Epidemiología de la colonización por pneumocystis en población general

Página 1 de 210 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Medicina EPIDEMIOLOGÍA DE LA COLONIZACIÓN POR PNEUMOCYSTIS EN POBLACIÓN GENERAL Memoria presentada por Rosa María Yang Lai para optar al grado de Doctor en Medicina y Cirugía Sevilla, junio de 2013 Página 3 de 210 Página 5 de 210 谨以此献给我敬爱的父母 杨 洋 A mis padres, con cariño Junio de 2013 Página 6 de 210 Este trabajo ha sido financiado por ERA-NET Pneumocystis pathoGenoMics y la Consejería de Salud de la Junta de Andalucía (PI 70/04 y PI 0391/07). AGRADECIMIENTOS Agradezco a mis directores y tutor de tesis sus consejos y dirección, sin cuyo apoyo y entusiasmo no habría sido posible la realización de este trabajo. Agradezco a los miembros integrantes del grupo de epidemiología clínica y molecular, CIBER de Epidemiología y Salud Pública, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), su inestimable ayuda durante todo el proceso de elaboración de la memoria. Agradezco a los miembros del centro de salud de El Coronil y a su director, Alfonso Medrano, por su apoyo e inestimable colaboración. Agradezco a la población de El Coronil por su participación. Gracias a Gao Lin por sus consejos. Página 7 de 210 EPIDEMIOLOGÍA DE LA COLONIZACIÓN POR PNEUMOCYSTIS EN POBLACIÓN GENERAL ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 9 1.1 Perspectiva histórica………………………………………………………………………. 11 1.2 Taxonomía…………………………………………………………………………………….. 17 1.3 Biología 1.3.1 Organismo…………………………………………………………………………….. 19 1.3.2 Microbiología………………………………………………………………………… 19 1.3.3 Genética………………………………………………………………………………… 21 1.4 Ciclo de vida………………………………………………………………………………….. 25 1.5 Métodos de diagnóstico………………………………………………………………….. 28 1.6 Clínica y tratamiento de la neumonía por Pneumocystis……………………. 36 1.7 Epidemiología 41 1.7.1 Reservorio…………………………………………………………………………….. 41 1.7.2 Mecanismos de transmisión……………………………………………………. 42 1.7.3 Epidemiología de la neumonía por Pneumocystis……………………… 50 1.7.4 Colonización por Pneumocystis………………………………………………. 54 2. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 71 3. MATERIAL Y MÉTODOS 77 3.1. Ámbito y población de estudio…………………………………………………………….. 79 3.2. Diseño 82 3.2.1. Cálculo del tamaño muestral…………………………………………………… 82 3.2.2. Intervención………………………………………………………………………….. 85 3.2.3. Seguimiento………………………………………………………………………….. 87 3.3. Variables de estudio.………………………………………………………………………. 89 3.4. Procesamiento y análisis de las muestras 3.4.1. Obtención de muestras de lavado orofaríngeo y procesamiento inicial………………………………………………………………………………………………………….. 92 3.4.2. Técnicas de laboratorio…………………………………………………………… 92 3.5. Detección de Pneumocystis jirovecii mediante PCR anidada 93 3.6. Detección del gen DHPS mediante touchdown PCR………………………….. 94 3.7. Caracterización genotípica de P. jirovecii 95 3.7.1. Secuenciación directa del gen mtLSU rRNA……………………………… 95 3.7.2. RFLP del gen DHPS……………………………………………………………….. 97 Página 8 de 210 3.8. Algoritmo diagnóstico y criterios de interpretación de los resultados….. 99 3.9. Controles de calidad………………………………………………………………………. 101 3.10. Detección de P. jirovecii mediante PCR a tiempo real………………………… 102 3.11. Variables biológicas………………………………………………………………………… 103 3.12. Recogida y análisis de datos…………………………………………………………… 103 3.13. Aspectos éticos………………………………………………………………………………. 105 4. RESULTADOS 107 4.1. Sujetos de estudio 109 4.1.1. Sujetos incluidos……………………………………………………………………… 109 4.1.2. Sujetos no incluidos…………………………………………………………………. 112 4.2. Prevalencia de colonización por Pneumocystis en la población general….. 113 4.3. Relación entre colonización por P. jirovecii y variables sociodemográficas, clínicas y biológicas…………………………………………………………. 119 4.4. Distribución de genotipos del patógeno y prevalencia de sujetos colonizados con mutaciones asociadas a la resistencia al cotrimoxazol……………… 132 5. DISCUSIÓN 135 5.1. Limitaciones………………………………………………………………………………………. 139 5.2. Prevalencia de colonización………………………………………………………………… 145 5.3. Factores asociados a la colonización…………………………………………………….. 151 5.4. Distribución de genotipos…………………………………………………………………… 155 5.5. Perspectivas futuras…………………………………………………………………………… 167 6. CONCLUSIONES 169 7. BIBLIOGRAFÍA 173 8. ANEXOS 199 Página 9 de 210 Epidemiología de la colonización por Pneumocystis en población general 1. INTRODUCCIÓN Página 16 de 210 inmunodepresión. Envió una carta a sus superiores alertándolos de estos hechos, que constituían la primera evidencia de la eclosión de la epidemia de SIDA (Calderon et al., 2002). Se descubría de esa manera los primeros casos de SIDA gracias a la infección de pacientes por patógeno oportunista. Desde ese momento y hasta la actualidad se reconoce a Pneumocystis como uno de los principales patógenos oportunistas que afectan tanto a pacientes infectados por el VIH como a sujetos que presentan cualquier otra causa de inmunosupresión. Página 17 de 210 1.2. Taxonomía La clasificación taxonómica de Pneumocystis ha sido problemática desde su descubrimiento y ha cambiado a largo de los años. Como hemos comentado, tras su identificación y durante muchos años Pneumocystis fue considerado un protozoo, debido a sus características morfológicas, su resistencia a los antifúngicos clásicos y su respuesta al tratamiento con pentamidina. Sin embargo, en 1970, Vavra y Kucera sugieren, basados en sus estudios ultraestructurales, que Pneumocystis puede ser un hongo (Vavra & Kucera, 1970), planteando un prolongado debate sobre la naturaleza de este microorganismo que se vería esclarecido con el advenimiento de las técnicas de biología molecular. La primera evidencia molecular de que este microorganismo es un hongo fue aportada por Edman y colaboradores. Estos investigadores encontraron que la secuencia nucleotídica del gen 16S del ARN ribosómico de Pneumocystis presentaba mayor similitud al de los hongos que al de los protozoos (Edman et al., 1988). Estos mismos resultados fueron corroborados por Stringer y sus colegas un año más tarde (Stringer et al., 1989). Además, otros genes importantes como la subunidad mayor del ARN del ribosoma mitocondrial (mt LSU rRNA, siglas en inglés) y otros siete genes contiguos mitocondriales mostraron una significativa homología con sus respectivos genes en los hongos. Otras evidencias importantes fueron identificadas, entre otras, se destaca la presencia en Pneumocystis de un tercer factor de elongación en la síntesis proteica, elemento necesario para realizar este proceso en los hongos, que se encuentra ausente en el resto de los organismos eucariotas. Finalmente, la timidilato sintasa y la dihidrofolato reductasa (DHFR) en Página 18 de 210 Pneumocystis son dos enzimas diferentes, mientras en los protozoos es una proteína individual con doble función (Stringer, 1996). Las técnicas moleculares también evidenciaron que existía una gran heterogeneidad genética en Pneumocystis, heterogeneidad que está clara y estrictamente correlacionada con la especie del huésped (Dei-Cas et al., 1998). Para reflejar estas diferencias se propuso en 1994 de forma provisional, mientras se describían o redescribían cada una de las especies del género Pneumocystis, un sistema trinomial que utilizaba la denominación Pneumocystis carinii en todos los casos seguida de “forma specialis” (f. sp.). En este sistema, el microorganismo que infecta a los humanos correspondía a Pneumocystis carinii f. sp. hominis, mientras que Pneumocystis carinii f. sp. carinii es una de las especies que infecta a las ratas y Pneumocystis carinii f. sp. murine la que infecta al ratón (Stringer et al, 2002). Sin embargo, ya en 1976 Frenkel había propuesto el nombre de Pneumocystis jiroveci para designar al patógeno que afecta al hombre. En aquel momento el organismo fue clasificado como protozoo y el nombre se encontraba en concordancia con la Nomenclatura Internacional de Códigos Zoológicos. Sin embargo, al demostrarse que Pneumocystis pertenecía al reino de los hongos, su nombre debía corresponder con la Nomenclatura Internacional de Códigos Botánicos (ICBN, International Code of Botanical Nomenclature), lo que condicionó que el nombre anterior se cambiara por el de Pneumocystis jirovecii (ICBN artículos 32.7 y 60.11), que es la denominación actualmente aceptada. La ubicación taxonómica actual de Pneumocystis jirovecii es en el Reino: Fungi, Phylum: Ascomycota, Clase: Pneumocystidomycetes, Orden: Pneumocystidales y Familia: Pneumocystidacae (Redhead et al., 2006). Página 19 de 210 1.3. Biología 1.3.1. Organismo Pneumocystis jirovecii es un hongo atípico, extracelular, ubicuo, unicelular, no cultivable y con marcado estenoxenismo. Habitualmente se encuentra confinado en los pulmones, aunque se ha demostrado su presencia en otras regiones del cuerpo. En la actualidad se han registrado casos de PcP en todos los continentes del mundo, excepto en la Antártica (Kovacs & Masur, 2009). 1.3.2. Microbiología El principal obstáculo en el conocimiento de la biología de Pneumocystis radica en la incapacidad para conseguir su crecimiento continuo en medios de cultivo in vitro (James et al., 2002). En 1979, Bartlett et al. consiguieron mantener el microorganismo durante un breve período de tiempo en una línea celular de mamíferos cocultivada (Bartlett et al., 1979) y en 1990, Cushion et al. en un medio axénico de cultivo (Cushion et al., 1990). Posteriormente, utilizando otra vez líneas celulares de mamíferos cocultivadas, se logró mantener la infectividad en animales experimentales durante 42 días, aunque el número de microorganismos disminuía a los diez días de cultivo (Mirovsky & Fishman, 1993). Finalmente, Merali et al. comunicaron el hallazgo de un método de cultivo continuo de Pneumocystis carinii en medio axénico (Meralli et al., 1999). Sin embargo, este método no ha podido ser reproducido en otros laboratorios, quedando el cultivo de P. jirovecii como un reto aún pendiente de ser alcanzado (Calderón et al., 2011). Página 20 de 210 Un aspecto esencial que ha ayudado a esclarecer algunas cuestiones sobre la biología de Pneumocystis ha sido el desarrollo de modelos animales de neumocistosis en varias especies de mamíferos. Estos modelos son de suma importancia para estudios bioquímicos, evaluaciones de fármacos y para la visualización microscópica del ciclo de vida del patógeno (Dei-Cas et al., 1998). La carencia de ergosterol en la membrana es otra característica fenotípica de interés en Pneumocystis que lo diferencia del resto de los hongos. Este lípido es el principal esterol en la membrana de los hongos. En cambio, Pneumocystis presenta colesterol, encontrado fundamentalmente en las membranas de los mamíferos. La ausencia de ergosterol explica su resistencia natural a la anfotericina B, antifúngico cuyo mecanismo de acción está íntimamente relacionado con dicho lípido (James et al., 2002, Wakefield et al., 1998). En cuanto a la proteómica de Pneumocystis, la glicoproteína mayor de superficie o MSG (Major Surface Glycoprotein) es la proteína más abundante y representativa del microorganismo. Se estima que constituye las tres cuartas partes de sus proteínas totales y fue la primera proteína aislada y caracterizada de este hongo. Posee un peso molecular de 120 kDa, con un porcentaje de carbohidratos entre el 5-10%, siendo la manosa el principal componente de sus hidratos de carbono (Kaneshiro, 1994). La MSG desempeña un importante papel biológico al presentar una gran variabilidad antigénica que, probablemente, permite al patógeno evadir la respuesta inmune del huésped. Otro aspecto interesante es su relevancia en el desarrollo de técnicas diagnósticas, habiéndose obtenido antígenos recombinantes de la misma que se han utilizado para estudios seroepidemiológicos y para evaluar la respuesta serológica durante la historia natural de la infección por Pneumocystis (Nkinin et al., 2009). Otras importantes proteínas importantes en el Página 21 de 210 patógeno son PCSTE20 y PCMAPK. Se ha demostrado que estas moléculas participan en los cambios morfológicos, ciclo sexual y en la unión del hongo a las células del epitelio alveolar (Kottom et al., 2003). Asimismo, las proteínas PRT1 desempeñan también una importante función biológica relacionada con la degradación de proteínas exógenas y con los procesos de variación antigénica del microorganismo (Ambrose et al., 2004). La proteína de choque térmico 70 (hsp 70) es otra de las más abundantes en Pneumocystis. Esta proteína está involucrada en procesos relacionados con el estrés, teniendo un papel esencial en el metabolismo del hongo (Cushion et al., 2007). Respecto a la genómica, habría que destacar por su implicación clínica el gen de la dihidropteroato sintetasa (DHPS). Su importancia radica en su asociación con la resistencia a las sulfamidas, fármacos de elección en el tratamiento y profilaxis de esta infección. Por otra parte, la identificación de mutaciones presentes en el gen que controla la síntesis de esta enzima resulta muy útil para estudios de epidemiología molecular de Pneumocystis (Stein et al., 2004; Friaza et al., 2010). 