Efecto de inoculantes microbianas en la acumulación de Zn, P, y otros micronutrientes

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica. Grado en Ingeniería Agronómica Efecto de inoculaciones microbianas en la acumulación de Zn, P y otros micronutrientes Universidad de Sevilla Sevilla, 5 de septiembre de 2017 Alumno: Ángel Velasco Sánchez Tutores: Antonio Delgado García y Aurora Moreno Lora 1 ÍNDICE Introducción ..................................................................................................................... 3 Objetivos .......................................................................................................................... 8 Materiales y métodos ...................................................................................................... 9 Diseño experimental ..................................................................................................... 9 Material vegetal ............................................................................................................ 9 Medio de crecimiento ................................................................................................... 9 Condiciones de cultivo ................................................................................................ 12 Tratamientos ............................................................................................................... 13 Análisis del suelo tras el cultivo ................................................................................. 14 Análisis del material vegetal ....................................................................................... 16 Análisis estadístico ..................................................................................................... 16 Resultados ....................................................................................................................... 18 Discusión ........................................................................................................................ 30 Conclusiones ................................................................................................................... 33 Bibliografía ..................................................................................................................... 34 2 3 Introducción La deficiencia de Zn en suelo es una de las más comunes a nivel global, especialmente en suelos calcáreos de regiones áridas o semiáridas (Cakmak et al., 1999). Estos suelos se dan con frecuencia en regiones mediterráneas, siendo los países del mediterráneo oriental donde más frecuente es esta deficiencia. Los suelos mediterráneos suelen caracterizarse por tener un pH frecuentemente básico y un bajo contenido en materia orgánica (<1%). Todo esto contribuye a la reducción de la solubilidad de micronutrientes. La deficiencia de Zn pasa a menudo desapercibida por agricultores y consumidores (Rashid & Ryan, 2004). Otras deficiencias de micronutrientes son frecuentes en estos tipos de suelos. Tradicionalmente, a la que se ha prestado más atención no es al Zn, sino a la deficiencia de Fe, conocida como clorosis férrica o clorosis por deficiencia de Fe (de Santiago & Delgado, 2006). Las deficiencias mencionadas pueden, no sólo reducir los rendimientos de las cosechas e incrementar los costes en abonos, sino que también pueden causar serios problemas para la salud (Prasad, 2012). En países subdesarrollados con dietas muy dependientes del trigo pueden desarrollarse enfermedades por la falta de Zn en la dieta (Cakmak et al., 1999). En suelos de la cuenca mediterránea, se considera la deficiencia de Zn como un problema serio que ocasiona pérdidas importantes en la producción y puede poner en riesgo la salud humana en algunos países del Norte de África o de Oriente Próximo (Rashid & Ryan, 2004). El incremento de la concentración de Zn y Fe en granos de cereal (sobre todo arroz y trigo), se considera un problema científico de primera magnitud para paliar las consecuencias en la salud humana de dietas basadas en el consumo de estos cereales. Esta búsqueda de mayores concentraciones de micronutrientes en grano, bien por manejo del cultivo (fertilización) o por mejora genética, se define como biofortificación. Elevados niveles de fósforo en el suelo se asocian a la deficiencia de Zn y