Efecto neuroprotector de antocianos de uva tinta

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA EFECTO NEUROPROTECTOR DE ANTOCIANOS DE UVA TINTA Pablo Morillo Roca 2 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO. GRADO EN FARMACIA EFECTO NEUROPROTECTOR DE ANTOCIANOS DE UVA TINTA -Pablo Morillo Roca- Presentación: septiembre 2022, Facultad de Farmacia, Sevilla. Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina legal. Tutora: Ruth Hornedo Ortega Proyecto de carácter experimental 3 RESUMEN El Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por una pérdida lenta y progresiva de memoria y otras habilidades cognitivas que resultan en una disminución de la calidad de vida del enfermo. Desde un punto de vista fisiopatológico, la causa principal de esta enfermedad es la deposición anormal y excesiva del péptido betaamiloide (Aβ) que da lugar a la formación de placas amiloideas que desembocan en la muerte neuronal. Las antocianidinas y antocianos son compuestos polifenólicos derivados del metabolismo secundario de las plantas y son responsables de aportar el color rojo, violeta y azul a las mismas. Además, numerosos estudios han demostrado que el consumo a través de la dieta de estos compuestos es capaz de prevenir la aparición de numerosas patologías, entre ellas, la enfermedad de Alzheimer. El objetivo principal de este trabajo fue evaluar las propiedades neuroprotectoras frente a la toxicidad causada por el péptido Aβ25-35 en células neuronales (línea celular PC12) de la antocianidina malvidina (MV) y de tres antocianos: malvidina-3-O-glucósido (MV3G), malvidina-3-O-(6''-p-acetil)-glucósido (MV3A) y malvidina-3-O-(6''-p-cumaroil)- glucósido (MV3C) aislados de hollejos de uva tinta (variedad Cabernet Sauvignon). Ninguno de los cuatro compuestos resultó ser tóxico para el modelo celular. Con respecto al efecto neuroprotector frente a la toxicidad inducida por el péptido Aβ25-35, tres de los cuatro compuestos fueron capaces de prevenir en diferente medida la muerte neuronal (MV>MV3C>MV3). Esta neuroprotección puede explicarse en parte a la capacidad de estos compuestos para disminuir las especies reactivas de oxígeno (EROs) y aumentar la expresión génica de varios vitagenes (sirtuína-1 (SIRT-1), hemeoxigenasa-1 (HO-1) y la proteína de choque térmico 70 (HSP70)), los cuales están relacionados con la supervivencia celular. Palabras clave antocianos / péptido Aβ25-35 / neuroprotección / EROs / Alzheimer 4 ÍNDICE 1 INTRODUCCIÓN 1.1 Los compuestos fenólicos 1.2 Flavonoides: antocianidinas y antocianos 1.3 Antocianos en la uva tinta (Vitis vinifera) 1.4 Enfermedades neurodegenerativas: enfermedad de Alzheimer 2 OBJETIVOS 3 MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Estándares y reactivos 3.2 Extracción, fraccionamiento y purificación de antocianos de uva 3.3 Cultivo y pase celular 3.4 Ensayo MTT 3.5 Medida de la producción intracelular de especies reactivas de oxígeno (EROs) 3.6 PCR a tiempo real (RT-PCR) 3.7 Análisis estadístico 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Evaluación de la citotoxicidad y efecto neuroprotector de la MV, MV3G, MV3A y M3VC frente a la toxicidad inducida por el péptido Aβ25-35 4.2 Evaluación del efecto de la MV, MV3G, MV3A Y M3VC sobre la producción de EROs inducidos por el péptido Aβ25-35 4.3 Efecto de la MV, MV3G, MV3A y MV3C en la expresión génica de vitagenes 5 CONCLUSIONES 6 BIBLIOGRAFÍA 5 1 INTRODUCCIÓN 1.1 Los compuestos fenólicos El término polifenoles se utiliza para definir a un grupo de compuestos sintetizados exclusivamente por plantas, y que, por lo tanto, están presentes en nuestra alimentación