en las tres fases del experimento (Pruebas t para una muestra, t(6)=-12,870, p=0.000; t(6)=- 16,883, p=0.000; t(6)=-21,418, p=0.000, para las fases 1, 2 y 3, respectivamente). Este resultado del tiempo en la zona estimulada significativamente inferior a lo esperado por el azar, explica el efecto aversivo que produce la activación de Dm2. %evitación 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Azar Dm2 TO * Figura 42. Porcentaje medio de evitación tras la estimulación en Dm2 y en el techo óptico (TO) en las tres fases del entrenamiento. El asterisco señala diferencias estadísticamente significativas (p<0.05). 2. Resultados. 119 Experimento 8. 0 20 40 60 80 Dm2 TO % tiempo en compartimento estimulado Azar Figura 43. Porcentaje medio de tiempo en el compartimento del tanque en el que eran estimulado en cada una de las tres fases del experimento para los electrodos situados en Dm2 y en el techo óptico (TO). Obsérvese que cuando los animales fueron estimulados en Dm2 tendieron a evitar las zonas del tanque en la que recibían la estimulación en las tres fases del experimento. En cambio, cuando eran estimulados en el techo óptico no evitaban las zonas en las que recibían la estimulación en ninguna de las tres fases del experimento. La ausencia de diferencias significativas entre las tres fases de entrenamiento durante la estimulación de Dm2 (F(2,10)=1,174, p=.348) y del techo óptico (F(2,16)=1,910, p=.180) permitió colapsar los datos del porcentaje de tiempo que los animales pasaban en el compartimento estimulado a lo largo de todo el entrenamiento. El análisis estadístico sobre esta medida promediada reveló diferencias significativas en el tiempo que pasaban los animales en el compartimento en el que fueron estimulados según el electrodo por el que fueran estimulado, Dm2 o techo óptico (t(29)=-8,436, p=.000; Figura 44). 2. Resultados. 120 Experimento 8. 0 10 20 30 40 50 60 70 Dm2 TO Azar * % tiempo en compartimento estimulado Figura 44. Porcentaje medio de tiempo en el compartimento en el que los animales eran estimulados durante las tres fases del experimento para los electrodos situados en Dm2 y en el techo óptico (TO). El asterisco señala diferencias significativas (p<0.05) El hecho de que la microestimulación eléctrica en Dm2 produjera sistemáticamente la evitación del compartimento en el que eran estimulados a lo largo de las tres fases de entrenamiento indica que este efecto es específico de la estimulación eléctrica de la región Dm2 y que no se debe a una preferencia inespecífica por alguno de los compartimentos del tanque experimental. En la Figura 45 se puede observar cómo cuando los animales fueron estimulados en la región Dm2 se produjo un rápido cambio de preferencia siempre hacia el compartimento en el que dejaban de ser estimulados. Este aprendizaje se producía en los primeros minutos en cada una de las tres fases experimentales. El análisis estadístico mediante una prueba t para muestras relacionadas mostró diferencias significativas cuando se compararon los últimos cinco minutos de cada fase con los 5 primeros minutos de la fase siguiente a lo largo del experimento (fase 1 vs fase 2, t(7)=-4,387, p=.003; fase 2 vs fase 3 t(7)=6,903, p=.000). Sin embargo, la estimulación en el techo óptico no produjo estos cambios rápidos de preferencia, independientemente del compartimento del tanque en el que eran estimulados (fase 1 vs fase 2, t(9)=1,393, p=.197; fase 2 vs fase 3, t(9)=2,020, p=.074). Estos resultados sugieren que mientras que la activación del techo 2. Resultados. 121 Experimento 8. óptico no produce ningún efecto motivacional aversivo, la estimulación del área Dm2 podría producir un estado de malestar o miedo en el animal. Este malestar se asoció con las señales externas (lugar) en las que se produjo la estimulación lo que facilitó el aprendizaje rápido de evitación del compartimento asociado con dicha estimulación en cada una de las fases del experimento. Los animales adaptaron su conducta rápidamente a los cambios de contingencia, reaprendiendo a evitar el compartimento en el que recibían la estimulación en cada inversión subsiguiente (Figura 45). Figura 45. Efectos de la microestimulación eléctrica en Dm2 y en el techo óptico a lo largo de las tres fases del experimento. Las curvas muestran para