Desarrollo del uso terapeútico de Piocinas tipo R en el tratamiento de infecciones por Pseudomonas aeruginosa multirresistente

Departamento de Microbiología Facultad de Medicina UNIVERSIDAD DE SEVILLA TESIS DOCTORAL Desarrollo del uso terapeútico de Piocinas tipo R en el tratamiento de infecciones por Pseudomonas aeruginosa multirresistente María del Mar Redero Cascón Sevilla, 2020 El Prof. Dr. Jesús Blázquez Gómez, investigador principal del Grupo de Estrés y Evolución Bacteriana en el Centro Nacional de Biotecnología (CNB) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC); la Dra. Ana Isabel Prieto Márquez, contrato Sara Borrell de la Universidad de Sevilla y el Prof. Dr. Javier Aznar Martín, Jefe de Servicio del Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla y Catedrático del Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla, CERTIFICAN: Que la Tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla y que lleva por título “Desarrollo del uso terapeútico de Piocinas tipo R en el tratamiento de infecciones por Pseudomonas aeruginosa multirresistente” ha sido realizada por Dª María del Mar Redero Cascón bajo su supervisión, considerando que reúne los requisitos necesarios para su presentación. Sevilla, Septiembre 2020 Fdo. Jesús Blázquez Gómez Fdo. Ana Isabel Prieto Márquez Fdo. Javier Aznar Martín A mi padre, Paco me miro en tus ojos, me miro en ti Agradecimientos Como un capítulo igual de necesario, es el agradecimiento y el reconocimiento de todas las personas que de una manera u otra han hecho posible que por fin, emocionada, esté escribiendo estas ansiadas palabras. Jesús Blázquez, gracias por dejarme formar parte de tu grupo e iniciarme en la investigación, exprimiendo el tiempo y aprendiendo de todos vosotros en los huecos que me dejaba mi ajetreada residencia en Microbiología. Sé que no fue fácil, por lo que Gracias. Anabel Prieto, gracias y mil gracias por enseñarme todo lo que sé técnicamente, por no abandonar nunca mi barco, por apostar por este proyecto, que al final se convirtió en una lucha personal que había que acabar. Gracias por corregir mis manías (o intentarlo concienzudamente), gracias por los consejos y las charlas sobre la vida, porque cuando te enfrascas en esta tarea, se puede perder la noción de muchas cosas. Javier Aznar, gracias por recuperar este proyecto en tiempos difíciles. Gracias por el soporte que nos proporcionaste. Sin duda, esta tesis no hubiera acabado sin tu ayuda. Gracias a todas las personas, del ámbito sanitario y demás amigos, por ayudarme e interesaros sinceramente por mi tesis, por animarme a acabarla, por ahogar mis penas en los momentos duros, profesionales y personales, por asentir y hacer como que entendíais mi tesis cuando, enérgicamente, os la intentaba explicar, y por soportar mis momentos de histeria y enajenación mental, siempre con una cariñosa sonrisa. Jose, mi alma gemela, el ánimo y la sonrisa personificados. Gracias por acompañarme todos estos años de locura, pero apasionantes como los que más. Has experimentado parte de esta tesis, con sus altos y bajos, éxitos y fracasos, disfrutando y sufriendo como si fueran propios. Gracias por recibirme todos los días con tu inmenso cariño. 2 Abreviaturas ADN: ácido desoxirribonucléico AG O: antígeno O AZT: aztreonam AZM: azitromicina BLEE: Betalactamasa de Espectro Extendido CAZ: ceftazidima CIP: ciprofloxacino CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute CMI: Concentración Mínima Inhibitoria COL: colistina CTX: cefotaxima EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing FDA: administración de alimentos y medicamentos (del inglés Food and Drugs Administration) FEP: cefepima FQ: Fibrosis Quística GEN: gentamicina IP: imipenem LB: caldo Lysogeny Broth LBA: Agar Lysogeny Broth LPS: lipopolisacárido MBL: metalobetalactamasa MDR: multiresistente (del inglés Multi-Drug-Resistant) MER: meropenem MH: caldo Mueller Hinton MHA: agar Mueller Hinton MIT C: mitomicina C 3 Abreviaturas MYSTIC: Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection NAVM: Neumonía Asociada a Ventilación Mecánica NCF: Normas de Correcta Fabricación ORF: marco de lectura abierta (Open Reading Frame) PBS: Tampón Fosfato Salino PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa PP/TZ: piperacilina tazobactam PTLB: bacteriocinas como colas de fagos (del inglés Phague-Tail Like Bacteriocins) R-PIOCINAS: piocinas tipo R rpm: revoluciones por minuto SCV: colonias enanas o puntiformes (del ingés Small Colony Variants) TOB: tobramicina UCI: Unidad de Cuidados Intensivos UFC: Unidad Formadoras de Colonias XDR: extensivamente resistente (del inglés Extensively-Drug-Resistant) 4 CAPÍTULO II INTRODUCCIÓN 5 6 Introducción 1. Sobre Pseudomonas aeruginosa 1.1. Generalidades Los primeros indicios acerca de Pseudomonas aeruginosa se remontan a 1850, cuando Sédillot fue el primero en sospechar la presencia de un agente transferible en las heridas quirúrgicas, debido a la coloración azul-verdosa que adquirían las vendas y gasas. Pseudomonas aeruginosa no se consiguió aislar en cultivo puro hasta 1882, en Francia, cuando Carle Gessard (químico y bacteriólogo de París) publicó un artículo titulado “On the Blue and Green Coloration of Bandages” refiriéndose al crecimiento de este microorganismo en heridas cutáneas de dos pacientes que presentaban una secreción purulenta verde-azulada. En 1916, Freeman publicó de forma detallada los mecanismos mediante los cuales P. aeruginosa era capaz de invadir el cuerpo humano, ocasionando una infección aguda o crónica 1. P. aeruginosa es un bacilo Gram-negativo incluido en la clase Gamma Proteobacteria, orden Pseudomonadales y familia Pseudomonadaceae, es no fermentador y no formador de esporas. Mide entre 1,5 y 5 μm de longitud y 0,5-1 μm de ancho, es recto o ligeramente curvado. Posee un flagelo polar lo que le confiere movilidad. A pesar de poseer un metabolismo aerobio estricto, es capaz de utilizar nitratos como aceptor final de electrones en condiciones de anaerobiosis. Es oxidasa y catalasa positivo y no fermentador de glucosa. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37°C, aunque a diferencia de otras especies del mismo género ésta es capaz de crecer hasta 42°C. Gracias a su gran genoma (6,3 Mpb), P. aeruginosa dispone de una gran proporción de genes implicados en la regulación metabólica (más del 9,4%), lo cual caracteriza a microorganismos capaces de sobrevivir en ambientes muy diversos 2. P. aeruginosa es capaz de producir diversos pigmentos hidrosolubles como la pioverdina, de color verde-amarillento característico, cuya función biológica es actuar como sideróforo captando hierro. Otro pigmento sintetizado por este microorganismo es la piocianina, de color verde azulado, considerado una toxina de P. aeruginosa, capaz de reducir u oxidar otros compuestos y generar especies reactivas del oxígeno. 7 Introducción Otros pigmentos menos frecuentes son la piomelanina (marrón), y la piorrubina (rojo) 2. Es un microorganismo ubicuo, capaz de persistir o incluso colonizar multitud de nichos ecológicos ambientales, así como también seres vivos, incluyendo plantas, animales y al hombre. En adultos sanos, se ha aislado en garganta, piel, mucosa nasal y mucosa intestinal. Es precisamente esa capacidad de sobrevivir en medios mínimos y la habilidad de tolerar gran variedad de condiciones físicas y químicas, lo que permite a P. aeruginosa persistir exitosamente tanto en la comunidad como en el ambiente hospitalario. En el hospital es frecuente aislar dicho microorganismo en antisépticos, jabones, equipos de respiración asistida, conductos de aire, colirios, etc 3. Fuera de él, lo podemos encontrar en reservorios comunitarios como piscinas e hidromasajes, humidificadores, soluciones para lentes de contacto, en plantas, rizosfera y suelo 3–5. 1.2. Importancia clínica P. aeruginosa es un patógeno humano que aprovecha el estado de inmunosupresión del huésped como una oportunidad para causar un amplio abanico de infecciones agudas y crónicas. La mayoría de infecciones adquiridas en la comunidad suelen ser leves y siempre condicionadas por el estado inmunológico del paciente, como otitis externa frecuentemente relacionada con el agua de las piscinas, foliculitis, conjuntivitis frecuentemente asociada al uso de lentes de contacto, queratitis, y algunas otras formas de infección ocular que pueden evolucionar desfavorablemente en muy poco tiempo y pueden conllevar la pérdida de visión, como en el caso de la endoftalmitis 6. Sin embargo, las infecciones graves y con peor curso tienen un origen nosocomial, cobrando especial relevancia en UCI y en unidades de críticos oncohematológicos, las cuales conllevan una alta mortalidad. Los largos periodos de estancia hospitalaria, la gravedad de los pacientes y la exposición a procedimientos invasivos, así como los factores de virulencia y la alta resistencia a antibióticos de este microorganismo están asociados a la adquisición de infecciones por P. aeruginosa 7. 8 Introducción La tasa de colonización hospitalaria puede llegar hasta el 50%. Es causante del 20-30% de las neumonías asociadas a ventilación mecánica 8, 10-20% de infecciones del tracto urinario y del 3-10% de bacteriemias 9. En la Tabla 1 se resumen las principales infecciones causadas por P. aeruginosa y los factores de riesgo relacionados. 1.3. Infecciones respiratorias Es imprescindible destacar el papel que comporta P. aeruginosa en las infecciones respiratorias. Dentro de las infecciones agudas, es uno de los principales responsables de la neumonía asociada a ventilación mecánica (NAVM) tardía. La presencia de lesiones secundarias a la intubación traqueal, ventilación mecánica, o traumatismos por la aspiración de secreciones, junto a la posibilidad de P. aeruginosa de crecer en forma de biofilm en la superficie del tubo endotraqueal, son los factores principales que favorecerán la colonización y la posterior infección. Las NAVM por P. aeruginosa pueden llegar a tener una tasa de mortalidad de hasta el 50 % entre los pacientes afectados 11. Tabla 1. Principales infecciones causadas por P. aeruginosa y factores de riesgo relacionados 10. Infección Factores de riesgo Tejidos blando Quemaduras, heridas abiertas, herida quirúrgica Tracto urinario Uso de catéter urinario Bacteriemia Inmunosupresión Pie diabético Diabetes, circulación microvascular deteriorada Neumonía Edad avanzada, EPOC, FQ, ventilación mecánica Otitis externa/media Daño en tejido, acumulación de agua Queratitis Usuarios de lentes de contacto 9 Introducción Si no se erradica durante la fase de infección aguda, puede adaptarse al ambiente pulmonar causando infección crónica. La infección respiratoria crónica por P. aeruginosa es una de los principales impulsores de la morbilidad y la mortalidad en pacientes con fibrosis quística (FQ), bronquiectasias o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La microbiota del tracto respiratorio de este tipo de pacientes representa un complejo ecosistema donde coexisten varias especies, siendo P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae y las especies pertenecientes al complejo Burkholderia cepacia, las más relevantes 12. De los pacientes con FQ un 80% de ellos en la pubertad ya resultan infectados de forma crónica por P. aeruginosa 13. Tradicionalmente, la colonización inicial se considera producida por cepas únicas adquiridas a partir de fuentes ambientales que sufren una extensa adaptación dentro de los pulmones del paciente, que conduce a infecciones persistentes con poca transmisión de paciente a paciente. El establecimiento de las estructuras características de biofilms y la adquisición de una gran cantidad de mutaciones adaptativas son los principales responsables de la persistencia de estas infecciones a pesar de la extensa terapia antimicrobiana 12. 1.3.1. Desarrollo de mecanismos adaptativos Algunos de estos mecanismos adaptativos más importantes son:  Fenotipo mucoide: asociado a la hiperproducción del exopolisacárido alginato. El cambio de un fenotipo no mucoso hacia un fenotipo mucoso debe relacionarse con un empeoramiento de la función pulmonar 14,15.  Fenotipo hipermutador: este tipo de variante se caracteriza por sufrir un aumento de la tasa de mutación espontánea, debido a mutaciones en los genes que codifican para el sistema de reparación de emparejamientos erróneos (mismatch repair system) del ADN tras su replicación. El fenotipo hipermutador presenta ventajas evolutivas en nichos ecológicos cambiantes, es la clave para la adaptación y la persistencia a largo plazo 16, así como para el desarrollo de resistencias a prácticamente todos los antimicrobianos conocidos 17. 10 Introducción  Variantes defectivas en el sistema quorum sensing: el quorum sensing es un sistema de estímulo-respuesta relacionado con la densidad poblacional. En bacterias coordina la expresión de ciertos genes según la densidad poblacional local. La variante defectiva en este sistema de comunicación es un fenotipo frecuente en aislados de FQ, y se cree que forma parte del proceso adaptativo de P. aeruginosa en las infecciones crónicas 18. La presencia de mutantes defectivos en este sistema indica que el quorum sensing deja de ser un elemento indispensable para el mantenimiento de la infección crónica, especialmente en las fases más avanzadas de la enfermedad 19.  Fenotipos resistentes a múltiples antibióticos: durante el curso de la enfermedad respiratoria crónica y sus exacerbaciones se administran múltiples antibióticos en combinación con el fin de erradicar o disminuir la población bacteriana que coloniza las vías respiratorias del paciente. Así es muy frecuente que los aislados provenientes de estos individuos presenten multirresistencia a los antimicrobianos utilizados en esta patología.  Crecimiento en forma de biofilms. 