1.3.3. Genética El conocimiento del genoma de Pneumocystis puede esclarecer aún muchas cuestiones oscuras relacionadas con la biología de este patógeno. Sin embargo, la ausencia de crecimiento in vitro del microorganismo ha limitado considerablemente los estudios relacionados con su polimorfismo genético. Técnicas moleculares relativamente sencillas de llevar a cabo, como la amplificación al azar del ADN polimórfico (RAPD, siglas en inglés), no han podido emplearse debido a la ausencia de cultivo continuo del microorganismo y a la mezcla del ADN Página 22 de 210 del huésped que se produce cuando se utilizan modelos animales para la obtención del patógeno (Wakefield, 1998). A pesar de estas dificultades, con otras técnicas como la electroforesis de campo pulsado (PFGE, siglas en inglés) se ha obtenido información importante sobre el hongo. Con esta metodología, se logró dilucidar que Pneumocystis tiene aproximadamente 15 cromosomas lineales con un tamaño aproximado entre los 300 Kb - 700 Kb. Se estima además, que el genoma total del microorganismo tiene aproximadamente 7,7 Mb, con una composición nucleotídica rica en contenido de A/T (60-65%), así como que las regiones codificadoras del material genético contienen uno o más intrones de tamaño corto, aproximadamente 50 pb. Las regiones terminales de los cromosomas son de especial interés ya que contienen los genes que codifican antígenos de superficie del organismo (Wakefield, 2002). Para estimar la dimensión del genoma lineal de Pneumocystis, una simple comparación de materiales genéticos de diferentes organismos mostró que se ubica entre el genoma de E. coli (4.2 Mb) y el de Saccharomyces cerevisiae (12 Mb). La comparación de genomas resulta del máximo interés para estudiar posibles asociaciones entre el contenido de genes y la forma de vida de los microorganismos considerados. Específicamente, en el caso de Pneumocystis, es importante su dependencia del huésped para realizar muchas funciones vitales. Al parecer, la esencia de la cuestión, radica en que una parte sustancial del genoma de Pneumocystis no codifica ninguna proteína, ocupando un espacio importante (10%): los espacios intergénicos (Stringer, 1998). Estimaciones realizadas sugieren que alrededor de 6 Mb del genoma de Pneumocystis pueden codificar algún tipo de proteínas. Si se considera que el Página 23 de 210 promedio de las proteínas del patógeno está alrededor de los 50 Kda, este genoma pudiera codificar unas 4000 moléculas proteicas, un número similar al comunicado para E. coli cuyo material genético es sustancialmente menor (Stringer & Cushion, 1998). Se han depositado muchas esperanzas en los proyectos de secuenciación del genoma de P. carinii (http://pgp.cchmc.org) y de P. jirovecii (Cissé, 2012; Porollo et al, 2012), pues ayudarán a esclarecer cuestiones muy importantes sobre la biología de estos microorganismos. Página 25 de 210 1.4. Ciclo de Vida El ciclo de vida propuesto en la actualidad (figura 1), basado en los datos obtenidos en pulmones de animales infectados, propone la existencia de una fase sexual y otra asexual que se alternan y en la que participan formas de vida morfológicamente bien diferenciadas: trofozoitos, esporocitos y quistes (Yoshida, 1989; Dei-Cas et al., 2004; de Souza & Benchimol, 2005; Thomas & Limper, 2007; Aliouat-Denis et al., 2009). Las formas tróficas o trofozoitos se corresponden con las formas vegetativas de otros hongos y son células de 2-8 µm de diámetro, mononucleares y haploides. Estas células, de forma ameboidea, poseen una pared celular delgada y electrón densa de 20-25 µm que se deforma permitiendo la emisión de proyecciones citoplasmáticas o filopodios (su número varía en función de la especie), utilizadas para adherirse a los neumocitos tipo I del pulmón del hospedador. La pared celular es flexible, frágil y rica en β-1,3-glucanos y glicoproteínas, componentes que permiten a Pneumocystis interaccionar con las células de huésped (Dei-Cas et al., 2004; de Souza & Benchimol, 2005; Thomas & Limper, 2007; Aliouat-Denis et al., 2009). De las formas de vida halladas en los pulmones de pacientes infectados o en animales de laboratorio inmunosuprimidos, los trofozoitos son los mayoritarios, comprendiendo un 90-95% de la población total, y apareciendo agregados en paquetes con aspecto de nubes. Esta imagen sugiere a los investigadores la posibilidad de que los trofozoitos puedan seguir una reproducción asexual basada en la fisión binaria, previa división mitótica del material genético, resultando dos Página 32 de 210 examen directo en fresco. Sin embargo, tiene falsos positivos con fibras vegetales, colágeno o elastina (Monheit et al., 1986). Procop y colaboradores compararon cuatro métodos de tinción para detectar P. jirovecii en muestras respiratorios, mostrando que el blanco de calcoflúor y la plata metenamina tenían valores predictivos positivos y negativos mayores del 90%; estos parámetros son suficientes para justificar su uso como métodos de rutina en los laboratorios clínicos (Procop et al., 2004). Inmunoflorescencia directa (ID) Esta técnica utiliza anticuerpos monoclonales específicos contra determinantes antigénicos de la pared de los quistes y trofozoitos de P. jirovecii. Tiene una sensibilidad cercana al 100% y una especificidad de alrededor del 96%. Los anticuerpos monoclonales tienen mayor sensibilidad y especificidad en las muestras de esputo inducido que las técnicas de tinción convencionales, pero esta diferencia es mucho menor cuando se emplean muestras de LBA (Cregan et al., 1990). Halford et al., compararon la técnica de inmunofluorescencia directa (ID) con la tinción de plata metenamina en 384 muestras de esputo encontrando P. jirovecii en 31 de las muestras analizadas por la primera técnica y sólo 24 en las analizadas por la segunda (Halford et al., 1994). Hay que señalar que la técnica de ID es más cara y consume más tiempo que las técnicas de tinción convencionales. Además, pueden existir reacciones cruzadas de antígenos de Pneumocystis con antígenos de Aspergillus sp. En este sentido, publicaciones recientes constatan un alto porcentaje de falsos positivos con esta Página 33 de 210 metodología (Procop et al., 2004). Por otra parte, resulta prudente revisar, sobre todo en regiones donde Paracoccidioides brasiliensis es endémica, un resultado positivo para P. jirovecii por ID, pues se han encontrado casos de reacciones cruzadas (Silletti et al., 1996). De especial interés resulta el hecho de la detección de quistes vacíos por ID, los cuales pueden persistir en el tejido pulmonar por espacio de cuatro a seis semanas después de un tratamiento efectivo (Armbruster et al., 1995). Finalmente, la ID ha sido utilizada en la detección de P. jirovecii en personas inmunocompetentes con infecciones pulmonares crónicas, pero resulta menos sensible que las técnicas moleculares en este tipo de pacientes (Medrano et al., 2005; Vidal et al., 2006). Métodos moleculares basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La poca sensibilidad de las técnicas de tinción en muestras obtenidas de forma no invasiva y su menor sensibilidad en situaciones con poca carga parasitaria, así como el elevado coste de la inmunofluorescencia directa han obligado a desarrollar nuevas alternativas para el diagnóstico de P. jirovecii (Roberts et al., 2007). Los métodos moleculares basados en la PCR, son una opción fiable y eficaz para los laboratorios con acceso a estas técnicas. Diferentes estudios publicados demuestran que la PCR es más sensible y específica que los métodos de tinción (Tuncer et al., 1998; Pinlaor et al., 2004; Rohner et al., 2009). La primera evidencia del empleo de métodos moleculares para la detección de P jirovecii en muestras clínicas fue aportada por Walkefield et al. en 1990 (Wakefield et al., 1990). Desde entonces y hasta la actualidad 14 genes del patógeno se han utilizado con fines diagnósticos y para estudios de genotipaje (Ripamonti et Página 34 de 210 al., 2009). En el año 2007, Robberts y colaboradores evaluaron 9 métodos moleculares en diferentes muestras clínicas provenientes de pacientes sudafricanos (Roberts et al., 2007). En este estudio, la PCR anidada que emplea el gen mt LSU rRNA como diana, mostró la mayor sensibilidad para detectar P. jirovecii. Varios autores coinciden en señalar su elevada sensibilidad y especificidad y sugieren que el gen mt LSU rRNA puede emplearse como diana atractiva para fines diagnósticos, de epidemiología molecular y seguimiento de la terapia aplicada a los pacientes (Wakefield et al., 2003; Montes-Cano et al., 2004; de la Horra et al., 2006). Sin embargo, es conocido que los métodos que utilizan la PCR anidada brindan una proporción apreciable de resultados falsos positivos y están sujetos a un mayor riesgo de contaminación que métodos que emplean la PCR simple (Wakefield et al., 2003). Por otra parte, se han evaluado otros genes del patógeno, obteniéndose resultados interesantes. Por ejemplo, Miller y Wakefield observaron una asociación entre la gravedad de la PcP y el genotipo encontrado en los microorganismos aislados al estudiar la región transcripta de los espacios intergénicos del operón del ARNr (ITS, internal transcribed spacer) (Miller & Wakefield, 1999). También, se ha comunicado la ausencia de genotipos específicos de la región ITS (como el A2c1) en pacientes colonizados por P jirovecii (Totet et al., 2004b). Recientemente, Esteves y colaboradores demostraron que la presencia de citosina en la posición 85 del gen mt LSU rRNA se asociaba con una evolución favorable de la PcP (Esteves et al., 2010). Por otra parte, mutaciones en el gen que codifica para la DHPS pueden indicar posible resistencia a las sulfamidas. Resultados sumamente útiles si consideramos que las pruebas de susceptibilidad frente a fármacos no se encuentran disponibles para el patógeno por la carencia del cultivo microbiológico (Stein et al., 2004). Página 35 de 210 Otros estudios han evaluado la posibilidad de amplificar ADN del microorganismo en otras muestras clínicas obtenidas por métodos no invasivos para el paciente. Trabajados publicados, reflejan resultados aceptables para el diagnóstico de la infección por P. jirovecii al emplear muestras de esputo obtenidas tras expectoración espontánea, lavados orofaríngeos y exudados nasofaríngeos utilizando métodos basados en la PCR (Wakefield et al., 1993; Nevez et al., 2001; Aderaye et al., 2008). Investigadores franceses describen una sensibilidad del 100% y una especificidad del 90% utilizando la amplificación mediante PCR del gen mt LSU rRNA en muestras de lavados orofaríngeos (Durand-Joly et al., 2005). Recientemente la utilización de la PCR a tiempo real en muestras clínicas y tejidos facilita la obtención de un resultado más rápido, en menos de tres horas, reduciendo asimismo la posibilidad de contaminación en las muestras. Además, esta metodología posibilita cuantificar la carga del patógeno, lo que podría servir para identificar el estado de colonización en los pacientes con baja carga parasitaria (Flori et al., 2004). No obstante, hay que tener presente que un resultado positivo para P. jirovecii por PCR sólo indica presencia de ADN de dicho germen, no indicando infección, ni viabilidad del patógeno en la muestra analizada. Para resolver esta dificultad, se han descritos métodos basados en la amplificación del ARN mensajero del microorganismo con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 86% (de Oliveira et al., 2007). Página 36 de 210 1.6. Clínica y tratamiento de la neumonía por Pneumocystis Formas de presentación La PcP puede resultar difícil de identificar y un verdadero reto si se pretende su diagnóstico sólo atendiendo a la clínica del paciente, pues diferentes infecciones comparten signos y síntomas similares a esta enfermedad (Kovacs & Masur, 2009). Clásicamente se han diferenciado cuatro formas clínicas de infección por Pneumocystis atendiendo a la edad y a la enfermedad de base responsable de la inmunodepresión: asintomática, infantil o neumonía intersticial de células plasmáticas, neumonitis esporádica de niños y adultos inmunocomprometidos e infección extrapulmonar, a las que actualmente habría que añadir la PcP asociada al síndrome de reconstitución inmune (Dei-Cas et al., 2005; Calderon et al., 2010). Síntomas y signos Clásicamente la PcP se presenta con fiebre, tos y disnea de esfuerzo. La tos normalmente es seca y no productiva. La disnea al inicio es a esfuerzo moderado, por lo que puede pasar desapercibida y progresar gradualmente. La fatigabilidad es una de las principales quejas en los pacientes con PcP, mientas que el dolor torácico, los escalofríos y la sudoración nocturna son menos frecuentes. Aunque con menor frecuencia, también se ha descrito la presencia de hemoptisis en los pacientes aquejados por esta infección. Por otra parte, la exploración clínica puede mostrar taquicardia, cianosis y crepitantes finos en la auscultación de los afectados (Thomas & Limper, 2004; Huang et al., 2006). Página 37 de 210 La presentación clínica de la PcP difiere en sus características entre pacientes con infección VIH de aquellos inmucomprometidos por otras razones (Russian & Levine, 2001; Barry & Johnson, 2001). Globalmente los pacientes con infección VIH presentan un curso subagudo con síntomas más prolongados de la infección, que incluyen típicamente el establecimiento de tos seca y disnea con o sin fiebre de una a dos semanas de evolución. En el examen físico puede apreciarse taquipnea, taquicardia y ocasionalmente cianosis, pero la auscultación torácica generalmente es normal, presentándose en ocasiones algunos sibilantes. La presencia de hipoxemia desencadenada con el ejercicio es otro elemento presente en este tipo de sujetos. Hasta un 27% de los pacientes con infección VIH que desarrollan PcP pueden presentar una insuficiencia respiratoria que requiera ventilación mecánica (Huang, 2005). En cambio, en pacientes sin infección VIH, la enfermedad tiene un comienzo más rápido con menor duración y mayor gravedad, caracterizada frecuentemente por una marcada hipoxemia (Rodríguez & Fishman, 2004). Un ejemplo interesante lo constituyen los pacientes trasplantados, en los cuales la infección se presenta a menudo con un cuadro clínico fulminante consistente en fiebre, tos, disnea e insuficiencia respiratoria. En la población de pacientes con trasplante pulmonar los síntomas pueden estar ausentes debido a la denervación del pulmón trasplantado. Diferentes estudios han señalado que en pacientes con inmunodepresión secundaria al tratamiento de enfermedades neoplásicas o trasplantes, la PcP tiene una presentación subaguda, de más de 24 horas y menos de una semana, aunque en trasplantados de órganos sólidos la PcP puede ocurrir también con un curso crónico (Collin & Ramphal, 1998; Sepkowitz, 2002). Página 38 de 210 Radiografía de tórax La radiografía (Rx) de tórax es muy útil ante la sospecha de una PcP en un paciente con infección por VIH cuando muestra el patrón típico de infiltrado pulmonar intersticial difuso bilateral (Vidal et al., 2006). Sin embargo, las imágenes atípicas (infiltrados unilaterales o localizados, lesiones nodulares o cavitarias) no son raras en estos pacientes. En algunos casos, entre el 10-39%, la Rx de tórax puede no mostrar alteraciones, asociándose esta característica a un mejor pronóstico de la enfermedad (Opravil et al., 1994). Por otra parte, es menos frecuente que aparezcan consolidaciones de un lóbulo o segmento, nódulos o cavitaciones y muy rara la presencia de adenopatías y afectación pleural. Un patrón granulomatoso apical similar a la tuberculosis puede existir y se ha asociado a la profilaxis con la pentaminida (Jasmer et al., 2000). Además, la PcP puede producir otros patrones radiológicos tales como neumotórax o infiltrado nodular (Baughman& Liming, 1998; Tansuphasawadikul et al., 1999). Tomografía axial computarizada (TAC) La tomografía axial computarizada (TAC) de alta resolución, es más sensible que la radiografía de tórax para el diagnóstico de la PcP, con el hallazgo típico de opacidades en vidrio deslustrado, bilaterales, que suelen aparecer acompañadas de múltiples pneumatoceles. Aunque no son específicas, la ausencia de opacidades va en contra del diagnóstico de PcP. Algunos autores plantean que los hallazgos encontrados en una TAC de tórax de alta resolución en pacientes con clínica sugestiva de PcP son suficientes como para obviar procedimientos invasivos como la Página 39 de 210 broncoscopia, aunque muchos otros clínicos prefieren la identificación del organismo en las muestras clínicas (Barry & Johnson, 2001; Huang, 2005) Otras técnicas de imagen han demostrado ser útiles en pacientes con sospecha de PcP y una radiografía de tórax normal. El empleo de tecnecio-99- dietilenetriamina penta-acetato (99mtcDPTA), y la gammagrafía con galio-67 al igual que la resonancia magnética nuclear pueden ayudar en el diagnóstico, siendo más sensible y específico el uso de 99mtcDPTA (Varthalitis et al., 1993). P. jirovecii puede diseminarse desde el pulmón a otros órganos induciendo lesiones secundarias viscerales. Las lesiones pulmonares pueden ser indetectables cuando las localizaciones extrapulmonares son diagnosticadas, como ocurre en la histoplasmosis diseminada y en otras micosis respiratorias causadas por hongos dimorfos. Los órganos afectados con más frecuencia son los ganglios linfáticos, bazo, hígado, corazón y médula ósea, aunque este patógeno se ha encontrado también en cerebro, páncreas, timo, tiroides, retina, coroides, oído externo y medio, apéndice, piel