de Fe en los cultivos (Rashid & Ryan, 2004). El contenido en Zn en planta se reduce en condiciones en las que el P es abundante en el suelo debido a varios factores, entre ellos: reducción del transporte de las raíces a los brotes, reducción de la concentración en los tejidos debido a un mayor crecimiento de la planta (efecto dilución) y defectos en el metabolismo de la planta (Mousavi, 2011). El abonado con P ha contribuido a aumentar la producción agrícola en el último siglo. Sin embargo, un exceso en su 4 aplicación puede conllevar antagonismos nutricionales que pueden reducir la producción, disminuir la calidad de la cosecha para su consumo humano, y contribuir a la eutrofización del agua y dañar el medio ambiente (MacDonald et al., 2011). El efecto sobre la calidad se debe no sólo a los antagonismos que pueden reducir la concentración de Zn y Fe en la cosecha, sino al incremento en semillas del P almacenado como ácido fítico que reduce la absorción en el tracto digestivo de los elementos mencionados. Se ha intentado controlar la aplicación de abonos fosfatados mediante normativas en diversos países de la Unión Europea y en Estados Unidos. No obstante, a pesar de haberse reducido los excesos, todavía en áreas como el norte de Europa o la cuenca del Golfo de México los excesos de P y N son preocupantes. China es, con diferencia, el país donde más excesos de abonados se producen y en la actualidad no se han impuesto normativas estrictas para frenar dichos aportes (Vitousek et al., 2009). En cuanto a salud se refiere, las deficiencias de Zn en la dieta humana empezaron a detectarse en los años 50 en países con dietas pobres en Zn como Irán y Egipto. Los efectos principales que presentan las personas con bajos niveles de ingesta de Zn pueden ser retraso mental, retraso del crecimiento en jóvenes y atrofia del aparato reproductor, entre otros. En casos severos, la deficiencia puede incluso producir la muerte (Prasad, 2012). Como se ha mencionado antes, los granos de trigo presentan un compuesto denominado ácido fítico que impide una buena asimilación del Zn en la digestión. Sin embargo, el ácido fítico presenta numerosas cualidades positivas para la salud humana como la inhibición de ciertos cánceres (Somasundar et al., 2017). Además, las semillas de trigo presentan los mayores contenidos de Zn en el embrión y en la capa aleurona (150 mg/kg). Como estas partes pueden perderse durante el proceso de molienda, se reduce significativamente el contenido en Zn en las harinas obtenidas (Cakmak, 2008). Estos aspectos hacen aún más severo el problema en comunidades con dietas poco variadas que dependen del cultivo de trigo, principalmente. En aras de conseguir un correcto estado nutricional del cultivo y, por tanto, del consumidor, se han propuesto varias vías para incrementar el contenido de Zn y otros elementos en la planta y en concreto en los granos de cereal. Uno de ellos es la mejora y la selección genética de variedades más efectivas en la fijación (bioacumulación) de Zn (Rashid & Ryan, 2004). Varios autores han sugerido numerosas variedades más eficientes en la absorción de Zn (Khoshgoftarmanesh et al., 2009; Rengel & Graham, 1996). En la actualidad se están realizando esfuerzos para obtener mejores variedades 5 (White & Broadley, 2009) y se ha demostrado que las variedades silvestres de trigo acumulan mayores niveles de Zn, Fe y proteínas, además de resistir mejor las condiciones de sequía (Peleg et al., 2008). También, en la actualidad, cabe destacar el desarrollo de nuevas variedades a través de la transgenia (Zhu et al., 2007). Sin embargo, la mejora genética también presenta limitaciones. El problema radica en que los suelos que presentan condiciones de pH alto, baja humedad y bajo contenido en materia orgánica no contienen el suficiente Zn disponible para alcanzar los niveles deseados para el correcto desarrollo del cultivo (Cakmak, 2008). En general, se consideran deficitarios todos los suelos con contenidos inferiores a 0,5 mg/kg de Zn extraíble por DTPA (Lindsay & Norvell, 1978). Estas condiciones son frecuentes en los suelos en los que se cultivan cereales en áreas mediterráneas (Cakmak, 2008). Por lo tanto, la mejora genética se ve limitada en suelos que han agotado el Zn disponible (Cakmak, 2002). Esto se acentúa aún más en países subdesarrollados donde el uso de