Proteostasis y degeneración macular asociada a la edad

1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA. FACULTAD DE FARMACIA Proteostasis y Degeneración Macular Asociada a la Edad Revisión bibliográfica Gloria Mora Castaño Junio, 2017 2 Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Trabajo Fin de Grado Doble Grado en Farmacia y Óptica y Optometría Proteostasis y Degeneración Macular Asociada a la Edad Gloria Mora Castaño Facultad de Farmacia, Junio 2017 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Tutor: Diego Ruano Caballero Revisión bibliográfica 3 Resumen En los últimos 100 años, la esperanza de vida ha aumentado, por tanto, hay un envejecimiento de la población que repercute en el incremento de la prevalencia de las enfermedades neurodegenerativas, entre ellas la Degenarción Macular Asociada a la Edad (DMAE). Estas enfermedades son proteinopatías pues los mecanismos que mantienen la proteostasis están desregulados. Los mecanismos principales son el proteosoma, las chaperonas y la autofagia. En presencia de estrés estos mecanismos se activan. Sin embargo, con el estrés crónico y en edades avanzadas, se ven disminuidos. Así ocurre también en las enfermedades neurodegenerativas y en la DMAE, que es la principal causa de ceguera entre las personas mayores de 60 años. Su principal agente etiológico es el estrés oxidativo en el epitelio pigmentario (EPR) que puede ser tanto endógeno como exógeno. Debido a las elevadas exigencias metabólicas del EPR, se generan altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). Existen factores que combaten el estrés oxidativo, destacando el Nrf2, que a su vez está regulado por otros factores como el p62. Sin embargo, estos mecanismos de defensa antioxidantes también están alterados en presencia de estrés oxidativo crónico. Todo ello tiene como consecuencia la desregulación de los sistemas que mantienen la proteostasis, siendo el sistema ubiquitina-proteosoma uno de los más importantes en el EPR, que no sólo afecta a la formación de agregados proteicos sino que también se estimulan factores proangiogénicos como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Como resultado se obtienen un cúmulo de proteínas dañadas, el incremento de la inflamación y la angiogénesis, característicos de la DMAE. Palabras clave: proteostasis, DMAE, ubiquitina-proteosoma, estrés oxidativo, EPR. 4 ÍNDICE Introducción .................................................................................................................................. 5 Objetivos de la revisión ................................................................................................................. 6 Metodología .................................................................................................................................. 7 Resultados y discusión .................................................................................................................. 8 1. Proteostasis ....................................................................................................................... 8 1.1 Maduración de las proteínas ..................................................................................... 8 1.2 Proteosoma ............................................................................................................... 8 1.3 Inmunoproteosoma ................................................................................................ 10 1.4 Pérdida de la proteostasis ....................................................................................... 10 2. Degeneración Macular Asociada a la Edad ..................................................................... 13 2.1 Tipos DMAE ............................................................................................................. 15 2.2 Estrés oxidativo ....................................................................................................... 16 2.2.1 Protección contra el estrés oxidativo…………………………………………………18 2.2.2 Cambios en los sistemas de protección contra el estrés oxidativo con la edad…………………………………………………………………………………………………………..………..20 2.3 Proteínas de choque térmico .................................................................................. 21 2.4 Vía de la ubiquitina-proteosoma en el ojo .............................................................. 24 2.4.1 Importancia de la vía ubiquitina-proteosoma……………………………………26 2.4.2 Relación del estrés oxidativo con la vía ubiquitina-proteosoma………..27 2.4.3 Consecuencias de la desregulación de la vía ubiquitina-proteosoma en la retina………………………….……………………………………………………………………………………28 2.5 Autofagia ................................................................................................................. 28 Conclusiones ............................................................................................................................... 31 Bibliografía .................................................................................................................................. 