Utilización del ensayo del ácido 2-tiobarbiturico (ATB) para evaluar el proceso autooxidativo en alimentos

96 Grasas y Aceites Vol. 48. Fase. 2 (1997), 96-102 REVISION Utilización del ensayo del ácido 2-tiobarbitúrico (ATB) para evaluar el proceso autooxidativo en alimentos Por I. M. Vicario Romero, R. Guillen Sans y iVI. Guzman Chozas* Área de Nutrición y Bromatología. Departamento de Bioquímica, Bromatología y Toxicología. Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla, el. Prof. García González, s/n. 41012 Sevilla. RESUMEN Utilización del ensayo del ácido 2-tiobarbitúrico (ATB) para evaluar el proceso autooxidativo en alimentos En esta revisión científica se recogen diferentes aspectos de la aplicación del ensayo del ácido 2-tiobarbitúrico (ATB) a la medida del grado de autooxidación de alimentos lipidióos. Se consideran las diferentes formas de procesado del alimento, de inducción voluntaria a la autooxidación, de preparación de las muestras, técnicas empleadas y posibles interferencias. Se contempla el estudio y aplicación del método a muestras de carne, pescados, huevos, leche y derivados lácteos, cereales, productos dietéticos infantiles, grasas animales y aceites vegetales comestibles. Se hace referencia a la posible correlación con otros índices de oxidación ya establecidos, como el índice de peróxidos y otros, así como también la posible correlación favorable entre los valores del índice o número de ATB y la evaluación sensorial del proceso autooxidativo (grado o estado de rancidez). PALABRAS-CLAVE: Acido 2-tiobarbitúrico - Alimento - Autoxidación - Rancidez - Revisión (artículo). SUMMARY Use of the 2-thiobarbituric acid (TBA) test for evaluation of the autoxidative process in foods. In this overview several aspects concerning the application of 2-thiobarbituric acid (TBA) test for measuring oxidative rancidity in foods are described and discussed. Different factors like food processing, sanriple induced oxidation and preparation, applied methodologies and interferences, are considered. The application of the TBA test to some foods like meats, fish, eggs, milk and dairy products, cereals, infant-foods, animal fats and vegetable oils are described. Correlation between TBA index or TBA number and other oxidation indices (i.e. peroxide value) as well as sensory evaluation are also considered. KEY-WORDS: Autoxidation - Food - Rancidity - Review (paper) - 2-Thiobarbituric acid. 1. INTRODUCCIÓN El ensayo del ácido 2-tiobarbitúrico (ATB) tiene su origen en un trabajo publicado por Kohn y Liversedge (1944) sobre los productos de oxidación de tejidos animales. Estos autores sugirieron que la sustancia reaccionante debería tratarse de un compuesto carboníiico. Bernheim etal. (1948) estudiaron la reacción entre el ATB y los productos de oxidación de determinadas sustancias lipídicas. De acuerdo con estas experiencias pioneras los productos de reacción coloreados, originados a partir de la oxidación de ácidos grasos insaturados, y su posterior reacción con ATB, se debían a la formación de los ácidos alquilidentiobarbitúricos. Los primeros científicos que utilizaron esta reacción para detectar la autooxidación en alimentos, más concretamente en grasa de leche, fueron Patton y Kurtz (1951). Estos autores comprobaron que el espectro de absorción obtenido al hacer reaccionar la grasa de leche oxidada con ATB era similar al del pigmento rojo (Xmáx=530-532 nm) que se obtenía cuando reaccionaban directamente malondialdehído (MDA) y reactivo ATB. A partir de estas observaciones extrajeron la conclusión de que el MDA tenía una especial significación o protagonismo en la incidencia de la rancidez (término sensorial que se deriva del proceso de autooxidación de las grasas) de la grasa alimentaria, y