fertilizantes con micronutrientes en la agricultura es poco frecuente. En el caso de otros micronutrientes, y en particular del Fe, sus concentraciones en suelo suelen ser altas incluso en aquellos donde aparece la clorosis férrica. En este caso, el problema puede deberse a la escasa solubilidad de las formas dominantes de Fe en el suelo debido al pH básico y al fallo en especies sensibles de los mecanismos de movilización y translocación del nutriente en la planta (de Santiago & Delgado, 2006; de Santiago et al., 2008). Los micronutrientes pueden aportarse como fertilizantes. El caso más habitual es aplicar Fe, generalmente como quelatos que son formas muy eficaces corrigiendo su deficiencia. Por el contrario, el Zn puede aplicarse directamente al suelo en diferentes formas químicas como ZnSO 4 (más habitual y económica), ZnO, ZnEDTA o Zn oxisulfato (Cakmak, 2008). La aplicación de Zn puede hacerse, además de al suelo, a la semilla y/o a la hoja. Las aplicaciones foliares son las más eficientes incrementando el contenido en Zn tanto en granos como en tallos (Yilmaz et al., 1997). Sin embargo, el abonado directamente al suelo mejora la producción y es más rentable debido a su efecto residual (Yilmaz et al., 1997). Esto puede deberse a que cultivos como el trigo necesitan Zn, sobre todo, durante sus fases de crecimiento tempranas (Ozturk et al., 2006). Las enmiendas orgánicas también pueden resultar interesantes, pues se ha demostrado que el aporte de restos del proceso de elaboración de aceite y de vino 6 incrementa el contenido en Zn disponible (Maqueda et al., 2015). También el uso de residuos sólidos urbanos, purines de aves y compost comercial incrementan los niveles de Zn disponible en suelos (Shuman, 1999). Estas enmiendas son efectivas incrementando parámetros de calidad del suelo, Un parámetro de calidad relevante es la actividad microbiana. Incrementos en la actividad microbiana dan lugar a mayores actividades enzimáticas en el suelo. Estas enzimas están directamente relacionadas con los ciclos y transformaciones de los nutrientes y varían rápidamente debido a alteraciones del suelo de origen natural o antropogénico (Puglisi et al., 2006). Dentro de las enzimas analizables de los suelos destacan, entre otras, las fosfatasas que se encargan de catalizar la hidrólisis de los enlaces fosfoéster liberando P al medio (Nannipieri et al., 2011), las β-glucosidasas que se implicadas en la hidrólisis de la celulosa del medio y convertirla en glucosa disponible para las plantas (Singhania et al., 2013) y las deshidrogenasas, encargadas de oxidar la materia orgánica transfiriendo protones y electrones del sustrato a aceptores (Makoi & Ndakidemi, 2008). Para la supresión de enfermedades de las plantas se han utilizado microorganismos. Uno de los mecanismos para el control de enfermedades es competir con los patógenos por los nutrientes (Mercado-Blanco & Bakker, 2007). En el caso del Fe, esto se consigue secretando sideróforos (quelantes) que son compuestos muy efectivos en complejar selectivamente Fe y a veces otros metales (Sharma et al., 2003). Por consiguiente, también pueden resultar interesantes para incrementar la biodisponibilidad de ciertos metales, por ejemplo el aumento de Fe y Cu que se ha constatado en plantas de pepino (Cucumis sativus) usando Trichoderma asperellum strain T34 (de Santiago et al., 2013), Fe en soja (Sharma et al., 2003), Cu en maíz (Tao et al., 2003) y Zn y Mn en medios de cultivo en condiciones “in vitro” (Altomare et al., 1999). Trichoderma asperellum T34 y Bacillus subtilis son usados para el control de enfermedades en plantas (Ongena & Jacques, 2008; de Santiago et al., 2013). De hecho, B. subtilis presenta un 4-5% de su genoma dedicado a la producción de antibióticos (Stein, 2005). B. subtilis se vende de forma comercial para combatir numerosas plagas en diferentes cultivos (Pérez-García et al. 2011). Al igual que en el caso de Trichoderma, Bacillus puede considerarse un biofertilizante (Pérez-García et al., 2011). Especies de Bacillus secretan al medio fitasa que actúa sobre los complejos formados por el fitato (una de las formas orgánicas de P más abundantes en el medio natural) 7 liberando metales que estaban unidos a él como Zn 2+ , Fe 2+ o Ca 2+ y haciéndolos disponibles para las plantas (Jorquera et al. 2008). También pueden reducir el