Evaluación inmunonutricional del amaranto. Desarrollo de productos proteicos de alto valor añadido

EVALUACIÓN INMUNONUTRICIONAL DEL AMARANTO. DESARROLLO DE PRODUCTOS PROTEICOS DE ALTO VALOR AÑADIDO INSTITUTO DE LA GRASA Departamento de Alimentación y Salud FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología ALICIA MARTÍNEZ LÓPEZ TESIS DOCTORAL 2022 EVALUACIÓN INMUNONUTRICIONAL DEL AMARANTO. DESARROLLO DE PRODUCTOS PROTEICOS DE ALTO VALOR AÑADIDO INSTITUTO DE LA GRASA Departamento de Alimentación y Salud FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología Memoria presentada por Dña. Alicia Martínez López para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Dr. SERGIO MONTSERRAT DE LA PAZ, Profesor del Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología de la Universidad de Sevilla Dra. MARÍA DEL CARMEN MILLÁN LINARES, Responsable de la Unidad de Biología Celular del Instituto de la Grasa del Consejo Superior de Investigaciones Científicas CERTIFICAN: Que la Tesis Doctoral titulada “EVALUACIÓN INMUNONUTRICIONAL DEL AMARANTO. DESARROLLO DE PRODUCTOS PROTEICOS DE ALTO VALOR AÑADIDO” realizada por Dña. Alicia Martínez López para optar al grado de Doctor, ha sido llevada a cabo bajo nuestra dirección. V.º B.º Los Directores Dr. Sergio Montserrat de la Paz Dra. Mª del Carmen Millán Linares Dr. VÍCTOR SÁNCHEZ MARGALET, Catedrático del Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología de la Universidad de Sevilla, CERTIFICA que Dña. Alicia Martínez López cumple los requisitos académicos (R.D. 99/2011) para optar al grado de Doctor. V.º B.º El Tutor Dr. Víctor Sánchez Margalet “Caminante, no hay camino, se hace camino al andar…” A ti, abuela Luisa, por enseñarme el valor de cada oportunidad. AGRADECIMIENTOS Me gustaría comenzar agradeciendo, en primer lugar, a mis directores de tesis, Sergio Montserrat de la Paz y María del Carmen Millán Linares, por la oportunidad que me han dado. Por su disposición siempre a ayudarme, por su paciencia y por hacer que todo fuera siempre tan fácil con ellos. Así mismo, agradecer al departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología de la Universidad de Sevilla y al departamento de Alimentación y Salud del Instituto de la Grasa con sus respectivos directores, por permitir desarrollar este trabajo en sus grupos e instalaciones, así como a los compañeros de ambos departamentos que me han ayudado para que todo saliera adelante. Así mismo, no quiero olvidarme de aquellas personas que me dieron la primera oportunidad en el mundo de la investigación y me enseñaron la base para desarrollar mi carrera investigadora. A Antonio Carrillo, a mis compañeros Nuria e Ivan por enseñarme tanto desde que llegue al laboratorio, recién acabada la carrera, y tuvieron la paciencia y tesón de formarme, y a Guille y Ana por acompañarme también en esa etapa. Por último, y no menos importante, me gustaría agradecer a mi familia y a mi marido, por creer más en mí que yo misma, por su apoyo incondicional para que siga luchando siempre por lo que me propongo y no dejar que me rinda nunca. A mis abuelas, porque siempre están presentes para mí y son una razón más para no abandonar. Sé que hubieran estado orgullosas de su nieta. GRACIAS. 2 3 INTRODUCCIÓN Amaranthus caudatus L. Características y usos La familia Amaranthaceae es considerada generalmente como la “familia del Amaranto”. En la actualidad también es conocida como el cultivo del tercer milenio. Basado en estudios taxonómicos, la familia se divide en dos secciones denominadas Amaranthus saucer y Blitopsis dumort. La palabra "amaranto" proviene de la palabra griega "amarantos" que significa "no marchito"; este término se aplicó a esta planta para resaltar sus abundantes características, simbolizando la inmortalidad [1]. Según la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación), el género amaranto se compone principalmente de unas 70 especies, la mayoría de ellas nativas de América y solo 15 especies provenientes de Europa, Asia, África y Australia. La división de especies se basa en la utilización de la planta, diferenciando entre especies en las que se utiliza el grano de amaranto, la parte vegetal, su uso ornamental o si simplemente es considerada maleza [2]. Dentro de los conocidos como amarantos de grano encontramos cuatro especies, A. hypochondriacus, A. cruentus, A. caudatus, y A. edulis [3, 4]. El género Amaranthus generalmente incluye plantas anuales monoicas excepto alguna forma dioica (muy restringida en distribución y tiene una aspecto ramificado y tupido). La planta puede medir desde 0,3 a 5 metros dependiendo de la especie y las hojas son oblongas y elípticas con un color verde de tonalidades claras u oscuras y que 4 puede presentar pigmentaciones rojas. Las inflorescencias son muy prominentes y coloridas, pudiendo presentar de 100 a 250 flores por glomérulo [4]. Los granos de polen son de forma esférica y las semillas son pequeñas y lenticulares con un diámetro promedio de 1 a 1,5 mm [5, 6]. El color de las semillas varía entre especies, pudiendo ser desde color marfil a negras [4, 6-8]. En la Figura 1 se pueden apreciar detalles de la planta de amaranto. Figura 1. Detalles de las características botánicas de las hojas, inflorescencias y semillas de Amaranthus. Los amarantos son un grupo destacado dentro de las plantas clasificadas como pseudocereales, con un gran potencial para prevenir la desnutrición, especialmente en los países en desarrollo 5 y con deficiencia de alimentos [9]. Los pseudocereales se definen como frutos o semillas de especies distintas a las herbáceas que se consumen de forma muy similar a los cereales y son eficaces suplementos nutricionales de los mismos. Actualmente, el amaranto es considerado como uno de los pocos cultivos polivalentes que suministran semillas en grandes cantidades, pudiendo ser utilizadas de diferentes formas, es decir, como pseudocereal, como sabrosa verdura de hoja de alta calidad nutricional, y también como alimento y pienso animal [9-11]. Comparados con el trigo, el arroz y la avena, los granos o semillas de amaranto no contienen gluten [12] y poseen un alto contenido en proteínas, incluyendo un perfil equilibrado de aminoácidos [9]. La mayoría de las especies del género Amaranthus spp. son nativas de América, con una alta variación fenotípica [13]. La semilla de amaranto se cultivó por primera vez en América, en el período prehistórico. La evidencia más antigua se encontró en una excavación arqueológica en una cueva en Tehuacán, México, donde encontraron semillas con una antigüedad de 6000 años. Este hecho sugiere que el amaranto se utilizaba como alimento principal en Centroamérica durante el período maya y azteca [14], aunque después de la colonización de América, su uso disminuyó significativamente [13]. Es decir, el amaranto es una de las primeras plantaciones conocidas, cultivada y utilizada extensamente por los aztecas, quienes la consideraban un superalimento. De hecho, el amaranto no solo se ha consumido por su semilla, sino también por sus hojas ricas en proteínas y micronutrientes [1]. Por ejemplo, en 6 India y otros países asiáticos las hojas de amaranto se comen como las espinacas, es por ello que es conocida como “espinaca china” [15]. Hoy en día, el amaranto se conoce a menudo como kiwicha. Se cultiva en pequeña escala en algunos lugares del mundo como México, Guatemala, Perú y Nepal, y tiene una perspectiva brillante para convertirse en un cultivo mayor en Estados Unidos y países tropicales [16]. Como se indicó anteriormente, existen aproximadamente 70 especies de Amaranthus que se distribuyen por todo el mundo en zonas de clima templado, subtropical y tropical [3]. Además de la zona de América tropical, la India ha sido considerada como uno de los centros de distribución del amaranto [3]. Más recientemente, se ha sugerido que China es también uno de los mayores productores a nivel mundial de amaranto, tanto para el consumo de cereales como para el uso como planta forrajera. Otros países en los que comienza a ser importante la producción de amaranto son Estados Unidos, Canadá y Argentina. Sin embargo, no hay datos oficiales sobre los niveles de producción mundial [11]. El amaranto puede crecer en condiciones climáticas muy variadas y en distintos tipos de suelos [17, 18]. Las características de A. caudatus lo convierten en un cultivo atractivo, tanto en el mundo occidental como en los países en desarrollo, adaptándose fácilmente a entornos nuevos y exigentes, incluidos algunos que son inhóspitos para los cereales. En la actualidad, es un cultivo alimenticio prometedor, principalmente por su resistencia al calor, a la sequía [3, 19, 20], a las enfermedades y a las plagas [21]. Además, presenta un potencial efecto para mitigar los problemas del cambio climático 7 por su menor requerimiento de agua en comparación con otros cultivos como el trigo, el maíz y el algodón [16]. Por todas estas razones, el cultivo de amaranto es un cultivo sostenible, permitiendo el sustento de las demandas alimentarias y nutricionales de las poblaciones más vulnerables [22]. El amaranto es una planta cuyas hojas se comen como verdura mientras que las semillas se comen como cereal [6, 23]. Debido al alto rendimiento de los cultivos y a su alta capacidad de producción de semillas, las especies A. caudatus, A. hypochondriacus y A. cruentus, tienen un enorme potencial para satisfacer la demanda de alimento en países menos desarrollados. Actualmente es utilizado en panadería, galletas, bizcochos, caramelos, tortitas, pasta y fideos, entre otros. [3]. En Perú, Bolivia y México las semillas de amaranto se utilizan como grano. En Perú con las semillas cocinadas como palomitas hacen dulces y melazas y con las semillas en crudo se hace harina. En la India, las semillas se usan principalmente para hacer dulces llamados ladus y, a veces, se toman con arroz después de hervirlas. En la región del Himalaya, la harina de semillas se usa para hacer chapatis. En los Estados Unidos, las semillas se utilizan para hacer galletas saladas, galletas dulces, como cereal y también en la preparación de productos horneados. Un uso tradicional del amaranto en México y otros países es mezclar amaranto con miel para hacer un tipo de aperitivo o snack y a veces, las semillas enteras se utilizan para hacer gachas o como condimento en otras preparaciones [3]. El uso más común es moler las semillas para obtener harina y usarla en la producción de panes, tortitas, cereales o pasteles, siendo un alimento con características de cereal, libre de 8 gluten, muy nutritivo y con buena aceptación [11]. De hecho, los dulces y aperitivos elaborados con este grano se consumen ampliamente en Asia y América del Sur [24, 25]. La harina de trigo mezclada con un alto contenido de proteína de amaranto se puede utilizar para mejorar el valor nutricional de productos alimenticios como fideos y galletas o bien preparados de patatas o yuca y panes y pasteles de maíz. Así mismo, el amaranto se puede utilizar para sustituir el trigo y otros productos de cereales alterando significativamente las propiedades funcionales y tecnológicas de los productos. Incluso podría utilizarse para elaborar pan sin gluten, especialmente para consumidores celíacos [26, 27]. La harina de amaranto también se utiliza frecuentemente mezclada con maíz para obtener una fuente equilibrada de proteínas [28, 29]. Además, se ha demostrado que el valor nutricional del pan podría mejorarse con la adición de granos enteros de amaranto expandidos (10-20%), aumentando el contenido en hierro, fósforo, calcio, magnesio y potasio [11, 30-32]. Sin embargo, es necesario estudiar la percepción de los consumidores sobre todos estos productos y desde una perspectiva sociológica [33, 34]. Se ha demostrado que el maíz con almidón de grano de amaranto podría usarse como espesante en salsas [24, 25] y además, se han propuesto varias tecnologías de procesamiento de alimentos (por ejemplo, germinación) como formas de mejorar la densidad de nutrientes y reducir los antinutrientes [35]. Se observó que el almidón presente en el amaranto es resistente a la congelación y descongelación, y por tanto, estable a algunos tipos de tratamiento 9 térmico, aunque las condiciones ácidas podrían limitar su estabilidad [36]. Hace unos años, se describieron los usos agroindustriales de la semilla de amaranto, así como el resultado de la primera aproximación sobre el procesamiento y la utilización de la semilla de amaranto y su conversión en alimento de alta calidad para lactantes [37-39]. Tanto el amaranto como la quinoa producen cantidades significativas de semillas comestibles [14], y son fuentes más ricas en minerales y vitaminas que la mayoría de los cereales, especialmente en el caso del amaranto, que se considera la semilla del siglo XXI [40]. Por otro lado, varios estudios han demostrado la aplicabilidad de la proteína de amaranto como material para la producción de películas comestibles [41, 42]. Estos estudios se han centrado en el desarrollo de películas y recubrimientos a partir de polímeros naturales como las proteínas y polisacáridos de amaranto, y también los lípidos. Se desarrollaron películas a partir de harina de A. caudatus y se llegó a la conclusión de que este material permitía formar películas con buenas propiedades como barrera a los gases en comparación con otras películas de base biológica. Aunque se demostró que las películas de harina de amaranto eran muy flexibles, mostraban una resistencia mecánica relativamente baja [43]. Según estos autores, las películas de amaranto tienen una estructura compleja, ya que no solo están formadas por almidón y plastificantes, sino que también poseen un importante contenido de proteínas y lípidos. En este caso, estos lípidos y el agua actúan como plastificantes, dando lugar a un 10 aumento en la elasticidad de las películas y una reducción de su rigidez [11]. Recientemente, se ha mostrado un interés considerable en la microencapsulación de nutracéuticos para la prevención de enfermedades. Diferentes estudios han demostrado que los biopolímeros extraídos del amaranto se pueden utilizar como material de microencapsulación de compuestos hidrofílicos y lipofílicos y como fuente de compuestos bioactivos para encapsular [11]. Además de su papel potencialmente importante en la dieta y nutrición, podría contribuir a mitigar o prevenir