Identificación de nuevos componentes en la ruta de transducción sensorial para la percepción de la luz en Phycomyces blakesleeanus

! UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE GENÉTICA Identificación de nuevos componentes en la ruta de transducción sensorial para la percepción de la luz en Phycomyces blakesleeanus Alejandro Miralles Durán Tesis Doctoral Universidad de Sevilla 2017 ! ! ! UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE GENÉTICA ! ! Identificación de nuevos componentes en la ruta de transducción sensorial para la percepción de la luz en Phycomyces blakesleeanus ! ! ! Trabajo presentado por el licenciado Alejandro Miralles Durán para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Sevilla, abril de 2017 Director del trabajo: Dr. Luis María Corrochano Peláez Catedrático de Genética Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla ! ! El director de la Tesis El doctorando Dr. Luis M. Corrochano Peláez Alejandro Miralles Durán ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! A Isa, A mis padres, ! ! “Hay una fuerza motriz más poderosa que el vapor, la electricidad y la energía atómica: la voluntad”. Albert Einstein ! ! ÍNDICE RESUMEN ..................................................................................................................... 13 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 17 1. Respuesta a la luz en hongos. ................................................................................... 19 1.1 La luz como estímulo ambiental.........................................................................19 1.2 Los fotorreceptores. ............................................................................................ 20 1.2.1 Proteínas del tipo White Collar de hongos. .................................................. 21 1.2.1.1 Neurospora crassa. .................................................................................. 21 1.2.1.1.1 Funcionamiento del complejo White Collar ................................. 23 1.2.1.2 Aspergillus nidulans ................................................................................ 27 1.2.1.3 Proteínas White Collar de Cigomicetos. .............................................. 29 1.2.2 Criptocromos .............................................................................................. 29 1.2.3 Fitocromos .................................................................................................. 31 1.2.4 Rodopsinas .................................................................................................. 33 1.3 Genes regulados por la luz en hongos. ............................................................... 34 2. El cigomiceto Phycomyces blakesleeanus. .................................................................... 35 2.1 Ciclo de vida ....................................................................................................... 36 2.2.- Genómica de Phycomyces blakesleeanus. ............................................................ 38 2.2.1 Duplicación genómica en el subfilo Mucoromycotina. ................................ 38 2.3 Genética de Phycomyces blakesleeanus. ................................................................. 39 2.4 Fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ........................................................... 41 2.4.1 Fototropismo. .............................................................................................. 42 2.4.1.1 Fotorreceptores . ................................................................................... 42 2.4.1.2 Mutantes del fototropismo. .................................................................. 45 2.4.2 Fotomorfogénesis en Phycomyces. ................................................................. 46 2.4.3 Fotocarotenogénesis en Phycomyces. ............................................................. 47 2.4.3.1 Biosíntesis de β-caroteno en Phycomyces. .............................................. 49 OBJETIVOS .................................................................................................................. 53 Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus ..................................................................................................................... 57 1.1 Introducción ........................................................................................................... 59 1.2 Resultados .............................................................................................................. 62 1.2.1 Acumulación de WcoB en Phycomyces tras exposiciones a la luz. .................... 62 1.2.2 Localización subcelular de WcoB. ................................................................... 64 1.2.3 Inmunoprecipitación de WcoB. ...................................................................... 64 1.2.4 Regulación de la proteína WcoB en mutantes carS. ........................................ 67 1.2.5 Localización de la proteína WcoB-GFP en Aspergillus nidulans. .................... 69 1.2.6 Interacción entre WcoB y CarS de Phycomyces mediante BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) en Aspergillus nidulans. ......................................... 70 1.2.7 Ubiquitinación de WcoB en P. blakesleeanus. .................................................. 72 1.3 Discusión. ............................................................................................................... 73 Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora ............................ 77 2.1 Introducción ........................................................................................................... 79 2.2 Resultados .............................................................................................................. 82 2.2.1 Ligamiento entre la mutación madC y marcadores moleculares en el genoma de Phycomyces. ................................................................................................................ 82 2.2.2 Caracterización del fototropismo de los descendientes de cada cruzamiento. . 84 2.2.3 Comprobación del sexo de los descendientes de cada cruzamiento. ................ 85 Resumen ! ! 16! citoplasmática que debe interaccionar con Ras para regular su actividad. Además, su acumulación en los conidios sugiere un papel en la germinación y el crecimiento de la hifa. La identificación de MadC es un hito en la fotobiología de hongos que ha permitido identificar la primera proteína que participa en la cadena de transducción sensorial para el fototropismo después del receptor. Uno de los efectos más llamativos de la luz es la activación de la síntesis del pigmento anaranjado β–caroteno. La primera etapa de su biosíntesis está catalizada por la sintetasa de geranilgeranil pirofosfato (GGPPS). En el tercer capítulo de esta tesis demostramos que la mutación en el gen ggsA, responsable de una GGPPS, está ligada a la mutación carC. Además, hemos confirmado la actividad GGPPS de CarC y GgsB utilizando como sistema heterólogo de expresión la bacteria E. coli. Con el fin de conocer si el gen carC puede complementar la función del gen al-3 de N. crassa expresamos el ADNc del gen carC de P. blakesleeanus en un mutante al-3 de N. crassa. Nuestros resultados demuestran que el gen carC de P. blakesleeanus no complementa la mutación del gen al-3 de N. crassa, ya que los transformantes obtenidos producen la misma cantidad de carotenos que la estirpe no transformada. Nuestros resultados muestran que las mutaciones en el gen ggsA están ligadas al fenotipo de los mutantes carC, y confirmamos que ggsA es carC y que carC y ggsB codifican para proteínas con actividades GGPPS. Los resultados obtenidos durante la realización de esta Tesis Doctoral han permitido avanzar en el conocimiento de diferentes aspectos de las proteínas que usa Phycomyces para detectar la luz y regular su comportamiento y metabolismo. ! ! ! INTRODUCCIÓN ! ! ! Introducción ! 19! 1. Respuesta a la luz en hongos. 1.1 La luz como estímulo ambiental. La luz es una fuente de energía esencial importante para la vida en la Tierra, y juega un papel fundamental como señal ambiental regulando el desarrollo y fisiología de muchos organismos, desde microbios a animales. La luz aporta energía para la fotosíntesis, calor y permite la visión en microorganismos, plantas y animales. La luz es esencial para organismos fotosintéticos, pero también para los que no lo son ya que permite informar sobre el entorno. La primera respuesta a la luz azul fue observada por Charles R. Darwin (Darwin, 1881), cuando describió cómo la luz azul induce una respuesta fototrópica en plantas. Respuestas a la luz de diferentes longitudes de onda se han descrito en diferentes hongos, como las respuestas a la luz azul en Neurospora crassa (Liu et al., 2003) y Phycomyces blakesleeanus (Cerdá-Olmedo, 2001), a la luz roja en Aspergillus nidulans (Fuller et al., 2013; Mooney & Yager, 1990; Röhrig et al., 2013) y para ultravioleta en Alternaria tomato (Kumagai, 1989). La presencia de diferentes respuestas a la luz en diferentes hongos sugiere la presencia de múltiples sistemas fotorreceptores optimizados para operar a diferentes intensidades de luz o para distintas fotorrespuestas (Corrochano & Garre, 2010). Por ello, los hongos han desarrollado una compleja maquinaria de percepción y transducción de la señal lumínica mediante proteínas fotorreceptoras que les permite ajustarse a las condiciones ambientales y evitar los efectos nocivos del exceso de luz solar (Corrochano, 2007; Idnurm et al., 2010). Los efectos perjudiciales de la luz solar, como la radiación ultravioleta, son reducidos mediante la activación por luz, fundamentalmente luz azul, de pigmentos como carotenoides, y la activación de proteínas que reparan el ADN, como se ha demostrado recientemente con el criptocromo (CryA) en Phycomyces (Alejandre-Durán et al., 2003; Berrocal-Tito et al., 1999; Corrochano & Garre, 2010; Tagua et al., 2015). Las bacterias también son capaces de detectar y responder a la luz mediante el empleo de mecanismos altamente evolucionados. Existen sistemas moleculares para aprovechar la energía útil de la luz en las bacterias fototrópicas, para combatir los daños foto-oxidativos derivados de las especies altamente reactivas que se generan en la absorción de la energía de la luz, usando el estímulo de la luz para la reparación del ADN, y para dirigir el crecimiento, el desarrollo y la virulencia (Elías-Arnanz et al., 2011). Las Introducción ! 20! plantas también responden a la luz no sólo para optimizar la fotosíntesis, sino también para regular procesos importantes como la germinación, la de-etiolación, el movimiento de cloroplatos, el movimiento de estomas, la floración y el ritmo circadiano (Rockwell et al., 2006). El fototropismo y la evitación de sombras también están regulados por luz en las plantas ya que ésta promueve la activación de fototropinas que conducen a la formación de un gradiente de la hormona auxina promoviendo el crecimiento de la región estimulada por la luz. La mayor concentración de auxina en la sombra en comparación con el lado iluminado permite la reorientación del crecimiento hacia la luz (Fankhauser & Christie, 2015). La luz regula el desarrollo y comportamiento de los hongos. El desarrollo de un hongo ocurre en varias etapas: germinación de esporas, crecimiento y ramificación de las hifas, y formación de las estructuras reproductoras para el desarrollo y dispersión de las esporas. Estos procesos están regulados por diferentes factores ambientales, incluyendo la presencia o ausencia de luz. La mayoría de las respuestas a la luz en hongos se deben principalmente a la luz azul; aunque también se conocen respuestas a otras longitudes de onda como la conidiación de A. nidulans regulada por luz roja o la conidiación en A. tomato, regulada por luz ultravioleta, por ejemplo. La luz azul actúa como señal ambiental responsable de la activación de rutas metabólicas como la síntesis de carotenos, o el crecimiento de estructuras reproductoras (Corrochano, 2007; Idnurm et al., 2010). La activación por la luz de la ruta de biosíntesis de carotenos en Phycomyces blakesleeanus y Neurospora crassa y el fototropismo de los cuerpos fructíferos de Phycomyces han servido como modelos de respuestas a la luz azul en hongos (Cerdá-Olmedo, 2001; Chen et al., 2010a; Corrochano & Garre, 2010; Idnurm et al., 2010; Linden et al., 1997a). 1.2 Los fotorreceptores. Los fotorreceptores son cromoproteínas, proteínas que se unen a moléculas que absorben la luz, como flavinas, tetrapirroles o retinal (cromóforos). La luz recibida por el cromóforo da lugar a cambios conformacionales del fotorreceptor, iniciando una transducción de la señal y generando una respuesta en el organismo. Existen distintos tipos de fotorreceptores que se unen a diferentes cromóforos. Introducción ! 21! 1.2.1 Proteínas del tipo White Collar de hongos. 1.2.1.1 Neurospora crassa. Las proteínas fotorreceptoras de hongos denominadas “White Collar” (WC) reciben este nombre por el peculiar fenotipo de los mutantes wc de Neurospora crassa que resulta de la diferente regulación de la carotenogénesis en el micelio y en las esporas. Mientras que en el micelio la síntesis de carotenoides es estrictamente dependiente de la luz, en los conidios se acumulan carotenoides tanto en luz como en oscuridad. En los tubos de agar inclinado se forma una capa de micelio en la base que desarrolla una masa de hifas aéreas dedicada en su gran mayoría a la formación de conidios. El mutante wc presenta la masa aérea pigmentada, mientras que en la base se aprecia un anillo de color blanco, que le da nombre al mutante. Estos mutantes albinos son fácilmente distinguibles de los mutantes albinos alterados en los genes estructurales de la ruta biosintética (al-1, al-2, al-3), ya que los conidios en estos mutantes son blancos y por tanto toda la biomasa es blanca. Los mutantes wc no sólo carecen de fotocarotenogénesis sino que además carecen del resto de fotorrespuestas en N. crassa, como son la regulación por luz de la conidiación, ajuste por luz del ritmo circadiano y regulación por luz de la formación y comportamiento de los peritecios. Estos mutantes a pesar de ser ciegos, no presentan ninguna alteración en el crecimiento o la morfología (Degli-Innocenti & Russo, 1984). Se han descrito mutantes en los dos genes wc, wc-1 y wc-2, y los dos genes se han clonado (Ballario et al., 1996; Linden et al., 1997b). La característica común de las proteínas del tipo White Collar-1 (WC-1) es la presencia de un dominio LOV, dos dominios PAS que se encargan de la interacción proteína-proteína, y un dominio dedo de zinc para la interacción con el ADN, lo que les permite actuar como factores de transcripción (Froehlich et al., 2002; He et al., 2002). El dominio dedo de zinc no aparece en las proteínas WC-1 de hongos pertenecientes al grupo de los basidiomicetos y en algunas proteínas del tipo WC-1 de cigomicetos (Idnurm et al., 2010). Con respecto a las proteínas del tipo White Collar-2 (WC-2) se caracterizan por presentar un dominio PAS y un dominio dedo de Zn; careciendo de dominio LOV y por consiguiente sin la capacidad de actuar por sí mismas como fotorreceptores. Concretamente, la proteína WC-1 de N. crassa contiene tres dominios PAS (Ballario et al., 1998), una señal de localización nuclear (NLS) (Schwerdtfeger & Linden, 2000a), y un dominio dedo de zinc tipo GATA (Ballario et al., 1996). El Introducción ! 22! dominio NLS no es imprescindible para el transporte de WC-1 al núcleo; ya en el mutante de wc-1 que carece del dominio NLS, WC-1 también es localizado en el núcleo. Parece ser necesaria la interacción de WC-1 con otras proteínas aún no conocidas para su transporte al núcleo; o la existencia de un dominio NLS no canónico (Wang et al., 2016). El primer dominio PAS es un dominio LOV y es el encargado de interaccionar con la flavina (FAD) que actúa como cromóforo (Froehlich et al., 2002; He et al., 2002). Los dominios LOV son dominios conservados de proteínas parecidos a los dominios de unión proteína-proteína denominados dominios PAS (Per Arnt Sim) que se unen a nucleótidos de flavina (FMN o FAD), y que están implicadas en respuestas a distintos estímulos como luz, oxígeno y voltaje (Christie, 2007; Christie et al., 1999). Estos dominios LOV absorben la luz dando lugar a la formación de un enlace covalente entre la flavina (FMN o FAD) y una cisteína del domino LOV (Salomon et al., 2000). La flavina se localiza en el interior del dominio LOV unida de forma no covalente mediante puentes de hidrógeno, enlaces Van der Walls e interacciones electroestáticas (Crosson & Moffat, 2001; 2002; Kennis et al., 2004). Estudios mutacionales han demostrado que la cisteína no es esencial para la unión de flavina, pero es esencial para la reacción fotoquímica reversible. Si la cisteína del dominio LOV es reemplazada por una serina se pierde la transcripción de los genes dependiente de la luz (Cheng et al., 2003). Los dominios LOV están presentes en bacterias, hongos, plantas y animales; de hecho, mediante estudios bioinformáticos se ha sugerido que los dominios LOV eucariotas presentes en la fotorreceptores circadianos de plantas ZTL/ADO/FKF1 provienen de las cianobacterias; mientras que los dominios LOV de fototropinas de plantas, LOV de aureocromos, LOV de proteínas del tipo White Collar de hongos y dominios LOV presentes en proteínas animales provienen de alfaproteobacterias (Herrou & Crosson, 2011). Oscuridad Luz Figura I.1: Cambios conformacionales en el dominio LOV tras una exposición a la luz. Las flechas indican los cambios principales en la estructura después de la formación del enlace flavinacisteína. Modificado de (Zoltowski et al., 2007). Introducción ! 23! La proteína WC-2 de N. crassa también presenta un dominio dedo de zinc tipo GATA, un dominio PAS y un dominio de localización nuclear (NLS) (Linden & Macino, 1997). El gen wc-2 se expresa igual en luz que en oscuridad; y la estabilidad de su ARNm es independiente de las proteínas WC-1 o WC-2, pero su transcripción depende de WC-1 que lo regula negativamente (Cheng et al., 2003; Linden & Macino, 1997). WC-1 interacciona con WC-2 a través de los dominios PAS para formar el complejo White Collar (WC), que se une a los promotores de los genes fotoinducibles (Ballario et al., 1998; Cheng et al., 2002; Talora et al., 1999). In vivo, el complejo WC se une a los promotores de los genes fotoinducibles de manera transitoria, permitiendo la fotoactivación de estos genes (He & Liu, 2005). Las proteínas WC están presentes en la oscuridad y se localizan preferentemente en el núcleo, aunque ambas proteínas se someten a ciclos rápidos de trayectos núcleo-citoplasma y viceversa. La localización nuclear de cualquiera de las proteínas, WC-1 o WC-2, no se ve afectada por la luz, y además no se altera por mutaciones en wc-2 o wc-1, respectivamente; lo que indica que la localización nuclear no requiere el complejo WC completo (Schwerdtfeger & Linden, 2000a). Además, la localización nuclear de WC-2 no parece depender de su señal de localización nuclear; ya que si ésta se elimina, la cantidad de WC-2 presente en el núcleo es la misma, por lo que debe existir otro mecanismo que regule su transporte al núcleo (Schwerdtfeger & Linden, 2000a). 1.2.1.1.1 Funcionamiento del complejo White Collar. En la oscuridad, el complejo WC se une a unas secuencias conservadas denominadas LRE (Light Response Elements) localizadas en los promotores de los genes fotoinducibles (Froehlich et al., 2003; 2002; He & Liu, 2005; Smith et al., 2010). Las secuencias consenso propuestas para estos LRE son GATNC---CGATN, donde N puede ser cualquier nucleótido pero el mismo en ambas repeticiones (He & Liu, 2005); y GATCGA, con variabilidad en la primera y la última base (Smith et al., 2010). El complejo WC una vez unido a las secuencias LRE interacciona con la histona acetiltransferasa NGF-1 (Brenna et al., 2012). La activación de WC-1 por la luz promueve un cambio conformacional en la proteína que permite la formación de homodímeros de complejo WC a través de los dominios LOV de las subunidades WC-1 (Malzahn et al., 2010). Esto resulta en la activación de la histona NGF-1 permitiendo la acetilación transitoria de la lisina-14 en las histonas H3 asociadas con los promotores de Introducción ! 24! genes fotoinducibles como se ha mostrado para el gen al-3 de N. crassa (Brenna et al., 2012; Grimaldi et al., 2006). La acetilación de la histona es revertida por una remodelación dependiente de ATP mediada por la enzima CSW-1 (ClockSwith-1) (Belden et al., 2007a). Oscuridad Luz azul Figura I.2: Modelo simplificado para la activación de la transcripción por luz. La recepción de la luz mediante el cromóforo FAD de WC-1 debe dar lugar a la formación del enlace entre la flavina y la cisteína, provocando un cambio conformacional que conduce a la dimerización del complejo WC, remodelación de la cromatina a través de la histona acetiltransferasa NGF-1, y la activación de la transcripción de genes. Las histonas modificadas son mostradas mediante estrellas en el sitio de unión al promotor. La exposición a la luz estimula la transcripción de los genes vvd, frq, y otros genes fotoinducibles. Figura modificada de (Olmedo et al., 2013). La luz promueve la transcripción transitoria de wc-1 (Ballario et al., 1996; Káldi et al., 2006) y la fosforilación de la proteína, lo que permite su degradación y reemplazamiento en el complejo WC por proteína WC-1 nuevamente sintetizada pero inactiva; reduciendo la capacidad del complejo WC para unirse a los promotores de genes fotoinducibles (He & Liu, 2005; Schwerdtfeger & Linden, 2000a; 2001; Talora et al., 1999). El gen wc-1 tiene un promotor complejo con tres sitios diferentes de iniciación de la transcripción (Káldi et al., 2006), y es fotoinducible a través del complejo WC (Ballario et al., 1996). Por otro lado, WC-2 también es fosforilado después de exposiciones a la luz y dicha fosforilación es dependiente de WC-1. La fosforilación de WC-2 es más débil y no cambia cuando la exposición a la luz se prolonga. Mutaciones en el dedo de zinc de WC-2 dan lugar a la pérdida de la fosforilación dependiente de la luz (Schwerdtfeger & Linden, 2000b; Talora et al., 1999). Introducción ! 