Efecto de la creatina sobre la inflamación intestinal

EFECTO DE LA CREATINA SOBRE LA INFLAMACIÓN INTESTINAL María Blanca Lucena Leiva GRADO EN FARMACIA – TRABAJO FIN DE GRADO Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla UNIVERSIDAD DE SEVILLA - FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO – GRADO EN FARMACIA EFECTO DE LA CREATINA SOBRE LA INFLAMACIÓN INTESTINAL María Blanca Lucena Leiva TUTORA: María José Peral Rubio COTUTORA: María Dolores Vázquez Carretero Departamento de Fisiología TFG EXPERIMENTAL Julio, 2021 María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado Índice INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1 Morfología del colon ................................................................................................................. 1 Barrera intestinal ....................................................................................................................... 1 Colitis ulcerosa .......................................................................................................................... 3 Homeostasis de la creatina ....................................................................................................... 5 - Sistema creatina/fosfocreatina/creatina kinasa ........................................................... 6 - Biosíntesis y transporte de creatina .............................................................................. 6 Suplementación con creatina .................................................................................................... 8 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 11 METODOLOGÍA.................................................................................................................. 11 ▪ DISPOSITIVOS .................................................................................................................. 11 ▪ REACTIVOS....................................................................................................................... 11 ▪ ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Y MATERIAL BIOLÓGICO .......................................... 12 ▪ DISEÑO EXPERIMENTAL .................................................................................................. 12 ▪ EVALUACIÓN DE LA INFLAMACIÓN ................................................................................. 13 o Peso corporal e Índice de actividad de la enfermedad (DAI) ...................................... 13 o Análisis macroscópico ................................................................................................. 14 o Análisis histológico ...................................................................................................... 14 ▪ REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL ............................. 16 ▪ PRESENTACION DE LOS RESULTADOS Y MÉTODOS DE ANÁLISIS DE DATOS .................. 17 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................. 17 1. Efecto de la suplementación de creatina en ratas sin tratar y tratadas con DSS, sobre el peso corporal y el DAI (Índice de Actividad de la Enfermedad) .............................................. 17 2. Efecto de la suplementación con creatina sobre la longitud y el daño histológico del colon inducido por DSS. .......................................................................................................... 20 3. Efecto de la suplementación de creatina sobre la abundancia del ARNm de IL-6, TNF-α e IL-1β en el colon. ..................................................................................................................... 23 CONCLUSIONES ................................................................................................................. 26 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 27 María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado RESUMEN La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una patología que cursa con una inflamación crónica del aparato digestivo presentando deposiciones frecuentes y líquidas, dolor abdominal, urgencia defecatoria y tenesmo, además de otras manifestaciones dependiendo de la gravedad de la enfermedad. Dentro de la EII están englobadas dos patologías: la Enfermedad de Crohn y la Colitis Ulcerosa. El objetivo del presente trabajo es evaluar la inflamación en un modelo de colitis crónica y determinar si una suplementación con creatina, un compuesto orgánico