Carotenoides en agroalimentación y salud

1 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones Carotenoides en agroalimentación y salud Antonio J. Meléndez-Martínez Coordinador 2 Car otenoides en agr oalimentación y salud Primera edición: noviembre de 2017 Comité Editorial Dra. Lourdes Gómez Gómez Facultad de Farmacia/Instituto Botánico Universidad de Castilla-La Mancha, sede de Albacete Dr . Dámaso Hornero Méndez Instituto de la Grasa Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Dr . Antonio J. Meléndez-Martínez Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Dra. Begoña Olmedilla Alonso Instituto de Ciencia y T ecnología de Alimentos y Nutrición Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Dr . Antonio Pérez Gálvez Instituto de la Grasa Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Coordinador general: Antonio J. Meléndez-Martínez D.R. © Aguilar -Espinosa, Mar garita; Alcalde, María Jesús; Alonso, Gonzalo L.; Álvarez, Rocío; Angaman, Djédoux Maxime; Arhazem, Oussama; Ávalos, Javier; Bagur , María José; Benítez-González, Ana; Berman, Judit; Bonet, María Luisa; Boronat, Albert; Canas, Jose A.; Capell, T eresa; Cárdenas-Conejo, Y air; Carle, Reinhold; Cerda, Ariel; Chacón-Ordóñez, T ania; Christou, Paul; Cuéllar , Fabio A.; De Pourcq, Karel; Dias, Maria Da Graça; Esquivel, Patricia; Estévez-Santiago, Rocío; Farre, Gemma; Gallardo-Guerrero, Lourdes; Gámbaro, Adriana; Gandul-Rojas, Beatriz; García Romero, Josefa; García-Rodríguez, María del V alle; Garrido-Fernández, Juan; Garza-Caligaris, Luz Elena; Gavilán Bravo, Andrés; Ginés, Rafael; Godoy-Hernández, Gregorio; Gómez-Gómez, Lourdes; Hempel, Judith; Heredia, Francisco J.; Hernández-Gras, Francesc; Hornero Méndez, D.; Izquierdo, Marisol; Jarén-Galán, Manuel; Jiménez, Víctor M.; Lado, Joanna; Limón, M. Carmen; Lugo-Cervantes, Eugenia; Luque de Castro, Maria Dolores; Maldonado, Eliana M.; Mapelli-Brahm, Paula; Martínez Vázquez, Ana; Meléndez-Martínez, Antonio J.; Mellado- Ortega, Elena; Mercadante, Adriana Z.; Molina-Calle, María; Murillo, Enrique; Odorissi, Ana A.; Olmedilla-Alonso, Begoña; Ornelas-Paz, José de Jesús; Osorio, Coralia; Palou, Andreu; Pérez-Gálvez, Antonio; Ribot, Joan; Rivera-Madrid, Renata; Robaina, Lidia; Roca, María; Rodrigo, Maria Jesús; Rodríguez-Concepción, Manuel; Rubio-Moraga, Ángela; Ruiz-Sola, M. Águila; Saavedra, Gloria F .; Salinas, M. Rosario; Schweiggert, Ralf M.; Simpson, Kevin; Stange, Claudia; Stinco, Carla M.; V ar gas- Murga, Liliana; V icario, Isabel M.; Zacarías, Lorenzo; Zhu, Changfu; Zorrilla-Lopez, Uxue. Las opiniones, conceptos, tablas, gráficas, ilustraciones y fotografías que aparecen en cada uno de los capítulos son responsabilidad exclusiva de los autores. Las figuras que aparecen reproducidas en diferentes capítulos se han usado con permiso de sus autores. Prohibida la reproducción parcial o total de esta obra, por cualquier medio o método, sin autorización previa y por escrito de los titulares del copyright. Producción: Editorial T erracota, SA de CV / México Edición: Pilar T apia Realización: Jeanette Vázquez Gabriel Fotografías: Autores y Freeimages ISBN 978-84-15413-35-6 Distribución: RED TEMÁTICA IBERCAROT (referencia 1 12R T445) http://carotenoides.us.es PROGRAMA IBEROAMERICANO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA P ARA EL DESARROLLO – CYTED 3 Í ndice Pr ólogo Antonio J. Meléndez-Mar tínez Pr eface Delia B. Rodriguez-Amaya y George Britton 1. Car otenoides: estructura, pr opiedades y funciones Antonio J. Meléndez-Mar tínez 2. Consideraciones generales para el análisis de los car otenoides Antonio J. Meléndez-Mar tínez, Paula Mapelli-Brahm, Ana Benítez-González, Carla M. Stinco y Enrique Murillo 3. Análisis de car otenoides por cr omatografía líquida de alta r esolución Antonio Pér ez-Gálvez, Ana Augusta O. Xavier , Manuel Jarén-Galán, Antonio J. Meléndez-Mar tínez, Ana Benítez-González, Carla M. Stinco y Juan Garrido-Fer nández 4. Identificación de car otenoides Adriana Z. Mer cadante 5. Estrategias en metabolómica para el estudio de los car otenoides en plantas y su acción en el organismo humano María Dolor es Luque de Castro y María Molina-Calle 8 9 12 32 51 78 95 Í ndice 4 Í ndice 6. Aplicación de las medidas de espectr ometría visible y de color al análisis de car otenoides en alimentos Antonio J. Meléndez-Mar tínez, Isabel M. V icario y Francisco J. Heredia 7. Análisis sensorial de color Adriana Gámbar o 8. Estrategias computacionales para evaluar mecanismos de acción antirradical de car otenoides Ana Mar tínez V ázquez 9. Biosíntesis de car otenoides: consideraciones generales M. Águila Ruiz-Sola y Manuel Rodríguez-Concepción 10. Biosíntesis de car otenoides en zanahorias Ariel Cer da, Kevin Simpson y Claudia Stange 11. Biosíntesis y acumulación de car otenoides en el fruto de tomate Francesc Her nández-Gras, Kar el de Pourcq, Djédoux Maxime Angaman y Alber t Bor onat 12. Car otenoides en frutos cítricos: diversidad y biosíntesis Joanna Lado, Fabio A. Cuéllar , Lorenzo Zacarías y María Jesús Rodrigo 11 8 141 153 167 187 208 223 5 Í ndice 13. Biosíntesis de car otenoides en azafrán Oussama Ahrazem, Ángela Rubio-Moraga y Lour des Gómez-Gómez 14. A vances biotecnológicos para potenciar la pr oducción de car otenoides de Bixa or ellana (achiote) para su uso y apr ovechamiento agr oindustrial Renata Rivera-Madrid, Gr egorio Godoy-Her nández, Margarita Aguilar -Espinosa, Y air Cárdenas-Conejo, Luz Elena Garza-Caligaris y Eugenia Lugo-Cervantes 15. Biosíntesis de car otenoides en hongos Javier Á valos y M. Car men Limón 16. Ingeniería genética de la ruta biosintética de los car otenoides Judit Ber man, Uxue Zorrilla-Lopez, Gemma Farr é, T er esa Capell, Paul Christou y Changfu Zhu 17. Influencia de factor es ambientales, agr onómicos, genéticos y fisiológicos en el contenido de car otenoides en frutas y hor talizas Gloria F . Saavedra y Eliana M. Maldonado 18. T abla de contenido en car otenoides de alimentos iber oamericanos M. Graça Dias, Begoña Olmedilla-Alonso, Dámaso Hor ner o-Méndez, Adriana Z Mer cadante, Coralia Osorio, Liliana V argas-Murga y Antonio J. Meléndez-Mar tínez 247 260 280 312 341 354 6 Í ndice 19. Estimación de la ingesta de car otenoides en la dieta Begoña Olmedilla-Alonso y Rocío Estévez-Santiago 20. Metabolismo de car otenoides en el fruto del olivo y sus modificaciones en el pr ocesado industrial María Roca, Lour des Gallardo-Guerr er o y Beatriz Gandul-Rojas 21. Car otenoides en cer eales Elena Mellado-Or tega y Dámaso Hor ner o-Méndez 22. Car otenoides hidr ofílicos del azafrán María del V alle Gar cía-Rodríguez, María José Bagur , M. Rosario Salinas y Gonzalo L. Alonso 23. Car otenoides en piensos para acuicultura y calidad de peces de cultivo Lidia Esther Robaina Robaina, Josefa Gar cía Romero, Rafael Ginés Ruiz y Marisol Izquier do López 24. Car otenoides y ganadería Rocío Álvar ez y María Jesús Alcalde 25. For mas de deposición de car otenoides en alimentos vegetales y sus posibles implicaciones en su bioaccesibilidad y biodisponibilidad Patricia Esquivel, V íctor M. Jiménez, T ania Chacón-Or dóñez, Judith Hempel, Ralf M. Schweigger t y Reinhold Carle 430 444 472 501 522 537 557 7 Í ndice 26. Biodisponibilidad de car otenoides, factor es que la deter minan y métodos de estimación Antonio J. Meléndez-Mar tínez, Antonio Pér ez-Gálvez, María Roca, Rocío Estévez-Santiago, Begoña Olmedilla-Alonso, Adriana Z. Mer cadante y José de Jesús Or nelas-Paz 27. El modelo de asimilación por difusión facilitada de car otenoides. T ranspor tador es y metabolismo Antonio Pér ez-Gálvez y María Roca 28. Car otenoides y salud humana: potencial efecto anti-obesidad M. Luisa Bonet, Joan Ribot, José A. Canas y Andr eu Palou 29. Consideraciones para el uso de los car otenoides en los alimentos funcionales Andr és Gavilán Bravo 30. Seguridad de los car otenoides: estudios toxicológicos, r eacciones adversas e interacciones con fár macos Liliana V argas-Murga Sobr e los autor es 574 609 628 670 687 704 8 P rólogo P rólogo Los car otenoides son compuestos especiales; si bien es común referirse a ellos como pigmentos, lo cier to es que son compuestos de gran versatilidad e impor tancia en la naturaleza. Más específicamente, son de gran inter és en agroalimentación y salud. Así, por ejemplo, son pigmentos naturales y por lo tanto tienen un impor tante papel en l a elección de alimentos por par te de los consumidor es. Asimismo, algunos de ellos son pr ecursores de la vitamina A. Sin embargo, que cada vez exista más inter és en los car otenoides en este contexto se debe en gran par te a muchos estudios de distinta naturaleza que indican que pueden pr oporcionar beneficios para la salud. Su inter és en alimentación funcional es por lo tanto indudable. En este libr o se refleja la experiencia en car otenoides de un gran númer o de pr ofesionales de la región iber oamericana. En conjunto, se ofr ece una visión general de la investigación sobr e estos compuestos en agroalimentación y salud. Los autor es son miembr os de la red IBERCAROT (http://car otenoides.us.es), que tiene entr e sus objetivos confor mar una r ed estable y funcional de profesionales que aúnen esfuerzos en pos de identificar nuevas fuentes de car otenoides de interés nutricional, mejorar su pr oducción y aumentar el valor de los productos que los contengan. Me gustaría agradecer a todas y cada una de las personas que han contribuido de una u otra for ma a que este libr o sea una realidad. T odos esperamos que sea de ayuda para personas inter esadas en los temas desarrollados. Gracias especialmente al Pr ograma Iberoamericano de Ciencia y T ecnología para el Desarrollo (CYTED, http:// www .cyted.org/) que, con su apoyo económico a la r ed IBERCAROT , ha hecho posible que varias decenas de equipos interaccionen en tor no a temas de inter és común para contribuir al desarr ollo a distintos niveles de la región iber oamericana. Antonio J. Meléndez-Martínez 9 P ref ace P ref ace Natur e has endowed Ibero-American countries with a r emarkable diversity of rich car otenoid sources. With this inspiring backgr ound, Iber o-American r esear chers have i ntensely investigated car otenoids for about five decades, contributing substantially to curr ent knowledge on these fascinating compounds. Ibero-American r esear ch on car otenoids spans a wide range of topics, including development and validation of analytical methods, deter mination of the car otenoid composition of Ibero-American foods, genetic and envir onmental factors affecting composition, biosynthesis and i ts r egulation, carotenogenesis during fruit ripening, ef fects of home and industrial pr ocessing, kinetics and mechanisms of degradation, factors influencing oxidation, antioxidant activity , development of carotenoid-rich food pr oducts, bioaccessibility and bioavailability , biotechnological production, micr oencapsulation and nanoencapsulation, car otenoids as food and feed colorants and precursors of ar oma compounds, health-pr omoting effects. Iber o-American resear chers have come and gone, but str ong car otenoid r esear ch has gone on. The new br eed of Ibero-American car otenoid r esear chers, organized into a network under the leadership of Antonio J. Meléndez-Mar tínez, will sur ely keep and str engthen the tradition. Delia B. Rodriguez-Amaya 16 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones f igura 4. Estructuras químicas de algunos carotenoides. anteraxantina (10 d.e.c.) β -caroteno (1 1 d.e.c.) cantaxantina (13 d.e.c.) γ -caroteno (1 1 d.e.c.) capsantina (1 1 d.e.c.) ζ -caroteno (7 d.e.c.) α -caroteno (10 d.e.c.) semi- β -carotenona (1 1 d.e.c.) HO OH O O O OH HO O O O 17 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones f igura 4. Estructuras químicas de algunos carotenoides. β-criptoxantina (1 1 d .e.c.) lactucaxantina (9 d.e.c.) crocetina (9 d.e.c.) licopeno (1 1 d.e.c.) decaprenoxantina (9 d.e.c.) luteína (10 d.e.c.) fitoeno (3 d.e.c.) fitoflueno (5 d.e.c.) neoxantina (9 d.e.c.) neurosporeno (9 d.e.c.) HO HOOC COOH OH OH HO OH OH HO OH OH HO C O 18 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones f igura 4. Estructuras químicas de algunos carotenoides. Ésteres, glucósidos y carotenoproteínas Las xantofilas pueden estar pr esentes en las fuentes en las que se encuentran libr es o esterificadas. Así, en pimientos, patatas o papas, mango, cítricos y otras fuentes las xantofilas se pueden encontrar esterificadas con ácidos grasos (Br eithaupt y Bamedi, 2002; Hor ner o-Méndez y Mínguez-Mosquera, 2000; Murillo et al., 2013; Philip, Chen y Nelson, 1988; Pott, Br eithaupt y Carle, 2003;). Asimismo, existen car otenoides asociados con azúcar es en otras fuentes; así, la crocetina (figura 4) puede encontrarse asociada con azúcar es en estigmas de azafrán y frutos de gar denia (V an Calster en et al ., 1997; Pfister et al., 1996). Por otra par te, los car otenoides pueden encontrarse también for mando complejos hidr osolubles de gran estabilidad con pr oteínas (carotenopr oteínas), lipopr oteínas o glucopr oteínas. Estos complejos pueden encontarse en inver tebrados (Bhosale y Ber nstein, 2007; Cheesman, Lee y Zagalsky , 1967; Goodwin, 1980b). Isómeros espaciales Pueden existir asimismo distintos isómer os geométricos ( cis/ trans o, más corr ectamente, Z/E ) de carotenoides. No todos los isómer os cis que podrían preveerse teóricamente existen, ya que, debido sobr e todo a impedimentos estéricos, sólo algunos son estables (Britton, 1995a; W eedon y Moss, 1995). Nor malmente los car otenoides naturales se encuentran en su mayoría como isómer os todo- trans (todo- E ), que suelen ser más estables. No obstante, varios estudios indican que algunos isómer os cis podrían ser más estables que los corr espondientes peridinina (9 d.e.c.) violaxantina (9 d.e.c.) rodoxantina (14 d.e.c.) zeaxantina (1 1 d.e.c.) HO O O O C HO OCOCH 3 O O HO HO OH OH O O 19 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones f igura 5. Estructuras químicas de algunos isómeros geométricos del β-caroteno. (15 Z )-β-caroteno (todo- E )-β-caroteno (9Z)-β-caroteno (13 Z )-β-caroteno 20 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones todo- E en algunos car otenos acíclicos, como licopeno, fitoeno y fitoflueno (Chasse et al., 2001; Meléndez-Mar tínez et al., 2014). En cualquier caso, es común encontrar cantidades impor tantes de isómer os cis (isómeros Z ) en fuentes naturales. Algunos ejemplos son el fitoeno, pr esente fundamentalmente como (15Z)-fitoeno en organismos car otenogénicos (Than et al. , 1972), la (9’ Z )-neoxantina (pr esente en tejidos fotosintéticos de todas las plantas y muchas algas) (Strand et al. , 2000) y algunos isómer os de los epoxicarotenoides violaxantina y anteraxantina (pr esentes en naranjas) (Meléndez-Mar tínez et al. , 2005; Meléndez-Mar tínez et al. , 2007a). En r elación con la pr esencia de isómeros Z en alimentos u otras fuentes es siempr e impor tante tener en cuenta que, en algunos casos, pueden ser ar tefactos analíticos o haberse for mado como consecuencia de tratamientos tecnológicos o culinarios (Rodríguez-Amaya, 1997; Schieber y Carle, 2005). Como se puede observar en la figura 5, los distintos isómer os geométricos de un mismo car otenoide tienen for mas y tamaños muy difer entes. La diferenciación entr e distintos isómer os geométricos de car otenoides es impor tante porque existen evidencias de que en algunos casos podría haber difer encias en r elación con su biodisponibilidad, reactividad, especificidad por enzimas, etc. (Böhm et al ., 2002; Hu et al. , 2006; Parr y , Babiano, y Horgan, 1990; Stahl et al. , 1992). Por otra par te, muchos car otenoides naturales poseen centros quirales, por lo que pueden existir diversos isómer os ópticos de cada uno de ellos. Un ejemplo típico es la zeaxantina (figura 6) (Britton, Liaaen-Jensen y Pfander , 2004). f igura 6. Estructuras químicas de isómeros ópticos de la zeaxantina. (3 R -3’ R )-zeaxantina (3 S -3’ S )-zeaxantina meso -zeaxantina ((3 R -3’ S )-zeaxantina) 21 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones Nomenclatura Además de la nomenclatura tradicional de los car otenoides, que suele hacer r eferencia a la fuente de la que se aislar on por primera vez, también se puede usar una nomenclatura semi-sistemática, que tiene la ventaja de que pr oporciona infor mación estructural. En esta nomenclatura se consideran las dos mitades de la molécula del compuesto, y éste se nombra como derivado del car oteno correspondiente. Para ello se hace r eferencia a los grupos terminales de éste mediante letras griegas. Asimismo se usan númer os, prefijos y sufijos para indicar la pr esencia de sustituyentes, cambios en el nivel de hidr ogenación, centros quirales, etc. (W eedon y Moss, 1995). Algunos ejemplos de nombr es semi-sistemáticos de car otenoides se muestran en la tabla 1. Sus estructuras están r epresentadas en la figura 4. P roPiedades Solubilidad Las gran mayoría de los car otenoides son insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos, como acetona, metanol, hexano y éter dietílico, entr e muchos otros. Por otra parte, los car otenoides ácidos pueden for mar sales solubles en agua por tratatamiento con una base. La esterificación de xantófilas va a modificar sus características, de for ma que la asociación con ácidos grasos aumentará su lipofilicidad. Por el contrario, si las xantófilas se encuentran asociadas con azúcar es, aumentará su hidr ofilicidad. Asimismo, las carotenopr oteínas son solubles en agua y muy estables. Debido a su carácter hidr ofóbico, los car otenoides in vivo se suelen localizar nor malmente en ambientes lipófilos, como por ejemplo en membranas (Britton, 1983; 1992; Britton, 1995 ab; Rodríguez-Amaya, 2001; Schiedt y Liaaen-Jensen, 1995 ). Absorción de luz Debido a la pr esencia del cromófor o de dobles enlaces conjugados, los car otenoides (con pocas excepciones) absorben luz UV -visible. Normalmente aparecen tr es máximos de absor ción. Las longitudes de onda a las que aparecen ( λ máx ) dependen del númer o de dobles enlaces conjugados y del disolvente empleado para medir el espectr o (Britton, 1995b). Con independencia del disolvente usado, los valor es de λ máx aumentan a medida que lo hace la longitud del cr omóforo, como se puede observar en el cuadr o 2. Además, se observa que el efecto de este incr emento se reduce al aumentar la extensión del cr omóforo. Los dobles enlaces no conjugados no afectan significativamente al espectr o. Nombr e tradicional Nombr e semi-sistemático β-Caroteno β,β-caroteno Fitoeno 7,8,1 1,12,7’,8’,1 1’,12’-octahidro-ψ, ψ-caroteno β-Criptoxantina β,β-caroten-3-ol Neoxantina 5’,6’-epoxi-6,7-didehidro-5,6,5’,6’- tetrahidro- β,β-caroteno-3,5,3’-triol Capsantina 3,3’-dihidroxi-β,κ-caroten-6’-ona Crocetina 8,8’-diapocaroteno-8,8’-ácido dioico Fuente: Adaptado de Rodríguez-Amaya (2001). t abla 1. Nombres comunes y semi-sistemáticos de diversos carotenoides 22 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones ondas superior es (Britton y Y oung, 1993; Rodríguez-Amaya, 2001). Sobr e el efecto del entor no molecular en la localización de la longitud de onda máxima ( λ máx ) es bien conocido que la energía de transición electr ónica responsable de la banda de absor ción principal del espectro depende del índice de r efracción del disolvente, de for ma que al aumentar éste, se pr oducen desplazamientos del máximo a longitudes de onda más altas (cambios batocr ómicos). Por lo tanto, los máximos de absor ción de cualquier carotenoide en disolventes como hexano, éter de petr óleo, etanol, éter dietílico y acetonitrilo son prácticamente idénticos, aunque se observan desplazamientos batocr ómicos en los espectros r ealizados en disolventes como acetona (2-6 nm), clor ofor mo, cloruro de metileno (10- 20 nm), piridina, benceno, tolueno (18-24 nm) y disulfur o de carbono (30-40 nm), entr e otros. Aunque la gran mayoría de los car otenoides no son solubles en agua, este disolvente puede tener un efecto impor tante en los espectr os de los car otenoides disueltos en disolventes miscibles con agua. Más concr etamente, para algunos carotenoides, cuando el contenido de agua está dentr o del intervalo entre 30-50%, se han descrito impor tantes disminuciones en la absorbancia al λ máx y la aparición de un nuevo e intenso máximo de absor ción en la r egión del UV cercano. Estos efectos se han atribuido a las interacciones entr e cromófor os debidas a la agr egación de las moléculas de car otenoides causadas por la presencia de altas cantidades de agua. Por otr o lado, los carotenoides se encuentran in vivo en un entor no lipídico o pr oteico. Así, pr esentan máximos de absorción a longitudes de onda alr ededor de 10 nm más altas que la λ máx en hexano. Por otra par te, cuando los car otenoides están for mando complejos con pr oteínas, se observan impor tantes desplazamientos batocr ómicos. Como ejemplo, el carotenoide r ojo astaxantina La extensión del sistema de d.e.c. a un anillo, como ocurr e por ejemplo en los anillos β , extiende el cr omóforo. En este caso, el anillo no es coplanar con la cadena poliénica lineal central y las λ máx apar ecen a longitudes de onda menores en comparación con los car otenoides no cíclicos con el mismo número de dobles enlaces conjugados. Esto se observa claramente al comparar las λ máx de licopeno (11 d.e.c., car otenoide acíclico), γ -car oteno (11 d.e.c., uno de ellos en el anillo ter minal) y β -car oteno (11 d.e.c., dos en los anillos ter minales) (cuadro 2). Es evidente que los grupos carbonílicos conjugados con el sistema de d.e.c. también aumentan la longitud del cr omóforo. En general, la pr esencia de un grupo carbonílico conjugado en un anillo desplaza unos 10 nm a longitudes de onda apr oximadamente superiores los máximos de absor ción. Si, en cambio, dicho grupo se encuentra en la cadena poliénica central, el desplazamiento es de unos 30 nm a longitudes de Car otenoide Número de d.e.c. (d.e.c. en anillos) λ máx en éter de petróleo (nm) Fitoeno 3 276, 286, 297 Fitoflueno 5 331, 348, 367 ξ-Caroteno 7 378, 400, 425 Neurosporeno 9 414, 439, 467 Licopeno 11 444, 470, 502 γ-Caroteno 1 1 (1) 437, 462, 494 β-Caroteno 1 1 (2) 425, 449, 476 Fuente: Adaptado de Rodríguez-Amaya (2001). t abla 2. Efecto de la longitud del cromóforo en los máximos de absorción de carotenoides acíclicos 23 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones impedimentos estéricos, como consecuencia de los cuales los dobles enlaces pr esentes en los anillos no son coplanares con los de la cadena poliénica central. Esto se manifiesta en el espectr o en una pérdida de estructura fina. Como ejemplo, en car otenoides con dos anillos β (como β -caroteno), en los que hay un doble enlace conjugado en cada anillo, la primera de las bandas de absor ción es más bien una inflexión. Por otra par te, cuando existen grupos funcionales carbonílicos conjugados se pr oduce una pronunciada pér dida de estructura fina. De hecho, en algunos casos, el espectr o de estos compuestos (como cantaxantina) se asemeja a una curva simétrica (Britton, 1995b; Mínguez-Mosquera, 1997; Rodríguez- Amaya, 2001). Así, la estructura fina disminuye de la siguiente for ma: -car oteno > -car oteno > cantaxantina, como puede observarse en la figura 8. El espectr o de absorción de isómer os Z pr esenta algunas difer encias con respecto al de los corr espondientes isómer os todo- E . Por ejemplo, las λ máx apar ecen a longitudes de onda pr esenta un máximo en acetona a 480 nm, mientras que la car otenoproteina α -crustacianina, que contiene astaxantina, lo hace a 630 nm y es azulada (Britton 1983, Britton y Y oung 1993; Britton, 1995 ab; Britton 1992; Hoischen et al ., 1998). La for ma general del espectr o de absorción de los car otenoides y la nitidez de las bandas de absor ción (lo que comúnmente se denomina estructura fina) dependen fundamentalmente del grado de planaridad del sistema de d.e.c. La estructura fina suele expr esarse como %III/II (figura 7). En los car otenoides acíclicos (como el ζ -caroteno) o cíclicos en los que el sistema de d.e.c. no se extiende a los anillos (como la aur oxantina) el cromófor o puede adoptar una conformación casi completamente planar y en sus espectr os aparecen máximos y mínimos de absor ción per fectamente definidos, es decir muestran una una elevada estructura fina. Cuando el sistema de d.e.c. se extiende a los anillos se pr oducen f igura 7. Representación de la estructura fina espectral. 24 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones esto se r ecomienda que las medidas de absorbancia estén dentr o del intervalo 0.2-0.8. se define como la absorbancia teórica de una disolución de concentración 1% (p/v) en una cubeta de 1 cm de paso de luz, mientras que ε se define como la absorbancia teórica de una disolución de concentración 1 molar . Ambos coeficientes están r elacionados de acuerdo con la siguiente fórmula (Britton, Liaaen-Jensen y Pfander , 2004): ε = ( × peso molecular)/10 [1] En r elación con esto, es impor tante reparar en el hecho de que, teóricamente, el ε es característico del cr omóforo e independiente del peso molecular del car otenoide. En este sentido, podría considerarse el mismo para distintos car otenoides con idéntico cromófor o, como por ejemplo 2-6 nm menor es en el caso de isómeros mono- Z e incluso apr oximadamente 10 nm menores en el caso de di- Z . Por otra par te, la nitidez de las bandas de absor ción disminuye (menor estructura fina) y apar ece una nueva en la región ultravioleta, apr oximadamente a 142 nm por debajo de la correspondiente al ter cer máximo de absorción en la r egión visible en hexano. Cuanto más cer cano esté el doble enlace Z al centro de la molécula, mayor es la intensidad de esta banda (Britton, 1995 ab; Zechmeister , 1962) (figura 9). Los car otenoides en disolución, obedecen la ley de Lamber t-Beer , de ahí que se puedan cuantificar espectr ofotométricamente. Para ello, se relaciona la absorbancia de dicha disolución con una deter minada λ con un valor estándar , ya sea el coeficiente de absorción específico ( ) o el coeficiente de absor ción molar ( ε ). En relación con f igura 8. Espectros visibles de los carotenoides -caroteno, -caroteno y cantaxantina en acetona. f igura 9. Representación de la intensidad de la banda cis del espectro con respecto a la de la banda principal de absorción. 25 1. C arotenoides : estruCtura , propiedades y funCiones y a la longitud de onda usados, y el volumen de la disolución en mL y el coeficiente de absor ción específico en el disolvente y a la longitud de onda usados para la medida. Color Los car otenoides absorben generalmente luz azul y violeta (apr ox. 400-500 nm), de for ma que exhiben coloraciones amarillentas, anaranjadas o r ojizas. La relación existente entr e la estructura química de los car otenoides típicos de la dieta y su color , medido objetivamente y expresado de acuer do con los parámetr os del espacio de color CIELAB, es bien conocida (Meléndez-Mar tínez et al. , 2007b). Es importante tener en cuenta que el color depende de otr os factores además de la estructura química, como por ejemplo la concentración, la agr egación de moléculas o la interacción con otras moléculas. Analíticamente, el color de los car otenoides es de gran ayuda. Así, un cambio de color durante la manipulación de muestras puede indicar que se han pr oducido transfor maciones. Asimismo, el color per mite monitor ear su separación mediante técnicas cr omatográficas clásicas, como cromatografía en capa fina o en columna. Por otra par te, la medida instrumental del color se ha pr opuesto como una herramienta analítica inter esante para la rápida cuantificación de carotenoides en diversas fuentes, además de para, obviamente, evaluar objetivamente dicho atributo, que está muy r elacionado con la aceptabilidad de los pr oductos (Arias et al. , 2000; Humphries, Graham y Mar es 2004; Meléndez-Mar tínez et al. , 2011; Moyano et al. , 2008; Ruiz et al. , 2005; Stinco et al. , 2013). Entr e las ventajas que ofr ecen las medidas instrumentales de color se encuetran la rapidez, la facilidad, la nula o escasa pr eparación de la muestra necesaria en muchos casos, la versatilidad, la por tabilidad y la posibilidad de automatización, entr e otras. β -car oteno y zeaxantina. En el caso del coeficiente de absor ción específico, los valores estarían r elacionados por sus pesos molecular es (Britton, Liaaen-Jensen y Pfander , 2004): (zeaxantina) = ( β -car oteno) × (536/568) [2] Los valor es de los coeficientes de absorción, generalmente , de distintos car otenoides en varios disolventes y las longitudes de onda a las que deben r ealizarse las medidas de absorbancia se pueden encontrar tabulados en la literatura especializada (Britton, 1995b; Davies, 1976; Mínguez-Mosquera, 1997; Rodríguez-Amaya, 2001). Debido a que la deter minación experimental de dichos valor es lleva asociadas cier tas dificultades, no es extraño encontrar algunas discr epancias en las tablas, siendo ésta una fuente impor tante de err ores de cuantificación. Por otra parte, cuando no se ha deter minado el para el car otenoide de interés, o bien se quier e deter minar el contenido total de carotenoides de un extracto, se suele usar un valor genérico de 2500 (Britton y Y oung, 1993). Los coeficientes de absor ción de los isómeros Z son claramente menor es que los de sus isómeros todo- E . No obstante, pocos se han calculado experimentalmente (Britton, Liaaen-Jensen y Pfander , 2004). En definitiva, para calcular la concentración de un deter minado car otenoide se puede aplicar la siguiente fór mula (Rodríguez- Amaya, 2001): x = ( A × y × 10 6 )/ × 100 [3] donde x es el peso del car otenoide en μg, A la absorbancia medida experimentalmente de la disolución en el disolvente 32 2. c onsideraciones generales P ara el análisis de los carotenoides Antonio J. Meléndez-Martínez, Paula Mapelli-Brahm, Ana Benítez-González, Carla M. Stinco, Enrique Murillo C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides i ntroducción El sistema de dobles enlaces conjugados de los car otenoides es el principal r esponsable de la inestabilidad de estos compuestos y de la mayoría de sus pr opiedades (Britton, 1995). Es necesario tomar una serie de precauciones para minimizar transfor maciones no deseadas (como isomerizaciones y degradaciones) de los mismos durante su manejo en el laboratorio, ya que éstas conducirían a r esultados err óneos. A continuación se compila, resume y organiza información propor cionada en diversos textos (Britton, 1991; Kimura y Rodríguez-Amaya, 1999; Meléndez-Mar tínez, V icario y Heredia, 2007; Meléndez-Martínez et al., 2014; Mercadante, 2007; Mínguez- Mosquera, 1997; Rodríguez-Amaya, 2001; Schiedt y Liaaen-Jensen, 1995), la cual es impor tante considerar para el trabajo con car otenoides en el laboratorio. Más infor mación práctica sobr e cómo evitar error es analíticos comunes puede encontrarse en una guía de r eferencia (Rodríguez-Amaya, 2001). C apítulo 2 33 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides P recauciones generales durante el análisis . f act ores a considerar Algunas de las principales r ecomendaciones a tener en cuenta para evitar la transfor mación no deseada de car otenoides durante su manejo son (Rodríguez-Amaya, 2001; Schiedt y Liaaen-Jensen, 1995): 1) llevar a cabo el análisis en el menor tiempo posible e idealmente de for ma continua, evitando interrupciones; 2) evitar la exposición dir ecta de las muestras a la luz; para eso se puede mantener el ár ea de trabajo a oscuras o con luz tenue, cubrir las muestras o usar r ecipientes opacos; 3) evitar calentamientos excesivos; se r ecomienda, en la medida de lo posible, el uso de disolventes de bajo punto de ebullición y evaporar a temperaturas por debajo de 40 ºC; 4) utilizar disolventes de gran pur eza, con especial atención a la ausencia de per óxidos y de ácidos; 5) para minimizar oxidaciones se debe desplazar , siempre que sea posible, el oxígeno de los r ecipientes que contengan carotenoides; esto puede hacerse sustituyendo el air e por nitrógeno o argón o mediante la aplicación de vacío, y 6) si los extractos no se van a analizar inmediatamente, éstos deben guar darse en el congelador , a una temperatura de –20 ºC o preferiblemente inferior , al abrigo de la luz y en ausencia de oxígeno. Es clave asimismo tener en cuenta que los car otenoides son especialmente inestables una vez que se extraen de la matriz donde se encuentran. Por otra par te, para pr evenir posibles inter fer encias en espectrometría de masas (MS), y también en r esonancia magnética nuclear (NMR), se desaconseja el uso de materiales plásticos, papel de filtr o y homogeneizadores tipo turrax en las etapas pr e-cromatográficas. Se detalla a continuación cómo afectan diversos factor es y sustancias químicas a los car otenoides, así como precauciones generales para evitar transfor maciones indeseadas (Britton, 1991; Kimura y Rodríguez-Amaya, 1999; Meléndez-Mar tínez et al., 2014; Mer cadante, 2007; Rodríguez-Amaya, 2001; Schiedt y Liaaen-Jensen, 1995). Oxidación El oxígeno, sobr e todo en combinación con la luz y el calor , es un factor muy destructivo. Incluso en muestras congeladas la pr esencia de trazas de oxígeno y otros agentes oxidantes pueden causar la degradación de los car otenoides. Por eso es impor tante trabajar de la for ma más rápida y continua posible, para que los extractos estén expuestos al air e el menor tiempo posible. Por otra par te, mantener los disolventes de extracción en frío puede ser una manera eficaz de r educir pérdidas por oxidación. Si los extractos no van a analizarse de inmediato, deben almacenarse en r ecipientes bien cerrados y el oxígeno debe ser desplazado con atmósferas de argón o nitr ógeno. Otra estrategia para r educir pérdidas por oxidación consiste en el uso de antioxidantes, como butilhidr oxitolueno (BHT) o pir ogalol. Éstos pueden añadirse durante la desintegración de la muestra que contiene los car otenoides, en los disolventes de extracción, durante la saponificación e incluso en los componentes de la fase móvil cr omatográfica. Luz Además de acelerar las r eacciones de oxidación, la luz puede favor ecer la isomerización geométrica ( cis-trans ) de los car otenoides e incluso su fotodestrucción. El área de trabajo debe estar pr otegida de la luz directa del sol, de for ma que la iluminación debe ser tenue. Los r ecipientes que contengan car otenoides se deben proteger de la luz cubriéndolos de manera apr opiada, por ejemplo con papel oscur o o de aluminio o bien emplear dispositivos adecuados. 