muchas enfermedades como el cáncer [44], la obesidad, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares [45] y los trastornos neurodegenerativos, que en conjunto se encuentran dentro de las principales causas de muerte mundial [46]. Los alimentos altamente procesados y el azúcar o las bebidas edulcoradas tienen efectos dañinos, mientras que los alimentos ricos en compuestos bioactivos como frutas, verduras, frutos secos, semillas y legumbres tienen efectos protectores [47]. Una dieta saludable que incluya la ingesta de alimentos funcionales podría contribuir a minimizar o prevenir estas enfermedades [48]. Así, en los últimos años se ha incrementado el interés de la investigación en compuestos bioactivos alimentarios como alternativa al tratamiento farmacológico y se ha asociado la introducción en la dieta de las semillas de amaranto con la promoción de la salud y la prevención de enfermedades [3]. De hecho, tanto las semillas como las hojas de amaranto se han utilizado tradicionalmente como remedios naturales. Por 11 ejemplo, A. caudatus se ha utilizado como antipirético, como agente astringente, diurético, antihemorrágico y hepatoprotector en la medicina tradicional india y nepalí [49]. A. caudatus también se ha utilizado para tratar molestias en la vejiga, hemorroides, dolor de muelas, trastornos sanguíneos e incluso disentería [50]. Los amarantos son una fuente rica en lisina, β-caroteno, vitaminas, minerales y fibra dietética [51, 52] y aunque también contienen nitratos y oxalatos, considerados antinutrientes, están presentes en pequeña cantidad, lo que no ocasiona ningún problema nutricional en condiciones normales de consumo [53]. Las principales actividades de investigación realizadas sobre el amaranto se han centrado en su excepcional valor nutritivo debido al contenido en proteína, grasa y otros principios activos con efectos antidiabéticos, antihiperlipidémicos [54], antihipercolesterolémicos [55, 56] y actividades antioxidantes [28, 57] y antimicrobianas [58]. Como ejemplo de su relevancia frente a la demanda nutricional y sus propiedades en la prevención de enfermedades, destaca el desarrollo de una formulación nutracéutica en forma de polvo para tratar la prevalencia de anemia en niños y adolescentes mexicanos, así como en adultos. La anemia por deficiencia de hierro es un importante problema de salud pública en niños pequeños de países en desarrollo y está asociada con un deterioro del desarrollo cognitivo y morbilidad. El nombre comercial de esta fórmula es “Naturalmente Alegría”, y fue aprobado por el Comité Federal de Protección contra Riesgos Sanitarios en México (COFEPRIS). Hasta 18 interés, un patrón de proteínas de referencia y los valores de digestibilidad publicados por la FAO [75]. La clasificación de PDCAAS fue adoptada por la FDA y la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura/ Organización Mundial de la Salud (FAO/OMS) en 1993 como el mejor método para determinar la calidad de la proteína. El valor del PDCAAS calculado para el amaranto es de 6,17, mientras que para el trigo y quinoa es 2,75 y 2,90 respectivamente [77]. Estudios recientes de cultivos emergentes muestran que la proteína de las semillas cocidas de amaranto tiene una alta digestibilidad, de aproximadamente el 90% [9, 64]. Por todas estas razones, el componente proteico del amaranto es cualitativa y cuantitativamente muy similar a los niveles recomendados por la FAO según se establece en su Informe FAO 92 de 2017 “Evaluación de la calidad de la proteína de la dieta en nutrición humana” y lo convierten en una fuente de proteína ideal para satisfacer las necesidades dietéticas humanas [75]. • Hidratos de carbono Los gránulos de almidón contenidos en el amaranto se componen principalmente de amilopectina (93,6–95,2%) dando lugar a gránulos pequeños en comparación con otras semillas de cereales [22]. Esta estructura le confiere mejores propiedades para su utilización en la industria alimentaria, además muestra una mayor resistencia a la acción de las amilasas. El almidón de amaranto muestra propiedades únicas de gelatinización y congelación/descongelación que podrían ser beneficiosas para la 19 industria alimentaria [21]. Las características del almidón, como su alta solubilidad y digestibilidad, se deben a su tamaño excepcionalmente pequeño, que es aproximadamente una décima parte del tamaño del almidón presente en la maicena y, por lo tanto, ofrece nuevas posibilidades para la industria alimentaria, farmacológica y cosmética. El almidón del amaranto también tiene una carga glucémica más alta y su consumo está relacionado con un mejor rendimiento físico y una recuperación más rápida asociada a la actividad física intensa y a la recarga de los depósitos de glucógeno después del ejercicio [78]. • Lípidos El contenido de lípidos del amaranto también es más alto en comparación con la mayoría de las especies de cereales, alrededor del 5–13% [46, 62, 63]. Las fracciones lipídicas de A. caudatus están compuestas por triacilgliceroles (80,3%) [22], fosfolípidos (10,2%) [22], escualeno (2,4-8,0%) [1] y vitaminas liposolubles como tocoferoles y tocotrienoles (0,006-0,013%) [79]. Entre los fitoesteroles detectados en las fracciones de lípidos insaponificables, el condrilasterol se ha descrito como el más abundante en A. caudatus [80]. En cuanto al perfil de ácidos grasos, es rico en ácidos grasos insaturados, alrededor de un 73% del total de ácidos grasos [81], siendo mayoritariamente linoleico (C18:2Δ9,12) (44,5-47,8%) y oleico (C18:1Δ9) (23,7-28,8%) [27, 63]. En el amaranto, la relación ácidos grasos insaturados/saturados es 2,7 y la relación linoleico/α- 20 linolénico es 52,4 [27]. Estos hechos hacen que el amaranto sea una atractiva fuente de ácidos grasos insaturados. La Tabla 3 muestra el perfil de lípidos y ácidos grasos del Amaranto. Tabla 3. Perfil lipídico y de ácidos grasos de semilla de A. caudatus. Ácidos grasos Semilla de amaranto [63] Semilla de amaranto [27] g/100 g Saturados - 26,9±0,2 Monoinsaturados - 23,9±0,1 Poliinsaturados - 49,1±0,2 Insat. / saturados - 2,7±0,0 Ác. Mirístico C14:0 0,22±0,004 - Ác. Palmítico C16:0 19,08±0,012 20,9±0,3 Ác. Esteárico C18:0 4,10±0,01 4,1±0,1 Ác. Oleico C18:1Δ9 28,82±0,02 23,7±0,1 Ác. Linoleico C18:2Δ 9,12 44,48±0,004 47,8±0,2 Ác. Α-linolénico C18:3Δ 9,12,15 0,89±0,005 0,9±0,0 Ác. Araquídico C20:0 0,97±0,005 0,8±0,0 Ác. Eicosenoico C20:1Δ 11 0,22±0,001 - Ác. Behénico C22:0 0,35±0,006 0,4±0,0 Ác. Lignocérico C24:0 0,22±0,004 0,4±0,0 Los datos que no aparecen en la tabla (-) no fueron determinados por los autores. 21 • Vitaminas y Minerales Respecto a las vitaminas, las semillas de A. caudatus contienen ácido ascórbico (29,8-70,5mg/kg) y vitaminas del complejo B como niacina o B3 (8,9-66,5mg/kg), piridoxina o B6 (4,5- 7,6mg/kg) y riboflavina o B2 (2,4-4,9mg/kg). Estos valores pueden verse alterados cuando el grano se cocina, se germina o se seca, debido a cambios químicos, exposición a cambios térmicos, etc., habiéndose observado por ejemplo, que si se elabora una harina rica en proteínas, aumenta la cantidad de dichas vitaminas: B3 (66,5mg/kg), B6 (7,6mg/kg) y B2 (4,9mg/kg) debido a la concentración de estas en la harina resultante [82]. En la Tabla 4 se resume la composición de vitaminas del Amaranto. Sin embargo, las vitaminas más importantes identificadas en A. caudatus son las diferentes isoformas de la vitamina E, como tocoferoles y tocotrienoles con un rango total de concentración de 63,7-129,3mg/kg [79], con δ-tocoferol (21,7-48,8mg/kg), βtocoferol (19,5-43,9mg/kg) y α-tocoferol (12,5-34,8mg/kg) en concentraciones mayores y γ-tocoferol (0,6-2,2mg/kg) en concentraciones menores [79, 80]. El interés de los tocoferoles y tocotrienoles radica en que actúan como antioxidantes naturales y su presencia en semillas oleaginosas a menudo se correlaciona con la abundancia relativa de ácidos grasos insaturados. Además de su conocida acción como antioxidantes y captadores de radicales libres, también son activos contra la aterosclerosis hipercolesterolémica [83]. Además, A. caudatus es una fuente rica en hierro (72-174ppm), calcio (1300-2850ppm), magnesio (2300-3360ppm) y zinc (36,2- 40ppm) [82], de esta forma, presenta una mayor cantidad de calcio, 22 hierro y fósforo que el arroz y el maíz, y una cantidad de hierro comparable a la del trigo [84]. La Tabla 5 resume la composición mineral de A. caudatus. Tabla 4. Composición vitamínica de la semilla de A. caudatus. Vitamina Amaranto [66] Semilla de amaranto [82] Semilla de amaranto [79] Semilla de amaranto [85] AESAN IDR Hombre/Mujer (mg) [86] (mg/kg) C 42 29,8 - 41,3-70,5 75/75 B1 1,16 - - 0,72-2,4 1,2/1,1 B2 2,0 2,4-4,9 - 1,8-2,7 1,5/1,2 B3 9,2 28,0-66,5 - 8,9-10 17/14 B6 5,9 4,5-7.6 - - 1,7/1,3 B9 0,82 - - - 0,33/0,33 E total - - 63,7-129,3 - α-tocoferol 11,9 - 12,5-34,8 2,97-34,81 13/11 βtocoferol - - 19,5-43,9 5,92-211,8 - δtocoferol - - 21,7-48,8 0,01-48,79 γ-tocoferol - - 0,6-2,2 0,95-57,07 - α-tocotrienol - - - 10,2–20,6 - βtocotrienol - - - 35,4–48,5 - δtocotrienol - - - 15,5–18,4 - γtocotrienol - - - 2,0–4,0 - IDR (Ingesta Diaria Recomendada): dosis mínima que se debe consumir de un nutriente para mantenerse sano. Los datos que no aparecen en la tabla (-) no fueron determinados por los autores. 23 Tabla 5. Composición mineral de la semilla de A. caudatus. Mineral Amaranto [66] Semilla de amaranto [82] Semilla de amaranto [27] AESAN IDR Hombre/Mujer (mg) [86] (mg/100g) Ca 159 176-308 180,1±6,1 950/650 Fe 7,61 14-27 9,2±0,2 9,1/18 Mg 248 288-497 279,2±1,1 350/300 P 557 582-1014 - 700/700 Zn 2,87 3,9-5,3 1,6±0,0 11/8 Mn 3,33 1,3-2,2 - 3/3 IDR (Ingesta Diaria Recomendada): dosis mínima que se debe consumir de un nutriente para mantenerse sano. Los datos que no aparecen en la tabla (-) no fueron determinados por los autores • Fracción fenólica y otros fitoquímicos Se ha descrito que los ácidos fenólicos totales en distintos tipos de amaranto de Perú pueden variar entre 18,3 y 40,1 mg/100g y entre 16,8 y 32,9 mg/100g (peso seco) [87]. Además, se ha identificado una fracción fenólica de A. caudatus de 5,24g TAE/kg en una harina de semilla (peso seco) y de 6,86g TAE/kg en una harina de alto contenido proteico (peso seco), definiéndose TAE como equivalentes de ácido tánico (por sus siglas en inglés) o mg ácido tánico/g material seco [22]. Sin embargo, la composición fitoquímica depende de las múltiples variables que condicionen el crecimiento de esta planta. 24 Basándonos en la composición química de la fracción fitoquímica total, los principales compuestos polifenólicos identificados en A. caudatus son: ácido ferúlico (120-620mg/kg), ácido vanílico (15,5-69,5mg/kg), ácidos benzoicos (4,7-136mg/kg), ácido cafeico (6,41-6,61mg/kg) y ácido cumárico (1,2 –17,4mg/kg) [85, 87]. En el caso del ácido gálico encontramos valores muy variables en la semilla (11,0-440mg/kg) [85]. Por otro lado, puede detectarse un derivado del ácido cafeico en hojas de amaranto [88]. La Tabla 6 resume la fracción polifenólica en la semilla de A. caudatus. Además de estos ácidos fenólicos, se han detectado algunos flavonoides monoméricos y diméricos en muestras de semillas de A. caudatus como quercetina (214-843mg/kg), kaempferol (22,4- 59,7mg/kg), isorhamnetina (42-600mg/kg), rutina (7-592mg/kg) y otros flavonoides minoritarios [22, 85]. La Tabla 7 muestra algunos flavonoides identificados en A. caudatus. Se han identificado otros fitoquímicos importantes en A. caudatus, como betalaínas (betacianinas y betaxantinas). Las principales betalaínas de A. caudatus son la amarantina (151,3mg/kg) y la isoamarantina (58,7mg/kg) [85]. Por otro lado, se ha observado que el extracto de A. caudatus contiene 24,1±1,29mg/100g de antocianinas [89], 17,7mg/kg de betaína, 5mg/kg de isobetaína, 3,55-4,29mg/kg de luteína y 0,14-0,32mg/kg de zeaxantina [85]. Las betalaínas se utilizan comúnmente como colorante alimentario natural, sin embargo, recientemente el interés por estos compuestos ha aumentado debido a sus propiedades antioxidantes. 25 Tabla 6. Principales polifenoles (ácidos benzoicos y ácidos cinámicos) de la semilla de A. caudatus [22, 85]. Ácido p-hidroxibenzoico (8,5–20,9 mg/kg) Ácido 2,4- dihidroxibenzoico (4,7–5,1 mg/kg) Ácido p-cumárico (1,2–17,4 mg/kg) Ácido 3,4- dihidroxibenzoico (4,7–136 mg/kg; 13,6±9,4 µg/g) Ácido vanílico (15,5–69,5 mg/kg) Ácido ferúlico (120–620 mg/kg; 203 cis/620 trans µg/g) Ácido 2,5- dihidroxibenzoico (trazas) Ácido gálico (11,0–440 mg/kg) Ácido cafeico (6,41–6,61 mg/kg) 26 Tabla 7. Flavonoides principales (flavonoides monoméricos y diméricos) de la semilla de A. caudatus [22, 85]. Quercetina (214–843 mg/kg; 6695±219/7755±85 mg/kg) Quercetina 3- arabinósido (trazas) Naringina (trazas) Rutina (7–592 mg/kg) Kaempferol (22,4–59,7 mg/kg) Miricetina (1,8 mg/kg) Isoquercetina (trazas) Kaempferol diramnosa (70 mg/kg) Isorhamnetina (42–600 mg/kg) 27 Compuestos bioactivos de Amaranthus caudatus Actualmente, la mayoría de las enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo, enfermedades cardiovasculares o inflamatorias son motivo de gran preocupación en todo el mundo, ya que, además de las implicaciones en salud, pueden provocar pérdidas económicas en materia de salud pública. El descubrimiento de diferentes compuestos bioactivos, extraídos de fuentes alimentarias, puede explorarse como nuevo fármaco natural y alimento funcional. A. caudatus ha sido clasificado como uno de los cinco vegetales principales en propiedades antioxidantes. Estas propiedades se pueden explicar por la presencia de compuestos como fitoesteroles, polifenoles, vitaminas, escualeno y péptidos bioactivos [16, 51, 90-93]; que proporcionan nutrientes y pueden mejorar la salud o el bienestar de los consumidores. Además, en los últimos años, los metabolitos secundarios de plantas como los flavonoides, terpenos y alcaloides han llamado la atención por sus diversas propiedades farmacológicas como son sus efectos citotóxicos y anticancerígenos. La tendencia a cambiar los compuestos sintéticos por naturales ha acelerado la investigación de fuentes vegetales como A. caudatus para identificar este tipo de componentes antioxidantes [94, 95], así como antiinflamatorios, antihipertensivos, antihipercolesterolémicos, etc. 34 caudatus para inhibir la peroxidación lipídica y la producción de ROS en un modelo de embrión de pez cebra [127]. • Propiedades cardioprotectoras El sector de la investigación