Estudio del Virus del Papiloma Humano como Factor Etiológico y de la Expresión de P16 en el Carcinoma de Células Escamosas de la Cavidad Oral

  TRABAJO FIN DE MÁSTER Estudio del Virus del Papiloma Humano como Factor Etiológico y de la Expresión de P16 en el Carcinoma de Células Escamosas de la Cavidad Oral Elena León Suárez Universidad de Sevilla, 2014   DON MANUEL DE MIGUEL RODRÍGUEZ, Doctor en Ciencias Biológicas y Profesor Titular del Departamento de Citología e Histología Normal y Patológica de la Universidad de Sevilla y DON JOSÉ RAMÓN ARMAS PADRÓN, Doctor en Medicina y Cirugía y Profesor Titular del Departamento de Citología e Histología Normal y Patológica de la Universidad de Sevilla CERTIFICAN: Que el trabajo titulado “Estudio del Virus del Papiloma Humano como Factor Etiológico y de la Expresión de P16 en el Carcinoma de Células Escamosas de la Cavidad Oral”, desarrollado por Dª. ELENA LEÓN SUÁREZ como Trabajo Fin de Máster en Ciencias Odontológicas ha sido realizado bajo su dirección, estando conformes con su presentación al encontrarlo acorde a la normativa actual aprobada por la Universidad de Sevilla. Y para que así conste, firman el presente documento en Sevilla a 24 de Junio de 2014. Fdo. Prof. De Miguel Rodríguez. Fdo. Prof. Armas Padrón.   ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 6 1.1. Epidemiología ....................................................................................... 6 1.2. Factores de riesgo ................................................................................ 8 1.2.1. Tabaco ....................................................................................... 8 1.2.2. Bebidas alcohólicas ................................................................. 11 1.2.3. Enfermedades de la mucosa oral ............................................ 12 1.2.4. Enfermedades sistémicas ........................................................ 13 1.2.5. Susceptibilidad genética .......................................................... 14 1.2.6. Agentes infecciosos ................................................................. 16 1.2.7. Factores dietéticos ................................................................... 18 1.2.8. Salud oral y dental ................................................................... 19 1.2.9. Enjuagues bucales con alcohol ............................................... 20 1.2.10. Exposición ocupacional ......................................................... 20 1.2.11. Estatus socioeconómico ........................................................ 21 1.3. Características clínicas ...................................................................... 21 1.3.1. Carcinoma de células escamosas de lengua .......................... 21 1.3.2. Carcinoma de células escamosas de suelo de boca ............... 24 1.3.3. Carcinoma de células escamosas de mucosa bucal y encía ... 25 1.3.4. Carcinoma de células escamosas de paladar ......................... 27 1.4. Anatomía patológica .......................................................................... 28 1.5. Estadios clínicos ................................................................................ 31 1.6. Carcinogénesis ................................................................................... 33 1.6.1. Cambios genéticos en el carcinoma oral de células escamosas ........................................................................................ 33 1.6.2. Cambios en genes supresores tumorales y oncogenes en el carcinoma oral de células escamosas ............................................... 35 1.7. Virus del Papiloma Humano (HPV).................................................... 46 1.8. Relación entre HPV y cáncer oral ..................................................... 52 2. OBJETIVO .................................................................................................. 56 3. MATERIAL Y MÉTODO ............................................................................. 58 3.1. Material ................................................................................................ 58 3.2. Método ................................................................................................. 60   4. RESULTADOS ........................................................................................... 63 5. DISCUSIÓN ................................................................................................ 68 6. CONCLUSIONES ....................................................................................... 75 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 77   1. INTRODUCCIÓN Elena León Suárez Introducción 6  1. INTRODUCCIÓN El cáncer de la cavidad oral pertenece a un grupo de neoplasias englobadas en los denominados carcinomas de cabeza y cuello o también llamados tumores de vías aerodigestivas superiores. Éstos engloban una gran variedad de neoplasias con diferencias en la incidencia, la forma clínica de presentación, la progresión, el enfoque terapéutico y el pronóstico 1. Se encuentran localizados en labios, cavidad oral, nariz y senos paranasales, glándulas salivares, nasofaringe, orofaringe, hipofaringe y laringe 2-4. Estos carcinomas, entre otros motivos, deben su importancia a su incidencia, ya que se encuentra en el sexto lugar de los cánceres diagnosticados en el mundo, con más de 600.000 casos nuevos diagnosticados anualmente y constituyendo la octava causa más común por muerte debida al cáncer 2,5. Esto se debe a que suelen ser diagnosticados en etapas tardías, teniendo por consiguiente un pobre pronóstico. Además, sus tratamientos podrían dejar severas secuelas funcionales y estéticas, con un gran impacto en la calidad de vida y salud psicológica de los pacientes 6. Más concretamente, el cáncer de cavidad oral define a las neoplasias localizadas en la mucosa de los labios, la mucosa oral, la encía (donde se incluye el trígono retromolar y el reborde alveolar), el paladar duro, los dos tercios anteriores de la lengua y el suelo de la boca 4,6,7 1.1 EPIDEMIOLOGÍA La prevalencia de los carcinomas de cabeza y cuello varía en función de las distintas zonas geográficas. Por ejemplo, en Europa se sitúan los sextos en cuanto a incidencia y los octavos en cuanto a tasa de mortalidad 8. Se sabe que la incidencia del cáncer oral es mayor en hombres que en mujeres de edad avanzada 1,6, localizándose con mayor frecuencia en la lengua (particularmente en la porción posterior del borde lateral) 9,10. Además, es más frecuente entre las personas de raza negra que entre las de raza blanca 9,10. Elena León Suárez Introducción 7  Estas diferencias se relacionan principalmente con factores de riesgo tales como el consumo de alcohol y tabaco, la dieta, el nivel socioeconómico, las creencias culturales y el estado de salud, entre otros 6,9. Hoy día se están observando variaciones en la incidencia de estos tumores, apreciándose un aumento en mujeres y jóvenes menores de 45 años que no fuman ni beben alcohol 6,11. Estas variaciones están relacionadas con el estudio de nuevos factores causales, como la infección por el virus del papiloma humano (HPV). Según el Programa de Registros de Cáncer de los Estados Unidos durante 1998-2008, existe un aumento en la incidencia de tumores en las zonas relacionadas con el HPV, y viceversa 5,6. En cuanto a la tasa de mortalidad debida a estos tumores, ésta es más elevada en hombres que en mujeres, y además existen grandes variaciones a nivel mundial, siendo más alta la mortalidad en la zona sur y centro de Asia 6. El carcinoma de células escamosas de la cavidad oral agresivo implica un rápido crecimiento del tumor a estadios avanzados, diseminación de las células tumorales a estructuras vitales y metástasis tempranas regionales o a distancia 12. Debido a estas características, el cáncer de la cavidad oral tiene un pronóstico relativamente adverso, y su tasa de supervivencia a los 5 años es aproximadamente del 45-50 %; incluso muchos pacientes sufren recidivas o metástasis y mueren al año del diagnóstico 6,10-12. Esto es debido al hecho de que a menudo son diagnosticados en una etapa avanzada 6, a pesar de que la cavidad oral es fácil de examinar y accesible para la biopsia, y de que la detección en estadios tempranos se considere la mejor forma de mejorar la supervivencia 11. Por otro lado, existe una relación entre la localización del tumor y la supervivencia basada en las metástasis a ganglios linfáticos del tumor primario. Así, lesiones en la lengua y en el área del trígono retromolar tienen un gran riesgo de metástasis al cuello comparada con lesiones en el área de la mucosa bucal o de la encía 6,12. Las lesiones con metástasis en los ganglios linfáticos tienen un pronóstico más pobre, y la supervivencia es significativamente más baja que en caso de no tener metástasis ganglionares. También afecta a la Elena León Suárez Introducción 8  supervivencia el tamaño del tumor, que está significativamente relacionado con las metástasis subclínicas y las recidivas 12. Últimamente se ha visto un aumento en la supervivencia en lesiones con presencia del HPV 6,7. 