Uso de residuos de almazara como enmienda orgánica: efecto en el comportamiento de herbicidas, parámetros fisiológicos del cultivo y población microbiana del suelo

Uso de residuos de almazara como enmienda orgánica: efecto en el comportamiento de herbicidas, parámetros fisiológicos del cultivo y población microbiana del suelo Sevilla, Octubre, 2012 Memoria que presenta Ana Isabel Cañero Amoreti para optar al título de Doctor con Mención Internacional por la Universidad de Sevilla Uso de residuos de almazara como enmienda orgánica: efecto en el comportamiento de herbicidas, parámetros fisiológicos del cultivo y población microbiana del suelo Visado en Sevilla, a 23 de octubre de 2012 LOS DIRECTORES LOS DIRECTORES EL TUTOR Dr D. Juan Cornejo Suero Profesor de Investigación del CSIC Dra. Dña. Lucía Gracia Cox Meana Investigadora Científica del CSIC Dra. Dña. Matilde Forteza González Profesor Titular de la Universidad de Sevilla Memoria que presenta Ana Isabel Cañero Amoreti para optar al título de Doctor con Mención Internacional por la Universidad de Sevilla PROFESOR DE INVESTIGACIÓN D. JOSÉ MANUEL PARDO PRIETO, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Uso de residuos de almazara como enmienda orgánica: efecto en el comportamiento de herbicidas, parámetros fisiológicos del cultivo y población microbiana del suelo”, presentada por Dña. Ana Isabel Cañero Amoreti para optar al grado de Doctor con Mención Internacional por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada en el Departamento de Agroquímica y Conservación de Suelos, bajo la dirección de los Drs. D. Juan Cornejo Suero y Dña. Lucía Gracia Cox Meana, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. En Sevilla, a 23 de octubre de 2012 El presente trabajo se ha realizado en el marco del proyecto AGL2007-65771-C02-01 del Plan Nacional de I +D (CYCIT), dentro del Programa Nacional de Formación de Personal Investigador. herbicidas, mostraron cepas tolerantes a MCPA y S-metolacloro, sin embargo, estas cepas no lograron crecer en presencia de estos herbicidas como única fuente de carbono. ABSTRACT In this Doctoral Thesis we present an evaluation of the effect of addition of organic wastes from olive oil extraction to soils on herbicide fate, Olea europaea physiology, and microbiota of soils. The effect of addition of olive oil wastes on MCPA and S-metolachlor behavior in soils was studied through sorption-desorption, dissipation, mineralization, leaching and bioassays assays under laboratory conditions with three soils from intensive crops. Due to the different degree of humification and composting state, the residues used showed different composition of dissolved organic components. The addition of these residues to soils did not negatively affect soil microbial population since dissolved organic matter and soil respiration increased. Different effects were found in MCPA and S-metolachlor behavior upon amendment with the residues: while no effect was detected in the case of MCPA, increase in retention and lower leaching and dissipation was found for S- metolachlor. The effect aged residues from olive oil extraction after 9 years application in the field on bentazone and S-metolachlor fate was also studied and compared to the results obtained with soils amended with fresh organic residues under laboratory conditions. Different behaviour was observed and attributed to differences in dissolved organic matter and porosity of the soils systems. This work also shows indirect phytotoxicity of the herbicide terbuthylazine reducing the photosynthetic efficiency of Olea europaea plants under greenhouse conditions. This reduction was counterbalanced by the addition of organic residues due to the increase in sorption of the herbicide to soil particles, minimizing plant absorption. No negative effect was observed in the case of glyphosate. The study of herbicide addition and soil amendment with organic residues on soil microbial communities did not reveal a negative effect on microbiota when herbicides MCPA, S-metolachlor or organic residues were added. While resistant to herbicides using these as only carbon source were not detected, tolerant organisms to high herbicides doses were found. ÍNDICE Capítulo I Introducción general………………………………………............................ 33 Capítulo II Efecto de la adición de alperujo sobre el comportamiento en suelo de los herbicidas MCPA y S-metolacloro bajo condiciones de laboratorio. Estudios de adsorción-desorción, disipación, mineralización, lixiviación y bioensayos………………………………………. 79 Capítulo III Efecto de residuos orgánicos transformados y no transformados en suelo sobre el comportamiento de bentazona y S- metolacloro. Estudios de adsorción-desorción, disipación, mineralización, lixiviación, actividad deshidrogenasa……………… 151 Capítulo IV Efecto de la adición de alperujo y de los herbicidas terbutilazina y glifosato sobre la eficiencia fotosintética en plantas jóvenes de Olea europaea bajo condiciones de invernadero. Estudios de fluorescencia de la clorofila a e intercambio gaseoso………………. 193 Capítulo V Efecto de la adición de alperujo y herbicidas a suelos sobre comunidades microbianas autóctonas del mismo. Estudios independientes y dependientes de cultivo…………………………………. 221 Capítulo VI Conclusiones Generales……………………………………………………………. 261 Capítulo VII Publicaciones……………………………………………………………………………. 269 Capítulo I I.- Introducción General……………………………………………………. 38 I.1.-ANTECEDENTES…………………………………………………………………… 38 I.2.-DINÁMICA DE PLAGUICIDAS EN SUELOS……………………............. 40 I.2.1.-Procesos de transferencia o transporte………………………… 41 I.2.1.1.-Procesos de adsorción-desorción………………………….. 41 a) Mecanismos de adsorción.................................... 43 b) Medida de adsorción……………………………………….. 43 c) Factores que influyen en la adsorcióndesorción................................................................... 48 I.2.1.2.-Procesos de lixiviación. Factores que afectan a la movilidad del plaguicida en suelo…………..………………………… 56 I.2.1.3.-Volatilización…………………………………………………………. 60 I.2.1.4.- Escorrentía…………………………………………………………... 60 I.2.1.5.- Absorción por plantas y organismos……………………. 60 I.2.2.- Procesos de degradación o transformación…………………. 61 I.2.2.1.- Degradación química…………………………………………..… 61 I.2.2.2.- Biodegradación…………………………………………………….. 61 I.2.2.3.- Fotodegradación……………………………......................... 62 I.3.-IMPORTANCIA DE LA ADICIÓN DE ENMIENDAS ORGÁNICAS AL SUELO. EL ALPERUJO COMO ENMENDANTE … 63 I.4.-BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………. 68 Capítulo II Efecto de la adición de alperujo sobre el comportamiento en suelo de los herbicidas MCPA y S-metolacloro bajo condiciones de laboratorio. Estudios de adsorcióndesorción, disipación, mineralización, lixiviación y bioensayos…………………………………………….............................. 80 II.1.- INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………. 82 II.2.- OBJETIVOS………………………………………………………………………..… 84 II.3.- MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………….….. 86 II.3.1. Herbicidas………………………………………………………………........ 86 II.3.1.1.-MCPA……………………………………………………………………. 86 II.3.1.2.-S-metolacloro…………………………………………………....... 87 II.3.1.3.- Método de análisis de los herbicidas…………………… 88 II.3.2. Alperujos………………………………………………………………………. 89 II.3.2.1. Propiedades físico-químicas…………………………………. 90 II.3.2.2. Caracterización de la materia orgánica soluble (MOS) 92 II.3.3. Suelos…………………………………………………………………………… 93 II.3.3.1. Análisis elemental………………………………………………… 93 II.3.3.2. Mineralogía………………………………………………………….. 93 II.3.3.3. Porosimetría………..………………………………………………. 93 II.3.3.4. Determinación capacidad de retención de agua 94 II.3.3.5. Respiración basal…………………………………………………. 95 II.3.4. Estudios con herbicidas en laboratorio.………………………. 96 II.3.4.1.- Estudios de adsorción………………………………………… 96 II.3.4.2.- Estudios de desorción………………………………………… 97 II.3.4.3.- Estudios de disipación……………………………………….. 98 II.3.4.4.- Estudios de mineralización………………………………… 100 II.3.4.5.- Estudios de lixiviación……………………………………….. 101 II.3.4.6.- Bioensayo…………………………………………………………… 102 II.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………… 104 II.4.1.- Caracterización de alperujos………………………………………. 104 II.4.1.1. Propiedades físico-químicas……………….………………… 104 II.4.1.2. Caracterización MOS.…………………………………………… 106 II.4.2.- Suelos………………………………………………………………………… 111 II.4.2.1. Análisis elemental. Propiedades Fisicoquímicas y superficiales……………………………………………………………………… 111 II.4.2.1. Respiración basal………………………………….……………… 116 II.4.3.- Estudios con MCPA……………………………………………………. 117 II.4.3.1.- Estudios de adsorción…………………………………………. 117 II.4.3.2.- Estudios de desorción……………..……….………….……… 121 II.4.3.3.- Estudios de disipación………………..………….…………… 122 I II.4.4.1.- Estudios de adsorción ……………………….…………….. 125 II.4.4.2.- Estudios de desorción…………………….………..………… 125 II.4.3.6.- Bioensayo………………………………………………………….. 129 II.4.4.- Estudios con S-metolacloro…………………………………………. 131 II.4.4.1.- Estudios de adsorción………………………………………….. 131 II.4.4.2.- Estudios de desorción………………………………………… 134 II.4.4.3.- Estudios de disipación………………………………………… 136 II.4.4.4.- Estudios de lixiviación………………………………………... 138 II.4.4.5.- Bioensayo…………………………………………………………… 141 II.5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 143 II.6. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………… 144 Capítulo III Efecto de residuos orgánicos transformados y no transformados en suelo sobre el comportamiento de bentazona y S-metolacloro. Estudios de adsorcióndesorción, disipación, mineralización, lixiviación y actividad deshidrogenasa…………………………………………………… 150 III.1.- INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….. 152 III.2.- OBJETIVOS…………………………………………………………………….. 154 III.3.- MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………... 154 III.3.1.- Herbicidas…………………………………………………………………... 154 III.3.1.1- Bentazona…………………………………………………………… 154 III.3.1.2- S-metolacloro…………………………………………………..… 155 III.3.1.3. Métodos de análisis de los herbicidas………………… 155 III.3.2.- Residuos orgánicos y suelo………………………………………. 155 III.3.3.- Análisis de residuos orgánicos y suelo………………………. 157 III.3.4.- Estudios de laboratorio…………………………………………….. 158 III.3.4.1.- Estudios de adsorción-desorción……………………….. 158 III.3.4.2.- Estudios de disipación-mineralización-Actividad deshidrogenasa………………………………………………………………….. 158 III.3.4.4.- Estudios de lixiviación……………………………………. 159 III.3.4.5.- Análisis estadístico……………..