25! Neurospora crassa es capaz de responder a largas exposiciones lumínicas mediante un proceso llamado fotoadaptación (Arpaia et al., 1999; Lauter & Yanofsky, 1993; Schwerdtfeger & Linden, 2001; 2003). En este proceso interviene una proteína llamada VIVID (VVD). Esta proteína tiene 186 aminoácidos que actúa como receptor de luz azul mediante un dominio tipo LOV, al cual se le une una flavina (FMN o FAD) como cromóforo (Heintzen et al., 2001; Zoltowski et al., 2007). Estirpes de N. crassa con mutaciones en el gen vvd muestran una fosforilación prolongada de WC-1 en luz, una reducción en la cantidad de WC-1 en la célula, y una fotoactivación génica prolongada; sugiriendo que la fosforilación tiene un importante papel en la actividad transitoria del complejo WC y la fotoadaptación (He & Liu, 2005; Heintzen et al., 2001; Malzahn et al., 2010; Schafmeier et al., 2005; Schwerdtfeger & Linden, 2001; 2003; Shrode et al., 2001). VVD se activa por luz azul y forma dímeros mediante el dominio LOV (Peter et al., 2012; Zoltowski & Crane, 2008). La similitud del dominio LOV de VVD y WC-1 sugiere una posible interacción entre ellos interrumpiendo los dímeros del complejo WC activos; lo que da lugar a una atenuación de la transcripción. Los heterodímeros de complejo WC-VVD provocan la fotoadaptación debido a la inactivación del complejo WC. El complejo WC activo es rápidamente degradado, pero la interacción de complejo WC-VVD previene a dicho complejo de la degradación (Malzahn et al., 2010), y crea una cantidad de WC-1 activados por luz que son transcripcionalmente inactivos. La sobreexpresión de vvd resulta en una desensibilización del complejo WC (Chen et al., 2010b; Hunt et al., 2010; Malzahn et al., 2010). En el proceso de fotoadaptación de N. crassa también participa la proteína quinasa C (PKC) (Arpaia et al., 1999; Franchi et al., 2005). Esta proteína interacciona con WC-1 in vivo y fosforila el dominio dedo de zinc (in vitro) de WC-1 en el micelio crecido en oscuridad o después de 2 horas de iluminación; cuando ya la luz ha provocado el cese de la expresión de genes fotoinducibles. Una estipe con baja cantidad de PKC tiene incrementado los niveles de WC-1 lo que confirma que PKC es un regulador negativo de WC-1 (Franchi et al., 2005). Introducción ! 32! fosfodiesterasa/ Adenilato ciclasa/ FhIA) que tiene actividad bilin liasa y contiene una cisteína conservada que une el cromóforo, un dominio exclusivo de cromóforos llamado PHY, y una región reguladora en su extremo carboxilo terminal que varía enormemente según las especies pero que siempre contiene un dominio relacionado con las quinasas de histidina (HKRD) (Mathews & Sharrock, 1996). Los fitocromos son cromoproteínas solubles que existen en dos formas interconvertibles que son diferenciadas por sus máximos de absorción y sus estructuras. Estas proteínas son sintetizadas en la conformación Pr que absorbe luz roja. La absorción de luz roja provoca cambios en el cromóforo seguidos por cambios de la conformación de la proteína. Los cambios estructurales van acompañados de cambios en la absorción máxima del fitocromo, que pasa de absorber en el rojo (660 nm) a absorber luz roja lejana (730 nm) en la forma Pfr. La forma Pfr puede absorber luz del rojo lejano para volver al estado Pr. La relación entre ambos estados determina el estado de señalización del fitocromo. Por tanto, en la mayoría de los casos, las respuestas son inducidas por la luz roja y revertidas por el rojo lejano, dando lugar al concepto de que la forma Pfr es la forma biológicamente activa (Rodríguez-Romero et al., 2010). En los genomas de algunos hongos también se han encontrado genes para fitocromos aunque en los genomas de cigomicetos no se han descrito. Los fitocromos de hongos están más estrechamente relacionados con los fitocromos de bacterias aunque los fitocromos de hongos presentan un dominio regulador en la región carboxilo terminal de la proteína y las bacterias tienen los módulos (quinasa y regulador) separados en dos genes (Idnurm et al., 2010). La conservación de la secuencia en el dominio de unión del cromóforo y la estructura de dominios de la proteína indican que los fitocromos de hongos son más similares a los fitocromos bacterianos que a los de plantas lo que sugiere un posible origen evolutivo (Corrochano, 2007; 2011). Sin embargo, el papel de los fitocromos en la fotobiología de los hongos no está claro. La falta de fenotipos claros en los mutantes de fitocromos en algunos hongos hace que sea difícil asignar un papel a estos fotorreceptores en la biología de estos organismos. En Aspergillus está bien caracterizado el fitocromo FphA. En A. nidulans la proteína FphA regula la transición de ciclo asexual a sexual y la biosíntesis de metabolitos secundarios en respuesta a la luz y también posee una función represora en la formación de cleistotecios (Rodríguez-Romero et al., 2010). Esta proteína también está implicada en la activación por la luz del gen brlA de ahí Introducción ! 33! su papel en esporulación (Ruger-Herreros et al., 2011). FphA forma un complejo con el sistema sensorial de luz azul controlado por el complejo White Collar (Purschwitz et al., 2008), interaccionando físicamente con LreB (homólogo a WC-2 de N. crassa), que interacciona a su vez con LreA (homólogo a WC-1 de N. crassa). Estas interacciones ocurren en el núcleo aunque el fitocromo sea una proteína mayoritariamente citoplasmática (Purschwitz et al., 2008). FphA también interacciona con VelvetA (VeA), cuyos homólogos están emergiendo como reguladores para el metabolismo secundario y esporulación en hongos (Calvo, 2008), explicado anteriormente en la sección 1.2.1.2. En A. nidulans se ha comprobado que el fitocromo FphA interacciona físicamente con una fosfotransferasa denominada YpdA, que a su vez fosforila a la MAP quinasa SakA de manera dependiente de la luz roja. En ausencia del fitocromo, SakA responde al estrés osmótico pero no a la luz. Por lo tanto, en este hongo se revela que la percepción de la luz roja es transmitida mediante la vía HOG (High Osmolarity Glycerol) a través de la cascada de MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase). Este proceso podría integrar varias respuestas a estrés y SakA puede ser considerada el núcleo para el procesamiento de diferentes señales ambientales (Zhenzhong et al., 2016). 1.2.4 Rodopsinas. Las rodopsinas son proteínas de membrana que constan de siete hélices transmembranales que forman un bolsillo interior para el cromóforo all-trans-retinal, el cual está unido covalentemente a través de una base de Schiff protonada a un residuo de lisina en la hélice G (García-Martínez et al., 2015; Sharma et al., 2006). El papel de las rodopsinas en fotobiología de hongos no está todavía claro. N. crassa contiene en su genoma un gen llamado nop-1 que codifica para una rodopsina, NOP-1, que es una rodopsina que une todo-trans-retinal como cromóforo (Bieszke et al., 1999). La inactivación de este gen no da lugar a un fenotipo evidente, pero el patrón de expresión del gen nos permite intuir un papel en el desarrollo de las estructura reproductivas de Neurospora (Bieszke et al., 1999) y en la derrepresión de la respuesta transcripcional a la luz de varios genes (Olmedo et al., 2010b). Los niveles de ARNm del gen aumentan al inducirse la conidiación indicando una relación de nop-1 con los genes de la conidiación (Bieszke et al., 2007). En los genomas de Fusarium existen genes que codifican para dos rodopsinas diferentes, llamadas OpsA en F. fujikuroi (Estrada & Introducción ! 34! Avalos, 2009) y CarO (Prado et al., 2004). La mutación de OpsA no produce cambios fenotípicos pero disminuyen los niveles de ARNm de los genes car aunque el contenido total de caroteno no se ve alterado (Estrada & Avalos, 2009). CarO es una bomba de protones activada por luz verde que se encuentra predominantemente en la membrana citoplasmática de los conidios. La tarea de CarO podría ser la de retardar la germinación de los conidios bajo la luz para mejorar las posibilidades de infección. CarO exhibe un fotociclo rápido y se satura a altas intensidades de luz, por lo que podría ser útil para que el hongo pueda ahorrar energía durante el día (García-Martínez et al., 2015). 1.3 Genes regulados por la luz en hongos. La diversidad de respuestas a la luz en hongos sugieren la presencia de diferentes genes regulados por luz en los genomas de hongos (Idnurm et al., 2010; Tisch & Schmoll, 1994). Se han realizado experimentos de hibridación de microarrays en Neurospora crassa (Chen et al., 2009; Dong et al., 2008; Lewis et al., 2002; Smith et al., 2010), Criptococcus neoformans (Idnurm & Heitman, 2010), Trichoderma atroviridae (Rosales-Saavedra et al., 2006) y Aspergillus nidulans (Rodríguez-Romero et al., 2010; Ruger-Herreros et al., 2011) para detectar diferencias transcripcionales debidas a la luz. El número de genes regulados por luz varía entre hongos, siendo del 0.25% en C. neoformans, el 2.5% en A. nidulans, el 2.8% en T. atroviridae y entre el 3-7% en N. crassa. Estos resultados no son comparables al estar realizados en distintas condiciones, con distintos medios de cultivo, condiciones de iluminación, etc, pero muestran una apreciable activación por la luz del transcriptoma de los hongos investigados. Se conocen pocos genes fotorregulados en todos los hongos. Los genes que están a menudo regulados por luz son fotoliasas para reparar ADN (Chaves et al., 2011) o enzimas para la biosíntesis de carotenos; aunque debe tenerse en cuenta que las fotoliasas están ausentes en algunos genomas de hongos y que la biosíntesis de carotenos no está inducida por luz en algunos hongos. Las fotoliasas y el caroteno juegan un papel en la protección contra la luz UV, por lo tanto la activación de estos genes por luz permite incrementar dicha protección (Idnurm & Heitman, 2010; Idnurm et al., 2010). Otros genes fotorregulados están implicados en procesos biológicos como el ritmo circadiano y la conidiación. Existen también genes regulados por luz que participan en procesos tales como el metabolismo y el transporte del carbono, reacciones rédox, respuestas a estrés, ciclo Introducción ! 35! celular y procesamiento de ADN, síntesis de proteínas, rescate celular, defensa, virulencia y transporte celular. Algunos de estos genes son factores de transcripción probablemente implicados en la activación de rutas de señalización dependientes de la luz (Dong et al., 2008; Rosales-Saavedra et al., 2006; Ruger-Herreros et al., 2011). El análisis global de la regulación de genes por luz en hongos sugiere la importancia de la luz para adaptarse a las duras y cambiantes condiciones ambientales. También ocurren cambios durante el ciclo día/noche para la hifas que crecen en la superficie, el aumento de la temperatura durante el día, la disminución de la humedad y la aparición de las especies reactivas de oxígeno. Un reloj circadiano presente en muchos hongos les permite prever los cambios que se presentan cada mañana para prevenirlos antes de que aparezcan y les provoquen algún tipo de daño (Rodríguez-Romero et al., 2010). 2. El cigomiceto Phycomyces blakesleeanus. Phycomyces blakesleeanus es un hongo filamentosos saprófito y terrestre. Pertenece al subfilo Mucoromycotina, orden Mucorales, familia Mucoraceae. Este hongo ha sido encontrado en ambientes húmedos en diversas regiones del mundo. Phycomyces fue descrito por primera por C.A. Agardh, quien inicialmente lo confundió con un alga verde y lo denominó Ulva nitens (Agardh, 1817). El nombre de Phycomyces “hongo alga” fue asignado en 1823. La especie original, Phycomyces nitens, fue dividida en dos denominadas como la anterior, P. nitens y otra especie llamada P. blakesleeanus, que es la que se utiliza en los laboratorios de investigación y la usada en esta tesis doctoral. La razón por la que se encuentra Phycomyces en los laboratorios es la sensibilidad a diferentes estímulos ambientales, sobre todo, su sensibilidad a la luz (Carnoy, 1870; Massart, 1888). Figura I.6: Aspecto de Phycomyces con los cuerpos fructíferos. Introducción ! 36! 2.1 Ciclo de vida. Phycomyces blakesleeanus tiene un ciclo de vida sexual y asexual (Figura I.7), y es haploide, lo que permite la expresión de mutaciones recesivas. Además, Phycomyces presenta un micelio cenocítico y sus esporas contienen varios núcleos excepto algunas que son uninucleadas. La espora contiene un promedio de 3 ó 4 núcleos y tan sólo el 0,3% de esporas son uninucleadas. Para la germinación masiva y simultánea de esporas es necesario someterlas a un choque térmico de 48ºC durante 15 minutos o también por la presencia de ciertos compuestos químicos como acetato o propionato (Rivero & Cerdá- Olmedo, 1994; Robbins & Kavanagh, 1942; Vanmulders & AJ, 1986). Las hifas contiene múltiples núcleos haploides que aparecen tras la mitosis de los núcleos que estaban presentes en la espora. El micelio tiene una velocidad de crecimiento de dos centímetros diarios, siempre que haya nutrientes y las condiciones ambientales lo permitan. Tras el crecimiento vegetativo comienza un proceso de diferenciación en hifas aéreas no ramificadas denominadas esporangióforos. El esporangióforo desarrolla en su extremo apical una esfera, el esporangio, que contiene núcleos con los que se formarán las esporas vegetativas. Phycomyces desarrolla dos tipos de esporangióforos, los micróforos, de hasta tres milímetros de longitud y los macróforos de varios centímetros o decímetros de longitud. La formación de un tipo u otro estará determinado por la luz, el medio de cultivo, la disponibilidad de oxígeno o la densidad del cultivo (Cerdá-Olmedo, 2001; Cerdá-Olmedo & Lipson, 1987a; Corrochano & Cerdá-Olmedo, 1992). (+) (-) esporas esporangios micelio esporangioforos progamentangio suspensor gamentangio cigosporas germosporas CICLO SEXUAL CICLO VEGETATIVO germosporangio Figura I.7: Ciclos de vida de Phycomyces. Imágenes cedidas por la Dra. Dolores Pérez de Camino Cantos. Introducción ! 37! Blakeslee en 1904 reconoció en las estirpes de los mucorales dos sexos que llamó (+) y (-), indistinguibles morfológicamente salvo por la capacidad de reaccionar sexualmente cuando se encuentra un micelio de sexo contrario y las condiciones ambientales son las idóneas (Blakeslee, 1906). Phycomyces por tanto es heterótalico ya que existen sexos diferenciados. Los genes responsables del sexo en Phycomyces se denominan sexM y sexP (Idnurm et al., 2008). Cada gen se encuentra en el locus sexual, una región de 5,8 kb para sexo (+) y de 3,4 kb para sexo (-) que contiene ADN repetido. Estos genes codifican para proteínas con un dominio HMG (High Mobility Group), que se ha descrito en genes asociados al locus del sexo de otros hongos y levaduras. Los genes del sexo tienen tamaños diferentes, 636 pares de bases en sexM y 723 pares de bases para sexP; y presentan distinta orientación en el genoma del hongo (Idnurm et al., 2008). No se conoce la manera en la que estas proteínas intervienen en la interacción sexual. La cercanía de micelios de distinto sexo en un medio sólido adecuado induce el comienzo del ciclo sexual de Phycomyces. Ambos sexos, antes de ponerse en contacto, difunden señales químicas específicas (Burgeff, 1924) en la primera demostración de feromonas en la naturaleza. Aún no ha sido identificado el compuesto químico, pero se conoce que es un derivado del β−caroteno ya que los mutantes que no pueden sintetizarlos no son capaces de estimular a la estirpe de sexo contrario (Burgeff, 1924; Sutter, 1975b). La principal hormona sexual parece ser el ácido trispórico (Bulock et al., 1974; Nieuwenhuis & Vandenende, 1975; Schimek & Wöstemeyer, 2009). Cuando las señales químicas de una estirpe son percibidas por la estirpe de sexo contrario se origina un engrosamiento de las hifas especializadas para el cruzamiento sexual llamadas cigóforos. Los cigóforos de ambos sexos contactan y se entrelazan por parejas en el aire adoptando una disposición de tenazas en la que cada mitad está compuesta por la región distal del otro, el progamentagio. Una pared transversal tabica los ápices de cada progamentagio, separando una célula llamada gamentagio y la parte restante se llama suspensor. La fusión de dos gamentagios origina una sola célula, la cigospora, que contiene citoplasma y núcleos de ambas estirpes. La cigospora mide unos 0,5 mm de diámetro y está rodeada de unas apéndices negros procedentes de los suspensores. En la cigospora, una vez fusionados los núcleos haploides, se tiene que producir una meiosis y posteriormente mitosis para generar los núcleos de la germospora; al menos esto es lo que hipotetizó Hans Burgeff (1928). Esta discusión sobre si ocurre meiosis o mitosis en la cigospora siguen siendo objeto de debate Introducción ! 38! ya que parece que hay evidencias de ambas cosas (desarrollado en la sección 2.3 de esta introducción). La cigospora permanece en latencia durante meses antes de germinar produciendo un germosporangióforo, con su germosporangio en la parte apical conteniendo las germosporas. Las germosporas al germinar dan lugar al micelio vegetativo (Cerdá-Olmedo, 2001; Cerdá-Olmedo & Lipson, 1987b). 2.2.- Genómica de Phycomyces blakesleeanus. La secuenciación del genoma de Phycomyces está ayudando a entender la base molecular de la sensibilidad a estímulos ambientales y está proporcionando información sobre la evolución de los genomas de hongos entre otras utilidades. El genoma de este hongo ha sido secuenciado por el Joint Genome Institute ( Departamento de Energía, EEUU). La secuencia del genoma de P. blakesleeanus con los resultados de la anotación automática están disponibles en (http://genome.jgi.doe.gov/Phybl2/Phybl2.home.html). El genoma de este hongo ha sido secuenciado y ensamblado en 80 contigs que contienen 53,9 Mbp con una predicción de 16528 genes con una densidad de génica de 306,4 genes/ Mbp (Corrochano et al., 2016). El hecho de tener el genoma secuenciado facilita las investigaciones en este hongo aunque todavía no se ha conseguido la transformación estable con ADN exógeno. Se ha intentado la introducción de ADN mediante diferentes técnicas, pero esto da lugar a una reacción por parte del hongo que degrada el ADN entrante y también el ADN propio dando lugar a la pérdida de viabilidad e inducción de mutaciones en los supervivientes (Obraztsova et al., 2004). Este hecho impide el uso de numerosas técnicas modernas de biología molecular que ya han sido aplicadas en otros hongos. 2.2.1 Duplicación genómica en el subfilo Mucoromycotina. La secuenciación de los genomas de algunos cigomicetos, entre ellos, el de P. blakesleeanus y M. circinelloides, han revelado que éstos han sido moldeados por una duplicación del genoma rara vez observada en los hongos. En el análisis de estos genomas se ha observado la expansión de algunas familias de genes, incluyendo los que participan en la transducción de señales. Los genes duplicados se han especializado, como se evidencia, por ejemplo, por las diferencias de su regulación transcripcional por la luz. La duplicación génica ha ampliado el número de genes que participan en la fotorrecepión en Phycomyces y Mucor. La duplicación genómica y la posterior especialización pueden haber Introducción ! 39! proporcionado nuevas proteínas para incrementar el repertorio sensorial de estos hongos (Corrochano et al., 2016). El incremento en los tamaños de los genomas de Phycomyces blakesleeanus (53,9 Mb) y Mucor circinelloides (36,6 Mb) es debido en parte a la gran cantidad de ADN repetitivo. La comparación de los genomas de estos hongos con el de otro cigomiceto, Rhizopus delemar, y otros hongos, sugiere que la duplicación génica ocurrió temprano en la evolución de la familia Mucoromycotina (Corrochano et al., 2016). Algunos familias de genes, pero no todas de una categoría se expanden como ocurre con los genes implicados en fotorrecepción en estos hongos. Los genes que codifican para proteínas del tipo White Collar se han duplicado en Phycomyces y Mucor; aunque no lo hace el gen del criptocromo. También existen genes que codifican para proteínas que participan en la defensa del genoma a través de ARNi que no se han duplicado en estos hongos. La presencia de estos genes sugiere la existencia de una regulación mediada por ARNi en Phycomyces y Rhizopus, como ya ha sido descrito en Mucor (Nicolás et al., 2015). En definitiva, la duplicación génica ha proporcionado en estos cigomicetos los medios para mejorar la percepción y transducción de señales ambientales; consiguiendo una mejor adaptación al medio que les rodea (Corrochano et al., 2016) 2.3 Genética de Phycomyces blakesleeanus. El análisis genético mendeliano es una potente herramienta disponible para investigar organismos eucariotas e incluye capacidades únicas para dirigir aspectos específicos sobre el comportamiento de los cromosomas. La habilidad para realizar cruces sexuales es particularmente importante en organismos que no han sido transformados genéticamente de manera exitosa, como es el caso de Phycomyces blakesleeanus. Gracias a los cruzamientos se consigue una batería de descendientes, cuyo análisis permite conocer diferentes aspectos de la genética de este hongo que incluyen el número de grupos de ligamiento, frecuencias de recombinación, etc. Se han aislado cientos de mutantes en Phycomyces aunque se han identificados muy pocos. La recombinación y la meiosis en Phycomyces sigue siendo objeto de investigación desde los estudios realizados por Burgeff en 1912. A pesar de ser la especie más idónea para los estudios genéticos en la familia Mucoromycotina, los eventos genéticos durante los Introducción ! 