y otros órganos. Las lesiones extrapulmonares son en general nodulares, evolucionando hacia la necrosis y la calcificación, pudiendo evidenciarse en algunos casos mediante TAC. Entre un 2 y un 3% de los pacientes con infección VIH y PcP podrían desarrollar esta forma clínica que, por otra parte, resulta excepcional en pacientes sin infección VIH donde sólo se ha encontrado en estudios post mortem (Ng et al., 1997; Telzak et al., 1990). Página 40 de 210 Tratamiento y profilaxis Desde hace años, por su alta eficacia y disponibilidad en forma oral e intravenosa, la asociación a dosis fijas de trimetoprim y sulfametoxazol (cotrimoxazol) constituye el fármaco de elección tanto para el tratamiento como para la profilaxis de la PcP en pacientes con y sin infección por VIH (Calderón et al., 2010). Sin embargo, las reacciones adversas, que habitualmente ocurren durante la segunda semana de tratamiento, son frecuentes, sobre todo en pacientes con infección VIH, y pueden obligar a cambiar la medicación, así como en casos de alergia a las sulfamidas. Por otra parte, en estos últimos años se han detectado mutaciones del gen de la DHPS homólogas de las que en otros microorganismos inducen resistencia a las sulfamidas. En P. jirovecii estas mutaciones están aparentemente asociadas al uso previo de sulfamidas y podrían indicar también la presencia de fenotipos del parásito resistentes a las mismas (Stein et al., 2004). Existen alternativas al cotrimoxazol para el tratamiento y la profilaxis de la PcP, que incluyen la dapsona, la pentamidina y la atovacuona entre otras, pero la información disponible sobre su eficacia es más limitada (Calderón et al., 2010). Página 41 de 210 1.7. Epidemiología 1.7.1. Reservorio El ADN de Pneumocystis ha sido detectado en muestras ambientales pero nunca se ha podido visualizar la presencia de organismos completos con técnicas microscópicas. Se ha comunicado la existencia de ADN de Pneumocystis en muestras de agua de charcas y en el aire circundante en huertos, incluso en muestras obtenidas en habitaciones de pacientes con PcP, suponiéndose su capacidad infectiva. Sin embargo, los modelos animales han aportado información que parecen descartar el agua o los alimentos contaminados por el parásito como el posible origen de la infección. En un estudio con ratas libres de patógenos a las que se les realizó un tratamiento inmunosupresor con dexametasona durante tres meses y posteriormente se expusieron de forma selectiva a aire, agua y comida contaminada con el patógeno, sólo las ratas estabuladas en jaulas sin filtros y, por tanto, expuestas al aire ambiental desarrollaron PcP (Hughes, 1982). Por tanto, hasta el momento actual no se ha identificado ningún reservorio ambiental, aunque esta posibilidad no puede ser definitivamente excluida (Wakefield, 1996; Bartlett & Lee, 2010). El contacto con animales portadores de Pneumocystis también podría ser una posible fuente de infección. Sin embargo, la gran divergencia genética encontrada en las diferentes especies animales y experimentos de infección cruzada, demuestran que la especie de Pneumocystis que infecta a un mamífero no es transmisible a mamíferos de otras especies, descartando la posibilidad de que la PcP tenga un origen zoonótico (Aliouat et al., 1994). En este sentido, inicialmente se postuló que existía una sola especie de Pneumocystis que infectaba a todos los mamíferos. Con esta idea, se creía que la PcP en la especie humana podría ser una zoonosis, siendo el reservorio cualquiera de los mamíferos con los que el humano puede cohabitar de forma habitual. Sin Página 48 de 210 Pneumocystis que han recibido tratamiento específico se sabe que la persistencia de la infección pulmonar es un fenómeno limitado en el tiempo, cuya duración depende de la capacidad de restauración de la función inmune (Dei-Cas, 2000). En cuanto a los pacientes con enfermedades pulmonares crónicas los estudios revisados previamente demuestran la existencia de elevadas tasas de colonización por el patógeno, sugiriendo que este grupo podría constituir un importante reservorio y fuente de infección del patógeno (Calderon 2011). Por otra parte, los sujetos inmunocompetentes sin neumopatías colonizados por el patógeno, podrían representar otra fuente potencial de infección. Existen algunas evidencias que apoyan esta hipótesis. En primer lugar, la demostración de una elevada tasa de colonización por Pneumocystis (20%) en población general sana (Medrano et al., 2005). En segundo lugar la demostración experimental de la transmisión aérea de Pneumocystis murina desde ratones Balb/c inmunocompetentes colonizados a ratones inmunocompetentes y a ratones SCID inmunodeprimidos (Durand-Joly et al., 2002). Finalmente, un trabajo de nuestro grupo que observó la posible transmisión de P. jirovecii desde adultos inmunocompetentes a infantes en el ámbito familiar (Rivero et al., 2008). Sin embargo, esta transmisión intrafamiliar no fue observada en otro estudio amplio en el que se evaluaron familias de 44 adultos y 60 niños con infección por VIH (Spencer et al., 2008). En cuanto al personal sanitario, la información disponible hasta la fecha es escasa. Un primer estudio publicado en 1993 mostró que el personal sanitario que atiende a pacientes con infección por VIH presenta una mayor título de anticuerpos específicos frente a Pneumocystis que los sujetos controles de otras áreas (Leigh et al., 1993b). Dos estudios publicados poco tiempo después, en los que se emplearon técnicas serológicas y de diagnostico molecular para estudiar un pequeño número de trabajadores sanitarios (Ludgren et al., 1997, Lidman et al., 1997), mostraron resultados discrepantes con los hallazgos iniciales, ya que el patógeno no fue detectado en muestras respiratorias de ninguno de los profesionales evaluados, y la presencia de anticuerpos específicos en el primer estudio fue igual de frecuente en el grupo expuesto y no expuesto a pacientes con PcP (Ludgren et al., 1997), pudiendo Página 49 de 210 ser detectada sólo en dos de los 26 sanitarios evaluados en el segundo estudio (Lidman et al., 1997). Posteriormente dos trabajos en los que se utilizaron muestras de frotis nasal (Vargas et al., 2000) y aspirado nasal o esputo inducido (Miller et al., 2001) demostraron que el personal sanitario en contacto con pacientes con PcP puede sufrir una colonización transitoria por el microorganismo. En otro estudio en el que se evaluaron muestras de enjuagues orofaríngeos de 164 profesionales sanitarios de tres áreas diferentes de un hospital (Durand-Joly et al., 2003), se encontró una prevalencia de colonización del 8% entre los trabajadores de una Unidad de Hematología de adultos (con una elevada proporción de pacientes inmunodeprimidos) y de un Servicio de Urgencias Pediátricas, aunque ninguno de los 35 profesionales de un tercer área de hospitalización en el que se atendían adultos inmunocompetentes estaba colonizado. Más recientemente, un análisis serológico (Tipirneni et al., 2009) del personal clínico (103 personas) y no clínico (23 personas) del hospital general de San Francisco, mostró una asociación significativa entre la exposición ocupacional de los trabajadores sanitarios clínicos y las respuesta inmune a P. jirovecii. Por otra parte, en los últimos años se han acumulado algunas evidencias que apoyan la idea de que la vía transplacentaria podría ser un mecanismo adicional de adquisición de la infección. La eficiencia de este mecanismo de transmisión podría ser diferente en cada especie, ya que depende de las características anatómicas de la placenta cuya variabilidad es importante en las distintas especies de mamíferos (Sanchez et al., 2007). En este sentido, la transmisión transplacentaria ha sido demostrada en el conejo, sobre todo en situaciones de multiparidad (Sánchez et al., 2007; Cere et al., 1997), no habiendo sido observada en ratas o ratones con inmunodeficiencia combinada severa (Dei-Cas, 2000). Los estudios realizados en el hombre para dilucidar este fenómeno son escasos y poco concluyentes (Mortier et al., 1995). Antes de la epidemia SIDA se había sugerido esta hipótesis en neonatos con neumonía (Ollson et al., 2001). En 1995 se publicó un controvertido caso de infección por Pneumocystis en el feto de una madre con infección VIH y PcP que no pudo ser corroborado posteriormente utilizando inmunofluorescencia con anticuerpos específicos (Mortier et al., 1995). Página 50 de 210 Sin embargo, evidencias indirectas como los estudios que muestran elevadas tasas de colonización en las embarazadas (Vargas et al., 2003) y la existencia de casos de neumocistosis de localización extrapulmonar mediante diseminación hematógena (Ng et al., 1997), inducen a pensar que este mecanismo de transmisión debería ser explorado detenidamente. En este sentido, el reciente hallazgo de P. jirovecii en el pulmón de fetos nacidos muertos que no habían llegado a respirar aporta evidencias de que la transmisión transplacentaria es posible en humanos (Montes-Cano et al., 2009). En definitiva y con los datos disponibles hasta la fecha, actualmente se considera que cualquier individuo, con independencia de su edad, sexo y situación inmune, es susceptible de adquirir una infección sintomática o asintomática por Pneumocystis, fundamentalmente por vía aérea y a partir de otro sujeto con PcP o colonizado por el microorganismo (Varela et al., 2006). 1.7.3. Epidemiología de la neumonía por Pneumocystis Hasta 1980 la PcP no era una entidad frecuente, asociándose con síndromes de inmunodeficiencia o situaciones de intensa inmunosupresión, particularmente con la quimioterapia del cáncer. Con la pandemia del VIH, la PcP emergió como la enfermedad más común definitoria de SIDA en los países industrializados. Antes de la introducción de la profilaxis, el 60 % de los pacientes con SIDA eran identificados por presentar una PcP. Además, se estimó que hasta el 80% de los pacientes con recuentos de linfocitos CD4+ menores de 200 células/mm3 podían desarrollar esta enfermedad (Helweg-Larsen, 2004). A finales del siglo pasado la PcP tenía una incidencia de 9,5 episodios por 100 personas al año en pacientes infectados por el VIH, observándose en más del 50% de los pacientes con SIDA (Russian & Levine, 2001). En la era de la terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA), muchas infecciones oportunistas como la PcP experimentaron una franca disminución. Los Página 51 de 210 casos de esta enfermedad disminuyeron un 3,2 % por año desde 1992 hasta 1995 con la utilización de quimioprofilaxis; posteriormente, con la introducción de la TARGA, la tasa continuó descendiendo hasta valores de 21,5 % por año desde 1996 hasta 1998 (Morris et al., 2004). La PcP afecta tanto a pacientes de países desarrollados como de áreas geográficas del tercer mundo donde actualmente la infección por VIH es endémica. Así, recientemente, un estudio prospectivo realizado en Uganda demostró que la PcP no era un enfermedad tan rara como se creía en el continente africano, pues se identificó P. jirovecii en el 40% de los individuos seropositivos al VIH (Worodria et al., 2003). Actualmente la neumocistosis ha adquirido una importancia creciente, sobre todo, en sujetos inmunodeprimidos no infectados por el VIH, tales como pacientes con cáncer, hemopatías malignas, afecciones inflamatorias crónicas donde se utiliza tratamiento con fármacos inmunodepresores y receptores de transplantes hematológicos o de órgano sólido. La incidencia de la enfermedad entre estos grupos de pacientes puede alcanzar hasta el 40%, con una mortalidad que puede alcanzar en algunas series hasta el 50% (Russian & Levine, 2001; Collin & Ramphal, 1998). En los pacientes con cáncer, la incidencia de la PcP varía de acuerdo al tipo de neoplasia, oscilando entre el 22-45% en los pacientes con leucemia linfoblástica aguda o con linfoma no-Hodgkin, 25% en los pacientes con rabdomiosarcoma y 1,3% en los pacientes con tumores sólidos que reciben tratamiento con esteroides. También, la PcP ha sido identificada como complicación del mieloma múltiple y la macroglobulinemia (Calderón et al., 2011; Cisneros et al., 1998). En los pacientes sometidos a trasplante cardíaco se ha descrito una incidencia de la enfermedad de un dos a un 10%, variando de acuerdo con la distribución de la enfermedad a nivel mundial. Por otra parte, se ha estimado una incidencia del 25% en los pacientes sometidos a trasplantes de pulmón y de corazón-pulmón (Calderón et al., 2011). La PcP también puede afectar a pacientes con otros tipos de enfermedades como granulomatosis de Wegener (6%), asma, glomerulonefritis, rectocolitis ulcerosa, y otras patologías como lupus eritematoso sistémico, poliarteritis nodosa, Página 52 de 210 polimiositis, dermatomiositis, artritis reumatoide, sarcoidosis y pénfigo. En estos subgrupos la PcP suele aparecer en pacientes que han recibido terapia inmunosupresora intensa. Además, P. jirovecii ha sido vinculado con el desarrollo de trastornos autoinmunes como el desarrollo de anticuerpos anticardiolipina y el síndrome de Goodpasture (Ognibene et al., 1995; Calderón et al., 2004). Por otra parte, la PcP afecta a más del 25% de los pacientes con inmunodeficiencia severa combinada (Calderón et al., 2011). Finalmente, resulta interesante señalar que en algunos estudios realizados en Estados Unidos y España se ha descrito la existencia de PcP en pacientes inmunocompetentes o sin predisposición aparente, aunque este hallazgo parece ser poco frecuente (Jacobs et al., 1991; Cano et al., 1993). Pneumocystis jirovecii es un patógeno con una distribución geográfica amplia, habiéndose encontrado distintos genotipos que varían según las diferentes zonas geográficas, grupos de pacientes y ecosistemas evaluados. La variabilidad geográfica de los subtipos de Pneumocystis ha sido evaluada en varios estudios. Así, en un estudio amplio donde se incluyeron muestras aisladas del patógeno recogidas en países tan dispares como Gran Bretaña, Estados Unidos, Brasil y Zimbabwe, se encontró que la secuencia de ADN de todas las muestras era idéntica, salvo en un nucleótido (Wakefield et al., 1994). En un trabajo posterior, se estudiaron los distintos patrones de transmisión de la PcP en personas con SIDA, evaluando 191 muestras de pacientes de cinco ciudades de los Estados Unidos en dos diferentes loci, el gen mt LSU-rRNA y el gen que codifica la DHPS. Los autores observaron diferencias en la frecuencia de distribución del genotipo según el lugar de diagnóstico del paciente, pero no por el lugar de nacimiento (Beard et al., 2000), hallazgo que apoya la hipótesis de la transmisión de novo de la infección. Página 53 de 210 En Gran Bretaña, se estudió la variación genotípica en muestras de P. jirovecii procedentes de pacientes con PcP durante un período de 12,5 años. Los autores identificaron un agrupamiento de genotipos específicos según el código postal de residencia de los participantes, observación coherente también con la hipótesis de la transmisión de novo persona a persona de P. jirovecii por vía aérea. La falta de asociación entre los genotipos específicos del mt LSU-rRNA y la severidad de la PcP sugería que este locus no estaba implicado en la virulencia del organismo (Miller et al., 2005). También hay estudios caracterizando el patrón de los genotipos en muestras de Lisboa (Portugal) y Sevilla (España), en los que se constata la existencia de diferencias geográficas según el locus evaluado (Estevez et al., 2008). En cuanto a los ecosistemas, un estudio publicado en 1998 examinó muestras de aire ambiental procedentes de habitaciones donde estaban ingresados pacientes con PcP, pasillos adyacentes, y otros ambientes hospitalarios. Los genotipos identificados fueron los mismos en cuatro de los cinco habitaciones de pacientes con PcP, sugiriendo que existe riesgo de transmisión persona a persona de P. jirovecii desde los pacientes con PcP. Tres de las 16 muestras ambientales donde no existían pacientes con PcP, y una muestra de una unidad cardiológica de un edificio hospitalario diferente fueron también positivos, lo cual refuerza la posibilidad de adquisición del P. jirovecii del ambiente (Ollson et al., 1998). En lo que respecta a la distribución estacional del patógeno, en Inglaterra se examinó a una cohorte de 8640 individuos con infección por VIH procedente de dos hospitales británicos, entre los que se habían descrito 792 casos de PcP. La incidencia de PcP fue significativamente más elevada en el mes de enero, asociación que sugiere la idea de una infección transmisible (Lubis et al., 2003). Página 54 de 210 En España también se estudió la relación entre la incidencia de la infección y los factores climáticos. En total, se identificaron 536 casos de infección por P. jirovecii en el período 1994-1998, existiendo una correlación inversa entre la incidencia de PcP y la media mensual de la temperatura ambiental mínima. La mayoría de los casos ocurrían en invierno, existiendo una asociación estacional estadísticamente significativa (Varela et al., 2004). En el año 2007, se publicaron resultados muy interesantes que apoyan la asociación entre factores estacionales y la detección de genotipos específicos de P. jirovecii. En un estudio que analizó 155 muestras de lavado broncoalveolar obtenidos entre 1989 y 2001, los autores encontraron variaciones mensuales y estacionales en la frecuencia de detección de genotipos mixtos, y asociación entre las variaciones mensuales y el genotipo 2. No encontraron asociación mensual o estacional con los genotipos 1, 3 y 4, o con las temperaturas mensuales o el índice de pluviosidad (Miller et al., 2007). En relación con la temperatura media y utilizando también muestras de lavado broncoalveolar (LBA), fueron estudiados 757 pacientes con PcP durante el período comprendido entre enero de 1989 y diciembre del 2006, encontrándose una correlación positiva entre la incidencia de PcP y la temperatura media, aunque en el estudio no existió asociación con otros factores climáticos como la lluvia o la fuerza del viento (Sing et al., 2009). 1.7.4. Colonización por Pneumocystis La aplicación de la PCR para la amplificación del ADN de Pneumocystis en los estudios epidemiológicos ha contribuido al desarrollo de avances significativos en la comprensión de los mecanismos de transmisión de este patógeno (Wakefield et al., 1990). Esta tecnología ha permitido demostrar la presencia del patógeno en diferentes muestras biológicas de pacientes sin manifestaciones clínicas ni radiológicas de neumonía, conociéndose este fenómeno como colonización (Morris & Norris, 2012; Calderón et al., 2011; Wakefield et al., 2003), aunque también ha Página 55 de 210 recibido otras denominaciones como infección subclínica o estado de portador asintomático (carrier) (Morris et al., 2008; Peterson & Cushion, 2005) La significación clínica de la colonización por Pneumocystis no está clara, pero se intuye su importancia por varias razones (Morris & Norris, 2011; Morris et al., 2008): - Los individuos colonizados con Pneumocystis pueden estar en riesgo de desarrollar PcP o bien transmitir Pneumocystis a otras personas. - En individuos que reciben profilaxis a largo plazo contra Pneumocystis, la colonización puede conducir a la selección de mutaciones, que pueden estar asociadas con la resistencia a fármacos. - La presencia de Pneumocystis en los pulmones, incluso a niveles bajos, puede estimular una respuesta inflamatoria en el huésped que puede conducir a un daño pulmonar, y por tanto, jugar un papel en la progresión de enfermedades pulmonares como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La magnitud de este fenómeno biológico no se conoce aún bien, pero en los últimos años se ha constatado la presencia de colonización por Pneumocystis en grupos poblacionales muy diferentes que se resumen a continuación. Mamíferos no humanos En animales, la colonización se ha detectado en los pulmones de diversas especies de roedores, caballos y primates (Laakkonen et al., 2001; Laakkonen et al., 2001 b; Morris & Norris, 2012). En roedores de laboratorio, se publicó una tasa de colonización del 98% detectada en muestras orofaríngeas mediante PCR anidada (Icenhour et al., 2001; Icenhour et al., 2001b). En ratas recién nacidas, se observó que el 80% eran portadoras de Pneumocystis durante las primeras dos horas después del nacimiento, 97% después de las primeras 24 horas, y el 100% tras 48 horas (Icenhour et al., 2001). Página 56 de 210 De forma similar, se ha demostrado que la colonización espontánea ocurre tanto en primates institucionalizados en laboratorio como en libertad (Croix et al., 2002; Board et al., 2003; Demanche et al., 2005). En una colonia de macacos en libertad, todos los animales experimentaron colonización durante un período de observación de dos años, con una duración media de la colonización de dos meses (Demanche et al., 2001). En macacos de laboratorio, se encontraron anticuerpos frente a Pneumocystis en el 95% de los casos, y se constató que animales saludables eran colonizados transitoriamente por el patógeno (Kling et al, 2009). En primates con el virus de inmunodeficiencia del simio, se comprobó colonización por Pneumocystis, tanto de forma natural como después de inoculación intrabronquial (Croix et al., 2002; Board et al., 2003), persistiendo este estado de colonización durante más de 40 semanas sin la aparición de PcP. Adultos inmunodeprimidos con infección VIH En pacientes con infección por VIH, la colonización por P. jirovecii parece ser un fenómeno frecuente. El rango de prevalencia encontrado depende de la población estudiada, del tipo de muestras y del método diagnóstico utilizado. En el primer estudio realizado en esta población se analizaron 70 muestras de esputos inducidos y de lavados broncoalveolares mediante PCR simple, encontrando una prevalencia de colonización que osciló entre un 10 y un 40% de colonización (Leigh et al., 1993). Utilizando PCR semi-anidada, dos estudios encontraron una prevalencia de un 14,3% y un 20% en los lavados broncoalveolares de 34 y 5 individuos infectados, respectivamente (Nevez et al., 1997; Nevez et al., 1999). En otros estudios, realizados con técnicas más sensibles de PCR anidada, el rango varía entre un 28,8% y un 68,8%. Página 57 de 210 Así, en un estudio inicial, se describió un 31,3% de prevalencia en 80 lavados broncoalveolares de pacientes asintomáticos que recibían profilaxis anti-PcP (Rabodonirina et al., 1997). Posteriormente, estudiando esputos inducidos y lavados orofaríngeos de 52 pacientes VIH positivos con síntomas respiratorios, se encontró un 28,8% de colonización (Matos et al., 2001). En 32 pacientes VIH positivos ingresados por neumonía no PcP, se observó una prevalencia de colonizados en los lavados broncoalveolares o esputos inducidos del 69% (Huang et al., 2003). Otro estudio encontró un 43% analizando lavados broncoalveolares de 16 individuos infectados por VIH (Wakefield et al., 2003). En el estudio de 91 muestras pulmonares de pacientes VIH positivos fallecidos por causa diferente a PcP, se describió una prevalencia del 46% (Morris et al., 2004). Más recientemente, en nuestro medio, se ha comunicado una prevalencia de un 40% en 20 individuos jóvenes VIH positivos (Gutierrez et al., 2011). En cuanto a los factores de riesgo relacionados con la colonización, Leigh et al. encontraron relación con el número de células CD4+, aumentando la prevalencia desde un 10% en personas con CD4+ por encima de 400 células/µl, hasta un 40% en aquéllos con menos de 60 células/µl (Leigh et al., 1993). Sin embargo, otros estudios no han podido confirmar esta posible asociación, habiéndose encontrado colonización en individuos con cifras elevadas de linfocitos CD4+, así como en aquellos individuos en tratamiento antirretroviral o que realizaban profilaxis anti- Pneumocystis (Huang et al., 2003; Morris et al., 2004). Otros posibles factores de riesgo propuestos incluyen el tabaquismo y los condicionantes geográficos (Morris et al., 2004). Así, en un estudio realizado sobre una cohorte de 91 sujetos con SIDA pertenecientes a varios estados norteamericanos, los participantes fumadores tenían una probabilidad significativamente mayor (2,9, p<0,05) de presentar colonización por Pneumocystis que los que no eran fumadores. También el lugar de residencia influía significativamente sobre la prevalencia de Pneumocystis siendo los participantes residentes en Los Angeles, los que menos riesgo de colonización presentaban. Otros factores evaluados en el estudio fueron el recuento de células CD4+, la historia previa de PcP, el uso de profilaxis frente a PcP o la toma de fármacos antirretrovirales, sin que se observara una asociación significativa con la colonización (Morris et al., 2004). Página 64 de 210 jirovecii. De esta forma, la colonización por el patógeno del tracto respiratorio inferior podría convertirse, junto con el hábito tabáquico, en un cofactor que aumentara o mantuviera la respuesta inflamatoria, acelerando la progresión de la EPOC (Gutiérrez et al., 2011). Enfermedades pulmonares intersticiales Las enfermedades pulmonares intersticiales son un grupo heterogéneo de procesos que afectan al tracto respiratorio inferior donde la alteración en el parénquima pulmonar conlleva una cascada de procesos inflamatorios e inmunológicos que causan fibrosis pulmonar (Gutierrez et al., 2011). En este sentido, hay estudios que implican a agentes infecciosos en la patogénesis de las enfermedades pulmonares intersticiales (Egan et al., 1997, du Bois et al., 2003). El rango de prevalencia de colonización por P. jirovecii en pacientes con enfermedades pulmonares intersticiales varía entre un 30 a un 34% (Vidal et al., 2006, Martín-Juan et al., 2008, Shimizu et al., 2009), siendo la prevalencia similar entre las diferentes enfermedades pulmonares intersticiales. En un estudio que incluyó a 240 pacientes con enfermedad intersticial pulmonar (Martín-Juan et al., 2008), los pacientes colonizados por P. jirovecii presentaban en sangre periférica unos niveles totales de leucocitos y eosinófilos más elevados que los no portadores. Estos autores observaron también que la razón CD4/CD8 era menor en los portadores, debido principalmente a un aumento en el recuento de CD8, aunque las diferencias no eran estadísticamente significativas. Este hallazgo sugiere que la colonización por Pneumocystis puede estar relacionada con una exacerbación de estas enfermedades. (Gutiérrez et al., 2011) Página 65 de 210 Fibrosis quística La fibrosis quística también ha sido analizada en varios estudios (Varela et al., 1998; Sing et al., 2001; Respaldiza et al., 2005; Montes-Cano et al., 2007; Pederiva et al., 2012), con tasas de prevalencia muy variables. El primer estudio realizado en 45 pacientes con esta enfermedad no encontró colonización por Pneumocystis, aunque el método de detección utilizado no fue la PCR, sino técnicas de tinción con inmunofluorescencia (Varela et al., 1998). Utilizando PCR anidada Sing et al. analizaron 137 esputos de 95 pacientes con fibrosis quística (edad media 23,3 años), encontrando que el 7,4% estaban colonizados por Pneumocystis (Sing et al., 2001). En otro estudio que analizó 54 esputos y 34 lavados orofaríngeos de 88 pacientes se encontró una prevalencia de colonización del 21,5 % (Respaldiza et al., 2005). La colonización fue más frecuente en sujetos con menos de 18 años (25,5% frente al 15,1%). Por otra parte, se ha podido comprobar que la colonización en los pacientes con fibrosis quística es un fenómeno dinámico con episodios continuos de aclaramiento y reinfección (Montes-Cano et al., 2007). Fuera de Europa, un estudio reciente ha comunicado una prevalencia de colonización del 38,2% en pacientes brasileños (Pederiva et al., 2012). La colonización por Pneumocystis no parece ser un factor de riesgo para producir PcP en los pacientes con fibrosis quística, probablemente porque el estado inmune de estos pacientes sea suficiente para controlar el paso de colonización a infección (Sing et al., 2001; Respaldiza et al., 2005; Montes-Cano et al., 2007). No obstante, incluso sin una inmunodepresión grave, la colonización por Pneumocystis puede provocar alteraciones respiratorias moderadas o severas, donde el patógeno actúa como un factor de comorbilidad estimulando la inflamación pulmonar (Calderon et al., 2007; Morris et al., 2008). Aquí se baraja la hipótesis de que la colonización por P. jirovecii provoca obstrucción de las vías aéreas y una respuesta inflamatoria en los pacientes con fibrosis quística (Calderon et al., 2011; Gutiérrez et al., 2011). Sin embargo, en la actualidad esta hipótesis no ha podido ser demostrada. Por tanto, no es posible hasta el momento establecer si la colonización Página 66 de 210 por P. jirovecii puede jugar un papel en el empeoramiento del curso natural de la fibrosis quística. Por otra parte, no es conocida la interacción del P. jirovecii con las bacterias patógenas del tracto respiratorio de pacientes con fibrosis quística. Sin embargo, esta interacción podría tener impacto sobre la fisiopatología de la fibrosis quística. En este sentido, una potencial relación antagonista entre la colonización por P. jirovecii y las bacterias microbiotas ha sido recientemente publicado en el tracto respiratorio de pacientes con neumonía intersticial idiomática (Friaza et al., 2010). Cáncer de pulmón de células pequeñas El hábito tabáquico es el factor de riesgo más importante en el cáncer de pulmón, pero no el único. El papel de los agentes infecciosos en el desarrollo de tumores humanos no ha sido demostrado hasta fechas recientes (Kuper et al., 2000). Actualmente, se estima que el 15% de todos los tumores humanos tienen un origen infeccioso (Pisani et al., 1997). Un estudio publicado recientemente aporta la primera evidencia de la asociación entre el cáncer de células pequeñas de pulmón y la colonización por Pneumocystis (de la Horra et al., 2004). Los autores estudiaron diez muestras de autopsias de pacientes con carcinoma de células pequeñas y 10 muestras de pacientes con otros tipos de cáncer de pulmón con características demográficas y clínicas similares, así como en cinco muestras de sujetos fallecidos sin patología pulmonar. El ADN del Pneumocystis fue encontrado en todos los casos de carcinoma pulmonar de células pequeñas, frente a sólo en dos casos de los otros tipos de cáncer y en ninguno de los controles. La asociación entre la presencia del ADN del Pneumocystis y el cáncer pulmonar de células pequeñas fue significativa (p<0,05) Esta asociación, aunque de naturaleza incierta, constituye un importante hallazgo abriendo un nuevo campo para la investigación, ya que