nutracéutica que presenta mayor desarrollo está vinculado a la identificación de especies vegetales que pueden ser utilizadas para producir suplementos alimenticios para contrarrestar la aparición de patologías relacionadas con el consumo de grasas y colesterol en la dieta [128]. Se considera que varios tipos de compuestos químicos presentes en la fracción lipídica de las semillas oleaginosas son corresponsables de la actividad hipocolesterolemiante. Se ha demostrado que el aceite de semilla de A. caudatus previene la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares. El consumo regular de amaranto podría reducir los niveles de colesterol y la presión arterial [80, 102, 107]. Algunos estudios han revelado los efectos antihipercolesterolémicos con potencial para la prevención de enfermedades coronarias de las semillas de A. caudatus. La ingesta de una dieta que incluía harina de A. caudatus durante 21 días disminuyó significativamente las concentraciones de colesterol total y colesterol LDL, y el contenido de triglicéridos fue 50% menor en animales hipercolesterolémicos en comparación con el tratamiento de control [114]. Estos efectos probablemente se debieron a la fibra dietética, el escualeno y la proteína en A. caudatus. En otro estudio, los extractos hidroalcohólicos de A. caudatus mostraron efectos antihipercolesterolémicos y antiaterogénicos 35 asociados con la reducción de los lípidos séricos y los marcadores de estrés oxidativo en animales alimentados con dietas con alto contenido en colesterol [89]. Otros estudios han demostrado que la semilla o el aceite de amaranto pueden ser beneficiosos para mejorar la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares. El consumo regular de estos productos reduce la presión arterial y los niveles de colesterol, al tiempo que mejora el estado antioxidante y algunos parámetros inmunes [16, 37]. La dislipidemia se caracteriza por un aumento del colesterol total, LDL, VLDL y triglicéridos y una disminución de HDL. Un estudio mostró que este perfil lipídico sérico alterado se invirtió hacia un perfil sano después del tratamiento con extractos metanólicos de A. caudatus, mostrando un efecto antihiperlipidémico significativo [55, 56]. Se han llevado a cabo distintos estudios sobre el efecto hipocolesterolemiante de diferentes productos de amaranto [129], mostrando por ejemplo, como el extracto de A. caudatus, en comparación con lovastatina, disminuyó significativamente los niveles de colesterol, LDL, triglicéridos, LDL oxidado (Ox-LDL), apo-lipoproteína B (apoB) y el índice aterogénico (IA) mientras que aumentaban los de HDL y apolipoproteína A (apoA) [115]. 36 • Actividad antidiabética Algunos flavonoides, debido a su estructura fenólica, están involucrados en el proceso de prevención de enfermedades, incluida la diabetes [130]. Los extractos de metanol del amaranto poseen flavonoides como principios antidiabéticos [55]. Los extractos de metanol de dos variedades de amaranto mostraron actividad antidiabética in vitro a través de la inhibición de la enzima α-amilasa (28-50,5% a 25μg/mL). El modelo de rata con diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) se caracteriza por una pérdida severa del peso corporal. El tratamiento con extractos metanólicos de A. caudatus mostró una caída significativa en los niveles de glucosa en sangre y se observó una ganancia significativa en el peso corporal en los grupos tratados [100]. Esto puede deberse a la presencia de 20% de proteína, los 9 aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales contenidos en los extractos [131]. También se ha demostrado que A. caudatus estimula la secreción de insulina en ratas Goto-Kakizaki, un modelo de diabetes mellitus tipo 2 [132], a su vez, tras una dosis diaria durante cuatro semanas, diferentes hidrolizados de amaranto inhibieron la actividad dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV) en ratones diabéticos inducidos por STZ [133]. En pacientes con diabetes, tras el consumo de amaranto durante tres meses, se observaron algunas mejoras en su salud y sobre distintos marcadores de obesidad [134]. La α-amilasa es una enzima que se encuentra en las secreciones salivales, mucosas intestinales y pancreáticas. Esta enzima aumenta la biodisponibilidad de la glucosa en sangre y se ha descrito que la inhibición de la α-amilasa reduce la biodisponibilidad de la glucosa. 37 Los estudios in vitro demuestran una apreciable actividad inhibidora de la α-amilasa con el extracto metanólico de A. caudatus [118]. La proteína de amaranto induce una disminución de la insulina plasmática en ratones alimentados con una dieta regular, mientras que por otro lado, se observó una disminución de los triglicéridos en ratones alimentados con una dieta alta en grasas [135]. • Propiedades antibacterianas y antifúngicas En las plantas, los metabolitos secundarios funcionan para atraer organismos beneficiosos y repeler organismos nocivos, sirven como fitoprotectores y responden a los cambios ambientales. En los seres humanos, sin embargo, estos compuestos tienen efectos beneficiosos que incluyen efectos antioxidantes, antiinflamatorios, modulación de las enzimas de desintoxicación, estimulación del sistema inmunológico, modulación del metabolismo de los esteroides y efectos antibacterianos y antivirales [136]. Algunos resultados indican que el extracto de hojas de A. caudatus contiene diversos tipos de compuestos farmacológicamente activos con actividad antimicrobiana [58]. Los péptidos antibacterianos llamados Ac-AMP1 y Ac-AMP2 fueron aislados de semillas de A. caudatus, demostrando actividad contra diferentes cepas bacterianas, así como actividad antifúngica [137]. Además, el extracto de A. caudatus inhibe la invasión de E. coli en las células uroepiteliales [138]. 38 HIDROLIZADOS PROTEICOS Y PÉPTIDOS BIOACTIVOS Las funciones de las proteínas en los alimentos, más allá de servir como nutrientes en la dieta, son cada vez más reconocidas. Muchas de estas funciones se llevan a cabo por secuencias concretas de péptidos encriptadas dentro de la proteína original [139]. Los hidrolizados de proteínas se definen como una mezcla compleja de oligopéptidos, péptidos y aminoácidos libres que se producen por hidrólisis parcial o total de proteínas, mientras que los péptidos bioactivos se definen como péptidos que poseen propiedades biológicas beneficiosas [140]. Hidrolizados proteicos vegetales Actualmente, en el mundo se generan gran cantidad de residuos agroindustriales, ricos en proteínas, como por ejemplo la harina resultante de la extracción de aceites de semillas, utilizada normalmente para alimentación de ganado. Sin embargo, estos residuos suponen una de las mayores reservas de proteínas con potencial para la industria alimentaria humana, lo que ha llevado a despertar interés por la generación de aislados proteicos a partir de ellos. No obstante, estos procesos presentan dos grandes limitaciones, como son la baja solubilidad y su potencial alergenicidad, debido a la presencia de regiones conocidas como epítopos antigénicos. Estas razones, sumadas a la creciente demanda de nuevos alimentos, han llevado al desarrollo y optimización de procesos de hidrolisis enzimáticas de estos aislados proteicos vegetales [141]. 39 El parámetro fundamental y que va a determinar en gran medida las características de un hidrolizado proteico es su grado de hidrólisis, es decir, el porcentaje de enlaces peptídicos rotos en relación a la proteína original. Atendiendo a este parámetro, los hidrolizados proteicos de origen vegetal destinados a alimentación pueden clasificarse, en tres grandes grupos [141] (Figura 4): - Hidrolizados con bajo grado de hidrólisis o hidrolizados limitados (entre 1 y 10% de hidrólisis), dando lugar a un incremento de la solubilidad, que a su vez es necesaria para la mejora de otras propiedades funcionales como el poder emulsificante o espumante y la absorción de agua o aceite. Además, permite la exposición de residuos hidrófobos de la proteína que estaban en el interior de la estructura de la proteína intacta. - Hidrolizados con grado de hidrólisis variable, generalmente alto, comúnmente usados como saborizantes o aromatizantes. Según el sustrato y las condiciones de hidrólisis, pueden aportar sabor y olor a los alimentos a los que se añadan. Normalmente se obtienen mediante la hidrólisis ácida, por lo que el grado de hidrólisis va a depender del tiempo, temperatura y concentración de ácido utilizada, lo cual influirá, junto con la interacción de los péptidos resultantes con azúcares y lípidos, en los atributos sensoriales del producto final. Actualmente, el uso de estos hidrolizados está en desuso, debido a que el proceso para su obtención puede dar lugar a la aparición de antinutrientes. 40 Hoy día, se está potenciando el uso de proteasas para la obtención de hidrolizados extensivos que puedan usarse como flavorizante [142, 143]. - Hidrolizados extensivos, con grado de hidrólisis superior al 10%, destinados a alimentación especializada, como suplementos o dietas médicas. En este grupo se encuentran los hidrolizados proteicos que contienen los péptidos bioactivos de interés y a los que se hace referencia en la presente tesis al hablar de forma genérica de “hidrolizados de proteínas”. Figura 4. Representación esquemática de los hidrolizados proteicos según su grado de hidrólisis. Figura creada con Microsoft Power Point. La hidrólisis proteica puede ocurrir en nuestro cuerpo mediante la digestión gastrointestinal de los alimentos (hidrólisis fisiológica) mediada por proteasas como pepsina, tripsina o quimotripsina, y que va a producir la liberación de aminoácidos y 41 pequeños péptidos que serán absorbidos por las células del endotelio digestivo. Sin embargo, la hidrólisis proteica también puede producirse durante el procesado de diversos tipos de alimentos, debido fundamentalmente a la acción de microorganismos implicados en procesos de fermentación o por proteasas endógenas del material original [144]. Por otro lado, los hidrolizados proteicos pueden obtenerse a través de digestión con ácidos o álcalis (hidrólisis química) o mediante el uso de enzimas (hidrólisis biológica) [145]. Hoy día, apenas se utiliza la hidrólisis química debido a sus efectos perjudiciales sobre la calidad nutricional del hidrolizado, ya que se destruyen L-aminoácidos, se forman D-aminoácidos y compuestos tóxicos como Lisinoalanina. En la hidrólisis biológica, los hidrolizados se producen mediante la acción de determinadas enzimas proteolíticas sobre proteínas completas en condiciones controladas de pH y temperatura, seguido de un procesamiento posterior para aislar los péptidos bioactivos deseados de una mezcla compleja de péptidos activos e inactivos. Estas condiciones controladas reducen la formación de compuestos indeseables y mantienen el valor nutricional de la proteína de origen, ya que no se produce degradación de los componentes hidrolizados. El resultado de esta hidrólisis muestra ventajas tecnológicas como la mejora en la solubilidad de los productos y en la estabilidad al calor [146]. La capacidad de las enzimas para hidrolizar una proteína es muy variable, por lo que es fundamental la elección de una enzima adecuada para poder obtener compuestos que tengan unas determinadas características fisicoquímicas y nutricionales. Según 42 sus mecanismos de hidrólisis, puede darse una hidrólisis endopeptídica o exopeptídica. Las endopeptidasas, son enzimas que hidrolizan las proteínas rompiendo al azar los enlaces peptídicos que se encuentran dentro de la secuencia de la proteína, mientras que las exopeptidasas son enzimas que sistemáticamente eliminan aminoácidos del extremo N o C terminal [145]. Algunos ejemplos de enzimas de grado alimentario son la Alcalasa 2.4L, también conocida como subtilisina A, que es una serina endopeptidasa que se obtiene de Bacillus licheniformis con un pH óptimo alcalino y una amplia especificidad de sustrato, que se ha mostrado útil para obtener péptidos con actividad antioxidante a partir de diferentes fuentes proteicas [147], la Izyme AL, que actúa de forma similar a la tripsina, es decir, es una serina proteasa que hidroliza proteínas en el lado carboxilo de los aminoácidos lisina o arginina [148] y la Bioproteasa LA660, una endopeptidasa de grado alimentario, que se obtiene a partir de una cepa seleccionada de Bacillus y que por sus características de estabilidad y resistencia al pH y la temperatura, resulta idónea para procesos de hidrólisis enérgicos [74]. La naturaleza de las proteínas alimentarias, la especificidad de las enzimas proteolíticas utilizadas para la hidrólisis, las condiciones de procesamiento (tiempo, pH, temperatura), así como la proporción enzima/sustrato, determinan el peso molecular, la composición de aminoácidos y secuencias de los péptidos y, por lo tanto, sus actividades biológicas [149]. En general, los hidrolizados de proteínas obtenidos mediante tratamientos biológicos, están compuestos por una mezcla de diversos péptidos inactivos y activos que tienen varios tamaños y diferentes secuencias de aminoácidos [150]. 43 Debido a la hidrólisis, las propiedades moleculares de las proteínas cambian, produciéndose la disminución del peso molecular, el aumento de la carga y la liberación de grupos hidrofóbicos, entre otros fenómenos [151, 152]. A su vez, las propiedades nutricionales de la hidrólisis reflejan un aumento de su solubilidad, digestibilidad y una disminución de la alergenicidad de los hidrolizados cuando se las compara con las proteínas parentales [152]. Péptidos bioactivos El desarrollo de compuestos bioactivos y seguros (como péptidos antioxidantes, antimicrobianos, antihipertensivos, etc.) procedentes de diversas fuentes naturales, que pueden ser utilizados para la prevención y/o tratamiento de diversas enfermedades degenerativas como hipertensión, obesidad y cáncer, ha atraído una atención cada vez mayor [150]. La actividad biológica de los péptidos se basa principalmente en su composición y secuencias de aminoácidos [153]. De esta forma, se ha descrito que las propiedades multifuncionales observadas en distintos péptidos dependen de su estructura, así como de su hidrofobicidad y carga [154], conteniendo la mayoría de estos péptidos bioactivos de 2 a 20 aminoácidos y siendo generalmente ricos en aminoácidos hidrófobos [155, 156]. Los péptidos bioactivos ofrecen ventajas sobre los fármacos convencionales debido a su amplio espectro de acción terapéutica, los bajos niveles de toxicidad que presentan y la diversidad 50 inmunomoduladores nuevos y más eficaces que mejoren la función inmunitaria, como pueden ser los péptidos derivados de proteínas alimentarias [150]. De esta forma, las proteínas de A. caudatus podrían empezar a cobrar importancia como ingredientes de alimentos funcionales para la prevención y manejo de enfermedades crónicas relacionadas con estrés oxidativo, hipertensión, diabetes [180] y/o inflamación [177]. En la Tabla 8 se recogen los péptidos bioactivos identificados en amarantos. 