32 5 Introducción En los últimos 100 años, la población ha experimentado un aumento en la esperanza de vida pasando de ser 40 años en la década de los 50 a los 80 años en la actualidad. Esto es debido a múltiples factores como los avances tecnológicos, mejoras en las condiciones higiénicas y el control de enfermedades infecciosas, sobre todo en los países industrializados (Garcés, 2016). El incremento de la esperanza de vida tiene como consecuencia el aumento del porcentaje de población de edad avanzada, que se traduce en un envejecimiento de la población ndación General CSIC., 2010; Garcés, 2016). En el caso de España, el fenómeno de envejecimiento es acelerado, pues en menos de 30 años se ha duplicado el número de personas mayores de 65 años. Según las estimaciones realizadas por el Instituto Nacional de Estadística (INE), las personas mayores de 65 años representarán más del 30% de la población en el año 2050 ndación eneral ., 2010). Este cambio poblacional supone también un incremento de la prevalencia de las enfermedades neurodegenerativas, tales como el Alzheimer, pues los estudios estadísticos muestran una clara relación de algunas de ellas con la edad. Frente a esto, se han abierto líneas de investigación para comprender el origen de estas patologías. Hoy en día, la mayoría de estas enfermedades no tienen cura. Actualmente, el objetivo terapéutico respecto a las enfermedades neurodegenerativas se centra en prevenir o retrasar su aparición, y en alargar la supervivencia y mejorar la calidad de vida de los pacientes, llegando a convertirla en enfermedades crónicas (Garcés, 2016). Así mismo, el envejecimiento de la población también implica un incremento de la prevalencia de la DMAE (Europa-Press, 2015), por ser una enfermedad neurodegenerativa también. La DMAE es una enfermedad que generalmente afecta a las personas mayores de 60 años, y es la principal causa de ceguera entre los ancianos (Handa, 2012; Wong et al., 2014). Mientras que la frecuencia de la DMAE en la población general es menos de 1 de cada 10 personas, a partir de los 85 años aumenta a 1 de cada 3 (Europa-Press, 2015). En la actualidad, esta enfermedad aflige al 30% de las personas mayores de 70 años, que supone una cifra de 60 millones de personas en todo el mundo. En EE.UU. hay 10 millones de personas afectadas por la DMAE, y se prevé que este número se duplique para el año 2050 (Mettu et al., 2012). El impacto de la DMAE para el individuo es sorprendente. La disminución de la calidad de vida con la DMAE temprana es similar a la de una persona con VIH sintomático. Así mismo, la calidad de vida con la DMAE avanzada se puede compara con la de un paciente con cáncer de 6 próstata metastásico con un dolor incontrolable. Esta reducción en la calidad de vida se ve acentuada con la disminución de la actividad, la depresión y la ansiedad. El impacto de la DMAE también recae en salud pública pues supone 30.000 millones de dólares anuales, y se prevé que aumente, dado que las personas mayores de 60 años representan el segmento de la población que crece más rápidamente (Handa, 2012; Mettu et al., 2012). Entre los factores que influyen en las enfermedades neurodegenerativas, la proteostasis juega un papel importante. La homeostasis de las proteínas o proteostasis es el proceso que regula el balance adecuado de proteínas dentro de la célula en función de las necesidades de éstas para mantener la salud tanto del proteoma celular como del propio organismo (Enzo Life Sciences, 2017). Este concepto abarca el estudio de las proteínas de manera individual, desde su síntesis, ubicación celular y función, hasta su vida media y degradación (Triana-Martínez et al., 2012). Mantener la homeostasis de las proteínas supone constantemente un desafío debido a una serie de circunstancias como son cambios en las condiciones ambientales de la célula, mutación genética, la capacidad limitada del correcto plegado de las proteínas, o el proceso de envejecimiento. Para mantener la proteostasis celular, las células cuentan con mecanismos que permiten un control de calidad de las proteínas nacientes a través de la eliminación de aquellas que están mal plegadas, evitar la formación de agregados proteicos y mecanismos que ayudan a un plegamiento correcto de las proteínas, puesto que una desregulación de la proteostasis puede conducir al desarrollo de enfermedades conocidas como proteinopatías (Dubnikov et al., 2017). Objetivos de la revisión Dado que la DMAE es una proteinopatía, nos planteamos conocer, en primer lugar, los mecanismos que intervienen en la proteostasis, así como las disfunciones de los mismos durante el envejecimiento. Siendo tan alta la prevalencia de esta enfermedad y tan alto el impacto que supone para los que la padecen, es objeto de estudio cómo se desencadena el proceso patológico. Así mismo, se estudiará si los mecanismos que mantienen la proteostasis se encuentran alterados en la patología y, en su caso, de qué forma están alterados y las repercusiones que esto tiene para el desarrollo de la DMAE. 7 Metodología Esta revisión bibliográfica se ha hecho a partir tanto de trabajos originales como de otras revisiones sobre el tema. También se han consultado páginas web oficiales, como la de la Fundación General CSIC. Para todo ello, se ha buscado información en bases de datos internacionales. Se ha tratado de elaborar una estrategia de búsqueda amplia de información relacionada con