todavía no podemos determinar si la colonización por P. jirovecii está facilitada por el tumor, o bien induce el desarrollo de este tipo de neoplasia en combinación con otros factores. Página 67 de 210  Población general Las evidencias sobre la posibilidad de que individuos sanos de la población general pudieran estar colonizados por Pneumocystis son escasas, y los resultados de los diferentes estudios publicados son muy variables, dependiendo fundamentalmente del tipo de muestras evaluadas, de las técnicas empleadas para la detección del microorganismo y de las características de los sujetos analizados. La prevalencia en población general, al igual que en el resto de poblaciones, ha ido cambiando en los distintos estudios publicados, siendo una de las principales razones, el desarrollo de técnicas más sensibles. En 1992, un estudio en autopsias de 15 adultos inmunocompetentes no fumadores sin enfermedades crónicas no encontró pruebas de colonización por Pneumocystis, aunque no utilizó técnicas moleculares (Peters et al., 1992). Los primeros estudios realizados para detectar ADN de Pneumocystis utilizaron técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) simple, no encontrando ADN en ninguno de los diez LBA de individuos inmunocompetentes (Wakefield et al., 1990), ni en los 15 pulmones de individuos adultos no inmunodeprimidos analizados (Peters et al., 1992). En otro estudio que utilizó ya una técnica más sensible de PCR anidada, no hubo evidencia de colonización en los esputos inducidos de 20 hombres VIH negativos (10 homosexuales y 10 heterosexuales), utilizados como controles para el estudio original (Leigh et al., 1993). En Portugal tampoco se encontró colonización en los 32 sujetos sanos utilizados como grupo control en un estudio sobre prevalencia de colonizción realizado en individuos con infección VIH (Matos et al., 2001), ni en Chile, donde se estudiaron a 33 mujeres inmunocompetentes como población control frente a mujeres embarazadas (Vargas et al., 2003). Sin embargo, en otro estudio realizado en 1997 en el que se analizaron mediante PCR anidada muestras de 169 sujetos sin infección por VIH se observó que el 19,5% de los sujetos estaba colonizado. El trabajo se realizó en dos hospitales Página 68 de 210 franceses, y los participantes fueron reclutados entre aquellos a los que se realizó un lavado broncoalveolar para el diagnóstico de diferentes enfermedades respiratorias y, por tanto, no se incluyeron sujetos sanos (Nevez et al., 1997). Posteriormente, en otro trabajo de este mismo grupo no se encontraron indicios de colonización en las muestras de esputo de 30 sujetos sanos franceses, mientras que en el grupo control, ocho de 50 pacientes con EPOC sí resultaron positivos a P. jirovecii. El grupo de personas sanas fue reclutado entre las personas que acudían al hospital para una polisomnografía nocturna con los siguientes criterios de inclusión: células CD4+ T en sangre >600 células/mm3 y ausencia de alteraciones pulmonares en el estudio practicado, que incluyó radiografía de tórax, espirometría y registro polisomnográfico (Nevez et al., 2006). Por otra parte, en un estudio realizado por nuestro grupo de trabajo, se analizaron las muestras de enjuagues orofaríngeos de 50 personas sanas entre febrero y julio de 2003. En las muestras de diez de estos sujetos se amplificó el fragmento mt LSU rRNA, observándose, por tanto, una prevalencia de colonización del 20%. Los participantes eran trabajadores de un hospital, sin contacto directo previo con los pacientes hospitalizados y que trabajaban en un edificio diferente a los de hospitalización. Los sujetos colonizados permanecieron asintomáticos durante un periodo de seguimiento de seis meses y, tras este período, sólo dos de los sujetos continuaban estando colonizados. Este estudio demostró por primera vez que el ADN del P. jirovecii puede ser detectado por técnicas sensibles de amplificación del ADN en muestras no invasivas del tracto respiratorio de un porcentaje importante de sujetos sanos (Medrano et al., 2005), así como que el estado de portador en población general adulta podría ser un fenómeno limitado en el tiempo, en concordancia con lo observado en trabajadores sanitarios inmunocompetentes colonizados con el patógeno (Miller et al., 2001; Durand-Joly et al., 2003). Finalmente, dos estudios realizados más recientemente apoyan fuertemente la posibilidad de que la colonización por Pneumocystis pueda ser un fenómeno relativamente frecuente en adultos sanos. En el primero de ellos se incluyeron 110 Página 69 de 210 personas mayores de 65 años inmunocompetentes residentes en Chile, y se encontró una prevalencia del 13% al examinar las muestras de lavados orofaríngeos. Esta prevalencia aumentó a un 23% al incluir también las muestras nasales de los mismos individuos (Vargas et al., 2010). En el segundo, realizado en autopsias de sujetos inmunocompetentes en Chile (Ponce et al., 2010), se analizó el ADN de un 3% del tejido pulmonar, encontrando en un 64,9% de estas muestras presencia de ADN de Pneumocystis. Estos resultados, no han sido aún replicados en otros estudios de diseño similar y son difíciles de comparar con los datos disponibles de trabajos realizados en sujetos inmunocompetentes vivos, pero sugieren fuertemente que niveles muy pequeños de colonización pueden ser más comunes de lo que se pensaba (Morris & Norris, 2012). Página 70 de 210 Página 71 de 210 Epidemiología de la colonización por Pneumocystis en población general 2. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Página 73 de 210 JUSTIFICACIÓN El conocimiento sobre la epidemiología de la infección humana por Pneumocystis jirovecii es aún muy limitado y, como se ha revisado en el capítulo introductorio, no están bien establecidos cuáles son sus reservorios y fuentes de transmisión. Se ha demostrado que el patógeno está presente en muestras respiratorias de individuos sin síntomas o signos neumonía, fenómeno que recibe el nombre de colonización y, recientemente, se ha observado que este fenómeno es frecuente en pacientes inmunodeprimidos o con algunas enfermedades pulmonares crónicas. En estudios preliminares se ha descrito la existencia de colonización en adultos sanos inmunocompetentes, hallazgo que sugiere que la población general podría desempeñar un papel como reservorio y fuente de infección del microorganismo. Sin embargo, en el momento actual se desconoce la prevalencia y relevancia de este fenómeno en población general, lo que justifica la necesidad de realizar nuevos estudios de base poblacional que, combinando un diseño epidemiológico riguroso con la aplicación de las nuevas técnicas moleculares para la identificación y caracterización de este microorganismo, permitan aclarar este aspecto fundamental de la epidemiología de la infección por Pneumocystis en el ser humano. Este conocimiento resulta esencial para poder diseñar estrategias racionales para la prevención y el control de la PcP que contribuirían a disminuir la morbimortalidad asociada a la infección por Pneumocystis en colectivos de riesgo como los niños y adultos trasplantados, los pacientes oncológicos y otros grupos de pacientes sometidos a inmunodepresión. Página 80 de 210 Figura 3. Centro de Salud de El Coronil Figura 2. Localización del término municipal de El Coronil, Sevilla Página 81 de 210 Tabla 1. Distribución de la población del municipio de El Coronil según edad y sexo. Edad Sexo Población Varón 126 0-4 Mujer 103 Varón 127 05-sep Mujer 137 Varón 156 oct-14 Mujer 151 Varón 172 15-19 Mujer 167 Varón 155 20-24 Mujer 155 Varón 156 25-29 Mujer 174 Varón 186 30-34 Mujer 181 Varón 217 35-39 Mujer 199 Varón 219 40-44 Mujer 189 Varón 185 45-49 Mujer 158 Varón 143 50-54 Mujer 109 Varón 131 55-59 Mujer 124 Varón 122 60-64 Mujer 119 Varón 108 65-69 Mujer 119 Varón 109 70-74 Mujer 132 Varón 103 75-79 Mujer 126 Varón 66 80-84 Mujer 99 Varón 29 >85 Mujer 48 Total 5045 Fuente: Instituto Nacional de Estadística, 2007 Página 82 de 210 3.2. Diseño Estudio transversal de prevalencia de base poblacional. 3.2.1. Cálculo del tamaño muestral Se realizó un muestreo sistemático con arranque aleatorio, estratificado por edad y sexo, tomando como fuente la Base de Datos del Usuario del Servicio Andaluz de Salud (BDU), actualizada a junio de 2007 (tabla 2). Los criterios de inclusión en el estudio fueron: - Adscripción al municipio de El Coronil en la BDU. - Posibilidad de obtención de una muestra de lavado orofaríngeo (LOF) para la evaluación microbiológica - Obtención del consentimiento informado por escrito (anexo 2), previa explicación verbal y escrita del estudio. En el caso de los menores de edad, se obtuvo el consentimiento paterno o del tutor legal. Para el cálculo del tamaño muestral se consideró, en función de los resultados de un estudio previo realizado en nuestra área (Medrano et al., 2005), una prevalencia del 12% que, con un nivel de confianza del 95%, un error muestral del 5% y un efecto de diseño igual a uno, representa un tamaño muestral inicial de 189 individuos. Estimando una tasa de pérdidas del 10% en cada estrato de edad y sexo, y una vez redondeada las cifras también por estratos, el tamaño muestral fue de 214 individuos, 108 hombres y 106 mujeres. De ellos, el 76,64% de la muestra (164) eran mayores de 18 años, y el 23,36% (50) eran iguales o menores de 18 años (figura 4). Antes de la realización del estudio se obtuvieron los permisos pertinentes de las autoridades sanitarias y se informó al personal sanitario y no sanitario del centro de la naturaleza y características del proyecto de investigación. Página 83 de 210 Tabla 2 .Tamaños muestrales calculados y obtenidos por grupo de edad y sexo (prevalencia 12%, error muestral 5%) Edad Sexo Tamaño muestral calculado Tamaño muestral +10% pérdidas estimadas Redondeo por estratos Varón 5 5,5 6 0-4 Mujer 4 4,4 4 Varón 5 6 6 05-sep Mujer 5 5,5 6 Varón 6 6,6 7 oct-14 Mujer 6 6,6 7 Varón 6 6,6 7 15-19 Mujer 6 6,6 7 Varón 6 6,6 7 20-24 Mujer 6 6,6 7 Varón 8 8,8 9 25-29 Mujer 7 7,7 8 Varón 7 7,7 8 30-34 Mujer 7 7,7 8 Varón 8 8,8 9 35-39 Mujer 7 7,7 8 Varón 8 8,8 9 40-44 Mujer 7 7,7 8 Varón 7 7,7 8 45-49 Mujer 6 6,6 7 Varón 5 5,5 6 50-54 Mujer 4 4,4 4 Varón 5 5,5 6 55-59 Mujer 5 5,5 6 Varón 5 5,5 6 60-64 Mujer 4 4,4 4 Varón 4 4,4 4 65-69 Mujer 4 4,4 4 Varón 3 3,3 3 70-74 Mujer 5 5,5 6 Varón 4 4,4 4 75-79 Mujer 5 5,5 6 Varón 2 2,2 2 80-84 Mujer 4 4,4 4 Varón 1 1,1 1 >85 Mujer 2 2,2 2 Total 189 207,9 214 Página 84 de 210 Figura 4. Cálculo del tamaño muestral por estratos de edad y sexo (prevalencia 12%, error muestral 5%, pérdidas estimadas 10%) Tamaño muestral calculado n =189 + 10% pérdidas n = 208 Tamaño muestral final tras redondeo por estratos de edad y sexo n = 214 Adultos (>18 años) n =164 No adultos (<=18 años) n= 50 Página 85 de 210 3.2.2. Intervención - Inclusión de los probandos Los candidatos a participar en el estudio fueron seleccionados de la población incluida en la Base de Datos del Usuario (BDU) del Servicio Andaluz de Salud de 2007 mediante un muestreo sistemático con arranque aleatorio. Un mes antes de la fecha prevista para el inicio del estudio, los individuos adultos seleccionados fueron invitados a participar en el presente proyecto de investigación mediante una carta postal donde se detallaba la naturaleza y características del mismo y se solicitaba su colaboración para ser incluido como probando. En la misma carta se le asignaba, si el probando otorgaba su consentimiento informado, una fecha concreta en la que acudir al Centro de Salud de El Coronil para la realización del estudio. También se proporcionó un teléfono de contacto para aclaración de posibles dudas o cambios en la cita. Una semana antes de la fecha asignada, cada sujeto seleccionado recibió un recordatorio telefónico realizado por los responsables del estudio o las administrativas del Centro de Salud de El Coronil. En los casos en los que no fue posible el contacto telefónico, se intentó localizar al sujeto en su domicilio. En los niños de 14 años o menos, utilizamos una captación activa entre los padres que acudían al centro de salud al programa de niño sano, así como aquellos padres que acudían con sus hijos como acompañantes. Sólo se incluyeron los que figuraban en la Base de Datos del Usuario. Página 86 de 210 - Período de estudio El período de inclusión de los probandos fue del 1 al 31 de julio del 2008. El trabajo de campo (encuestas sociodemográfica y clínica, y obtención de muestras biológicas) se realizó en un período de siete días hábiles consecutivos. Durante los primeros cuatro días, fueron citadas en horario de mañana (10 a 14 horas) siete personas cada media hora. Los siguientes tres días se reservaron para la inclusión de aquellos probandos que no pudieron acudir a la cita inicialmente programada. En estos días se ofertó un horario de mañana y tarde para facilitar la asistencia de los probandos con obligaciones laborales o dificultad para acudir en el turno de mañana. - Trabajo de campo Los individuos que aceptaron participar en el proyecto de investigación fueron citados en el Centro de Salud, otorgando por escrito su consentimiento informado (anexo 12) antes de su inclusión en el estudio. A cada uno de los participantes se le realizó una entrevista directa estandarizada que incluyó un cuestionario con preguntas cerradas (anexo 1). Simultáneamente se realizó un examen de salud, con anamnesis y exploración física. Todos los datos fueron recogidos de forma estandarizada en un cuaderno de recogida de datos (CRD) (anexo 2). Seguidamente se obtuvieron muestras biológicas (sangre y lavado orofaríngeo) de los probandos en condiciones de ayunas de al menos ocho horas. Diariamente se transportaron las muestras en nevera portátil para su procesamiento al Laboratorio de Investigación del Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla. Página 87 de 210 3.2.3. Seguimiento El seguimiento de todos los sujetos incluidos en el estudio y la necesidad o no de tratamiento quedó en todos los casos a criterio del médico de atención primaria responsable de cada probando. Página 89 de 210 3.3. Variables de estudio Las variables fueron obtenidas mediante una encuesta clínicasociodemográfica estandarizada, así como de muestras de lavado orofaríngeo (LOF) y sangre que incluyeron los siguientes parámetros recogidas en el CRD (anexo 2) a) Encuesta sociodemográfica y clínica En la tabla 3 se recogen las variables de la encuesta sociodemográfica y clínica, así como las categorías o unidades de medida consideradas. b) Variables biológicas En las muestras de sangre obtenidas se determinaron los niveles sanguíneos de hemoglobina, y un recuento automatizado de leucocitos, neutrófilos, linfocitos totales, linfocitos CD4+ y CD8+, así como niveles séricos de láctico deshidrogenasa (LDH) y proteína C reactiva (PCR). c) Variables microbiológicas Diagnóstico molecular de la infección por P. jirovecii en lavados orofaríngeos (LOF) y caracterización genotípica en las muestras positivas. Página 96 de 210 Tabla 6. Genotipos del locus mtLSU- rRNA de Pneumocystis jirovecii según los nucleótidos presentes en las posiciones 85 y 248 del gen NUCLEÓTIDO Posición 85 Posición 248 GENOTIPO C C 1 A C 2 T C 3 C T 4 Figura 5. Secuenciación de la posición 85 del locus mtLSU rRNA de Pneumocystis jirovecii Figura 6. Secuenciación de la posición 248 