en la oxidación de las membranas tisulares de los tejidos vivos, en general. Si realizamos una revisión de la bibiliografía acumulada referente al ensayo del ATB, tres han sido las técnicas generalmente empleadas: - La técnica de destilación, de Tarladgis et al., (1960), aplicada habitualmente a alimentos de origen animal. - La de calentamiento a reflujo (Caldwell y Grogg, 1955; Cain et al., 1956; Pokorny y Dieffenbacher, 1989), sin etapa de separación previa. - La de extracción simple, aplicada por primera vez a los aceites vegetales por SidweII etal. (1954), y con modificaciones recientes en las que se introduce la extracción en fase sólida para su aplicación en carnes (Raharjo etal., 1993). Mientras que en la técnica de extracción simple se extraen de la muestra las sustancias reaccionantes con ATB, empleando una fase acuosa en la que está disuelto el reactivo y posteriormente se calienta, en la (c) Consejo Superior de Investigaciones Científicas Licencia Creative Commons 3.0 España (by-nc) http://grasasyaceites.revistas.csic.es Vol.47. Faso. 2(1997) 97 técnica de calentamiento a reflujo la reacción se realiza directamente entre la muestra y el reactivo. En la técnica de destilación se hace una separación previa de las sustancias reactivas por volatilización a altas temperaturas. Existen adecuadas revisiones donde se comparan las diferentes técnicas en su aplicación a los aceites vegetales comestibles (Guillén-Sans y Guzmán-Chozas, 1993; Sans etal., 1993) o a carnes (Sorensen y Jorgensen, 1996). Aunque, dada la complejidad del proceso, todavía no se ha llegado a esclarecer por completo el mecanismo de esta reacción, sí que se ha demostrado su utilidad, junto con otras técnicas de medida de la autooxidación, en la detección de los cambios oxidative que se producen en los alimentos y en los sistemas biológicos por factores tales como el aire (oxígeno), el calor, la luz, las radiaciones ionizantes y la presencia de iniciadores de la reacción en cadena, tales como las trazas de elementos metálicos (cobre, hierro...). Una de las críticas frecuentes a esta reacción es su poca especificidad, ya que otros aldehidos presentes en el alimento también reaccionan con ATB dando un compuesto coloreado, que puede interferir en la evaluación total de la oxidación (Guillén-Sans y GuzmánChozas, 1995). 2. CARNES El ensayo del ATB se ha aplicado a muestras de ganado bovino y de cerdo, y también en menor extensión, a muestras de pollo y de pavo. El procesado o preparación de la muestra ha sido muy diverso. Así, el ensayo del ATB ha sido practicado en carnes sometidas a diversos procesos de conservación: refrigeradas y/o congeladas (Tomás y Funes, 1987), carnes cocinadas (Tarladgis etal., 1960; Shaidi etal., 1987), carnes curadas (Zisper y Watts, 1962; Yun etal., 1987) o almacenadas durante distintos períodos de tiempo. Se han comparado los resultados obtenidos en carne cruda y sometida a diversos procesos de cocinado (asado, estofado, enlatado, cocinado lento y appertización o enlatado) (Huang y Greene, 1978). Por el frecuente uso de la misma, también se han hecho estudios del ensayo del ATB en carne picada (hamburgesas) (Greene y Cumuze, 1981; Willemont et al., 1987; Raharjo et al., 1991). En muestras refrigeradas (4° C) y congeladas (-20°G) se daban valores más bajos del número de ATB que los que se daban en carne cocida. La técnica habltualmente empleada ha sido la destilación (Tariadgis et al., 1960), que en ocasiones se ha comparado con la técnica de calentamiento a reflujo, convencional después de desproteinizar con ácido tricloroacético (ATA) (Tomás y Funes, 1987). Al objeto de reducir el tiempo de duración de la técnica de destilación, a veces ardua, en carne de bovino picada se empleó el calentamiento en