cada fase del entrenamiento el porcentaje medio de tiempo en cada compartimento en bloques de 5 minutos. Abajo se muestran los mapas de calor de la actividad de un animal representativo durante la estimulación del electrodo situado en Dm2 (izquierda) y durante la estimulación del electrodo situado en el techo óptico (derecha) en cada una de las fases del experimento. El símbolo de descarga indica el compartimento en el que se presentó la estimulación en cada fase. Obsérvese la tendencia a evitar sistemáticamente el compartimento emparejado con la estimulación en Dm2 en las tres fases del experimento, invirtiendo incluso su preferencia en las fases 2 y 3 respecto a la fase anterior. En cambio, la estimulación en el techo óptico no produjo ningún cambio en la preferencia en relación con el compartimento en el que los animales eran estimulados en ninguna de las tres fases experimentales. % tiempo en cada compartimento % tiempo en cada compartimento 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Bloques de 5 min Bloques de 5 min Bloques de 5 min Bloques de 5min Bloques de 5 min Bloques de 5 min Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 1 Fase 2 Fase 3 Compartimento A Compartimento B Compartimento A Compartimento B Dm2 Techo óptico 122 Discusión general. El primer objetivo del presente trabajo consistió en la identificación funcional de áreas del palio del telencéfalo de la carpa dorada que pudieran estar implicadas en el procesamiento de los estímulos somatosensoriales. Mediante la combinación de técnicas de estimulación sensorial y de registro óptico utilizadas en el Experimento 1 pudimos confirmar la presencia de un área somatosensorial localizada en el área Dm4, en el polo caudal del palio telencefálico de la carpa dorada. La estimulación somatosensorial, consistente tanto en un chorro de agua como en una leve descarga eléctrica en la base de la aleta dorsal, provocó la activación súbita de este área en un patrón espacio-temporal característico circunscrito dentro de los límites anatómicos de Dm4, con escasa variabilidad entre sujetos en cuanto a su localización (Figuras 3, 4 y 5), lo que sugiere una respuesta sensorial de baja latencia. La estimulación repetida produjo respuestas con escasa variabilidad tanto en relación con el área activada como a la magnitud de la respuesta máxima evocada (Figura 6). Esta región somatosensorial del palio parece codificar también información sobre la intensidad de la estimulación somatosensorial, ya que el aumento de la intensidad del estímulo produjo un incremento sistemático tanto en la respuesta máxima evocada como en el área activada (Figura 7). Finalmente, los experimentos de cartografía funcional han mostrado que el área somatosensorial identificada en Dm4 presenta una organización somatotópica, es decir, contiene un mapa corporal que podría representar espacialmente la localización de los estímulos somatosensoriales (Figura 8). El mapa somatosensorial de la región Dm4 del palio de la carpa dorada está organizado, sin embargo, como una representación con escasa definición espacial, en la que las diferentes zonas cerebrales que se activan desde diferentes localizaciones corporales muestran un alto grado de solapamiento, guardando este mapa más similitud con las representaciones somatosensoriales de la corteza insular de los mamíferos que con los mapas de cartografía refinada DISCUSIÓN GENERAL 123 característicos de las áreas somatosensoriales del neocórtex (Craig, 2003; del Águila, 2024; Henderson et al., 2007). Los resultados obtenidos en el Experimento 1 del presente trabajo de investigación son convergentes con los de experimentos previos de cartografía funcional del palio de la carpa dorada realizados en nuestro laboratorio, en los que también se identificó un área implicada en el procesamiento somatosensorial localizada en la región Dm4 (del Águila, 2024; Ocaña, 2009; Reiriz-Rojas, 2017) y en su conjunto representan la primera descripción concluyente de organización topográfica de áreas sensoriales en el palio de los peces teleósteos. Estos experimentos revelaron también la presencia de un área sensorial auditiva situada en una posición lateral al área somatosensorial y parcialmente solapada con ella, además de un área gustativa situada en la región Dm3, en una