que puede ser producido de forma endógena u obtenerse con la dieta, puede reducir las manifestaciones que se presentan en esta patología o servir de protectora en el desarrollo de la enfermedad. Para realizar dicho estudio se ha empleado un modelo experimental de colitis crónica en ratas, inducida con DSS (Dextrano Sulfato Sódico), que ha demostrado que está relacionada con la enfermedad inflamatoria intestinal humana, y además, en algunos grupos experimentales se ha empleado creatina como suplemento para comprobar el efecto protector de la misma. A lo largo del tratamiento se han observado manifestaciones tanto clínicas como histológicas en los grupos tratados con DSS y se ha comprobado que la suplementación con creatina ejerce cierto papel protector en el desarrollo de la enfermedad, ya que atenúa las manifestaciones clínicas observándose una reducción del DAI y una menor expresión de la citoquinas proinflamatorias medidas, e histológicas reduciendo la respuesta inflamatoria y, por tanto, la gravedad de la enfermedad. Este estudio y otras investigaciones pueden servir para que en un futuro se pueda incluir la creatina, junto con medicamentos ya desarrollados como coadyuvante. Palabras clave: inflamación intestinal, colitis ulcerosa, creatina María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 1 INTRODUCCIÓN Morfología del colon El intestino grueso constituye la última parte del aparato digestivo. Este se encuentra formado por el ciego, el colon y el recto. El colon es la última parte del intestino donde se reabsorben agua y electrolitos ayudando a mantener la homeostasis. Este, a su vez, se puede dividir en cuatro partes: colon proximal o ascendente, transverso, descendente y sigmoide (Saladin, 2013). La pared del colon está formada por cuatro capas: serosa, muscular, submucosa y mucosa, ordenadas desde la zona basal hasta la luz del colon. Son capas muy similares a las del intestino delgado. La capa serosa es la más externa. Es una membrana formada por células epiteliales debajo de la que se localiza tejido adiposo y tejido conjuntivo. La capa muscular está formada por dos capas de músculo liso, una capa interna circular y un capa externa dispuesta de forma longitudinal, entre las que se encuentra el plexo mientérico de Auerbach. La submucosa está formada por tejido conectivo, en la que se encuentra el plexo submucoso o plexo de Meissner. Por último, se encuentra la capa mucosa, compuesta por el epitelio, la lámina propia de tejido conectivo laxo y la capa muscular de la mucosa. En ella se localizan las criptas del colon, que son invaginaciones del epitelio. En la superficie están las células epiteliales que le dan forma al epitelio; y en la base, se encuentran células madre pluripotentes que producen distintos tipos celulares como las células epiteliales o colonocitos, las células goblet o caliciformes y las células enteroendocrinas, para favorecer la renovación celular (Figura 1) (Seller y Morton, 2014). Figura 1. Representación esquemática del intestino grueso y de una cripta intestinal con los distintos tipos celulares que presenta (esquema modificado de Williams et al., 2016; Dutton et al., 2019). Barrera intestinal La barrera intestinal es una unidad física y biológica que abarca el intestino y que separa el medio interno del externo. Su función es evitar la entrada de microorganismos patógenos y sustancias María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 2 tóxicas y mantener la homeostasis. Se encuentra formada por la propia microbiota, moco y péptidos antimicrobianos, células epiteliales y células inmunes, desde la zona más externa a la más interna (Camilleri et al., 2012; Peterson y Artis, 2014). El moco es la primera línea de defensa. En el colon, las células goblet o caliciformes, son células del epitelio especializadas en mantener la función de la barrera intestinal, en este caso produciendo moco (compuesto de proteínas glicosiladas de mucina, agua e iones), e IgA secretora, además de péptidos antimicrobianos. La secreción luminal de mucina previene que se adhieran bacterias, actuando como parte de la respuesta inmune del organismo contra patógenos. Hay distintos tipos de mucinas, siendo la más abundante la Mucina 2, que es esencial para la organización de la capa de moco intestinal en la superficie epitelial del colon. Tras la capa de moco, se encuentran uniones estrechas que enlazan las células epiteliales formando una barrera física (Peterson y Artis, 2014; Viggiano