autoclave (Ramírez y Spillman, 1987). Asimismo se ha usado la técnica de extracción simple modificada, empleando como extractante el ácido perclórico. Se pudo concluir que la técnica de extracción era más rápida, fácil de llevar a cabo y tan exacta como lo pudiera ser la de destilación, en el control de carne de aves (Salih etal., 1987). Una mejora de la técnica de extracción simple, usando ATA, permite medir a baja temperatura (4°C) y eliminar las sustancias que interfieren mediante columnas en fase sólida (O 18) (Raharjo etal., 1991). Como longitud de onda experimental (de medida), se escogió la que correspondía al máximo de absorción del pigmento rojo (530-532 nm). Se han ofrecido fórmulas correctivas para evitar las interferencias (si las hubiera) de los pigmentos amarillo (Xmáx=450 nm) y/o anaranjado (Xmáx=497 nm) (Yu y Sinnhuber, 1962). Para calcular el número de ATB se ha hecho uso de sustancias modelo y del valor de absortividad molar del compuesto coloreado (Witas, 1972). A veces, mediante una aproximación matemática, se elimina la necesidad de usar un patrón externo (Izumimoto etal., 1990). Diversos factores pueden afectar los resultados del ensayo. La adición de antioxidantes, como galato de propilo y AEDT ocasionaban valores más bajos del índice de ATB (Rhee., 1978). Iniciadores del proceso autooxidativo, como hematina (Keskinel et al., 1964), sales de Fe (III) o tert-butilhidroperóxidos (Kosugi et al., 1991), incrementaban este índice de ATB. El tipo de especie animal y alimentación (harina de pescado), clase de músculo o profundidad desde la piel de la toma de muestra (Arefjord, 1960), interferencias frecuentes (carbohidratos) y el tamaño y grado de división de la muestra (Turner et al., 1954), ocasionaban efectos diversos sobre los resultados. Dietas ricas en hierro incrementaban el valor de las sustancias que reaccionan con ATB (TBARS) en músculo esquelético de cerdo (Miller etal., 1994). La presencia de aditivos, como alginates, aumentaba los índices del ensayo (Raharjo etal., 1989), en cambio la presencia de nitritos prevenía la rotura oxidativa de los lípidos durante el almacenamiento (Willemont, 1987). En carne de ternera a la que se había suministrado vitamina E ofrecía índices de ATB más bajos (Shortland, 1976). Se ha correlacionado el número de ATB con otros parámetros indicativos de la oxidación lipídica como el índice de peróxido (Vittuci et al., 1986) o el índice de yodo (Arefjord, 1960). En carne de bovino cruda los contenidos en hexanal y 2-3, octanodiona mostraban un grado de correlación significativamente altos con los resultados obtenidos en el ensayo del ATB; la carne estaba cruda, recién cocida, almacenada y recocinada (St. Angelo et al., 1987). Después de aplicar la técnica de destilación, se encontraron coeficientes de correlación bajos, aunque significativos, entre el número de ATB y la puntuación sensorial, en carne de bovino picada (Greene y Cumuze, 1981). La extracción en fase sólida supone una mejora de la técnica de extracción simple, aumenta la especificidad y ofrece (c) Consejo Superior de Investigaciones Científicas Licencia Creative Commons 3.0 España (by-nc) http://grasasyaceites.revistas.csic.es 98 Grasas y Aceites una buena correlación con la evaluación sensorial en carne de ternera cruda y cocinada (Raharjo et al., 1993). 