Cambios fenotípicos derivados de la ausencia de las N-acilhomoserina lactonas en Sinorhizobium meliloti SVQ747

Trabajo de Fin de Máster Cambios fenotípicos derivados de la ausencia de las N-acil- homoserina lactonas en Sinorhizobium meliloti SVQ747. Autora: Mª Carmen Sánchez Aguilar Tutora: María del Rosario Espuny Gómez Codirectora: Cynthia Victoria Alías Villegas Departamento de Microbiología Máster Universitario en Biología Avanzada: Investigación y Aplicación Facultad de Biología Universidad de Sevilla Curso 2021-2022 Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 2 de 21 Índice 1. Introducción .......................................................................................................................... 4 2. Materiales y métodos ........................................................................................................... 7 2.1. Métodos utilizados en el estudio de las bacterias ...................................................... 9 2.1.1. Producción de sobrenadantes .................................................................................. 9 2.1.2. Ensayo de difusión en placa para determinar la producción de AHL ................. 9 2.1.3. Ensayo de producción de AHL mediante la medida de la actividad βgalactosidasa (β-gal) ............................................................................................................. 9 2.1.4. Movilidad, morfología de las colonias y producción de EPS ............................. 10 2.1.5. Ensayo de producción de EPS mediante la reacción de la Antrona Jones ........ 10 2.2. Métodos utilizados para los estudios con alfalfa (Medicago sativa cv. Aragón) ..... 10 2.2.1. Desinfección y germinación de semillas ............................................................ 10 2.2.2. Ensayo de efectividad de simbiosis con la alfalfa .............................................. 10 2.2.3. Medida del grado de competitividad por la nodulación de la alfalfa ............... 10 3. Resultados y discusión........................................................................................................ 11 3.1. Producción de AHL ...................................................................................................... 11 3.2. Producción de exopolisacáridos (EPS) ....................................................................... 13 3.3. Movilidad .................................................................................................................... 15 3.4. Propiedades simbióticas............................................................................................. 16 4. Conclusiones y perspectivas futuras .................................................................................. 18 5. Bibliografía .......................................................................................................................... 19 Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 3 de 21 Resumen Sinorhizobium meliloti lleva a cabo la comunicación célula-célula mediante quorum sensing, que implica la producción de moléculas señal difusibles, los autoinductores, empleando los sistemas SinI/SinR y MelI/MelR y TraI/TraR, según la estirpe. Los autoinductores más conocidos de estas bacterias son las N-acil homoserina lactonas (AHL) que, dependiendo de longitud de la cadena acilo, difunden libremente al exterior o necesitarían la intervención de bombas de eflujo que se encuentran en la membrana, como el sistema RND. A concentraciones moderadas de AHL, la expresión de sinI se ve fuertemente estimulada por ExpR, una proteína de tipo “LuxR solo”. Sin embargo, a concentraciones muy altas de AHL, ExpR reprime la transcripción de sinR, provocando una retroalimentación negativa. Las AHL en los rizobios controlan funciones como la activación de la síntesis de exopolisacáridos (EPS), la movilidad bacteriana y durante el establecimiento de la simbiosis con la planta hospedadora. En este trabajo se estudian los cambios provocados por la ausencia de AHL sobre S. meliloti SVQ747, aislado de nódulos de Medicago marina de las marismas del Odiel, que presenta SinI/SinR y ExpR, y de SVQ749, su mutante en el sistema RND NolG. Según los resultados obtenidos se puede concluir que, tanto en SVQ747 como en SVQ749, la ausencia de las AHL disminuye la producción de EPS totales, favorece la movilidad tipo swimming y, al contrario, disminuye movilidad tipo sliding, además de provocar la disminución en el número de nódulos desarrollados en la alfalfa, sin afectar a la efectividad de la simbiosis. Además, la capacidad competitiva por la nodulación de la alfalfa no se ve afectada por la carencia de AHL. La mutación en nolG no afectó a la producción de AHL por lo que la mayor capacidad competitiva de SVQ749 no puede atribuirse a una mayor o menor capacidad de exportación de AHL. Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 4 de 21 1. Introducción Muchas bacterias establecen comunicación célula-célula mediante la producción de moléculas señal difusibles cuando forman parte de una comunidad bacteriana. Estas señales, llamadas autoinductores, controlan la expresión génica en respuesta a la densidad celular bacteriana; a este proceso se le conoce como quórum sensing (QS). Los autoinductores de las bacterias Gram negativas más conocidos son las N-acil homoserina lactonas (AHL) que, generalmente, son sintetizadas por proteínas de la familia LuxI. A medida que aumenta la densidad de la población, las moléculas de AHL se acumulan en el medio de crecimiento y, al alcanzar una concentración umbral crítica, vuelven a entrar uniéndose y activando una proteína receptora de AHL perteneciente a la familia LuxR de reguladores transcripcionales. El complejo LuxR homólogo-AHL activa o reprime la expresión de los genes diana incluyendo, en muchos casos, la activación de la autoinductor sintasa, lo que resulta en la producción de más AHL (bucle de retroalimentación positiva) (Pearson et al., 1999). Las moléculas de AHL consisten en una cadena de acilo de longitud variable de 4 a 18 carbonos, C4-HL a C11-HL se consideran AHL de cadena corta y C12-HL a C18-HL de cadena larga, unida a un grupo de cabeza de homoserina lactona conservada (Figura 1A). Las diferencias en la longitud de la cadena de acilo, la naturaleza del sustituyente en el C3 (oxo- o hidroxi-) y la presencia de un doble enlace confieren la especificidad de la señal y determinan su permeabilidad a través de la membrana celular. Las AHL de cadena más corta se mueven a través de las membranas celulares por difusión, mientras que las AHL de cadena más larga parecen ser secretadas por bombas de eflujo que se encuentran en la membrana (Aendekerk et al., 2002); como, por ejemplo, el sistema RND (Resistance-Nodulation-Cell-Division), que es un complejo tripartito compuesto por la proteína RND (el componente de la membrana interna), la proteína de fusión de la membrana (MPF, componente periplásmico) y la proteína de la membrana externa (OMP). Estas tres proteínas forman un canal a través de la envoltura de la célula Gram negativa asegurando que las moléculas puedan llegar al medio externo (Figura 1B) (Dinesh & Ayush, 2013). Figura 1: A) Estructura general de N-acil homoserina lactona (AHL), donde R representa la cadena lateral de acilo. B) Modelo del sistema RND, destallando el complejo AcrB-AcrA-TolC, donde se ve que AcrB comprende un trímero de protómeros. Comprende un cabezal extramembrana (periplásmico) y una región transmembrana. La estructura de TolC atraviesa la membrana externa. La suma de la longitud periplásmica de AcrB y es suficiente para cruzar el espacio periplásmico. Dado que el diámetro de la parte superior de la cabecera es casi igual al de la parte inferior de TolC, AcrB y TolC pueden acoplarse directamente entre sí. Por lo tanto, los dominios de los protómeros que forman la parte superior se denominan tentativamente dominios de acoplamiento TolC y el mecanismo esquemático de exportación de múltiples moléculas mediado por dicho sistema (Murakami et al., 2002). A B Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 5 de 21 La mayoría de los sistemas de QS caracterizados hasta ahora aparecen en bacterias que establecen relaciones, patógenas o simbióticas, con plantas o animales (de Kievit & Iglewski, 2000). En el caso de Sinorhizobium meliloti, una bacteria Gram negativa que establece una relación simbiótica fijadora de nitrógeno con la alfalfa, Medicago sativa. El QS lo