40! cruzamientos siguen sin estar claros. En Metha et al., 2001 señalan que sus datos y otras relaciones de segregación son incompatibles con que exista un solo núcleo diploide que se somete a una reducción meiótica, siendo también las pruebas de meiosis en Phycomyces escasas. Metha et al. apuntan que no se da meiosis porque este proceso es simétrico y ordenado y en Phycomyces se producen frecuencias alélicas erráticas en un germosporangio. Por ello, defienden la hipótesis de que no hay meiosis, sino que los núcleos supervivientes diploides sufren repetidas divisiones mitóticas, en las que se producirían una frecuente recombinación mitótica y luego una haploidización permitiendo una progenie con núcleos haploides (Mehta & Cerdá-Olmedo, 2001). Sin embargo, Chaudhary et al., 2013 sugieren que a pesar de no poder resolver completamente la naturaleza de los eventos de reducción genética dentro de la cigospora de Phycomyces confirman que ocurre recombinación entre los cromosomas aunque no mediante una “meiosis perfecta”. Estos autores proponen que la meiosis está influenciada por un pobre o inoportuno alineamiento de los cromosomas durante la meiosis I. Esto se basa en las relativamente altas tasas de recombinación (33,2 kb por cM) observadas en los cruzamientos (Chaudhary et al., 2013), pero que son consideradas escasas para la segregación de marcadores comparadas con lo que se obtiene con cruces entre estirpes con una mayor proporción de material genético compartido (Alvarez & Eslava, 1983b). Es decir, Phycomyces sufre una meiosis o tiene una frecuencia de recombinación mitótica de ordenes de magnitud mayor que otros eucariotas. Otro resultado que apoya la existencia de meiosis es que los genes del sexo de Phycomyces, sexP y sexM, están dentro de regiones idiomórficas de ADN rodeadas de secuencias de ADN conservadas (Idnurm & Heitman, 2005). La tercera evidencia de meiosis en Phycomyces es la presencia en su genoma de genes que codifican para proteínas, como por ejemplo, Dcm1, Spo11, Hop2 Mnd1, Msh5/ Msh5 cuyo papel en la meiosis está confirmado en otros organismos. Además, la frecuencia de recombinación observada en Phycomyces está al mismo nivel que la de otros hongos donde la meiosis está confirmada (Chaudhary et al., 2013). Mediante análisis genético de descendientes de los diferentes cruzamientos y comprobando el ligamiento entre distintos marcadores a lo largo del genoma de Phycomyces se ha construido un mapa genético con 134 marcadores, mayoritariamente RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)-PCR. El análisis de los alelos en los Introducción ! 41! descendientes reveló entre 9 o 12 grupos de ligamientos. La frecuencia de recombinación entre los marcadores en cada grupo de ligamiento es de 1583,4 cM. Además, se estimó la frecuencia de recombinación media del genoma, revelando que 1 cM equivale a 33,2 kb. Los grupos de ligamientos en Phycomyces han sido numerados como: I, IIa, IIb, III, IV, Va, Vb, VI, VII, VIII, IXa y IXb (Chaudhary et al., 2013). 2.4 Fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. Phycomyces es capaz de responder a diferentes estímulos ambientales tales como la luz, la gravedad, el viento, la presión, las radiaciones ionizantes y la presencia de obstáculos (evitación) . Este organismo tiene la capacidad de modificar la velocidad y dirección de crecimiento de su cuerpo fructífero (esporangióforos) para responder a los diferentes estímulos (Cerdá-Olmedo, 2001). Los esporangióforos tienen tropismo positivo a la luz azul, radiación UV cercano, viento y presión, y a la radiación de 310 nm de longitud de onda (Martín-Rojas et al., 1995); mientras que presentan tropismo negativo a la presencia de obstáculos (Meyer et al., 1987) y la gravedad (Eibel et al., 2000; Galland et al., 2004; Grolig et al., 2004). Las respuestas miceliares a la luz más investigadas son la fotomorfogénesis y la fotocarotenogénesis. La fotomorfogénesis es el efecto de la luz sobre la formación y el desarrollo de los esporangióforos. La luz regula la formación de los dos tipos de esporangióforos que se originan en Phycomyces, macróforos y micróforos (Corrochano & Cerdá-Olmedo, 1992; Thornton, 1972). La luz azul estimula la producción de macróforos e inhibe la de micróforos (Corrochano & Cerdá-Olmedo, 1992). La capacidad de movimiento del macróforo se explicaría en la naturaleza como una necesidad de dispersión de las esporas ya que las esporas de Phycomyces a diferencia de las de otros hongos no son volátiles. Por otro lado, los aparición de micróforos durante el crecimiento en la oscuridad es una alternativa energéticamente económica de dispersión cuando no existe una posibilidad de dispersión a un entorno iluminado (Cerdá-Olmedo, 2001). La fotocarotenogénesis es el efecto de la luz sobre la síntesis del pigmento amarillo β-caroteno. La presencia de luz azul incrementa la cantidad de carotenos acumulados en el micelio (Bejarano et al., 1991; Bergman et al., 1973). Introducción ! 48! dieta; con la excepción de algunos áfidos o ácaros que son capaces de sintetizarlos gracias a la transferencia horizontal desde un hongo patógeno o simbionte (Altincicek et al., 2012; Moran & Jarvik, 2010). En humanos, el consumo de carotenoides ha sido asociado a los diferentes efectos beneficiosos para la salud, incluyendo la reducción en la incidencia de algunas enfermedades (Krinsky & Johnson, 2005; Rao & Rao, 2007; Stahl & Sies, 2003). El caroteno más importante es el β-caroteno, tiene propiedades antioxidantes y es el precursor del retinal (aldehído de la vitamina A o retinol) y del ácido retinoico. Otros carotenos como el licopeno poseen una elevada capacidad antioxidante, y su ingestión reduce el riesgo de cáncer y cierto problemas cardiovasculares (Hadley et al., 2002). A nivel biotecnológico, los carotenoides son importantes ya que se utilizan como ingredientes activos en las industrias cosméticas y alimentarias no sólo por sus propiedades químicas sino también por sus llamativos colores. Cada vez se utiliza más en productos de belleza, como colorante alimenticio o en alimentos pobres en carotenos (Avalos & Cerdá-Olmedo, 2004). Muchos hongos sintetizan carotenoides, y en algunos, la bioquímica y genética de su biosíntesis han sido objeto de estudio. Los carotenoides mejor estudiados son el βcaroteno, neurosporaxantina y astaxantina, mientras existe menos información sobre la producción de otros carotenoides como son las xantofilas. El β-caroteno es el caroteno más extendido en la naturaleza (Zeilinger et al., 2015) y es el principal producto final de la vía de carotenogénesis de muchos hongos, entre ellos los mucorales Phycomyces blakesleeanus (Bejarano et al., 1991), Blakeslea trispora (Quiles-Rosillo et al., 2005) y Mucor circinelloides (Navarro et al., 1995). Además de los mucorales, la producción de βcaroteno ha sido también descrita en otros grupos taxonómicos, incluyendo basidiomicetos como Rhodosporidium sp. (de Miguel T et al., 1997), Sclerotium rolfsii (Georgiou CD et al., 2001a), Sclerotinia sclerotiorum (Georgiou CD et al., 2001b), Sporidiobolus pararoseus (Han et al., 2012), Ustilago maydis (Estrada et al., 2009) y algunas especies de Ustilago (Will et al., 1984; 1985); y en ascomicetos como Aspergillus giganteus (El-Jack et al., 1988), Cercospora nicotianae (Daub & Payne, 1989), Neurospora crassa (Harding & Turner, 1981), Fusarium fujikuroi (Avalos & Cerdá-Olmedo, 1987) y Penicillium sp (Han et al., 2005). Sin embargo, el β-caroteno es una molécula Introducción ! 49! intermediaria en la síntesis de otros carotenoides en muchas especies de hongos (Zeilinger et al., 2015). 2.4.3.1 Biosíntesis de β-caroteno en Phycomyces. La biosíntesis de β-caroteno comienza con la condensación de dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato (GGPP) para formar un compuesto incoloro llamada fitoeno, a través de un intermediario, el pirofosfato de prefitoeno (Altman LJ et al., 1972). Esta doble reacción es catalizada por la fitoeno sintasa CarA que corresponde al dominio A del gen carRA (Arrach et al., 2001; Sanz et al., 2011a; Torres-Martínez et al., 1980). A partir de fitoeno, ocurren cuatro deshidrogenaciones consecutivas para dar lugar a licopeno, un compuesto rojizo; y posteriormente dos β-ciclaciones para originar β-caroteno. Las cuatros deshidrogenaciones están catalizadas por cuatro moléculas de la enzima fitoeno deshidrogenasa, codificada por el gen carB. Los intermediarios de estas reacciones son fitoflueno, ζ-caroteno, y neurosporeno, hasta llegar a licopeno (Aragon et al., 1976; Eslava et al., 1974; Sanz et al., 2011a). Posteriormente, la molécula de licopeno sufre una primera ciclación en un extremo originando γ–caroteno y una segunda ciclación en el otro extremo de la molécula originando el producto final de la ruta que es el β–caroteno. Estas reacciones son catalizadas por la enzima licopeno ciclasa CarR, producto del dominio R del gen carRA (Aragon et al., 1976; Eslava & Cerdá-Olmedo, 1974; la Guardia et al., 1971; Torres-Martínez et al., 1980). En definitiva, la biosíntesis de β−caroteno en Phycomyces depende de dos genes estructurales que codifican para tres proteínas que actúan formando un agregado enzimático (Aragon et al., 1976; la Guardia et al., 1971): el gen carB para la deshidrogenasa de fitoeno (Eslava & Cerdá-Olmedo, 1974; Ruiz-Hidalgo et al., 1997) y el gen bifuncional carRA para la ciclasa de licopeno y la sintasa de fitoeno (Torres- Martínez et al., 1980). Ambos genes se encuentran ligados en los genomas de Phycomyces (Arrach et al., 2001; Roncero & Cerdá-Olmedo, 1982), Mucor (Velayos et al., 2000) y Blakeslea (Rodríguez-Sáiz et al., 2004). La biosíntesis de β−caroteno se lleva a cabo en un complejo enzimático que contiene siete moléculas con tres actividades catalíticas diferentes codificadas por los genes carB y carRA (Aragon et al., 1976; Candau et al., 1991; la Guardia et al., 1971; Sanz et al., 2002). En Phycomyces toda la síntesis del β−caroteno desde acetato ocurre en compartimentos especializados, independientes de los de otros terpenoides, como los esteroles y la ubiquinona (Kuzina & Cerdá-Olmedo, Introducción ! 50! 2007). En este punto, la molécula de β−caroteno es cortada por la oxigenasa CarS, codificada por el gen carS que es reprimido por luz y activado por la interacción sexual (Medina et al., 2011; Tagua et al., 2012), formando moléculas C25 y C15. El C25 se corta posteriormente por la oxigenasa AcaA, que se activa por la interacción sexual (Medina et al., 2011), produciendo moléculas C7 y C18. Las moléculas C15, C7 y C18 forman las familias de apocarotenoides de los monociclofarnesoides, los metilhexanos y los trisporoides, respectivamente. Estos apocarotenoides actúan como las feromonas sexuales de los cigomicetos. La oxigenasa CarS regula la ruta de biosíntesis de β−caroteno mediante la producción de un apocarotenoide regulador que modifica la actividad de CarA (Tagua et al., 2012). La síntesis de β−caroteno en Phycomyces está regulada por varios estímulos ambientales: estimulación sexual (Barnett et al., 1956), por la presencia de ciertos productos químicos como el retinol (Eslava et al., 1974) o el ftalato de dimetilo (Bejarano et al., 1988; Cerdá-Olmedo & Hüttermann, 1986) y por la luz (Bejarano et al., 1991; Bergman et al., 1973). El estudio de los mutantes de la carotenogénesis ha permitido obtener un modelo general de la biosíntesis de β−caroteno y su regulación (Bejarano & Cerdá-Olmedo, 1988; Govind & Cerdá-Olmedo, 1986; Mehta & Cerdá-Olmedo, 2001; Mehta et al., 1997; Murillo & Cerdá-Olmedo, 1976). Además de los dos genes estructurales, carB y carRA, existen seis genes reguladores: carC (Revuelta & Eslava, 1983), carD (Salgado et al., 1989), carE (la Concha Conejero A, 1983), carF (Mehta et al., 1997), carI (Roncero & Cerdá-Olmedo, 1982) y carS (Murillo & Cerd Olmedo, 1976). El gen carRA, además de ser responsable de la síntesis de dos proteínas estructurales, tiene también una función reguladora (Arrach et al., 2001; Murillo et al., 1981; Torres-Martínez et al., 1980). Se ha comprobado que los compuestos apocarotenogénicos que presentan la estructura química anillo-β, como β−caroteno o retinol, inhiben la función de la proteína CarA (fitoeno sintasa) (Arrach et al., 2001; Bejarano et al., 1988; Roncero & Cerdá-Olmedo, 1982). La combinación de las distintas mutaciones pueden tener un efecto sinérgico; llegando a aumentar hasta doscientas veces la cantidad de caroteno con respecto a la estirpe silvestre (Cerdá-Olmedo, 2001; Cerdá-Olmedo & Hüttermann, 1986; Murillo et al., n.d.). Los Introducción ! 51! mutantes carC (Revuelta & Eslava, 1983), cuyo gen se ha propuesto que codifica para una geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPPS) (Tagua, 2012), contienen menos cantidad de caroteno que la estirpe silvestre. Los mutantes carI y carA, los cuales tienen afectados el dominio A del gen carRA, presentan una disminución de la cantidad de caroteno y son insensibles a los agentes químicos carotenogénicos (Roncero & Cerdá-Olmedo, 1982). Por el contrario, los mutantes carS presentan hasta 50 veces más β−caroteno que la estirpe silvestre creciendo en oscuridad (Murillo & Cerd Olmedo, 1976; Tagua et al., 2012). Los mutantes carS, cuyo gen codifica para una oxigenasa de β−caroteno, no pueden estimular a otra estirpes de sexo contrario debido a que no pueden romper el β−caroteno y producir apocarotenoides, las hormonas sexuales de Phycomyces (Medina et al., 2011; Polaino et al., 2012; Tagua et al., 2012). En definitiva, el fenotipo sexual de los mutantes carB, carR (no producen β−caroteno) y carS es el mismo: ellos responden sexualmente a sus compañeros pero ellos no son capaces de estimularlos (Kuzina & Cerdá-Olmedo, 2006). Los productos de los genes carD y carS participan en la regulación de la biosíntesis de carotenos por producto final; ya que los niveles de carotenos son altos en oscuridad pero aun así aumentan tras una inducción por luz (Cerdá-Olmedo & Lipson, 1987a). El gen carF no está implicado en la regulación por producto final, y sus niveles de carotenos en los mutantes no aumentan por efecto de la luz y sus mutaciones ejercen un efecto sinérgico junto con carS (Mehta et al., 1997). Los mutantes carS, carD y carF son superproductores de carotenos (Mehta et al., 1997; Murillo & Cerd Olmedo, 1976; Salgado et al., 1989), aunque la máxima producción de β−caroteno se da en el doble mutante carF carS, que contiene 100 veces más β−caroteno que la estirpe silvestre. Existe una estirpe S444, que deriva de C115 y que posee el alelo carS42, y otra mutación no identificada, acumula más que un mutante carF carS pero con un crecimiento muy lento, una morfología defectuosa y un extraño comportamiento genético (Mehta et al., 1997). Introducción ! 52! Figura I.11: Modelo de la síntesis de carotenoides y apocarotenoides en Phycomyces blakesleeanus (Medina et al., 2011; Polaino et al., 2010; 2012; Tagua et al., 2012). ! ! OBJETIVOS ! ! ! ! ! Objetivos! ! 55! Los objetivos de esta tesis doctoral han sido profundizar en el estudio sobre la fotobiología del hongo Phycomyces blakesleeanus desde la transcripción génica hasta el estudio de la acumulación y función de las proteínas implicadas en la respuesta a la luz. Por ello, marcamos unos objetivos generales que se resumen de la siguiente manera: 1.- Investigar el papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces abordando desde su regulación por luz hasta el estudio de las proteínas con las que interacciona. 2.- Identificación de madC como una proteína que participa en la ruta de transducción sensorial y su implicación en el fototropismo del esporangióforo de P. blakesleeanus. 3.- Caracterizar el ligamiento genético entre las mutaciones en el gen ggsA con el fenotipo carC e investigar la actividad enzimática GGPPS de las proteínas CarC y GgsB usando sistemas heterólogos. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Capítulo 1 El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 64! 1.2.2 Localización subcelular de WcoB. Las proteínas de tipo WC en Phycomyces tienen un dominio dedo de zinc que permite la interacción de estas proteínas con el ADN para participar en la regulación de la transcripción de genes fotoinducibles. De las siete proteínas WC presentes en este hongo, WcoB es la única que no tiene el dominio dedo de zinc y por tanto esto sugiere que WcoB se localiza en el citoplasma y que su función no es regular directamente la transcripción. La ubicación subcelular de WcoB se determinó mediante fraccionamiento celular en la estirpe silvestre extrayendo las proteínas de las distintas fracciones (nuclear y citosólica) e hibridándolas con un anticuerpo específico contra WcoB. Como control de purificación de proteínas nucleares se utilizó un anticuerpo contra la histona H2B de Saccharomyces cerevisiae. El fraccionamiento se realizó tanto en oscuridad como en cultivos iluminados con el fin de determinar la presencia de la proteína en ambas condiciones o predominantemente en alguna de ellas. WcoB se observó en la fracción citosólica tanto en luz como en oscuridad y, como describimos anteriormente, hay una acumulación mayor en luz que en oscuridad (Figura 1.3). 100 75 20 kDa$ ET C N ET C N WcoB α-H2B Oscuridad Luz !1.2.3 Inmunoprecipitación de WcoB. En Mucor circinelloides se ha descrito la relación de la proteína MCWC-1b, homóloga a WcoB de P. blakesleeanus, con la carotenogénesis mediante la regulación de dicha proteína a través de la ubiquitin ligasa CrgA (Silva et al., 2008). MCWC-1b está implicada en la biosíntesis de carotenos en Mucor aunque no está relacionada con la inducción por luz. Se ha demostrado que CrgA interviene en la mono y diubiquitilación de MCWC-1b para reprimir la carotenogénesis. Esta acción no está ligada con la degradación de MCWC-1b pero la ubiquilación de esta proteína parece que impide la Figura 1.3: Localización subcelular de WcoB. El micelio se cultivó durante 48 horas a 22ºC en medio líquido en agitación. Posteriormente los cultivos fueron iluminados 30 minutos o mantenidos en oscuridad. Las proteínas fueron extraídas de las distintas fracciones: proteínas totales (ET), citoplasmáticas (C) y nucleares (N), separadas mediante SDS-PAGE e hibridadas con anticuerpos para WcoB. La misma membrana fue incubada con el anticuerpo para la histona H2B como control de proteínas nucleares. !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 65! transcripción de los genes de la carotenogénesis (Silva et al., 2008). Para investigar si la función de WcoB en P. blakesleeanus es similar o no a su homóloga en Mucor y para identificar las proteínas que interaccionan con WcoB y que pudieran ayudar a entender su funcionamiento, realizamos experimentos de inmunoprecipitación de proteínas. Para estos experimentos la estirpe silvestre se cultivó durante 48 horas en medio mínimo líquido y posteriormente se iluminó durante 30 minutos antes de recoger los micelios. Además, mantuvimos micelios en oscuridad durante todo el experimento como control. Durante el experimento de inmunoprecipitación recogimos diferentes muestras: extracto total (INPUT), fracción eluída (FT) y proteínas inmunoprecipitadas (IP). Como control realizamos el mismo experimento pero sin usar el anticuerpo contra WcoB en la etapa de inmunoprecipitación. Posteriormente, las fracciones inmunoprecipitadas se separaron en un gel de acrilamida que se tiñó con sales de plata. Las diferentes bandas obtenidas entre las fracciones inmunoprecipitadas con y sin anti-WcoB fueron identificadas mediante espectrometría de masas (Figura 1.4). Para comprobar el correcto funcionamiento del experimento realizamos experimentos de hibridación de western usando el anticuerpo contra WcoB con los extractos de las diferentes fracciones. Como se observa en la figura 1.4A detectamos la presencia de WcoB en la fracción inmunoprecipitada con WcoB. * IP + antiWcoB IP – antiWcoB (control) * * * * * 260 140 100 70 50 kDa !+ anti WcoB INPUT FT IP INPUT FT IP - anti-WcoB + anti-WcoB NRRL1555 (estirpe silvestre) 100% 70% kDa% WcoB A B Figura 1.4: Co-Inmunoprecipitación de proteínas usando un anticuerpo contra WcoB. A) Hibridación de western para comprobar la inmunoprecipitación (Control). La figura muestra la hibridación de las diferentes fracciones (INPUT, FT e IP) con el anticuerpo contra WcoB. B) Tras la inmunoprecipitación las proteínas se separaron mediante una electroforesis SDS-PAGE y se detectaron mediante tinción con sales de plata. El control se llevó a cabo con el mismo extracto de proteínas pero sin añadir el anticuerpo anti-WcoB. La gráfica situada a la derecha del gel de la inmunoprecipitación indica la diferencia de grises entre la IP sin anti-WcoB y con anti-WcoB. En el cromatograma están indicadas con el símbolo * las bandas de proteínas de las que se obtuvieron resultados en la identificación mediante espectrometría de masas. !