3. PESCADOS Los estudios se han centrado fundamentalmente en especies de origen marino: merluza y bacalao (Crawford etal., 1979), sardina (Asahara, 1987; Rodríguez et al., 1991), arenque (Snauwarert et al., 1977), atún (Sinnhuber y Yu, 1958), caballa (Vyncke, 1975), jurel (López Capont y Barcia, 1978) salmonete (Lee y Toledo, 1977), tiburón (Kakiuchi et al., 1989) y ostras (Schwartz y Watts, 1957). Aunque también existen un número estimable de referencias que se refieren a la carpa (Mai y Kinsella, 1979; Iredale y York, 1977) y al salmón (Vittucci et al., 1986). También se ha aplicado el método en harina, aceite y salsa de pescado. La preparación de la muestra varía según los casos. Se ha controlado pescado fresco, congelado, refrigerado, almacenado varios meses, seco y salado, en filetes, rodajas, desmenuzado, picado, sin la piel, almacenado a una humedad relativa del 30-50%, envasado a vacío o irradiado, cocinado o sometido a fritura. La rancidez del pescado y los métodos a través de los cuales puede detectarse, entre ellos el método del ATB, ha sido revisada (Caroche y Jiménez-Colmenero, 1988). Como técnicas, se han empleado la destilación original (Rhee, 1978), la extracción directa utilizando ácido tricloroacético (Vyncke, 1978) y un procedimiento indirecto que suponía la extracción previa de los lípidos desde la muestra (Bratkoswska y Zwierzykowski, 1988); asimismo se ha utilizado el extractor Bligh y Dyer, que separa el MDA libre de MDA lábil, aconsejado para las muestras con muy bajo contenido graso. Los resultados que se obtuvieron con la técnica de destilación original fueron distintos en muestras de pescado, que en muestras de animales terrestres (bovino, cerdo y pollo), lo que parece lógico debido a la diferente composición en ácidos grasos insaturados. Si se trata de muestras de peces, aún se hace más necesario el empleo de un sistema antioxidantesinérgico al aplicar la técnica de destilación (Rhee, 1978). La adición de la mezcla de tripolifosfato AEDT a pescado en salsa, aunque suponía un descenso en las cifras del número de ATB, no conseguía inhibir el olor a rancio. El uso de BHT era más efectivo para reprimir el ascenso del número de ATB; pero tampoco resultaba eficaz para suprimir el desagradable efecto sensorial. Solamente mediante el empleo de una mezcla ascorbato-nitrito se conseguía detener la apreciación del desarrollo oxidative, tanto por las cifras que se obtenían del número de ATB, como en el aspecto sensorial (Satomi etal., 1988). Hemoglobina, o mioglobina, y Fe (II), aumentaban las cifras del número de ATB en aceite de pescado. empleando la técnica de destilación. La adición de AEDT enmascaraba el Fe (II), mientras que la adición de BHA prevenía el efecto adverso de los pigmentos de la sangre (Shibata y Kinumaki, 1979 a, b). Otros factores que también pueden influenciar los resultados son el tipo de especie animal (Crawford eí al., 1979), o el tipo de músculo (rojo o blanco) que se considera (Lee y Toledo, 1977). Una interferencia importante es la presencia de formaldehído (HCHO), sustancia que se origina en el pescado. El formaldehído ocasiona una turbidez o precipitado blanco, cuando reacciona con el reactivo ATB, habiéndose comprobado que una concentración superior a 25|jg/mL interfiere claramente (Almandós et al., 1986). Para evitar un proceso de separación previa (filtración, centrifugación) se podría soslayar la interferencia empleando un exceso de reactivo; más concretamente, que la ratio concentración de ATB/concentración de MDA> 1000 (Caroche y Tejada, 1988). El número de ATB se ha correlacionado satisfactoriamente con el contenido en la muestra de pescado de sustancias reductoras volátiles y con el índice de peróxido. Parece darse una buena correlación entre el ensayo del ATB y el método de HPLC con detector fotométrico (532 nm) (Kakiuchi etal., 1989). 4. HUEVOS Los estudios se han centrado en yema de huevo almacenada varios días a 23°C, empleando la técnica de destilación. Los resultados se ven afectados por factores tales como la presencia, con efecto pro-oxidante, tanto del hierro, naturalmente presente en la yema, como del cloruro de guanidina, presencia de antioxidantes, AEDT (secuestrante) (Pike y Peng, 1988a), y la influencia del pH, puesto que a valores bajos del pH se incrementa la prooxidación (Pike y Peng, 1988b). 