Desarrollo de marcadores genéticos de microsatélites para especies de plantas del género Phlomis mediante técnicas de Next-Generation Sequencing (NGS)

Desarrollo de marcadores genéticos de microsatélites para especies de plantas del género Phlomis mediante técnicas de Next-Generation Sequencing (NGS) Paloma Triguero Piñero Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla 1 TRABAJO DE FIN DE GRADO UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA Grado en Farmacia Desarrollo de marcadores genéticos de microsatélites para especies de plantas del género Phlomis mediante técnicas de Next-Generation Sequencing (NGS) Nombre: Paloma Triguero Piñero Tutor: Rafael González Albaladejo Departamento: Biología Vegetal y Ecología Tipología: Trabajo de carácter experimental Lugar y fecha de presentación: Por determinar 2 RESUMEN: La diversidad genética da lugar a la evolución de las especies, permitiéndoles adaptarse al medio ambiente cambiante, y contribuyendo de este modo a la genética de conservación de las poblaciones de organismos. Esta diversidad genética se mide con marcadores moleculares o genéticos, siendo los marcadores de microsatélites los más empleados. En este trabajo se disponía de una serie de marcadores obtenidos por técnicas de Next-Generation Sequencing (NGS), de dos especies endémicas del género Phlomis: Phlomis lychnitis y Phlomis crinita subsp. Malacitana. De las cuales se quería obtener el potencial de amplificación y variabilidad, además de calcular los parámetros básicos de la diversidad genética para así poder determinar el potencial de estos marcadores para futuros estudios de hibridación. Nuestros resultados muestran un conjunto de 10 marcadores de microsatélites que presentaban variabilidad, es decir, marcadores que presentaban diferentes alelos en las muestras, por tanto, polimórficos; y 12 monomórficos, los cuales presentaban un único alelo en la misma posición por lo que no presentaban variabilidad. Para probar la capacidad diagnóstica de los marcadores que presentaron variabilidad se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) para ordenar los genotipos multilocus de cada individuo en un espacio multidimensional. Esta representación determinó la capacidad de diferenciar genéticamente las dos especies, al tratarse de dos poblaciones puras. Por ello, podemos afirmar que el conjunto de marcadores empleados es bueno para discernir entre las dos especies estudiadas. En un futuro este estudio se podría transferir a otras especies endémicas del género Phlomis. Palabras clave: variabilidad genética, hibridación, microsatélites, NGS, SSR. 3 ÍNDICE: I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 4 1. MARCADORES GENÉTICOS: ................................................................................................. 4 2. ¿QUÉ SON LOS MICROSATÉLITES?: ..................................................................................... 6 3. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA (NGS) ................................................................... 7 4. ANTECEDENTES: .................................................................................................................. 8 5. ESPECIES DE ESTUDIO: ........................................................................................................ 9 II. OBJETIVOS DEL TFG: ................................................................................................... 13 III. METODOLOGÍA: ......................................................................................................... 14 1. MUESTREO Y EXTRACCIÓN DE ADN .................................................................................. 14 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: ........................................................................................ 16 1. RESULTADOS DE LA EXTRACCIÓN Y AMPLIFICACIÓN DE ADN: ......................................... 16 V. CONCLUSIONES: ......................................................................................................... 23 VI. BIBLIOGRAFÍA: ........................................................................................................... 