Inmunotoxicidad inducida por cianotoxinas: microcistinas y cilindrospermopsina

INMUNOTOXICIDAD INDUCIDA POR CIANOTOXINAS: MICROCISTINAS Y CILINDROSPERMOPSINA María del Monte Benítez González Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla - 1 - Trabajo Fin de Grado de carácter bibliográfico Grado en Farmacia “INMUNOTOXICIDAD INDUCIDA POR CIANOTOXINAS: MICROCISTINAS Y CILINDROSPERMOPSINA” Tutoras: Dra. Ángeles Jos Gallego y Dra. María Puerto Rodríguez Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal. Área de Toxicología. Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla. María del Monte Benítez González Julio de 2018 - 2 - RESUMEN Las cianobacterias son bacterias Gram negativas fotosintéticas capaces de producir floraciones a nivel mundial. Estas cianobacterias pueden producir también cianotoxinas perjudiciales para la salud de humanos, animales y plantas, y pueden actuar como hepatotoxinas, citotoxinas, neurotoxinas o dermatotoxinas. Las cianotoxinas de mayor interés son las microcistinas (MC) y la cilindrospermopsina (CYN) por su extensa distribución y toxicidad. Aunque se conoce que principalmente las MC son hepatotóxicas y la CYN citotóxica, se ha observado que pueden producir alteraciones en otros órganos y sistemas, de los cuales el sistema inmune está aún escasamente estudiado. La presente revisión tiene, por tanto, como objetivo poner de manifiesto en modelos experimentales tanto in vitro como in vivo las alteraciones que se producen en el sistema inmune tras la exposición a estas cianotoxinas y la importancia que ello tiene en la respuesta inmunitaria. Tras la realización de una búsqueda bibliográfica se seleccionaron veintitrés y siete artículos relacionados con la inmunotoxicidad de MC y CYN, respectivamente. En ellos se evidencia el efecto de las MC sobre la proliferación de los linfocitos y la expresión de múltiples citoquinas, entre otros. Así mismo, se ha observado el efecto de la CYN sobre la viabilidad y capacidad de los linfocitos a pesar de que los estudios de inmunotoxicidad sobre ésta sean escasos. Por tanto, ambas cianotoxinas presentan potencial inmunotóxico que debería ser estudiado en mayor profundidad, especialmente en el caso de la CYN. PALABRAS CLAVE: cianobacterias, microcistinas, cilindrospermopsina, inmunotoxicidad - 3 - ÍNDICE 1. Introducción……………………………………………………………………………... 5 1.1. Cianobacterias y cianotoxinas...………………………………………………..5 1.2. Microcistinas…………………………………………………………………...7 1.3. Cilindrospermopsina………...……………………………………………….... 9 1.4. Sistema Inmune………………………………………………………………..10 2. Objetivos………………………………………………………………………………...12 3. Metodología……………………………………………………………………………..13 4. Resultados y discusión...………………………………………………………………...14 4.1. Inmunotoxicidad inducida por MC………………………………………........14 4.1.1. Efecto de las MC sobre los linfocitos……………………………….23 4.1.2. Efecto de las MC sobre la expresión de citoquinas…………………24 4.1.3. Cambios morfológicos producidos por las MC……………………..24 4.1.4. Otros efectos producidos por las MC……………………………….25 4.2. Inmunotoxicidad inducida por CYN………………………………………….25 4.3. Discusión general...