Fe 3+ , muy difícil de asimilar por las plantas (Pérez-García et al., 2011), a Fe 2+ , el cual es absorbido con mayor facilidad por la planta (Valencia-Cantero et al., 2007). Además, B. subtilis produce citoquininas que estimulan el crecimiento de las plantas en condiciones adversas (Arkhipova et al., 2007). Adicionalmente se ha demostrado que los ácidos orgánicos volátiles secretados por B. subtilis promueven el crecimiento de las plantas como Arabidopsis thaliana a través de la homeostasis de las auxinas y el crecimiento celular (Zhang et al., 2007). Por lo tanto, el uso de biofertilizantes como el caso de T. asperellum o B. subtilis y la aplicación de materia orgánica lábil que favorezca el desarrollo de los microorganismos del suelo, puede suponer una herramienta novedosa para conseguir una buena nutrición en los cultivos sin comprometer el medio ambiente y que pueda combinarse con los avances realizados en la mejora vegetal. 14 2. Inóculo de Bacillus subtilis En el caso de B. subitilis, la inoculación se realizó con 2x10 4 CFU/g de suelo de B. subtilis que se aplicaron regando con una suspensión de inóculo en agua de 20 mL a una concentración de 3x10 5 CFU/mL en 4 puntos diferentes de la superficie del suelo (García-López & Delgado, 2016). El proveedor fue Bayer Cropscience. 3. Aporte de celulosa En cuanto a la celulosa, se realizaron dos aplicaciones de 100 mg C/kg de suelo cada una, la primera se llevó a cabo una vez realizado el trasplante aplicando en 4 puntos diferentes de la superficie del suelo una solución con la celulosa disuelta en 20 mL de agua (en el mismo volumen de agua usado para inocular los microorganismos) y la segunda aplicación se llevó a cabo al inicio del espigado, estadío Z5.1 (Zadoks et al., 1974; de Santiago et al., 2013). La riqueza de la celulosa era de 0,44 g C/g celulosa. Análisis del suelo tras el cultivo Se separó el suelo rizosférico, el adherido a las raíces, del resto y se almacenaron por separado. Se procedió a realizar los siguientes análisis a los suelos de cada maceta. 1. Ácidos orgánicos Se determinó la concentración de ácidos orgánicos en suelo rizosférico mediante High Performance Liquid Chromatography HPLC (Gao, 2012) previa extracción con NaOH (0,01M) en relación 1:1 p/v. 2. Plating Para comprobar la presencia de Bacillus subtilis y Trichoderma asperellum en los suelos inoculados, se realizó un plating al final del ciclo de cultivo. La determinación de Bacillus subtilis se realizó en un medio de cultivo semi-selectivo según Zhao et al (2011). En el caso de Trichoderma asperellum se contabilizó siguiendo el método de Chung & Hoitink (1990). La presencia de microorganismos quedó 15 confirmada en los medios que habían recibido inóculo No se detectaron unidades formadoras de colonias (CFU) en los medios que no recibieron inóculo. 3. Actividades enzimáticas Se analizaron los niveles de fosfatasa, β-glucosidasa y deshidrogenasa según los procedimientos de Tabatabai (1994). • Fosfatasa: Se pesaron 2 g de suelo (control y dos repeticiones de cada muestra) y se le añadieron 4 ml de buffer universal (MUB) y 1 ml de p-nitrophenilfosfato (PNP). La muestra se agitó y se dejó incubar al baño maría durante 1 hora a 37ºC. Transcurrido ese tiempo se paró la reacción añadiendo 1 ml de CaCl 2 0,5 M y 4 ml de NaOH 0,5 M. Posteriormente se midió mediante espectofotometría visible a 410 nm. Se determinó la cantidad de p-nitrophenilfosfato (PNP). Los resultados se expresaron en µg PNP/g suelo h. • β-glucosidasa: Se midió la actividad mediante la incubación de 0,5 g de suelo, a 37ºC durante 60 minutos, con 4 mL de buffer universal (MUB) a pH 6 y 1 mL de 0,05 M p-nitrophenyl-ß-D-glucoside (PNG). Tras 60 minutos se adicionaron 1 mL de CaCl 2 (0,5 M) y 4 mL de solución extractora de 0,1 M p-nitrophenol (THAM) a pH 12. Se filtró con papel Whatman nº 2 y se midió mediante espectrofotómetría visible a 410 nm para determinar la cantidad de p-nitrophenol formado. Los resultados se expresaron en µg PNG/g suelo h. • Deshidrogenasa: Se analizó la actividad deshidrogenasa mediante la incubación, a 37ºCdurante 24 horas, de 2 g de suelo, a los que se les añadió; 0,0335 g de CaCO 3 ,0,5 mL de 2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride (TTC) al 3% y 1,75 mL de agua millipore. Pasadas las 24 horas de incubación, se añadieron 7,75 mL de etanol y