…………………………... 160 III.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………..…………………………………. 161 III.4.1.- Propiedades fisicoquímicas y superficiales de los suelos sin enmendar y enmendados y de los residuos usados. 161 III.4.2.- Respiración basal……………………………………………………… 166 III.4.3.- Estudios de laboratorio…………………………………………….. 167 III.4.3.1.- Estudios de adsorción…………………………………………. 167 III.4.3.2.- Estudios de desorción…………………………………………. 170 III.4.3.3.- Estudios de disipación-mineralización……………….. 174 III.4.3.5.- Monitorización de actividad deshidrogenasa……… 177 III.4.3.6.- Estudios de lixiviación…………………………………………. 181 III.5.- CONCLUSIONES…………………………………………………………………. 185 II.6.- BILIOGRAFÍA……………………………………………………………………... 191 Capítulo IV Efecto de la adición de alperujo y de los herbicidas terbutilazina y glifosato sobre la eficiencia fotosintética en plantas jóvenes de Olea europaea bajo condiciones de invernadero. Estudios de fluorescencia de la clorofila a e intercambio gaseoso…………………………………………………………… 195 IV.1.- INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………. 195 IV.2.- OBJETIVOS………………………………………………………………………… 197 IV.3.- MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………..……………… 198 III.3.1. Herbicidas………………………………………………………………….. 199 IV.3.2. Tratamiento plantas y del suelo ……………………………….. 201 IV.3.3. Suelo y residuo orgánico …..………………………………….…… 202 IV.3.4. Adsorción y análisis de los herbicidas………………………… 202 IV.3.5. Medida de fluorescencia de la clorofila a……..……………. 202 IV.3.6. Medida de intercambio gaseoso……..………………………… 203 IV.3.7. Análisis estadístico……..……………………………………………… 205 IV.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………. 206 IV.4.1 Adsorción……….……..…………………………………………………… 206 IV.4.2 Fluorescencia……………………………………………………………… 208 IV.4.3. Intercambio gaseoso………………..…………………………………. 212 IV.5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 214 IV.5. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………….. 215 Capítulo V Efecto de la adición de alperujo y herbicidas a suelos sobre comunidades microbianas autóctonas del mismo. Estudios independientes y dependientes de cultivo. …………………………. 221 V.1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………… 221 V.2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………… 227 V.3. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………….…… 228 V.3.1.- Herbicidas…………………………………………………………………. 228 V.3.2.- Alperujos………………………………………………………………..… 228 V.3.3.- Suelos………………………………………………………………………. 228 V.3.4.- Extracción de ADN de suelos y alperujos…………………… 228 V.3.5. Extracción de ARN…………………………………………………….. 229 V.3.6. Caracterización morfológica y recuento de microorganismos bajo técnicas cultivo-dependientes…………… 230 V.3.7. Electroforesis en gel de agarosa………………………………... 231 V.3.8. Amplificación de ARNr 16S a través de PCR………………… 233 V.3.9. Electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE)……………………………………………………………………………….. 233 V.3.10. Estudio de tolerancia de las poblaciones microbianas frente a los herbicidas……………………………………………………….. 235 V.3.11. Estudios de degradación de los herbicidas MCPA y S- metolacloro por cepas aisladas……………………………………..……. 236 V.3.12. Secuenciación.………………………………………………………… 236 V.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.……………………………………………….. 237 V.4.1. Extracción de ARN.…………………………………………………. 237 V.4.2. Caracterización morfológica y recuento de colonias o UFC…………………………………………………………………………………… 239 V.4.3. Aislamiento colonias seleccionadas, purificación y secuenciación……………………………………………………………………. 240 V.4.4. DGGE.……………………………………………………………………... 250 V.4.5. Selección de microorganismos resistentes………………. 252 V.5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 257 V.6. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………… 258 Capítulo VI VI. Conclusiones Generales………………………………………………… 265 Capítulo VII VI. Publicaciones……………………………………………………………….. 269 VI.1. Cañero, A.I., Cox, L., Redondo-Gómez, S., Mateos- Naranjo, E., Hermosín, M.C., Cornejo, J. Effect of the herbicides terbuthylazine and glyphosate on Photosystem II Photochemistry of young olive (Olea europea) plants. J.Agric. 269 Food Chem. 2011, 59, 5528-5534. ………………………………………….. VI.2. Cañero, A.I., Becerra, D., Cornejo, J., Hermosín, M.C. Albarrán, A., López-Piñeiro, Cox, L. Transformation of organic wastes in soil: Effect on bentazone behaviour. Sci. Tot. Environ. 2012, 433, 198-205……………………………………… 276 ÍNDICE DE TABLAS Tabla I.1. Procesos que determinan el comportamiento de los plaguicidas en suelo……………………………………………………………………………………… 36 Tabla II.1. Límites inferiores de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) por HPLC para MCPA y S-metolacloro……………………………………………… 85 Tabla II.2. Propiedades físico-químicas e índice de humificación (HIX) de los dos alperujos utilizados…………………………………………………………… 101 Tabla II.3. Porcentajes para algunos macronutrientes y micronutrientes metálicos y no metálicos contenidos en los dos alperujos Jaén (AJ y Morón (AM) utilizados……………………………………………………………… 102 Tabla II.4. Propiedades físico-químicas de los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 5 y 10% (p/p) con AJ (S5J, S10J, C5J, C10J, T5J, T10J) y con AM (S5M, S10M, C5M C10M, T5M, T10M)……………………………………………………………………………….. 108 Tabla II.5. Porcentajes relativos de filosilicatos presentes en la fracción arcilla de los tres suelos estudiados sin enmendar (S, C y T) …………………. 110 Tabla II.6. Volúmenes de poro (mm3 g-1) para distintos rangos de tamaño de poro y volúmenes totales de poro para los suelos usados sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 5 y 10% (p/p) con AJ (S5J, S10J, C5J, C10J, T5J, T10J) y con AM (S5M, S10M, C5M C10M, T5M y T10M)………………………………………………………………………………………. 110 Tabla II.7. Coeficientes de adsorción de Freundlich para MCPA en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 10% (p/p) con AJ (S10J, C10J, T10J) y con AM (S10M, C10M, T10M)………………………………………………………………………………………… 112 Tabla II.8 Coeficientes de desorción de Freundlich y porcentaje de desorción (D) y coeficiente de histéresis (H) para MCPA en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 10% (p/p) con AJ (S10J, C10J, T10J) y con AM (S10M, C10M yT10M)………………………………………………………………………………………. 116 Tabla II.9. Vida media (T ½) y coeficientes de ajuste a una cinética de primer orden para MCPA en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 10% (p/p) con AJ (S10J, C10J, T10J) y con AM (S10M, C10M, T10M)………………………………………………………….. 118 Tabla II.10. Coeficientes de adsorción de Freundlich para S-metolacloro en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 5 y 10% (p/p) con AJ (S5J, S10J, C5J, C10J, T5J y T10J) y con AM (S5M, S10M, C5M C10M, T5M y T10M)……………………………………….. 121 Tabla II.11. Coeficientes de desorción de Freundlich, el porcentaje de desorción (D), y el coeficiente de histéresis (H) para S-metolacloro en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 10% (p/p) con AJ (S5J, S10J, C5J, C10J, T5J y T10J) y 129 Capítulo I. Introducción General 33 CAPITULO I. Introducción General I.1. Antecedentes Uno de los pilares de la economía española lo constituye la producción agrícola, y es que España cuenta con la segunda extensión agraria más importante de Europa (en torno a 16-18 millones de hectáreas) y cuyo VAB (Valor Añadido Bruto) agrario, a precios básicos, se situó en tercer lugar entre los países de la UE, después del de Italia y el de Francia, así como también con la contribución más importante de Europa a la Red Natura 2000 (MAGRAMA, 2009). Sin embargo, el sector agrícola se ha visto durante años perjudicado por grandes pérdidas económicas generadas por la acción de patógenos y parásitos sobre los cultivos. En los últimos 50 años la introducción del uso de sustancias xenobióticas, sobre todo plaguicidas, para combatir plagas y enfermedades de las plantas, ha conseguido compensar estas pérdidas, haciendo que el uso de plaguicidas sea indispensable en la agricultura e incrementándose su uso en las últimas décadas. Gracias a esto, la producción en los cultivos se ha visto incrementada y se ha podido afrontar la gran demanda de alimentos que una población cada vez mayor solicitaba. De acuerdo con los informes de la FAO (Organización para la Alimentación y la Agricultura de las Naciones Unidas), a pesar del uso de plaguicidas gran parte de las cosechas se pierden, llegando estas pérdidas a suponer hasta un 25% en los países desarrollados. Uno de los motivos de estas pérdidas es que frecuentemente sólo entre un 1 y un 20% del producto aplicado (plaguicida) alcanza la plaga contra la que se destinaba actuar y, por tanto, más del 80% del producto se dispersa en el ambiente, llegando éstos a estar disponibles para sufrir procesos de degradación, lixiviación o escorrentía. Esto ha conducido al incremento en las dosis de aplicación de plaguicidas en los suelos, hasta lograr obtener beneficios en las cosechas. Este incremento supone un beneficio en el sector agrícola, pero la aplicación de plaguicidas en exceso a lo largo de los años, puede llegar a convertirse en fuente de contaminación puntual y/o difusa de plaguicidas y sus residuos. Esto hacía que los plaguicidas alcanzaran lugares hacia los que no estaban destinados, como por ejemplo las aguas subterráneas y superficiales, suponiendo un grave riesgo tanto para el ecosistema y organismos que lo habitan, como para el ser humano. El suelo como sistema complejo, dinámico y vivo, está constituido por compartimentos de diversa naturaleza, (tierra, agua, aire, organismos vegetales y animales) y todo en su conjunto posee la capacidad dentro de una medida, de autodepuración de sustancias xenobióticas como son los plaguicidas, contrarrestando, o amortiguando el impacto producido por su aplicación (Cornejo et al., 2005). Sin embargo, en los últimos años el aporte de éstos al suelo es mayor que la propia capacidad del mismo de amortiguar su efecto negativo, pasando los agroquímicos a ocupar espacios para los que no estaban destinados. Aquí reside el origen del problema del uso abusivo de plaguicidas. Este creciente problema ha despertado la necesidad de estudiar en profundidad el comportamiento de estos compuestos en suelo, y poder así minimizar su impacto sobre la salud humana y el medioambiente. Aragón et al. (2001) detectó valores máximos de 1.96 y 0.6 µg l-1 de herbicidas como la terbutilazina y el glifosato, respectivamente, en aguas subterráneas, siendo la familia más representativa en este estudio la de las triazinas. Otros estudios han detectado otros compuestos orgánicos en aguas subterráneas a valores también superiores a los establecidos por la Directiva CE sobre agua potable 80/778/EC y la nueva directiva 98/83/CE en la que la máxima concentración para un plaguicida es 0.1µg l-1 o la suma total de todos los plaguicidas presentes 0.5 µg l-1 (Carabías-Martínez et al., 2003, Arias-Estévez et al., 2008, Hildegrandt et al., 2008). Como consecuencia se modificaron la autorizaciones de algunas materias activas como por ejemplo terbutilazina por parte del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación MAPYA, restricciones y suspensiones temporales a nivel nacional en determinados ámbitos territoriales de riesgo por su proximidad a embalses destinados a la producción de aguas de consumo humano, constituyéndose para su uso la dosis máxima permitida de 1 kg ha-1 y año de sustancia activa en el olivar (Liñán, 2009). Además de la restricción en el uso de las materias activas aplicadas, el modo adecuado de aplicación de las mismas ha de ser tenido en cuenta, sobre todo en escenarios de riesgo como es el cultivo del olivar, para el control de contaminación de aguas y optimización de la eficiencia en el uso de plaguicidas (Manual de buenas prácticas en el olivar). 