del locus mtLSU rRNA de Pneumocystis jirovecii Página 97 de 210 3.7.2. RFLP del gen DHPS Se analizaron las mutaciones del gen DHPS asociados a resistencias a sulfamidas mediante la identificación de polimorfismos según la longitud de los fragmentos obtenidos con enzimas de restricción específicas (RFLP). Para ello, las muestras que resultaron positivas se dividieron en dos alícuotas. - La primera alícuota se utilizó para identificar la presencia de cepas silvestres frente a la mutación en el codón 55 mediante digestión durante 2 horas a 37 °C utilizando 1 U de la enzima de restricción AccI (Roche Diagnostics, Alemania) cuya diana se encuentra en dicho codón de la cepa silvestre. - La segunda alícuota se utilizó para identificar la presencia de cepas silvestres frente a la mutación en el codón 57 empleando la enzima de restricción HaeIII (Roche Diagnostics, Alemania) mediante el mismo protocolo. Las cepas silvestres presentan en su secuencia de ADN las dianas para estas enzimas de restricción, por lo que cuando una muestra con cepas silvestres (sin mutación en el codón 55) se somete a digestión con la enzima AccI, ésta corta el amplicón de DHPS, detectándose 2 fragmentos de ADN, uno de 229 pb y otro de 141 pb, respectivamente; mientras que si la mutación está presente se detecta una sola banda no cortada de 370 pb. De la misma forma, con la enzima HaeIII se detectan 2 fragmentos de 221 y 149 pb cuando existe una cepa silvestre sin mutación en el codón 57, y una sola banda no cortada de 370 pb si la mutación está presente (figura 7). Como se muestra en la tabla 7, los diferentes genotipos para el gen DHPS dependen de los aminoácidos presentes en las posiciones 55 y 57. Página 98 de 210 Tabla 7. Genotipos del locus DHPS de Pneumocystis jirovecii según los aminoácidos presentes en las posiciones 55 y 57 AMINOÁCIDO Codón 55 Codón 57 GENOTIPO Thr (w) Pro (w) 1 Ala (m) Pro (w) 2 Thr (w) Ser (m) 3 Ala (m) Ser (m) 4 A ccI H aeIII 370 pb 149 pb 221 pb 141 pb 229 pb Figura 7. RFLP del locus DPHS de P neumocystis jirovecii Página 99 de 210 3.8. Algoritmo diagnóstico y criterios de interpretación de los resultados El algoritmo seguido para identificar la presencia de ADN de Pneumocystis jirovecii en las muestras de lavado orofaríngeo (LOF) consta de los siguientes pasos (figura 8): - La muestra de lavado orofaríngeo se divide en dos alícuotas. - Se realiza una PCR anidada del gen mtLSU-rRNA en la alícuota 1 (PCR1 mtLSU-rRNA) - Si no existe amplificación en la PCR1 mtLSU-rRNA la muestra se considera negativa y no se realizan más determinaciones - Si existe amplificación en la PCR1 mtLSU-rRNA, en una segunda alícuota se realiza otra PCR anidada del gen mtLSU-rRNA, así como una PCR del gen DHPS Las muestras de LOF se consideran positivas cuando se cumple alguna de estas condiciones (tabla 8) - Existe amplificación del gen mtLSU-rRNA en las dos alícuotas - Existe amplificación del gen mtLSU-rRNA y del gen DHPS en la alícuota 1 La clasificación final de la muestra problema tras el algoritmo diagnóstico se muestra en los valores recogidos dentro de los óvalos de la figura 8, así como en la tabla 8. Para los fines de este trabajo se consideró que un sujeto estaba colonizado por Pneumocystis si en ausencia de síntomas clínicos o signos clínicos de neumonía, el estudio de la muestra de lavado orofaríngeo resultaba positivo. Las personas que no cumplían estos criterios se consideraron como no colonizados. 149 pb Página 100 de 210 Figura 8. Algoritmo para el diagnóstico molecular de P. jirovecii en las muestras de LOF PCR del gen mtLSUrRNA Alícuota 1 PCR del gen mtLSUrRNA Alícuota 2 PCR del gen DHPS Positivo Negativo Negativo PositivoNegativo + - ++ -- Tabla 8. Interpretación diagnóstica de los resultados del análisis molecular Genes estudiados PCR 1 mtLSU-rRNA PCR 2 mtLSU-rRNA PCR DHPS Resultado + + + Positivo + + - Positivo + - + Positivo + - - Negativo - Negativo PCR 1, PCR anidada para el gen mtLSU rRNA en la primera alícuota; PCR 2, PCR anidada para el gen mtLSU rRNA en la segunda alícuota; PCR DHPS, PCR “touchdown” para el gen DHPS en la primera alícuota. Página 101 de 210 3.9. Controles de calidad Las muestras se procesaron en el laboratorio a ciegas y bajo código. La extracción del ADN, la preparación de la mezcla de reacción, la adición del ADN a la mezcla de la PCR, la amplificación por PCR y la detección se realizaron en diferentes áreas del laboratorio. Asimismo, para evitar falsos positivos, se utilizaron puntas con filtro en cada paso. Por otra parte, en cada experimento se utilizaron controles positivos y negativos de agua estéril que permitieron detectar la posibilidad de contaminación cruzada. En todas las muestras que resultaron negativas se estudió también la presencia del gen de la beta-globina humana para descartar procesos de inhibición en la reacción de la PCR que pudieran estar condicionadas por la presencia de inhibidores de la amplificación del ADN en la mezcla de reacción o por una deficiente calidad de la muestra. Un resultado positivo utilizando la PCR para la beta-globina humana con los cebadores BGLO-1 (5´-ACA CAA TGT GTT CAC TAG CA-3´) y BGLO-2 (5´-CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC -3´) demostraba que un resultado negativo en la PCR de P. jirovecii no era debido a la inhibición de la reacción (Saiki et al., 1985). Para reforzar los controles de calidad, las dos alícuotas fueron retestadas por una segunda técnica de PCR (PCR a tiempo real), evaluándose la concordancia entre los resultados obtenidos por esta segunda técnica y los observados con el algoritmo diagnóstico del estudio. La descripción de dicha técnica se realiza a continuación. Página 102 de 210 3.10. Detección de P. jirovecii mediante PCR a tiempo real Para la detección de P. jirovecii mediante PCR a tiempo real (PCR-TR) se utilizó el equipo LightCycler® 1.5 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) y el LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals, Mannhein, Germany). La PCR-TR fue realizada en un volumen final de 20 µL, con los cebadores pAZ102-X y pAZ102-Y a una concentración de 250 µM cada uno, MgCl2 2 mM y 30 ng de ADN total de la muestra. Tras una etapa inicial a 95º durante 8 minutos para activar al enzima, la amplificación se realizó en 40 ciclos. El programa incluyó las etapas recogidas en la tabla 9. Las muestras fueron consideradas positivas cuando las dos alícuotas amplificaron antes del ciclo 35. Tabla 9. Etapas de la PCR a tiempo real Etapa Número de ciclos Temperatura (ºC) Tiempo Desnaturalización 1 95 8 minutos 95 5 segundos 55 15 segundos Amplificación 40 72 10 segundos 95 30 segundos 65 30 segundos Melting 1 95 10 segundos Enfriamiento 1 40 30 segundos Página 103 de 210 3.11. Variables biológicas El hemograma y la medición de los niveles de séricos de LDH y PCR se realizaron en el Laboratorio Central del Hospital Virgen del Rocío utilizando equipos automatizados comerciales. El recuento de subpoblaciones linfocitarias se realizó en el Laboratorio de Inmunología del Hospital Virgen del Rocío mediante citometría de flujo con un equipo comercial (Cytomics FC 500, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). 3.12. Recogida y análisis de datos Los datos epidemiológicos, clínico-biológicos y microbiológicos se recogieron en un formato estandarizado. Todos los datos fueron traspasados a soporte magnético, mediante procedimientos operativos que contemplaron: - Doble introducción de información - Contraste automático de datos - Detección de valores atípicos - Rutinas de depuración lógica para detección de inconsistencias Los datos se introdujeron en una base de datos construida expresamente para este proyecto, garantizando mediante encriptación bajo código el cumplimiento de la normativa vigente sobre protección de datos de carácter personal (Ley Orgánica 15/1999). El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico SPSS versión 15.0. El archivo de datos se diseñó cumpliendo también las normas de confidencialidad y privacidad señaladas por la normativa vigente sobre protección de datos de carácter personal (Ley Orgánica 15/1999). Para el estudio descriptivo, las variables cuantitativas se expresaron como medidas de tendencia central (media ± desviación típica) y de dispersión, Página 104 de 210 y las variables cualitativas como frecuencias. Para el análisis bivariado, se utilizó la distribución chi-cuadrado, t de Student, el test de Anova o una correlación lineal según el tipo de variables a relacionar. Se realizó un análisis multivariante para evaluar la posible asociación entre las diferentes variables clínicobiológicas y la prevalencia de infección. Página 105 de 210 3.12. Aspectos éticos En el presente estudio se aplicaron los principios éticos recogidos en la última revisión de la declaración de Helsinki, así como los recogidos en el Convenio del Consejo de Europa relativo a los derechos humanos y la biomedicina, en la Declaración Universal de la UNESCO sobre el genoma humano y los derechos humanos. Se cumplieron todos los requisitos establecidos en la legislación española en el ámbito de la investigación biomédica, la protección de datos de carácter personal y la bioética. El presente estudio contó con la aprobación oficial del Comité de Ética de la Investigación del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla. La participación en el proyecto fue voluntaria y la solicitud de participación fue realizada como una propuesta de investigación en salud, independiente del proceso asistencial convencional del sistema sanitario. A cada participante se le informó por escrito de la naturaleza de la investigación y del uso de la información obtenida, así como de su derecho al acceso, modificación o eliminación de los registros en cualquier momento. Se garantizó la confidencialidad de sus datos, así como la utilización de los datos para los fines especificados del estudio. Además de la información verbal a los participantes, se solicitó un consentimiento informado por escrito (anexo 1). Los participantes recibieron un informe con los datos clínicos más relevantes hallados. En caso de observar valores alterados, se aconsejó en la misma carta consulta con su médico de atención primaria. Toda la información clínico-epidemiológica así como las muestras biológicas obtenidas fueron codificadas y separadas de los datos personales de los sujetos, encriptados y custodiados por la investigadora principal de este proyecto. Página 112 de 210 4.1.2. Sujetos no incluidos Entre los 28 sujetos que no participaron en el estudio (14,81%; IC95% 9,7-19,87), ocho eran adultos y 20 no, como se muestra en las tablas 10 y 12. Los adultos no incluidos fueron ocho sujetos (seis varones y dos mujeres), lo que representa el 5,48% de todos los adultos calculados para la muestra. Los sujetos no participantes estaban en la franja de edad comprendida entre 20 y 54 años. Las razones de su no inclusión fueron variadas: un sujeto no fue posible de localizar, cinco tenían jornada laboral incompatible con el horario de recogida de la muestra, un individuo estaban de vacaciones y uno se negó a participar. Los menores de 18 años no incluidos fueron 20 sujetos (11 varones y nueve mujeres), que constituyeron el 46,51% de todos los no adultos calculados para la muestra. Las razones de su no inclusión variaron según la franja de edad. En los niños de catorce años o menos, donde se hizo captación activa en el centro de salud, las razones fueron principalmente la negativa de los padres o tutores legales de los niños a participar en el estudio. Página 113 de 210 4.2. Prevalencia de colonización por Pneumocystis en la población general Todas las 169 muestras de lavado orofaríngeo (LOF) recogidas fueron aptas para su análisis y procesadas. Siguiendo nuestro algoritmo diagnóstico (Figura 8, tabla 8), 27 de las 169 muestras, o sea, un 15,98% (IC 95% 10,5-21,5) fueron positivas en la primera PCR anidada para el gen mtLSU rRNA (PCR1). A las 27 muestras positivas, se les realizó una segunda PCR anidada para el gen mt LSU rRNA (PCR2), así como una PCR “touchdown” para el gen de la DHPS (tabla 13). La PCR para el gen mtLSU rRNA fue nuevamente positiva en una segunda alícuota en 19 de estas 27 muestras, cumpliendo así uno de los criterios de positividad de nuestro estudio. Por otra parte, la PCR para el gen DHPS fue positiva en 15 de estas 27 muestras. Tres de estas 15 muestras habían resultado negativas en la PCR2 aunque cumplían el segundo criterio de positividad de nuestro estudio. Las restantes 12 muestras fueron positivas por las tres técnicas de PCR ensayadas (PCR1, PCR2 y PCR para el gen DHPS (tabla 13). De esta forma, considerando los criterios diagnósticos del estudio, 22 sujetos estaban colonizados (tabla 14), lo que representa una prevalencia global de colonización del 13,02% (IC 95% 7,95-18,09, p<0,05). Página 114 de 210 Tabla 13. Resultados de las técnicas de PCR en las muestras positivas en la primera PCR anidada del gen mtLSU rRNA Código de muestra PCR anidada gen mtLSU- rRNA primera alícuota (PCR 1) PCR anidada gen mtLSU- rRNA segunda alícuota (PCR 2) PCR gen DHPS primera alícuota Muestras con al menos PCR 1 y PCR 2 positivas CO-109 + + + CO-140 + + + CO-142 + + + CO-184 + + + CO-193 + + + CO-194 + + + C0-214 + + + CO-218 + + + CO-219 + + + CO-225 + + + CO-229 + + + CO-238 + + + CO-139 + + - CO-239 + + - CO-241 + + - CO-267 + + - CO-268 + + - CO-269 + + - CO-276 + + - Muestras con PCR 1 y PCR gen DHPS positivas CO-240 + - + CO-270 + - + CO-273 + - + Muestras con sólo PCR 1 positivas CO-115 + - - CO-149 + - - CO-230 + - - CO-251 + - - CO-257 + - - +, positivo; -, negativo Página 115 de 210 Figura 9. Resultado de las técnicas moleculares durante el flujo del algoritmo diagnóstico considerado en el estudio PCR del gen mtLSUrRNA Alícuota 1 PCR del gen mtLSUrRNA Alícuota 2 PCR del gen DHPS Positiva n=19 Negativa n=12 Negativa n=142 Positiva n=15 Negativa n=8 + - ++ -- Tabla 14. Resultados de las técnicas moleculares y clasificación final de la muestra según el algoritmo diagnóstico y los criterios de positividad del estudio. Técnicas moleculares PCR 1 PCR 2 DHPS Clasificación final de la muestra Número + + + Positiva 12 + + - Positiva 7 + - + Positiva 3 22 positivas + - - Negativa 5 - Negativa 142 147 negativas PCR 1, PCR anidada para el gen mtLSU rRNA en la primera alícuota; PCR 2, PCR anidada para el gen mtLSU rRNA en la segunda alícuota; PCR DHPS, PCR touchdown para el gen DHPS en la primera alícuota. Página 116 de 210 Controles de calidad de los criterios diagnósticos de colonización Siguiendo los controles de calidad previstos en el estudio, todas las muestras fueron analizadas por una segunda técnica de PCR (PCR a tiempo real; PCR-TR) para el gen mtLSU rRNA en las dos alícuotas disponibles. Los resultados se muestran en las tablas 15 y 16. Con los criterios diagnósticos de colonización considerados en nuestro estudio, 21 de las 22 (95,45%) muestras de sujetos colonizados por Pneumocystis resultaron también positivas en las dos alícuotas por PCR-TR. Por otra parte, 140 de las 147 (95,98%) muestras de individuos no colonizadas fueron también negativas utilizando PCR-TR (tabla 15). La concordancia global entre la clasificación de los sujetos según los criterios diagnósticos de colonización del estudio y los resultados de la PCR-TR utilizada como control