et al., 2015; Camara-Lemarroy et al., 2018). Por último, en la lámina propia, se encuentra la siguiente capa que es, en su mayoría, inmunológica, formándose lo que se conoce como tejido linfoide. Este está formado por folículos linfoides y células inmunes con capacidad de proporcionar una respuesta inmune frente a patógenos y producir mediadores inflamatorios regulando así la homeostasis (Viggiano et al., 2015; Camara-Lemarroy et al., 2018). La barrera es permeable al agua y a otras moléculas pequeñas, pero cuando la permeabilidad se altera moléculas más grandes y bacterias comensales pueden penetrar, lo que puede conllevar consecuencias patológicas, siendo las más características la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) que incluye dos enfermedades: la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (Figura 2) (Camara-Lemarroy et al., 2018). María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 3 Figura 2. Disfunción de la barrera intestinal (esquema modificado de Mehandru y Colombel, 2020). Colitis ulcerosa La colitis ulcerosa es una enfermedad inflamatoria intestinal crónica. Se caracteriza por una inflamación de la mucosa que comienza en el recto y se extiende hasta el colon. La alteración de la mucosa intestinal y la perturbación de la microbiota son factores de riesgo que pueden desembocar en esta patología. Los síntomas que presenta son diarrea, dolor abdominal, urgencia defecatoria y tenesmo. Dependiendo de la severidad y localización de la enfermedad, los pacientes además pueden presentar sangre en las heces y secreción de moco; y en casos más extremos pérdida de peso y fiebre, anemia y, de forma ocasional, la muerte. Los síntomas suelen comenzar de forma gradual y evolucionar durante varias semanas. Además, en algunos casos se producen manifestaciones extraintestinales que pueden afectar a la piel, a los ojos, al hígado y a las articulaciones, siendo esta manifestación extraintestinal la más frecuente (Solomon et al., 2010; Vavricka et al., 2015; Ungaro et al., 2017; Feuerstein et al., 2019). Histológicamente la inflamación se produce de manera superficial y puede afectar a la mucosa, submucosa y a la muscular de la mucosa. Es característico la formación de úlceras, la infiltración de células inflamatorias, la pérdida de células goblet o caliciformes, la destrucción de las criptas intestinales y los abscesos (Solomon et al., 2010). Hay diferentes tratamientos para la colitis ulcerosa. Como fármacos de primera línea se encuentran los aminosalicilatos que se emplean vía oral y rectal para inducir la remisión de las recaídas. También se emplean tiopurinas y corticosteroides como la budesonida. En pacientes que no responden a estos tratamientos se emplean fármacos biológicos que son agentes que dirigen su acción hacia mecanismos inmunológicos e inflamatorios que están involucrados en el desarrollo de la enfermedad. Uno de estos agentes terapéuticos son los anticuerpos anti-TNFα (Factor Necrótico Tumoral Alfa). TNFα es una citoquina proinflamatoria que tiene mucha importancia en la activación y mantenimiento del proceso inflamatorio, de manera que con este tratamiento biológico se puede bloquear la liberación del TNF y neutralizar su acción y así conseguir una remisión completa de la enfermedad (Hinojosa, 2000; Yamamoto-Furusho et al., 2018). De forma paralela, la respuesta inflamatoria puede estar asociada a cambios en el metabolismo de los tejidos. En el tracto gastrointestinal sano las células epiteliales que recubren la mucosa María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 4 forman una barrera con una vasculatura compleja donde está disminuido el flujo sanguíneo, de manera que, estas células, trabajan en un entorno de baja oxigenación. Cuando se produce una inflamación, como ocurre en la colitis ulcerosa, debido a la vasoconstricción, edema y al aumento del consumo de oxígeno que conlleva la patología, se produce hipoxia, por lo que el tracto gastrointestinal ha tenido que desarrollar una serie de mecanismos para hacer frente a su entorno metabólico, produciéndose variaciones en la expresión de enzimas, de genes, y otros mecanismos para poder obtener energía ante una menor disponibilidad de oxígeno y mantener la homeostasis del oxígeno, fundamental para la supervivencia (Karhausen et al., 2004; Colgan et al., 2017). La respuesta a la hipoxia deber estar coordinada. De esta forma, a nivel celular, se regula por el factor de transcripción HIF, en