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 66! Este experimento se realizó varias veces con el fin de optimizar la técnica y confirmar las interacciones de las proteínas con WcoB. La primera vez que se realizó la inmunoprecipitación sólo se identificó la proteína CarS, una oxigenasa de caroteno. Al repetir el experimento, el proceso de tinción del gel tras la electroforesis con sales de plata se optimizó identificando nuevas proteínas, además de la proteína CarS. Las proteínas que hemos identificado en los experimentos de inmunoprecipitación que interaccionan con WcoB aparecen en la tabla 1.1. Las primeras inmunoprecipitaciones se realizaron tanto en luz como en oscuridad, pero debido a que este hecho no modificaba el patrón de proteínas inmunoprecipitadas finalmente el resto de experimentos se realizaron con micelios iluminados. Tabla 1.1: Proteínas inmunoprecipitadas usando el anticuerpo contra WcoB. Proteína ID Descripción Cobertura (%) #Péptidos PM (kDa) pI Phybl1.e_gw1.4.1 17470 Quitina sintasa 90,65 12 12,6 9,77 MadB 77137 White Collar-2 73,45 25 40,1 5,81 HSP100 29012 Proteína de choque térmico 72,03 52 100,7 5,68 WcoB 76314 Familia White Collar-1 46,54 41 82,1 6,49 CarRA 180114 Fitoeno sintasa/Licopeno ciclasa 48,34 31 68,6 7,37 CarS 183749 Oxigenasa de caroteno 48,73 28 70,1 6,54 MadA 184132 Familia White Collar-1 35,76 21 73,5 6,07 WcoA 77612 Familia White Collar-1 43,91 29 70,6 6,86 WctC 65293 Familia White Collar-2 44,95 20 42,9 5,21 WctB 179643 Familia White Collar-2 33,42 22 44,9 5,97 HmgS 126185 Hidroximetilglutaril-CoA sintetasa 9,56 5 50,1 6,62 Las proteínas mencionadas en la tabla son las más relevantes para el estudio realizado en este capítulo. #Péptidos: indica los péptidos encontrados de la proteína. PM: indica el peso molecular de la proteína. pI: punto isoeléctrico. Además de CarS identificamos la interacción entre WcoB y las proteínas CarRA y HmgS (Arrach et al., 2001; Roncero & Cerdá-Olmedo, 1982; Ruiz-Albert et al., 2002; Sanz et al., 2011b). Estas dos proteínas son necesarias para la biosíntesis del β–caroteno lo que sugiere que el fotorreceptor WcoB podría tener un papel regulador sobre la actividad de estas enzimas en la biosíntesis de β–caroteno modulando su actividad por la luz. Además, identificamos interacciones entre WcoB y los componentes del complejo Mad y otras proteínas WC, lo que sugiere que estos fotorreceptores forman un complejo multimérico para regular las respuestas a la luz en Phycomyces. !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 67! 1.2.4 Regulación de la proteína WcoB en mutantes carS. En las diferentes inmunoprecipitaciones de WcoB realizadas en esta tesis siempre hemos detectado la interacción entre WcoB y la oxigenesa de caroteno CarS, además de otras proteínas. Para determinar si la presencia de la proteína CarS mutada afecta a la acumulación de WcoB hicimos experimentos de hibridación de western con proteínas extraídas de dos estirpes con el gen carS mutado: la estirpe M1 (alelo carS43) que contiene un cambio de serina a leucina en la posición 433 y la estirpe S324 (alelo carS180) que contiene un cambio de glutamina por un codón de stop prematuro en la posición 143. En la estirpe S324 la proteína CarS sólo presenta 142 aminoácidos de los 628 aminoácidos que presenta la proteína silvestre, por lo tanto, este mutante puede proporcionar más información sobre cómo se afecta WcoB cuando la mayor parte del dominio oxigenasa de la proteína CarS ha desaparecido (Figura 1.5). 100 75 0 5 30 120 0 5 30 120 M1 (carS (S433L))&& S324 (carS (Q143Stop))&& kDa 0 5 30 120 0 5 30 120 NRRL1555 (estirpe silvestre) L51 (madA madB) kDa 100 75 WcoB WcoB Tiempo Iluminación, min Tiempo Iluminación, min Coomassie Coomassie En la figura 1.5 se observa que la cantidad de WcoB en la estirpe silvestre aumenta en luz con respecto a la oscuridad mientras que en la estirpe madA madB la cantidad de WcoB no varía en luz con respecto a oscuridad debido a que está mutado el complejo Mad encargado de regular la transcripción de wcoB. La estirpe M1 acumula WcoB como la estirpe silvestre, lo que indica que la mutación presente en este mutante carS no afecta a la cantidad de WcoB. Sin embargo, en la estirpe S324 cuya proteína CarS sólo presenta 142 aminoácidos, apenas podemos detectar WcoB a los treinta minutos de iluminación. Para determinar si la disminución en la cantidad de WcoB en la estirpe mutante S324 se debe a una disminución en la transcripción de wcoB, se realizó una RT-PCR Figura 1.5: Acumulación de WcoB en las estirpe silvestre NRRL1555, L51 (madA madB) y mutantes del gen carS. Las estirpes fueron cultivadas en medio mínimo durante 48 horas en oscuridad y posteriormente iluminadas a diferentes tiempos con luz azul. Las proteínas fueron extraídas y separadas mediante SDS-PAGE, transferidas a una membrana de nitrocelulosa e incubadas con un anticuerpo específico contra WcoB. Como control de carga se ha utilizado la tinción Coomassie blue. !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 68! cuantitativa usando los mismos micelios de estos mutantes que usamos para la extracción de proteínas (Figura 1.6). La figura 1.6 muestra que en los mutantes carS se detecta la acumulación del ARNm del gen wcoB en luz aunque la acumulación está reducida a la mitad si la comparamos con lo observado en la estirpe silvestre. Los datos de transcripción con los datos de la cantidad de proteínas observada en la figura 6 sugieren que existe una regulación de la interacción de la proteína WcoB y CarS ya que el mutante S324 que carece de la mayor parte de CarS existe transcripción del gen wcoB pero no se detecta proteína como ocurre en el caso del otro mutante carS (M1). Los resultados sugieren una regulación postraduccional de WcoB mediante la interacción con CarS. 0.20 0.96 1 0.97 0.09 0.06 0.03 0.09 0.04 0.57 0.67 0.26 0.03 0.34 0.80 0.31 0 1 2 0.39 0.83 1 0.68 0.26 0.21 0.19 0.26 0.23 0.68 0.75 0.33 0.27 0.58 0.52 0.46 0 1 2 1.41 1.47 1 0.29 4.66 4.93 4.50 2.18 4.38 3.59 1.29 2.33 0.60 0.46 0.32 0.41 0 2 4 6 0 5 30 120 0 5 30 120 0 5 30 120 0 5 30 120 Tiempo de Iluminación, min cryA wcoB carS NRRL1555 (estirpe silvestre) madA madB M1 carS (S433L) S324 carS (Q143Stop) Expresión relativa Figura 1.6: Regulación de la transcripción de los genes wcoB y carS en las estirpes mutantes en el gen carS de P. blakesleeanus. Los micelios crecieron durante 48 horas a 22ºC y entonces fueron iluminados a distintos tiempos con luz azul o recogidos en oscuridad. Las estirpes utilizadas fueron: estirpe silvestre (NRRL1555), L51 (madA madB), M1 (alelo carS43 (S433L)) y S324 (mutante carS180 (Q143Stop)). La cantidad de ARNm para cada gen fue ensayada mediante RT-PCR cuantitativa. Cada señal fluorescente fue primero normalizada a la correspondiente señal de actina (actA) para corregir errores de carga y entonces fue normalizado a la señal obtenida a los 30 minutos de iluminación de la estirpe silvestre. En el gráfico se muestran la media y el error estándar de tres experimentos independientes. La expresión del gen carS se reprime en luz en la estirpe silvestre al igual que en el mutante madA madB y los mutantes carS. En el doble mutante madA madB la transcripción del gen carS es mayor al compararla con la del mismo gen en la estirpe silvestre. Sin embargo, la expresión de carS en los mutantes de dicho gen varía entre ellos. El mutante M1 tiene una cinética de expresión como la estirpe silvestre pero con mayores niveles de transcripción del gen carS mientras que la estirpe S324 la transcripción de carS es muy baja y no sigue la cinética observada para este gen en la estirpe silvestre. Estos !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 69! datos sugieren una retroalimentación en la regulación de la transcripción por la luz por el propio gen carS, ya que cuando la proteína CarS carece prácticamente del dominio oxigenasa los niveles de transcripción del gen carS disminuyen casi a cero, y cuando la proteína CarS tiene una mutación puntual los niveles de transcripción de dicho gen aumentan. 1.2.5 Localización de la proteína WcoB-GFP en Aspergillus nidulans. Para investigar la localización de WcoB in vivo y demostrar in vivo las interacciones entre WcoB y otras proteínas, realizamos experimentos de expresión heteróloga usando Aspergillus nidulans como modelo ya que Phycomyces blakesleeanus no se ha conseguido transformar con ADN exógeno de manera estable (Obraztsova et al., 2004). Para estos experimentos hemos transformado Aspergillus nidulans con el gen wcoB de Phycomyces blakesleeanus fusionado a la proteína fluorescente GFP para su detección in vivo. Para ello, se clonó el ADNc de wcoB en el plásmido pSR46 bajo el control del promotor del gen para la histona H2B. Además, clonamos también los ADNc de los genes madA y madB de P. blakesleeanus, homólogos a wc-1 y wc-2 de Neurospora, cuya localización se espera que sea nuclear, ya que tienen dominios dedo de zinc para interaccionar con el ADN (Sanz et al., 2009). Además estas proteínas forman el complejo Mad encargado de la transcripción de un gran número de genes fotoinducibles (Sanz et al., 2009). Por el contrario esperamos que WcoB se acumule en el citoplasma por la falta de dominio de interacción con el ADN y los resultados obtenidos en los experimentos de fraccionamiento subcelular. También transformamos A. nidulans con una fusión del gen carS al gen que codifica para la GFP para comprobar si se localiza también en el citosol como WcoB para dar lugar a la interacción. Realizamos experimentos de microscopía de fluorescencia utilizando las instalaciones del laboratorio del Prof. Fischer (KIT, Karlsruhe, Alemania) (Figura 1.7). !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 70! MadA DAPI Visible Merge MadB WcoB CarS GFP Figura 1.7: Localización de las proteínas MadA, MadB, WcoB y CarS de P. blakesleeanus etiquetadas con GFP en A. nidulans. Las proteínas MadA y MadB se utilizaron como control ya que su localización se presuponía nuclear. MadA y MadB se localizan en el núcleo mientras que WcoB y CarS se localizan en el citoplasma. Para localizar los núcleos se utilizó DAPI (azul). La línea blanca representa 10 µm. En los experimentos de microscopía observamos que MadA y MadB se localizan en el núcleo ya que actúan como factores de transcripción (Sanz et al., 2009). La localización de WcoB y CarS ocurre en el citoplasma del hongo. Este resultado era esperado porque previamente demostramos que WcoB se localiza en el citoplasma en Phycomyces (Figura 1.3). Estos resultados también muestran que las señales que permiten la localización nuclear o citoplásmica están conservadas entre Aspergillus y Phycomyces. 1.2.6 Interacción entre WcoB y CarS de Phycomyces mediante BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) en Aspergillus nidulans. Para confirmar la interacción entre WcoB y CarS de P. blakesleeanus investigamos si se observa esta interacción in vivo en Aspergillus mediante BiFC, una técnica para corroborar interacciones proteicas. Esta técnica se basa en la asociación de fragmentos de proteínas fluorescentes fusionados a proteínas cuya interacción se quiere comprobar. De esta manera si se quiere comprobar la interacción de una proteína A con otra B, se fusiona la proteína A a la fracción N-YFP de la proteína fluorescente YFP y la proteína B a la !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 71! fracción C-YFP. Si la proteínas A y B interaccionan, provocaran la proximidad de los fragmentos N-YFP y C-YFP reconstituyendo la estructura de la proteína YFP y por consiguiente fluorescencia (Figura 1.8). Esta técnica permite la detección de interacciones débiles o transitorias ya que la señal fluorescente generada es estable (Kerppola, 2006a; 2006b; Marani et al., 2002). Absorción No existe emisión de fluorescencia Emisión Absorción Fragmento C-YFP Fragmento N-YFP Antes BiFC Después BiFC 514 nm 530 nm Figura 1.8: Esquema del funcionamiento de la técnica BiFC. El esquema representa el principio en el que se basa el ensayo BiFC, utilizando el fluoróforo YFP dividido. Las proteínas A y B se fusionan a los fragmentos N- y C- terminales de YFP, respectivamente. En ausencia de una interacción entre A y B, las mitades de fluoróforo son no funcionales. Tras la interacción entre A y B, se reconstituye un fluoróforo funcional que exhibe emisión de fluorescencia tras la excitación con una longitud de onda apropiada. Modificado de (Bhat et al., 2006). Se clonó el ADNc del gen wcoB en un plásmido con la fracción N-YFP y el ADNc del gen carS se clonó en el plásmido con la fracción C-YFP. Si estas proteínas interaccionan in vivo, las dos fracciones de proteína YFP interaccionarán y emitirán fluorescencia. Este experimento servirá para confirmar que la interacción que se ha observado en extractos de proteínas mediante inmunoprecipitación de proteínas también se observa in vivo, al igual que se conocerá la ubicación de esta interacción y el grado de estabilidad de la interacción en Aspergillus nidulans (Figura 1.9). !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 72! Figura 1.9: WcoB y CarS de P. blakesleeanus interaccionan en A. nidulans utilizando la técnica BiFC. C-YFP::wcoB interacciona con N-YFP::carS y dicha interacción provoca la emisión de fluorescencia (YFP). Para localizar los núcleos se usó DAPI (azul). Como control se usó el plásmido con la fracción C-terminal de la YFP y otro plásmido con la fracción N-YFP sin genes. La línea blanca representa 10 µm. En la figura 1.9 se puede observar que WcoB interacciona con CarS y que su localización es citoplasmática. Como control del experimento se transformó la estirpe SVK103 (veA+, pyroA4, pyrG89) de Aspergillus con el plásmido con la fracción C-YFP clonado contiguo al ADNc del gen wcoB y otro plásmido que tiene la fracción N-YFP sin ningún gen clonado. De esta forma al no interaccionar WcoB con nada, no se emitirá fluorescencia ya que no se formará la proteína YFP silvestre (Figura 1.9). 1.2.7 Ubiquitinación de WcoB en P. blakesleeanus. En M. circinelloides la proteína MCWC-1b se ubiquitina por la proteína CrgA de manera independiente de su degradación en el proteasoma 26S (Silva et al., 2008). Para comprobar si WcoB de P. blakesleeanus está regulada de la misma manera que su homólogo en Mucor, hicimos experimentos de inmunoprecipitación de proteínas y detección con anticuerpos contra la ubiquitina (Figura 1.10). DAPI Visible Merge YFP C-YFP::wcoB + N-YFP::carS C-YFP::wcoB- N-YFP (control) !Capítulo 1: El papel del fotorreceptor WcoB en la fotobiología de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 73! Figura 1.10: Ubiquitinación de WcoB. Alícuotas de proteínas de micelio cultivado durante 48 horas en medio líquido en oscuridad, y transcurrido este tiempo se iluminó durante 30 minutos. Las proteínas fueron separadas mediante SDS-PAGE y transferidas a membrana de nitrocelulosa. Posteriormente se realizó la inmunoprecipitación usando un anticuerpo específico contra WcoB (+AC). Como control se realizó también la inmunoprecipitación sin anticuerpo contra WcoB (-AC). La membrana fue hibridada contra un anticuerpo contra la Ubiquitina y también contra WcoB (control). En algunos casos también se cargó en el gel el INPUT (extracto total de proteínas). El * indica el tamaño predico para WcoB, mientras que las flechas indica WcoB ubiquitinada. A) Primera prueba usando el anticuerpo contra Ubiquitina. B) Segundo experimento usando nuevas inmunoprecipitaciones hibridando la membrana con anti- Ubiquitina. En esta ocasión se muestra el control contra anti-WcoB. Los resultados de este experimento permiten observar que WcoB está ubiquitinada, ya que como aparece en la figura 1.10 se observa una proteína ubiquitinada con el tamaño predicho para WcoB (82,2 kDa) y dos bandas de WcoB ubiquitinada, una por debajo de 100 kDa y otra por encima de 100 kDa. Este hecho nos hace sospechar que WcoB puede estar regulada como MCWC-1b en Mucor (Silva et al., 2008). 1.3 Discusión. La activación por luz de los genes wcoA, wcoB, wctB y wctD de Phycomyces sugiere que estos productos génicos pueden ser necesarios después de una exposición a la luz, o para responder a diferentes intensidades de luz (Sanz et al., 2009). La transcripción de estos genes depende del complejo Mad ya que en el doble mutante madA madB la transcripción de estos genes es prácticamente nula (Sanz et al., 2009). Estudios previos del gen wcoB han confirmado que son necesarias intensidades altas de luz (1 J/m2) para el inicio de su transcripción (Sanz et al., 2009). Nuestros resultados han permitido confirmar que el gen wcoB se transcribe levemente más en luz que en oscuridad y que este incremento coincide con la acumulación de la proteína en las mismas condiciones. Este sutil incremento en la cantidad de WcoB puede deberse a que este fotorreceptor sólo esté optimizado para altas 100# 75# 50# 150# *# - AC + AC Es)rpe## silvestre## A kDa# 100# 75# 50# 150# - AC + AC INPUT Es)rpe## silvestre## *# - AC + AC Es)rpe## silvestre## WcoB 100# 75# INPUT B kDa# kDa# WcoB-Ub WcoB-Ub WcoB WcoB-Ub WcoB-Ub WcoB Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 80! Los mutantes del gen madC fueron encontrados tras una mutagénesis con N- metil-N’-nitro-N-Nitrosoguanidina (NTG) o con el mutágeno ICR-170 (Eslava et al., 1976). Estos mutantes sólo están afectados en el fototropismo del esporangióforo mientras que las respuestas miceliares a la luz (carotenogénesis y morfogénesis) no se ven afectadas (Bergman et al., 1973; Corrochano & Cerdá-Olmedo, 1992). Por ello, se pensó que el gen madC era responsable de un fotorreceptor que interviene en el fototropismo del esporangióforo para la recepción de la luz junto con el complejo Mad en P. blakesleeanus (Galland & Lipson, 1985a). Los resultados de este capítulo son parte de una colaboración internacional que ha permitido identificar el gen madC mediante clonación posicional como un gen que codifica para una proteína que activa la función GTPasa de Ras (Polaino et al., 2017). Las proteínas Ras (Rat Sarcoma) tienen la capacidad de servir como “interruptores moleculares” mediante el intercambio entre las conformaciones RasGDP (inactivo) o RasGTP (activo) que presentan dos propiedades principales compartidas por todas las GTPasas: en primer lugar la capacidad de unirse a nucleótidos de guanina con alta afinidad (Lenzen et al., 1998), y en segundo lugar su capacidad para hidrolizar GTP a GDP y fosfato inorgánico (Pi) (Hennig et al., 2015). El paso de la proteína RasGDP a RasGTP se lleva a cabo por la familia de proteínas llamadas GEFs (Factor intercambiador de nucleótido de guanina) mientras que la transición de RasGTP a RasGDP se debe a la actividad de proteínas RasGAPs (Proteínas Activadoras de la función GTPasa para Ras). La tasa de hidrólisis de GTP determina el tiempo de vida del estado activado (Hennig et al., 2015). GTP Ras GEF GAP Ras GDP Estado activo Estado inactivo GTP GDP Pi H2O Figura 2.1: Modelo de activación de las proteínas Ras. La transición de RasGDP a RasGTP se lleva a cabo por las proteínas GEF mientras que la transición de RasGTP a RasGDP se lleva a cabo por las GAP. Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 81! Las proteínas Ras de hongos juegan un papel importante en el crecimiento celular y la morfogénesis. En S. cerevisiae, se ha descrito que la proteína Ira1, una RasGAP, regula negativamente los niveles de AMPc en condiciones de falta de nutrientes a través de la proteína Ras2 (Tanaka et al., 1989). S. pombe presenta otra proteína RasGAP, llamada Sar1, capaz de complementar la función de IRA1 en S. cerevisiae (Wang et al., 1991). Otra proteína RasGAP llamada LRG1 encontrada en el hongo N. crassa, es esencial para la extensión de la hifa y también para restringir la formación excesiva de ramificaciones en las regiones subapicales de ésta (Vogt & Seiler, 2008). En Aspegillus nidulans, la proteína GapA juega un papel importante en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad, y es necesaria para el desarrollo normal de los conidióforos. La ausencia de GapA resulta en una desorganización del citoesqueleto de actina y defectos en la polarización. GapA juega un papel fisiológico mediante la regulación de RasA estimulando la actividad GTPasa de Ras. La proteína GapA, al igual que la proteína MadC de P. blakesleeanus, presenta dos dominios principales: RasGAP, que incluye desde el aminoácido 177 al 484; y un dominio llamado RasGAP-C, que incluye desde el aminoácido 583 al 702 de la proteína. Mutantes en la proteína GapA que carecen del dominio RasGAP-C sugieren que este dominio juega un importante papel en la funcionalidad de la GapA ya que al faltar este dominio la proteína se vuelve inestable (Harispe et al., 2008). En ensayos de doble híbrido se comprobó que la proteína MadC interacciona físicamente con dos proteínas Ras, RasA y RasB, corroborando su función como proteína RasGAP. S. cerevisiae contiene en su genoma dos genes RasGAP, llamados IRA1 e IRA2, homólogos al gen madC de P. blakesleeanus y al gen nf1 de H. sapiens (Xu et al., 1990). Los mutantes de S. cerevisiae con el gen IRA1 delecionado son sensibles al choque térmico (Tanaka et al., 1989; Wang et al., 1991). Al expresar el ADNc del gen madC de P. blakesleeanus en la estirpe Δ ira1 de S. cerevisiae se restaura la resistencia al choque térmico a niveles de la estirpe silvestre sugiriendo que MadC conserva su función en la regulación de Ras. En N. crassa fue identificado el mutante band (bd) que proporciona un patrón de bandas de conidios asexuales aproximadamente cada 22 horas como parte de la salida del ritmo circadiano, mientras que la estirpe silvestre tiene un patrón difuso de conidiación. El mutante band tiene un alelo dominante del gen que codifica para una Ras llamada RAS-1 cuyo alelo se conoce como ras-1bd que provoca un incremento en la expresión del Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 82! principal regulador de la conidiación, el gen fluffy (fl) además de con-6 y con-10 (Belden et al., 2007b). La mutación que presenta la estirpe ras-1bd consiste en un cambio de citosina por timina que conlleva un cambio de la treonina 79 a isoleucina (Belden et al., 2007b). Esta mutación ocurre en una región altamente conservada (switch II) vital para la interacción con las proteínas GEFs (Milburn et al., 1990). En el mutante ras-1bd se eleva la tasa de intercambio entre Ras-GDP y Ras-GTP comparada con la estirpe silvestre. Además, la transcripción de los genes implicados en la conidiación está incrementada en el mutante ras-1bd al igual que la expresión del gen wc-1. También se ha observado que en el mutante ras-1bd hay menos cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) pero el efecto en la estirpe ras-1bd es mayor que en la estirpe silvestre ya que RAS-1bd es más sensible a estos compuestos que la proteína silvestre. Estos resultados relacionan las proteínas Ras con las ROS amplificando la señal endógena y desencadenando el desarrollo de los conidios siguiendo un ritmo circadiano (Belden et al., 2007b). Adicionalmente, ras1bd tiene un incremento en la transcripción de wc-1 aunque la cantidad de proteína sea menor que en la estirpe silvestre (Belden et al., 2007b; Loros et al., 2007). Se propuso entonces que las ROS tienen un efecto directo en WC-1, por lo que el domino LOV es oxidado directamente por el superoxido incrementando su actividad y hace que WC-1 sea más activo (Belden et al., 2007b; Yoshida & Hasunuma, 2004). Estos datos sugieren que RAS y ROS contribuyen positivamente a la activación de WC-1 y que múltiples vías intervienen en el reloj biológico y afectan a la amplitud de la expresión regulada por el ritmo circadiano (Belden et al., 2007b). En este capítulo estudiaremos la localización del gen madC en el genoma de P. blakesleeanus y su implicación en la fotobiología de dicho hongo. Además investigaremos algunas características del gen ira-1 (NCU06122) de N. crassa, homólogo a madC, por su posible papel en la fotobiología de N. crassa. 