gracias al consumo de frutas y verduras y sus derivados. Estos compuestos son metabolitos secundarios que presentan en su estructura uno o varios grupos hidroxilo (- OH) unidos a varios anillos aromáticos, concretamente anillos de benceno (Vermerris y Nicholson, 2006). Estos compuestos tienen la capacidad de aportar protección frente a diversos agentes que pueden causar algún tipo de daño a las plantas, como por ejemplo patógenos, radicales libres o la radiación ultravioleta (Naczk y Shahidi, 2004). Los polifenoles componen un enorme grupo heterogéneo de sustancias, ya que se conocen multitud de compuestos diferentes (Li et al., 2014). Estos compuestos se dividen en dos familias principales: flavonoides y no flavonoides. Estas dos familias se pueden dividir a su vez en otras subfamilias en función del número de fenoles dentro de su estructura, sustituyentes, enlaces entre los grupos fenólicos, etc. (Figura 1) (Truzzi et al., 2021). Así podemos encontrar los ácidos fenólicos, los estilbenos y los lignanos en la subfamilia de los no flavonoides y los antocianos, flavonoles, flavonas, flavononoles y flavan-3-oles en la subfamilia de los flavonoides. Figura 1: Clasificación de los compuestos polifenólicos. 6 1.2 Flavonoides: antocianidinas y antocianos La familia de los compuestos polifenólicos flavonoides comparten químicamente una misma estructura de difenilpropano, compuesta por 15 carbonos dispuestos en configuración C6-C3-C6. Esta estructura consiste en dos anillos aromáticos, A y B, unidos por un anillo heterocíclico, C (Figura 2) (Merken y Beecher, 2000). Figura 2: Estructura general de un flavonoide La gran diversidad estructural de los flavonoides se debe al grado de insaturación de los anillos, el patrón de hidroxilación y/o metilación y al tipo de azúcar como sustituyente en el anillo central, dando lugar a un amplio abanico de compuestos (Lunte, 1987). Dentro de la esta familia encontramos los compuestos antociánicos, los cuales son solubles en agua (Prior et al., 1998) y ampliamente conocidos por ser los compuestos responsables de la pigmentación natural roja, azul y violeta de muchas frutas, tales como la uva o la fresa, y verduras como la berenjena o remolacha, así como de sus productos derivados como el vino tinto (Kong et al., 2003). La estructura de estos compuestos está basada en la estructura básica del 2-fenil-benzopirilo o ión flavilio (Figura 3). Figura 3: Estructura básica de las antocianidinas Dentro de este grupo cabe resaltar la diferencia entre antocianidina y antociano. Desde el punto de vista químico, los antocianos (también llamados antocianinas) son glucósidos de las antocianidinas, es decir, están constituidas por una antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un azúcar por medio de un enlace glucosídico. En la naturaleza podemos encontrar diferentes tipos de antocianidinas (aglicona), pero las más abundantes en lo vegetales son: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, 7 petunidina y malvidina (Del Valle et al., 2005). Estas antocianidinas pueden presentan diferentes patrones de hidroxilación y metilación en las posiciones 3’ y 5’, las cuales corresponden a R1 y R2, respectivamente (Figura 4) (Winkel-Shirley, 2001). Estas antocianidinas suelen presentar un grupo azucarado unido en la posición 3. El azúcar más común suele ser la glucosa, sin embargo, se pueden encontrar también unidos a esta posición otros azúcares como la galactosa, la xilosa, la L-arabinosa y la ramnosa. Asimismo, estas formas monoglucosiladas pueden estar aciladas en la posición C6’’ (R3) de la glucosa por ácidos aromáticos como el ácido caféico o alifáticos