realiza empleando al menos dos sistemas diferentes, Sin y Mel, aunque también con el sistema Tra (Llamas et al., 2004). Estos sistemas desempeñan un papel en su relación simbiótica con la alfalfa. S. meliloti Rm1021 y Rm41 tienen al menos dos y tres sistemas de detección de quórum, respectivamente. El sistema Mel está involucrado en la síntesis de AHL de cadena corta, como la C8-HL. El sistema Tra, también es responsable de la producción de AHL de cadena corta y regula la transferencia de plásmidos conjugativos en S. meliloti Rm41. El sistema Sin es responsable de sintetizar AHL de cadena larga, desde C12-HL hasta C18-HL con diferentes sustituyentes en el tercer carbono (Marketon & González, 2002). Por otro lado, el producto del gen expR, una proteína de tipo “LuxR solo”, que son proteínas LuxR relacionadas con el QS que no están emparejadas con un LuxI afín (Bez et al., 2021), es el principal regulador de la expresión génica controlada por AHL de cadena larga en S. meliloti. A concentraciones moderadas de AHL, la expresión de sinI se ve fuertemente estimulada por ExpR, provocando una retroalimentación positiva. Sin embargo, a concentraciones muy altas de AHL, ExpR reprime la transcripción de sinR, provocando una retroalimentación negativa. La presencia de AHL de cadena larga, como C16:1-HL, provoca la regulación transcripcional mediada por ExpR, lo que controla funciones como la activación de la síntesis de exopolisacáridos (EPS) y represión de la producción de flagelos (Charoenpanich et al., 2013). S. meliloti produce dos tipos de EPS, el succinoglicano (EPSI) y el galactoglicano (EPSII). El succinoglicano es un polímero de glucosa y de galactosa, con modificaciones de succinilo, piruvilo y acetilo. El EPSII es un polímero de glucosa acetilada y galactosa piruvilada (Jones, 2012). Ambos EPS se sintetizan en fracciones de alto y bajo peso molecular (HMW y LMW). Las fracciones LMW de succinoglicano y el EPSII se cree que están implicadas de manera importante en la simbiosis, amortiguando la respuesta inmune de las leguminosas durante la invasión (Jones et al., 2008), ya que sintetizar uno de estos tipos de EPS es necesario para la invasión de M. sativa por S. meliloti, o la protección contra las especies reactivas de oxígeno encontradas durante la invasión (Rinaudi & González, 2009). Además, la regulación de la síntesis de EPS está influenciada por una serie de factores ambientales, como los iones metálicos, la sal, la osmolaridad, el pH y la limitación de nitrógeno y fosfato. Este último induce la expresión de sinI, a través de PhoB, que es un regulador transcripcional que responde a la inanición de fosfato, lo que demuestra que en escasez de este nutriente se activa el QS. La regulación de la producción de succinoglicanos y EPSII está controlada por varios sistemas en S. meliloti, como ExoS/ChvI, SyrA/SyrM y SinI/ExpR, este último implicado en el QS (Geddes et al., 2014). S. meliloti Rm1021 silvestre contiene un elemento de inserción que interrumpe expR y, como resultado, no puede sintetizar EPSII en condiciones normales (Gao et al., 2005). Las AHL unidas a ExpR activan una serie de programas de expresión temporal dependientes de sus concentraciones. Por ejemplo, los genes responsables de la producción de EPS se activan a concentraciones más bajas de AHL que las requeridas para la represión de los genes que controlan la producción de flagelos (Charoenpanich et al., 2013). Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 6 de 21 Las AHL parece que participan en el proceso de nodulación, que comienza cuando los rizobios activan la proteína NodD, reguladora trascripcional de los genes nod, activada por flavonoides, moléculas señal liberadas por la raíz de la planta. Los productos codificados por los genes nod participan en la síntesis de moléculas específicas denominadas factores Nod (NF) o lipoquitooligosacaridos (LCO). Al secretarlas, las bacterias desencadenan el programa de desarrollo de la nodulación, incluida la deformación del pelo radical y la formación de primordios de nódulos en el córtex (Figura 2) (Saeki, 2011). Se sabe que las AHL pueden influir en las interacciones con las plantas, permitiendo el desarrollo de un mayor número de nódulos en