2.2 Resultados 2.2.1 Ligamiento entre la mutación madC y marcadores moleculares en el genoma de Phycomyces. Los mutantes madC de Phycomyces blakesleeanus sólo están afectados en el fototropismo del esporangióforo ya que las respuestas del micelio no se ven afectadas (Bergman et al., 1973). Estos mutantes son 106 veces menos sensibles a la luz azul que la estirpe silvestre NRRL1555. La secuenciación del genoma de Phycomyces blakesleeanus Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 83! ha permitido disponer de un mapa de polimorfismos (SNP: Single Nucleotide Polimorfism) entre las estirpes silvestres UBC21 y NRRL1555 (Chaudhary et al., 2013). La secuenciación del genoma de las estirpes UBC21 (sexo +) y NRRL1555 (sexo -) ha permitido utilizar como herramienta para la identificación del gen madC mediante análisis genético la técnica denominada RFLP (Restriction Fragment Length polymorphism)-PCR. Esta técnica consiste en la amplificación por PCR de un fragmento del genoma de diferentes estirpes con un SNP que da lugar a un cambio del sitio de reconocimiento de una enzima de restricción. De esta manera se generan distintos patrones de fragmentos en el gel de electroforesis (figura 2.2) tras la digestión enzimática de los fragmentos amplificados. La frecuencia de recombinación entre cada SNP y la mutación objeto de estudio permitirá averiguar la distancia genética entre los diferentes marcadores moleculares y el gen madC. 0 1200 EcoRI Cebador R Cebador F Producto A Producto B Digestión EcoRI - + - + UBC21 NRRL1555 M A+B A B A) B) C) * pb ADN Figura 2.2: Procedimiento seguido para la localización del gen madC. A) Fotografía de la recolección de cigosporas procedentes de los cruces de UBC21 (+) con las estirpes mutantes madC (-) (fondo genético NRRL1555). Los esporangioforos de ambas estirpes fueron eliminados de la placa para una mejor recolección de cigosporas. B) Proceso seguido para el diseño de cebadores que flanquean un marcador (*)(PCR-RFLP) que es diana de restricción para un fondo genético (NRRL1555) y no para el otro (UBC21). C) En este ejemplo, la enzima EcoRI cortará el fragmento de PCR originado por los cebadores F y R de 700 pb (A+B) en dos fragmentos, uno de 400 pb (producto A) y otro de 300 pb (producto B) en la estirpe con fondo genético NRRL1555 y no en la estirpe con fondo genético UBC21. M: marcador; signo -: el fragmento de ADN no ha sido digerido (PCR); signo +: el fragmento de ADN fue digerido con la enzima EcoRI. Este procedimiento se llevará a cabo con todos los descendientes obtenidos en los cruzamientos. Para examinar la frecuencia de recombinación entre los distintos SNPs y el gen madC se cruzó la estirpe UBC21 con las estipes B2 y A905 (mutantes madC). Como los parentales B2 y A905 tienen el mismo fondo genético que la estirpe NRRL1555, se puede comparar la frecuencia de recombinación entre los distintos SNPs asociados a cada contig y la mutación madC. Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 84! Se realizaron dos cruces entre UBC21 y B2 de los que se aislaron 61 descendientes procedentes de 61 cigosporas. Las germosporas de cada cigospora se inocularon en medio mínimo ácido para seleccionar una colonia al azar de cada cigospora. Se realizaron dos cruces entre UBC21 y A905, de los cuales se aislaron 36 descendientes procedentes de 36 cigosporas. 2.2.2 Caracterización del fototropismo de los descendientes de cada cruzamiento. !Para realizar los análisis de recombinación entre el gen madC y los SNPs seleccionados se comprobó el fototropismo del esporangióforo de los 97 descendientes obtenidos (Figura 2.3). Figura 2.3: Fototropismo en Phycomyces. Los esporangióforos de la estirpe silvestre crecen hacia la fuente de luz (fototropismo positivo), mientras que la estirpe mutante madC no (fototropismo negativo). El número de descendientes con fototropismo positivo o negativo de cada cruce está indicado en la Tabla 2.1. Tabla 2.1: Fototropismo de los descendientes obtenidos en los cruzamientos entre UBC21 y los mutantes madC (B2 y A905). Fototropismo silvestre madC UBC21 x B2 1er cruce 18 (37,5%) 30 (62,5%) 2º cruce 1 (7,7%) 12 (92,3%) UBC21 x A905 1er cruce 14 (63,64%) 8 (36,36%) 2º cruce 7 (50%) 7 (50%) Total 40 (41,2%) 57 (58,8%) Los resultados muestran que el fenotipo madC se reparte de manera más o menos equivalente entre toda de la descendencia (58,8%). Luz azul Mutante madC Estirpe silvestre Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 85! 2.2.3 Comprobación del sexo de los descendientes de cada cruzamiento. P. blakesleeanus es heterotálico y por tanto presenta estirpes que tienen el gen sexP (sexo +) o estirpes con el gen sexM (sexo -). Para comprobar cómo segrega el locus del sexo en los cruzamientos que realizamos, se comprobó el sexo de todos los descendientes mediante amplificación por PCR utilizando cebadores específicos (Tabla 2.2). Los resultados muestran un incremento en los descendientes de sexo – entre todos los descendientes analizados (Figura 2.4). UBC21 (+) NRRL1555 (-) Descendientes Descendientes UBC21 (+) NRRL1555 (-) sexM sexP sexM sexP 300 pb Figura 2.4: Comprobación del sexo de los descendientes de los cruzamientos entre UBC21 y los mutantes madC. El sexo de cada estirpe se comprobó mediante PCR usando cebadores específicos para cada gen, sexP y sexM. Tabla 2.2: Porcentaje de descendientes con sexo + o sexo - obtenidos en los cruzamientos entre la estirpe silvestre (UBC21) y los distintos mutantes madC ( B2 y A905). Sexo + - UBC21 x B2 1er cruce 22 (45,83%) 26 (54,16%) 2º cruce 1 (7,7%) 12 (92,3%) UBC21 x A905 1er cruce 10 (45,45 %) 12 (54,54%) 2º cruce 3 (21,43%) 11 (78,57%) Total 97 36 (37,11%) 61 (62,89%) En teoría, esperábamos obtener un 50% de descendientes de cada sexo, y un 50% de descendientes con fenotipo madC. Creemos que las diferencias entre los resultados esperados y obtenidos se deben a las variaciones que se suelen observar con los cruzamientos entre estas dos estirpes silvestres (Alvarez & Eslava, 1983a) y a las diferencias entre sus respectivos fondos genéticos. Los cruzamientos utilizando la estirpe Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 86! A56 que es isogénica con NRRL1555 (Alvarez & Eslava, 1983a) suelen dar lugar a descendencias con un reparto del genoma más regular pero la isogenicidad elimina la gran mayoría de SNPs que son necesarios para la realización de este proyecto. Las diferencias en el reparto equitativo del locus sexual o de la mutación madC, aunque son mayores de lo esperado, permiten utilizar los descendientes de ambos cruzamientos para analizar la frecuencia de recombinación entre madC y varios SNPs. 2.2.4 Estimación de la frecuencia de recombinación entre cada SNP y el gen madC. Para realizar la localización de madC en el genoma se eligieron SNPs de diferentes contigs. En primer lugar, se eligieron cinco SNP localizados en cuatro grupos de ligamiento. De esta manera se podían caracterizar diferentes zonas del genoma de P. blakesleeanus para así obtener una pista inicial del lugar del genoma donde pudiera estar madC. Posteriormente, se eligieron nuevos SNPs en el grupo de ligamiento donde la frecuencia de recombinación resultó más baja (grupo de ligamiento IV), permitiendo realizar una búsqueda más dirigida (Figura 5). En la primera búsqueda el marcador que presentó menor frecuencia de recombinación con el gen madC fue el marcador 7 ( 25 descendientes recombinantes de 97 descendientes analizados) que identifica que madC está en el grupo de ligamiento IV (Figura 2.5). 19 12 3 32 29 9 I 5 (37/94) 33 38 41 45 5 46 48 IV 7 (25/97) 19 20 1 6 21 22 14 III 4 (47/94) 2 (42/97) IIb 31 10 2 24 35 26 30 4 27 IIa 3 (18/25) 500 kB Figura 2.5: Mapa físico de los grupos de ligamiento del genoma de P. blakesleeanus. Los números encuadrados en la casilla verde representan los SNPs elegidos para la localización y entre paréntesis el número de descendientes recombinantes entre el total de descendientes analizados para cada marcador. Los grupos de ligamiento están indicados en números romanos y los números sin encuadrar indican el contig. Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 87! Posteriormente se procedió a la elección de nuevos marcadores en el grupo de ligamiento IV. La manera de proceder en el mapeo de madC siempre se hace de la misma manera. Se elige un SNP, se diseñan cebadores aguas arriba y aguas abajo de dicho SNP y se hace una PCR con los ADNs de todos los descendientes de los distintos cruzamientos. A continuación, se digieren los fragmentos amplificados con la enzima de restricción adecuada y se carga la digestión en un gel de electroforesis donde se compara los patrones electroforéticos de la digestión con el fototropismo de los descendientes. Mediante este procedimiento se va cuantificando el número de descendientes recombinantes entre el SNP seleccionado y el gen madC (Figura 2.6). Para el mapeo del gen madC se han utilizado en nuestro laboratorio un total de 18 marcadores (SNPs). La localización completa del gen madC se ha llevado a cabo en colaboración con el laboratorio del Prof. Alexander Idnurm (University of Missouri-Kansas City). Fototropismo ! ! ! ! ! ! ! M + - + - - + + Marcador no ligado (4) Descendientes wt - + - + - + - + - + - + - + madC Enzima de restricción Descendientes Fototropismo Marcador ligado (21C) ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! + - - - - - - + + + + wt - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + madC Enzima de restricción En la siguiente tabla (Tabla 2.3) se muestran los resultados obtenidos con todos los marcadores utilizados en esta tesis, su localización en el genoma y la frecuencia de recombinación entre el SNP y el gen madC. Figura 2.6: Evidencia genética que indica cuándo un marcador (SNP) está o no ligado al gen madC. En esta imagen aparecen algunos de los descendientes que fueron examinados, no toda la descendencia. -: indica que el fragmento amplificado no ha sido sometido al proceso de digestión por la enzima correspondiente. +: indica que el fragmento ha sido sometido al proceso de digestión por la enzima correspondiente. Se muestra el patrón de digestión de los parentales. wt se refiere al parental con fondo genético UBC21 y madC a los parentales con fondo genético NRRL1555. ! Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 88! Tabla 2.3: Frecuencia de recombinación entre los SNPs seleccionados y el gen madC en los descendientes de los cruzamientos entre UBC21 y los mutantes madC (B2 y A905). Nombre marcador Contig SNP (v2.0) Enzima restricción NRRL1555 UBC21 Desc. Recombinantes/ Desc. analizados Frecuencia Recombinación 2 6 1427725 EcoRI A (+) B(-) 42/97 0,43 3 4 1474019 BamHI A (+) B(-) 18/25 0,72 4 1 1269164 EcoRI A (+) B(-) 47/94 0,50 5 3 2024210 HindIII A (+) B(-) 37/94 0,39 ALID190/191 5 977527 NdeI A (+) B(-) 31/82 0,38 7 5 902130 PstI A (+) B(-) 25/97 0,25 6D 5 848770 EcoRV A (-) B (+) 21/92 0,23 6B 5 758494 HindIII A (-) B (+) 22/78 0,28 6H 5 284381 HindIII A (-) B (+) 20/93 0,22 ALID393/394 5 557248 EcoRV A (+) B (-) 23/84 0,27 ALID1079/1080 5 2201014 EcoRV A (-) B (+) 15/92 0,16 21C 5 2015120 HindIII A (-) B (+) 6/82 0,07 21I 5 1937421 KpnI A (+) B (-) 6/69 0,09 ALID1077/1078 5 1816625 XbaI A (+) B (-) 10/77 0,13 ALID1184/1185 41 155605 NdeI A (-) B (+) 3/76 0,04 54A 45 247336 EcoRV A (+) B (-) 11/77 0,14 54B2 45 196999 EcoRI A (+) B (-) 3/61 0,05 ALID1017/1018 45 9911 XhoI A (-) B (+) 6/80 0,08 SNP (v2.0): posición del SNP en la base de datos del genoma de Phycomyces blakesleeanus versión 2.0. (+): indica que la enzima de restricción utilizada para ese SNP digiere el ADN en esa posición. (-): indica el la enzima de restricción utilizada para ese SNP no digiere el ADN en esa posición. A: indica fondo genético NRRL1555; B: indica fondo genético UBC21. La Frecuencia de Recombinación se muestra en tanto por 1. En las tablas anteriores se observa que los contigs con menor frecuencia de recombinación son el 5, 41 y 45 (Figura 2.7). Estos resultados indican que el gen debe estar localizado cercano o en uno de estos contigs. carRA carB carS 5 41 45 33 46 38 Contigs ALID 190 Frecuencia recombinación ALID 1079 ALID 1184 Genes 54B2 SNP 6H ALID 393 6B 6D 721C 21I ALID 1077 54A ALID 1017 0,22 0,27 0,28 0,23 0,25 0,38 0,13 0,09 0,07 0,16 0,04 0,05 0,08 0,14 500 kb Figura 2.7: Localización del gen madC. Mapa físico y de ligamiento entre los genes carRA, carB, carS, y diferentes marcadores (SNP) cercanos al gen madC. Los contigs están separados por huecos en la secuencia del genoma. El rectángulo rojo representa el grupo de ligamiento IV. En la figura están anotadas las frecuencias de recombinación obtenido para cada marcador en los descendientes de los cruzamientos entre UBC21 y los mutantes madC (B2 y A905). Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 89! 2.2.5 Identificación del gen madC. Gracias a la colaboración con el laboratorio del Prof. Idnurm, se ampliaron los datos de recombinación entre los marcadores y el gen madC. De esta manera se facilitó la identificación del gen madC acotando de una forma más precisa y rápida la zona del genoma que contiene dicho gen. La región del genoma de Phycomyces donde se localiza madC pertenece al contig 33 (versión 2.0 JGI) (figura 2.8). Una vez localizado este contig se rastreó en busca de genes candidatos a ser madC. Se secuenciaron varios genes candidatos en todos los mutantes de este gen. Así se encontró un gen que estaba mutado en las estirpes usadas en los cruzamientos, B2 y A905. Posteriormente se comprobaron las demás estirpes mutantes madC que también presentaban mutaciones en este gen. Esto indicó que este gen sería el gen madC. La identificación del gen madC fue llevada a cabo en el laboratorio del Prof. Alexander Idnurm (Polaino et al., 2017) . carRA carB carS 5 41 45 33 46 38 Contigs Genes madC Figura 2.8: Localización del gen madC. Mapa físico y de ligamiento entre los genes carRA, carB, carS, y madC. Los contigs están separados por huecos en la secuencia del genoma. El rectángulo rojo representa el grupo de ligamiento IV. El gen identificado como madC en Phycomyces blakesleeanus codifica para una proteína GTPasa activadora de Ras (GAPs) que pertenece a la superfamilia RasGAP (Polaino et al., 2017). La localización del gen en la base de datos de P. blakesleeanus (versión 2.0) lo sitúa en el contig 33 entre los nucleótidos 419316 y 422794, y su protein ID es 118908. Este gen contiene 8 exones y 7 intrones dando lugar a un transcrito de 2313 pb. La proteína está formada por 821 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 93,69 kDa. Esta proteína tiene dos dominios conservados principales llamados RasGAP-GAPA (desde el aminoácido en la posición 174 al 525) y RasGAP-C (desde el aminoácido en la posición 587 al 741) (Figura 10). Existen cinco alelos de madC en P. blakesleeanus que dan lugar a proteínas MadC truncadas. Los alelos descritos son los siguientes: 1) cambio de una guanina por una alanina en la posición 949 que resulta en un defecto en el procesamiento del tercer intrón, 2) cambio de una guanina por una alanina en la posición 1300 que resulta en un defecto en el procesamiento del cuarto intrón, Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 96! C V A V A 15 h 24 h Oscuridad 100 75 kDa C V A V A 15 h 24 h Luz 75 100 kDa Coomassie Coomassie α-FLAG α-FLAG Se observa que la proteína IRA-1::3xFLAG está presente en hifas aéreas tanto a 15 horas como a 24 horas, pero sólo está presente en micelio vegetativo tras 15 horas después de la inducción de la conidiación (Figura 2.17). En la fracción vegetativa tras 24 horas después de la inducción de la conidiación apenas se acumula IRA-1::3xFLAG. 2.3 Discusión El esporangióforo de Phycomyces es capaz de variar su dirección de crecimiento después de percibir algunos estímulos ambientales como: luz, gravedad, viento y la presencia de objetos cercanos (Cerdá-Olmedo, 2001). Uno de los estímulos más estudiados en este hongo es el fototropismo del esporangióforo que es capaz de responder a la luz azul en un intervalo de intensidad de 10-9 a 102 W/m2 en la estirpe silvestre (Bergman et al., 1969). En Phycomyces mediante mutagénesis y análisis genético se identificaron 10 genes con defectos en el fototropismo y otras respuestas a otros estímulos, y se denominaron genes mad (Bergman et al., 1973; Campuzano et al., 1995; Orejas et al., 1987). Algunos de estos genes ya han sido identificados, como por ejemplo los genes madA y madB, que codifican para proteínas del tipo WC-1 y WC-2 de N. crassa. MadA y MadB interaccionan formando el complejo fotorreceptor principal en Phycomyces, el complejo Mad. De la acción de este complejo depende la fotoinducción de muchos genes en el hongo (Sanz et al., 2009). El gen madC, estudiado en este capítulo, es necesario para el fototropismo del esporangióforo pero no es necesario para las respuestas a la luz en el micelio. Figura 2.17: Localización de IRA- 1::3xFLAG en micelio aéreo y vegetativo. La muestra control (C) corresponde al micelio crecido en medio líquido antes de transferirlo a medio sólido. El micelio vegetativo (V) y las hifas aéreas (A) fueron recogidos a diferentes tiempos (15 ó 24 horas) tras la transferencia. El control de carga fue confirmado mediante tinción con Coomassie. Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 97! Durante mucho tiempo se ha especulado con la idea de que MadC sea un fotorreceptor específico de esporangióforo. Esta hipótesis estaba basada en experimentos biofísicos y genéticos que mostraban cambios en el espectro de acción del mutante madC y la interacción entre MadC y MadB (Galland & Lipson, 1985b; Lipson & Teresaka, 1981; Medina & Cerdá-Olmedo, 1977). Nuestros resultados, en colaboración con el grupo del Prof. Idnurm, han permitido identificar a MadC como una proteína que regula a Ras, no un fotorreceptor. Los datos genéticos y biofísicos que sugieren alguna interacción entre MadC y el complejo fotorreceptor Mad no han podido ser confirmados mediante ensayos de doble híbrido (Polaino et al., 2017), lo que sugiere que la interacción entre estos componentes de la cadena de transducción sensorial debe ser breve y/o débil ya que se espera que la señal luminosa se transfiera de alguna manera a MadC para regular a Ras. Tampoco podemos descartar la existencia de una proteína que sirva de puente entre MadC y el complejo Mad, aunque no se haya podido proponer por la falta del mutante correspondiente. ¿Cómo regula MadC el fototropismo? La identificación de MadC es un hito en la fotobiología de hongos ya que ha permitido identificar a la primera proteína que participa en la cadena de transducción sensorial para el fototropismo después del fotorreceptor. Además, ha permitido colocar el sistema de regulación por Ras en la cadena de transducción sensorial. La mutación de MadC da lugar a la hiperactivación de Ras y, suponemos, el bloqueo de la cadena de transducción desde el fotorreceptor hasta las sintetasas de quitina que gobiernan el crecimiento de la pared celular. Es posible que la proteína Ras cuya actividad está regulada por MadC interaccione con una sintetasa de quitina para modular su actividad, o que regule a otras proteínas que participan en la regulación de la sintetasa de quitina o del crecimiento de la pared celular. Esperamos que la identificación de otros genes mad o la identificación de proteínas que interaccionan con Ras puedan ayudar a completar la cadena de transducción sensorial para el fototropismo de Phycomyces. Existen muchos ejemplos en los que Ras y sus proteínas reguladoras participan en procesos claves de la vida de la célula, también en hongos. De hecho, en Aspergillus fumigatus se ha descubierto un dominio N-terminal en la proteína RasA que tiene desde dos a ocho aminoácidos terminando en una arginina invariable. Este dominio parece ser Capítulo 2: El gen madC de Phycomyces y su homólogo en Neurospora. ! ! 