Plasticidad fisiológica de las células madre del cuerpo carotídeo adulto: caracterización del linaje mesectodérmico

1 Universidad de Sevilla Departamento de Fisiología Médica y Biofísica Plasticidad fisiológica de las células madre del cuerpo carotídeo adulto: caracterización del linaje mesectodérmico Tesis Doctoral Elena Navarro Guerrero Director de Tesis: Dr. Ricardo Pardal Redondo Sevilla, 2015 2 Departamento de Fisiología Médica y Biofísica Facultad de Medicina Universidad de Sevilla Plasticidad fisiológica de las células madre del cuerpo carotídeo adulto: caracterización del linaje mesectodérmico Elena Navarro Guerrero Licenciada en Biotecnología Director de Tesis: Dr. Ricardo Pardal Redondo Instituto de Biomedicina de Sevilla CSIC-US-HUVR 3 4 Ricardo Pardal Redondo, Profesor del Departamento de Fisiología Médica y Biofísica de la Universidad de Sevilla, adscrito al Instituto de Biomedicina de Sevilla de Sevilla, Certifico que: Elena Navarro Guerrero, Licenciada en Biotecnología por la Universidad Pablo de Olavide, ha realizado su Tesis Doctoral titulada “Plasticidad fisiológica de las células madre del cuerpo carotídeo adulto: caracterización del linaje mesectodérmico” bajo mi dirección, en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (CSIC-US-HUVR). Considero que la presente Tesis Doctoral reúne las condiciones de originalidad y rigor necesarios y se encuentra en condiciones de ser presentada y defendida públicamente para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Y para que conste a todos los efectos, firmo el presente certificado, En Sevilla, a 27 de abril de 2015. Dr. Ricardo Pardal Redondo Director de Tesis Profesor del Departamento de Fisiología Médica y Biofísica, Universidad de Sevilla INSTITUTO DE BIOMEDICINA DE SEVILLA (IBIS) 5 Agradecimientos 6 Agradecimientos En primer lugar quiero agradecer al Dr. Ricardo Pardal Redondo, por confiar en mí y por darme la oportunidad de formar parte de su grupo de investigación. Me gustaría agradecer también haber tenido una beca de formación de personal investigador (FPI), otorgada por el Ministerio de Ciencia e Innovación en 2010. Agradezco al Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), por haberme permitido realizar este trabajo de tesis doctoral a través de sus instalaciones y sus técnicos especializados. Quiero agradecer a mi grupo por su apoyo y por todo lo que me han enseñado durante estos años, y por supuesto a mi familia. Muchas gracias. 7 Resumen 8 Resumen El cuerpo carotídeo (CB), un órgano quimiosensor derivado de la cresta neural, permite la adaptación a la hipoxia crónica mediante neurogénesis y angiogénesis. Recientemente se ha descrito en nuestro grupo que ambos procesos son resultado de la actividad de una población de células madre neurales que residen en este nicho germinal. Éstas dan lugar a neuroesferas (NS) in vitro. Mediante análisis génico por microarrays de NS de CB enriquecidas en células indiferenciadas versus diferenciadas hemos hallado a la proteína CD10 como un marcador de progenitores de CB. CD10 es una metaloendopeptidasa que inactiva péptidos señalizadores a través de su dominio catalítico exterior, y paralelamente, interviene en proliferación, diferenciación endotelial y migración gracias a su dominio citoplasmático. La expresión de CD10 en CB co-localiza parcialmente con Nestina y/o GFAP, y los análisis del trazado del linaje celular han confirmado que las células CD10+ provienen del linaje de la célula madre del CB (CBSC) GFAP+. El aislamiento de células CD10+ mediante citometría de flujo incrementa la eficiencia de formación de NS. De manera relevante, los progenitores CD10+ se diferencian hacia células de músculo liso (SMA+) y células endoteliales (GSA I+), pero no se diferencian hacia células neuronales (TH+), indicando que los progenitores CD10+ están restringidos hacia el linaje mesectodérmico del CB. Dado que CD10 es un regulador angiogénico en otros tejidos, y la importante angiogénesis que tiene lugar en el CB en hipoxia mantenida, realizamos experimentos funcionales de esta proteína. Estos han revelado que la expresión de CD10 está regulada por la hipoxia en CB, y que CD10 controla la diferenciación endotelial de los progenitores CD10+, al menos a través de su actividad catalítica. Uno de los principales sustratos de CD10 es la endotelina-1 (ET-1), que es liberada en el CB en hipoxia. Es una citoquina pro-proliferativa y pro-angiogénica que incrementa el número de células CD10+ y los niveles de expresión de CD10 in vitro, además mediante análisis génico de mciroarrays hemos visto que ET-1 induce la diferenciación mesectodérmica de las CBSCs. En definitiva, los progenitores CD10+, restringidos al linaje mesectodérmico, tras el estímulo hipóxico, ven reducidos los niveles de expresión de CD10, produciéndose la activación de dichos progenitores y su consecuente diferenciación hacia células vasculares, que contribuyen a la angiogénesis que tiene lugar en el órgano en hipoxia crónica. 9 Resumen en inglés (Abstract) We have described a novel neurogenic niche in the adult carotid body (CB), an oxygen-sensing organ derived from the neural crest that is able to adapt to chronic hypoxemia by increasing the number of chemosensory neuronal cells and vascular cells. These neurogenesis and angiogenesis depend on the activity of a resident population of neural progenitors, which are also able to form neurospheres (NS) in vitro. Gene expression analysis comparing NS cultures enriched in undifferentiated versus differentiated cells displayed CD10 as a candidate marker for CB progenitor cells. CD10 is a metalloendopeptidase that inactivates signalling peptides, modifying the extracellular environment. In parallel, CD10 protein has an intracellular domain that mediates proliferation, endothelial differentiation and migration processes, by direct protein-protein associations. In the CB, CD10 expression partially co-localizes with Nestin and/or GFAP, and a cell-fate mapping analysis has confirmed that CD10+ cells lie within the CB progenitor lineage. Sorting for CD10+ cells increases NS-forming efficiency. Interestingly, CD10+ progenitors can differentiate into smooth muscle (SMA+) or endothelial (GSA I+) cells, but are not able to convert into neuronal (TH+) cells, indicating a mesectodermal commitment in these cells. Since a profound angiogenesis occurs in the CB in response to hypoxia and it is described that CD10 is a key regulator of angiogenesis, we have tested whether CD10 is having a role in regulating this process. Our functional study revealed that CD10 protein controls endothelial differentiation of the CD10+ progenitor subpopulation, likely through the catalytic activity of CD10. One of the typical molecules cleaved by CD10 is the pro-angiogenic peptide endothelin-1 (ET-1). ET-1 significantly increases CD10 expression and the amount of CD10+ cells in vitro, and gene expression analysis shows that ET-1 induces an increase in mesectodermal differentiation of CBSCs. Taking together, our results suggest that GFAP+ stem cells give rise to mesectoderm-committed CD10+ progenitors, and that CD10 could have a functional role cleaving peptides such as ET-1, regulating the angiogenesis that accompany the neurogenesis suffered in hypoxemia. A deeper knowledge of the molecular mechanisms governing CB progenitor cell fate decisions will improve our understanding of the physiology of this important chemoreceptor organ. 16 Clave de Abreviaturas 7-AAD 7-Amino-actinomycin D Amp Ampicilina ATP Adenosine triphosphate BSA Bovine serum albumin CB Carotid body (Cuerpo carotídeo) CBA Carotid body adherent (línea de CB cultivada en adherente) CBSCs Carotid body stem cells (Células madre de cuerpo carotídeo) CNS Central nervous system (Sistema nervioso central) DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole dNTPs Desoxirribonucleótidos trifosfato EGF Epidermal growth factor (Factor de crecimiento epidérmico) eGFP enhanced Green Fluorescent Protein (Proteína verde fluorescente) DIV Days in vitro ET-1 Endotelina-1 FBS Fetal bovine serum (Suero fetal bovino) FCH Fold change FGF2 Fibroblast growth factor 2 (Factor de crecimiento fibroblástico 2 o básico) FITC Fluorescein isothiocyanate HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid IGF-1 Insulin-like growth factor 1 (Factor de crecimiento insulínico) IRES Internal ribosome entry site Km Kanamicina L15 Leibovitz -15 Medium MUT Mutado OCT Optimal Cutting Temperature pb Pares de bases PBS Phosphate buffered saline (Tampón fosfato salino) PBTX phosphate buffer + Triton-X PE Phycoerythrin (Ficoeritrina) PFA Paraformaldehído PNS Peripheral nervous system (Sistema nervioso periférico) P/S Penicilina/estreptomicina RT Room temperature, (temperatura ambiente) SGZ Subgranular zone 17 SVZ Subventricular zone TH Tirosina hidroxilasa VEGF Vascular endothelial growth factor WT Wild type 18 Introducción 19 Introducción 1. El cuerpo carotídeo 1.1. Fisiología del cuerpo carotídeo El cuerpo carotídeo (CB, del inglés “Carotid Body”) es un órgano quimiorreceptor situado en la bifurcación de la arteria carótida (Figura 1A), encargado de detectar cambios en distintas variables químicas de la sangre, como la presión parcial de CO2, el pH, la glucemia y principalmente la presión parcial de oxígeno (PO2). El CB presenta fibras nerviosas aferentes que forman parte del nervio glosofaríngeo, y una gran red de vasos sanguíneos (Kameda, 2005; López-Barneo et al., 2001). Este quimiorreceptor es un componente clave del sistema de homeostasis del O2 en sangre, y concretamente es necesario para activar la respuesta pulmonar de hiperventilación ante situaciones de hipoxemia, por ejemplo en personas que viven a una altitud elevada o en pacientes que sufren enfermedades crónicas con obstrucción pulmonar (Weir et al., 2005). El CB está presente principalmente en mamíferos y aves, donde es crucial para la supervivencia pues facilita un rápido ajuste de las respuestas respiratoria y cardiovascular en situaciones de hipoxemia, lo que asegura el aporte de O2 al cerebro y al corazón (López-Barneo et al., 2001). Otros vertebrados poseen estructuras similares al CB, como pueden ser el arco branquial y los quimiorreceptores de O2 en peces, o el laberinto carotídeo en anfibios (Hempleman y Warburton, 2013). El CB está inervado por fibras sensoriales aferentes del sistema nervioso autónomo, principalmente por el nervio del seno carotídeo. Además de la inervación sensorial, el CB recibe inervación eferente parasimpática y simpática, esta última a partir de pequeños nervios ganglioglomerulares procedentes del vecino ganglio cervical superior (Fidone y González, 1986). Además, el CB recibe sangre de una rama de la arteria carótida externa que se divide hasta pequeños capilares que quedan distribuidos por todo el parénquima neural del órgano, convirtiéndolo en uno de los tejidos más irrigados del organismo (Fidone y González, 1986). Tanto la vasculatura como el 20 parénquima neural del CB juegan un papel importante en la aclimatación del órgano a la hipoxemia, como se verá a continuación. El parénquima neural del CB se organiza en glomérulos compuestos por células glómicas o tipo I, envueltas por células de sostén, llamadas sustentaculares o tipo II (Figura 1A). Las células glómicas son células más o menos esféricas de 10-12 µm de diámetro, que se caracterizan por tener numerosas vesículas secretoras cargadas de neurotransmisores (ATP, dopamina, acetilcolina), además de diversos péptidos neuromoduladores (sustancia P, encefalinas, endotelina-1) (Platero-Luengo et al., 2014a; Smith et al., 1990). Al ser altamente dopaminérgicas las células glómicas tienen una alta expresión del marcador tirosina hidroxilasa (TH), enzima limitante en la síntesis de catecolaminas. Las células tipo I tienen función quimiorreceptora y comunican los cambios en las variables químicas sanguíneas liberando neurotransmisores junto a las terminaciones nerviosas aferentes que inervan el CB. Estos axones llevan la información hasta los centros cardiorrespiratorios del tronco del encéfalo, donde se ponen en marcha las respuestas compensatorias. Las células glómicas definen el parénquima neurosecretor del CB y comparten muchas propiedades con las neuronas, por lo que se les considera células neuronales especializadas (López- Barneo, 2003). Las células sustentaculares son de menor tamaño y de forma más alargada que las células glómicas, y poseen extensos procesos citoplasmáticos que envuelven a las células neuronales (Figura 1A). Las células tipo II se caracterizan por la expresión de marcadores de tipo glial como las proteínas GFAP (glial fibrillary acidic protein) y S100. Además de estos dos tipos celulares, en el CB se pueden encontrar células endoteliales, fibroblastos, macrófagos y un pequeño número de neuronas parasimpáticas localizadas interglomerularmente, cuyos axones inervan a capilares y arteriolas (Fidone y González, 1986). Al poseer características propias de células gliales, clásicamente se pensó que las células tipo II tenían una función meramente de soporte de las tipo I. Sin embargo, datos experimentales obtenidos en nuestro grupo muestran que las células tipo II son células madre neurales en estado quiescente, y en respuesta a hipoxia pueden proliferar y diferenciarse hacia nuevas células glómicas (Figura 1B), facilitando la adaptación fisiológica del órgano a la hipoxia crónica, tal y como se expondrá más adelante (Pardal et al., 2007) (Figura 1C). Las células tipo II presentan un fenotipo glial y comparten características con las células madre de los nichos neurogénicos del 21 sistema nervioso central (CNS, del inglés central nervous system). Podemos por tanto considerar al CB adulto como un nicho neurogénico funcionalmente activo, localizado en el sistema nervioso periférico (PNS, del inglés peripheral nervous system). La principal característica funcional del CB es su sensibilidad a los cambios en la tensión de O2 del medio. La disminución de la tensión de O2 sanguíneo (hipoxemia) es detectada por las células tipo I, que son excitables y contienen un amplio espectro de canales voltaje y ligando dependientes (Duchen et al., 1988; López-Barneo et al., 1988). Las células glómicas constituyen el elemento quimiorreceptor del CB que detecta la hipoxemia. La disminución en la PO2 provoca el cierre de canales de K+ en estas células, con la consecuente reducción de la conductancia a este ión, desencadenándose así la despolarización celular (Buckler y Vaughan-Jones, 1998; López-Barneo et al., 1988; Peers y Green, 1991; Stea y Nurse, 1991). Como resultado de esta despolarización, se abren canales de Ca2+ voltaje-dependientes, facilitándose la entrada de calcio y activándose la secreción de neurotransmisores por exocitosis (Ureña et al., Figura 1. Organización y tipos celulares del cuerpo carotídeo. A, Localización del CB en rata adulta y estructura celular de un glomérulo. Modificado de Kokovay et al. 2007 y de Pardal et al. 2007. B, Diagrama representativo de los tipos celulares y los procesos que tienen lugar en el CB en respuesta a hipoxia. Adaptado de Pardal et al. 2010. C, Inmunohistoquímica contra TH (rojo) en CB de ratón normóxico (control, izquierda) y expuesto a hipoxia crónica (10% O2) durante 21 días (derecha). Modificado de Pardal et al. 2007. D, Imagen en campo claro de neuroesferas de CB. E, Inmunohistoquímica de secciones de una neuroesfera, marcada con Nestina (verde) y TH (rojo). Escalas, 50 µm en (C), 100 µm en (D y E). 22 1994). La liberación de neurotransmisores al espacio sináptico activa a las fibras sensoriales aferentes que conducirán la información a los centros respiratorios del bulbo raquídeo para que estos disparen la respuesta hiperventilatoria pulmonar y de esta forma se restauren los niveles de O2 en el organismo (Montoro et al., 1996; Peers y Buckler, 1995; Ureña et al., 1994). Las células glómicas también se despolarizan en respuesta a una reducción de la glucosa extracelular (Fitzgerald et al., 2009; García-Fernández et al., 2007; Pardal y López-Barneo, 2002; Zhang et al., 2007). Aunque el papel del CB como regulador de la glucemia en sangre ha estado clásicamente sujeto a debate (Bin-Jaliah et al., 2004; Gallego-Martin et al., 2004), estudios recientes con tejido humano han confirmado la capacidad de las células glómicas para detectar los niveles de glucosa (Ortega-Sáenz et al., 2013; Wehrwein et al., 2015). Además de la respuesta del CB a la hipoxia aguda, cuando la condición de hipoxemia es mantenida en el tiempo, se desencadenan dentro del órgano numerosos cambios moleculares, neuroquímicos y anatómicos (Bisgard, 2000; Wang y Bisgard, 2005), siendo el más significativo un aumento considerable del tamaño del parénquima neurosecretor, del número de células neuronales (Figura 1C). Este cambio morfológico, que incrementa los impulsos excitatorios que recibe el centro respiratorio, constituye una respuesta homeostática fundamental que permite la aclimatación de los humanos y otros mamíferos a la altitud, y ayuda a la supervivencia de los pacientes con enfermedades cardiorrespiratorias asociadas a hipoxemia (Edwards et al., 1970; López- Barneo et al., 2001; Weir et al., 2005). La hipertrofia del CB en condiciones de hipoxia incluye igualmente un aumento de la vascularización (Arias-Stella y Valcarcel, 1976; McGregor et al., 1984). Estos dos procesos de neurogénesis y angiogénesis son en parte el resultado de la actividad de las células madre del cuerpo carotídeo (CBSCs, del inglés carotid body stem cells), cuyo estudio es el objetivo principal de nuestro grupo. 2. Células madre; aspectos generales Durante la Segunda Guerra Mundial, los estudios sobre el daño producido por emisiones nucleares condujeron al descubrimiento de unas células capaces de regenerar 23 tejidos dañados por la radiación (Becker et al., 1963; Till y McCulloch, 1961). Al principio se las denominó unidades formadoras de colonias, debido a su capacidad de auto-renovación y formación de colonias in vitro (Till y McCulloch, 1961). La médula ósea fue la primera fuente descrita de las finalmente denominadas células madre (Scadden, 2014), y las células madre hematopoyéticas (HSCs, del inglés hematopoietic stem cells) que residen en ella son indudablemente las mejor caracterizadas hoy en día (Blau et al., 2001). Tras el desarrollo de co-cultivos con células estromales para mantener a las HSCs in vitro, se demostró que estas células dependían de otras células para sobrevivir (Dexter et al., 1977), lo que constituyó la primera evidencia de la existencia de un nicho celular para las células madre. Posteriormente se descubrieron células pluripotentes en la masa celular interna del blastocisto embrionario, a las que se denominó células madre embrionarias (ESCs, del inglés embryonic stem cells) (Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981), y que proliferan in vitro de manera indiferenciada e ilimitadamente (Bongso et al., 1994; Ramalho-Santos et al., 2002). Las ESCs dan lugar a las tres capas germinales y podrían utilizarse en el tratamiento de un sinfín de afecciones como la enfermedad de Parkinson, las lesiones en la médula espinal o la diabetes (Thomson et al., 1998). Sin embargo, el uso de embriones humanos presenta diversos conflictos éticos. Por ello, las células madre específicas de tejido, grupo al que pertenecen las HSCs, son consideradas como potencialmente muy útiles para la regeneración de tejido dañado. Aunque estas células madre somáticas no tienen la pluripotencialidad de las ESCs, poseen cierta plasticidad de diferenciación, determinada por el linaje celular del que derivan. Además, su utilización no conlleva problemas de carácter ético. En base a su origen y a su potencial de diferenciación hoy en día las células madre se clasifican en dos grandes grupos: pluripotentes y multipotentes. Las células madre pluripotentes son las ESCs y las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs, del inglés induced pluripotent stem cells) (Takahashi y Yamanaka, 2006). Las células madre somáticas o específicas de tejido son las denominadas multipotentes, y existen multitud de variedades, encontrándose prácticamente en todos los tejidos, por ejemplo, las células madre neurales (NSCs, del inglés neural stem cells) (Yoo et al., 2013), que residen en el sistema nervioso. Se han trazado muchos paralelismos entre las NSCs y las HSCs (Morrison et al., 1995) en cuanto a su biología y comportamiento, pero siguen existiendo problemas metodológicos para llevar a cabo estos estudios comparativos, 24 principalmente debido a que las HSCs pueden aislarse mediante citometría de flujo o FACS, mientras que apenas contamos con buenos marcadores para aislar por citometría las NSCs. De hecho, este problema de aislamiento prospectico de las distintas poblaciones de células madre somáticas es el que ha provocado que el progreso en el conocimiento de las propiedades de las células madre específicas de tejido haya tenido lugar preferentemente en el sistema hematopoyético (Morrison et al., 1999). Por definición, una célula madre es aquella célula indiferenciada con capacidad de proliferación, auto-renovación y producción de un número diverso de tipos de células diferenciadas, es decir, aquella célula responsable de la regeneración y mantenimiento del tejido en el que reside. Aunque algunos autores defendieron que las células madre somáticas podían sufrir “transdiferenciación”, y contribuir así a la regeneración de tejidos diferentes a su tejido de origen (Blau et al., 2001), hoy en día esa teoría está muy cuestionada (Álvarez-Dolado et al., 2003). En general se acepta que las células madre somáticas son multipotentes, poseen plasticidad de diferenciación, pero siempre generan tipos celulares propios del tejido en el que residen. Esta plasticidad que poseen las células madre somáticas presenta un interés especial por su potencial uso en terapia celular frente a numerosas enfermedades metabólicas, inmunológicas y degenerativas (Stewart, 2004), como es el caso del uso de las NSCs frente a la enfermedad de Parkinson o de Huntington (Yoo et al., 2013). 