51 Tabla 8. Péptidos bioactivos del amaranto. Péptido bioactivo Función Tipo de amaranto YESGSQ, GGEDE, NRPET, FLISCLL, TALEPT, HVIKPPS, SVFDEELS, ASANEPDEN, DFIILE Antioxidante y antihipertensivo (inhibición de ACE, α-amilasa y DPP-IV) A. caudatus [68] STHASGFFFFHPT, STNYFLISCLLFVLFNGCMGEG, GLTEVWDSNEQEF, TIEPHGLLLPSFTSAPELIYIEQGNGITGMMIP G-CPETYESGSQQFQGGEDE Antihipertensivo (inhibición de DPP-IV) A. hypochondriacus [174] YP, LPP, LRP, VPP, IKP Antihipertensivo (inhibición de ACE) Diferentes especies de Amaranthus [90] PÉPTIDOS DE LAS FRACCIONES GBSSI, ALB1H48, GLOBH48, GLUH24, DIPROTINA A Y SITAGLIPTINA Antihipertensivo (inhibición de ACE y DPP-IV) A. hypochondriacus [108, 133] SSEDIKE Inmunomodulador A. hypochondriacus [177] NEAAALFR, SIFQFPK, RYVTFK, ILDPLAQFEVEPSK, TYDGLVHIK, LSTDDWILVDGNDPR Antitumoral A.caudatus y A.mantegazzianus [178] PÉPTIDOS DE HIDROLIZADOS DE PROTEÍNAS TOTALES, FRACCIONES DE ALBÚMINA, GLOBULINA Y GLUTELINA Antihipertensivo, antioxidante, antitumoral, hipocolesterolémico, antimicrobiano y antidiabético A. hypochondriacus [180] 52 INFLAMACIÓN El sistema inmunitario es una compleja red de moléculas, células, tejidos y órganos que actúa para eliminar elementos potencialmente dañinos como bacterias, virus, hongos, protozoos y previene el crecimiento de células cancerosas. El sistema inmunitario se clasifica en dos categorías funcionales principales, la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa [181]. La inmunidad innata es inespecífica y proporciona la primera línea de defensa a través de medios anatómicos (piel, membranas mucosas), fisiológicos (pH bajo, temperatura y mediadores químicos), celulares (macrófagos, células polimorfonucleares y células dendríticas), células NK y componentes inflamatorios (citoquinas, interferones, moléculas del complemento, defensinas, leucotrienos, proteínas de fase aguda y prostaglandinas) [181]. La inmunidad adaptativa, también llamada inmunidad específica o inmunidad adquirida, es muy específica. Se divide, a su vez, en dos tipos, inmunidad mediada por células e inmunidad mediada por anticuerpos o humoral. Los linfocitos T y B son las células más importantes en la inmunidad adaptativa. La inmunidad mediada por células implica a los linfocitos T efectores, que secretan moléculas como citoquinas y median la respuesta inmunitaria tras la interacción con células presentadoras de antígenos. La inmunidad humoral involucra a los linfocitos B, responsables de la producción de anticuerpos tras la interacción con antígenos específicos. Los anticuerpos pueden unirse a antígenos de patógenos invasores y marcarlos para su destrucción por macrófagos. 53 Los monocitos son componentes fundamentales de la inmunidad innata, mediando diversas funciones biológicas determinadas por sus estados de activación. Responden a la infección microbiana o cambios fisiológicos en el microambiente, diferenciándose en macrófagos M1 o M2. La activación clásica por LPS o señales inflamatorias conduce a la generación de macrófagos M1, productores de factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), mientras que la activación alternativa conduce a la generación de macrófagos M2, que son antiinflamatorios y producen citoquinas inmunosupresoras, como el factor de crecimiento transformante beta (TGFβ). Aunque la activación generalmente surge después de la exposición a patógenos o lesión tisular, varios péptidos cortos, como los péptidos de defensa natural del huésped (HDP, por sus siglas en inglés), también pueden estimular su diferenciación a macrófagos [181, 182]. La inflamación es una respuesta inmune que conduce al reclutamiento celular y producción de mediadores proinflamatorios como TNFα, las interleuquinas IL-1β, IL-6, IL-8 e interferón gamma (IFN), en el lugar de la infección o daño tisular. Estos mediadores pueden amplificar la respuesta inflamatoria al interactuar con diferentes tipos de células. Sin embargo, su producción excesiva y descontrolada conduce a daño tisular y pérdida de la función inmunitaria. La respuesta inflamatoria puede ser aguda (efectos momentáneos seguidos de curación) o crónica (efectos continuos). Se ha demostrado que las respuestas inflamatorias crónicas a menudo se asocian con la patogénesis de enfermedades como la diabetes tipo 2, la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la 54 artritis, la aterosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares [179, 183]. Otro de los componentes fundamentales de la inmunidad innata son los inflamasomas, complejos multiproteicos citoplasmáticos que comprenden una proteína sensor, caspasas inflamatorias y, en algunos casos, una proteína adaptadora que conecta los dos componentes anteriores. Pueden activarse mediante estímulos endógenos y exógenos, lo que lleva a la activación enzimática de la caspasa-1 canónica, la caspasa-4 y caspasa-5 no canónicas o caspasa-8, resultando en la secreción de IL-1β e IL-18, y finalmente en la muerte celular por apoptosis o piroptosis [184]. De forma muy resumida, el ensamblaje de un complejo heterooligomérico basado en una proteína de “andamio”, como las NLRP y en algunos casos el reclutamiento adicional de adaptadores, como la proteína ASC, provocan la activación de la caspasa. A su vez, la activación de ésta, da como resultado la activación proteolítica de citoquinas proinflamatorias como IL-1β e IL-18. Esta activación inflamatoria dará lugar en última instancia a muerte celular por piroptosis o apoptosis. La activación apropiada del inflamasoma es vital para que el organismo pueda hacer frente a patógenos o daño tisular, mientras que su activación aberrante puede provocar respuestas inmunes incontroladas que pueden contribuir a diversas enfermedades, incluidos distintos trastornos autoinflamatorios, enfermedades cardiometabólicas, cáncer y enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es esencial mantener un adecuado equilibrio entre la activación y la inhibición del inflamasoma, lo que 55 requiere una regulación precisa tanto del ensamblaje de sus componente como de su función efectora [184]. Según estudios epidemiológicos y clínicos, el 15-20% de las neoplasias malignas en todo el mundo se desarrollan debido a la inflamación crónica y se ha convertido en una amenaza pública tanto en países desarrollados como en desarrollo [179]. Las respuestas inflamatorias podrían tratarse con fármacos antiinflamatorios. Sin embargo, la mayoría de las intervenciones farmacológicas actuales son inadecuadas para controlar las respuestas inflamatorias crónicas y su consumo prolongado se asocia con efectos secundarios adversos [185, 186]. Por tanto, existe la necesidad urgente de desarrollar opciones terapéuticas alternativas y más seguras a partir de productos o alimentos naturales [179]. Inflamación Intestinal La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que incluye la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), es una inflamación crónica recurrente del tracto gastrointestinal [187]. Sobre la patogenia aún se conoce poco, pero la EII es multifactorial y se caracteriza por la pérdida de la integridad de la barrera epitelial debido a respuestas inflamatorias excesivas. El epitelio intestinal es una barrera crítica que controla el paso de agua y electrolitos e inhibe el paso de bacterias y otros agentes patógenos. Este epitelio es una monocapa celular en la que los contactos celulares están sellados, controlando la permeabilidad, que aumenta durante las fases activas de la EII. Algunos tratamientos incluyen fármacos antiinflamatorios, anticuerpos contra el TNFα, esteroides o 56 inmunomoduladores que inhiben la proliferación de células del sistema inmune. Sin embargo, estos fármacos solo consiguen aliviar los síntomas y en los casos más graves, se requiere cirugía. Por tanto, actualmente, no existe ningún tratamiento para reducir la inflamación y restaurar la función de barrera intestinal. Además, la mayoría de los medicamentos pueden tener efectos secundarios graves. Esto hace necesarios enfoques de tratamiento alternativos. Los suplementos nutricionales se han estudiado ampliamente en cultivos celulares y modelos animales, y algunos de ellos han mostrado resultados prometedores en estudios clínicos [187, 188]. Inmunomodulación Un inmunomodulador es cualquier sustancia que pueda aumentar, disminuir o modificar la respuesta inmune al influir en cualquier punto del sistema inmunitario, ya sea en la respuesta innata o adaptativa. Existen fármacos para modular la respuesta inmunitaria en humanos. Sin embargo, los efectos secundarios dañinos y el alto costo de los fármacos han restringido su uso en pacientes y la mayoría de los fármacos inmunomoduladores no son apropiados para usos crónicos o preventivos. En los últimos años, se ha demostrado que la modulación de la función inmunológica a través de los componentes de la dieta es una estrategia eficaz y eficiente; mientras tanto, el descubrimiento de nuevos péptidos inmunomoduladores a partir de proteínas alimentarias podría proporcionar una ventaja adicional al tratamiento [181]. El consumo de hidrolizados de proteínas inmunomoduladores puede contribuir a retrasar o prevenir 57 enfermedades relacionadas con el sistema inmunológico. Con el fin de desarrollar estos hidrolizados con efecto inmunomodulador, es necesario conocer qué péptidos contenidos en ellos son responsables de estos efectos inmunológicos, así como los mecanismos subyacentes. Se han empleado con éxito tanto métodos in vitro, cultivos de líneas celulares, como in vivo, modelos animales, para evaluar los efectos inmunomoduladores de péptidos o hidrolizados de proteínas de origen alimentario [181, 189], demostrándose el efecto inmunomodulador de estos hidrolizados tanto en monocitos, macrófagos y células mononucleares de sangre periférica humana [148, 190-192]. Por otro lado, también se han demostrado los efectos inmunomoduladores de los hidrolizados de proteínas en ensayos clínicos [193]. Además de la capacidad moduladora de la inmunidad innata y adaptativa de los péptidos o hidrolizados de proteínas, el potencial inmunomodulador relacionado con la inflamación se ha convertido en un área activa de investigación, ya que la inflamación se ha asociado durante mucho tiempo con la fisiopatología de muchas enfermedades como el cáncer y la aterosclerosis, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, diabetes, etc. Se ha demostrado que varios péptidos o hidrolizados de proteínas tienen un potencial inmunomodulador relacionado con la inflamación al inhibir la producción de NO, prostaglandina E2 (PGE2) y citoquinas (IL-1β, IL- 6, IL-8 y TNFα) en modelos de cultivo celular in vitro inducidos por LPS [181]. 58 Para comprender los efectos inmunitarios que pueden inducir los hidrolizados de proteínas y, en última instancia, utilizarlos para fines específicos, es de crucial importancia comprender exactamente cómo se producen estos efectos. Hasta ahora, solo unos pocos estudios se han centrado en elucidar los mecanismos subyacentes de los efectos inmunomoduladores de los hidrolizados de proteínas. Investigaciones recientes sugieren que los péptidos podrían unirse directamente a inmunoreceptores de la superficie celular implicados en señalización pro o antinflamatoria; entrar en la célula a través de un transportador de péptidos e interferir con estas vías de señalización; o bien ser absorbido por la célula mediante endocitosis y actuar de forma similar [189]. Neuroinflamación La neuroinflamación, de manera genérica, es la compleja respuesta inmune innata del tejido neural para contener la infección, eliminar patógenos, restos celulares y proteínas mal plegadas. Sin embargo, en las enfermedades neurológicas crónicas la neuroinflamación se vuelve persistente y perjudicial para las células neuronales. La evidencia emergente sugiere que la neuroinflamación es un factor clave en varios trastornos neurológicos, incluidas las enfermedades neurodegenerativas y las lesiones del Sistema Nervioso Central (SNC). Se trata de un arduo proceso orquestado por varios grupos de células gliales en el SNC y células inmunitarias periféricas. La comunicación entre los distintos tipos celulares en la neuroinflamación del SNC es un proceso extremadamente complejo y dinámico. Sin embargo, la comprensión 59 de cómo las células gliales interactúan entre sí para dar forma a la respuesta inmunitaria del SNC sigue siendo limitada [194]. Las células gliales son las células más abundantes y ampliamente distribuidas en el SNC; interactúan con neuronas y células inmunes, así como con vasos sanguíneos. Algunas de éstas funcionan como células inmunitarias innatas residentes en el SNC, contribuyendo a la vigilancia del medio fisiológico y actuando como primera línea de defensa. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares de las células gliales en la neuroinflamación siguen siendo poco conocidos [194]. Las células gliales incluyen astrocitos, microglía y oligodendrocitos, así como las células precursoras de oligodendrocitos (OPC), consideradas el cuarto tipo de células gliales en el SNC [195]. La microglía es el principal elemento celular con función inmunitaria dentro del SNC. Al igual que los macrófagos, la microglía puede alterar sus fenotipos y funciones en respuesta a alteraciones del microambiente. Dependiendo del balance de factores secretados, la microglía puede desarrollar un fenotipo de activación clásico M1 o proinflamatorio, o bien un fenotipo de activación alternativo M2 o antiinflamatorio [196], similar a lo que ocurre con los monocitos/macrófagos. El estado M1 provoca la liberación de citoquinas y moléculas proinflamatorias como la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), mientras que en el estado M2 se da la expresión de citoquinas y moléculas antiinflamatorias, como la arginasa-1 (Arg-1) [197] (Figura 6). La evidencia de la polarización de la microglía en modelos de enfermedades relacionadas con la neuroinflamación llevó a la idea 66 67 3. MATERIAL Y MÉTODOS 68 69 MATERIAL Y MÉTODOS Reactivos y muestras La harina de semilla de Amaranthus caudatus fue proporcionada por STURLA, S.R.L. (Buenos Aires, Argentina). La enzima Bioproteasa LA-660 fue comprada a BIOCON (Barcelona, España). Todos los productos químicos (reactivos y disolventes) fueron de grado analítico y proporcionados por Sigma-Aldrich, Bachem AG y Gibco. Curva de solubilidad de proteínas Se disolvió harina desengrasada de kiwicha (HDK, 2 g) en H2O (100 mL) y se ajustó el pH a 12 con NaOH. Seguidamente, el pH se fue disminuyendo sucesivamente a 10, 8, 6, 4 y 2 hasta pH constante utilizando HCl. En cada punto de pH se tomó una alícuota, por duplicado, que se centrifugó durante 15 minutos a 12000 g y se midió el contenido en nitrógeno de los sobrenadantes recuperados. Para obtener la curva de solubilidad se representa el porcentaje de nitrógeno soluble en los sobrenadantes (respecto al nitrógeno total) frente a las diferentes unidades de pH. Obtención del aislado de proteína de kiwicha El aislado proteico de kiwicha (APK) se obtuvo mediante el método de Lqari et al. [200]. En resumen, se solubilizó la harina desengrasada de kiwicha (HDK) con Na2SO3 al 0,25% (p/v) a pH 11 durante 1 hora. Después de centrifugar el extracto a 7500 rpm 70 durante 15 minutos, se recuperó el sobrenadante y el pellet se sometió de nuevo al mismo proceso de extracción. Ambos sobrenadantes se ajustaron al punto isoeléctrico de las proteínas de la kiwicha, previamente determinado mediante la curva de solubilidad, (pH 4 durante 30 minutos), siendo este el pH donde se produce la menor solubilidad de las proteínas. La dispersión obtenida se centrifugó a 7500 rpm durante 15 minutos, y el precipitado se lavó con agua destilada ajustada a pH 4 y se centrifugó de nuevo, en las mismas condiciones, para eliminar las sales residuales y otros compuestos no proteicos. Finalmente, las proteínas precipitadas se liofilizaron y almacenaron a temperatura ambiente. Hidrólisis del aislado de proteína de kiwicha La hidrólisis del APK se realizó en un biorreactor LAMBDA MINIFOR (LAMBDA Laboratory Instruments Sihlbruggstrasse, Switzerland) con agitación continua a pH y temperatura controlados. El APK se resuspendió en agua destilada (10% p/v), la temperatura se ajustó a 50°C y el pH se ajustó a 8. Tras 30 minutos se añadió Bioproteasa en una relación enzima/sustrato de 0,3AU/g de proteína. Manteniendo el pH 8 se tomaron alícuotas a 5, 10, 15, 30 y 60 minutos, que se incubaron a 85°C durante 20 minutos en baño de agua para inactivar la enzima. El sobrenadante obtenido por centrifugación a 7500 rpm durante 15 minutos constituyó cada hidrolizado proteico de kiwicha (HPK). Los HPK obtenidos mediante este método se designaron como HPK5, HPK10, HPK15, HPK30 y 71 HPK60, correspondiendo el número al tiempo de hidrólisis en minutos. Evaluación del grado de hidrólisis El grado de hidrólisis (GH), definido como el porcentaje de enlaces peptídicos escindidos, se calculó mediante el método TNBS (ácido trinitrobenceno sulfónico) que determina los grupos aminos libres [201]. El número total de grupos aminos se determinó en una muestra que había sido hidrolizada al 100% en HCl 6 N a 110°C durante 24 horas. Composición química de los productos proteicos obtenidos La concentración de proteína se determinó mediante microanálisis elemental, usando un analizador LECO TRUSPEC MICRO (Leco Corporation, St. Joseph, MI, EEUU) y expresándose como porcentaje tras multiplicar el contenido de nitrógeno por un factor de conversión de 6,25 (factor de conversión para vegetales). La fibra dietética total se determinó mediante el método gravimétrico [202]. El contenido de cenizas se determinó según el método de ignición directa (550°C durante 36 horas). Los polifenoles y los azúcares solubles se midieron utilizando curvas estándar de ácido clorogénico y glucosa, respectivamente [203, 204]. 72 Determinación de la composición de aminoácidos mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución La composición de aminoácidos se determinó según el método de Alaiz et al. [205] con ligeras modificaciones. Para ello, las muestras (4-6 mg de proteína) se hidrolizaron mediante incubación con HCl 6 N a 110°C durante 24 h en tubos cerrados y bajo atmósfera de nitrógeno. Una vez finalizada la hidrólisis, las muestras se llevaron a sequedad en rotavapor y se redisolvieron en tampón borato sódico 1 M pH 9, llevándolas a un volumen final de 10 mL. Tras su derivatización con etoximetilenmalonato de dietilo, los aminoácidos se determinaron en el hidrolizado ácido mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución (UHPLC) (Ac quity Arc, Waters, EE. UU.), utilizando ácido D,L-α-aminobutírico como patrón interno, y una columna de fase inversa de 3mm x 150mm (XSelect HSS T3 XP, 2,5 μm; Waters). Se utilizó un sistema de gradiente binario con los disolventes (A) acetato de sodio 25 mM, azida de sodio al 0,02% (pH 6,0) y (B) acetonitrilo. El flujo fue de 0.8 mL/min y el gradiente de elución usado fue: tiempo 0-1 min, elución con A:B 92:8, tiempo 1-4.33, gradiente lineal desde A:B 92:8 hasta A:B 86:14; tiempo 4.33-7.32 min, elución con A:B 86:14; tiempo 7.32-11.65 min, gradiente lineal desde A:B 86:14 hasta A:B 72:28; tiempo 11.65- 13.31 min gradiente lineal desde A:B 72:28 hasta A:B 65:35, tiempo 13.31-15.64 gradiente lineal desde A:B 65:35 hasta A:B 8:92, tiempo 15.64-16 elución con A:B 8:92. Las curvas de calibración para cada aminoácido se realizaron utilizando una mezcla de estándar de aminoácidos (Merck, España) en las mismas condiciones de hidrólisis de las muestras y los picos resultantes se analizaron con el 73 software EMPOWER (Waters, EE. UU.). Además, el contenido de triptófano se evaluó según el método de Yust et al. [206]. Brevemente, las muestras (aprox. 20 mg de proteína) se hidrolizaron con 3 mL de NaOH 4 N a 110 °C durante 4 h, en tubos con cierre y bajo atmósfera de nitrógeno. Tras la hidrólisis, las muestras fueron enfriadas en hielo y neutralizadas a pH 7 usando HCl 6 N. Posteriormente, fueron diluidas hasta un volumen de 10 mL con tampón borato sódico 1 M a pH 9. El análisis se llevó a cabo mediante UHPLC con una columna de fase inversa de 3mm x 150mm (XSelect HSS T3 XP, 2,5 μm; Waters), usándose un sistema isocrático binario con tampón acetato sódico 25 mM, azida sódica 0.02% (p/v) pH 6 y acetonitrilo como disolventes en relación 91:9, siendo el flujo de 0.8 mL/min. El contenido en triptófano se determinó a partir de una recta de calibrado preparada con L-triptófano. Digestibilidad proteica Para determinar la digestibilidad proteica in vitro se usó el método establecido por Sindayikengera y Xia [207] con ligeras modificaciones. La muestra (0,1g) se añadió a un tubo de 50 mL, con 7,5 mL de HCl 0,1 N conteniendo 1,5 mg de pepsina y luego se incubó a 37°C durante 2 h. Seguidamente, la suspensión se neutralizó con NaOH 0,5 N, y se trató con pancreatina (1,875 mg) en 7,5 mL de tampón fosfato 0,2 M (pH 8,0). La mezcla se agitó suavemente y se incubó durante 2 horas más a 37°C. Posteriormente, la muestra se trató con 5 mL de TCA (ácido tricloroacético) al 10% y se centrifugó a 10000 g durante 20 min a temperatura ambiente. El contenido en proteínas en el sobrenadante se estimó como % de contenido de 74 nitrógeno × 6,25 mediante microanálisis elemental en un analizador LECO TRUSPEC MICRO. La digestibilidad proteica se calculó como porcentaje de la relación entre la proteína en el sobrenadante y la proteína total en la muestra. Perfil molecular por Cromatografía Líquida Rápida de Proteínas El perfil molecular de las muestras se determinó usando la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC, por sus siglas en inglés) Akta purifier 10 (GE Healthcare Bio-sciences). Se utilizó una columna pre-empaquetada Superose 12 10/300 GL, para cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento con un amplio rango de fraccionamiento para moléculas con pesos moleculares entre 1 y 300 kDa. Se utilizaron proteínas con pesos moleculares conocidos (GE Healthcare, Reino Unido) para calibrar la columna: dextrano azul (2000kDa), aldolasa (158kDa), conalbúmina (75kDa), albúmina de suero bovino (67kDa), ribonucleasa A (13,7kDa) y bacitracina (1423kDa). La recta de calibrado se realizó a partir de los logaritmos de los pesos moleculares de estas proteínas y sus volúmenes de elución. La elución se realizó con 50 mL de tampón fosfato sódico 0,05 M, cloruro sódico 0,15 M y azida sódica al 0,02% (p/v) a pH 7,5, con un flujo de 1 mL/min. El volumen inyectado de las muestras y sus concentraciones fueron de 500 μL y 30 mg/mL de proteína, respectivamente. La elución de las proteínas se registró midiendo su absorbancia a 280 nm. 75 Actividad antioxidante • Actividad captadora del radical DPPH El efecto de captación de radicales de las muestras sobre el radical libre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) se midió según Wu et al. [208]. Brevemente, se agregaron 1,5 mL de cada muestra (a una concentración de 10 mg de proteína/mL) a 1,5 mL de DPPH 0,1 mM en etanol. La mezcla se agitó y se dejó durante 30 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se midió la absorbancia a 517 nm en un espectrofotómetro modelo DU-640 (Beckman Instruments, Fullerton, CA, EE.UU.). Se llevó a cabo un experimento de control de la misma manera, utilizando como control negativo agua destilada en lugar de la muestra y BHT (butilhidroxitolueno) a 0,08 mg/mL como estándar positivo. La actividad de eliminación de radicales de DPPH se expresó utilizando la siguiente ecuación: Actividad captadora de radicales DPPH (%) = (𝐴𝑐−𝐴𝑚) 𝐴𝑐 x 100, donde Ac y Am representan la absorbancia del control y de la muestra, respectivamente. • Poder antioxidante de reducción del hierro (FRAP) La capacidad de las muestras para reducir el hierro (III) se midió según Oyaizu [209]. Brevemente, se añadieron 0,1 mL de muestra (a una concentración de 10 mg de proteína/mL) a 0,25 mL de tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 6,6) y 0,25 mL de ferricianuro potásico 0,03 M. La mezcla se incubó a 50°C durante 20 minutos. A continuación, se añadieron 0,25 mL de 0,6 M de ácido tricloroacético y la mezcla se centrifugó a 1300 g durante 10 minutos. Se mezclaron 82 Tabla 9. Secuencias de cebadores para los genes de estudio. Gen Accession Number Foward primer (5’-3’) Reverse primer (5’-3’) h TNFα NM_001270782.1 GTGGGAGCTTCTCACTCTGG TAGGGCTTTTTCTCCTGCAA h IL-1β NM_000576 AAGGAGAGCTCTTTCCCACC GCCTCTGGTCTCCTTGGATT h IL-6 NM_000600 TAACCATCCCTGTCCCAACC AGTTACATGCCCAGTGGACA h IL-10 NM_000572 CTGACATCAAGGAGCACGTG GGCTTTGTAGACACCCCTCT h NLRP3 NM_004895.5 GTCTGGGTGAGAGTGTGAGC TCATCGGGGTCAAACAGCAA h ASC NM_013258.5 TCTACCTGGAGACCTACGGC ATAAAGTGCAGGCCTGGCTT h CASP1 NM_001257119.3 CAAGACCTCTGACAGCACGT GCAGGCCTGGATGATGATCA h IL-18 NM_001386420.1 GATAATGCACCCCGGACCAT CCTCCGGAGTGCAAGTGATT h CCR2 NM_001123396.1 TGCCTGACTCACACTCAAGG GGCTTCTCAGCAACTGAACC h CCL2 NM_002982.3 CCCCAGTCACCTGCTGTTAT ACGAAGCCATTTGGTAAACG h CCR1 NM_001295 AATGGGGAACTACTGCTGGC AGTCCCTCCCCTTTATGGCT h CCR5 NM_000579.4 GTTTGCGTCTCTCCCAGGAA TCCCGAGTAGCAGATGACCA h CX3CR1 NM_001171172.2 TGTATCAGGTGCCCATCCCT AATCAGGGGAGAGGCTGGAT h CCR7 NM_007719.2 GTGTGCTTCTGCCAAGATGA CCACGAAGCAGATGACAGAA h iNOS NM_ 000625 ACCCAGACTTACCCCTTTGG GCCTGGGGTCTAGGAGAGAC h MRC1 NM_ 138806 GGCGGTGACCTCACAAGTAT ACGAAGCCATTTGGTAAACG h CD200R NM_138940.2 GTTGCCCTCCTATCGCATTA TGGAAATTCCCATCAGGTGT h HPRT NM_001289746 ACCCCACGAAGTGTTGGATA AAGCAGATGGCCACAGAACT h GAPDH NM_001289746 CACATGGCCTCCAAGGAGTAAG CCAGCAGTGAGGGGTCTCTCT m TNFα NM_001278601 AGCCCCCAGTCTGTATCCTT CTCCCTTTGCAGAACTCAGG m IL-1β NM_008361 GCCCATCCTCTGTGACTCAT AGGCCACAGGTATTTTGCG m IL-6 NM_031168 AGTTGCCTTCTTGGGACTGA TCCACGATTTCCCAGAGAAC m IL-10 NM_010548 CCAAGCCTTATCGGAAATGA TTTTCACAGGGGAGAAATCG m CCR7 NM_001301713 CCAGGCACGCAACTTTGAG ACTACCACCACGGCAATGATG m iNOS NM_010927 CACCTTGGAGTTCACCCAGT ACCACTCGTACTTGGGATGC m ARG1 NM_007482 GTGAAGAACCCACGGTCTGT CTGGTTGTCAGGGGAGTGTT m YM1 NM_009892.3 ACTTTGATGGCCTCAACCTG AATGATTCCTGCTCCTGTGG m HPRT NM_013556.2 TATGTCCCCCGTTGACTGAT TGCTCGAGATGTCATGAAGG m GAPDH NM_001289726 AACTTTGGCATTGTGGAAGG ACACATTGGGGGTAGGAACA h, humano; m, mouse (ratón) Análisis por citometría de flujo Se evaluó mediante citometría de flujo la expresión de marcadores de monocitos CD14 (APC-Cy7 anti-human CD14, Miltenyi), CD16 (PE antihuman CD16, Miltenyi) y CCR2 (APC antihuman CCR2, Vitro). Se incubaron 5x105 células con la cantidad de anticuerpos recomendada por el fabricante a temperatura ambiente, 83 en oscuridad, durante 15 minutos. Para la citometría se utilizó el analizador multiparamétrico de células BD FACSCanto II y se analizó con el software BD FACSDiva (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). En cada muestra se midió la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las células. Los monocitos se clasificaron en 3 subconjuntos: monocitos clásicos CD14++CD16–, monocitos intermedios CD14++CD16+ y monocitos no clásicos CD14+CD16++. Los niveles de expresión se presentaron como MFI corregido para la unión inespecífica de anticuerpos utilizando un control de isotipo. Así mismo se estudió la expresión de CCR2 en la población completa de monocitos para evaluar la expresión de este mediador de quimiotaxis. Análisis estadístico Todos los valores se expresan como media aritmética ± desviación estándar (DE). Los datos se evaluaron con el software GraphPad Prism versión 5.01. La significación estadística de cualquier diferencia en cada parámetro entre los grupos se evaluó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA), siguiendo la prueba de comparaciones múltiples de Tukey como prueba post hoc. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. 