de calidad fue del 95,98%. El índice Kappa resultante fue de 0,817 (I.C. 95% 0.65- 0.94), lo que representa una concordancia diagnóstica muy buena (índice de Kappa 0,6- 0,8 representa buena concordancia, 0,8 a 1 muy buena) (López de Ullibarri & Pita, 1999). Tabla 15. Control de calidad de los criterios diagnósticos de colonización utilizando PCR-TR PCR-TR Positivo Negativo Sí (n=22) 21 1 Colonización No (n=147) 7 140 PCR-TR, PCR-TR para el gen mtLSU rRNA Página 117 de 210 Tabla 16. Resultados de las diferentes técnicas diagnósticas del estudio y de los controles de calidad (PCR a tiempo real) en las muestras de los sujetos colonizados por Pneumocystis. Código PCR 1 PCR 2 PCR DHPS PCR-TR primera alícuota PCR-TR segunda alícuota CO-109 + + + + + CO-140 + + + + + CO-142 + + + + + CO-184 + + + + + CO-193 + + + + + CO-194 + + + + + C0-214 + + + + + CO-218 + + + + + CO-219 + + + + + CO-225 + + + + + CO-229 + + + + + CO-238 + + + + + CO-139 + + - + - CO-239 + + - + + CO-241 + + - + + CO-267 + + - + + CO-268 + + - + + CO-269 + + - + + CO-276 + + - + + CO-240 + - + + + CO-270 + - + + + CO-273 + - + + + +, positiva; -, negativa. PCR 1, PCR anidada para el gen mtLSU rRNA en la primera alícuota; PCR 2, PCR anidada para el gen mtLSU rRNA en la segunda alícuota; PCR DHPS, PCR touchdown para el gen DHPS en la primera alícuota; Q-PCR, PCR a tiempo real. Página 118 de 210 Concordancia diagnóstica entre PCR anidada y PCR a tiempo real Respecto a la concordancia entre las dos técnicas, PCR anidada y PCRTR, de las 19 muestras positivas en las dos PCR anidadas para el gen mtLSU rRNA, el 94,74% (18) resultaron positivas en la PCR-TR en las dos alícuotas. Por otra parte, de las 150 muestras negativas por PCR anidada, el 95,33% (143) resultó también negativo por PCR-TR en las dos alícuotas. Por tanto, la concordancia diagnóstica entre ambas técnicas fue del 95,27% (tabla 17), siendo el índice Kappa de 0,79 (I.C. 95% 0,65-0,93), lo que representa una buena concordancia entre ambas técnicas (López de Ullibarri & Pita, 1999). Tabla 17. Concordancia diagnóstica entre PCR anidada y PCR-TR PCR-TR Positivo Negativo Positivo 18 1 PCR anidada Negativo 7 143 PCR anidada, PCR anidada para el gen mtLSU rRNA; PCR-TR, PCR a tiempo real para el gen mtLSU rRNA Agregación familiar Entre los individuos colonizados, dos tenían familiares (cónyuges) que habían participado en el estudio. Los resultados de las muestras orofaríngeas de estos familiares fueron negativos para Pneumocystis. Página 119 de 210 4.3. Relación entre colonización por P. jirovecii y variables sociodemográficas, clínicas y biológicas Al analizar las características de los individuos incluidos en el estudio no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes colonizados y no colonizados para las diferentes variables demográficas, clínicas y biológicas analizadas (tablas 18, 19 y 21), excepto para los valores de hemoglobina, que fueron significativamente más elevados en los individuos colonizados (p= 0,037). En la tabla 22 se muestran las principales características demográficas y clínico-biológicas de los sujetos colonizados. A continuación se describen de forma pormenorizada los resultados para las diferentes variables analizadas. Variables sociodemográficas En la tabla 18 se representan las distintas variables sociodemográficas analizadas, así como su relación con la colonización por P. jirovecii. Asimismo, en la tabla 22 podemos encontrar las principales características de los sujetos colonizados. Sexo De las 169 muestras obtenidas, las 22 muestras positivas para P. jirovecii correspondían a 14 hombres y ocho mujeres. Por tanto, el 17,72% de los hombres y el 8,89% de las mujeres estudiadas estaban colonizados por Pneumocystis. Por el contrario, las 147 muestras negativas pertenecían a 65 hombres y 82 mujeres. Existe una tendencia a una mayor prevalencia de colonización entre los varones que no alcanzó significación estadística (17,72% de varones vs 8,89% de mujeres, p= 0,089, tal y como se representa en la figura 10. Página 120 de 210 Edad La edad media de los participantes en el estudio fue de 43,68 años, y la de los adultos participantes fue de 47,42, con un rango entre 18 y 89 (IC95% 44,39 - 50,45). No hubo diferencias significativas entre la edad de los participantes y la colonización por Pneumocystis (tabla 18). Todos los individuos colonizados fueron mayores de 18 años, encontrándose en el rango etario de 18 a 64 años el 81,81%. Entre los no colonizados, este porcentaje fue del 68,71%, siendo los menores de edad el 11,56% y los mayores de 65 el 19,73% (figura 11) Nivel de estudios Las distintas categorías de la variable se recodificaron en dos categorías (sin estudios o primarios, secundarios o universitarios) para obtener un número de individuos suficiente para el análisis estadístico. Entre los individuos colonizados, el 26,15% tenían estudios secundarios o universitarios, frente al 18,18% entre los no colonizados (p= 0,196, figura 12). No hubo diferencias significativas en cuanto al nivel de estudios, y la situación de colonización por P. jirovecii. Página 121 de 210 Tabla18. Variables sociodemográficas en los individuos participantes según colonización por P. jirovecii Colonización por P. jirovecii Variable Sí No p Hombre 17,72(14) 82,28 (65) Sexo1 Mujer 8,89(8) 91,11 (82) 0,089 Edad2 Total 42,05 ± 19,23 (22) 43,93± 21,64 (147) 0,093 Sin estudios o primarios 15,8 (18) 84,2 (96) Nivel de estudios Secundarios o universitarios 10,5 (4) 89,5 (34) 0,196 1 Variables cualitativas expresadas en porcentaje por filas (número); 2 Variables cuantitativas expresadas en media ± desviación típica (número) Figura 10. Distribución de la variable sexo en la población muestral según colonización por P. jirovecii. % Sexo 0 10 20 30 40 50 60 70 Hombres Mujeres No colonizados Colonizados Página 128 de 210 Tabla 21. Variables biológicas en los individuos participantes según colonización por P. jirovecii Colonización por P. jirovecii Variables Positiva Negativa Significación Hemoglobina (g/dl) 1 143,8±17,721 (15) 135,43±14,013 (114) 0,037 LDH (UI/l)1 386,43±55,17 (14) 360,45±70,65 (78) 0,195 Proteína C Reactiva positiva2 26,7 (15) 26,3 (124) 0,98 CD4 (cel/mm3) 1 908,62±469,64 (13) 895,94±339,91 (77) 0,91 CD8 (cel/mm3) 1 513,77±300,67 (13) 502,26±280,49 (77) 0,89 Neutrófilos (cel/mm3) 1 4149,3±2098,89 (15) 3935,04±1167,32 (115) 0,55 Linfocitos(cel/mm3) 1 2142,8±787,232 (15) 2242,73±796,41 (115) 0,65 Leucocitos(cel/mm3) 1 6980±2297,09 (15) 6778,7±1681,5 ( 115) 0,68 1Variables cuantitativas expresadas en media±desviación típica (número de sujetos); 2Variables cualitativas expresadas en proporción (número de sujetos); la Proteína C Reactiva se consideró positiva a partir de 5 mg/dl. LDH, láctico deshidrogenasa. Página 129 de 210 Figura 13. Distribución de los valores de hemoglobina según colonización por P. jirovecii Figura 14. Distribución de los valores de LDH según colonización por P. jirovecii Colonizados No colonizados Colonizado s No colonizados Página 131 de 210 Las características de los individuos colonizados se resumen en la tabla 22. Tabla 22. Perfil sociodemográfico, clínico y biológico de los pacientes colonizados por P. jirovecii Código Edad (años) Sexo Comorbilidad Tratamiento esteroideo Tabaquismo Hemoglobina (g/dl) Leucocitos (cél/mm3) Linfocitos (cél/mm3) CD4+ (cél/mm3) CD8 LDH (UI/l) CO-109 74 Mujer Trasfusión No No 130 6190 2642 1208 479 512,42 CO-139 79 Hombre Cáncer pulmón No Sí 96 6630 1800 693 378 956,71 CO-140 75 Hombre Trasfusión, AIT No No 152 5480 2200 484 1162 1132,23 CO-142 69 Hombre EPOC Sí Exfumador 150 12170 1100 499 127 2438,88 CO-184 19 Hombre No No No 163 5060 2400 536 662 944,03 CO-193 22 Mujer No No Sí ND ND ND ND ND ND CO-194 38 Hombre No No Sí 142 7260 2400 ND ND ND CO-214 24 Hombre No No Sí 152 7420 2000 ND ND ND CO-218 45 Hombre No No No 145 3670 1500 728 298 504,12 CO-219 53 Mujer No No No 150 5970 1900 1386 306 430,74 CO-225 55 Mujer HTA No No 127 5120 1700 677 457 756,28 CO-229 64 Hombre HTA, dislipemia No No 138 5950 1900 792 293 751,26 CO-238 34 Hombre HTA No No 139 8080 1300 549 362 1471,77 CO-239 24 Hombre No No No 158 5460 1900 814 378 670,76 CO-240 28 Hombre No No Sí 172 9770 3100 1383 957 706,44 CO-241 39 Hombre No No No 143 10470 4300 2063 820 507,51 CO-267 27 Hombre HTA, encefalopatía No No ND ND ND ND ND ND CO-268 29 Mujer No No No ND ND ND ND ND ND CO-269 28 Hombre No No No ND ND ND ND ND ND CO-270 37 Mujer HTA No No ND ND ND ND ND ND CO-273 36 Mujer No No Sí ND ND ND ND ND ND CO-276 26 Mujer Psoriasis Sí No ND ND ND ND ND ND ND, no disponible Página 132 de 210 4.4. Distribución de genotipos del patógeno y prevalencia de sujetos colonizados con mutaciones asociadas a la resistencia al cotrimoxazol. Siguiendo la metodología previamente descrita en todas las muestras positivas en la primera PCR anidada para el gen mtLSU-rRNA, se realizó una segunda PCR anidada del mismo gen en una extracción independiente de ADN, así como la amplificación del gen de la DHPS mediante un protocolo de touchdown PCR. Una vez identificadas las muestras que amplificaban para alguno de los dos genes (mtLSU-rRNA o DHPS), se procedió a su caracterización genotípica utilizando las técnicas previamente descritas. Locus mlLSU-rRNA Teniendo en cuenta que en nuestro algoritmo diagnóstico partía de las muestras positivas en la primera PCR anidada del locus mtLSU-rRNA (figura 8), este gen fue amplificado en las 22 muestras que resultaron positivas según los criterios diagnósticos del estudio. En 20 de estas 22 muestras positivas se obtuvo DNA suficiente para realizar una purificación satisfactoria que permitiera su posterior secuenciación. El genotipo más frecuente fue el 3 que se encontró en 18 de los 20 sujetos (90%), apareciendo el genotipo 1 en las dos muestras restantes (10%) (Tablas 23 y 24). Locus DHPS El gen DHPS pudo ser amplificado en 15 de las 22 muestras positivas. De las 15 muestras que amplificaron para este locus sólo 10 contenían ADN suficiente para realizar un estudio de RFLP satisfactorio. En 8 de estos 10 sujetos (80%) se identificó un genotipo 1 (wt/wt) o doble silvestre en las posiciones 55 y 57 y en los dos restantes (20%) cepas con genotipo 3 (wt/57) o con la mutación en el codon 57 asociada a resistencias al cotrimoxazol (tablas 23 y 25). Página 133 de 210 Tabla 23. Resultados del análisis molecular y tipificación de los locus mtLSU-rRNA y DHPS en las muestras de los sujetos colonizados por P. jirovecii PCR 1 PCR 2 PCR DHPS Genotipo mt LSU rRNA Genotipo DHPS 1 1 1 3 1 (wt/wt) 1 1 1 3 1 (wt/wt) 1 1 1 1 1 (wt/wt) 1 1 1 3 NT 1 1 1 3 1 (wt/wt) 1 1 1 3 NT 1 1 1 3 NT 1 1 1 3 1 (wt/wt) 1 1 1 3 3 (wt/57) 1 1 1 3 3 (wt/57) 1 1 1 3 NT 1 1 1 NT NT 1 1 0 3 1 1 0 3 1 1 0 3 1 1 0 1 1 1 0 3 1 1 0 3 1 1 0 3 1 0 1 3 1 (wt/wt) 1 0 1 NT 1 (wt/wt) 1 0 1 3 1 (wt/wt) PCR 1, PCR para el gen mtLSU-rRNA en la primera extracción de ADN; PCR 2, PCR para el gen mtLSU-rRNA en la segunda extracción de ADN; PCR DHPS, PCR touchdown para el gen DHPS en la segunda extracción de ADN; NT, no tipificable; 1(wt/wt), genotipo 1 (silvestre); 3(wt/57), genotipo 3 (silvestre en posición 55 y con la mutación en posición 57 asociada a resistencia a cotrimoxazol) Tabla 24. Genotipos del gen mtLSU rRNA Tabla 25. Genotipos en el gen DHPS Genotipo mtLSU rRNA n % Genotipo DHPS n % 1 2 10 1 (wt/wt) 8 80 3 18 90 3 (wt/57) 2 20 1(wt/wt), cepas silvestres; 3(wt/57), cepas con mutación en posición 57 asociada a resistencia a cotrimoxazol) Página 135 de 210 Epidemiología de la colonización por Pneumocystis en población general 5. DISCUSIÓN Página 137 de 210 5. DISCUSIÓN Pnemocystis jirovecii, conocido generalmente como agente causante de neumonía grave en individuos inmunocomprometidos, ha sido recientemente asociado con el desarrollo de infecciones asintomáticas en individuos que no presentan alteraciones en su sistema inmune (Peterson et al., 2005). Los resultados de este estudio de base poblacional permiten objetivar por primera vez la existencia de una elevada prevalencia de colonización por P. jirovecii en adultos inmunocompetentes en el entorno comunitario, concordante con la hipótesis de que la población general puede ser un importante reservorio y fuente de transmisión de esta infección. En el presente estudio no se ha encontrado asociación entre la presencia de colonización y las diferentes variables sociodemográficas, clínicas ni biológicas evaluadas, algunas de las cuales han sido previamente asociadas a un mayor riesgo de colonización (Tipirneni et al., 2009; Calderón et al., 2004; Maskell et al., 2003; Vargas et al., 2001), salvo con los niveles de hemoglobina, que son significativamente más elevados en los probandos colonizados. Por otra parte esta investigación ha permitido caracterizar la distribución de genotipos del patógeno en la población general de nuestro medio, que presenta un patrón diferente al observado en otros grupos poblacionales de sujetos inmunocompetentes (Tipirneni et al., 2009; Medrano et al., 2005; Maskell et al., 2003; Vargas et al., 2001). Asimismo, en el presente estudio se ha descrito por primera vez la presencia de mutaciones asociadas a resistencia a cotrimoxazol en población general; este hecho podría tener una importante relevancia epidemiológica si se demostrara su posible transmisión a sujetos inmunodeprimidos susceptibles de desarrollar PcP. Página 144 de 210 simple presencia de ADN de Pneumocystis no es necesariamente un indicador de que el patógeno es viable en la muestra analizada. Para resolver esta dificultad, se han descrito métodos basados en la amplificación del ARN mensajero del microorganismo (de Oliveira et al., 2007). Sin embargo, la identificación de ARN de Pneumocystis no se ha investigado en muestras de lavado orofaríngeo donde probablemente su sensibilidad sea baja por la poca carga parasitaria. Por este motivo no se ha plateado su utilización en nuestro estudio. Página 145 de 210 5.2. Prevalencia de colonización En las dos últimas décadas la aplicación de técnicas diagnósticas basadas en la amplificación por PCR de regiones específicas del genoma han permitido detectar ADN de Pneumocystis en muestras obtenidas por métodos no invasivos y en sujetos con baja carga de patógenos, lo que ha posibilitado el estudio de la colonización en sujetos no inmunodeprimidos. Sin embargo, los estudios realizados previamente en sujetos sanos y/o población general son escasos y sus resultados discrepantes. En la mayoría de ellos, sobre todo en los realizados inicialmente, no se encontró evidencia de colonización por el patógeno en muestras pulmonares de autopsias (Peters et al., 1992) o de secreciones respiratorias (Wakefield et al., 1990; Leigh et al., 1993; Vargas et al., 2003; Nevez et al., 2006). Así, en el primero de ellos, publicado en 1990, se utilizó una PCR simple y no se pudo detectar ADN de Pneumocystis en las muestras de lavado broncoalveolar de los diez sujetos sanos evaluados (Wakefield et al., 1990). En 1992, Peters et al. utilizando también PCR simple, tampoco pudieron encontrar ADN de Pneumocystis en las muestras pulmonares procedentes de la autopsias de 15 sujetos no inmunodeprimidos. En los otros estudios con resultados negativos se utilizó PCR anidada para analizar muestras de esputo inducido (20 sujetos de un grupo control, Leigh et al., 1993), esputo convencional (30 sujetos con