posición anterior a la región somatosensorial aquí descrita, además de un área visual localizada en el área Dldm de la región lateral del palio (Ocaña, 2009; Reiriz-Rojas, 2017). Asimismo, resultados recientes de experimentos adicionales realizados en nuestro laboratorio han mostrado que Dm4 no sólo se activa con la estimulación somatosensorial sino que también lo hace con la estimulación nociceptiva (del Águila, 2024). En su conjunto, los resultados funcionales obtenidos en nuestro laboratorio coinciden al menos parcialmente con los de otro trabajos funcionales previos, como el estudio de Prechtl y colaboradores (1998), en el que utilizando técnicas electrofisiológicas, identificaron áreas parcialmente segregadas que responden a diferentes modalidades sensoriales en el palio de un pez mormírido. El conjunto de nuestros resultados funcionales sobre la organización sensorial del palio coincide también en gran medida con los datos hodológicos disponibles hasta el momento, que describen que las regiones caudales del área Dm de los teleósteos recibe importantes entradas somatosensoriales y de la línea lateral, así como de otras modalidades sensoriales, procedentes del complejo preglomerular y otras regiones diencefálicas y del tronco cerebral (Ito & Yamamoto, 2009; Northcutt, 2006, 2008; Ocaña, 2009; Yáñez et al., 2022). Estos trabajos previos funcionales y hodológicos, sin embargo, ofrecen en general una información bastante imprecisa acerca del número, la localización, DISCUSIÓN GENERAL 130 de control motor. Dado que las áreas motoras se han definido tradicionalmente también como aquellas regiones desde las que se pueden provocar movimientos con intensidades más bajas de estimulación eléctrica (Donoghue & Wise, 1982; Fritsch & Hitzig, 1870; Graziano, Taylor, & Moore, 2002; Penfield & Boldrey, 1937; Woolsey et al., 1952), realizamos también en este trabajo una serie de experimentos empleando la técnica de microestimulación eléctrica localizada para evaluar si alguna región del palio de la carpa dorada era excitable y producía algún tipo de respuesta motora (Experimentos 4, 5 y 6). La técnica de microestimulación eléctrica intracerebral ha sido empleada frecuentemente en mamíferos para identificar áreas motoras y analizar su organización interna (Asanuma & Rosén, 1972; Asanuma & Sakata, 1967; Asanuma & Ward, 1971; Bury & Jones, 2002; Kleim et al., 1998, 2002; Monfils et al., 2005; Nudo et al., 1990; Rosén & Asanuma, 1972; Watson et al., 2016; Young et al., 2011). Esta técnica se ha empleado también de forma sistemática para estudiar la implicación del techo óptico de los peces teleósteos en la generación de las respuestas motoras (Demski, 1982, 1983; Demski et al., 1975; Herrero et al., 1998; Rodríguez, 1996; Salas et al., 1995, 1997), por lo que en los presentes experimentos utilizamos también electrodos implantados en el techo óptico a modo de grupo de referencia y control. Como puede observarse en las Figuras 25, 26, 27, 30, 31 y 32, la estimulación eléctrica en el techo óptico de la carpa dorada produjo respuestas motoras de forma sistemática y consistente. La estimulación del techo óptico generó respuestas de orientación contralaterales y graduadas en función de los parámetros de estimulación tanto en los animales con electrodos implantados de forma crónica y con libertad de movimientos (Figuras 25-27), como en una preparación aguda (Figuras 30-31). Las respuestas motoras provocadas desde el techo óptico consistieron en movimientos integrados y coordinados de grupos musculares y plantas motoras diferentes, incluyendo movimientos oculares conjugados de tipo sacádico, así como movimientos coordinados de las aletas y contracciones coordinadas de la musculatura axial que producían desplazamientos del animal en el plano horizontal. Estas respuestas presentaban, además, un curso temporal indistinguible del de las respuestas DISCUSIÓN GENERAL 131 naturales. Las características métricas y cinéticas (amplitud, dirección, velocidad y duración) de las respuestas provocadas por la estimulación del techo óptico variaron, además, de forma gradual y sistemática conforme se modificaron los parámetros de intensidad o frecuencia de la estimulación eléctrica. Todos estos resultados son coincidentes con los resultados obtenidos en estudios