se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos. Se repitió el mismo procedimiento 2 veces más, añadiendo 10 mL de etanol en lugar de 7,75 y obteniéndose un volumen total de 30 mL de etanol. Se determinó la formación de 1,3,5-Triphenyltetrazolium formazán (TPF) a través de la medida en espectrofotometría visible a 485 nm. Los resultados se expresaron en µg TPF/g suelo h. 16 4. Sideróforos Para la cuantificación de sideróforos (queladores) se siguió el método propuesto por Schwyn & Neilands (1987) previa extracción con NaOH 0,1 M, en una relación 1:1 de p/v. Análisis del material vegetal Tras finalizar el ciclo y sacarse las macetas de la cámara de cultivo, las plantas fueron desprendidas del suelo y se separaron y pesaron por separado raíz y parte aérea. Las raíces fueron introducidas en un baño de ultrasonidos para eliminar contaminaciones. El material vegetal se introdujo en estufa a 65ºC dentro de sobres de papel individuales durante al menos 48 horas para desecar por completo los tejidos. Tras esto, se separaron los granos de la parte aérea y se volvieron a pesar por separado. El material vegetal se molió finamente (tamaño de partícula inferior a 1 mm) para luego introducirse en hornos mufla a 550ºC durante 8 horas para ser calcinado. A continuación, se procede a disolver la ceniza resultante en 10 mL de 1 N HCl. En la disolución resultante, se determinaron Zn, Fe, Cu y Mn mediante espectrometría de absorción atómica (Thermo Fisher C3100) y el P mediante colorimetría siguiendo el método de Murphy and Riley (1962). Análisis estadístico Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) en bloques al azar con tres factores. Previamente se comprobó la distribución normal de datos y la homogeneidad de la varianza con los test de Smirnov-Kolmogorov y Cochran, respectivamente. En caso de no cumplir estos requisitos los datos se transformaron mediante transformación logarítmica o potencial. Si el efecto de los factores principales era significativo, se realizó la comparación de medias mediante el test LSD (P < 0,05). Si la interacción de factores es significativa, el efecto de los factores principales no puede discutirse, ya que su efecto depende del nivel del otro factor. En tal caso, se realizó un análisis del efecto (ANOVA) para la combinación de los dos factores y una comparación de medias 17 mediante el test mencionado anteriormente. También se realizaron regresiones para estudiar las posibles relaciones entre variables. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software Statgraphis Centurion XVI (Statpoint 2013). 18 Resultados La producción de biomasa, en concreto la materia seca de grano y tallo, fue afectada significativamente por los tratamientos (Tabla 5). Es la celulosa la que tanto en grano como en tallo mejora la materia seca con respecto al testigo. En el caso del tallo también B. subtilis mejora la biomasa respecto al testigo sin tratar de manera estadísticamente representativa. T. asperellum no dio lugar a diferencias significativas respecto al testigo sin inocular. Lo mismo ocurre con el número de granos (Tabla 6). Podemos ver claramente el efecto que producen dichos tratamientos en las Figuras 1, 2 y 3. Por el contrario, los tratamientos no tuvieron efectos significativos sobre parámetros nutricionales de la planta (Tabla 7). En cuanto a los efectos de los tratamientos en las propiedades bioquímicas del suelo, sí hemos observado efectos significativos de los tratamientos sobre actividades enzimáticas en la rizosfera (glucosidasa y fosfatasa) y Fe complejado por sideróforos (Tabla 5). A este respecto, podemos resaltar el efecto significativo de los tratamientos de T. asperellum y de celulosa ya que aumentan la actividad enzimática en el suelo (glucosidasa y fosfatasa) respecto al testigo y en mayor medida que B. subtilis (Tabla 8). Por el contrario, la adición de celulosa al suelo reduce la cantidad de Fe complejado por sideróforos. 