la enfermedad tratada en el tema. La búsqueda bibliográfica comenzó a finales de enero de 2017, y finalizó a finales de mayo del mismo año. Las principales fuentes de información fueron PubMed, Medline y Scopus en menor medida, en las que se puso como condición que los artículos o revisiones tuviesen menos de 10 años, con el fin de encontrar la información más actual. Finalmente, se ha aceptado información anterior a 10 años, al considerarla necesaria para realizar esta revisión. Hemos partido, por tanto, de artículos y revisiones actuales, que nos han llevado en ocasiones a informaciones algo más antiguas. La combinación de palabras clave y filtros ha sido vital para la búsqueda bibliográfica. “Proteostasis and age-related mac lar degeneration” ha sido la combinación más sada con frecuencia. Otras combinaciones y palabras han sido: “proteostasis”, “proteasome”, “chaperones and age related macular degeneration”, “a tophagy”. Se ha realizado casi en su totalidad en inglés, por ser en el idioma en el que más información hay sobre este tema. De todos los resultados obtenidos, se han escogido aquellos que se encontrasen dentro de unos criterios de inclusión preestablecidos, y se desecharon aquellos que no cumplían estos criterios: publicación realizada hace menos de 15 años, publicación en español, inglés, o francés, información asociada a la vía ubiquitina-proteosoma en especial, más que a la de otros mecanismos que intervienen en la proteostasis, artículos con relación directa entre la proteostasis y la DMAE. 8 Resultados y discusión 1. Proteostasis 1.1 Maduración de las proteínas Los polipéptidos nacientes se someten a un proceso complejo de múltiples etapas de maduración para alcanzar su estructura espacial correcta, obtener adecuadas modificaciones postraduccionales y convertirse en proteínas funcionales. Por ejemplo, las proteínas que van a ser secretadas llevan una señal de localización de retículo endoplasmático (RE). Así, dichas proteínas entran en el retículo. A medida que se va sintetizando la proteína, entran en juego las chaperonas, proteínas que asisten en el proceso de plegamiento para evitar errores de conformación. Una vez alcanzado el plegamiento correcto, las proteínas pasan al aparato de Golgi, donde experimentan las últimas etapas de maduración, exceptuando las que no se hayan plegado correctamente que serán retro-translocadas al citosol para su degradación por el proteosoma (Sauer et al., 2008; Dubnikov et al., 2017). 1.2 Proteosoma El proteosoma es un complejo multiproteico cuyas funciones son destruir proteínas malformadas, tiene un papel regulador como parte del sistema ubiquitina-proteosoma, interviene en la diferenciación celular, regula el ciclo celular y es defensa contra toxinas, entre otras. Debido a todo esto, podemos entender la importancia que tiene para la célula (Franco et al., 2008). Este complejo multiproteico lo componen 3 partículas estructurales: una partícula 20S con función catalítica y dos partículas 19S con función reguladora. La subunidad 20S tiene forma de barril y está compuesta a su vez por 4 anillos que son idénticos dos a dos: 2 anillos alfa (α) y 2 anillos beta (β) (Franco et al., 2008; Medicina molecular, 2008) (Figura 1). Uno de los anillos α se encuentra en la parte superior del proteosoma 20S y el otro en la parte inferior. Cada uno de estos anillos está formado por 7 subunidades. Los anillos β se encuentran en la parte interior del proteosoma 20S y también están formados cada anillo por 7 subunidades (Franco et al., 2008). La actividad catalítica la desempeñan las subunidades β1 (actividad caspasa), β2 (actividad tripsina) y β5 (actividad quimotripsina) (Angosto, 2005). La subunidad 19S se une a los extremos de la subunidad 20S (Medicina molecular, 2008). Esta subunidad está formada por una tapa y una base que se une al proteosoma 20S (Angosto, 2005) (Figura 2). Para que una proteína sea reconocida y sufra degradación en el proteosoma 26S, debe estar marcada previamente con ubiquitina. El proceso de degradación de las proteínas ubiquitinadas 9 empieza por el reconocimiento de las mismas a través del receptor de ubiquitina de la subunidad 19S. Le sigue la función ATPasa de la subunidad 19S que emplea la energía para desplegar la proteína sustrato y continúa con la introducción de la proteína en la subunidad 20S previamente desubiquitinada por acción de las isopeptidasas. Dentro del proteosoma, la proteína se rompe en fragmentos que saldrán por el extremo 19S opuesto (Angosto, 2005). Una de las funciones del proteosoma es degradar proteínas mal formadas o aquellas que necesitan un recambio por antigüedad. El proteosoma cobra especial importancia en la degradación de proteínas de vida media muy corta como las ciclinas del ciclo celular, las proteínas que participan en la cascada de señalización intracelular en respuesta a señales externas o las que participan en la reparación del daño en el ADN. El proteosoma puede ser regulado mediante distintas vías. Una de ellas es a través de la proteína Rpn4 que es capaz de estimular la inducción de los genes que codifican el proteosoma. A su vez, el gen que codifica Rnp4 está sujeto a una compleja regulación en la que participan varios factores de transcripción en respuesta a los distintos estímulos y tipos de estrés celular que requieran un aumento en los niveles de proteosoma (Medicina molecular, 2008). Figura 1. Representación de la partícula 20S. Modificado de Hispano-300, 2015. Figura 2. Representación del proteosoma 26S. Modificado de Angosto, 2005. 