como el ácido acético (Figura 4) (Konczak et Zhang, 2004; Andersen et Jordheim, 2006). Figura 4. Estructura básica de un antociano y tipos según las sustituciones en los radicales (R1, R2 y R3). Las antocianinas son compuestos muy inestables y se ven afectados por diversos factores tales como el incremento del pH, el aumento de temperatura y la concentración de oxígeno. El pH es el factor que más afecta a la estabilidad de estos compuestos, así su estructura y color dependen del pH al que se encuentren. A pH muy ácido (pH 0-1) la forma predominante es el catión flavilio (AH+) que presenta un color rojizo y es la forma más estable de un antociano. A medida que el pH va aumentando por el efecto de una base, por ejemplo, se producen dos reacciones paralelas: una desprotonación del ion flavilio para dar lugar a la base quinoidal de color azul (A) (pH=2-4) o bien una hidratación en posición 2 originando el hemiacetal incoloro (B2). A pH más básico la forma hemiacetal puede sufrir una tautomerización para dar lugar a cis-chalcona (Cc), que a su vez puede formar la trans-chalcona (Tc) mediante un proceso de isomerización (Figura 5) (Brouillard et al., 1978). 8 Figura 5: Reacciones de una antocianina en medio ácido. El interés mayoritario de estos compuestos siempre ha residido en su utilización como pigmentos en la industria alimentaria (Delgado-Vargas et al., 2003), no obstante, son poseedores de otras propiedades más orientadas a la salud ya que numerosos estudios han demostrado que el consumo de alimentos ricos en estos compuestos puede prevenir la aparición de patologías como cardiovasculares o neurodegenerativas (Konczak et al., 2004; Isaak et al., 2017). 1.3 Antocianos en la uva tinta (Vitis vinifera) Los compuestos antociánicos se encuentran principalmente en la piel u hollejo de la uva tinta en su estado de maduración. También podemos encontrar esta familia de sustancias en las uvas denominadas “teinturier”, las cuales presentan una pulpa coloreada (Burns et al., 2002). Estos compuestos gracias a su naturaleza hidrosoluble, pasan al vino mediante el proceso de maceración en presencia de hollejos llevado a cabo para la elaboración del vino tinto. El contenido aproximado de antocianos en la piel de la uva oscila entre 11,47 y 29,83 g/kg de materia seca (Pinelo et al.,2006). En el vino tinto estas cantidades pueden llegar a alcanzar los 700 mg/L (Nemzer et al; 2022). En las variedades de uva Vitis vinífera encontramos principalmente 15 antocianos siendo los principales los 3-O- monoglucósidos de la delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y malvidina (Figura 6). De entre ellos la malvidina-3-O-glucósido es generalmente el más abundante con valores que oscilan alrededor de los 5,42 mg/g de materia seca (Acevedo et al., 2012). Además, podemos encontrar las formas aciladas 3-O-(6''-p-cumaroil)-glucósido y 3-O- (6''-acetil)-glucósido de la delfinidina, petunidina, peonidina y malvidina. 9 Figura 6: Cromatograma (HPLC-DAD) de antocianos del extracto de piel de uva (Cabernet sauvignon) (Trabajo de Fin de Master realizado por Maël Durant: Etude des composés phénoliques du raisin & du vin en lien avec l’astringence, 2020-2021). 