24 4 INTRODUCCIÓN: La cuantificación de la diversidad genética en las poblaciones de organismos es una prioridad en la genética de la conservación (Frankham et al., 2004). La diversidad genética es necesaria en las poblaciones para su adaptación a un medio ambiente cambiante. En otras palabras, la diversidad genética es la materia prima con la que la selección natural opera para la adaptación de las especies al medio. Usualmente poblaciones grandes de especies ampliamente distribuidas tienen una mayor diversidad genética que las poblaciones de especies endémicas que ocurren en un área geográfica más restringida (Gitzendanner y Soltis, 2000). Típicamente la manera de medir esa diversidad genética es mediante el uso de marcadores moleculares o marcadores genéticos. MARCADORES GENÉTICOS: El Instituto Nacional de Investigaciones del Genoma Humano define el Marcador genético como “Un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un cromosoma y cuya herencia se puede rastrear. Un marcador puede ser un gen, o puede ser alguna sección del ADN sin función conocida”. Durante los procesos de replicación del ADN se pueden producir mutaciones en el genoma, originadas principalmente por sustituciones, delecciones, inserciones, inversiones o translocaciones en una o varias bases nucleotídicas. Estas mutaciones generan variabilidad entre los individuos de una población, y pueden usarse como marcadores genéticos (Brooker, 2012), lo que nos permite estudiar la evolución de las poblaciones y en última instancia de las especies. Los marcadores genéticos, al ser fragmentos específicos de ADN, se pueden identificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). Esta técnica, desarrollada en 1983 por Kary Mullis, permite amplificar in vitro regiones específicas de ADN para su posterior análisis, incrementando el número de copias. Este nuevo ADN se sintetiza gracias a unos cebadores que se sitúan en los extremos de los segmentos de ADN que están presente en la muestra, y que es replicado selectivamente por una enzima denominada Taq polimerasa (Nelson y Cox, 2007). El procedimiento de la PCR tiene 3 pasos, que se repiten usualmente entre 25 y 30 ciclos (Figura 1): 5 1. Desnaturalización de la cadena de ADN: las dos hebras de ADN se separan por calentamiento (normalmente a 95°C). 2. Hibridación o alineamiento: los cebadores de ADN sintético flanquean la región del ADN que se desea amplificar (usualmente ocurre a una temperatura entre 45-65°C). 3. Extensión: el ADN nuevo se sintetiza por polimerización gracias a la acción de la ADN polimerasa (suele llevarse a cabo a 72°C). Figura 1. Amplificación de un fragmento de ADN mediante PCR. Imagen tomada de: https://archive.cnx.org/contents/[email protected]). 6 ¿QUÉ SON LOS MICROSATÉLITES?: Los microsatélites, también llamados SSR (Simple Sequence Repeat), STR (Short Tándem Repeat) o VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) son secuencias de ADN constituidas por repeticiones en tándem de unidades cortas de 1 a 6 pares de bases (Jarne y Lagoda, 1996; Selkoe y Toonen, 2006). Los microsatélites comprenden regiones de ADN no codificante. Las repeticiones más abundantes se dan en forma de mono, di y trinucleótidos, y en menor porcentaje en tetra, penta y hexanucleótidos (Kantartzi, 2013). En plantas, los microsatélites se localizan en regiones no repetitivas del ADN, es decir, en regiones anteriores a la expansión del genoma. A pesar de ello, están localizados uniformemente a lo largo del genoma, aunque son muy variables en el número de unidades repetidas entre individuos. El patrón más abundante encontrado en el genoma de las plantas es (AT)n, (GA)n y (GAA)n donde n se refiere al número total de repeticiones, generalmente en el rango de 5 a 40 (Selkoe y Toonen, 2006). Las regiones de ADN que rodean los loci de microsatélites se denominan regiones flanqueantes y generalmente son regiones conservadas entre individuos de la misma especie (a veces incluso entre individuos de especies cercanas filogenéticamente). El desarrollo de marcadores de microsatélites se basa en el diseño de oligonucleótidos cebadores (primers) en estas regiones flanqueantes que guíen la amplificación del locus de microsatélite mediante PCR. Como marcadores genéticos, los microsatélites son muy útiles y poseen una gran variedad de aplicaciones en genética y ecología vegetal gracias