…………………………………………………………...26 5. Conclusiones…………………………………………………………………………....30 6. Bibliografía……………………………………………………………………………..31 - 4 - ABREVIATURAS Células NK células Natural Killer CINC-2αβ neutrófilos quimioatractores inducidos por citoquinas-2 ConA concavalina A ERO especies reactivas de oxígeno GM-CSF factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos IFN-1 interferón-1 IFN-γ interferón gamma IL- interleuquina iNOS óxido nítrico sintasa inducida i.p. intraperitoneal LPS lipopolisacáridos NO óxido nítrico PMA forbol-12-miristato-13-acetato PNM polimorfonucleares TGF factor de crecimiento β TNF-α factor de necrosis tumoral. - 5 - 1. INTRODUCCIÓN 1.1. CIANOBACTERIAS Y CIANOTOXINAS Las cianobacterias son un conjunto de bacterias procariotas Gram negativas, conocidas comúnmente como algas verde-azuladas (Msagati et al., 2006). Estas cianobacterias son capaces de crear floraciones en lagos y embalses de agua dulce eutróficos, debido a que estas aguas contienen gran cantidad de nitrógeno y de fósforo que facilitarían su crecimiento (Chen et al., 2016, 2004). Además, como consecuencia de la contaminación antropogénica y el cambio climático su crecimiento se incrementa con respecto a otros grupos de fitoplancton (ej. diatomeas y algas verdes), al darse unas condiciones óptimas para su proliferación por el aumento de temperatura y altos niveles de CO2 (Li et al., 2016; Rymuszka y Adaszek, 2013). Las floraciones de cianobacterias se encuentran mayormente en regiones tropicales (Saker y Eaglesham, 1999), aunque debido a la contaminación de las aguas y al calentamiento global, hoy día se encuentran mundialmente distribuidas (Fig. 1), llegando a encontrarse incluso en ambientes extremos como en el ártico y el antártico (Aráoz et al., 2010). De hecho, las floraciones de cianobacterias son un problema endémico en países como China (Shen et al., 2003) (Fig. 2). Figura 1: Distribución de cianobacterias a nivel mundial (Buratti et al., 2017) - 6 - Figura 2: Floración de cianobacterias en el lago Taihu (China) debido a la eutrofización de las aguas (Fuente: elmundo.es ciencia y ecología) Las cianobacterias presentan una serie de características que les permiten tener ciertas ventajas sobre otros organismos, ya que poseen unas vesículas de gas que les posibilita moverse en el agua y posicionarse donde adquieran unas condiciones óptimas de temperatura y de nutrientes (Msagati et al., 2006; Walsby et al., 2006). Por ello, son capaces de proliferar en las capas superiores del agua produciendo anoxia en el área de crecimiento y ocasionando la muerte de organismos acuáticos (Yan et al., 2017). Además, pueden llegar a provocar un cambio en el color, olor y sabor del agua así como graves riesgos para la salud de humanos, animales y plantas por la producción de toxinas (Chen et al., 2016; Dörr et al., 2010). Las toxinas producidas por las diferentes especies de cianobacterias son conocidas como cianotoxinas y pueden clasificarse según su mecanismo de acción en cuatro grupos (Codd, 2000; Codd et al., 2005; Mankiewicz-Boczek et al., 2011; Msagati et al., 2006): a) Hepatotoxinas: dentro de este grupo podemos encontrar microcistinas (agua dulce) y nodularinas (agua salada) que provocan hemorragias masivas, alteraciones en el hígado de mamíferos y, algunos efectos adversos en el riñón. b) Neurotoxinas: en este otro grupo podemos encontrar alcaloides como anatoxina-a o saxitoxina que pueden producir un bloqueo neuromuscular. - 7 - c) Citotoxinas: destaca la cilindrospermopsina, inhibidor de la síntesis proteica. Causa lesiones necróticas generalizadas en mamíferos (hígado, pulmones, riñones, intestino, etc.) y en otros organismos. d) Dermatotoxinas: encontramos lyngbyatoxina A, apysiatoxina y lipopolisacáridos que pueden causar, principalmente, irritación de la piel e inducción de tumores. De todas ellas, las más estudiadas son las microcistinas (MC) y la cilindrospermopsina (CYN) debido a su amplia distribución y toxicidad. Las MC, concretamente la microcistina-LR (MC-LR), junto con la CYN, fueron las responsables de la muerte de 70 pacientes que