5. LECHE Y DERIVADOS LÁCTEOS Leche (entera y en polvo) y derivados lácteos, como la caseína (Witas, 1972), fueron los primeros productos alimentarios a los que se le aplicó el método del ATB (Dunkiey y Jennings, 1951), así como mantequilla y queso, comprobándose que este ensayo mide el grado de oxidación por debajo del nivel de sensibilidad alcanzable sensohalmente (Biggs y Bryant, 1953). Las muestras se almacenaban a temperatura ambiente, refrigeradas y en salmuera, así como pasteurizadas. La técnica usualmente empleada es indirecta, mediante extracción previa de la fracción grasa. La reacción se ve afectada por la interferencia de carbohidratos (lactosa) (Biggs y Bryant, 1953), y el tipo de disolvente usado en la extracción (Pearson, 1974). (c) Consejo Superior de Investigaciones Científicas Licencia Creative Commons 3.0 España (by-nc) http://grasasyaceites.revistas.csic.es Vol.47. Faso. 2(1997) 99 En muestras de mantequilla almacenada interfería la presencia de especias (comino, tomillo) en el producto original (Farag etal., 1988). En queso mantenido en salmuera se comprobó que tanto la refrigeración como la pasteurización reducían sensiblemente la autoxidación (Hamed etal., 1987). El índice de ATB en leches y derivados lácteos se han comparado con otros índices como el de Kreis, el índice de yodo, índice de acidez y peróxidos. Se comprobó (Patton y Kurtz, 1951) que en lácteos el ensayo del ATB era más sensible que los tradicionales ensayos del índice de yodo y del índice de Kreis, y presenta una correlación adecuada con las pruebas sensoriales (Dunkiey, 1951). 6. CEREALES, PRODUCTOS DE REPOSTERÍA Y PRODUCTOS DIETÉTICOS INFANTILES El ensayo del ATB se aplicó por primera vez en productos de panadería a mediados de la década de los cincuenta (Caldwell y Grogg, 1955). En productos procesados, tales como pasteles y salsas, se determinó el número de ATB, haciendo uso de la absortividad molar del pigmento rojo (Witas, 1972). En productos de pastelería elaborados con margarina y edulcorantes (sacarosa y maltitol), se comprobó mediante el ensayo del ATB que se manifestaba un mayor efecto prooxidante cuando en la composición el edulcorante usado era la sacarosa (Wada etal., 1978). Una modificación en el ensayo del ATB, en la que se calcula la absorbancia de los aductos ATB-MDA y ATB-sacarosa, permite corregir la interferencia debida a los azúcares (Du y Bramiage, 1992). Varios productos dietéticos infantiles se almacenaron en condiciones ordinarias durante dos años; periódicamente se investigaban distintos índices para evaluar el progreso de la oxidación, entre ellos la prueba del ATB, que fue la que mejor coeficiente de correlación presentaba con las pruebas sensoriales (Karadzhov, 1973). 7. GRASAS ANIMALES El método se ha aplicado a sebo y manteca de cerdo sometidos a tratamiento térmico, que iba desde 120°C a 240°C (Kalac etal., 1988). Tradicionalmente se ha empleado la técnica de extracción simple (Sidwell et al., 1954; Vargas y Gutiérrez, 1956). Pokorny etal., (1985) desarrollaron una técnica adaptable a los primeros estadios de oxidación de la manteca de cerdo. Se han hecho otras pruebas con antioxidantes y sinérgicos, y también con catalizadores clásicos del proceso autooxidativo (hierro, cobre e hidroperóxidos preexistentes en la muestra) (Kosugi etal., 1991). En manteca de cerdo existía una buena correlación entre las pruebas sensoriales y el número de ATB (Jacobson et al., 1964). Maleki (1974) llevó a cabo una validación del método de grasas y aceites. 