34 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides En países muy calur osos es recomendable trabajar en las zonas más fr escas del laboratorio y , en su caso, usar el aire acondicionado o un ventilador para mantener la temperatura ambiente en tor no a los 25 ºC. Para concentrar extractos de car otenoides en rotavapor es u otr os aparatos la temperatura debe mantenerse siempr e por debajo de 40 ºC. Ácidos Los ácidos pueden favor ecer la descomposición, deshidratación e isomerización de los car otenoides. Para evitar estas transfor maciones se r ecomienda evitar el trabajo con ácidos fuer tes cer ca de las áreas donde se manipulen los car otenoides. Además, los disolventes a usar no deben contener ácidos. Las trazas de HCl en el clor ofor mo son difíciles de eliminar por lo que es r ecomendable sustituir este disolvente en la medida de lo posible por diclor ometano (DCM). Debe tenerse especial cuidado con los car otenoides La rápida manipulación de las muestras y la pr otección contra la luz son especialmente impor tantes en los extractos que contengan clor ofilas (por ejemplo, extractos de tejidos fotosintéticos). Las clor ofilas son fotosensibilizadores y pueden acelerar las transfor maciones de los car otenoides presentes originalmente en la matriz. Para pr oteger los carotenoides de la luz de las lámparas fluor escentes se pueden usar fundas de policarbonato. Estos pr otectores absorben la radiación de longitudes de onda de 375 a 390 nm e incluso más cor tas. En cualquier caso, no deben excluirse las pr ecauciones indicadas anterior mente. Calor Los car otenoides son compuestos ter molábiles; el calor favor ece su oxidación y las isomerizaciones cis-trans. Asimismo, a temperaturas muy elevadas, los car otenoides pueden fragmentarse. Se aconseja trabajar en ambientes fr escos y sólo calentar la muestra cuando sea imprescindible. f igura 1. Isomerización del grupo 5,6-epóxido (izquierda) a 5,8-furanoide (derecha). 35 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides f igura 2. Estructuras químicas de la violaxantina (carotenoide con grupos 5,6-epóxidos) y sus derivados con grupos 5,8-furanoides (luteoxantina y auroxantina). 5,6-epóxidos (como violaxantina y neoxantina, pr esentes en tejidos fotosintéticos), ya que se isomerizan a sus isómer os 5,8-furanoides (luteoxantina y aur oxantina en el caso de violaxantina y neocr omo en el caso de neoxantina) incluso en pr esencia de trazas de ácidos (figuras 1 y 2). Cuando se r ompe la integridad celular de alimentos que contienen car otenoides 5,6-epóxido (por ejemplo, durante homogenizaciones, exprimidos o extracciones) debe pr ocederse al análisis rápido de la muestra para evitar el contacto de dichos car otenoides con los ácidos liberados por el pr opio alimento. Además, durante la extracción, se pueden añadir bases débiles como NaHCO 3 , MgCO 3 o CaCO 3 (1 g/10 g muestra) para neutralizar los ácidos. La for mación de car otenoides 5,8-furanoides a par tir de 5,6-epóxidos se pr oduce incluso en muestras congeladas, como por ejemplo en el caso de los zumos o jugos de naranja (Meléndez-Mar tínez et al., 2008). Bases Es impor tante tener en cuenta que, a pesar de que muchos car otenoides son bastante estables en medio básico (Kimura, Rodríguez-Amaya y Godoy , 1990; Rodríguez-Amaya et al., 1988), la saponificación puede generar ar tefactos y pr omover la degradación de algunos car otenoides (Deli, Matus y Szabolcs, 1992; Ittah, Kanner y Granit, 1993; Mínguez- Mosquera y Pér ez-Gálvez, 1998; Müller , 1997; Oliver , Palou y Pons, 1998). Los car otenoides con grupos hidroxilos alílicos y grupos carbonilos, como la astaxantina, son muy pr opensos violaxantina auroxantina luteoxantina 36 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides de mayor tamaño deben cor tarse en cuar tos longitudinales siguiendo sus ejes de simetría. Posterior mente se seleccionan, mezclan y homogeneizan los tr ozos opuestos. Los vegetales foliáceos nor malmente deben ser tr oceados de for ma previa a su homogeneización (Mer cadante y Rodríguez-Amaya, 1991). En el caso de que la muestra se vaya a estudiar tanto en crudo como una vez sometida a algún pr oceso de cocinado, debe dividirse en dos fracciones homogéneas para que las par tes estudiada en ambos casos sean r epresentativas y comparables (Granado et al., 1992). En el caso de muestras comer ciales que hayan sido sometidas a procesado, se pueden tomar muestras al azar de un mismo lote, que luego se mezclan y homogeneizan antes del análisis (Mer cadante, 2007; Rodríguez-Amaya et al., 2008). En el caso de que las muestras de laboratorio no se vayan a extraer de inmediato es necesario almacenarlas tomando una serie de pr ecauciones. Se recomienda liofilizar y luego almacenar a –20 ºC o incluso mejor a –80 ºC. Es impor tante tomar en cuenta que en el caso de tener que almacenar las muestras, siempr e que sea posible, su homogeneización debe posponerse hasta que ter mine el periodo de almacenamiento para evitar transfor maciones no deseadas. El pr oceso de rotura de los tejidos puede liberar enzimas (como las lipoxigenasas y per oxidasas, que favorecen la oxidación) y ácidos pr esentes en las muestras. Asimismo, durante el descongelado pueden pr oducirse reacciones de degradación. Para r educirlas se r ecomienda llevar a cabo la descongelación a temperaturas de r efrigeración (Mercadante, 2007; Rodríguez-Amaya, 2001; Schiedt y Liaaen-Jensen, 1995). a la oxidación en pr esencia de álcali y aire. Schiedt, Bischof y Glinz (1993) desarr ollaron un método para llevar a cabo la saponificación de muestras con estos car otenoides evitando transfor maciones indeseadas de los mismos. Por otra par te, los car otenoides carbonílicos pueden sufrir condensación aldólica en medio básico en pr esencia de acetona (Meléndez-Mar tínez, V icario y Heredia, 2007; Schiedt y Liaaen-Jensen, 1995) por lo que se debe pr oceder a la eliminación completa de la acetona antes de llevar a cabo la saponificación si la muestra contiene estos car otenoides. m uestreo Infor mación detallada sobr e cómo realizar un buen muestr eo de alimentos puede encontrarse en otr os textos (Mercadante, 2007; Rodríguez-Amaya y Kimura, 2004). Es muy impor tante anotar , siempre que sea posible, toda la información de inter és de la muestra, como datos sobre variedades, estado de maduración, estación, origen geográfico, par te analizada, métodos de pr ocesado industrial, métodos de procesado en el laboratorio, método de cocinado, mar ca o lote (Mercadante, 2007; Rodríguez-Amaya y Kimura, 2004). Una metodología general es la descrita por Mer cadante, que aconseja la toma al azar de unos 2 kg de pr oducto fresco o 3-5 envases de pr oducto procesado del mismo lote (Mer cadante, 2007). Una vez que la muestra se encuentra en el laboratorio, las par tes no comestibles suelen eliminarse, a no ser que su análisis sea inter esante para comparaciones u otros pr opósitos. La muestra que generalmente llega al laboratorio es muy grande, por lo que debe ser r educida en tamaño y homogeneizada con cuidado de mantener siempr e la r epresentatividad. Alimentos vegetales pequeños pueden homogeneizarse fácilmente al licuarlos, mientras que los 37 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides qué momento se ha alcanzado la extracción completa de todos los car otenoides de interés de la muestra. Para ello, en ensayos pr evios se pueden analizar por separado las fracciones obtenidas durante las distintas tandas de extracción, para deter minar en cuál de ellas se ha dejado de extraer car otenoides. Las hojas y otras matrices de difícil penetración suelen r equerir maceraciones durante 15 minutos como mínimo para suavizar las par edes celulares. Para favor ecer la r otura de los tejidos de estas matrices se puede añadir celita. En el caso de frutas o ver duras blandas y sin hojas se pueden usar homogeneizador es, que per miten la disgregación y mezcla de manera rápida y eficiente (Rodríguez-Amaya, 2001; Schiedt y Liaaen-Jensen, 1995). Para mejorar la extracción de algunas muestras, como alimentos extruidos o aceites, se puede llevar a cabo una digestión enzimática pr evia (Lietz y Henr y , 1997; Ríos y Mer cadante, 2004; Biehler et al., 2012). Para pr evenir las oxidaciones, especialmente cuando no se pueda trabajar bajo atmósfera iner te o cuando el análisis se alarga, se suelen añadir al medio de extracción antioxidantes como pir ogalol, ascorbato de sodio, BHT o palmitato de ascorbilo (Müller , 1997; Oliver y Palou, 2000; T ee y Lim, 1991). Además, se pueden añadir bases débiles como carbonato de calcio, carbonato de magnesio o bicarbonato de sodio (1 g/10 g de muestra) al medio de extracción para neutralizar los ácidos liberados (Har t y Scott, 1995), como ya se ha comentado. Otra medida pr eventiva para evitar la degradación de los car otenoides es trabajar en frío, añadiendo hielo seco o trabajando con disolventes enfriados pr eviamente. Los ester oles que suelen extraerse junto con los carotenoides pueden eliminarse al mantener el extracto disuelto en éter de P asos Precroma tográficos Extracción Uno de los mayor es problemas asociados con el pr oceso de extracción en el análisis cuantitativo de car otenoides es que no siempr e es fácil conseguir su extracción completa. Por otra par te, debido a la gran diversidad de polaridades que pr esentan los carotenoides, no existe un método estándar para la extracción de los mismos (Mínguez-Mosquera, 1997; Rodríguez-Amaya, 2001). Precauciones generales durante la extracción Muchos pr otocolos de extracción de carotenoides constan con fr ecuencia de tres pasos. El primer o suele ser la trituración o r otura de las muestras; con eso se desintegran los tejidos de las mismas y se facilita la liberación de los car otenoides durante la extracción. El segundo, la homogeneización en pr esencia del disolvente de extracción, que se puede llevar a cabo de distintas for mas; por ejemplo, se pueden usar homogeneizador es, agitadores mecánicos o mortero y pistilo. En el caso de que se usen molinos para obtener tamaños de par tícula muy pequeños (que facilitan la extracción), debe contr olarse que la temperatura no aumente mucho. Por último, se lleva a cabo la extracción. En muchos casos los pr ocesos de r otura de los tejidos, homogeneización y extracción suelen hacerse de for ma simultánea. Durante la extracción se plantea una situación de compr omiso, ya que el pr oceso debe realizarse en el menor tiempo posible para evitar transfor maciones indeseadas per o, a la vez, el disolvente y los car otenoides deben estar en contacto el tiempo suficiente para asegurar la completa extracción de éstos. Para optimizar el tiempo de extracción es impor tante deter minar en 38 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides extracto de car otenoides. Un aspecto a tener en cuenta para elegir el disolvente final al que transferimos los car otenoides es su densidad r elativa al agua, ya que dependiendo de la metodología de extracción elegida (por ejemplo, la clásica o micr oextracciones) podría convenir que el extracto de car otenoides quedara por encima o por debajo de la fase acuosa (Meléndez-Mar tínez et al., 2014). Los car otenoides presentan polaridades muy diversas, por lo que no todos serán igual de solubles en un disolvente deter minado. En general los car otenos como el licopeno y el β -car oteno, son más solubles en disolventes poco polares o no polar es como el hexano o el éter de petróleo (EP). Las xantofilas lo son en disolventes más polar es como el etanol, el metanol y la acetona. Para conseguir una buena extracción de todos los car otenoides presentes en una muestra está muy extendido el uso de mezclas de disolventes. Por ejemplo, el hexano y el EP suelen mezclarse con metanol, etanol o acetona. El diclor ometano (DCM) es un excelente disolvente de car otenoides que también puede usarse en estas combinaciones. Así, mezclas comunes son EP:acetona, hexano:acetona, hexano:etanol, hexano:acetona:etanol, DCM:metanol, tetrahidr ofurano (THF):metanol. Antes de usar una deter minada mezcla hay que asegurarse de que los disolventes sean miscibles entr e sí y compatibles con el posterior sistema de análisis, generalmente cr omatográfico (Meléndez-Mar tínez et al., 2014; Mer cadante, 2007; Rodríguez- Amaya, 2001). Existen cier tos car otenoides hidrofílicos, como la cr ocetina, que se encuentra en los estigmas de Cr ocus sativus y en los frutos de Gar denia jasminoides. Para su extracción se requier e el uso de disolventes o mezclas tales como agua, metanol, etanol, etanol:agua (1:1) o metanol:acetona (Pfister et al., 1996). petr óleo (PE) a –10 °C y bajo atmosfera iner te durante la noche. Cuando han pr ecipitado pueden eliminarse por centrifugación o filtración (Britton y Y oung, 1993). Elección de los disolventes de extracción Para tratar de conseguir la extracción completa de los car otenoides y evitar transfor maciones no deseadas de los mismos es indispensable elegir corr ectamente el disolvente a usar durante la extracción. En la tabla 1 se muestran algunas pr opiedades y características de disolventes comúnmente usados en la extracción de car otenoides. Para la extracción de car otenoides de muestras que contienen mucha agua, es decir , la situación en la mayoría de los alimentos, se deben usar en primer lugar disolventes orgánicos miscibles en agua como el THF , la acetona, el metanol o el etanol para asegurar la penetración del disolvente en la muestra. Las muestras secas o liofilizadas pueden extraerse con disolventes inmiscibles en agua, per o suele ser más eficiente la r ehidratación previa (con tiempos de r ehidratación variables) y luego continuar la extracción con disolventes miscibles en agua (Meléndez-Mar tínez et al., 2014; Mínguez- Mosquera, 1997; Rodríguez-Amaya, 2001). Los disolventes desnaturalizan las pr oteínas, liberando los carotenoides que puedan encontrarse ligados a ellas. Los car otenoides se transfier en después a disolventes orgánicos más apolares (hexano, éter de petr óleo o éter dietílico). La transferencia se facilita por la adición de agua o solución acuosa de NaCl (6- 10%). Es impor tante evitar la for mación de emulsiones, lo que afectaría negativamente la extracción de los car otenoides; para ello, es r ecomendable que la propor ción agua-disolvente polar - disolvente más apolar , sea aproximadamente 1:1:1. Por último, el disolvente polar pasa a la fase acuosa y los car otenoides pasan el disolvente más apolar . Al final se concentra el 39 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides t abla 1. Propiedades de disolventes comunes usados en la extracción de carotenoides Disolvente Polaridad PE (ºC) V entajas Desventajas AC Polar 56 Penetra bien en matrices alimentarias. Facilita partición a un disolvente apolar . Barato. Disuelve muy bien carotenos y xantofilas. THF Polaridad media 66 Disuelve muy bien carotenos y xantofilas. Acumula peróxidos. ED Poco polar 35 Disuelve muy bien carotenos y xantofilas. Acumula peróxidos. Riesgo de incendio. DCM Polar 40 Fácil evaporación. Riesgo de incendio. HX No polar 69 Buen disolvente para carotenos. Neurotóxico. No muy apropiado para alimentos ricos en xantofilas (hojas). BC No polar 80 Cancerígeno. ME Polar 65 Penetra muy bien en las matrices alimentarias. ET Polar 79 Penetra muy bien en las matrices alimentarias. Poco riesgo para la salud. AE Polaridad media 77 CL Poco polar 61 Disuelve muy bien el licopeno. Posibles trazas de ácidos y etanol. Neurotóxico. EP No polar 35-60 Buen disolvente para carotenos. Equivalente al hexano. TL No polar 111 Fuentes: Britton (1991), Craft y Soares (1992), Royal Society of Chemistry (2014). AC: acetona; THF: tetrahidrofurano; ED: éter dietílico; DCM: diclorometa- no; HX: hexano; BC: benceno; ME: metanol; ET : etanol; AE: acetato de etilo; CL: cloroformo; EP: éter de petróleo; TL: tolueno 40 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides Saponificación Muchos alimentos, sobr e todo las frutas, contienen xantofilas esterificadas con ácidos grasos. Cada una podría estar esterificada con uno o más ácidos de grasos de for ma que el análisis por cr omatografía líquida de alta eficacia (HPLC) de esta mezcla de compuestos no siempr e es fácil de interpretar , al apar ecer muchos picos cromatográficos escasamente r esueltos (figura 3). En la figura 3, corr espondiente a cromatogramas de extractos de jugo de naranja se observa que, en el caso del extracto no saponificado, apar ecen muchos picos que eluyen muy tar de y están poco separados. La inmensa mayoría de dichos picos corr esponden a distintos ésteres de las xantofilas pr esentes en el producto. Al saponificar , el cr omatograma se simplifica mucho, aunque se pier de una infor mación muy valiosa del estado nativo de los car otenoides en la muestra. Así, antes de saponificar , los n ésteres de una misma xantofila darían lugar a n picos cr omatográficos, mientras que tras la saponificación sólo darían lugar a uno. Cier tos disolventes pueden acumular trazas de per óxidos, como el éter dietílico (ED) y el THF , y ácidos que pr omueven la degradación de los car otenoides, por eso se recomienda el uso de disolventes de alta pur eza o la purificación de aquellos de menor calidad. Para eliminar las trazas de per óxido se puede llevar a cabo la destilación del disolvente sobr e polvo de hierro r educido o hidruro de calcio. T ambién es impor tante tener en cuenta que, aunque algunos disolventes se suministran con BHT como estabilizante, tienen un tiempo límite para usarse (Meléndez-Mar tínez et al., 2014; Rodríguez-Amaya, 2001; Schiedt y Liaaen-Jensen, 1995). La elección de disolventes de puntos de ebullición bajos es una buena opción para acelerar la concentración de los extractos y evitar calentamientos excesivos. Disolventes de bajo punto de ebullición son, por ejemplo, el DCM (40 ºC apr oximadamente) o el ED (35 ºC aproximadamente). Entr e las fracciones de EP se elegirán aquellas con menor es puntos de ebullición (35-60 ºC). Para la evaporación de los últimos r estos de disolvente o extractos de pequeño volumen se puede usar una corriente de gas iner te (nitr ógeno o argón) (Meléndez- Mar tínez et al., 2014; Rodríguez-Amaya, 2001; Schiedt y Liaaen-Jensen, 1995). Otr o aspecto a considerar es la toxicidad del disolvente. Siempr e que sea posible se escogerán los menos nocivos para la salud. Así, hexano, benceno y clor ofor mo pueden ser sustituidos por EP , tolueno y DCM r espectivamente (Britton y Y oung, 1993; Meléndez-Mar tínez et al., 2014; Rodríguez- Amaya, 2001). Independientemente del disolvente elegido, todas las operaciones de extracción deben llevarse a cabo en una campana de extracción con las medidas de seguridad adecuadas. f igura 3. Cromatogramas a 450 nm correspondientes a un extracto de jugo de naranja antes (azul) y después de saponificar (rojo). 41 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides Sin embargo la saponificación (hidr ólisis alcalina) también pr esenta cier tos inconvenientes. Así, la reacción aumenta el tiempo total de análisis y aumenta la posibilidad de que se pr oduzcan ar tefactos y degradaciones. Por lo tanto, debe incluirse en el análisis sólo cuando sea esencial. Por ejemplo, no es necesaria en muestras como tomates, zanahorias u hojas ver des, ya que los carotenoides en ellas están esencialmente libr es, es decir , no esterificados (Mercadante y Rodríguez- Amaya, 1989; Rodríguez-Amaya y T avar es, 1992). En el caso de los tejidos fotosintéticos, las clor ofilas que se extraen con los car otenoides pueden separarse fácilmente por cromatografía líquida. Aunque los car otenoides provitamínicos (pr ovitamina A) son bastante estables a la saponificación, los niveles de otr os, como luteína, violaxantina o neoxantina, pueden r educirse considerablemente durante la r eacción de saponificación y en los lavados posterior es (Khachik, Beecher y Whitaker , 1986; Meléndez-Mar tínez et al., 2014; Mínguez-Mosquera, 1997; Rodríguez-Amaya, 2001; Rodríguez-Amaya et al., 1988). Asimismo, como ya se ha comentado, otr os carotenoides pueden modificarse estructuralmente. Un aspecto muy impor tante desde un punto de vista analítico, y al que a menudo se le pr esta poca atención, es la r ecuperación de carotenoides después de la saponificación. Esta etapa es crucial, de hecho par te de las pér didas atribuidas a la saponificación podrían deberse a una incorr ecta r ecuperación de carotenoides tras la r eacción. En esta etapa es r ecomendable seleccionar el disolvente no polar con más afinidad por los car otenoides que resultan de la saponificación y evitar la for mación de emulsiones, difíciles de r omper . Cuando la muestra contiene principalmente car otenos, se logran buenas r ecuperaciones al añadir hexano o éter de petróleo, o bien una mezcla éter dietílico:hexano (1:1). Sin embargo, cuando el extracto contiene niveles altos de car otenoides con Por otra par te los lípidos pr esentes en algunas muestras pueden modificar los tiempos de r etención de los carotenoides y acor tar la vida útil de la columna cr omatográfica. Estos inconvenientes pueden r esolverse si se lleva a cabo una saponificación pr evia para hidrolizar los éster es o eliminar los lípidos y clor ofilas (Meléndez-Mar tínez et al., 2014; Mínguez- Mosquera, 1997; Rodríguez-Amaya, 2001). Las clor ofilas pr esentes en vegetales y frutas se extraen junto con los car otenoides, por su similar solubilidad en los disolventes de extracción. En la estructura de las clor ofilas (figura 4) se encuentra esterificado el fitol, un alcohol de 20 carbonos que las hace solubles en disolventes no polar es. Cuando se elimina el grupo fitol, por ejemplo por hidr ólisis alcalina, las clorofilas se hacen más hidr ofílicas y pasan a la fase acuosa, separándose de los car otenoides (Mínguez-Mosquera, 1997). Las soluciones de hidr óxido de sodio o de potasio (típicamente al 5-10%) en metanol o etanol son las más utilizadas para saponificar . Cuando los carotenoides son poco solubles en alcohol o el extracto es alto en grasa, es r ecomendable utilizar un co-disolvente, como éter dietílico, diclor ometano o THF . f igura 4. Estructuras de las clorofilas a y b . 48 2. C onsideraCiones generales p ara el análisis de los Carotenoides Deli, J., Matus, Z. y Szabolcs, J. 1992. 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REFERENCIAS 51 a nálisis de carotenoides Por croma tografÍa lÍquida de al t a resolución Antonio Pérez-Gálvez, Ana Augusta O. Xavier , Manuel Jarén-Galán, Antonio J. Meléndez-Martínez, Ana Benítez-González, Carla M. Stinco, Juan Garrido-Fernández a nálisis de Carotenoides por Croma t ografía líquida de al t a resoluCión i ntroducción Aspectos generales de la cromatografía líquida de alta resolución La cr omatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica de separación que utiliza los principios básicos de la cr omatografía líquida —separación basada en la interacción del analito entr e una fase líquida móvil y una fase estacionaria— y emplea instrumentos avanzados: inyector , bomba, columna y detector . En este tipo de cr omatografía, el líquido que compone la fase móvil se bombea mecánicamente a través de una columna que contiene la fase estacionaria. Así, un equipo de HPLC consiste en bomba mecánica, contr olador y detector , equipos entre los que se inter cala la columna cr omatográfica en la que se realiza la separación y el conjunto está contr olado por un software de gestión del sistema cr omatográfico, adquisición de datos y posterior análisis de los mismos (W eston y Brown, 1997). C apítulo 3 52 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución Antes de la aparición de la cr omatografía líquida de alta r esolución, a mediados de la década de 1970, la separación de los pigmentos car otenoides se realizaba por cr omatografía en columna abier ta (OCC) y por cr omatografía en capa fina (TLC). Una de las primeras memorias sobr e la aplicación de separación por HPLC a los pigmentos car otenoides data de 1971 y la r ealizaron Wheaton y Stewart, separando car otenos y xantofilas de extractos cítricos mediante el uso de cr omatografía de flujo continuo en una columna de fase nor mal compuesta por óxido de magnesio. Unos años más tar de, Fiksdahl, Mor tensen y Liaaen-Jensen (1978) estudiar on las aplicaciones y limitaciones de HPLC acoplada a espectr ometría de UV -visible en la separación de car otenoides, xantofilas, isómer os cis-trans , y diastereoisómer os, empleando columnas r ellenas de sílice y usando diferentes gradientes de acetona, hexano y metanol como fase móvil. En la actualidad la técnica de HPLC es el método de elección más popular para la separación, análisis y cuantificación de car otenoides al presentar muchas ventajas en comparación con otras técnicas cr omatográficas, sobre todo en términos de r esolución, separación, tiempo necesario de análisis y la cantidad r equerida de muestra (Mínguez-Mosquera, 1997). Así, el tiempo de análisis necesario, incluyendo la pr eparación de la muestra y la pr opia separación, per mite la evaluación de un gran númer o de muestras y replicados en un tiempo cor to. El acoplamiento de equipos de HPLC con difer entes tipos de detector es facilita la tarea de identificación de estos compuestos; la detección se hace mediante espectr ometría UV -visible (longitud de onda y sistemas de matriz de diodos individuales) o espectr ometría de masas, que son los sistemas empleados hoy (Schoefs, 2004). Características físicas y químicas de los carotenoides y su relación con la cromatografía líquida de alta resolución Los car otenoides tienen como estructura básica un esqueleto tetraterpeno con 40 átomos de carbono, que consta de ocho unidades de isopr eno enlazadas en un patrón de cabeza a cola con una simetría inver tida en el centr o de la molécula (Britton, 1995). Esta estructura puede modificarse por hidr ogenación, deshidrogenación, ciclación y oxidación, dando lugar a estructuras difer enciadas que comprenden más de 700 car otenoides, cifra de los compuestos que han sido identificados hasta el momento en la naturaleza (Davies, 1976). Su característica estructural principal es el sistema de dobles enlaces conjugados, donde los electr ones están deslocalizados eficientemente. Este cr omóforo es r esponsable de la capacidad de los car otenoides para absorber luz en la r egión visible, por lo que la detección mediante espectrometría de UV -visible de diodos en línea es particular mente adecuada. Además, el cr omóforo de los car otenoides hace que los isómer os todo- trans sean moléculas rígidas y lineales, lo que deriva en una pr opiedad impor tante para el resultado de las interacciones con las fases estacionarias en HPLC (Khachik, 2009). Además del compor tamiento cr omatográfico de los car otenoides en relación con el númer o de dobles enlaces conjugados en el cr omóforo, se deben considerar la naturaleza de los grupos ter minales y el tamaño de la moléculas (Davies, 1976). La influencia de los dobles enlaces se ilustra bien por adsor ción mediante afinidad de los carotenoides acíclicos con fase nor mal, eluyendo en la siguiente secuencia: fitoeno, fitoflueno, ζ -car oteno, licopeno y neurospor eno (Davies, 1976; Rodríguez-Amaya, 2001; figura 1). La ciclación, en general, 53 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución f igura 1. Estructuras químicas de algunos carotenoides. anteraxantina (10 d.e.c.) β -caroteno (1 1 d.e.c.) cantaxantina (13 d.e.c.) γ -caroteno (1 1 d.e.c.) capsantina (1 1 d.e.c.) ζ -caroteno (7 d.e.c.) α -caroteno (10 d.e.c.) semi- β -carotenona (1 1 d.e.c.) HO OH O O O OH HO O O O 54 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución f igura 1. Estructuras químicas de algunos carotenoides. β-criptoxantina (1 1 d .e.c.) lactucaxantina (9 d.e.c.) crocetina (9 d.e.c.) licopeno (1 1 d.e.c.) decaprenoxantina (9 d.e.c.) luteína (10 d.e.c.) fitoeno (3 d.e.c.) fitoflueno (5 d.e.c.) neoxantina (9 d.e.c.) neurosporeno (9 d.e.c.) HO HOOC COOH OH OH HO OH OH HO OH OH HO C O 55 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución P reP aración de la muestra P ara el análisis croma t ográfico Procedimientos analíticos generales La alta susceptibilidad a la degradación y la isomerización inher ente a la estructura química de los carotenoides r equier e pr ecauciones especiales durante su análisis con el fin de evitar los efectos deletér eos del oxígeno, la temperatura, la luz y los ácidos. Aunque no existe un pr otocolo nor malizado para la pr eparación de muestras para el análisis de los car otenoides, ya que el per fil y la concentración de estos pigmentos varía ampliamente de acuer do con la matriz que los contiene, sí se puede indicar un pr ocedimiento típico a seguir en la pr eparación de la muestra para su análisis por HPLC: muestr eo y preparación de la muestra, extracción, partición por disolventes compatibles con cr omatografía, en algunos r educe la afinidad de adsorción y , por lo tanto, β -car oteno (con dos anillos tipo β ) se absorbe más débilmente que γ -car oteno (un anillo β ). Por otr o lado, la presencia de grupos oxigenados aumenta la polaridad y por lo tanto la adsor ción de los car otenoides, y la magnitud de este incremento depende del tipo, númer o y ubicación de esos grupos (Rodríguez-Amaya, 2001). En fase r eversa, el orden de elución es prácticamente el or den inverso que se observa en fase nor mal de elución. Las xantofilas, al ser más polar es eluyen antes que los car otenos, con las xantofilas di-hidroxiladas (tales como luteína y zeaxantina), eluyendo primer o, seguidas por las mono- hidr oxiladas. Los carotenos, a su vez, no siguen un or den de elución estándar , y su compor tamiento cromatográfico depende del tipo de fase estacionaria (monómer o o polímero) utilizada y la composición de la fase móvil (Rodríguez-Amaya, 2001). f igura 1. Estructuras químicas de algunos carotenoides. peridinina (9 d.e.c.) violaxantina (9 d.e.c.) rodoxantina (14 d.e.c.) zeaxantina (1 1 d.e.c.) HO O O O C HO OCOCH 3 O O HO HO OH OH O O 56 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución Derivación de grupos funcionales Mientras que la espectr ometría de UV -visible r evela la naturaleza del cr omóforo de los car otenoides y el compor tamiento cr omatográfico propor ciona cierta infor mación sobr e su polaridad relativa, hay algunas pruebas químicas bastante simples que pr oporcionan información acerca de la naturaleza, la estructura y la posición de algunos grupos funcionales (Davies, 1976). Las pruebas más utilizadas se discuten br evemente a continuación, sobre la base de pr ocedimientos descritos por Eugster (1995) y Mínguez- Mosquera, Hor ner o-Méndez y Pérez-Gálvez (2002). a) Grupo 5,6-epóxido: r eordenamiento furanoide La prueba se basa en la modificación de aquella transfor mación en el cr omóforo r esultante de la pr esencia de un grupo 5,6-epóxido a 5,8-epóxido en medio ácido (figura 2), lo que r esulta en un desplazamiento hipsocrómico del espectr o casos saponificación y lavado, concentración y la evaporación del disolvente (Mer cadante, 2008; Rodríguez-Amaya, 2001) hasta obtener un extracto seco listo para su dilución y análisis. En el capítulo 2 se ofr ece infor mación detallada de las consideraciones generales para el análisis de car otenoides. Saponificación de muestras con alto contenido graso o con ésteres de carotenoides La etapa de hidr ólisis alcalina, también conocida como saponificación, se aplica para la eliminación de los lípidos en las muestras con alto contenido graso y la hidr ólisis de los éster es de carotenoides pr esentes habitualmente en tejidos de origen vegetal (Mer cadante, 2008; Rodríguez-Amaya, 2010). Como ya se ha indicado en el capítulo 2, se trata de una etapa con ventajas e inconvenientes, por lo que siempr e debe considerarse si es r ealmente necesaria. f igura 2. Isomerización del grupo 5,6-epóxido (izquierda) a 5,8-furanoide (derecha). 