sufrían insuficiencia renal en el estado de Pernambuco (Brasil), debido a que el agua usada en la hemodiálisis estaba contaminada por estas cianotoxinas (Soares et al., 2006). La exposición humana a cianotoxinas puede tener lugar a través de varias rutas. Así, además de la vía parenteral, también cabe destacar la dérmica (a través del baño o actividades recreativas acuáticas en aguas contaminadas) y, principalmente, la oral (al consumir agua de bebida o alimentos contaminados) suponiendo un peligro para la salud (Žegura et al., 2011) y un interesante objeto de estudio. 1.2. MICROCISTINAS Las MC son producidas por los géneros Microcystis, Anabaena, Nostoc y Oscillatoria (Shen et al., 2003), entre otros. Son heptapéptidos cíclicos que poseen una estructura general compuesta por diferentes aminoácidos: D-alanina (posición 1), ácido D- metilaspártico (posición 3), 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-ácido dienoico o Adda (posición 5), ácido D-glutámico (posición 6) y N-metildehidroalanina (posición 7), así como dos aminoácidos en la posición 2 y 4, que normalmente son L- aminoácidos (Chen et al., 2004) (Fig. 3). - 8 - Figura 3: Estructura general de las MC (Chen et al., 2004) Las MC son las cianotoxinas más extendidas y comprenden un grupo de más de 100 variantes estructurales (Spoof y Catherine, 2017), donde los aminoácidos de la posición 2 y 4 pueden cambiar, siendo la variante más común, y que más toxicidad presenta, la microcistina-LR (MC-LR), que contiene un residuo de leucina en la posición 2 y un residuo de arginina en la posición 4 (Kujbida et al., 2008). Otras variantes importantes son la microcistina-RR (MC-RR) que contiene en la posición 2 y 4 un residuo de arginina, y la microcistina-YR (MC-YR) que contiene un residuo de tirosina en la posición 2 y un residuo de arginina en la posición 4 (Kujbida et al., 2008; Zhong et al., 2017). Según su mecanismo de acción son principalmente hepatotóxicas debido al aminoácido Adda, puesto que inhibe la actividad de las fosfatasas PP1 y PP2A tanto in vivo como in vitro causando cambios en la morfología y en la funcionalidad de los hepatocitos (Fontanillo y Köhn, 2018; Kujbida et al., 2006). Sin embargo, la hepatotoxicidad no es el único daño que pueden llegar a causar, ya que hay evidencias de que pueden producir estrés oxidativo y ser promotores de tumores (Gutiérrez-Praena et al., 2013). De hecho, en 2010 la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) clasificó a la MC-LR en el grupo 2B como "posiblemente carcinógeno para los humanos" (IARC, 2010). Además, diversos estudios han informado sobre la genotoxicidad producida por la MC-LR, que puede causar roturas en las cadenas del ADN, mutaciones de las bases, inducir daño oxidativo e interferir en las vías de reparación del daño del ADN (Liu y Le, 2015; Žegura et al., 2011). Asimismo, hay hallazgos que demuestran que las MC pueden inducir apoptosis de linfocitos humanos, pollos y peces provocando por tanto alteraciones de importancia en el sistema inmune de éstos (Zhang et al., 2006). - 15 - Tabla 1. Estudios de inmunotoxicidad realizados con MC. Tipo de cianotoxina Modelo experimental Ensayo Condiciones de exposición Principales resultados Referencias MC-LR Macrófagos de ratas Wistar Expresión de IL-1β, TNF-α 0,1, 0,3 y 1,0 mg/mL de MC-LR durante 1 h Se produjo un aumento de la expresión de IL-1β y TNF-α a todas las concentraciones. (Rocha et al., 2000) MC-LR MC-YR Esplenocitos y timocitos de ratón B6C3F1 Células EL-4 de timoma de ratón C57BL/6 Linfoproliferación inducida por mitógenos (LPS y ConA) Estabilidad del ARNm de IL-2 