previos de microestimulación eléctrica del techo óptico de los teleósteos (Demski, 1982, 1983; Herrero et al., 1998; Rodríguez, 1996; Salas et al., 1995, 1997). Por el contrario, la microestimulación eléctrica localizada en la región Dm4 resultó completamente ineficaz para provocar respuestas motoras, tanto en el animal con electrodos implantados crónicamente y con libertad de movimientos (Figuras 25-27), como en la preparación aguda, que permitía medir de forma muy precisa las respuestas motoras de los ojos y los apéndices del animal (Figuras 30 y 31). Las respuestas en Dm4 fueron negativas a pesar de haberse probado un amplio rango de intensidades, frecuencias y duraciones de la estimulación eléctrica. La estimulación eléctrica en Dm4, a diferencia de la estimulación del techo óptico, fue también completamente ineficaz para alterar el patrón rítmico espontáneo de movimientos oculares característico de la carpa dorada inmovilizada (Figura 32), resultado que es convergente con otros obtenidos en estudios anteriores que indican que este patrón espontáneo de movimientos oculares tampoco resulta alterado por la ablación de los hemisferios telencefálicos en la carpa dorada (Dietrich et al., 2002; Rodríguez, 1996). Una posible objeción a estos resultados negativos podría ser la posibilidad de que, a pesar del amplio rango de parámetros de estimulación empleados, los parámetros de estimulación eléctrica utilizados no fueran los apropiados para activar al área Dm4. Sin embargo, los resultados presentados en la Figura 29 permiten refutar esta posible objeción. A pesar de que la microestimulación eléctrica resultó ineficaz para generar respuestas motoras dentro del amplio rango de parámetros de estimulación utilizado, demostró ser eficaz para producir niveles de activación neural en el área Dm4 semejantes a los provocados por la estimulación en el techo óptico. La activación del área Dm4 se produjo incluso utilizando valores de intensidad eléctrica muy bajos. Además, los niveles de activación del área Dm4 producidos por los distintos valores de DISCUSIÓN GENERAL 132 intensidad utilizados fueron similares a los observados en el techo óptico (Figura 29). Por lo tanto, dado que la estimulación eléctrica produce la activación tanto del área Dm4 como del techo óptico, puede concluirse que, a diferencia del techo óptico, la actividad del área Dm4 no está vinculada a la generación o el control de las respuestas motoras en la carpa dorada. El conjunto de resultados de los experimentos de este trabajo indica que la región Dm4 del palio, que contiene una representación somatosensorial organizada topográficamente parece no estar implicada en la generación de respuestas motoras ni en el control del movimiento. Aunque generalmente las áreas motoras están asociadas topográficamente a representaciones somatosensoriales en el palio de los vertebrados, y que es poco probable la presencia de áreas motoras en ausencia de un sistema de retroalimentación somatosensorial, mediante el Experimento 6 realizamos un mapeo exhaustivo de la posible existencia de áreas motoras en todo el palio del telencéfalo de la carpa dorada. De esta forma se extendió el mapeo mediante microestimulación eléctrica a toda la superficie dorsal del palio, estimulándose a cuatro profundidades diferentes (250, 500, 1000 y 1500µm), lo que cubrió prácticamente la totalidad del palio en todo su volumen (Figura 34). Como puede apreciarse en la Figura 34, la totalidad de los puntos probados en el palio fueron inefectivos para provocar respuestas motoras. Tan sólo en los puntos situados en una posición y una profundidad compatible con la localización de los núcleos pretectales la estimulación generó respuestas motoras de tipo sacádico, con umbrales similares a los del techo óptico (Figuras 34 y 36). Cabe destacar que este mapeo exhaustivo incluye también a las regiones Dorsodorsal (Dd) y Dorso-central (Dc) del palio (Figuras 34 y 35). El resultado negativo en todos los puntos localizados en las áreas Dd y Dc es especialmente relevante ya que algunos autores han propuesto la hipótesis de que estas regiones del palio de los teleósteos constituyen un sector histogenético independiente que podría considerarse homólogo al neocórtex de los mamíferos (Mueller, 2022; Mueller et al., 2011; Porter & Mueller, 2020). Puesto que el neocórtex de los mamíferos se caracteriza por tener una implicación directa en la generación de respuestas motoras, cabría esperar que, si esta hipótesis fuera correcta, las regiones Dd DISCUSIÓN GENERAL 133 y Dc tuvieran algún tipo de implicación en la generación del movimiento. Sin embargo, la estimulación de Dd y Dc fue ineficaz para producir movimientos en la carpa dorada, incluso con valores de estimulación elevados. En conclusión, todos los resultados discutidos hasta aquí apoyan la hipótesis de que el palio telencefálico de la carpa dorada no está involucrado directamente en el control motor, y que, a diferencia de otros centros premotores, como por ejemplo el techo óptico, no tiene un acceso directo a los centros de generación del tronco del encéfalo. Funcionalmente, estos resultados no respaldan la presencia de un sector del palio dorsal equivalente al neocórtex en los teleósteos ya que las funciones motoras son una característica primordial de la neocorteza. Cómo discutiremos más adelante, los presentes resultados, junto con los obtenidos en otros estudios realizados recientemente en nuestro laboratorio (del Águila, 2024; Reiriz-Rojas, 2017), nos llevan a reevaluar críticamente las hipótesis existentes sobre las homologías del palio de los teleósteos y a elaborar una nueva hipótesis que otorga una identidad límbica y mesolímbica al palio de los teleósteos. La transición filogenética hacia los peces actinopterigios, y en especial la transición a los teleósteos, supuso la aparición de un buen número de innovaciones evolutivas y la adquisición de importantes avances en las capacidades motoras. La aparición de finas aletas que pueden cambiar de posición y de curvatura con precisión, formada por radios rígidos, plegables y muy móviles, con músculos insertados en la base de cada radio individual y con diversos tipos de terminaciones sensoriales, que permiten a estos animales cambiar de forma precisa las fuerzas que ejercen en el agua, posibilitó una variedad y precisión en los movimientos sin precedentes en sus ancestros no teleósteos (Striedter & Northcutt, 2020; Williams IV et al., 2013). Las aletas pectorales de los peces teleósteos están dotadas de un enorme rango de movilidad y de capacidad de cambio de curvatura y de superficie propulsora, lo que permite al animal realizar movimientos y cambios de orientación graduados y precisos, realizar y mantener ajustes posturales y cambios de inclinación del eje corporal, mantenerse inmóviles en aguas con corrientes ligeras y turbulencias, subir o bajar en vertical en la columna de agua, frenar en seco o incluso nadar hacia atrás. Los teleósteos también desarrollaron DISCUSIÓN GENERAL 134 una aleta caudal más compleja que permite movimientos independientes de sus lóbulos dorsal y ventral. Además de ello, otra importante innovación evolutiva en los teleósteos fue la modificación de las mandíbulas y del aparato bucal, que se transformó en una estructura más compleja y móvil que la de sus ancestros, y que puede ser protruida con rapidez y generar suficiente fuerza para succionar partículas de comida o manipular objetos (Mehta & Wainwright, 2008; Striedter & Northcutt, 2020). Todas estas innovaciones y modificaciones morfológicas y mecánicas tuvieron que ir acompañadas de las correspondientes innovaciones a nivel neural necesarias para controlar las nuevas estructuras y producir nuevas y más complejas y refinadas formas de control motor. En su conjunto, todas estas características hacen que los peces teleósteos sean mucho más ágiles que sus ancestros de aletas radiadas (Striedter & Northcutt, 2020) y que posean capacidades motoras de hecho sólo comparables a las de los mamíferos y las aves. No obstante, los resultados del presente trabajo de investigación muestran que el palio del telencéfalo no está implicado en funciones sensoriomotoras y de control motor directo, lo que apoya la idea de que los circuitos cerebrales que posibilitan el refinado control motor que muestran los peces teleósteos no dependen del palio del telencéfalo y que, por tanto, no son semejantes en este aspecto a los de los mamíferos. Probablemente, más que en el telencéfalo, las innovaciones evolutivas en los sistemas con control motor que pudieron ocurrir en la