35 I.2. Dinámica de los plaguicidas en el suelo Los plaguicidas pueden incorporarse al suelo a través de tres vías principales. En primer lugar está la aplicación directa, típica de tratamientos sobre la superficie del suelos, en segundo lugar está la aplicación sobre las partes aéreas de las plantas, a través de la cual puede posteriormente ser arrastrado al suelo por efecto de la lluvia o por el viento, y en tercer lugar, por medio de restos vegetales desprendidos durante la cosecha o de forma natural, que transportan restos de plaguicidas al suelo. Figura I.1. Procesos por los que se pueden incorporar los plaguicidas al suelo. Una vez que el plaguicida se ha incorporado al suelo, va a sufrir la acción de diversos procesos simultáneamente, los cuales se pueden agrupar en dos grandes tipos: procesos de transferencia o transporte y procesos de transformación o degradación. Los procesos de transferencia o transporte son aquellos por los que el herbicida se ve desplazado de una a otras fases del suelo sin experimentar ningún tipo de transformación química de la molécula. En este grupo se engloban los procesos de adsorción, desorción, volatilización, lixiviación, escorrentía, absorción y exudación por organismos vivos y difusión y arrastre por aire y suelo. Por el contrario, los procesos de transformación, implican modificación de las propiedades químicas de los plaguicidas, APLICACIÓN DIRECTA APLICACIÓN PARTES AÉREAS PLANTAS ARRASTRE POR LLUVIA Y/O VIENTO RESTOS VEGETALES ARRASTRE DE RESTOS SUSPENDIDOS EN LA ATMÓSFERA PROCESOS DE TRANSFERENCIA PROCESOS DE TRANSFORMACIÓN -Adsorción-desorción -Volatilización -Lixiviación -Escorrentía -Absorción-exudación -Difusión-arrastre -Fotodegradación -Biodegradación -Degradación química transformándose en otros compuestos distintos, que pueden tener la misma, mayor o menor toxicidad. Éstos son la degradación química, biodegradación o Fotodegradación. Tabla I.1.Procesos que determinan el comportamiento de los plaguicidas en suelo Hay que tener en cuenta que todos los mecanismos que se mencionan se pueden dar simultáneamente en el sistema suelo. Además, estos procesos pueden afectarse unos a otros en mayor o menor medida, siendo el comportamiento en suelo de los plaguicidas resultado de la acción conjunta de todos ellos. El proceso de adsorción condiciona a cada uno de los demás, ya que modifica la cantidad de plaguicida en disolución y por ello la cantidad que puede lixiviar, volatilizar, perderse por escorrentía o ser absorbida por plantas u otros organismos. I.2.1. Procesos de transferencia o transporte I.2.1.1. Procesos de adsorción-desorción El proceso de adsorción se define como el paso de un soluto desde una fase líquida o gaseosa a la superficie de una fase sólida sin producir cambios en esta misma (Osgerby, 1970). Los procesos de adsorción en el suelo ocurren con mayor frecuencia entre la disolución del suelo y la fase sólida del suelo, ya que ésta se encuentra siempre rodeada de una fina capa de agua y sólo en casos de extrema aridez se produciría la adsorción gas-sólido (Pignatello, 1989). El proceso de adsorción se debe a la atracción o repulsión entre la superficie del adsorbente del suelo y las moléculas o iones del adsorbato (plaguicida) (Calvet, 1989). Los procesos de adsorción son muy importantes en la dinámica del plaguicida en suelo, ya que determinan la cantidad de plaguicida libre en solución y por tanto que puede sufrir transformación o transporte por otros procesos 37 (Cornejo et al., 2005). Por ejemplo, la volatilización, la lixiviación o la biodisponibilidad, disminuyen con la adsorción, (Ferreira et al., 2002), mientras que la degradación química o el transporte por partículas en suspensión pueden verse favorecidos (Cox et al., 1993). Figura I.2. Procesos que determinan el comportamiento de los plaguicidas en suelo. Otro proceso que también está implicado en la cantidad de herbicida que está disponible en la solución del suelo, es el proceso inverso a la adsorción: la desorción. Durante éste, las sustancias adsorbidas vuelven a la disolución del suelo o a su fase gaseosa. En caso de desorción total de las moléculas adsorbidas, se habla de adsorción reversible (Wauchope y Myers, 1985, Monkiedje y Spiteller, 2002), pero si las moléculas adsorbidas se desorben parcialmente, se habla entonces de adsorción irreversible (Cox et al., 1995). La irreversibilidad o histéresis es un fenómeno importante ya que en gran medida, determina la biodisponibilidad del plaguicida en el suelo (Wauchope, 2002). Las fuerzas de atracción responsables de la adsorción pueden ser de diferentes tipos y se clasifican como mecanismos de adsorción. En función de las propiedades de los solutos y de la superficie adsorbente son posibles varios tipos de mecanismos que pueden ocurrir simultáneamente. VOLATILIZACIÓN ADSORCIÓN DESORCIÓN LIXIVIACIÓN AGUAS SUBTERRÁNEAS ABSORCIÓNEXUDACIÓN DEGRADACIÓN BIOLÓGICA CAPILARIDAD DEGRADACIÓN QUÍMICA FOTODEGRADACIÓN a) Mecanismos de adsorción La adsorción y retención de plaguicidas en la fase sólida del suelo se debe a una serie de mecanismos que implican fuerzas de atracción. Normalmente no se da un único mecanismo, ya que en la mayoría de los casos la retención de los plaguicidas se produce por una variedad de fuerzas y factores. Según Cornejo y Hermosín (1996) hay mecanismos favorecidos por cambios de entalpía y otros en los que la adsorción produce cambios de entropía, como son las interacciones hidrofóbicas. Y por otro lado, describen mecanismos relacionados con cambios de entalpía, como son el enlace iónico, el enlace covalente, fuerzas de Van der Waals, puente de Hidrógeno, transferencia de carga y cambio de ligando. b) Medida de adsorción La medida y caracterización de la adsorción permite investigar los mecanismos de este tipo de interacciones y obtener por tanto resultados comparativos, entre adsorbatos (plaguicidas) y adsorbentes (suelos) diferentes y en diversas condiciones (Beck et al., 1993). La adsorción al suelo se caracteriza normalmente por una constante de reparto K, con el subíndice d para indicar distribución. Se define como la proporción entre la cantidad de moléculas adsorbidas y la cantidad de moléculas en disolución en el equilibrio: Siendo Ce la concentración de soluto en equilibrio con el suelo y Cs la cantidad adsorbida por unidad de masa del sólido. Frecuentemente se asume que Cs depende linealmente de Ce y se define un coeficiente de distribución, Kd, como: Esta forma lineal generalmente describe correctamente el equilibrio a bajas concentraciones de adsorbato en la fase líquida. El coeficiente Kd puede utilizarse para Kd= Cs/Ce CeCs Kd Ecuación I.1 39 comparar le grado de adsorción de diferentes compuestos en un mismo suelo o de un mismos compuesto en diferentes suelos en unas condiciones experimentales determinadas y a la concentración inicial del compuesto en cuestión. Por lo general, valores elevados de Kd indican que el plaguicida presenta una gran afinidad por el adsorbente y se suelen corresponder con plaguicidas hidrofóbicos e insolubles en agua (Wauchope et al., 2002). No obstante, en la mayoría de los casos la relación entre la cantidad adsorbida y la cantidad en disolución no es lineal, por lo que el valor de Kd depende de la concentración a la que se evalúe. En estos casos, una caracterización adecuada de la adsorción requiere la obtención de isotermas de adsorción. Isotermas de adsorción Las isotermas de adsorción representan la cantidad adsorbida por unidad de masa del sólido (Cs) en función de la concentración de soluto en equilibrio (Ce) a una determinada temperatura. Para eso se hacen interaccionar cantidades conocidas de sólido y soluciones de plaguicida con diferentes concentraciones iniciales. Una vez alcanzado el equilibrio, se determina la cantidad de plaguicida en disolución Ce, así como la cantidad adsorbida, Cs, para las distintas concentraciones conocidas. El valor de Cs se puede obtener directamente, determinando la cantidad de plaguicida que queda adsorbida en suelo tras la extracción del mismo por técnicas adecuadas, o indirectamente, por diferencia entre la cantidad inicial del plaguicida y la cantidad en equilibrio, asumiendo que la desaparición del plaguicida se debe a la adsorción y no a otros procesos. La forma de las isotermas es una característica importante porque proporciona mucha información acerca de los mecanismos de adsorción (Calvet, 1989) y está también relacionada con la naturaleza de la molécula a adsorber y de la superficie adsorbente. Según Giles et al. (1960) las isotermas de adsorción pueden ser clasificadas en cuatro tipos distintos, dependiendo de la pendiente del tramo inicial de la curva. A continuación se describen. Como la montmorillonita y la vermiculita tienen mayor superficie específica y CCC, su capacidad de adsorción de compuestos orgánicos es mayor que en el caso de otros minerales de la arcilla no expansibles (Cox et al., 1993, Hermosín et al., 1993). Según Green (1974), el grado en que estas superficies adsorben moléculas orgánicas depende principalmente de la naturaleza de los cationes de cambio, del grado de hidratación de la arcilla y de las propiedades de la molécula orgánica en cuestión. La