57 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución HPLC, y el númer o de productos formados sugiere el númer o de grupos hidr oxilo que han sido acetilados. La aparición de un derivado monoacetilado indica la pr esencia de un solo grupo hidr oxilo. En el caso de tener dos grupos hidroxilo en la estructura original, se pueden observar uno (monoacetilado) o dos (diacetilado) derivados como pr oductos de reacción, dependiendo de si la posición de los grupos hidr oxilo es simétrica o no. d) Ensayo de grupo hidr oxilo alílico La pr esencia del grupo funcional se detecta a través de una r eacción de deshidratación que introduce un doble enlace adicional en el cr omóforo del car otenoide. Este aumento de los dobles enlaces del cr omóforo pr oduce un desplazamiento batocr ómico (a mayor longitud de onda) de 10 a 16 nm que se puede observar en el espectr o UV -visible. La r eacción consiste en la adición de HCl diluido a una solución del car otenoide en clor ofor mo. e lement os crÍticos en HPLC P ara la seP aración de carotenoides Eluyentes en la fase móvil Las pr opiedades más impor tantes que se deben observar e influyen en la elección de la fase móvil son la viscosidad y la polaridad que, si es posible, debe ser baja. La fase móvil debe ser compatible con el método de detección, en especial para los car otenoides que absorben en la zona del UV , y que la mezcla óptima de elución sea completamente clara e incolora (Pfander , 1995). T ambién es necesario que los car otenoides sean completamente solubles en la fase móvil utilizada para la separación cr omatográfica. Los carotenoides en general son de absor ción entre 15 y 20 nm. La r eacción puede llevarse a cabo dir ectamente en la cubeta del espectrofotómetr o mediante la adición de varias gotas de HCl 0.1 N y medir los cambios en el espectr o de absorción UV -visible, in situ, o bien mediante TLC tras pulverizar la banda cr omatográfica de inter és con HCl una vez completada la separación cr omatográfica. En este caso, la aparición de un color azul característico identifica la pr esencia del grupo 5,6-epóxido: los diepóxidos se r evelan mediante un color azul oscuro y los monoepóxidos con un color ver de azulado. La prueba también puede r ealizarse inyectando en el sistema de HPLC un extracto antes y después de acidificar con el HCl diluido. b) Carbonilo: r educción de aldehídos y cetonas Los r eactivos LiAlH 4 o NaBH 4 se utilizan en general como agentes de r educción de grupos carbonilo para for mar los corr espondientes alcoholes. Los aldehídos se reducen a alcoholes primarios y las cetonas a alcoholes secundarios. La prueba se r ealiza mediante la adición de NaBH 4 a la solución car otenoide, que se mantiene en condiciones de refrigeración y en la oscuridad durante tr es horas. Si hay algún grupo carbonilo conjugado con cadena polienoica, se observará tanto un desplazamiento hipsocr ómico del máximo de absorción y un aumento considerable en la estructura fina del espectr o UV - visible. c) Ensayo de acetilación de grupos hidr oxilo La prueba se basa en la conversión de alcoholes a éster es, que son menos polar es, pero que tienen el mismo espectr o de absor ción UV -visible. La r eacción se produce mediante la adición de anhídrido acético en piridina a la solución car otenoide. La mezcla se mantiene en la oscuridad durante 12 horas y la r eacción se detiene mediante la adición de agua. El seguimiento de esta r eacción se lleva a cabo por TLC o 64 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución t abla 1. Ejemplos de metodologías para la separación por HPLC de carotenoides en frutas y verduras. Características de la columna Condiciones cr omatográficas Matriz Car otenoides determinados Método de detección Refer encia C 18 Nova-pak 300 × 4,0 mm, 4 μm Pre-columna: no se aplica. Modo de elución: gradiente. Eluyentes: acetonitrilo/acetato de etilo/agua. Gradiente: 88:2:10 para 85:15:0 en 15 min, manteniendo por 30 min. Flujo: 1 mL/min. T emperatura de la columna: 29 ºC. Acerola ( Malpighia punicifolia L.) Neocromo+neoxantina, violaxantina, luteoxantina, luteina, zeaxantina, 5,6,5’,6’-diepoxi-β- criptoxantina, 5,6-epoxi-β- criptoxantina, 5,8-epoxi-β- criptoxantina, zeinoxantina, β-criptoxantina, 5,6,5’,6’-diepoxi-β-caroteno, 5,8-epoxi-β-caroteno, α- e β-caroteno. DAD De Rosso y Mercadante (2005). C 18 Spherisorb ODS-2 250 × 4,6 mm, 5 μm Pre-columna: no se aplica. Modo de elución: gradiente. Eluyente A: agua/ reactivo ion par/metanol (1:1:8). Reactivo ion par: 0,05 mmol/L acetato tetrabutilamonio y 1 mol/L acetato de amonio en agua. Eluyente B: acetona/metanol (1:1). Gradiente: De 75% de A y 25% de B para 25% de A y 75% de B en 8 min, manteniendo por 2 min, 10% de A y 90% de B a los 18 min, 100% de B en 23 min, volviendo a 75% de A y 25% de B a los 30 min. Flujo 2 mL/min. Aceitunas ( Olea eur opea L.) var . Hojiblanca, Arbequina e Picual Luteína, anteraxantina, β-caroteno, neoxantina e violaxantina DAD Roca y Mínguez- Mosquera (2003). C 30 YMC 250 × 4,6 mm, 5 μm Pre-columna: C 18 Nucleosil 10 × 4,6 mm, 5 μm Modo de elución: gradiente. s istema i Eluyente A: metanol/agua/trietilamina (90:10:0,1). Eluyente B: metanol/MTBE/agua/trietilamina (6:90:4:0,1). Gradiente: 99% de A de 0 a 8 min, 0% de A a los 45 min y 99% de A a los 50 min, manteniendo por 5 min. Flujo 1 mL/min T emperatura de la columna: 35 °C s istema ii Eluyente A: metanol/MTBE/agua/trietilamina (81:15:4:0,1) Eluyente B:metanol/MTBE/agua/trietilamina (6:90:4:0,1) Patatas ( Solanum tuber osum L.) V iolaxantina, anteraxantina, luteína, zeaxantina, β-criptoxantina, todo trans -β-caroteno, violaxantina dimiristato, violaxantina miristato- palmitato, luteína dimiristato, zeaxantina dimiristato, luteína miristato-palmitato. DAD-MS (APCI modo positivo, quadrupolo) Breithaupt y Bamedi (2002) 65 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución Gradiente: 99% de A en 0 min, 44% de A en 39 min, 0% de A en 45 min y 99% de A a los 50 min, manteniendo por 5 min. Flujo 1 mL/min T emperatura de la columna: 35 °C C 30 YMC 250 × 4,6 mm, 5 μm Pre-columna: no se aplica Modo de elución: gradiente. Eluyentes: metanol/MTBE/agua (0,1% BHT y 0,05% TEA en los disolventes or gánicos) Gradiente: 90:5:5 en 0 min, 95:5:0 en 12 min, 89:1 1:0 en 25 min, 75:25:0 en 40 min, 50:50:0 en 60 min, 90:5:5 en 62 min. Flujo 1 mL/min. Zumo de naranja concentrado Luteoxantina, cis - auroxantina, auroxantina A, auroxantina B, anteraxantina, cis -luteoxantina, auroxantina C, cis -luteoxantina, mutatoxantina epímero A, luteína, mutatoxantina epímero B, zeaxantina, 9- cis - o 9’- cis -anteraxantina, 13- cis - o 13’- cis -β-criptoxantina, zeinoxantina, 9- cis - zeaxantina, β-criptoxantina, 13- cis -β-caroteno, cis - ζ-caroteno, α-caroteno, β-caroteno, ζ-caroteno. DAD Meléndez- Martínez et al. (2008) C 30 YMC 250 × 4,6 mm, 5 μm Pre-columna: no se aplica Modo de elución: gradiente. Eluyente: metanol/MTBE/agua. Gradiente: De 81:15:4 en 0 min hacia 6:90:4 en 90 min Flujo 1 mL/min T emperatura de la columna: 25 °C Pimientas: ají ( Capsicum baccatum L.) y rocoto ( C. pubescens R. & P .) V iolaxantina, neoxantina, cis - violaxantina, luteoxantina, 5,6-epoxi-capsantina, anteraxantina, cis -capsantina, capsorubina, mutatoxantina, luteína, capsantina, zeaxantina, α-criptoxantina, β-criptoxantina, α-caroteno, β-caroteno. DAD-MS (APCI modo positivo, quadrupolo) Rodríguez- Burruezo et al. (2010) C 30 YMC 250 × 4,6 mm, 5 μm Pre-columna: no se aplica. Modo de elución: gradiente. Eluyentes: metanol/éter terc-metilbutílico. Gradiente: De 95:5 para 70:30 en 30 min, 50:50 por 20 min y manteniendo esa proporción durante 15 min. Flujo 0,9 mL/min. T emperatura de la columna: 29 °C. Mana-cubiu ( Solanum sessiliflorum ) 9’- cis -neoxantina, todo- trans -violaxantina, todo- trans -luteoxantina, 9- cis -violaxantina, 9- cis -luteoxantina, todo- trans -luteína, 5,8-epoxi- β-criptoxantina, todo- trans -zeinoxantina, todo- trans -β-criptoxantina, 15- cis -β-caroteno, 13- cis - β-caroteno, todo- trans -α- caroteno, todo- trans -β- caroteno, 9- cis -β-caroteno. DAD-MS (APCI modo positivo, ion trap ) Rodrigues et al. (2013) 66 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución la pr esencia de anteraxantina y β -criptoxantina. Meléndez- Mar tínez et al. (2008) separar on, entre otr os car otenoides, isómer os geométricos de auroxantina, luteoxantina, anteraxantina, β -criptoxantina, zeaxantina, β -car oteno, ζ -car oteno mediante el empleo de elución en fase reversa C 30 . El per fil de car otenoides de frutos de Capsicum se evaluó mediante una columna C 30 (Rodríguez-Burruezo, González- Mas y Nuez, 2010) y se constató la pr esencia de los pigmentos característicos de este géner o, capsantina y capsorrubina. Rodrigues, Mariutti y Mer cadante (2013) deter minaron un gran númer o de carotenoides de maná-cubiu ( Solanum sessiliflorum ) como 9’- cis -neoxantina, violaxantina e isómer os, luteoxantina e isómer os, luteína, 5,8-epoxi- β -criptoxantina, zeinoxantina, β -criptoxantina, 15- cis -β -car oteno, 13- cis - β -caroteno, α -car oteno, β -caroteno y 9- cis - β car oteno. En la contribución de Murillo et al. (2013) se identificar on y separaron con éxito más de 30 car otenoides en for ma libre, mono- y diesterificada en frutas tr opicales mediante HPLC-DAD-MS en fase reversa. C 30 YMC 250 × 4,6 mm, 5 μm Pre-columna: no se aplica. Modo de elución: gradiente. Eluyente A: metanol/MTBE/agua (81:17:2). Eluyente B: metanol/MTBE/agua (10:88:2). Gradiente: 0% de B de 0 a 24 min, 100% de B a los 140 min, 0% de B a los 141 min. Flujo 0,8 mL/min. Frutas tropicales: Corozo ( Aiphane- saculeate ), Sastra ( Gar cinia intermedia ), Sapote ( Quararibea cor data ), Frutita ( Allophylus- psilospermus ), Maracuya chino ( Cionosicyos- macranthus ), y Mamey rojo ( Pouteria- sapota ) Luteína, zeaxantina, 13- cis - 13’- cis -β-criptoxantina, β-criptoxantina, 13- cis - β-caroteno, ζ-caroteno, α-caroteno, zeaxantina monocaprato, 13- cis - 13’- cis -β-criptoxantina monolaurato,β-caroteno, zeaxantina monolaurato,β- criptoxantina monocaprilato, β-criptoxantina monocaprato, zeaxantina monopalmitato, zeaxantina dicaprato, β-criptoxantina monolaurato, zeaxantina caprato- laurato, β-criptoxantina monomiristato, zeaxantina dilaurato, β-criptoxantina monopalmitato, zeaxantina laurato-miristato, zeaxantina caprato-palmitato, zeaxantina dimiristato, zeaxantina laurato-palmitato, zeaxantina miristato- palmitato,zeaxantina dipalmitato, licopeno DAD-MS (APCI modo positivo y negativo, quadrupolo) Murillo et al. (2013) 67 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución t abla 2. Ejemplos de metodologías para la separación por HPLC de carotenoides en muestras de tejidos biológicos Características de la columna Condiciones cr omatográficas Matriz Car otenoides determinados Método de detección Refer encia s istema 1 Fase reversa C 18 Microsorb 250 × 4,6 mm, 5 m m Precolumna: Spheri-5-C 18 , 30 × 4,6 mm, 5 m m Fase normal Silica-based nitrile-bonded 250 × 4,6 mm, 5 m m Precolumna: nitrile-bonded 30 × 4,6 mm, 5 m m s istema 2 Fase reversa C 18 Microsorb 250 × 4,6 mm, 5 m m Precolumna: Spheri-5-C 18 , 30 × 4,6 mm, 5 m m s istema 1 Fase reversa Modo de elución: gradiente Eluyente: acetonitrilo/metanol/ diclorometano/hexano. 85:10:2,5,2.5 de 0 a 10 min, alcanzando la proporción 45:22,5:22,5:10 en los 40 min. Flujo 0,7 mL/min. Fase normal Modo de elución: isocrático. Eluyente: hexano/ diclorometano/metanol/ N,N’-diisopropiletilamina 74,65:25:0,25:0,10 Flujo 0,7 mL/min. s istema 2 Fase reversa Modo de elución: gradiente Eluyente A: acetonitrilo/acetato (9:1) Eluyente B: hexano/ diclorometano/metanol/N,N- diisopropiletilamina 95% de A y 5% de B en 0 min, manteniento hasta 10 min, gradiente linear alcanzando 45% de A y 55% de B en 30 min. Flujo 0,7 mL/min T emperatura de la columna 25 °C Suero humano y leche materna ε,ε-caroteno-3,3’-diona, 3’-hidroxi-ε,ε-caroten-3-ona, 2,6-ciclolicopeno-1,5-diol, 3-hidroxi-β-ε-caroten-3’-ona, cis -3-hidroxi-β-ε-caroten-3’- ona, lactucaxantina, 13- cis - 13’- cis -3 R , 3’ R ,6’ R -luteina, todo- trans -3 R ,3’ R ,6’ R -luteina, 2,6-ciclolicopeno-1,5-diol, todo- trans -3 R ,3’ R -zeaxantina, todo- trans -3’-epiluteina, 9- cis -3 R ,3’ R ,6’ R -luteina, 9’- cis -3 R ,3’ R ,6’ R -luteina, 13- cis -luteina + 13’- cis - luteina, 9- cis -zeaxantina, 13- cis -zeaxantina, 15- cis - zeaxantina, 3 R ,6’ R -3-hidroxi- 3’,4’-didehidro-β-γ-caroteno, 2’,3’-anhidroluteina, α-criptoxantina, β-criptoxantina, cis -β-criptoxantina, licopeno, cis -licopeno, neurosporeno, γ-caroteno, ζ-caroteno, α-caroteno, todo- trans -β- caroteno, 9- cis -β-caroteno, 13- cis -β-caroteno, todo- trans - fitoflueno, cis -fitoflueno, fitoeno DAD-MS (ECNI) Khachik et al., 1997 68 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución Microsorb-MV silica based nitrile- bond 250 × 4,6 mm, 5 m m Modo de elución: isocrático Eluyente: hexano/ diclorometano/metanol/ N,N’-diisopropiletilamina 80:19,4:0.5:0,1 Flujo 1 mL/min Mácula humana y retina periférica Luteína, zeaxantina DAD Y emelyanov et al., 2001 C 18 Nucleosil 150 × 4,6 mm, 3 m m Precolumna: C 18 , V ydac 250 × 4,6 mm, 5 m m y C 18 , Hypersil 20 × 4,6 mm, 5 m m Modo de elución: isocrático. Eluyente: acetonitrilo/metanol (50 mM acetato de amonio)/ agua/diclorometano 70:15:5:10 Flujo 2 mL/min Plasma humano Astaxantina, luteína, zeaxantina, cantaxantina, β-criptoxantina, equinona, todo- trans -licopeno, cis-licopeno, α-caroteno, todo- trans -β-caroteno, 9- cis -β- caroteno, 13- cis -β-caroteno DAD L yan et al., 2001 C 30 YMC 250 × 4,6 mm, 5 m m Precolumna: C 30 YMC, 10 × 4,6 mm Sumichiral OA-2000 YMC con grupo 3.5-dinitrobenzoil ligado 250 × 4,6 mm, 5 m m Modo de elución: gradiente. Eluyente: MTBE/metanol/agua Gradiente: De 15:81:4 en 0 min hacia 74,9:21,1:4 en 70 min Flujo 1 mL/min Modo de elución: isocrático Eluyente: n -heptano/ diclorometano/2-propanol (70:25:5) Flujo 1 mL/min Salmon salvaje ( Oncor - hynchus spp.) y salmon de piscifac- toría ( Salmo salar ), plasma humano 3 R ,3’ R -astaxantina, 3 R ,3’ S - astaxantina, 3 S ,3’ S -astaxantina DAD Rüfer et al., 2008 C 30 YMC 150 × 4,6 mm, 3 m m Modo de elución: gradiente Eluyente: metanol (0.1% acetato de amonio)/MTBE Gradiente: 100% de metanol en 0 min, 85% de metanol en 45 min, 40% de metanol en 55 min, 30% de metanol en 60 min, manteniendo por 5 min, luego volviendo a 100% de metanol en 70 min Plasma humano, pulmón de hurones Cis -fitoeno, 15- cis -fitoeno, todo- trans -fitoeno, fitoflueno e isómeros, todo- trans -fitoflueno, di- cis -luteina, 15- cis -lutein, di- cis- zeaxantina, 13- cis -luteina, 13- cis -zeaxantina, todo- trans - luteina, 15- cis -zeaxantina, 9- cis - luteina, di- cis -β-criptoxantina, 15- cis -β-criptoxantina, 9- cis - luteina, 13- cis -β-criptoxantina, DAD Meléndez-Martínez et al., 2013 69 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución Métodos HPLC en plasma y tejidos de origen animal La tabla 2 incluye difer entes métodos para la deter minación de car otenoides en plasma y tejidos de animales por HPLC. Khachik et al. (1997) identificar on 34 carotenoides, incluyendo tr ece isómeros geométricos y ocho metabolitos en muestras de leche y suer o de madres lactantes: Para ello utilizar on HPLC (un sistema en fase nor mal y otr o en fase reversa) y detección por MS y DAD. Luteína y zeaxantina se deter minar on en muestras de r etina utilizando un sistema de HPLC - DAD con la columna de sílice de fase nor mal (Y emelyanov , Katz y Ber nstein, 2001). Se han identificado tr ece carotenoides en muestras de plasma humano mediante separación en columna C 18 . Entr e los pigmentos carotenoides identificados se separar on los isómeros cis y trans de β -car oteno (L yan et al. , 2001). Rüfer et al. (2008) emplear on un procedimiento de separación en fase r eversa y columna quiral para separar los isómer os ópticos de astaxantina en la car ne de salmón y plasma humano y pulmón de hur ones. Un método para la deter minación de car otenoides en hurones, plasma y pulmón humano fue desarr ollado por Meléndez-Mar tínez et al. (2013), utilizando difer entes gradientes de elución con metanol/ MTBE y una columna C 30 para llegar a separar hasta 39 13’- cis -β-criptoxantina, 9- cis - zeaxantina, todo- trans -β- criptoxantina, 13- cis -α-caroteno, 9- cis -β-criptoxantina, 13’- cis -α- caroteno, 9’- cis -β-criptoxantina, 15- cis -β-caroteno, 13- cis -β- caroteno, todo- trans -α-caroteno, 9- cis -α-caroteno, 9’- cis -α- caroteno, todo- trans -β-caroteno, 9- cis -β-caroteno, isómeros di- cis de licopeno, 15- cis -licopeno, 9- cis -licopeno, todo- trans - licopeno, 5- cis -licopeno C 30 YMC 150 × 2,0 mm, 5 m m Modo de elución: gradiente. Eluyente A: metanol acetato de amonio 1M (98:2) Eluyente B: Acetato de etilo Gradiente: 100% de A en 0 min, 80% de A en 6 min, manteniendo esta proporción hasta 8 min, volviendo a 100% de A en 1 1 min Flujo 0.37 mL/min. Leche materna, formula infantil y células Caco-2 13- cis -luteina, 13’- cis - luteina, todo- trans -luteina, 13- cis -zeaxantina, todo- trans - zeaxantina, 9- cis -luteina, 9’- cis - luteina, α-criptoxantina, 9- cis - zeaxantina, β-criptoxantina, 15- cis -β-caroteno, 13- cis - β-caroteno, 13- cis - β-caroteno, α-caroteno, todo- trans - β-caroteno, 9- cis - β-caroteno, γ-caroteno, cis -licopeno, todo- trans -licopeno, 5- cis -licopeno DAD Lipkie et al., 2014 70 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución económicos, medioambientales y de pr oductividad, ya que el númer o de muestras que se pueden analizar en una jor nada de trabajo aumenta considerablemente. A pesar de estas evidentes ventajas, hay que considerar que el análisis de car otenoides es par ticular mente complejo. Por ejemplo, en muchos casos se r equieren columnas C 30 para conseguir una separación óptima de los car otenoides de inter és, en especial de isómeros geométricos y ópticos. En este sentido, en un trabajo r eciente se ha puesto de manifiesto que, dado que aún no existen columnas C 30 para UPLC, el uso de esta técnica para car otenoides está en muchos casos limitado (Bijttebier et al. , 2014). Es necesario por lo tanto conocer los pr os y los contras de estas técnicas rápidas de cr omatografía líquida para decidir si son o no apr opiadas para el objetivo del análisis. En la tabla 7 se r esumen las características de algunos métodos de RRLC y UPLC usados para el análisis de car otenoides, algunos de los cuales se comentan con más detalle a continuación. car otenoides. En un estudio sobre bioaccesibilidad in vitr o de los car otenoides presentes en la leche materna y fór mulas infantiles, los extractos se analizar on por HPLC en fase reversa mediante una columna C 30 (Lipkie et al. , 2014). Métodos de UPLC El desarr ollo de columnas cromatográficas con tamaños de par tícula menor es a los tradicionales (3 o 5 micras) ha posibilitado la aparición de técnicas cr omatográficas muy rápidas, como la cr omatografía líquida de rápida r esolución ( rapid resolution liquid chr omatography , RRLC) o la cr omatografía líquida de ultra-resolución ( ultraper for mance liquid chr omatography , UPLC). A veces se habla de cr omatografía líquida de resolución ultra alta ( ultra-high per for mance liquid chr omatography , UHPLC). Una de las mayor es diferencias entr e UPLC y HPLC es el tamaño de par tícula de las columnas, que en el caso de la primera es inferior a 2 μm. En UPLC se opera a pr esiones considerablemente mayor es, si bien se pueden conseguir análisis más rápidos (al ser posible disminuir los tiempos de r etención), picos más estrechos (con lo que se mejora la r elación señal-ruido) y mayor sensibilidad (Rivera y Canela- Garayoa, 2012) Granado-Lor encio et al. (2010) compararon HPLC vs. UPLC para la deter minación simultánea de biomar cadores del estado nutricional (vitaminas A, E, D y car otenoides individuales) y analizar on algunas de las diferencias significativas entr e ambas técnicas (tabla 3). Así, el volumen de inyección puede ser del or den de diez veces menor en UPLC. Además el tiempo del análisis cr omatográfico es menor , lo que se traduce a su vez en una r educción de la cantidad de disolvente empleada en cada muestra. Este ahorr o es asimismo impor tante en tér minos t abla 3. Comparación UPLC vs HPLC Características UPLC HPLC V olumen de inyección 1 m L 10 m L Flujo 0,5 mL/min 1,8 mL/min T iempo de análisis 4,5 min 30 min V olumen fase móvil/análisis < 2,5 mL 55 mL Rendimiento (análisis/7,5 h) Hasta 90 /día Hasta 15/día V olumen fase móvil 2,5 L 56 L Fuente: Elaboración propia con base en Granado et al. (2010). 71 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución sólo doce minutos. Para los análisis se usó una columna C 18 Por oshell 120 (2,7 µm, 5 cm x 4,6 mm; Agilent, Palo Alto) cuya temperatura se mantuvo a 28 ºC. El volumen de inyección de muestra osciló entr e 10-20 µL y el flujo fue de 1 mL/min. En la fase móvil se usar on tres disolventes, concr etamente acetonitrilo (A), metanol (B) y acetato de etilo (C), de acuer do con el siguiente gradiente: 0 min: 85% A+15% B; 5 min: 60% A+20% B+20% C; 7 min: 60% A+20% B+20% C; 9 min: 85% A+15% B; 12 min: 85% A+ 15% B. Stinco et al. (2014) desarr ollaron un método de extracción (con y sin saponificación) y posterior separación mediante UPLC para el scr eening de isoprenoides (car otenoides, clor ofilas y tocofer oles) en frutas y verduras. Mediante este método se pueden deter minar de manera simultánea car otenoides típicos de la dieta (como violaxantina, luteína, β -criptoxantina, α -car oteno, β -caroteno, licopeno, fitoeno y fitoflueno), cuatr o tocofer oles y algunos pigmentos clorofílicos (clor ofilas y feofitinas); la duración del análisis cr omatográfico es de tan t abla 4. Características de algunos métodos de RRLC y UPLC aplicados al análisis de carotenoides Refer encia Método V .I. (µL) a Flujo (mL/min) T .A. (min) b Columna T .C. (ºC) c Granado-Lorencio et al., 2010 UPLC 1 0,5 4,5 HSS T3 column (2,1 × 100 mm;1,8 m m) 35 Hongyan Li et al., 201 1 UPLC 3 0,3 18 Phenomenex® Kinetex C 18 (100 × 2,1 mm; 1,7 m m) 30 Bohoyo-Gil et al., 2012 UPLC 1,4 0,3 10 Zorbax Eclipse Plus C 18 (2,1 × 50 mm; 1,8 m m) 28 Rivera et al., 201 1 UPLC 0,4 15 ACQUITY UPLC®BEH 130 Ă C 18 (2,1 × 100 mm; 1,7 m m) 32 Stinco et al., 2014 RRLC 10 a 20 1 12 C 18 Poroshel 120 (5 cm × 4,6 mm; 2,7 m m) 28 Delpino-Rius et al., 2014 UPLC 5 0-6,5 min: 0.5 17 ACQUITY UPLC®BEH C 18 (2,1 × 100 mm; 1,7 m m) 32 6,5-13,6 min: 0,7 13,6-16,6 min: 0,5 Bijttebier et al., 2014 UPLC 1,25 0,5 23 ACQUITY UPLC BEH C 18 (2,1 × 100; 1,7 m m) 35 Bijttebier et al., 2014 UPLC 1,25 0,5 23 ACQUITY UPLC HSS C 18 SB (2,1 × 100; 1,7 m m) 35 a V olumen de inyección. b T iempo de análisis cromatográfico. c T emperatura de la columna. 72 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución Bohoyo-Gil et al. (2012) optimizaron un método UPLC para el análisis de car otenoides en alimentos. En concreto, describier on la separación de siete carotenoides en menos de 8.5 minutos, r ealizando una comparación en tér minos de r esolución, selectividad, sensibilidad, tiempo y ahorro de solventes con un método HPLC. Para el análisis por HPLC usar on una columna C 18 Lichrosorb RP-18 (10 µ m, 4.6 × 200 mm) y una fase móvil con acetonitrilo:metanol (85:25) (disolvente A) y acetonitrilo:metanol:acetato de etilo (60:20:20) (disolvente B) con 0.1% de BHT y 0.05% de TEA. El flujo fue de 1 mL/min. Para el análisis por UPLC se usó una columna C 18 Zorbax Eclipse Plus (1.8 μm, 2.1 × 50 mm) y una fase móvil con los mismos disolventes usados para el método de HPLC . El flujo 0.3 mL/min. Con ambas metodologías se obtuvo una corr ecta resolución de los picos de capsantina, luteína, zeaxantina, criptoxantina y licopeno. No obstante, α - y β -car oteno no se separaron bien por HPLC per o sí por UPLC. Asimismo, observaron cambios en el or den de elución de algunos carotenoides como zeaxantina y luteína entr e ambos métodos. Li et al. (2012) usar on para el análisis de carotenoides de tomates una columna C 18 Phenomenex Kinetex (1.7 µm, 100 x 2,1 mm) y una fase móvil consistente en metanol:MTBE:agua (85:14:5, disolvente A) y metanol:MTBE:agua (90:5:5, disolvente B), de acuer do con el siguiente gradiente: 0% A a 20% en 3 min. 20% A a 100% desde el minuto seis hasta el minuto quince. El flujo fue de 300 µL/min, la temperatura de la columna se mantuvo a 30 ºC y el volumen de inyección fue de 3 µL. Delpino-Rius et al. (2014) desarr ollaron un método rápido para deter minar el per fil de car otenoides de productos a base de frutas. Para la separación de los analitos se usó una columna ACQUITY UPLC TM BEH C 18 (1,7 µm; 2,1 mm x 100 mm) y una fase móvil con dos disolventes: ACN-MeOH (7:3) y H 2 O (100%). El volumen de inyección fue 5 μ L y la columna se mantuvo a 32 ºC. Con esta metodología se detectar on un total de 27 car otenoides, entre los que se encontraban neoxantina, neocr omo A y B, violaxantina, luteoxantina A y B anteraxantina, aur oxantina A, B y C, zeaxantina, isómeros de luteína, α - y β -criptoxantina, β -car oteno, ζ -caroteno, fitoeno y fitoflueno. AGRADECIMIENT OS 73 3. A nálisis de cArotenoides por cromA togrAfíA líquidA de Al t A resolución De Rosso, V .V . y Mer cadante, A.Z. 2007. Jour nal of Agricultural and Food Chemistr y 55: 5062-5072. Delgado-Pelayo, R., Gallar do-Guerrer o, L. y Hornero- Méndez, D. 2014. Food Resear ch Inter national 65: 272- 281. Delpino-Rius, A., Eras, J., Marsol-V all, A., V ilar ó, F ., Balcells, M. y Canela-Garayoa, R. 2014. Jour nal of Chr omatography A 1331: 90-99. Epler , K.S., Sander , L.C., Ziegler , R.G., Wise, S.A. y Craft, N.E. 1992. Jour nal of Chr omatography 595: 89-101. Eugster , C.H. 1995. En G. Britton, S. Liaaen-Jensen y H. Pfander (eds.). 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I dentIfIcacIón de carotenoIdes en tor no a 130 nm, siendo transpar entes en la región del UV - visible; por eso se eligen para ser usados como disolventes. n ociones básicas de esPectrometrÍa de masas La espectr ometría de masas (MS) se usa para medir la masa molecular de un compuesto. La masa de un átomo es la suma de las masas de sus par tículas, sustrayendo la energía liberada en la for mación del núcleo de este átomo. Las masas de las par tículas atómicas se r ecogen en la tabla 1, considerando que la unidad de masa atómica (u) es equivalente a 1.6605 × 10 -27 kg (1/12 de la masa del 12 C). Las masas molecular es exactas son diferentes y únicas para cada de la onda. Estas r elaciones se ilustran en las ecuaciones [1 a 3]. c = l × f [1] E = h × f [2] E = h × c × l -1 [3] donde: c = velocidad de la energía radiante (3 x 10 8 m/s en el vacío); l = longitud de onda (metr os); f = frecuencia (hertzios); E = energía del fotón (julios); h = constante de Planck (constante de pr oporcionalidad), 6.63 ×10 −34 (J s). Cuando la radiación electr omagnética atraviesa un compuesto se pr oducen transiciones electrónicas. La energía de la radiación UV -visible puede pr omover solamente transiciones de electr ones de la capa de valencia (electrones en orbitales pi [ p ] y de heter oátomos con pares de electr ones no compartidos). Así, por ejemplo, compuestos con dos dobles enlaces conjugados absorben a 217 nm (figura 2), y a medida que aumenta el númer o de dobles enlaces conjugados (d.e.c.), la energía disminuye y , por lo tanto, la longitud de onda aumenta, llegando hasta la r egión visible (400 nm a 760 nm). La par te de la molécula r esponsable de la absorción de radiación en las r egiones UV y visible se conoce como cromófor o. Este término surgió en la industria de tintes, para r eferirse a los grupos y conexiones en la molécula que son r esponsables del color del colorante (véase IUP AC). En compuestos con enlaces covalentes no conjugados (por ejemplo C-C, C-H) se pr oducen transiciones de electrones en orbitales sigma ( s s *). Dichos compuestos absorben f igura 2. Diagrama de los orbitales p en sistemas de dobles enlaces separados y conjugados. 81 4. I dentIfIcacIón de carotenoIdes de masa/carga ( m/z ) y detector (figura 3). El analizador y el detector se mantienen siempr e en vacío, mientras hay fuentes de ionización que necesitan vacío y otras que operan a pr esión atmosférica. La muestra tiene que ser introducida en la fuente de ionización del instrumento, ya sea por inyección en flujo ( flow-injection ), cr omatografía gaseosa (GC ), HPLC , UHPLC o electr oforesis capilar (CE). Una vez que la muestra ya está en el interior de la fuente de ionización, se ionizan los compuestos. Los iones for mados se dirigen hacia el analizador del espectr ómetro de masas, donde se separan de acuer do con la r elación masa/carga ( m/z ). Los iones separados son detectados y esta señal es enviada a un sistema de datos donde las r elaciones m/z se almacenan junto con su abundancia r elativa para la obtención del espectro de masas. Existen muchos métodos de ionización disponibles y cada uno tiene sus pr opias aplicaciones, ventajas y desventajas. La elección del método de ionización depende esencialmente del peso molecular y de la polaridad de los compuestos pr esentes en la muestra, así como del analizador de m/z y del tipo de método de intr oducción de la muestra. Los métodos más conocidos y utilizados son la ionización por electr ones (EI), aplicada típicamente para compuestos apolar es y con muy bajo peso molecular , como los compuestos volátiles; la ionización química a pr esión atmosférica ( atmospheric pressur e chemical ionization , APCI) usada sobr e todo para compuestos apolar es o de baja polaridad y bajo peso molecular , como los car otenoides; la ionización por electrospray (ESI), empleada sobr e todo para compuestos polares de cualquier peso molecular , como los compuestos fenólicos, y la ionización por desor ción-ionización láser asistida por la matriz ( matrix- assisted laser desorption-ionization , MALDI), r ecomendada para compuestos de cualquier polaridad y alto peso molecular , como las pr oteínas. Con la mayoría de los métodos de compuesto químico, mientras que la masa nominal es la masa r edondeada en 1 u. Por ejemplo, considerando la masa nominal, los compuestos N 2 , CO y C 2 H 4 poseen la misma masa de 28 u; sin embargo, considerando las masas molecular es exactas, los valores son únicos para cada estructura, con N 2 = 28.0061 u; CO = 27.9949 u y C 2 H 4 = 28.0313 u. Los equipos de espectr ometría de masas poseen tres partes fundamentales, a saber , fuente de ionización, analizador t abla 1. Masa atómica y unidad de masa atómica de las partículas atómicas Partícula Masa atómica (kg) Unidad de masa atómica (u) Protón 1.6726 × 10 -27 1.0073 Neutrón 1.6749 × 10 -27 1.0086 Electrón 9.1093 × 10 -31 0.0005 Fuente: Xxxxxx Figura 3. Esquema simplificado de los principales componentes de un espectrómetro de masas. 82 4. I dentIfIcacIón de carotenoIdes El detector monitoriza la corriente de iones, la amplifica y luego transmite la señal al sistema de datos. El tipo de detector se deter mina de acuer do con el tipo de analizador; los más comunes son la multiplicadora de electr ones y la placa de micr ocanal. e sPectro uV - Visible de carotenoides Características generales Las características generales del espectr o de los carotenoides se discuten en el capítulo 1. Las longitudes de onda de máxima absor ción ( l max ) de muchos carotenoides en difer entes disolventes están disponibles en la literatura (Britton, 1995; Britton, Liaaen-Jensen y Pfander , 2004); sin embargo, es común encontrar variaciones de 1 a 3 nm en el l max para el mismo car otenoide en el mismo disolvente en diferentes ionización, existe la posibilidad de pr oducción de iones cargados positiva o negativamente, dependiendo de la afinidad del compuesto por pr otones. En la ionización en el modo positivo, que es la más utilizada para car otenoides, se for ma la molécula pr otonada ([M+H] + ), mientras que en el modo de ionización negativo se logra la molécula depr otonada ([M-H] – ) o el ion molecular ([M•] – ). En la actualidad se r ecomienda que dejen de emplearse los tér minos ion molecular pr otonado, ion pseudomolecular e ion casi-molecular (V essecchi et al. , 2011; Murray et al. , 2013). La función principal del analizador de masas es aislar , de acuer do con la relación m/z , los iones formados en la fuente de ionización del espectr ómetro de masas. Actualmente hay varios analizador es de masas disponibles, con precios y características muy difer entes, como rango de m/z que puede ser analizado, pr ecisión de masa y resolución. Los analizador es más conocidos son cuadrupolo ( quadrupole , Q), tiempo de vuelo ( time-of-flight, TOF) y trampa iónica ( ion trap, IT). Cuando se usa un analizador sólo el ion pr ecursor (generado en la fuente de ionización) se analiza. En la espectr ometría de masas secuencial ( tandem-mass spectr ometr y , MS-MS) se combinan difer entes analizadores en un único instrumento. En el MS-MS el ion pr ecursor se selecciona en un analizador , después se fragmenta a alta energía en una r egión inter mediaria (célula de choque) y los iones generados se dirigen a otr o analizador de m/z para sus separación y el r egistro de datos. Las combinaciones de MS-MS más utilizadas son triple cuadrupolo (QqQ) o cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF). En el caso de la trampa iónica, la espectr ometría de masas secuencial ocurre en un mismo analizador . Las ventajas del MS-MS incluyen el aumento de la sensibilidad y la obtención de infor maciones estructurales basadas en el patr ón de fragmentación. f igura 4. Representación de la estructura fina espectral. 