a su reproductibilidad, su elevada variabilidad alélica debido a una alta tasa de mutación (promedio de 5 × 10-4 mutaciones por locus por generación) (Schlötterer, 2000), su comportamiento selectivamente neutro, una herencia codominante, abundancia relativa y buena cobertura a lo largo del genoma. Entre sus múltiples aplicaciones se encuentra por ejemplo la estima de la variación genética a nivel molecular en una colección de germoplasma que ayude a la correcta elección de progenitores para cruces en un programa de mejora, el mapeo y marcado de genes o QTL (Quantitative Trait Loci, loci responsables de rasgos fenotípicos cuantitativos), el estudio de la estructura y variabilidad genética de las poblaciones naturales de plantas así como el establecimiento de relaciones taxonómicas y filogenéticas entre poblaciones y especies (Lowe et al., 2004). Tradicionalmente un gran obstáculo para el uso de estos marcadores tan versátiles en especies no-modelo era su desarrollo, costoso en tiempo y en dinero (Schoebel et al., 2013). El proceso requería usualmente la preparación de librerías enriquecidas de ADN (fragmentación 7 del ADN y amplificación de los fragmentos), clonación (inserción de los fragmentos de ADN en plásmidos de células E. coli competentes y cultivo de las colonias) y posterior secuenciación mediante secuenciación Sanger de los fragmentos clonados (p.e. Albaladejo et al., 2008, 2010). TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA (NGS) Las técnicas de secuenciación masiva o de próxima generación (Next Generation Sequencing o NGS) han revolucionado en la última década el panorama en la secuenciación del ADN. En un breve periodo de tiempo tres marcas comerciales lanzaron al mercado casi de forma simultánea tres plataformas de secuenciación masiva; el pirosecuenciador 454 Life Sciences (Roche, Basilea, Suiza), el Solexa Genome Analyzer (Illumina Inc., San Diego, CA, EEUU) y el SOLiD (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EEUU). Cada una con sus ventajas e inconvenientes han rebajado los tiempos y sobretodo los costos de secuenciación por base pudiendo generar millones de lecturas de ADN a una escala sin precedente. Las diferentes técnicas de NGS comparten tres pasos básicos en común (Myllykangas et al., 2012); (i) preparación de librerías de ADN que básicamente consiste en la fragmentación del ADN con enzimas de restricción y la adicción de secuencias cortas conocidas (adaptadores) a los extremos de los fragmentos, (ii) inmovilización de los fragmentos de ADN a una superficie sólida por medio de los adaptadores, y (iii) secuenciación de los fragmentos inmovilizados mediante una amplificación previa de los mismos que permita obtener una señal detectable. La plataforma de secuenciación que se usó como paso previo a la realización de este TFG fue el pirosecuenciador 454 Life Sciences GS FLX. Un esquema de funcionamiento de esta plataforma se encuentra ilustrado en la figura 2. En esta plataforma la superficie sólida donde se ligan los fragmentos de ADN son cientos de miles de bolitas de 1 µm de diámetro (beads) y el proceso de amplificación de ADN se lleva a cabo en una emulsión (emPCR). Cada bead se encuentra en un pocillo microscópico de una placa denominada Picotiter con millones de pocillos. Los diferentes nucleótidos se van añadiendo de forma secuencial y cuando se incorpora alguno a la cadena de ADN que se está sintetizando en cada pocillo se libera una molécula de pirofosfato que alimenta una serie de reacciones que culminan en la emisión de luz por acción de la enzima luciferasa. Esta señal luminosa queda registrada por un sensor CCD. 8 Figura 2. Esquema de funcionamiento de la plataforma 454. La construcción de la librería liga adaptadores específicos a los fragmentos de ADN. Los fragmentos se ligan a las beads en una emulsión donde se realiza una PCR para la amplificación de los fragmentos previa a la secuenciación. El panel inferior ilustra la reacción de pirosecuenciación que ocurre tras la incorporación de un nucleótido para reportar la secuencia de síntesis del ADN (tomado de Mardis, 2008). ANTECEDENTES: Como paso previo a la realización de este TFG se disponía de los resultados brutos de una carrera de secuenciación realizada en un pirosecuenciador 454 GS FLX