transición hacia los peces actinopterigios, y hacia los teleósteos en particular, quizás tuvieron lugar principalmente en los sistemas motores descendentes de la formación reticular del tronco cerebral, y especialmente en el sistema rubroespinal, en los circuitos del cerebelo, y en los sistemas tecto-reticulares, cuya importancia podría haber aumentado en relación con la evolución de las extremidades pares (Ten Donkelaar, 2001). Recientemente se ha propuesto que, en un proceso evolutivo divergente, algunas estructuras diencefálicas e incluso hipotalámicas, como el lóbulo inferior, podrían haber evolucionado de forma divergente en los teleósteos y desempeñar un papel importante en los mecanismos de control motor y las capacidades de manipulación de objetos en los peces teleósteos (Estienne et al., 2023, 2024; Yamamoto et al., 2017). La DISCUSIÓN GENERAL 135 presencia de un área somatomotora para el control motor directo en el palio podría ser una característica derivada propia de los mamíferos, es decir, una adquisición reciente de la historia evolutiva de este grupo de vertebrados (Kaas, 2004, 2011b, 2011a; Ten Donkelaar, 2001). En este sentido, aunque otras vías descendentes que se originan en el tronco del encéfalo son básicamente idénticas a las de los mamíferos, no se ha identificado un homólogo del tracto corticoespinal en los teleósteos y tampoco parece encontrarse un homólogo del tracto corticoespinal en los demás vertebrados no mamíferos (Nieuwenhuys et al., 1998; Ten Donkelaar, 2001; Yamamoto et al., 2017). Por lo que el control directo del sistema motor espinal podría ser una característica derivada que evolucionó en los mamíferos (Butler & Hodos, 2005; Heffner & Masterton, 1983; Heldmaier & Neuweiler, 2003; Kuypers, 1981; Nieuwenhuys et al., 1998; Petras, 1968; Rosslenbroich, 2014; Ten Donkelaar, 2001; Yamamoto et al., 2017), y quizás, de forma separada y paralela, en las aves (Rosslenbroich, 2014; Ten Donkelaar, 2001). Por lo tanto, los resultados del presente estudio sugieren que la organización funcional del palio del telencéfalo de los peces teleósteos es radicalmente diferente de la del neocórtex de los mamíferos. En diferentes especies de mamíferos puede observarse la presencia de áreas motoras que mantienen un solapamiento al menos parcial con las representaciones somatosensoriales del palio (Chapin & Woodward, 1986; Donoghue et al., 1979; Donoghue & Wise, 1982; Hall & Lindholm, 1974; Sanderson et al., 1981; Sanderson et al., 1984; Sapienza et al., 1981). En roedores y primates, el área somatosensorial primaria, localizada en el córtex agranular, se solapa parcialmente con el área motora primaria (Donoghue & Wise, 1982; Graziano, Taylor, & Moore, 2002; Rizzolatti & Luppino, 2001). Es frecuente encontrar respuestas sensoriales tanto en la corteza motora primaria como en la corteza premotora. En la corteza motora primaria pueden registrarse neuronas con campos receptivos táctiles pequeños, especialmente en las zonas de las manos o de los dedos individuales, además de respuestas a la rotación pasiva de las articulaciones, y campos receptivos generalmente más grandes en la corteza premotora (Donoghue & Wise, 1982; Hall & Lindholm, 1974; Sanderson et al., 1981). En diversas DISCUSIÓN GENERAL 136 especies de mamíferos, las áreas somatosensoriales del palio solapadas con el área motora reciben también entradas procedentes del núcleo ventrolateral del tálamo (Donoghue et al., 1979; Donoghue & Wise, 1982; Jones & Leavitt, 1974), una característica propia del córtex motor que al igual que las áreas motoras, proyectan a la formación reticular y a la médula espinal (Donoghue & Wise, 1982; Kievitt & Kuypers, 1977; Krettek & Price, 1977; Sakai, 1982; Strick, 1973, 1976). Incluso en humanos, a pesar de que se ha diferenciado un área motora primaria localizada en la circunvolución precentral y un área somatosensorial localizada en el giro postcentral del lóbulo parietal, diversos estudios sugieren que la corteza somatosensorial y motora no se encuentran separadas de forma bien definida por el surco central, sino que existe solapamiento entre estas dos regiones. Así por ejemplo, Nii (1996) registró respuestas sensoriales y también respuestas motoras tanto en el giro precentral como en el giro postcentral de 33 pacientes con