3. Células madre neurales somáticas; concepto y metodología de estudio La visión clásica del sistema nervioso cambió en la década de los 60 debido a la caracterización de la neurogénesis, o producción de nuevas neuronas, en el sistema nervioso adulto. Hasta ese momento, el dogma existente consideraba el CNS como una estructura inmutable y terminalmente diferenciada. Santiago Ramón y Cajal (1913) concluyó en sus estudios que las neuronas se generaban exclusivamente durante el desarrollo prenatal, y aunque muchos datos sugerían la existencia de células en división en el CNS (Allen, 1912; Hamilton, 1901), fue imposible, con las herramientas de la época, realizar el seguimiento de dichas células y demostrar que se trataba de nuevas 25 neuronas en lugar de glía (Ramón y Cajal, 1913). La creencia de que no se producían nuevas neuronas tras el nacimiento perduró prácticamente un siglo (Gross, 2000). En la segunda mitad del siglo XX se publicaron una serie de artículos mostrando evidencias de la aparición de nuevas neuronas en varias regiones del cerebro de la rata adulta, incluyendo el giro dentado del hipocampo (Altman y Das, 1965), el neocórtex (Altman, 1966), y el bulbo olfatorio (AltmanJ, 1969). Sin embargo, a estos estudios se les dio poca importancia. No fue hasta mediados de los años 70 cuando se reconsideró la existencia de neurogénesis adulta (Kaplan y Hinds, 1977), ya que por primera vez se demostró que las neuronas nuevas del hipocampo sobrevivían durante largo tiempo. Los siguientes descubrimientos continuaron revelando la presencia en el cerebro adulto de neuronas jóvenes resultado de la diferenciación a partir de progenitores proliferativos, mayoritariamente en el hipocampo (Cameron et al., 1993). Al mismo tiempo se aislaron células progenitoras del CNS adulto, capaces de diferenciarse hacia neuronas y glía en cultivo (Reynolds y Weiss, 1992). Estas células se denominaron “células madre neurales” (NSCs), y se demostró que eran las responsables de la generación de nuevas neuronas en el sistema nervioso adulto, es decir, de la neurogénesis (Kuhn et al., 1996; Palmer et al., 1997). Las NSCs muestran características definitorias de célula madre: auto-renovación o capacidad de proliferar manteniendo la naturaleza de célula madre, y multipotencia o capacidad de diferenciación hacia distintos tipos celulares. En los años 90 los estudios sobre neurogénesis adulta se impulsaron debido al avance de nuevas tecnologías, y numerosos trabajos han demostrado desde entonces que en ciertas partes del cerebro adulto de mamíferos, incluido el humano, se generan nuevas neuronas a partir de unas células madre específicas de tejido neural. Las NSCs del sistema nervioso central pueden generar los tres tipos celulares principales del cerebro: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (AltmanJ, 1969; Álvarez-Buylla y Garcia-Verdugo, 2002; DoetschF. et al., 1999a; Lois et al., 1993; Palmer et al., 1997; Reynolds y Weiss, 1992; Weiss et al., 1996). La neurogénesis adulta en mamíferos se ha demostrado inequívocamente en dos zonas del cerebro: la zona subventricular (SVZ, del inglés subventricular zone), junto a los ventrículos laterales (DoetschF. et al., 1999a) (Figura 2), y la zona subgranular (SGZ, del inglés subgranular zone) en el giro dentado del hipocampo (Eriksson et al., 1998) (Figura 3). También se han propuesto otras zonas como posibles centros neurogénicos que están menos consensuadas y caracterizadas, como el bulbo olfatorio de roedores (Gritti et al., 32 3.3. El cuerpo carotídeo, nicho germinal del sistema nervioso periférico adulto Actualmente no se conoce con detalle la función que desempeñan las NCSCs en el PNS adulto (Dupin y Le Douarin, 2014). El único caso en el que se ha descrito un papel claro de estas células en la fisiología del órgano en el que residen lo constituye el CB (Pardal et al., 2007). El estudio de este nicho neurogénico adulto es uno de los objetivos principales de la investigación que se lleva a cabo en el laboratorio del Dr. Pardal, en el cual se ha realizado la presente tesis doctoral. En hipoxia las células madre del cuerpo carotídeo (CBSCs, del inglés carotid body stem cells) proliferan y llevan a cabo neurogénesis para dar lugar a nuevas células glómicas, lo que contribuye a la adaptación del órgano a un estímulo hipóxico mantenido (Pardal et al., 2007). En condiciones de normoxia, la población de células madre del CB permanece quiescente, pero en hipoxia las CBSCs GFAP+ se transforman en progenitores proliferativos Nestina+, los cuales eventualmente darán lugar a nuevas células glómicas TH+ (López-Barneo et al., 2008). La hipertrofia e hiperplasia de las células glómicas (McGregor et al., 1984), junto con la generación de nuevas células tipo I, tiene como resultado el incremento en el parénquima neurosecretor dopaminérgico. Aunque algunas células TH+ tienen la capacidad de sufrir mitosis (Chen et al., 2007a; Pardal et al., 2007; Wang et al., 2008), los resultados previos de nuestro grupo han confirmado que gran parte de las nuevas células glómicas aparecidas en hipoxia se originan a partir de los progenitores del CB (Pardal et al., 2007). La hipertrofia del CB en condiciones de hipoxia crónica incluye igualmente un aumento de la vascularización (Arias-Stella y Valcarcel, 1976; McGregor et al., 1984), debido a vasodilatación y a la aparición de nuevos vasos, probablemente provocado por la sobre-expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, del inglés vascular endothelial growth factor) (Chen et al., 2003). El CB está irrigado por una profusa red de vasos sanguíneos y capilares que se entrelaza entre los glomérulos de células neurales. Esta vasculatura sufre angiogénesis durante la exposición a hipoxia crónica, siguiendo una dinámica de crecimiento paralela al aumento de parénquima neural experimentado por el órgano. La red de vasos sanguíneos parece por tanto estar fuertemente coordinada con las células neurales, pues además, al decrecer el tejido neural cuando se restablecen los valores normóxicos de oxígeno, ocurre igualmente una reducción paralela del número de vasos sanguíneos (Platero-Luengo, 2014b). El CB es 33 uno de los órganos más irrigados del organismo y muestra una situación estructural a nivel celular óptima para el establecimiento de un nicho vascular para las NCSCs. Además, tras la activación del órgano en hipoxia crónica, el intenso proceso angiogénico que se pone en marcha podría potenciar aún más las interacciones entre células vasculares y neurales. De forma muy relevante para esta tesis doctoral, resultados recientes de nuestro grupo han demostrado que parte de esta angiogénesis es fruto de la actividad de las propias células madre neurales del órgano, las células tipo II (Annese et al., en revisión). Estas NCSCs adultas mantienen por tanto la típica plasticidad de la cresta neural, siendo capaces de diferenciarse hacia células neuronales y endoteliales en respuesta al estímulo hipóxico, contribuyendo de esta forma tanto a la neurogénesis como a la angiogénesis. El sistema neurovascular de este nicho juega por tanto un papel clave en la fisiología del órgano. Las células endoteliales también son sensibles a la hipoxia, y responden mediante liberación de factores solubles, como endotelina-1 (ET-1) o VEGF, provocando la diferenciación de las células madre y un incremento aún mayor de la angiogénesis (Goldman y Chen, 2011; Palmer et al., 2000). El CB ofrece una oportunidad excelente para estudiar la importancia de moléculas liberadas por el nicho vascular en la regulación del comportamiento de las NCSCs. Un gran número de estos factores vasculares controlan la proliferación de progenitores neurales en otras regiones del sistema nervioso (Ramírez-Castillejo et al., 2006; Shen et al., 2008). El CB transduce la disminución de la PO2 al CNS a través de la secreción de vesículas por parte de las células glómicas (López-Barneo et al., 1988). Estas vesículas contienen gran variedad de neurotransmisores, a la vez que neuromoduladores del tipo de encefalinas, sustancia P (SP), péptido natriurético atrial, neurokinina A, neuropéptido Y, o endotelinas (Kumar, 1997; Platero-Luengo et al., 2014a). La participación activa de algunas de estas moléculas (SP, ET-1) en la regulación de la actividad quimiorreceptora está ampliamente descrita (Fidone y González, 1986; López-Barneo et al., 2008; Smith et al., 1990). Nuestro grupo incluso ha demostrado que algunos de estos neuromoduladores, como la ET-1, juegan un papel en la activación proliferativa de las células madre, gracias a una estructura especial de interacción entre las células neuronales y las células madre a la que se ha denominado sinapsis quimioproliferativa (Platero-Luengo et al., 2014a). La existencia de este tipo de interacción permite acoplar la actividad germinal del órgano con la actividad quimiorreceptora neuronal. La función 34 de muchas otras de las moléculas incluidas en las vesículas neuronales del CB, como la bradiquinina (BK), sobre la biología de las células progenitoras, está aún por estudiar. En este trabajo se aborda, al menos parcialmente, el estudio de algunas de estas moléculas. 4. Células madre del cuerpo carotídeo (CBSCs) 4.1. Mecanismos de proliferación y diferenciación de las CBSCs El estímulo proliferativo del CB es la hipoxemia crónica. Pasados 2-3 días de exposición al estímulo hipóxico, se observa una proliferación de las células tipo II seguida de su diferenciación hacia células glómicas (Pardal et al., 2007) (véase la figura 1B). Como acabamos de exponer, también se ha demostrado en nuestro grupo que las células tipo II tienen la capacidad de diferenciarse tanto in vivo como in vitro hacia células de músculo liso SMA+ (Pardal et al., 2007), y células endoteliales (Annese et al., en revisión). Esta capacidad multipotente de diferenciación hacia ambos linajes neuronal y mesectodérmico podría indicar que las CBSCs llevan a cabo divisiones asimétricas, además de las típicas divisiones simétricas necesarias para la autorenovación. Aunque este es un aspecto que se ha estudiado en otros tipos de células madre del sistema nervioso (Gage, 2000; Luque y Gimenez y Ribotta, 2004; Shah et al., 1996), no ha sido abordado de forma específica en el presente trabajo de tesis doctoral. Los datos previos de nuestro grupo han permitido dilucidar por tanto mecanismos a nivel celular y molecular que explican la activación proliferativa de las CBSCs y su diferenciación hacia el linaje neuronal (Pardal et al., 2007; Platero-Luengo et al., 2014a). Sin embargo, la diferenciación de estos progenitores específicos de tejido hacia el linaje mesectodérmico está mucho menos estudiada. Igualmente, se conoce muy poco acerca de los mecanismos de regulación de la angiogénesis que tiene lugar en el órgano durante la exposición a hipoxia crónica. En este trabajo de tesis doctoral hemos investigado más a fondo sobre esta cuestión. 35 4.2. Progenitores neurales restringidos del cuerpo carotídeo A diferencia de las células madre neurales multipotentes, un progenitor neural restringido se define como aquella célula que generalmente madura hacia un único tipo celular determinado (progenitor unipotente) (Luque y Gimenez y Ribotta, 2004). Las CBSCs se dividen dando lugar a los progenitores Nestina+, en este caso aún multipotentes, que de hecho pueden revertir hacia células madre quiescentes de nuevo (Pardal et al., 2007) (véase el diagrama celular del CB de la figura 1B). Tras diversos estudios, hoy en día sabemos que los nichos neurogénicos contienen progenitores restringidos hacia linajes celulares específicos propios del tejido. En la SVZ por ejemplo existe una subpoblación de progenitores indiferenciados pero restringidos hacia el linaje de oligodendrocitos (Nait-Oumesmar et al., 2008). El linaje germinal del CB descrito hasta ahora contempla que, en condiciones de hipoxia, la célula madre GFAP+ da lugar de manera reversible a un progenitor intermedio (Nestina+) (Pardal et al., 2007), y éste prolifera y se diferencia hacia células neuronales TH+ o hacia células de músculo liso SMA+ (Pardal et al., 2010). Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral proponen que en el CB, de forma parecida a lo explicado para otros nichos neurogénicos, podrían existir subpoblaciones de progenitores neurales indiferenciados pero restringidos hacia un linaje específico del CB. La hipoxia podría de nuevo estar jugando un papel clave en la activación y diferenciación de estas subpoblaciones de progenitores restringidos de este tejido. El presente trabajo de tesis doctoral pretende esclarecer la existencia de estos progenitores restringidos en el CB, especialmente aquellos especificados hacia linaje mesectodérmico. 4.3. Origen embrionario de las células madre de cuerpo carotídeo Para entender la capacidad multipotente de las CBSCs y su especificidad de diferenciación, resulta adecuado conocer en detalle el origen embrionario de este tejido glómico. La cresta neural está compuesta por una población de células embrionarias multipotentes que se delaminan antes del cierre del tubo neural durante la neurulación (Dupin y Sommer, 2012; LeDouarin, 1986a) (Figura 4). Entre estas células se encuentran las células madre de la cresta neural (NCSCs) (Kruger et al., 2002). Durante su migración, las células de la cresta neural sufren una limitación o restricción 36 progresiva de su plasticidad (Baroffio et al., 1991). Finalmente, y en función de su posición de origen a lo largo del tubo neural, colonizan varios tejidos donde se diferencian a diversos tipos celulares. Las células de la cresta neural dan lugar a gran diversidad de estructuras, que incluyen el esqueleto craneofacial, la mandíbula, los melanocitos de la piel, células musculares lisas de las arterias del arco branquial y otras células vasculares, y la mayoría del PNS, incluyendo los ganglios autonómicos, como el ganglio cervical superior, ganglios entéricos, ganglios de la raíz dorsal, células de Schwann, células cromafines de la médula adrenal, y algunos órganos sensoriales especializados como el cuerpo carotídeo (Dupin y Sommer, 2012; Jiang et al., 2000; LeDouarin, 1986a). La enorme diversidad de tejidos que genera la cresta neural ha motivado un debate sobre la posible multipotencia de las células de la cresta neural. Hoy en día se plantean dos modelos posibles; uno propone que la población de células de la cresta neural es multipotente y capaz de dar lugar a todos los tipos celulares o la mayoría de ellos (Baggiolini et al., 2015). Y por el contrario el otro modelo sostiene que existe una mezcla de células madre que están predeterminadas hacia un único tipo de tejido. Los primeros estudios de la cresta neural se llevaron a cabo en aves, pues tienen un desarrollo embrionario similar al de humanos y sus células son accesibles durante toda la gestación. Los embriones de pollo (Gallus gallus) o de codorniz japonesa (Coturnix coturnix japonica) son los modelos más utilizados. Para poder marcar y monitorizar las células de la cresta neural se crearon quimeras in ovo entre ambas especies (Le Douarin, 1980; LeDouarin, 1986a). Estas quimeras fueron el primer sistema estable para el seguimiento de las células de la cresta neural, y con ellas se demostró que el CB de las aves efectivamente se origina a partir de la cresta neural (Le Douarin, 1980; Le Lièvre y Le Douarin, 1975; LeDouarin, 1986a; Pearse et al., 1973). Durante años se asumió el mismo origen para las células glómicas del CB de otros vertebrados (Hempleman y Warburton, 2013), hasta que pudo corroborase mediante un sistema de seguimiento del linaje celular específico de mamíferos: un ratón transgénico con el promotor Wnt1 (un proto-oncogén expresado por células de la cresta neural) unido a un gen reportero (Chai et al., 2000; Jiang et al., 2000). Esta técnica de trazado de linaje celular ha permitido confirmar que tanto las células glómicas como las tipo II tienen su origen en la cresta neural (Pardal et al., 2007). 37 La cresta neural se estructura en cuatro regiones: craneal, troncal, vagal y sacral. Las NCSCs se especifican hacia distintos linajes dependiendo de su posición inicial en la cresta neural, siendo la región cefálica (craneal y vagal) a la cual pertenece el CB, más plástica que las partes troncal y sacral (LaBonne y Bronner-Fraser, 1998). El CB se forma durante el desarrollo fetal mediante la migración de progenitores simpatoadrenales especificados en las proximidades de la aorta (Saito et al., 2012). En mamíferos, el primer signo morfológico del CB es una acumulación de células mesenquimales en la pared de la tercera arteria branquial (Kondo, 1975), constituyendo lo que se conoce como el primordio del CB (Hempleman y Warburton, 2013; Kameda, 2005). Las paredes de las arterias de los arcos branquiales o faríngeos, incluida la tercera arteria branquial, derivan de células mesenquimales o mesectodérmicas de la cresta neural (Jiang et al., 2000). El primordio es colonizado por células precursoras neurales, procedentes del vecino ganglio cervical superior, que irán migrando y diferenciándose hasta convertirse en células glómicas (Kameda, 2002; Kameda et al., Figura 4. Formación de la cresta neural. La cresta neural (verde) aparece en el borde de la placa neural. Tras el cierre del tubo neural, las células de la cresta neural se delaminan desde la región entre el tubo neural dorsal y el ectodermo suprayacente, y migran hacia la periferia. Adaptado de Gammill y Bronner-Fraser, 2003. 38 2002; Kameda et al., 1994; Le Douarin et al., 1972). Asimismo, el primordio es inervado durante todo el proceso por fibras procedentes del ganglio cervical superior y del nervio glosofaríngeo. Varios estudios con ratones transgénicos proponen que el CB está formado por células procedentes de dos linajes de la cresta neural (Kameda, 2005; Kameda et al., 2012; Pardal et al., 2007): células mesenquimales procedentes de la tercera arteria branquial (Jiang et al., 2000; Kameda, 2005; Le Lièvre y Le Douarin, 1975; Waldo et al., 1999), y células neurales derivadas del ganglio vecino, el ganglio cervical superior (Kameda, 2005; Le Douarin et al., 1972; LeDouarin, 1986b). Este doble ambiente neural y mesenquimal durante el desarrollo podría influir en la especificación y multipotencia de los progenitores del órgano que persisten hasta la vida adulta. No obstante, aún no está totalmente aclarado si las células madre del CB, las células tipo II, provienen del ganglio cervical superior formando parte de los progenitores de células glómicas, o por el contrario provienen de las células mesenquimales de la pared de la tercera arteria branquial, lo que explicaría su fenotipo mesenquimatoso. En resumen, el CB deriva de la zona craneal de la cresta neural, la zona más versátil, y lo hace a partir de progenitores neurales que aterrizan en un ambiente mesenquimatoso. Todo ello podría explicar la enorme plasticidad de diferenciación que presentan las células madre de este quimiorreceptor periférico. 4.4. Uso del cuerpo carotídeo en terapia celular Las NCSCs que persisten en el organismo adulto manteniendo su multipotencia, como es el caso de las células madre del CB (Annese et al., en revisión; Macías et al., 2014; Pardal et al., 2007), constituyen una interesante fuente celular donde estudiar esa plasticidad de diferenciación y su papel en la fisiología de los tejidos adultos. La multipotencia que conservan las CBSCs adultas representa un potencial uso en terapia celular frente a la enfermedad de Parkinson (PD, del inglés Parkinson’s disease). El CB ha sido utilizado exitosamente en trasplante intracerebral en modelos animales de PD (Muñoz-Manchado et al., 2013; Toledo-Aral et al., 2003; Villadiego et al., 2005). Además, las células glómicas del CB producen grandes cantidades del factor neurotrófico GDNF (del inglés glial cell line-derived neurotrophic factor), que estaría involucrado en el efecto protector y regenerador del CB en la terapia celular anti- 39 parkinsoniana (Villadiego et al., 2005). Sin embargo, el auto-trasplante de CB a pacientes con PD ha generado tan sólo un modesto beneficio clínico, probablemente debido, entre otros factores, a la poca cantidad de material disponible en un CB humano (Mínguez-Castellanos et al., 2007). Por ello, la expansión in vitro del CB a partir de células madre adultas posee un interés clave en la terapia celular frente a la PD (Ortega- Sáenz et al., 2013; Pardal et al., 2007). Las CBSCs no sólo generan células neuronales sino que dan lugar a derivados mesectodérmicos, tales como músculo liso o endotelio (Annese et al., en revisión). Por tanto, la aplicación clínica de las células madre de CB frente al parkinson depende de un mejor conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la toma de decisiones de linaje de esos progenitores. El bloqueo farmacológico de la diferenciación mesectodérmica de las CBSCs in vitro podría aumentar el rendimiento de producción de células glómicas, ricas en dopamina y GDNF, ambos necesarios para la terapia celular anti-parkinsoniana. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral pueden contribuir a la elaboración de nuevos protocolos para inhibir el linaje mesectodérmico en el CB, favoreciendo el neuronal. El linaje mesectodérmico es el menos estudiado dentro del CB, debido entre otras razones a la falta de herramientas y marcadores específicos para detectar estos tipos celulares. 4.5. Análisis de expresión génica por microarray con células del CB Las NSCs poseen especial interés (Cameron y McKay, 1998; Gage, 1998; Temple y Álvarez-Buylla, 1999) no sólo por su importancia durante el desarrollo y en la fisiología de los tejidos adultos, sino también por su potencial terapéutico en el tratamiento de distintas enfermedades (Gage et al., 1995). Sin embargo, la falta de marcadores para aislarlas apropiadamente in vivo del resto de células de los tejidos en los que residen ha supuesto durante muchos años un obstáculo importante para su estudio (Morrison et al., 1999). Afortunadamente, el desarrollo de nuevas técnicas en los últimos años ha permitido hallar proteínas que permiten purificar NSCs de tejidos embrionarios y adultos (Corti et al., 2007; Morrison et al., 1999; Pardal et al., 2007). La mayoría de los ensayos de enriquecimiento en progenitores se realizan mediante citometría de flujo (FACS, del inglés fluorescence-activated cell sorting) con anticuerpos específicos. Sin embargo, es imprescindible encontrar nuevos marcadores moleculares específicos, que permitan purificar a las células madre, y no sólo enriquecer una población celular determinada. En la actualidad se han desarrollado 40 estrategias experimentales que abordan el problema de la falta de marcadores. Una de estas estrategias es el uso de microarrays, con los que se ha estudiado la expresión génica y los perfiles genéticos de los diferentes tipos celulares de la SVZ (Beckervordersandforth et al., 2010; Codega et al., 2014). Esta técnica permite conocer mejor las rutas moleculares de las que depende la biología de estas células, y descubrir nuevos marcadores de superficie que mejoren su manipulación y aislamiento. Al igual que las células madre neurales del CNS, las células madre del CB expresan GFAP (Doetsch, 2003; García et al., 2004; Seri et al., 2001). Al activarse estas células durante la hipoxia, comienzan a expresar otro filamento intermedio, la Nestina, convirtiéndose así en progenitores intermedios proliferativos en el órgano. Además de estas proteínas específicas del citoesqueleto, no se conocen otros marcadores de superficie para las CBSCs, lo que dificulta su aislamiento y el estudio de la biología de estos progenitores. En ausencia de marcadores, el único método del que disponemos para trabajar con los progenitores de CB es el ensayo de formación de neuroesferas (NS) in vitro. El ensayo de NS ha sido utilizado en nuestro grupo para llevar a cabo un análisis de expresión génica por microarrays (Figura 5) (Platero-Luengo, 2014b). Este análisis se hizo anterior e independientemente de la presente tesis doctoral. En la aproximación llevada a cabo para analizar las CBSCs se decidió utilizar NS enriquecidas en la región progenitora (células indiferenciadas), muestra a la que se denominó UNDIFF-NS (del inglés undifferentiated), y comparar su expresión génica mediante chips de microarray con una población de NS enriquecidas en células dopaminérgicas (células tipo I), muestra a la que se denominó DIFF-NS (del inglés differentiated) (Figura 5). Como se ha descrito previamente en la Introducción, las NS de cuerpo carotídeo están formadas por una esfera central (core) con progenitores (Nestina+), rodeada de pequeños glomérulos de células neuronales (blebs, TH+) (Figuras 5A-D). La proporción de progenitores versus células neuronales puede ser modificada a través de las condiciones de cultivo. Aunque las muestras utilizadas en el microarray no están compuestas por poblaciones celulares puras, el análisis genético de NS permite extraer información valiosa sobre la biología del CB y sus distintos tipos celulares. Igualmente, el array es útil para encontrar marcadores que permitan la separación de células tipo II y/o de otros progenitores del CB adulto. El análisis de expresión diferencial que se 41 utilizó en el presente estudio para la búsqueda de marcadores de superficie seleccionaba los genes mediante dos parámetros o filtros: una diferencia de expresión mínima de dos veces (en inglés fold change, FCH) (FCH≥2), y un p-valor ajustado (FDR, del inglés false discovery rate) <0,01 (Platero-Luengo, 2014b), lo que asegura significación en las diferencias. Así se obtuvo un listado de genes altamente expresados en cada población de neuroesferas. En la muestra UNDIFF-NS se obtuvieron 535 genes de interés y 1.019 genes en el caso de la muestra DIFF-NS (Figura 5E). Continuando con nuestro objetivo de búsqueda de marcadores de células progenitoras de CB, y tras analizar las proteínas de membrana más expresadas en ambas condiciones del microarray, centramos nuestra investigación en un marcador de superficie altamente expresado en la condición indiferenciada, llamado CD10 o neprilisina (Figuras 5J y 5K). Este marcador de membrana obtenido del microarray nos ha permitido llevar a cabo el presente trabajo de tesis doctoral de aislamiento y caracterización de una subpoblación de progenitores neurales en el CB. Para abordar el primer objetivo de esta tesis doctoral se estudiaron los genes que codifican proteínas integrales de membrana de la muestra indiferenciada, pues esta estaba enriquecida en progenitores de CB. En la figura 5K podemos observar los genes de las proteínas de membrana integrales más expresadas en las NS-UNDIFF y NSDIFF, ordenados en función de la expresión diferencial (FCH). Entre los genes con mayor diferencia de expresión en la muestra diferenciada se encuentran la enzima convertidora de endotelina (Ecel1), una proteína involucrada en el procesamiento de la ET-1, citoquina liberada por las células tipo I (Platero-Luengo, 2014b; Platero-Luengo et al., 2014a). También se encuentran dos receptores de neurotransmisores (P2ry12, Adora2a), una molécula de adhesión (Amigo2), un receptor de factor neurotrófico, (Ntrk2), y una proteína implicada en sinapsis (Syt13). Estas proteínas reflejan cómo las neuroesferas enriquecidas en células neuronales expresan genes relacionados con diferenciación neuronal y sistema nervioso. La muestra diferenciada se sometió a hipoxia (10% O2) y se trató con medio de cultivo sin mitógenos. Estas condiciones han permitido que las células madre de CB sufran una diferenciación hacia el linaje neuronal, tal y como se perseguía con las condiciones de cultivo aplicadas. 48 5.2. Modificaciones post-traduccionales de CD10 Mme codifica una glicoproteína de 90-110 kDa (Malfroy et al., 1988; Malfroy et al., 1987; Turner y Tanzawa, 1997), debido a modificaciones post-traduccionales como la glicosilación (LeBien y McCormack, 1989). CD10 se caracteriza por la presencia de diversos sitios de N-glicosilación (Devault et al., 1987) y contiene grandes cantidades de ácido siálico (Johnson et al., 1984). Además, se ha descrito que cambios en la cadena glucídica de la glicoproteína afectan a su estabilidad y a su actividad enzimática (Lafrance et al., 1994). El extremo carboxilo terminal de CD10 posee el dominio “CAAX”, que le permite sufrir otras modificaciones como la endoproteólisis o la metilesterificación (Fu y Casey, 1999). 5.3. Funciones de CD10 CD10 tiene dos mecanismos de acción a través de dos dominios distintos: el dominio proteasa en el exterior celular, que inactiva péptidos del medio extracelular e impide que lleven a cabo su función señalizadora, y el dominio intracelular, que regula procesos como proliferación, diferenciación y migración celular mediante señalización interna (Figura 7D). Tras su descubrimiento en riñón, se demostró que CD10 también se expresaba en el sistema nervioso (Erdos y Skidgel, 1989), mayoritariamente en neuronas pero también en oligodendrocitos, en astrocitos (Marcel et al., 1990; Waksman et al., 1986b), en células de Schwann del sistema nervioso periférico (Kioussi y Matsas, 1991; Matsas et al., 1986), así como en el sistema nervioso entérico (Roques et al., 1993). La actividad proteasa de CD10 está implicada en la fisiología del CNS y del PNS mediante degradación de neuropéptidos, siendo uno de los primeros descritos la encefalina (Malfroy et al., 1978; Roques et al., 1993). Este factor es un péptido opiáceo liberado por las neuronas en respuesta al dolor. El descubrimiento de inhibidores de CD10 como el Tiorfan (Thiorphan en inglés) (Roques et al., 1980), del cual hablaremos más adelante, ha permitido confirmar el papel de esta peptidasa en la inactivación de encefalina y otros péptidos, tales como neurotensina (Mumford et al., 1981), oxitocina, o la sustancia P (SP), de la familia de las taquininas, que posee efecto vasodilatador mediante la inducción de histamina, serotonina y bradiquinina (Maguer-Satta et al., 2011a). CD10 es también una de las enzimas degradadoras del péptido amiloide Aβ, y 49 polimorfismos en su gen (Helisalmi et al., 2004) o disfunciones en la parte enzimática (Iijima-Ando et al., 2008), pueden influir negativamente en pacientes con Alzheimer. CD10 también está presente en el sistema inmune; se ha localizado en la membrana plasmática de los neutrófilos, donde regula su activación mediante degradación de péptidos inflamatorios (Shipp et al., 1991). Se expresa también en células pre-B y células estromales de médula ósea, lo que sugiere que tiene un papel en las fases tempranas del desarrollo de los linfocitos B (Roques et al., 1993). Además, participa en respuestas quimiotácticas, fagocitosis, procesos inflamatorios y analgesia periférica (Roques et al., 1993). Neprilisina también se expresa, aunque transitoriamente, durante el desarrollo de órganos sensoriales como el ojo o los bigotes (Roques et al., 1993), o en tejidos epiteliales, como pulmón (Sunday et al., 1992) o mama (Atherton et al., 1994), sugiriendo que también tiene un papel en la morfogénesis de estos tejidos. En mama, por ejemplo, CD10 se expresa en células mioepiteliales (Atherton et al., 1994), y está implicado en el desarrollo de las glándulas mediante el control de la proliferación, la diferenciación celular, y de la transición epitelio-mesénquima a través de la degradación de taquinina (Kenny et al., 1989). CD10 ha sido utilizado como marcador de célula madre en muchos tejidos sanos. Pero además, en tejidos tumorales se utiliza como marcador de diagnóstico y prognosis. Es el caso del cáncer de hígado, pulmón, próstata, mama (Maguer-Satta et al., 2011a), o cuello (Fukusumi et al., 2014). Además, la separación de células CD10+ ha permitido enriquecer en células formadoras de esferas en distintos sistemas, considerándose una herramienta útil para identificar poblaciones de células madre o progenitores en nichos en los que anteriormente no era posible detectarlos (Bachelard-Cascales et al., 2010). La actividad proteasa de CD10, degradando péptidos específicos, tiene un papel dual, manteniendo la reserva de progenitores e impidiendo su diferenciación hacia células maduras en un gran número de tejidos (Kenny et al., 1989; Salles et al., 1993). En conjunto, todos estos datos indican que CD10, a través de su función enzimática, podría tener un papel importante en el nicho como regulador del comportamiento de las células madre. En el presente trabajo de tesis doctoral hemos analizado el papel de esta proteína en la fisiología del nicho neurogénico y angiogénico del CB, para averiguar si influye 50 en el comportamiento de las células progenitoras en este importante quimiorreceptor periférico, un papel hasta ahora no descrito para la neprilisina en el CB. 5.4. Funciones de CD10 descritas en cuerpo carotídeo La neprilisina es la principal endopeptidasa del tejido quimiorreceptor del CB (Grasemann et al., 1999; Kumar, 1997), con una actividad proteasa muy superior a las otras peptidasas presentes en el órgano, hecho que indica su relevancia. El uso de inhibidores como el Fosforamidón o el Tiorfan señala que CD10 juega un papel crucial en la respuesta a hipoxia del CB de mamíferos (Kumar et al., 1990), puesto que la inhibición de CD10 aumenta esta respuesta (Kumar et al., 2000a). Neprilisina está considerado como un importante regulador de la respuesta de las células tipo I a la hipoxia aguda (Grasemann et al., 1999; Kumar, 1997). El mecanismo de acción no se conoce con exactitud, aunque su situación dual, en la membrana celular de ciertas células pero también en el medio extracelular del parénquima neural, sugiere que actúa degradando péptidos secretados por las células tipo I (como encefalina, sustancia P, o endotelinas) (Kumar, 1997), previsiblemente afectando a las sinapsis quimiorreceptoras entre estas células y los nervios sensitivos aferentes. Este tipo de mecanismo está igualmente descrito en el CNS, concretamente en el área sináptica entre neuronas sinaptotalámicas (Roques et al., 1993). Uno de los factores mejor descritos en el CB es la sustancia P (Grasemann et al., 1999), la cual es capaz per se de inducir la respuesta ventilatoria. Pues bien, CD10 parece tener un papel regulador en esta inducción (Kumar et al., 2000a). También se ha descrito que la dopamina podría interaccionar con CD10, modulando el metabolismo de neuropéptidos en el CB (Kumar et al., 2000b), pero son necesarios más estudios que corroboren estos hallazgos. Las células madre adultas residen en nichos específicos que les proporcionan el ambiente propicio para mantener su multipotencia y su capacidad de auto-renovación (Platero-Luengo et al., 2014a). Estas células se encuentran normalmente en un estado quiescente que las protege del estrés celular. Los mecanismos por los cuales estas células se activan selectivamente, para abandonar la quiescencia y diferenciarse hacia células maduras, continúan sin resolverse en la mayoría de nichos adultos (Chell y Frisén, 2012; Suda et al., 2011) y también en el cuerpo carotídeo. CD10 tiene un papel 51 en la regulación de progenitores en nichos adultos, como es el tejido mamario, determinando el abandono de la quiescencia de estos progenitores y su consecuente diferenciación (Maguer-Satta et al., 2011a). Además de la acción de la neprilisina liberada al medio extracelular para degradar neuropéptidos implicados en la respuesta a hipoxia en el CB, no se sabe si CD10 tiene un papel en la regulación de progenitores del nicho, similar al que desempeña en otros sistemas (Maguer-Satta et al., 2011a). Se desconoce si esta es una de las funciones que tiene esta peptidasa en los progenitores CD10+ en el CB adulto. Tampoco se ha caracterizado con detalle la subpoblación de células positivas para CD10 en el CB, por tanto se desconoce la naturaleza de estas células. El estudio de la expresión celular de CD10 en el CB, y el papel de esta proteína en la regulación del comportamiento de los progenitores del órgano, son dos de los principales aspectos que se han estudiado en la presente tesis doctoral. 52 Objetivos 53 Objetivos 1. Optimización de la manipulación de células madre del CB a través de métodos de separación y aislamiento. 2. Estudio del papel de factores del nicho del CB en la regulación de la proliferación y diferenciación de las CBSCs. 3. Estudio y caracterización de la población de células CD10+ del cuerpo carotídeo. 4. Estudio del papel de la proteína CD10 en la fisiología del cuerpo carotídeo. 5. Estudio de la regulación de CD10 por hipoxia. 6. Efecto de la endotelina-1 en los progenitores CD10+. 54 Materiales y métodos 55 Materiales y Métodos 1. Animales Se han utilizado ratas Wistar y ratones C57 modificados genéticamente, con edades comprendidas entre 3 y 8 semanas para las ratas, y de 6 a 8 meses en los ratones. Los roedores fueron estabulados y suministrados por el Animalario de la Universidad de Sevilla y por el Servicio de Producción y Experimentación Animal del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). La estabulación se realizó en jaulas ventiladas, con temperatura constante (22±1ºC), con ciclos alternantes de luz-oscuridad de 12 h, y con libre acceso al alimento y al agua. Para el manejo experimental y su posterior sacrificio los animales fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina, a una dosis de 80/10 mg/kg. Ambas drogas fueron suministradas por la Farmacia del Hospital Virgen del Rocío. Todos los animales fueron manipulados y tratados de acuerdo a la guía de cuidado de animales de laboratorio del Consejo Comunitario Europeo (86/609/EEC). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Investigación con animales de la Universidad de Sevilla. El modelo genético de ratón utilizado ha sido GFAP-CRE/ROSA26, con el fin de corroborar que las células CD10+ provienen de las células madre del cuerpo carotídeo (CBSCs). 1.1. Tratamiento de hipoxia crónica mediante cámaras isobáricas Los animales han sido sometidos a hipoxia crónica (10% O2) durante diferentes periodos de tiempo (2; 4; 7 ó 21 días). Para ello se colocaron las jaulas en una cámara hermética isobárica (Coy Laboratory Products, Inc.). Ésta posee controladores de O2 y CO2, así como de temperatura y de humedad. Además se utilizó un medidor externo de O2 y CO2 para comprobar que las cámaras funcionaban correctamente. Debido a la existencia de una esclusa con doble puerta, estas cámaras pueden manipularse sin que se alteren las condiciones del interior. Tras sacrificar los animales expuestos a hipoxia, se les determinó el hematocrito por centrifugación de la sangre en un capilar sin heparina (Hirschmann Lab.) a 5000 rpm durante 5 min (dos capilares por animal). Se utilizó el mismo número de machos y hembras para salvar variaciones debidas al sexo. 56 2. Técnicas histológicas 2.1. Inclusión de tejidos y corte Los tejidos extraídos del animal fueron lavados en PBS frío e incluidos en resina criopreservante OCT (Tissue Tek, Electron Microscopy Sciences) en moldes de plástico (Cryomold, Tissue Tek, Electron Microscopy Sciences), congelados rápidamente en hielo seco y posteriormente guardados en el congelador a -80ºC hasta su corte. Las muestras se cortaron con un criostato (Leica) con temperaturas en torno a -17ºC (cámara) y -24ºC (muestra). Se realizaron cortes seriados de 10 µm que fueron recogidos en portaobjetos adherentes (Superfrost Plus, Thermo Scientific) y congelados a -20ºC hasta su uso para inmunohistoquímica. 2.2. Preparación de tejidos frescos Según el anticuerpo con el que íbamos a hacer la inmunohistoquímica de muestras de cuerpo carotídeo (CB) o de neuroesferas (NS), se realizó una fijación específica; • Fijación con parafolmadehído (PFA, Sigma) al 4%. Se extrajeron los portaobjetos del congelador e inmediatamente se aplicó PBS durante 30 min para hidratar los tejidos. Después se aplicó PFA al 4% durante 20 min a temperatura ambiente (RT) y se hizo un lavado de 10 min con PBS para rehidratar la muestra. • Fijación con acetona (Sigma). Se extrajeron los portaobjetos del congelador e inmediatamente se sumergieron en acetona fría (a -20ºC) y se incubaron durante 10 min, todo dentro del congelador. Tras este tiempo, los portaobjetos se secaron al aire durante 15-30 min para dejar evaporar la acetona. • Fijación con metanol (Sigma). Se extrajeron los portaobjetos del congelador e inmediatamente se sumergieron en metanol enfriado (-20ºC) durante 10 min a RT. Después se realizó un lavado de 10 minutos con PBS para rehidratar la muestra. 57 3. Cultivos celulares 3.1. Medios y soluciones Tyrode 2Ca+2 1Mg+2 o solución de extracción STOCK Concentración final Cantidad para 1 L NaCl 140 mM 8,64 g KCl 4.7 mM 0,15 g MgCl2 · 6H2O 1 mM 0,6 g HEPES (Gibco) 10 mM 2,38 g Glucosa (Sigma) 5 mM 1,8 g pH = 7.4 Solución de dispersión de cuerpo carotídeo STOCK Concentración final Cantidad para 1 ml Tripsina (Sigma) 0,3 mg/ml 10 µl Colagenasa tipo II (Sigma) 0,6 mg/ml 10 µl Elastasa porcina (Calbiochem) 0,35 U/ml 10 µl CaCl2 5 mM 50 µM 10 µl PBS (Gibco) 1 ml Solución de dispersión de neuroesferas STOCK Concentración final Cantidad para 1 ml Papaína (Worthington) 1,43 mg/ml 35 µl Colagenasa tipo II (Sigma) 3,96 mg/ml 66 µl Elastasa porcina (Calbiochem) 0,35 U/ml 10 µl HBSS (Gibco) 1 ml 64 4.5. Cuantificaciones celulares y cuantificación del área de expresión Las cuantificaciones celulares en las imágenes fluorescentes se llevaron a cabo manualmente, con ayuda del plugin “Cell counter” del software ImageJ (NIH). La expresión de algunos marcadores de membrana, como CD10 y lectina proporcionan una tinción filamentosa y sinuosa, que forma una red por todo el tejido difícil de cuantificar. Por consiguiente, para el análisis de estos marcadores, utilizamos el área de expresión. Para estos marcadores se elaboró una macro especial en el programa ImageJ, que modificaba el brillo/contraste en cada imagen y la reducía a 8 bits, después asignaba un valor umbral (o threshold), definido visualmente, para delimitar los píxeles positivos. De este modo, se obtenía una imagen máscara de la tinción original que se basaba en adjudicar valor 1 ó 0 a cada pixel, siendo 1 expresión del marcador y 0 no expresión. Con estas imágenes binarizadas podíamos analizar dónde se expresaba el marcador, aunque no el nivel de expresión. Posteriormente, se medía el área de expresión en la rodaja de CB o de NS de cada imagen. El área total se establecía utilizando el marcaje DAPI, ya que el parénquima del CB o el área de la neuroesfera pueden definirse fácilmente por la densidad de núcleos que lo forman. 