1.4 Enfermedades neurodegenerativas: enfermedad de Alzheimer Las enfermedades neurodegenerativas representan hoy día un devastador problema de salud pública. La enfermedad de Alzheimer es el trastorno más común ocasionando el 65- 70% de las demencias en personas mayores de 65 años (Gálvez et al., 2001). Esta enfermedad se caracteriza por una pérdida progresiva de la memoria a corto y largo plazo que desemboca en un déficit cognitivo empeorando la calidad de vida de la persona (Scheltens et al., 2016). En 2018 el número total de casos en el mundo fue de aproximadamente 50 millones de personas, y se cree que para el año 2050 estas cifras alcanzarán los 82 millones (Patterson, 2018). La fisiopatología del Alzheimer está caracterizada por una agregación anormal del péptido beta-amiloide (Aβ), el cual se acumula formando agregados que conforman las denominadas placas seniles que se encuentran en el cerebro de pacientes, principal característica de esta enfermedad (Kawahara y Kuroda., 2000) (Figura 7). 16 pero fueron co-tratadas al mismo tiempo con el péptido Aβ25-35 (concentración final 10 µM). Además del control (sólo células y medio), se incubaron 4 pocillos con péptido Aβ25-35 sirviendo este como control positivo (Figura 10). Al igual que para la evaluación de la citotoxicidad, el co-tratamiento tuvo una duración de 24 horas. Pasado este tiempo se repitió el ensayo MTT anteriormente descrito y se midió la absorbancia a 540 nm en el lector de placas (Synergy HT, Biotek). Los resultados fueron presentados como porcentajes con respecto a la absorbancia de las células control (n=3). Figura 10: Diseño de las placas para evaluar la neuroprotección de los compuestos objeto de estudio frente a la toxicidad inducida por el péptido Aβ25-35. Malvidina (MV), malvidina-3-O- glucósido (MV3G), malvidina-3-O-(6''-p-acetil)-glucósido (MV3A) y malvidina-3-O-(6''-p- cumaroil)-glucósido (MV3C). Las concentraciones ensayadas fueron 1,10,25 y 50 μM junto con el péptido Aβ25-35 (10 µM). 3.5 Medida de la producción intracelular de especies reactivas de oxígeno (EROs) Para determinar el efecto antioxidante de la MV y de los tres antocianos objeto de estudio frente al estrés oxidativo inducido por el péptido Aβ25-35 se utilizó la sonda fluorescente DCFH-DA. El DCFH-DA es capaz de atravesar la membrana de las células y emitir fluorescencia cuando hay presencia de EROs en el citoplasma celular (Wardman, 2007). Para la realización de este ensayo se sembraron las células PC12 a una densidad de 30.000 17 células/pocillo en placas de 96 pocillos negras con fondo negro y fueron incubadas a 37ºC y 5% de CO2 durante 24 horas. Una vez pasado este tiempo se realizó un co-tratamiento de los compuestos (concentración final de 50 µM) junto al péptido Aβ25-35 (10 µM) y se incubó la placa durante 24 horas (Figura 11). Finalizado el co-tratamiento, las células fueron lavadas con PBS y se añadió a cada pocillo 100 µl de una solución de DCFH-DA (5 µM en PBS). La placa se introdujo en el incubador durante 30 minutos y la intensidad de fluorescencia fue medida inmediatamente después en un lector de placas (Synergy HT, Biotek) a las longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 520 nm, respectivamente. Los resultados fueron expresados en fluorescencia (unidades arbitrarias) con respecto a las células control (n=3). Figura 11: Diseño de las placas para evaluar la producción de EROs inducida por el péptido Aβ25-35: malvidina (MV), malvidina-3-O-glucósido (MV3G), malvidina-3-O-(6''-p-acetil)- glucósido y malvidina-3-O-(6''-p-cumaroil)-glucósido (MV3C). La concentración ensayada fue 50 μM con y sin el péptido Aβ25-35 (10 µM). 