83 4. I dentIfIcacIón de carotenoIdes publicaciones. Un espectr o UV -visible de buena calidad se puede obtener fácilmente con un espectr ofotómetro con 1 a 2 m g de un car otenoide aislado o con algunos ng en un sistema HPLC-DAD. El espectr o UV -visible de un car otenoide puede ofr ecer infor mación muy útil sobre el cr omófor o, grupos funcionales y anillos pr esentes. Para ello resulta útil, además de considerar las longitudes de onda a la que apar ecen los máximos, calcular parámetr os como la estructura fina espectral (% III/II) y la intensidad del pico cis (%A B /A II ) (figuras 4 y 5). Efecto del disolvente y de la estructura química Las características del espectr o UV -visible de car otenoides dependen de varios factor es: a) Disolvente: el aumento en el índice de r efracción del disolvente pr oduce un desplazamiento batocrómico (a f igura 5. Representación de la intensidad de la banda cis del espectro con respecto a la de la banda principal de absorción. t abla 2. Características del espectro UV -visible en MeOH/MTBE y del espectro de masas de isómeros de a - y b -caroteno obtenidas por HPLC-DAD-MS Car otenoides (númer o de d.e.c. de la cadena+anillo b )* l max (nm) % III/II % A B /A II Ms y Ms-Ms ** ( m/z ) (15 Z )-β-caroteno (9+2 b ) 337, 420, 449, 472 10 61 537, 444 (13 Z )-β-caroteno (9+2 b ) 338, 420, 444, 470 12 47 537, 444 (todo- E )- a -caroteno (9+1 b ) 420, 445, 473 66 0 537, 481, 444 (9 Z )- a -caroteno (9+1 b ) 330, 420, 444, 472 60 9 537, 481, 444 (todo- E )- b -caroteno (9+2 b ) 421, 452, 478 25 0 537, 444 (9 Z )- b -caroteno (9+2 b ) 338, 420, 447, 472 20 18 537, 444 Fuente: De Rosso y Mercadante (2007). *Los compuestos se presentan en orden de menor a mayor tiempo de elución en columna C 30 . ** Los fragmentos en negrita se detectaron mediante MS-MS. 84 4. I dentIfIcacIón de carotenoIdes desplazamiento hipsocr ómico (a longitudes de onda menores) de 2 a 6 nm del máximo de absor ción para isómeros mono- Z. Dicho desplazamiento puede llegar a ser de hasta 34 nm para isómer os tetra- Z , como el prolicopeno, si bien estos isómer os con cuatr o dobles enlaces en configuración Z son raros. En los espectr os de isómeros Z también se observa una disminución en la absorbancia, r educción en la estructura fina espectral y la aparición de una nueva banda de absor ción, conocida como pico cis , apr oximadamente a una longitud de onda 142 nm por debajo de la banda de mayor l (III). En la figura 7 se observa que la estructura fina (% III/II) disminuye y la % A B /A II aumenta a medida que el doble enlace en configuración Z se apr oxima al centr o de la molécula. d) Grupo ter minal cíclico: algunos grupos ter minales (como el ε , entr e otros) no tienen dobles enlaces conjugados con la cadena poliénica (figura 8), por lo que no for man par te del cr omóforo y no afectan significativamente el espectr o UV -visible. Como ya se comentó en el capítulo 1, el doble enlace del anillo b está conjugado con la cadena poliénica, per o no en el mismo plano. Como consecuencia, se pr oducen impedimentos estéricos longitudes de onda mayor es). El aumento de la polaridad del disolvente, por su par te, pr oduce disminución de la estructura fina espectral. Por ejemplo, el licopeno pr esenta l max de 444, 470,502 nm en éter de petr óleo y de 458, 484, 518 nm en clor ofor mo. Por lo tanto, siempre debe indicarse el disolvente utilizado para la obtención del espectr o UV -visible, especialmente cuando se obtiene mediante un DAD durante HPLC en gradiente de fase móvil. b) Númer o de dobles enlaces conjugados: como ya se ha comentado, a medida que el númer o de d.e.c. aumenta, la energía necesaria para pr omover las transiciones de los electr ones disminuye y las l max aumentan (ecuación 3) (tabla 2). La figura 6 muestra la difer encia de 70 nm en la l max de un car oteno lineal con 7 d.e.c. ( z -caroteno) y de otr o con 11 d.e.c. (licopeno) en gradiente de MeOH y éter metil- ter t -butílico (MTBE). c) Isomería Z/E : como se dijo en el capítulo 1 existen impor tantes difer encias en los espectros de isómer os geométricos de un mismo car otenoide. Así, se produce un f igura 6. Espectros de absorción UV -visible de ζ -caroteno y licopeno obtenido por HPLC- DAD en MeOH/MTBE. 250 300 350 400 450 500 550 600 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 respuesta del detector nm licopeno -caroteno licopeno (11 d.e.c.) -caroteno (7 d.e.c.) 85 4. I dentIfIcacIón de carotenoIdes f igura 7. Isómeros de b -caroteno. a) Espectros de absorción en el UV -visible, obtenido por HPLC-DAD en MeOH/MTBE, b) Estructuras químicas. f igura 8. Grupos terminales presentes en las moléculas de carotenoides. de tal for ma que el valor de %III/II disminuye y se pr oduce un desplazamiento hipsocr ómico en comparación con el grupo ter minal acíclico Y ( pr esente por ejemplo en el licopeno ), donde todos los dobles enlaces conjugados son coplanar es . Así, por ejemplo, en MeOH/MTBE, el b -car oteno con 11 d.e.c. (9 en la cadena + 2 en los anillos b ) pr esenta l max a 421, 452, 478 y % III/II = 25, mientras el g -car oteno, con 10 d.e.c. + 1 en el anillo b posee l max a 430, 461, 492 nm y % III/II = 68 y el licopeno, también con 11 d.e.c. en la cadena poliénica, posee l max a 446, 472, 503 y % III/II = 75. Las características espectrales pr esentadas en la tabla 2 son muy útiles para difer enciar fácilmente los isómeros Z de b -car oteno y de a -caroteno. A pesar de que el (todo- E )- y (9 Z )- a -car oteno así como el (13 Z )- b -caroteno pr esentan la mismo l max , la baja estructura fina espectral de este último ya indica que se trata de un isómer o Z del b -caroteno y no del a -car oteno, que posee un anillo ε y otro b . Independientemente de la localización del enlace en la configuración Z , todos los isómer os Z de b -caroteno pr esentar on el pico cis a 337-338 nm, mientras que en el (9 Z )- a -car oteno se observó a 330 nm. Respuesta del detector 250 300 350 400 450 500 550 600 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 Longitud de onda (nm) todo- E 22-25 0 9 Z 20-22 10 13 Z 4-4,5 44-45 15 Z 0-2 56-58 Isómero %III/II %A B /A II A B (todo- E )- -caroteno (15 Z )- -caroteno (13 Z )- -caroteno (9 Z )- -caroteno 86 4. I dentIfIcacIón de carotenoIdes f igura 9. Estructura química y longitudes de onda de máxima absorción de carotenoides con diferentes grupos químicos terminales. Datos extraídos de G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Pfander (2004). Carotenoide l en nm (disolvente) b -citraurineno (9 d.e.c.) metil- b -apo-8-carotenoato (10 d.e.c.) 3-hidroxi-sintaxantina (10 d.e.c.) b -citraurina (10 d.e.c.) b -citraurinol (9 d.e.c.) 403, 425, 450 (hexano) 402, 424, 450 (etanol) 453 (hexano) 452 (etanol) 446, 474 (hexano) (426), 447, (475) (etanol) (417), 442, 465 (hexano) 403, 426, 450 (hexano) 87 4. I dentIfIcacIón de carotenoIdes un d.e.c. en el anillo) y aumento en la estructura fina, mientras que la pr esencia de un anillo 5,8-epóxido en un anillo b pr oduce un desplazamiento hipsocrómico de 15-20 nm, debido a la “pér dida” de 2 d.e.c. (uno en el anillo b y otro en la cadena poliénica central) (figura 10). g) Grupo hidr oxilo: los grupos hidroxilos tienen poca o ninguna influencia en el espectr o UV -visible, como se puede compr obar en la figura 9. Cabe destacar que cualquier modificación en la estructura química que no pr ovoque cambio en el cromófor o, como adición de grupos funcionales que no estén conjugados con el conjunto de d.e.c., no altera el espectr o UV -visible. e) Grupo carbonilo: cuando existen grupos carbonilos en conjugación con la cadena poliénica el cr omóforo se extiende. Eso r esulta en un desplazamiento batocrómico y , en general, en la pér dida de la estructura fina espectral. El grado de desplazamiento y de estructura fina depende de la función química y de la longitud de la cadena poliénica del car otenoide. Por ejemplo, el efecto batocrómico de un ácido carboxílico o éster es menor que el de un aldehído (figura 9). f) Grupo epóxido: la adición de un grupo epóxido a un doble enlace solamente causa desplazamiento hipsocr ómico cuando el doble enlace for maba par te del sistema de d.e.c. La pr esencia de un grupo 5,6-epóxido en un anillo b provoca una disminución de ca. 6 nm en las l max (debido a la “pér dida” de 5,6-epoxi- β -caroteno 250 300 350 400 450 500 550 600 λ (nm) 420 473 445 respuesta del detector 5,6:5’,6’-diepoxi- β -caroteno 5,8-epoxi- β -caroteno 250 300 350 400 450 500 550 600 415 468 439 λ (nm) respuesta del detector 250 300 350 400 450 500 550 600 403 452 427 λ (nm) respuesta del detector f igura 10. Estructuras química y espectros UV -visible, obtenidos por HPLC-DAD en MeOH/MTBE, de epóxidos de b-caroteno. 88 4. I dentIfIcacIón de carotenoIdes el modo negativo, se detectan tanto la molécula despr otonada ([M-H] - ) como el ión molecular cargado negativamente ([M • ] – ) (Mariutti et al. , 2012; V an Br eemen, Dong y Pajkovic, 2012). Las fragmentaciones logradas por MS-MS, consecuecia de la masa molecular y de los grupos ter minales y funcionales, confir man la atribución corr ecta del pico de la molécula protonada. En la cadena poliénica, se han observado pér didas de tolueno (92 u) y a veces de metil-ciclopentadieno (80 u) en los espectr os de carotenos y xantofilas obtenidos por APCI, tanto en el modo positivo como en el negativo (De Rosso y Mer cadante, 2007; Mariutti et al. , 2012; V an Br eemen, Dong y Pajkovic, 2012). La pér dida de xileno (106 u) es menos fr ecuente en apci (De Rosso y Mercadante, 2007; V an Breemen, Dong y Pajkovic, 2012). A veces, además de estas pér didas se observan otras que corr esponden a grupos funcionales (figura 11). Como la pér dida de por lo menos uno de esos compuestos se verifica en todos los car otenoides, estas infor maciones son útiles para confir mar la atribución de la [M+H] + , aunque tenga poca utilidad para distinguir entr e los carotenoides. Fragmentaciones desde los grupos terminales y funcionales En r elación con los anillos (tabla 3), se han observado pérdidas del anillo b -ionona (124 u) y de este anillo acompañado de un grupo metileno (137 u) desde la [M+H] + en b -car oteno y en a -car oteno, mientras la eliminación de par te del anillo ε- se verificó en a -car oteno (De Rosso y Mercadante, 2007) y en luteína (Mariutti et al. , 2012; V an Br eemen, Dong y Pajkovic, 2012). La pér dida de agua desde la molécula protonada r evela la pr esencia de grupos oxigenados. Estas pérdidas pueden ser e sPectro de masas de carotenoides Los datos más impor tantes obtenidos a par tir del espectr o de masas son la masa molecular del compuesto y los patr ones de fragmentación característicos de su estructura. Como la cadena poliénica de los car otenoides puede estabilizar tanto carga positiva como negativa, los car otenoides for man iones estables con diversas técnicas de ionización. Para obtener un buen espectr o de masas se requier e pequeña cantidad de muestra, generalmente pocos µg. En la bibliografía hay muchos espectr os, datos y fragmentos obtenidos por EI, los cuales se encuetran compilados en un trabajo (Enzell y Back, 1995). No obstante, como esta fuente de ionización no puede ser acoplada al HPLC, los datos que se usan comúnmente en la actualidad se han obtenido principalmente con ionización por APCI en el modo positivo (De Rosso y Mer cadante, 2007a; V an Br eemen, Dong y Pajkovic, 2012). Así, solamente los espectr os obtenidos con esta técnica se discutirán en este capítulo. En este sentido hay que tener en cuenta que, debido a que difer entes técnicas de ionización pueden pr oducir diferentes patr ones de fragmentación para el mismo car otenoide, la interpretación de espectr os de masas basada en la bibliografía debe ser r ealizada con cuidado. Masa molecular y fragmentación de la cadena poliénica En la fuente APCI en el modo positivo, en general se detecta el pico de masa atómica más alta, con valor impar , que corr esponde a la molécula protonada ([M+H] + ) del car otenoide. Nor malmente es el pico de mayor intensidad (pico base) en el espectr o de masas, con algunas excepciones. En 89 4. I dentIfIcacIón de carotenoIdes espectr ometría de masas”, el uso de MS-MS es necesario para confir mar el origen del fragmento. Por ejemplo, los epóxidos 5,6 y 5’,6’ de b -criptoxantina poseen el mismo cr omóforo y , por lo tanto, espectros UV -visible idénticos, así como la misma masa molecular de 568 Da. Ambos epóxidos pr esentan [M+H] + de 569 u y pér dida de agua ( m/z 551), tanto en la fuente de ionización como en el MS-MS (tabla 3). El modo más fácil de difer enciarlos es a través de la presencia en el MS-MS de los fragmentos a m/z 205 o 221, r espectivamente (figura 12). Los éster es de xantofilas que se encuentran de for ma natural en muchas fuentes, como por ejemplo frutas, están acilados con difer entes ácidos grasos. Como ya se ha comentado, dichos éster es se hidrolizan durante la saponificación. Los éster es presentan características del espectr o UV -visible idénticas a aquellas del car otenoide libre, sin embargo pueden ser identificados por MS, ya que que sus pesos molecular es dependen de los ácidos grasos pr esentes. A pesar de que el pico de la [M+H] + puede ser de baja intensidad o incluso sucesivas en xantofilas di-hidr oxiladas. Por ejemplo, luteína y zeaxantina tienen el mismo peso molecular (568 Da) y , en consecuencia, la misma [M+H] + en m/z 569. A pesar de este hecho, la difer enciación entre estos dos car otenoides puede r ealizarse con base en la intensidad relativa del pico de la [M+H] + en comparación con el fragmento a m/z 551 ([M+H-18] + ). En la zeaxantina la mayor intensidad del pico de la [M+H] + en comparación con el fragmento a m/z 551 confir ma que los grupos hidr oxilos no son alílicos al doble enlace del anillo. Por otr o lado, el espectro de la luteína posee características opuestas. Esto es, el pico corr espondiente a la pér dida de agua posee mayor intensidad que el pico de la [M+H] + (figura 11). Esta característica fue también utilizada para difer enciar zeinoxantina y a -criptoxantina, ya que ambos poseen el mismo espectr o UV -visible y la misma masa molecular (De Rosso y Mer cadante, 2007), aunque solamente el último pr esente actividad de vitamina A. Según lo comentado en la sección “Nociones básicas de f igura 1 1. Estructuras químicas y espectros de masas de luteína y zeaxantina mostrando la fragmentación en la fuente. ApCI-modo positivo zeaxantina [M+H] + [M+H-18] + [M+H-92] + luteína [M+H] + [M+H-18] + [M+H-18-92] + APCI - modo positivo APCI - modo positivo 96 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano consecuencia del flujo de infor mación biológica (figura 1) (Gomase et al. 2008). Así, la genómica es la ómica que estudia el ADN de un organismo o célula, es decir , su carga genética o su genotipo. El siguiente eslabón en el flujo de infor mación es el ARN mensajer o, que estudia la transcriptómica y apoya la infor mación para el estudio de las pr oteínas, objeto de la pr oteómica. El objetivo de la última de las grandes ómicas son los metabolitos, r esultado de la acción enzimática de cier tas pr oteínas. El conjunto de moléculas pequeñas objeto de la metabolómica confor ma el metaboloma, definido como “la serie completa de todos los metabolitos for mados por una célula en r espuesta a su metabolismo, que compr ende el endometaboloma (todos los metabolitos intracelular es) y el exometaboloma (todos los metabolitos excr etados al fluido extracelular)”. El metabolismo, en definitiva, es una r ed extensa de reacciones metabólicas en la que los pr oductos de una reacción son los r eactantes de otra subsiguiente. Por ello, se define metabolito como “cualquier inter medio o pr oducto final del metabolismo, usualmente r estringido a pequeñas moléculas que no están genéticamente codificadas”. En función tanto de las rutas metabólicas en las que están implicados los metabolitos como de su función se pueden clasificar en: a) Metabolitos primarios: aquellos que están dir ectamente implicados en el cr ecimiento, desarrollo y r epr oducción del organismo. b) Metabolitos secundarios: los que no están dir ectamente implicados en los pr ocesos de crecimiento, desarr ollo y r eproducción, per o generalmente tienen una función biológica impor tante como, por ejemplo, la defensa contra pr edadores, parásitos o enfer medades, competencia entr e especies o para facilitar los pr ocesos de repr oducción (color es, olor es, etc.). El metaboloma y , por lo tanto, el estado metabólico de un ser vivo, puede verse afectado por diversos factor es intrínsecos (edad, estado de salud, estado r eproductivo, etc.) y extrínsecos (nutrientes, compuestos ar tificiales como pesticidas o fer tilizantes, en caso de plantas, y fár macos, contaminantes, etc., en caso de animales y ser es humanos). Por eso, el estudio del metaboloma es de gran impor tancia para conocer el estado de un organismo y cómo le afecta su entor no. El metaboloma está considerado la última expr esión de la infor mación biológica, por lo que se r elaciona directamente con el fenotipo. Como ejemplos se pueden considerar los pigmentos, que afectan el color de la piel y el pelo, o la acumulación de azúcar es, que propor ciona el sabor dulce a la fruta. La infor mación obtenida a par tir de todas o algunas de estas ómicas puede combinarse para conseguir un conocimiento más completo de la biología de un organismo y , en consecuencia, de los pr ocesos que afectan el crecimiento, el envejecimiento, las r eacciones a estímulos exter nos, etc. El uso de la infor mación combinada pr oveniente de varias ómicas constituye la biología de sistemas. La metabolómica pr esenta impor tantes ventajas para el f igura 1. Relación entre las distintas ómicas en función del flujo de información biológica, desde la car ga genética hasta su expresión final como metabolitos. 97 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano la establece el númer o de clases, subclases, familias, etc. de lípidos que existen y sus acciones clave para el funcionamiento del organismo, en el caso de la nutrimetabolómica su impor tancia viene dada por la variedad entr e sujetos que a su vez da lugar a su difer ente compor tamiento frente a los alimentos, lo que justifica la investigación sobr e la dieta personalizada. e stra tegias analÍticas en met abolómica y sus PrinciP ales objetiVos Existen distintas estrategias analíticas en metabolómica entr e las que se puede elegir dependiendo del objetivo del estudio. En general, todas ellas se caracterizan por un costo menor de análisis por muestra y tiempos de análisis más cor tos que en las otras grandes ómicas. Perfil metabolómico El per fil metabolómico o metabolomic pr ofiling se utiliza para clasificar muestras con base en una característica deter minada (pr ocedencia, relevancia u origen biológico). Se utilizan espectr os de resonancia magnética nuclear (NMR) o de espectr ometría de masas (MS) del conjunto de metabolitos en estudio para obtener un conjunto de señales características. Es una estrategia rápida, per o los datos obtenidos son genéricos, ya que no apor tan infor mación específica de los metabolitos, por lo que se orientan a la clasificación rápida de numer osas muestras utilizando estadística multivariante. Como ejemplo, V an Ruth et al. (2011) analizar on el conjunto de car otenoides de la yema de huevo mediante esta estrategia para discriminar entr e huevos convencionales y orgánicos. estudio de un sistema biológico con r especto al resto de las ómicas. Para llevar a cabo este tipo de estudios se utilizan platafor mas analíticas que se caracterizan por tener una excelente r eproducibilidad analítica y biológica con un bajo costo de análisis por muestra, en contraposición a los costos de aplicación de cualquiera otra de las grandes ómicas. Además, la metabolómica es mínimamente invasiva, no r equiere una pr eselección de los analitos y per mite llevar a cabo estudios exploratorios. Sin embargo, esta disciplina pr esenta cier tas características que la hacen más compleja que otras ómicas en algunos aspectos. Los metabolitos son moléculas muy diversas químicamente, no se encuentran confinados, como en el caso del ADN, y están pr esentes en el organismo en una gran númer o (en el ser humano puede haber unos diez mil metabolitos, mientras que un sistema vegetal puede alcanzar hasta 200.000) y en un amplio rango de concentraciones que puede abar car hasta nueve órdenes de magnitud (de picomoles a milimoles). La gran variedad de analitos y su amplio rango de concentraciones hacen necesaria la aplicación de técnicas muy diversas, tanto para la pr eparación de la muestra como para el análisis de los metabolitos en cuestión, jugando un papel clave la experiencia del investigador para seleccionar las más adecuadas en función de la naturaleza de los metabolitos a deter minar y de la matriz de la muestra. La enor me variedad de metabolitos y de tipos de sistemas que abar ca la metabolómica ha dado lugar a la división de la disciplina en subdisciplinas, entr e las que destacan por su extensión la lipidómica (dividida a su vez en difer entes ramas en función de la clase de lípidos considerados: acil- lipidómica, glicer ofosfolipidómica, etc.), y la nutrimetabolómica, mediante la que se estudian las dosis y cambios temporales en compuestos de bajo peso molecular en r espuesta a tratamientos dietéticos. Mientras que en lipidómica la extensión 98 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano manejables y , finalmente, en resultados interpr etables. Los metabolitos se identifican mediante dos vías: La comparación con patr ones o con bases de datos especializadas (pr eferiblemente mediante ambas para una identificación segura). Esta estrategia per mite la identificación de nuevos metabolitos que estén implicados en rutas metabólicas y , por lo tanto, el conocimiento de dichas rutas. H erramient as analÍticas utilizadas en met abolómica La selección de las herramientas analíticas más adecuadas en cada caso depende del objetivo del estudio, que a su vez delimitará la estrategia analítica a utilizar y , por lo tanto, el método analítico que se r equiere poner a punto: a) Para obtener el per fil metabolómico, la situación más común es un análisis dir ecto de la muestra precedido de etapas muy simples, como la dilución o la eliminación de pr oteínas. b) Cuando se trata de análisis orientado los pr otocolos son más selectivos, ya que es necesario obtener la fracción deseada eliminando o minimizando la pr esencia de especies inter fer entes; lo que en definitiva requier e un mayor númer o de etapas en la pr eparación de la muestra. c) Si se trata del análisis metabolómico global se r equieren pr otocolos genéricos no selectivos con el fin de identificar el mayor númer o posible de metabolitos. En la figura 2 se muestra el diagrama de flujo de un pr oceso analítico en metabolómica en función de la estrategia, que se puede r esumir en las siguientes etapas: selección y Análisis orientado El análisis orientado (dirigido) o targeted analysis se r estringe a un númer o limitado de metabolitos (a veces un único metabolito) que han sido caracterizados pr eviamente, por lo que r epresenta una pequeña fracción del metaboloma. La cuantificación de metabolitos clave con funciones bien definidas en rutas metabólicas puede usarse para la detección de per turbaciones de estas rutas, lo que per mite obtener infor mación sobr e el estado general del sistema en estudio. El análisis orientado, al estar enfocado a un grupo r educido de metabolitos, r equiere una etapa de pr eparación de la muestra generalmente laboriosa como, por ejemplo, una extracción en fase sólida (SPE). Cier tos autor es argumentan que el análisis orientado no puede considerarse una estrategia de la metabolómica, sino un mer o análisis de un númer o limitado de compuestos. No obstante, la selección de esos compuestos para r ealizar el seguimiento de un pr oceso metabólico (o para la discriminación entre difer entes compor tamientos metabólicos) constituye estrictamente un estudio metabolómico. Análisis metabolómico global El análisis metabolómico global o untargeted analysis se r efiere al análisis cualitativo y cuantitativo de todos los metabolitos pr esentes en un sistema. Es una estrategia que requier e la integración de los r esultados obtenidos por aplicación de difer entes métodos de preparación de la muestra y distintos métodos de análisis basados en difer entes técnicas de separación y de detección. Además, el conjunto de datos obtenidos mediante la aplicación de estos métodos es muy extenso, por lo que r equiere tratamientos con técnicas quimiométricas avanzadas para conver tirlos en datos 99 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano el muestr eo, la primera etapa del tratamiento en el caso de muestras líquidas es la eliminación de par tículas en suspensión o la pr ecipitación de proteínas, si se trata de muestras clínicas; mientras la extracción de los metabolitos en muestras vegetales sólidas se facilita mediante secado y pulverización o por trituración de la muestra. La etapa de interrupción del metabolismo es clave para su estudio in vivo, ya que su objetivo es evitar los cambios causados por la actividad enzimática desarr ollados tras el muestr eo. Esta etapa debe ser muy rápida, prácticamente instantánea, compatible con las siguientes etapas del pr oceso pr eparación de la muestra, extracción de los metabolitos y análisis con o sin separación pr evia. Selección del tipo de muestra y muestreo Una vez planificado el estudio a r ealizar , la primera etapa es la selección de la muestra que, dependiendo del sistema, puede ser un biofluido, células o tejidos en análisis animal o clínico, u hojas, frutos, raíces, flor es, etc., si se trata de plantas. La etapa de muestr eo es de gran impor tancia ya que influirá decisivamente en el r esultado final. La repr esentatividad es la característica fundamental de un buen muestr eo. Realizado f igura 2. Esquema general del proceso analítico en metabolómica. Análisis orientado / Análisis global metabolómico Análisis orientado / Análisis global metabolómico Per fil metabolómico Per fil metabolómico Muestra Muestra 100 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano fr ecuente) o en extracción sólido-líquido, más propiamente conocida como lixiviación. Las difer entes alter nativas para llevar a cabo esta última incluyen las técnicas convencionales, como la maceración y la extracción Soxhlet, muy utilizadas por su simplicidad y el bajo costo del dispositivo experimental. Una mejora sustancial en la eficiencia y en el tiempo de extracción se ha conseguido al sustituir las técnicas convencionales por otras basadas en el uso de líquidos sobr ecalentados o fluidos super críticos. Inconvenientes de cada uno de estos tipos de extracción son que en los primer os se utilizan temperaturas altas que pueden degradar los compuestos ter molábiles; mientras los fluidos super críticos (generalmente CO 2 ) son no polar es, por lo que la lixiviación de compuestos polar es o iónicos requier e el uso de coextractantes que complican el método en cuestión. La extracción con CO 2 super crítico puede pr oporcionar métodos muy selectivos, como en el caso de la extracción de la cafeína del café y del té (Park et al. 2007), per o con el inconveniente del alto costo de adquisición y de uso (teniendo en cuenta que la despr esurización del sistema propor ciona el extracto seco, per o que la ausencia de r esiduos del extractante requier e que éste sea de alta pur eza). La extracción con etanol sobrecalentado la han utilizado Mustafa et al. (2012) para obtener los car otenoides de zanahorias desechadas; mientras que Liau et al. (2010) usar on CO 2 super crítico con etanol como coextractante para extraer lípidos y car otenoides de microalgas de la especie Nannochlor opsis oculata. Energías auxiliar es como microondas (MW) o ultrasonidos (US) se han utilizado en una amplia variedad de muestras para favor ecer la transferencia de masa del sólido al lixiviante. La limitación en la aplicación de alguna de estas energías es la ter molabilidad de los metabolitos (en el caso de las MW) y la pr oducción de radicales libres en medios polar es sometidos a la acción de los US. La eficacia de la lixiviación de analítico, y no debe pr oducir cambios físicos o químicos en los metabolitos. Estos r equerimientos hacen que las alter nativas más empleadas en esta etapa sean la disminución de la temperatura hasta un intervalo compr endido entre –20 y –80 ºC y el uso de valor es extremos de pH, tanto ácidos como básicos. Extracción de los metabolitos Las características de la etapa genéricamente conocida como extracción dependen del estado físico de la muestra y del tipo de estrategia metabolómica subsiguiente, per o su objetivo es siempr e separar , de for ma más o menos selectiva, los metabolitos en estudio de la matriz de la muestra. Mientras en análisis orientado se r equiere una alta selectividad, esta característica en análisis global conduciría a una muestra tratada con escaso númer o de metabolitos, situación no deseable. El estado físico de la muestra condiciona la técnica utilizada para conseguir el aislamiento más o menos selectivo de los metabolitos, que puede ser extracción líquido–líquido (LLE) o SPE en el caso de muestras líquidas. La última de estas técnicas, así como su versión miniaturizada —micr oextracción en fase sólida (SPME)— se utilizan ampliamente en sus versiones manuales y automatizadas para la limpieza de la muestra o la pr econcentración de los metabolitos o con ambos objetivos. Los compuestos r etenidos dependerán del tipo de sorbente utilizado y pueden ser los metabolitos de inter és o las especies potencialmente inter fer entes. El pequeño volumen de muestra que se r equiere en SPME la convierte en una herramienta muy útil en análisis clínicos. La selección del eluyente juega un papel clave en el factor de pr econcentración que se consigue con la SPE en cualquiera de sus for matos. La obtención de una disolución de los metabolitos a par tir de una muestra sólida puede basarse en digestión (de uso poco 101 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano per mite la combinación de difer entes espectros de una misma muestra, denominadas técnicas NMR bidimensionales, con lo que se puede conocer la interacción de los núcleos de una misma molécula. Aunque estas técnicas pr oporcionan mayor infor mación cualitativa, los tiempos de adquisición de datos son más largos, incluso de un día. Un ejemplo del uso de esta técnica para obtener un per fil metabolómico es el estudio de Neily et al. (2011), en el que obtuvier on el espectro 1 H-NMR de los car otenoides presentes en pieles de difer entes tomates transgénicos a difer entes tiempos de desarrollo. Mediante comparación por análisis de componentes principales (PCA) de los espectr os obtenidos consiguieron difer enciar variedades y estadios de desarr ollo. Las espectr ometrías infrarroja y Raman también se han utilizado para la obtención del per fil metabolómico, ya que tienen un pequeño costo por análisis y tiempos de toma y tratamiento de datos cor tos. Sin embargo, al contrario que la NMR, la infor mación estructural que pr oporcionan es más limitada y son poco sensibles. La espectr ometría Raman se utiliza para deter minar el nivel de car otenoides en piel, ya que es no invasiva y no implica peligr o personal si se aplica in vivo. La MS (basada en la ionización, posterior fragmentación y detección de los iones for mados por los analitos de inter és) es una técnica ampliamente utilizada, no sólo en metabolómica, sino también en otras ómicas, como la pr oteómica. La infor mación que pr oporciona incluye la masa exacta del metabolito y la elucidación de su mecanismo de fragmentación, lo que per mite la identificación de su estructura. El análisis sin separación pr evia presenta la ventaja r especto a otras técnicas de que un espectr ómetro de masas se comporta, en cier to modo, como un equipo de separación, ya que per mite separar las señales en función de la r elación masa/carga ( m/z ) de los car otenoides asistida por US en comparación con la extracción convencional se puso de manifiesto en el estudio de Y e et al. (2011), en el que demostrar on que, en presencia de US, la cantidad de estos compuestos extraída de maíz es hasta 10 veces mayor que sin la aplicación de US y que para conseguir extraer la misma cantidad, la extracción con us r equiere 10 veces menos tiempo. Análisis sin etapa de separación: análisis directo Los análisis sin separación pr evia se utilizan casi exclusivamente para la obtención del per fil metabolómico. Para estos análisis se usan principalmente la