1.2 FACTORES DE RIESGO Como se ha comentado anteriormente, la aparición de los carcinomas de la cavidad oral está fuertemente asociada con factores de riesgo medioambientales y con el estilo de vida, y se considera de etiología multifactorial. El alcohol y el tabaco se consideran los principales factores etiológicos del cáncer oral. No obstante, las variaciones en la incidencia de los últimos años hace pensar que existen otros factores de riesgo importantes relacionados con estas neoplasias 6,7,11-13. 1.2.1 Tabaco Tabaco con humo. Se sabe que este es el principal factor de riesgo de cáncer oral 6,9-11,14, aunque se sabe que la zona de la laringe parece ser la más vulnerable a los efectos carcinógenos del tabaco 11. La actividad carcinogénica se debe a que las distintas partículas que genera el tabaco, como las nitrosaminas y los radicales libres, pueden actuar como iniciador, promotor o como cocarcinógeno 4,10,14. En determinados tipos de tabaco fumado, como es el tabaco en pipa, la displasia se localiza en la zona de colocación de esta, por lo que se tiende a pensar que, en estos casos, el efecto carcinogénico se debe a un efecto térmico e incluso a un trauma físico 4. El riesgo de padecer cáncer oral aumenta con la frecuencia de cigarrillos, la duración del consumo y la edad de inicio del hábito 1,4,10,11. Lo mismo que existe esta demostrada relación causa-efecto, también se sabe que el hecho de dejar de fumar disminuye el riesgo de padecer cáncer oral, y lo hace gradualmente en el tiempo e independientemente de la cantidad de tabaco previamente consumida. El exceso de riesgo desaparece aproximadamente a los 20 años del cese del hábito 11. Elena León Suárez Introducción 9  Existen estudios sobre cómo afectan los distintos tipos de tabaco fumado a estas neoplasias, viéndose por ejemplo que el tabaco negro tiene mayor riesgo que el tabaco rubio, o cómo el consumo de puros o pipas tiene un mayor riesgo que el cigarrillo industrial 11. En zonas como la India, donde se fuman cigarrillos tradicionales hechos a mano como bidi, chutta o cheroot (son más alcalinos y contienen más sustancias carcinogénicas), existe un mayor riesgo respecto a los cigarrillos industriales. Esto se puede explicar por el hecho de que estos cigarrillos no contienen solo tabaco, sino que en estos países se le podrían añadir otros ingredientes 11. En general, existen zonas de la cavidad bucal que tienen un mayor riesgo de padecer estas neoplasias. Tanto el suelo de la boca como el paladar blando tienen mayor riesgo que la lengua, la mucosa bucal y las encías 11. Además, en función del tipo de tabaco, se pueden ver más afectadas algunas zonas de la cavidad oral; tal es el caso de puros y pipas, donde se afecta más el paladar blando, el suelo de la boca, la encía y el resto de la mucosa oral que la lengua 11. Tabaco sin humo. Otra forma de consumo de tabaco es el tabaco sin humo, el cual parece tener también efecto carcinogénico. Aquí tenemos el tabaco masticado y el preparado para ser inhalado (snuff). El tabaco masticado puede ir solo o acompañado de otras sustancias, dependiendo de las distintas zonas geográficas 6,11, y tiene una relación significativa con el riesgo de padecer cáncer oral 6,10,11. Este riesgo aumenta tanto con la cantidad como con la duración del hábito y, en este caso, parece no estar relacionado ni con dejar el hábito ni con la edad de inicio de este 11. Asimismo, es más frecuente la aparición de cáncer en la encía y en el resto de la boca que en la lengua 11. Se ha estudiado el efecto de la combinación de fumar y masticar tabaco, y se ha visto que tiene mayor riesgo que ambos hábitos por separado, aunque sin llegar a ser un aumento multiplicativo 11. En cuanto al tabaco que se deja en la boca, debajo de los labios o en los vestíbulos bucales, hábito común en Escandinavia y Estados Unidos, no Elena León Suárez Introducción 16  de otro tipos de cánceres no parece incrementar el riesgo de cáncer de cavidad oral 11. 1.2.6 Agentes infecciosos La inflamación causada por infecciones ha sido sugerida como uno de las causas evitables más importantes de cáncer en general. Dado que las infecciones dentales tienen una alta prevalencia en la población, su asociación con el cáncer las hace interesante y un motivo de preocupación 13. Infecciones bacterianas. A menudo, los pacientes con cáncer oral presentan una salud oral pobre en general, suelen tener dientes cariados y periodontitis. El número de dientes perdidos puede estar asociado al cáncer oral, aunque la salud oral puede ir unida a otras variables como son el consumo de tabaco y alcohol que nos confundan y que sean difíciles de controlar a la hora de hacer un estudio epidemiológico. Sin embargo, la enfermedad periodontal ha demostrado aumentar el riesgo de padecer cáncer de cabeza y cuello, incluso en individuos que nunca han consumido alcohol o tabaco. Además, el caso de padecer periodontitis está más relacionado con un carcinoma de células escamosas pobremente diferenciado que el individuo con salud periodontal 13,14. Comparando la población microbiana de las zonas sanas y las zonas lesionadas, se han sugerido algunas bacterias orales específicas que desempeñarían un papel relevante en la carcinogénesis. Entre ellas cabe mencionar a Streptococcus anginosus y Treponema denticola 13. El mecanismo carcinogénico de estas bacterias no se conoce exactamente, pero podrían inducir proliferación celular, inhibir la apoptosis, interferir en los mecanismos de señalización celular e incluso actuar como promotores tumorales. También se podría explicar por su capacidad de metabolizar el alcohol, produciendo así un aumento en la concentración de acetaldehído. De todas formas, queda por demostrar si el control de estas bacterias afecta a la incidencia del cáncer oral 13. Candidiasis crónica. Candida albicans es el hongo aislado con mayor frecuencia en la cavidad oral, aunque parece que va en aumento el número de Elena León Suárez Introducción 17  non-albicans Candida albicans (NACA), particularmente entre los pacientes medicamente comprometidos. Las NACA son a menudo resistentes a antifúngicos comunes, y se ha visto un aumento de estos microorganismos en pacientes con cáncer oral. Las cándidas en general tienen más prevalencia en carcinomas que sobre mucosa sana de la boca 13,14. Estos hongos invaden el epitelio y pueden estar involucrados en los cambios de las leucoplasias y las displasias. Hay estudios animales que confirman su capacidad para provocar transformación maligna en la mucosa oral. Sin embargo, no se conocen los mecanismos carcinogénicos implicados. Podría ser que las nitrosaminas producidas por las cándidas iniciaran el desarrollo de la transformación maligna. También hay que señalar el metabolismo del etanol a acetaldehído, un aspecto en el que tienen particular importancia las NACA 13,14. Por otro lado, podría haber un efecto sinérgico entre la candidiasis y el estilo de vida en la carcinogénesis oral, ya que se puede asociar a otros factores de riesgo como son el tabaco y el alcohol 13. Sin embargo, no hay estudios que demuestren que el control de las candidiasis mejore la incidencia de cáncer oral 13. Infecciones virales. Los mecanismos virales de carcinogénesis están principalmente relacionados con la manipulación de la regulación genética de las células 13. Virus del Papiloma Humano. Como se menciona en el apartado 1.1, hoy día se están observando variaciones en la incidencia del cáncer de la cavidad oral, aumentando los casos de mujeres y jóvenes menores de 45 años de edad que nunca han bebido alcohol o fumado 6,11,14,18. Estas variaciones están relacionadas con el estudio de nuevos factores causales, como son la infección por el virus del papiloma humano (HPV) 6,14,18. Este aspecto se menciona más detalladamente en el apartado 1.7. Herpesvirus. El virus Epstein-Barr (EBV) está fuertemente relacionado con varias patologías malignas humanas, incluido el carcinoma de células escamosas oral. También se han encontrado niveles altos de anticuerpos frente al virus del herpes simple (HSV-1 y HSV-2) en pacientes con cáncer oral Elena León Suárez Introducción 18  cuando se comparan con los controles. Además, utilizando técnicas de hibridación in situ, se ha detectado con mayor frecuencia en tumores orales, situados en los laterales de la lengua. Si añadimos a seropositividad a HSV el hábito de fumar, se aumenta el riesgo de padecer cáncer 6,13,14. Además del virus Epstein-Barr, los virus herpes más comúnmente implicados en el cáncer oral son el herpesvirus humano tipo 8 (HHV-8) y el citomegalovirus 3. Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). La relación entre VIH y cáncer oral no está clara. Hay casos de individuos con VIH positivo o SIDA con mayor índice de cáncer oral, pero esto puede estar enmascarado por el consumo de tabaco y alcohol, o también por la mayor prevalencia de infección oral por el HPV que sufren estos pacientes 6,13. Aunque todos estos virus pertenecen a distintas familias y usan distintas estrategias para contribuir al desarrollo del cáncer, comparten algunas características, como la habilidad de infectar pero no matar su célula huésped. Estos virus oncogénicos tienden a estabilizar una infección de manera persistente, desarrollando estrategias para evadir la respuesta inmune del huésped. Además, existen otros cofactores como son la inmunidad del huésped y la inflamación crónica, así como mutaciones celulares adicionales del huésped, que también juegan un papel importante en el proceso de transformación celular 3. Por otro lado, en general no existen estudios que demuestren que el control de las infecciones virales afectaría a la incidencia de cáncer oral 13. 1.2.7 Factores dietéticos Una dieta desequilibrada y/o con deficiencias es la responsable de un cierto número de cánceres de faringe y cavidad oral 10,11. Por el contrario, una dieta rica en productos frescos, frutas, verduras crudas o cocinadas, pescado, carotenoides y aceite de oliva, está relacionada con una disminución del riesgo de cáncer en la cavidad oral, aunque también en la orofaringe, hipofaringe, y laringe 1,4,6,11,13,14. Una dieta rica en estos alimentos, como la llamada dieta mediterránea, ha demostrado su asociación con la disminución en el riesgo de cáncer oral 14,19. Esta disminución está relacionada con la cantidad consumida Elena León Suárez Introducción 19  de estos alimentos, y parece tener mayor relación con las verduras que con las frutas 11. La fibra consumida, probablemente la contenida en frutas y verduras, también disminuye el riesgo de cáncer oral 11. En cuanto a las vitaminas, la vitamina C (antioxidante) es un factor protector ante el cáncer oral, aunque en realidad es difícil separar el efecto aislado de la vitamina C de los efectos del consumo de frutas y verduras. Igualmente se han encontrado efectos protectores con el consumo de vitaminas E, A y D 1,4,9,10. Asimismo, un déficit en hierro y glutatión produce un aumento de estrés oxidativo, el cual, parece aumentar el riesgo de padecer cáncer oral 10,13. Existe mayor riesgo de padecer cáncer oral en dietas ricas en carnes rojas, grasa animal, mantequillas, pescados ahumados (que tienen un elevado contenido en nitrosaminas) y en salazón, y alimentos fritos 1,4,9,11,13. Hay estudios menores relativos a otros grupos de alimentos, en los que se observa cómo por ejemplo el alto consumo de pan está inversamente asociado al cáncer de cavidad oral y lengua; sin embargo, también se ha descrito que algunos tipos de cereales, como el trigo o el mijo, pueden aumentar el riesgo de cáncer de cavidad oral 11. El consumo de mate, una bebida muy utilizada en América del Sur, parece estar relacionado con el aumento de riesgo de cáncer de lengua y de cavidad oral en general. En este caso, es importante realizar estudios para ver cómo afecta la alta temperatura de la bebida en el proceso de carcinogénesis 6,11,20. 1.2.8 Salud oral y dental Existen distintos indicadores para valorar la salud dental y oral, como son la frecuencia diaria de cepillado dental, el material usado, el número de pérdidas dentarias, dientes empastados o dañados, ser portador de prótesis removible, frecuencia de revisiones médicas, sangrado de encías y movilidad dental. Una salud dental y oral pobre puede estar asociada a un bajo nivel tanto socioeconómico como educacional, así como al consumo de tabaco y/o alcohol. Sin embargo, la mala salud oral y dental es un factor de riesgo independiente para el cáncer de la cavidad oral 11. Elena León Suárez Introducción 20  En el caso de dientes deteriorados, empastados o rotos se ve que no existe relación con el riesgo de cáncer oral. Igualmente ocurre con las personas portadoras de prótesis removibles, aunque en estos casos, cuando las prótesis están mal ajustadas y causan daños (úlceras), sí se ve aumentado el riesgo de padecer la enfermedad 11. También se ve una disminución del riesgo en aquellas personas que están siendo tratadas de alguna patología (ortodoncia, periodoncia) y acuden periódicamente a revisiones dentales, comparado con aquellas que no acuden regularmente a revisiones 11. La enfermedad periodontal (definida clínicamente con sangrado de encías y movilidad dental, y radiológicamente por la pérdida de hueso alveolar) tiene una fuerte relación con el cáncer oral. Dicha relación aumenta en los casos en los que se observa una mayor pérdida ósea alveolar, y es aún mayor en el caso de pacientes fumadores 10,11. 1.2.9 Enjuagues bucales con alcohol Se han diseñado estudios para determinar cómo afecta al cáncer oral el uso de enjuagues bucales que contienen alcohol, llegándose a conclusiones contradictorias. Son estudios con resultados difíciles de interpretar e incluso en los que no se han tenido en cuenta factores importantes como el consumo de alcohol y/o tabaco, o la concentración de alcohol que contiene el enjuague bucal en cuestión. Por lo tanto, la evidencia de que el uso de enjuagues bucales con alcohol aumenta el riesgo de cáncer oral es bastante limitada 10,11. 1.2.10 Exposición ocupacional Aunque se han observado factores de riesgo en varias ocupaciones e industrias, como por ejemplo el asbesto o el percloroetileno (solvente orgánico usado en la limpieza en seco), los resultados no son del todo concluyentes. Además, tampoco se han tenido en cuenta en este caso factores como el consumo de tabaco y/o alcohol 1,4,11. También podría considerarse como mayor riesgo de cáncer la exposición a radiaciones ionizantes terapéuticas o naturales, pero hay pocos datos en cuanto a aumento de riesgo del cáncer oral 14. Elena León Suárez Introducción 21  1.2.11 Estatus socioeconómico Hay tres parámetros para definir el estatus socioeconómico: ingresos, categoría socio-profesional y nivel de educación. Se observa un aumento de riesgo de cáncer oral tanto en las categorías socio-profesionales más perjudicadas, como en las personas con un nivel económico y educacional más bajo. Además, el estatus socioeconómico y la inestabilidad social (divorcio, desempleo, soltería) suele estar ligado a estilos de vida asociados a factores de riesgo de cáncer oral, como el consumo de tabaco y el alcohol. Por ejemplo, en la India, el consumo de tabaco masticado es más frecuente entre los ancianos y las personas con un estatus socioeconómico bajo 4,6,11,14. 1.3 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS El tipo histológico más común (95%) de los cánceres malignos de cabeza y cuello es el carcinomas de células escamosas, y lo más frecuente es que aparezcan en la cavidad oral 2,3,7. Estos carcinomas suelen iniciarse en la mucosa, rara vez lo hacen en la submucosa 4,21. 1.3.1 Carcinoma de células escamosas de lengua El carcinoma de células escamosas de la lengua es el proceso maligno intrabucal más común, suponiendo el 25-40% de los carcinomas de la boca. Son más frecuentes en hombres de 60 a 80 años aunque ocasionalmente también se pueden dar en personas muy jóvenes, presentando en estos casos una conducta bastante agresiva. Casi siempre es asintomático, aunque en las últimas etapas, cuando ocurre la invasión profunda, el dolor o la disfagia pueden ser quejas prominentes del paciente. Se puede presentar clínicamente de cuatro formas: una úlcera indurada con bordes elevados que no cicatriza, una lesión roja, una lesión blanca o una lesión blanca y roja. Algunas veces puede presentar un patrón de crecimiento exofítico notorio y también uno endofítico. Un pequeño porcentaje de casos de leucoplasia lingual está representado por el carcinoma invasivo de células escamosas, que se Elena León Suárez Introducción 22  convierte con el tiempo en carcinoma de células escamosas. Prácticamente todas las placas eritroplásicas que aparecen sobre la lengua, son carcinomas de células escamosas in situ o invasivos en el momento que se descubren 21 . La localización más común de la neoplasia en la lengua es la porción posterior del borde lateral; raras veces se desarrolla sobre el dorso o la punta. Aproximadamente el 25% de los cánceres de lengua surgen en el tercio posterior o base de este órgano. Dichas anormalidades son más problemáticas que otras, debido a su avance asintomático en un área difícil de visualizar. De acuerdo con lo anterior, estas lesiones suelen estar más avanzadas o revelan metástasis regionales en el momento de su descubrimiento, lo que refleja un pronóstico bastante peor en comparación con la afectación de los dos tercios anteriores. En