inducida por PMA 1-50 µg de MC durante 30 min Inhibición de la linfoproliferación de células B inducida por LPS dependiente de la concentración de MC. MC-YR inhibió la proliferación de linfocitos T inducida por ConA mientras que MC-LR no mostró ningún efecto. Las MC inhibieron la sobreexpresión de ARNm de IL-2 inducida por PMA en esplenocitos y timocitos, pero no tuvieron este efecto en células EL-4. (Yea et al., 2001) Extracto de floración de cianobacterias que contiene MC-LR Esplenocitos de ratón BALB/c Medida de la capacidad de captación de los fagocitos periféricos Proliferación de linfocitos B y T inducida por mitógenos Respuesta de anticuerpos Inyección i.p. de tres dosis 16, 32 y 64 mg de células de algas liofilizadas/kg peso de ratón durante 14 días que contenían 4.97, 9.94, 19.88 μg equivalentes de MC/kg de peso corporal Se observó una disminución de los índices de fagocitos a una dosis de 32 y 64 mg/kg, así como una disminución en la proliferación de linfocitos B inducida por LPS y una disminución de células plasmáticas productoras de anticuerpos. Inmunosupresión en el sistema humoral debido a la disminución de la proliferación de células B. No se afectó la linfoproliferación de células T inducidas por ConA. (Shen et al., 2003) - 16 - MC-LR Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c machos NO, iNOS y abundancia de ARNm de diversas citoquinas Estimulación con 100 µg/L de LPS y exposición a 1- 1000 nmol/L durante 24 h Disminución dependiente de la concentración de los niveles de producción de NO, ARNm de iNOS, IL- 1β y TNF-α, así como una disminución independiente de la concentración de los niveles de ARNm de GM-CSF e INF-γ. (Chen et al., 2004) MC-LR Linfocitos de sangre periférica de pollo y humana cultivados in vitro Producción de citoquinas. Proliferación de linfocitos T y B inducidos por mitógenos 1,10 y 25 µg/mL MC-LR durante 12, 24, 48 y 72 h La MC-LR a la concentración más alta disminuyó la proliferación de células T y a todas las concentraciones inhibió la proliferación de células B. Aumentó en los linfocitos humanos la producción de IL-6 y se disminuyó la de IL-2. (Lankoff et al., 2004) Extracto de floración de cianobacterias que contiene MC-LR Ratones BALB/c hembra Expresión de múltiples citoquinas, incluidas las citoquinas proinflamatorias (IL-1β, TNF-α e IL-6) y Th1/Th2 (IL-2, IL-4 e IL-10) Inyección de 23, 38, 77 y 115 mg de células de algas liofilizadas/Kg de peso corporal que contenían, respectivamente, una concentración de equivalentes de MC de 7, 12, 24 y 36 µg/Kg de peso corporal En comparación con el grupo control disminuyó el nivel de ARNm de IL-1β, TNF-α, IL-2 e IL-4 después de la inyección de todas las dosis, mientras que el nivel de IL-6 no se vio afectado y, el nivel de ARNm de IL-10 aumentó. (Shi et al., 2004) MC-LR Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c Expresión de ARNm de iNOS y múltiples citoquinas (IL-1β, TNF- α, GM-CSF e IFN-γ Macrófagos inducidos se expusieron a 1- 1000 nmol/L de MC-LR durante 6h Disminución significativa de la expresión de ARNm de INOS, IL-1β, TNG-α, GM-CSF e IFN-γ en todas las concentraciones usadas. (Chen et al., 2005) - 17 - MC-LR [Asp3]-MC- LR extraídas de una cepa de Microcystis panniformis Neutrófilos humanos Estudio de la migración, capacidad oxidativa y fagocítica Migración: 0,01- 1000 nM 60 min Capacidad oxidativa: 10, 100 nM, 5 min Capacidad fagocítica: 1 y 1000 nM, 10 y 15 min Ambas MC aumentaron la migración de neutrófilos. Ambas toxinas indujeron la producción de ERO. En presencia de 1 nM de MC hubo un incremento de aproximadamente un 70% de