NMR, la MS y, en menor pr oporción, las espectr ometría infrarr oja y Raman. La NMR es una técnica no destructiva y , por lo tanto, muy útil para muestras valiosas, con una pr eparación de muestra simple y rápida (nor malmente sólo r equiere dilución). Además, per mite obtener espectr os NMR directamente de células y tejidos, así como monitor ear metabolitos sensibles al proceso de extracción. Por otr o lado, presenta una menor sensibilidad que la MS, r equiere el uso de disolventes deuterados, sobr e todo metanol o clor ofor mo, y el agua presente en los sistemas biológicos ocasiona inter fer encia, por lo que debe llevarse a cabo la supr esión de su señal. Esta técnica se basa en la absor ción de energía de una frecuencia determinada por algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético exter no. Los núcleos atómicos pr esentes en compuestos biológicos capaces de absorber esta energía son 1 H, 13 C, 15 N y 31 P , de los que principalmente se usan los dos primer os, dando lugar a las modalidades 1 H- NMR y 13 C- NMR. La absor ción por cada tipo de núcleos depende de los núcleos de otra naturaleza pr esentes en su entor no, por lo que es útil a la hora de deter minar la estructura del metabolito en estudio. La NMR 102 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano de separación útil para el análisis de car otenoides, que son compuestos ter molábiles, ya que las altas temperaturas de trabajo pr ovocan su degradación. Por ello, la cromatografía líquida (LC) es la mejor alter nativa para la separación de car otenoides. Una de las razones que apoyan su elección es que los difer entes for matos de LC, desde los convencionales hasta los cr omatógrafos de ultrarresolución, cubr en todas las necesidades en cuanto al tamaño de muestra, capacidad y velocidad de separación de los metabolitos. Además, la posibilidad de uso de una gran variedad de fases móviles y de fases estacionarias (columnas) aumenta su versatilidad para la separación de difer entes tipos de metabolitos. Las columnas de fase r eversa, principalmente las empaquetadas con sílice (C 30 o C 18 ), se caracterizan por una fuerte interacción con compuestos de baja polaridad, mientras que las columnas de fase nor mal, como las HILIC, son más eficaces para compuestos polar es. La CE es una técnica de separación que se usa especialmente para análisis orientados de metabolitos polar es. Para la separación se r equiere un medio electr olítico cuya elección depende de la naturaleza química de los metabolitos a separar . Para metabolitos con carga per manente como antocianos o flavonoides sulfatados se utiliza como medio electr olítico un tampón acuoso (Bedná et al. 2005); para metabolitos con grupos hidr oxilo se requier e un pH básico, mientras que aquellos que no pueden clasificarse como ácidos o bases (por ejemplo azúcar es o glucósidos fenólicos) necesitan derivatización pr evia (Unger , 2009); por último, para compuestos poco o no polar es es necesario utilizar un tampón acuoso que contenga un disolvente orgánico miscible como acetonitrilo, dietilamina, etc. (Porras y Kenndler , 2005). T ras la aplicación de alguna de las etapas de separación comentadas, el detector más utilizado en metabolómica es el compuestos. Aunque la MS con inyección dir ecta (DIMS) es una técnica muy útil para la obtención del per fil metabolómico, la combinación de MS y técnicas de separación pr evia ha ganado mucha impor tancia en metabolómica, por lo que se explica más detalladamente en la subsección siguiente. Análisis con etapa de separación previa Los métodos de análisis que implican separación pr evia a la detección, aunque se han utilizado en ocasiones para la obtención del per fil metabolómico, se usan más ampliamente en el caso de análisis orientados y análisis globales metabolómicos, ya que per miten la detección individual de los metabolitos para su cuantificación o identificación, siendo las técnicas cr omatográficas (de gases o de líquidos) las más usadas en este ámbito —en menor pr oporción se utiliza la electr oforesis capilar (CE)—. La cr omatografía de gases (CG) per mite la separación de compuestos volátiles, como, por ejemplo, compuestos ar omáticos. Puede incorporar un muestr eador de espacio de cabeza (HS) en el que se calienta la muestra en un vial cerrado, cr eando una atmósfera en su interior en la que se concentran los compuestos volátiles. El HS, además, se puede combinar con la SPME, concentrando así los compuestos volátiles en el sorbente, como en el caso del estudio de Donadio et al. (2011), en el que analizar on mediante HS-SPME/GC-MS los derivados volátiles de car otenoides generados por micr oorganismos en aguas salinas. Para la separación de compuestos menos volátiles es necesaria una r eacción de derivatización de los metabolitos con la que se aumente su volatilidad. A pesar de que la cr omatografía de gases está muy extendida para el análisis de compuestos volátiles así como de ácidos grasos y fenoles pr evia derivatización, no es una técnica 103 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano cr eada a par tir de patrones de los compuestos de inter és a distintas concentraciones. Una de las mejor es for mas de compensar los efectos de la supr esión de ionización es la utilización de estándar es inter nos adecuados, cuyos mejores exponentes son los mar cados con algún isótopo estable, como 13 C, 15 N, 18 O o, más comúnmente, 2 H (Fer nández-Peralbo et al., 2014). Otr o analizador de masas muy usado para análisis metabolómico global es la trampa de iones (IT), que se combina fr ecuentemente con un GC, por lo que está orientado al análisis de compuestos volátiles, que pueden ser metabolitos o sus pr oductos de derivatización. La incompatibilidad entr e las altas temperaturas con las que se trabaja en GC y la ter molabilidad de los car otenoides explica que el acoplamiento GC- MS(IT) no se haya utilizado para el análisis de estos compuestos, aunque sí para sus derivados, como se comenta en la sección “Metabolismo de los car otenoides en el organismo humano”. Detector es más asequibles, tanto por su costo de adquisición y mantenimiento como por su manejo y tratamiento de los datos, también se han utilizado para análisis orientados en metabolómica. Espectr ofotómetros de absor ción molecular en la zona UV -visible, tanto de tipo convencional como de diodos en fila (DAD) y los de emisión de fluor escencia (FLD) conectados a un LC se utilizan en análisis sencillos de pocos compuestos o en etapas de optimización de un método en las que la evolución global en función del cambio de las variables en estudio puede seguirse a través la comparación del per fil cr omatográfico. La omnipresencia de grupos absorbentes en los car otenoides hace de la fotometría una técnica de detección muy útil para el seguimiento de las etapas de optimización, generalmente en la zona visible del espectr o. MS, que apor ta una gran exactitud en la medida de las masas y una excelente sensibilidad. El MS de cuadrupolo tiempo de vuelo (QTOF) posibilita la ionización de los compuestos (modo MS) y su fragmentación (modo MS-MS) pr oporcionando una exactitud en el valor de las masas obtenidas del or den de 0.0001 unidades de m/z y generando una gran cantidad de infor mación de cada uno de los metabolitos para su posterior identificación. Este analizador de masas se caracteriza por pr oporcionar una alta selectividad, mientras que su sensibilidad es menor que la de otr os analizadores de masas como el de triple cuadrupolo (QqQ). El QTOF se combina con fr ecuencia con un cr omatógrafo de líquidos o de gases para el análisis global metabolómico. Entr e las fuentes de ionización más comunes en MS, la ionización química a pr esión atmosférica (APCI) es la preferida en análisis de car otenoides, ya que sus condiciones de trabajo suaves se adaptan mejor a la ter molabilidad de estos metabolitos. La excelente sensibilidad de los equipos de q q q los convier te en los pr eferidos para el análisis cuantitativo en estrategias orientadas. Este detector también ioniza y fragmenta los metabolitos per o, a diferencia de los QTOF , registra una señal en el modo de análisis denominado monitor eo de r eacciones seleccionadas ( selected reaction monitoring, SRM) corr espondiente a una transición del ión precursor (compuesto ionizado) al ión pr oducto (fragmento generado). Debido a la múltiple fragmentación de los compuestos, es necesaria una optimización de los parámetr os de ionización y fragmentación con el fin de seleccionar el fragmento con la mayor señal posible sin per der la señal del ión precursor . Esta transición se r elaciona con la concentración del metabolito mediante interpolación de la señal obtenida en una r ecta de calibrado 104 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano r equiere herramientas quimiométricas y bioinformáticas para el tratamiento de los datos brutos. El análisis de los datos generados en estudios metabolómicos es complejo y r equiere varias etapas, como se esquematiza en la figura 3. Preprocesado de datos La finalidad del pr eprocesado de datos es la transformación de los datos “brutos” (los que pr oporciona el instrumento analítico y que son exclusivos de la mar ca comercial) en datos “limpios” (aquellos que poseen un for mato universal) para su pr ocesado por cualquier softwar e de tratamiento de datos. Las principales técnicas de pr eprocesado de datos son: No ocurr e lo mismo en el caso de la fluorimetría, ya que la emisión luminiscente r equiere una etapa de derivatización con la que se consigue la rigidez suficiente de la molécula para la desactivación radiante. La ventaja de ambos tipos de detector es es que no son destructivos, por lo que se pueden acoplar en línea con otr os detectores, como un MS. a nálisis de da tos en met abolómica El análisis de datos es de gran impor tancia en metabolómica, ya que per mite transfor mar los datos brutos en infor mación útil para el estudio. La obtención de este tipo de infor mación f igura 3. Etapas del análisis de datos en metabolómica. 105 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano a) Nor malización, que per mite estandarizar los datos para hacerlos comparables mediante el ajuste del ruido. b) Escalado, que establece la intensidad de las difer entes señales en función de la más intensa con el fin de facilitar la comparación entr e ellas. c) Centrado, que nor maliza los datos y usa el valor medio para trasladar el centr o de gravedad y disminuir la impor tancia de deter minadas señales. d) Detección de valor es anómalos ( outliers ), que identifican las variables, muestras o combinaciones de ambas que se desvían de la distribución nor mal de la mayoría de los datos. Procesado de datos Los estudios metabolómicos generan una gran cantidad de datos que dependen de un númer o grande de variables. El pr ocesado per mite aplicar análisis univariantes y multivariantes a estos datos para conseguir infor mación útil de ellos. El análisis multivariante es el más usado en metabolómica, al estar implicadas muchas variables. Integra un conjunto de técnicas estadísticas cuya finalidad es analizar simultáneamente un conjunto de datos for mados por varias variables medidas en cada muestra. Sus objetivos son visualizar los datos, es decir , conseguir detectar relaciones entr e las diferentes muestras usando gráficas, animaciones o imágenes; el análisis de datos para buscar pautas consistentes o r elaciones entre las variables que componen un conjunto de datos complejo y el modelado de los datos para deter minar r elaciones entre conceptos y objetos mediante la pr eparación de un modelo matemático. Las técnicas de análisis multivariante se clasifican en dos grupos según su finalidad: a) Deconvolución, que per mite r esolver in silico señales solapadas en NMR o GC- y LC-MS. Para técnicas cr omatográficas se genera una tabla de señales donde cada metabolito se r epresenta por una variable. b) Alineamiento, mediante el que se or denan las señales corr espondientes a los mismos metabolitos en registr os NMR y en cr omatogramas para que tengan el mismo desplazamiento químico o el mismo tiempo de r etención, ya que son valores variables entr e análisis. Es una etapa muy útil para la combinación de datos pr ocedentes de diferentes muestras. c) Corr ección de la línea de base, para la eliminación del ruido de fondo en r egistros NMR y en cr omatogramas, así como de señales no asociadas con metabolitos. El ruido de fondo puede ser químico, debido al pr oceso de medida, o aleatorio, asociado con el sistema de detección. d) Corr ección de fase, que se utiliza para eliminar la asimetría de los picos en los espectr os NMR obtenidos por la transfor mada de Fourier . e) Selección de picos ( peak-picking ), que organiza las señales obtenidas mediante NMR y MS y las pr esenta como tabla para su posterior tratamiento. Pretratamiento de datos Para esta etapa los datos se pr esentan nor malmente como una tabla que contiene los r esultados analíticos a los que se aplican difer entes operaciones matemáticas para facilitar la comparación entr e muestras. Las operaciones aplicadas con mayor fr ecuencia con este propósito son: 11 2 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano en la conservación del semen podrían estar afectadas por la ingesta de car otenoides, pero se desconoce el pr oceso de incorporación de estos compuestos al semen, por lo que un estudio metabolómico podría ser clave para aclarar este aspecto. El efecto negativo del b -car oteno combinado con los compuestos oxidantes del tabaco en el desarr ollo de cáncer de pulmón, r evisado por Saler no, Crifò y Siems (2010), o la r elación entre la concentraciones de car otenoides en suer o mater no y en suer o fetal en el par to, estudiada por Scaife et al. (2007), son algunos ejemplos de la impor tancia de los car otenoides en el organismo humano. La necesidad de infor mación de los pr ocesos y rutas metabólicas implicados en cada caso abr e una vía a futuros estudios metabolómicos para su esclar ecimiento y subsiguientes actuaciones. Una base sólida para estos estudios la constituye el método desarr ollado por Ferr eiro-V era et al. (2011) para el análisis de carotenoides en plasma basado en el acoplamiento en línea de SPE automática y HPLC-DAD. r et os Pendientes en el binomio met abolómica - carotenoides De los r etos pendientes que engloban la metabolómica y los car otenoides hay que distinguir entre los que se r efier en a su biosíntesis y destino en plantas y los que se r elacionan con las vías mediante las cuales el organismo humano los metaboliza. A pesar de que se han hecho pr ogresos significativos para explicar el metabolismo de los car otenoides en plantas, quedan todavía aspectos r elevantes que no se han resuelto en mayor o menor pr oporción, como: piel y , en consecuencia, una disminución en la concentración de radicales libr es. Aguilar et al. (2014), por otro lado, establecier on la relación entr e el aumento en la ingesta de frutas y ver duras y la mayor acumulación de carotenoides en la piel, que a su vez corr elacionaron con el contenido en sangr e. En ambos estudios se obtuvo la concentración de car otenoides en piel mediante análisis in vivo usando espectr ometría Raman de r esonancia. Los datos del exhaustivo cuestionario pr oporcionado por cada participante posiblemente hubieran dado lugar a estudios metabolómicos, además de los simples diagramas de barras r ealizados por los autores. La acumulación de car otenoides que se produce en la r etina ocular se considera que puede fr enar los procesos que originan la degeneración macular , una de las principales causas de ceguera irr eversible. Como base para cualquier estudio metabolómico en esta ár ea, Bhosale y Ber nstein (2005) pusier on a punto un método de cuantificación de luteína, zeaxantina y 3’-oxoluteína en la r etina de personas muer tas basado en HPLC-APCI-MS. La sensibilidad del método permitió la cuantificación de la 3’-oxoluteína, un pr oducto de oxidación de luteína y de zeaxantina; lo que puede constituir una excelente vía para estudiar el metabolismo de car otenoides en este compar timento tan sensible y crucial para el individuo. La acumulación r elativa de carotenoides en plasma y semen (ocho y cuatr o carotenoides, r espectivamente, considerados en el estudio) en pacientes fér tiles e infér tiles estudiada mediante HPLC-UV -FLD fue investigada por Benedetti et al. (2012). Los r esultados obtenidos mostraron que una mayor concentración de car otenoides en sangre conlleva una mayor concentración en semen, lo que está r elacionado directamente con la calidad del semen y la fer tilidad del paciente. Este estudio deja entr ever que las rutas metabólicas implicadas 11 3 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano del binomio considerado. Un estudio en pr ofundidad de los difer entes aspectos implicados en la regulación de los car otenoides propor cionará conocimientos sobr e los mecanismos r egulatorios que facilitará las estrategias transgénicas para modificar el contenido y la composición de estos compuestos con r esultados predecibles en las difer entes especies de plantas. Con r especto al conjunto de procesos que experimentan los car otenoides en el ser humano, existen numerosas lagunas que impiden conocer en pr ofundidad cómo se metabolizan estos compuestos. La gran mayoría de los estudios llevados a cabo hasta la fecha r elacionan directamente la ingesta de car otenoides con su función final o su acumulación, pero en ellos no se considera qué ocurr e en las etapas que tienen lugar entr e ambos extremos, así como aspectos de esta ár ea que deberían ser objeto de investigación son los siguientes: a) El efecto que la digestión tiene sobr e los carotenoides. Las r eacciones químicas y bioquímicas en las que pueden estar implicados durante el pr oceso digestivo; el papel, posiblemente clave, de la micr oflora intestinal en los cambios pr oducidos, que influirán de for ma decisiva en la facilidad con que son absorbidos y transpor tados a los difer entes puntos de acción o acumulación. b) Las vías de transpor te de los car otenoides a fluidos biológicos, como la sangr e, y los compuestos que pueden favor ecer o dificultar este proceso son aspectos poco o nada conocidos que demandan investigación adecuada. c) Las zonas de acumulación de los car otenoides en el organismo humano y , especialmente, su función en ellas. Aunque se ha compr obado la acumulación de estos a) No se conocen suficientemente los mecanismos r egulatorios globales que sustentan el metabolismo de los car otenoides y los elementos genéticos que r egulan la expresión de los genes de la biosíntesis de estos metabolitos secundarios, por lo que la infor mación “corriente arriba” que pr oporciona la metabómica puede ser impor tante para aclarar estos mecanismos. b) Las moléculas señalizadoras que inician el desarr ollo de los plastidios para la biosíntesis y acumulación de los car otenoides son muy poco conocidas, lo que debería constituir una línea de investigación primor dial del binomio metabolómica- car otenoides. c) La acción de la luz en el contr ol de la biosíntesis de car otenoides es bien conocida, pero cómo la luz r egula r ealmente este proceso sigue siendo una incógnita para cuya r esolución es imprescindible la metabolómica. d) La infor mación de cómo el flujo metabólico se distribuye entr e las diferentes ramas de las rutas biosintéticas de los isopr enoides es muy limitada, por lo que la flujómica, como ómica derivada de la metabolómica, tiene un papel clave en la obtención de la infor mación necesaria sobr e este aspecto. e) El conocimiento exhaustivo de las interacciones entr e la ruta biosintética de los car otenoides y otras rutas, y la for ma en que estas interacciones influyen en el cr ecimiento y desarrollo de la planta es un r eto en investigación claramente dependiente de la metabolómica. La for ma en la que se pr oduce la regulación de la r enovación de los car otenoides en las plantas para mantener la homeostasis constituye otra de las asignaturas pendientes 11 4 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano El estudio de todos estos aspectos podrá significar un mejor conocimiento de la implicación de los car otenoides en el organismo, así como al desarr ollo de planes total o par cialmente personalizados para una ingesta adecuada de compuestos que conduzcan a conseguir mejoras en la salud de cada individuo. compuestos en zonas como la piel y la r etina ocular , o en fluidos como el semen, poco se conoce acer ca de las funciones que r ealizan, relacionadas o no con enfermedades u homeostasis. d) El metabolismo de los car otenoides en el organismo, apar te de su carácter de pr ecursores de vitaminas, está escasamente estudiado. AGRADECIMIENT OS 11 5 5. E stra tEgias En mEt abolómica p ara El Estudio dE los carotEnoidEs En plant as y su acción En El organismo humano Aguilar , S.S., Wengr een, H.J., Lefevr e, M., Madden, G.J. y Gast, J. 2014. Jour nal of the Academy of Nutrition and Dietetics 114: 1174-1180. Bedná , P ., Papoušková, B., Müller , L., Bar ták, P ., Stávek, J., Pavloušek, P . y Lemr , K. 2005. Jour nal of Separation Science 28: 1291-1299. Benedetti, S., T agliamonte, M.C., Catalani, S., Primiterra, M., Canestrari, F ., De Stefani, S., Palini, S. y Bulletti, C. 2012. Repr oductive Biomedicine Online 25: 300-306. Beyoglu, D. y Idle, J.R. 2013. Biochemical Phar macology 85: 12-20. Bhosale, P . y Ber nstein, P .S. 2005. Analytical Biochemistr y 345: 296-301. Bolhassani, A., Khavari, A. y Bathaie, Z.S. 2014. Biochimica et Biophysica Acta 1845: 20-30. Bondia-Pons, I., Cañellas, N., Abete, I., Rodríguez, M.A., Per ez-Cor nago, A., Navas-Carreter o, S., Zulet, M.A., Corr eig, X. y Mar tínez, J.A. 2013. 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Heredia a pliCaCión de las medidas de espeCtrometría visible y de Color al análisis de Carotenoides en aliment os i ntroducción El color de los alimentos tiene un impor tante efecto psicológico en el consumidor , de ahí su r elación bien establecida con la aceptación y el empleo extendido de colorantes en la industria alimentaria. La disponibilidad de métodos apr opiados para evaluar este parámetr o de calidad es, por consiguiente, una necesidad de esa industria. Aunque la evaluación visual se emplea en el contr ol de calidad de alimentos y es de gran utilidad para algunos fines, los métodos instrumentales objetivos de medida del color ofr ecen una serie de ventajas en el control de calidad en distintas fases de la pr oducción, transfor mación y comercialización de los alimentos. Los car otenoides, son r esponsables del color de muchos alimentos y se usan como colorantes naturales, tanto individualmente ( e.g. b -car oteno, licopeno, luteína) como en extractos ( e.g. annatto, azafrán), si bien, como ya se ha comentado, su impor tancia va más allá de su papel como pigmentos En este capítulo discutimos la aplicación de datos espectr ométricos y de color en el análisis de car otenoides. Entre otr os aspectos, se tratan la r elación entr e C apítulo 6 11 9 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos su estructura química y el color —objetivamente medido— y la utilidad de parámetr os de color y de las medidas de absorbancia y r eflectancia en el visible para cuantificarlos. c olor : definición y a tributos Cuando observamos una fuente de luz visible o un objeto iluminado por ella, los bastones (sensibles al blanco y negr o) y conos (que r esponden a los estímulos de rojo, ver de y azul) dentr o de la retina envían información al cerebr o, a través del nervio óptico, que se interpr eta en tér minos de color . El color es por lo tanto un fenómeno psicofísico y complejo, r elacionado principalmente con la energía radiante espectral de una fuente de luz visible, la fisiología de la visión y la psicología del observador . La percepción del color de un objeto depende en cier ta medida de su composición, aunque esto no significa que el color sea una pr opiedad inherente del objeto, que puede absorber par te de la luz visible que le llega y r eflejar , transmitir o dispersar el resto. De hecho, el color per cibido del objeto cambia si cambiamos las características espectrales de la fuente que lo ilumina (Wyszecki y Stiles, 2000; Hutchings, 1994). Es impor tante considerar que el color es uno de los componentes de la apariencia de los alimentos más r elacionados con la percepción de la calidad, aunque la apariencia es un concepto más amplio que abar ca también otr os atributos como brillo, for ma y textura visual (Francis, 1995; Hutchings, 1994). Según Francis (1995), el color puede definirse como “el impacto de las longitudes de onda de la luz del espectr o visible de 390 a 760 nm en la r etina humana”. Es decir , el color puede definirse como una r espuesta mental al estímulo que pr oduce una radiación luminosa visible en la retina, que es transmitida al cer ebro por el nervio óptico. Otra definición es la pr oporcionada por Wyszecki y Stiles (2000); según estos autor es el color es el aspecto de la percepción visual por el cual un observador puede distinguir las difer encias entre dos campos de visión del mismo tamaño, for ma y estructura, por las difer encias en la composición espectral de la energía radiante en la observación. El estímulo colorimétrico se compone de tr es sensaciones distintas, aunque a veces hay leves discr epancias con r especto a los tér minos utilizados para su definición. Estos atributos se denominan generalmente como matiz, luminosidad o brillo y saturación, cr oma o colorido (Wyszecki y Stiles, 2000; Hutchings, 1994). Hunt (1998) define tr es atributos de las sensaciones visuales, denominadas, brillo, tono y colorido: a) brillo es el atributo según el cual un ár ea parece exhibir más o menos luz; b) el tono de un color es el atributo de la sensación visual según la cual el estímulo apar ece similar a uno de los color es percibidos: r ojo, ver de, amarillo y azul o a cier tas pr oporciones de dos de ellos; se considera el atributo cualitativo del color y está r elacionado con la longitud de onda dominante del espectr o, y c) el colorido es el atributo según el cual un ár ea parece exhibir más o menos de su tono. Además, definió tr es tér minos subjetivos y relativos de la siguiente manera: a) luminosidad: brillo de un ár ea evaluado en r elación con el brillo de un área similar iluminada que par ece blanca o altamente transmisiva, b) cr oma: es el colorido de una zona juzgada en r elación con la luminosidad de un área iluminada de for ma similar que par ece blanca o altamente transmisiva y c) saturación: el colorido de una zona juzgado en r elación con su brillo. 120 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos y un orbital molecular pi antienlazante (π*), tal que uno de los electr ones π de la cadena poliénica es ascendido a un orbital π* pr eviamente desocupado. Debido al hecho de que los electr ones π están altamente deslocalizados en el cromófor o de dobles enlaces conjugados (d.e.c.), el estado excitado es de poca energía en comparación con otras moléculas, así que la energía de la radiación visible (ca. 380-770 nm) es suficiente para pr oducir las transiciones electrónicas (Britton, 1983; 1995). Los car otenoides absorben fundamentalmente luz violeta y azulada (ca. 400-500 nm), por lo que típicamente exhiben tonalidades amarillentas, anaranjadas o r ojizas. No obstante la gama de color es de estos isoprenoides puede ampliarse al azul, púrpura y ver de mediante la for mación de complejos con pr oteínas (Britton, 1992). Al menos son necesarios siete dobles enlaces conjugados (d.e.c) para que un car otenoide sea color eado, así los carotenoides más saturados como fitoeno y fitoflueno (con 3 y 5 d.e.c., r espectivamente, figura 4, del capítulo 1) son incolor os (Rodríguez-Amaya 2001). l a imPor t ancia del color en la industria aliment aria El color de los pr oductos alimentarios es de gran interés en la industria debido al efecto psicológico que ejer ce sobre los consumidor es (véase el capítulo 7). El papel del color en la aceptación de los alimentos va más allá de lo visual, ya que con fr ecuencia suele estar asociado con otras expectativas sensoriales (como ar oma y gusto) (Fer nández-V ázquez et al. , 2014), de ahí que a veces se hable de sinestesia cr omática. T ambién es importante considerar que, en la mayoría de los casos, el consumidor no está familiarizado con la naturaleza ¿P or qué los carotenoides son coloreados ? Cuando los electr ones de los átomos o de las moléculas absorben un cuanto de energía de la radiación electr omagnética se pr oducen transiciones energéticas de un estado de menor energía a otr o de mayor energía. La absorción de la radiación ocurr e cuando su energía ( E ) coincide con la difer encia de energía entr e los dos estados energéticos. No obstante, no todas las transiciones electr ónicas son posibles. La energía de la radiación puede expr esarse según la siguiente fór mula: E = h ν = hc/ l [1] donde E es la cantidad de energía, h es la constante de Planck, ν la fr ecuencia de la radiación, c la velocidad de la luz y l la longitud de onda. En las moléculas los núcleos r otan y vibran, por lo que un electr ón en su estado basal o excitado puede existir en varios niveles de energía vibracional. A su vez, para cada uno de ellos, son posibles varios niveles de energía r otacional. A difer encia de lo que ocurre con los átomos, en el caso de las moléculas la transición electr ónica no tiene un requerimiento energético específico, ya que podría ocurrir por una variedad de cuantos de energía que coincidan con las difer encias de energía entr e el estado basal y excitado para los distintos niveles de energía vibracional y r otacional. Por lo tanto, los espectr os de absorción de las moléculas contienen bandas de absor ción en lugar de líneas, ya que la absorción de la luz ocurr e en un rango de longitudes de onda (Britton 1983; 1995). En el caso de los car otenoides, la transición electrónica r elevante se produce entr e un orbital molecular pi enlazante (π) 121 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos La evaluación visual puede r ealizarse mediante la comparación de las características colorimétricas de la muestra con las de los elementos contenidos en escalas o atlas de color (sistema DIN, sistema Munsell, sistema OSA-UCS, sistema Ostwald, etc.). Otr o ejemplo de este tipo de análisis visual es la comparación del color de los zumos de naranja con los de color es de estándares de plástico desarr ollados por el Depar tamento de Agricultura de Estados Unidos (Meléndez- Mar tínez, V icario y Heredia, 2005). Estas colecciones pueden ser útiles en la industria alimentaria para diversos objetivos. Además, son por tátiles y estables en cier ta medida, aunque estudios r ecientes han revelado varios pr oblemas en una escala de color es utilizados para el análisis visual de aceite de oliva (Melgosa et al., 2000; Melgosa et al. , 2001, Moyano et al. , 1999). El análisis visual del color de los alimentos es una herramienta insustituible en la industria alimentaria y se trata en pr ofundidad en el capítulo 7. No obstante, para la evaluación objetiva deben utilizarse métodos instrumentales. a nálisis instrument al del color La medida y definición objetiva del color es un pr opósito perseguido desde hace siglos por numer osos científicos como Newton, Y oung, Helmholtz, Grassmann, Maxwell, Adams, Munsell, Hunter y muchos otr os. T radicionalmente se han utilizado tres tipos de aparatos para el análisis instrumental del color: colorímetr os, espectrofotómetr os y espectr orradiómetros. Los colorímetr os miden el color de fuentes de radiación primarias (que emiten luz pr opia) y secundarias (que reflejan o transmiten luz exter na). Estos aparatos poseen filtr os de color física del color , y que mira el producto como si su color fuese constante y no dependiente de factor es como el tipo de luz que lo ilumina. En otras palabras, se puede decir que aunque el color tiene gran impor tancia en la adquisición o el r echazo de un pr oducto, estas asociaciones también pueden ser engañosas o infundadas en algunas ocasiones. Según Clydesdale (1993) hay asociaciones alimentos-color es aceptables que se desarr ollan a una edad temprana y nos llevan a r echazar cier tos alimentos que no presentan las características colorimétricas esperadas. En este sentido, el color a menudo se r elaciona con la seguridad, grado de madur ez, estado y grado de cocción y el efecto del procesado industrial o almacenamiento, entr e otros factor es. El hecho de que los alimentos tengan asociado un color característico está muy r elacionado con la generalización del uso de colorantes en la industria, con el objetivo último de hacerlos más atractivos. El color también es muy impor tante en r elación con la aceptabilidad de los alimentos con base en factor es culturales y publicitarios. Por ejemplo, un español r echazará naranjas con ár eas verdosas en la piel, ya que las considerará inmaduras, mientras que este es el aspecto que se espera de las naranjas maduras en países tr opicales. Por otra par te, la publicidad puede llevar a los consumidor es a comprar un producto con un color extraño. a nálisis Visual del color En principio, el color de los alimentos puede evaluarse visual u objetivamente mediante instrumentos apr opiados y en condiciones adecuadas. 