16 como el VEGF (Taylor, 2012). Este factor favorece el crecimiento de neovasos subyacentes al EPR que se originan en la coriocapilar que, a través de roturas de la membrana de Bruch, llegan al epitelio. El papel de la inflamación en la progresión de la DMAE se conoce de muchos años atrás. Diversos estudios identifican una relación entre macrófagos y la formación de membranas neovasculares en la DMAE húmeda. Las quimioquinas desempeñan un papel importante en la quimiotaxis del reclutamiento y activación de macrófagos. Es sabido que la expresión de genes relacionados con quimioquinas es notable en todas las formas (húmeda y seca) de la DMAE (Rutar y Provis, 2016). La pérdida de vasos en la coriocapilar también podría ser un estímulo para la formación de drusas, ya que el sistema de eliminación de desechos retinales y material exocitado del EPR sería limitado (Bhutto y Lutty, 2012). Debido a la presencia de nuevos vasos anormales, se pueden producir hemorragias que invaden la retina, especialmente la zona central, impidiendo la visión de los individuos. La forma húmeda podríamos decir que es la forma grave de la enfermedad (Verdaguer, 2010; Monés, 2017). Figura 6. Formas de DMAE. Tomada de Bhutto y Lutty, 2012. 2.2 Estrés oxidativo Entre los muchos factores que hacen que la investigación de la DMAE sea tan desafiante es que la enfermedad es claramente multifactorial. Se han propuesto muchas hipótesis para explicar la etiología y mecanismos de la DMAE, y la mayoría de las investigaciones presentan 17 datos para apoyar al menos una hipótesis: incluyen el estrés oxidativo como una de las causas más importantes en la DMAE (Chen et al., 2014; Handa, 2012; Taylor, 2012). Como ya hemos dicho, la mácula tiene una alta demanda metabólica y esto se traduce en altos niveles de ROS. También es sabido que el EPR se encarga de fagocitar los extremos más externos de los fotorreceptores. De hecho, el EPR fagocita casi 30.000 segmentos externos cada día. Durante la fagocitosis del segmento externo, el H2O2 intracelular resultante de la NADPH oxidasa en el fagosoma o de la β-oxidación de los lípidos en los peroxisomas se genera en la misma proporción con la que se produce en otras células fagocíticas como los macrófagos (Handa, 2012). Así podemos hacernos una idea del nivel de estrés oxidativo al que está sometido el EPR, que se traduce en la acumulación de proteínas alteradas, lípidos y/o material genético que puede ser citotóxico y puede acumularse en formas o en sitios que dan lugar a un EPR disfuncional (Taylor, 2012). Las células del EPR se protegen de un exceso de estrés oxidativo en parte, mediante la regulación catalasa durante este proceso (Handa, 2012; Mettu et al., 2012). Además, la acumulación de lipofuscina promueve el mal plegamiento de proteínas intracelulares, produciendo un estrés oxidativo adicional en las células del EPR, puesto que se ha demostrado que inhibe la respiración mitocondrial (Mettu et al., 2012; Jarrett y Boulton, 2012; Kaarniranta et al., 2009). También hay factores exógenos que son fuente adicional de estrés oxidativo. La mácula procesa la luz para la visión y el estrés fotooxidativo se ha relacionado con el daño oxidativo a la retina, el EPR y la coroides, y múltiples trabajos han corroborado esta observación. Estos datos se correlacionan con el vínculo epidemiológico de la exposición a la luz solar y el riesgo de DMAE (Mettu et al., 2012). El humo del cigarrillo sería otra de las fuentes de estrés oxidativo pues genera más de 4.700 componentes químicos, algunos de los cuales son oxidantes fuertes (Rangasamy et al. 2004). De hecho, cada bocanada de humo de cigarrillo contiene 1.015 radicales libres. Mientras el papel exacto del daño oxidativo causado por el tabaquismo en la DMAE es desconocido, está claro que los oxidantes químicos en el humo de los cigarrillos agotan los niveles del ácido ascórbico en los tejidos y de los grupos sulfidrilo de las proteínas, causando la oxidación del ADN, de los lípidos y de las proteínas. Muchos de estos cambios moleculares tales como malondialdehído, 4-hidroxinonenal, y los productos finales de glicación avanzada (AGE), se han identificado en la DMAE, e indican que el daño producido por la oxidación es un factor importante en el mecanismo de desarrollo de la enfermedad (Chen et al., 2014; Handa, 2012). Muchos de los oxidantes del humo del cigarrillo tienen preferencia por dirigirse a las células 18 del EPR produciendo lesiones en él y finalmente dar lugar a la apoptosis celular. Estos oxidantes en el EPR suprimen la expresión de la proteína quimioatrayente de monocitos 1 resultando en la reducción del reclutamiento de los macrófagos eliminadores y como consecuencia, acumulación de desechos proinflamatorios en el EPR. Entre los oxidantes del humo de cigarrillo destaca la hidroquinona, que provoca estrés en el retículo endoplásmico, encargado de la biosíntesis y modificaciones postraduccionales de proteínas de membrana. Así, este