fagocitosis. La concentración más alta no dio lugar a un incremento mayor. (Kujbida et al., 2006) MC-LR MC-RR Linfocitos de la carpa (Carassius auratus) Evaluación de cambios morfológicos Fragmentación de ADN Exposición a 1-10 nM durante 2, 4, 6 y 8 h. Se observaron cambios morfológicos en los linfocitos y se produjo apoptosis de los linfocitos dependiente del tiempo y de la concentración. (Zhang et al., 2006) MC-LR MC-LA MC-YR Neutrófilos de ratas Wistar macho Viabilidad celular y fragmentación de ADN Ensayo de quimioluminiscencia para determinar los niveles de ERO Citoquinas: IL-8 (humano), CINC-2αβ (rata) y TNF-α (humano y rata) 1-1000 nM de las diferentes MC durante 24 h Se observó un mayor número de células con ADN fragmentado tras la exposición a MC-LA y MC-YR y se produjo un aumento significativo de CINC-2αβ tras la incubación con MC-LR. Sin embargo, no se observó un cambio significativo en la producción de TNF-α ni en la generación de ERO intracelular. (Kujbida et al., 2008) Neutrófilos humanos de voluntarios sanos Se observó un aumento de la viabilidad de los neutrófilos con la presencia de MC-LA y MC-LR, pero no se alteró en presencia de MC-YR. La fragmentación del ADN no fue significativa. Además, se produjo un aumento de IL-8 por neutrófilos, un incremento de ERO extracelular y, no se observó un cambio significativo en la producción de TNF-α. - 18 - MC-LR Bazo y pronefros de carpa herbívora (Ctenopharyngodon idella) Evaluación de los cambios patológicos por microscopía electrónica de transmisión Inyección i.p. de 50 µg/Kg de MC-LR Bazo y pronefros fueron diseccionados 1, 2, 7, 14 y 21 días después de la inyección i.p. Se produjeron cambios patológicos en los linfocitos del bazo y en los linfocitos de los pronefros con recuperación de éstos tras los 21 días de la inyección. El bazo fue el órgano más sensible. (Wei et al., 2008) Extracto crudo conteniendo MC Extracto purificado conteniendo MC Extracto no conteniendo MC Linfocitos de voluntarios sanos Viabilidad celular (XTT) Genotoxicidad (ensayo cometa) Viabilidad: incubación con extractos que contienen de 0-10 µg/mL de MC Genotoxicidad: extractos con MC entre 0-4 µg/mL durante 3 y 6 h Se observó un efecto citotóxico y genotóxico en los linfocitos humanos tras la exposición al extracto crudo y purificado de cianobacterias. La mayor citotoxicidad se observa con el extracto purificado. En los resultados se aprecia la influencia de otros compuestos diferentes a MC presentes en los extractos. (Mankiewicz- Boczek et al., 2011) MC-LR Leucocitos de la sangre y de la cabeza de riñón de carpa (Cyprinus carpio L.) PCR y análisis de la expresión de citoquinas pro y antiinflamatorias 0,01-0,1 µg/mL de MC-LR durante 4 h Las células incubadas a baja concentración aumentaron la expresión de IL-1β y TNF-α. No se observó ningún efecto en la expresión de IL-10 ni de TGF-β. Las células de la cabeza de riñón incubadas a alta concentración mostraron una disminución de la expresión de IL-1β y de TNF-α y, un aumento en la expresión de TGF-β y de IL-10. (Rymuszka y Adaszek, 2012) - 19 - MC-LR Ratones Análisis de la función fagocítica de glóbulos blancos Expresión de IL-6, IL- 10 y TNF-α Inyección i.p. de 0- 25.000 µg/Kg/día durante 7 días Se observó una disminución en el índice fagocítico de los macrófagos, pero no se observaron cambios significativos en el índice fagocítico de los leucocitos. Se produjo un aumento dependiente de la dosis de la expresión de IL-6 y disminución de la expresión de TNF-α. No se observaron cambios significativos en la expresión de IL-10. (Huang et al., 2013) Floración de cianobacterias