1.3.2. Formación de biofilms Como se ha descrito anteriormente, P.aeruginosa posee múltiples mecanismos para evadir la respuesta del huésped y causar un amplio abanico de infecciones. Uno de ellos es la formación del biofilm. Los biofilms son comunidades bacterianas organizadas, embebidas en una matriz extracelular polimérica asociada a una superficie vital o inerte. Están presentes en el 65-80% de las infecciones microbianas y representan una estrategia de adaptación para la supervivencia de los microorganismos en ambientes hostiles, entre los que se encuentra el ser humano 20. La matriz extracelular que envuelve el biofilm constituye el 85% del total de la biomasa y está formada fundamentalmente por exopolisacáridos, ADN extracelular, productos derivados de la lisis bacteriana y polipéptidos que forman un entramado altamente hidratado, que aporta estabilidad frente a fuerzas mecánicas y dificulta la entrada de antibióticos y de moléculas del 11 Introducción 2. Sobre la Fagoterapia 2.1. Bacteriófagos Los bacteriófagos, a menudo abreviados como fagos, son virus que infectan bacterias y son las entidades más abundantes en la Tierra. 1031 partículas se distribuyen en nuestro planeta en todos los ecosistemas 51. Los fagos se clasifican según su morfología en fagos filamentosos y fagos icosaédricos 52: Los fagos filamentosos se caracterizan por tener una hélice filamentosa. Los fagos icosaédricos se llaman así por la forma de su cabeza. Pueden ser de cola (96% de todos fagos) o sin cola. El Fago T4, perteneciente a La familia Myoviridae es un fago icosaédrico de cola cuya estructura ha sido estudiado en gran detalle. A continuación se explica brevemente la morfología de dicho fago, ya que posteriormente nos servirá para comprender mejor la estructura de las piocinas tipo R. El fago T4 poseé una cabeza icosaédrica con una cápside que encierra el ADN. La cabeza está unida a la placa de la base por una cola que consiste en una vaina helicoidal que cubre un tubo a través del cual el material genético se desliza durante la infección. Las fibras de la cola, conectadas a la placa base hexagonal, son necesarias para el reconocimiento de la bacteria huésped. Tras el reconocimiento, estas se unen irreversiblemente a la superficie de la célula asegurando la conexión. Después, el tubo de la cola penetra en la célula, y con la ayuda de enzimas hidrolíticas, inyecta el genoma viral 52,53. Tras la infección, los fagos pueden seguir el ciclo lítico o el ciclo lisogénico que conducen a diferentes resultados en el proceso infeccioso. En función de estos ciclos Figura 4. Imagen de microscopía de iones de helio de fagos T4 (verde) unidos a superficies bacterianas (azul). (Figura tomada de 53) 18 Introducción de replicación, los bacteriófagos se clasifican como virulentos por medio de la vía lítica, o atemperados, los cuales una vez han infectado la célula pueden seguir en ciclo lítico o lisogénico. En el ciclo lítico, el fago utiliza la maquinaria metabólica bacteriana para producir proteínas virales y copiar el genoma viral, sintetizando nuevos fagos inmediatamente seguida de una lisis celular, liberando la progenie. Mientras que el ciclo lisogénico implica la integración del genoma viral en el ADN bacteriano, lo que se conoce como profago. De esta manera, el genoma del profago permanece en un estado quiescente. Cada vez que una célula divide, replica el ADN del fago junto con el propio y traslada las copias a las células hijas. La propagación pasiva de los profagos puede ser desplazada hacia un ciclo lítico, bajo determinadas circunstancias, como el estrés, condiciones ambientales específicas o la presencia de algunos antibióticos; derivando finalmente en la lisis celular 52. 2.2. Necesidad de terapias alternativas Poco después del descubrimiento de la penicilina y el comienzo del uso generalizado de antibióticos por parte de la medicina occidental en la década de 1940, el propio Fleming advirtió que el mal uso de estos medicamentos pueden dar lugar a bacterias resistentes a los antibióticos. Sin embargo, el descubrimiento y el desarrollo de nuevos antibióticos floreció durante muchas décadas 54. A finales del siglo XX, el descubrimiento de antibióticos se desaceleró, y el alarmante aumento en las tasas de resistencia a los antibióticos señalaron que la edad de oro de los antibióticos, tal vez había terminado. De hecho, aparte de tres nuevas clases de antibióticos descubiertas entre 2005 y 2018, no se han desarrollado nuevas clases de antibióticos desde la década de 1980 55–57. El mecanismo de acción similar entre estos nuevos antibióticos ha llevado a la evolución potencial de resistencia cruzada en las bacterias. Mientras que las modificaciones sintéticas a algunos antibióticos preexistentes han extendido temporalmente su utilidad clínica 58, este enfoque también ha seleccionado 19 Introducción mecanismos de resistencia más amplios, como las betalactamasas de espectro extendido 59, cambios adaptativos que han evolucionado más fácilmente en comparación con la aparición de mecanismos de resistencia de novo. En 2017, la Organización Mundial de la Salud (OMS) destacó la amenaza particular de patógenos gramnegativos resistentes a múltiples antibióticos. Es por tanto imprescindible el descubrimiento, diseño y desarrollo de nuevas terapias antibacterianas alternativas. La capacidad de los bacteriófagos de lisar a sus bacterias hospedadoras, su amplia distribución y su elevada especificidad hicieron que estas entidades biológicas fueran propuestas desde un principio como herramientas de control de la población bacteriana. 2.3. Historia de la fagoterapia La historia de los bacteriófagos comienza con el descubrimiento de los mismos durante la segunda década del siglo pasado (Twort, 1915; D´Herelle, 1917). Las primeras observaciones sobre la existencia de los mismos provienen del científico alemán Ernest Hankin quien informó acerca de una actividad antimicrobiana sobre Vibrio cholerae en el año 1896. Dos años después, Nikolay Fyodorovich Gamaleya observó el mismo fenómeno en Bacillus subtilis. Estos investigadores, sin embargo, no pudieron explicar la naturaleza del agente causante de esta actividad. En el año 1915 en Londres, Frederick Twort 60 estableció la hipótesis de que esa actividad bactericida podía ser debida a un virus y en 1917 en el Institut Pasteur en París, el microbiólogo francocanadiense Félix D´Herelle demostró que la actividad antimicrobiana era producida por virus capaz de infectar bacterias 61. El propio D´Herelle propuso el término bacteriófagos [del griego griego phagein = comer] para designarlos, nombre con el que se los conoce hasta la actualidad. 20 Introducción D’Hérelle aplicó los fagos por primera vez en 1919 en el Hospital infantil Infants Malades en París, en pacientes con disentería tóxica mediante la administración oral. En Alejandría, Egipto, d’Herelle trató cuatro pacientes con peste bubónica inyectando fagos directamente en los nodos linfáticos infectados. Los cuatro pacientes se recuperaron. Este fue un éxito notable y ampliamente divulgado en revistas médicas. Durante una epidemia de cólera en la India en 1927, d’Herelle trató a pacientes con fagos, reduciendo la tasa de mortalidad del 63% de los pacientes no tratados al 8% de los pacientes tratados con fagos62. Félix d'Herelle colaboró con un científico georgiano, Georgi Eliava en los primeros trabajos del Instituto Pasteur y continuó desarrollándolos junto a él en Tbilisi, Georgia. Los dos finalmente fundaron la IBMV (Instituto de Microbiología y virología de bacteriófagos) en 1933 en Tbilisi, que fue explotado posteriormente por sus seguidores para ser el mayor centro de investigación y producción de fagos del mundo. A pesar del entusiasmo de los resultados de estos primeros años, ya en 1934 comenzaron las primeras críticas. El escaso conocimiento de la biología de los fagos, la falta de resultados concluyentes, el descubrimiento de los antibióticos como la penicilina y su masiva utilización en la Segunda Guerra Mundial, hicieron que tanto en Europa occidental como en EE.UU, se abandonara progresivamente esta estrategia. En cambio se mantuvo en Europa Oriental, especialmente en el Instituto Eliava de Tiflis (Georgia), donde siguieron desarrollando técnicas para la obtención, purificación y selección de bacteriófagos utilizados contra una variedad de infecciones bacterianas. Los casos de pacientes durante décadas anteriores han sido documentados recientemente. Particularmente durante la Segunda Guerra Mundial, se produjeron y se utilizaron grandes volúmenes de fagos. El Instituto se convirtió en Figura 5. Frederick Twort (arriba), Félix D Herelle (centro), Georgi Eliava (abajo). 21 Introducción una rama del Ministerio de Salud soviético, y en la década de 1980, 1000 empleados estaban produciendo más de una tonelada de fagos a la semana. El 80% se destinó a los militares soviéticos, principalmente para combatir la disentería ampliamente presente. Con la ruptura de la antigua Unión Soviética, el centro de producción gigante fue privatizado. Aún así, dicho instituto ha mantenido su investigación y desarrollo hasta hoy, con una reputación internacional incuestionable 63. Se han documentado casos de pacientes durante décadas hasta ahora 64, incluyendo un estudio de casos bilateral georgiano-alemán 65,66. Sin embargo, todavía no se han realizado ensayos clínicos de acuerdo con los estándares occidentales. También en Wroclaw, Polonia, hay un centro de renombre para la investigación en terapia de fagos personalizada. Los científicos polacos dirigidos por A. Górski (Instituto Ludwik Hirszfeld de Inmunología y Terapia Experimental) investigan la respuesta inmune producida por la fagoterapia. En un estudio realizado de 2008 a 2010 con 153 pacientes, no pudieron describir una respuesta inmune no deseada; concluyendo que la eficacia de los fagos parece independiente de la respuesta inmune 67–69. Se comenzaron aplicando principalmente cócteles de fagos elaborados por Eliava BioPreparations LTD, para aumentar la probabilidad de combatir diversas infecciones bacterianas. El gobierno de la República de Georgia aprobó estos cócteles, los cuales han evolucionado desde la década de 1930: Intestiphage®, dirigidos a Salmonella, Shigella, E. coli, Proteus, Pseudomonas, Enterococcus y Staphylococcus procedentes de infecciones intestinales y Pyophage® para infecciones del lecho quirúrgico, contra Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, E. coli y Proteus. Actualmente ambos productos son probados y actualizados cada seis meses, y están ampliamente distribuidos en las farmacias georgianas. 22 Introducción Con la ayuda de Europa, actualmente están aplicando las Normas de Correcta Fabricación (NCF) (en inglés, Good Manufacturing Practice GMP) vigentes en países occidentales. Se puede decir que a partir de estos ensayos la utilización de fagos (o de sus productos) está viviendo una época de renovado interés científico y de gran esperanza para el tratamiento de ciertas infecciones recalcitrantes. 2.4. Panorama actual de la fagoterapia La fagoterapia en los últimos años ha tenido una serie de importantes problemas. Así, debido a un escaso interés por parte de la industria farmacéutica no existen preparaciones comerciales de fagos en Europa o EEUU para uso humano. Por otro lado, las autoridades sanitarias mundiales no han previsto que la fagoterapia pudiera beneficiar a los pacientes y no se han elaborado guías sobre producción, calidad y seguridad de los mismos. El comportamiento de los fagos, al ser elementos infecciosos bacterianos, los hace biológicamente distintos de otras preparaciones farmacéuticas, aunque podrían regularse siguiendo las directrices de las vacunas víricas atenuadas 70,71. A pesar de ello, existen preparados de fagos que son utilizados en la industria alimentaria para la eliminación de las principales bacterias enteropátogenas y que están aprobados por la FDA como elementos “considerados generalmente como seguros” 72. Desde el año 2000, en Europa se han descrito varios ensayos clínicos. Especialmente en Bélgica y Francia se han utilizado fagos en casos únicos de Figura 6. Intestiphage® y Pyophage®. Cócteles de fagos elaborados por Eliava BioPreparations LTD 23 Introducción infecciones potencialmente mortales según la Declaración de Helsinki, art. 37. Un ejemplo es el caso de un paciente con sepsis de origen renal 73. Hasta 2005 no se realizó un estudio sobre la seguridad humana en la administración de preparaciones de fagos. En el trabajo de Bruttin y cols. 74 los sujetos recibieron por vía oral el fago T4 en el agua de bebida. No se detectaron efectos adversos asociados a la ingesta. Este dato favoreció el inicio en Europa occidental de los primeros ensayos para el tratamiento de las otitis causadas por Pseudomonas aeruginosa. Los resultados mostraron un 50% de disminución de los síntomas comparado con el 20% de los no tratados. Del mismo modo los pacientes tratados con fagos redujeron la carga bacteriana en un 80% mientras que los no tratados permanecieron igual a las 3 semanas del análisis 74,75. También los estudios realizados en modelos animales han mostrado unos resultados muy esperanzadores. Varios fagos han sido capaces de eliminar Escherichia coli multirresistentes del intestino murino 76,77 y han obtenido un porcentaje de supervivencia del 100% frente a sepsis por P. aeruginosa resistente a imipenem 78. Sin embargo la mayoría de estudios en animales se han realizado bajo condiciones experimentales totalmente diferentes y no siempre comparables. A pesar de ello, y de forma global estos estudios demuestran la importancia del momento y de la vía de administración de estos fagos. De modo que su eficiencia disminuye a medida que se retrasa su administración y que la vía tópica o local parece obtener más eficacia que la oral 78,79. Como se ha mencionado anteriormente, la formación de biofilms durante la infección bacteriana es uno de los principales problemas en el control de las mismas. Las bacterias en los biofilms son extremadamente resistentes a los antibióticos, están protegidas de las defensas del huésped y acaban convirtiéndose en infecciones crónicas 80. Algunos fagos son capaces de penetrar