concreto el HIF-1, que es esencial para mantener la homeostasis del oxígeno. HIF-1 es un heterodímero compuesto por dos subunidades (HIF-1α y HIF-1β) cuya actividad es mediada, fundamentalmente, por la estabilidad de la proteína de la subunidad alfa. Cuando hay niveles normales de oxígeno, la subunidad α es expresada y rápidamente degradada, pero en hipoxia, esta subunidad se estabiliza y se trasloca al núcleo, donde se une a la subunidad β y a secuencias de ADN que expresan genes que responden a la hipoxia. Así, por ejemplo, aumenta la densidad mitocondrial, la mioglobina, y la activación del metabolismo anaeróbico para la producción de energía. Además, se reduce la producción de citoquinas proinflamatorias y aumenta la producción de β-defensinas (Figura 3) (Aquino-Gálvez y González- Ávila, 2010; Colgan et al., 2017; Postovalova et al., 2020). Figura 3. Las funciones del Factor Inducible por Hipoxia HIF-1α en la enfermedad inflamatoria intestinal (esquema modificado de Postovalova et al., 2020). María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 5 Para poder estudiar la colitis ulcerosa, se puede emplear un modelo experimental en ratas o ratones donde la colitis es inducida por DSS. El mecanismo por el que este complejo polímero de glucosa produce la enfermedad inflamatoria intestinal se debe al daño que realiza sobre las células epiteliales del colon haciendo que la barrera intestinal sea atravesada por el contenido intestinal hacia el tejido subyacente, provocando así la inflamación (Solomon et al., 2010; Marin et al., 2016). La colitis es inducida al administrar DSS en el agua de bebida. Dependiendo de la forma de administración (frecuencia, duración…), se producirá una colitis crónica o aguda; así, por lo general, una colitis aguda se induce usando concentraciones altas de DSS administrado de forma continua durante periodos cortos de unos 4-14 días; y la colitis crónica, se consigue administrando DSS en distintas concentraciones y de forma cíclica, es decir alternando días de tratamiento y días de agua. Normalmente, a partir del 3º día de tratamiento se dan las primeras manifestaciones y la inflamación puede establecerse en un plazo de unos 10 días, pero cuando se suspende el tratamiento los animales tienden a recuperarse (Solomon et al., 2010; Marin et al., 2016). Homeostasis de la creatina La creatina es un zwitterión, un compuesto orgánico nitrogenado que puede ser producido de forma endógena u obtenerse con la dieta (Joncquel-Chevalier Curt et al., 2015). La mayoría de la creatina está presente en el músculo esquelético, y el resto se reparte, principalmente, entre el corazón, cerebro, testículos, hígado y riñón. Esta es menos requerida donde se puede sintetizar, y los tejidos que la necesitan, como el sistema nervioso, el músculo esquelético o el corazón no son capaces de producirla o lo hacen de una manera muy limitada. Por lo que la creatina tiene que ser transportada desde los lugares donde se sintetiza, a través de la sangre, hasta los tejidos con alta demanda energética donde se absorbe (Braissant et al., 2001). La creatina estimula la función muscular y energética contribuyendo al almacenamiento intracelular de energía. Está involucrada en el metabolismo celular a través de la reposición de ATP (Joncquel-Chevalier Curt et al., 2015). María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 12 ▪ ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Y MATERIAL BIOLÓGICO Se han utilizado ratas Wistar machos, de unos 20 días de edad, con un peso inicial entre 50-70 gramos. Las ratas procedían del Centro de Producción y Experimentación animal de la Universidad de Sevilla y se mantuvieron en el Animalario de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla en condiciones de luz, temperatura y humedad adecuadas y con acceso libre a pienso (Global Rodent Diet). Durante las semanas de tratamiento para la inducción de colitis, se controló la ingesta de agua de cada grupo de ratas diariamente. El sacrificio se realizó mediante una inyección intraperitoneal de ketamina (50mg/kg) más xilacina (10mg/kg), de acuerdo a la Directiva Europea 2010/63/UE y al Real Decreto 53/2013 que trata sobre las normas éticas de experimentación con animales. Tras el sacrificio de las ratas se extrae rápidamente el intestino grueso y se disecciona el ciego y el colon, se lavan con solución salina fisiológica fría (4ºC) y se procesan de distinta forma dependiendo del uso experimental. El colon distal es