4.6. Ensayos funcionales en cultivos de CBSCs 4.6.1. Determinación de la capacidad proliferativa de las células madre La capacidad proliferativa de las células progenitoras que componen una neuroesfera se halla a partir del diámetro de dicha NS. Por tanto, analizamos los diámetros de las NS de cada condición de forma manual con la ayuda del software ImageJ (NIH). Cada condición contaba con un mínimo de 3 réplicas, que se correspondían con tres pocillos de la placa de cultivo. Se medía el diámetro de las NS en cada pocillo y se calculaba una media de las réplicas. Esta media poblacional era comparada entre las distintas condiciones del experimento. En cada pocillo había entre 40 y 50 NS, por lo que las comparaciones entre condiciones se hacían, al menos, con la medida de unas 100 neuroesferas. 65 4.6.2. Análisis de la diferenciación de las CBSCs Análisis en secciones de neuroesferas En las neuroesferas de CB, las células dopaminérgicas diferenciadas se distribuyen en el exterior formando unas estructuras abultadas llamadas blebs. En cambio, los progenitores se distribuyen por todo el interior de la esfera, pudiéndose hablar de una zona diferenciada y otra zona indiferenciada (llamada core), que prácticamente nunca solapan. Para cuantificar la diferenciación neuronal en las NS, se cuantificó el número de células glómicas o tipo I (agrupadas dentro de los blebs). Una vez teñidas y fotografiadas las secciones de las neuroesferas, se procedió a la superposición de las fotografías utilizando el programa ImageJ, lo cual nos permitió obtener una imagen final donde se visualizan claramente las células glómicas, pues los núcleos están marcados con DAPI (azul) y el citoplasma de las células con el anticuerpo anti-TH (rojo o verde). El contaje celular se llevó a cabo manualmente, utilizando dicho programa informático, y se calculó la proporción de células positivas para TH con respecto a las células totales (detectadas mediante el DAPI). El grado de diferenciación mesectodérmica de las NS se detectó mediante inmunohistoquímica contra los marcadores CD10 y GSA I (lectina). Con la ayuda del software ImageJ se elaboró un macro para cada canal y tal y como se explica en la sección 4.5, se midió el área de cada tinción en cada imagen. De esta manera, se cuantificó el grado de diferenciación mesectodérmica inducido por un agente o factor sobre los progenitores de CB. Análisis en neuroesferas adheridas a sustrato El cultivo de los progenitores de CB sobre sustrato adherente constituye un fuerte estímulo para su diferenciación hacia miofibroblastos y células de músculo liso. Las NS se sembraron durante 12h en placas tratadas con fibronectina (5µg/ml) para analizar la capacidad de diferenciación hacia el linaje mesectodérmico del CB. Se utilizó medio de diferenciación (sin mitógenos, ver apartado 3.1). Con estas condiciones de cultivo, las NS se adhieren al sustrato y los progenitores que forman la esfera salen y se diferencian. Estas células fueron teñidas con el anticuerpo anti-α-SMA, que se une a la actina de músculo liso α, y con la GSA I (o lectina), que se une a carbohidratos presentes en células endoteliales. Una vez realizada la inmunocitoquímica, las células fueron 66 fotografiadas y se procedió a la cuantificación de las células positivas para cada marcador. Para la detección del marcador lectina, se consideraron positivas las células GSA I+ que tenían forma alargada, típica del fenotipo endotelial. 5. Citometría de flujo La citometría de flujo se utilizó para analizar y obtener poblaciones celulares de interés purificadas. Las separaciones celulares se realizaron mediante la técnica FACS y se utilizó un citómetro de flujo de tres láseres MoFlo (DAKO Cytomation) y un citómetro de cinco láseres FACSAria Fusion (BD Biosciences). Esta técnica detecta la fluorescencia desprendida por un fluoróforo unido en nuestro caso a un anticuerpo secundario, para identificar un tipo celular concreto y separarlo de la mezcla heterogénea de células. Para analizar poblaciones sin separarlas se utilizó un citómetro de seis láseres LSRFortessa (BD Biosciences). Mediante la técnica de citometría de flujo se analizaron tres tipos de muestras: células dispersas a partir de CB completos, células procedentes de la dispersión de NS y células procedentes de las líneas primarias de CB. Las células muertas fueron eliminadas del análisis mediante el marcador de viabilidad 7-AAD (Molecular Probes), para el cual son positivas. En los análisis sin separación a veces se estudiaban marcadores intracelulares, y en estos casos las células necesitaban ser fijadas por lo que se prescindía del 7-AAD. La tinción utilizada para marcadores intracelulares se explica en el apartado 0. En todos los ensayos de citometría se llevaron en paralelo células que servían de controles para los ajustes del citómetro y para comprobar la especificidad del anticuerpo. Uno de estos controles fueron células incubadas únicamente con los anticuerpos secundarios, para poder eliminar la fluorescencia inespecífica de éstos, y el otro control fue un tubo control que lleva las células marcadas sólo con 7-AAD, para establecer los valores negativos de este fluoróforo sin otra interferencia. Antes de pasar las células por el citómetro, todas las muestras se filtraron con membranas de 50 µm de poro (Celltrics, Partec) para eliminar posibles restos y agrupaciones celulares. 67 5.1. Tinción de marcadores de membrana para citometría de flujo Las células dispersas se transfirieron de los tubos de 15 ml a los tubos específicos de citometría (de poliestireno y fondo redondo, BD Falcon). En primer lugar se lavaron con 3 ml de solución FACS (ver Soluciones en apartado ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.), y se centrifugaron a 300 g durante 5 min a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y las células fueron resuspendidas en 200 µl de los anticuerpos primarios diluidos en solución de FACS. Las células se incubaron con los anticuerpos primarios durante 1 hora a 4ºC, y posteriormente se lavaron con 3 ml de FACS y se centrifugaron de nuevo. A continuación, las células se incubaron con los anticuerpos secundarios, PE- donkey-anit-goat IgG para CD10, FITC-goat-anti-mouse-IgM para HNK-1, y PE-rat- anti-mouse-IgG1 para CD31, todos ellos diluidos 1:200 en solución de FACS, durante 30 min, a 4ºC y oscuridad. Después, las células se volvieron a lavar y a centrifugar. Por último, las células se incubaron en el marcador de viabilidad 7AAD diluido 1:500 en FACS, y se procedió a si análisis en el citómetro correspondiente. Las células endoteliales, detectadas mediante el anticuerpo anti-CD31 y mediante la lectina, son sensibles al proceso de dispersión al que son sometidos los CB. Por ello, tras la dispersión, las células fueron cultivadas durante 12h en condiciones no adherentes, y seguidamente se procedió a la tinción de citometría. De esta manera, para estudiar la co-expresión de CD10 con marcadores endoteliales, primero se separaron las células CD10- y CD10+, se incubaron, y pasado este tiempo, se procedió a hacer la tinción de los marcadores endoteliales con el protocolo usual. A diferencia de los marcadores endoteliales, los niveles de la proteína CD10 disminuyen 12 horas tras la dispersión, por este motivo, las células CD10+ eran siempre separadas recién disperso el CB. 5.2. Tinción doble, de marcador de membrana y de marcador intracelular, para citometría de flujo Para algunos ensayos, se cuantificó mediante citometría la co-expresión de CD10 con algunos marcadores intracelulares. Para ello, primero se marcaron las células con el anticuerpo anti-CD10, y posteriormente se fijaron con 150 µl de PFA al 4% durante 15 min a RT. Se lavaron con 4 ml de PBS y se centrifugaron a 300 g durante 5 min a 4ºC. A partir de este paso los lavados se hacían con PBS, ya que las células ya no estaban 68 vivas. Se eliminó el sobrenadante y se procedió a la tinción con los anticuerpos contra las proteínas intracelulares (GFAP o nestina entre otras). El anticuerpo primario se incubó en solución de bloqueo con un agente permeabilizante para que pudiera atravesar la membrana celular (10% suero de caballo, 1% albúmina bovina, y 0,1% Tritón X-100, en PBS). Según el anticuerpo, la incubación fue de 1 hora a 4ºC, o 30 min a RT. A continuación, se lavó con PBS y se procedió al análisis de las células mediante un citómetro LSRFortessa (BD Biosciences). 5.3. Separación de células de cuerpo carotídeo mediante FACS Las células de CB o de NS fueron separadas mediante citometría de flujo, en todos los casos se utilizó el anticuerpo anti-CD10 para aislar las poblaciones CD10- y CD10+. Los cuerpo carotídeos (8-12 CB) o las NS fueron dispersados como se describe en la sección ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. en cada caso. Las células se conservaron en frío durante todo el proceso de tinción para evitar la internalización del marcador de membrana CD10. En algunas tinciones con CD10, el marcador HNK fue utilizado como marcador negativo para descartar una parte de la población de células neuronales de CB. La cantidad de células recolectadas varió entre experimentos, llegándose a obtener un máximo de 20.000 células de la población limitante. 6. Análisis de expresión de ARN mensajeros 6.1. Extracción de ARN total y retrotranscripción Los estudios de expresión génica se llevaron a cabo mediante la extracción de ARN total de CB, de NS, de células de líneas primarias de CB, o de células separadas mediante citometría de flujo. La cantidad de material dependió del experimento y del tipo de muestra. La extracción de ARN se realizó con el kit comercial RNeasy MICRO kit (Qiagen), siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Las medidas de concentración del ARN obtenido se llevaron a cabo en un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). El cDNA (DNA complementario) se sintetizó inmdiatamente después de 69 obtener el RNA, mediante el kit QuantiTec Reverse transcription kit (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. El proceso de retrotranscripción se llevó a cabo a 42ºC durante 30 min. El tratamiento de los tejidos, tanto en la disgregación como en el procesado para la extracción del mRNA fue diferente según los casos: • Cuerpos carotídeos. Se utilizaron de 2 a 6 CB, que fueron extraídos en condiciones libres de RNAsas. El material necesario para la cirugía y la recolección se trató con etanol al 70% y con RNaseZap (Ambion), o fue horneado a 240ºC durante 4h. Las soluciones utilizadas fueron tratadas con Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma) para inhibir las RNAsas. Los CB se recolectaron en un tubo de microcentrífuga libre de RNAsas, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se guardaron a - 80ºC hasta realizar la extracción del ARN. Posteriormente, para extraer el mRNA se disgregó el tejido mediante arena de sílice (Sigma) horneada. Se añadió un poco de arena a los tubos de microcentrífuga, que se mantuvieron en nitrógeno líquido durante el proceso, y con ayuda de un pistilo desechable se trituró el tejido para romperlo. Seguidamente, se retiró el tubo del nitrógeno, se añadieron 350µl de solución de lisis RLT (Qiagen) con 3,5µl de β-mercaptoetanol (Sigma), y se continuó con la trituración. Seguidamente, se decantó la arena mediante un pulso con la microcentrífuga (Eppendorf) y se pasó el sobrenadante a un nuevo tubo, entonces fue homogeneizado con una aguja de 20G acoplada a una jeringuilla de 1 ml, y se volvió a centrifugar para retirar los restos de tejido. A partir de aquí, se siguieron las instrucciones del kit de extracción de ARN del fabricante. • Neuroesferas. Se utilizaron al menos 2 pocillos de cultivo con NS (con unas 60-100 NS). Éstas eran recolectadas bajo el microscopio con especial cuidado de no introducir células sueltas u otro material presente en el medio. Se pasaron a un tubo de microcentrífuga libre de RNAsas, y fueron centrifugadas a 300 g durante 5 min a 4ºC. Se retiró el sobrenadante y los tubos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido hasta su uso. Posteriormente, para extraer el mRNA se disgregó el tejido mediante arena de sílice (Sigma) horneada. • Células provenientes del citómetro. Se necesitó un mínimo de 1.000 células y el máximo dependió del rendimiento del proceso de separación, que no fue más de 20.000 células. Éstas se separaron mediante citometría de flujo y se asilaron 70 directamente en solución de lisis RLT (Qiagen) con β-mercaptoetanol, y se guardaron a -80ºC hasta la extracción de mRNA, que se realizó utilizando el kit comercial RNeasy MICRO kit (Qiagen), siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. 6.2. Reacciones de PCR Las reacciones de PCR estándar se realizaron en un Termociclador Professional TRIO (Biometra). La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25µl que contenía tampón NH4+, MgCl2 a 2mM, dNTPs (Invitrogen) a 0,2mM, cebadores a 0,4µM (Sigma), 5U de Taq polimerasa (Bioline) y 1µl de muestra. Las condiciones de las reacciones fueron: desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 min, 40 ciclos a la temperatura de alineamiento específica de cada pareja de cebadores, y una extensión final de 5 min 72ºC. Se realizó una electroforesis en tampón Tris-Borato-EDTA (TBE, National Diagnostic) de los productos de PCR en un gel de agarosa a una concentración determinada por el tamaño del trascrito, en TBE. Las bandas de DNA fueron visualizadas con MIDORI (Labotaq) y tampón de carga 10X (Takara). Para determinar el tamaño de las bandas de cada transcrito se utilizó un marcador de peso molecular de 100pb o 1kb (New England Biolabs). La información sobre los genes analizados y los cebadores se facilita en la Tabla 3 (Oligonucleótidos). Las reacciones de PCR cuantitativa (qRT-PCR, Real Time quantitative Reverse Transcription PCR) se realizaron en un termociclador 7900 HT (Applied-Biosystems) siguiendo las condiciones recomendadas por el fabricante. La detección se realizó con FAST SYBR Green® PCR Master Mix o ensayos TaqMan (Applied-Biosystems), dependiendo del experimento. Cada muestra se normalizó respecto al transcrito de Hprt1 para realizar la cuantificación relativa de la expresión de cada gen. Las curvas de disociación de los genes mostraron un único pico, demostrando así la especificidad de los cebadores. El análisis de los datos se llevó a cabo mediante el método de ΔΔCt. El cDNA de las muestras se diluyó en agua ultrapura y de esa dilución se usó el volumen necesario para amplificar 20 ng de cada muestra por pocillo, en placas de 96 pocillos (MicroAmp Fast Optical, Applied-Biosystems). Estas placas se mantuvieron en hielo durante todo el proceso, se sellaron con film (Optical Adhesive Film, Applied- Biosystems), y se centrifugaron a 1000 rpm durante 1 min antes de su análisis. 71 6.3. Análisis de microarrays 6.3.1. Cultivos de neuroesferas para la realización del microarray Los estudios de expresión génica se realizaron a partir de cultivos de neuroesferas de CB para comparar la expresión diferencial de genes entre neuroesferas tratadas con endotelina-1 (ET-1) y neuroesferas sin tratar (CONTROL). Estas dos poblaciones se obtuvieron al cultivar las células dispersas procedentes de CB durante 10 días en dos condiciones distintas, siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.3. En el caso de las NS-ET-1, las células de CB se sembraron en medio completo (con mitógenos), y se suplementaba con endotelina-1 (0,01 µM) en días alternos, y en condiciones de normoxia. Para favorecer el crecimiento de las NS-CONTROL se utilizaron las mismas condiciones, a excepción de la adición de la ET-1. 6.3.2. Estudio de expresión diferencial de genes El análisis de expresión se realizó mediante microarrays GeneChip® Rat Gene ST 1.0 Array de Affymetrix, en la Unidad de Genómica del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). Se analizaron un número estimado de 27.342 genes bien descritos y conocidos. El análisis estadístico de los datos, que fue llevado a cabo por la unidad de Genómica del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), se realizó mediante LIMMA (Linear Models for Microarray Analysis) utilizando el programa oneChannel (en R), que es el recomendado para esta plataforma. Se trata de un análisis que aplica un t-test empíricamente ajustado por un test de Bayes. 6.3.3. Validación de los microarrays Los datos obtenidos del análisis de los microarrays fueron validados por qRT- PCR mediante el uso de una placa prediseñada conteniendo sondas TaqMan (Applied Biosystem) de un grupo de genes de interés. Estas placas contenían 44 ensayos en duplicado que incluían un control genérico (18S ARN) y tres genes de control endógeno (GAPDH, HPRT1 y GUSB). Los pocillos de estas placas se rellenaron con 20µl de muestra obtenidos a partir de la disolución del cDNA procedente de la retrotranscripción de cada cultivo, diluidos 1/14 en agua ultrapura, y se añadió un 72 volumen de TaqMan Fast Master Mix. Algunos genes se analizaron mediante ensayos con FAST SYBR Green® PCR Master Mix (Applied-Biosystems). 6.3.4. Estudio de las funciones biológicas mediante IPA Los datos de expresión génica de los microarrays se han analizado mediante el programa Ingenuity Pathways Analysis (IPA) de Ingenuity System. Este programa ayuda a interpretar el significado biológico de los datos genómicos. IPA utiliza la Ingenuity Knowledge Base, una base de datos creada manualmente por expertos que está basada en la literatura científica, y que es revisada y actualizada continuamente. Para proporcionar los resultados, IPA emplea dos estadísticos, el z-score y el p-value. El valor de p-value es calculado mediante el Test exacto de Fisher y refleja la probabilidad de que la asociación o la superposición entre un conjunto de moléculas importantes del experimento y un proceso dado se deban al azar. Cuanto menor es el valor de p, menor será la probabilidad de que la asociación sea debida al azar. El valor p no tiene en cuenta el efecto direccional de la expresión de una molécula, es decir si un gen está sobreexpresado o infraexpresado. Sinn embargo, el z-score tiene en cuenta el efecto direccional de una molécula sobre otra molécula o en un proceso, y la dirección del cambio de las moléculas en el conjunto de datos. Para este estudio, los genes proporcionados por los microarrays fueron seleccionados aplicando un FCH ≥ 2 y una FDR (p-value ajustado) < 0,05, y se llevó a cabo un IPA Core Analysis. Este análisis ofrece una evaluación de la señalización y rutas metabólicas, redes moleculares y procesos biológicos que están significativamente representados en el conjunto de datos. Los procesos biológicos se definen como Categorías y Biofunciones. Las Categorías agrupan Biofunciones más específicas. Una Biofunción puede estar contenida en una o varias categorías, por lo que para evitar la redundancia se ha mencionado cada Biofunción una sola vez incluyéndose en la Categoría que se pensó más conveniente, teniendo en cuenta su orden de aparición o especificidad. 