los casos de carcinomas de base de lengua positivos a la infección por el HPV, los individuos no fumadores y no consumidores de excesivas cantidades de alcohol tienen un pronóstico mejor que los carcinomas en la misma localización relacionados con el consumo de tabaco y alcohol 21 . Las metástasis del cáncer lingual son relativamente frecuentes en el momento del tratamiento primario. Los depósitos metastásicos del carcinoma lingual de células escamosas se observan en los ganglios linfáticos del cuello, casi siempre sobre el mismo lado del tumor. Los primeros ganglios dañados son los submandibulares o yugulodigástricos en el ángulo de la mandíbula (niveles anatómicos I y II). Raras veces se pueden detectar depósitos metastásicos distantes en pulmón o hígado 21 . A Fig. A: Lesión en el borde lateral de la lengua 21 . Elena León Suárez Introducción 23  B Fig. B: Lesión en la cara ventral de la lengua 21 . C Fig. C: Lesión en el borde lateral de la lengua 22 . D Fig. D: Lesión en el borde lateral de la lengua, tercio posterior 21 . Elena León Suárez Introducción 24  1.3.2 Carcinoma de células escamosas de suelo de boca El suelo de boca es la localización intrabucal que ocupa el segundo lugar como sitio más frecuente de carcinoma de células escamosas (15-20% de los casos). Los carcinomas en esta zona se presentan más en hombres de edad avanzada, en particular en fumadores y alcohólicos crónicos. El cuadro habitual de presentación es el de úlcera indurada e indolora que no cicatriza. También puede adoptar la forma de placa blanca o roja. En ocasiones, la lesión puede infiltrar extensamente los tejidos blandos del suelo de la boca, produciendo así una reducción de la movilidad de ésta. La metástasis a ganglios linfáticos submandibulares no es infrecuente en las lesiones del suelo de la boca 21 . A B Elena León Suárez Introducción 25  C D Fig. A, B, C, D: Lesiones en el suelo de la boca 21 . 1.3.3 Carcinoma de células escamosas de mucosa bucal y encía Las lesiones de la mucosa bucal y de la encía explican, cada una, casi un 10% de los carcinomas bucales de células escamosas. El grupo más frecuentemente afectado son los hombres de 70 años de edad. En estas lesiones malignas, el factor etiológico más importante es el hábito de masticar tabaco. El cuadro clínico inicial varía desde una placa blanca hasta una úlcera que no cicatriza y una lesión exofítica. En este último grupo mencionado está la entidad clínico-patológica denominada carcinoma verrucoso. Esta variante del carcinoma de células escamosas se presenta como una masa de base ancha, Elena León Suárez Introducción 32  Fig.1. Distintos grados de afectación de los nódulos linfáticos en el cáncer oral 21 .  M x : no se pueden evaluar las metástasis a distancia.  M 0 : no hay metástasis a distancia.  M 1 : hay metástasis a distancia. Según estos parámetros, obtenemos cuatro estadios clínicos, que son:  I: T 1 N 0 M 0  II: T 2 N 0 M 0  III: T 3 N 0 M 0 ; T 1-3 N 1 M 0  IVA: T 4a N 0-1 M 0 ; cualquier T 1-4a N 2 M 0  IVB: T 4b, cualquier N M 0 ; cualquier T, N 3, M 0  IVC: cualquier T, cualquier N, M 1 Los estadios I y II, se consideran iniciales, ya que en ellos no hay metástasis ganglionares y el tamaño es menor de 4 cm en general. Se ha observado que ambos estadios tienen un buen pronóstico, con una tasa de supervivencia elevada. Sin embargo, los estadios III y IV se consideran avanzados, disminuyendo en gran medida el porcentaje de supervivencia global. Elena León Suárez Introducción 33  Los ganglios linfáticos más afectados son lo submaxilares y los de la cadena cervical superficial y profunda. Las metástasis a distancia, por vía sanguínea, se localizan con más frecuencia en pulmón, hígado y huesos. 1.6 CARCINOGÉNESIS La carcinogénesis oral, al igual que ocurre en otros cánceres, es un proceso de múltiples pasos a través del cual las células normales son transformadas a células premalignas o potencialmente malignas, caracterizadas por tener la habilidad de replicarse de forma autónoma. Todo este proceso requiere la acumulación de múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas. Estas alteraciones incluyen expresiones aberrantes y alteraciones funcionales que afectan a la regularización de la señalización celular, el crecimiento, la supervivencia, la motilidad, la angiogénesis y el control del ciclo celular. El concepto fundamental del mecanismo genético del cáncer es la sobreexpresión o sobreactividad de oncogenes y/o el silenciamiento de genes supresores tumorales. Todas estas alteraciones son la verdadera razón de la adquisición progresiva del fenotipo maligno del queratinocito, convirtiéndolo en una célula maligna caracterizada por una proliferación incontrolada y que podría resultar en un cáncer, caracterizado por la invasión de la membrana basal epitelial y con metástasis eventuales 10,14,17,23,24. El metabolismo enzimático carcinogénico, no obstante, varía de persona a persona, según las bases genéticas de cada individuo. También hay una amplia serie de enzimas reparadoras de DNA, las cuales pueden reparar las mutaciones, y en éstas también encontramos diferencias genéticas entre los individuos 10. 1.6.1 Cambios genéticos en el carcinoma oral de células escamosas Aberraciones cromosómicas, como son eliminaciones, amplificaciones y reordenamientos estructurales, son señales de identidad de la malignidad y se observan en tumores de cabeza y cuello (Tabla 1) 17. Elena León Suárez Introducción 34  Tabla 1. Aberraciones cromosómicas comunes en carcinomas de cabeza y cuello 17 . Entre estas aberraciones, cabe destacar la pérdida del cromosoma 3p, que se observa con alta frecuencia y en la que se sugiere que podrían albergarse oncogenes y genes supresores tumorales importantes para la iniciación o progresión del cáncer oral. Otra alteración importante es la pérdida heterocigótica 9p21, evento común en displasias (30%) y en carcinoma oral de células escamosas (70-80%), y que además tiene un importante valor en el diagnóstico temprano y vigilancia del tumor 12,17 . Además, esta pérdida es relevante porque en esta zona se codifican genes supresores tumorales importantes, como son el p16, p15 y p14, entre otros 12,24 . Según datos recientes, se sabe que aproximadamente el 30% de los casos de cáncer oral están rodeados por grandes zonas de células con cambios genéticos relacionados con el cáncer. Estas zonas, frecuentemente, permanecen cuando el tumor es extirpado, causando así tumores secundarios que son clínicamente asignados como recurrencias o como segundo tumor primario, en función de la distancia y del tiempo de aparición 17 . Elena León Suárez Introducción 35  1.6.2 Cambios en genes supresores tumorales y oncogenes en el carcinoma oral de células escamosas Los genes supresores tumorales (tumor suppressor genes, TSG) son genes que actúan controlando el crecimiento de las células mediante la regulación del ciclo celular, apoptosis, adhesión celular y reparación del DNA 10,14. El ciclo celular normal incluye la muerte celular programada o apoptosis, y células que evitan que éstas tengan potencial para llegar a ser cancerosas 10 (Fig. 2). La inactivación de los TSG puede ocurrir por mecanismos epigenéticos o genéticos 17. La función de los TSG puede ser alterada por aberraciones como mutaciones o deleciones en los genes de los TSG, o por silenciamiento de los TSG mediante una hipermetilación. Cualquiera de estos cambios puede llevar al desarrollo del cáncer 14. Fig. 2. Regulación del ciclo celular 21. Elena León Suárez Introducción 36  Los TSG afectados con mayor implicación en la carcinogénesis oral son:  p53: es el TSG más frecuentemente afectado en la carcinogénesis oral, y se encuentra localizado en el cromosoma 17p13.1 7,14,23,25. El gen TP53 se relaciona con la apoptosis y con la regulación del ciclo celular 10. La mutación del gen TP53 produce una acumulación de la proteína p53 7,23. Esta alteración ocurre por mutación en una secuencia del TP53, produciendo proteínas alteradas o inactivadas, o también por la producción aberrante de otras proteínas que se encargan de la regulación de la actividad de p53 (como son MDM2 o proteínas virales) 17. Algunos estudios relacionan las mutaciones de p53 con la exposición a tabaco y alcohol 12. La sobreexpresión de esta proteína está asociada con una baja supervivencia de los pacientes con carcinoma oral de células escamosas 23. Además, existe una asociación significativa entre la sobreexpresión de p53 y el tamaño del tumor, presencia de metástasis en los ganglios linfáticos y un estado más avanzado 23.  