dividido en segmentos que, o bien se congelan en nitrógeno líquido, para realizar la PCR; o se incuban en paraformaldehído al 4% en PBS (137mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,1 mM Na2HPO4 y 1,8mM KH2PO4) durante toda la noche con agitación orbital, para el análisis histológico. ▪ DISEÑO EXPERIMENTAL Se ha utilizado un modelo animal en rata que reproduce la enfermedad inflamatoria intestinal con características similares a la colitis ulcerosa humana (Cooper et al., 1993). Para ello se administró en el agua de bebida dextrano sulfato sódico (DSS, MW 40KDA; Panreac Applichem) diluido al 5%. Este compuesto es tóxico para las células epiteliales del colon y altera la integridad de la barrera epitelial. Por otra parte, algunos grupos de ratas fueron suplementados con creatina (Best Medical Diet S.L.). La administración de esta se realiza a una dosis de 0,5g de creatina por Kg de peso corporal de rata y día. Para inducir la colitis crónica el tratamiento con DSS se realizó en tres ciclos, 2 ciclos de 14 días en los cuales las ratas estuvieron 7 días con tratamiento de DSS, seguidos de otros 7 días sin tratamiento; y un último ciclo de 8 días, en los que los 7 primeros días recibieron el tratamiento y el último día estuvieron sin él, finalizando los ciclos con el sacrificio de las ratas. Las ratas fueron divididas en cuatro grupos, asignadas aleatoriamente: - Grupo agua: sin tratamiento ni suplementación. - Grupo creatina: con suplemento de creatina en el agua de bebida. María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 13 - Grupo DSS: con tratamiento de DSS en el agua de bebida. - Grupo DSS + creatina: con tratamiento de DSS y suplemento de creatina en el agua de bebida. Antes de comenzar el tratamiento con DSS, los grupos de ratas con suplemento de creatina (agua + creatina y DSS + creatina), estuvieron dos semanas únicamente con suplemento de creatina en el agua de bebida, y, a partir del día 14 comenzó el tratamiento con DSS. Así los grupos DSS + creatina y agua + creatina se encuentran con este suplemento a lo largo de todo el tratamiento. Durante el tratamiento, y de forma diaria se registró el peso corporal de las ratas, la consistencia de las heces y el sangrado. Al día siguiente de finalizar el tratamiento se sacrificaron las ratas de cada grupo experimental y tras el sacrificio se procedió al estudio macroscópico del intestino grueso e histológico del colon; y se realizaron los ensayos de PCR en tiempo real (Figura 7). Figura 7. Diseño experimental del tratamiento en cada grupo experimental. Se representa como se llevó a cabo el tratamiento en los diferentes grupos experimentales. ▪ EVALUACIÓN DE LA INFLAMACIÓN o Peso corporal e Índice de actividad de la enfermedad (DAI) La severidad de la enfermedad se evaluó por las manifestaciones clínicas que se presentaban como el cambio del peso corporal, la consistencia de las heces, y la sangre en heces a lo largo del tratamiento (Yan et al., 2018), estableciendo un valor de 0 a 3 siguiendo la Tabla 1 que se María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 14 describe a continuación. Estos parámetros se registraron diariamente durante todo el tratamiento. De este modo la ganancia de peso se calculó considerando que el peso inicial de la rata como el 100% y el DAI como la suma de las puntuaciones obtenidas de las tres medidas indicadas. Tabla 1. Criterios de evaluación del DAI. Valor Peso Consistencia de las heces Sangrado rectal 0 Mayor de 75% Consistentes o bien formadas Sin sangrado 1 50 – 75% Heces blandas que no se adhieren al ano Pequeñas manchas de sangre en heces. Región anal seca 2 25 – 50% Heces muy blandas adheridas al ano Grandes manchas de sangre en las heces. La sangre aparece a través del orificio anal. Se observa inflamación del ano 3 Menor de 25% Heces líquidas con región anal húmeda Heces de color rojo oscuro. La sangre se extiende en gran medida alrededor de la región anal. Se observa inflamación del ano o Análisis macroscópico Para el análisis macroscópico del intestino grueso de las ratas, se determina la presencia de sangre y se mide la longitud del colon indicativo del grado de inflamación. o Análisis histológico Los segmentos de colon se fijan con paraformaldehído al 4% en PBS y se deshidratan con soluciones de alcohol a concentraciones crecientes del 70, 80, 90 y 100%. A continuación, se someten a xilol en campana a temperatura ambiente con agitación orbital. Una vez que están deshidratados