6.4. Transfección de células dispersas de CB con siRNA Las células de CB se transfectaron tras 8 ó 12 h en cultivo mediante una mezcla de 4 secuencias de ARN de interferencia (siRNA, del inglés small interfering RNA) 73 distintas para asegurar la interferencia del gen (ver Tabla 3.Oligonucleótidos). Las secuencias que se utilizaron fueron testadas previamente (Tong et al., 2008); concretamente utilizaron el CD10 SMARTpool siRNA (Darmacon). Para los experimentos realizados en esta tesis los oligonucleótidos fueron diseñados y comprados en Sigma. Como ensayo control se utilizaron las secuencias de siControl SMARTpool siRNA (Darmacon). Los ensayos de silenciamiento génico se realizaron mediante la transfección de oligonucleótidos de siRNA expecíficos para Mme (Tong et al., 2008), estas secuencias disminuyen la expresión de genes mediante la interferencia en el ARNm. Se realizó una curva de dosis/respuesta de siRNA para el siCD10, obteniéndose una dosis óptima de 50 nM. Hay que tener en cuenta que 50 nM es la concentración total de siRNA con la que se transfecta. En esta cantidad tenemos las 4 secuencias de interferencia, por lo tanto, cada secuencia está a 12,5 nM. Se realizó también un curso temporal para comprobar el tiempo que duraba la interferencia, en la figura 18C aparece el fold change de la expresión del gen CD10 48 h tras la transfección de las diferentes concentraciones de siRNA. Para la transfección se usó Lipofectamina2000 (Life-Technologies-Invitrogen). En primer lugar, se diluyó cada mezcla de siRNA (siControl y siCD10) en OptiMEM suplementado con GlutaMAX (Gibco). Paralelamente se mezcló la cantidad adecuada de Lipofectamina®2000 y OptiMEM según el tipo de pocillo, ambas mezclas se incubaron durante 5 min a RT. Después se mezcló el siRNA y la Lipofectamina®2000 diluidos, añadiendo el siRNA diluido al vial con la Lipofectamina2000 diluida. Se homogeneizó todo y se incubó 20 min a RT. Dicha mezcla se añadió al pocillo con las células gota a gota y con cuidado. Las placas se incubaron a 37ºC durante 6 h, tras ese tiempo se les añadió medio completo en exceso (2,5 ml por pocillo) para diluir la mezcla. Este medio era sin antibiótico, ya que puede dañar a las células debido a los poros que abre la Lipofectamina®2000 en la membrana plasmática. Al día siguiente de la transfección se puede comprobar si el vector ha entrado a las células. Debido a que CD10 es una proteína de membrana hicimos experimentos esperando 48 horas para que se tradujera y se translocase a la membrana. Así mismo, en experimentos de formación de NS, que requieren un tiempo total más largo, se esperó sólo 24 h, ya que el efecto del siRNA tiene un tiempo limitado de unos 4 días. Después, 80 81 Resultados A. Análisis de expresión génica e identificación de CD10 como marcador de células indiferenciadas de cuerpo carotídeo Como ya se expuso en la Introducción, trabajos previos de análisis de expresión génica en nuestro grupo habían identificado a la proteína CD10 como altamente expresada por células progenitoras indiferenciadas del CB. En el presente trabajo de tesis doctoral nos propusimos analizar en detalle la naturaleza de las células positivas para CD10 en el CB, y el papel que esta proteína de membrana podría estar desempeñando en la fisiología del órgano. Para ello, necesitamos primero identificar anticuerpos que nos permitieran aislar y estudiar las células CD10+. 1. Detección y aislamiento de células CD10+ en el cuerpo carotídeo 1.1. Búsqueda de anticuerpos que reconozcan el marcador CD10 en CB de rata Teniendo en cuenta las proteínas de membrana que surgieron del análisis de expresión génica llevado a cabo en nuestro grupo (ver Introducción), se buscaron anticuerpos que detectaran estas proteínas y que pudieran utilizarse por citometría de flujo, para facilitar el aislamiento de las células positivas. Sólo se encontraron anticuerpos adecuados para dos proteínas de la lista; CD10 (R&D Systems) y Ramp3 (Santa Cruz Biotechnology). Estos anticuerpos fueron los únicos que cumplían lo requerido, es decir, reconocían el epítopo de rata y podían utilizarse para la técnica de FACS. Como se ha avanzado en la Introducción, CD10 está descrito en diversos tipos de células madre, aunque el papel de esta proteína en la biología de células madre es aún poco conocido (Maguer-Satta et al., 2011a). Por ello, su estudio presentaba un gran interés para nuestro grupo, y de hecho se convirtió en objetivo principal de la presente tesis doctoral. El papel de Ramp3 no está aún descrito en cuerpo carotídeo, sin embargo, el hecho de disponer de anticuerpos específicos para su estudio justificó el análisis preliminar de su expresión que se muestra a continuación. En primer lugar se verificó si los anticuerpos adquiridos reconocían células de rata, para lo que fueron testados en tejidos en los que está descrita la presencia de células positivas; en el caso de CD10 en riñón e hígado (Li et al., 1995) (Figura 8), y en 82 el caso de Ramp3 en médula ósea y tálamo (Nagae et al., 2000; Oliver et al., 2001) (Figura 9). La Figura 8 muestra el uso del anticuerpo anti-CD10 para detectar subpoblaciones celulares CD10+ en riñón y en hígado. Alrededor de un 20% de las células de riñón, y un 6% de las células de hígado, aparecen como positivas para el marcador (Figura 8A-B). Figura 8. Test del anticuerpo anti-CD10. A-C, Dot-plots representativos de la especificidad del anticuerpo secundario (Control Ac. 2ario; izquierda), y de la población de células positivas para CD10 detectada (CD10-PE; derecha) en células de: riñón (A), hígado (B), y neuroesferas de CB (C). La detección de una población de células CD10+ en neuroesferas sugiere que el anticuerpo está reconociendo progenitores de cuerpo carotídeo. 83 En ambos casos la población positiva detectada por citometría de flujo está claramente separada de la negativa, lo que indica que el anticuerpo anti-CD10 detecta células positivas de rata de forma correcta. En el caso de CD10, en esta primera prueba de expresión decidimos incluir también células de neuroesferas de CB, que están enriquecidas en células indiferenciadas. La figura 8C muestra que alrededor del 13% de estas células son positivas para CD10, lo que constituye un resultado preliminar interesante sobre la expresión de este marcador en progenitores del CB. Por otra parte, el anticuerpo anti-Ramp3 no detectó una población clara de células positivas en los tejidos control (Figura 9A-B), por lo que parece que el anticuerpo no reconoce correctamente células de rata. Por todo ello, decidimos centrarnos en CD10 como posible marcador de progenitores de CB, y procedimos a la caracterización de las células positivas para este marcador en el cuerpo carotídeo. Figura 9. Test del anticuerpo anti-RAMP3. A-B, Dot-plots representativos de la especificidad del anticuerpo secundario (Control Ac. 2ario; izquierda), y la población de células RAMP3+ detectada (RAMP-PE; derecha) en células de; tálamo (A) y médula ósea (B). Véase que el anticuerpo anti-Ramp3 detecta un porcentaje muy bajo de células positivas (0,46% en tálamo, y 0,31% en médula ósea), por ello concluimos que el anticuerpo no reconoce correctamente células de rata. 84 Todas las pruebas preliminares de citometría de flujo con los distintos anticuerpos se acompañaron de tinciones paralelas de las células con el anticuerpo secundario solo, es decir, con el fluoróforo que se utilizará con cada anticuerpo (Figuras 8 y 9). Este tipo de tinción define la unión inespecífica del anticuerpo secundario, y en todos los casos resultaron porcentajes de células muy marginales, lo que garantiza una detección correcta del marcador de membrana. 1.2. Detección de células CD10+ en cuerpo carotídeo mediante citometría de flujo Una vez comprobado el correcto funcionamiento del anticuerpo anti-CD10 en células de rata, se marcaron células dispersas de cuerpo carotídeo con dicho anticuerpo y se analizaron mediante la técnica de FACS (ver Apartado 5.1 de Materiales y Métodos) (Figura 10). Esta técnica utiliza anticuerpos específicos conjugados a fluoróforos detectables mediante láser, y es una de las técnicas de separación celular más sofisticadas y precisas que existen (Alberts et al., 2002). Para aislar las células de un tejido sólido es necesario romper la matriz extracelular que las mantiene unidas. El CB es un órgano cuyo parénquima posee un alto contenido en matriz extracelular, mayoritariamente compuesta por colágeno, y además es un tejido altamente irrigado, lo que complica la obtención de una suspensión de células únicas. Por todo ello, para la disrupción del CB es necesario utilizar enzimas proteolíticas que rompan la matriz, como la tripsina y la colagenasa, y también enzimas que disgreguen los vasos sanguíneos, como la elastasa. La dispersión enzimática, unida a la dispersión mecánica que se aplica en paralelo al tejido, hace que la membrana de las células del CB, y por ende las proteínas de membrana, puedan quedar dañadas. Es probable por tanto que con la técnica de citometría estemos subestimando la cantidad de células CD10+ presentes en el CB. En cualquier caso, las tinciones para citometría de flujo se acompañan siempre de una tinción con un marcador de viabilidad celular, en nuestro caso la actinomicina (7-AAD). Los días que por alguna razón, el porcentaje de células dañadas 7-AAD+ es excesivamente elevado, la preparación no se incluía en el estudio. Para mejorar la dispersión de los tejidos se puede usar también el ácido etildiaminotetraacético (EDTA), un agente quelante de iones Ca2+. Estos iones son importantes para las uniones célula-célula, por lo que al retirarlos se favorece la disgregación celular. Sin embargo, el EDTA es un inhibidor de CD10, por lo que su uso se ha excluido en estos experimentos. 85 La Figura 10 muestra un típico análisis por citometría de flujo de células dispersas de CB, teñidas con el anticuerpo anti-CD10 conjugado al fluoróforo ficoeritrina (PE, del inglés Phycoerythrin). Aproximadamente el 20% de las células de CB son positivas para el marcador (Figura 10A, derecha). El porcentaje de positividad debe ser corregido restándole el porcentaje de células que aparecen positivas en el control del anticuerpo secundario (Figura 10A, izquierda), aunque en este caso, ese porcentaje de no especificidad es prácticamente despreciable. El gráfico de barras de la figura 10B muestra la media de células positivas para CD10, obtenida a partir de 9 preparaciones independientes de CB llevadas a cabo en distintos días. La reducida desviación estándar del porcentaje obtenido, 19,65±1,37%, denota la robustez de la preparación y de la tinción, y la repetitividad de la cantidad de células CD10+ presentes en el órgano. A continuación, se estudió con detalle la población celular CD10+. En primer lugar se comprobó si las células CD10+ proceden del linaje de la célula madre de CB mediante estudios de seguimiento del linaje celular, y también mediante estudios de coexpresión de CD10 con otros marcadores moleculares descritos en CB como pertenecientes al linaje germinal de la CBSC (GFAP, Nestina, SMA, TH, GSA I, CD31, etc.). También se procedió a analizar la posible existencia de células progenitoras dentro de la población de células CD10+ aislada por citometría, así como las características de estas células. Figura 10 . Análisis de células CD10+ de CB mediante citometría de flujo. A, Dot-plots representativos en los que se muestra la especificidad del anticuerpo secundario (Control Ac. 2ario, izquierda) y las poblaciones celulares CD10+ y CD10- (derecha) de cuerpo carotídeo. B, Cuantificación de células CD10+ analizadas mediante citometría de flujo en CB recién disperso (n=9). Este análisis nos confirma el correcto funcionamiento del anticuerpo anti-CD10 y la existencia de una población notable de células CD10+ (en torno a un 20%) en cuerpo carotídeo. Las barras de error indican SEM (del inglés Standard Error of the Mean, es decir, la desviación o error estándar de la media). 86 2. Caracterización de las células CD10+ de cuerpo carotídeo 2.1. Inmunodetección de células CD10+ in vivo La inmunodetección de la población celular CD10+ se llevó a cabo en secciones de bifurcación carotídea de rata mediante tinción inmunohistoquímica. Al contrario que con la técnica de citometría de flujo, con la tinción inmunohistoquímica podemos ver in situ la expresión del marcador en tejido intacto, sin necesidad de disgregación mecánica o enzimática. La Figura 11 muestra imágenes representativas de inmunohistoquímica de cuerpo carotídeo en las que se puede observar que la tinción con anticuerpo anti-CD10 en tejido es de tipo filamentosa. En la figura 11A vemos una sección de CB que ha sido marcada únicamente con un anticuerpo secundario Alexa-568 IgG. En esta imagen no aparece ninguna célula positiva para el marcaje de CD10, lo que indica que el anticuerpo secundario no se une inespecíficamente al tejido. Este dato confirma la especificidad del anticuerpo utilizado en la inmunohistoquímica. En la figura 11B-C se muestran imágenes de inmunohistoquímica de bifurcación carotídea teñidas con anticuerpo primario anti-CD10. Como podemos ver, las células CD10+ están extendidas por todo el parénquima del CB, y se encuentran principalmente asociadas a los vasos sanguíneos. La figura 11C muestra una ampliación de la figura 11B en la que podemos observar células positivas para CD10 que forman parte de la pared celular de las arterias (señaladas por las puntas de flecha). A veces los anticuerpos secundarios se unen inespecíficamente a las células vasculares, pero en este caso la señal observada en la figura 11B no aparece en la inmunohistoquímica realizada sólo con el anticuerpo secundario (Figura 11A), lo que indica que es una señal específica. La pared celular de las arterias es una zona característica de células endoteliales y de células de músculo liso. La localización de las células CD10+ sugiere que existe una asociación entre estas y los vasos sanguíneos, y que probablemente una gran proporción de las células positivas para CD10 forman parte del tejido mesectodérmico del CB. 87 2.2. Identificación de las células CD10+ dentro del linaje germinal del CB En primer lugar, se comprobó si la población de células CD10+ pertenece al linaje de las células madre del CB mediante técnicas de trazado del linaje celular (en inglés cell-fate mapping). El trazado del linaje celular se llevó a cabo con el ratón transgénico B6 GFAP-cre/R26R (floxed LacZ). Este ratón transgénico ha sido utilizado en nuestro Figura 11. Detección de células CD10+ in vivo en cuerpo carotídeo. A, Inmunohistoquímica control de bifurcación carotídea, sólo con el marcaje del anticuerpo secundario (Alexa-568 anti-cabra), utilizado para detectar al anticuerpo primario anti-CD10 en (B y C). La ausencia de marcaje en (A) indica que el anticuerpo secundario detecta específicamente las células CD10+. B, Imágenes representativitas de inmunohistoquímicas de CD10 en bifurcación carotídea. C, Ampliación del área encuadrada en (C). Las puntas de flecha señalan células CD10+ asociadas a los vasos sanguíneos. Escalas, 50 µm en (A y B), y 10 µm en (C). 88 grupo anteriormente (Annese et al., en revisión; Pardal et al., 2007) para hacer un seguimiento de la diferenciación de las CBSCs hacia ambos linajes neuronal y mesectodérmico. En la figura 12A podemos ver un diagrama de las construcciones genéticas que posee este ratón, las cuales proceden del cruce de dos ratones: ratón GFAP-CRE y ratón R26R. El diagrama muestra también el funcionamiento del sistema Cre-LoxP, cuyo uso está muy extendido para estudios de expresión específica de tejidos. El gen LacZ actúa como gen reportero, y el promotor de la recombinasa cre determinará el tejido que quedará marcado. La secuencia genómica situada entre los dos sitios loxP será escindida por medio de la recombinación que efectúa la recombinasa, que en este ratón, estará disponible únicamente en las células que expresen o hayan expresado alguna vez el gen gfap. El gen LacZ codifica la proteína β-galactosidasa (βgal), enzima que degrada el X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido), un compuesto orgánico con un grupo indol enlazado covalentemente a un galactósido. El X-gal se utiliza en técnicas de seguimiento del linaje celular y se añade a las células al realizar la inmunocitoquímica. Las células que posean la enzima β-galactosidasa degradan el X-gal y, como consecuencia, se forma un precipitado azul observable en campo claro por microscopía óptica convencional. De esta manera, las células de CB que expresan o han expresado alguna vez el gen gfap quedan marcadas. La técnica nos permite localizar células GFAP+, y también células que hayan derivado de estas, aunque ya no expresen la GFAP, dado que el evento de recombinación de la cre es irreversible. La parte superior de la figura 12B muestra una inmunohistoquímica de una célula CD10+ que es además positiva para X-gal. El precipitado azul que aparece en esta célula indica que es positiva para la expresión de LacZ, y que por tanto se trata de una célula CD10+ que proviene del linaje de las CBSCs, que deriva de una célula GFAP+. La figura 12B inferior muestra una inmunohistoquímica representativa de una célula de CB marcada con el anticuerpo anti-CD10 y con el anticuerpo anti-β-galactosidasa (Novus Biologicals). Esta célula es CD10+ y β-galactosidasa+, lo que confirma que las células CD10+ derivan de las células madre del CB. 89 Tras confirmar que la población de células CD10+ deriva de las células madre del CB, se llevó a cabo un estudio inmunocitoquímico con células CD10+ para comprobar la co-expresión de CD10 con otros marcadores que también pertenecen al linaje de las CBSCs, como son GFAP, Nestina o SMA. Nuestra experiencia previa con inmunohistoquímica para detectar CD10 (Figura 11), para lo cual hubo incluso que poner a punto un protocolo de tinción diferente al protocolo que se utiliza para otros marcadores en este tejido, nos convenció de no utilizar esta técnica para los estudios de co-expresión. Por este motivo, el análisis de co-expresión de CD10 con marcadores del linaje de las CBSCs se realizó mediante inmunocitoquímica ex vivo, con células de cuerpo carotídeo recién disperso (ver apartados 4.3 y 5.1 de Materiales y Métodos). La figura 13A muestra imágenes representativas de la inmunocitoquímica realizada para detectar la expresión de GFAP, Nestina, SMA o TH, en combinación con CD10. Como vemos en la figura 13B, aproximadamente un 25% de las células CD10+ co-expresan GFAP (24,8±7,8%). La figura 13C nos muestra que esta cantidad supone el 37,0±16,8% dentro de la población total de células GFAP+ de cuerpo carotídeo. La figura 13A muestra también una célula CD10+ que co-expresa Nestina, un marcador de progenitor neural. En las cuantificaciones de la figura 13B vemos que el 6,3±1,0% de células CD10+ son Nestina+. El estudio inmunocitoquímico revela por tanto que existe una subpoblación de células CD10+ que co-expresa GFAP, y/o Nestina. Estos resultados Figura 12. Análisis del linaje celular de las CBSCs que dan lugar a células CD10+. A, Diagrama de las construcciones genéticas que posee el ratón GFAP-cre/ROSA26, las cuales proceden del cruce de dos ratones: ratón GFAP-cre y ratón R26R. Adaptado de Pardal et al. 2007. B, Inmunocitoquímica de células CD10+ de CB de dicho ratón marcadas con X-gal (arriba) o β-galactosidasa (abajo). El montaje muestra la combinación de las imágenes de DAPI, CD10, y X-gal o β-gal. Escalas, 10 µm. 96 diferenciarse hacia células neuronales TH+, aunque este último aspecto ha sido estudiado con más detalle y será expuesto a continuación. 2. Diferenciación de los progenitores CD10+ Tras analizar la presencia de progenitores CD10+ procedimos a estudiar la multipotencia de estos progenitores. La Figura 15 muestra el estudio del grado y el tipo de diferenciación (neuronal o mesectodérmica) de los progenitores CD10+. Como hemos descrito anteriormente, los progenitores de cuerpo carotídeo tienen la capacidad de proliferar y diferenciarse in vitro e in vivo hacia células dopaminérgicas positivas para la tirosina hidroxilasa (TH), pero también hacia células de músculo liso (SMA positivas) (Pardal et al., 2007), o hacia células endoteliales (positivas para GSA I) (Annese et al., en revisión). La figura 15A muestra imágenes de inmunohistoquímica de secciones de NS con anticuerpos frente a tirosina hidroxilasa y Nestina. Se cuantificaron las células positivas para TH en las NS de células CD10- y CD10+ (Figura 15C), y se vio que el porcentaje de células dopaminérgicas TH+ presentes en las NS de células CD10+ (0,95±0,86%) es significativamente menor al porcentaje presente en las NS de células CD10- (38,36±9,92%; p≤0,05). Este resultado confirma la observación inicial que se había hecho en las imágenes de campo claro (Figura 14E-F), e indica que los progenitores CD10+ no tienen capacidad de diferenciarse hacia células de tipo neuronal. Tras confirmar la ausencia de diferenciación neuronal en los progenitores CD10+, se comprobó la capacidad de diferenciación de estos progenitores hacia el linaje mesectodérmico. La figura 15B muestra imágenes de inmunocitoquímica, con anticuerpos frente a α-SMA y GSA I (lectina), en células de NS cultivadas en sustrato adherente. La cuantificación de las células positivas para cada marcador, y para ambos juntos (α-SMA+ GSA I+), mostró que los progenitores CD10+ tienen capacidad de diferenciarse hacia células de músculo liso, y hacia células endoteliales (Figura 15D-F). En la figura 15D podemos ver que existe una diferencia no significativa en el porcentaje de células GSA I+ presente en ambos tipos de NS, siendo este porcentaje superior en las obtenidas a partir de progenitores CD10+. Por ello, concluimos que los progenitores 97 tanto CD10- como CD10+ tienen la capacidad de diferenciarse in vitro hacia el linaje mesectodérmico, aunque sólo los CD10- lo hacen hacia el linaje neuronal. Puede que los progenitores CD10+ posean una capacidad incrementada de diferenciación mesectodérmica, aunque este aspecto no se refleje en los resultados quizás debido a que el sustrato adherente constituye un fuerte estímulo para este tipo de diferenciación, lo que enmascararía una posible diferencia entre las células positivas y negativas para CD10. Figura 15. Análisis de diferenciación de progenitores CD10+. A, Inmunohistoquímica de secciones de NS marcadas con anticuerpos frente a Nestina (verde) y TH (rojo). B, Imagen de inmunocitoquímica de NS sembradas en sustrato adherente (fibronectina 5µg/ml) durante 12 h, marcadas con GSA I (verde) y anticuerpo frente a SMA (rojo). C, Cuantificación de células TH+ detectadas mediante inmunohistoquímica en NS de progenitores CD10- y CD10+ mostradas en (A). D-F, Cuantificación de células positivas para GSA I (D), SMA (E) y dobles SMA+ GSA I+ (F) en NS de células CD10- y CD10+ mostradas en (B). Escalas, 30 µm en (A) y 50 µm en (B). * p≤0,05. Test T de Student. 