128 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos eléctricos de alta intensidad (PEAI) sobr e el color y el per fil de car otenoides del zumo de naranja. Los tratamientos PEAI pr ovocaron menor es disminuciones en el contenido de car otenoides que la pasteurización, y los cambios en el contenido de pigmentos estuvier on acompañados de disminuciones en a* y aumentos en b*. Además, indicar on que los tratamientos podrían conducir a cambios de color visualmente per ceptibles por los consumidores. Chen, Peng y Chen (1995) evaluar on los cambios en el per fil de car otenoides y el color de zumos de zanahoria sometidos a difer entes condiciones de procesado y observar on isomerizaciones Z/E que, en algunos casos, estuvier on acompañadas de cambios en el tono de naranja a amarillo. Más r ecientemente, en un zumo modelo de manzana de acajú ( Anacar dium occidentale ) sometido a diferentes tratamientos tér micos se observar on impor tantes cambios de color pr ovocados fundamentalmente por isomerizaciones ( Z/E y de grupos 5,6 epóxidos a 5,8-furanoides) y oxidaciones en los car otenoides (Zepka y Mercadante, 2009; Zepka et al. , 2009). Las isomerizaciones de car otenoides 5,6-epóxido a 5,8-furanoides (figura 4) están causadas por condiciones ácidas y se ven favor ecidas en algunos alimentos, como los zumos de cítricos, una vez que se pier de la compar timentación celular . En este sentido, se han observado cambios de color , algunos de los cuales son visualmente per ceptibles, como consecuencia de la pr ogresiva isomerización de anteraxantina y violaxantina a sus isómer os 5,8-furanoides (Meléndez- Mar tínez, V icario y Heredia, 2009; Melendez-Martínez et al. , 2010). En cuanto a los valor es de croma, todos los pigmentos estudiados pr esentaron valor es entr e 31-53 unidades CIELAB, excepto los car otenoides con 7 d.e.c., con valores notablemente inferior es (alrededor de 14 unidades CIELAB) (Meléndez-Mar tínez et al. , 2007). Sobr e el efecto de la isomerización de 5,6-epóxidos a 5,8-furanoides en su color , se observó que como resultado de la r eordenación de un grupo 5,6-epóxido en anteraxantina, neoxantina y violaxantina para dar mutatoxantina, neocr omo y luteoxantina, r espectivamente, se produjo una disminución en los valor es de a*, b*, C* ab y aumentos en el h ab . No obstante, la conversión del grupo r estante 5,6-epóxido en luteoxantina para dar aur oxantina produjo un incr emento de en a* y h ab y mar cadas disminuciones de C* ab y b * (Meléndez-Mar tínez et al. , 2007). Recientemente se ha estudiado el efecto de la epoxidación y la r otura oxidativa del b -caroteno en los parámetr os de color , observándose que ambas r eacciones conducen a impor tantes descensos en los valor es de b* y C* ab . Eso indica que estos parámetr os pueden ser útiles para monitorear la oxidación mediante estos mecanismos de este car otenoide provitamina A (Gurak et al. , 2014). Efectos de cambios químicos en el color de los carotenoides Los efectos de distintos tratamientos y condiciones de almacenamiento sobr e el contenido de carotenoides y el color de los alimentos han sido estudiados por varios autor es. Por ejemplo, Cor tés et al. (2006), evaluar on el efecto de la pasteurización en difer entes condiciones y mediante pulsos 129 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos La exactitud en la cuantificación de car otenoides depende de la exactitud de los coeficientes de absor ción. Para su deter minación se r ecomienda pesar entre 1 y 2 mg del pigmento pur o (con una exactitud de ± 0.001 mg.) y disolverlos completamente en un disolvente apr opiado (Britton, 1995), algo que no es tan simple como podría par ecer , sobr e todo si los carotenoidess están cristalizados, por lo que el contenido de car otenoides a menudo se subestima (Britton, 1992). De todo esto, se puede deducir fácilmente que el análisis cuantitativo de los car otenoides implica cier to grado de inexactitud. En este sentido, también es impor tante tener en cuenta que los coeficientes de absor ción de los isómeros Z son notablemente más bajos que los corr espondientes a sus homólogos (todo- E ). No obstante, pocos se han deter minado experimentalmente hasta la fecha (Britton, Liaaen-Jensen y Pfander , 2004), así que la cuantificación de estos isómer os mediante el uso de los coeficientes corr espondientes a los isómeros todo- E , implica un mayor nivel de impr ecisión. Por otra per te, cuando no se ha deter minado experimentalmente el coeficiente de absor ción específico ( ) de un car otenoide o se pretende evaluar la concentración de un extracto de car otenoides, se suele emplear un valor arbitrario de 2500 (Britton y Y oung, 1993). Sin embargo, este pr ocedimiento lleva a una subestimación notable de estos pigmentos en el caso del zumo de naranja (Meléndez-Mar tínez, 2005) y pr obablemente de otros muchos pr oductos. Estimación del contenido de carotenoides a partir medidas de absorbancia-reflectancia y de color Existe una gran variedad de estudios sobr e el color y el contenido de car otenoides de diversos alimentos como los frutos cítricos (Lee y Castle, 2001; Shim y Kim, 2002; Cor tés et al. , 2006, Beltrán González et al. , 2008; V an Wyk, Huysamer y Barr y , 2009), zanahorias (Bao y Chang, 1994; Chen, Peng y Chen, 1995), tomates (Her edia et al. , 2009; Meléndez-Mar tínez et al ., 2010) y otr os (Pérez-López et al. , 2007; Gómez-Ladr ón de Guevara et al. , 1996; Cano et al. , 1996). No obstante, en algunos casos las r elaciones entre ambos no han sido estudiadas en pr ofundidad. Determinación de carotenoides a partir de medidas de absorbancia La absor ción visible intensa de los carotenoides también es la base para su análisis cuantitativo, aspecto que se trata en el capítulo 1. f igura 4. Isomerización del grupo 5,6-epóxido (izquierda) a 5,8-furanoide (derecha). 130 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos un único punto, aunque el espectr o de absorción visible de la mayoría de los car otenoides presenta bandas de absor ción en un intervalo de unos 40 nm. Sin embargo, los valor es triestímulos de CIE X, Y , Z (a par tir de los cuales se obtienen los parámetr os de color de otr os espacios, como ya se ha mencionado) se calculan considerando el espectr o visible completo de una muestra, entr e otros datos. Por lo tanto, es razonable pensar que los parámetr os de color de un alimento pueden utilizarse para evaluar su contenido de pigmentos, ya que éstos son los principales r esponsables del espectro visible. La utilidad de las coor denadas de color para estimar el contenido de licopeno en difer entes productos del tomate está bien documentada. D’Souza, Singha e Ingle (1992) concluyer on que tanto a* como L* se corr elacionaban bien con los niveles de pigmentos, aunque las mejor es correlaciones se obtuvier on considerando el parámetr o (a* / b*) 2 . En un interesante estudio Arias et al. (2000) llegar on a la conclusión de que el contenido de licopeno del tomate podría estimarse con base en los parámetr os a *, a* / b* y (a* / b*) 2 . En otro estudio se concluyó que los valor es de tono de diferentes tomates medidos en homogeneizados eran mejor es indicadores de su contenido de licopeno que los medidos en la r egión ecuatorial (Thompson et al. , 2000). Más r ecientemente se ha estimado el contenido de licopeno de zumos y frutos de tomate a par tir de los parámetr os de color obtenidos con dos diferentes instrumentos, aplicando estadística multivariante y considerando difer entes modelos lineales (Fer nández-Ruiz et al. , 2010). Asimismo se ha estimado el contenido de licopeno en tomates y derivados usando análisis digital de imágenes, como se comentó (Stinco et al. , 2013). Además de la metodología clásica a la que nos hemos r eferido en este apar tado y en el capítulo 1, se han pr opuesto otras para algunas aplicaciones. Así, cabe mencionar la descrita por Hor ner o-Méndez y Mínguez-Mosquera (2001), quienes desarr ollaron un método espectr ofotométrico útil y rápido para la estimación de las fracciones de car otenoides rojizos y amarillentos en pr oductos del pimiento rojo, mediante la aplicación de la ley Lamber t-Beer para mezclas complejas, y considerando las lecturas a dos longitudes de onda (472 y 508 nm). Más r ecientemente, se ha propuesto una metodología para estimar el contenido de car otenoides de zumo de naranja considerando los valor es de reflectancia a cinco longitudes de onda seleccionadas (420, 455, 515, 545 y 610 nm o 420, 445, 510, 545 y 605, según las condiciones de medida) (Meléndez- Mar tínez et al. , 2010). Además de considerar varias l , la novedad principal de esta metodología es que la valoración del contenido de car otenoides se hace considerando valores de r eflectancia medidos directamente en el pr oducto, no en el extracto de car otenoides. Para este fin, se aplicó el método del vector característico (Lebar t et al. 1985) a fin de obtener 5 longitudes de onda a par tir de las cuales se podrían r econstruir los espectr os visibles de los zumos con una buena exactitud para evaluar su color (Meléndez-Mar tínez et al. , 2010). Correlación entre contenido de carotenoides y parámetros de color en diferentes alimentos La cuantificación de car otenoides a par tir de un extracto por medidas espectr ofotométricas ha sido un método habitual durante muchos años. Dos desventajas de este pr ocedimiento son la poca exactitud de los coeficientes de extinción empleados y que se utiliza la infor mación espectr ométrica de 131 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos de los principales car otenoides del zumo de naranja y los parámetr os de color b*, C* ab y h ab . Además, mediante métodos de estadística multivariante obtuvier on ecuaciones que per mitier on deter minar los contenidos de carotenoides individuales a par tir de infor mación colorimétrica. Para ello, se consideraban los conjuntos de parámetr os L*, a*, b* y L*, C* ab y h ab para tomar en consideración la infor mación colorimétrica completa. En un estudio posterior Meléndez- Mar tínez, V icario y Heredia (2007) concluyer on que los parámetr os mejor correlacionados con el contenido total de car otenoides de zumo de naranja ultracongelado eran b * y C* ab . Los r esultados de estos dos estudios son útiles para ilustrar con un caso práctico la impor tancia de las r elaciones entr e el contenido del pigmento y los parámetros de color . Así, del primer estudio (Meléndez-Mar tínez et al. , 2003) se puede inferir que los niveles de car otenoides del zumo de naranja considerados individualmente se corr elacionan bien con los atributos cuantitativos (C* ab ) y cualitativos (h ab ) del color . El tono está estrechamente r elacionado con el tipo de radiación visible absorbida por el pigmento que, a su vez, está deter minado principalmente por su cr omóforo. Sin embargo, cuando los car otenoides del zumo se consideran en conjunto, el atributo cuantitativo de color sigue siendo un buen pr edictor del contenido de car otenoides, mientras que el tono no lo es, cuando, como en este caso, se consideran juntos pigmentos con cr omóforos de diversa estructura. En lo r efer ente a la utilidad de los parámetr os de color para estimar el contenido total de car otenoides en zumos Zulueta, Esteve y Frígola (2007) analizar on 17 zumos comerciales y bebidas a base de leche y encontrar on buenas correlaciones de ese parámetr o con a* y b* (r > 0.75). Se han r ealizado otros estudios sobr e la corr elación entr e el color y el contenido de car otenoides en batatas (T akahata, El color de los aceites de oliva se debe tanto a clor ofilas (principalmente feofitina a) y car otenoides (sobre todo b -car oteno y luteína) (Moyano et al. , 2010) y se ha comprobado que los niveles de estos pigmentos pr esentan una alta corr elación (r > 0.8) con los parámetros del espacio CIELAB en varios aceites de oliva de difer entes variedades y etapas de maduración. Por ejemplo, se encontrar on altas correlaciones (r > 0.8) entr e la clorofila y el contenido total de pigmentos de las muestras y el parámetr o a*. Asimismo, se encontró buena corr elación entre la fracción de car otenoides y los parámetr os de color b* y C* ab (r > 0.95). Además, también se encontrar on valor es de r > 0.8 entre los pigmentos (considerados en conjunto o por separado) y dos índices color , C* ab / L* y b* / L* (Mínguez-Mosquera et al. , 1991). Más r ecientemente, en un estudio en el que se analizar on 1700 muestras de ocho variedades de aceitunas españolas en difer entes etapas de maduración se observó que las mejor es correlaciones se encontraban entr e este índice y C* ab y b* (Moyano et al. , 2008, 2008a), lo que concuer da con los resultados publicados por Mínguez-Mosquera et al. (1991). Una conclusión impor tante de los dos estudios de Moyano et al. , (2008, 2008a) es que, teniendo en cuenta la infor mación de color completa y la aplicación de métodos estadísticos multivalentes apr opiados es posible obtener ecuaciones que per mitan pr edecir el contenido de pigmentos a par tir de los parámetr os de color . El color del zumo de naranja ha sido objeto de un gran númer o de estudios, sobr e todo en Estados Unidos (Meléndez- Mar tínez et al . 2005). Sin embargo, la mayoría de los estudios enfocados a estudiar la r elación de este atributo con los car otenoides, considerados individualmente o en conjunto, han apar ecido en los últimos 15 años. En este sentido, Meléndez-Mar tínez, V icario y Heredia (2003) encontrar on corr elaciones estadísticamente significativas entre el contenido 132 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos car otenoides en muchas muestras, proponiéndose ecuaciones para estimar el contenido de estos pigmentos a par tir de dicha coor denada de color (Humphries, Graham y Mares, 2004). Los r esultados de este estudio son útiles para seleccionar de una manera más rápida y eficiente variedades con altos niveles de car otenoides para su cultivo. Aunque muchos de los estudios en los que se investiga la r elación entre el contenido de car otenoides y el color de los alimentos se han r ealizado en alimentos vegetales, los hay también en los que se han evaluado alimentos de origen animal. Por ejemplo, se ha empleado un índice de color para estimar el contenido en car otenoides de leche de vaca (Calder ón et al. , 2007; Calderón et al. , 2007a). Sin embargo, la mayoría de los estudios sobr e alimentos de origen animal se han r ealizado en pescados. Estos estudios son especialmente numer osos en el caso de peces de la familia de los salmónidos, en los que el color r ojo del músculo es considerado un impor tante atributo de calidad. Como se podía esperar , el color de los filetes (principalmente debido a cetocar otenoides r ojizos como astaxantina y cantaxantina, figura 5) se corr elaciona bien con a* (Skrede y Stor ebakken, 1986; Skr ede, Stor ebakken y Nås, 1990; Ando et al. 1992). Además, también se ha pr opuesto la calibración multivariante de datos de espectr ometría visible como un procedimiento apr opiado para estimar niveles de car otenoides en trucha arcoíris (Ronsholdt y McLean, 2001). Otr o impor tante hallazgo de estos autores es que la aplicación de la teoría de Kubelka-Munk puede ser útil para eliminar la infor mación espectral de origen físico, es decir , no debida a los pigmentos. En un exhaustivo estudio en el que se analizar on los datos de 376 muestras de peces alimentados con astaxantina se encontrar on relaciones no lineales entr e los parámetr os de Noda y Nagata, 1993; Ameny y Wilson, 1997), pr oductos de zanahoria (Chen y T ang, 1998), albaricoques (Ruiz et al. , 2005; Ruiz et al. , 2008), mangos (Or nelas-Paz, Y ahia y Gardea, 2008, V ásquez-Caicedo et al. , 2005) y cer eales (Humphries, Graham y Mar es, 2004). En lo refer ente a los estudios sobr e batatas, T akahata, Noda y Nagata (1993) encontrar on que el contenido de b -car oteno de variedades con la pulpa naranja estaba bien corr elacionado con L*, a* y b*. Asimismo propusier on la estimación de los niveles de b -car oteno a par tir de los valores de a* como una herramienta útil para el contr ol de calidad en la pr oducción. Contrariamente, Ameny y Wilson (1997) encontrar on que el valor Hunter b correlacionaba mucho mejor que a* con el contenido de b -car oteno de diversos productos de batata. Puesto que el car otenoide provitamínico b -car oteno es el principal car otenoide de las batatas (Huang, T anudjaja y Lum, 1999, V an Jaarsveld et al ., 2006; Kidmose et al. , 2007), se puede pensar que es posible obtener una buena estimación de la hipotética actividad vitamínica A de estos pr oductos a par tir de medidas de color . Sin embargo, este aspecto se tratará más adelante. El valor de b de Hunter también se ha corr elacionado con los cambios en car otenoides en residuos de pulpa de zanahoria almacenada en difer entes condiciones (Chen y T ang, 1998). Los niveles de car otenoides coloreados individuales y totales también se corr elacionan bien con los parámetros de color (sobr e todo a* y h ab ) en albaricoque (Ruiz et al. , 2005; Ruiz et al. , 2008). Asimismo, se ha demostrado que el tono y los valor es de a* en mangos son parámetros útiles para obtener infor mación rápida sobr e su contenido de carotenoides (Or nelas-Paz, Y ahia y Gardea, 2008; V ásquez-Caicedo et al. , 2005). Por otr o lado, en un estudio en el que se analizaron diversos tipos de pan y de variedades de trigo durum y triticale, se obtuvier on altas correlaciones entr e b * y los niveles de 133 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos tanto con sus pr opiedades químicas como físicas y concluyen, entr e otras cosas, que otros componentes del músculo distintos de los lípidos (especialmente agua y pr oteínas) deben tenerse en cuenta, junto con el contenido de car otenoides, para explicar las difer encias de color en el conjunto de muestras estudiadas. color y los niveles de car otenoides (Hatlen, Jobling y Bjerkeng, 1998). Los autor es observaron que el color de los peces puede verse afectado por factor es como las condiciones de cría, el origen genético y el estado r eproductivo. Por otra parte, en una inter esante discusión proponen como hipótesis que las difer encias en el color de los filetes podrían estar relacionadas f igura 5. Estructuras químicas de cantaxantina y astaxantina. cantaxantina astaxantina HO O OH O O O 134 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos actividad antioxidante de estos compuestos, hay que adver tir que los mecanismos subyacentes no están totalmente dilucidados. Por su naturaleza lipofílica los car otenoides se encuentran en ambientes lípidicos, como las membranas celular es, donde pueden interaccionar con diversos electrófilos según su estructura química y su orientación (W oodall, Britton y Jackson, 1997; W oodall et al. , 1997). Asimismo, estudios r ecientes apuntan a que la actividad antioxidante in vivo de los car otenoides o sus metabolitos también puede deberse a la inducción de pr ocesos mediados por enzimas s (Ben Dor et al. , 2005; Lian y W ang, 2008). La utilidad de la infor mación de color para hacer una estimación de la hipotética actividad como vitamina A de diversos alimentos, como zumos de naranja (Meléndez- Mar tínez, V icario y Heredia, 2003, Meléndez-Martínez et al. , 2007), cer eales (Humphries, Graham y Mares, 2004), mangos (V ásquez-Caicedo et al. , 2005) y albaricoques (Ruiz et al. , 2005; Ruiz et al. , 2008) ha sido pr opuesta por varios autores. Por otr o lado, en un estudio preliminar en el que se evaluó la capacidad antioxidante de extractos lipofílicos de tomate fr ente al catión radical ABTS, se ha constatado que los valor es TEAC están corr elacionados con las coordenadas de color L*, a*, b* y L*, C* ab , h ab (R = 0.839 y 0.838, r espectivamente) (Stinco et al. , 2010). Utlidad de los parámetros de color para estimar la potencial actividad de los carotenoides De los estudios mencionados, se concluye que es posible deter minar los niveles de car otenoides y pigmentos, en general, a par tir de los datos de espectr ometría visible y de color . Dado que algunos carotenoides (unos 60 de los 700 descritos hasta ahora) pr esentan actividad como vitamina A y se ha demostrado que muchos tienen actividad antioxidante in vitr o , es razonable pensar que las medidas de color en alimentos que contienen car otenoides podrían utilizarse también para evaluar de for ma rápida tanto la hipotética actividad vitamínica como la capacidad antioxidante. Sin embargo, en este punto es conveniente hacer hincapié en el hecho de que, obviamente, estos valor es (ya sean equivalentes de actividad de r etinol, unidades inter nacionales, capacidad antioxidante en equivalentes de T rolox, etc.) no son extrapolables a condiciones in vivo . En este sentido, es impor tante considerar que la actividad biológica depende de muchos factor es, como la biodisponibilidad y la bioconversión, que a su vez dependen de muchos factor es (matriz del alimento, interacciones, estado nutricional y de salud, envejecimiento, variabilidad interindividual, etc.) (Faulks y Southon, 2005; Y eum y Russell, 2002). En lo refer ente a la 135 6. A plicAción de lAs medidAs de espectrometríA visible y de color Al Análisis de cArotenoides en Alimentos Ameny , M.E. y Wilson, P .W . 1997. Jour nal of the Science of Food and Agricultur e 73: 301-306. Ando, S., Y amauchi, H., Hatano, M. y Heard., W .R. 1992. Aquacultur e 103: 359-365. Arias, R., Lee, T .C., Logendra, L. y Janes, H. 2000. Journal of Agricultural and Food Chemistr y 48: 1697-1702. Ar tigas, J.M. 2002. En P . Capilla, Ar tigas, J.M. y Pujol, J. (eds.). Fundamentos de colorimetría. V alencia: Universidad de V alencia, 119-131. Bao, B. y Chang, K.C. 1994. 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Éste podría ser fácilmente sustituible por un panel de jueces entr enados en la evaluación del atributo color (Durán, 1971). r elación entre color y otros a tributos sensoriales Al per cibir el color de un alimento, el consumidor , de manera espontánea, lo r elaciona con otras características —grado de madur ez de frutas, propor ción o calidad de la fruta en una bebida, fr escura de la car ne, tipo o calidad del vino, etc.— y basta su primera r eacción en lo que deduce de esta relación (Durán y Costell, 1999). El color es un atributo tan impor tante en la mayoría de los alimentos que no solamente influye en el primer juicio del consumidor sino también pr ovee infor mación sensorial que le per mite interaccionar con el gusto, el olfato y la textura para deter minar su aceptabilidad total (Dubose, Car dello y Maller , 1980). Este fenómeno psicológico se manifiesta, sobr e todo, en la per cepción del gusto. Los resultados obtenidos por difer entes autor es en cuanto al efecto del color sobre el gusto son contradictorios, en par te debido a que las investigaciones se r ealizaron unas veces en sistemas modelo y otras en alimentos r eales, generalmente bebidas de frutas a las que se han añadido colorantes. En la mayoría de los casos la atención se ha centrado sobr e el efecto del color en la identificación o en la intensidad del sabor típico de la fruta en estudio (Dubose, Car dello y Maller , 1980; Johnson et al. 1982; Stillman, 1993). y otr os factores ambientales, modifican la sensación que sobr e el observador produce un determinado color , por lo que es necesario el entr enamiento de los evaluadores y la estandarización de las condiciones de medida. d) La capacidad para detectar difer encias entre los color es es limitada; debido a cómo funciona nuestr o sistema visual, tr es factores afectan nuestra capacidad de distinguir los color es entre sí: i) palidez: cuanto más pálidos son los color es (menos saturados), más difíciles son de distinguir , ii) el tamaño del objeto: los color es de los objetos más pequeños o más delgados son más difíciles de distinguir y iii) la separación: en los objetos más separados es más difícil distinguir sus color es, especialmente si la separación es lo suficientemente grande como para r equerir el movimiento del ojo entre los objetos. T odo esto apunta claramente a la necesidad de disponer de métodos objetivos y pr ecisos que per mitan cuantificar los color es para definirlos, interpretarlos y compararlos entr e sí. Lamentablemente, estos métodos no son totalmente r epresentativos de la apr eciación visual que r ealiza el consumidor . Por muy sofisticado que sea un colorímetro, no llega a alcanzar la capacidad integradora y analizadora del cer ebro humano. La heter ogeneidad del color de la mayoría de los alimentos, apr eciables por un observador en for ma instantánea y completa, difícilmente se puede r epresentar por una medida instrumental o por una medida química. Ambos pr ocedimientos, subjetivo y objetivo, son incompletos y el método a elegir dependerá del alimento, de acuer do con la finalidad específica de la medida (Durán, 1979). Para el elaborador de alimentos, el grado de variación aceptado en este atributo estaría limitado por un criterio de calidad que establece las tolerancias de la variación de 145 7. A nálisis sensoriAl de color (medida de la intensidad luminosa por unidad de ár ea) debería ser apr oximadamente 100 cd/m 2 (cd: candela, unidad básica de intensidad luminosa del Sistema Inter nacional) y no debería disminuir en ninguna zona de visión por debajo de 15 cd/m 2 . En muchos laboratorios sensoriales se utilizan cabinas por tátiles para la evaluación de color es, equipadas con iluminantes adecuados de for ma que la luz pr ocedente de esa fuente se pr oyecte ver ticalmente sobre la muestra y se observe con un ángulo de 45º (Fer nández-V ázquez et al. , 2013; T árrega y Costell, 2007). Requisitos de iluminación La luz con que vemos los alimentos es fundamental para la evaluación de su color . Se pueden encontrar muchos tipos de iluminaciones que operan a través de una amplia gama de intensidades. Para obtener r esultados confiables y r eproducibles en las evaluaciones, es esencial una fuente de luz apr opiada y niveles de intensidad adecuados. En el ár ea general, se recomienda utilizar luces incandescentes para pr oporcionar una iluminación uniforme y libre de sombras, con luminancia similar o ligeramente inferior a la de las cabinas de evaluación. Dentr o de una cabina sensorial se debe evitar la r eflexión especular de la fuente (cuando los ángulos de incidencia y de r eflexión son aproximadamente los mismos), lo que se logra con una fuente de luz ver tical sobr e el objeto y donde la visualización se pr oduzca a aproximadamente 45 grados r especto a la muestra (ISO, 1999; Hutchings, 2002). Para iluminar las muestras a evaluar se debería usar luz unifor me difusa, lo que se logra con los siguientes tipos de iluminación: a) una fuente ar tificial de luz que r epresente la luz Otr os trabajos publicados confir man el impor tante papel del color en el r econocimiento de un gusto y en la percepción de su intensidad. En este sentido, algunos estudios r evelaron que el color de bebidas cítricas, en general, está r elacionado con la per cepción de sabor , dulzor y otras características vinculadas con la calidad de estos pr oductos (T epper , 1993). Consumidor es uruguayos relacionar on el color amarillo de muestras de aceite de oliva con el gusto suave, mientras que los aceites de color más ver de, fueron descritos como sabr osos, aromáticos, con gusto fuerte y con sabor a hierba (Gámbar o et al. 2014). e V aluación del color de alimentos Requisitos físicos Existen dir ectrices detalladas en distintas nor mas para el diseño general de los laboratorios de evaluación sensorial (ASTM, 1986; ISO 8589, 1988). Una de las r ecomendaciones más impor tantes es que toda ár ea de evaluación, como cabinas sensoriales y salas de r euniones (para entrenamiento y discusión de r esultados), deberían propor cionar un ambiente cómodo, neutral, sin distracciones. No debe haber objetos brillantes o de color en los alr ededores que puedan generar distracciones; hasta se sugier e cubrir las ropas de color es brillantes o muy intensos con batas de laboratorio blancas o grises. En par ticular , para el análisis sensorial de color , la norma ISO 11037 (1999) especifica que las par edes, tanto del lugar de evaluación como de las cabinas individuales, deberían estar pintadas de un color neutr o (blanco, gris, etc.), con una r eflectancia de 0.3 a 0.5. La luminancia óptima de las paredes 146 7. A nálisis sensoriAl de color distinguir pequeñas difer encias de los colores ver de, amarillo y r ojo (T orricella, Zamora y Pulido, 1989). La prueba consiste en par tir de soluciones madr es concentradas de tres colorantes: amaranto (E-123), tar tracina (E-102) y ver de sólido (E-143). Estas soluciones madr e se obtienen disolviendo 1.0 g de cada colorante en 100 mL de agua destilada. Las soluciones para la prueba se pr eparan a par tir de una alícuota de la solución madr e, la que se diluye a 100 mL con agua destilada, de acuer do con la tabla 1. del día pr omedio, como el iluminante D65 de la CIE (2007) y b) el cuadrante nor te de cielo como una fuente natural de luz difusa (ISO, 1999). f ormación de un P anel de jueces sensoriales Selección de candidatos Con el fin de seleccionar a los candidatos para for mar un panel de jueces sensoriales que evalúen color se deben seguir los lineamientos de la nor ma ISO 11037 (1999). La deter minación de la visión nor mal de los candidatos se puede r ealizar por medio del Far nswor th-Munsell 100 Hue T est, lo que también per mite examinar la capacidad de discriminación visual de los candidatos (Far nswor th, 1957). La visión nor mal también se puede verificar usando tablas policr omáticas como las de Ishihara, Stilling, Rjabkin o V elhagen (ISO, 1999). Se deben identificar y eliminar del panel los candidatos con visión de color anómala. Con excepción de estos métodos nor malizados y aunque la evaluación del color se incluye en muchos estudios sensoriales (Calvo, Salvador y Fiszman, 2001; Frata, V alim y Monteir o, 2006; Poelman y Delahunty , 2011), hay muy poca infor mación sobr e pruebas sensoriales que se puedan llevar a cabo para seleccionar y entr enar a los integrantes de un panel de jueces sensoriales para este tipo de evaluación. Una alter nativa de bajo costo para el Far nswor th-Munsell 100 Hue T est es el test de sensibilidad de la vista desarr ollado por el Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia de Cuba, cuyo fin es deter minar la aptitud de un candidato para t abla 1. Preparación de soluciones para la prueba de sensibilidad de la vista Númer o de solución V olumen de la alícuota (mL) 1 0.10 2 0.20 3 0.26 4 0.33 5 0.43 6 0.55 7 0.70 8 0.90 9 1.49 10 1.92 Fuente: Datos de T orricella, Zamora y Pulido (1989). Las 30 soluciones (10 de cada color) se vier ten en tubos de ensayo codificados con númer os aleatorios de tres cifras, de for ma que el líquido tenga la misma altura en todos los tubos. Se les entr egan a los candidatos los 30 tubos mezclados aleatoriamente y se les da, en primer lugar , la tarea de separarlos según el color . Posterior mente, deben ordenar 147 7. A nálisis sensoriAl de color a r epetir preparando las soluciones de cada uno de los tr es colorantes en una base de yogur natural bebible y utilizando la misma metodología y criterio para r echazar a los candidatos. Con base en este trabajo, Fer nández-V ázquez et al. (2013) seleccionar on a un grupo de individuos para evaluar el color de zumos de naranja de la siguiente manera: se pr epararon soluciones de color naranja utilizando dos colorantes alimentarios (r ojo y amarillo) mezclados en diferentes pr oporciones: a) 500 de colorante r ojo y 12.000 μL/L de colorante amarillo para las soluciones más amarillas, b) 1250 de colorante r ojo y 12 000 μL/L de colorante amarillo para las soluciones naranjas y c) 3 000 de colorante r ojo y 12 000 μL/L de colorante amarillo para las soluciones más r ojas. De cada mezcla de colorantes se pr epararon 10 soluciones acuosas al 100, 78, 47, 36, 29, 22, 17, 14, 10 y 5%. Se colocar on 75 mL de cada una de estas soluciones en botellas de plástico transpar ente codificadas con números aleatorios de dos dígitos. Las sesiones de evaluación se organizar on de la siguiente manera: en la primera etapa, se entr egaron a los candidatos tr es muestras correspondientes al mismo nivel de dilución de cada mezcla de colorantes y se les pidió que las or denaran de las más amarillas a las más r ojas (en total 10 evaluaciones). En la segunda etapa, se entr egaron a los candidatos las 10 diluciones de cada mezcla de colorantes por separado y se les pidió que las or denaran de acuerdo con la intensidad cr eciente. Para seleccionar a los evaluadores, los criterios utilizados fuer on: a) rechazar a aquellos que no pudier on llevar a cabo la clasificación de los tubos en los tr es grupos de tonos y b) r echazar a aquellos candidatos cuyos coeficientes de corr elación de Spear man ( ρ ) para la ordenación de alguno de los tr es tonos fuera no significativo (p>0.05) (O’Mahony , 1986). los 10 tubos de ensayo de cada color de menor a mayor intensidad. La prueba se debe r ealizar con los tubos sobre un fondo blanco y con iluminación adecuada. Para ser apr obados, los candidatos deberán identificar , sin error , los colores ver de amarillo y r ojo. Para evaluar el ordenamiento, se otorga un punto por cada r espuesta correcta; los candidatos deben alcanzar un mínimo de 25 puntos para ser considerados aptos (T orricela, Zamora y Pulido, 1989). Con base en la prueba de T orricela, Zamora y Pulido (1989), Gámbar o, Giménez y Burgueño, (2001) propusier on una prueba específica para seleccionar panelistas para la evaluación del color r ojo en yogur de frutilla o fresa, que se puede r ealizar a continuación de las pruebas mencionadas antes. Ésta consiste en la pr eparación de tres soluciones acuosas usando tr es diferentes colorantes r ojos: r ojo ponceau 4R (E- 124), eritr osina (E-127) y rojo carmín (E-120). El objetivo de la prueba es deter minar la habilidad de los candidatos para discriminar entr e diferencias de tono e intensidades en color r ojo. Se preparan 10 soluciones acuosas de cada colorante con 10, 20, 26, 33, 43, 55, 70, 90, 49 y 192 mg/L (30 en total). Las soluciones se colocan en tubos de ensayo codificados con númer os aleatorios de tres cifras. Se les entr egan a los candidatos los 30 tubos mezclados aleatoriamente y se les da, en primer lugar , la tarea de separarlos según el tono de color r ojo. Posterior mente, deben ordenar los 10 tubos de ensayo de menor a mayor intensidad. La prueba se debe r ealizar en una cabina con buena iluminación y fondo blanco. Para seleccionar a los candidatos, se usan los siguientes criterios: a) r echazo de aquellos candidatos que no separan corr ectamente los tubos en los tr es tonos de color rojo, b) r echazo de aquellos candidatos cuyo coeficiente de corr elación de Spear man ( ρ ) para la or denación de alguno de los tres tonos no es significativo (p>0.05) (O’Mahony , 1986). Esta misma prueba se puede volver 148 7. A nálisis sensoriAl de color Se cita a los jueces sensoriales a tr es sesiones de trabajo, las que deben estar separadas entr e sí por lo menos por dos horas, para evitar la fatiga de los evaluador es. En la primera sesión se entr ega a los jueces sensoriales seis muestras (las A y B por duplicado y las C y D) para que evalúen la intensidad del color con una escala no estructurada de 10 cm con los extr emos nada-mucho, siguiendo el diseño que se observa en la tabla 13. T odos los jueces sensoriales r eciben las muestras en el mismo or den en cada sesión. Es impor tante presentar las muestras en for ma monádica (o sea en for ma individual) y r etirar la muestra anterior antes de entr egar la siguiente. En la segunda sesión se entr egan para su evaluación con la misma escala las muestras A y B (por duplicado) y las E y F . En la ter cera sesión se entr egan las muestras A y B (por duplicado) y las G y H, siempr e siguiendo el diseño de la tabla 13. Esta for ma de pr esentar las muestras per mite el entrenamiento de los jueces en la cuantificación de la intensidad de color r ojo y per mite deter minar la r eproducibilidad del juicio individual de cada juez (en la misma sesión y en sesiones difer entes) La sensibilidad a las difer encias de color de alimentos también se puede deter minar usando otr os alimentos, en función del objetivo del pr oyecto. Por ejemplo, cuando la calidad de un pr oducto par ticular depende del amarronamiento, se puede seleccionar a los panelistas pidiéndoles que or denen soluciones de caramelo o leche tratada tér micamente (Jellinek, 1985). Entrenamiento Aunque la evaluación del color se incluye en muchos estudios sensoriales hay muy pocos estudios que infor men sobr e cómo capacitar especialmente a los panelistas para hacer la evaluación visual de los alimentos. Gámbar o, Giménez y Burgueño, (2001), en el mismo estudio sobr e evaluación sensorial de color rojo en yogur de frutilla, pr opusieron la siguiente metodología de entr enamiento: se pr eparan ocho soluciones de colorante rojo ponceau 4R (E-124) utilizando yogur natural bebible como base; las concentraciones utilizadas se indican en la tabla 2. t abla 2. Muestras para el entrenamiento de los jueces sensoriales en color rojo de yogur de frutilla t abla 3. Muestras y orden de presentación de las mismas en cada sesión de entrenamiento. Muestra A B C D E F G H Concentración (mg/L) 10.2 43.0 2.0 90.0 26.0 70.0 55.0 5.0 sesión Muestras y orden de pr esentación 1 A C B D A B 2 B A E F A B 3 A B G H B A 149 7. A nálisis sensoriAl de color pr esentación a cada juez fue aleatorio. Sobre los r esultados obtenidos se r ealizó un análisis de varianza de tres factor es (juez, muestra y r epetición) para las dos muestras comerciales y un análisis de varianza de dos factor es (juez y muestra) para estas dos muestras y todas las diluciones (O’Mahony , 1986). Según los r esultados obtenidos, los evaluadores con varianza más alta y mayor dispersión de juicio fuer on retirar on del panel. c onclusiones La per cepción humana del color tiene puntos fuer tes y limitaciones y , si bien existen hoy métodos objetivos y precisos para cuantificar , definir , interpr etar y comparar entr e sí los color es, estos métodos no son totalmente repr esentativos de la apr eciación visual que realiza el ser humano. Por otr o lado, un panel de jueces entrenados en la evaluación del atributo color es una herramienta económica y sencilla de obtener (aunque costosa en tiempo y mano de obra), que podría constituirse en una alter nativa para las pequeñas y medianas empr esas que no siempre tienen disponibles instrumentos para la medición y el contr ol de calidad del color . En ese caso, una adecuada selección y for mación de los panelistas es esencial para un desempeño eficaz y eficiente del panel. y la homogeneidad de juicios del panel. Para eso se r ealiza un análisis de varianza para los juicios obtenidos para las muestras A y B utilizando juez, muestra, sesión, r epetición y sus interacciones como factor es de variación. Este análisis per mite identificar a los jueces con mayor varianza y mayor dispersión en sus juicios. El trabajo se puede r epetir utilizando otros colorantes, hasta lograr un panel consistente en sus juicios. Fer nández-V ázquez et al. (2013), en el mismo estudio sobr e evaluación sensorial de color de zumo de naranja, utilizar on escalas no estructuradas de 10 cm de longitud para entr enar a los jueces en la evaluación de tonalidad (extr emos amarillento-rojizo) e intensidad de color (extr emos bajo a alto). Seleccionar on muestras para abarcar la gama de intensidad de color y el matiz en zumo de naranja comer cial. Para eso utilizar on dos muestras comerciales de zumo de naranja y seis muestras pr eparadas a par tir de diluciones de una de las muestras comer ciales (6, 10, 30, 50, 60 y 80% r espectivamente). Estas muestras fueron evaluadas en sesiones de quince minutos de duración. Al final de cada sesión se r ealizó una reunión de tr einta minutos del líder con todos los miembr os del grupo para unificar los criterios de evaluación. En cada sesión, los evaluador es evaluaron las muestras comer ciales por duplicado y un par de las muestras diluidas. Las muestras evaluadas en cada sesión fuer on las mismas para todos los evaluador es, pero el or den de 150 7. A nálisis sensoriAl de color ASTM. 1986. J. Egger t y K. Zook (eds.). Physical Requir ement Guidelines for Sensor y Evaluation Laboratories. American Section of the Inter national Association for T esting Materials (ASTM) PCN 04- 913000-36. Barr on, R.W ., Maraulja, M.D. y Huggar t, R.L. 1967. Pr oceedings of the Florida State Hor ticultural Society 80: 308-311. Calvo, C. 1992. Revista Española de Ciencia y T ecnología de Alimentos 32: 589-602. Calvo, C., Durán, L. 1979. Revista del Instituto de Agr oquímica y T ecnología de Alimentos 19: 141-152. Calvo, C., Salvador , A. y Fiszman, S. 2001. European Food Resear ch and T echnology 213: 99-103. CIE. 2007. Commission Inter nationale de l’Eclairage. Standar d Illuminants for Colorimetr y . ISO, 11664-2. Costell, E., Durán, L. 1981. Revista del Instituto de Agr oquímica y T ecnología de Alimentos 21: 454-470. 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Una descripción práctica La química es el estudio de las transfor maciones de la materia. La computación es la herramienta que utilizamos para hacer química a través de modelos matemáticos. Así, lo que nos distingue a los que hacemos química computacional no es lo que estudiamos sino las herramientas que utilizamos para nuestra investigación. Al principio, cuando los or denadores o computadoras eran rudimentarias y solamente sumaban y r estaban, no había for ma de hacer química computacional, por que para eso necesitamos realizar muchas operaciones matemáticas y no éramos capaces de hacerlo en un tiempo razonable. Cuando la tecnología mejor ó y con los ordenador es se pudier on hacer otras operaciones, se comenzar on a estudiar los átomos. Así, los primeros cálculos los hicier on los físicos y se refirier on al estudio del átomo de hidr ógeno y del átomo de helio. Después, con el avance de la tecnología se pudier on estudiar átomos y moléculas de mayor tamaño, y hoy podemos investigar incluso sistemas como las pr oteínas. C apítulo 8 256 13. B iosíntesis de carotenoides en azafrán nuevo alelo de CsCCD1b , designado CsCCD2 . Esta nueva dioxigenasa, al igual que CsCCD1b, se expresa en los estadios iniciales del estigma (Rubio et al. , 2008). CsCCD1b y CsCCD2 muestran 97% de identidad a nivel de su secuencia de aminoácidos (figura 5). A pesar de este elevado grado de similitud, CsCCD1b corta en las posiciones 9,10;9’,10’ del β -caroteno (Rubio et al. , 2008), mientras que CsCCD2 no reconoce como sustrato el β -caroteno, sólo reconoce la zeaxantina y la corta en las posiciones 7,8;7’,8’, y también reconoce a la luteína como sustrato (frusciante et al. , 2014). La secuencia de aminoácidos de CsCCD2 no parece presentar una señal clara de localización en plastidios, al igual que CsCCD1b; sin embargo, su actuación sobre carotenoides sugiere su presencia en estos suborgánulos, como es el caso de CCD4 y de NCED. Será necesario realizar experimentos de localización para determinar dónde se encuentra la enzima. El análisis del transcriptoma también ha permitido identificar nueve posibles aldehído deshidrogenasas implicadas en la transformación de crocetindial en crocetina. La caracterización de esta enzima está en marcha y pronto podremos conocer las enzimas implicadas en la ruta completa de la biosíntesis de la crocetina en C. sativus . c onclusiones Las principales enzimas implicadas en la biosíntesis de apocarotenoides y compuestos relacionados tan característicos de esta planta y responsables de las propiedades organolépticas de la especia de mayor valor económico conocida actualmente se han caracterizado recientemente. La identificación y la regulación de estas enzimas las convierten en claras candidatas en aproximaciones biotecnológicas vitro la crocetina y la crocina, denominada UGTCs2 (Moraga et al. , 2004) (figura 6). Esta enzima es capaz de añadir hasta 12 moléculas de glucosa sobre una molécula de crocetina, y se han identificado crocinas con hasta 10 moléculas de glucosa en otras especies de Crocus (Rubio-Moraga et al. , 2013). El patrón de expresión del gen que codifica para esta enzima en el estigma de C. sativus es similar al patrón de acumulación de crocinas. Se desconoce por el momento la enzima implicada en la formación de picrocrocina, y también aquellas UGT que glucosilan otros derivados de carotenoides minoritarios presentes en el estigma de azafrán. Entre ellos se encuentran un éster de monogentiobiosa, relacionado estructuralmente con la crocina, que podría formase a partir del corte de la zeaxantina o del β -caroteno en las posiciones 7,8 y 13,14 (Straubingerr et al. , 1998); la β -D-glucopiranosido (4R)-4- hidroxi-3,5,5-termetilciclohex-2-enona, la (4S)-4-hidroxi- 3,5,5-termetilciclohex-2-enona, y la (4S)-4-hidroximetil-3,5,5- termetilciclohex-2-enona, junto con otros siete compuestos relacionados con otros identificados previamente en otras especies vegetales (Straubingerr et al. , 1998). l as resPuest as del transcriPt oma Con el objetivo de identificar las enzimas clave en la biosíntesis de la crocetina en C. sativus , se procedió a la elaboración de un transcriptoma de los distintos estadios de desarrollo del estigma de azafrán, perfectamente caracterizados en cuanto a la acumulación de los distintos carotenoides y compuestos derivados (Moraga et al. , 2009). A partir de este análisis, además de los ya identificados CsCCD1a , CsCCD4a , CsCCD4b , se aislaron dos nuevos alelos de CsCCD4 y un 257 13. B iosíntesis de carotenoides en azafrán AGRADECIMIENT OS para la modificación en distintas especies vegetales del contenido de carotenoides y derivados que, debido a sus efectos benéficos sobre la salud, contribuyen a incrementar el valor nutricional de los alimentos derivados de plantas que los contienen. 258 13. B iosíntesis de carotenoides en azafrán Ahrazem, O., Rubio-Moraga, A., Lopez, R.C., Gómez- Gómez, L. 2010. J Exp Bot 61: 105-119. Ahrazem, O., Trapero, A., Gómez, M.D., Rubio-Moraga, A., Gómez-Gómez, L. 2010a. Genomics 96: 239-250. Alder, A., Holdermann, i., Beyer, P. y Al-Babili, S. 2008. Biochem J 416: 289-296. Auldridge, M.E., Block, A., Vogel, J.T., Dabney-Smith, C., Mila, i., Bouzayen, M., Magallanes-Lundback, M., DellaPenna, D., McCarty, D.R., Klee, H.J. 2006. Plant J 45: 982-993. 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Planta 232: 1-17. REFERENCIAS 260 14. a V ances biotecnológicos P ara Potenciar la Producción de carotenoides de B ixa orellana ( acHiote ) P ara su uso y aProVecHamiento agroindustrial Renata Rivera-Madrid, Gregorio Godoy-Hernández, Mar garita Aguilar - Espinosa, Y air Cárdenas-Conejo, Luz Elena Garza-Caligaris, Eugenia Lugo-Cervantes a v anCes bioteCnológiCos p ara potenCiar la produCCión de Carotenoides de B ixa orellana ( aChiote ) p ara su uso y aproveChamient o agroindustrial i ntroducción En la industria alimenticia, los colorantes artificiales se utilizaron durante muchos años para reemplazar a los colorantes naturales. Debido a su estabilidad a temperaturas elevadas, los diversos lotes de productos procesados presentan mayor uniformidad en comparación con los colorantes naturales, que pueden modificarse durante el procesamiento de los alimentos. Sin embargo, el número de colorantes artificiales para alimentos se ha reducido drásticamente como resultado de los estudios toxicológicos y las legislaciones más estrictas en los países industrializados. Los consumidores también prefieren los colorantes naturales a los artificiales por considerarlos más seguros, de manera que el interés en la bixina (derivada de B. orellana ) se ha incrementado y se comercializa en grandes cantidades en todo el mundo (Spears, 1988). Bixa orellana es una especie perenne nativa de la región neotropical. Comúnmente se conoce como achiote; otros nombres que recibe son anato, uruku y uñañe (Arce, C apítulo 14 261 14. A v Ances biotecnológicos p ArA potenciAr lA producción de cArotenoides de B ixa orellana ( Achiote ) p ArA su uso y AprovechAmiento AgroindustriAl 1999). Tiene interés agroindustrial por su alto contenido de carotenoides y sus derivados, como la bixina. Este pigmento, de distintas tonalidades de rojo, naranja, y amarillo, carece de toxicidad y su poder colorante es alto. Se utiliza como colorante en muy diversos productos alimenticios, como lácteos, panadería, aceites vegetales y bebidas, entre otros. La demanda del achiote como colorante comercial va en aumento en el mercado mundial y hoy se prefiere su uso con respecto a otros colorantes sintéticos de características similares presentes en el mercado (León, 1987). Su uso en alimentos procesados ha sido aprobado sin restricciones tanto en la Unión Europea como en Estados Unidos. Se calcula una producción mundial de semillas de achiote de 10 mil toneladas anuales (Leal y Clavijo, 2010), de las cuales dos terceras partes se comercializan como semillas y el resto como pigmento. América Latina produce 60% del achiote del mundo, seguida por África (27%) y Asia (12%). En México la producción total entre 2000 y 2014 fue en promedio de 576 toneladas, con una tendencia a la baja (Sinarefi, 2014), y la producción por hectárea fue de 0.96 ton/ha, insuficiente para cubrir la demanda nacional. Los precios de las semillas de achiote dependen del contenido del pigmento; para la exportación, este contenido debe ser mayor de 2.7 por ciento. A la fecha son pocos los estudios científicos sobre este cultivo a pesar de su importancia económica y biológica. Existe una gran diversidad de morfotipos de achiote que varían en cuanto a la producción de semilla y pigmento. Los productores de este cultivo han desarrollado cierto tipo de selección de materiales con características fenotípicas de interés agronómico, pero no existen variedades certificadas. Estamos iniciando un programa científico de mejoramiento genético del achiote, aunque aún no se dispone de una caracterización completa de los morfotipos que permita el registro de sus variedades. Nuestro trabajo de investigación está enfocado a la implementación de herramientas biotecnológicas para la producción de achiote con mayores niveles de bixina y en mejorar la comprensión de los procesos y mecanismos moleculares de la biosíntesis de sus carotenoides. Esto requiere obtener la secuenciación de transcriptomas y genotecas de B. orellana. En colaboración con el grupo del doctor Luca Comai de la Universidad de California, en Davis, nos embarcamos en la tarea de iniciar la generación de los primeros transcriptomas de B. orellana usando nuevas tecnologías de secuenciación (Cárdenas-Conejo et al. , 2015). Mediante análisis bioinformático se podrán identificar y aislar los genes que nos permitan comprender mejor los mecanismos moleculares de la carotenogénesis y obtener los genes candidatos que favorecen o limitan la síntesis de la bixina y de otros carotenoides, con el fin de optimizar la mejora genética de este cultivo. Al mismo tiempo, se desea mejorar 262 14. A v Ances biotecnológicos p ArA potenciAr lA producción de cArotenoides de B ixa orellana ( Achiote ) p ArA su uso y AprovechAmiento AgroindustriAl la ruptura oxidativa de carotenoides; la ruptura puede ocurrir al azar a través de la fotoxidación o la co-oxidación de la lipoxigenasa (Walter, Floss y Strack, 2010). También se ha propuesto, la ruptura enzimática de los carotenoides a través de carotenoide dioxigenasas (CCD) específicas (Vogel et al. , 2008; Walter, Floss y Strack, 2010). En algunos casos, los apocarotenoides se derivan de la partición enzimática del licopeno (Bouvier, Dogbo y Camara, 2003; Rodríguez-Ávila et al. , 2011), como la bixina en la planta de anato o B. orellana. La bixina presenta dos configuraciones estereoquímicas: cis ( Z ) de color naranja e insoluble en aceite vegetal y trans (todo- E ) de color rojo y soluble en aceite (Francis, 1987). En condiciones normales, en los extractos predominan los isómeros Z de bixina, conocidos también como a -bixina (Tong, 1984), y corresponde a 80% de los carotenoides totales presentes en las semillas (Preston y Rickard, 1980; Rivera-Madrid et al. , 2006). En solucion el isómero Z de bixina calentado en aceite a 70°C para quitar el pericarpio y vuelto a calentar a 130°C a vacío pasa a la configuracion todo-E, más estable (Mckeown y Mark, 1962; Francis, 1987); sus isómeros tienen un máxima absorción a 500 nm y 470 nm en cloroformo (McKeown y Mark, 1962). Su punto de fusión es de 189.5 °C-198.5 °C, y el coeficiente de absorción para la bixina pura es: E 1% (470) = 2.826 cm en CHCl 3 /10 mg (Belmino dos Santos, 2007). Los pigmentos en las semillas de B. orellana pueden extraerse mediante procesos mecánicos a través de la molienda de las semillas y por métodos físico-químicos usando disolventes o enzimas (Mercadante et al. , 1996). La extracción mediante disolventes puede ser efectuada usando tres métodos básicos: a) la extracción alcalina (con soluciones de NaOH o KOH), la cual da como resultado la conversión de la bixina en norbixina (tanto isómeros Z como todo- E ), soluble en agua y con peso molecular de 380.5 g/ la micropropagación mediante metodologías in vitro que reduzcan el tiempo del ciclo de vida de esta planta, así como propagar las plantas élite. El objetivo de nuestro programa de mejoramiento genético es ofrecer plantas de achiote con alto contenido de bixina y con frutos indehiscentes (Rivera-Madrid et al. , 2006). Actualmente también evaluamos la actividad antitumoral y antioxidante de las proteínas de almacenamiento de las semillas de Bixa orellana L. para obtener péptidos bioactivos y estudiar su actividad citotóxica y mitogénica. Estas investigaciones contribuirán a aumentar la producción de achiote y de bixina para responder a la demanda de colorante a escala nacional e internacional. l a bixina y otros carotenoides en B ixa orellana Propiedades generales de la bixina La bixina es el principal pigmento rojo-naranja presente en el arilo o cubierta de las semillas del achiote (McKeown y Mark, 1962; Rivera-Madrid et al. , 2006). Es un apocarotenoide de 25 átomos de carbono con 9 dobles enlaces conjugados; su fórmula molecular empírica es C 25 H 30 O 4, y su nombre químico metil hidrógeno (9ʼZ)-6,6ʼ-diapocaroteno-6,6ʼ-dioato éster (Preston y Rickard, 1980), con peso molecular de 394.5 g/ mol (Francis, 1987). Presenta un grupo carboxílico libre y otro esterificado, los cuales le confieren funciones como ácido orgánico, y proporcionan solubilidad y estabilidad a la molécula. Está indexado con el número 75120 (OMS-FAO, 1976). Los apocarotenoides son un grupo de derivados de 263 14. A v Ances biotecnológicos p ArA potenciAr lA producción de cArotenoides de B ixa orellana ( Achiote ) p ArA su uso y AprovechAmiento AgroindustriAl tres genes en Bixa orellana que codifican las enzimas para sintetizar bixina a partir de licopeno: licopeno dioxigenasa (BoLCD), bixina aldehído deshidrogenasa (BoBADH) y norbixina metiltransferasa (BonBMT). La mayoría de los estudios relacionados con la síntesis de bixina y su regulación se han hecho en semillas. Rodríguez-Ávila et al. (2011) demostraron que la bixina se encuentra también en todos los tejidos de la planta de B. orellana en estadios jóvenes y adultos; Rodríguez-Ávila et al. (2011a) también plantearon la posible participación de otras enzimas CCD que se encargan de realizar cortes oxidativos en el licopeno y que están implicadas en la producción de bixina en el achiote. Sin embargo, Rivera-Madrid et al. (2013) demostraron que la producción de bixina puede tener lugar aun en ausencia o escasa acumulación de licopeno, pues la biosíntesis de este pigmento puede tomar una ruta alternativa con ayuda de otros precursores y otras enzimas de la familia de las CCD. Otros apocarotenoides en Bixa or ellana Se han descubierto otros apocarotenoides en la cubierta de la semilla de B. orellana , como refieren Mercadante et al. (1996), quienes aislaron el apocaroteno metil (9ʼZ)-apo-6ʼ-licopenoato. Algo más tarde, Mercadante, Steck y Pfander (1997) también aislaron trazas de otros cinco apocarotenos de la cubierta de la semilla de B. orellana , y establecieron además sus estructuras químicas; dos de ellos resultaron ser nuevos apocarotenoides: metil (7Z,9Z,9ʼZ)-apo-6ʼ-licopenoato; metil ( 9Z )-apo-8ʼ- licopenoato y metil (todo- E )-apo-8ʼ-licopenoato. Los otros dos: (todo- E )- 8ʼ-apo- β -caroteno-8ʼ-oato y el metil (todo- E )-apo- 6ʼ-licopenoato, no habían sido encontrados antes en achiote. Mercadante, Steck y Pfander (1999) también aislaron otros tres nuevos apocarotenoides en B. orellana L., el 6-geranilgeranil 8-metil-6,8ʼ-diapocaroteno-6,8ʼdioato, el 6ʼ-geranilgeranil mol (Francis, 1987); b) la extracción con aceites comestibles de soja (soya) o maíz (Freund, Washam y Maggion, 1988) es el método más empleado a escala industrial (Figueiredo, Oliveira y Queiroz, 2000), y c) la extracción con disolventes orgánicos (cloroformo, acetona, acetato de etilo, metanol, éter etílico, etanol anhidro, n-hexano, propilen glicol); con este método, las concentraciones de la bixina extraída y de los otros pigmentos presentes varían en relación con el disolvente usado (Belmino dos Santos, 2007). La estabilidad química de la bixina y otros pigmentos de las semillas se ve afectada por la luz, temperaturas altas (Bittencourt et al. , 2005), oxígeno y cambios de pH (Bittencourt et al. , 2005; Belmino dos Santos, 2007); no obstante es bastante resistente a ácidos, alcoholes y a la acción microbiana (Leal y Michelangeli, 2010). Síntesis de bixina Jako et al. (2002) y Bouvier, Dogbo y Camara (2003) establecieron la ruta biosíntetica de bixina usando un sistema de expresión heterólogo. En este estudio se identificaron 264 14. A v Ances biotecnológicos p ArA potenciAr lA producción de cArotenoides de B ixa orellana ( Achiote ) p ArA su uso y AprovechAmiento AgroindustriAl Usos como colorante en la industria alimenticia El extracto, obtenido de la semilla de B. orellana se conoce también como anato, se considera uno de los principales colorantes naturales y no parece tener ningún efecto tóxico en el ser humano. Su uso en alimentos procesados ha sido aprobado sin restricciones en la Unión Europea y en Estados Unidos. Es uno de los colorantes naturales más utilizados en la industria alimenticia. Este pigmento, al que se asocia el código E160b, se emplea en sustitución del amarillo 5 OMS/ FAO, 1976. Se usa en productos lácteos, bebidas, mayonesas, pastelería, pescados y sazonadores, entre otros. A partir de la semilla de B. orellana se obtiene tanto la bixina, colorante liposoluble de color rojo a anaranjado, como la norbixina, colorante hidrosoluble color amarillo. Ambos pigmentos representan más de 80% de todos los carotenoides presentes en la semilla (McKeown, 1961). A partir de ellos se obtienen sal de norbixina y diversos productos liposolubles de la degradación térmica que tienen un color amarillento estable; éstos se utilizan fundamentalmente para la coloración de pastas y quesos. Una limitación para el uso de carotenoides como pigmentos es su baja solubilidad en agua; sin embargo, es posible aumentar esta propiedad utilizando emulsificantes, como los polisorbatos y el glicol propilénico, entre otros. El anato tiene la capacidad de cambiar tanto su coloración de amarillo a rojo como su solubilidad; por eso este pigmento es muy utilizado y representa un gran potencial para la industria alimenticia, que demanda cada vez más pigmentos naturales. Aplicaciones como ingrediente beneficioso para la salud Los carotenoides se consideran compuestos beneficiosos para la salud, como ya se ha comentado en el capítulo 1, 6ʼ-metil (9 Z )-6,6ʼ-diapocaroteno-6,6ʼ-dioato y el 6-geranilgeranil 6ʼ-metil-6,6ʼdiapocaroteno-6-6ʼ-dioato. Además de la bixina y la norbixina, actualmente se han aislado más de dos docenas de sustancias de las semillas de B. orellana L. Entre estos compuestos están isobixin, a -caroteno, β -caroteno, criptoxantina, luteína, zeaxantina, orellina (color amarillo) aislados por McKeown (1961) de extractos obtenidos con cloroformo. En extractos acuosos alcalinos de Na + o K + , Mercadante (2001), Taylor (2002) y Oliveira (2005) aislaron los compuestos Z -norbixin y (todo- E )-norbixin, bixeina, bixol, crocetina, ácido salicílico, treonina, triptófano y fenilalanina. u sos y aPlicaciones La B. orellana se ha utilizado desde épocas precolombinas con diversos fines: alimenticios, medicinales, colorante de alimentos, cerámica y pieles, y como ornamento. Su uso y cultivo se extiende desde Paraguay hasta México (Bouvier et al ., 2010). Bouvier et al 2003. Es de origen americano y fue llevada a diversas colonias durante los siglos xVi y xVii. Actualmente se cultiva en india, Sri Lanka y Filipinas en Asia, y en Costa de Marfil, Angola y Kenia en África. En la mayoría de los países productores representa una fuente de ingresos para pequeños agricultores que tienen la planta cerca de sus plantíos o en sus huertos. En términos generales, los pequeños productores surten la demanda local. Sólo tres países exportan el pigmento en volúmenes importantes: Brasil (el mayor exportador), Perú y Kenia. Los principales consumidores del pigmento son india, Japón, Turquía, Rusia, Argentina, Estados Unidos, Canadá y la Unión Europea, donde se utiliza fundamentalmente como colorante de alimentos. 