98! esencial para la morfogénesis polarizada y el desarrollo asexual del hongo. Además, este dominio no está presente en los homólogos de rasA de eucariotas superiores. Mutaciones en este dominio afectó la interacción con una GTPasa de tipo Rho y disminuyó la activación de la proteína quinasa A (PKA) provocando cambios en la traducción de señales (Abdallah et al., 2016). Se ha comprobado que la mutación de genes homólogos a madC de Phycomyces en otros hongos tienen efectos severos, como por ejemplo problemas en el crecimiento y desarrollo en el basidiomiceto Schizophyllum commune (Schubert et al., 2006) y en el ascomiceto Aspergillus nidulans afectando al citoesqueleto de actina y a la polaridad (Harispe et al., 2008). En Aspergillus nidulans, la proteína GapA, homóloga a MadC de Phycomyces, actúa en parte regulando la actividad de Ras pero también tiene funciones independientes de Ras como le ocurre a la proteína de mamíferos p120- RasGAP que participa en la regulación de la motilidad celular (Harispe et al., 2008; Kulkarni et al., 2000). En Neurospora, una mutación de Ras permite detectar la regulación de la conidiación por el ritmo circadiano (Belden et al., 2007b). En Phycomyces, la mutación en la RasGAP (MadC) disminuye la sensibilidad a la luz para el fototropismo de los esporangióforos. Es interesante comprobar cómo dos rutas de transducción sensorial tan diferentes en hongos poco emparentados tienen en común la regulación por Ras. La deleción del homólogo de MadC en Neurospora da lugar a una alteración del ritmo circadiano (Polaino et al., 2017) y a una menor sensibilidad a la luz (Luque, E; com. pers.). Nuestros resultados de experimentos de localización celular indican que es una proteína citoplásmica que debe interaccionar con Ras para regular su actividad. Su acumulación en conidios indica un papel importante en la germinación y el crecimiento de la hifa, seguramente para participar en la regulación del ritmo circadiano a través de Ras. La conservación en la secuencia de aminoácidos entre MadC e IRA-1 permite suponer que MadC podría complementar la función de IRA-1 en Neurospora. Introducir la proteína MadC en el mutante ira-1 de Neurospora permitiría continuar explorando la función de MadC e identificar posibles proteínas con las que interaccione para avanzar en nuestro conocimiento del papel de las proteínas RasGAP en la transducción sensorial en hongos. ! ! ! ! ! ! Capítulo 3 El gen carC de Phycomyces blakesleeanus ! ! ! ! ! ! Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 101! 3.1 Introducción En algunos hongos del orden Mucorales se ha investigado en detalle la biosíntesis de carotenos, concretamente en los cigomicetos Phycomyces blakesleeanus, Blakeslea trispora y Mucor circinelloides (Avalos & Limón, 2015). El principal producto final de la ruta de síntesis de los carotenoides es el β-caroteno, que es uno de los carotenos más abundantes de la naturaleza (Zeilinger et al., 2015). La ruta de biosíntesis de carotenos se ha descrito en la introducción de esta tesis, sección 2.4.3.1. 3.1.1 Las geranilgeranil pirofosfato sintasas (GGPPS). La ruta de síntesis de carotenos (Figura I.11) comienza con la biosíntesis del geranilgeranil pirofosfato (GGPP). Para ello es necesario la intervención de la enzima geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPPS) que pertenecen a la familia de las Ε–prenil transferasas. Estas enzimas catalizan la condensación consecutiva de IPP (Isopentenil pirofosfato) con difosfatos prenil-alílicos produciendo cadenas hidrocarbonadas con diferentes longitudes según la enzima (Hemmi et al., 2003). Estas moléculas son utilizadas para sintetizar los precursores de numerosos tipos de compuestos isoprenoides como esteroides, carotenoides, quinonas respiratorias y proteínas preniladas (Koyama, 1999; Ogura & Koyama, 1998). Las Ε-prenil-transferasas han sido clasificadas en tres grupos basados en su estructura cuaternaria y en la longitud del compuesto hidrocarbonado que sintetizan: de cadena corta (C10-25), media (C30-35) y larga (C40-50) (Hemmi et al., 2003; Ogura & Koyama, 1998). Las GGPPS están incluidas en el grupo de las E-prenil transferasas de cadena corta ya que los productos originados contienen entre 10 y 20 átomos de carbono (Hemmi et al., 2003). Las GGPPS contienen cinco dominios conservados designados I-V (Figura 1) (Chen & Poulter, 1994). La fracción disfosfato de los sustratos alílicos DMAPP (Dimetilalil-pirofosfato)/ GPP (Geranil pirofosfato)/ FPP (Farnesil pirofosfato) se unen mediante iones Mg2+ a los dos motivos ricos en aspartato, DDXX(XX)D y DDXXD (donde X representa cualquier aminoácido), presentes en la región I y V, respectivamente. Estos dominios son conocidos como dominio FARM (First Aspartate-Rich Motif) y SARM (Second Aspatate-Rich Motif), respectivamente. La región III contiene el motivo GQXXD que está también implicado en la unión de los sustratos alílicos. La unión de la Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 102! fracción difosfato del sustrato IPP implica a los residuos básicos presentes en la región I que contiene el motivo GKXXR. Los residuos de lisina y treonina conservados de los motivos KT de la región IV participan en la catálisis por la activación del grupo difosfato y la posterior estabilización del carbocatión del intermediario formado durante la catálisis (Saikia et al., 2008). NH2 COOH A. FARM DDXX(XX)D SARM DDXXD I II III IV V I II B. V IV III Figura 3.1: Regiones conservadas de varias GGPPS. A. Estructura representativa de las E-preniltransferasas mostrando los cinco regiones conservadas incluyendo el motivo FARM y el motivo SARM. B. Alineamiento de regiones conservadas de GGPPS de hongos, resaltando los aminoácidos conservados de cada región. Los números indican la posición del primer aminoácido. Secuencias de la GGPPS de Phycomyces blakesleeanus (Pb), Mucor circinelloides (Mc); Neurospora crassa (Nc), Penicillium paxilli (Pp), Fusarium fujikuroi (Ff) y Saccharomyces cerevisiae (Sc). Las secuencias de proteínas fueron alineadas usando el programa ClustalX con los parámetros por defecto (Tagua, 2012). Los genomas de algunos hongos filamentosos como Aspergillus flavus, A. fumingatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, Neotyphodium lolii, Fusarium graminearum y F. fujikuroi tienen dos o más copias de genes que codifican para GGPPS. La presencia de varias copias de genes para las GGPPS sugiere una “firma molecular” para la biosíntesis de diterpenos y podría significar que la ruta de biosíntesis que utilizan estas enzimas podría estar compartimentalizada con GGPPS especializadas para la biosíntesis de terpenoides en diferentes compartimentos (Saikia & Scott, 2009). Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 103! 3.1.2 Las GGPPSs de Phycomyces. Phycomyces blakesleeanus también tiene dos genes que codifican para GGPPS llamados ggsA y ggsB (Tagua, 2012) (Figura 2). Estas proteínas son homólogas de la proteína AL-3 de Neurospora crassa y de la proteína CarG de Mucor circinelloides que participan en la ruta de biosíntesis de carotenos (Nelson et al., 1989; Velayos et al., 2003). 1 2 3 4 5 6 1 2 3.1 3.2 3.3 4 5 6 ggsA ggsB 150 pb Figura 3.2: Estructura genómica de los genes que codifican para las GGPPS de Phycomyces blakesleeanus. Se indican los los exones, los intrones y la dirección de la transcripción. En cajas rojas se indican los exones de cada gen. Las cajas verdes muestran el exón 3 que se encuentra interrumpido por dos intrones en ggsB. Imagen modificada de la Tesis de Víctor G. Tagua, 2012. El gen ggsA tiene una longitud de 1176 pb y contiene 5 intrones y 6 exones, y el gen ggsB tiene una longitud de 1530 pb y contiene 7 intrones y 8 exones. La estructura genómica de los dos genes es muy parecida, excepto el exón 3 de ggsA que está dividido por dos intrones en ggsB después de la duplicación para dar lugar a estos dos genes (Figura 2). La duplicación de los genes para las GGPPS también se observa en otros mucoromicetos como Mucor y Rhizopus sugiriendo que estos genes aparecieron por una duplicación del gen para la GGPPS en el antepasado de estos hongos. El análisis del genoma de varios hongos mucoromicetos ha demostrado que durante la evolución de estos hongos ocurrió una duplicación de su genoma (Corrochano et al., 2016). Este fenómeno puede ser responsable de las dos copias de genes para GGPPS que existen en los genomas de varios hongos mucoromicetos igual que se ha propuesto para la duplicación de genes de fotorreceptores y otras proteínas que participan en transducción sensorial (Corrochano et al., 2016). Las proteínas GgsA ( JGI ID protein # 33722) y GgsB (JGI protein # 183831) tienen 299 y 322 aminoácidos respectivamente. Las dos proteínas tienen un 91.6% de identidad y contienen los cinco dominios característicos de las GGPPS (Figura 1) (Chen & Poulter, 1994). GgsA y GgsB pertenecen a las familia de las GGPPS de tipo III debido a su secuencia y estructura (Tagua, 2012). La GGPPS ha sido purificada del mutante M1 (mutante carS superproductor de caroteno) de Phycomyces blakesleeanus debido a la alta actividad GGPPS que se detectaba Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 104! en este mutante (Brinkhaus & Rilling, 1988). La GGPPS de Phycomyces consiste en dos subunidades de aproximadamente 30 kDa con tendencia a disociarse. No está claro si las dos subunidades purificadas corresponden a dos subunidades de GgsA, dos subunidades de GgsB o a un heterodímero de GgsA y GgsB, ya que las proteínas GgsA y GgsB tienen un tamaño similar, 34,06 y 36,73 kDa respectivamente. También se ha observado que la enzima purificada utiliza como sustrato IPP y FPP para la formación de GGPP (Brinkhaus & Rilling, 1988). 3.1.3 Regulación de la transcripción de los genes ggsA y ggsB. La transcripción de los genes ggsA y ggsB está regulada por la luz y el desarrollo sexual. Para conocer cómo la luz regula la transcripción de los genes implicados en carotenogénesis se estudió la transcripción de los genes ggsA, ggsB, carRA y carB, carS y acaA. Cuando los micelios se exponen a diferentes tiempos de iluminación con luz azul se ha observado la inducción de la transcripción de los genes ggsA, carRA y carB, y la represión de ggsB y carS (Tagua, 2012). Sin embargo, el gen acaA no responde a la exposición a luz azul. La mayor acumulación de ARNm de ggsA ocurre tras 15-30 minutos de exposición a luz azul (10 veces más acumulación que en oscuridad), pero exposiciones más prolongadas dan lugar a una disminución de ARNm. En cambio, ggsB y carS se reprimen por la luz y la máxima represión se detecta tras 60 minutos de iluminación. La activación o represión transitoria se deben a la fotoadaptación que ha sido observada para varios genes regulados por luz en Phycomyces (Rodríguez-Romero & Corrochano, 2006; Sanz et al., 2009; Tagua et al., 2015). La regulación por luz tanto para la activación como para la represión de estos genes está mediada por el complejo Mad que está formado por los productos de los genes madA y madB (Bergman et al., 1973; Idnurm et al., 2006; Sanz et al., 2009). Los mutantes del complejo Mad no son capaces de regular la transcripción de los genes ggsA, ggsB o carS por la luz (Tagua, 2012). En Phycomyces blakesleeanus la carotenogénesis también se induce por la interacción sexual (Barnett et al., 1956). Se ha investigado la expresión de los genes ggsA, ggsB, carS, carRA, carB y acaA en cultivos mixtos y en cultivos simples. La transcripción de estos genes se activa por el sexo excepto la transcripción de ggsA que se reprime dando lugar a una acumulación de ARNm dos veces menor en cultivos mixtos que en cultivos simples. La cantidad de ARNm de carS es 12-15 veces mayor en cultivos mixtos que en Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 105! cultivos simples, y en el caso de ggsB es de 30-35 veces mayor en cultivos mixtos que en cultivos simples. Por tanto, parece que ggsA se activa por luz y participa en la activación de la biosíntesis de carotenos por la luz mientras que ggsB se activa por la interacción sexual para que GgsB participe en la síntesis de carotenos durante el desarrollo sexual de Phycomyces blakesleeanus (Tagua, 2012). 3.1.4 El gen carC. Los mutantes en el gen de la GGPPS de N. crassa son letales debido al papel de estas proteínas en la biosíntesis de terpenoides esenciales (Macino et al., 1993). Sin embargo, existen mutantes en el gen responsable de la GGPPS de Neurospora (al-3) que son rezumantes. Estos mutantes tienen un fenotipo albino por la reducción en la biosíntesis de carotenoides como resultado de una GGPPS que no es completamente activa (Macino et al., 1993). Los mutantes en el gen carC tienen un color blanquecino por su escasa acumulación de β-caroteno y el producto de este gen ha sido propuesto como regulador de la ruta de biosíntesis de carotenos. Además, los mutantes carC son defectuosos en la fotocarotenogénesis pero el retinol es capaz de estimular la carotenogénesis del mutante carC tanto como la estirpe silvestre (Revuelta & Eslava, 1983). TAG|T !TATT GAA|GTA !GAATTA S92F ggsA carC669 carC662 carC652 carC668 Figura 3.3: Estructura genómica del gen ggsA de P. blakesleeanus. La flechas negras indican las diferentes mutaciones descritas en el gen ggsA. Para investigar si los genes ggsA o ggsB correspondían a carC, Víctor G. Tagua (2012) secuenció estos genes en varios mutantes carC y encontró que todos los mutantes carC tenían mutaciones en el gen ggsA (Tagua, 2012). Se identificaron tres alelos diferentes del gen ggsA. El alelo carC669 tiene una transición de G a T en el nucleótido 43 que altera el procesamiento del primer intrón originando un stop prematuro que da como resultado una proteína truncada de 35 aminoácidos. Las estirpes con la mutación carC652 y carC668 contienen una transición de G a T en el nucleótido 879 que altera el procesamiento del quinto intrón originando un stop prematuro y una proteína truncada Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 112! peso seco)(Figura 3.9) (Tabla 4 y 5). Estos resultados confirman que carC codifica para una GGPPS capaz de complementar la falta de crtE en E. coli. Además, cuando la cepa ΔcrtE fue transformada con plásmidos con los ADNc de los genes carC y carRA de Phycomyces también se detectó la acumulación de β-caroteno en la bacteria en mayor cantidad que cuando no contenían el plásmido con el ADNc de carRA (36,68 ± 11 µg/g peso seco) (Tabla 3.4 y 3.5). Cuando la estirpe de E. coli sin la GGPPS y la licopeno ciclasa (ΔcrtE ΔcrtY) fue transformada con el plásmido pUC19 no se detectó la acumulación de ningún caroteno. Sin embargo, cuando esta estirpe se transformó con el plásmido con el ADNc del gen carC se obtuvo licopeno (73,50 ± 17 µg/g peso seco de licopeno). Similares resultados se obtuvieron cuando se cotransformó con plásmidos con el ADNc de carC y carRA de Phycomyces (36,83 ± 8 µg/g peso seco). Este resultado sugiere que la actividad licopeno ciclasa de CarRA no funciona en E. coli (Figura 3.10 y 3.11) (Tabla 3.4 y 3.5). Unidades de absorbancia, mAU ΔcrtE + crtE + crtE pUC19 57,5 10 0 20 57,5 10 0 200 57,5 10 0 20 57,5 10 0 20 57,5 10 0 20 ΔcrtE + carC ΔcrtE + ggsB ΔcrtE + carC pUC19 57,5 10 0 20 57,5 10 0 200 57,5 10 5 0 50 ΔcrtE ΔcrtY carC ΔcrtE ΔcrtY + ggsB ΔcrtE ΔcrtY + carC + ΔcrtE ΔcrtY + + ΔcrtE ΔcrtY ΔcrtE + 5 0 50 0 50 7,5 10 7,5 10 Tiempo de retención, min β-caroteno licopeno + carRA carRA Figura 3.11: Cromatograma de los perfiles de elución del HPLC obtenidos con extractos de las cepas de E. coli transformadas con los plásmidos que contienen los genes crt de E. uredovora o los genes carC y ggsB de P. blakesleeanus. Se indican con una flecha los carotenos detectados a 450 nm (β–caroteno) y a 475nm (licopeno). Las estirpes de E. coli han sido transformadas con un plásmido que contiene los genes necesarios para sintetizar β–caroteno de E. uredovora excepto crtE (ΔcrtE) ó crtE y crtY ( Δ crtE Δ crtY), y además con el gen crtE, carC, ggsB o carRA. En la figura sólo se indican los genotipos relevantes de cada estirpe y cada plásmido. Las gráficas de color naranja indican la presencia de β– caroteno y las gráficas de color rojo indican la presencia de licopeno. Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 113! Hemos realizado experimentos similares para confirmar la actividad GGPPS de GgsB en E. coli. Cuando la estirpe sin el gen que codifica para la GGPP sintasa (ΔcrtE) fue transformada con el ADNc de ggsB se observó la acumulación de β-caroteno (6,17 ± 3 µg/g peso seco de β-caroteno) mientras que no se detectó la acumulación de ningún pigmento en la estirpe transformada con pUC19. Por lo tanto, el gen ggsB también codifica para una enzima con actividad GGPPS capaz de complementar la falta de CrtE de E. uredovora en E. coli. La actividad de GgsB es menor que la de CarC ya que se produjo una menor acumulación de β-caroteno que cuando E. coli fue transformada con CarC. Cuando la estirpe ΔcrtE ΔcrtY se transformó con el gen ggsB de Phycomyces se observó la acumulación de licopeno (37,1 ± 8 µg/g peso seco de licopeno) de la misma forma que al transformar con el gen carC (Figura 3.11 y 3.12) (Tabla 3.4 y 3.5). ! + crtE + carC + ggsB + crtE + carC +ggsB pUC19 ΔcrtE, ΔcrtY ΔcrtE pUC19 Figura 3.12: Extractos carotenogénicos procedentes de las distintas cotransformaciones realizadas entre los genes crt de E. uredovora y los genes carC y carRA de P. blakesleeanus. ΔcrtE: control negativo; + crtE: control positivo. Imagen cortesía de la Dra. Catalina Sanz. Los resultados muestran que CarC y GgsB codifican para GGPPS ya que son capaces de complementar la falta de la GGPPS CrtE en E. coli para sintetizar β-caroteno. Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 114! Tabla 3.4: E. coli DH5α se transformó con un plásmido con los genes de E. uredovora para sintetizar β-caroteno excepto crtE o crtY y, además, un plásmido con el gen crtE o el ADNc de carC, carRA o ggsB. Carotenos Plásmidos ClrR Plásmidos AmpR y TetR Licopeno γ-caroteno β-caroteno pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pUC19 pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pAVB8 (crtE) ✔ ✔ pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pGEMT (carC) ✔ pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pGEMT (carC) + pCS19 (carRA) ✔ pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pGEMT (ggsB) ✔ pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE, ΔcrtY) + pUC19 pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE, ΔcrtY) + pAVB8 (crtE) ✔ pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE , ΔcrtY) + pGEMT (carC) ✔ pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE, ΔcrtY) + pGEMT (carC) + pCS19 (carRA) ✔ pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE, ΔcrtY) + pGEMT (ggsB) ✔ La tabla muestra la acumulación de carotenos: β-caroteno, γ-caroteno o licopeno en las cepas resultantes de los experimentos de cotransformación. Los genes delecionados son mostrados con el símbolo Δ. El símbolo (✔) indica presencia de los correspondientes carotenoides en las muestras de las distintas cotransformaciones realizadas y cuyos extractos fueron analizados mediante HPLC. Clrr: plásmido resistente a cloranfenicol; Ampr: plásmido resistente a ampicilina; Tetr: plásmido resistente a tetraciclina. Los plásmido pAVB fueron cedidos por el Dr. Antonio Velayos Baeza, y los plásmidos pCS fue construido en por la Dra. Catalina Sanz (Sanz et al., 2011b). Tabla 3.5: E. coli DH5α se transformó con un plásmido con los genes de E. uredovora para sintetizar β-caroteno excepto crtE o crtY y, además, un plásmido con el gen crtE o el ADNc de carC, carRA o ggsB. Plásmido ClrR Plásmidos AmpR y TetR Carotenoides (µg/g peso seco) Licopeno β-caroteno pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pUC19 - pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pAVB8 (crtE) 113,33 ± 17 pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pGEMT (carC) 28,45 ± 6 pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pGEMT (carC) + pCS19 (carRA) 36,68 ± 11 pAVB3 ( crtB, crtI, crtY, ΔcrtE) + pGEMT (ggsB) 6,17 ± 3 pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE, ΔcrtY) + pUC19 - pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE, ΔcrtY) + pAVB8 (crtE) 119,07 ± 15 pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE, ΔcrtY) + pGEMT (carC) 73,50 ± 17 pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE, ΔcrtY) + pGEMT (carC) + pCS19 (carRA) 36,83 ± 8 pAVB14 (crtB, crtI, ΔcrtE, ΔcrtY) +pGEMT (ggsB) 37,1 ± 8 La tabla muestra la acumulación de carotenos: β-caroteno, γ-caroteno o licopeno en las cepas resultantes de los experimentos de cotransformación. Los genes delecionados son mostrados con el símbolo Δ. La tabla muestra la cuantificación de carotenoides de las diferentes cotransformaciones realizadas en E. coli para comprobar la actividad GGPPS del gen carC de P. blakesleeanus. Clrr: plásmido resistente a cloranfenicol; Ampr: plásmido resistente a ampicilina; Tetr: plásmido resistente a tetraciclina. Los plásmido pAVB fueron cedidos por el Dr. Antonio Velayos Baeza, y los plásmidos pCS fueron construidos por la Dra. Catalina Sanz (Sanz et al., 2011b). Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 115! 3.2.3 Complementación del gen carC de Phycomyces blakesleeanus en Neurospora crassa. Neurospora crassa contiene en su genoma el gen al-3 con una identidad del 56% con el gen carC de P. blakesleeanus. El gen al-3 es esencial pero el mutante al-3 tiene una mutación puntual que da lugar a un cambio de la serina 335 a asparragina (Carattoli et al., 1991; Romano & Macino, 1991). Esta mutación está localizada aguas abajo del dominio V típico de las GGPPS y es responsable de la reducida actividad GGPPS observada en el mutante (Sandmann et al., 1993). Para investigar si el gen carC puede complementar la función del gen al-3 de N. crassa, se transformó la estirpe NCS1 (al-3 his-3) con un plásmido con el ADNc del gen carC de P. blakesleeanus. La estirpe NCS1 se consiguió mediante un cruzamiento entre las estirpes FGSC#6524 (his-3, a) y FGSC#2082 (al-3, A). Para la transformación se utilizó el plásmido pMF272 (Freitag et al., 2004) en el que se clonó el ADNc del gen carC de P. blakesleeanus. El plásmido pMF272 está diseñado para insertar el gen de interés (carC) mediante recombinación en el gen his-3 de N. crassa (Margolin et al., 1997). Este plásmido tiene el gen his-3 truncado ya que carece de los 567 nucleótidos (189 aminoácidos) primeros del gen, y también tiene la región 3’ UTR de dicho gen. Además, entre estas regiones se encuentra el ADNc del gen carC bajo la regulación del promotor fotoinducible ccg-1 (McNally & Free, 1988) (Figura 13). Cuando se transforma la estipe NCS1 con el plásmido, estas regiones recombinan con el gen his-3 lo que da lugar a la reconstrucción del gen his-3 silvestre y la integración del resto del plásmido con el ADNc del gen carC (Figura 3.13). pMF272::carC AmpR his-3 truncado carC ccg-1p región 3’ carC ccg-1p región 3’ his-3 silvestre mutación Cromosoma I Cromosoma I X DraIII NdeI Figura 3.13: Esquema de la integración del gen carC de P. blakesleeanus mediante el reemplazamiento del gen his-3 de N. crassa. Para ello se ha utilizado el plásmido pMF272 que carece de los primero 189 aminoácidos del gen his-3 de N. crassa aunque también tiene dos regiones homólogas presentes en el ADN genómico de N. crassa a través de las cuales se consigue la integración y reemplazamiento del gen his-3 además del gen de interés (carC). El gen carC se encuentra bajo el promotor fotoinducible ccg-1. El plásmido es linearizado con las enzimas de restricción NdeI y DraIII para su correcta integración en el genoma de N. crassa. Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 116! El plásmido pMF272::carC se comprobó mediante digestión y PCR con cebadores específicos para carC (Figura 3.14). 1 2 3 8 1 kB 2 12 1: pMF272::carC sin digerir. 2: pMF272::carC digerido con XmaI. 3: pMF272:: carC digerido con XmaI-XbaI. B pMF272 carC pMF272::carC 9371 pb A Figura 3.14: A: Esquema del plásmido pMF272 con el ADNc del gen carC de P. blakesleeanus. B: Comprobación de la clonación del gen carC en el plásmido pMF272 mediante digestión con las enzimas de restricción XbaI-XmaI. En el carril 3 de la electroforesis se observa tras la digestión una banda de 8.4 kb que corresponde con el plásmido pMF272 y otra de 0,9 kb que corresponde al ADNc del gen carC de P. blakesleeanus. Posteriormente, se procedió a la transformación mediante electroporación de los conidios de la estirpe NCS1 de N. crassa. Se obtuvieron dos transformantes de color blanco como la estirpe NCS1 original (Figura 3.15). Los transformantes obtenidos se aislaron desde la placa de transformación a tubos de Vogel inclinados sin histidina y los conidios se inocularon en placas de FGS. Las placas FGS permiten el crecimiento colonial sin histidina y fueron utilizadas para seleccionar una colonia e inocularla de nuevo en tubos de medio Vogel inclinado sin histidina. Este proceso se hizo tres veces con el fin de purificar una colonia homocarionte con todos los núcleos con el ADNc del gen carC de P. blakesleeanus. Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 117! wt NCS1 T1 T2 Para confirmar que el ADNc de carC estaba presente en el genoma de los transformantes se amplificó el ADNc de dicho gen por PCR en la estirpe silvestre (FGSC#2489), la estirpe NCS1 y los transformantes de N. crassa (T1 y T2). Como cabía esperar únicamente el genoma de los transformantes contenían el gen carC de P. blakesleeanus (Figura 3.16). Para comprobar que el gen carC de Phycomyces se ha insertado al lado del gen his-3 se realizaron PCRs en la estirpe silvestre, la estirpe NCS1 y las estipes transformantes (T1 y T2) utilizando un cebador que se une dentro del gen carC y otro cebador que se une dentro del gen his-3. Los resultados muestran que el gen carC está localizado al lado del gen his-3 restaurado en las estirpes transformantes (Figura 3.16). compr valida carC finall blanca Printed: 26/07/2016 12:50:45 Page 1 of 1 Location: C:/Documents and Settings/gen/Escritorio/Capturas/Álex L3/CarC wt hisal3 T1 T2 wt hisal3 T1 T2 wt hisal3 T1 T2 kb kb al-3 carC carC his-3 2.5 2 1 2.5 2 1 kb kb 3 3 Figura 3.16: Comprobación de la transformación del ADNc del gen carC de Phycomyces en N. crassa. La figura muestra los resultados de amplificar el gen al-3, carC y la región de ADN entre carC e his-3 en la estirpe silvestre, NCS1 y los dos transformantes. 3.2.3.1 Análisis de los transformantes. El fenotipo albino de los transformantes sugiere que el ADNc del gen carC no complementa la mutación al-3. Sin embargo, otra hipótesis podría ser que el gen carC no se transcribiese con normalidad bajo el promotor ccg-1. Para investigar si carC se transcribía en las estirpes transformadas se realizó una RT-PCR cuantitativa en la estirpe Figura 3.15: Fenotipo de los transformantes obtenidos tras la transformación de la estirpe NCS1 de N. crassa con el plásmido pMF272::carC. wt: estirpe silvestre, NCS1 (al-3 his-3), T1 y T2: transformantes. El micelio fue crecido en medio Vogel sólido durante dos días a 34ºC y posteriormente expuestos a la luz. Se muestra como los transformantes con el gen carC de P. blakesleeanus no complementan la mutación del gen al-3 de N. crassa y dan lugar a micelio de color blanco. Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 118! silvestre, la estirpe transformada NCS1, y de los dos transformantes. Estas estirpes fueron cultivadas tanto en luz como en oscuridad ya que el gen carC está insertado en el genoma bajo un promotor fotoinducible (Figura 3.17). 0.08 1 0.40 0.10 0.86 0.39 0.10 1.07 0.38 0.09 1.02 0.31 0,0 0,5 1,0 1,5 0.01 0.02 0.03 0.01 0.02 0.01 1 2.14 1.15 2.67 10.36 3.82 0 3 6 9 12 15 18 Expresión relativa Tiempo de iluminación, min 0 30 120 0 30 120 0 30 120 0 30 120 con-10 al-3 carC wild type NCS1 T1 T2 0.02 1 0.18 0.02 0.08 0.10 0.01 0.51 0.34 0.02 0.48 0.16 0,0 0,5 1,0 1,5 Los resultados obtenidos en la RT-PCR cuantitativa muestran la acumulación de ARNm del gen con-10 y al-3 en todas las estirpes, incluida el mutante al-3, así como la acumulación de ARNm de carC en los transformantes debido a que son los únicos que tienen este gen (Figura 3.17). Los resultados muestran una acumulación de ARNm de carC tras 30 minutos de iluminación, ya que ccg-1 es un promotor fotoinducible (Arpaia et al., 1995). Tanto con-10 como al-3 son genes cuya transcripción está regulada por la luz y se observa una acumulación de sus ARNm tras 30 minutos de exposición a la luz. Exposiciones más prolongadas (120 minutos) disminuyen la respuesta transcripcional debido al fenómeno de la fotoadaptación (Malzahn et al., 2010). Estos resultados indican que la falta de complementación por el ADNc de carC no se debe a la falta de transcripción de dicho gen en N. crassa. Para confirmar que los transformantes no acumulaban ningún caroteno aunque tuvieran el gen carC de P. blakesleeanus se procedió a la extracción de carotenos de la estirpe silvestre, la estirpe NCS1, y los dos transformantes de micelios mantenidos en oscuridad o expuestos a la luz durante 8 minutos. Una vez extraídos los carotenos, se cuantificaron mediante espectrofotometría (Figura 3.18). Figura 3.17: Acumulación de ARNm después de iluminar a diferentes tiempos de luz la estirpe silvestre, NCS1, T1 y T2 de N. crassa. Los micelios fueron crecidos en Vogel mínimo durante 24 horas a 34ºC en oscuridad y expuestos a diferentes tiempos de luz. Estos resultados de cada PCR para cada gen fueron normalizados a la correspondiente PCR de gen tub-2 como control de carga y normalizados a los valores obtenidos a los 30 minutos de iluminación de la estirpe silvestre. El gen con-10 se utilizó como control positivo de la fotoinducción. Las gráficas muestran la expresión relativa de dos experimentos independientes y sus correspondientes errores estándar. Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 119! 4.70 2.58 1.97 2.73 95.98 5.42 5.44 5.15 0 20 40 60 80 100 120 wt NCS1 T1 T2 Carotenoides, µg/g peso seco Oscuridad Luz Figura 3.18: Producción de carotenos en los transformantes obtenidos de N. crassa. Los carotenos fueron extraídos de micelios crecidos en oscuridad continua durante 48 horas o expuestos 8 minutos a luz blanca y posteriormente crecidos de nuevo en oscuridad. Las estirpes utilizadas fueron la estirpe silvestre (wt); la estirpe NCS1 (al-3 his-3), y los transformantes (T1 y T2) obtenidos en la transformación con el plásmido pMF272 y el gen carC de P. blakesleeanus. Los datos de la cantidad media de carotenoides fueron obtenidos en tres experimentos independientes; indicando el error estándar de los tres experimentos. Como se observa en la figura 3.18, los transformantes con el ADNc del gen carC de Phycomyces no complementan la mutación del gen al-3 en Neurospora, ya que producen la misma cantidad de carotenos que la estirpe transformada NCS1. Estos resultados indican que la homología entre al-3 y carC no es suficiente para complementar la falta de GGPPS en N. crassa. El hecho de que los transformantes tengan un micelio de color blanco aunque tengan en su genoma el gen carC de P. blakesleeanus y que se exprese en los transformantes indica que carC no complementa la mutación del gen al-3 de N. crassa. 3.3 Discusión La biosíntesis del β-caroteno comienza con la condensación del farnesil pirofosfato (FPP) y el isopentenil pirofosfato (IPP) para dar geranilgeranil pirofosfato (GGPP) (Sagami et al., 1993). En P. blakesleeanus esta reacción la pueden llevar a cabo los genes carC y ggsB que codifican para la geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPPS). Resultados previos en nuestro laboratorio permitieron proponer la hipótesis de que los mutantes carC que acumulan menos β-caroteno tienen mutaciones en el gen ggsA. Nuestros resultados combinando un análisis de recombinación y la expresión heteróloga en E. coli permiten confirmar que ggsA es carC. Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 120! Phycomyces blakesleeanus produce trisporoides que derivan de la rotura de la molécula de β-caroteno y son usados por el hongo como feromonas durante la interacción sexual para el reconocimiento entre ambas estirpes de sexo contrario (Polaino et al., 2010; 2012; Schimek & Wöstemeyer, 2009). Los mutantes que carecen de β-caroteno son incapaces de estimular a la estirpe silvestre aunque ellos sí son estimulados por ella (Sutter, 1975a). En el caso de los mutantes carC, éstos presentan un micelio blanco aparentemente carente de β-caroteno pero cuando se analiza el contenido, se observa que todos estos mutantes producen aproximadamente unos 13 µg/g peso seco de β-caroteno mientras que la estirpe silvestre en las mismas condiciones es capaz de producir 59 µg/g peso seco (Revuelta & Eslava, 1983). Los mutantes carC que producen cuatro veces menos β-caroteno que la estirpe silvestre, son capaces de producir cigosporas viables tras la interacción sexual aunque hemos observado que estas cigosporas tardan más tiempo en germinar (aproximadamente 5-6 meses) que las cigosporas obtenidas de cruzamientos entre estirpes silvestres (2-3 meses). Por lo tanto, parece ser que el caroteno producido por estos mutantes carC es suficiente como precursores de las hormonas sexuales necesarias para estimular a la estirpe de sexo opuesto y producir cigosporas viables. Además, estos mutantes tienen un retraso en la maduración de los esporangios (Revuelta & Eslava, 1983). Los resultados de muestran que ggsB se expresa preferentemente durante el ciclo sexual mientras que carC se expresa durante el crecimiento vegetativo tras la exposición a la luz (Tagua, 2012). En esta Tesis Doctoral hemos demostrado que las dos proteínas tienen una actividad GGPPS parecida, lo que sugiere que tras la duplicación génica se ha producido una especialización transcripcional para que cada enzima permita la síntesis de β-caroteno en diferentes etapas del ciclo de vida de Phycomyces. Aunque hemos confirmado la identidad de carC, no se ha descrito ningún otro mutante blanco que tenga una mutación en ggsB (Tagua, 2012). Resulta interesante comprobar que aunque existan dos genes para GGPPS en Phycomyces, la mutación en carC da lugar a una disminución de la biosíntesis de β-caroteno que no puede ser corregida por la presencia de ggsB, aunque GgsB tenga actividad GGPPS. Dos posibilidades podrían explicarlo: 1. Las mutaciones en carC son rezumantes y permiten un poco de actividad GGPPS en el micelio vegetativo independientemente de la presencia de GgsB. Capítulo 3: El gen carC de Phycomyces blakesleeanus. ! ! 121! 2. Que las mutaciones en carC den lugar a una GGPPS inactiva y que haya un poco de GgsB en micelios vegetativos que permita la biosíntesis parcial del β-caroteno y la síntesis de GGPP para otras funciones celulares. Esta hipótesis podría ser la más plausible. De hecho, todos los alelos carC acumulan la misma cantidad de β-caroteno, incluso la estirpe con el alelo carC669 con una mutación que da lugar a una parada prematura y una proteína truncada de 35 aminoácidos. Es decir, independientemente del alelo de carC, todas las estirpes carC acumulan la misma cantidad de β-caroteno (Revuelta & Eslava, 1983). Es interesante que el alelo carC669 no sea letal ya que la proteína CarC tiene sólo 35 aminoácidos lo que parece indicar que GgsB está complementando parcialmente su función. Resulta interesante que CarC y GgsB funcionen en el sistema de expresión heteróloga en E. coli pero no en el hongo N. crassa. Es posible que las enzimas que participan en la biosíntesis de carotenoides de N. crassa formen un complejo enzimático parecido al de Phycomyces (Almeida & Cerdá-Olmedo, 2008; Sanz et al., 2002). Si esto es así, no es extraño que CarC no permita las interacciones moleculares para reconstituir el complejo carotenogénico de N. crassa, lo que impediría la complementación de la mutación al-3 aunque hayamos detectado transcripción del gen en los transformantes de N. crassa. Además, puede que no se produzcan las modificaciones transcripcionales y traduccionales que permiten la actividad de estas enzimas. La GGPPS de Phycomyces se purificó del mutante M1 (mutante carS) donde la actividad de la GGPPS es mayor. En dicha purificación aparecieron dos bandas, una de aproximadamente 30 kDa y otra de 60 kDa. Cuando la banda de 60 kDa fue separada por electroforesis de nuevo fueron encontradas otra vez las dos bandas anteriores, lo que permite proponer que la banda de 60 kDa se corresponde con un dímero (Brinkhaus & Rilling, 1988). Este dímero podría estar formado por dos monómeros de CarC, dos monómeros de GgsB o un monómero de CarC y otro de GgsB. Es probable que el dímero esté formado por dos subunidades de CarC por varios motivos: la GGPPS fue purificada de micelio vegetativo donde se expresa sobre todo carC. Además, la enzima purificada aparece como una banda de un peso molecular de unos 30 kDa y no como dos bandas como se esperaría si fuese un heterodímero ya que GgsB tiene un peso molecular algo mayor que CarC (36,73 y 34,06 kDa, respectivamente). Estos resultados no son incompatibles con la propuesta de que GgsB esté complementando en parte la función de ! ! ! ! Discusión!general! ! ! 128! El hecho de que existan dos genes en Phycomyces que codifiquen para una GGPPS y que ggsB no supla la falta de carC podría ser debido a que las mutaciones carC son rezumantes o que GgsB permita la biosíntesis parcial de caroteno suficiente para la síntesis de GGPP para otras funciones celulares. Esta parece la hipótesis más plausible ya que todos los alelos carC producen la misma cantidad de β-caroteno independientemente de la mutación que tengan (Revuelta & Eslava, 1983). Nuestros resultados no son incompatibles con la propuesta de que GgsB esté complementando en parte la función de CarC ya que aunque el gen se reprima en micelio vegetativo expuestos a la luz, es posible que exista suficiente GgsB para permitir la síntesis de GGPP y la complementación parcial de los mutantes carC. ! ! ! ! ! ! ! CONCLUSIONES ! ! ! ! ! ! 131! 1. WcoB es una proteína citoplasmática y se acumula levemente en micelios iluminados. WcoB interacciona con proteínas para la biosíntesis de β-caroteno y proteínas WC. 2. WcoB y CarS interaccionan en Phycomyces y en Aspergillus. Esta interacción se produce en el citoplasma. 3. CarS regula la acumulación de WcoB. En el mutante carS (alelo carS180), que carece del dominio oxigenasa, disminuye drásticamente la acumulación de WcoB. 4. WcoB se ubiquitina y esta modificación puede regular su actividad o su estabilidad. 5. El gen madC de P. blakesleeanus codifica para una proteína GTPasa activadora de Ras (RasGAP) y es la primera proteína identificada que participa en la cadena de transducción sensorial para el fototropismo después del fotorreceptor. 6. El gen madC no se fotoinduce ni en la estirpe silvestre ni en los mutantes con los diferentes alelos de madC. 7. El gen homólogo de madC en Neurospora, ira-1 (NCU06122), no se induce por luz ni se observan cambios en la acumulación de la proteína. 8. IRA-1 es citoplasmática y se acumula en conidios y en micelio vegetativo a las 15 horas de la inducción al desarrollo. 9. Las mutaciones en el gen ggsA de P. blakesleeanus están ligadas al fenotipo de los mutantes carC. 10. Los genes carC y ggsB codifican para proteínas con actividad GGPPS. 11. Los genes carC y ggsB expresados en E. coli complementan la mutación del gen que codifica para la GGPPS. 12. El gen carC expresado en N. crassa no complementa la mutación del gen al-3 que codifica para la GGPPS de Neurospora. ! ! ! ! ! ! MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! Materiales y Métodos ! ! 135! 1. Estirpes usadas en esta tesis: -Phycomyces blakesleeanus. Tabla MM1.1: Estirpea Genotipob Fuentec NRRL1555 Wild type (-) UBC21 Wild type (+) A56 Wild type (+) A32 x NRRL1555 C47 madA35 (-) NRRL1555, NTG C111 madB103 (-) NRRL1555, NTG L51 madA7 madB103 (-) C303 x C21 A905 madC406 (-) NRRL1555, ICR-170 B2 madC452 (-) NRRL1555, ICR-170 A491 madC491 (-) NRRL1555, EMS S5 madC202, carA51 (-) UBC24, NTG C93 madC84 (+) NRRL1554, NTG C2 carA5 (-) NRRL1555, NTG C5 carB10 geo10 (-) NRRL1554, NTG C9 carR21 (-) NRRL1554, NTG A346 carC662 (-) NRRL1555, NQO A355 carC669 (-) NRRL1555, NQO A98 carC652 (-) NRRL1555, NQO A344 carC660 furA401 (-) NRRL1555, NQO M1 carS43 (-) NRRL1554, NTG S324 carS180 (-) C2 x S213, NTG a La estirpe silvestre NRRL1555 fue obtenida en el Northern Regional Research Laboratory, USDA, Peoria, IL, U.S.A. Estirpes con prefijo C, proceden del laboratorio del Premio Nobel Max Delbrück (Instituto de Tecnología, California, Pasadena, CA, U.S.A.); A, proceden del laboratorio de Salamanca (Departamento de Microbología y Genética, Universidad de Salamanca, España); S, proceden del Sevilla (Departamento de Genética, Universidad de Sevilla, España); L, proceden de Siracusa (Departamento de Física, Universidad de Siracusa, U. S. A.); M, proceden de Morgantown (Universidad de Virginia, WV, U.S.A.); UBC, obtenida por R. J. Bandoni (Universidad de Columnia Británica, Vancouver, Canadá). b Mutaciones nombradas mad están afectadas en el fototropismo del esporangióforo; mutaciones car en carotenogénesis; mutaciones geo están afectadas en geotropismo; mutaciones furA muestran resistencia a 5- fluorouracilo. c Los mutantes fueron obtenidos mediante mutagénesis con N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) o 4- nitroquinolina-1-oxido (NQO). Las estirpes con el símbolo “x” fueron obtenidas mediante cruzamiento sexual. -Neurospora crassa: Tabla MM1.2: Estirpe Genotipo Fuente FGSC#2489 74-OR23-1V mat A FGSC FGSC#6524 his-3 mat a FGSC FGSC#2082 al-3 mat A FGSC FGSC#10785 ira-1, mat a FGSC NCS1 al-3 his-3 Esta tesis T1 al-3 his-3 carC Esta tesis T2 al-3 his-3 carC Esta tesis IRA-1::3xFLAG ira-1::10Xgly3XFLAG Esta tesis Materiales y Métodos ! ! 136! -Aspergillus nidulans: Tabla MM1.3: Estirpe Genotipo Fuente SVK103 pyroA4; pyrG89; veA+ Vienken & Fischer, 2006 ANS1 pyroA4; pyrG89; veA+; madA::gfp Esta tesis ANS2 pyroA4; pyrG89; veA+; madB::gfp Esta tesis ANS3 pyroA4; pyrG89; veA+; wcoB::gfp Esta tesis ANS4 pyroA4; pyrG89; veA+; carS::gfp Esta tesis ANB1 pyroA4;pyrG89;veA+;wcoB::C-YFP;N-YFP Esta tesis ANB2 pyroA4;pyrG89;veA+;wcoB::C-YFP;carS::N-YFP Esta tesis Para las clonaciones de plásmido se usó Escherichia coli DH5α (huA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 ) (Taylor et al., 1993). Para el etiquetado de genes en Neurospora se utilizó para la construcción de cassette la levadura FY834 (MATα his3∆200 ura3-52 leu2∆1 lys2∆202 trp1∆63 ). 2. Oligonucleótidos usados en esta tesis. Tabla MM.2: Nombre Secuencia 5’→3’ Uso wcoB-1325F GCAACTTCCTTTCGCTCAAGA RT-PCR wcoB-1395R CATGGCTCCACTGTTCTGTTGT RT-PCR act-98F AGGCTGTCCTTTCCCTTTACG RT-PCR act-165R GACACCATCACCGGAATCG RT-PCR CRY-78F GATCCACCCTGGAGATGTCAA RT-PCR CRY-147R CCGTTTCCGAAAGGGTGTAA RT-PCR carS-79F CCTGCCTTCAACAAGCCAGTAG RT-PCR carS-144R GACACCATTTACCACTCTGGAA RT-PCR crgA-58F AACATTGGAGGCCTTCCCTAGA RT-PCR crgA-122R CCTCGTCGTCGATATCCACAT RT-PCR madC-260-F TGGCCCTTGACGAACAAAC RT-PCR madC-360-R TCCGTATTGTTGCATTTTTCGA RT-PCR ncu06122RT44F GGTATTCCATGTCGGCCTTGT RT-PCR ncu06122RT144R GAGATCCCGCAGCACCTTT RT-PCR con10-45F CAGCCACAGCGGAGGC RT-PCR con10-104R TTGGAAGCAATTTCGCGC RT-PCR al3-165F CATCTCTTCCGCCGGTCTAG RT-PCR al3-227R ACCGAGGCCTTGCGTTTAC RT-PCR carC-F AACGCAAACAAACACCCCTAA RT-PCR carC-R TTGTGCTTTTTGGACACCTTTTC RT-PCR F-AscI-wcoB GGCGCGCCAATGAATCCCTTTGAAAACATCGTCCCA TTTAACC Etiquetado GFP,YFP Materiales y Métodos ! ! 137! R-PacI-wcoB TTAATTAATTACTACAAGCGCCGCATAGTACAAGTA TTGC Etiquetado GFP,YFP F-AscI-madA GGCGCGCCAATGGATTCCTTCTCATCTTAC Etiquetado GFP,YFP R-PacI-madA TTAATTAATTATTATGTTTCCATTGCAGTGG Etiquetado GFP,YFP F-AscI-madB GGCGCGCCAATGGAATCAGCTCGTCAACC Etiquetado GFP R-PacI-madB TTAATTAATTATTATATGTCTGACCCATCTGG Etiquetado GFP F-AscI-carS GGCGCGCCAATGCTTACTCCTGCCGCCG Etiquetado GFP R-PacI-carS TTAATTAATTATTAGTTAACAGCAACACCTTTG Etiquetado GFP sexP-D3 GCAAATGTGTACCGAAAGC PCR sexP-I3 ATTATTACAAAAGTCCTGCC PCR sexM-D3 CCTAGCATTCTATCAAGC PCR sexM-I3 GTAGTCTTGTGAGGTAGC PCR Oligo 2-F TCTTATGCGAGATTCGGCAG PCR Oligo 2-R TCACTGATACGACGGACTAG PCR Oligo 3-F TACACGATCGAACAGCAAGC PCR Oligo 3-R GAAGACAGTGATCTGATCCC PCR Oligo 4-F GGTTTACTCGGGTCATTGAG PCR Oligo 4-R TTCTGGCGCAATGGGTAATC PCR Oligo 5-F CCAGTTTCGAGAGGATCTTC PCR Oligo 5-R TCATGTGCAATTGCAGGTGG PCR ALID190-F ACCAGCGCTGGACAACAC PCR ALID190-R TATTCCGCAAACTGATCC PCR Oligo 7-F GGAATCGTATATGACGTGGC PCR Oligo 7-R TCATTTATGCCACGCACAGC PCR Oligo 6D-F GGCCTAAGACTTGCTACTC PCR Oligo 6D-R GCCTACCAAGTCAAAGAAGC PCR Oligo 6B-F GCCTTCCAGAGGTGATAGATAG PCR Oligo 6B-R CAGAAGCAGGAGCATGACC PCR Oligo 6H-F CGAGATCGATCTCGAAGATG PCR Oligo 6H-R CGACTCTGTATCAGAGGTACG PCR ALID393-F CCCATTTCTTGTCCCTGTAG PCR ALID393-R CATTCACAAAATAGCACAGC PCR Oligo 21C-F GACGTGTCTGTCATAGTGC PCR Oligo 21C-R GAGCTTATACGAGATCCGAAG PCR Oligo 21I-F CCTGTTGTAAGCCATGTTGCC PCR Oligo 21I-R AGGCTGAGAAGAACCTCGAG PCR ALID1079-F AATCCGTGAGATAAGCACAG PCR ALID1079-R TAAGATGTACATCGTCCTAC PCR ALID1077-F CTATTGTTATCATTCAGGAGG PCR ALID1077-R AATATCGCAGTTGCATTGAC PCR ALID1184-F TCGTGCTACCGTACAAACCCCT PCR ALID1184-R ACCCCGGTCTAATTGGGGTCTAGA PCR Oligo 54A-F CTCTTCACAATGGCCATCCG PCR Oligo 54A-R GCACTACCTCAGAGGGAAG PCR Oligo 54B2-F CACGTGATCTACCGTTGTAAG PCR Oligo 54B2-R GGACCACTATTTCCATCCCAC PCR ALID1017-F CTGGCTCGCTCAAGGTCGAG PCR ALID1017-R AACTCAAGATCGTTATGCTG PCR 5’-6122-F GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACG GATTTATGCTCGAACTGTGCG Etiquetado ira-1 5’-6122-R CCTCCGCCTCCGCCTCCGCCGCCTCCGCC Etiquetado ira-1 Materiales y Métodos ! ! 