adsorción de plaguicidas a los minerales de la arcilla puede ocurrir fundamentalmente en los cationes de cambio (bien directamente o por medio de moléculas de agua coordinadas a los cationes de cambio) o por interacción con los grupos OH basales de la caolinita y los de los bordes de las láminas de los silicatos (Calvet, 1989). Laird (1996) y Celis et al. (1997a), pusieron de manifiesto la existencia de micrositios hidrófobos situados entre las cargas de los espacios interlaminares que pueden adsorber moléculas orgánicas neutras por simple interacción hidrofóbica. También en este espacio interlaminar, los plaguicidas se pueden adsorber por interacción donador-aceptor de electrones (Hederlain y Schwarzernbech, 1993). Los óxidos metálicos coloidales que incluyen hidróxidos, oxohidróxidos y óxidos propiamente dichos son componentes muy importantes de la arcilla, siendo los de aluminio, silicio y sobre todo los de hierro especialmente abundante (Schwertamann y Taylor, 1989). En estos minerales los centros activos de adsorción son los hidroxilos superficiales que, según el pH del medio en que se encuentren, se pueden comportar como aceptores o donadores de electrones, es decir, tienen cargas dependientes del pH (Hingston et al., 1972). En suspensión acuosa, los átomos metálicos terminales del óxido completan su esfera de coordinación con grupos hidroxilos y moléculas de agua que adsorben H+ o OH- dependiendo del pH de la disolución. El pH al cual las cantidades adsorbidas de H+ y OH- es la misma se denomina punto de carga cero del óxido. Los óxidos y oxihidróxidos poseen una elevada superficie específica, lo que significa que pueden ser buenos adsorbentes de compuestos orgánicos, fundamentalmente aniónicos (Madrid y Díaz Barrientos, 1991; Hermosín y Cornejo, 1991; Celis et al., 1999b, Dubus et al., 2001). En general los compuestos orgánicos de baja polaridad no son capaces de competir con las moléculas de agua, que solvatan las superficies hidrofóbicas de los coloides minerales, por posibles sitios de adsorción. Además, la concentración del compuesto orgánico en la disolución del suelo suele ser demasiado pequeña, para 47 competir eficazmente con las moléculas de agua por los sitios de adsorción (Calvet, 1989). Por ello, frecuentemente se considera que los coloides minerales tienen un papel secundario en la adsorción de plaguicidas no iónicos salvo en el caso de suelos de muy bajo contenido en carbono orgánico. Para estos compuestos muy hidrofóbicos y en suelos con un contenido en materia orgánica mayor que el 2%, la adsorción ocurre fundamentalmente debido a la materia orgánica (Senesi, 1992; Schulten et al., 2001; Nemeth-Konda et al., 2002). Muchos autores han puesto de manifiesto las limitaciones de considerar a la materia orgánica como la única responsable de la adsorción en el caso de compuestos polares (Weber et al., 1986; Reddy y Gambrell, 1987; Calvet, 1989, Hermosín y Cornejo, 1991; Cox et al., 1995; Cox et al., 1996; Wauchope et al., 2002; Fernandes et al., 2003). En muchos casos se ha encontrado una mayor correlación entre la adsorción y el contenido de arcilla de los suelos que con el de materia orgánica (Hermosín et al., 1991; Hermosín y Cornejo, 1991; Cox et al., 1993; Cox et al., 1994a; Aguer et al., 2000; Hermosín et al., 2000). En estos casos el compuesto orgánico considerado tenía siempre características polares, iónicas o ionizables. Para estas condiciones Hermosín y Cornejo (1994) proponen el uso de un coeficiente de adsorción normalizado al contenido de arcilla, Kclay, similar al coeficiente de adsorción normalizado al contenido de carbono orgánico, KOC, que resalta la importancia de los coloides minerales en la adsorción y reduce la variabilidad en la adsorción. Componentes orgánicos Aunque la fracción orgánica en el suelo está compuesta por organismos vivos y sus restos no descompuestos, parcialmente descompuestos y completamente descompuestos, el término de materia orgánica en el suelo es usado para referirse más específicamente a los componentes no vivos, siendo una mezcla heterogénea compuesta de un gran número de productos resultantes de las transformaciones químicas y microbianas de desechos orgánicos. Sustancias no húmicas Son compuestos pertenecientes a los polisacáridos, polipéptidos, ácidos grasos y otros compuestos de bajo peso molecular procedentes de restos animales y vegetales y para los que es posible asignar una fórmula molecular precisa de las subunidades que los componen. Son, en general, fácilmente atacados o degradados por los microorganismos, lo que hace que el tiempo de vida media de estas sustancias en el suelo sea relativamente corto (Khan, 1980). Sustancias húmicas Grupo de compuestos orgánicos que se forma a partir de las sustancias no húmicas a través de procesos de biodegradación y de síntesis. Son mucho más estables, por lo que constituyen el grueso de la materia orgánica de la mayoría de los suelos (Khan, 1980). Las sustancias húmicas se caracterizan por tener una estructura química compleja y amorfa, carácter ácido, color oscuro y elevado peso molecular. Se considera que están formadas por un esqueleto fundamentalmente aromático, a base de heterociclos nitrogenados, quinonas, fenoles y ácidos benzoicos, con cadenas alifáticas laterales. Más que polímeros tridimensionales, las sustancias húmicas son predominantemente lineales con puentes de unión entre diferentes puntos de los tramos lineales (Oades, 1989). Según su solubilidad las sustancias húmicas se dividen en tres grupos (Aiken et al., 1985): a) huminas, fracción de las sustancias húmicas que es insoluble en agua a cualquier pH, b) ácidos húmicos, fracción de sustancias húmicas que es insoluble en ácido, pero soluble a pH más elevados, c) ácidos fúlvicos, fracción que es soluble en cualquier pH. d) Estructuralmente los ácidos húmicos y los ácidos fúlvicos son muy similares, diferenciándose sólo en el peso molecular y en el contenido en grupos funcionales. Las huminas pueden consistir, según Stevenson (1985), en: (i) ácidos húmicos íntimamente ligados a la fracción mineral que no pueden ser separados, y (ii) materia húmica altamente condensada con un contenido elevado en carbono (>60%) y por eso insoluble en álcalis. 49 Los grupos funcionales presentes en las sustancias húmicas son muy numerosos y variados. Incluyen grupos carboxilos, carbonilos, hidroxilos, sulfhidrilos, aminos, sulfónicos, etc. Los grupos carboxilos e hidroxilos son los principales responsables de su elevada capacidad de intercambio catiónico (CCC), dependiente del pH, así como de su capacidad para acomplejar metales. Se considera que los grupos hidroxilos y carboxilos están directamente implicados en la interacción con compuestos orgánicos catiónicos y otros componentes como los óxidos metálicos y los minerales de la arcilla (Theng, 1974, Cornejo y Hermosín, 1996). Por su naturaleza aromática y contenido en grupos funcionales polares, las sustancias húmicas tienen un doble carácter hidrófobo e hidrófilo. Así, las estructuras lineales pueden adoptar en disolución acuosa una conformación esférica de forma que las regiones hidrófobas quedan hacia el interior mientras que la mayoría de los grupos polares quedan próximos a la periferia (Wershaw, 1986, Oades, 1989). Los grupos periféricos polares son los responsables del hinchamiento de las sustancias húmicas en disolución acuosa, donde pueden llegar a adsorber de 2 a 6 veces su propio peso de agua (Ahlrichs, 1972). Existen, no obstante, grupos internos responsables de una cierta capacidad de cambio iónico que ocurre lentamente en comparación con los grupos periféricos (Oades, 1989). Los compuestos orgánicos apolares interaccionan fundamentalmente con las regiones hidrofóbicas de la materia orgánica del suelo de forma que la adsorción es menor al aumentar el contenido en grupos funcionales polares (Rutherford et al., 1992). Por el contrario, las regiones hidrofílicas contribuyen a la retención de solutos polares, más aún teniendo en cuenta que la saturación en agua de la materia orgánica del suelo en disolución aumenta aún más su polaridad, y por tanto su compatibilidad con los solutos polares (Rutherford y Chiou, 1992, Negre et al., 2001). Excepto en el caso de solutos polares o suelos con bajo contenido en materia orgánica se considera que los coloides orgánicos del suelo juegan un papel prioritario en los procesos de adsorción. Es frecuente obtener una correlación bastante alta adsorcióncontenido de materia orgánica (Wolfe et al., 1990, Ferreira et al., 2002), lo que según Chiou et al. (1985) es una consecuencia de la alta afinidad de las moléculas de agua por las superficies minerales, quedando por tanto excluidas para la adsorción de compuestos orgánicos. Características de la disolución del suelo Es importante tener en cuenta el efecto del pH y de la fuerza iónica de la disolución. Numerosos trabajos han puesto de manifiesto la importancia del pH en los procesos de adsorción de plaguicidas (Hermosín y Cornejo., 1987; Li et al., 2001). El pH de la disolución del suelo determina la carga superficial de los componentes con carga variable del suelo y la ionización de los plaguicidas con propiedades ácidas o básicas. La variación de la carga superficial de los coloides del suelo influye directamente en su capacidad de interaccionar con especies iónicas. Así, por ejemplo, la adsorción de compuestos aniónicos a óxidos metálicos aumenta al disminuir el pH como consecuencia del aumento del número de centros positivos en la superficie del óxido. La adsorción de compuestos catiónicos a sustancias húmicas disminuye con la disminución del pH debido a la protonación de los grupos -COO- y O- del polímero orgánico. El pH también afecta a la ionización de los plaguicidas con características ácidas o básicas e influye directamente en el proceso de adsorción. El efecto del pH depende del carácter ácido o básico del compuesto así como de la carga de la superficie adsorbente. La fuerza iónica asume un papel importante en los procesos de adsorción por fuerzas electrostáticas, ya que con el aumento de la fuerza iónica disminuye la adsorción debido a la competencia por los sitios de adsorción entre el soluto y los iones en solución (Watson et al., 1973). Según Calvet (1989), en el caso de moléculas neutras se observa que un aumento de la fuerza iónica por encima de la unidad da lugar a un aumento de la adsorción, mientras que para valores por debajo de la unidad no existe una tendencia general. Temperatura Los procesos de adsorción son exotérmicos, mientras que los de desorción son endotérmicos (Clark, 1974), por lo que un incremento de temperatura dará lugar a una disminución de la adsorción y a un aumento de desorción. Por otra parte, la temperatura afecta a la solubilidad de los plaguicidas afectando también indirectamente a la adsorción. Según Hamaker y Thompson (1972), el efecto de la temperatura en la adsorción depende de la fuerza de la interacción entre el soluto y la superficie, a mayor fuerza de interacción mayor es la influencia de la temperatura. 