que contenían MC Hígado y timo de ratas (Rattus norvegicus var alba) Histopatología del timo y del bazo y estudios de las poblaciones de linfocitos en sangre periférica, bazo y timo Control: ratas alimentadas con una dieta comercial sin carne de pescado. Grupo D,E: ratas alimentadas con una dieta comercial, 25% de carne de pescado sin cianobacterias y enriquecida con una biomasa de floración de cianobacterias que contiene una concentración de MC de 700 y 5000µg/Kg de alimento. Grupo F: ratas alimentadas con una dieta comercial y 25% de carne de pescado procedente de una localidad con floraciones. No se observaron cambios histológicos significativos. Se observó en sangre periférica que en el grupo D y E hubo un aumento de células NK y linfocitos T gamma-delta. Sin embargo, en los órganos linfoides hubo un aumento de los linfocitos T gammadelta, linfocitos B y linfocitos T CD8+. En el grupo F hubo un aumento significativo en los linfocitos CD4+ y una disminución en los linfocitos CD8+. (Palikova et al., 2013) - 20 - MC-LR MC-RR Carpa (Carassius auratus) Evaluación de cambios morfológicos y de parámetros inmunológicos Control: dieta sin cianobacterias Grupo 1: 20% de liofilizado de cianobacterias que contenían 5,64 mg/Kg de MC Grupo 2: 40% de liofilizado de cianobacterias que contenían 11,28 mg/Kg de MC Se observaron cambios morfológicos en la cabeza del riñón en el grupo 1 y 2. Sin embargo, en el bazo no se observaron cambios significativos en ninguno de los dos grupos. Se produjo un aumento significativo de los fagocitos en ambos grupos. (Qiao et al., 2013) MC-LR Extracto de floraciones que contienen MC-LR Linfocitos y fagocitos aislados de la sangre y de la cabeza de riñón de carpas (Cyprinus carpio L.) Proliferación de linfocitos Expresión de ARNm de citoquinas pro y antiinflamatorias Grupo 1: 25 µg/L de MC-LR pura Grupo 2: 25 µg/L del extracto que contiene MC-LR El agua se cambió y se aplicó la toxina diariamente. Se sacrificaron tras 1,3 y 5 días de exposición No se observó cambio en la proliferación de linfocitos de las células aisladas de los peces expuestos a MC-LR. Sin embargo, en las células expuestas a MC-LR durante 3 y 5 días se observó una inhibición significativa en la proliferación de los linfocitos derivados de la sangre y riñones. Las células aisladas de la sangre expuestas al extracto mostraron un aumento de la expresión de ARNm de IL-1β en los días 3 y 5 y, en los tres días, de TNF-α e IL-10. No se observó cambio significativo en la expresión de TGF-β. En las células aisladas del riñón se observó un aumento de la expresión de IL-1β, TNF-α e IL-10 en los tres días. Las células aisladas del riñón mostraron un aumento de la expresión de IL-1β expuestas a MC-LR pura. No se observó cambio significativo en la expresión de otras citoquinas expuestas a MC-LR pura. (Rymuszka y Adaszek, 2013) - 21 - MC-LR Linfocitos de carpa (C.auratus) Viabilidad de los linfocitos Producción de ERO y apoptosis en inmunocitos Incubación con 1 µg/L de MC-LR y diferentes concentraciones de quercetina durante 24 h Se produjo un aumento de la viabilidad de los linfocitos a concentraciones altas de quercetina. Disminuyó significativamente la producción de ERO y de la apoptosis de los inmunocitos con concentraciones altas de quercetina. (Zhang et al., 2014) MC-LR Pez cebra adulto (Danio rerio) Expresión génica de citoquinas en bazo, intestino y branquias 120 peces se dividieron en cuatro grupos y fueron expuestos a 0, 1, 5 y 20 µg/L MC-LR durante 30 días En el bazo se produjo un aumento significativo de los niveles transcripcionales del IFN-1 y IL-8 a las