19 Tabla 5. Análisis de la varianza de parámetros de biomasa y bioquímicos del suelo (valor de P) Fuente de variación MS tallo MS raiz 1 MS grano Nº grano Ácido oxálico Deshidrogenasa 2 β-Glucosidasa 3 Fosfatasa 4 Sideróforos A: Suelo 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 B: Tratamiento 0,0094 0,2094 0,0477 0,2103 0,0801 0,7716 0,0001 0,0283 0,0051 C: Nivel de Zn 0,0000 0,0557 0,0002 0,0299 0,9290 0,0000 0,0000 0,0000 0,0015 INTERACCIONES AB 0,0150 0,2214 0,3553 0,1172 0,6916 0,0000 0,0026 0,0008 0,0026 BC 0,7396 0,0267 0,6375 0,5997 0,0492 0,3862 0,6974 0,5308 0,1252 1 Transformada Dato 0.17 para cumplir requisitos de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homodedasticidad (Cochran) 2 Transformada Dato -0.356 para cumplir requisitos de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homodedasticidad (Cochran) 3 Transformada Dato -0.388 para cumplir requisitos de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homodedasticidad (Cochran) 4 Transformada Dato 0.11 para cumplir requisitos de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homodedasticidad (Cochran) MS= materia seca 20 Tabla 6. Efecto del tratamiento en valores de biomasa Tratamiento MS tallo MS grano Nº granos Promedio Error Estándar Promedio Error Estándar Promedio Error Estándar B 0,97 ± 0,04 a 0,39 ± 0,02 ab 11,65 ± 0,63 ab C 1,00 ± 0,03 a 0,42 ± 0,02 a 12,70 ± 0,56 a H 0,95 ± 0,03 ab 0,37 ± 0,02 ab 11,95 ± 0,44 ab T 0,92 ± 0,04 b 0,39 ± 0,02 b 11,23 ± 0,62 b Medias separadas con letras que indican grupos homogéneos diferentes (LSD) MS expresada en g B, B. subtilis, C, celulosa, H, T. asperellum y T, testigo Figura 1. Efecto del tratamiento sobre el peso seco del tallo en gramos. B, B. subtilis, C, celulosa, H, T. asperellum y T, testigo. Barras indican error estándar. Figura 2. Efecto del tratamiento sobre el peso seco del grano en gramos. B, B. subtilis, C, celulosa, H, T. asperellum y T, testigo. Barras indican error estándar. MS tallo (g) B C H T Medias y 95,0% Intervalos LSD Tratamiento 0,89 0,92 0,95 0,98 1,01 1,04 MS grano (g) B C H T Medias y 95,0% Intervalos LSD Tratamiento 0,32 0,35 0,38 0,41 0,44 0,47 21 Tabla 7. Análisis de la varianza de parámetros de concentración de nutrientes en grano y nutrientes totales en planta (valor de P) Fuente de variación [Fe] grano 1 [Cu] grano [Mn] grano [Zn] grano [P] grano 2 Fe planta 3 Cu planta 4 Mn planta 5 Zn planta 6 P planta 7 Zn grano/ Zn planta 8 Fe grano/ Fe planta 9 A: Suelo 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 B: Tratamiento 0,7063 0,5865 0,3950 0,7024 0,0994 0,5351 0,6021 0,5869 0,5257 0,9921 0,1023 0,8481 C: Nivel de Zn 0,7382 0,9945 0,0008 0,1638 0,0067 0,0212 0,6936 0,0006 0,0000 0,3892 0,5634 0,9215 INTERACCIONES AB 0,4505 0,4930 0,1970 0,2949 0,2864 0,2178 0,5202 0,0120 0,0836 0,3745 0,1222 0,1999 BC 0,3460 0,1655 0,2401 0,0442 0,3602 0,0044 0,4577 0,0012 0,0003 0,0068 0,0394* 0,1108 1 2 3 5 9 Transformación logarítmica (base 10) para cumplir requisitos de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homodedasticidad (Cochran) 4 Transformada Dato -0,231 para cumplir requisitos de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homodedasticidad (Cochran) 6 Transformada Dato 0.09 para cumplir requisitos de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homodedasticidad (Cochran) 7 Transformada Dato -0,138 para cumplir requisitos de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homodedasticidad (Cochran) 8 Se elimina interacción ABC para mejorar el valor de P, al ser la interacción ABC no significativa 22 Figura 3. Efecto del tratamiento sobre el número de granos. B, B. subtilis, C, celulosa, H, T. asperellum y T, testigo. Barras indican error estándar Tabla 8. Efecto del tratamiento en valores bioquímicos del suelo Tratamiento Glucosidasa Fosfatasa Sideróforos Promedio Error Estándar Promedio Error Estándar Promedio Error Estándar B 121,71 ± 1,7 b 186,86 ± 3,85 ab 0,0134 ± 0,0003 a C 124,91 ± 1,7 a 199,88 ± 3,78 a 0,0118 ± 0,0003 b H 124,93 ± 1,7 a 196,52 ± 3,78 a 0,0131 ± 0,0003 a T 117,42 ± 1,7 b 186,38 ± 3,78 b 0,0134 ± 0,0003 a Medias separadas con letras que indican grupos homogéneos diferentes (LSD) B, B. subtilis, C, celulosa, H, T. asperellum y T, testigo Glucosidasa expresada en µg PNG/g suelo h Fosfatasa expresada en µg PNP/g suelo h Sideróforos expresados en µg (Fe 3+) complejados por sideróforos/g suelo Las actividades enzimáticas presentan además relaciones lineales positivas entre ellas como se puede ver en los Figuras 4 y 5. Figura 4. Relación lineal entre fosfatasa y glucosidasa. P=0 R 2 =37,69% B C H T Medias y 95,0% Intervalos LSD Tratamiento 10 11 12 13 14 Nº grano Gráfico del Modelo Ajustado Fosfatasa = 103,65 + 0,727865*Glucosidasa 0 50 100 150 200 250 300 