84 85 4. RESULTADOS 86 87 RESULTADOS 1. Caracterización química de productos proteicos de alto valor añadido de kiwicha Obtención del aislado de proteína de kiwicha Para obtener el aislado proteico de kiwicha a partir del cual obtener los hidrolizados tal y como se describe anteriormente, se determinó el punto isoeléctrico y la solubilidad de las proteínas de kiwicha contenidas en el aislado proteico procedente de la harina desengrasada. Como se observa en la Figura 7, el menor porcentaje de proteína solubilizada se cuantificó a un pH de 4, considerándose este, por tanto, el punto isoeléctrico (pI) de las proteínas de kiwicha, siendo utilizado para la optimización del proceso del aislado proteico [68, 210]. Figura 7. Curva de solubilidad de las proteínas de kiwicha a distintos pH. Los datos, representados como porcentaje de proteína solubilizada (eje y), son la Media±DE de dos determinaciones realizadas a los distintos valores de pH (eje x). 88 El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH en el que una proteína no posee carga eléctrica y, por lo tanto, se considera neutra. El pI de los péptidos depende en gran medida de la constante de disociación de los grupos ionizables de los aminoácidos, presentes principalmente en arginina, aspartato, cisteína, histidina, lisina y glutamato. Sin embargo, la exposición de los residuos cargados a los solventes, los enlaces de hidrógeno y la deshidratación también influyen en el pI de una proteína. El pI de una proteína es crucial para comprender su función bioquímica y, por lo tanto, determinar este valor es un aspecto esencial de los estudios proteómicos [211]. Caracterización química de productos de kiwicha La harina de semilla de kiwicha se desengrasó obteniendo HDK con un contenido de proteína de 15,88%. El APK se aisló partiendo de la harina de semilla de kiwicha desengrasada con un 30,87% de rendimiento por extracción básica seguida de precipitación ácida, obteniendo un APK con un 84,52% de proteína. La composición química de los HPK fue similar a la del APK. La principal diferencia entre APK y HPK fue un mayor contenido de cenizas en los hidrolizados debido a la adición de álcali para mantener el pH constante durante la hidrólisis (Tabla 10). 89 Tabla 10. Composición química de los productos de kiwicha. Los datos, expresados como porcentaje sobre la base de materia seca, muestran la Media±DE de tres determinaciones. % Grasa (harina de semilla) 5,73±0,12 HDK APK HPK5 HPK10 HPK15 HPK30 HPK60 Proteínas 15,88±0,13 84,52±0,55 80,93±0,57 80,77±0,12 80,30±0,36 76,89±0,01 78,50±0,17 Humedad 7,01±0,17 0,96±0,10 2,86±0,13 1,59±0,27 1,29±0,09 4,54±0,04 1,93±0,19 Cenizas 2,18±0,09 1,75±0,05 7,17±0,25 7,54±0,36 8,40±0,16 9,13±0,59 9,31±0,05 Fibra 10,63±0,16 7,86±0,08 6,58±0,02 7,37±0,09 8,31±0,31 8,09±0,24 8,04±0,18 Azúcares 1,73±0,22 0,78±0,12 0,37±0,01 0,52±0,06 0,46±0,02 0,30±0,04 0,29±0,02 Polifenoles 0,01±0,00 0,03±0,00 0,04±0,00 0,05±0,00 0,04±0,00 0,04±0,00 0,04±0,00 Otros1 62,56 4,1 2,05 2,16 1,2 1,01 1,89 Digestibilidad proteica In vitro2 60,74±0,04 77,97±2,93 79,18±0,66 67,00±3,23 69,58±0,63 71,74±1,66 73,28±0,51 1: Otros: 100- (proteínas + humedad + cenizas + fibra + azúcar + polifenoles) 2: gramos de proteína digerida/100 g de proteína Composición en aminoácidos de los productos de kiwicha El perfil de aminoácidos podría influir en la actividad peptídica de los productos de kiwicha. Por lo tanto, se analizó el perfil de aminoácidos en HDK, APK y los cinco HPK (Tabla 11). Todos estos productos tenían perfiles de aminoácidos similares y se identificaron como una gran fuente de aminoácidos esenciales. En resumen, los productos de kiwicha eran ricos en aminoácidos cargados negativamente como ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu), y también ricos en arginina (Arg). 90 Tabla 11. Composición de aminoácidos de los productos de kiwicha. Los datos, expresados como porcentaje de aminoácidos sobre el contenido total de aminoácidos, son la Media±DE (n=3). AA (mg/g prot) HDK APK HPK5 HPK10 HPK15 HPK30 HPK60 FAO 1,2 Aminoácidos esenciales His 24,30,0 27,60,0 30,80,1 30,80,1 31,20,1 31,10,0 31,50,0 15 Ile 30,8±0,3 43,8±0,0 42,7±0,1 44,6±0,1 44,9±0,2 44,9±0,2 45,2±0,1 30 Leu 61,2±0,0 72,±0,1 71,9±0,2 73,9±0,1 74±0,1 74,3±0,1 75,6±0,0 59 Lys 62,3±0,1 53,1±0,1 55±0,1 55,2±0,1 55±0,1 55±0,0 55,9±0,0 45 Met+Cys 32,5±0,1 34,6±0,1 28,2±0,1 35,7±0,1 34,5±0,1 37,1±0,1 36,6±0,1 22 Met 13,1±0,1 20,9±0,2 13,3±0,1 21,5±0,1 20±0,2 22,7±0,2 20,5±0,2 Cys 19,4±0,1 13,7±0,0 14,9±0,1 14,2±0,1 14,5±0,1 14,4±0,1 15,1±0,1 Phe+Tyr 77,9±0,1 92,6±0,1 93,1±0,2 94,8±0,1 93,7±0,1 95,5±0,0 95,4±0,2 38 Thr 39,8±0,1 41±0,0 42,9±0,1 43,1±0,1 43±0,0 43±0,0 43,7±0,0 23 Trp 9,2±0,0 11,5±0,0 16,7±0,0 16±0,0 15,2±0,0 12,6±0,1 8,7±0,0 60 Val 35,3±0,3 46,1±0,1 45,2±0,2 47,4±0,1 48,1±0,2 47,3±0,2 48,2±0,2 39 Total 405,8 456,9 454,7 477,2 474,1 477,9 476,4 Aminoácidos no esenciales Asp+Asn 94,3±0,4 92,6±0,2 99,7±0,2 97,7±0,2 97,1±0,1 96,8±0,0 98,3±0,0 Glu+Gln 183±0,6 155,1±0,1 168,4±0,3 163,3±0,4 162,4±0,2 160,8±0,0 162,7±0,1 Ser 79,1±0,4 55,4±0,1 60,3±0,1 59±0,1 58,5±0,1 58,4±0,1 59,4±0,1 Gly 83,1±0,4 49,3±0,1 52,8±0,1 51,6±0,1 52,5±0,1 51,4±0,0 53 ±0,1 Arg 87,3±0,2 89,4±0,1 95,2±0,2 94,2±0,2 93,8±0,1 93,7±0,1 94,8±0,1 Ala 41,4±0,2 41,1±0,0 43±0,1 43,1±0,1 43,3±0,1 43±0,0 43,6±0,0 Pro 58,5±0,7 94,9±0,6 54,4±1,9 49,7±1,4 52,7±0,5 54,8±0,6 48,3±1,0 Tyr 34,9±0,1 40,8±0,2 41±0,2 41,5±0,1 40,4±0,2 42,3±0,0 41,1±0,3 1 FAO/OMS/UNU. Patrón de puntuación mg/g de las necesidades de proteínas en adultos. 2 FAO y FINUT, 2017. Evaluación de la calidad de las proteínas alimentarias en la nutrición humana. Documento de alimentación y nutrición de la FAO NO. 92. 91 Grado de hidrólisis y perfil molecular de los productos de kiwicha El grado de hidrólisis puede utilizarse como una indicación de la longitud de la cadena del péptido resultante; un valor alto indica longitudes medias más cortas, mientras que un valor bajo indica longitudes medias más largas. La hidrólisis extensiva de APK se realizó en la forma que se muestra en la Figura 8. El APK se hidrolizó durante 1 hora con Bioproteasa. La velocidad de hidrólisis fue rápida durante los primeros 5 minutos de hidrólisis y aumentó más lentamente en los siguientes 55 minutos, hasta alcanzar un 32,02% de grado de hidrólisis final. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0 10 20 30 40 min Grado de Hidrólisis (%) APK HPK5HPK10 HPK15 HPK30 HPK60 Figura 8. Evolución temporal del grado de hidrólisis del APK durante la hidrólisis enzimática con Bioproteasa a 5 (HPK5), 10 (HPK10), 15 (HPK15), 30 (HPK30) y 60 (HPK60) minutos. Los datos, expresados como el porcentaje de enlaces peptídicos escindidos (eje y), son la Media de las tres determinaciones realizadas a cada tiempo (eje x). 98 En segundo lugar, para evaluar no solo la expresión génica de estas citoquinas, sino también como influían los hidrolizados de kiwicha seleccionados en su expresión y secreción proteica, se midieron los niveles de TNFα, IL-1β, IL-6 e IL-10 en el medio, es decir, fueron determinadas mediante ELISA en los sobrenadantes de los cultivos de las células Caco-2. De forma similar, se utilizó LPS como estímulo proinflamatorio, y como tratamiento HPK15 y HPK30 a 50 y 100μg/mL durante 24h. En el caso de los niveles de TNFα, Figura 12A, el LPS mostró una tendencia al aumento de la secreción de esta citoquina con respecto al control no tratado, de forma similar a lo observado con respecto a su expresión génica. Curiosamente, el tratamiento con HPK15 a 50μg/mL provocó un aumento similar al provocado por el LPS, pero en este caso si fue significativamente mayor (p<0,05) en comparación con el control no tratado. Sin embargo, no se observaron efectos significativos en la secreción de TNFα con el tratamiento de este HPK15 a 100μg/mL, ni del HPK30 a 50 o 100μg/mL. En cuanto a la secreción de la IL-1β, Figura 12B, el LPS provocó un aumento significativo (p<0,05) de los niveles de esta citoquina con respecto al control no tratado, mientras que el tratamiento HPK30 tanto a 50 como a 100μg/mL contrarrestó significativamente (p<0,05) este aumento inducido por LPS, disminuyendo los niveles de IL-1β. En el caso de HPK15 a 50 y 100μg/mL no se observaron cambios significativos, pero si una tendencia a disminuir la secreción al sobrenadante de esta citoquina proinflamatoria. 99 Al evaluar los niveles de la citoquina proinflamatoria IL-6 en los sobrenadantes, Figura 12C, únicamente se observó un aumento significativo (p<0,05) provocado por el LPS respecto al control no tratado, mientras que, tanto en el caso del tratamiento con HPK15 a 50 y 100μg/mL como con HPK30 a 50 y 100μg/mL, no se observaron cambios significativos en la secreción de IL-6, aunque si una tendencia a disminuir sus niveles. Por último, en el caso de la citoquina antiinflamatoria IL-10, Figura 12D, el LPS provocó una disminución significativa (p<0,05) de los niveles de secreción de esta citoquina con respecto al control no tratado, mientras que el tratamiento con HPK15 a 100μg/mL y HPK30 a 50μg/mL contrarrestaron esta disminución inducida por LPS, aumentando significativamente (p<0,01) los niveles de IL-10. Por tanto, el tratamiento con ambos hidrolizados mostró un efecto antiinflamatorio a través de esta citoquina. 100 No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1000 2000 3000 4000 5000 IL1β secreatdo por Caco-2 (pg/mL) ✱ ✱ ✱ B. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 200 400 600 800 1000 IL6 secreatdo por Caco-2 (pg/mL) ✱ C. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 2000 4000 6000 TNFα secreatdo por Caco-2 (pg/mL) ✱ A. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1000 2000 3000 4000 IL10 secreatdo por Caco-2 (pg/mL) ✱✱✱ ✱✱ ✱ D. No tratadas LPS (1μg/mL) LPS + HPK15 (50μg/mL) LPS + HPK15 (100μg/mL) LPS + HPK30 (50μg/mL) LPS + HPK30 (100μg/mL) Figura 12. Niveles de TNFα (A), IL-1β (B), IL-6 (C) e IL-10 (D) en sobrenadantes de cultivos de células Caco-2 tras 24h de incubación con LPS (1μg/mL) y HPK15 y HPK30 a 50 y 100μg/mL. Los valores se muestran pg/mL y se presentan como Medias±DE (n=3). Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 101 A continuación, con el fin de completar la evaluación de la potencial modulación inflamatoria de los HPK, se examinó también la expresión génica tanto de componentes del inflamasoma, NLRP3 y ASC, como de moléculas cuya expresión o funcionalidad está regulada por la activación de este inflamasoma, en este caso, Caspasa-1 e IL-18. En cuanto a la expresión de NLRP3, como puede observarse en la Figura 13A, la exposición a LPS provocó un aumento muy significativo (p<0,001) de la expresión de su ARNm con respecto al control no tratado, mientras que el tratamiento tanto con HPK15 a 100μg/mL como con HPK30 a 50μg/mL contrarrestaron significativamente (p<0,01) este cambio inducido por LPS. De forma similar, el tratamiento con HPK30 a 100μg/mL, también contrarrestó significativamente (p<0,05) este aumento, bloqueando por tanto ambos hidrolizados el aumento de expresión de NLRP3. En el caso del otro componente del inflamasoma estudiado, el ASC, Figura 13B, la exposición a LPS provocó un aumento significativo (p<0,01) de la expresión de su ARNm con respecto al control no tratado. Sin embargo, tratamiento tanto con HPK15 a 100μg/mL contrarrestó significativamente (p<0,01) este aumento. En el caso del HPK30, tanto a 50 como a 100μg/mL, también contrarrestó significativamente (p<0,05) el cambio inducido por LPS. Por tanto, de forma similar a lo que se observó para NLRP3, ambos hidrolizados regularon el aumento de expresión de ASC. Para evaluar los efectos de la modulación de este inflamasoma, se determinaron los niveles de Caspasa-1 y IL-18. En el caso de la Caspasa-1, Figura 13C, como era de esperar dados los 102 resultados en NLRP3 y ASC, la exposición a LPS provocó un aumento significativo (p<0,05) de la expresión de Caspasa-1 con respecto al control no tratado, mientras que el tratamiento tanto con HPK15 a 50 y 100μg/mL como con HPK30 a 50 y 100μg/mL contrarrestaron significativamente (p<0,01) este aumento. Para la citoquina proinflamatoria IL-18, Figura 13D, de forma similar a la Caspasa-1, la exposición a LPS provocó un aumento significativo (p<0,05) de la expresión de su ARNm con respecto al control no tratado. En el caso de los tratamientos con hidrolizados de la kiwicha, tanto con HPK15 a 100μg/mL como con HPK30 a 50 y 100μg/mL se observó una disminución significativa (p<0,05) de este aumento de la expresión desencadenada por LPS. 103 No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1 2 3 4 Expresión génica ASC en Caco-2 (valores relativizados) ✱✱ ✱✱ ✱ ✱ B. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1 2 3 Expresión génica CASP1 en Caco-2 (valores relativizados) ✱✱✱ ✱✱ ✱✱ ✱✱ C. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1 2 3 4 5 Expresión génica NLRP3 en Caco-2 (valores relativizados) ✱✱✱ ✱✱ ✱✱ ✱ A. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 2 4 6 Expresión génica IL18 en Caco-2 (valores relativizados) ✱ ✱ ✱ ✱ D. No tratadas LPS (1μg/mL) LPS + HPK15 (50μg/mL) LPS + HPK15 (100μg/mL) LPS + HPK30 (50μg/mL) LPS + HPK30 (100μg/mL) Figura 13. Expresión génica de NLRP3 (A), ASC (B), Caspasa-1 (C) e IL-18 (D) en células Caco-2 tras 24h de incubación con LPS (1μg/mL) y HPK15 y HPK30 a 50 y 100μg/mL. Los valores se muestran relativizados al control no tratado y se presentan como Medias±DE (n=3). Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 104 3. Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de los hidrolizados proteicos de kiwicha a nivel de inflamación sistémica Una vez observada la capacidad de los HPKs para modular la respuesta inflamatoria en los ensayos con células Caco-2, se utilizaron monocitos como modelo celular específico para estudiar la inflamación in vitro más allá de la inflamación intestinal, por su implicación en inmunidad innata y capacidad de polarización hacia fenotipo M1 o M2. Propiedades de los hidrolizados de proteína de kiwicha en la quimiotaxis de monocitos En primer lugar, se midió mediante citometría de flujo la intensidad de fluorescencia media (MFI) de los monocitos, clasificándolos, en 3 subconjuntos: CD14++CD16– (monocitos clásicos), CD14++CD16+ (monocitos intermedios) y CD14+CD16++ (monocitos no clásicos). Por un lado, se observó un aumento significativo (p<0,05) de monocitos clásicos con respecto al control provocado por LPS, que solo fue contrarrestado, significativamente (p<0,05) en el caso del tratamiento con HPK30 a 100μg/mL (Figura 14A). Este aumento significativo (p<0,05) provocado por LPS también se observó para los monocitos intermedios, pero en este caso, tanto el tratamiento con HPK15 a 50μg/mL como con HPK30 a 50 y 100μg/mL, disminuyeron significativamente (p<0,05) este aumento, aproximándolo a valores similares al control (Figura 14B). 