51 Humedad La importancia del contenido de humedad del suelo en la adsorción del plaguicida puede ser explicada por dos mecanismos, uno se relaciona con la solubilidad del plaguicida, ya que la solubilidad varía con el contenido de agua (Bailey y White, 1970). Cuando este contenido es bajo, debido a la baja solubilidad que generalmente presentan la mayor parte de los plaguicidas, tienden a quedar en estado sólido y, por tanto, difícil de adsorberse. El otro mecanismo tiene que ver con la competencia del plaguicida por los lugares de adsorción a diferentes niveles de humedad. El agua está adsorbida muy fuertemente en los lugares de adsorción del coloide por ser un compuesto muy polar. Por ello los contenidos bajos en humedad provocan una fuerte retención del agua, que deja pocos sitios activos libres para que el plaguicida pueda adsorberse (Navarro Blaya, 1986). De acuerdo con Chiou y Shoup (1985), la retención de los compuestos orgánicos por los constituyentes minerales y orgánicos depende de la humedad del suelo. En suelos secos, la adsorción de compuestos orgánicos resulta fundamentalmente de las interacciones del plaguicida con los componentes minerales, mientras que en suelos húmedos, es la materia orgánica la que tiene un papel más importante. Esto es debido a la fuerte interacción de dipolo entre la fracción mineral del suelo y las moléculas de agua, la cual excluye a los compuestos orgánicos, especialmente los pocos solubles en agua de esta fracción del suelo. Así, la solubilidad del plaguicida en el agua seria uno de los principales factores que afectan al fenómeno de adsorción (Chiou et al., 1983). I.2.1.2.- Procesos de lixiviación. Factores que afectan la movilidad de plaguicidas en el suelo La lixiviación es el proceso por el cual el agua, procedente de lluvia o de riego, arrastra o disuelve moléculas dando lugar a un movimiento vertical a lo largo del perfil del suelo. Esto incide en la efectividad biológica del plaguicida y favorece la contaminación de aguas subterráneas. El riesgo de contaminación de acuíferos por el movimiento vertical de plaguicidas depende fundamentalmente de la velocidad de transporte a través del suelo y de su adsorción y degradación a lo largo del perfil del mismo, ya que ambos procesos disminuyen el riesgo de contaminación de las aguas subterráneas (Bowman, 1989). La movilidad de los plaguicidas se ve afectada principalmente por factores como las propiedades físico-químicas del plaguicida, la adsorción por los coloides del suelo, las propiedades físicas, químicas y microbiológicas del suelo, la estructura del suelo, el clima, la forma y época de aplicación y las prácticas culturales. Propiedades físico-químicas del plaguicida La mayor o menor lixiviación de los plaguicidas se ve afectada por la retención del mismo en el suelo, y ésta está determinada entre otros factores por las características fisico-químicas de los plaguicidas. Características como la ionizabilidad, solubilidad en agua, presión de vapor y carácter hidrofóbico modifican el grado de retención del plaguicida por las partículas del suelo (Weber et al., 1980). Estas características, como se dijo anteriormente, también influyen en la adsorción de plaguicidas al suelo. Por esta razón, mientras mayor sea la adsorción menor será el riesgo de lavado, aunque si el lavado es continuo el plaguicida puede desorberse y así aumentar la concentración de plaguicida en el lixiviado. Los herbicidas catiónicos, como es el caso del paraquat y el diquat, son poco móviles, debido a los fuertes enlaces iónicos que forman con el complejo de cambio catiónico de los coloides del suelo. Herbicidas con propiedades básicas como las striazinas, presentan una movilidad de baja a moderada, dependiente del pH de los suelos: teniendo en cuenta que existe una relación inversa entre el pH y la adsorción, la movilidad será mayor bajo condiciones neutras o alcalinas que en condiciones ácidas. En cambio, los herbicidas ácidos, como es el caso del picloram, dicamba, 2,4-D, bentazona o MCPA, son muy móviles debido a su baja adsortividad. Los herbicidas no iónicos, poco solubles en agua, como la trifluralina, son muy poco móviles en disolución, debido a su baja solubilidad (Calderón et al., 1999). Los herbicidas muy solubles, como la hexazinona y el fenurón (Bouchard y Lavi, 1985) son muy móviles por su baja adsortividad. Adsorción por los coloides del suelo La lixiviación de plaguicidas es un proceso que se ve afectado directamente por la adsorción, manteniendo una relación inversamente proporcional (Beck et al., 1993). Los herbicidas muy solubles, como la hexazinona y el fenurón (Bouchard y Lavi, 1985) son muy móviles por su baja adsortividad. Sin embargo, se ha visto que en ocasiones una alta adsorción puede llevar acompañada lixiviación. Estos son los casos en los que los plaguicidas se ven transportados al moverse las partículas a las que se encuentran 53 adsorbidos (transporte facilitado) (Roy y Dzombak, 1997; Graber et al., 2001; McGechan y Lewis, 2002). Esto es frecuente en herbicidas de baja solubilidad que se adsorben a partículas orgánicas del suelo que se mueven a lo largo del perfil (Nelson et al., 1998; Cox et al., 2000ª; Graber et al., 2001). Los coloides minerales y la materia orgánica son los principales componentes del suelo responsables de los procesos de adsorción. En los horizontes más superficiales, la materia orgánica es, en general, el factor determinante de la adsorción, impidiendo o reduciendo los procesos de lixiviación (Bouchard y Lavi, 1985), mientras que al aumentar la profundidad, es la fracción mineral, arcillas y óxidos metálicos, la que controla los procesos de adsorción-desorción (Beck et al., 1993).También hay que mencionar que la desorción de los plaguicidas vuelve a poner en solución los plaguicidas previamente sorbidos, disponibles para lixiviar (Worrall et al., 1999). Estructura del suelo El suelo como compartimento heterogéneo está compuesto por partículas de distinto tamaño y naturaleza, construyendo un complejo sistema de poros de distinto tamaño. Los de mayor tamaño, llamados macroporos son los formados por los conductos animales, canales de raíces, roturas y fisuras que se forman por el efecto del agua o por expansión y contracción del suelo, congelamiento y deshielo y conductos formados por la acción erosiva del agua, y que pueden existir a profundidades considerables del perfil del suelo. El movimiento de plaguicidas en el suelo se ve influenciado por la presencia de esos macroporos, originando flujos preferenciales sin atravesar la masa del suelo (Beven y Germann, 1981, Larsson et al., 1999). En este caso se habla de transporte hidrodinámico, mientras que el movimiento del plaguicida a través de la masa del suelo ocurre por procesos de difusión. Los poros de menor tamaño son los mesoporos y microporos donde el movimiento vertical de los plaguicidas en el suelo ocurre lentamente predominando los procesos de difusión, adsorción y degradación. Intensidad y frecuencia de lluvia y/o riego El aporte de agua al suelo, ya sea procedente de lluvia o de agua de riego, es un factor de gran importancia en lo que se refiere a la persistencia y lixiviación de plaguicidas en suelos. La intensidad, frecuencia, distribución y estacionalidad del agua aplicada afectan enormemente al movimiento y distribución de los plaguicidas en el suelo. La retención de plaguicidas en el suelo aumenta progresivamente con el tiempo tras su aplicación (Pignatello et al., 1993), por tanto las lluvias al principio de la aplicación tendrán gran influencia en la cantidad de herbicida lavada (Wauchope, 1978) y, consecuentemente, en la contaminación de aguas. Prácticas culturales Las prácticas culturales tienen un efecto directo en la lixiviación de plaguicidas, creando o destruyendo rutas preferenciales de transporte, y modificando la estructura, naturaleza y actividad microbiana del suelo. Una práctica cultural que tiene una gran influencia en la lixiviación es el tipo de laboreo. Estudios han determinado que el laboreo convencional tiende a destruir los canales y macroporos conectados (Ehlers, 1975). Por otra parte, la utilización de un mínimo laboreo aumenta la microfauna y microflora del suelo, con lo que puede favorecer la biodegradación y, consecuentemente, una disminución en el riesgo de contaminación al reducirse la cantidad de plaguicida en la solución del suelo (Cox et al., 1996; Calderón et al., 1999; Cox et al., 1999a). También se ha encontrado que en laboreo de conservación la materia orgánica en los primeros milímetros del suelo es mayor que en suelos con laboreo convencional (Calderón et al., 1999), por lo que la adsorción se puede ver favorecida y la lixiviación reducida. La adición de enmiendas orgánicas al suelo de cultivo como práctica cultural aumenta el contenido en materia orgánica del suelo, modificando la estructura y actividad microbiana del suelo. Por una parte, el aumento en materia orgánica del suelo tras la enmienda podría llevar a un aumento de adsorción de plaguicidas y/o a una mayor degradación dando lugar a una menor lixiviación (Guo et al., 1993; Cox et al., 2000a). Por otra parte, el cambio en la estructura del suelo puede dificultar o favorecer el desplazamiento del plaguicida (Sánchez-Camazano et al., 1996; Cox et al., 1997a). También puede haber un transporte facilitado del plaguicida cuando está adsorbido a la materia orgánica en solución en el caso de enmiendas con alto contenido en materia orgánica soluble. (Cox et al., 2000a; Williams et al., 2002; Worrall et al., 2001) 55 I.2.1.3.