situado en el servicio de Biología Molecular del Centro de Investigación Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS). Para ello se extrajo ADN de un individuo de la especie Phlomis lychnitis (≈ 5 µg) con el que se construyó una librería siguiendo las pautas del fabricante para su secuenciación en un cuarto de placa Picotiter. Como resultado de la carrera se obtuvieron 91704 lecturas de ADN que se sometieron al análisis bioinformático con la plataforma QDD 2.1 (Meglecz et al., 2010). Este software busca secuencias que contengan regiones con microsatélites y diseña los primers necesarios para su posterior amplificación. Al final del proceso, esquematizado en la figura 3, se obtuvieron 38 secuencias con microsatélites que fueron apropiadas para el diseño de primers y que fueron las seleccionadas para probar su amplificación y variabilidad. 15 Los productos amplificados y marcados con fluorescencia se analizaron en un secuenciador automático ABI 3730 DNA Analyzer (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EEUU) en la Unidad de Genómica (Universidad Complutense, Madrid). El análisis y puntuación de los fragmentos amplificados se realizó con el software Peak Scanner Software v1.0 (PE Applied Biosystems). Con este programa se visualizan los fragmentos amplificados de ADN separados en función del fluoróforo y de su tamaño, permitiendo así calcular con precisión el tamaño en pares de base de los fragmentos amplificados. Una vez puntuados los fragmentos se calcularon parámetros básicos de diversidad genética para cada especie con Genalex v.6.5 (Peakall y Smouse, 2012) incluyendo para cada marcador o locus el número de alelos (Na), número de alelos efectivos (Ne), heterocigosidad esperada (He), heterocigosidad observada (Ho) e índice de fijación (F). El número efectivo de alelos se calculó como y proporciona información acerca de la frecuencia de los diferentes alelos en la población. Para la heterocigosidad esperada se utilizó el estimador no sesgado, donde n es el tamaño de muestra, y pi es la frecuencia del alelo i en la población. Por su parte, el índice de fijación se calcula como y proporciona información sobre los apareamientos en una población; valores cercanos a cero indican reproducción aleatoria, valores positivos son indicativos de la existencia de endogamia (inbreeding) en la población y valores negativos indican un exceso de heterocigotos debido a una reproducción no aleatoria dirigida (negative assortative mating) o a la existencia de hibridación (Hartl, 2000). Para probar la capacidad diagnóstica de los marcadores resueltos se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) para ordenar los genotipos multilocus de cada individuo en un espacio multidimensional. Este análisis se realizó también en Genalex v6.5. 16 RESULTADOS Y DISCUSIÓN: RESULTADOS DE LA EXTRACCIÓN Y AMPLIFICACIÓN DE ADN: La concentración medida de ADN en las extracciones fue muy elevada en las muestras seleccionadas (> 100 ng/µl), por lo que no se plantearon problemas derivados de un escaso rendimiento en la extracción. De los 38 marcadores de microsatélites disponibles que se probaron se obtuvo un producto amplificado mediante PCR en 24 de ellos (63%) (Figura 8). El análisis de los fragmentos amplificados y marcados con fluorescencia de estos 24 microsatélites revelaron los siguientes resultados; dos de ellos produjeron patrones poco claros difícilmente interpretables, 12 produjeron un único producto amplificado homogéneo en todas las muestras analizadas (i.e. presentaban un único alelo en la población por lo que no mostraron variabilidad y fueron considerados monomórficos), 10 loci presentaron patrones de amplificación claros y variables (i.e. mostraron diferentes alelos en las poblaciones y se consideraron polimórficos). Las características de los 22 marcadores monomórficos y polimórficos se recogen en la Tabla 1. Figura 8. Amplificación de ADN en gel de agarosa al 1,5% del marcador Phlomis 11. La primera calle corresponde al marcador de peso molecular (100 bp), las calles 2 a 5 se corresponden con cuatro individuos de Ph. lychnitis y las calles 6 a 9 se corresponden con cuatro individuos de Ph. crinita subsp. malacitana. 