98 En resumen, el análisis de diferenciación nos indica que los progenitores CD10+ no son multipotentes, sino que están restringidos o especificados hacia el linaje mesectodérmico de las células madre del cuerpo carotídeo. 3. Línea primaria de cuerpo carotídeo CBA, enriquecida en células CD10+. El número aproximado de células que posee un CB de rata adulta es de 30.000- 60.000, y esta cantidad normalmente resulta insuficiente para llevar a cabo determinadas técnicas de biología molecular y celular como el Western-Blot, o la transfección de siRNAs. Al estar el presente trabajo de tesis doctoral centrado en el estudio de lo que parecen ser progenitores restringidos de linaje mesectodérmico, y ser este un linaje con apetencia por el sustrato adherente, se nos ocurrió que podríamos amplificar el número de células progenitoras mesectodérmicas mediante el cultivo adherente de células del CB. Para conseguir esta amplificación se cultivaron células dispersas de CB en medio completo, 21% de O2 (ver Apartado 3.4 de Materiales y Métodos), y sobre un sustrato tratado para la adherencia celular. Estas células se mantuvieron durante varios días a modo de línea celular, a la que se denominó “línea CBA” (del inglés Carotid Body Adherent) (Figura 16). Los paneles A-A’’ de la Figura 16 muestran imágenes de campo claro del cultivo celular de la línea CBA a distintos tiempos. Tras 3 días in vitro (3DIV), las células de CB disperso que se adhieren a la placa comienzan a dividirse (Figura 16A). Estas observaciones indican que hay unidades formadoras de colonias adherentes entre las células de CB. Probablemente estas células incluyan a los progenitores mesectodérmicos, que al cultivarse en sustrato adherente, se adhieren y proliferan. Transcurridos de 7-10 días in vitro, las células llegan a confluencia, ocupando toda la superficie del frasco (Figura 16A’’). Dependiendo del número de células sembrado inicialmente, que osciló entre 60.000 y 100.000 células/frasco, la línea tardó entre 7 y 10 días en llegar a confluencia, aunque tras ese tiempo el número de células podía seguir aumentando. Por tanto, a partir de los dos cuerpos carotídeos de un único animal se puede establecer una línea celular adherente, que nos permite incrementar el número de células con fenotipo mesectodérmico exponencialmente. 99 Para caracterizar esta línea de CB se analizaron las células mediante inmunocitoquímica y citometría de flujo (Figura 16B-F). La figura 16B muestra imágenes de inmunocitoquímica donde puede observarse que la mayoría de las células de la línea son positivas para CD10 , y más de un 25% para Nestina. A continuación, se llevó a cabo una cuantificación detallada de la expresión, por citometría de flujo, de distintos marcadores en estas células de la línea CBA (Figura 16C). En primer lugar, se corroboró que la mayoría de las células son positivas para CD10 (82,50±2,37%). También se estudió la proporción de progenitores que había en el cultivo adherente, utilizando para ello el marcador Nestina. Un 26,83±6,03% de las células resultaron ser Nestina+. Para ver si las condiciones del cultivo adherente permitían la supervivencia de células neuronales, se analizaron también las poblaciones positivas para TH y para HNK-1, también llamado CD56, que ha descrito en nuestro grupo como marcador de una subpoblación de células neuronales. Los porcentajes obtenidos (0,2% de células TH+ y 0,87±0,07% de células HNK+) fueron discretos, señalando la práctica ausencia de células neuronales en este tipo de cultivos. Asimismo, se comprobó si las células de la línea CBA se estaban diferenciando hacia endotelio, para lo que se utilizó CD31 como marcador de endotelio maduro. Únicamente el 1,85±0,75% de las células expresaba CD31, por lo que la presencia de células endoteliales maduras es también bastante discreta. Para estudiar cómo variaba el fenotipo de la línea adherente con el tiempo en cultivo, se analizaron las células durante los tres primeros pases mediante citometría de flujo. En la figura 16D-F podemos ver la cuantificación de las poblaciones CD10+, Nestina+ y HNK+ a lo largo de los tres primeros pases. Todas ellas se mantienen en proporciones similares durante los tres primeros pases. Sólo se produce un cambio significativo en el porcentaje de células Nestina+ del primer al segundo pase (Figura 16E), aunque vuelve a ser no significativo en el siguiente pase. Por otro lado, decidimos estudiar la capacidad de formación de NS de las células de la línea adherente, de nuevo durante los tres primeros pases. La figura 16G muestra una típica imagen de campo claro de NS formadas a partir de células de la línea adherente. Estos resultados indican que, al menos durante los tres primeros pases, en la línea CBA persisten células con capacidad de formar NS (Figura 16G-H). La figura 16H muestra la eficiencia de formación de NS de dichas células, la cual se mantiene sin cambios significativos durante estos tres primeros pases. Este resultado de la eficiencia indica que la proporción de progenitores parece mantenerse constante, pese a las 100 pequeñas variaciones que puedan observarse en la expresión de Nestina. Aunque al comparar el porcentaje de expresión de Nestina con la eficiencia de formación de NS se puede concluir que el marcador Nestina no es ni mucho menos específico de progenitores neurales formadores de esferas. El diámetro medio de las NS también se mantiene constante (Figura 16I). La mayoría de las NS formadas a partir de progenitores de la línea CBA están desprovistas de blebs (Figura 16G), al igual que ocurría con las NS formadas a partir de células CD10+ de CB disperso. Tomando en conjunto todos estos resultados, podemos concluir que el cultivo de células de CB en sustrato adherente favorece un enriquecimiento en el linaje mesectodérmico, incluyendo la presencia de una población de progenitores, restringidos para este linaje, y capaces de formar NS in vitro. Figura 16. Caracterización de la línea adherente CBA. A-A’’, Imágenes de campo claro de células de la línea CBA, cultivada durante 3 (A); 5 (A’) y 7 DIV (A’’). B, Imágenes de inmunocitoquímica frente a CD10 (arriba, rojo) y Nestina (abajo, verde) en células de la línea CBA (de 10 DIV). C, Caracterización de la línea primaria CBA en pase inicial mediante citometría de flujo, se muestra la cuantificación de células CD10+, Nestina+, CD31+, HNK+ y TH+. D-F, Cuantificación de células CD10+ (D), nestina+ (E) y HNK+ (F) en los tres primeros pases. G, Imágenes de campo claro de NS formadas a partir de células de la línea CBA. H, Eficiencia de formación de NS de los progenitores presentes en la línea CBA en los pases 0; 1 y 2. I, Diámetro medio de las NS cuantificadas en (H). Escalas, 50 µm en (A-A’’), 30 µm en (B) y 100 µm en (G). * p≤0,05. Test T de Student. 101 En la Figura 17 hemos querido mostrar una comparación entre las NS obtenidas a partir de células dispersas del CB, NS obtenidas de la línea CBA, y NS obtenidas de células CD10+ aisladas por citometría de flujo a partir de CB disperso. El número de NS formadas a partir de células de la línea primaria es similar al obtenido en el ensayo de NS con células de CB completo (Figura 17D), pero mucho menor al obtenido a partir de células CD10+ de CB recién disperso. Las células positivas para CD10 tienen una eficiencia de formación de NS (1,80±0,19%) seis veces mayor que la de las células de CB disperso (0,31±0,03%), o que la de células de la línea (0,21±0,03% en P0; 0,26±0,05% en P1; 0,25±0,05% en P2). Este resultado significa que en la línea CBA hay una alta presencia de células CD10+ no progenitoras (parcialmente diferenciadas hacia células mesectodérmicas), lo que provoca que la proporción de células CD10+ capaces de formar NS sea menor y muy parecida al caso del tejido in situ, pese a la alta expresión de CD10 en las células de la línea. El diámetro medio de las NS obtenidas de la línea adherente, de forma similar a lo que ocurre con las NS obtenidas de células CD10+ recién dispersas, es significativamente mayor al diámetro de NS obtenidas a partir de células de CB completo (Figura 17E). Este resultado es coherente con las diferencias observadas en la presencia de blebs entre estas NS (Figura 17 A-C), y confirman que el cultivo en adherente está seleccionando progenitores restringidos al linaje mesectodérmico, muy probablemente similares a los progenitores CD10+ obtenidos directamente del órgano. En definitiva, la línea celular adherente de CB nos permite aumentar exponencialmente el número de células, y sobre todo es una técnica que favorece un enriquecimiento en el linaje mesectodérmico del CB. El cultivo de la línea adherente CBA podría suponer por tanto un método útil para conseguir mayores biomasas de células mesectodérmicas del CB, con las que llevar a cabo algunas de las técnicas de biología molecular y celular que se han utilizado en este trabajo de tesis doctoral. 102 Figura 17. Comparación entre las neuroesferas obtenidas de células dispersas de CB, NS de células de la línea adherente CBA, y NS de células CD10+ separadas por citometría de flujo. A-C, Imágenes representativas de campo claro de las diferentes NS: NS formadas a partir de células de CB disperso (A), NS de células de la línea celular CBA (B), y NS a formadas a partir de células CD10+ separadas por citometría de flujo (C). D, Eficiencia de formación de los distintos tipos de NS mostradas en (A, B y C). E, Diámetro medio de cada uno de los tipos de NS cuantificadas en (D). Escala, 100 µm. 103 C. Los progenitores CD10+ se activan ante un estímulo hipóxico Los datos presentados hasta el momento, sobre el análisis de co-expresión y el estudio de los progenitores CD10+, muestran que CD10 marca una población de células del linaje mesectodérmico del CB. A continuación, quisimos investigar qué función tenía la proteína CD10 en este nicho, y por tanto qué papel están jugando las células positivas para este marcador. CD10 es una endopeptidasa de membrana con dos mecanismos de acción, llevados a cabo por el dominio catalítico y por el dominio intracelular que posee esta proteína (ver figura 7D, en el apartado 5.1 Introducción). El dominio catalítico se encarga de degradar una gran variedad de péptidos extracelulares señalizadores, insensibilizando a las células a estas señales. Esta acción es clave para el mantenimiento del estado de célula madre (“stemness” en inglés) en nichos germinales tales como el tejido mamario (Bachelard-Cascales et al., 2010), y está siendo investigada en la actualidad también en otros nichos. En paralelo a esta actividad enzimática, el dominio intracelular de la proteína CD10 interviene en procesos de señalización a través de la interacción con PTEN, que media diversos procesos celulares, tales como proliferación, migración, diferenciación endotelial o angiogénesis (Maguer-Satta et al., 2011a). Para examinar el papel de la proteína CD10 presente en los progenitores CD10+, se anuló su actividad endopeptidasa, o se disminuyó la expresión de la proteína completa mediante siRNAs. La supresión de la actividad enzimática se realizó mediante el inhibidor de CD10 Tiorfan (Thiorphan o ±-3-mercapto-2-benzilpropanoilglicina; Figura 18A) (10µM, Sigma) (Roques et al., 1980). Éste es un inhibidor selectivo con una alta afinidad por el sitio activo de CD10, concretamente por el átomo de zinc que contiene esta proteína (David et al., 1999). La figura 18B muestra un diagrama de la unión de Tiorfan al sitio activo de neprilisina, una posición en la que impide que los sustratos se unan al sitio activo y sean degradados. Como consecuencia de esta inhibición, la concentración extracelular de los sustratos de CD10 aumenta, y como resultado sus efectos sobre las células serán mayores. 104 Asimismo se examinó el papel de CD10 mediante silenciamiento génico; disminuyendo la expresión de la proteína mediante la interferencia de la traducción de su mRNA. Estos ensayos se realizaron mediante transfección de oligonucleótidos de siRNA específicos para el gen Mme de rata. Para el diseño de los siRNAs se utilizaron secuencias que habían sido testadas anteriormente (Tong et al., 2008). Con este método de supresión se verán reducidos ambos mecanismos de acción de la proteína CD10, el catalítico externo y el de señalización interna. Antes de llevar a cabo el experimento de silenciamiento génico, se realizó una curva dosis-respuesta con tres concentraciones crecientes de siRNAs (25, 50, y 100nM). Se utilizó como control una mezcla de 4 oligonucleótidos de siRNA diseñados y testados para obtener la mínima interacción con el mRNA de rata, por lo que sólo causarían daños celulares propios de la transfección, debidos en parte a la Lipofectamina (Invitrogen). En la figura 18C se muestra un gráfico que representa los cambios (fold change) en la expresión de CD10, 48 horas después de la transfección con las diferentes concentraciones de siRNAs. De las tres concentraciones probadas, se seleccionó 50nM, ya que era la que más disminuía la expresión del gen CD10 sin provocar daños significativos por parte de los siRNAs Figura 18. Puesta a punto de la inhibición farmacológica y genética de CD10. A, Estructura molecular de Tiorfan. B, Modelo de unión de Tiorfan al sitio activo de CD10. C, Curva dosis respuesta de la expresión de CD10, cuantificada mediante qPCR 48h post-transfección con siRNAs a distintas concentraciones. Se seleccionó 50nM porque provocó la bajada de expresión más significativa afectando lo mínimo a las células. D, Western-blot de CD10 de las muestras transfectadas con siRNAs Control y CD10 (50nM). La α-Tubulina ha sido utilizada como control de carga. E, Cuantificaciones densitométricas de la proteína CD10 en presencia de siCD10 a distintas concentraciones. ST: Sin transfectar. * p≤0,05. Test T de Student. 105 control. Utilizando las secuencias de siCD10 a 100nM disminuye la expresión significativamente (Figura 18C), pero la transfección de siControl a 100nM también disminuye la expresión, lo que significa que la disminución observada con siCD10 podría ser no específica. También se comprobaron los niveles de proteína en las muestras transfectadas con siRNAs de CD10 mediante Western-Blot. En la figura 18D podemos observar la disminución de la intensidad de la banda correspondiente a la proteína CD10 que provoca la transfección con siCD10 a 50nM. Aunque ninguna de las concentraciones de siRNA provocó un cambio estadísticamente significativo a nivel de proteína, la diminución más acusada se produjo con la concentración de 50nM (Figura 18E). 1. CD10 controla la proliferación de los progenitores CD10+ En primer lugar, en el estudio funcional del papel de CD10 se analizó la proliferación de los progenitores CD10+, para lo cual se estudió la eficiencia de formación de NS y el diámetro de las mismas. La Figura 19 muestra las diferencias entre los progenitores tratados con el inhibidor Tiorfan (10µM) y los no tratados, o entre los progenitores transfectados con siCD10 y los transfectados con siControl. En ambos casos se observa un aumento estadísticamente significativo en la eficiencia de formación de NS formadas a partir de células CD10+ (Figuras 19B y 19G). Estos resultados sugieren que una de las funciones de CD10 sería mantener a los progenitores mesectodérmicos en estado de reposo, probablemente insensibilizándolos frente a péptidos mitogénicos presentes en el medio, tales como FGF-2 o ET-1. Esta función de CD10 ha sido descrita en otros tejidos del organismo (Goodman et al., 2006; Karoor et al., 2013). La inhibición por tanto de la actividad catalítica externa de CD10, ya sea mediante Tiorfan o con siRNAs, evita que CD10 degrade péptidos pro-proliferativos, por lo que las células se sensibilizan y proliferan más, dando lugar a más neuroesferas. Por otro lado, los progenitores CD10- no ven modificada ni su eficiencia de formación de NS ni el diámetro de las NS que generan tras la aplicación de Tiorfan (Figura 19B- C). Este hecho muestra la especificidad del inhibidor utilizado, que parece afectar únicamente a los progenitores CD10+. La figura 19C muestra la cuantificación del diámetro medio de las NS obtenidas a partir de células CD10- y CD10+ tratadas o no con Tiorfan, y puede observarse que no 112 La exposición del CB a hipoxia durante 2 días aún no provoca el característico aumento del tamaño del órgano que se observa posteriormente (Pardal et al., 2007). Sin embargo, tras sólo dos días ya se observa una bajada significativa del número de células CD10+ in vivo. Nuestro resultados sugieren que esta disminución de la expresión de CD10 en los progenitores mesectodérmicos, que se encuentran en estado latente en condiciones de normoxia, podría sensibilizarlos a citoquinas presentes en el nicho, provocar su activación proliferativa, y finalmente su maduración hacia células vasculares, contribuyendo así a la angiogénesis que ocurre en el órgano durante un estímulo hipóxico mantenido. Esta progresión del linaje mesectodérmico en el CB requiere de una comunicación estrecha entre las células vasculares y los progenitores del CB, posiblemente a través de la liberación de péptidos señalizadores durante el estímulo hipóxico. Uno de los péptidos candidato para esta comunicación es la endotelina-1 (ET-1), liberada por las células vasculares en los nichos neurogénicos del sistema nervioso (Pardal y Platero-Luengo, 2011; Ramírez-Castillejo et al., 2006; Shen et al., 2008), y también por las células glómicas en el caso del CB (Platero-Luengo, 2014b; Platero-Luengo et al., 2014a). Dado que la ET-1 es uno de los principales sustratos de CD10, se estudió a continuación si esta citoquina tenía un papel en la activación de los progenitores CD10+ del CB durante la hipoxia. 113 D. CD10 como mediador del efecto de la endotelina-1 en los progenitores de CB 1. La ET-1 provoca un aumento en la proporción de células CD10+ La endotelina-1 es un péptido pro-angiogénico liberado durante la hipoxia en el nicho del CB (Chen et al., 2007a; Platero-Luengo et al., 2014a). Además, es uno de los principales sustratos de CD10 (Dempsey et al., 2009; Karoor et al., 2013). En primer lugar, quisimos analizar el efecto que producía la ET-1 en la población CD10+ del CB. Se realizaron cultivos de NS, tratadas o no con esta citoquina, y se analizaron mediante FACS y PCR cuantitativa (Figura 21A-D). En la figura 21A podemos ver imágenes de campo claro de las NS tratadas con ET-1 (0,01 µM), junto a NS no tratadas o NS control. De acuerdo con el papel pro-proliferativo de la ET-1 sobre las CBSCs (Platero- Luengo, 2014b), se obtuvieron más NS y de mayor tamaño al añadir esta citoquina al medio de cultivo. Los resultados del análisis genético mediante qPCR confirmaron que ET-1 aumenta la expresión de CD10 in vitro (Figura 21B). A continuación, se comprobó mediante citometría de flujo el porcentaje de células CD10+ en las NS tratadas versus las NS control (Figura 21C). La cuantificación de estos ensayos se muestra en la figura 21D, en la que vemos un aumento estadísticamente significativo del número de células CD10+ en las NS tratadas con ET-1 (26,2±3,3%) con respecto a las NS control (15,4±2,7%) (p<0,001). De nuevo en concordancia con el efecto inductor de la ET-1 sobre la proliferación de los progenitores multipotentes del CB (Platero- Luengo et al., 2014a), las NS tratadas con la citoquina daban lugar a un mayor número de NS secundarias tras su disociación y re-siembra (Figura 21E-G). 