-Volatilización La volatilización es el proceso físico-químico por el cual un compuesto es transferido a la fase gaseosa. Puede resultar de la evaporación de la fase líquida, sublimación de la fase sólida, evaporación de una solución acuosa o desorción de la matriz del suelo (Bedos et al., 2002). Los factores que influyen en la volatilización son: propiedades físico-químicas del plaguicida, las características del suelo, las condiciones climáticas (sobre todo la temperatura y humedad) y las prácticas de cultivo (Bedos et al., 2002). Este proceso se da principalmente en los primeros centímetros de la superficie del suelo, aunque también se da en la superficie de plantas y durante la presencia del plaguicida en la disolución del suelo (Thomas, 1982). I.2.1.4.- Escorrentía El proceso de escorrentía tiene lugar cuando la precipitación o el riego supera la tasa de infiltración de agua en el suelo. Según Wauchope (1978), las pérdidas de plaguicidas por escorrentía tienen lugar en disolución en el caso de plaguicidas relativamente solubles en agua, plaguicidas con solubilidades mayores de 2 mg l-1, o con el plaguicida adsorbido a los coloides del suelo para plaguicidas con solubilidades inferiores a 2 mg l-1. Los factores más importantes que determinan las pérdidas por escorrentía son las condiciones climáticas, las características del suelo y del plaguicida y las prácticas culturales. El proceso de arrastre que constituye la escorrentía y la lixiviación están relacionados, ya que el movimiento lateral de los plaguicidas hacia aguas superficiales, no contribuirán al movimiento a través del perfil de suelo o lixiviación. I.2.1.5.- Absorción y exudación por plantas y organismos Las plantas y microorganismos del suelo asimilan plaguicidas, acumulándolos y metabolizándolos. La gran variedad de plantas y organismos resistentes a determinados plaguicidas, lo son porque los metabolizan a compuestos no tóxicos, lo que constituye una vía natural de descomposición (Schmidt y Fedtke, 1977). Este proceso de absorción está determinado en gran medida por la fijación del plaguicida por los coloides del suelo, ya que esto determina la cantidad de plaguicida en la solución del suelo. El plaguicida en solución es absorbido por el sistema radicular. Los organismos también exudan estos compuestos, volviendo así a estar disponibles en la disolución del suelo. La nueva tecnología de extracción de aceite de oliva consiste en un proceso de 2 fases que genera una parte líquida (aceite de oliva) y una parte residual sólida, conocida por alperujo (Alburquerque et al., 2004, Alburquerque et al., 2009). Usando este sistema, las almazaras generan aproximadamente 4.000.000 de toneladas al año de este residuo durante periodos muy cortos en el tiempo como es la cosecha de la aceituna, siendo su eliminación un problema técnico, financiero y medioambiental (Rodríguez-Lucena et al., 2010). La introducción del uso de sustancias xenobióticas, como son los plaguicidas, ha mejorado la producción de los cultivos, incluido el olivar, en todo el mundo durante los últimos 50 años. Antes de ser lanzados al mercado, los plaguicidas sufren rigurosas pruebas, con el objetivo de alcanzar una alta eficacia hacia su especie diana y producir mínimos daños ambientales. Sin embargo, en ocasiones la actividad del plaguicida no actúa exclusivamente hacia los organismos para los que están dirigidos y afectan directa o indirectamente a organismos no-diana, bien sean organismos animales, o vegetales, entre los que puede verse afectado el propio cultivo. Además, este problema se agrava ya que el cultivo del olivar comprende en la mayoría de las veces, suelos con bajo contenido orgánico y donde el 74% de la superficie de los cultivos se encuentra inclinada al menos un 7% (Junta de Andalucía, 2003). Esto favorece la desestructuración del suelo y el lavado de nutrientes y por consecuencia, reducen la fertilidad de los suelos en las zonas altas del cultivo y consecuente pérdida de plaguicidas en el sistema suelo, conduciendo a aplicar más cantidad de producto en los campos de cultivo., provocando en ocasiones restricciones en la capacidad de adquirir recursos por parte del cultivo y, por tanto, reduce su productividad (Galmés et al., 2011). 63 I.4. BIBLIOGRAFÍA Aguer, J. P., Cox, L., Richard, C., Hermosín, M. C., Cornejo, J. Sorption and photolysis studies in soil and sediment of the herbicide napropamide, J. Environ. Sci. Health B. 2000, 35, 725-738. Aiken, G.R., McKnight, D.M., Wershaw, R.L., MacCarthy, P. 1985. 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Los objetivos específicos a desarrollar en este capítulo han sido: 1.- Evaluar el efecto que la adición de los alperujos producen sobre las propiedades fisicoquímicas y superficiales de los suelos. 2.- Caracterizar la materia orgánica soluble de los alperujos por espectroscopia de fluorescencia y espectroscopia infrarroja. 3.- Estudiar la influencia que tiene la adición de estos residuos de almazara al suelo, sobre los procesos de adsorción, desorción, lixiviación, disipación, mineralización y efectividad biológica de los herbicidas MCPA y S-metolacloro. 83 II.3.- MATERIALES Y MÉTODOS II.3.1. Herbicidas II.3.1.1.- MCPA MCPA es un ácido químicamente muy estable (4-cloro-2-metilfenoxi) acético. Posee un peso molecular de 200.6 g mol-1 y un coeficiente de partición octanol agua log P = 0.59 a pH 5 y -0.81 a pH 7 (ambos a 20 ºC). Su solubilidad en agua es 0.395 g l-1 a pH 1 y 25 ºC, a la misma temperatura y con las mismas unidades, 26.2 a pH 5, 293.9 a pH 7 y 320.1 a pH 9 y en metanol 775.6 g l-1 a 25ºC. Presenta un pKa de 3.73 a 25 ºC (Tomlin, 2006). Es un herbicida auxínico, sistémico y selectivo. Se absorbe tanto por vía foliar como radicular y se trasloca hacia toda la planta Se acumula en el tejido meristemático, donde inhibe el crecimiento de éste, ya que interfiere en la división y diferenciación celular, así como en la síntesis de proteínas (Liñán, 2006). Se utiliza para el control de post-emergencia de malas hierbas anuales y perennes de hoja ancha en cereales, lino, arroz, vides, guisantes, patatas, espárragos y olivo. La dosis agroquímica para MCPA oscila entre 0.28 y 2.25 kg ha-1 y con frecuencia se usa en combinación con otros herbicidas. El producto técnico empleado para los estudios de adsorción-desorción, lixiviación, disipación y bioensayos fue adquirido a Sigma Aldrich GmbH (Seelze, Alemania) con una pureza de 98.8%. Para los estudios de mineralización se usó el producto MCPA- [U14-C-ring] marcado radiactivamente con actividad específica de 5.55 MBq mg-1 y proporcionado por IZOTOP (Budapest, Hungría). Figura II.2. Estructura tridimensional de la molécula de MCPA. II.3.1.2.- S-metolacloro S-metolacloro(S-2-cloro-N-(2-etil-6-metilfenil)-N-(2-metoxi-1-metiletil) acetamida) pertenece a la familia de las cloroacetamidas. Posee un peso molecular de 283.8 y coeficiente de partición octanol agua log P= 3.05 (20 ºC y pH 7). Su solubilidad en agua es de 480 mg l-1 a 25 ºC y es totalmente miscible en solventes orgánicos (Tomlin, 2006). Es un herbicida selectivo de preemergencia o temprana postemergencia, es comúnmente usado para el control de adventicias (principalmente hierbas anuales y algunas hierbas de hoja ancha) en cultivos de maíz, algodón, soja, remolacha, girasol y patata entre otros (Cao et al., 2008). Se absorbe principalmente por los hipocótilos y brotes y actúa inhibiendo la división celular y la germinación. Su dosis de aplicación varía entre 0.8 y 1.6 kg ha-1. S-metolacloro es un producto mezcla de isómeros en una proporción 80-100% (S- isómeros) y hasta un 20% (R- isómeros). Moser et al. (1982) encontró en un estudio con 10 malas hierbas distintas, que los S- isómeros poseen al menos 20 veces más actividad biológica en preemergencia que los R- isómeros. El producto analítico usado para los estudios de adsorción-desorción, lixiviación, disipación y bioensayos fue suministrado por Dr Ehrenstorfer GMBH (96% de pureza). No se realizaron ensayos de mineralización debido a que no se disponía del herbicida S- metolacloro marcado radiactivamente. Figura II.3. Estructura tridimensional de la molécula de S-metolacloro. 85 II.3.1.3. Método de análisis de los herbicidas Para el análisis de los herbicidas descritos en este capítulo se usaron dos técnicas analíticas que se describen a continuación. En primer lugar para la determinación de los herbicidas MCPA y S-metolacloro sin marcar con C14 se usó la técnica analítica de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El cromatógrafo usado pertenece a la marca comercial “Waters Milipore” y está constituido por una bomba WATERS 1525, un inyector automático WATERS 717 Autosampler y un detector de fotodiodos WATERS 2996 Photodiode Array Detector. El sistema está controlado por un ordenador a través del software “Millenium 2010 Cromatography manager” versión 2.15.01”. Se empleó una columna Nova Pack C18 de 150 mm de longitud y 3.9 mm de diámetro interno. El volumen de inyección fue de 25 μl y el flujo del sistema eluyente de 1 ml min-1 en modo isocrático. Previo análisis de las muestras de herbicidas por HPLC se realizó la puesta a punto de los métodos de detección para cada uno de los herbicidas. Se determinaron los límites inferiores de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) según el protocolo descrito por Camacho-Muñoz et al. (2009) y se seleccionó como sistema eluyente más óptimo (es decir, sistema eluyente con la que se obtuvo mayor porcentaje de recuperación del herbicida tras una extracción) una mezcla de Metanol y Ácido fosfórico 1 N a pH 2 para el análisis de MCPA, en una proporción 60:40 (v/v) y para S-metolacloro una mezcla Acetonitrilo y agua Mili-Q en una proporción 55:45 (v/v). La concentración de los herbicidas MCPA y S-metolacloro en solución de las muestras se cuantificó a las longitudes de onda de 230 y 204 nm, respectivamente, y en un tiempo de análisis de 7 minutos. Los valores para LOD y LOQ encontrados se reflejan en la Tabla II.1. Tabla II.1. Límites inferiores de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) por HPLC para MCPA y S-metolacloro. Herbicidas LOD (mg l-1) LOQ (mg l-1) MCPA 0.02 0.05 S-metolacloro 0.01 0.03 Para el análisis de MCPA marcado con C14 se utilizó el conteo por centelleo líquido. Las muestras se recogían en unos viales de propileno especiales para el análisis, con capacidad para 6.5 ml y se mezclaban homogéneamente con 5 ml de líquido de centelleo Ecolite suministrado por Biomedicals. Las muestran permanecían 24 horas en oscuridad y posteriormente eran analizadas con un contador de centelleo BECKMAN LD 5000 TD. A diferencia de la cromatografía líquida de alta resolución, que presenta límites inferiores de detección y cuantificación específicos para cada molécula que se analice, el conteo por centelleo posee un límite de detección general para todas las moléculas, determinado por el aparato, que en este caso y con el líquido de centelleo usado en particular, se encontraba dentro del rango 18 y 22 dpm (desintegraciones por minuto). Figura II.4. Contador de centelleo (izquierda) y HPLC (derecha). II.3.2.