p16 o CDKN2: es el segundo TSG más frecuentemente afectado en la carcinogénesis oral, y se sabe que se encuentra mutado en el 60% de los carcinomas de células escamosas de la cavidad oral 14,24. Se trata de una proteína que consiste exclusivamente en cuatro repeticiones de anquirina. Se denominaP16 INK4A porque actúa como inhibidor de CDK4, o también CDKN2, por su acción inhibidora de CDK2. Esta proteína está codificada por el gen supresor p16 o CDKN2A (dependiente de ciclina inhibidor de quinasa 2A), localizado en el cromosoma 9p21. La proteína p16 ejerce su función normal principalmente inhibiendo las quinasas dependientes de ciclina (complejo ciclina D1/CDK4-6), evitando así la fosforilación de pRB (proteína del retinoblastoma). De esta manera queda secuestrado el factor de transcripción E2F, formando el complejo pRb/E2F (que se forma cuando la proteína pRb se encuentra hipofosforilada), impidiendo así que el factor E2F acceda a los promotores de los genes de proliferación, y deteniendo el ciclo celular en el punto G1/S 10,17,23-25. Además de la vía pRb/E2F, p16 también contribuye a la progresión del ciclo celular a través de otras vías de regulación alternativas e independientes 24 (Fig. 3). Elena León Suárez Introducción 37  Fig.3. Rutas de señalización p16–CDK4/6–pRb 24. También se ha demostrado que la expresión elevada de p16 inducida por oncogenes como respuesta a un daño en el DNA o por envejecimiento, puede desencadenar y acelerar la senescencia celular 24. Por otra parte, estudios recientes han demostrado que p16 podría estar implicado en la respuesta celular a agentes genotóxicos. Se ha visto cómo después de un daño en el DNA inducido por genotóxico, la elevada expresión de p16 en las células tumorales resultó en la detención del ciclo celular y la inhibición de eventos apoptóticos 24. La inactivación de p16 implica cuatro tipos de alteraciones genéticas: eliminación homocigótica, hipermetilación del promotor, pérdida de heterocigosidad y mutación puntual 24,25. Mientras que la supresión homocigótica y la hipermetilación del promotor constituyen la mayoría de las alteraciones de p16, parece ser que existe una preferencia por un tipo Elena León Suárez Introducción 38  específico de alteración de p16 en ciertos tipos de tumores; por ejemplo, aproximadamente el 30% de las alteraciones de p16 en los carcinomas de células escamosas orales son mutaciones puntuales. Además, la naturaleza de una alteración genética en p16 determina su efecto mutagénico en las funciones p16. Mientras que deleciones homocigóticas y silenciamiento aberrante de p16 mediado por metilación conducen por lo general a la pérdida completa de la función de p16 en las células, mutaciones puntuales solo afectan parcialmente la estructura y la función de p16 24,25. Además de la inactivación genética de p16, se dan otros eventos moleculares frecuentes, como son sobreexpresión de la ciclina D1 (CCND1), gankyrin (PSMD10), SEI-1 (SERTAD1), CDC6 y NF-kB, los cuales, también conducen a la desregulación de p16 a través de distintos mecanismos. En consecuencia, se deduce que la regulación alterada de p16 en el cáncer está sujeta a la coordinación y suma de alteraciones genéticas de p16, la activación de oncogenes, y cambios en TSG relacionados 24. La coordinación entre la inactivación genética de p16 y la desregulación de p16 también puede variar con las etapas de desarrollo del cáncer. La inactivación genética de p16 se ha establecido como punto de referencia durante la progresión del cáncer 17,24, aunque queda por dilucidar si este suceso se produce como el estado más temprano de la carcinogénesis. Nuevas evidencias muestran que la desregulación de p16, a través de los oncogenes antes mencionados, se produce durante las etapas más tempranas del desarrollo del cáncer, posiblemente con antelación a las alteraciones genéticas de p16. Se ha visto cómo, por ejemplo, una expresión aberrante de gankyrin, independiente de las alteraciones genéticas de p16, puede representar un biomarcador útil para la detección temprana del cáncer 24. Por otra parte, también se ha observado que esta desregulación de p16 mediada por oncogenes puede tener efectos más profundos que su inactivación genética. Se sabe que alteraciones aberrantes de algunas oncoproteínas (como gankyrin y SEI-1), pueden generar consecuencias multifactoriales capaces de modular el crecimiento celular y la progresión carcinogénica de forma independiente 24. Elena León Suárez Introducción 39  La sobreexpresión de p16 mutado está asociada con un peor pronóstico de varios tipos de cánceres, entre los que se incluye el cáncer oral. Se da hasta en un 55% de los carcinomas de células orales 24. Igualmente, la reducción o la no expresión de p16 están relacionadas con un peor pronóstico en pacientes con cáncer oral. Esto se produce en el 83% de los carcinomas orales de células escamosas y en el 60% de las lesiones premalignas 17,23. Además de la alteración de estos TSG (que son las más frecuentes), en el cáncer oral ocurren otras más como es el caso del gen p27. Éste se encuentra localizado en el cromosoma 12p13, y codifica una proteína nuclear que se encarga de inhibir la formación del complejo ciclina D1/CDK durante las fases G0 e inicio de G1 del ciclo celular. La disminución de la expresión de p27 ha sido asociada con la progresión, la metástasis y el pobre pronóstico del tumor en varios cánceres 23. Hay otros numerosos TSG alterados o silenciados en el proceso de la carcinogénesis (p14, p15, p18, etc.), pero la vía de alteración o silenciamiento podría ser diferente entre los pacientes 10,24. Los oncogenes son genes que contribuyen al crecimiento, supervivencia y propagación de las células; por tanto, pueden participar en el desarrollo del cáncer, ya que, cuando un oncogén es activado, puede promover una proliferación no controlada de las células, resultando así en una carcinogénesis 10,12,14. Dentro del concepto de las bases genéticas de la carcinogénesis, se sabe que, además de la afectación de los TSG, se produce la sobreexpresión de los oncogenes 10. Entre estos tenemos:  Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR): Es el oncogén más estudiado y aparece sobreexpresado en la mayoría de los carcinomas de células escamosas orales 10,12,17,23,26. Pertenece a la familia ErbB de receptores tirosina quinasa. Esta familia incluye cuatro miembros, que son: EGFR/erbB1 (HER1), c-erbB2 (HER2/neu), c-erbB3 (HER3) y c-erbB4 (HER4) 12,17,26-29. Elena León Suárez Introducción 40  El EGFR es una glicoproteína transmembrana que incluye 3 dominios funcionales: un dominio extracelular, un dominio transmenbrana y un dominio citoplasmático tirosina quinasa, aunque este último dominio funcional solo lo poseen los receptores EGFR y ErbB4 12,26-30 . (Fig. 4) Fig. 4. Estructura de los receptores ErbB 29 . Son unos receptores implicados en las vías de señalización comúnmente expresadas en algunos tejidos epiteliales, y juegan un papel importante en la proliferación, supervivencia, organogénesis y reparación de los tejidos de las células de los organismos multicelulares 12,17,23,27 . Estos receptores traducen las señales extracelulares a través de la activación de mensajeros intracelulares o directamente a través de la translocación del receptor al núcleo 29 . En condiciones normales, y en ausencia de ligandos, estos receptores se encuentran en estado inactivado. La activación de los receptores ErbB está controlada por la expresión temporal y espacial de sus ligandos, los cuales son miembros de la familia EGF de factores de crecimiento. Estos ligandos se unen al dominio extracelular, y los miembros de la familia ErbB desencadenan una Elena León Suárez Introducción 41  compleja y estrechamente regulada dimerización y activación intracelular 27-29 . La dimerización del receptor es esencial para las funciones de ErbB. El ligando y el receptor unidos sufren dimerización, ya sea como homodímeros o heterodímeros entre miembros de la familia ErbB. En condiciones normales, los receptores ErbB están plegados para inhibir su dimerización, y por lo tanto existen como monómeros 27 . Cuando se produce la unión al ligando, se inducen reordenamientos conformacionales para exponer y estabilizar el dominio de dimerización, favoreciendo de este modo la dimerización del receptor. Después de la dimerización, se produce la fosforilación de los dominios de tirosina quinasa intracelulares. Con esta fosforilación, se inicia la cascada múltiple de señalización intracelular 27,30 . Alternativamente, la transactivación, al menos parcial, de EGFR, también se puede lograr mediante mecanismos intracelulares independientes de ligando, tales como el receptor acoplado a proteína G (GPCR), estimulación de Src o niveles elevados de calcio 30 . Existen numerosos ligandos de la familia EGF. Se pueden dividir en tres grupos. El grupo uno se une específicamente con EGFR, el segundo grupo se une con EGFR y ErbB4, y el tercer grupo se une a ErbB3 y ErbB4, mientras que NRG3 y NRG4 se une solamente a ErbB4 27,29 . (Tabla 2) Tabla 2. Ligandos de la familia EGF 27 . No se conoce ningún ligando que se una a ErbB2. Sin embargo, un