114 2. La ET-1 promueve el linaje mesectodérmico del CB Adicionalmente a su acción pro-proliferativa sobre las CBSCs (Platero-Luengo et al., 2014a), la ET-1 induce angiogénesis en el CB (Chen et al., 2007a). El aumento observado en los niveles de CD10, un marcador que, como acabamos de exponer, es específico del linaje mesectodérmico del CB, podría ser compatible con que la ET-1 Figura 21. Efecto de la ET-1 en células CD10+ del CB. A, Imágenes de campo claro representativas de neuroesferas control (sin ET-1; izquierda) y neuroesferas tratadas con ET-1 (derecha). B, Niveles de expresión de CD10 obtenidos mediante qPCR en NS control y NS tratadas con ET-1. C, Dot-plots representativos de células de NS control (izquierda) y NS tratadas con ET-1 (derecha). D, Porcentaje de células CD10+ cuantificadas mediante FACS. E, Esquema explicativo de la realización de los experimentos de neuroesferas secundarias (Control y ET-1). Las NS primarias se cultivaron con o sin ET-1 durante 10 DIV, posteriormente las NS fueron dispersadas y re-sembradas de nuevo en medio completo (ambas NS secundarias sin añadir ET-1), durante 7 DIV. F, Imágenes de campo claro representativas de NS secundarias formadas a partir de progenitores de NS primarias control y tratadas con ET-1, obtenidas tal y como se explica en (E). G, Cuantificación de la eficiencia de formación de NS secundarias de los progenitores de NS (primarias) control y tratadas con ET-1, mostradas en (F). * p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001. Escala, 100 µm. 115 estuviese promoviendo la diferenciación de las CBSCs hacia este linaje. Para corroborar esta hipótesis, analizamos el grado de diferenciación que producía la ET-1 in vitro, mediante inmunohistoquímica frente al marcador endotelial lectina (GSA I) y frente a CD10, en secciones de neuroesferas (Figura 22A). La figura 22B muestra la cuantificación del área positiva para GSA I, donde podemos observar que no hay diferencias significativas entre las NS control y las NS tratadas con endotelina. No obstante, la cuantificación del área CD10+ en las NS tratadas con ET-1 sí muestra un aumento estadísticamente significativo (Figura 22C), confirmando el aumento de células CD10+ observado mediante citometría. A continuación, analizamos la capacidad de diferenciación de las CBSCs mediante ensayo de diferenciación mesectodérmica en adherente. En la figura 22D podemos ver células procedentes de NS control o de NS tratadas con ET-1, y teñidas con anticuerpos frente a SMA y GSA I. Se cuantificó la proporción de células diferenciadas GSA I+ o SMA+, pero no se observaron diferencias significativas en la frecuencia de células endoteliales GSA I+ (Figura 22E), ni en la frecuencia de células de músculo liso SMA+ (Figura 22F). Estos resultados podrían deberse a que el sustrato adherente es un estímulo extremadamente eficiente para inducir la diferenciación mesectodérmica, lo que ha provocado que esta diferenciación sea similar en ambas condiciones. Además de la diferenciación en sustrato adherente, se analizó también la presencia de progenitores indiferenciados en las NS mediante el ensayo de formación de NS secundarias (Figura 21G-H). Se aislaron mediante citometría de flujo los progenitores CD10- y CD10+ de NS tratadas o no con ET-1. La figura 21G muestra dos dot-plots representativos de las poblaciones que fueron dispersadas a partir de NS primarias, y sembradas en cultivo. En la figura 21H podemos ver una cuantificación de la eficiencia de formación de NS secundarias. En el caso de las NS control, vemos que hay un aumento estadísticamente significativo de la formación de NS secundarias cuando sembramos las células CD10+, de manera similar a lo que ocurre en las células CD10+ aisladas de cuerpo carotídeo disperso (ver Figura 14C). Sin embargo, en el caso de las NS tratadas con ET-1, las células CD10+ no tienen una eficiencia de formación de NS mayor que las CD10-. Aunque de manera no significativa, las células CD10- procedentes de NS tratadas con ET-1 sí aumentan su eficiencia de formación de NS 2arias. Los progenitores CD10- y CD10+ aislados de las NS tratadas con ET-1 poseen una capacidad proliferativa similar, sugiriendo que esta citoquina promueve la proliferación 116 de las células madre de CB en general, pero además induce la progresión a través del linaje mesectodérmico. Aunque no hemos observado un aumento significativo en el número de células endoteliales, la ET-1 aumenta la cantidad de células CD10+, pero no la formación de NS secundarias, por lo que estas células CD10+ están inmersas en diferenciación mesectodérmica. En conclusión, los datos sugieren que esta citoquina podría estar promoviendo la diferenciación de las CBSCs hacia este tipo de linaje mesectodérmico, además de la activación y maduración de los progenitores restringidos hacia ese linaje. Figura 22 . Efecto de la ET-1 en la diferenciación mesectodérmica de las CBSCs. A, Imágenes representativas de inmunohistoquímica de secciones de NS control y de NS tratadas con ET-1, mostrando las células marcadas con GSA I (verde), y anti-CD10 (rojo). B-C, Cuantificaciones del porcentaje del área positiva para GSA I (B) y CD10 (C) en las NS mostradas en (A). D, Imágenes representativas de inmunocitoquímica de progenitores procedentes de NS control y NS ET-1, sembradas en sustrato adherente, y sometidas a tinción frente a GSA I (verde) y anti-SMA (rojo). E-F, Cuantificaciones de células GSA I+ (E) y SMA+ (F) de las inmunocitoquímicas mostradas en (D). G, Dot-plots representativos de células CD10- y CD10+ de NS control y ET-1 dispersadas. Las células de las NS primarias dispersas fueron marcadas con anti-CD10, y separadas mediante FACS. Posteriormente se re-sembraron en medio sin ET-1 durante 7DIV y dieron lugar a NS secundarias. H, Cuantificación de la eficiencia de formación de NS secundarias de progenitores CD10- y CD10+ de NS (primarias) control y ET-1. ** p≤0,01; *** p≤0,001. Escala, 100 µm. 117 3. Análisis del efecto de la ET-1 mediante estudio de expresión génica por microarray Los datos recién expuestos sobre el efecto de la ET-1 en las NS de CB claramente sugieren que esta citoquina tiene una función no sólo de activación de la proliferación sino también de inducción de la progresión a través del linaje mesectodérmico. Sin embargo, las dificultades con el ensayo adherente de NS han provocado que estas conclusiones no sean totalmente robustas. Tendríamos que utilizar algún otro método para demostrar que efectivamente el tratamiento de los progenitores de las NS con ET-1 está induciendo la progresión hacia el linaje mesectodérmico. Decidimos llevar a cabo un estudio de expresión génica por microarray para comparar NS tratadas versus no tratadas con ET-1, para así esclarecer los programas génicos que estaban activándose en los progenitores en respuesta a esta citoquina. Para este análisis, se utilizaron dos tipos de muestras de neuroesferas de CB, cultivadas en medio completo durante 10 días. La primera se nombró “NS ET-1”, y se cultivó en medio con mitógenos (EFG, FGF e IGF) más ET-1, y al 21% de O2. La otra muestra se nombró “NS Control”, y se cultivó en medio con mitógenos y al 21% de O2, pero sin ET-1. Por tanto, la única diferencia entre ambas muestras es la presencia de ET-1. En la figura 23A-C se muestran las dos poblaciones de NS que fueron comparadas mediante chips de microarray. La figura 23A muestra una imagen de campo claro de los dos tipos de NS. Como hemos mencionado anteriormente, las NS tratadas con ET-1 presentan mayor tamaño y menor cantidad de blebs. En la figura 23B-C podemos ver una inmunohistoquímica de secciones de estas NS, las cuales presentan un marcaje de lectina similar entre ellas. Sin embargo, el área teñida por CD10 es muy superior en las NS con ET-1, de acuerdo con lo expuesto anteriormente y con los valores de expresión obtenidos por PCR cuantitativa (Figura 23E). En la figura 23D y G se observa que el análisis de expresión génica ha distribuido las muestras en dos grupos, que coinciden con las poblaciones tratadas con ET-1 y las poblaciones control (no tratadas), lo que denota la robustez y repetitividad de la preparación de NS. Mediante el Volcano Plot que se muestra en la figura 23F se puede comprobar la distribución de los genes del microarray, ordenados según su valor de expresión (fold change; en el eje X) y de significancia (p-valor o p-value; en el eje Y). En este tipo de representación, la región de interés la forman los puntos con valor más alto en el eje Y, y que están más alejados a la derecha o a la izquierda del punto 0 del 118 eje X, es decir, aquellos con un cambio más alto en la expresión génica y con mayor significancia. Figura 23. 3. Análisis del efecto de la ET-1 mediante estudio de expresión génica por microarray. A, Imágenes representativas de campo claro de las neuroesferas de cada una de las muestras comparadas en el análisis de expresión génica: NS tratadas con ET-1 (izquierda) y NS control (derecha). B-C, Inmunohistoquímica representativa de una NS tratada con ET-1 (B) y una NS control (C), ambas marcadas con GSA I (verde) y anti-CD10 (rojo). D, Agrupación jerárquica de las muestras utilizadas en el estudio en la que se puede ver que las condiciones de cultivo aplicadas a las células de CB han logrado dos poblaciones de células realmente diferentes. Las muestras de una misma población están relacionadas consigo mismas de forma más inmediata que con las de otra población. E, Niveles de expresión de CD10 en NS control y NS tratadas con ET-1, obtenidos mediante qPCR. F, Volcano-plot, gráfico que ordena los genes analizados de cada población según su p-valor (eje Y) y su FCH (eje X). G, Mapa de calor que proporciona una visión general de los niveles de expresión en cada muestra. H, Validación del microarray por qPCR de 14 de los principales genes. Escala, 100 µm. 119 Los resultados del estudio revelaron cambios de expresión en 261 genes cuando se aplicaban unos valores de fold change (FCH)≥2 y FDR (p-value ajustada)<0,05. Los valores empleados para los parámetros de FCH y FDR son restrictivos y proporcionan genes con cambios importantes en la expresión y que son altamente significativos. La figura 23H muestra la comparación de los cambios de expresión de 14 de esos genes estudiado por microarray versus PCR cuantitativa, lo que sirve de validación de los resultados del array. Como primera comprobación del análisis génico realizado, de entre los genes que superaron los filtros establecidos de (FCH>2 y FDR (p-value ajustada)<0,05), se examinaron genes típicos de células madre neurales. En la tabla 3 podemos encontrar 10 genes seleccionados para realizar un perfil de identidad en cada población. Entre los genes expresados en el grupo NS ET-1, se muestra en primer lugar la tenascina N o tenascina W (Tnn o Tnw), con el mayor FCH. Esta proteína se expresa en células derivadas de la cresta neural y está asociada con la fase de la migración durante el desarrollo embrionario, también se expresa en células de músculo liso y de hueso (Degen et al., 2008; Scherberich et al., 2004). A continuación encontramos la proteína modificadora de la actividad del receptor 3 (Ramp3), un receptor de la adrenomedulina (Dumont et al., 2002; Muff et al., 2001), una hormona cuyo papel no ha sido descrito en la fisiología del CB. Se muestra también la metalo-endopeptidasa de membrana (Mme o CD10), que como ya se ha mencionado se expresa en una amplia variedad de tejidos y nichos de células madre, y actúa como regulador de la diferenciación y proliferación en muchos de ellos (Maguer-Satta et al., 2011a). También encontramos la trombospondina 2 (Thbs2), involucrada en regulación de angiogénesis y de migración celular (Lin et al., 2003; Sanders et al., 2002), y el factor de crecimiento fibroblástico 7 (Fgf7), asociado a proliferación de células mesenquimales y de células epiteliales (Chelly et al., 2001; Yan et al., 1992). También se puede observar el receptor de endotelina B (Ednrb), cuya función en la activación de los progenitores del CB y en la diferenciación mesectodérmica de estos durante hipoxia han sido descritos (Chen et al., 2002; Chen et al., 2007a; Platero-Luengo et al., 2014a), y el receptor de factor derivado de plaquetas alfa (Pdgfra), que interviene en la migración de las células de la cresta neural que dan lugar a derivados mesectodérmicos (Richarte et al., 2007; Soriano, 1997). 120 Tabla 3. Perfil de identidad de NS control y NS ET-1. 121 Por otro lado, en el grupo de NS CONTROL sobresalen genes como la dopa decarboxilasa (Ddc) o la sinapsina II (Syn2), ambos relacionados con el fenotipo neuronal (Evergren et al., 2007). No obstante, aparecen también genes como la osteoglicina (Ogn) o la elastina (Eln), relacionados con formación de tejidos óseo y cardíaco (Petretto et al., 2008), y tejido vascular (Briones et al., 2003). Todos estos tejidos derivan de la cresta neural, y estos genes muestran por tanto el perfil multipotente que tienen las NS de CB en la condición control. Los genes destacados en la población control están relacionados con pluripotencia, diferenciación neuronal y diferenciación mesectodérmica. Sin embargo, en la población de NS tratadas con ET-1 los genes que sobresalen están relacionados con células madre y con diferenciación mesectodérmica, nunca con diferenciación o fenotipo neuronal, sugiriendo de nuevo que esta citoquina especifica a los progenitores hacia el fenotipo mesectodérmico. Los datos resultantes del análisis genético se utilizaron también para elaborar el perfil de expresión o huella genética de las NS control y de las NS tratadas con endotelina-1. La Tabla 4 muestra el perfil de expresión de las dos muestras, confeccionado con los genes que definen las dos poblaciones celulares. Para elaborar este perfil se filtraron los genes obtenidos utilizando un fold change alto (FCH>7), y de nuevo un valor de FDR<0,05. En la población de NS ET-1 obtuvimos 9 genes que cumplían dichos criterios, y en la población de NS CONTROL sólo 4 genes. El primer gen con mayor diferencia de expresión en las NS ET-1 es BPI fold containing family A, member 2F, expresado en epitelio pulmonar, nasal y bucal (Musa et al., 2012). La segunda proteína es la Tenascina-N, que como hemos mencionado se expresa en células derivadas de la cresta neural durante la embriogénesis y en el adulto. Las tenascinas están relacionadas con la adhesión y la migración, pudiendo ser estimulantes o inhibidoras según el tipo celular (Chiquet-Ehrismann et al., 1988; Lotz et al., 1989). La modulación de la adhesión es un mecanismo que influye en la proliferación celular, la migración y la diferenciación. La tercera proteína que obtenemos es la Interleukina 11, una citoquina que estimula el desarrollo o la supervivencia de los progenitores de osteoclasto (McCoy et al., 2013). El cuarto gen es preprotripsinógeno IV o tripsina IV, expresado en el sistema nervioso, sobre todo en astrocitos, así como en células epiteliales de intestino (Knecht et al., 2007), y su expresión está asociada a varios tipos de cáncer. La huella genética de las NS tratadas con ET-1 nos muestra que los genes 128 Continuación de Tabla 5. Biofunciones destacadas en las NS ET-1. NS ET-1 Categories Biofunctions p-Value # Molecules Predicted Activation State Activation z-score apoptosis of tumor cell lines 1,14E-08 32 -0,294 cell death of tumor cell lines 2,94E-07 34 -0,520 apoptosis of endometrial cancer cell lines 6,71E-06 4 -0,320 apoptosis of leukemia cell lines 9,57E-06 11 1,341 necrosis of epithelial tissue 1,27E-05 17 -1,575 cell death of epithelial cells 1,62E-05 15 -1,652 apoptosis of epithelial cells 2,06E-05 11 -1,714 neuronal cell death 3,40E-05 18 0,751 cell death of muscle cells 8,09E-05 11 Decreased -2,452 cell death of parenchymal cells 2,38E-04 7 -0,543 apoptosis of primordial germ cells 3,04E-04 2 cell viability of stem cells 6,94E-04 4 differentiation of cells 5,26E-13 54 Increased 3,180 differentiation of neuronal hybrid cells 1,02E-04 2 maturation of cells 4,01E-04 12 Increased 2,073 proliferation of cells 1,08E-10 68 Increased 3,080 colony formation of cells 4,52E-08 19 1,258 colony formation of tumor cell lines 5,57E-05 10 1,318 proliferation of bone marrow cell lines 5,39E-04 5 Increased 2,000 proliferation of connective tissue cells 4,65E-10 24 Increased 2,107 proliferation of epithelial cells 4,04E-08 19 Increased 2,001 generation of leukocytes 3,85E-04 7 1,925 migration of tumor cell lines 3,11E-10 25 Increased 3,241 cell movement of tumor cell lines 1,16E-09 27 Increased 3,471 cell movement of muscle cells 2,50E-06 10 0,928 invasion of cells 2,86E-06 22 Increased 2,459 migration of colon carcinoma cells 1,00E-05 3 migration of prostate cancer cell lines 3,72E-05 6 1,945 invasion of tumor cell lines 1,89E-04 15 Increased 2,313 Connective Tissue Disorders, Organismal Injury and Abnormalities, Skeletal and Muscular Disorders, Tissue Morphology damage of cartilage tissue 5,05E-09 9 0,518 Organ Morphology, Organismal Injury and Abnormalities, Skeletal and Muscular Disorders, Tissue Morphology damage of bone 3,17E-09 11 0,730 deterioration of connective tissue 2,38E-09 12 0,686 quantity of cells 8,64E-08 38 Increased 2,034 abnormal morphology of epithelial tissue 2,38E-05 14 Cellular Movement Tissue Morphology Cell Death and Survival Cellular Development Cellular Growth and Proliferation Cellular Growth and Proliferation, Tissue Development 129 Tabla 6 . Biofunciones destacadas en NS control. NS CONTROL Categories Biofunctions p-Value # Molecules Predicted Activation State Activation z-score vascular disease 9,88E-08 26 -0,157 occlusion of artery 1,03E-06 19 -0,155 atherosclerosis 1,19E-06 16 0,104 Hypertension 1,21E-06 19 1,320 disorder of artery 4,48E-06 20 -0,068 arteriovenous malformation 1,00E-04 3 abdominal aortic aneurysm 1,22E-04 4 instability of atherosclerotic lesion 2,75E-04 2 abnormal ST segment 5,47E-04 2 injury of aorta 5,47E-04 2 atherosclerosis of aortic sinus 9,06E-04 2 abnormality of cardiovascular system 1,73E-03 3 reperfusion injury 1,80E-03 4 vasospasm 1,88E-03 2 essential hypertension 2,82E-03 4 Infarction 3,03E-03 8 0,838 peripheral arterial occlusive disease 4,80E-03 6 female genital tract cancer 5,39E-07 50 genital tract cancer 3,10E-06 52 uterine serous papillary cancer 8,33E-06 10 genital tumor 1,86E-05 52 endometrial cancer 5,42E-05 41 endometrial carcinoma 2,10E-03 34 adenocarcinoma in endometrium 3,13E-03 33 HER2 negative hormone receptor negative breast cancer 5,08E-03 5 blood pressure 1,95E-08 15 1,495 systolic pressure 1,96E-08 10 1,942 diastolic pressure 2,81E-06 6 1,664 mean arterial pressure 3,08E-05 6 1,546 systolic pressure of right ventricle 2,49E-03 2 secretion of catecholamine 6,96E-07 7 0,000 secretion of neurotransmitter 6,56E-06 8 0,000 quantity of catecholamine 2,15E-05 8 -0,849 uptake of 5-hydroxytryptamine 2,49E-03 2 uptake of neurotransmitter 4,96E-03 3 Cardiovascular System Development and Function, Hematological System Development and Function Cancer, Organismal Injury and Abnormalities, Reproductive System Disease Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry Cardiovascular Disease 130 Continuación de Tabla 6. Biofunciones destacadas en las NS CONTROL. NS CONTROL Categories Biofunctions p-Value # Molecules Predicted Activation State Activation z-score concentration of corticosterone 2,15E-04 6 1,554 oversecretion of corticosterone 2,75E-04 2 concentration of anandamide 3,18E-03 2 quantity of insulin in blood 2,15E-05 9 0,333 quantity of IGF1 in blood 1,53E-03 3 quantity of ACTH in blood 5,72E-03 2 concentration of hormone 8,12E-09 18 -0,767 quantity of ACTH 2,95E-04 3 secretion of hormone 4,05E-04 6 1,091 abnormal quantity of hormone 4,26E-04 4 quantity of pituitary hormone derivative 1,35E-03 2 Endocrine System Disorders, Hematological Disease, Metabolic Disease hypoglycemia 1,96E-07 9 Increased 2,777 secretion of molecule 1,29E-09 22 -0,722 transport of molecule 2,85E-08 37 Decreased -2,276 transport of monovalent inorganic cation 4,40E-05 9 transport of metal 6,08E-05 11 transport of cation 9,81E-05 12 -1,980 transport of inorganic cation 1,05E-04 11 transport of K+ 1,19E-04 6 transport of metal ion 1,88E-04 10 transport of ion 3,77E-04 13 Decreased -2,213 import of K+ 3,95E-03 2 abnormal morphology of nervous system 4,76E-08 23 activation of brain 1,47E-05 5 lack of superior cervical ganglion 9,23E-05 2 abnormal morphology of superior cervical ganglion 4,48E-04 3 weight gain 4,10E-07 14 1,604 obesity 1,05E-05 15 0,289 central obesity 2,95E-04 3 quantity of protein in blood 3,85E-08 20 1,835 quantity of cytokine 1,54E-03 8 Increased 2,094 quantity of leptin in blood 2,23E-03 5 0,447 Protein Synthesis Endocrine System Development and Function, Lipid Metabolism, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry Molecular Transport Nervous System Development and Function Nutritional Disease 131 En la tabla 5 podemos ver que, además de los procesos biológicos propios de células progenitoras, en las NS tratadas con endotelina aparecen otros procesos relacionados con el linaje mesectodérmico de la cresta neural, como son la proliferación de células de tejido conectivo o la angiogénesis. Estas funciones hacen referencia a tejidos derivados de dicha estructura germinal, tales como músculo liso, tejido vascular, conectivo, y óseo, reafirmando la multipotencia de las CBSCs. La presencia de estas biofunciones en las NS ET-1 indica que está teniendo lugar cierta especificación o diferenciación hacia el linaje mesectodérmico en el núcleo de las neuroesferas tratadas con la citoquina. Asimismo, los datos obtenidos en este análisis génico apoyan los resultados del microarray realizado anteriormente (Platero-Luengo, 2014b), confirmando que las CBSCs son progenitores multipotentes capaces de generar células de fenotipo neuronal y células de fenotipo mesectodérmico, y que se requieren señales específicas del microambiente para promover la diferenciación hacia uno u otro linaje. Por último, se seleccionaron las 5 biofunciones más destacadas según el p-valor o el z-score. En la Tabla 7 podemos ver que en la muestra de NS tratadas con ET-1 aparecen biofunciones relacionadas con proliferación o crecimiento de células y del organismo, o con movimiento celular. Además, en esta muestra aparecen biofunciones relacionadas con el linaje mesectodérmico, como es la proliferación de células de tejido conectivo. Por el contrario, en las NS control las biofunciones son de características más variadas, apareciendo algunas como el transporte de moléculas, la concentración de hormonas o la inflamación del órgano. De manera relevante, las biofunciones más destacadas en la muestra control están relacionadas con un fenotipo neuronal, y no aparecen entre las biofunciones destacadas de la muestra tratada con ET-1, como por ejemplo la biofunción proliferación de células neuronales. Tabla 7 . Las 5 biofunciones más destacadas en las NS ET-1 y NS CONTROL. Biofunciones NS ET-1 Biofunciones NS CONTROL Organismal death Glucose metabolism disorder Cell