electrodos implantados subduralmente. El solapamiento entre las áreas somatosensoriales y motoras podría desempeñar una función importante para el control cortical de movimientos que son iniciados por entradas cutáneas de las extremidades o guiados mediante retroalimentación somatosensorial (Donoghue & Wise, 1982; Hall & Lindholm, 1974). Las áreas motoras del neocórtex de los mamíferos están implicadas en la ejecución de una serie de transformaciones sensoriomotoras complejas y muy específicas, como por ejemplo la transformación de la información visual sobre objetos y la ubicación de los objetos en acciones dirigidas a metas apropiadas, el emparejamiento de las acciones observadas realizadas por otros sujetos con las representaciones motoras internas de esas acciones (mecanismo de neuronas espejo), o en procesos de toma de decisiones que conducen al inicio de la acción (Graziano, Taylor, & Moore, 2002; Rizzolatti & Luppino, 2001). Las áreas motoras del neocórtex de los mamíferos, además de ejercer un control directo sobre los centros motores mesencefálicos y medulares que controlan las contracciones de la musculatura, a través de las vías corticorubrales, corticoreticulares, corticoespinales, y otras vías descendentes, desempeñan un amplio rango de funciones que afectan a diferentes ámbitos del comportamiento (Graziano, Taylor, & Moore, 2002; Rizzolatti & Luppino, 2001). DISCUSIÓN GENERAL 137 En primer lugar, las áreas motoras del neocórtex de los mamíferos participan en una serie de transformaciones sensoriomotoras que convierten la información visual y de otras modalidades sensoriales sobre la identidad y localización de los objetos en acciones dirigidas hacia metas apropiadas. Diferentes circuitos organizan también las secuencias y temporizaciones de los movimientos que conforman las acciones. Además, las áreas motoras del neocórtex de los mamíferos están implicadas en procesos de toma de decisiones que llevan a la iniciación de la acción. La presencia de áreas motoras comparables a las del neocórtex de los mamíferos en el palio de aves y reptiles es una cuestión que está aún en discusión (véase por ejemplo (Jarvis, 2009; Kaas, 2017; Medina & Reiner, 2000; Naumann & Laurent, 2017). Aunque la información disponible es mucho más escasa que en mamíferos, algunos autores han sugerido la posible presencia de áreas somatosensoriales y motoras solapadas en aves y reptiles que podrían ser equivalentes a las áreas somatosensoriales y motoras del neocórtex de los mamíferos. En las aves se ha descrito la presencia de áreas somatosensoriales en el palio (Butler & Hodos, 2005; Jarvis, 2009, 2004; Ulinski, 1983). La zona rostral del Wulst de las aves recibe información somatosensorial procedente de los núcleos de la columna dorsal a través del tálamo y podría contener también un área motora que podrían estar al menos parcialmente solapadas, y se ha descrito también la presencia de posibles zonas motoras en la cresta ventricular dorsal y en el arcopalio (Delius & Bennetto, 1972; Karlen, 1991; Karten, 1971; Knudsen et al., 1995; Manger et al., 2002; Medina & Reiner, 1997, 2000; Pettigrew & Frost, 1985; Ulinski, 1983; Wild, 1992; Zecha, 1962). Sin embargo, las áreas motoras del palio de las aves podrían no ser homólogas a las áreas motoras del neocórtex de los mamíferos, sino que podrían representar un caso típico de evolución paralela (convergencia) de una característica funcional con una historia filogenética diferente (Rosslenbroich, 2014; Ten Donkelaar, 2001, 2009). La presencia de áreas motoras semejantes a las del neocórtex de los mamíferos en las aves es realidad una cuestión controvertida, ya que aunque la estimulación eléctrica localizada en algunas regiones del palio de las aves puede producir algún tipo DISCUSIÓN GENERAL 138 de actividad locomotora y facilitar la producción de conductas específicas de la especie, los estudios de lesión disponibles indican que esas regiones del palio no son esenciales para la generación y el control de los movimientos en las aves (Jarvis, 2008). Los resultados de algunos estudios de lesión en aves sugieren que dichas áreas supuestamente motoras podrían participar en la modulación de los movimientos o en el aprendizaje del canto de las aves, pero no ser esenciales en la generación de los