- Alperujos Se han utilizado dos subproductos orgánicos de la producción de aceite de oliva: un alperujo procedente de una almazara de Jaén (AJ) y otro procedente de una almazara de Morón (AM). Para reducir su alto contenido en humedad se dejó secar al aire libre mediante volteo con pala mecánica. El alperujo de Jaén procedía de la finca experimental del IFAPA en Menjíbar mientras que el de Morón fue proporcionado por la empresa Hijos de Espuny Osuna S.L. II.3.2.1. Propiedades físico-químicas Propiedades físico-químicas (como contenido en COT, contenido en nitrógeno, pH, CE…) de estos alperujos fueron determinadas por el Servicio de Análisis del IRNAS con la metodología habitual para residuos orgánicos. El contenido en MO total de los alperujos 87 se determinó por calcinación a 540 ºC, y el pH en una relación 1:5 (p/v) residuo/agua destilada. El contenido en hemicelulosa, celulosa y lignina fue determinado usando el método descrito por Goering y Van Shoest. (1970). Además se analizó el contenido en algunos macronutrientes y micronutrientes, entre ellos algunos metales pesados, de estos residuos por ICP-OES. Estas propiedades se encuentran recogidas en la Tabla.II.4 II.3.2.2. Caracterización de la materia orgánica soluble (MOS) Debido a la dificultad para determinar experimentalmente la verdadera MOS en muestras de suelo, suele estudiarse en su defecto la materia orgánica total o COT extraíble en agua o solución de CaCl (0.01 M) (Zsolnay y Görlitz, 1994). Las técnicas utilizadas para la caracterización d ela MOS han sido la espectroscopia FTIR y la espectroscopia de fluorescencia, técnicas ampliamente empleadas para la caracterización de la MOS (Cox et al., 2000b; 2004; Ohno et al., 2007). El contenido en CO de los extractos de MOS también fue determinado. Determinación del carbono orgánico soluble total Triplicados de 1 g de AJ y AM se pusieron a interaccionar con 20 ml de CaCl2 (0.01 M). Las suspensiones fueron agitadas durante 24 h a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 15 min a 8000 rpm. El sobrenadante se filtró usando filtros de vidrio de 0.45 µm de poro. Se hicieron diluciones 1:100 (v/v) y el COT de los extractos se analizó en el Servicio de Análisis del IRNAS con un Analizador de Carbono Orgánico Total y módulo de Nitrógeno Shimadzu TOC-V sch (TOC). Estudios por espectroscopia de fluorescencia Triplicados de 1 g de AJ y AM se extrajeron con 20 ml de una solución CaCl2 (0.01 M) (proporción 1:20). Las suspensiones fueron agitadas durante 15 min a temperatura ambiente, se centrifugaron durante 15 min a 8000 rpm y finalmente se filtraron usando filtros de fibra de vidrio de 0.45 µm. La MOS en estas muestras se analizó por espectroscopia de fluorescencia en el espectrofotómetro F-2500 FL-SPECTROPHOTOMETER de HITACHI, en el rango de longitudes de onda de entre 300 y 480 nm, ya que para valores inferiores y superiores se observa el fenómeno de dispersión (Zsolnay et al., 1994). Por otro lado se acidificaron las muestras añadiendo HCL 2N hasta alcanzar pH 2. Se midió la absorbancia a 254 nm de los extractos de alperujo a temperatura ambiente y a pH de extracto. Se excitó la muestra a la longitud de onda de 254 nm y se obtuvo el espectro de emisión de fluorescencia. A partir de estos espectros de fluorescencia, se ha calculado el índice de Humificación (HIX) según Zsolnay et al. (1999): HIX= Σ λ W480-435 /Σ λ W345-300 (Ecuación II.1) Donde λ es la longitud de onda en nanómetros y Iλ es la intensidad a una longitud de onda determinada. Estudios por espectroscopia infrarroja Triplicados de 5 g de los distintos residuos se hicieron interaccionar con 10 ml de CaCl2 (0.01 M), se agitaron durante 24 h y se centrifugaron 15 min a 8000 rpm. El sobrenadante se filtró usando filtros de fibra de vidrio de 0.45 µm de poro y se pasó a unas placas de cerámica donde se congelaron a -4 ºC durante 24 h. Una vez congeladas se liofilizaron durante 24 h y posteriormente se molieron en mortero de ágata y se secaron a 100 ºC en una estufa durante 24 h. Las muestras se analizaron por espectroscopia de infrarrojos FT-IR en un NICOLET 5PC y el barrido utilizado estuvo comprendido entre 400 y 4000 cm-1 usando un promedio de 4 registros y una resolución nominal de 4 cm- 1.obteniéndose los espectros de infrarrojos para la MOS de los residuos. 89 II.3.3.- Suelos Se seleccionaron tres suelos (S, C y T) en base a sus distintas características físico-químicas, contenido en CO y a su uso procedentes de cultivos intensivos de la Vega del río Guadalquivir. El suelo S, de textura arenosa, procede de la finca experimental “La Hampa” perteneciente al Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS) en la localidad de Coria del Río (37º17’N, 6º03’O), mientras que los otros dos (C y T), de textura arcillosa, pertenecen a los municipios de Las Cabezas de San Juan (36º59’N, 5º56’O) y Tocina (37º36’N, 5º44’O), respectivamente (Figura II.5). Los suelos se muestrearon a una profundidad de 0-20 cm y fueron llevados al laboratorio donde se secaron al aire, se tamizaron con un tamiz de 2 mm de luz de malla y se congelaron a -4 ºC hasta su caracterización y/o utilización. Los estudios de adsorción-desorción, lixiviación, disipación y mineralización de los herbicidas se realizaron con los suelos sin enmendar y los suelos enmendados con los alperujos de Jaén Y Morón a las dosis de 5 y 10% (p/p) (S, S5J, S10J, T, T5J, T10J, C, C5J y C10J). Figura II.5. Situación de los puntos de muestreo de los suelos S, C y T y procedencia de los alperujos de Jaén y Morón. metolacloro en una solución de etanol, que produce menor efecto tóxico sobre los organismos presentes en el suelo. Posteriormente se añadió agua destilada suficiente para llevar al suelo al 40% de su capacidad máxima de retención de agua y se tamizó 2 veces usando un tamiz de luz de malla 2 mm y con el fin de distribuir homogéneamente el herbicida en las muestras de suelo. Los suelos se pasaron a los envases con cierres herméticos y se guardaron en oscuridad a 25±1 ºC durante todo el experimento. Para controlar que la humedad del suelo a lo largo del estudio no variaba, se controló el peso semanalmente de los tarros durante todo el experimento y en caso de pérdida de humedad se reponía con agua destilada. Figura II.10. Tarros herméticos para estudio de disipación de los herbicidas. Se tomaron muestras a los tiempos: 0, 7 ,14 ,21 ,28 ,42 ,56 ,77 y 118 días tras la aplicación de MCPA y 0, 7, 14, 21, 28, 42, 56, 77, 90 y 118 días tras la aplicación de S- metolacloro. Cada uno de esos días se recogía 30 g de muestra que eran congeladas hasta el momento de extracción de los herbicidas. Las extracciones se realizaron con una relación 1:2 (p/v) de 5 g de suelo y 10 ml de extractante, una mezcla de ácido ácido fosfórico (1 N y pH=2) y metanol en proporción (40:60) (v/v) para MCPA y solución únicamente de metanol para S-metolacloro. Una vez puesto a interaccionar el suelo con los extractantes en un tubo de centrífuga, se dejó agitando durante 24 h, y posteriormente se centrifugó a 8.000 rpm durante 10 min. El extracto se filtró utilizando filtros vidrio de 0.45 µm y se analizó por HPLC. Se representaron los logaritmos neperianos de la cantidad de herbicida extraído frente al tiempo y del ajuste lineal se calculó la vida media (t1/2) (tiempo al cual la cantidad de herbicida inicialmente aplicado se reduce a la mitad del inicial) de los herbicidas en los suelos originales y enmendados. Se asumió que la disipación de los herbicidas en los suelos siguió una cinética de primer orden: 97 La expresión logarítmica de la ecuación es: Siendo Co la concentración inicial de herbicida, C la concentración de herbicida en el tiempo t y k la constante de disipación. La vida media se calculó utilizando la ecuación: II.3.4.4.- Estudios de mineralización Los estudios de mineralización se llevaron a cabo sólo con el herbicida. Se usó C14-MCPA (marcado uniformemente en el anillo bencénico), con actividad específica de 5.55 MBq mg-1. Se determinó su mineralización en el suelo arenoso (S) y los arcillosos T y C, sin enmendar y enmendados con alperujo de Jaén al 5 y 10 %. Para ello se colocaron 25 g por duplicado, en matraces biométricos de 250 ml a los que se añadió la disolución de herbicida marcado con C14 para conseguir una radiactividad de 0.05 µCi en 25 g de suelo (unas 4000 dpm g-1 de suelo aproximadamente) y también se aplicó el herbicida sin marcar hasta alcanzar una concentración de 1.5 kg ha-1. Una vez ésto, se añadió agua destilada al suelo para ajustar el contenido al 40% de la capacidad máxima de retención de agua. En el brazo del matraz biométrico se añadió 1 ml de NaOH (1 N) que actuaría como trampa de CO2 resultado de la mineralización MCPA y se tapó un tapón de goma. El matraz biométrico se pesaba semanalmente para controlar que la humedad permaneciera constante. También semanalmente se retiraba el mililitro de NAOH (1 N), que era reemplazado por uno nuevo mientras que el retirado se mezclaba con 5 ml de líquido de centelleo (LSC), se dejaba durante 24 horas bajo condiciones de oscuridad y por conteo de C= C0e-kt ln C = ln Co-kt ln 2 t1/2 = k Ecuación II.7 Ecuación II.8 Ecuación II.9 centelleo se registraba la radiactividad contenida, correspondiente con la cantidad de herbicida mineralizado. II.3.4.5.