3.6 PCR a tiempo real (RT-PCR) Las células PC12 se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 450.000 células/pocillo durante 24 horas a 37ºC. Al día siguiente se trataron las células de la 18 siguiente manera por duplicado: las muestras control solo con medio, un control positivo con péptido Aβ25-35, los compuestos (malvidina, malvidina-3-O-glucósido, malvidina-3- O-(6''-acetil)-glucósido y malvidina-3-O-(6''-p-cumaroil) a una concentración de 50 µM junto con péptido Aβ25-35 y sin la presencia de este (volumen final de cada pocillo 500 µL) durante 24 horas (Figura 12). Finalizado el tratamiento las células se recogieron con TRIsureTM y el ARN se extrajo de las células siguiendo el protocolo del fabricante. La cantidad de ARN se cuantificó con un espectrofotómetro (NanoDropTM, Thermo Fisher Scientific). Figura 12: Diseño de las placas para la extracción del material genético (ARN) necesario para la RT-PCR. Células solo con medio (Control, C-), células con péptido Aβ25-35, (Aβ,C+), malvidina (MV), Malvidina-3-O-glucósido (MV3G), Malvidina-3-O-(6''-p-acetil)-glucósido (MV3A) y Malvidina-3-O-(6''-p-cumaroil)-glucósido (MV3C) (50 µM) con y sin el péptido Aβ25-35 (10 µM). El ADNc se obtuvo utilizando el Kit de síntesis de ADNc a partir de 180 µg de ARN en un termociclador (TC-5000, Thermo Fisher Scientific) en tres ciclos: 5 minutos a 25ºC, 60 minutos a 42ºC y 5 minutos a 70ºC. Posteriormente a cada muestra se le añadieron 180 µL de agua de calidad para biología molecular. La RT-PCR se realizó utilizando el kit SensiFASTTM SYBR® No-ROX y usando como cebadores: SIRT-1, Hsp70, HO-1. La βactina se utilizó como gen housekeeping (Tabla 2). Los resultados se calcularon a partir de los valores umbrales del número de ciclos (Ct, cycle threshold). Se normalizaron los datos utilizando como referencia los valores Ct de la β-actina. 19 Tabla 2: Cebadores empleados en la RT-PCR ARNm Cebadores β-actina Forward: 5’-TGTGATGGTGGGAATGGGTCA-3’ Reverse: 5’-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3’ SIRT-1 Forward: 5’TCATTCCTGTGAAAGTGATGACGA-3’ Reverse: 5’-GCCAATCATGAGGTGTTGCTG-3’ Hsp70 Forward: 5’- GGGCTCTGAGGAACCGAGC-3’ Reverse: 5’-CAGCCATTGGCGTCTCTC-3’ HO-1 Forward: 5’-ACTTTCAGAAGGGTCAGGTGTCC-3’ Reverse: 5’-TTGAGCAGGAAGGCGGTCTTAG-3’ 3.7 Análisis estadístico Para la exploración de diferencias significativas en los ensayos de neuroprotección, producción de EROs y expresión de los genes SIRT-1, HSP70 y HO-1 se utilizó un análisis estadístico unidireccional (ANOVA) usando el software Statistica versión 14.0.0.15. La significancia se fijó en un valor alfa p < 0,05. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Evaluación de la citotoxicidad y efecto neuroprotector de la MV, MV3G, MV3A y M3VC frente a la toxicidad inducida por el péptido Aβ25-35 El Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa y progresiva carente de un remedio eficaz para su tratamiento (Suttisansanee et al., 2020). El ensamblaje anómalo del péptido Aβ es la causa de la formación de agregados insolubles en cerebros los cuales son los principales causantes de la muerte neuronal en pacientes del Alzheimer (Pike et al., 1993). Conseguir evitar esta agregación evitándose por consiguiente la neurotoxicidad asociada, puede constituir la base para prevenir esta enfermedad (Pike et al.,1993; Lashuel et al., 2002; Volles y Lansbury., 2003; Outeiro et al., 2008). Partiendo de esto, y cómo se ha indicado anteriormente, los antocianos y antocianidinas son compuestos que pueden evitar la neurotoxicidad inducida por estos péptidos gracias a la modulación de diferentes mecanismo y vías de señalización (Espín et al., 2000; Cheplick et al., 2007; Vitaglione et al., 2007; Aquilano et al., 2008; Kovacsova et al., 2010; Shih et al., 2011; Angeloni et al., 2012; Ullah et al.,2014; Thummayot et al.,2014; Ereminas et al., 2017; Kaewmool et al., 2019; Afzal et al., 2019). 