los segmentos se incuban a 60ºC en una mezcla de xilol:parafina (1:1) y se incluyen en parafina a 60ºC donde permanecen toda la noche. Para terminar, se montan los bloques de parafina con el tejido y se dejan solidificar a temperatura ambiente. Una vez que están solidificados los bloques de parafina con el tejido, con ayuda de un microtomo se realizan cortes de colon de 5 μm de espesor y se adhieren a un portaobjetos que contiene un adhesivo (StarFrost® adhesive slides, Knittle, Glaser, Alemania) y conservan a temperatura María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 15 ambiente hasta su utilización. Las secciones de colon sobre el portaobjetos se tiñen con hematoxilina-eosina, colorante que pigmenta las estructuras ácidas con un color granate, como son los núcleos; y las básicas con un tono rosado, como el citoplasma, respectivamente. Cuando se finaliza la tinción para poder observar las muestras al microscopio se utiliza pegamento de montaje EUKITT®. El análisis de las muestras se llevó a cabo con el microscopio óptico Axioskop 40 Carl Zeiss equipado con una cámara fotográfica digital SPOT Insight V3.5 y un programa de tratamiento de imágenes SPOT Advanced 3.5.4.1. Para poder evaluar el daño histológico de las muestras se empleó el método descrito por Gaudio (Gaudio et al., 1999) en el que los parámetros que se indican en la Tabla 2 se puntúan del 0-3 según las características mostradas. Así, la evaluación se lleva a cabo por 3 observadores diferentes que dan una puntuación ciega y la valoración final que se obtiene es la suma de puntuación que se atribuye a cada parámetro y la media de los datos obtenidos por cada observador. Tabla 2. Evaluación de las alteraciones histológicas en inflamación. VALOR Destrucción del epitelio y glándulas Dilatación de las criptas glandulares Reducción y pérdida de células goblets Infiltración de células inflamatorias Edema Abscesos en las criptas 0 Morfología normal Aspecto normal Aspecto normal Ausencia de infiltración Ausencia Ausencia 1 Destrucción local de la superficie epitelial y/o cripta Dilatación local Disminución ligera de células goblets Infiltración lee en la zona subepitelial y lámina propia o base de las criptas Local Local 2 Destrucción zonal de la superficie epitelial y/o cripta Criptas dilatadas en algunas zonas Disminución en algunas zonas o moderada en general Infiltración alcanza la muscular de la mucosa Zonal y/o extendida moderada mente Zonal María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 16 de células goblet 3 Destrucción que se extiende por mucosa y/o submucosa y/o pérdida de criptas Criptas dilatadas en la mayor parte del tejido Disminución extendida o completa de células goblets Infiltración severa que se extiende hasta la submucosa y/o muscular propia Extendida y severa Extendido por todo el tejido ▪ REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL El ARN total se extrae del colon distal mediante el Kit comercial “RNeasy® Mini” (Método Quiagen). La concentración, pureza e integridad del ARN total obtenido se determinan mediante espectrofotometría (absorbancia a 260nm y 280nm) y electroforesis en gel de agarosa al 1%. El ARN obtenido se somete a una transcripción reversa, usando 1µg de ARN total y el kit comercial “QuantiTect® Reverse Transcription” (Método Quiagen) para obtener el ADN complementario (ADNc). En ambos casos se siguieron las instrucciones del fabricante. Para la reacción de amplificación se utiliza: 1µl de ADNc problema, 0,4µM de cebadores específicos y 10µl de la enzima SsoFastTM EvaGreen® Supermix (Bio-Rad). En todos los casos se incluyen blancos que no tienen ADNc. Se utiliza β-actina como gen de referencia para la normalización de los valores de ARNm de las diferentes muestras. La secuencia de los cebadores fue diseñada de acuerdo a la secuencia de ADNc disponible en la base de datos Genbank y utilizando el programa informático PerlPrimer v1.1.14 (Parkville, Vic., Australia). Los cebadores utilizados se resumen en la tabla 3. La amplificación se realiza en el termociclador MiniOpticonTM (Bio-Rad) utilizando el siguiente protocolo: 3 minutos a 95ºC para desnaturalizar el ADN, seguido de 35 ciclos de 40 segundos a 95º, 40 segundos a 58ºC y 40 segundos a 72ºC y, por último, una etapa de elongación de 3 minutos a 72ºC. Posteriormente se realiza un análisis de curvas de disociación calentando la María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 17 muestra desde los 65ºC hasta los 