17 Tabla 1. Características de los 22 marcadores de microsatélites desarrollados para especies del género Phlomis. Nombre del Locus Secuencia del Primer (5´-3´) Motivo de repetición Tª de anillamiento Fluoróforo primer M13* Phlomis 1 F: AAACTCCACAGCCAATTCCC R: AGGGCCCATATGTTTACGCT (CT)5 65 FAM Phlomis 2 F: CAAATGAGTGGCCTGTCCTC R: GCATAAAGGAATAAAGAAAGGAAA (TTTTC)5 55 NED Phlomis 3 F: TTCCAACATCCAAAGCACAA R: GGATTGAAGCATTATTGAAGCTC (AG)5 65 VIC Phlomis 4 F: AAACCAATATCCACAAGTAATGC R: CACCAATGCATGTGAGCATC (AC)5 65 FAM Phlomis 5 F: TTCCTAAATTATGGGTGTCCC R: ACGTGACGTCGGACTGAAAC (CT)5 65 NED Phlomis 6 F: CGCCATTGACTTGTTACCGT R: TGCTTCTATGGGTTCGATAACT (TA)5 65 VIC Phlomis 7 F: GAATGTCCCTGCTCCTACCC R: CCCATCCGACATAGGACAAA (TC)5 65 PET Phlomis 8 F: CTTGAACCACCTTGGCCTTT R: TCTTACCAATAGCTTCCTTGTAGCA (AC)5 65 FAM Phlomis 9 F: CCTCGAAATTGTTTGCTTGG R: CGTGGCATAGCACCTCTACC (CT)5 65 NED Phlomis 10 F: CCTATCGATACCGTGCTTGC R: AAACAAAGAAAGAAAGATCAAATCAAA (CT)5 55 VIC Phlomis 11 F: TTCCACGACATCGTCTTCCT R: AAAGACTGGTCCCGTCACAA (TCA)5 65 PET Phlomis 12 F: CAGTGAGATGTGTTTGCCCA R: AGTGGGAGTAAGGGACCTGG (TTC)5 65 FAM Phlomis 13 F: TGTTGCACTGTGGAATCACC R: GTTCGTGAATCTCCGTCAGG (TTC)5 60 NED Phlomis 14 F: TGTCAAGGTGCACTGACCAA R: AGAAGGCACTCCAAACCACA (CTT)5 65 VIC Phlomis 15 F: ACCGTTCAATCGTCACGTCT R: CCATTCAAGCACCTCCAAAG (TC)6 62 PET Phlomis 16 F: AATTCAAATTGAGAGCCCGC R: TGCTTCTTGCTTGAATCTGC (AC)5 65 FAM Phlomis 17 F: TGAGTCGAGAATCAGAACCACA R: AGCCTCTCCCGTGGATGTAG (AC)5 65 NED Phlomis 18 F: TAGGCGTGCGGTGTTAAACT R: AGTGGTCGTCCAAGCACAGT (TC)5 62 VIC Phlomis 19 F: GAAGCCTCAACAGCAGGAGA R: ACGATCCTACATCATTCCGC (AT)5 65 PET Phlomis 20 F: TTCGAGAAGAGACGAACCAGA R: TGGTTTGCCACTTAGCAAGAA (AG)5 62 FAM Phlomis 21 F: CTTCACCTGAACTCCAAAGTCA R: AAAGTGTGACTTCTTATGACCAAA (ATT)6 60 NED Phlomis 22 F: ATCAAAAATTTCGGCACGAT R: GCTGGGTTAGGTCGGATTTT (TA)12 60 VIC 18 A modo ilustrativo en la figura 9 se muestra la resolución del secuenciador de un marcador monomórfico (Phlomis 3) en cuatro individuos, dos de la especie Ph. lychnitis y dos de Ph. crinita subsp. malacitana. Figura 9. Captura del software Peak Scanner mostrando el microsatélites Phlomis 3. Los dos paneles de la izquierda se corresponden con muestras de Phlomis lychnitis y los dos paneles de la derecha con Phlomis crinita subsp. malacitana. En este ejemplo todas las muestras amplificaron un único producto de 172 bp. Los 10 marcadores polimórficos (aquellos con más de un alelo en la población) fueron los correspondientes a Phlomis 1, Phlomis 2, Phlomis 5, Phlomis 6, Phlomis 9, Phlomis 13, Phlomis 15, Phlomis 17, Phlomis 21 y Phlomis 22. Hay que destacar que dos de estos marcadores (Phlomis 1 y Phlomis 15) no mostraron variabilidad en la población de Ph. crinita subsp. malacitana. En la figura 10 se muestra la salida del secuenciador para el marcador Phlomis 9 que presenta varios alelos en las dos especies de Phlomis estudiadas. 19 Figura 10. Captura del software Peak Scanner mostrando el microsatélite Phlomis 9. Los cuatro paneles de la derecha se corresponden con muestras de Phlomis lychnitis y los cuatro paneles de la izquierda con Phlomis crinita subsp. malacitana. En este ejemplo se muestran cinco alelos diferentes del locus (177-179-181-183-185 bp). Estos marcadores permitieron calcular parámetros básicos de diversidad genética para cada especie con Genalex v.6.5. Estos valores re encuentran reflejados en la tabla 2. 20 Tabla 2. Valores de diversidad genética para las poblaciones de Phlomis lychnitis y Phlomis crinita subsp. malacitana usando el conjunto de marcadores de microsatélites polimórficos. Nombre del Locus Na Ne Tamaño de los alelos (bp) He Ho F Phlomis lychnitis Phlomis 1 2 1,923 174-176 0,492 0,800 -0,667 Phlomis 2 2 1,882 222-227 0,481 0,750 -0,600 Phlomis 5 2 1,536 150-152 0,358 0,450 -0,290 Phlomis 6 2 1,995 140-142 0,512 0,950 -0,905 Phlomis 9 6 3,137 177-187 0,699 0,450 0,339 Phlomis 13 3 1,946 229-256 0,499 0,650 -0,337 Phlomis 15 4 2,623 192-242 0,635 0,650 -0,051 Phlomis 17 2 1,600 235-238 0,385 0,500 -0,333 Phlomis 21 2 1,980 426-429 0,508 0,700 -0,414 Phlomis 22 2 1,819 199-201 0,462 0,684 -0,520 Media + SD 2,70+1,34 2,044+0,482 0,503+0,102 0,658+0,159 -0,378+ 0,344 Phlomis crinita subsp. malacitana Phlomis 2 2 1,105 222-227 0,097 0,100 -0,053 Phlomis 5 2 1,406 150-152 0,296 0,350 -0,212 Phlomis 6 2 2,000 140-142 0,513 1,000 -1,000 Phlomis 9 4 1,957 