estos biofilms y podrían suplementar al tratamiento antibiótico convencional. Algunos autores han comprobado como una mezcla de diferentes fagos frente a Clostridium difficile reducen significativamente los biofilms y previenen la colonización bacteriana de los mismos 81. También se ha observado una disminución significativa en la formación de 24 Introducción biofilms por parte de Proteus mirabilis en las infecciones asociadas a catéter urinario 70,77,80. La sencillez del genoma de los fagos permite realizar innumerables alteraciones mediante ingeniería genética. Así se han modificado para que al utilizarlos conjuntamente con un antibiótico se incremente su actividad bactericida 71. También su modificación genética ha permitido disminuir el desarrollo de resistencias bacterianas a ciertos antibióticos; la administración de fagos con genes de resistencia dominantes determina una disminución de la resistencia en las bacterias receptoras 71. Recientemente se han elaborado fagos genéticamente modificados que incluyen el sistema de edición génica CRISPRCas9 para que detecten los genes bacterianos de resistencia y los inactiven 71. En 2006 la FDA aprobó un ensayo clínico en Fase I con 42 pacientes con úlceras cutáneas para evaluar la seguridad de ocho combinaciones de fagos capaces de lisar a Staphylococcus aureus, P. aeruginosa y E. coli; se obtuvieron unos resultados excelentes tanto en la seguridad como en la eficacia terapéutica (clinicaltrials.gov NCT00663091) 82. Tres años más tarde se realizó otro estudio sobre la seguridad, tolerabilidad y eficacia de la administración oral del fago T4 en el tratamiento de la diarrea toxigénica por E. coli en niños; los resultados mostraron ser una alternativa a la terapia antibiótica especialmente en los países en vías de desarrollo sin modificaciones sobre la flora intestinal de los pacientes (clinicaltrials.gov NCT00937274) 82. En 2013 se puso en marcha el estudio "Phagoburn", auspiciado por la Comisión Europea bajo el 7° programa de investigación y desarrollo, destinado a evaluar el uso tópico de cócteles de fagos en las quemaduras infectadas por E. coli y P. aeruginosa. Además servirá para establecer las guías de utilización de esta nueva terapia en infecciones cutáneas (clinicaltrials.gov NCT0216010) 82. En septiembre del 2017 en Alemania se lanzó ‘‘Phage4Cure’’ financiado completamente por el gobierno alemán, para demostrar la seguridad de preparaciones de fagos altamente purificados y finalmente reducir la infección crónica de P. aeruginosa en pacientes con fibrosis quística o bronquiectasias, mediante la inhalación de fagos. El ensayo clínico se realizará en el Charité University Hospital, Berlín (http://phage4cure.de/en/). Este ensayo clínico se utilizará para establecer las NCF de purificación para futuras preparaciones de fagos en Alemania. 25 Introducción AmpliPhi Biosciences Corporation (http://www.ampliphibio.com) ha lanzado otro ensayo clínico, focalizado en P. aeruginosa en pacientes con FQ 83. En Estados Unidos se están desarrollando varios trabajos de fagoterapia de uso tópico para el tratamiento de las úlceras diabéticas 84,85. Para el tratamiento de infecciones del lecho quirúrgico por S. aureus, se han formulado matrices similares a un parche que liberan continuamente fagos 86. 2.5. Ventajas y limitaciones de la fagoterapia La característica principal de los fagos es su alta especificidad de infección, que generalmente reconoce un rango limitado de cepas bacterianas. Esto reduce el daño causado a la flora microbiana habitual del huésped, evitando así disbiosis y desarrollo de infecciones secundarias, pero también requiere la identificación del patógeno y la Figura 7. Hitos importantes logrados y esfuerzos realizados en el desarrollo de la terapia con fagos. También se mapean en orden cronológico las aprobaciones para nuevas entidades químicas (azul) y el desarrollo de resistencia a los medicamentos (naranja). Tomado de Saha y cols. 52. 26 Introducción selección de un fago efectivo 87,88, lo cual puede retrasar el tratamiento. Además, como la propagación de los fagos depende de su huésped, la replicación se produce únicamente en el sitio de la infección, son autodosificantes y autolimitantes, con lo que no persisten al eliminar a su patógeno bacteriano específico. Otra ventaja de los fagos es su baja propensión a inducir resistencia y la ausencia de resistencia cruzada a los antibióticos 89. Esto hace que los fagos sean una solución efectiva contra bacterias resistentes a múltiples fármacos y biopelículas 90. Sin embargo, se pueden seleccionar bacterias fago-resistentes. Algunos mecanismos de resistencia ya han sido identificados. Estos incluyen el bloqueo de adsorción de fagos debido a la pérdida o mutación del receptor bacteriano 87,91, así como la adquisición horizontal de un sistema de restricción-modificación o desarrollo de inmunidad adaptativa, ambos dando como resultado la degradación del ADN del fago inyectado 91,92. Uno de los inconvenientes más preocupantes de los fagos está relacionado con su material genético. Los fagos puedan portar genes de resistencia a los antibióticos u otros factores de virulencia bacteriana que se puedan transferir a la bacteria a través de la transducción generalizada 93,94. Como esto es más común en fagos capaces de infectar bacterias mediante un ciclo lisogénico, sólo se utilizan fagos líticos (no transductores) en terapéutica 95. Sin embargo, los fagos líticos también pueden ser problemáticos, ya que la lisis rápida de una gran cantidad de bacterias in vivo puede conducir a la liberación de endotoxinas y superantígenos que puede inducir una respuesta inflamatoria, que potencialmente puede causar efectos secundarios graves 87,96. También es importante la inmunogenicidad que puedan generar los fagos y su consiguiente eficacia in vivo. Los fagos son percibidos por el sistema inmune como invasores y puede ser rápidamente eliminados de la circulación sistémica, lo que dificulta mantener una concentración efectiva de fagos 96. Un estudio de Łusiak- Szelachowska y cols. demostró la inducción de anticuerpos antifágicos después de la terapia con fagos, siendo dependiente de la ruta de administración y tipo de fago 97. 27 Introducción responsable de las distintas especificidades del receptor. Esta región variable es la parte de unión que interactúa con diferentes restos en el receptor, que es el lipopolisacárido celular 110,117,118. Se requiere de una pequeña proteína chaperona para el ensamblaje de las fibras de la cola. Cada tipo de piocina codifica una chaperona diferente correspondiente a las distintas proteínas de unión al receptor. El modelo propuesto para el mecanismo de acción es el siguiente (Figura 10): La piocina R se unen al lipopolisacárido (LPS) de la superficie celular mediante las proteínas de unión al receptor (en las fibras de la cola) 118. Una vez unida, la vaina se contrae, obligando al núcleo a penetrar en la envoltura celular, dirigida por la punta de la cola, a través de la membrana interna. Esto deja un canal a través del cual fluyen los protones y otros iones pequeños, interrumpiendo el gradiente de iones con la consecuente pérdida del potencial de membrana 104,119. Por lo tanto, el mecanismo de destrucción de las bacteriocinas de tipo R está relacionado con el mecanismo en el que los fagos Myoviridae introducen el ADN en la célula después de su unión. Pero en lugar de ADN, al entrar en la célula, se crea un poro 111. Como se ha dicho anteriormente, al no tener ADN, eliminan la posibilidad de transmisión horizontal de genes, una de las ventajas más importantes con respecto a la fagoterapia. Núcleo Vaina o envoltura Pico de la cola Base Fibras de la cola Envuelta celular Unión celular Contracción de la vaina Penetración del núcleo Formación del poro H+Citoplasma Pérdida del potencial de membrana Muerte celular Figura 10:Piocina tipo R. (a) Estructura. (b) Mecanismo de acción: las partículas se unen a la superficie celular mediante la unión al receptor, y la vaina se contrae, conduciendo el núcleo a través de la envoltura celular y dejando un canal que desacopla el gradiente de iones y para la respiración celular. (Figura adaptada de Scholl 104) 34 Introducción La lisis de P.aeruginosa se produce varias horas después de la muerte. Es probable que la lisis no sea parte del mecanismo de muerte, sino más bien se produzca debido a la posterior degradación de las células a partir de enzimas celulares 105. 3.1.4. Receptor de las piocinas R: el lipopolisacárido Inicialmente se sugirió que el lipopolisacárido (LPS) podría jugar un papel importante en la interacción piocina-superficie celular, ya que se demostró que extractos del LPS de cepas de P. aeruginosa sensibles a las piocinas podían neutralizar las preparaciones de piocinas R 120. El lipopolisacárido es un glucolípido complejo anclado en el exterior de la membrana de bacterias Gram-negativas que actúa como un escudo que protege a la bacteria de sustancias dañinas, pero también es en sí mismo es una endotoxina que puede desencadenar y activar las respuestas inmunes del huésped durante una infección 121. El LPS consta de tres dominios: el lípido A, que contiene cadenas de ácidos grasos responsables de anclar el LPS a la membrana externa, un oligosacárido ramificado llamado núcleo, y un polímero de hidratos de carbono repetitivo conocido como el antígeno O. La mayoría de las cepas de P. aeruginosa producen dos formas distintas de Ag O, una es un homopolímero de d-ramnosa que es un antígeno de polisacárido común (CPA, anteriormente denominado banda A), y la otra un heteropolímero de tres a cinco distintos (y a menudo únicos) didesoxiazúcares en sus unidades repetidas, conocidas como antígeno específico O (OSA, anteriormente denominado banda B). Las diferencias de composición en el antígeno O entre el OSA de diferentes cepas forman la base del Esquema Internacional de Tipificación Antigénica para la clasificación mediante serotipado de diferentes cepas de P. aeruginosa 121,122. Curiosamente, Kohler y cols. 118 descubrieron que las cepas de ciertos serotipos tendían a ser más resistentes a las piocinas R (O10, O11, O12), mientras que aquellas con otros serotipos fueron más sensibles (O1, O3, O6). Los autores sugieren que los serotipos O1, O3, y O6 podría tener densidades de empaquetado más bajas en sus bandas A y B, permitiendo acceder a las piocinas a los receptores celulares necesarios pero desconocidos. Al estudiar diferentes mutantes en 35 Introducción el LPS de P. aeruginosa (wbpP, wbpM, wbpL, rmlC y algC), Kohler y cols. descifraron los sitios específicos de unión de las piocinas R en el LPS 118 (Figura 11). Estos incluían dos residuos de glucosa separados que eran necesarios para la actividad de piocinas R2 y R5 y un residuo de L-ramnosa para R1 118. Estos datos en conjunto sugieren que el LPS actúa tanto como un escudo contra la actividad de la piocinas en algunos casos, pero también como un receptor necesario para todas las piocinas de tipo R. Figura 11. Estructuras de LPS de P. aeruginosa PAO1 (serotipo O5) y derivados mutantes. Las estructuras 1 y 2 muestran un núcleo cubierto por las cadenas polisacarídicas banda B y banda A, respectivamente. La Estructura 3 muestra el núcleo sin cubrir. El LPS de una cepa PAO1 salvaje (wt)se compone de las estructuras 1, 2 y 3. Los mutantes wbpP ywbpM carecen de banda B en el LPS, mientras que los mutantes wbpL son deficientes en bandas A y B. PAO1 algC (estructura 4) carece de residuos de glucosa en el núcleo externo (OC), mientras que contiene un núcleo interno intacto (IC). Los residuos de azúcar involucrados en el reconocimiento de R-piocinas se indican con flechas. El mutante rmlC carece del residuo terminal L-Rha (línea discontinua). (Figura tomada de Köhler y cols. 117) 36 Introducción 3.2. Piocinas en terapeútica El primer ejemplo en el que se documentó el papel antiinfeccioso de las piocinas se remonta a 1969 cuando Bird y Grieble 123 mostraron que las piocinas de tipo R podrían rescatar embriones de pollo infectados con una cepa de P. aeruginosa. Tres años después, Merrikin y Terry 124 mostraron que las piocinas de tipo R eran eficaces en infecciones sistémicas por P.aeruginosa en ratones. En estos estudios, los animales fueron infectados por vía intravenosa con dosis altas (107 UFC) y tratados con piocinas R por vía intravenosa. En 1974, Haas y cols. 125 realizaron un estudio profiláctico en ratones en el que concluyeron que una dosis única de piocina intraperitoneal podría proteger a los animales de una infección letal por P. aeruginosa administrándose 4 días antes de la infección. Pese a los buenos resultados hallados, la falta de conocimiento de las piocinas y las limitaciones técnicas de la época, resultaron en experimentos poco concluyentes. Pasaron más de 30 años hasta el siguiente estudio in vivo que mostró que la piocina R2 podría ser utilizado para tratar enfermedades infecciosas en un modelo murino de peritonitis por P.aeruginosa 126. En este estudio, que se realizó utilizando soluciones de piocinas purificadas y mejor cuantificadas que en los estudios anteriores, los ratones sobrevivían tras la administración intraperitoneal o intravenosa de dosis únicas de piocina R2. Además de su potencia, la especificidad de especie de estas partículas es un rasgo deseable por dos razones. En primer lugar, a diferencia de los antibióticos de amplio espectro, la falta de presión selectiva limitará el desarrollo de resistencia a los antibióticos dentro de la población microbiana y, en segundo lugar, el estrecho espectro de acción permite tratar con éxito las infecciones bacterianas mientras se deja intacta la flora bacteriana normal. Las principales complicaciones asociados con la disbiosis inducida por antibióticos incluyen diarrea asociada a antibióticos y la infección por Clostridium difficile 127,128. Más recientemente, se ha sugerido que los desequilibrios microbianos desempeñan un papel importante en una variedad de enfermedades crónicas como la enfermedad de Crohn, diabetes, obesidad y artritis reumatoide 129–132. 