sus raíces (Veliz et al., 2014). Las bacterias presentan varios tipos de movilidad (Figura 3), algunas de ellas influenciadas por las AHL. La movilidad tipo swimming es un movimiento de bacterias individuales en un líquido impulsado por flagelos que pueden girar libremente. La de tipo swarming, también mediada por flagelos, consiste en la migración superficial de grupos de bacterias y requiere interacciones intercelulares, secreción de surfactante y un aumento en el número de flagelos. El twitching es el movimiento superficial de las bacterias impulsado por la extensión de los pelos tipo IV, que se adhieren a la superficie, se retraen y acercan a la célula al sitio de unión. Esto le confiere un movimiento celular lento, a menudo con una apariencia espasmódica. El gliding es un movimiento superficial activo que se produce a lo largo del eje longitudinal de la célula sin requerir flagelos ni pelos e implica complejos de adhesión focal. Y el movimiento tipo sliding es una forma pasiva de propagación superficial que no requiere un motor activo, sino que depende de los surfactantes para reducir la tensión superficial, lo que permite que la colonia se extienda desde el origen, impulsada por la presión hacia afuera del crecimiento celular (Kearns, 2010). A altas densidades de población se sabe que los genes de movilidad están reprimidos por ExpR unido a AHL (Calatrava-Morales et al., 2018). Figura 2: Esquema gráfico del proceso de infección de una raíz por un rizobio y de la nodulación. la proteína NodD, reguladora trascripcional de los genes nod, de los rizobios se activan al reconocen los flavonoides, liberados por la raíz de la planta. Los productos codificados por estos genes participan en la síntesis de moléculas específicas denominadas factores Nod (NF) o LCO. Al secretar estos factores se desencadena el programa de desarrollo de la nodulación, incluida la deformación del pelo radicular y la formación de primordios de nódulos en la corteza. Se forma, entonces, la que se conoce como un tubo de infección que envuelve a la bacteria. A continuación, ésta degrada la pared celular del pelo radical y lo penetra formando un tubo de celulosa conocida como tubo de infección, que conduce hacia la corteza. Comienza la división de las células corticales inducidas por los factores Nod, formándose un tumor. Al llegar, la bacteria es endocitada. Las bacterias quedan, entonces, contenidas en una estructura llamada simbiosoma donde comienzan a transformarse en bacteroides: dejan de dividirse, pierden sus flagelos subpolares, se agrandan, cambian la composición de su pared celular y su morfología y sintetizan nitrogenasa para la fijación del N2 (Barbaggelata, 2020; Tarocco, 2012). Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 7 de 21 El microorganismo objeto de este trabajo es S. meliloti SVQ747, un mutante espontáneo a rifampicina obtenido a partir de ORT12, tolerante a metales pesados aislado de nódulos de Medicago marina de las marismas del Odiel (Huelva). En estudios anteriores, se ha demostrado que SVQ747 presenta el operón nodMnolFGnodN donde nodM y nodN podrían ser genes de nodulación mientras que nolFG pertenecen a un sistema RND de bombas de eflujo. Según los mismos estudios nolG parece no estar implicado en la resistencia a metales pesados ni a otras sustancias antimicrobianas, y la deleción individual de nodM, nodN o nolG no afectó a la producción de factores Nod ni en la simbiosis con la alfalfa. Sin embargo, el mutante SVQ749, generado por inserción en el gen nolG, presentó una mejor capacidad competitiva por la nodulación de la alfalfa frente a la estirpe silvestre, sin afectar la eficacia de fijación de nitrógeno. Eso implicaría que las sustancias transportadas a través de NolG no serían esenciales para la simbiosis, pero podrían contribuir a la competitividad por la nodulación (Alías-Villegas et al., 2015; Alías-Villegas, 2016). Además, se conoce que SVQ747 es productora de AHL, presenta genes sinI, sinR y, a diferencia de Sm1021 y Sm2011, un gen expR no interrumpido, lo que permite la síntesis de EPSII en condiciones normales y explicaría la alta mucosidad de esta bacteria (M.R. Espuny, comunicación personal). Con estos antecedentes, en este trabajo se