concentraciones más altas, mientras que a concentraciones más bajas se produce un aumento de la transcripción de IL-1β y TNF-α. Aumento drástico de los niveles de ARNm de IFN-1, IL-1β, IL-8 TGF-β y TNF-α en el intestino y en las branquias. (Chen et al., 2016) MC-LR Carpa común (C.carpio) Expresión génica de proteínas inflamatorias (IL-1β, TNF-α e IFN I) Control: alimentado con una dieta normal Grupo 1: dieta normal e inyección i.p. de 150 µg/Kg de MC-LR. Sacrificio a las 0, 12, 24, 48 y 96h Grupo 2, 3 y 4: dieta con dosis de 0,5-2 g/kg de L-carnitina durante 4 semanas antes de la inyección de MC-LR El grupo 1 mostró un aumento de la expresión de las proteínas inflamatorias. Los grupos 2,3 y 4 mostraron una reducción de los niveles de ARNm de las proteínas inflamatorias. (Chen et al., 2017) - 22 - MC-LR Pez cebra macho Niveles de transcripción de los genes relacionados con el sistema inmune innato esplénico 0-30 µg/L de MCLR durante 30 días Se produjo un activación inflamatoria en los grupos de baja concentración (0.3, 1 y 3 µg/L) y una inhibición inmune en los grupos de alta concentración (10 y 30 µg/L). (Lin et al., 2017) MC-LR Carpa herbívora Análisis de los genes relacionados con el sistema inmune Inyección intraperitoneal de 25, 75 y 100 µg/Kg de MC-LR y sacrificio tras 96 h Se encontró que 61, 203 y 129 genes relacionados con el sistema inmune alteraron su expresión a 25, 75 y 100 µg/Kg de MC-LR, respectivamente. Esto indica una disrupción del sistema inmune. (Wei et al., 2018) Liofilizado de cianobacterias conteniendo MC-LR, MCRR y MC-YR Peces (Megalobrama amblycephala) Acumulación de MC en órganos linfoides Control: dieta con amoniaco y sin cianobacterias Grupo 1: dieta con amoniaco y 15% de liofilizado de cianobacterias que contenían 0,50 mg/g de MC-LR, 0,84 mg/g de MC-RR y 0,07 mg/g de MC-RR durante 30 días Grupo 2: dieta con amoniaco y 30% del mismo liofilizado de cianobacterias durante 30 días Se produjo un aumento de la concentración de MC dependiente de la concentración de amoniaco en los órganos linfoides. Se observaron cambios morfológicos en los linfocitos del grupo 1 y 2 dependientes de la concentración de amoniaco. Aumentó la actividad fagocítica en el grupo 1 y se produjo una disminución en el grupo 2. (Xia et al., 2018) - 23 - 4.1.1. EFECTO DE LAS MC SOBRE LOS LINFOCITOS Los linfocitos son células blancas que reconocen antígenos extraños originando respuestas inmunitarias adquiridas. Se desarrollan principalmente en los órganos linfoides y, según donde maduren, se originarán dos tipos de linfocitos (linfocitos B y T) que tendrán diferentes funciones en la inmunidad. De manera que los linfocitos B madurarán en la médula ósea y serán mediadores de la inmunidad humoral mientras que los linfocitos T madurarán en el timo y serán mediadores de la inmunidad celular (Abbas et al., 2015). En la tabla 1 se muestran los diferentes ensayos que se han realizado para evaluar el efecto de las MC sobre los linfocitos. En los primeros estudios in vitro realizados se estimuló la producción de linfocitos con mitógenos y se comprobó que MC-LR y MC-YR inhibieron la proliferación de linfocitos B en los esplenocitos de ratón, pero en cambio, sólo MC-YR fue capaz de inhibir la proliferación de linfocitos T a altas dosis (Yea et al., 2001). Otros autores también han comprobado que MC-LR ha disminuido la proliferación de linfocitos B mientras que la proliferación de linfocitos T no se ha afectado, ha disminuido sólo a dosis altas o pasados varios días tras la exposición (Lankoff et al., 2004; Rymuszka y Adaszek, 2013; Shen et al., 2003). Además, en otros