37 Introducción Sin embargo, este estrecho rango de acción a veces se ha visto como una limitación, ya que no se conocen (hasta la fecha) tantas piocinas como para cubrir a muchos de los patógenos comunes. Muchos estudios se han centrado en la ingeniería genética de piocinas para redirigir el espectro antibacteriano de las piocinas R. Un estudio de Williams y cols. 110 describió por primera vez la ingeniería de piocinas R para cambiar la diana de P. aeruginosa a E. coli simplemente a través de la sustitución de las proteínas de unión al receptor de la fibra de la cola. Se crearon piocinas quiméricas por fusión del extremo N-terminal de la fibra de cola de la piocina R y el extremo C- terminal de la fibra de la cola del fago P2. Como resultado, la piocina quimérica obtuvo actividad en E. coli, y la perdió contra P. aeruginosa 110. Más tarde, se aplicó la misma estrategia con éxito para matar E. coli productora de toxina Shiga (STEC) O157: H7 y un E. coli enteroagregativo altamente virulento O104: H4 133,134. A diferencia de los antibacterianos tradicionales, las piocinas diseñadas no causaron la liberación de Toxina Shiga del EHEC en un modelo de infección de conejo, lo que se tradujo en la disminución de los síntomas de la enfermedad 135. Recientemente, la ingeniería de piocinas R también se ha aplicado para controlar Clostridium difficile 136. Debido a su estabilidad in vivo, la ingeniería de piocinas R tiene gran potencial, especialmente en la administración oral, para atacar patógenos intestinales, o para modificar el microbioma intestinal 105. Recientemente, también se han realizado estudios in vivo para evaluar la eficacia de otro tipo de piocinas, S2, S5, L1, AP41 137 y SD2 138, donde fueron altamente efectivas para reducir la carga bacteriana en un modelo murino de neumonía aguda por P. aeruginosa. Los estudios anteriores demuestran que las piocinas R pueden atacar bacterias patógenas muy específicas sin dañar la microbiota beneficiosa normal, siendo altamente efectivas. Estas bacteriocinas podrían ser utilizadas potencialmente como una alternativa terapéutica, o en coadyuvancia con los tratamientos comunes, para tratar una amplia gama de infecciones bacterianas, especialmente aquellas que ahora son resistentes a los antibióticos tradicionales, como P. aeruginosa. 38 CAPÍTULO III OBJETIVOS 39 40 Objetivos Debido al progresivo aumento de resistencias antimicrobianas en Pseudomonas aeruginosa y al escaso desarrollo de nuevos fármacos que propongan una solución, el principal objetivo de esta Tesis ha sido estudiar la actividad de las piocinas R en infecciones por P. aeruginosa para evaluarlas como potenciales alternativas o adjuvantes en el tratamiento antibiótico convencional. Para ello, este trabajo pretenderá llevar a cabo los siguientes objetivos específicos: 1- Evaluar la actividad de piocinas R en aislados clínicos de P. aeruginosa bien caracterizados, procedentes de pacientes con fibrosis quística con infecciones de curso crónico, y aislados clínicos de otros orígenes con infecciones de curso agudo. 2- Analizar la evolución en la sensibilidad a piocinas R en aislados clínicos de P. aeruginosa procedentes de pacientes con fibrosis quística recogidos a lo largo de 8 años de enfermedad. 3- Analizar la correlación entre el perfil de sensibilidades a los antipseudomónicos comunes y a las piocinas R en aislados clínicos de P. aeruginosa procedentes de diversos orígenes. 4- Analizar la interacción entre los antipseudomónicos comunes y las piocinas R para proponer su administración como adyuvantes en el tratamiento convencional. 5- Evaluar la actividad de las piocinas R en el biofilm formado por P. aeruginosa, antes y después de su desarrollo. 6- Analizar la actividad in vivo de las piocinas R en un modelo animal de neumonía aguda por un clon de alto riesgo de P. aeruginosa. 41 42 CAPÍTULO IV PUBLICACIONES 43 did not produce R-pyocins, except two invading clones from patient 8 that produced pyocinR1 (Table S4). Some of them produced a diffuse halo over indicator strain lawns suggesting the production of another inhibitor. Correlation between antibiotic and R-pyocin susceptibility profiles Antibiotic and R-pyocin susceptibility patterns to six conventional antibiotics used in clinical practice against P. aeruginosa (ceftazidime, imipenem, meropenem, ciprofloxacin, tobramycin and colistin) were studied for 34 P. aeruginosa strains with unique STs from CF patients and 30 isolates from patients with bloodstream infection (non-CF). The v 2 test showed no relationship between R-pyocin and antibiotic resistance for either CF isolates or non-CF isolates (MIC values are shown in Table S5). Aminoglycoside resistance has been associated with changes in LPS (from smooth to rough). 31 Among non-typeable isolates in our set, 3 out of 19 were resistant to tobramycin (of those, only one was resistant to R-pyocins). A reduction in the number of LPS molecules has also been associated with colistin resistance. 32 Only one colistin-resistant isolate was identified among 19 nontypeable strains. Interactions between R-pyocins and antipseudomonal agents To assess the therapeutic use of R-pyocins in combination with standard treatments for P. aeruginosa infections, interactions between R-pyocins and antipseudomonal antibiotics were quantitatively evaluated by the use of the chequerboard method according to EUCAST recommendations. 27 Isolates from different groups were chosen: three CF isolates (FQSE36-1111, FQSE02-1102-3 and FQSE12-1007), one laboratory strain (PAK wbpP) and two XDR/MDR nosocomial isolates (PA1016 and PA116, both belonging to the ST175 clone, which is considered a high-risk clone). 33 No interactionwas found between R-pyocins and standard antipseudomonal antibiotics for the strains PA116, PAK wbpP,FQSE36- Patient 1 Year 1 ST 1108 ST 1108 ST 1072 ST 1108 ST 1108 ST 1108 ST 1108 ST 1108ST 155 ST 274 ST 274 ST 701 ST 299 ST 274 ST 1073 ST 1088 ST 1089 * ST 1089 * ST 1089 * ST 1089 * ST 1089 **** ST 1089 ST 1089 ST 1089 ST 1089 * ST 1089 ST 1071 Isolate 1 Isolate 2 Isolate 3 Isolate 4 Isolate 5 Isolate 6 Isolate 7 Isolate 8 Isolate 9 Isolate 10 ST 1071 ST 1071 ST 1071 ST 1071 ST 1071 ST 1071 ST 1071 ST 1071 ST 1071 * ST 1088 ST 1088 ST 1109 ST 1109 ST 1109 ST 1109 ST 1109 ST 1109 ST 1088 ST 1073 ST 1073 ST 1073 ST 1073 ST 1073 ST 1073 ST 1073 ST 1073 ST 1073 *** ***** ******* * ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 1089 * ST 299 ST 299 ST 299 ST 299 ST 299 ST 146 ST 146 ST 146 ST 146 ST 701 ST 701 ST 701 ST 701 ST 701 ST 254 ST 701 ST 701 ST 701 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 299 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 ST 274 * Time course Year 8 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 Patient 9 Patient 10 R5 R2 R1 R5 R2 R1 R5 R2 R1 R5 R2 R1 R5 R2 R1 R5 R2 R1 R5 R2 R1 R5 R2 R1 R5 R2 R1 R5 R2 R1 Figure 2. Evolution of R-pyocin susceptibility of P. aeruginosa isolates from CF patients. Susceptibility to R-pyocins of sequential isolates from CF patients over 8 years. White rectangles show R-pyocin-susceptible isolates and striped rectangles correspond to resistant isolates. An asterisk indicates a mutator isolate. ST clones are indicated; ST274 and ST1089 belong to the same PFGE clonal type. R-pyocin susceptibility of P. aeruginosa strains JAC 2773 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/article-abstract/73/10/2770/5057983 by guest on 18 December 2018 50 1111, FQSE02-1102-3 and FQSE12-1007 (Table 2). The FICI was between 0.62 and 1. Interestingly, a synergic effect between R2-pyocin and tobramycin and between R2-pyocin and gentamicin was observed for strain PA1016 (ST175) (FICI 0.28 and 0.08 respectively). 27 Discussion The search for new effective antimicrobials to fight P. aeruginosa infections is a priority, especially in the context of CF, where the isolation of this bacterium is associated with a poorer disease progression. 34 Research in phage therapy is slowly resurging, 7 mainly due to the lack of development of new antibiotics. Pyocins are bacteriocins of phage origin produced by P. aeruginosa strains, supposedly for intra-species competition purposes, 8 although they are also active against non-related species. Notably, R-pyocins exhibit narrow bactericidal spectra and thus can be expected to have little effect on healthy microbiota. Also, they are not replicative structures (they do not contain DNA) and therefore they cannot promote the horizontal spread of MDR among other bacteria, which is a desirable characteristic for a therapeutic agent. In the present study we compared isolates from CF patients, where the infection caused by this pathogen becomes chronic in later stages and a plethora of regulatory networks play a role in adaptation, 35,36 with isolates from patients with bloodstream infection, where infections are usually acute. 37 Our results show that P. aeruginosa isolates from cystic fibrosis patientsare moresusceptible to R-pyocins. Almost 80% of the CF isolates were susceptible to at least one out of the three R-pyocins, while only 50% of isolates from bloodstream infections showed susceptibility. This pattern was also demonstrated in isolates that causedacute infection from a different hospital (HUVR). Little is known about the R-pyocin susceptibility pattern of P. aeruginosa clinical isolates. Ko¨hleret al. 12 described the R-pyocin susceptibility profile of 47 isolates from tracheal aspirates. They found a similar proportion of isolates susceptible to R-pyocins (59% versus 50% in our study). They also analysed the R-pyocin- production profile and demonstrated a similar percentage of nonproducers and R1, R2 and R5 producers (17%–29%). The R-pyocin deficient isolates were susceptible to R1-, R2- and R5-pyocins, while most R2- and R5-pyocin producers were resistant. 12 Ghoul et al. 38 also used clinical isolates from CF patients and non-lung sources to study the role of pyocins in the dynamism of lung colonization. They concluded that isolates taken from strains causing chronic infections produce fewer types of pyocins and, at the same time, are more susceptible to pyocins produced by other strains than the strains causing acute infections. These findings are in agreement with the high susceptibility to R-pyocins of CF isolates in our collection. The majority of strains of P. aeruginosa isolated from CF patients display the loss of O-serotype reaction (non-typeable) and susceptibility to normal human serum 28,29 suggesting defects in LPS (e.g. loss of OSA). Our results are in agreement with previous publicationsassomeCFisolateswerealsonon-typeable. Interestingly, O1- and O6-type isolates showed increased susceptibility to R-pyocins suggesting that some LPS conformations may enable R-pyocins to find their targets. A previous study has also identified O1- and O6- typesashighlysusceptibleserotypes. 12 Our results point to LPS architecture as the ultimate cause of R-pyocin susceptibility in CF isolates. The loss of O-antigen or evolutiontowardsmoreaccessibleO- Table 2. Interactions between R-pyocins and common antipseudomonal agents Combination FICI a PA1016 PA116 PAK wbpP FQSE12-1007 FQSE36-1111 FQSE02-1102-3 TOB !R1 0.75 1 0.75 – 0.75 – TOB !R2 0.28 0.75 1 0.75 0.75 1 TOB !R5 – 0.75 1 0.75 0.75 – GEN !R1 0.75 0.62 – – – – GEN !R2 0.08 1 – 0.7 – – GEN !R5 – 1 – 1 – – AMK !R1 0.75 – – – – – AMK !R2 0.63 – – – – – LVX !R1 1 – – – – – LVX !R2 1 – – – – – CIP !R1 1 – – – – – CIP !R2 1 – – – – – CST !R1 1 – – – – – CST !R2 1 – – 0.75 – – CST !R5 – – – 1 – – IPM !R1 1 – – – – – IPM !R2 1 – – – – – TOB, tobramycin; GEN, gentamicin; AMK, amikacin; LVX, levofloxacin; CIP, ciprofloxacin; CST, colistin; IPM, imipenem. a FICI values indicating synergy are shown in bold. Redero et al. 2774 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/article-abstract/73/10/2770/5057983 by guest on 18 December 2018 51 types in chronic isolates may render these strains more susceptible to R-pyocins. R-pyocin resistance is caused by modifications in the LPS molecule. 19 Our evolutionary study carried out with 10 CF patients for 8years revealed a few changesin the R-pyocin susceptibility profile over time (among the patients infected with one ST clone), suggesting that these modifications are not very frequent in the lung environment. In addition, most of the patients were colonized by one or two clones. Almost no changes in R-pyocin susceptibility were observed in clones that remain for years, some of them mutators (patients 2, 3, 9 and 10), in contrast to antibiotic resistance, which is developed throughout the illness. 