105 Sin embargo, para los monocitos no clásicos, se observó un efecto totalmente inverso, provocando el LPS una disminución muy significativa (p<0,001) con respecto al control no tratado de esta población celular CD14+CD16++, que fue contrarrestada con el tratamiento con HPK15 a 50 y 100μg/mL y con HPK30 a 50 y 100μg/mL de forma muy significativa (p<0,001). Por tanto, ambos hidrolizados, a las dos concentraciones testadas, produjeron un aumento considerable de los niveles de esta población (Figura 14C). 106 No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0.0 0.5 1.0 1.5 Monocitos clásicos (CD14++ CD16-) (valores relativizados) ✱ ✱ A. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0.0 0.5 1.0 1.5 Monocitos intermedios (CD14++ CD16+) (valores relativizados) ✱ ✱ ✱ ✱ B. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0.0 0.5 1.0 1.5 Monocitos no clásicos (CD14+ CD16++) (valores relativizados) ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ C. No tratadas LPS (1μg/mL) LPS + HPK15 (50μg/mL) LPS + HPK15 (100μg/mL) LPS + HPK30 (50μg/mL) LPS + HPK30 (100μg/mL) Figura 14. Análisis de monocitos clásicos CD14++CD16–(A), monocitos intermedios CD14++CD16+(B) y monocitos no clásicos CD14+CD16++(C) tras 24h de incubación con LPS (1μg/mL) y HPK15 y HPK30 a 50 y 100μg/mL. Los valores se muestran relativizados al control no tratado y se presentan como Medias±DE (n=3). Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 107 A su vez, se estudió la expresión de CCR2 en la población completa de monocitos como mediador de quimiotaxis tanto por citometría, como a nivel de expresión génica mediante qRT-PCR. De forma similar, también se evaluó la expresión génica de su ligando CCL2. En el análisis por citometría, se pudo observar como el LPS provocó un aumento muy significativo (p<0,001) de los niveles de CCR2 en monocitos, con respecto al control sin tratar, mientras que el tratamiento con HPK15 a 50μg/mL disminuyó significativamente los niveles de CCR2 (p<0,01) y el tratamiento con HPK15 a 100μg/mL y con HPK30 a 50 y 100μg/mL los redujo de forma aún más significativa (p<0,001) (Figura 15A). En cuanto a la expresión génica de esta molécula quimiotáctica, los resultados observados fueron muy similares a los obtenidos por citometría, ya que el LPS provocó un aumento muy significativo (p<0,001) de la expresión de CCR2 con respecto al control no tratado, que fue contrarrestado con los hidrolizados, puesto que mostraron una disminución significativa de los niveles de expresión génica de CCR2 tanto HPK15 a 50μg/mL (p<0,01), como a 100μg/mL (p<0,001) y HPK30 a 50 y 100μg/mL (p<0,01) (Figura 15B). Para su ligando CCL2, también se dio un aumento significativo (p<0,001) de su expresión génica provocado por LPS, pero en este caso, solo el tratamiento con HPK15 a 100μg/mL consiguió disminuir este aumento de forma significativa (p<0,01) (Figura 15C). 114 No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1000 2000 3000 4000 TNFα secreatdo por Monocitos (pg/mL) ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ A. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 2 4 6 8 10 12 IL10 secreatdo por Monocitos (pg/mL) D. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 100 200 300 400 IL1β secreatdo por Monocitos (pg/mL) ✱✱✱ ✱ ✱✱ ✱✱ ✱ B. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 50 100 150 200 IL6 secreatdo por Monocitos (pg/mL) ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ C. No tratadas LPS (1μg/mL) LPS + HPK15 (50μg/mL) LPS + HPK15 (100μg/mL) LPS + HPK30 (50μg/mL) LPS + HPK30 (100μg/mL) Figura 18. Niveles de TNFα (A), IL-1β (B), IL-6 (C) e IL-10 (D) en sobrenadantes de cultivos de monocitos tras 24h de incubación con LPS (1μg/mL) y HPK15 y HPK30 a 50 y 100μg/mL. Los valores se muestran en pg/mL y se presentan como Medias±DE (n=3). Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 115 Propiedades de los hidrolizados de proteína de kiwicha sobre la polarización de monocitos Para completar el estudio en monocitos, se determinó el efecto de los hidrolizados seleccionados sobre la expresión génica de distintos marcadores de polarización hacia fenotipo M1 o M2 como son CCR7 e iNOS, y MRC1 y CD200R respectivamente. En cuanto a la expresión de CCR7, Figura 19A, no se observaron cambios significativos en su expresión génica con respecto al control no tratado, ni tras la exposición a LPS ni con los hidrolizados, aunque se aprecia una tendencia al aumento de expresión con LPS y hacia una disminución de ésta con los distintos tratamientos. En el caso de iNOS, Figura 19B, se observó algo muy similar a lo observado para CCR7, es decir, no se apreció ningún cambio significativo en su expresión génica con respecto al control no tratado, ni tras la exposición a LPS ni con los hidrolizados, y en este caso solo se observó una tendencia al aumento de expresión por efecto del LPS. Para MCR1, Figura 19C, se observó una tendencia a la disminución de su expresión génica con respecto al control no tratado inducida por la exposición a LPS, y se produjo un aumento significativo de su expresión por el tratamiento con HPK15 a 100μg/mL (p<0,01), siendo este el único cambio significativo observado en marcadores de polarización de monocitos, ya que para CD200R, Figura 19D, aunque se observó la misma tendencia a la disminución de su expresión génica por exposición a LPS con 116 respecto al control no tratado y una tendencia al aumento por efecto de los hidrolizados, estos cambios no fueron significativos. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1 2 3 Expresión génica CCR7 en Monocitos (valores relativizados) A. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Expresión génica CD200R en Monocitos (valores relativizados) D. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1 2 3 4 Expresión génica iNOS en Monocitos (valores relativizados) B. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Expresión génica MRC1 en Monocitos (valores relativizados) ✱✱ C. No tratadas LPS (1μg/mL) LPS + HPK15 (50μg/mL) LPS + HPK15 (100μg/mL) LPS + HPK30 (50μg/mL) LPS + HPK30 (100μg/mL) Figura 19. Expresión génica de CCR7 (A), iNOS (B), MRC1 (C) y CD200R (D) en M1 y M2 tras 24h de incubación con LPS (1μg/mL) y HPK15 y HPK30 a 50 y 100μg/mL. Los valores se muestran relativizados al control no tratado y se presentan como Medias±DE (n=3). Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 117 4. Evaluación de las propiedades neuroprotectoras de los hidrolizados proteicos de kiwicha Como modelo para estudiar el efecto in vitro de los hidrolizados de kiwicha sobre la microglía, se utilizó la línea celular BV-2. En concreto, se buscó evaluar el efecto en neuroinflamación y polarización de la microglía hacia fenotipo M1 o M2, de forma similar a la aproximación llevada a cabo con monocitos. Para ello, se estudió el efecto sobre la expresión génica, mediante qRT-PCR, de las citoquinas pro y antiinflamatorias TNFα, IL-1β, IL-6 e IL-10 y de CCR7 e iNOS, y ARG1 y YM1 para evaluar la polarización M1 y M2 respectivamente. Propiedades antiinflamatorias de los hidrolizados de proteína de kiwicha en microglía En cuanto a la expresión génica de TNFα, como puede observarse en la Figura 20A, el LPS provocó un aumento significativo (p<0,001) de los niveles de ARNm de esta citoquina con respecto al control no tratado, mientras que se produjo una disminución significativa de sus niveles de expresión por el tratamiento tanto con HPK15 a 50 y 100μg/mL, como con HPK30 a 50 y 100μg/mL (p<0,001). En el caso de la citoquina proinflamatoria IL-1β, Figura 20B, el LPS provocó un aumento significativo (p<0,01) de la expresión génica de esta con respecto al control no tratado. A su vez, se produjo una disminución significativa de estos niveles de expresión tanto 118 por el tratamiento con HPK15 a 50 y 100μg/mL (p<0,05), como con HPK30 a 50 y 100μg/mL (p<0,01). Para la IL-6, Figura 20C, se observó un aumento significativo de la expresión inducida por LPS (p<0,05) con respecto al control no tratado, pero aunque se observó una tendencia a la disminución, no se produjo ningún efecto significativo sobre la expresión de esta citoquina por los tratamientos con HPK15 o HPK30. De forma similar a los efectos observados en experimentos anteriores, para la citoquina antiinflamatoria IL-10, Figura 20D, aunque el LPS no provocó un cambio significativo de su expresión, se observó una tendencia a la disminución de los niveles de ARNm con respecto al control no tratado, mientras que el tratamiento con HPK15 a 50 y 100μg/mL contrarrestaron esta tendencia inducida por LPS, aumentando significativamente (p<0,01) la expresión de IL- 10. 119 No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 5 10 15 20 Expresión génica TNFα en BV-2 (valores relativizados) ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ A. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Expresión génica IL10 en BV-2 (valores relativizados) ✱✱ ✱✱ D. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 2 4 6 8 Expresión génica IL1β en BV-2 (valores relativizados) ✱✱ ✱ ✱ ✱✱ ✱✱ B. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1 2 3 4 Expresión génica IL6 en BV-2 (valores relativizados) ✱ C. No tratadas LPS (1μg/mL) LPS + HPK15 (50μg/mL) LPS + HPK15 (100μg/mL) LPS + HPK30 (50μg/mL) LPS + HPK30 (100μg/mL) Figura 20. Expresión génica de TNFα (A), IL-1β (B), IL-6 (C) e IL-10 (D) en células BV-2 tras 24h de incubación con LPS (1μg/mL) y HPK15 y HPK30 a 50 y 100μg/mL. Los valores se muestran relativizados al control no tratado y se presentan como Medias±DE (n=3). Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 120 Propiedades de los hidrolizados de proteína de kiwicha sobre la polarización de microglía Al igual que se evaluó en monocitos, se determinó el efecto de los hidrolizados seleccionados sobre la expresión génica de distintos marcadores de polarización hacia fenotipo M1 o M2 de la microglía, en este caso de CCR7 e iNOS, y ARG1 y YM1 respectivamente. En este caso, la expresión génica de CCR7, Figura 21A, aumentó significativamente por efecto del LPS con respecto al control no tratado (p<0,05), mientras que el tratamiento tanto con HPK30 a 50 como a 100μg/mL disminuyó significativamente su expresión (p<0,05). Para iNOS, Figura 21B, se observó un aumento muy significativo en su expresión génica con respecto al control no tratado por la exposición a LPS (p<0,001), el cual fue contrarrestados por el tratamiento con los hidrolizados, disminuyendo muy significativamente la expresión de iNOS tanto con HPK15 a 50 y 100μg/mL (p<0,001), como con HPK30 a 50 y 100μg/mL (p<0,001). En el caso de los marcadores de polarización M2 de la microglía, la expresión génica de ARG1, Figura 21C, no disminuyó de forma significativa por efecto del LPS con respecto al control no tratado, pero si se produjo un aumento significativo de los niveles de ARNm de ARG1 por el tratamiento con HPK15 a 100μg/mL (p<0,01) y HPK30 a 100μg/mL (p<0,001). Por otro lado, para YM1, Figura 21D, se observó una tendencia a la disminución de su expresión génica por exposición a LPS con respecto al control no tratado, y un 121 aumento significativo de ésta provocado por el tratamiento con HPK15 a 100μg/mL (p<0,05). No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 1 2 3 Expresión génica CCR7 en BV-2 (valores relativizados) ✱ ✱ ✱ A. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Expresión génica YM1 en BV-2 (valores relativizados) ✱ D. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 5 10 15 20 Expresión génica iNOS en BV-2 (valores relativizados) ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ ✱✱✱ B. No tto. LPS HPK15 (50) HPK15 (100) HPK30 (50) HPK30 (100) 0 2 4 6 8 10 Expresión génica ARG1 en BV-2 (valores relativizados) ✱✱ ✱✱✱ C. No tratadas LPS (1μg/mL) LPS + HPK15 (50μg/mL) LPS + HPK15 (100μg/mL) LPS + HPK30 (50μg/mL) LPS + HPK30 (100μg/mL) Figura 21. Expresión génica de CCR7 (A), iNOS (B), ARG1 (C) y YM1 (D) en células BV-2 tras 24h de incubación con LPS (1μg/mL) y HPK15 y HPK30 a 50 y 100μg/mL. Los valores se muestran relativizados al control no tratado y se presentan como Medias±DE (n=3). Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 122 123 5. DISCUSIÓN 130 mediadas por linfocitos T y B [219]. Además de ser un modelo útil para el estudio del transporte intestinal, se han desarrollado modelos que utilizan células Caco-2 para probar los efectos antiinflamatorios de varios compuestos in vitro [220], como se ha hecho en este trabajo, donde observamos que los hidrolizados de kiwicha, son capaces de disminuir nos niveles de expresión génica de estas tres citoquinas proinflamatorias, TNFα, IL-6 e IL-1β, tras haber inducido su producción con LPS. Esto sugiere que los hidrolizados obtenidos y seleccionados son capaces de regular la respuesta inmune inflamatoria a nivel intestinal y conseguir estabilizarla, recuperando en la mayoría de los casos niveles de expresión génica muy similares al estado basal representados por el control no tratado. En el caso de la citoquina antiinflamatoria IL-10, y de forma contraria a lo que ocurre para TNFα, IL-6 e IL-1β, los efectos de estos hidrolizados sobre su expresión se observan a nivel de proteína, aumentado su secreción. Por tanto, ante una situación de inflamación intestinal, estos hidrolizados estarían actuando como reguladores de la respuesta inmune, no solo a nivel de expresión génica, disminuyendo la expresión de citoquinas proinflamatorias, sino también a nivel de producción de proteínas, aumentando la secreción de citoquinas antiinflamatorias. Por otro lado, se ha propuesto modular la actividad NLRP3 para regular la respuesta inmunitaria innata durante la inflamación intestinal [221]. En condiciones normales, la actividad del inflamasoma NLRP3 está estrictamente regulada para evitar su activación incontrolada, ya que la señalización inadecuada se asocia con diversas patologías autoinmunes y metabólicas, incluida artritis, 131 obesidad, diabetes tipo 2, enfermedad de Alzhéimer y enfermedades inflamatorias intestinales [184, 222]. Por tanto, la regulación de este sistema puede tener un potencial terapéutico en el tratamiento de estas enfermedades a través de la inhibición de NLRP3. Tanto es así, que existen numerosos estudios en los que se fija esta molécula como posible diana terapéutica, utilizando distintos abordajes tanto a nivel de regulación pos-traduccional como pos-transcripcional, así como