20 El primer objetivo de este trabajo fue evaluar la citotoxicidad de la MV, la MV3G, la MV3A y la M3VC en las células PC12 a fin de establecer las concentraciones no citotóxicas. Como se puede observar en la Figura 13, ninguna de las concentraciones ensayadas resultó tóxica para las células manteniéndose la viabilidad celular por encima del 85% para todos los compuestos a todas las concentraciones ensayadas. Figura 13: Citotoxicidad de los compuestos: Malvidina (MV), Malvidina-3-O-glucósido (MV3G), Malvidina-3-O-(6''-p-acetil)-glucósido (MV3A) y Malvidina-3-O-(6''-p-cumaroil)- glucósido (MV3C). Seguidamente se llevó a cabo el ensayo de neuroprotección de los cuatro compuestos a las cuatro concentraciones no citotóxicas frente a la toxicidad inducida por el péptido Aβ25-35 (fragmento responsable de la toxicidad) (Figura 14). Como se puede observar, la incubación de las células con el péptido Aβ25-35 (control positivo) resultó en un descenso significativo de la viabilidad celular. De hecho, el tratamiento con el péptido Aβ25-35 provocó la muerte de aproximadamente el 50% de las células (Figura 14). 21 Figura 14: Neuroprotección de los compuestos frente a la toxicidad inducida por el péptido Aβ25- 35: Malvidina (MV), Malvidina-3-O-glucósido (MV3G), Malvidina-3-O-(6''-p-acetil)-glucósido (MV3A) y Malvidina-3-O-(6''-p-cumaroil)-glucósido (MV3C). Sin embargo, cuando el péptido Aβ25-35 fue co-incubado con los compuestos se observó que tres de los cuatro compuestos son capaces de disminuir significativamente la toxicidad inducida por este péptido. En general se observa que los tres compuestos activos siguen una tendencia dosis-dependiente, es decir a mayor concentración ensayada mayor efecto neuroprotector. La MV (aglicona) es capaz de ejercer un efecto neuroprotector significativo (p<0,05) a partir de 1a concentración de 10 µM observándose un aumento de la viabilidad celular de un 8% a 10 µM, un 20% a 25 µM y un 25% a 50 µM. En el caso de la MV3C se encontraron diferencias significativas a partir de la concentración 25 µM y efectos neuroprotectores similares a la antocianidina MV con un incremento de la viabilidad de un 29% a 50 µM. La MV3A demostró efectos neuroprotectores a partir de 50 µM (Figura 13), siendo el antociano con menor efecto neuroprotector ya que solo aumenta la viabilidad celular en un 12% a la concentración más elevada ensayada (50 µM). Por último, la MV3G no resultó neuroprotectora a ninguna de las concentraciones ensayadas. Otros estudios han analizado el efecto neuroprotector de la MV y de la MV3G frente a la toxicidad inducida por una mezcla del péptido Aβ25-35 (0,5 μM) y Aβ1-40 (5 μM) en células neuronales (Neuro-2A). En este caso, los autores observaron que ninguno de estos 22 compuestos (a 50 µΜ) fue capaz de aumentar la viabilidad celular, resultado que concuerda en parte con nuestros resultados (para el caso de la MV3G) (Shih et al., 2011). Sin embargo, otro ensayo in vitro en el que se evaluó el papel neuroprotector de la MV3G frente a la toxicidad inducida por H2O2 en células gliales de rata (C6) demostró que este antociano a 10 y 20 μM es capaz de proteger a las células de la muerte con un aumento de la viabilidad de un 16% y un 36%, respectivamente (Ereminas et al., 2017). El efecto neuroprotector de la cianidina-3-O-glucósido, uno de los antocianos más estudiados y que difiere de la MV3G en la presencia de un –OH en R1 en lugar de un -OCH3 y un –H en R2 en lugar de un –OCH3, también se analizó en células neuronales SK-N-SH. Las concentraciones 0,2, 2 y 20 μM de este antociano demostraron ser efectivas frente a la toxicidad neuronal inducida por el péptido Aβ25-35, aumentando la supervivencia de las células en un 5%, 14% y 19%, respectivamente (Thummayot et al., 2014). Una de las posibles explicaciones a las diferencias observadas entre este trabajo y los descritos anteriormente para la malvidina y sus derivados glucosilados es que el modelo celular y los agentes inductores de la neurotoxicidad son diferentes a los utilizados en este trabajo. Asimismo, las concentraciones de péptido Aβ25-35 son menores que las utilizadas en nuestro ensayo experimental. 