Glucosidasa 0 100 200 300 400 Fosfatasa 23 Figura 5. Relación lineal entre fosfatasa y deshidrogenasa. P=0 R 2 =37,78% Se han estudiado además otras relaciones lineales como entre valores de biomasa (raíz seca) y bioquímicos del suelo (Fe complejado por sideróforos) (Figura 6). También entre valores de concentración de nutrientes (P en planta) y actividad enzimática (fosfatasa) (Figura 7). Figura 6. Relación lineal entre raíz seca y sideróforos. P=0 R 2 =27,9% Gráfico del Modelo Ajustado Fosfatasa = 152,283 + 19,3964*Deshidrogenasa 0 2 4 6 8 10 Deshidrogenasa 0 100 200 300 400 Fosfatasa Sideróforos Gráfico del Modelo Ajustado Raíz seca (g) = 0,628549 - 26,8282*sideroforos 0 4 8 12 16 20 24 (X 0,001) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Raíz seca (g) 30 Discusión La inoculación con B subtilis y la aplicación de celulosa incrementó la materia seca de los tallos de las plantas de trigo respecto al testigo sin tratamiento. Además, la celulosa también incrementó la producción de grano, mientras que los incrementos obtenidos con B. subtilis y T34 no fueron significativamente distintos del testigo sin tratamiento. Esto indica que la inoculación con ciertos microorganismos o el incremento de la actividad microbiana del suelo que se puede conseguir con la aplicación de enmiendas orgánicas, que en nuestro caso se simulan con la aplicación de celulosa, pueden tener efectos positivos en el desarrollo y producción de los cultivos. Por el contrario, la concentración de nutrientes en las plantas no se mejoró con estos tratamientos. Esto puede deberse a un efecto de dilución en los tejidos de la planta, al aumentar la biomasa en tallo y grano y el número de granos mediante los tratamientos no se consigue aumentar la concentración de nutrientes en la planta. Es bien conocido que la concentración de nutrientes a lo largo del ciclo de cultivo disminuye al aumentar la acumulación de biomasa (Villalobos y Fereres, 2017). Esto puede resultar particularmente evidente si la disponibilidad de un nutriente en el suelo es limitada. El efecto de mejora en la producción de biomasa o grano no parece necesariamente relacionado con mejoras en la acumulación total de un nutriente, ya que en este caso el efecto de los tratamientos depende esencialmente del nivel de Zn en el suelo. Este efecto positivo podría explicarse por el efecto que los microorganismos del suelo pueden tener en la producción de sustancias fisiológicamente activas (García-López et al., 2015). Otro aspecto remarcable es el hecho de que los tratamientos que aumentan la relación Zn grano/Zn planta también reducen la concentración de P en el grano. El aumento de la relación mencionada implica un aumento en el índice de cosecha de este nutriente. Éste es un efecto positivo ya que de alguna manera contribuye a aumentar el efecto biofortificante. La relación negativa entre Zn grano/Zn planta y la concentración de P en grano puede poner de manifiesto que el antagonismo entre el Zn y el P puede ser debido a la interacción del P en el movimiento de Zn en la planta. Entre las propiedades que están afectadas por la interacción de los tratamientos y el tipo de suelo está la concentración de sideróforos en la rizosfera. No se puede distinguir entre la producción de sideróforos por la planta (las gramíneas como el trigo la producen) o los 31 microorganismos, pero se sabe que también pueden afectar la acumulación de Zn. Hay una relación negativa entre la concentración de sideróforos y la materia seca de raíz. Una explicación plausible sería que cuando los medios son menos limitantes para la planta, al tener una mayor disponibilidad de micronutrientes, las plantas se desarrollan mejor y hay menos necesidad de secretar sustancias que movilicen estos nutrientes, lo que conlleva un gasto energético. El factor que mayor efecto tiene sobre los parámetros estudiados es el suelo. Sin embargo, los suelos también influyen en los efectos de los tratamientos como ponen de manifiesto muchas de las interacciones descritas. Esto puede deberse a las diferencias en las propiedades químicas y físicas que presentan cada uno de los cinco suelos estudiados. En general, no se puede establecer una propiedad del suelo en concreto que explique estos resultados. Esto parece indicar que es un conjunto de propiedades del suelo que afectan la geoquímica y disponibilidad