tratará de averiguar si las AHL juegan un papel importante en la simbiosis de S. meliloti SVQ747 y su mutante SVQ749 con Medicago sativa y si existe alguna relación entre la mayor competitividad del mutante en nolG, SVQ749, y la producción y/o exportación de AHL. 2. Materiales y métodos En la tabla 1 se muestran las estirpes bacterianas y los plásmidos empleados. Tabla 1. Estirpes bacterianas y plásmidos empleados. Las abreviaturas Gm25, Km200, Rif50 y Tc 30 significa resistencia a la gentamicina, la kanamicina, la rifampicina y a la tetraciclina a las concentraciones de 25, 200, 50 y 30 µg/mL, respectivamente. Figura 3: La movilidad tipo swarming es el movimiento multicelular de bacterias a través de una superficie y está impulsado por flagelos. La movilidad tipo swimming es el movimiento de bacterias individuales en un líquido, también impulsado por flagelos giratorios. La movilidad tipo twitching es el movimiento superficial de las bacterias que es impulsado por la extensión de los pelos, que luego se adhieren a la superficie y luego se retraen, acercando la célula al sitio de unión. La movilidad tipo gliding es un movimiento superficial activo que no requiere flagelos ni pelos e implica complejos de adhesión focal. La movilidad tipo sliding es una translocación superficial pasiva impulsada por el crecimiento y facilitada por un surfactante. La dirección del movimiento se indica con flechas negras y los motores que impulsan el movimiento se indican con círculos de colores (Kearns, 2010). Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 8 de 21 BACTERIAS Estirpe Características Referencia Agrobacterium tumefaciens NT1 (pZRL4) A. tumefaciens curada del plásmido pTiC58; traG::lacZ, traR. Gm30 (Cha et al., 1998) Sinorhizobium meliloti SVQ747 ORT12, Rif50 (Alías-Villegas, 2016) SVQ749 SVQ747 mutado en el gen nolG por inserción del casete lacZ-Gm en sentido contrario al gen. Rif50 Gm25 (Alías-Villegas, 2016) SVQ747 (pGUS3) SVQ747 que porta el plásmido pGUS3. Rif50, Km200 (Alías-Villegas, 2016) SVQ747 (pME6863) SVQ747 que porta el plásmido pME6863. Rif50, Tc30 Cedida por M. R. Espuny (sin publicar) SVQ749 (pME6863) SVQ749 que porta el plásmido pME6863. Rif50, Tc40 Cedida por M. R. Espuny (sin publicar) SVQ747 (pME6000) SVQ747 que porta el plásmido pME6000. Rif50, Tc40 Cedida por M. R. Espuny (sin publicar) SVQ749 (pME6000) SVQ749 que porta el plásmido pME6000. Rif50, Tc40 Cedida por M. R. Espuny (sin publicar) PLÁSMIDOS Plásmido Características relevantes Referencia pME6000 Vector de clonación de amplio rango. Tc30 (Lefebre & Valvano, 2002) pME6863 pME6000 con el gen aiiA bajo el control del promotor del gen lacZ (Reimmann et al., 2002) En la tabla 2 se describe la composición en gramos de los distintos medios de cultivos de las bacterias y las soluciones nutritivas para las plantas. Todos ellos se completaron con hasta 1 litro de agua destilada, se ajustó el pH a 7 aproximadamente y se esterilizaron en la autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de presión y a 121ºC. Tabla 2. Medios de cultivos de las bacterias y soluciones nutritivas para plantas. Medios de cultivos de bacterias Compuestos Cantidad (gramos) Medio Bromfield (Sourjik & Schmitt, 1996) Extracto de levadura 0,4 Triptona 0,1 CaCl2 2H2O 0,1 Agar bacteriológico 3 Medio YM (Vincent, 1970) K2HPO4 0,5 MgSO4 7H2O 0,2 NaCl 0,2 Extracto de levadura 0,1 Manitol 10/3 (10 gramos para YM10 y 3 gramos para YM3) Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 9 de 21 Medio TY (Behringer, 1974) Extracto de levadura 3 Triptona 5 CaCl2 2H2O 0,65 Solución nutritiva para plantas Rigaud & Puppo (Rigaud & Puppo, 1975) R&P K2HPO4 0,2 MgSO4 7H2O 0,2 KCl 0,2 CaSO4 2H2O 0,12 Quelato de hierro (6%) 0,0025 Solución de microelementos Gibson Compuestos Cantidad (gramos) H3BO3 2,86 MnSO4 H2O 2,08 ZnSO4 7H2O 0,22 CuSO4 5H2O 0,08 Na2MoO4 0,11 H2O destilada Hasta 1 litro 1 mL 2.1. Métodos utilizados en el estudio de las bacterias 2.1.1. Producción de sobrenadantes Los sobrenadantes (SB) se extraen de cultivos líquidos de los rizobios crecidos 3 días a 28ºC en medio YM3 sin antibiótico, mediante 2 centrifugaciones a 13000 rpm. Se mantienen a -20ºC hasta su uso. 2.1.2. Ensayo de difusión en placa para determinar