miembro de la familia de las mucinas, MUC4, puede actuar como modulador intramembrana de la actividad de ErbB2. Además, ErbB2, es el preferido por los otros EGFRs para la dimerización 27,29,30 . Elena León Suárez Introducción 48  conocidos por causar cáncer de cérvix uterino, ano, vagina, vulva, pene y de cabeza y cuello 5. Tanto los de bajo como los de alto riesgo pueden causar el crecimiento de células anormales; pero solo los de alto riesgo pueden producir cáncer, ya que únicamente la proteína E7 codificada por los HPV de alto riesgo puede inmortalizar las células del epitelio humano 3. Estas variaciones genotípicas en las secuencias del DNA de E6 y E7 son las que permiten la estratificación de los fenotipos de los virus oncogénicos en bajo o alto riesgo 32. Los tipos 1-15, 17, 19-30, 32, 34, 36-44, 46-51, 53-57 y el 59 son considerados de bajo riesgo, mientras que los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 y 52 son considerados de alto riesgo de producir lesiones malignas 7,11. La transmisión del virus puede ser vertical, a través de la infección cervical de la madre, pero la mayoría de la transmisión es horizontal. Esta transmisión horizontal es por contacto directo, ya sea sexual o no sexual. También es posible el contagio por autoinoculación de una localización a otra 32. Una vez que el virus está en contacto con la piel, colándose a través de heridas o abrasiones, va pasando por las distintas capas hasta llegar a la capa basal del epitelio, que es la única proliferativa. A través de un receptor celular específico, se introduce en las células basales del epitelio, alcanzando el núcleo. El incremento del número de células inducido por el virus provoca un engrosamiento del estrato espinoso y de la capa basal. Una vez dentro de la célula, el genoma viral permanece en forma episomal, es decir, circularizado y no integrado en el genoma celular. A partir de aquí, el virus va madurando con la diferenciación de estas células hasta su estadio de queratinocito terminal, donde se va a replicar haciendo que las células más superficiales se transformen en coilocitos. Estos coilocitos, característicos de la infección por papilomavirus, son queratinocitos hipertrofiados con halos transparentes que rodean los núcleos arrugados. El virus no es lítico, es decir, no produce la rotura de la célula infectada, sino que contagia a otra persona por desprendimiento de esos coilocitos y su contacto posterior con el epitelio no infectado, ya que el virus aprovecha la maduración de las células de la piel Elena León Suárez Introducción 49  para atravesar las capas cutáneas y desprenderse con las células muertas de la capa superior 3,35,36 (Fig.7). Fig. 7: Progresión del carcinoma mediado por HVP 35 . Las bases moleculares más importantes de este fenómeno involucran a varios genes virales. Por ejemplo, las proteínas codificadas por los genes E1 y E2 son críticas para la replicación del DNA viral. E4 se asocia a los filamentos intermedios de citoqueratina y los desestabiliza, lo que facilita la liberación de partículas virales. E2 también se asocia a los genomas virales con los cromosomas celulares en mitosis, lo que garantiza que esos genomas no se pierden durante la división celular. E5, E6 y E7, considerados oncogenes, promueven la proliferación celular incontrolada para permitir la amplificación viral, pero también contribuyen a la iniciación y a la progresión del cáncer a través del mismo mecanismo y mediante la inducción de la inestabilidad Elena León Suárez Introducción 50  genómica. Por último, L1 y L2 son las proteínas estructurales que terminarán el proceso de maduración del virus 5,7,36,37. Como se ha mencionado anteriormente, en el ciclo productivo del HPV, el genoma viral se encuentra en bajo número de copias en el núcleo de las células basales y en forma episomal, pero este estado es variable. Por factores desconocidos, en un momento determinado, el virus provoca la integración de su genoma al genoma celular (los HPV de alto riesgo). Esto ocurre al azar, pero esta inserción se observa con frecuencia cerca a los denominados “sitios frágiles” cromosómicos, que son sectores del DNA celular que tienden a romperse con más facilidad que otros, y provocan un fenotipo mutado 32,36. En los HPV de alto grado de malignidad, como son los tipos 16, 18 o 31, la inserción al genoma celular se hace a través del gen viral E2, el cual, normalmente, actúa inhibiendo la expresión de los genes virales E5, E6 y E7. Cuando ese genoma se integra, E2 sufre deleciones que lo inactivan, aunque esto no evita la expresión de otros genes víricos como son el E6 y E7. Estos genes, ya fuera del control de E2, se convierten en oncogenes 3,32,32,35,36. E7 activa la síntesis de DNA y los mecanismos de replicación celular que están inactivados normalmente en las células epiteliales maduras, y así se inicia el crecimiento celular patológico. Mediante la inducción de la supervivencia celular y el bloqueo de la apoptosis de células con daño en el DNA, E6 permite a E7 ejercer y mantener su efecto patológico 3,34. Por otro lado, E6 se asocia a la proteína p53 y, simultáneamente, activa la transcripción de la enzima telomerasa. Al mismo tiempo, E7 se une a la proteína pRb e inhibe su función, permitiendo que se libere el factor de transcripción E2F, que estimula la división celular. Como consecuencia, estas cepas actúan, por una parte, destruyendo a p53 y permitiendo la acumulación de DNA mutado, activando la telomerasa y produciendo eventualmente la inmortalización celular; además, inhibe a uno de los controles del ciclo celular (pRb), con lo que la célula inmortalizada y con mutaciones en su DNA entra constantemente en el ciclo celular. Además, E7 actúa uniéndose e inhibiendo a las proteínas p21 y p27 7,8,32,34-36 (Fig. 8). Elena León Suárez Introducción 51  Fig. 8. Modelo de interacción de E6 y E7 del HPV 32 . E6 y E7 pueden cooperar con oncoproteínas como ras y myc, las cuales permiten al virus actuar a nivel de factores de crecimiento y metabolismo celular y nuclear, produciendo células oncogénicas. Además, E6 y E7 pueden provocar mutaciones en el DNA de la célula huésped, probablemente por causar alteraciones en los mecanismos de reparación del DNA. Esto significa que ciertos tipos de HPV son capaces de causar lesiones malignas incluso sin la acción de otros cofactores 32 . En la infección por HPV también se produce una desregulación de la proteína p16 por la pérdida del control de retroalimentación negativo de la expresión de pRb. Esto tiene como resultado una sobreexpresión de la proteína p16, lo cual está extensamente documentado en los carcinomas HPV positivos y se considera un marcador sustituto útil de carcinomas relacionados con la infección de HPV 32 . Elena León Suárez Introducción 52  En el caso de las cepas no oncogénicas, las secuencias de los genes E6 y E7 no son similares, y, por consiguiente, estos genes intervienen en el ciclo productivo del virus, pero no degradan a p53 ni a pRb 36. Hay estudios en los que se sugiere que la inactivación de pRb por E7 podría ser el principal evento en el desarrollo del carcinoma de células escamosas oral 25. La respuesta inmune del huésped contra el HPV no está completamente clara. Se ha encontrado en las células de la capa basal la expresión de antígenos virales tempranos, mientras que antígenos virales tardíos se forman en la capa epitelial queratinizada superficial 3. Además, se han demostrado ambos tipos de respuesta inmune (con anticuerpos y la mediada por células). Los anticuerpos contra HPV pueden ser del tipo de IgA, IgM o IgG, alcanzando los niveles máximos a los 6 o 12 meses después del inicio de la infección. La existencia de anticuerpos contra E4 está asociada con la replicación viral y con el primer contacto del huésped con el HPV. La regresión de las lesiones de HPV está asociada con una respuesta histológica característica con la participación de linfocitos T y macrófagos. En el caso de pacientes inmunodeprimidos, la posibilidad de infección del virus de alto riesgo aumenta debido a la falta de respuesta inmune, al efecto oncogénico de los fármacos administrados y a la estimulación antigénica crónica 32. 