estrés conduce a la apoptosis de las células del epitelio pigmentario. Esto es debido a la supresión por parte de la hidroquinona de XBP1, una proteína esencial para la supervivencia celular en el EPR (Chen et al., 2014). En resumen, la combinación de un flujo muy alto de sangre oxigenada y la exposición a fotosensibilizadores y la luz en la retina crea un ambiente ideal para la generación de ROS y el resultante daño oxidativo. Además, hay elevadas concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados que son extremadamente propensos a la peroxidación de lípidos. Este estrés oxidativo, combinado con capacidades antioxidantes disminuidas al envejecer, da como resultado un aumento de la carga citotóxica. La disminución de las capacidades proteolíticas debida a la edad y al estrés exacerba la acumulación de disfunciones dentro del EPR. En conjunto, estas disminuciones y la deficiencia de los sistemas reparativos dan lugar a una disfunción retiniana asociada con la DMAE (Taylor, 2012). 2.2.1 Protección contra el estrés oxidativo Existen diversas moléculas antioxidantes cuya función es combatir el estrés oxidativo. Estos sistemas están regulados por factores de transcripción como NF-κB, AP1, la familia FoxO, o PGC-1α (Handa, 2012). El NF-κB está implicado en procesos inflamatorios, inmunes, de estrés y del desarrollo. Este factor sufre un proceso de dos etapas para su activación. En primer lugar, la proteína precursora p105 se rompe y forma la proteína p50 activa. Ésta se une a p65 formando un heterodímero con el inhibidor IκB. Después de un estímulo celular (citoquinas, componentes víricos, bacterianos o situaciones de estrés), se induce la fosforilación del inhibidor κB que conduce a la rápida ubiquitinación de dicho inhibidor y posterior degradación por el proteosoma. Así el heterodímero (p50-p65) NF-κB queda libre y activo y puede translocarse al núcleo, donde inicia la transcripción específica de genes proinflamatorios. La activación del NF-κB j ega n importante papel en m chos aspectos del desarrollo tumoral, progresión y terapia, así como en la activación de genes que codifican para IL-1 y otras citoquinas que promueven la inflamación y genes necesarios para proliferación celular, adhesión celular y angiogénesis (Angosto, 2005). 19 No obstante, el sistema de transcripción más potente está mediado a través del Nrf2. El Nrf2 regula un programa transcripcional coordinado que mantiene la homeostasis celular redox y protege a la célula de lesiones oxidativas (Rangasamy et al., 2004). El Nrf2 es normalmente secuestrado en el citosol mediante la interacción con Keap1, que funciona como una proteína de adaptador de sustrato de Nrf2 para que se degrade por la vía ubiquitina-proteosoma, ayudando a mantener los niveles de estado estacionario de Nrf2. Así, en ausencia de estrés, Keap1 hace que se degrade Nrf2 y así prevenir su translocación al núcleo, lo que resulta en una baja expresión basal de genes antioxidantes (Handa, 2012). Sin embargo, tras la exposición a ROS, Keap1 sufre un cambio conformacional cuando sus múltiples residuos de cisteína interactúan con ROS, que libera Nrf2 e inhibe a Keap1. El Nrf2 liberado se transloca entonces al núcleo, donde se dimeriza con Maf, y se une al elemento de respuesta antioxidante (ARE) en los promotores de sus genes diana para iniciar la transcripción (Figura 7). La respuesta derivada de esto es una regulación de enzimas como la catalasa o superóxido dismutasa (SOD) que neutralizan H2O2 y superóxido, respectivamente, el mantenimiento de glutatión celular y tiorredoxina, y las enzimas del metabolismo xenobiótico que producen equivalentes reductores, tales como NADPH quinina oxidorreductasa (NQO - 1). Cuando las ROS agotan el glutatión celular, las células pueden morir por apoptosis mediada oxidativamente. Es importante destacar que Nrf2 juega un papel antioxidante esencial en el EPR (Jarrett y Boulton, 2012; Handa, 2012). Figura 7. Regulación de moléculas antioxidantes por Nrf2. Tomado de Handa, 2012. 20 Además, diversos estudios han demostrado la relación de la proteína p62 con la regulación de Nrf2. Esta proteína interactúa con diversos factores de señalización y regula una variedad de funciones celulares incluyendo inflamación, apoptosis y autofagia. Se ha revelado en el EPR que p62 promueve la autofagia en él y simultáneamente mejora una respuesta antioxidante mediada por Nrf2 para proteger contra el estrés oxidativo agudo. También se ha observado que p62 contribuye a la inflamación mediada por NF-κB. Esto lleva a plantearnos si p62 protege o agudiza la lesión tisular (Wang et al., 2016). Como ya hemos dicho, la eliminación de las proteínas oxidadas o mal plegadas depende del proteosoma y la autofagia. Pues el estrés agudo inhibe el proteosoma, pero regula los genes antioxidantes, como ya sabemos, y también de la autofagia, incluyendo p62. También se ha confirmado el papel protector de p62 en el EPR, a través tanto de la autofagia como de la activación de la señalización antioxidante Nrf2 (Wang et al., 2016). Una de las funciones de p62 es unirse a proteínas poliubiquitinadas y guiarlas hacia el autofagosoma. Hay estudios que confirman que el silenciamiento de p62 en el EPR produce una autofagia ineficiente, y que la sobreexpresión de la misma produce una eficiente autofagia. Sin embargo, se ha observado que la influencia de p62 en la autofagia sólo se da cuando las células están bajo estrés oxidativo. Esto lleva a pensar que en condiciones basales, las células del EPR dependen de sistemas como el proteosoma, y que la influencia de p62 en la autofagia se reserva para situaciones de mucho estrés. Además favorece la transcripción del antioxidante Nrf2. Por tanto, p62 produce dos mecanismos de citoprotección del EPR, via autofagia de proteínas insolubles y la activación de Nfr2 (Wang et al., 2016). 