recuento de células CD4+ y radiografía de tórax normales, Nevez et al., 2006) y aspirado nasofaríngeo (28 mujeres sanas, Vargas et al., 2003). En cualquier caso, todos los estudios anteriores incluyeron un bajo número de sujetos (Wakefield et al., 1990; Peters et al., 1992; Leigh et al., 1993; Vargas et al., 2003; Nevez et al., 2006). En algunos, la ausencia de colonización podría estar relacionada con la utilización de técnicas como la PCR simple (Wakefield et al., 1990; Peters et al., 1992; Leigh et al., 1993), menos sensible que la PCR anidada (Robberts et al., 2007) o con el uso de esputos o secreciones nasales que podrían contener un menor número de organismos que el lavado orofaríngeo (Leigh et al., 1993; Nevez et al., 2006; Vargas et al., 2003) Página 146 de 210 Sin embargo, existen otros estudios en los que sí se ha obtenido evidencia de colonización por el patógeno. En el primero de ellos se analizaron mediante PCR anidada muestras de lavado broncoalveolar (LBA) de 169 sujetos sin infección por VIH a los que se había realizado una broncoscopia diagnóstica. El patógeno fue identificado en el 19.5 % de los casos (Nevez et al., 1997), aunque como consecuencia del propio diseño del estudio, la población incluida estaba integrada por individuos con enfermedades respiratorias agudas o crónicas. Asimismo, se ha demostrado la presencia de colonización en profesionales sanitarios hospitalarios en estrecho contacto con pacientes con PcP (Vargas et al., 2000; Miller et al., 2001) o que trabajaban atendiendo a pacientes inmunodeprimidos o a niños con procesos médicos agudos (Durand-Joly et al., 2003) y, por tanto, presumiblemente expuestos al patógeno. Por otra parte, en un estudio piloto realizado en nuestro entorno y que representa la base que sustenta la hipótesis del presente proyecto de investigación, se analizaron muestras de lavado orofaríngeo mediante PCR anidada en un grupo algo mayor de sujetos sanos y se encontró una prevalencia del colonización del 20% (Medrano et al., 2005). En este estudio se evaluaron 50 profesionales sanos del Hospital Universitario Virgen del Rocío no expuestos al contacto directo con pacientes y que fueron incluidos de forma consecutiva en la Unidad de Riesgo Laboral del Hospital. Dicho estudio permitió por primera vez demostrar que el ADN del patógeno esta presente en el árbol respiratorio de sujetos sanos, hallazgo que ha sido confirmado por otros dos estudios realizados más recientemente en Chile (Ponce et al., 2010; Vargas et al., 2010). En el primero de ellos se estudiaron muestras pulmonares procedentes de autopsias de 77 individuos fallecidos fuera del hospital (accidentes de tráfico, homicidios, suicidios y causas no violentas), detectándose ADN del patógeno en un 64,9% de los casos (Ponce et al., 2010). En el segundo, realizado por el mismo grupo de trabajo, se encontró una prevalencia de colonización del 13% en ancianos (edad > 69 años) analizando 109 muestras de lavados orofaríngeos obtenidas en un centro de consultas externas (Vargas et al., 2010). Estos datos tan discordantes procedentes de una misma zona geografía plantean dudas sobre la validez de los mismos (Calderon, 2010). Página 147 de 210 Para poder situar adecuadamente estas cifras, habría que compararlas con la frecuencia de colonización observada en otros grupos poblacionales, como los pacientes inmunodeprimidos con y sin infección por VIH, así como los pacientes no inmunodeprimidos. Con respecto a la población infectada por VIH, la colonización por Pneumocystis es claramente constatable en este segmento de la población, aunque el rango varía según las características de estos individuos y el tipo de PCR utilizado. El amplio rango en las prevalencias puede ser debido tanto a las diferencias existentes en las poblaciones estudiadas como en los métodos de recolección de las diferentes muestras respiratorias, así como a la diferente sensibilidad de las distintas técnicas diagnósticas utilizadas (Calderon, 2009). La colonización también ocurre en pacientes inmunodeprimidos sin infección por VIH (Morris et al., 2008), con cifras que oscilan entre un 15,9% y el 55,8% (Nevez et al., 1999; Helweg-Larsen et al., 2002; Maskell et al., 2003; Vargas et al., 2003). Otros estudios sobre el fenómeno de colonización se han realizado en pacientes no inmunodeprimidos con diferentes enfermedades pulmonares. En nuestro medio utilizando técnicas de PCR anidada se ha encontrado una prevalencia de un 34% en pacientes con enfermedades intersticiales pulmonares (Vidal et al., 2006). En pacientes con fibrosis quística, la prevalencia utilizando PCR anidada osciló entre un 7,4 y un 22% (Sing et al., 2001; Respaldiza et al., 2005). En relación con la bronquitis crónica, en nuestro medio se encontró un 10% de prevalencia utilizando técnicas inmunohistoquímicas y de inmunofluorescencia (Calderón et al., 1996). Estos mismos autores, utilizando PCR anidada, encontraron un 41% de prevalencia en pacientes con las mismas características (Calderón et al., 2004). Otro estudio más reciente utilizando Página 148 de 210 también PCR anidada, encontró un 55% de individuos con EPOC colonizados (Calderón et al., 2007). Finalmente en un estudio realizado en pacientes con diversas alteraciones respiratorias en el que se utilizó PCR anidada, se describió una prevalencia de colonización en individuos con EPOC del 41% (Probst et al., 2000). En cuanto al cáncer de pulmón, un estudio realizado en diez pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas encontró que todos los pacientes presentaban ADN de Pneumocystis en el tejido pulmonar, frente a sólo dos de los diez pacientes con cáncer de pulmón diferente al de células pequeñas, y ningún paciente sin otra patología pulmonar subyacente (de la Horra et al., 2004). En el presente estudio, dado que se realizó en población general donde la prevalencia de inmunodepresión o enfermedades pulmonares es baja, no ha sido posible detectar una asociación entre dichas enfermedades y la presencia de colonización por Pneumocystis. En cuanto a la población infantil de nuestro estudio, una limitación de este estudio puede ser la escasa participación de los menores de 18 años, un 53,48%. Este comportamiento de la población no adulta, por otra parte, frecuente en estudios de tipo observacional, puede sesgar los resultados del presente trabajo, infraestimando los resultados de colonización por Pneumocystis en población no adulta, en relación con otros estudios de prevalencia en población infantil sana. Así, en un estudio previo de 233 niños españoles en esta misma área geográfica, se mostró una prevalencia global de seroconversión de un 73%. La prevalencia aumentaba con la edad desde un 52% a los 6 años hasta un 80% a los 13 años (Respaldiza et al., 2004). Aunque en este estudio no había datos de cuantos niños permanecían colonizados tras la exposición. Otro estudio similar, realizado en población infantil de Chile, encontró una prevalencia de seroconversión de un 32% en 74 niños de un mes de vida, permaneciendo positivos 4 de 17 niños en las muestras obtenidas dos o tres Página 149 de 210 meses después. Este estudio incluía niños que acudían a centros de salud pediátricos u hospitales para otros estudios serológicos. La seroconversión llegó al 85% en niños de 20 meses de edad (Vargas et al., 2001). Los estudios realizados en población infantil han puesto también de manifiesto la presencia de ADN de P. jirovecii asociado tanto a enfermedades pulmonares diversas, como al síndrome de muerte súbita del lactante (SMSL). Estos individuos son diferentes a los incluidos en el presente estudio, donde la mayoría de la población está sana. En niños sanos chilenos con infecciones respiratorias leves, se obtuvo un 32% de colonización de los aspirados nasofaríngeos estudiados (Vargas et al., 2001) Aunque esta prevalencia de colonización se detectó en el contexto clínico de una infección respiratoria leve, el hecho de que el 21% realizara una seroconversión sin antecedentes de síntomas respiratorios sugiere que la infección primaria puede ser también asintomática en niños (Morris et al., 2008). En niños franceses con bronquiolitis, la prevalencia encontrada fue de un 24% utilizando PCR anidada (Nevez et al., 2001). Otros estudios realizados en diferentes países también encuentran niveles similares de colonización (14 a 25%) en niños inmunocompetentes con enfermedades respiratorias agudas y crónicas (Kasolo et al., 2002; Totet et al.,2003; Larsen et al., 2007). Los estudios realizados en autopsias de niños muertos por SMSL sugieren una posible relación entre la colonización por Pneumocystis y el SMSL. Así, Vargas et al. encontraron que el 25% de los niños muertos por SMSL tenían ADN de Pneumocystis, frente al 2,9% de los niños que murieron por otras causas (Vargas et al., 1999). Sin embargo, este mismo grupo, en un estudio más reciente, encontró que la proporción de niños con Pneumocystis era similar si morían de SMSL o de otras causas (Vargas et al., 2007) Página 150 de 210 En otro estudio, la prevalencia mediante microscopía en las autopsias de niños muertos por SMSL en Chile y Reino Unido fue del 32% (Morgan et al., 2001). Utilizando PCR anidada, Vargas et al., notificaron una prevalencia de colonización del 52% en niños muertos en la comunidad, frente al 20% de los niños muertos en el hospital (Vargas et al., 2005). Otro estudio encontró que una prevalencia del 100% en 58 niños muertos tanto por SMSL como por otras causas, utilizando también PCR anidada (Beard et al., 2005). Las diferentes cifras encontradas pueden ser debidas a las diferentes técnicas de PCR utilizadas, variaciones geográficas así como las distintas características de los sujetos estudiados. Página 151 de 210 5.3. Factores asociados a la colonización En el presente estudio se analizó la posible asociación entre la presencia de colonización y diferentes variables sociodemográficas, clínicas y biológicas. Siguiendo un diseño metodológico sólido, en el estudio se utilizó un cuaderno de recogida de datos (CRD) estandarizado (anexo 1), donde se recopilaron las distintas variables utilizadas. Este hecho permitió una evaluación posterior exhaustiva y homogénea. Las variables sociodemográficas estudiadas fueron edad, sexo y nivel de estudios. En el análisis, se observa una mayor frecuencia de colonización entre los varones, aunque esa diferencia no llega a ser estadísticamente significativa (p=0,089). En este caso cabe plantearse si al aumentar el tamaño de la muestra, esta diferencia de sexos fuera más visible. El perfil de los hombres del municipio de El Coronil es diferente al de las mujeres en cuanto al consumo de tóxicos, sobre todo de tabaco, donde la población es eminentemente masculina. Este hecho dificulta la realización de una regresión logística multivariante utilizando la variable consumo de tabaco y sexo, al estar relacionadas las variables entre sí. Respecto a las variables clínicas, tampoco se ha encontrado una relación entre la colonización y distintas circunstancias que podrían predisponer a situaciones de inmunodeficiencia, como el consumo de tóxicos (tabaco y alcohol), la malnutrición, alteraciones en el metabolismo de la glucemia, o alteraciones en la función renal. Otras variables clínicas, también relacionadas con situaciones de inmunodepresión, no fueron analizadas estadísticamente al estar prácticamente ausentes en los individuos analizados (tabla 20). Esta constancia en los datos puede deberse a que el ámbito estudiado es poblacional, donde la tasa de prevalencia de estas situaciones de inmunodepresión es muy baja. Los factores de riesgo relacionados con la colonización por Pneumocystis descritos hasta ahora en la literatura han sido evaluados en su mayoría en pacientes infectados por el VIH. Entre las asociaciones encontradas están los Página 152 de 210 niveles de subpoblaciones linfocitarias CD4+<50 células/mm3, la ausencia de quimioprofilaxis con cotrimoxazol, el tabaquismo y la ciudad de residencia (Morris et al., 2008, Wissmann et al., 2010) Estos factores son difíciles de analizar en nuestra población de referencia, al ser la mayoría de los individuos inmunocompetentes y estar el estudio realizado dentro de la misma población. En cuanto a las variables biológicas analizadas, estudiamos las relacionadas con el sistema inmunitario y la respuesta inflamatoria. Utilizamos la variable LDH como marcador de daño alveolar inespecífico (aunque cuando no existe confirmación microbiológica los valores de LDH aumentados en presencia de una imagen radiográfica sugestiva pueden ser indicativos de PcP), y la variable PCR como marcador inflamatorio inespecífico. También analizamos las series eritrocitaria y leucocitaria, así como las poblaciones sublinfocitarias CD4+ y CD8+. En nuestro estudio se han observado unos valores de hemoglobina significativamente mayores en los individuos colonizados por P. jirovecii. La interpretación biológica de este hallazgo es difícil. Una posible explicación podría ser que los valores elevados de hemoglobina fueran marcadores de una situación de enfermedad pulmonar crónica no evidente. Es cierto que en las enfermedades respiratorias crónicas, y por tanto con mayor probabilidad de colonización por Pneumocystis, los valores de hemoglobina están aumentados por la eritropoyetina generada como consecuencia de los episodios de desaturación (Wedzicha et al., 1985). Sin embargo, en nuestra población de estudio no hay suficiente prevalencia de enfermedades pulmonares crónicas como para poder esclarecer este hecho. Se ha constatado que existe una relación entre gravedad de la EPOC y prevalencia de colonización por Pneumocystis, así como que la colonización en pacientes con EPOC está asociada con una respuesta sistémica inflamatoria incrementada (Morris et al., 2012; Calderón et al., 2007; Varela et al., 2003). De nuevo, dada la baja prevalencia de enfermedades respiratorias crónicas en nuestro estudio, no es posible confirmar este aspecto. Por tanto, cabe plantearse Página 153 de 210 si la elevación de los niveles de hemoglobina en los pacientes colonizados además de una significación estadistica tiene un significado clínico-biológico. Una de las limitaciones a la hora de analizar las diferentes variables estudiadas es el bajo número de individuos colonizados. Este hecho limita la potencia estadística de nuestro estudio para evaluar posibles variables asociadas a un mayor riesgo de colonización, así como no permite la realización de un análisis multivariante. Otro aspecto a la hora de analizar la prevalencia de Pneumocystis es la tendencia estacional de colonización, aspecto que no es posible abordar en nuestro trabajo, ya que se realizó durante el mes de julio. Artículos realizados en España y el Reino Unido sobre el predominio de PcP muestran una asociación entre los meses de invierno y la infección por Pneumocystis (Varela et al., 2004; Calderon et al., 2004b; Lubis et al., 2003), mientras que en otro estudio realizado en Alemania se describe una asociación inversa, donde el mayor número de PcP se observa en los meses de verano, sin relación con la lluvia o el viento (Sing et al., 2009). Por su parte, Miller et al. analizaron en el Reino Unido los distintos genotipos según predominio estacional, no encontrando ninguna relación entre estas dos variables (Miller et al., 2007).