estudios donde se alimentaron a ratas con floraciones de cianobacterias que contenían MC o con pescados contaminados con cianotoxinas se pudo comprobar cómo en las alimentadas con floraciones se había producido un aumento de linfocitos B y de diversos linfocitos T, mientras que en las alimentadas con pescados contaminados se produjo un aumento de los linfocitos T CD4+, que se encargan de activar a los linfocitos B, y una disminución de los linfocitos T CD8+, encargados de eliminar células afectadas (Palikova et al., 2013). Todo ello, nos lleva a pensar que las MC son capaces de producir inmunosupresión humoral al inhibirse o disminuirse los linfocitos B en los diferentes órganos y, serán capaces de producir inmunosupresión celular al inhibirse o disminuir los linfocitos T sólo cuando las concentraciones de MC sean altas y/o hayan pasado varios días tras la infección. - 24 - 4.1.2. EFECTO DE LAS MC SOBRE LA EXPRESIÓN DE CITOQUINAS Las citoquinas son proteínas que se encargan de coordinar la respuesta del sistema inmunológico. Estas citoquinas pueden actuar sobre varias células del sistema inmune a la misma vez originando respuestas antagónicas. Las principales citoquinas que podemos encontrar son: interleuquinas (IL), factor de necrosis tumoral (TNF), interferones (IFN), factor estimulador de colonias (CSF) y quimiocinas (Abbas et al., 2015). En la tabla 1 se incluyen diversos ensayos relacionados con la alteración de la expresión de varias citoquinas inducida por MC. Su expresión varía aumentando o disminuyendo en función de la dosis/concentración utilizada, de manera que en algunos ensayos se puede comprobar cómo a dosis bajas se estimula unos tipos de citoquinas y a dosis altas se inhiben. Sin embargo, siempre se ha observado que la interleuquina-2 (IL-2), importante para la proliferación y supervivencia de los linfocitos T así como para activar otro tipo de citoquinas, ha disminuido su expresión (Lankoff et al., 2004; Shi et al., 2004; Yea et al., 2001). Además, en la mayoría de los ensayos se ha producido una disminución en la expresión de citoquinas pro-inflamatorias (IL-1β, TNF-α, IFN-γ, etc.) y de mediadores como iNOS o NO. Mientras que las citoquinas antiinflamatorias (TGF-β, IL-10, IL-4, etc.) han aumentado su expresión. Por tanto, se puede afirmar que las MC tienen influencia sobre los diferentes mediadores de la respuesta inmune afectando de esta manera a la respuesta inmune adaptativa. 4.1.3. CAMBIOS MORFOLÓGICOS PRODUCIDOS POR LAS MC Las MC son capaces de generar cambios morfológicos en los linfocitos. Principalmente, en los estudios recopilados en la tabla 1 que incluyeron observación microscópica, las mitocondrias se volvieron edematosas, se observaban vacuolas en el citoplasma, compactación de la cromatina y deformación del núcleo (Qiao et al., 2013; Wei et al., 2008; Zhang et al., 2006). En otro estudio se demostró que se producían cambios morfológicos en los linfocitos cuando aumentaba la concentración de amoniaco, puesto que el amoniaco era capaz de concentrar las MC en los órganos linfoides (Xia et al., 2018). Estos cambios serán los responsables de que se pueda llegar a producir la apoptosis de los linfocitos. - 31 - 6. BIBLIOGRAFÍA Abbas A.K., Lichtman A.H., Pillai S. Inmunología celular y molecular. 8ª ed. Barcelona: Elsevier Inc; 2015. Abbas A.K., Lichtman A.H., Pillai S. Inmunología básica. Funciones y trastornos del sistema inmunitario. 5ª ed. Barcelona: Elsevier Inc; 2016. Aráoz R, Molgó J, Tandeau de Marsac N. Neurotoxic cyanobacterial toxins. Toxicon 2010;56:813-28. 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