4.2 Evaluación del efecto de la MV, MV3G, MV3A y M3VC sobre la producción de EROs inducidos por el péptido Aβ25-35 Una de las propiedades más evaluadas de los compuestos antociánicos es su capacidad antioxidante (Shih et al., 2011; Ullah et al., 2014; Thummayot et al., 2014; Ereminas et al., 2017; Afzal et al., 2019). El péptido Aβ, tal y cómo se ha mencionado anteriormente, es un potente inductor de la apoptosis celular la cual está relacionada con el estrés oxidativo generado por este péptido y sus agregados (Thummayot et al., 2014; Pinkaew et al., 2015). Por ello, el segundo objetivo de este estudio fue analizar la capacidad de la MV, la MV3G, la MV3A y la MV3C para inhibir la producción intracelular de EROs inducida por el péptido Aβ25-35. En base a los resultados anteriormente obtenidos, se seleccionó la concentración de 50 µM, ya que es la concentración ensayada que presenta una mayor actividad. Según se puede comprobar en la Figura 15, la incubación de las células con el péptido Aβ25-35 se traduce en un aumento significativo de la fluorescencia (de 800 a más de 1600 U.A) en comparación con el control, indicando que este péptido genera un importante estrés oxidativo a nivel intracelular. Se observa sin embargo un descenso significativo (p<0,05) de EROs cuando las células son co-incubadas con el 23 péptido y los cuatro compuestos objetos de estudio. La MV3C y la MV3A son los compuestos que presentaron un efecto antioxidante mayor reduciendo la producción de EROs en un 48% y un 44%, respectivamente. La MV y la MV3G también produjeron una disminución en la producción de EROs, aunque en menor medida que los dos compuestos anteriores. Figura 15: Efecto en la producción intracelular de EROs inducida por el péptido Aβ25-35 (fluorescencia) de Malvidina (MV), Malvidina-3-O-glucósido (MV3G), Malvidina-3-O-(6''-p- acetil)-glucósido (MV3A) y Malvidina-3-O-(6''-p-cumaroil)-glucósido (MV3C) Otros autores han estudiado la capacidad antioxidante de la MV y la MV3G frente al estrés oxidativo inducido por una mezcla del péptido Aβ25-35 (0,5 μM) y Aβ1-40 (5 μM) en otro modelo de células neuronales (Neuro-2A). La co-incubación de las células con la mezcla de ambos péptidos durante 24 horas y su posterior tratamiento con los compuestos por separado a una concentración de 50 µM durante 12 horas resultó en una disminución en la producción de EROs de un 82% y de un 67% para la MV y la MV3G, respectivamente (Shih et al., 2011). Otro estudio realizado por Ereminas y sus colaboradores mediante ensayos in vitro evaluó la capacidad antioxidante de la MV3G frente al estrés oxidativo inducido por H2O2 en células gliales de rata (C6). Este estudio demostró que este antociano a 5, 10 y 20 μM es capaz de producir un leve descenso en la producción de EROs, concretamente entre un 5% y un 10%, en comparación al control tratado solamente con H2O2 (50 µM) (Ereminas et al., 2017). 24 Como ya se mencionó anteriormente, existen estudios con otros compuestos antociánicos, siendo la cianidina-3-O-glucósido el antociano más estudiado. La investigación llevada a cabo por Yang et al. demostró que este compuetso a una concentración de 10 µg/ml (20,6 µM) reduce en más de un 50% los niveles de EROs producidos por el péptido Aβ25-35 a 20 µM (Yang et al., 2018). En otro estudio, pero utilizando células neuronales SK-N-SH se demostró que la cianidina-3-O-glucósido fue capaz de reducir la producción de EROs inducida por el Aβ25-35 (10 µM) en un 46%, 67% y 85% para 0,2, 2 y 20 µM, respectivamente (Thummayot et al.,2014). 