survival Hypoglycemia Perinatal death Proliferation of neuronal cells Growth of organism Inflammation of organ Cell viability Quantity of cells Differentiation of cells Secretion of molecule Cell movement Concentration of hormone Growth of tumor Transport of molecule Migration of tumor cell lines Systolic pressure Proliferation of connective tissue cells Blood pressure top-5 z-score top-5 p-value 132 3.2. Rutas de señalización representadas en los progenitores del cuerpo carotídeo tratados o no con ET-1 El Core Analysis utilizado para analizar los genes de las NS ET-1 y de las NS control proporcionó, además de las biofunciones, una serie de rutas de señalización canónicas asociadas a las moléculas representadas en cada población de neuroesferas. Estas rutas aparecen ordenadas en las Tablas 8 y 9 según el valor de p-value. Las tablas muestran también el Ratio, un parámetro que mide la relación entre las moléculas de nuestros datos que aparecen en dicha ruta y las moléculas totales de la ruta en cuestión. Tabla 8. Rutas de señalización canónicas destacadas en NS ET-1. Ingenuity Canonical Pathways en NS ET-1 -log(p-value) Ratio Hematopoiesis from Pluripotent Stem Cells 3,83 0,15 PPAR Signaling 3,09 0,07 Mitotic Roles of Polo-Like Kinase 2,93 0,09 Role of Osteoblasts, Osteoclasts and Chondrocytes in Rheumatoid Arthritis 2,89 0,04 Eicosanoid Signaling 2,82 0,08 PCP pathway 2,79 0,08 Prostanoid Biosynthesis 2,68 0,29 Ovarian Cancer Signaling 2,62 0,05 Human Embryonic Stem Cell Pluripotency 2,56 0,05 Mouse Embryonic Stem Cell Pluripotency 2,37 0,06 Role of Macrophages, Fibroblasts and Endothelial Cells in Rheumatoid Arthritis 2,30 0,03 Hepatic Cholestasis 2,20 0,04 PXR/RXR Activation 2,00 0,07 L-cysteine Degradation II 1,99 1,00 Regulation of the Epithelial-Mesenchymal Transition Pathway 1,99 0,04 Role of Wnt/GSK-3β Signaling in the Pathogenesis of Influenza 1,97 0,07 LXR/RXR Activation 1,91 0,05 Hepatic Fibrosis / Hepatic Stellate Cell Activation 1,86 0,04 Basal Cell Carcinoma Signaling 1,80 0,06 IL-10 Signaling 1,72 0,05 Neuregulin Signaling 1,72 0,05 1,25-dihydroxyvitamin D3 Biosynthesis 1,70 0,50 Sulfate Activation for Sulfonation 1,70 0,50 Cysteine Biosynthesis/Homocysteine Degradation 1,70 0,50 Glycogen Biosynthesis II (from UDP-D-Glucose) 1,70 0,50 UDP-N-acetyl-D-galactosamine Biosynthesis II 1,70 0,50 Factors Promoting Cardiogenesis in Vertebrates 1,66 0,05 Colorectal Cancer Metastasis Signaling 1,56 0,03 UDP-N-acetyl-D-glucosamine Biosynthesis II 1,52 0,33 Neuroprotective Role of THOP1 in Alzheimer's Disease 1,52 0,07 Role of Hypercytokinemia/hyperchemokinemia in the Pathogenesis of Influenza 1,52 0,07 Role of IL-17F in Allergic Inflammatory Airway Diseases 1,49 0,07 Inhibition of Matrix Metalloproteases 1,49 0,07 G-Protein Coupled Receptor Signaling 1,41 0,03 Myo-inositol Biosynthesis 1,40 0,25 Graft-versus-Host Disease Signaling 1,33 0,06 Role of Cytokines in Mediating Communication between Immune Cells 1,31 0,06 Adipogenesis pathway 1,31 0,04 133 En la Tabla 8 se puede observar que muchas de las rutas que aparecen en las NS con ET-1 están asociadas con proliferación celular y células madre. Otras son específicas de tejido óseo, están relacionadas con hematopoyesis, o están implicadas en cáncer de células gliales. Por otro lado, las vías de señalización presentes en NS Control están relacionadas con células madre, pero de nuevo aparecen vías relacionadas con biología neuronal. Sin embargo, las rutas destacadas de las NS ET-1 están poco asociadas al sistema nervioso. El análisis de los datos del microarray apoya los resultados obtenidos en los cultivos celulares, por lo que pensamos que la adición de endotelina-1 induce no sólo la proliferación sino también la diferenciación mesectodérmica de las CBSCs multipotentes. Creemos que esta citoquina induce la conversión de las CBSCs hacia progenitores mesectodérmicos positivos para CD10, que dejan de ser multipotentes y que quedan a disposición de la señalización del nicho para, en un momento determinado, madurar y dar lugar a nuevas células vasculares. Como hemos descrito en Tabla 9 . Rutas de señalización canónicas destacadas en NS Control. Ingenuity Canonical Pathways en NS Control -log(p-value) Ratio Inhibition of Angiogenesis by TSP1 3,05 0,15 LPS/IL-1 Mediated Inhibition of RXR Function 2,40 0,04 Renin-Angiotensin Signaling 2,19 0,05 Type II Diabetes Mellitus Signaling 2,02 0,05 Glycerol-3-phosphate Shuttle 2,02 1,00 Gαi Signaling 1,99 0,05 GDNF Family Ligand-Receptor Interactions 1,88 0,06 GABA Receptor Signaling 1,88 0,06 Reelin Signaling in Neurons 1,78 0,05 Dopamine Receptor Signaling 1,76 0,05 Dopamine-DARPP32 Feedback in cAMP Signaling 1,74 0,04 1,25-dihydroxyvitamin D3 Biosynthesis 1,72 0,50 Glutathione-mediated Detoxification 1,69 0,09 Oncostatin M Signaling 1,62 0,08 UVC-Induced MAPK Signaling 1,56 0,07 Glycerol Degradation I 1,54 0,33 PPARα/RXRα Activation 1,54 0,03 IL-8 Signaling 1,52 0,03 RAR Activation 1,50 0,03 G-Protein Coupled Receptor Signaling 1,48 0,03 Sperm Motility 1,42 0,04 Serotonin Receptor Signaling 1,40 0,06 Sphingosine-1-phosphate Signaling 1,38 0,04 Cellular Effects of Sildenafil (Viagra) 1,34 0,04 FXR/RXR Activation 1,31 0,04 134 anteriores apartados, el estímulo hipóxico parece ser el encargado de activar a los progenitores CD10+. Durante la hipoxia tiene lugar una importante liberación de factores, entre los que se encuentra la endotelina. Nuestros resultados indican que el efecto de la ET-1 es más visible si estudiamos la población de células CD10+ y que, probablemente, el efecto de la citoquina sobre la diferenciación mesectodérmica está mediado por la proteína CD10, tal y como ocurre en otros sistemas. No obstante, serán necesarios ensayos adicionales para confirmar el papel que ejerce CD10 a través de la degradación de ET-1 en el CB durante normoxia e hipoxia. En condiciones de hipoxia, la bajada de la expresión de CD10 es un claro indicador de la ausencia de degradación por parte de esta endopeptidasa de membrana, tanto de ET-1 como de otros péptidos señalizadores, y esta falta de degradación origina una sensibilización de las células hacia estos factores, promoviéndose por tanto la diferenciación endotelial y la angiogénesis. 135 Discusión 136 137 Discusión 1. Linajes celulares del cuerpo carotídeo: plasticidad de las CBSCs El cuerpo carotídeo es un órgano que deriva de la cresta neural, una de las estructuras más multipotentes en los vertebrados durante el desarrollo (Weston y Thiery, 2015). Desde el descubrimiento de las células de la cresta neural, existe un amplio debate acerca de si éstas son verdaderamente multipotentes (Baggiolini et al., 2015; Baroffio et al., 1988; Bronner-Fraser y Fraser, 1989; Bronner-Fraser y Fraser, 1988; Dupin et al., 2010; McKinney et al., 2013; Stemple y Anderson, 1992), o en cambio constituyen una población heterogénea de progenitores restringidos (Harris y Erickson, 2007; Henion y Weston, 1997; Krispin et al., 2010). El cuerpo carotídeo deriva de la región craneal (LaBonne y Bronner-Fraser, 1998), una de las zonas más plásticas de la cresta neural, que da lugar tanto a tejidos mesenquimales como neurales (Dupin y Le Douarin, 2014). Resultados recientes de nuestro grupo han mostrado que la célula madre del CB es capaz de dar lugar a células neuronales y a células de linaje mesectodérmico (Annese et al., en revisión; Pardal et al., 2007), lo que indicaría que estas células madre son verdaderamente multipotentes, y que retienen esta plasticidad, propia de las NCSCs, durante la vida adulta. Aunque aún no está totalmente determinado si las células tipo II o CBSCs provienen de progenitores neurales o de células madre mesenquimales derivadas de la cresta neural (Kameda et al., 2012; KamedaY, 2005; Pardal et al., 2007), su procedencia craneal las hace idóneas para originar simultáneamente derivados neurales y mesectodérmicos (LaBonne y Bronner- Fraser, 1998). Asimismo, diversos análisis genéticos realizados por nuestro grupo anteriormente a esta tesis doctoral (Platero-Luengo, 2014b) evidencian que existe expresión de genes relacionados con los fenotipos neuronal y mesectodérmico en las células madre del CB, confirmando la multipotencia de estas células. A raíz de estos análisis genéticos hemos podido aislar un progenitor restringido hacia el linaje mesectodérmico de este nicho germinal. Los progenitores CD10 positivos derivan de la célula madre del CB, y nuestros resultados apuntan a que su presencia en el órgano está destinada a contribuir a la angiogénesis en situaciones de hipoxia crónica. 144 3. La ET-1 activa a los progenitores mesectodérmicos CD10+ para su diferenciación hacia células vasculares El péptido endotelina-1 es un factor proliferativo que participa en el ensanchamiento de las paredes vasculares inducido por hipoxia, la hipertensión pulmonar, y la hipertrofia cardíaca (Bonvallet et al., 1994; Eddahibi et al., 1995; Oparil et al., 1995). La ET-1 está igualmente implicada en la especificación y migración de progenitores de la cresta neural (Bonano et al., 2008; Shin et al., 1999). En el cuerpo carotídeo, las células glómicas liberan ET-1 en respuesta a hipoxia, y este factor ejerce un papel mediador en la sinapsis formada entre la célula tipo I y la célula madre, provocando la activación proliferativa de estas últimas (Platero-Luengo et al., 2014a). Esta citoquina está también implicada en la inducción de la angiogénesis que tiene lugar en el CB durante hipoxia (Chen et al., 2007a), pues es liberada también por las células endoteliales cuando disminuyen los niveles de oxígeno. Resultados recientes de nuestro grupo muestran que varios factores vasculares, entre los que se encuentra la endotelina, promueven la diferenciación endotelial de los progenitores de CB in vitro (Annese et al., en revisión). La ET-1 también actúa junto con factores de crecimiento específicos promoviendo el ciclo celular en fibroblastos y células de músculo liso vascular en otros órganos (Rubanyi y Polokoff, 1994). Al igual que en otros nichos de células madre, la vasculatura juega un papel esencial en el CB (Annese et al., en revisión; Ramírez- Castillejo et al., 2006; Shen et al., 2008). Durante la exposición a hipoxia crónica, la red de vasos que envuelve a los glomérulos del CB sufre una angiogénesis que acompaña al aumento del parénquima neural experimentado por el órgano (Pardal et al., 2007; Platero-Luengo et al., 2014a). De manera adicional a las células glómicas, las células endoteliales de los vasos liberan varios factores pro-angiogénicos, entre ellos la endotelina-1 (Chen et al., 2007a; Platero-Luengo et al., 2014a), que contribuirán a la progresión de la angiogénesis. La ET-1 es uno de los principales sustratos de CD10 (Karoor et al., 2013; Maguer-Satta et al., 2011a; Mitra et al., 2013; Rubanyi y Polokoff, 1994; Turner y Tanzawa, 1997). La proteína CD10 degrada péptidos activos (Bachelard-Cascales et al., 2010; Maguer-Satta et al., 2011a; Roques et al., 1980; Turner y Tanzawa, 1997), como el FGF-2 o la ET-1, e impide así que estos lleven a cabo su efecto a través de sus receptores de membrana. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral muestran que CD10, presente en una subpoblación de progenitores mesectodérmicos del nicho del 145 CB, juega un papel importante en la diferenciación endotelial de estas células. En concreto, diversos experimentos funcionales han mostrado que el dominio enzimático de CD10 es una pieza clave en la regulación que ejerce esta proteína. La hipoxia induce la liberación rápida de ET-1 por las células neuronales, y de forma algo más lenta por las células vasculares. Nuestros resultados sugieren que ET-1 está activando a los progenitores CD10+ del CB, gracias a que la hipoxia disminuye en paralelo la función de la endopeptidasa de membrana. Quedaría por aclarar si la fuente que libera esta citoquina hacia los progenitores CD10+ son las células neuronales o el nicho vascular, aunque muy probablemente ambas fuentes sean importantes. Los datos sugieren también que ET-1 podría estar igualmente induciendo a algunas células madre multipotentes del CB a diferenciarse hacia progenitores mesectodérmicos CD10+. Esta diferenciación mesectodérmica se activa en el órgano con la llegada del estímulo hipóxico, una situación en la que tiene lugar un aumento de la liberación de ET-1. Una hipótesis para entender el curso temporal de activación de los progenitores CD10+ podría ser que primero reciben la ET-1 liberada por las células glómicas, y una vez activados, continuarían su diferenciación hacia células endoteliales maduras en respuesta a la ET-1 liberada por los vasos, contribuyendo de esta forma a la angiogénesis que tiene lugar en el órgano. Resultados anteriores de nuestro grupo confirman que en hipoxia el CB sufre un claro aumento del número de vasos sanguíneos y de células endoteliales CD31+ (Platero-Luengo et al., 2014a). Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis doctoral, los progenitores CD10+, al diferenciarse, dejarían de expresar CD10 en la membrana, para comenzar a expresar marcadores endoteliales. En concordancia con esta hipótesis, la bajada de células CD10+ durante hipoxia coincide con el incremento de células CD31+ en el CB, es decir, los progenitores mesectodérmicos están madurando y completando su diferenciación hacia células endoteliales que formarán parte de los nuevos vasos sanguíneos generados. Resultados obtenidos por nuestro grupo (Platero-Luengo et al., 2014a) demuestran que las células glómicas son los reguladores principales de la fisiología del CB, ya que son responsables tanto de la quimiorrecepción aguda (a corto plazo) como de la adaptación crónica (a largo plazo) del órgano, pues inducen a las células madre a participar en neurogénesis y angiogénesis. Hemos descrito características moleculares específicas de las CBSCs desconocidas hasta ahora, y hemos revelado un mecanismo 146 celular específico por el que estas células llevan a cabo angiogénesis. Los resultados obtenidos muestran que ET-1 induce la diferenciación de las CBSCs hacia el linaje mesectodérmico, a través del aumento de la población de células CD10+. Nuestros resultados apoyan la existencia de una función adicional a la neurogénica para la célula madre del CB, siendo éstas responsables de la adaptación angiogénica del órgano a la hipoxemia mantenida, a través de la activación de una subpoblación de progenitores mesectodérmicos que permanecen en estado latente en el nicho hasta que se precise su diferenciación para dar lugar a nuevos vasos sanguíneos. El estímulo que activa a estos progenitores sería directamente la hipoxia, mediante la inhibición de la función de CD10, junto a la presencia de citoquinas pro-angiogénicas como la ET-1. De esta forma, nuestros datos ayudan a comprender los procesos celulares que tienen lugar en el nicho germinal del CB, mediante los cuales las células madre participan tanto en neurogénesis como en angiogénesis, en respuesta al estímulo hipóxico. Un mejor conocimiento de los mecanismos que utiliza la célula madre del CB para decidir entre un linaje u otro, puede aportar importantes avances para el uso de estas células en terapia celular frente a enfermedades neurodegenerativas. 4. Aplicaciones en medicina Las células madre de la cresta neural presentan una gran plasticidad durante el desarrollo embrionario (Le Douarin et al., 2008), especificándose a diversos linajes dependiendo de su posición rostro-caudal. La región cefálica (craneal y vagal) es más plástica que las partes troncal y sacral (LaBonne y Bronner-Fraser, 1998). Algunas NCSCs, como las CBSCs, persisten en el organismo adulto y pueden diferenciarse hacia células del linaje neuronal y del linaje mesectodérmico (Annese et al., en revisión; Pardal et al., 2007). Esta capacidad podría hacerlas especialmente interesantes desde el punto de vista de la terapia celular. El cuerpo carotídeo se ha utilizado satisfactoriamente para el tratamiento de los síntomas de la enfermedad de Parkinson en modelos animales (Toledo-Aral et al., 2003; Villadiego et al., 2005). Dada la naturaleza 147 dopaminérgica de las células neuronales derivadas del CB, y la secreción de factores tróficos por parte de estas células, este tejido posee un gran potencial para contrarrestar el progreso de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson (Muñoz-Manchado et al., 2013; Ortega-Sáenz et al., 2013; Toledo-Aral et al., 2003). Sin embargo, la aplicación clínica de esta técnica está dificultada por el pequeño volumen, y por tanto bajo número de células neuronales, que presenta el cuerpo carotídeo humano (Arjona et al., 2003; Mínguez-Castellanos et al., 2007). La presencia de células madre en el CB ofrece una oportunidad para la expansión in vitro y la obtención de biomasa suficiente de células neuronales para los trasplantes (Lopez-Barneo et al., 2009). El uso de este tipo de células madre del CB para terapia celular anti-parkinsoniana requiere por tanto de un profundo conocimiento de los mecanismos celulares y moleculares que gobiernan la biología y el comportamiento de estas células. Datos previos de nuestro grupo de investigación ayudan a entender los mecanismos de diferenciación neuronal de las células madre del CB a nivel celular y molecular (Pardal et al., 2007; Platero-Luengo et al., 2014a). Sin embargo, la diferenciación de las CBSCs hacia el linaje mesectodérmico está menos estudiada, en parte debido a la falta de marcadores que permitan aislar a las células de este linaje a partir del nicho del CB. La caracterización de CD10 como marcador de este linaje supone un gran avance, puesto que ha permitido aislar progenitores especificados hacia este linaje mesectodérmico del CB, y también nos ha proporcionado las primeras pistas sobre los mecanismos moleculares que permiten el progreso a lo largo de este linaje. Nuestros datos indican que la especificación de la célula madre hacia progenitores neuronales o mesectodérmicos ocurre en un estadio anterior a la expresión de CD10. Entender qué mecanismos intervienen en estas “decisiones” de las células madre es clave para conseguir manipular la diferenciación y la proliferación de estas células, y así desarrollar estrategias que permitan optimizar la obtención de células neuronales, y no mesectodérmicas, para su uso en terapia celular anti-parkinsoniana. La elaboración de mecanismos de inhibición mesectodérmica en las células madre del CB podría ser de gran interés, ya que hasta ahora no se han podido encontrar estrategias que induzcan claramente el linaje neuronal. En cualquier caso, en los trasplantes cerebrales también es necesaria una vascularización que permita la supervivencia del trasplante, vascularización que podría verse favorecida por la diferenciación endotelial de los progenitores del CB. Por tanto, se requieren experimentos adicionales con trasplantes 148 para determinar la verdadera utilidad de la capacidad de diferenciación mesectodérmica de las CBSCs en el tratamiento de los síntomas del Parkinson. El estudio del papel de CD10 en la regulación de la diferenciación endotelial tiene gran relevancia en terapias anti-tumorigénicas (Goodman et al., 2006; Horiguchi et al., 2008), y podría ser utilizado como diana para generar estrategias que modulen la angiogénesis asociada al tumor. Asimismo, debido a la expresión de CD10 en células madre cancerosas en algunos tumores (Fukusumi et al., 2014), y a la asociación que existe entre CD10 y metástasis (Maguer-Satta et al., 2011a), la ampliación de nuestro conocimiento sobre CD10 en un nicho de células madre como es el CB, podría ser de gran utilidad para el desarrollo de nuevas dianas terapéuticas en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Una disminución de la función de CD10 por hipoxia también afecta a la enfermedad de Alzheimer, pues la proteína CD10 es una de las metaloendopeptidasas degradadoras del péptido amiloide Aβ (Fisk et al., 2007; Iwata et al., 2000; Nalivaeva et al., 2004). Los estudios sobre la función reguladora de CD10 en distintos sistemas, como por ejemplo el presente trabajo en cuerpo carotídeo, pueden contribuir al conocimiento del papel catalítico de esta endopeptidasa en esta otra enfermedad neurodegenerativa. 149 Conclusiones 150 151 Conclusiones • CD10 es un marcador específico que permite la identificación y el aislamiento de una subpoblación de progenitores del cuerpo carotídeo. • Las células CD10+ derivan de la célula madre GFAP+ del cuerpo carotídeo. • Los progenitores CD10+ están restringidos hacia el linaje mesectodérmico, siendo capaces de diferenciarse hacia células de músculo liso y endotelio, pero no hacia células neuronales. • Los progenitores CD10+ se activan en hipoxia, en parte gracias a la disminución de la expresión de CD10. • La proteína CD10 actúa como regulador de la angiogénesis en el cuerpo carotídeo a través de su actividad catalítica. • La función reguladora de la diferenciación endotelial de CD10 se realiza mediante la degradación de endotelina-1, entre otros péptidos señalizadores pro-angiogénicos liberados en el nicho. • La endotelina-1 favorece la diferenciación mesectodérmica de los progenitores del cuerpo carotídeo, confiriendo a las neuroesferas de este órgano un perfil de expresión génica compatible con este linaje. 152 Bibliografía 153