95ºC en intervalos de 1ºC y monitorizando la fluorescencia. Esta curva representa la temperatura de separación de las cadenas de ADN o temperatura de fusión frente a la fluorescencia emitida por el producto de PCR. La temperatura de fusión es específica para cada fragmento de ADN amplificado. La obtención de un único producto de PCR fue confirmado por la aparición de un único pico en la curva de disociación obtenida. Para cada ADNc, la reacción de PCR se hace por triplicado. En cada muestra, se determinó el número de ciclos necesarios para alcanzar un nivel de fluorescencia umbral (Ct). Los resultados se analizan usando el método comparativo de Ct en una hoja de cálculo (Gene Expression Macro) proporcionada por BioRad (Vandesompele et al., 2002). Tabla 3. Cebadores específicos para PCR en Tiempo Real. GEN SENTIDO (5’ … 3’) ANTISENTIDO (5’ … 3’) IL-1β CTTTCGACAGTGAGGAGAATGAC CCACAGCCACAATGAGTGAC IL-6 ACAAGTCGGAGGCTTAATTACA GAAAAGAGTTGTGCAATGGCAA TNFα CTCACACTCAGATCATCTTCTC TGGTATGAAATGGCAAATCGG β-actina ACCCACACTGTGCCCATCTACGGAACCGCTCATTGCC ▪ PRESENTACION DE LOS RESULTADOS Y MÉTODOS DE ANÁLISIS DE DATOS Los resultados se muestran como el error estándar de la media (EMM). El número de animales utilizados en cada condición experimental fue de 6 (n=6). Para realizar comparaciones de múltiples medidas se utilizó el test ANOVA, un análisis de varianza de dos vías, seguido del test de Bonferroni o Tukey según el caso. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Efecto de la suplementación de creatina en ratas sin tratar y tratadas con DSS, sobre el peso corporal y el DAI (Índice de Actividad de la Enfermedad) Se ha evaluado el efecto de la creatina en un modelo de colitis crónica en ratas tratadas con DSS. Tal como se explica en Métodos el tratamiento consistió en un periodo de suplementación solo con creatina seguido de 3 ciclos con DSS-agua. María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 18 Para evaluar el efecto de la creatina se mide el peso corporal de las ratas a lo largo de todo el periodo de estudio. Los resultados recogidos en la Figura 8 muestran que las ratas tratadas con DSS, a partir del séptimo día desde el comienzo del tratamiento con DSS, es decir, en torno al día 21, ganan menos peso que las ratas que solo toman agua. Este efecto se ve reducido en las ratas con colitis que además recibieron el suplemento de creatina. Figura 8: Peso corporal relativo de las ratas a lo largo del estudio experimental Se representa el porcentaje de peso corporal respecto al del día de inicio del estudio. Media ± EMM (6 ratas en cada grupo experimental). Test de Tukey: a p<0,01 vs. agua, b p<0,01 vs. agua + creatina. En relación con la disminución de la ganancia de peso observada en los grupos de ratas tratados con DSS, un estudio en el que se demostró que los animales suplementados con creatina eran menos susceptibles a la pérdida de peso en una colitis aguda inducida con DSS. Por otro lado, en el mismo estudio, para corroborar este hecho se indujo una colitis con ácido TNBS (trinitrobencenosulfónico) donde también se observó una menor ganancia de peso del grupo tratado, a diferencia del que, además de TNBS, llevaba suplemento de creatina (Glover et al., 2013). María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 19 También se evaluó el Índice de Actividad de la Enfermedad (DAI). Este evalúa los signos que indican la presencia de inflamación en el colon a lo largo del tratamiento con DSS. Como se observa en la Figura 9, el DAI aumenta los días 21, 37 y 49 en aquellas ratas tratadas con DSS siendo menor en las suplementadas con creatina en los días 21 y 49. Figura 9: Índice de actividad de la enfermedad (DAI) a lo largo del estudio experimental. Media ± EMM (6 ratas en cada grupo experimental). Test de Bonferroni: a p<0,05 vs. agua, b p<0,05 vs. agua + creatina, c p<0,05 vs. DSS. Algunas publicaciones afirman que la suplementación oral con creatina en ratones inflamados con DSS reduce la severidad que se produce en la enfermedad inflamatoria intestinal (Wallimann et al., 2021). Esto se puede ver corroborado en la enfermedad de Crohn donde se realizó un estudio en una persona joven para comprobar si el suplemento con creatina podía aliviar los síntomas de la enfermedad. Para ello se empleó 1,5 g/día de creatina durante 6 meses, mostrándose un efecto positivo al atenuar el índice de actividad de la enfermedad y, por tanto, la sintomatología y las alteraciones histológicas de esta patología (Roy y Lee, 2016). Otro ejemplo más reciente es el ensayo clínico que se ha llevado a cabo en los últimos cinco años (2016 – 2021) en la Universidad de Colorado (Denver) en el que a 6 pacientes con colitis ulcerosa leve – moderada se les administró 21 g/día de creatina durante 8 semanas, tras las cuales se María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 20 observó una disminución de la inflamación de la mucosa, propia de la colitis ulcerosa, y una reducción de la permeabilidad intestinal (Wallimann et al., 2021; NCT02463305). 