17 Our results are in contrast to those obtained by Ko¨hleret al. 12 where a short evolution of 20days in a patient’s lung was monitored. They showed that a pyocin-producer clone, which was resistant to its own and the other colonizing clone pyocin, replaced the susceptible one. However, 20days of colonization represent a very different scenario for a CF patient compared with the years of evolution considered in our study and others. For instance, Ghoul et al. 38 carried out a long-term study of infection within patients (6–10years). Overall, the pyocin susceptibility profile did not change over time, in agreement with our results from patients 2, 4, 9 and 10. They found no support for the hypothesis that certain strains are dominant in the CF lung through pyocins. Along those lines, our results suggest that isolates able to reach the latest stages of infection are more susceptible to R-pyocins and produce fewer R-pyocins. The biological cost of pyocin production, together with the envelope peculiarities selected within the host, likely constitute a handicap in the context of infection. We did not find a correlation between the susceptibility profile to R-pyocins and common antibiotics currently used in clinical practice for Pseudomonas infections. In the late 1980s, a study including 116 P. aeruginosa isolates from diverse clinical sources (which were not mentioned), 39 suggested a potential relationship between multiple antibiotic resistance (carbenicillin and gentamicin) and susceptibility to R2-pyocins. These authors suggested the impairment of the outer membrane permeability caused by LPS modifications as the likely cause. Carbenicillin and gentamicin have not been studied in this work. However, we studied tobramycin and colistin, which cause alterations in membrane permeability, 40,41 and our results show that isolates susceptible to R- pyocins were not more susceptible to colistin or aminoglycosides. Moreover, no interaction was found between antipseudomonal antibiotics and R-pyocins, i.e. the activity of both agents was not affected. The lack of interaction between aminoglycosides or colistin and R-pyocins indicate that they must be targeting different LPS components. Surprisingly, we did find interaction between R2-pyocin and aminoglycosides (tobramycin and gentamicin) for strain PA1016 (resistant to gentamicin and tobramycin). In contrast, no synergy was observed for the PA116 strain (also resistant to gentamicin and tobramycin). PA1016 and PA116 are both susceptible to R2- pyocin. Therefore, this interesting interaction seems to be specific to the PA1016 strain and requires further investigation. In summary, here we provide evidence that R-pyocins could be a valuable therapeutic alternative, alone or as adjuvants, in the treatment of P. aeruginosa infections, particularly in CF patients, where their isolates show a high susceptibility to these agents. Future studies addressing issues such as stability, effect on pulmonary epithelial cells and routes of administration are necessary before the possible clinical application of pyocins for lung infection. Acknowledgements Pseudomonas R-pyocin indicator strains were a kind gift from Dr Ko¨hler (Department of Microbiology and Molecular Medicine, University of Geneva, Switzerland). We are grateful to Michael McConnell for useful scientific comments and English revision of the manuscript. Funding This work was supported by: Consejerı´a de Salud de la Junta de Andalucı´a (grant number PI-0062-2014); Subprograma Sara Borrell to A. I. P.; Instituto de Salud Carlos III, Spain (PI13/00063); Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI RD16/0016/0009); and European Development Regional Fund ERDF ‘A way to achieve Europe’, Operative programme Intelligent Growth 2014-2020. Transparency declarations None to declare. Supplementary data Tables S1 to S5 and statistical analysis are available as Supplementary data at JAC Online. References 1Lister PD, Wolter DJ, Hanson ND. 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EUCAST Definitive Document E.Def 1.2, May 2000: terminology relating to methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. Clin Microbiol Infect 2000; 6: 503–8. 28 Hancock RE, Mutharia LM, Chan L et al.Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains. Infect Immun 1983; 42: 170–7. 29 PenkethA,PittT,RobertsDet al. The relationship of phenotype changes in Pseudomonas aeruginosa to the clinical condition of patients with cystic fibrosis. Am Rev Respir Dis 1983; 127:605–8. 30 Oliver A, Canto´n R, Campo P et al. High frequency of hypermutable Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis lung infection. Science 2000; 288: 1251–4. 31 Richard B, Clark DHH, Janda JM et al. Increased susceptibility of gentamicin-resistant Pseudomonas aeruginosa to human sera. Curr Microbiol 1986; 13: 159–62. 32 Falagas ME, Kasiakou SK. Colistin: the revival of polymyxins for the management of multidrug-resistant gram-negative bacterial infections. Clin Infect Dis 2005; 40: 1333–41. 33 Oliver A, Mulet X, Lo´pez-Causape´Cet al. The increasing threat of Pseudomonas aeruginosa high-risk clones. Drug Resist Updat 2015; 21–22: 41–59. 34 Bhagirath AY, Li Y, Somayajula D et al. Cystic fibrosis lung environment and Pseudomonas aeruginosa infection. BMC Pulm Med 2016; 16: 174. 35 Marvig RL, Sommer LM, Molin S et al. Convergent evolution and adaptation of Pseudomonas aeruginosa within patients with cystic fibrosis. Nat Genet 2015; 47: 57–64. 36 Jelsbak L, Johansen HK, Frost AL et al. Molecular epidemiology and dynamics of Pseudomonas aeruginosa populations in lungs of cystic fibrosis patients. Infect Immun 2007; 75: 2214–24. 37 Engel JN. Molecular pathogenesis of acute Pseudomonas aeruginosa infections. In: Hauser AR, Rello J, eds. Severe Infections Caused by Pseudomonas aeruginosa. Boston, MA, USA: Springer US, 2003; 201–29. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-0433-7_13. 38 Ghoul M, West SA, Johansen HK et al. Bacteriocin-mediated competition in cystic fibrosis lung infections. Proc Biol Sci 2015; 282:doi: 10.1098/rspb.2015.0972. 39 Tzouvelekis LS, Tumah H, Malliara K et al. Relationship of antibiotic resistance phenotype to the R-pyocin susceptibility pattern in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa.JChemother1989; 1: 226–30. 40 Bialvaei AZ, Samadi Kafil H. Colistin, mechanisms and prevalence of resistance. Curr Med Res Opin 2015; 31: 707–21. 41 Bulitta JB, Ly NS, Landersdorfer CB et al. Two mechanisms of killing of Pseudomonas aeruginosa by tobramycin assessed at multiple inocula via mechanism-based modeling. Antimicrob Agents Chemother 2015; 59: 2315–27. Redero et al. 2776 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/article-abstract/73/10/2770/5057983 by guest on 18 December 2018 53 54 Publicaciones Publicación 2. Eficacia antibacteriana de las piocinas de tipo R contra Pseudomonas aeruginosa en biofilms y en un modelo murino de infección pulmonar aguda. Como se explica en la introducción, la formación del biofilm mucoide es el sello distintivo de las infecciones crónicas debidas a P. aeruginosa y constituye una de las complicaciones más serias en pacientes con fibrosis quística, donde su presencia es indicativa de progresión de la enfermedad y persistencia a largo plazo. Las células bacterianas dentro de esta matriz se vuelven menos accesibles a los antimicrobianos. Este fenómeno junto con el incremento de cepas cada vez más resistentes, hace que sea necesario la búsqueda de nuevas moléculas con la capacidad de penetrar en el biofilm y ser activas dentro de él. Tomando la propuesta anterior (Publicación 1) como premisa, el objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad de las piocinas R en un biofilm de P. aeruginosa, y su eficacia en un modelo murino de infección pulmonar aguda por un clon de alto riesgo, XDR, ST175 de P. aeruginosa, prevalente en servicios de UCI europeos. Nuestros resultados demostraron que las piocinas R pueden atacar a las bacterias adheridas a una superficie evitando la formación del biofilm, así como penetrar dentro de la entramada estructura del biofilm manteniendo su alta eficacia, capaces de reducir la carga bacteriana hasta 8log10 tras tres dosis, sin seleccionar mutantes resistentes. En este trabajo, también se demuestra que la piocina R1 es activa administrada por vía intranasal en un modelo murino de infección pulmonar por un clon de alto riesgo, XDR, ST175 de P. aeruginosa, tanto si se administra antes de la infección como un tratamiento preventivo, como en la neumonía aguda como tratamiento curativo, con una eficacia superior al tratamiento con colistina estándar. Además, este trabajo es el primero en describir los cambios histopatológicos pulmonares producidos después de la administración de piocinas R que contribuyen a la resolución de la neumonía por P. aeruginosa en nuestro modelo murino. 55 Publicaciones Este trabajo complementa a los resultados presentados en la Publicación 1, ampliando nuestro conocimiento de las piocinas R, al mostrar su efectividad en biofilms, así como en un modelo murino de neumonía por el clon de alto riesgo de P. aeruginosa. Dadas las necesidades actuales, este trabajo destaca el uso potencial de las piocinas R como agentes terapéuticos, las cuales podrían considerarse como una posible alternativa terapéutica en las infecciones por P. aeruginosa XDR, donde las opciones de tratamiento son muy limitadas. 56 Antibacterial efficacy of R-type pyocins against Pseudomonas aeruginosa on biofilms and in a murine model of acute lung infection Mar Redero 1,2 , Javier Aznar 1–3 and Ana I. Prieto 1 * 1 Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), Avda. Manuel Siurot s/n, 41013 Seville, Spain; 2 Unidad de Enfermedades Infecciosas, Microbiologı´a y Medicina Preventiva, Hospital Universitario Virgen del Rocı´o, Seville, Spain; 3 Universidad de Sevilla, Seville, Spain *Corresponding author. E-mail: [email protected] Received 25 July 2019; returned 0 Month 2019; revised 13 February 2020; accepted 0 Month 2019 Background: The appearance of MDR strains and the development of biofilms make Pseudomonas aeruginosa infections a therapeutic challenge. To overcome this scenario, bacteriocins have been proposed as a potential adjuvant or alternative to antibiotic treatment. Objectives: To study the activity of R-pyocins on biofilms and in a murine model of pneumonia using a high-risk clone of P. aeruginosa. Methods: The activity of R-pyocins on P. aeruginosa biofilms was tested on bacteria attached to a silicone surface, before and after biofilm formation. The effectiveness of R1-pyocin was studied in a murine model of pneumonia using ST175, a high-risk clone of P. aeruginosa. Results: R-pyocins attacked adherent bacteria, preventing biofilm formation, and penetrated into the biofilm, killing P. aeruginosa within it, resulting in a dramatic reduction in bacterial load. R1-pyocin was active in a murine model of P. aeruginosa lung infection, administered before infection as a preventive treatment, and in acute pneumonia, with efficiency higher than standard colistin treatment. In addition, this work is the first to describe histopathological lung changes after administration of R-pyocins, contributing to the resolution of P. aeruginosa pneumonia in a murine model. Conclusions: This work highlights the potential use of the R-pyocins as therapeutic agents, alone or as adjuvants, due to its effectiveness on biofilms and in a murine model of pneumonia using ST175, a high-risk clone of P. aeruginosa. It may thus be feasible to consider R-pyocins as a possible therapeutic alternative in XDR infections, where treatment alternatives are limited. Introduction Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic human pathogen capable of causing a wide array of life-threatening acute and chronic infections. P. aeruginosa can colonize the cystic fibrosis patient’s airways and persist as an ineradicable infection until the end of patient’s life in almost 70% of adults, being the main cause of morbidity and mortality. 1 Furthermore, this pathogen is also associated with hospital-acquired infections including ventilatorassociated pneumonia, central line-associated bloodstream infection and urinary catheter-related infection. 2 Its prevalence and persistence in clinical settings are related to its extraordinary survival capabilities in different unfavourable conditions, such as antibiotic treatment and stress. 3 One such capability is increased adherence leading to biofilm formation. Biofilms are cellular aggregations embedded in a polymeric substance that protects them from the environment and provides persistence. 4,5 The formation of biofilms in the lungs of patients with cystic fibrosis constitutes one of the most serious complications in the course of the disease. 6 Bacteria immersed in a biofilm matrix become less accessible to the action of antimicrobials. This fact, together with the rapid emergence of MDR strains, makes it necessary to search for new therapeutic options, not only with antimicrobial activity on MDR strains, but also with the ability to penetrate the biofilm. In this scenario, the use of bacteriophages for the treatment of bacterial infections is re-emerging as an alternative therapeutic strategy. 7–12 Bacteriophages were used as antimicrobial agents for the first time during the first half of the 20th century, but the lack of knowledge of phage biology and the advent of antibiotics in 1940 contributed to the abandonment of this application. 13 However, V CThe Author(s) 2020. Published by Oxford University Press on behalf of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. All rights reserved. For permissions, please email: [email protected]. 1of9 J Antimicrob Chemother doi:10.1093/jac/dkaa121 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/advance-article-abstract/doi/10.1093/jac/dkaa121/5854855 by Beurlingbiblioteket user on 18 June 2020 57 the alarming rise of MDR bacteria and the consequent need for antibiotic alternatives has renewed the interest in phage therapy. Numerous in vitro and in vivo studies have evaluated the efficacy of phage therapy, alone or in combination with common antibiotics, in diverse P. aeruginosa infections and for biofilm dispersal. 14–17 These studies have been carried out in clinical trials with humans, such as in chronic otitis or in burns, 18,19 where high efficacy was demonstrated in eradication of P. aeruginosa without side effects. Phage targets are highly specific and effective against a limited range of bacterial strains, and cause limited damage to the normal host microbiota. However, phages may carry antibiotic resistance genes or other bacterial virulence factors that can be transferred to the bacteria through generalized transduction. 20 The chromosome of certain P. aeruginosa strains encodes at least three different types of bacteriocins (R-, F- and S-type), referred to as pyocins. 21 R-pyocins are genetically and structurally related to the contractile tail of P2 bacteriophages but lack the phage head structure, 22 and therefore are incapable of transmitting any gene encoding antibiotic resistance or virulence factors. R-pyocins can be classified into three types (R1, R2 and R5). Their targets are located on the LPS structure, 23,24 and the core structure of the R-pyocin is inserted through the cell envelope, causing depolarization of the cytoplasmic membrane, which leads to cell lysis. 