2.2.2 Cambios en los sistemas de protección contra el estrés oxidativo con la edad Con la edad, p62 sufre daño oxidativo. En ratones de edad avanzada se observa una expresión reducida de p62, por lo que se podría pensar que ratones e incluso pacientes con DMAE también tuvieran reducidos los niveles de p62. Pero se ha observado lo contrario. Observaciones similares aparecen en pacientes con enfermedades neurodegenerativas. Esta contradicción puede deberse a la desregulación postranscripcional de la p62 para rescatar células dañadas. Pero es cuestionable si p62 es capaz de eliminar las proteínas agregadas cuando la maquinaria de autofagia está dañada (Wang et al., 2016). Dado que el fallo de la autofagia y una respuesta debilitada de Nrf2 en el EPR es un componente de la DMAE, el p62 acumulado en el área de la enfermedad posiblemente ejerce 21 un efecto dañino agravando la inflamación crónica, una característica común de las enfermedades neurodegenerativas (Wang et al., 2016). También con la edad se ha observado una disminución de Nrf2 así como en la enfermedad. No obstante, la respuesta antioxidante alterada podría revertirse disminuyendo la expresión de Keap1 o aumentando la de Nrf2. En la DMAE, el equilibrio entre el estrés oxidativo fisiológico y el inicio del estrés oxidativo patológico se altera, dando lugar a daño tisular. La capacidad de defenderse contra el estrés oxidativo mediante la regulación de la respuesta antioxidante es probable que sea un acontecimiento central que medie la iniciación y la progresión de la DMAE (Handa, 2012). La señalización deficiente de Nrf2 predispone al desarrollo de inflamación, que es uno de los factores que inciden en la DMAE. Por el contrario, la activación de Nrf2 impide el estrés oxidativo mediado por la inflamación. Además, se ha observado que en el EPR de ratones deficientes de Nrf2 hay segmentos de fotorreceptores no digeridos, autofagosomas, autolisosomas y agregados de proteínas poliubiquitinadas (Handa, 2012). Ante la deficiente capacidad de combatir el estrés oxidativo, se generan lípidos oxidados altamente reactivos. En la mácula destaca el ácido docosohexanoico (DHA), que es el ácido graso más abundante en las puntas de los fotorreceptores, y es también el ácido graso más oxidable en el cuerpo debido a su estructura insaturada. Estos lípidos oxidados pueden modificar proteínas, lípidos y ADN. Estas modificaciones pueden activar la respuesta inmune. Si la producción de estas modificaciones supera la capacidad de los sistemas de eliminación de estos daños, puede dar como resultado la apoptosis del EPR y la acumulación de desechos inflamatorios dentro de la membrana de Bruch que favorece la formación de drusas. Esta acumulación de restos citotóxicos compromete la maquinaria de edición de proteínas celulares que promoverán aún más la biogénesis de drusas. La pérdida de la función del EPR lleva también a una pérdida de la función de los fotorreceptores y por tanto, pérdida de la visión (Handa, 2012). 2.3 Proteínas de choque térmico La expresión de las proteínas de choque térmico se induce para prevenir la desnaturalización y agregación de proteínas. Estas proteínas ayudan en el repliegue de proteínas dañadas y su translocación a su correcta localización intracelular (Bukau et al., 2006). También interaccionan de forma no covalente con las superficies hidrófobas expuestas de proteínas no nativas y las estabilizan para evitar una agregación irreversible (Kaarniranta et al., 2009). 22 La Hsp90 es una de las proteínas de choque térmico más conservadas y desempeña un papel en la regulación de la fisiología celular tanto en condiciones normales como en situaciones de estrés (Aguilà y Cheetham, 2016). Regula la estabilidad y activación de ciertas proteínas así como participar en el etiquetado de las mismas para proceder a su degradación por el proteosoma (Kaarniranta et al., 2009). En condiciones de reposo, Hsp90 se une al factor de transcripción sensible al estrés, el factor de choque térmico 1 (HSF-1), para silenciar la actividad del mismo. Esto es una forma de regulación de los niveles de chaperonas moleculares según las necesidades de plegamiento de las proteínas. Por tanto, la inhibición de Hsp90 conduce a la liberación de HSF-1 y consecuentemente, esto supone una activación de la respuesta al estrés y un aumento de chaperones moleculares. Así mismo, esta inhibición de Hsp90 puede conducir a la degradación de las proteínas mediada por el proteasoma. También lleva a un aumento del nivel de chaperonas como las Hsp70 y Hsp40. En conjunto, tenemos un efecto protector mejorado contra la agregación de proteínas y una toxicidad proteica reducida (Aguilà