la producción de AHL Se utiliza el método de la doble capa. En las placas de Petri se colocan cilindros metálicos huecos de 0,8 cm de diámetro y 1 cm de altura estériles. Se vierte YM3 al 1,5% y, tras solidificar, en la doble capa se vierten 4 mL de medio YM al 0,8% de agar fundido, 60 µL de X-gal (20 µg/mL de N,N-dimetil formamida) y 400 µL de cultivo líquido del biosensor A. tumefaciens NT1 (pZLR4) crecido 3 días. Cuando se solidifica el medio se extraen los pocillos con una pinza esterilizada y se añaden 150 µL de los SB en los pocillos formados y se incuba 24-48 horas a 28ºC. 2.1.3. Ensayo de producción de AHL mediante la medida de la actividad β-galactosidasa (β-gal) Los cultivos se preparan con 2 mL de YM3 inoculados con 300 µL de A. tumefaciens NT1 (pZLR4) crecido 4 días, 400 µL de agua destilada estéril y 100 µL de SB. Se preparan un control positivo con 20 µL de con 3-oxo-C6-HL (10 µg/mL metanol) y 80 µL de H2O estéril y un control negativo con 100 µL de YM3. Para conocer la actividad, a 200 µl de cultivo de 24 horas, a los que se les mide sus DO660 nm, se les añaden 800 µL de tampón Z (60 mM de Na2HPO4, 40 nM de NaH2PO4, 10 mM de KCl , 1mM de MgSO4 y 50 mM de βmercaptoetanol), 10 µl de SDS al 0,1% y 20 µL de cloroformo. Se agitan durante 15 segundos y se añaden 200 µL de ONPG (4 mg/mL de ONPG en tampón Z). Tras el desarrollo de color amarillo, se para la reacción con 500 µL de Na2CO3 (1M). Se mide la DO420 nm de cada reacción. Con estos datos se calculan las correspondientes actividades en Unidades Miller aplicando la siguiente fórmula: (DO420 nm*1000)/(0,2*DO660 Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 16 de 21 Figura 10: Halo de movilidad en medio Bromfield al 0,3% de agar tras 14 días de cultivo. 1. SVQ747, 2. SVQ747(pME6000), 3. SVQ747(pME6863), 4. SVQ749, 5. SVQ749(pME6000), 6. SVQ749(pME6863). Se realizaron 3 ensayos de tres réplicas cada uno. Figura 11: Movilidad en medio Bromfield al 0,7% a los 14 días. En la imagen se observan números que corresponden a las bacterias: 1. SVQ747, 2. SVQ747 (pME6000), 3. SVQ747 (pME6863), 4. SVQ749, 5. SVQ749 (pME6000), 6. SVQ749 (pME6863). Se realizaron 3 ensayos de tres réplicas cada uno. 3.4. Propiedades simbióticas En los ensayos de efectividad simbiótica se observó (Figura 12) que la ausencia de AHL disminuyó significativamente la capacidad de desarrollar nódulos de SVQ747 y SVQ749 (Figura 12A), aunque este menor número de nódulos no afectó significativamente al peso seco desarrollado por las plantas (Figura 12B), que sólo se vio disminuido, aunque no significativamente, en el caso de SVQ747 (pME6863). Se ha visto que la 3-oxo-C14-HL es capaz de inducir la formación de nódulos por S. meliloti en leguminosas y que algunas AHL son capaces de provocar cambios en el crecimiento de raíces y el número de raíces laterales, por lo que aumenta la superficie para poder infectar (Veliz-Vallejos et al., 2014), lo que podría explicar el menor número de nódulos desarrollados por las bacterias con la lactonasa. Extrañamente, la presencia del vector pME6000 provocó una disminución no significativa, en el número de nódulos en SVQ747 y en SVQ749, sin afectar al peso seco de la planta. 1 3 2 1 4 6 5 1 4 5 6 1 2 3 Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 17 de 21 En lo relativo a la competición por la nodulación de la alfalfa, se observó (Figura 13) que la ausencia de AHL no afectó a la capacidad competitiva de SVQ747 ni de SVQ749, y que SVQ749 confirmó claramente su mayor competitividad. De nuevo se observó que pME6000 afectó, aunque no significativamente, a la competitividad tanto de SVQ747 subiéndola, como de SVQ749, disminuyéndola. El vector pME6000 porta el gen de resistencia a tetraciclina tcR y su regulador tetR. TetR pertenece a una familia de reguladores transcripcionales generalmente negativos y muy extendidos entre procariotas que regulan resistencia a antibióticos, frecuentemente regulando la expresión de bombas de eflujo, pero también otros mecanismos reguladores, entre ellos el QS (Ramos et al., 2005). De hecho, LuxR de Vibrio fischeri es un regulador positivo que también pertenece a la familia TetR (Fidopiastis et al., 2002). La presencia de tetR puede ser la causa de algunos de los cambios observados en estas bacterias. Figura 12: Efectividad simbiótica en la alfalfa tras 8 semanas de cultivo. A) Número de nódulos desarrollados, B) Peso seco de la parte aérea de la planta en mg. Las barras con las mismas letras no difieren significativamente entre sí. Los resultados corresponden a un ensayo con tres réplicas con 8 plántulas por bacteria. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 NI SVQ747 SVQ747 (pME6000) SVQ747 (pME6863) SVQ749 SVQ749 (pME6000) SVQ749 (pME6863) Número de Nódulos D A AC BC AB AC CD 0 50 100 150 200 250 NI SVQ747 SVQ747 (pME6000) SVQ747 (pME6863) SVQ749 SVQ749 (pME6000) SVQ749 (pME6863) Peso Fresco de la Parte Aérea B B BB B A A B B Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 18 de 21 Figura 13: Ensayo del grado de competitividad por la nodulación de la alfalfa tras 24 días de cultivo en vermiculita: perlita con solución nutritiva para plantas R&P. La nodulación se realizó con las siguientes mezclas: SVQ747 (pGUS3) solo como control negativo, SVQ747 / SVQ747 (pGUS3), SVQ747 (pME6000) / SVQ747 (pGUS3), SVQ747 (pME6863) / SVQ747 (pGUS3), SVQ749 / SVQ747 (pGUS3), SVQ749 (pME6000) / SVQ747 (pGUS3), SVQ749 (pME6863) / SVQ747 (pGUS3). Los resultados corresponden a un ensayo con 14 plántulas cada una por pareja de bacterias a ensayar. 4. Conclusiones y perspectivas futuras La ausencia de las AHL disminuye significativamente la producción de EPS totales, tanto en SVQ747 como en SVQ749. Posiblemente esta disminución sea fundamentalmente en EPSII, lo que habría que demostrar en posteriores estudios. SVQ747 presenta movilidad tipo swimming, pero en las condiciones estudiadas no se ha podido ver la movilidad de tipo swarming posiblemente debido a la gran producción de EPS. En su lugar, sí presenta movilidad tipo sliding, que está muy influenciada por la producción de EPS. La ausencia de AHL favorece la movilidad tipo swimming (Figura 10-3 y 10-6). Al contrario, la movilidad tipo sliding es menor en las bacterias que carecen de AHL y producen menos EPS (Figura 11-3 y 11-6). Sin embargo, haría falta realizar más ensayos con medidas de diámetro y en distintos medios de cultivos, puesto que Nogales et al., 2012, detectaron que la composición del medio de cultivo afecta a los distintos tipos de movilidad. En cuanto a las propiedades simbióticas, la ausencia de AHL disminuyó significativamente el número de nódulos desarrollados en las plantas de alfalfa sin afectar a la efectividad de la simbiosis. Posiblemente habría sido necesario el peso seco de los nódulos, para determinar si un menor número de nódulos lleva consigo una menor masa nodular o no. En cuanto a la capacidad competitiva por la nodulación de la alfalfa, la ausencia de AHL no afectó significativamente ni a SVQ747 ni a SVQ749. Se vuelve a comprobar que SVQ749 es más competitivo que SVQ747. Según nuestros resultados no la podemos achacar a una mayor exportación de AHL, aunque sí podría influir una ligera mayor producción de polisacáridos y movilidad tipo swimming y sliding. Curiosamente, según los resultados en espectrometría de masa (M.R Espuny, comunicación personal), SVQ749 produce mayor cantidad de AHL totales, lo que podría explicar su mayor competitividad. Sin embargo, la herramienta utilizada para el estudio del efecto de la ausencia de AHL, no ha sido la más correcta, dado que el vector sin el gen de la lactonasa ya afecta a los distintos fenotipos, por tanto, en el futuro habría que confirmar que SVQ747 presenta solo el sistema SinI/SinR y hacer un mutante en SinI que no produzca AHL y llevar a cabo todos estos estudios. Agradecimientos: al MUBA, al Departamento, al grupo y a mi tutora María del Rosario Espuny Gómez. 27,51 15,00 21,78 20,58 71,70 49,62 46,59 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 SVQ747pGUS SVQ747 / SVQ747pGUS SVQ747 (pME6000) / SVQ747pGUS SVQ747 (pME6863) / SVQ747pGUS SVQ749/ SVQ747pGUS SVQ749 (pME6000)/ SVQ747pGUS SVQ749 (pME6863) / SVQ747pGUS Competitividad frente a 747 pGus3 (%) B BBB A AA Universidad de Sevilla 2021-2022 Página 19 de 21 5. Bibliografía Acosta-Jurado, S., Alías-Villegas, C., Almozara, A., Espuny, M., Vinardell, J., & Pérez-Montaño, F. (2020). 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