144! matraces a 30ºC y luego se recogieron en papel de filtro y se lavaron. Las tortas de micelio sobre el papel de filtro se invirtieron sobre un segundo papel de filtro sobre una placa con medio Vogel que contenía 0,45% [p/v] de agar. Los cultivos se incubaron a 30°C durante diferentes tiempos dependiendo del experimento. El micelio debe crecer primero a través de papel de filtro para obtener aire, y luego las hifas aéreas pueden ser cosechadas por separado del micelio vegetativo inferior que crece entre los dos papeles de filtro. Cultivo líquido en agitación, 24h, 30ºC El micelio se recoge con la bomba de vacío en un papel de filtro. Este papel de filtro se coloca sobre otro papel de filtro en la parte superior de una placa de Petri con medio sólido (0,45% de agar). Posteriormente se incuba durante 15-24 h, 30ºC. Tejido aéreo, conidios Tejido vegetativo Recoger los diferentes tejidos, aéreo y vegetativo. Figura MM1: Método de inducción al desarrollo basado en {BaileyShrode:2004wd}. Modificado de (Ruger- Herreros, 2014). 3.4 Medios y condiciones de cultivo para Aspergillus nidulans. Los medios de cultivo utilizados para cultivar este hongo han sido descritos en (Pontecorvo et al., 1953). De forma generalizada se ha utilizado medio mínimo (MMA) líquido o sólido añadiendo los suplementos apropiados en caso de los mutantes auxótrofos. 3.4.1 Disoluciones utilizadas (preparación por litro): -Solución de sales 50X: 26 g KCl, 76 g KH2PO4 anhidro, 26 g MgSO4· 7H2O and 2.5 ml de elementos traza fueron disuelto en 775ml de agua destilada. Entonces, fue enrasado a 1 litro y autoclavado. -Elementos traza (1000X): 22 g ZnSO4 · 7H2O, 11g H3BO3, 5g MnCl2 · 4H2O, 3,14g FeSO4 · 2H2O, 1,6g CuSO4 · 5H2O, 1,6g CoCl2 · 6H2O, 1,1g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 50g Na2EDTA. Ajustar con KOH a pH 6,8. Esterilizar por autoclavado. -Disolución de glucosa (10X): 200g de glucosa. Esterilizar por autoclavado. -Disolución de tartrato amónico (100X): 92g de tartrato amónico. Esterilizar por autoclavado. Materiales y Métodos ! ! 145! 3.4.2 Medio Mínimo de Aspergillus con nitrato Este medio se utilizó para el crecimiento y esporulación de las distintas cepas utilizadas en esta tesis. Este medio está compuesto por (preparación por litro): 6g NaNO3, 1,5g KH2PO4 anhidro, 0,5 g KCl, 0,54g MgSO4· 7H2O, 15g agar, 0,5ml elementos traza. Ajustar pH a 6,8 y autoclavar. Después de autoclavar añadir 100ml de glucosa 10X. En el caso de los mutantes auxótrofos para pyro, se añade piridoxina-HCl a una concentración final de 2,5µM. Para los mutantes pyrG suplementar el medio con 5mM de uridina y 5mM de uracilo. Para disolver el uracilo y la uridina se necesita calentar el agua donde se van a disolver y una vez disuelto añadir al medio antes de autoclavar. 3.4.3 Medio Mínimo líquido con tartrato amónico. Este medio se utilizó para la obtención e protoplastos y posterior transformación de las estirpes. El medio está compuesto por (preparación por litro): 20ml de solución de sales 50X y 0,3 ml de elementos traza. Ajustar el pH a 6,8 con NaOH y autoclavar. Una vez autoclavado, añadir 30ml de glucosa 10X, 15ml de tartrato amónico 100X y los suplementos necesarios para las distintas auxotrofías. 3.4.4 Medio de Regeneración (MMR): Este medio se utilizó en los experimentos de transformación de Aspergillus y se compone de (preparación para un litro): 20ml de solución de sales 50X, 342g de sacarosa (1M). Ajustar el pH a 6,8 con NaOH y añadir 15g agar. Autoclavar y luego añadir 100ml de glucosa 10X y 10ml de tartrato amónico 100X. 3.4.5 Medio de Regeneración-TOP (MMR-TOP): Este medio se utilizó en los experimentos de transformación de Aspergillus y se compone de (preparación para un litro): 20ml de solución de sales 50X, 342g de sacarosa (1M). Ajustar el pH a 6,8 con NaOH y añadir 6g agar. Autoclavar y luego añadir 100ml de glucosa 10X y 10ml de tartrato amónico 100X. 3.4.6 Watch Minimal Medium (WMM Aspergillus): Este medio se utilizó para la visualización de las proteínas etiquetadas en Aspergillus. El WMM está compuesto por (preparación para un litro): 1,28g KCl, 1,24g MgSO4· 7H2O, 0,92g tartrato amómico, 3,44g NaH2PO4, 1ml de elementos traza y 23,52ml de glicerol al 85%. Ajustar el pH a 5,5. En el caso de los mutantes auxótrofos Materiales y Métodos ! ! 146! para pyro, se añade piridoxina-HCl a una concentración final de 2,5µM. Para los mutantes pyrG suplementar el medio con 5mM de uridina y 5mM de uracilo. Para disolver el uracilo y la uridina se necesita calentar el agua donde se van a disolver y una vez disuelto añadir al medio. Este medio no se autoclavó porque precipitan las sales; así que una vez preparados se filtra. 3.5 Medios de cultivo para Saccharomyces cerevisiae: Las levaduras se cultivaron a 30°C durante diferentes tiempos dependiendo de la propósito del experimento. Los medios utilizados en el trabajo con levaduras fueron: -YPD: 1% [p/v] de extracto de levadura, 2% [p/v] de bactopeptona, 2% [p/v] de glucosa. Añadir 2% [p/v] de agar para medio sólido. -Medio SC mínimo: 0,17% [p/v] YNB sin NH4SO4 ni aminoácidos, NH4SO4 al 0,5% [p/v], glucosa al 2% [p/v]. Añadir 2% [p/v] de agar para medio sólido. Suplemento con aminoácidos si es necesario. 3.6 Medios de cultivo para Escherichia coli. El medio utilizado para el crecimiento y mantenimiento de las cepas de Escherichia coli fue el medio LB (Luria & Borrous, 1957) con los suplementos antibióticos apropiados. Los cultivos se realizan por inoculación de una única colonia en cultivos líquidos o sólidos y se cultivaron a 37°C durante 12 horas. Los medios utilizados están compuestos por: -Medio Luria-Bertani: 10 g de triptone, 5 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl se disolvieron secuencialmente en 950 ml de agua destilada, se llenaron hasta 1 litro y se ajustó el pH a 7,5 antes del autoclave. Los cultivos sólidos se suplementaron con agar al 2%[p/v]. -Stock ampicilina: 10% [p/v] de ampicilina sódica en agua destilada. Esterilizar por filtración y almacenar a -20ºC. Uso en medio LB a 0,01% [p/v]. -Stock kanamicina: 5% [p/v] de ampicilina sódica en agua destilada. Esterilizar por filtración y almacenar a -20ºC. Uso en medio LB a 0,005% [p/v]. Materiales y Métodos ! ! 147! 4. Aislamiento y purificación de ácidos nucleicos. 4.1 Extracción de ADN El ADN de los hongos utilizados en esta tesis se extrajo de micelios cultivados en medio o agar mínimos por dos métodos distintos. Para obtener ADN en alta concentración en Phycomyces se utilizó el método desarrollado por Weinkove (Weinkove et al., 1998) o para minipreparaciones se usó GenElute Plant Genomic DNA Miniprep kit (Sigma-Aldrich). Los ADN plasmídico se aislaron a partir de cultivos líquidos de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae cultivados durante 12 horas a 37ºC o 30ºC usando el kit GenElute Plasmid Miniprep (Sigma-Aldrich). Los cultivos de levadura se centrifugaron, se resuspendieron en 640 µl de solución de zimolasa y se incubaron a 37ºC durante 1 hora antes del aislamiento del plásmido. La solución de zimolasa contiene: 0.9 M sorbitol, 0.1 M EDTA pH 8, 0.01% [v/v] β-mercaptoetanol, 150 µg de zimolasa 20T. 4.2 Extracción de ARN. Aproximadamente 100mg de micelio se mezclaron con RLC Buffer (RNeasy Plant Mini kit-QUIAGEN), con 1,5 g de perlas de zirconio (0,5 mm de diámetro) y se sometieron a dos pulsos de 0,5 min en un homogeneizador celular (FastPrep-24, MP Biomedicals). Posteriormente se siguió el procedimiento del RNeasy Plant Mini kit- QUIAGEN. Las muestras de ARN fueron tratadas con DNAse I (USB) antes de su uso en los experimentos de RT-PCR cuantitativa. 5. Reacción en cadena de la polimerasa. 5.1 PCR convencional. La reacción de PCR convencional se hizo usando la polimerasa GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase (PROMEGA) mezclando: 1,5 µl de oligonucleótidos (10 µM), 1µl of dNTPs (10 mM de cada nucleótido), 10 µl de 5X Green GoTaq Flexi Buffer, 5 µl de MgCl2 25mM, 1,25 U de polimerasa y 1 µl ADN (10-50 ng) y añadir agua destilada hasta llegar a 50 µl . La reacción consistió en 1 ciclo de 3 minutos a 94ºC, 35 ciclos para la amplificación del ADN incluyendo 30s a 94ºC, 30s a la temperatura determinada para los pareja de cebadores, y una tiempo variable a 72ºC o 68ºC dependiendo de la longitud del producto de PCR, generalmente 1 minuto por cada kb. Tras estos ciclos, se Materiales y Métodos ! ! 148! añadió un ciclo de 5 minutos a 72ºC. La polimerasa GoTaq se ha utilizado para PCRs de comprobación de clonaciones. Para las PCRs realizadas en el Capítulo 1 para la localización del gen madC de Phycomyces se usó la polimerasa AmpliTaq DNA polymerase (Applied Biosystems). La mezcla para la PCR consistía en: 1,5 µl de oligonucleótidos (10 µM), 1µl of dNTPs (10 mM de cada nucleótido), 5 µl de 10X PCR Buffer con 15mM de MgCl2 25mM, 1,25 U de polimerasa y 1 µl ADN (10-50 ng) y añadir agua destilada hasta llegar a 50 µl . La reacción consistió en 1 ciclo de 3 minutos a 94ºC, 35 ciclos para la amplificación del ADN incluyendo 30s a 94ºC, 30s a la temperatura determinada para los pareja de cebadores, y una tiempo variable a 72ºC o 68ºC dependiendo de la longitud del producto de PCR, generalmente 1 minuto por cada kb. Tras estos ciclos, se añadió un ciclo de 5 minutos a 72ºC. Los productos de PCR utilizado para las clonaciones de la tesis se hicieron usando la polimerasa Expand High Fidelity PCR System (Roche) mezclando: 1,5 µl de oligonucleótidos (10 µM), 1µl of dNTPs (10 mM de cada nucleótido), 5 µl de Buffer 3, 5 µl de MgCl2 25mM, 1,25 U de polimerasa y 1 µl ADN (10-50 ng) y añadir agua destilada hasta llegar a 50 µl . La reacción consistió en 1 ciclo de 3 minutos a 94ºC, 35 ciclos para la amplificación del ADN incluyendo 30s a 94ºC, 30s a la temperatura determinada para los pareja de cebadores, y una tiempo variable a 72ºC o 68ºC dependiendo de la longitud del producto de PCR, generalmente 1 minuto por cada kb. Tras estos ciclos, se añadió un ciclo de 5 minutos a 72ºC. 5.2 RTPCR cuantitativa. Para los experimentos de expresión génica se realizó RT-PCR cuantitativa en un LightCycler 480 II (Roche) utilizando el Kit de RT-PCR PrimeScriptTM de One Step (Takara Bio Inc.), 0,2 µM de cada cebador y 50 ng de ARN en una reacción de 10 µl . La reacción consistió en 5 min a 42ºC, seguido por 10s a 95ºC, y luego 40 ciclos de amplificación de ADN (5s a 95ºC y 20s a 60ºC). Después de cada PCR se realizó análisis de la curva de fusión para mostrar la amplificación específica de segmentos de ADN único y la ausencia de ADN amplificado no específico. Las comparaciones de ambos protocolos mostraron consistencia y fiabilidad entre ambos métodos. La señal fluorescente obtenida para cada gen se normalizó a la señal fluorescente Materiales y Métodos ! ! 149! correspondiente obtenida con tub-2 (Neurospora crassa) y actA (Phycomyces blakesleeanus) para corregir los errores de muestreo. 6. Transformación de Escherichia coli. 6.1 Choque térmico. El método de choque térmico se utilizó para transformar células competentes de E. coli DH5α. Se mezclaron células competentes (50 µl) con la cantidad apropiada de ADN y se incubaron durante 10 minutos sobre hielo. Luego se incubaron durante 15 segundos a 42ºC y se pusieron inmediatamente en hielo durante 3 minutos. Se añadieron 1 ml de medio LB a las células y se incubaron durante 1 hora a 37ºC con agitación moderada. Después de este tiempo, se sembraron 100 µl de suspensión de células en una placa Petri con 25 ml de medio sólido LB con el antibiótico apropiado y el resto se centrifugó y el sedimento se extendió en una placa diferente. Las placas se cultivaron durante 12 horas a 37ºC. Este método se usó normalmente para amplificar vectores. 7. Transformación de Saccharomyces cerevisiae. La transformación de Saccharomyces cerevisiae se realizó siguiendo un protocolo modificado de (Gietz & Woods, 2002). Se inoculó una única colonia de la cepa FY834 en matraces de 100 ml con 25 ml de medio YPD y se cultivó durante 12 horas a 30ºC con agitación. A continuación, el cultivo se diluyó hasta 0,2 DO600 en 25 ml de YPD y se incubó a 30ºC hasta alcanzar 0,7 DO600. Las células se recuperaron y se lavaron con agua destilada por centrifugación. Las células se lavaron una vez con 500 µl de SOLUCIÓN-I (SLN-I) y finalmente se resuspendieron en 250 µl de SLN-I. Para cada transformación, se mezclaron 50 µl de suspensión celular, 120 ng de plásmido linealizado pRS426, 5 µl de cada flanco de PCR, 1 µl de ADN de esperma de salmón (100 ng / µl) y 300 µl de SOLUCIÓN II (SLN-II) con se mezcló con ayuda de la pipeta para incubarlo a 30ºC durante 30 minutos. Las células se sometieron entonces a choque térmico a 42ºC durante 15 minutos seguido de 3 minutos de incubación en hielo. Las levaduras se recuperaron y se lavaron con agua destilada por centrifugación, se resuspendieron sobre 1 ml de YPD y se incubaron durante al menos 1 hora a 30ºC con agitación. Las células finalmente se centrifugaron, se resuspendieron en 150 µl de agua destilada estéril y se extendieron sobre placas SC-URA. Las colonias individuales Materiales y Métodos ! ! 150! aparecerán en los siguientes 3-4 días y se verifican para la construcción deseada por PCR de las colonias. Este método se usa para la generación de los casetes que se van a usar para etiquetar genes en Neurospora crassa. Soluciones necesarias: -TE 10X: 0.1 M Tris-HCl pH 8, 0.01 M EDTA. -SLN-I: TE 1X, 0.1 M acetato de litio. -SLN-II: TE 1X, 0.1 M acetato de litio, 40 % [w/v] PEG 3500. 8. Transformación de Neurospora crassa. 8.1 Generación del casete para el etiquetado de genes. La generación de proteínas marcadas en Neurospora crassa se realizó siguiendo el método descrito por (Honda & Selker, 2009) con algunas modificaciones. Este método se basa en la generación de un casete de knock-in que permite la adición de una etiqueta en el C-terminal de la proteína. La generación de casetes de marcaje implica la generación de dos flancos de aproximadamente 1,2 kb cada uno, uno justo antes del codón de parada (5 ') y el otro después del codón de parada (3') en la región intergénica. Cada flanco se obtiene por PCR usando cebadores con una cola complementaria al fragmento marcador obtenido por digestión de plásmidos que contienen un enlazador de poliglicina antes del epítopo que es seguido por el marcador seleccionable hph para conferir resistencia a la higromicina. Los tres fragmentos (dos productos de PCR y un fragmento digerido lineal) y el plásmido linealizado pRS426 se usaron para fabricar los casetes de knock-in por recombinación en una cepa auxotrófica de S. cerevisiae (Oldenburg et al., 1997). Figura MM2: Generación de casetes de etiquetado knock-in por recombinación homóloga en levaduras. Modificado de (Ruger-Herreros, 2014). 1. Generación de insertos y digestión de los vectores para el etiquetado. 2. Recombinación homóloga en levaduras 3. Generación de casetes con el gen etiquetado. Materiales y Métodos ! ! 151! 8.2 Tranformación del etiquetado. La transformación de Neurospora crassa se realizó por electroporación (Colot et al., 2006). La cepa mutante Δmus-52::bar se creció para obtener conidios maduros que se cosecharon con sorbitol frío 1 M. El número de conidios se determinó contando en una cámara de Burker y alrededor de 108 conidios en un volumen de 40 µl de sorbitol 1 M se colocaron en una cubeta de electroporación con 5-10 µl de producto de PCR (0,2 a 1 µg) del casete. La electroporación se realizó con un instrumento BTX Electro Cell Manipulator (Modelo ECM 630) a 1500V, 600Ω y 25µF. Después del electro-pulso 1 ml de frío 1 M sorbitol se añadió de inmediato a la cubeta. Se mezcló una cantidad de 150 µl de la suspensión conidial con 850 µl de solución de regeneración y se incubó durante al menos 2 horas a 30ºC con agitación moderada. A continuación, la suspensión conidial se añadió a 5 ml de agar de regeneración y se extendió en placas de FGS suplementadas con extracto de levadura e higromicina. Los medios requeridos son: -Solución de recuperación: Vogel 1X, extracto de levadura al 2% [p/v]. -Agar de regeneración: 1X sales de Vogel, extracto de levadura al 2% [p/v], Sorbitol 1M 1%[p/v], agar, solución de FGS 1X, 300 µg/ml de higromicina B (Roche) -Medio mínimo para las transformaciones: 1X sales de Vogel, agar al 1,5% [p/v], solución 1X FGS, 300 µg/ml Higromicina B (Roche). 8.3 Transformación con el plásmido pMF272. Esta transformación fue utilizada para introducir el gen carC de Phycomyces en Neurospora (Capítulo 2). El plásmido pMF272 (Freitag et al., 2004) está diseñado para insertar el gen de interés contiguo al gen his-3 de N. crassa. La cepa mutante his-3 al-3 se creció en Vogel sólido con histidina (0,1 mg/ml) para obtener conidios maduros que se cosecharon con sorbitol frío 1 M. El número de conidios se determinó contando en una cámara de Burker y alrededor de 108 conidios en un volumen de 40 µl de sorbitol 1 M se colocaron en una cubeta de electroporación con 5-10 µl de producto de PCR (0,7 a 1 µg) del plásmido con el gen de interés. Antes de transformar se eliminó la resistencia a ampicilina mediante digestión con NdeI y DraIII para linearizar el plásmido. La electroporación se realizó con un instrumento BTX Electro Cell Manipulator (Modelo Materiales y Métodos ! ! 152! ECM 630) a 1500V, 600Ω y 25µF. Después del electro-pulso 1 ml de frío 1 M sorbitol se añadió de inmediato a la cubeta. Se mezcló y los conidios electroporados se repartieron en 5 placas de FGS (200µl por placa) y se incubó durante al menos 2 días a 34ºC. Posteriormente los transformantes obtenidos se pasaron de la placa de FGS a tubos de Vogel sólido inclinado. Este paso se realizó al menos tres veces para purificar los núcleos transformados. Los medios requeridos para este experimento están descritos en la secciones 3.2.2.1 y 3.2.2.3 de los Materiales y Métodos de esta tesis. 9. Proteínas. 9.1 Extracción de proteínas totales. Los micelios (100mg) se mezclaron diferentes volúmenes de tampón PEB que contenía inhibidores de proteasas y fosfatasas y se trituró con 1,5 g de perlas de zirconio (0,5 mm de diámetro), sometiendo la mezcla a dos pulsos de 0,5 min en un homogeneizador celular (FastPrep-24, MP Biomedicals). Después de triturar los micelios, los extractos crudos se centrifugaron a 13000 rpm y 4ºC. Los sobrenadantes se recogieron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su utilización. Las concentraciones de proteínas se midieron por espectrometría usando un instrumento Nanodrop (Abs 280 nm) o un ensayo de Bradford (Bradford, 1976). Las soluciones utilizadas son: -PEB: 50 mM HEPES pH 7.4, 10% [v/v] glicerol, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA. -Inhibidores de proteasas: leupeptina (1 µM), pepstatina (1 µM), and PMSF (50 µM). 9.2 Western blot. Las proteínas de lisados celulares totales, fracciones citoplasmáticas, nucleares o inmunoprecipitadas se sometieron a SDS-PAGE sobre geles de acrilamida: bisacrilamida (29:1) al 7,5% o 10%. Las muestras se resuspendieron en tampón Laemmli 1X y se hirvieron durante 5 minutos antes de cargar en geles. Las proteínas se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE usando el tampón 1X SDS-Running. Posteriormente, las proteínas se transfirieron a membranas de transferencia de nitrocelulosa (GE Healthcare). Como marcador de peso molecular se utilizaron las Precision PlusTM Standards All Blue de Bio-Rad. La carga igual se confirmó mediante membranas de tinción con solución de Ponceau S. Las membranas se lavaron durante 15 minutos antes de bloquear usando TBS 1X. El bloqueo se llevó a cabo utilizando una Materiales y Métodos ! ! 153! solución de bloqueo durante al menos 1 hora con agitación moderada a temperatura ambiente antes de la incubación con anticuerpos primarios. Los anticuerpos utilizados en esta tesis se detallan en la tabla TMM.3. Los anticuerpos secundarios utilizados se conjugaron con la peroxidasa de la planta Armoracia rusticana (rábano). La actividad de la peroxidasa se detectó usando quimioluminiscencia (ECL Prime Reagent GE Healthcare). Las soluciones utilizadas son: -Laemmli Buffer (4X): Tris-HCl 240 mM pH 6,8, SDS al 8% [p/v], glicerol al 40% [v/v], β-mercaptoetanol al 4% [p/v] Bromofenol azul. -Gel de acrilamida al 4% (stacking): 4% [p/v] bisacrilamida (29: 1), Tris-HCl 125 mM pH 6,8, SDS al 0,1% [p/v], APS al 10% [p/V], 0,2% [v/v] TEMED. -Gel de acrilamida al 10% (running): 7,5%, acrilamida al 10% [p/v]: bisacrilamida (29: 1), Tris-HCl 375 mM pH 8,8, SDS al 0,1% [p/v], 0,5% APS 10% [p/v], 0,2% [v/v]TEMED. -Tampón SDS-Running(10X): 0,4 M Tris base, 1,2 M Glicina, 1% [p/v] SDS. -Tampón de transferencia semi-seca: base de Tris 20 mM, glicina 150 mM, metanol al 20%[v/v],0,05%[P/v]SDS. -Solución Ponceau S: 0,1% [p/v] Ponceau S, 3% [p/v] TCA. -TBS (10X): NaCl 1,5 M, base Tris 33 mM. Ajustar a pH 7.5. -Solución de bloqueo: Leche desnatada al 5% [p/v] (Difco), TBS 1X. Tabla TMM.3. Anticuerpos usados en esta tesis: Anticuerpo Tipo Concentración Uso FLAG Monoclonal 1/10000 Western blot, IP TUB Monoclonal 1/1000 Western blot hH2B Policlonal 1/4000 Western blot WcoB Ubiquitina Policlonal Policlonal 1/1000, 1/100 1/1000 Western blot, IP Western blot 9.3 Tinción de geles de poliacrilamida. 9.3.1 Tinción Coomassie. Los geles de acrilamida se tiñeron usando solución de Coomassie durante 1 hora a temperatura ambiente. Para visualizar los geles de proteínas, a continuación, se