1.8 RELACIÓN ENTRE HPV Y CÁNCER ORAL La asociación entre HPV y lesiones de células escamosas en varias localizaciones del cuerpo, incluyendo la cavidad oral, fue descrita por primera vez por Syrjänen et al. en 1983 38, aunque previamente en 1976, Zur Hausen 32 ya postuló el papel del HPV en el cáncer de cérvix. Los resultados sugerían que el HPV podría ser el agente implicado en el desarrollo de al menos ciertos tipos especiales de carcinomas de células escamosas orales. En 1985, en Elena León Suárez Introducción 53  Alemania 39, fue detectado por primera vez DNA de HPV en el carcinoma de células escamosa oral 3,32,38,39. En los siguientes años, la literatura proporciona además evidencia cuantitativa de que la infección oral con HPV, particularmente con los genotipos de alto riesgo, es un importante factor de riesgo independiente de carcinoma de células escamosas oral 3. Sin embargo, mientras que la relación entre la infección con HPV 16 y 18, y el cáncer de orofaringe está bien establecida como factor de riesgo, en el caso del cáncer de la cavidad oral hay una asociación menos fuerte 6,18. La prevalencia de la detección de DNA de HPV en los tumores varía entre distintos estudios en función de la población estudiada, combinación de los sitios, tipo de muestra y el método de detección del DNA 11. De todas formas en un meta-análisis realizado por Jayaprakash et al. en 2011, se apoya la hipótesis de que la infección de HPV-16/18 podría ser factor de riesgo no solo para el cáncer de orofaringe, sino también para el cáncer de la cavidad oral 18. Se ha estimado que aproximadamente el 0,4% de la población tiene verrugas exofíticas y condilomas en la mucosa oral, mientras que la infección podría estar latente en un 12% de sujetos con una mucosa clínicamente sana 13. La realización de test de hibridación in situ ha mostrado que aproximadamente un 50% de los carcinomas de células escamosas, tanto de la cavidad oral como de la orofaringe, son positivos a la infección por HPV. El tipo oncogénico más común es el HPV-16 junto con HPV-18, aunque en la cavidad oral se han aislado al menos 30 tipos de HPV. En mucosa oral normal se ha encontrado los HPV tipo 2, 6, 7, 11, 13, 16, 18, 31, 33 y 35, aunque no se sabe el significado de estos HPV en la mucosa aparentemente sana; y en lesiones benignas y malignas orales se han detectado los HPV tipo 1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 31, 32, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 57, 58, 59, 66, 69, 72 y 73 3,6,8,13,18,33,34. Los tipos más comúnmente asociados con condilomas orales benignos y papilomas benignos son los HPV tipo 6 y 11. Con menor frecuencia aparecen verrugas orales en forma de hiperplasia epitelial focal y verrugas Elena León Suárez Introducción 54  orales que son causadas por los HPV tipos 13 y 32 y HPV tipos 2 y 4, respectivamente 33. Las zonas de la cavidad oral donde la prevalencia de HPV parece ser mayor son la lengua y el suelo de la boca 6,11. Por otra parte, los tumores que son HPV positivos tienen un mejor pronóstico que los que son HPV negativos y que son atribuidos al consumo de tabaco o alcohol 6,33. Un estudio realizado en Estados Unidos muestra que la incidencia de carcinoma de células escamosas aumenta en las zonas de la cavidad oral relacionadas con la infección de HPV, mientras que se produce una disminución en las zonas de la cavidad oral no relacionadas con la infección del HPV. Este aumento en la prevalencia de la infección de HPV puede estar asociado a los cambios en las conductas sexuales de las generaciones jóvenes con múltiples parejas y práctica de sexo oral 6.El riesgo de aislar HPV de la cavidad oral es 8 veces mayor en entre individuos con experiencias sexuales que entre los inexpertos 5. La transmisión sexual podría explicar la relación entre el cáncer de la cavidad oral y los comportamientos sexuales. La infección por HPV-16 en cáncer de cavidad oral es más frecuente en individuos con una edad temprana de debut sexual, con múltiples parejas sexuales y con práctica de sexo oral 5,11. Se consideran por tanto factores que aumentan el riesgo de padecer un carcinoma de células escamosas positivo a HPV, una pobre higiene oral, la práctica de sexo oral y un estado sistémico de inmunosupresión 7.    2. OBJETIVOS Elena León Suárez Objetivos 56  2. OBJETIVOS Según la literatura existente, la relación del HPV como factor etiopatogénico del carcinoma de células escamosas de orofaringe está claramente demostrada. Sin embargo, existe gran controversia sobre la relación del HPV como factor etiopatogénico del carcinoma de células escamosas de la cavidad oral. Por lo tanto, el objetivo de nuestro estudio es determinar si existe tal relación, haciendo un estudio de muestras de carcinoma de células escamosas de distintas localizaciones de la cavidad oral exclusivamente a lo largo de un período de seis años y medio. Con esto, si se demuestra esta relación, podríamos ver posteriormente cómo se pueden ver afectados tanto el tratamiento como el pronóstico del carcinoma de células escamosas de estos casos, en comparación con los carcinomas originados por otros factores etiológicos, como pueden ser el tabaco y el alcohol.    3. MATERIAL Y METODO Elena León Suárez Resultados 64  B Fig. B. Inmunotinción focal de las células neoplásicas para p16 (IHQ, 200x). C Fig. C. Células neoplásicas positivas para el HPV de alto riesgo (ISH, 200x). Elena León Suárez Resultados 65  Hemos analizado un par de muestras de cada localización de un par de años, y los resultados son los siguientes: Año 2007: p16 HPV II HPV III Mucosa oral 1 - - - Mucosa oral 2 - - - p16 HPV II HPV III Lengua 1 + - - Lengua 2 - - - p16 HPV II HPV III Encía 1 - - - Encía 2 - - - p16 HPV II HPV III Suelo boca 1 - - - Suelo boca 2 + focal - - Año 2008: p16 HPV II HPV III Suelo de boca 1 + - + Suelo de boca 2 + - - p16 HPV II HPV III Mucosa oral 1 + focal - - Mucosa oral 2 + focal - - Elena León Suárez Resultados 66  p16 HPV II HPV III Encía 1 + - - Encía 2 + focal - - p16 HPV II HPV III Lengua 1 - - - Lengua 2 + focal - - De un total de 16 muestras analizadas hemos obtenido los siguientes resultados: - p16: negativo 7, positivo 4 y positivo focal 5. - HPV familias 6 y 11: negativo 16. - HPV familias 16 y 18: negativo 15 y positivo 1. El único caso de las 16 muestras que dio positivo a HPV familias 16 y 18, también fue positivo a la determinación de la p16.    5. DISCUSIÓN Elena León Suárez Discusión 68  5. DISCUSIÓN Al igual que lo descrito en la literatura, al realizar nuestra búsqueda de las muestra de carcinoma de células escamosas de la cavidad oral hemos observado cómo la lengua es la localización de mayor prevalencia 9,10. En nuestro estudio hemos visto que, de un total de 295 muestras, 151 se encuentran localizadas en la lengua. Como ya hemos dicho con anterioridad, la infección por HPV es una causa importante en el caso del carcinoma de orofaringe; sin embargo el papel del HPV en la carcinogénesis de la cavidad oral (estrictamente definida como tal) sigue siendo muy debatida, tanto por la amplia gama de prevalencia viral (que abarca desde el 0% al 100%) 40,41, como por el hecho de que se haya identificado HPV de alto riesgo en mucosa oral normal. Aparte de las diferencias étnico-geográficas y socio-conductuales, esta amplia gama de prevalencia podría estar relacionada con la clasificación errónea de carcinoma de células escamosas de la cavidad oral con respecto al carcinoma de células escamosas de la orofaringe, así como con el tipo de muestra usada para el análisis, y la diferente sensibilidad y especificidad de los distintos métodos de diagnóstico y de detección de HPV utilizados 34,40,41. En cuanto a la metodología usada, en este trabajo hemos usado muestras de zonas exclusivamente de las definidas como cavidad oral. Hemos realizado todos los estudios sobre cortes realizados a las biopsias de los carcinomas. Sabemos que la biopsia sigue siendo uno de los procedimientos más comunes de toma de muestras por vía oral, usando la misma muestra tanto para el examen morfológico, así como para la prueba de HPV, incluso en un período de tiempo diferente. Por otra parte, la biopsia proporciona una muestra más representativa de la mucosa oral en comparación con otros procedimientos como la citología exfoliativa, ya que la biopsia incluye las células de la capa basal, donde el virus puede estar presente en una forma latente 40. Además, Syrjanen et al. 34 señalan que la asociación de HPV con el carcinoma de células escamosas oral es significativa solo cuando se detecta el HPV en las muestras de biopsias. Esta asociación significativa se pierde Elena León Suárez Discusión 69  completamente cuando solo se utiliza citología exfoliativa para analizar el HPV. Por lo tanto, estos autores llegaron a la conclusión de que, para obtener los resultados más precisos, solo los tejidos biopsiados deben ser utilizados para los test del HPV 40. Por otra parte, también es importante la calidad de la muestra, como el hecho de que esté congelada o fijada. Termine et al. (1988-2007) demostraron en su meta-análisis que la tasa de detección del HPV con ISH fue mayor en muestras fijadas con formalina e incluidas en parafina 34,42. En cuanto a los métodos de detección del HPV, nosotros hemos usado la ISH. Antes de la era de las técnicas moleculares era común el uso de pruebas serológicas para la detección de virus. En estos casos, la seropositividad solo significa que ha habido un contacto pasado o presente con el virus, pero no nos indica nada