movimientos o para la producción de las vocalizaciones (Jarvis, 2004, 2008). Por lo tanto, cabe la posibilidad que el palio de las aves estuviera en realidad implicado más bien en funciones “límbicas” que en las funciones de control sensorio-motor características del neocórtex de los mamíferos. Se requieren estudios adicionales para confirmar que, en el caso de las aves, las áreas motoras descritas en el palio por algunos autores sean de áreas propiamente “motoras” y no regiones de carácter límbico y paralímbico desde la que se generan respuestas emocionales con componentes motores. En el caso de los reptiles, aunque la evidencia disponible en este caso es mucho menor y menos concluyente que en aves, algunos trabajos iniciales sugerían la presencia de área motoras en el palio de tortugas, caimanes, iguanas y lacértidos, que podrían estar además solapadas o parcialmente solapadas con áreas somatosensoriales (Bagley & Richter, 1924; Goldby, 1937; Hoogland & Vermeulen-Vanderzee, 1989; Johnston, 1916; Kunzle & Woodson, 1982; Manger et al., 2002; Medina & Reiner, 2000; Schapiro & Goodman, 1969; Siemen & Künzle, 1994). En base a estos trabajos clásicos, algunos autores han sugerido que la presencia de áreas somatosensoriales y motoras solapadas en el palio podría representar la condición primitiva en los amniotas (Johnston, 1916; Medina & Reiner, 2000). Sin embargo, experimentos posteriores de estimulación eléctrica y de lesión de las áreas del palio receptoras de información somatosensorial de la cresta ventricular dorsal y del palio dorsal de los reptiles indican que esas regiones no son esenciales para la generación y control del movimiento, pudiendo estar más bien implicadas en funciones de modulación emocional y en la regulación de conductas típicas de la especie, como patrones de conducta agresiva, defensiva y de cortejo (Bremer et al., 1939; Distel, 1976, 1978; Greenberg, 1977; Greenberg DISCUSIÓN GENERAL 139 et al., 1979, 1988; Jarvis, 2009; Keating et al., 1970; Naumann & Laurent, 2017; Peterson, 1980; Schapiro & Goodman, 1969; Sugerman & Demski, 1978). También se ha sugerido que la estimulación eléctrica podría haber provocado respuestas motoras en algunos de los estudios antiguos debido a la propagación de la corriente a áreas subcorticales (Nudo & Frost, 2007; Peterson, 1980). En el caso de los anfibios y reptiles, las proyecciones telencéfalo-espinales se encuentran en el telencéfalo basal, y podrían ser homólogas a las neuronas amigdaloespinales de los mamíferos (Nudo & Masterton, 1988). Estos resultados están en concordancia, por tanto, con la hipótesis tradicional de que la presencia de áreas somatomotoras del palio del telencéfalo es una característica derivada propia de los mamíferos, una adquisición reciente en la historia evolutiva de este grupo de vertebrados (Kaas, 2004, 2011b, 2011a; Nieuwenhuys et al., 1998; Ten Donkelaar, 2001), y no una característica primitiva de los amniotas (Karten, 1991, 1997, 2013; Karten & Shimizu, 1989; Medina & Reiner, 2000). Según esta interpretación, las áreas con funciones aparentemente motoras descritas en el palio de varias especies de reptiles en estos trabajos antiguos podrían no ser en realidad áreas motoras propiamente comparables a las del neocórtex de los mamíferos, sino más bien a áreas de regiones paralímbicas implicadas en la generación de reacciones emocionales con un componente conductual motor (Bremer et al., 1939; Distel, 1976, 1978; Greenberg, 1977; Greenberg et al., 1979, 1988; Keating et al., 1970; Naumann & Laurent, 2017; Peterson, 1980; Schapiro & Goodman, 1969; Sugerman & Demski, 1978). En este sentido, otros autores consideran que las áreas somatosensoriales y motoras equivalentes a las del palio de los mamíferos podrían haber estado ausentes en el palio de los amniotas ancestrales y que por tanto estas áreas podrían haber evolucionado de forma independiente en aves y mamíferos (Briscoe & Ragsdale, 2019; Nudo & Frost, 2007; Ten Donkelaar, 2001, 2009). Finalmente, existen muy pocos datos disponibles en la actualidad sobre la posible presencia de mapas somatosensoriales y motores en el palio de otros grupos de vertebrados, como los peces actinopterigios no-teleósteos y los condrictios. Recientemente se ha propuesto que el palio de las lampreas posee regiones