25 R-pyocins are highly effective against a plethora of P. aeruginosa strains 26,27 and other species. 6,28,29 The antibacterial efficacy of S-pyocins has been demonstrated in vitro 30,31 and in murine models of acute lung infection. 32,33 R-pyocins have been found to be active against different bacterial species, including P. aeruginosa in biofilms, as well as in a P. aeruginosa peritonitis murine model. 34–38 In previous work, 39 we demonstrated high antibacterial activity of R-pyocins on clinical isolates of P. aeruginosa from patients with cystic fibrosis, and showed that R-pyocins do not interfere with the antibiotics used in clinical practice, suggesting a potential use as adjuvant therapy. In this work, we show the high activity of R-pyocins (R1, R2 and R5) on biofilms and in a murine model of acute lung infection by the ST175 high-risk clone of P. aeruginosa, to evaluate them as potential adjuvants or as an alternative to antibiotic treatment. Materials and methods Strains and culture medium The strains used in this study are described in Table 1. Clinical isolate PA1016 is an ST175 high-risk clone of an XDR P. aeruginosa, which has spread in European ICUs. All strains were grown in LB broth at 37C. Pyocin purification Pyocin production and purification were accomplished according to Ito et al. 40 The sources of pyocins for this study were P. aeruginosa strains PAK, PA14 and 15108, 23 which are R1-, R2- and R5-pyocin producers, respectively. R-type pyocins, whose expression is RecA-mediated, 27 were induced by adding mitomycin C to log-phase cultures growing in LB broth medium at 37C and shaking at 200rpm. Mitomycin C was added to obtain a final concentration of 3 lg/mL, when the culture (100 mL) reached an OD at 600nm of 0.25. Cultures were incubated for 2.5 h until complete lysis. Three microlitres of DNase I (1U/lL; Invitrogen, ThermoFisher V R ) wasadded per100mL ofculture and incubated for 30min. The next steps were carried out at 4C. Lysates were collected, and debris was removed from the lysate by centrifugation at 22000gfor 1 h. To each 100 mL of supernatant, 65mL of saturated ammonium sulphate was slowly added, while stirring on ice. The suspension was stored at 4C overnight. The ammonium sulphate precipitate was sedimented at 22000 gfor 1 h at 4C and the pellet resuspended in 16mL of TN50 buffer (50mM NaCl, 10mM Tris, pH 7.5). R-pyocin was then sedimented at 65000 gfor 1 h at 4C, and resuspended in 6 mL of TN50 buffer. The resulting preparation was an R1-, R2- and R5-pyocin-enriched extract. To obtain extracts free of R-pyocins, named DR1, DR2 and DR5, the same process was carried out with the PAKDR1, PA14DR2 and 15108DR5 strains, which carried essential deletions for R1-, R2- and R5-pyocin synthesis, respectively. Quantification of R-pyocin extracts Indicator strains with known susceptibility to R-pyocins, listed in Table 1, were grown overnight and diluted to obtain an OD at 600nm of 0.64. Three microlitres of each suspension was added to 3 mL of top agar (0.4% LB Table 1. Characteristics of P. aeruginosa strains used in this work Strains Lysis by a Characteristics ReferencesR1-pyocin R2-pyocin R5-pyocin PAK 0 1 1 R1 producer 23 PA14 0 0 0 R2 producer 23 15108 1 1 0 R5 producer 23 PAO1 0 0 0 laboratory strain 23 PAO1 wbpM 1 1 1 PAO1 mutant LPS 23 PAO1 wbpL 1 0 1 PAO1 mutant LPS 23 PAO1 rmlC 0 1 1 PAO1 mutant LPS 23 PAO1 algC 0 0 0 PAO1 mutant LPS 23 PA1016 1 1 0 ST175, high-risk-clone, XDR this study a 0, no lysis; 1, lysis. Redero et al. 2of9 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/advance-article-abstract/doi/10.1093/jac/dkaa121/5854855 by Beurlingbiblioteket user on 18 June 2020 58 agar) and poured onto fresh LB medium plates. In the spot assay, 7 lLofR- pyocins and serial dilutions (1:10) were deposited on the top agar, and the plates were incubated overnight at 37C. Clear halos (lysis) were considered as a positive result for R-pyocin activity. As negative activity controls, susceptibility assays with DR1, DR2 and DR5 extracts were performed in parallel. R-pyocin concentration (mg/L of total protein) was estimated with the Bradford protein assay according to the manufacturer (Bio-Rad Laboratories, Inc.). R-pyocin solutions were stable for at least 60days at 4C in TN50 buffer without preservative. MIC The MICs of R-pyocins for each bacterial strain were assessed in triplicate using the broth microdilution method, according to EUCAST. 41 Overnight cultures were prepared and adjusted toa McFarland density of 0.5. Time–kill curves in planktonic growth Overnight cultures of the different strains were grown at 37CinLBbroth. Then, 5%10 5 cfu/mL from these cultures were inoculated into fresh LB containing 60, 20 and 20mg/L of the R1-, R2- and R5-pyocins, respectively, and incubation was performed at 37C for 8 h at 200rpm. The growth control (GC, R-pyocin-free) and purified extracts from strains with deletion of the pyocin genes (DR1, DR2 and DR5) were used as negative treatment controls. Viable bacterial counts were determined by plating serial dilutions at different times onto LB agar plates incubated at 37C for up to 24 h. If the cfu count in the first dilution was zero, the entire suspension was centrifuged and plated for colony counting. Activity assays of R-pyocins on biofilm The activity of R-pyocins on biofilm produced by the ST175 high-risk clone of P. aeruginosa (PA1016) was tested on the surface of silicone elastomer discs (15mm in diameter %1.5mm in thickness; Merefsa SL) as previously described by Chandra et al. 42 Two conditions were studied: bacteria adhered to a silicone surface (i) prior to biofilm formation (pre-biofilm assay) and(ii) after biofilm formation (post-biofilm assay). Pre-biofilm assay A total of 2 mL of 10 5 cfu/mL of the biofilm-forming strains was added to each well of a 12-well plate (TC Plate 12-Well, Suspension F, Sarstedt V R ) containing the silicone discs and the plate was incubated for 90min at 37C. Discs with attached bacteria were transferred to clean 12-well plates containing 2 mL of 60, 20 or 20mg/L purified R1-, R2- and R5-pyocins. Plates were incubated at 37C and shaken at 60rpm for 24h. After washing each well with 2mL of fresh PBS to discard the planktonic cells, the silicone discs were placed into clean wells containing 2 mL of fresh PBS. Biofilm-forming cells on each silicone disc were detached with a cell scraper (Cell Scraper 25cm, Sarstedt V R ) and homogenized. Viable cells were counted. Post-biofilm assay: time–kill curves Once the bacteria were adhered to the silicone discs as previously described, they were transferred to fresh 12-well plates, each containing 2mL of fresh LB, and the plates were incubated at 37C and shaken at 60rpm for 24h. Once the biofilm had developed, each disc was transferred to a clean well containing 2mL of R-pyocin solution. The plates were incubated at 37C and shaken at 60rpm for 2, 4 and 8 h. For every timepoint, biofilm-forming bacteria were detached with a cell scraper, homogenized and counted as above. Post-biofilm treatment studies Using thesamebiofilm model, the efficacy of three consecutive treatments with R-pyocins every 4h was evaluated. Spot assays were performed to test R-pyocin susceptibility of the viable cells after treatment. Both pre-biofilm and post-biofilm assays, GC (R-pyocin-free) and purified extracts carrying a deletion in R-pyocins (DR1, DR2 and DR5) were used as negative controls. The results shown are the average of three independent experiments. Ethics All the experimental procedures were performed in accordance with the Spanish Royal Decree 14/2007 on the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. All procedures were approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of the University Hospitals Virgen Macarena and Virgen del Rocı´o (registration number 0732-N-15). In vivo assays Female C57/BL6 mice weighing 20–22g were acquired from Charles River (Charles River, Barcelona, Spain) and Universidad de Sevilla (Sevilla, Spain). Upon arrival, animals were housed in regulation cages with HEPA filters, provided with water and food ad libitum throughout the experiments and housed under a reversed 12h/12h light/dark cycle. To produce the infection, mice (five per group) were anaesthetized by an intraperitoneal (IP) injection of ketamine 35mg/kg and xylazine 5 mg/kg. Mice were infected by instillation of 30lLofa10 8 cfu/mL bacterial suspension of XDR P. aeruginosa PA1016 and treated with 30lL of TN50 buffer (control group), 60 mg/ L of R1-pyocin (R1 group) or 15mg/kg sodium colistimethate (colistin group) administered intranasally. All mice were sacrificed by cervical dislocation, and their lungs were aseptically removed and homogenized in 2 mL of saline using a tissue homogenizer. Homogenates were serially diluted, plated onto LB agar plates and incubated for 24h at 37C. After incubation, colony counts were performed and the results were expressed as log 10 total cfu/lung. Histopathological studies Lungs were fixed in situ using 10% formalin solution before being removed and placed in fixative. Histology processing and haematoxylin and eosin (H&E) staining was carried out by the Histology Service Laboratory-IBIS. High-resolution whole images were captured and scored blind by independent assessors from the Compared Pathology Unit, Biobanco- Universitary Hospital Virgen del Rocio-IBIS. Statistics Due to small sample sizes, non-parametric tests were used for analysis. One-sided Mann–Whitney U-tests with a significance threshold of P0.05, adjusted for multiple comparisons using the Bonferroni correction, were then used to analyse specific sample pairs for significant differences. All mice, including outliers, were included in the statistical analysis. Results In vitro activity of R-pyocins The in vitro activity of R-pyocins on P. aeruginosa cultures in planktonic growth and in biofilms was tested. The laboratory strain PAO1 and its PAO1 wbpM LPS mutant, together with the ST175 high-risk clone PA1016, were used (Table1). R-type pyocins against P. aeruginosa in acute lung infection JAC 3of9 Downloaded from https://academic.oup.com/jac/advance-article-abstract/doi/10.1093/jac/dkaa121/5854855 by Beurlingbiblioteket user on 18 June 2020 59 66 CAPÍTULO V DISCUSIÓN 67 68 Discusión El alarmante aumento de bacterias resistentes a antibióticos constituye un auténtico reto en la salud mundial, con el consecuente aumento de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. P. aeruginosa es un patógeno humano que aprovecha el estado de inmunosupresión del huésped como una oportunidad para causar un amplio abanico de infecciones agudas y crónicas10. El tratamiento de estas infecciones en muchos casos resulta muy complicado, ya que este microorganismo posee mecanismos de resistencia intrínseca a diversos antibióticos, y además puede adquirir resistencias durante el tratamiento 28,31,33–35. Además, P.aeruginosa posee múltiples mecanismos para evadir la respuesta del huésped como es la formación del biofilm. Aquí, las comunidades bacterianas organizadas están embebidas en una matriz extracelular polimérica asociada a una superficie vital, como por ejemplo el epitelio pulmonar en el caso de pacientes con fibrosis quística o EPOC, o a una superficie inerte como son los dispositivos biomédicos, causando infecciones relacionadas con ellos como es el caso de la neumonía asociada a ventilación mecánica, bacteriemia o ITU relacionadas con catéter, etc. 20. En este ambiente existe una mayor tolerancia a los antimicrobianos, debido principalmente a la baja actividad de algunos antibióticos en ambientes anaeróbicos, la presencia de células persistentes frente a las cuales los antibióticos son inactivos, la inducción de mecanismos de resistencia, el desarrollo de resistencias mutacionales durante el tratamiento antibiótico y la transferencia genética horizontal entre bacterias26. Como se ha mencionado anteriormente, las NAVM por P. aeruginosa pueden llegar a tener una tasa de mortalidad de hasta el 50 % y la infección respiratoria crónica por Pseudomonas aeruginosa es una de los principales impulsores de la morbilidad y la mortalidad en pacientes con FQ, bronquiectasias o EPOC13. Por lo tanto, es una prioridad encontrar un tratamiento adecuado para tratar a estas bacterias cada vez más resistentes, y con mecanismo sofisticados que impiden, entre otros, el acceso al foco de infección y la correcta actividad de las moléculas conocidas hasta ahora. 