y Cheetham, 2016). Recientemente, se ha observado que Hsp90 regula la agregación yuxtanuclear de proteínas que son dirigidas por la red de microtúbulos. Los agregados de proteínas formados en la periferia de la célula son transferidos a lo largo de los microtúbulos a un lugar yuxtanuclear donde forman agregosomas. Una forma de prevenir estos agregosomas sería despolimerizar los microtúbulos mediante fármacos o prevenir la función Hsp90 (Kaarniranta et al., 2009). Hsp90 desempeña un papel indispensable en la homeostasis de la retina puesto que una inhibición prolongada de Hsp90 conduce a la muerte de células fotorreceptoras. Hsp90 se expresa también en las células del EPR y aumenta su expresión durante el desarrollo de la DMAE. Hsp90 de células necrosadas del EPR estimula la inflamación de células adyacentes sanas del EPR. Para evitar esta inflamación sería necesaria la inhibición de Hsp90. Uno de estos inhibidores, geldanamicina, es inhibidor también del VEGF inducido por hipoxia en células del EPR. De esta forma podemos deducir que la inhibición de Hsp90 podría evitar la inflamación y angiogénesis que se da en la DMAE (Aguilà y Cheetham, 2016). Por otro lado, la chaperona Hsc70 tiene como una de sus funciones participar en la autofagia mediada por chaperonas y la inhibición de la agregación de proteínas durante condiciones de estrés (Bukau et al., 2006). La forma citosólica de Hsc70 reconoce la secuencia KFERQ en el sustrato y lo dirige para su degradación por autofagia. Hsc70 se unen a la membrana lisosomal. Otra forma de Hsc70 también existe en la luz lisosomal. Si tratamos con anticuerpos 23 inhibidores de lisosomas, esto conduce también a la inhibición de la autofagia indirectamente por la inhibición de la función lisosomal de Hsc70 lisosomal (Kaarniranta et al., 2009). Además, la síntesis de Hsp está estrechamente conectada al sistema ubiquitina-proteosoma, ya que la inhibición de la maquinaria del proteosoma y la acumulación de proteínas altamente ubiquitinadas inducen HSF-1 y una posterior respuesta del gen Hsp. Si la capacidad de las Hsp para reparar daños en proteínas es insuficiente o la degradación por parte del proteosoma se ve comprometida, se formarán agregados de proteínas en la periferia celular que serán transferidos a una ubicación yuxtanuclear y se formarán los agregosomas (Kaarniranta et al., 2009). Por último cabe destacar por su relevancia en el ojo un tipo de chaperonas denominadas αcristalinas. Estas son proteínas importantes en la retina con diversas funciones. Entre ellas está su función de chaperonas además de propiedades antiinflamatorias, antifibrilares y antiapoptóticas, protección contra el estrés, implicación en la autofagia, modulación de la angiogénesis, así como interacciones proteína-proteína con una gran variedad de proteínas (Kannan et al., 2016). Como función chaperona, se une para corregir proteínas mal plegadas y prevenir agregaciones de proteínas. En la misma línea y relacionándolo con sus propiedades antiapoptóticas, su función de plegamiento de proteínas previene la activación de la apoptosis así como de factores tales como el NF-κB (Kannan et al., 2016). En cuanto a su implicación en la protección contra el estrés oxidativo, se ha demostrado que las células del EPR que sobreexpresan las α-cristalinas son resistentes a la muerte celular inducida por H2O2. Además, contienen GSH aumentado. Sin embargo, el estrés prolongado disminuye los niveles de α-cristalinas, de manera que las células serán más susceptibles a muerte celular inducida por estrés (Kannan et al., 2016). Como sabemos, uno de los mecanismos que mantienen la proteostasis es la autofagia, que se encuentra aumentada en situaciones de daño celular y que facilita la eliminación de agregados de proteínas. Uno de las formas de autofagia es la mediada por chaperonas. Es aquí donde las α-cristalinas entran en juego. Ciertamente, en presencia de estrés oxidativo agudo, se aumenta la expresión de las α-cristalinas y como consecuencia también hay un aumento de la autofagia. Sin embargo, ante estrés oxidativo crónico se reduce tanto las α-cristalinas como la autofagia y así se ha corroborado en ojos de pacientes donantes con DMAE (Kannan et al., 2016). 24 2.4 Vía de la ubiquitina-proteosoma en el ojo La observación de que la retina, como otros muchos tejidos, acumula proteínas durante el envejecimiento, indica que el control de calidad de proteínas es esencial para la salud de la retina. Entre los sistemas de degradación de proteínas dañadas encontramos la vía ubiquitinaproteosoma. Respecto a los otros sistemas proteolíticos como la autofagia, existe poca información sobre su papel en las enfermedades de la retina, pero parece ser que una disminución tanto de la autofagia como de la actividad lisosómica se asocian con el envejecimiento de la retina y DMAE (Shang y Taylor, 2012; Mettu et al., 2012). Las proteínas dañadas o modificadas en los ojos se degradan selectivamente por la vía ubiquitina-proteosoma y la disfunción de ésta puede contribuir a enfermedades relacionadas con la edad, como la opacidad del cristalino (catarata) y la DMAE. Sin embargo, también la vía proteolítica lisosomal juega un papel importante en la degradación de proteínas en el EPR. Aunque la