de los nutrientes la que explica el diferente efecto que los tratamientos relacionados con la actividad microbiana tienen dependiendo del tipo de suelo. La interacción entre tratamientos y tipo de suelo en las actividades enzimáticas pueden revelar un diferente efecto de inoculación y enmienda en parámetros relacionados con la actividad microbiana dependiendo del tipo de suelo, bien sea por sus propiedades fisicoquímicas o porque las poblaciones de microorganismos autóctonas pueden afectar el establecimiento de los inóculos. Las relaciones de la fosfatasa con la deshidrogenasa y con la β-glucosidasa revelan que la primera actividad está influenciada por la actividad microbiana en el suelo, ya que las otras actividades están asociadas a microorganismos del suelo. Por tanto, parece que los microorganismos afectan positivamente la actividad hidrolítica del P orgánico, que se sabe contribuye al suministro de P para las plantas (Recena et al., 2015). Esto contribuye a explicar la relación positiva observada entre el P en la planta y la actividad fosfatasa en la rizosfera. Existen interacciones entre el nivel de Zn en el suelo y los tratamientos en parámetros que son relevantes desde un punto de vista de nutrición de la planta y que afectan a la calidad nutricional del grano. Los tratamientos aumentan el contenido en Zn en la planta en mayor medida en aquellos suelos con altos niveles en Zn. En promedio, la inoculación con los dos microorganismos o la aplicación de celulosa aumenta un 20 % la acumulación de Zn total en la planta cuando los niveles de Zn son altos. Por el 32 contrario, el efecto parece negativo a niveles bajos del nutriente, en particular para B. subtilis y para T34, lo que quizás pone de manifiesto cierto efecto de competencia en la adquisición de Zn cuando los niveles de disponibilidad son bajos en el suelo (Marschner et al. 2011). Sin embargo, en aquellos suelos con niveles bajos, los tratamientos mejoran la acumulación de Zn en el grano respecto al que se acumula en la planta en su conjunto, en particular B. subtilis y celulosa, que mejoran el índice de cosecha de Zn (Zn grano/Zn planta) en un 30 %. Por tanto, aunque en condiciones de mayor limitación de disponibilidad de Zn en el suelo hay una menor absorción de Zn por la planta, la proporción de Zn que se acumula en el grano es mayor con estos tratamientos. Esto revela cierto efecto en el transporte de Zn al grano que resulta positivo en términos nutricionales. Curiosamente, existe también, una interacción sobre el P en la planta. Resulta particularmente claro en el efecto de T34, positivo con niveles altos de Zn, y negativo con niveles bajos. Esto revela, que los potenciales efectos de los inoculantes microbianos sobre el Zn o el P no se pueden contemplar de manera aislada, y que la interacción entre ambos nutrientes puede condicionar el efecto de dichos inoculantes. 33 Conclusiones Los tratamientos de B. subtilis, T. asperellum y celulosa no incrementaron el contenido en nutrientes en la planta mientras que sí dieron lugar a una mayor producción de biomasa en tallo y grano y del número de granos. El efecto de los tratamientos en las actividades enzimáticas en la rizosfera y en la nutrición de las plantas está condicionado sobre todo por las propiedades del suelo, pero también por el nivel de Zn del suelo. En los suelos con niveles altos en Zn, la inoculación con microorganismos y la celulosa aumentó el Zn total en la planta, mientras que en los suelos con niveles bajos de Zn los tratamientos con celulosa y B. subtilis aumentan de manera significativa la acumulación de Zn en el grano respecto al resto de la parte aérea. 34 Bibliografía Altomare, C., Norvell, W. A., & Harman, G. E. (1999). Solubilization of Phosphates and Micronutrients by the Plant-Growth-Promoting and Biocontrol Fungus Trichoderma harzianum Rifai Solubilization of Phosphates and Micronutrients by the Plant-Growth-Promoting and Biocontrol Fungus Trichoderma harzianum Rifai. Appl EnvironMicrobiol 65, 65(7), 2926–2933. Arkhipova, T. N., Prinsen, E., Veselov, S. U., Martinenko, E. V., Melentiev, A. I., & Kudoyarova, G. R. (2007). Cytokinin producing bacteria enhance plant growth in drying soil. Plant and Soil, 292(1–2), 305–315. https://doi.org/10.1007/s11104- 007-9233-5 Cakmak, I. (2002). 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