69 Discusión En las últimas décadas, se ha desacelerado bruscamente el descubrimiento de antibióticos y el mecanismo de acción similar entre los pocos nuevos medicamentos ha llevado a la evolución potencial de resistencia cruzada en las bacterias. Aunque las modificaciones sintéticas a algunos antibióticos preexistentes han extendido temporalmente su utilidad clínica58, se han seleccionado mecanismos de resistencia más amplios, como las betalactamasas de espectro extendido59, cambios adaptativos que han evolucionado más fácilmente en comparación con la aparición de mecanismos de resistencia de novo. Ante este escenario, es imprescindible el descubrimiento, diseño y desarrollo de nuevas terapias antibacterianas alternativas. La capacidad de los bacteriófagos de lisar a sus bacterias hospedadoras, su amplia distribución y su elevada especificidad, ha renovado su interés entre la comunidad científica. Numerosos ensayos clínicos en humanos proponen a los cócteles de fagos como una alterativa en potencia para tratar infecciones bacterianas recalcitrantes. Para poner solución a las limitaciones más importantes de la fagoterapia, como por ejemplo la transmisión de elementos génicos, se están investigando diversas vertientes, como es el uso y desarrollo de proteínas derivadas de los fagos. Las piocinas de tipo R son bacteriocinas de origen fágico producidas por P. aeruginosa, supuestamente para fines de competencia intraespecie141, aunque son también activas contra especies no relacionadas106–109, y que agregan numerosas ventajas a las terapias convencionales actuales. A diferencia de los antibióticos de amplio espectro, las piocinas R tienen un espectro muy reducido y específico, lo que limitará la evolución de la resistencia bacteriana debido a la ausencia de presión selectiva. Este espectro reducido preserva la microbiota intestinal, evitando así enfermedades como la diarrea asociada a antibióticos por Clostridioides difficile 128. Además, a diferencia de los fagos, las piocinas R son estructuras no replicativas (no contienen ADN) por lo que no transportan material genético y, por lo tanto, evitan la propagación horizontal de genes de resistencia a antibióticos y otros elementos génicos que confieran virulencia entre otras bacterias, una característica deseable para un agente terapéutico. Su producción es sencilla, ya que al estar reguladas por RecA, se puede inducir su producción y obtener 200 veces más partículas que a su nivel 70 Discusión basal112,114. Mediante un sencillo y eficaz mecanismo de acción, la piocina R produce un poro en la membrana celular con la consecuente despolarización de la membrana, ruptura de la respiración celular y lisis de la bacteria104,119. Además, las piocinas tipo R son muy activas, tan sólo se necesitan 1 o 2 partículas para lisar una bacteria, mientras que se requieren entre 180 y 200 piocinas tipo F y tipo S para alcanzar el mismo efecto102–104. Es por ello, que en esta Tesis hayamos decidido trabajar con las piocinas tipo R, ya que son las más activas. En la presente Tesis, tratamos de evaluar la actividad de las piocinas tipo R para proponerlas como una alternativa terapéutica o en adyuvancia con los antibióticos utilizados en la práctica clínica para combatir infecciones tanto crónicas como agudas por P. aeruginosa. En la Publicación 1, hemos comparado aislamientos bien caracterizados de pacientes con FQ, donde la infección causada por este patógeno se vuelve crónica en etapas posteriores y una gran cantidad de redes reguladoras juegan un papel en la adaptación142,143, con aislamientos procedentes de pacientes con bacteriemia, la cual habitualmente cursa de forma aguda. Nuestros resultados muestran que los aislados de P. aeruginosa de pacientes con fibrosis quística son más sensibles a las piocinas R. Casi el 80% de los aislados de FQ fueron sensibles al menos a una de las tres piocinas R, mientras que sólo el 50% de los aislamientos de las infecciones del torrente sanguíneo fueron sensibles. Este patrón también se demostró en los aislamientos que causaron infección aguda en otras localizaciones, procedentes del Hospital Universitario Virgen del Rocío (Anexo II). Poco se sabe sobre el patrón de sensibilidad de aislamientos clínicos de P. aeruginosa a las piocinas R. Kohler y cols.118 describieron el perfil de sensibilidad a las piocinas R de 47 aislados de aspirados traqueales. En ellos se encontró una proporción similar de aislamientos sensibles a piocinas R (59% versus 50% en nuestro estudio). También analizaron el perfil de producción de piocinas R y demostraron un porcentaje similar de no productores y productores de piocinas R1, R2 y R5 (17%–29%). Los aislamientos deficientes en piocinas R fueron sensibles a las piocinas R1, R2 y R5, mientras que la mayoría de los productores de piocinas R2 y R5 eran resistentes118. 71 Discusión Ghoul y cols.144 también analizaron aislamientos clínicos de pacientes con FQ y otras localizaciones extrapulmonares para estudiar el papel de las piocinas en el dinamismo de la colonización pulmonar. Llegaron a la conclusión de que los aislados procedentes de etapas posteriores en las infecciones crónicas producen menos tipos de piocinas y, al mismo tiempo, son más sensibles a las piocinas producidas por otras cepas, que las cepas que causan infecciones agudas. Concluyen que este patrón podría ocurrir por la competencia de cepas que se produce en un ambiente hostil como es el pulmón en FQ, con cepas más competitivas que producen menos piocinas145–148, ya que la producción de una mayor diversidad de piocinas podría ser más costoso en infecciones crónicas. Estos hallazgos están de acuerdo con la alta sensibilidad a las piocinas R de los aislados procedentes de pacientes con FQ presentados en esta Tesis. Para intentar dar una explicación a este resultado, se realizó un análisis del antígeno O del LPS. Al estudiar diferentes mutantes en el LPS de P. aeruginosa, Kohler y cols.118 descifraron los restos glucosídicos específicos de unión a las piocinas R, situados en el núcleo externo del LPS. Cubriendo esta estructura se sitúan las cadenas o bandas polisacarídicas que conforman el antígeno O. Cada bacteria se compone de forma heterogénea, como si de un mosaico se tratara, de una variedad de bandas, con distintas longitudes y niveles de empaquetamiento122. La mayoría de las cepas de P. aeruginosa aisladas de pacientes con FQ muestran una pérdida en la reacción del serotipo O (no tipificables) y sensibilidad al suero humano149,150, lo que sugiere que estas cepas tienen defectos en el LPS, como por ejemplo, la pérdida del antígeno O. Nuestros resultados están de acuerdo con publicaciones anteriores donde aislamientos procedentes de FQ tampoco eran tipificables. Según nuestros resultados, estos aislados no tipificables fueron más sensibles a las piocinas R. Curiosamente, en la presente tesis y en un estudio anterior118, los aislados con serotipos O1 y O6 mostraron una mayor sensibilidad a las piocinas R. Esta correlación puede reflejar la densidad de empaquetamiento de las cadenas laterales del antígeno O del LPS, según las propiedades fisicoquímicas de los azúcares que las componen. Estos resultados sugieren que los aislados de serotipo O1 y O6 tienen una baja proporción de moléculas que conlleva a un empaquetamiento en el LPS de baja densidad. Este hecho 72 Discusión proporcionaría un acceso relativamente libre de las piocinas R a sus receptores de superficie. Por lo tanto, algunas conformaciones de LPS pueden permitir que las piocinas R accedan más fácilmente a su lugar de unión en el núcleo del LPS. Nuestros resultados apuntan a la arquitectura del LPS como la última causa de sensibilidad a las piocinas R en aislados de FQ. Concluimos con que la pérdida del antígeno O o la evolución hacia conformaciones más accesibles en aislados crónicos pueden explicar que estas cepas sean más sensibles a las piocinas R. La resistencia a piocinas de tipo R es causada por modificaciones en la molécula del LPS109. Nuestro estudio evolutivo realizado con aislados clínicos procedentes de 10 pacientes con FQ recogidos durante 8 años de evolución de su enfermedad revelaron muy pocos cambios en el perfil de sensibilidad de piocinas R con el tiempo (entre los pacientes infectados con un clon ST), lo que sugiere que estas modificaciones no son muy frecuentes en el ambiente pulmonar. Además, la mayoría de los pacientes fueron colonizados por uno o dos clones. Se observaron muy pocos cambios en la sensibilidad de piocinas R en clones que permanecen durante años, algunos de ellos hipermutadores (pacientes 2, 3, 9 y 10), en contraste con la resistencia a los antibióticos, que se desarrolla a lo largo de la enfermedad139. Ghoul y cols.144 llevaron a cabo un estudio en pacientes con FQ de infección a largo plazo (6-10 años). En general, el perfil de sensibilidad a las piocinas no cambió con el tiempo, de acuerdo con nuestros resultados de los pacientes 2, 4, 9 y 10. Encontraron que las cepas más dominantes/persistentes, tomadas de etapas de infección posteriores, son menos capaces de matar, ya que producen menos piocinas y a su vez son más sensibles a ellas. Como se explica anteriormente, nuestros resultados también sugieren que los aislamientos capaces de alcanzar las últimas etapas de infección permanecen sensibles a las piocinas R y a su vez, producen menos piocinas R. Las cepas más dominantes, que persisten y compiten a lo largo del tiempo para provocar infecciones crónicas, portan una menor diversidad de piocinas144. En etapas más tempranas de la infección es favorable una mayor diversidad de piocinas, ya que compiten con una mayor diversidad de cepas, pero en etapas posteriores, esta 73 Discusión producción, lejos de ser ventajosa, conlleva un alto coste biológico, ya que hace disminuir la resistencia a agentes genotóxicos, tan comunes en el ambiente pulmonar de FQ151. En los resultados presentados en la Publicación 1, no encontramos una correlación entre el perfil de sensibilidad a las piocinas R y a los antibióticos comunes utilizados actualmente en la práctica clínica para infecciones por P. aeruginosa. A finales de la década de 1980, un estudio incluyendo 116 aislados de P. aeruginosa de diversas fuentes clínicas (que no se mencionaron)152, sugirió una relación potencial entre resistencia a múltiples antibióticos (carbenicilina y gentamicina) y sensibilidad a piocinas R2. Estos autores sugirieron como causa probable el deterioro de la permeabilidad de la membrana externa causada por modificaciones en el LPS. La correlación con carbenicilina y gentamicina no ha sido estudiada en esta Tesis. Sin embargo, si lo hicimos con tobramicina y colistina, que causan alteraciones en la permeabilidad de la membrana153,154 y nuestros resultados muestran que los aislamientos sensibles a piocinas R no fueron más sensibles a colistina o aminoglucósidos. Es importante destacar que muchas de las cepas de nuestra colección presentan resistencia a tres o más grupos de antibióticos, lo que las categoriza como multirresistentes (MDR) o incluso extensivamente resistentes (XDR). El estado de multirresistencia de los aislados clínicos analizados no se relaciona con la sensibilidad o resistencia a piocinas. Por lo tanto, el hecho de que una cepa posea múltiples mecanismos de resistencia antibiótica, no condiciona su sensibilidad a las piocinas R, una cuestión importante al plantear a las piocinas como una alternativa terapéutica para estos aislados con pocas posibilidades de tratamiento. Hasta la fecha, no se han documentado trabajos que hayan realizado estudios de interacción entre piocinas R y antipseudomónicos comunes. Si se pretende considerar a las piocinas R como una alternativa potencial para realizar un tratamiento en adyuvancia con antibióticos comúnmente usados en la práctica clínica, es fundamental el estudio de sus interacciones. 74 Discusión En los resultados presentados en la Publicación 1, no se encontraron interacciones entre antibióticos antipseudomónicos como tobramicina, gentamicina, amikacina, levofloxacino, ciprofloxacino, colistina e imipenem y piocinas R, es decir, la actividad de los distintos agentes no se modificó en presencia de las piocinas R. Cabe destacar la falta de interacción entre la colistina y las piocinas R, ya que ambas moléculas tienen su diana en el LPS. Aunque el mecanismo exacto por el cual la colistina puede matar células bacterianas actualmente no está claro, si bien es cierto que la colistina interacciona con el lípido A del LPS para alterar la membrana lo que conlleva a la pérdida del material celular y su muerte153,155,156. Como ya se ha mencionado anteriormente, los receptores específicos de las piocinas R se sitúan en el núcleo externo del LPS118. Con lo cual, nuestros resultados apuntan hacia la falta de competencia entre colistina y piocinas R para alcanzar sus distintas dianas en el LPS. Sorprendentemente, encontramos una fuerte sinergia entre la piocina R2 y aminoglucósidos (tobramicina y gentamicina) en el clon de alto riesgo ST175, PA1016 (resistente a gentamicina y tobramicina). Por el contrario, no se observó sinergia en la cepa PA116 (también perteneciente al ST175 y resistente a la gentamicina y tobramicina) ni en el resto de las cepas estudiadas. PA1016 y PA116 son sensibles a la piocina R2. Por lo tanto, esta interacción parece ser específica de la cepa PA1016 y requerirá más investigación más profunda. Aunque es temprano aún para considerar un tratamiento exclusivo con piocinas R, la falta de interacciones observada en nuestros resultados abre el camino para poder considerar una posible administración conjunta de piocinas R como adyuvantes de las terapias convencionales. Como se explica en la introducción, la formación del biofilm mucoide es el sello distintivo de las infecciones crónicas debidas a P. aeruginosa y es indicativa de la progresión de la enfermedad y la persistencia a largo plazo. Las células bacterianas dentro de esta matriz se vuelven menos accesibles a los antimicrobianos. Este fenómeno hace que sea necesario buscar nuevas moléculas con la capacidad de penetrar en el biofilm y ser activas dentro de él. 75 Conclusiones 7. Las piocinas R penetran en el biofilm de P. aeruginosa y son altamente eficaces en reducir la carga bacteriana dentro de él. Además, no se seleccionan mutantes resistentes después de varias dosis de piocinas R, lo que sugiere que la erradicación bacteriana total puede ser posible después de tratamientos secuenciales. 8. La piocina R1 es altamente eficaz, como tratamiento preventivo y tratamiento curativo en nuestro modelo murino de neumonía aguda por el clon de alto riesgo ST175 de P. aeruginosa, al disminuir la carga bacteriana y provocar los cambios histopatológicos que conducen hacia la resolución de la neumonía, obteniendo resultados aún mejores que con el tratamiento estándar con colistina. 9. Las piocinas tipo R podrían suponer una alternativa terapéutica o en combinación con tratamientos estándares en infecciones agudas o crónicas por P. aeruginosa multiresistentes, donde las opciones terapéuticas son muy limitadas. 82 CAPÍTULO VII BIBLIOGRAFÍA 83 84 Bibliografía 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Alhazmi, A. Pseudomonas aeruginosa – Pathogenesis and Pathogenic Mechanisms. Int. J. Biol. 2015, 7 (2). Stover, C. 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Susceptibility to R-Pyocins of Pseudomonas aeruginosa Clinical Isolates from Cystic Fibrosis Patients. J. Antimicrob. Chemother. 