primera vía sea más eficiente en la degradación de proteínas citoplásmicas solubles y la segunda degrade principalmente proteínas unidas a orgánulos o a la membrana, puede haber superposición para algunos sustratos entre las dos vías. Parece que se complementan y respaldan entre ellas en la eliminación de las proteínas dañadas (Kaarniranta et al., 2009; Shang y Taylor, 2012). Tal mecanismo de respaldo fue indicado en un estudio sobre la degradación de proteínas glicadas en cultivos de EPR. La glicación es una modificación postraduccional que puede tener consecuencias adversas en relación con enfermedades oculares. Las proteínas glicadas y los productos finales de glicación avanzada se acumulan de forma acelerada al envejecer en la retina, específicamente en drusas, y el proceso se acelera aún más en condiciones diabéticas (Handa, 2012). El consumo de dietas de alto índice glucémico, uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo de la DMAE en los seres humanos, también acelera la acumulación de AGE en los tejidos de los ojos. La glicación induce cambios irreversibles en las estructuras proteicas y conduce a la pérdida de actividad o agregación y toxicidad. Además, parece ser que las proteínas glicosiladas son resistentes a la degradación por la vía ubiquitina-proteosoma. Existen datos en cultivos de EPR que indican que las proteínas glicosiladas y ubiquitinadas llegan al lisosoma cuando el proteasoma no es funcional. Además, el deterioro de la vía ubiquitina-proteosoma en el EPR activa la vía autofágica (Shang y Taylor, 2012; Taylor, 2012). Como ya dijimos, en condiciones homeostáticas normales, las vías del proteosoma y del lisosoma funcionan independientemente o en concierto para mantener la proteostais. Sin embargo, sobre el estrés crónico y el envejecimiento estas capacidades son insuficientes para 25 mantener la proteostasis. Esto da lugar a la acumulación de proteínas dañadas llevando al desarrollo de lesiones similares a la DMAE (Shang y Taylor, 2012). Es sabido que las proteínas oxidadas debido al estrés oxidativo se degradan preferentemente por la vía ubiquitina-proteosoma. Un aumento transitorio en los niveles de estas proteínas que se ubiquitinan se correlaciona con el aumento de la proteólisis intracelular durante la recuperación de un estrés oxidativo leve, también implica que la vía ubiquitina-proteosoma participa en la restitución de la proteostasis durante la recuperación del estrés oxidativo (Shang y Taylor, 2012). Aunque en la actualidad hay escasos datos sobre la degradación de las proteínas oxidadas en la retina o el EPR por el proteosoma, los resultados canónicos de las funciones de esta vía en la mayoría de los tejidos sugieren que esto es extrapolable también al tejido retiniano. Además, dada la destacada relación etiológica entre la oxidación, el aumento de los niveles de proteínas oxidadas en la retina y en el EPR, acumulación de agregados y retinopatía, el papel del proteosoma en la retina representa un desafío para estudios futuros (Zhang et al., 2008). 2.4.1 Importancia de la vía ubiquitina-proteosoma en la retina La vía de degradación ubiquitina-proteosoma juega un papel importante en diversas funciones en la retina. Esta vía participa activamente en el buen desarrollo y formación de la retina. En la formación de los conos deben eliminarse por apoptosis una serie de células pigmentarias. Muchos mutantes que causan apoptosis anormal y ojos anormales se encuentran relacionados con aberraciones en la función de ubiquitina-proteosoma, lo que indica que esta vía desempeña un papel importante en la regulación de la apoptosis (Shang y Taylor, 2012). Por otro lado, la señalización celular eficiente y adecuada es esencial para la salud de la retina. Y una de las funciones más importantes de la vía ubiquitina-proteosoma es regular el proceso de señalización intracelular a través de la degradación de reguladores de las vías de señalización tales como la vía NF-κB o la vía de señalización inducida por hipoxia. La regulación adecuada de estas vías es esencial para el desarrollo y las funciones visuales y su desregulación pueden conducir a la degeneración retiniana. Concretamente, la activación de NF-κB en células oculares depende de la actividad del proteosoma, como ya sabemos (Angosto, 2005). Pues si el proteosoma está dañado o tiene una actividad deficiente se inhibe la activación de NF-κB, por tanto en condiciones de recuperación del estrés oxidativo, se reduce la viabilidad celular (Wu et al., 2009). 32 Bibliografía Aguilà M, Cheetham ME. Retinal Degenerative Diseases. Adv Exp Med Biol . 2016;854:161-7. Angosto M. Vía de la ubiquitina-proteosoma. Anal. Real Acad. Nac. Farm. 2005;71:45-82. Bhutto I, Lutty G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epitheli m/Br ch’s membrane/choriocapillaris complex. Mol. Aspects Med. Elsevier Ltd; 2012;33(4):295-317. Bukau B, Weissman J, Horwich A. Molecular Chaperones and Protein Quality Control. Cell. Elsevier Inc.; 2006;125(3):443-51. Chen C, Cano M, Wang JJ, Li J, Huang C, Yu Q, et al. Role of unfolded protein response dysregulation in oxidative injury of retinal pigment epithelial cells. Antioxid. Redox Signal. 2014;20(14):2091-106. 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