2. Efecto de la suplementación con creatina sobre la longitud y el daño histológico del colon inducido por DSS. El acortamiento del colon es considerado un signo de colitis. De esta forma, al finalizar el estudio, se midió la longitud de este en las ratas que solo tomaban agua, en las ratas tratadas con DSS y en aquellas suplementadas con creatina mostrándose diferencias significativas (Figuras 10 y 11). Como era de esperar, las ratas que recibieron DSS presentan menor longitud del colon respecto a las ratas no tratadas, y las ratas que además recibieron creatina junto a DSS presentan una reducción menor del colon. Figura 10: Fotografías representativas del ciego y del colon. María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 21 Figura 11: longitud del colon. Se representa la longitud del colon de cada grupo de ratas. Media ± EEM (6 ratas en cada grupo experimental). El ANOVA reveló un efecto del DSS y de la creatina sobre la longitud del colon (p<0,001). Test de Tukey: a p<0,05 vs. agua, b p<0,05 vs. agua + creatina, c p<0,05 vs. DSS. En relación con nuestros resultados, muchos estudios en los que se administró DSS para inducir una colitis en los que se observó que los animales no tratados tenían una longitud normal del colon a diferencia de los que sí recibieron un tratamiento de DSS en los que se observó un acortamiento del mismo (Li et al., 2018). Además, los animales suplementados con creatina vieron reducida su susceptibilidad a la colitis inducida por DSS, al no presentar la misma inflamación ni el colon tan acortado como los que solo tenían tratamiento con DSS (Glover et al., 2013; Turer et al., 2017). El análisis histológico del colon de las ratas con DSS y DSS + creatina se realizó para confirmar que la colitis estaba siendo inducida correctamente, y para estudiar el efecto de la suplementación con creatina sobre los daños causados por el DSS. De igual forma y, a modo de control, se realizó el mismo análisis en el colon de las ratas que bebieron agua y agua + creatina. Tal como se explica en Métodos, el análisis se realiza sobre cortes histológicos de colon de ratas pertenecientes a cada uno de los grupos experimentales, que han sido teñidos con Hematoxilina/Eosina y asignando un valor numérico a cada uno de los parámetros establecidos (Tabla 2 de Métodos) obteniendo finalmente una puntuación global del daño histológico. En la Figura 12 se muestran fotografías representativas de los tejidos teñidos de los cuatro grupos experimentales, y en la Figura 13 se representa la puntuación del daño histológico. Como era de esperar las ratas tratadas con DSS presentan una puntuación de 7,2 ± 2,1 indicando que el DSS ha causado daño que se aprecia en la mucosa y submucosa del colon. Estos daños fueron revertidos, al menos en parte, en las ratas que, además de DSS, fueron suplementadas con creatina donde la puntuación obtenida fue de 4,7 ± 1,1. Las imágenes recogidas en la Figura 12, muestran que las ratas tratadas con DSS tienen, principalmente la mucosa y submucosa, con pérdida de la estructura normal de las criptas, de las células caliciformes, y de los colonocitos, presentando, además, edema e infiltración de células inflamatorias. También se observa que aquellas ratas que además del DSS recibieron creatina presentan una estructura de la pared del colon casi normal, manteniendo cierta integridad en el epitelio (colonocitos y criptas) y prácticamente sin edema ni infiltración. Estos resultados nos confirman que el efecto protector de la creatina también ocurre a nivel histológico. María Blanca Lucena Leiva Trabajo Fin de Grado 28 10. Da Silva RP, Kelly KB, Leonard K-A, Jacobs RL. Creatine reduces hepatic TG accumulation in hepatocytes by stimulating fatty acid oxidation. Biochim Biophys Acta BBA - Mol Cell Biol Lipids. 2014; 1841(11): 1639-1646. 11. Dutton JS, Hinman SS, Kim R, Wang Y, Allbritton NL. 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