interviniendo en el ensamblaje del sistema NLRP3-ASC-Caspasa-1 [184]. Dada la íntima asociación entre la desregulación del inflamasoma y distintas enfermedades, desentrañar los complejos mecanismos que subyacen a su activación y regulación, y su importancia para la salud y la enfermedad humanas, suponen actualmente un reto. Los resultados obtenidos en el presente trabajo muestran como los hidrolizados obtenidos de la kiwicha son capaces de disminuir de forma significativa los niveles de expresión génica de todo el complejo del inflamasoma en células Caco-2, actuando de forma similar sobre NLRP3, ASC, la Caspasa-1 y la citoquina proinflamatoria IL-18, observándose una disminución a nivel transcripcional de cada una de estas moléculas, aproximando los valores de expresión a los de la condición basal. Estos resultados sugieren que este podría ser otro punto desde el que los hidrolizados permitieran regular la respuesta inmune a nivel intestinal, con la repercusión que esto tendría para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales. 132 Por otro lado, los monocitos representan un buen modelo como primera aproximación para el estudio de las respuestas inmunes, con numerosos estudios que lo avalan [181]. Al igual que ocurre con otras células del sistema inmune, uno de los factores que condicionan la actividad inmunológica de monocitos son las quimioquinas, mediando la inflamación aguda e impulsando su migración hacia tejidos dañados o infectados. Sin embargo, la expresión elevada de estas moléculas y sus receptores puede contribuir a la inflamación crónica [223]. Se han identificado tres poblaciones diferentes de monocitos, conocidas como monocitos clásicos (CD14++CD16−), intermedios (CD14++CD16+) y no clásicos (CD14+CD16++), siendo fenotípica y funcionalmente diferentes. Sin embargo, la función de la población intermedia aún no está bien definida, ya que algunos estudios sugieren que están relacionados con el subconjunto clásico y otros con el subconjunto no clásico. Los monocitos clásicos suponen alrededor del 80 a 95% de los monocitos circulantes, siendo células fagocíticas caracterizadas por la expresión de marcadores proinflamatorios. Los monocitos intermedios comprenden entre el 2 y el 8% del total de monocitos, y entre sus funciones descritas se incluyen la producción de especies reactivas de oxígeno, presentación de antígenos, participación en la proliferación y estimulación de las células T, respuestas inflamatorias y angiogénesis. Por último, los monocitos no clásicos comprenden aproximadamente del 2 al 11% de los monocitos y se les atribuye la función de revisión del endotelio en busca de lesiones, aunque también se ha descrito que podrían secretar citoquinas 133 inflamatorias en respuesta a infecciones y participar en la presentación de antígenos y la estimulación de las células T [224]. En este trabajo se observa como los hidrolizados de kiwicha, son capaces de contrarrestar el efecto producido por LPS en los tres subgrupos de monocitos, disminuyendo el aumento en monocitos clásicos e intermedios y aumentando los monocitos no clásicos, tendiendo a normalizar los valores a niveles similares a los del control en los tres casos. Esta última población, los monocitos no clásicos, parecen ser la que se ve más influenciada por el efecto de estos hidrolizados. En conjunto, esto podría significar que al disminuir los monocitos clásicos e intermedios, y con ello disminuir las funciones proinflamatorias que se les atribuyen, y aumentar la población de monocitos no clásicos, los hidrolizados de kiwicha estarían favoreciendo la regulación de la inflamación por parte de este último subtipo celular, ya que se cree que los monocitos no clásicos están involucrados tanto en la resolución de la inflamación como en la homeostasis del endotelio vascular, recorriendo activamente la vasculatura, fagocitando micropartículas y eliminando las células endoteliales dañadas [225]. Los monocitos, las células dendríticas inmaduras y las subpoblaciones de células T tienen una alta expresión de CCR2 que media su migración hacia quimioquinas como CCL2. El eje de señalización CCL2-CCR2 está implicado en muchas enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas como la aterosclerosis, la esclerosis múltiple, el asma, el dolor neuropático, la nefropatía diabética y el cáncer y, por lo tanto, se explora como una diana potencial para el tratamiento de estas enfermedades [226]. En 134 cuanto a CCR5, también está implicado en el reclutamiento de leucocitos a los lugares de inflamación y en la regulación de su activación, por lo que, al igual que CCR2 y CCL2, representa un factor importante en la respuesta inflamatoria. De hecho, las terapias dirigidas de forma dual a CCR5/CCR2 están surgiendo como una estrategia más eficaz que las que lo hacen de forma individual a cualquiera de estos dos receptores [223]. El receptor CCR1 se expresa en numerosas células del sistema inmune, entre ellas los monocitos, pudiendo unirse a distintas quimioquinas. El papel de CCR1 se ha caracterizado bien para distintas afecciones inflamatorias y está implicado la migración transendotelial, ya que desempeña un papel importante en la adhesión de monocitos/macrófagos y células T al endotelio vascular activado, el paso inicial crítico para la transmigración de leucocitos y al reclutamiento a sitios extravasculares de lesión, habiéndose demostrado esta función en varios modelos de enfermedades inflamatorias [227, 228]. Como otras quimioquinas, el eje CX3CR1-CX3CL1 está implicado en muchos trastornos inflamatorios. Sin embargo, existen conclusiones contradictorias con respecto al efecto de la sobreexpresión o deficiencia de CX3CR1. Por un lado, ha sido descrito que los macrófagos CX3CR1+ son los principales responsables de la eliminación de microorganismos patógenos a nivel intestinal y que juegan un papel importante en el control de la inflamación intestinal anormal que puede provocar daño tisular. De hecho, esta función antiinflamatoria de monocitos/macrófagos CX3CR1+ depende en gran medida de la IL-10, aunque también 135 pueden actuar de manera autónoma y/o dependiente de células Treg. En contraposición, también se ha observado que los monocitos CX3CR1+ que migran hacia el intestino, promueven la activación de células T amplificando la respuesta inflamatoria. Por estas razones, entre otras, se considera que el resultado funcional de los macrófagos CX3CR1+ va a depender en gran medida del microambiente de citoquinas circundante [229]. Para el conjunto de los receptores de quimioquinas, el presente trabajo muestra como todos los hidrolizados de kiwicha testados estarían dando lugar a una disminución de la expresión del receptor CCR2, tanto a nivel de transcripción como de traducción, y a su vez, en este caso en una de las condiciones ensayadas, también estaría disminuyendo la expresión génica de su ligando CCL2. Sin embargo, para los receptores CCR1 y CCR5, aunque se observe una leve tendencia, la presencia de los hidrolizados en el medio parece no ser suficiente para contrarrestar la sobreexpresión provocada por LPS. Además, en el caso de CX3CR1, se observa una tendencia de los hidrolizados a aumentar los niveles de expresión en monocitos, por encima incluso de los valores basales del control, pero sin llegar a ser significativo. Por todo ello, se podría suponer que el efecto de los hidrolizados a nivel de quimioquinas se vería reflejado principalmente en su acción sobre el eje CCR2/CCL2, apoyando una vez más el efecto regulador de estos en mecanismos de inflamación. Asimismo, se ha descrito que los monocitos clásicos expresan altos niveles del receptor CCR2 y pueden migrar a sitios de lesión e infección donde se diferencian en macrófagos inflamatorios, que por el contrario, los monocitos no clásicos expresan altos niveles del 136 receptor relacionado con la adhesión CX3CR1 y exhiben una capacidad única para patrullar la vasculatura en reposo y eliminar los desechos [225]. Estos resultados sobre receptores, sumados a los observados en las distintas poblaciones de monocitos, sugieren que los hidrolizados podrían ejercer sus propiedades antiinflamatorias y de regulación del sistema inmune innato teniendo efecto también a nivel de monocitos, ya que a grandes rasgos se muestra como los hidrolizados de kiwicha disminuyen monocitos clásicos y CCR2/CCL2 y aumentan monocitos no clásicos, así como la tendencia observada al aumento de los niveles de CX3CR1. No obstante, para demostrar esta hipótesis se podrían diseñar nuevos experimentos con los que verificar este efecto de los hidrolizados en los subtipos concretos de monocitos. Es bien sabido que los monocitos/macrófagos son factores clave durante las respuestas inflamatorias y su fenotipo determina el perfil de secreción de citoquinas, de forma que los macrófagos M1 contribuyen al desarrollo de los procesos inflamatorios y están asociados con la actividad de las células Th1, dando lugar a una producción elevada de citoquinas proinflamatorias, como TNFα, IL- 6, IL-1β, óxido nítrico y ROS. Sin embargo, la activación de macrófagos a fenotipo M2 se desencadena en respuesta a IL-4 o IL- 13 y se asocia con remodelación tisular e inmunorregulación, produciendo citoquinas antiinflamatorias como IL-10, asociándose así a procesos antiinflamatorios. Los niveles de las citoquinas proinflamatorias TNFα, IL-6 e IL-1β se elevan en situaciones de inflamación crónica y actualmente numerosos estudios evidencian que los péptidos biológicamente activos derivados de las plantas 137 pueden prevenir muchos de estos trastornos debido a sus efectos antioxidantes y antiinflamatorios [148], como podría suceder en el caso de los hidrolizados de kiwicha, ya que este trabajo muestra como en presencia de estos, los niveles tanto de TNFα como de IL-6 e IL-1β disminuyen hasta niveles muy similares al estado basal en monocitos y como se tiende al aumento en el caso de la IL-10, lo que apoyaría fehacientemente el efecto antiinflamatorio que se sugiere anteriormente con los primeros datos observados de los hidrolizados sobre en esta población. Por otro lado, dada esta capacidad de polarización a diferentes fenotipos M1 y M2, y promover a su vez, respuestas proinflamatorias en el caso de macrófagos M1 y respuestas antiinflamatorias en macrófagos M2 [230], observando los resultados obtenidos en el presente trabajo en los que se muestran como hidrolizados de kiwicha son capaces de aumentar significativamente los niveles de expresión génica de MRC1, y una tendencia al aumento en el caso de CD200R, ambos marcadores característicos de monocitos M2 [231], se podría hipotetizar que los hidrolizados estarían dando lugar a un microambiente antiinflamatorio que implicase a su vez la polarización de monocitos/macrófagos hacia fenotipo M2. Así mismo, dados los resultados observados en monocitos y el paralelismo de sus funciones con la microglía, se pretendió profundizar en los posibles efectos de los hidrolizados no solo sobre la inmunidad a nivel periférico, sino a nivel de neuroinflamación, utilizando la línea BV-2 como modelo bien establecido en numerosos estudios [232]. 138 La microglía es el principal elemento celular con función inmune dentro del sistema nervioso central. La neuroinflamación es un sello distintivo de las enfermedades neurodegenerativas y se considera que la neuroinflamación mediada por microglía juega un papel importante en la patogénesis y progresión de estas enfermedades. Al igual que ocurre con los macrófagos de la periferia, la microglía puede alterar sus fenotipos y funciones en respuesta a cambios del microambiente. Dependiendo del predominio de factores secretados, la microglía se caracteriza por polarizarse hacia fenotipo M1 o proinflamatorio, o hacia fenotipo M2 o antiinflamatorio. A su vez, el estado M1 provoca la liberación de citoquinas proinflamatorias y óxido nítrico mientras que el estado M2 provoca la expresión de citoquinas antiinflamatorias, así como arginasa-1 (Arg-1), MRC1 e YM1. Las alteraciones en la polarización de la microglía M1/M2 se han asociado con enfermedades neurodegenerativas, evaluándose como estrategia para el tratamiento de enfermedades relacionadas con inflamación la inhibición de la polarización M1 junto con la estimulación de la polarización de la microglía M2. Sin embargo, la mayoría de los compuestos estudiados muestran capacidad para suprimir la microglía M1, pero muy pocos promueven la polarización hacia el fenotipo M2 [233]. En este trabajo encontramos que los hidrolizados de kiwicha tienen efectos antiinflamatorios significativos al bloquear la expresión génica de TNFα e IL-1β en células microgliales BV-2 tratadas con LPS. Dado el papel de estas citoquinas proinflamatorias sobre el estado de la microglía, estos resultados sugieren que los 139 hidrolizados proteicos de kiwicha podrían proteger contra la activación proinflamatoria de la microglía. Este efecto inmunomodulador y antiinflamatorio es apoyado por el aumento de la expresión de IL-10 en presencia de los hidrolizados. Además, se ha demostrado que la IL-10 tiene la propiedad de inhibir la liberación o los efectos de citocinas proinflamatorias y promover la supervivencia de las neuronas y la homeostasis neuronal [234]. La microglía M2 está involucrada en la reconstrucción de redes neuronales dañadas mediante la eliminación de agregados tóxicos, la regulación positiva de factores neurotróficos y citoquinas antiinflamatorias y la regulación negativa de citoquinas proinflamatorias. Por lo tanto, en situaciones de neuroinflamación, la promoción de la microglía hacia un fenotipo M2 podría proteger al SNC [235]. La presente tesis muestra que los hidrolizados de kiwicha, no solo disminuyen los niveles de expresión génica de los marcadores M1 como son CCR7 e iNOS, sino que además promueven la expresión génica de los marcadores M2 como Arg-1 e YM1 en células BV-2 tratadas con LPS. En conjunto, los resultados del presente trabajo relativos a las células BV-2, sugieren que los hidrolizados de kiwicha podrían mejorar el estado inflamatorio y la relación de población de células de microglía M1/M2 en condiciones de neuroinflamación, protegiendo así de enfermedades desencadenadas por un estado inflamatorio crónico mediante el manteniendo de la homeostasis del SNC. Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en demostrar in vitro que los hidrolizados de kiwicha obtenidos