sobre el sitio exacto de la infección. En el caso de la detección de HPV, las pruebas serológicas son métodos poco fiables por su reducida sensibilidad y especificidad 7,34. La principal ventaja de las técnicas moleculares es su alta sensibilidad y especificidad 7. Para la determinación del HPV existen distintas técnicas moleculares que se dividen, de manera general, en técnicas que son no amplificables y las que usan amplificación. Dentro de las que no requieren amplificación encontramos la ISH y el Southern Transfer Hybridization (STH). A su vez, de manera general se pueden dividir las técnicas que usan amplificación en tres grupos: 1. Target amplification entre las que se encuentra la PCR (polimerase chain reaction), 2. Signal amplification entre las que se encuentran Hybrid capture y Gene expression (DNA microarray) y 3. Probe amplification. En la literatura existente se encuentran estudios realizados con PCR, ISH, Southern, e incluso algunos que usan PCR y ISH conjuntamente, entre otros 18,32. La ISH se hace directamente sobre muestras fijadas con formalina e incluidas en parafina obtenidas a partir de una biopsia. Tiene la ventaja de darnos la información de si el HPV está presente y, en caso afirmativo, dónde se encuentra localizado el DNA del HPV en el tejido. Tiene una desventaja, y es su baja sensibilidad en comparación con la PCR. La ISH tiene un límite de Elena León Suárez Discusión 70  detección de 20 virus por células infectada, con lo que lesiones de alto grado (que a veces contienen menor número de virus) son no siempre sensibles a esta técnica. Además, es una prueba que consume más tiempo 7,32. Al igual que la ISH, en el caso del Southern blot hybridization (SBH), su principal desventaja es la baja sensibilidad en comparación con la PCR. Además, requiere grandes cantidades de DNA celular y mayor gasto, lo que la hace inadecuada para el uso clínico de rutina. Esta técnica es útil para confirmar algunos casos de la PCR y para clasificar nuevos tipos virales identificados 5,7,32. La PCR es una técnica que ofrece varias ventajas sobre otros métodos, principalmente su capacidad de detección de cantidades muy pequeñas de DNA. Esta técnica, además de que requiere solo una pequeña cantidad de material biológico, puede detectar la presencia viral en etapas muy tempranas de la infección. Es altamente sensitiva y específica, y puede complementar la detección de manifestaciones clínicas del virus asociadas a lesiones orales. Por ello, la PCR es el método de detección viral más utilizado. Sin embargo, se considera una desventaja el riesgo de contaminación que podría originar falsos positivos 7,32. Solo hay un caso en el que la ISH se puede considerar un método más sensible que la PCR, y es en aquellas muestras en las que tenemos pocas células infectadas por HPV pero con un alto número de copias del virus en las mismas, de modo que no son detectadas por la PCR 34,43. Por otro lado, la PCR también puede dar lugar a falsos positivos debido a su alta sensibilidad a los genomas del HPV que pueden estar presentes en los tejidos orales, pero que no están relacionados con el cáncer 5. Existen algunos estudios que han usado métodos de PCR sensibles y han identificado DNA de HPV en una alta proporción (35-55%) de los carcinomas de células escamosas orales. Pero estas tasas de detección disminuyen en los estudios que requieren evidencia de la actividad oncológica del HPV. Sin embargo, si se usa como medida real de la presencia de virus oncológicamente activo la expresión de E6 y E7, el HPV se detecta en una pequeña fracción (1-5%) de carcinomas de células escamosas orales 41. Elena León Suárez Discusión 71  Por otro lado, hay estudios en los que se demuestra que la detección de la proteína p16 mediante técnicas inmunohistoquímicas se puede considerar una alternativa práctica para la detección de HPV, basándose en la alta correlación entre la detección de HPV y la sobreexpresión de p16 5,41,44. Esta técnica es rápida, barata y de fácil disponibilidad, por lo que se ha convertido en una técnica estándar para la evaluación clínica del estado del HPV 45. Cabe señalar que no todos los tumores p16 positivos son HPV positivos. Así, aproximadamente el 10-20% de los carcinomas p16 positivos no muestran evidencia de infección por HPV 5. En cualquier caso, el estado de p16 positivo, incluso en ausencia de HPV positivo, tiene un significado pronóstico. Aunque la causa de la sobreexpresión de p16 no esté clara, puede haber otras causas como una infección viral alternativa, mutaciones inducidas por carcinógenos que conducen a la sobreexpresión de p16 u otra etiología 5. En cuanto al serotipo buscado, se sabe que los serotipos de alto riesgo 16 y 18 son los más comunes (más el tipo 16) 5,18,33,34. Se detectan en el 30% de las muestras de carcinoma de células escamosas oral 18. Desafortunadamente, la razón del tropismo específico de estos serotipos sigue sin estar clara 5. Solo en menos de un 1% de las muestras de carcinoma se ha detectado otro serotipo de alto riesgo distinto 18. De todas formas, la identificación del tipo específico de HPV actualmente no juega un papel clínico importante, debido tanto a la alta incidencia de HPV-16 como a la falta de conocimiento sobre cómo utilizar esta información si se obtuviera de forma rutinaria 5. En nuestro estudio, además de la búsqueda de los serotipos 16 y 18, hemos añadido la búsqueda de los serotipos benignos 6 y 11. Debido a la gran controversia de resultados presentes en la literatura, hay estudios en los que se han tenido en cuenta otros factores, como pueden ser distintas localizaciones geográficas, edad y sexo de la población estudiada, grado histológico de la lesión e incluso el año de la publicación, no encontrando en ninguno de los casos diferencias significativas 18. Sin embargo, en dos estudios realizados en Estados Unidos se observó cómo el hombre tiene 2-3 veces mayor riesgo de tener infección oral por HPV que la mujer. Además, la prevalencia en la población muestra una distribución bimodal en cuanto a la Elena León Suárez Discusión 72  edad, con dos picos, uno más grande en torno a los 55-64 años, y otro más pequeño en torno a los 30-34 años 33,46. Numerosos informes clínicos proporcionan pruebas convincentes de que aquellos pacientes con HPV positivo tienen mejores resultados que aquellos que tienen HPV negativo, resultado que se extiende por varios continentes y métodos de tratamiento 5. La base biológica verdadera para esta mejora no está clara. Se ha postulado que el aumento de la sensibilidad a la radiación puede ser la causa en gran parte de la diferencia observada, y los datos preclínicos recientes proporcionan apoyo a esta hipótesis 47,48. De todas formas, no se puede descartar factores biológicos alternativos, como puede ser una mejora de la vigilancia inmune en los carcinomas HVP positivos 5. Los estudios apoyan la hipótesis de que aquellos pacientes con carcinomas HPV positivos tienen significativamente mejor supervivencia (60-80% menos mortalidad), mejor control local/regional e incluso una pequeña mejora en la tasa de metástasis que aquellos con HPV negativo 5,49. O´sullivan et al. 50, en un estudio que realizaron a 500 pacientes, encontraron que estadios avanzados T o N eran predictores de recidivas metastásicas a distancia, independientemente de ser carcinomas HPV positivos o negativos. Esto implica que puede haber un límite a la favorabilidad biológica conferida por el hecho de ser HPV positivo 50. En resumen, para confirmar el papel de HPV como agente etiológico en el carcinoma de células escamosas oral, se requiere una evidencia adicional que se resume en los “Postulados modificados de Koch´s” 51: 1. La infección viral precede al desarrollo del cáncer; de lo cual, aunque existe evidencia, no se ha confirmado formalmente 34,51. 2. El genoma viral se encuentra presente en las lesiones tumorales o células tumorales; un hallazgo que sí está confirmado 34,51. 3. Existe una asociación epidemiológica entre la presencia del virus y el desarrollo del cáncer; algo que, a día de hoy, no se ha demostrado 34,51. 4. Las proteínas virales tienen la capacidad de transformar células in vitro; hecho que sí está claramente demostrado 34,51. Elena León Suárez Discusión 73  5. Las proteínas virales tienen la capacidad de promover la formación de tumores en animales; lo cual está demostrado por un modelo experimental de ratón, donde existe la expresión de las proteínas E6 y E7 junto con otros carcinógenos que inducen la aparición de cáncer oral en 9 meses34,51-53. 6. La vacunación profiláctica contra el HPV eliminará el carcinoma de células escamosas oral, lo cual requerirá al menos 20 años antes de que la prevalencia de cáncer oral en HPV vacunados y no vacunados se pueda determinar epidemiológicamente 34,51. 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