8. ACEITES VEGETALES COMESTIBLES El ensayo del ATB se ha aplicado a diversos aceites: aceite de oliva virgen y refinado, aceites de soja, aceites de girasol, sésamo, algodón, maíz, colza, cártamo y cacahuete. La introducción voluntaria y en un tiempo breve de la autooxidación en la muestra incluyó diversos procedimientos: hidrogenación parcial, conservación a la luz difusa, método del oxígeno activo (A.O.M.) (SidweII et al., 1954; Gutiérrez y Vargas, 1957), almacenamiento en envases cerrados y abiertos durante varios meses (Bolinas y Rossetti, 1977), envejecimiento de los aceites a 37°C y 60°C (Jacobson etal., 1964), la adición de antioxidantes y sinérgicos con posterior calentamiento entre 38°C-75°C (Fioriti etal, 1974), la termooxidación en estufa a distintas temperaturas (Arya y Nirmala, 1971; Kalac et al., 1988; Guillén-Sans et al., 1988; Guillén-Sans et al., 1991). Las diferentes técnicas utilizadas para medir la autooxidación lipídica en aceites vegetales han sido revisadas recientemente (Guillén-Sans y Guzman Chozas, 1993). Se ha empleado la técnica de extracción simple original, midiendo las absorbancias a 452 nm y 530 nm. Reduciendo la temperatura de calentamiento, se consigue estabilizar el pigmento amarillo (450 nm) y se obtiene una mejor correlación con las pruebas sensoriales (flavor) que en la técnica original (Marcuse y Pokorny, 1994). En tiempos se utilizó un sistema cerrado y temperaturas de ebullición (100°G) para llevar a efecto la reacción (Taüfel y Zimmerman, 1960). Utilizando sustancias modelo, y haciendo uso de la absortividad molar, se determinó el número de ATB a partir de los valores de absorbancia a 532 nm (Witas, 1972). Pero la técnica más adecuada ha demostrado ser la extracción simple, modificada y optimizada en aceites de oliva, aplicable con igual eficacia a los aceites de semilla (Vicario et al., 1988, 1990). Otras técnicas dispersas se han empleado. Papel reactivo de ATB, que contenía ácido cítrico y tiosulfato sódico, podría ser válida como prueba semicuantitativa (Asakawa y Matsushita, 1975). En aceite de soja termooxidado se comprobó la existencia de correlación entre el incremento de MDA y el descenso de tocoferoles. Tanto MDA (malondialdehído) como las TBARS (sustancias que reaccionan con ATB) ascendían durante el proceso oxidative (oxidación a 170°G) en presencia de tocoferol (Kishida et al., 1991). Entre los valores TBARS y el consumo de oxígeno también se da una buena correlación, creciendo ambos linealmente hasta ciertos valores de consumo de oxígeno en los que los valores TBARS se estabilizan e incluso descienden (Kishida etal., 1993). En determinadas condiciones ni el índice de peróxidos ni el índice de Kreis eran pruebas adecuadas para determinar el período de inducción, pero sí se pudo lograr a través del ensayo del ATB (Gutiérrez y Vargas, 1960; Arya y Nirmala, 1971). El aceite de algodón, utilizado como muestra-sustrato, sirivió para un estudio (c) Consejo Superior de Investigaciones Científicas Licencia Creative Commons 3.0 España (by-nc) http://grasasyaceites.revistas.csic.es 100 Grasas y Aceites connparativo del método del ATB frente a otros métodos y técnicas, tales como la quimioluminiscencia, HPLC, o la resonancia de spin electrónico (Yang etal., 1991). Entre los factores que afectan o pueden afectar, los resultados del ensayo se podría citar el tipo de aceite vegetal, su forma de envasado y el almacenamiento de las muestras (debido principalmente a la inestabilidad del MDA), junto con el tipo de técnica aplicado (Guillén-Sans et al., 1993), la elección adecuada de la longitud de onda de medida (532 nm, 452 nm) y la posible presencia de sustancias que rebajan la oxidación (gliadina, albúmina) (Taguchi etal., 1988). BIBLIOGRAFÍA Almandós, M. E., Giannini, D. H., Ciarlo, A. S., Boeri, R. L. 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