2018, 73 (July), 2770–2776. 101 102 CAPÍTULO VIII ANEXOS 103 104 Anexos ANEXO I: Producción científica adicional Participación en congresos: Efficacy of R1-pyocin in a murine model of acute Pseudomonas aeruginosa lung infection. Mar Redero, Antonio Oliver, Jesús Blázquez y Ana Isabel Prieto. 28th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Madrid, España (2018). Hipersusceptibility to R-pyocins of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from cystic fibrosis patients. Mar Redero, Carla López-Causapé, José Antonio Lepe, Antonio Oliver, Jesús Blázquez y Ana Isabel Prieto. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Amsterdan, Holanda (2016). High effect of R-type pyocins on susceptible and multiresistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Mar Redero, Carla López-Causapé, Jana Basas, Joan Gavaldà, Antonio Oliver, Jesús Blázquez y Anabel Prieto. XI Reunión del grupo especializado de Microbiología Molecular de la Sociedad Española de Microbiología, Sevilla (2016). Killing effect of R-pyocins on susceptible and XDR Pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Mar Redero, Carla López-Causapé, Jana Basas, Joan Gavaldà, Antonio Oliver, Jesús Blázquez y Anabel Prieto. , Sevilla (2016). Hipersensibilidad a piocinas de tipo R en cepas de Pseudomonas aeruginosa aisladas de pacientes con fibrosis quística. Mar Redero, Carla López-Causapé, José Antonio Lepe, Antonio Oliver, Jesús Blázquez y Ana Isabel Prieto. XIX Congreso Nacional de la SEIMC, Sevilla (2015). 105 Anexos Conferencias: Título: Uso de Piocinas, una variante de la Fagoterapia: evaluación de su actividad en infecciones por Pseudomonas aeruginosa XDR. Evento científico: Seminario Programa de Enfermedades Infecciosas y del Sistema Inmunitario. Organizador: Instituto de Biomedicina de Sevilla. Centro: Instituto de Biomedicina de Sevilla. Fecha: 18 de marzo de 2019. Título: Piocinas, la nueva era antimicrobiana post-antibiótica. Evento científico: Seminario Enfermedades infecciosas. Organizador: Instituto de Recerca, Hospital Vall d`Hebrón, Barcelona. Centro: Instituto de Recerca, Hospital Vall d`Hebrón, Barcelona. Fecha: 20 de enero de 2016 106 Anexos ANEXO II: Material suplementario Supplementary material for: Susceptibility to R-pyocins of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from cystic fibrosis patients Mar Redero1–3, Carla López-Causape´4, Javier Aznar1–3, Antonio Oliver4, Jesús Blázquez 1,2,5† and Ana I. Prieto1,2*† 1Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), Avda. Manuel Siurot s/n, 41013 Seville, Spain 2Unidad de Enfermedades Infecciosas, Microbiología y Medicina Preventiva, Hospital Universitario Virgen del Rocío, Seville, Spain 3Universidad de Sevilla, Seville, Spain 4Servicio de Microbiología y Unidad de Investigación, Hospital Universitario Son Espases, Palma de Mallorca, Spain 5Centro Nacional de Biotecnología (CNB), Madrid, Spain 107 Anexos PAVR90 - - - - Sputum 163 PAVR93 + + + + Bronchial aspirate 163 PAVR94 - + + + Sputum 163 PAVR95 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR96 + + + + Sputum 163 PAVR97 + + - + Bronchial aspirate 163 PAVR98 + + + + Wound 163 PAVR100 - + + + Exudate 163 PAVR101 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR102 - - - - Catheter 163 PAVR103 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR104 + + - + Bronchial aspirate 163 PAVR105 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR106 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR107 - + - + Intraabdominal abscess 163 PAVR108 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR109 - - - - Exudate 163 PAVR110 + - - + Sputum 163 PAVR111 + + - + Sputum 163 PAVR112 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR113 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR114 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR115 - + - + Bronchial aspirate 163 PAVR116 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR117 - - - - Bronchial aspirate 163 PAVR118 - + + + Bronchial aspirate 163 96 Anexos PAVR119 - + - + Sputum 163 PAVR120 - + + + Bronchial aspirate 163 PAVR121 - + - + Sputum 163 * +, lysis; -, non lysis. Lysed by R1, R2 or R5. R1/R2/R5 refers to lysis by any of the three R-pyocins. NA; no agglutination. 97 Anexos TABLE S3. Isolates of P. aeruginosa from 8 CF patients along 10 years Strain ID Characteristics Lysis by*: Mutator Phenotype Isolate order Pigment Production Morphotype PATIENT R1-pyocin R2-pyocin R5-pyocin R1/R2/R5 PATIENT 1 FQSE05-0403 Clone E; ST-1108 + - - + - 1 + normal FQSE05-0104 Clone E; ST-1108 + + - + - 2 + normal FQSE05-0704 Clone D; ST-299 - - - - - 3 + Mucoid FQSE05-0305 Clone F; ST-1072 + + - + - 4 + normal FQSE05-0506 Clone E; ST-1108 + + - + - 5 + mucoid FQSE05-0807 Clone G; ST-155 - + + + - 6 + mucoid FQSE05-0408 Clone E; ST-1108 + + - + - 7 - normal FQSE05-0709 Clone E; ST-1108 + + - + - 8 + normal FQSE05-0310 Clone E; ST-1108 + + - + - 9 + normal FQSE05-0111 Clone E; ST-1108 + + - + - 10 + normal PATIENT 2 FQSE06-0403 Clone A; ST-274 + + + + - 1 + scv FQSE06-1003 Clone A; ST-274 + + + + - 2 + normal FQSE06-1104 Clone A; ST-274 + + + + + 3 - normal FQSE06-0205 Clone A; ST-274 + + + + - 4 + normal FQSE06-0106 Clone A; ST-274 + + + + - 5 + normal FQSE06-1106 Clone A; ST-274 + + + + - 6 + normal FQSE06-0807 Clone A; ST-274 + + + + - 7 + normal FQSE06-1008 Clone A; ST-274 + + + + - 8 + normal FQSE06-1209 Clone A; ST-274 + + + + - 9 + normal FQSE06-0610 Clone A; ST-274 + + + + - 10 + normal PATIENT 3 FQSE10-0503 Clone A1; ST-274 + + + + - 1 - scv 98 Anexos FQSE10-0504 Clone A1; ST-274 + + + + - 2 + mucoid FQSE10-0105 Clone A1; ST-274 + + + + - 3 + normal FQSE10-0106 Clone A1; ST-274 + + + + - 4 - normal FQSE10-0606 Clone A1; ST-274 + + + + - 5 - normal FQSE10-0607 Clone A1; ST-274 + + + + - 6 - normal FQSE10-0408 Clone A1; ST-274 + + + + - 7 - scv FQSE10-0109 Clone A1; ST-274 + + + + - 8 - mucoid FQSE10-0110 Clone A1; ST-274 + + - + - 9 + scv FQSE10-0111 Clone A1; ST-274 + + - + - 10 - scv PATIENT 4 FQSE11-0603 Clone K; ST-701 + + + + - 1 + mucoid FQSE11-0304 Clone K; ST-701 + + + + - 2 - mucoid FQSE11-0205 Clone K; ST-701 + + + + - 3 - mucoid FQSE11-1205 Clone K; ST-701 + + + + - 4 + normal FQSE11-1006 Clone K; ST-701 + + + + - 5 - mucoid FQSE11-0707 Clone K; ST-701 + + + + - 6 - mucoid FQSE11-0608 Clone L; ST-254 + + - + - 7 - normal FQSE11-0609 Clone K; ST-701 + + + + - 8 - normal FQSE11-0510 Clone K; ST-701 + + + + - 9 + mucoid FQSE11-1010 Clone K; ST-701 + + + + - 10 + normal PATIENT 5 FQSE12-0603 Clone C; ST-299 + + + + + 1 + mucoid FQSE12-0704 Clone C; ST-299 + + + + + 2 + scv FQSE12-0605 Clone C; ST-299 + - - + + 3 + normal FQSE12-0206 Clone C; ST-299 + + + + + 4 + normal FQSE12-0506 Clone C; ST-299 + + + + + 5 + normal FQSE12-1206 Clone C; ST-299 + + + + + 6 - mucoid FQSE12-1007 Clone B; ST-146 - + + + - 7 + normal 99 Anexos FQSE12-0108 Clone B; ST-146 - + + + - 8 + normal FQSE12-0110 Clone B; ST-146 + + + + - 9 - mucoid FQSE12-1110 Clone B; ST-146 - + + + - 10 + normal PATIENT 6 FQSE15-0803 Clone A; ST-274 + + - + - 1 + normal FQSE15-0204 Clone A; ST-274 + + + + - 2 + normal FQSE15-1104 Clone A; ST-274 + + + + - 3 + normal FQSE15-0905 Clone A; ST-274 + + + + - 4 + normal FQSE15-0906 Clone A; ST-274 + + - + - 5 + normal FQSE15-0307 Clone A; ST-274 + + + + - 6 + normal FQSE15-0508 Clone A; ST-274 + + - + - 7 + mucoid FQSE15-1009 Clone A; ST-274 + + - + - 8 + mucoid FQSE15-0310 Clone A; ST-274 + + + + - 9 + mucoid FQSE15-1110 Clone A; ST-1089 + + + + + 10 + mucoid PATIENT 7 FQSE16-0803 Clone M; ST-1073 + + + + + 1 + normal FQSE16-0104 Clone M; ST-1073 + + - + + 2 - normal FQSE16-1204 Clone M; ST-1073 + + + + + 3 + scv FQSE16-0405 Clone M; ST-1073 - + + + + 4 + normal FQSE16-1105 Clone M; ST-1073 + + + + + 5 + normal FQSE16-0406 Clone M; ST-1073 - - + + + 6 - normal FQSE16-0507 Clone M; ST-1073 - - + + + 7 + normal FQSE16-0108 Clone M; ST-1073 - - + + + 8 + mucoid FQSE16-0908 Clone M; ST-1073 - - + + + 9 + normal FQSE16-0910 Clone M; ST-1073 + + + + + 10 + mucoid PATIENT 8 FQSE21-1003 Clone H; ST-1088 + + + + - 1 + mucoid FQSE21-0204 Clone H; ST-1088 + + + + - 2 + mucoid FQSE21-1004 Clone H; ST-1088 + + + + - 3 - mucoid 100 Anexos FQSE21-0505 Clone I; ST-1109 - + + + - 4 - scv FQSE21-0706 Clone I; ST-1109 - + + + - 5 - scv FQSE21-0507 Clone I; ST-1109 - + + + - 6 - normal FQSE21-0308 Clone I; ST-1109 - + + + - 7 - scv FQSE21-1109 Clone I; ST-1109 - + + + - 8 - normal FQSE21-0410 Clone I; ST-1109 - + + + - 9 + mucoid FQSE21-1110 Clone H; ST-1088 + + + + + 10 - normal PATIENT 9 FQSE24-0304 Clone A; ST-1089 + + + + + 1 + normal FQSE24-0804 Clone A; ST-1089 + + + + + 2 + normal FQSE24-0405 Clone A; ST-1089 + + + + + 3 + normal FQSE24-1005 Clone A; ST-1089 + + + + + 4 + normal FQSE24-0707 Clone A; ST-1089 + + + + + 5 + normal FQSE24-1207 Clone A; ST-1089 + + + + + 6 + normal FQSE24-0308 Clone A; ST-1089 + + + + + 7 + normal FQSE24-1109 Clone A; ST-1089 + + + + + 8 + normal FQSE24-0310 Clone A; ST-1089 + + + + + 9 - scv FQSE24-1010 Clone A; ST-1089 + + + + + 10 + normal PATIENT 10 FQSE28-1006 Clone J; ST-1071 + + + + - 1 + normal FQSE28-0207 Clone J; ST-1071 + + + + - 2 + normal FQSE28-0807 Clone J; ST-1071 + + + + - 3 + mucoid FQSE28-1107 Clone J; ST-1071 + + + + - 4 + mucoid FQSE28-0308 Clone J; ST-1071 + + + + - 5 + mucoid FQSE28-0908 Clone J; ST-1071 + + + + - 6 + mucoid FQSE28-0409 Clone J; ST-1071 + + + + - 7 + normal FQSE28-1009 Clone J; ST-1071 + + + + - 8 + mucoid FQSE28-0210 Clone J; ST-1071 + + + + - 9 + mucoid 101 Anexos FQSE28-1110 Clone J; ST-1071 + + + + - 10 + mucoid * +, lysis; -, non lysis. Lysed by R1, R2 or R5. R1/R2/R5 refers to lysis by any of the three R-pyocins. SVC, small colony variants TABLE S4. R-pyocin production Strain ID Characteristics Lysed by Lyses to R-pyocin production R1 R2 R5 PAO1algC PAO1 rmd PAO1 rmlC PAO1 wbpM PAO1 wbpL FQSE05-0403 Clone E; ST-1108 + - - - - - - - 0 FQSE05-0704 Clone D; ST-299 - - - - - - - - 0 FQSE05-0305 Clone F; ST-1072 + + - - - - - - 0 FQSE05-0807 Clone G; ST-155 - + + - - - - - 0 FQSE06-1003 Clone A; ST-274 + + + - - - - - 0 FQSE11-0603 Clone K; ST-701 + + + - - - - - 0 FQSE11-0608 Clone L; ST-254 + + - - - - - - 0 FQSE12-0603 Clone C; ST-299 + + + - - - - - 0 FQSE12-1007 Clone B; ST-146 - + + - - - - + ? FQSE16-0803 Clone M; ST-1073 + + + - - - - - 0 FQSE21-1003 Clone H; ST-1088 + + + - - - + + R1 FQSE21-0505 Clone I; ST-1109 - + + - - - + + R1 FQSE24-0304 Clone A; ST-1089 + + + - - - - - 0 FQSE28-1006 Clone J; ST-1071 + + + - - - - - 0 FQSE01-1205 ST-1837 + - + - - - - - 0 FQSE02-1103-2 ST-1838 + + + - - - - - 0 FQSE04-0213-4 ST-285 + + + - - - - - 0 FQSE07-0810 ST-308 + - - - - + + + R5 FQSE08-0503 ST-253 - - - - - + + - R2 FQSE09-0213 ST-1839 - - - - - + + - R2 FQSE13-0807-2 ST-1527 - + + - - - - - 0 FQSE14-0703 ST-1840 + + + - - - - - 0 102 Anexos FQSE16-0413 ST-1613 - - + - - - - - 0 FQSE17-0612 ST-1841 - - - - - + + - R2 FQSE20-0608-3 ST-505 - - - - - + + + R5 FQSE23-0209-2 ST-1339 + + - - - + + + R5 FQSE25-0208 ST-277 - - - - - + + - R2 FQSE26-0406-2 ST-1842 + + + - - - - - 0 FQSE29-0313-2 ST-606 - - + - - + + - R2 FQSE30-0210-2 ST-938 - - - - - + + + R5 FQSE31-0712 ST-312 + + + - - - - - 0 FQSE32-1208 ST-1637 + + + - - - - - 0 FQSE36-1111 ST-386 + + + - - - - - 0 FQSE39-0910 ST-198 + + + - - - - - 0 * +, lysis; -, non lysis; ?, unknown 103 Anexos TABLE S5. Antibiograms and R-pyocins susceptibility Antibiotics* Strain ID CAZ IMP MEM CIP TOB COL R-PYOCINS** Eucast MIC Eucast MIC Eucast MIC Eucast MIC Eucast MIC Eucast MIC FQSE05-0403 R 16,00 S 1,50 S 0,250 S 0,25 S 1,50 S 0,50 S FQSE05-0704 S 2,00 S 3,00 S 0,75 R 3,00 S 1,50 S 0,75 R FQSE05-0305 S 1,00 S 0,50 S 0,047 S 0,25 S 0,75 S 2,00 S FQSE05-0807 S 0,75 S 1,50 S 0,19 S 0,047 S 0,50 S 1,50 S FQSE06-1003 S 4,00 R >32 R 6,00 S 0,25 R 64,00 S 1,50 S FQSE11-0603 S 1,00 S 1,50 S 0,032 S 0,13 S 2,00 S 1,50 S FQSE11-0608 S 1,00 S 1,00 S 0,02 S 0,38 S 2,00 S 1,50 S FQSE12-0603 S 0,75 S 1,00 S 0,06 S 0,25 R 24,00 S 0,75 S FQSE12-1007 R 24,00 R >32 S 1,50 R 4,00 S 4,00 R 1024,00 S FQSE16-0803 S 1,50 S 3,00 S 0,19 R 1,50 S 3,00 S 0,50 S FQSE21-1003 S 0,50 S 0,38 S 0,19 S 0,25 S 0,38 S 1,00 S FQSE21-0505 R 16,00 S 3,00 S 0,50 R 2,00 R 16,00 S 2,00 S FQSE24-0304 S 1,00 R >32 S 2,00 R 8,00 S 3,00 S 1,00 S FQSE28-1006 S 1,50 S 4,00 S 0,09 S 0,13 S 3,00 S 2,00 S FQSE01-1205 S 0,50 S 2,00 S 0,25 S 0,13 S 0,75 S 2,00 S FQSE02-1103-2 S 2,00 S 3,00 S 0,75 S 0,01 S 2,00 S 1,50 S FQSE04-0213-4 R 24,00 S 3,00 S 0,190 S 0,38 S 1,50 S 1,50 S FQSE07-0810 R 256,00 R 32,00 R 32,00 R 1,50 R 8,00 S 1,00 S FQSE08-0503 S 2,00 S 0,13 S 0,13 S 0,13 R 256,00 S 0,50 R FQSE09-0213 S 1,00 S 4,00 S 0,50 S 0,19 S 2,00 R 3,00 R 104 Anexos FQSE13-0807-2 S 6,00 R 32,00 R 32,00 R 12,00 S 2,00 S 0,50 S FQSE14-0703 S 1,50 R 32,00 I 4,00 R 4,00 S 2,00 S 0,06 S FQSE16-0413 S 1,00 S 3,00 S 0,06 S 0,50 S 3,00 S 1,50 S FQSE17-0612 S 1,00 S 2,00 S 0,09 S 0,19 S 1,00 S 1,50 R FQSE20-0608-3 S 2,00 S 1,50 S 0,38 S 0,13 S 2,00 S 2,00 R FQSE23-0209-2 S 1,00 S 2,00 S 0,25 S 0,13 S 2,00 S 2,00 S FQSE25-0208 R 32,00 S 1,50 S 0,38 S 0,12 S 2,00 S 2,00 R FQSE26-0406-2 S 0,75 S 1,50 S 0,06 R 2,00 S 1,50 S 2,00 S FQSE29-0313-2 S 3,00 R 32,00 R 32,00 R 4,00 S 3,00 S 0,75 S FQSE30-0210-2 S 1,50 S 1,50 S 0,38 S 0,19 S 1,50 S 0,75 R FQSE31-0712 S 1,50 R 32,00 S 2,00 S 0,50 S 1,00 S 0,13 S FQSE32-1208 S 4,00 R 32,00 R 32,00 R 0,75 R 12,00 S 0,50 S FQSE36-1111 S 1,50 S 2,00 S 0,25 S 0,13 S 0,75 S 0,75 S FQSE39-0910 S 1,00 S 1,50 S 0,38 S 0,25 S 1,50 S 1,50 S PAmb37 S 2 S 2 S 0,5 R 4 S 1 S 0,5 R PAmb39 S 2 S 1 S 1 S 0,125 S 1 S 0,5 R PAmb54 S 2 S 0,5 S 0,25 S 0,125 S 1 S 2 S PAmb60 S 8 R >64 R >64 R 1 S 0,5-2 S 1 S PAmb91 S 4 S 1 S 2 S 0,06 S 0,5 S 0,5 R PAmb112 S 2 S 4 S 1 S 0,25 S 1 S 1 S PAmb113 S 2 R 8 S 0,06 S 0,125 S 0,5 S 0,25 R PAmb120 S 4 R 64 S 2 S 0,125 S 0,5 S 0,125 S PAmb122 R 16 S 1 S 0,5 S 0,125 S 1 S 0,5 S PAmb129 R 64 R 32 R 8 R 16 S 1 S 0,55 R PAmb152 R 128 R 8 R 8 R 1 S 0,5 S 1 S PAmb180 S 2 S 1 S 0,25 S 0,5 S 0,25 S 1 S 105