177-187 0,502 0,211 0,569 Phlomis 13 2 1,205 229-256 0,175 0,188 -0,103 Phlomis 17 2 1,430 235-238 0,309 0,368 -0,226 Phlomis 21 2 1,724 426-429 0,431 0,600 -0,429 Phlomis 22 2 1,051 199-201 0,050 0,050 -0,026 Media + SD 2,25+0,71 1,485+0,371 0,297+0,178 0,358+0,312 -0,185+ 0,438 Los resultados obtenidos de diversidad genética muestran que la mayoría de los marcadores utilizados no son extremadamente variables, ya que la mayoría de los locus resueltos presentaron solo dos alelos. Estos valores son bajos si se comparan con datos obtenidos en otros estudios en los que se emplearon marcadores de microsatélites. Por ejemplo, en una compilación de estudios de microsatélites en plantas (Nybom, 2004) el número medio de alelos por locus reportado por estudio fue de 9.9 alelos/locus, bastante superior a los 2,7 alelos/locus mostrados aquí para Ph. lychnitis y los 2,25 para Ph. crinita subsp. malacitana. Los valores de diversidad genética en general fueron mayores en Ph. lychnitis que en Ph. crinita subsp. malacitana de acuerdo con las expectativas de que especies con distribuciones más restringidas presentan por lo general valores más reducidos de diversidad (p.e. Gitzandanner y Soltis, 2000). No obstante, para corroborar este resultado sería necesario un estudio que ampliara de manera significativa el número de poblaciones de cada especie. 21 Así mismo, es importante resaltar el valor del índice de fijación (F) obtenido. Este dato proporciona información sobre los apareamientos entre individuos en una población. Tal y como se ha comentado anteriormente, valores negativos como los reportados en este estudio, indican un exceso de heterocigosidad debido a una reproducción no aleatoria dirigida (negative assortative mating) o a la existencia de procesos de hibridación e introgresión entre especies ya que la mezcla de pool genéticos diferentes aumentan mucho la heterocigosidad observada. En este caso, los valores negativos se deben a la hibridación frecuente entre Ph. lychnitis y Ph. crinita subsp. malacitana ya que los valores negativos concuerdan con los valores negativos obtenidos anteriormente para este complejo de especies mediante el uso de otros marcadores moleculares (Albaladejo & Aparicio, 2007). Sin embargo, a pesar de que los marcadores empleados no son excepcionalmente variables, han mostrado un gran poder para discriminar genéticamente entre las especies. El análisis de coordenadas principales (PCoA) permitió diferenciar los individuos de las dos especies claramente en un espacio multidimensional (Figura 11). Figura 11. Análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en 10 marcadores polimórficos para Ph. lychnitis y Ph. crinita subsp. malacitana. Coord. 2 Coord. 1 Ph. lychnitis Ph. crinita subsp. malacitana 22 Con los resultados de este análisis se puede afirmar que el conjunto de marcadores desarrollados serán de utilidad para futuros estudios sobre los patrones de hibridación entre estas especies. 23 CONCLUSIONES: En este trabajo se han desarrollado un conjunto de marcadores genéticos que permiten la amplificación de microsatélites específicos para las especies Ph. lychnitis y Ph. crinita subsp. malacitana a partir de técnicas de secuenciación masiva a un coste económico inferior a los métodos tradicionales. Estos marcadores han permitido estudiar la variabilidad genética existente en dos poblaciones de estas especies y servirán para el estudio de sus patrones de hibridación. Otra potencial utilidad de estos marcadores muy interesante sería probar la transferencia de estos marcadores a otras especies del género. Este conjunto de microsatélites es el primero desarrollado para el género. El género Phlomis es muy rico en especies endémicas interesantes desde el punto de vista de la genética de la conservación. Disponer de herramientas moleculares útiles es fundamental para asegurar la conservación de las especies, mantener la variabilidad genética de las especies y así garantizar su capacidad de adaptación a un medio cambiante. 24 BIBLIOGRAFÍA: Albaladejo RG, Aparicio A, Silvestre S. Variation patterns in the Phlomis x composita (Lamiaceae) hybrid complex in the Iberian Peninsula. Bot J Linn. Soc. 2004; 145(1): 97–108. Albaladejo RG, Aparicio A. 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