265 14. A v Ances biotecnológicos p ArA potenciAr lA producción de cArotenoides de B ixa orellana ( Achiote ) p ArA su uso y AprovechAmiento AgroindustriAl también se usa como estimulante, diurético, afrodisíaco, laxante y cicatrizante. Juárez, Morales y Chacón (1998) señalan en particular que las hojas y raíces destacan por su aplicación como cataplasmas, y en tratamientos asmáticos y bucofaríngeos, así como en la prevención de la caída del cabello. Otros usos El achiote es ampliamente utilizado en la comida tradicional de algunos países como México, Guatemala, Costa Rica y Perú. En México se utiliza en la península de Yucatán, Chiapas y Tabasco para elaborar bebidas y platillos típicos, como cochinita pibil, relleno negro, tamales y la bebida tascalate, entre muchos otros (Arce 1991; Godoy-Hernández, 2000). En Bolivia se prepara el majadito (arroz al que se le incorpora el pigmento), en Venezuela se consumen “bollos” o bolitas de masa con achiote rellenas de carne, en Nicaragua se preparan nacatamales y en Ecuador, carne colorada. Muchos guisos de la comida típica de los países latinoamericanos incorporan el pigmento de B. orellana , sea como colorante, o mezclado con especias para dar sabor a muchos platillos típicos. Otro uso importante del achiote es en la elaboración de alimentos para aves de corral, pues aumenta el contenido de carotenoides de los huevos y mejora el color de la yema. Al igual que otros carotenoides, el pigmento de achiote se emplea en cosméticos, como barras de labios, productos para el cuidado de la piel y el cabello, jabones y productos para pintar el cuerpo ( body paint ). Algunas etnias de Brasil, como los yawanawas, usan este tinte para la decoración corporal y del rostro. En este mismo país, otro grupo indígena incorpora el pigmento en la cerámica. En menor medida se utiliza en peletería y textiles; también se de ahí que algunos de ellos (como licopeno, β -caroteno, cantaxantina, luteína, zeaxantina y astaxantina) se usen en este contexto como ingredientes en diversos productos alimenticios para humanos y piensos (Del Campo, García- González y Guerrero, 2007; Fassett y Coombes, 2011). La bixina es un apocarotenoide con nueve dobles enlaces conjugados que, al igual que otros carotenoides, podría actuar como antioxidante y proporcionar beneficios para la salud. En contraste con la diversidad de usos medicinales en la farmacopea popular, como se comenta en la sección siguiente, existe muy poca investigación científica sobre los carotenoides típicos del achiote. Cáceres et al. (1995) y Otero et al. (2000) encontraron que la evidencia experimental es negativa en el caso de la diabetes y parcialmente positiva para los otros casos. En células de E coli se observó un efecto protector contra mutaciones inducidas por luz ultravioleta cuando el medio contenía norbixina. Asimismo Junior et al. (2005) observaron un efecto inhibidor de la oxidación por H 2 O 2 in vitro . En experimentos en animales Chin e ima-Nirwana (2014) documentaron efectos en la recalcificación de huesos. Considerando estas evidencias, puede afirmarse que el estudio de los efectos beneficiosos de bixina y norbixina aparece como un campo importante de investigación para el futuro en el contexto de la alimentación funcional. Usos medicinales del achiote El achiote también forma parte del acervo de plantas medicinales precolombinas. Las diversas culturas, antes y después de la conquista, han utilizado las plantas de B. orellana por sus propiedades curativas. Popularmente se le atribuyen propiedades contra enfermedades como la diabetes, infecciones microbianas, mordidas de serpientes, disentería, diarrea, amigdalitis y dolores pectorales. Juárez, Morales y Chacón (1998) y Pérez, Cuen y Becerra (2003) refieren que 272 14. A v Ances biotecnológicos p ArA potenciAr lA producción de cArotenoides de B ixa orellana ( Achiote ) p ArA su uso y AprovechAmiento AgroindustriAl publicaron el primer trabajo de embriogénesis somática indirecta a partir de anteras; Parimalan et al. (2011a) lo hicieron a partir de hipocotilos; Paiva Neto et al. (2003a) y Parimalan et al. (2011a) realizaron embriogénesis somática directa a partir de embriones somáticos inmaduros. En los trabajos del grupo de investigación del doctor Godoy- Hernández, el medio de cultivo empleado es el medio Phillips y Collins (PC-L2), mientras que en otros grupos, los medios más comúnmente empleados han sido el Murashige y Skoog (MS) y/o en combinación con el Gamborg (B5) y el Nitsch y Nitsch (NN). T ransformación genética A pesar del éxito de la propagación in vitro de morfotipos de achiote, ya sea vía organogénesis o embriogénesis, para establecer plantaciones comerciales de achiote, los morfotipos con los más altos contenidos de bixina en sus semillas presentan el fenómeno de dehiscencia de sus frutos, lo que representa pérdidas en la colecta anual de las semillas. Por tal motivo, el grupo de trabajo del doctor Godoy-Hernández optó por el establecimiento de protocolos de regeneración in vitro (Zaldívar-Cruz, 2004; Canul-Canché, 2004) para emplearlos en el establecimiento de un protocolo de transformación genética estable del achiote, con la finalidad de transformar morfotipos de frutos indehiscentes con genes de la ruta de biosíntesis de los isoprenoides plastídicos, para favorecer la producción de bixina en los morfotipos con frutos indehiscentes. El primer trabajo de transformación de B. orellana , vía Agrobacterium tumefaciens , lo reportaron Zaldívar-Cruz et al. (2003), con la transformación transitoria de hipocotilos con el gen reportero GUS con los vectores pBi.121 y pCAMBiA 2301; sin embargo, Zaldívar-Cruz (2004) indica que no se logró la Hernández optó por establecer cultivos de raíces normales. Estos cultivos producían un 0.005% de bixina, un valor similar al detectado en los explantos originales de raíz con un 0.004% de bixina. Aunque los cultivos de órganos producen mejores contenidos de bixina que los callos y suspensiones celulares, el cultivo de raíces normales produce aproximadamente 200 veces menos bixina que la que está presente en las semillas del morfotipo criolla de achiote (1.07%) (Galaz-Ávalos, 1993), por lo que tampoco son un modelo útil para la producción de bixina in vitro. En un trabajo más reciente, Mahendranath et al. (2011) proponen al cultivo de raíces normales con un contenido de bixina de 0.346% como una opción alternativa para la producción de bixina durante todo el año. Morfogénesis En virtud de que los cultivos de callos, suspensiones celulares o raíces normales de achiote producen bixina a concentraciones inferiores a las presentes en las semillas, el grupo de investigación de Godoy-Hernández reportó el establecimiento de protocolos de regeneración a partir de diversos explantes de hipocótilo (Zaldívar-Cruz, 2004; Canul-Canché, 2004; Rodríguez-Vera, 2012; Mian-Mian, 2014); mientras que Canul- Canché (2004) y Rodríguez-Vera (2012) partieron de raíces para micropropagar los morfotipos más sobresalientes en cuanto al contenido de bixina en sus semillas, con el fin de establecer plantaciones comerciales de morfotipos con altos contenidos de este pigmento. En la actualidad, D’Souza y Sharon (2001) y Parimalan, Giridhar y Ravishankar (2011) han mostrado la morfogénesis de achiote vía organogénesis a partir de ápices meristemáticos; Paiva Neto et al. (2003) en hipocotilos; Parimalan et al. (2007) en cotiledones; Joseph, Siril y Nair (2011) y Siril y Joseph (2013) en explantos nodales y Ferreira da Cruz et al. (2014) en raíces. Michelangeli de Clavijo, Artioli y Medina (2002) 273 14. A v Ances biotecnológicos p ArA potenciAr lA producción de cArotenoides de B ixa orellana ( Achiote ) p ArA su uso y AprovechAmiento AgroindustriAl con potenciales marcadores moleculares que diferencian el color de la flor, el fruto y el contenido de bixina (proyecto en curso). Este resultado abre las perspectivas para hacer genómica comparativa que nos permita encontrar más marcadores que diferencien características agronómicas de interés y nos sirvan como marcadores asistidos de selección (MAS) para esta planta leñosa que da su primera floración tres o cuatro años después de su germinación. Fin al men te, l os estudios están dirigidos a la obtención de mayores rendimientos en pigmentos y mayor diversificación de estos compuestos, que poseen alta variación en los colores de sus diferentes morfotipos. Esta característica es muy importante pues de ella depende el valor agregado de la bixina. A nivel de la carotenogenesis el achiote es la única especie que produce el pigmento bixina en cantidades elevadas. La bixina es un derivado de los productos de la ruta de carotenoides y nuestro reto está enfocado a la producción de plantas de achiote con mayor cantidad de pigmento así como promover la síntesis de otros apocarotenoides con color como la orellina, de color amarillo. Al mismo tiempo, se está trabajando en la micropropagación de B. orellana para multiplicar de manera eficiente los materiales más productores de bixina u otro pigmento en particular. Por último, en colaboración con la doctora Lugo del CiATJ, (Coronado-Cáceres et al. , 2013), hemos comenzado a explorar las semillas de achiote como alimento funcional, ya que las semillas de achiote de alguna forma se consumen en su totalidad en la preparación de platillos. Los resultados preliminares indican que las semillas podrían poseer cualidades antioxidantes y antitumorales. Es necesario estudiar esto con más detalle y con mayor rigor. obtención de brotes transgénicos a GUS a partir de dicho explante. Recientemente, Parimalan et al. (2011a) muestran la regeneración de brotes transgénicos al gen reportero GUS a partir de embriones somáticos con el vector pCAMBiA 1305.2 vía A. tumefaciens ; Zhai et al. (2014) obtuvieron raíces peludas de B. orellana vía Agrobacterium rhizogenes . Sin embargo, no se ha informado sobre su transformación con genes de la ruta de los isoprenoides plastídicos. Puesto que únicamente se han publicado dos trabajos sobre la transformación genética estable de B. orellana con A. tumefaciens (Parimalan et al. , 2011a) y A. rhizogenes (Zhai et al. , 2014), se puede considerar que el achiote es una especie recalcitrante a la transformación genética. Por lo que habría que detectar genotipos susceptibles a la transformación genética estable, ya que ello podría ser la limitante en su transformación con genes de la ruta de isoprenoides plastídicos. P ersPectiV as El achiote es un cultivo promisorio por el alto contenido de pigmentos que produce. Nuestro grupo de investigación ha generado resultados interesantes que permitirán avanzar más rápido en su mejora genética, así como en su micropropagación in vitro ; ambos aspectos son de vital importancia para este cultivo. También se cuenta con la caracterización de los morfotipos y con un banco de germoplasma de accesiones con variación de las características morfológicas incluyendo variación en contenido de carotenoides y bixina (Valdez-Ojeda et al ., 2008; Aguilar- Espinosa, Rivera-Madrid y Lizama-Rivero, 2012). A nivel molecular, principalmente en la variación genética, contamos 274 14. A v Ances biotecnológicos p ArA potenciAr lA producción de cArotenoides de B ixa orellana ( Achiote ) p ArA su uso y AprovechAmiento AgroindustriAl AGRADECIMIENT OS 275 14. A v Ances biotecnológicos p ArA potenciAr lA producción de cArotenoides de B ixa orellana ( Achiote ) p ArA su uso y AprovechAmiento AgroindustriAl Aguilar-Espinosa, M.L., Rivera-Madrid, R. y Lizama-Rivero, O. 2012. Revista Latinoamericana de Química , 39. iSNN0370-5943, Suplemento especial. Alarcón, P.J.C., Castaño, P.H.i., Corrales, G.L.L., Jiménez, R.S.L. Díaz C. A. 2006. Vitae. Revista de la Facultad de Química Farmacéutica. 13: 17-23. 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REFERENCIAS 280 15. b iosÍntesis de carotenoides en Hongos Javier Ávalos y M. Carmen Limón b iosíntesis de Carotenoides en hongos i ntroducción Los hongos son organismos no fotosintéticos que forman un reino dentro de los eucariotas y que poseen una enorme versatilidad metabólica y capacidad de adaptación a ambientes ecológicos muy diversos. En muchos casos, su metabolismo incluye la capacidad de sintetizar carotenoides, objeto de este capítulo. Los hongos se dividen en varios grupos taxonómicos, entre los que figuran los ascomicetos, que deben su nombre a la formación de ascas, los basidiomicetos, que forman basidios, y los zigomicetos, que forman zigosporas. Con independencia del grupo taxonómico, los hongos pueden desarrollarse formando filamentos (hongos filamentosos) o células individuales (levaduras). Por sus facilidades de cultivo y manipulación en el laboratorio, los investigadores prefieren estudiar algunos hongos. Además, la diversidad de su metabolismo hace de ellos organismos de gran interés biotecnológico; algunas especies se han empleado como modelos de investigación en la síntesis de carotenoides. C apítulo 15 281 15. B iosíntesis de carotenoides en hongos La síntesis de carotenoides en hongos se produce a partir del pirofosfato de geranilgeraniol (GGPP). El GGPP se sintetiza tras cuatro pasos consecutivos de condensación a partir de un precursor de cinco átomos de carbono, el pirofosfato de isopentenilo (iPP). Este compuesto se sintetiza en diferentes organismos mediante dos rutas biosintéticas diferentes. La primera deriva del hidroximetilglutaril coenzima A (HMG-CoA) a través del mevalonato, y la segunda, de la condensación de la hydroxietil-tiamina y el gliceraldehído 3-fosfato, con la D-1- deoxixilulosa 1-fosfato como intermediario (Rohmer et al. , 1993). En los casos investigados, la síntesis de carotenoides en los hongos ocurre a través de la ruta del mevalonato. Todos los carotenoides tienen su origen en el fitoeno, un carotenoide incoloro de 40 átomos de carbono que se sintetiza por condensación de dos unidades de GGPP a través de un intermediario en conformación cis (figura 1). La introducción de dobles enlaces conjugados a esta molécula aporta a los subsiguientes carotenoides la capacidad de absorber luz visible, dándoles las características pigmentaciones amarilla, anaranjada o rojiza. La ruta difiere después en distintos hongos en función de las modificaciones químicas que se introducen, que normalmente incluyen la ciclación de uno o los dos extremos de la cadena lineal (anillos ε o β ) o la introducción de grupos oxigenados. Aunque la capacidad de producir carotenoides es una característica frecuente en los hongos, no todos poseen esta ruta biosintética. Algunas especies muy empleadas en investigación, como Aspergillus nidulans o Saccharomyces cerevisae , carecen de los genes para esta ruta. En este capítulo se resume el conocimiento sobre los carotenoides producidos por hongos, prestando especial atención a aquellos en los que se ha profundizado más a nivel bioquímico y genético. f igura 1. Biosíntesis del β -caroteno en hongos. La flecha discontinua resume los cuatro pasos consecutivos de desaturación, cuyos intermediarios son el fitoflueno, el z -caroteno y el neurosporeno (no mostrados). 288 15. B iosíntesis de carotenoides en hongos En algunos casos la fotoinducción se ha estudiado con gran detalle. En P. blakesleeanus , la fotorrespuesta se limita a una etapa concreta del desarrollo, antes de la formación de los esporangióforos, estructuras en las que se desarrollan las esporas asexuales (Bejarano et al. , 1991). En esta fase del desarrollo, la aplicación de distintos flujos de luz al mismo tiempo permitió detectar dos niveles de sensibilidad, con distintos umbrales y rangos de respuesta. Una exposición a luz muy débil produce una pequeña estimulación que se satura a flujos mayores, hasta alcanzar un umbral capaz de producir una respuesta mucho más fuerte. Se ha encontrado también una respuesta bifásica al flujo luminoso en N. crassa (Schrott, 1980). La fotoinducción es particularmente eficaz en este hongo, capaz de producir un incremento sensible de la carotenogénesis después de sólo un minuto de exposición a la luz (Zalokar, 1955) o incluso menos (Rau, Lindemann y Rau- Hund, 1968), alcanzando su valor máximo aproximadamente 6-8 horas después del estímulo. Sin embargo, una vez disparada la respuesta a un pulso de luz, el hongo es insensible temporalmente a un segundo pulso (Schrott, 1981), indicando un bloqueo temporal del sistema de fotorrecepción. La respuesta es menos eficaz en Fusarium aquaeductuum (Bindl, Lang y Rau, 1970) y F. fujikuroi (Ávalos y Schrott, 1990), y en estos casos es necesario al menos una hora de iluminación para una respuesta detectable. En los casos investigados, la inducción mediante la luz tiene lugar a nivel de transcripción de los genes estructurales. En los hongos mucorales, el incremento es particularmente fuerte en M. circinelloides , y es suficiente un pulso de 10 minutos de luz azul para que los niveles de ARNm de los genes carB y carRA aumenten hasta 300 veces (Velayos et al. , 2000; 2000a), mientras que el incremento no es tan acusado en P. blakesleeanus (Ruiz-Hidalgo et al. , 1997; Blasco et al. , 2001; r egulación de la sÍntesis de carotenoides en Hongos Debido al interés en las aplicaciones de los carotenoides y al uso de algunos hongos para su producción biotecnológica, la regulación de su síntesis ha recibido especial atención en estos organismos. En función de las especies, la síntesis se estimula mediante la luz o por algunas condiciones adversas de cultivo, como la escasez de nutrientes o el estrés oxidativo. En algunos casos se conocen los mecanismos de regulación asociados a determinadas etapas del desarrollo o del ciclo de vida. La existencia de proteínas reguladoras específicas se evidencia debido a la existencia de mutantes regulatorios, algunos de los cuales se han estudiados con especial detalle. Se describen a continuación los principales aspectos de los mecanismos de regulación. Estimulación mediante la luz La inducción por luz es un carácter frecuente en los hongos productores de carotenoides (Ávalos, Bejarano y Cerdá-Olmedo, 1993). Entre los casos mejor conocidos figuran la fotoinducción de la síntesis de β -caroteno en P. blakesleeanus (Bejarano et al. , 1991), M. circinelloides (Navarro, Sandmann y Torres-Martínez, 1995; Velayos et al. , 1997) y A. giganteus (El-Jack, Mackenzie y Bramley, 1988) junto con la de neurosporaxantina en N. crassa (Ávalos y Corrochano, 2013) y en distintas especies de Fusarium (Ávalos y Estrada, 2010). También se ha descrito fotoinducción de la síntesis de astaxantina en mutantes de X. dendrorhous (Meyer y Du Preez, 1994). Sin embargo, la inducción por luz no es una regla general. Así, por ejemplo, la síntesis de β -caroteno no aumenta significativamente en B. trispora (Sutter, 1970) o en U. maydis (Estrada et al. , 2010) cuando se cultivan bajo iluminación continua. 289 15. B iosíntesis de carotenoides en hongos contenido en carotenoides de sus mutantes en condiciones de iluminación. Los niveles de ARNm de los genes carRA, carB (Linnemannstöns et al. , 2002; Prado et al. , 2004) y carT (Prado-Cabrero et al. , 2007) de F. fujikuroi manifiestan una fotorregulación similar a la de sus ortólogos al-1 , al-2 y cao- 2 en N. crassa . Sin embargo, los del gen carD , ortólogo de ylo-1 , no están influidos por la luz de forma significativa (Díaz- Sánchez et al. , 2011). Una fotoinducción similar de carRA y carB se ha descrito en Fusarium oxysporum (Rodríguez-Ortiz et al. , 2012) y en Fusarium verticillioides (Ádám et al. , 2011). La regulación por luz se ha estudiado también para los genes de la síntesis de GGPP, un sustrato que no es exclusivo de la síntesis de carotenoides. Los niveles de ARNm de estos genes son fotoinducibles en N. crassa, al-3, (Nelson et al. , 1989; Baima, Macino y Morelli, 1991), y M. circinelloides, carG (Velayos et al. , 2003), pero no en F. fujikuroi, ggs1 (Mende, Homann y Tudzynski, 1997). En este último hongo hay un segundo gen presuntamente implicado en la síntesis de GGPP en la ruta biosintética de giberelinas, ggs2 (Tudzynski, 2005), pero no se ha estudiado su posible regulación mediante la luz. Fotorreceptores responsables de la inducción mediante la luz Uno de los aspectos de mayor interés en los estudios de la regulación mediante luz es la identificación de los fotorreceptores responsables. El espectro de acción de la fotorrespuesta se ha determinado para F. aquaeductuum (Rau, 1967), N. crassa (De Fabo, Harding y Shropshire, 1976) y para los dos niveles de sensibilidad de P. blakesleeanus (Bejarano et al. , 1991). Los espectros obtenidos son comparables, teniendo en cuenta las diferencias experimentales, y compatibles con Almeida y Cerdá-Olmedo, 2008). Un estudio más detallado en este hongo mostró dos picos en la cinética de fotoinducción, uno en los primeros dos minutos y otro a los 20 minutos, y detectó la unión de un posible complejo inhibidor a la doble región promotora carB/carRA (Sanz et al. , 2010). Los ARNm de los genes carRA y carB también aumentan tras la exposición a la luz en B. trispora , a pesar de que sus cultivos con luz continua no acumulan más carotenoides que los incubados en la oscuridad (Quiles-Rosillo et al ., 2005). Esta discrepancia parece deberse a la transitoriedad de la fotorrespuesta, un fenómeno conocido como fotoadaptación, observado también en otros hongos, que permite la atenuación de la expresión de los genes de la carotenogénesis tras exposiciones prolongadas a la luz. Sin embargo, la iluminación de micelio de B. trispora previamente incubado en la oscuridad produce un aumento significativo en el contenido de carotenoides (Quiles-Rosillo et al ., 2005), lo que obliga a reconsiderar su supuesta falta de fotoinducción. En los ascomicetos se han descrito también fotorrespuestas similares para los genes de la carotenogénesis. En N. crassa, los niveles de ARNm de los genes al-1 (Schmidhauser et al. , 1990), al-2 (Schmidhauser et al. , 1994) y cao-2 (Saelices et al. , 2007) aumentan enormemente al exponer el hongo a la luz, pero no se ha detectado fotoinducción para el último gen de la ruta, ylo-1 (Estrada et al. , 2008b). Como en los hongos mucorales, el aumento es transitorio, ya que disminuye a niveles casi basales unas horas después del estímulo. El mecanismo molecular de la fotoadaptación se ha estudiado en especial detalle en este hongo (He y Liu, 2005), donde implica cambios en la actividad de su complejo fotorreceptor WC. En el proceso participan otras proteínas reguladoras, y tiene un papel importante la flavoproteína ViViD (VVD) (Shrode et al. , 2001; Schwerdtfeger y Linden, 2003), llamada así por el mayor 290 15. B iosíntesis de carotenoides en hongos la inducción por luz de la carotenogénesis, y los dobles mutantes madA madB están más fuertemente afectados en la fotorrespuesta (Jayaram, Leutwiler y Delbrück, 1980; López- Díaz y Cerdá-Olmedo, 1980). La disponibilidad de la secuencia del genoma permitió identificar los genes responsables: madA resultó ser homólogo de wc-1 (idnurm et al. , 2006) y madB de su correspondiente pareja wc-2 , una conclusión apoyada por la capacidad de las proteínas MadA y MadB para interaccionar y formar un complejo (Sanz et al. , 2009). El análisis del genoma de P. blakesleeanus reveló la existencia de cinco genes para otras dos proteínas del tipo WC-1, que se denominaron WcoA y WcoB, y para otras tres proteínas de tipo WC-2, que se denominaron WctB, WctC y WctD (Corrochano y Garre, 2010). La existencia de esta variedad permitiría múltiples combinaciones en la formación de complejos WC, aunque hasta ahora sólo se ha demostrado la formación del complejo MadA-MadB (Sanz et al. , 2009). La regulación mediante luz puede implicar la participación de otras proteínas, como indica la identificación de otros mutantes con menor sensibilidad a la luz, como los afectados en los genes picA, picB (López- Díaz y Cerdá-Olmedo, 1980) y pimA (Flores Cerdá-Olmedo y Corrochano, 1998), cuyos productos no han sido aún identificados. M. circinelloides posee un juego similar de genes wc (Corrochano y Garre, 2010). En este caso, la disponibilidad de herramientas de transformación permitió su mutagénesis dirigida, y por lo tanto el estudio de sus funciones. Así, los mutantes nulos de mcwc-1c (ortólogo de wcoA ) carecen de fotoinducción de la síntesis de β -caroteno, y los de mcwc- 1a (ortólogo de madA ) están específicamente afectados en la respuesta a la luz del desarrollo de los esporangióforos, mientras que los mutantes de mcwc-1b (ortólogo de wcoB ) carecen de fenotipo detectable (Silva, Torres-Martínez y la participación de una flavina como pigmento responsable de la absorción de luz. La mediación de una flavina quedó en evidencia en N. crassa por la menor fotoinducción observada en mutantes con un contenido reducido de este compuesto (Paietta y Sargent, 1981) y por la no recuperación de la respuesta por adición de análogos de la riboflavina (Paietta y Sargent, 1983). El primer fotorreceptor se identificó en N. crassa , donde la respuesta es mediada por el complejo “white collar” (WC). El nombre proviene del fenotipo de sus mutantes, que en los cultivos en tubos de agar muestran un anillo blanco de micelio en la base debido a la ausencia de fotoinducción de la carotenogénesis, mientras que la masa de micelio aéreo es de color anaranjado debido a la inducción de la síntesis de carotenoides durante la conidiación. El complejo WC es un heterodímero formado por dos proteínas, llamadas WC-1 y WC- 2, identificadas mediante el análisis de los mutantes afectados en los correspondientes genes, wc-1 y wc-2 . Los estudios moleculares mostraron que ambos mutantes habían perdido la inducción por luz de la actividad biosintética del fitoeno (Harding y Turner, 1981), así como la propia síntesis de los carotenoides (Degli-innocenti y Russo, 1984) y la transcripción de los genes estructurales (Saelices et al. , 2007). Cuando detecta la luz, el complejo WC se une a los promotores de los genes diana (He y Liu, 2005), habiéndose identificado en algunos de ellos posibles elementos reguladores responsables de dicha unión (Carattoli et al. , 1994). Dentro del complejo, la función fotorreceptora la desempeña WC-1, que es la que contiene el cromóforo de flavina. Estudios posteriores en otros hongos han identificado sistemas fotorreceptores similares. En P. blakesleeanus , los mutantes regulatorios madA y madB muestran una disminución en 291 15. B iosíntesis de carotenoides en hongos Mutantes superproductores de carotenoides Los mutantes afectados en genes de reguladores positivos de la carotenogénesis, como los fotorreceptores MadA y MadB en P. blakesleeanus o WC-1 y WC-2 en N. crassa , presentan caídas en las cantidades de carotenoides en la luz. La base molecular de otros mutantes con menores cantidades de carotenos, como los del gen carC de P. blakesleeanus (Revuelta y Eslava, 1983), u otros de B. trispora (Mehta y Cerdá-Olmedo, 1995) o M. circinelloides (Navarro, Sandmann y Torres-Martínez, 1995; Fraser et al. , 1996; Velayos et al. , 1997), es desconocida. Sin embargo, debido a sus implicaciones biotecnológicas, son de especial interés las mutaciones en genes de reguladores negativos de la carotenogénesis, ya que se espera que den lugar a incrementos en la producción de carotenoides. Tales tipos de mutantes se han descrito en distintos hongos. En P. blakesleeanus los análisis genéticos de mutantes con un mayor contenido en β -caroteno en la oscuridad los han distribuido en tres genes, carS (Murillo y Cerdá-Olmedo, 1976), carD (Salgado, Bejarano y Cerdá- Olmedo, 1989) y carF (Mehta et al. , 1997). Se han descrito mutantes similares en B. trispora (Mehta y Cerdá-Olmedo, 1995; Mehta, Obraztsova y Cerdá-Olmedo, 2003) y M. circinelloides (Navarro, Sandmann y Torres-Martínez, 1995; Fraser et al. , 1996), pero el aumento en la producción respecto a la estirpe silvestre es sólo de tres a cuatro veces, comparado con las cien veces de diferencia que se llega a alcanzar en algunos mutantes carS o carF en P. blakesleeanus . Los mutantes carS de P. blakesleeanus están afectados en una enzima que utiliza el β -caroteno para la síntesis de otros compuestos no coloreados y no en una proteína reguladora. Por ese mismo motivo, los mutantes de los genes carB o del dominio ciclasa de carRA acumulan los sustratos de las correspondientes enzimas (fitoeno y licopeno, respectivamente) Garre, 2006). Sin embargo, aunque el mutante nulo de mcwc- 1a muestre fotoinducción de la carotenogénesis, la proteína MCWC-1A participa en la inducción por luz del gen mcwc-1c , por lo cual la fotoinducción de la transcripción de los genes estructurales carB y carRP baja considerablemente tanto en los mutantes carentes de MCWC-1A como de MCWC-1C, implicando a ambas proteínas en su mecanismo de regulación por luz. También se han encontrado diferencias en la función del complejo WC en el género Fusarium , cuyos genomas poseen un solo juego de genes de tipo wc-1 y wc-2 (Ávalos y Estrada, 2010). Los mutantes de F. fujikuroi y F. oxysporum carentes de proteína funcional WC-1 (llamadas WcoA y Wc1 respectivamente) muestran todavía un nivel significativo de fotocarotenogénesis (Estrada y Ávalos, 2008; Ruiz-Roldán et al. , 2008), sugiriendo la participación de al menos un segundo fotorreceptor. En F. fujikuroi se han obtenido mutantes de otros tres fotorreceptores, el criptocromo DASH CryD (Castrillo, García-Martínez y Ávalos, 2013) y las rodopsinas CarO (Prado et al. , 2004) y OpsA (Estrada y Ávalos, 2009), pero todos ellos conservan la capacidad de fotoinducir la fotocarotenogénesis. Sin embargo, los mutantes del gen de la adenilato ciclasa, acyA , de F. fujikuroi (García-Martínez, Ádám y Ávalos, 2012) o del gen MAT1-2-1 del locus sexual de F. verticillioides (Ádám et al. , 2011), muestran niveles menores de fotoinducción, lo que indica la existencia de una regulación más compleja que la observada en N. crassa o en P. blakesleeanus . Datos recientes de F. fujikuroi indican que WcoA juega un papel similar al de WC-1 en N. crassa y que el criptocromo CryD es capaz de llevar a cabo una fotoinducción por un mecanismo molecular que no actúa a nivel de la transcripción (Castrillo y Ávalos, 2015). 292 15. B iosíntesis de carotenoides en hongos crgA de M. circinelloides , los genes estructurales de la carotenogénesis de F. fujikuroi y F. oxysporum son capaces aun de responder a la luz en los mutantes carS (Prado-Cabrero et al. , 2007a; Rodríguez-Ortiz et al. , 2012). El fenotipo carS de ambas especies suele deberse a mutaciones en un gen para una proteína de la familia RiNG Finger, emparentada con CrgA y denominada CarS (Rodríguez-Ortiz et al ., 2012; Rodríguez-Ortiz, Limón y Ávalos, 2013). El grado de similitud de CarS con CrgA no es muy alto, pero cubre toda la proteína y sus dominios principales, lo que sugiere un origen evolutivo común. A pesar de su llamativo fenotipo, no se han descrito mutantes carS en otras especies de Fusarium. En F. fujikuroi , los mutantes carS están también afectados en la producción de otros metabolitos secundarios, como las giberelinas y las bikaverinas, (Candau, Bejarano y Cerdá-Olmedo, 1991; Rodríguez-Ortiz, Limón y Ávalos, 2009), pero no muestran alteraciones en el desarrollo o en la esporulación. En N. crassa no existen mutantes superproductores de neurosporaxantina equiparables a los mutantes carS de Fusarium , pero se han descrito mutantes con patrones parcialmente desregulados en la oscuridad o en la luz. Los mutantes ccb-1 y cbb-2 poseen niveles de carotenoides ligeramente desregulados en la oscuridad, aunque no muestran más cantidad de ARNm de los genes estructurales (Linden, Rodríguez-Franco y Macino, 1997). De ellos, sólo ccb-2 acumula más cantidad de carotenoides también en la luz, en este caso con un aumento apreciable de los niveles de ARNm. Otros mutantes no muestran cambios en la oscuridad pero producen más carotenoides en la luz. A esta clase pertenecen los mutantes ovc (Harding et al. , 1984) y vvd , este último ya mencionado por su participación en el mecanismo de fotoadaptación. El mutante ovc es más complejo, ya que presenta además alteraciones del desarrollo y en la sensibilidad en cantidades muy superiores a las de β -caroteno en la estirpe silvestre de la que proceden. El primer gen implicado en la regulación de la síntesis de carotenoides en los hongos, ajeno a la regulación por luz, fue crgA de M. circinelloides (Navarro et al. , 2000), que codifica una proteína de la familia “RiNG finger” con un dominio LON. La pérdida de CrgA produce un incremento en los niveles de ARNm de los genes estructurales carRA y carB , aunque siguen conservando su respuesta a la luz (Navarro, Ruiz-Pérez y Torres-Martínez, 2001; Lorca-Pascual et al. , 2004). De acuerdo con las características de la proteína, se ha propuesto que CrgA ejerce su función interaccionando con proteínas diana y provocando su ubiquitinación, lo que puede conducir a su degradación por el proteosoma (Lorca-Pascual et al. , 2004). Además, se ha observado que CrgA inactiva a MCWC-1B por proteólisis independiente de ubiquitinación (Silva et al. , 2008). CrgA no es un regulador exclusivo de la carotenogénesis, ya que afecta también a otros procesos, como el crecimiento vegetativo y la esporulación (Quiles-Rosillo, Torres-Martínez y Garre, 2003; Murcia-Flores et al. , 2007). Proteínas similares a CrgA se encuentran en otros mucorales, como B. trispora (Quiles-Rosillo et al. , 2005). En F. fujikuroi y F. oxysporum se han descrito mutantes superproductores de neurosporaxantina, genéricamente llamados carS (Ávalos y Cerdá-Olmedo, 1987; Rodríguez-Ortiz et al ., 2012). Los mutantes carS , que acumulan cantidades elevadas de carotenoides con independencia de las condiciones de cultivo, poseen niveles anormalmente altos de los ARNm de los genes de la ruta (Prado et al. , 2004; Thewes et al. , 2005; Prado-Cabrero et al. , 2007a), lo que se refleja en una elevada actividad carotenogénica in vitro (Ávalos et al. , 1988). De forma similar a como se observó para los mutantes 293 15. B iosíntesis de carotenoides en hongos El retinol ejerce también un efecto activador (Choudhari, Ananthanarayan y Singhal, 2008), aunque no es tan eficaz como en P. blakesleeanus (Bejarano et al. , 1988), y los fenoles carecen de efecto. Una búsqueda sistemática de activadores de la carotenogénesis en B. trispora encontró un efecto estimulador en la β -ionona así como en una gran diversidad de compuestos químicos, entre los que figuran amidas, imidas, lactamas, hidrazidas y derivados de las piradinas (Ninet, Renaut y Tissier, 1969). Más recientemente, se han encontrado también efectos inductores en el uso de surfactantes, como el monolaureato de sorbitano (Choudhari, Ananthanarayan y Singhal, 2008), el ácido araquidónico (Hu, Sun et al. , 2012) y el fungicida quetoconazol (Dong et al. , 2008), cada uno de ellos atribuible a distintos mecanismos de acción. Un caso especialmente relevante de activación química de la carotenogénesis es el llevado a cabo en los mucorales por los ácidos trispóricos, hormonas sexuales sintetizadas tras la interacción entre estirpes de sexo contrario (Sutter, Harrison y Galasko, 1974; Sutter, 1987). En algunas especies, dichas hormonas provocan una fuerte activación en la acumulación de β -caroteno (Blakeslee, 1904). En P. blakesleeanus , los cultivos conjuntos de dos estirpes de sexo opuesto (cultivos “mixtos”) contienen cinco veces mas carotenoides que los cultivos individuales (Govind y Cerdá-Olmedo, 1986), un aumento debido a un mayor nivel de expresión de los genes carRA y carB (Almeida y Cerdá-Olmedo, 2008), y al consiguiente incremento en actividad enzimática (Salgado et al. , 1991). La estimulación es producida también por la adición de las hormonas o de moléculas análogas a éstas a los cultivos individuales tanto de P. blakesleeanus (Govind y Cerdá-Olmedo, 1986) como de otros mucorales (Sahadevan et al. , 2013). En P. blakesleeanus la estimulación sexual de la carotenogénesis en los cultivos mixtos es aún mayor en los al estrés osmótico (Youssar et al. , 2005) y se debe a una deleción que abarca una veintena de genes (Youssar y Ávalos, 2007). Entre ellos se encuentra el gen cut-1 , responsable de las alteraciones adicionales e indirectamente también de la superproducción de carotenoides. También se puede aumentar la producción de carotenoides en Neurospora al mejorar la provisión de sustrato mediante el incremento de la actividad biosintética de mevalonato a partir del HMG-CoA (Wang y Keasling, 2002), o sometiendo el hongo a estrés oxidativo. Activación química de la carotenogénesis En los hongos mucorales P. blakesleeanus y B. trispora, la presencia de algunos compuestos químicos aumenta la producción de la síntesis de β -caroteno. En el caso de P. blakesleeanus hay al menos dos familias de compuestos químicos inductores con distintos mecanismos de acción: los retinoides y los fenoles (Bejarano et al. , 1988). Los retinoides, como el retinol y la β -ionona (Eslava, Álvarez y Cerdá- Olmedo, 1974), tienen en común la presencia de un anillo β y pueden actuar compitiendo con el β -caroteno para unirse a alguna enzima o proteína reguladora. Por otra parte, los compuestos fenólicos poseen una eficacia muy variable y no se ha identificado una característica química común que esté ausente en los fenoles inactivos y que se pueda, por lo tanto, asociar a su actividad (Cerdá-Olmedo y Hüttermann, 1986). Los más eficientes son el veratrol y el ftalato de dimetilo, cuya acción independiente de los retinoides se pone de manifiesto por el efecto aditivo producido en presencia de ambos tipos de activadores (Bejarano et al. , 1988). Debido al uso biotecnológico de B. trispora para la producción de carotenoides, la activación química de la carotenogénesis ha recibido una atención muy considerable en esta especie. [Document text truncated for crawler view.]