4.3 Efecto de la MV, MV3G, MV3A y MV3C en la expresión génica de vitagenes Nuestra supervivencia y la calidad de vida física y mental depende del buen funcionamiento de diversos procesos de mantenimiento y reparación celular. El sistema vitagenes se define como un grupo de genes implicados en el mantenimiento de la homeostasis celular en situaciones de estrés. Entre ellos podemos destacar las proteínas de choque térmico (HSP), la hemeoxigenasa-1 (HO-1), y las proteínas sirtuinas (SIRT) (Cornelius et al., 2013). Con objeto de evaluar el mecanismo de acción implicado en el efecto neuroprotector observado anteriormente por parte de la MV, MV3G, MV3A y MV3C se determinó la expresión génica de la SIRT-1, HO-1 y HSP70 tras tratar las células PC12 con los cuatro compuestos a 50 µM en presencia y ausencia del péptido Aβ25-35 (Figura 15). Así se ha obtenido una diferencia significativa (p<0,05) en la expresión de la SIRT-1 únicamente con el compuesto MV3G al ser co-incubado con el péptido Aβ25-35, con un aumento del 20% con respecto a la expresión solo con el péptido. Aunque no existan diferencias significativas existe también una tendencia al aumento de la expresión de la SIRT-1 con la MV3G y la MV3C sin péptido Aβ25-35 (Figura 16). Existen estudios que demuestran que la SIRT-1 está relacionada con procesos fisiológicos como la proliferación celular, diferenciación, apoptosis o metabolismo (Zheng et al., 2021). En concreto este gen regula el procesado de la proteína precursora del péptido Aβ, la neuroinflamación y la disfunción mitocondrial (Rizzi y Roriz-Cruz, 2018). Así, el aumento de la expresión de la SIRT-1 supone un beneficio demostrado contra el envejecimiento neuronal (Kim et al., 2007). 25 Figura 16: Expresión de los genes SIRT-1, HSP70 y HO-1 en las células control y tratadas con Aβ con o sin los compuestos en estudio: Malvidina (MV), Malvidina-3-O-glucósido (MV3G), Malvidina-3-O-(6''-p-acetil)-glucósido (MV3A) y Malvidina-3-O-(6''-p-cumaroil)-glucósido (MV3C). En cuanto al gen HSP70, se obtuvieron resultados significativos cuando se trataron las células con MV3G y MV en presencia de péptido Aβ25-35 con incrementos en la expresión de este gen de un 20 y 11% respectivamente con respecto a la expresión del gen solo con el péptido (Figura 15). Cabe citar que la HSP70 también tiene un papel importante en la defensa de la célula frente al estrés oxidativo (Madrigal et al., 2009). Asimismo, esta proteína tiene la capacidad de prevenir la agregación del péptido Aβ y de la proteína tau (Repalli y Meruelo, 2015). Varios estudios han demostrado que su sobreexpresión inhibe la agregación del péptido Aβ, protegiendo las neuronas y evitando a toxicidad inducida por el péptido Aβ (Rivera et al., 2018). Con respecto a la expresión del gen HO-1 se obtuvieron resultados significativos para tres de los cuatro compuestos evaluados. Así la MV3G en co-tratamiento con el Aβ25-35 fue el compuesto que produjo un mayor aumento de la expresión, llegando hasta el 122% (un 24% más que con el péptido solo). De igual forma se obtuvo un aumento significativo de 32 Naczk M, Shahidi F. Extraction and analysis of phenolics in food. J Chromatogr A. 2004; 1054(1-2): 95-111. Navarro-Hortal MD, Romero-Márquez JM, Esteban-Muñoz A, Sánchez-González C, Rivas-García L, Llopis J, Cianciosi D et al. Strawberry (Fragaria × ananassa cv. 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