- Estudios de lixiviación Para los estudios de lixiviación de MCPA y S-metolacloro en suelos alterados, se empaquetaron manualmente columnas de vidrio de 24 cm de longitud y diámetro interno de 3.1 cm con 140 g de los suelos sin enmendar y con los suelos enmendados. Con el fin de evitar la pérdida de partículas de suelo durante el estudio de lixiviación, se colocó en la parte inferior de la columna lana de vidrio y sobre ésta, 10 g de arena de mar lavada. Otros 10 g de arena se colocaron en la parte superior de la columna para que la distribución de la disolución inicial del herbicida y las disoluciones de lavado fuera lo más uniforme posible. Además, con esta arena de mar también se reducían pérdidas por evaporación de dichas disoluciones. Figura II.11. Columnas de vidrio empaquetadas a mano con los suelos usados. Antes de aplicar el herbicida al suelo de las columnas se procedió a determinar el volumen de poro de los suelos originales y enmendados en las columnas de vidrio, es decir, la cantidad de agua que es capaz de retener el suelo bajo saturación. Para ello se añadieron 80 ml de CaCl2 (0.01 M) y una vez transcurridas 24 h se midió el volumen 99 lixiviado. La diferencia entre el volumen aplicado y el recogido corresponde al volumen de poro de los suelos. La dosis de aplicación de los distintos herbicidas fueron: 1.5 kg ha-1 para MCPA y 1kg ha-1para S-metolacloro. Después de 24 h de la aplicación del herbicida se procedió a aplicar diariamente 10 ml de CaCl2 0.01 M durante 30 días para MCPA y 50 para S- metolacloro. El volumen del lixiviado era medido y guardado en una cámara frigorífica (4 ºC) hasta el momento de ser analizados por HPLC. Para su análisis por HPLC se filtraron con filtros de vidrio de 0.45 µm. Las concentraciones de herbicidas medidas en los lixiviados se representaron frente al volumen aplicado obteniéndose las curvas de elución relativa. Las curvas de elución acumuladas resultaron de representar el porcentaje de plaguicida acumulado en los lixiviados frente al volumen aplicado. Al final del estudio, se determinó la cantidad de los herbicidas retenidos en el suelo contenido en las columnas. Para ello se extrajo el suelo contenido en la columnas con N2 y se dividió en 4 fragmentos de 5 cm, correspondiendo con 4 profundidades distintas: 0-5, 5-10, 10-15 y 15-20 cm. Las extracciones se realizaron con 100 ml de extractante, una mezcla de ácido fosfórico (pH=2) y metanol en proporción (40:60) (v/v) para MCPA y solución únicamente de metanol para S-metolacloro. Una vez puesto a interaccionar el suelo con el extractante en un tubo de centrífuga, se dejó agitando durante 24 h y, posteriormente se centrifugó a 8.000 rpm durante 10 min. El extracto se filtró utilizando vidrio de 0.45 µm y se analizó por HPLC la cantidad de herbicida extraído. Esta cantidad constituía el % de herbicida retenido por el suelo de las columnas durante el estudio de lixiviación. II.3.4.6.- Bioensayo Para comprobar que la efectividad de los herbicidas MCPA y S-metolacloro no se veía afectada por la adición de alperujo al suelo y al mismo tiempo comprobar que este residuo no tiene efecto fitotóxico, se llevó a cabo un bioensayo con semillas de Lepidum sativum (para MCPA) y Ray grass (para S-metolacloro) en macetas con suelo enmendado y sin enmendar. Se usaron macetas de 50 cm2 y en el fondo se dispusieron 30 g de arena de mar lavada y lana de vidrio para facilitar el drenaje de agua. Una vez se hubieron rellenado las macetas con suelo C, se saturaron con agua y dejaron drenar durante 24 h. Tras eso se colocaron 15 semillas en la superficie del suelo de la maceta para después semienterrarlas con 5 g de suelo. Las macetas se dispusieron en un lugar idóneo para la germinación y se regaron diariamente con agua. Se realizaron cuatro tratamientos distintos por triplicado: macetas con el herbicida a la dosis de 1.5 kg ha-1 (para MCPA) y 1 kg ha-1 (para S-metolacloro), macetas a las que se le añadió alperujo (OW) al suelo al 10% (p/p), y macetas con herbicida junto con el alperujo y macetas sin herbicida ni residuo orgánico como controles (C). 101 II.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN II.4.1.- Caracterización de Alperujos II.4.1.1.- Propiedades físico-químicas La caracterización de los alperujos Jaén (AJ) y Morón (AM) usados en este trabajo se realizó según la metodología descrita en el apartado II.3.2. En la Tabla II.2. se muestran algunas de sus propiedades físico-químicas y el Índice de Humificación (HIX) calculado a partir de los espectros de fluorescencia, como se describirá más adelante. Además, se determinó el contenido de algunos macronutrientes y micronutrientes de estos alperujos, entre ellos algunos los metales pesados, cuyos valores se recogen en la Tabla II.3. Tabla II.2. Propiedades físico-químicas e índice de humificación (HIX) de los dos alperujos utilizados. pH MOT (%) (540 ºC) COS (g l-1) N Kjeldahl (%) CE (mS cm-1) H C LC HIX Alperujo Jaén (AJ) 6.7 81 2.2 1.5 3.1 12.4 ±1.33* 16.5 ±0.66 10.5 ±0.61 9.5 Alperujo Morón (AM) 4.8 91 4.1 1.1 9.1 15.9 ±0.34 23.8 ±0.27 23.5 ±0.31 1.3 H: hemicelulosa; C: celulosa; LC: Lignina-Cutina; * error estándar Como se puede observar en la Tabla II.2, el pH de AM es más bajo que el presentado por AJ, siendo la cantidad de materia orgánica ligeramente más baja en este último. Este diferente pH de los alperujos afectará al pH de la solución del suelo y puede ser importante en lo que respecta a la adsorción de herbicidas ácidos, como MCPA, que se presentan en forma aniónica a los pH normales de suelos agrícolas. Los valores de COS de AM fueron dos veces mayores que para AJ (4.1 frente a 2.2 g l-1). Tanto el contenido en materia orgánica del alperujo, como el contenido en N (ligeramente menor en AJ que en AM), se encuentran dentro de los valores normales para este tipo de residuos, al compararse con los valores publicados por Alburquerque et al. (2004) en un estudio de caracterización de 11 alperujos procedentes de distintas localidades de España. Los contenidos en hemicelulosa, celulosa y la lignina, productos finales de la humificación, fueron más altos en el caso del alperujo de Morón, que en el de Jaén. Esto es indicativo del menor grado de madurez de este alperujo, ya que con el compostaje disminuyen los niveles de lignina y celulosa (Komilis y Ham, 2003; Alburquerque et al., 2009). La conductividad eléctrica (CE) es una variable que puede presentar valores muy dispares en función del origen del residuo (Madejón et al., 1998?). Como se puede ver en la Tabla II.2., AJ presenta 3 veces menor CE que AM, (3.1 respecto a 9.1 mS cm-1), valores que se encuentran entre los recogidos en una revisión de propiedades físico-químicas de ocho alperujos presentada por Roig et al., (2006). La diferencia en CE entre los dos alperujos usados en este estudio se puede deber a que las aguas del lavado del residuo procedente de Morón en su tratamiento en la almazara, presentaran mayor contenido en especies iónicas (potasio, cloro, sulfatos, amonio y nitratos) ya que el contenido en sodio de este alperujo fue 24 veces mayor que para AJ. Al contrario, se encontró cuatro veces más Calcio en AJ que AM (Tabla II.3), lo que se ha atribuido a la naturaleza más calcárea de las aguas de lavado de la aceituna, o algún otro proceso en la extracción del aceite de oliva o incluso el agua de riego del cultivo, en el caso de AJ. Los valores de micronutrientes y macronutrientes fueron similares a los encontrados en otros estudios (Alburquerque et al., 2004; Roig et al., 2006). Los valores presentados por As, Cd, Co, S y Zn se encontraban dentro de los valores normales para este tipo de residuos. El contenido en Cu fue mayor de lo normalmente detectado en otros alperujos (Roig et al., 2006), esto puede ser debido a los tratamientos con sulfato de Cobre que se aplican en ocasiones al cultivo del olivar con el fin de reducir infecciones fúngicas (Tabla II.3.). También se encontró que PB, Ni y Fe presentaron valores ligeramente más altos de los generalmente encontrados (Tabla II.3.), elementos cuya presencia en los alperujos se encuentra asociada entre sí y se relaciona a la maquinaria que se usa en las almazaras en el proceso de extracción de aceite de oliva (Alburquerque et al., 2009). (Roig et al., 2006). Tabla II.3. Porcentajes para algunos macronutrientes y micronutrientes metálicos y no metálicos contenidos en los dos alperujos utilizados. Al Co Cu Fe Mg Mn Ni Pb (%) AJ 213 0.07 3.39 197 0.32 6.00 1.66 5.89 AM 217 <0.1 2.16 57 0.22 2.03 0.682 3.09 103 As Ca Cd K Na P S Zn (%) AJ <0.1 3.95 <0.2 1.7 0.032 0.39 0.45 3.00 AM <0.1 1.06 <0.2 2 0.77 0.37 0.37 2.51 II.4.1.2.- Caracterización MOS Estudios por espectroscopia de fluorescencia La caracterización por espectroscopia de fluorescencia de la MOS de los alperujos se realizó según la metodología descrita en el apartado II.3.2.2. Los espectros de fluorescencia de los extractos de MOS de los dos alperujos utilizados en este estudio se muestran en la Figura II.12. En ella se representa la intensidad de fluorescencia con excitación a 254 nm de la MOS normalizada al máximo registrado, frente a la longitud de onda (300-480 nm) a pH del extracto y acidificado a pH2. En la Figura II.12. se puede observar que la forma de los espectros de la MOS de los alperujos a pH de extracto (línea continua), es distinta: el espectro de fluorescencia de AM muestra dos máximos de emisión bien definidos, uno en la región de absorbancia de los 300-360 nm y otra a longitudes de onda mayores de 400 nm, mientras que AJ muestra un único máximo a longitudes de onda mayores a 400 nm. Las diferencias entre los espectros de fluorescencia de los alperujos indica que, aunque los dos residuos contengan similares cantidades de materia orgánica (AJ: 81% y AM: 91%), la MOS, la cual es indicativa de la materia orgánica total (MOT), es cualitativamente distinta. A longitudes de onda próximas a 300 nm fluorecen moléculas de menor peso molecular, polares y no humificadas (Kumke et al., 1995; Zsolnay et al., 1999), mientras que a longitudes de ondas superiores a 400 nm, lo hacen moléculas mayores y más complejas, probablemente aromáticas, típicas del material humificado (Zsolnay et al., 1999; Cox et al., 2000b; Senesi et al., 1991;). Esto es lo que ocurre en el caso del alperujo Jaén y nos sugiere que su MOS se encuentra en un estado de humificación más avanzado que la del alperujo Morón. A partir de estos espectros de fluorescencia, se ha calculado el índice de Humificación (HIX) según Zsolnay et al, (1999), usando la Ecuación II.1. Los valores para este índice se muestran en la Tabla II.1. Estos valores indican que la materia orgánica soluble de AJ, indicativa de la MOT, está más humificada que la de AM. Los valores son, en el caso del alperujo de Jaén, superiores a los HIX de suelos de la zona de las marismas del Guadalquivir y en el caso del alperujo de Morón, inferiores (Cox et al., 2004). Figura II.12. Espectro de fluorescencia para la MOS de los alperujos de Jaén y Morón a pH de extracto y a pH=2. De acuerdo con la bibliografía actual (Ewald et al., 1988; Spark y Swift, 1994) se sabe que la fluorescencia de las moléculas está en función del pH al que se mida. Esto puede ser debido a grupos funcionales que al pH de los extractos se encuentran cargados negativamente y hacen que el tamaño de las moléculas de MO sea mayor debido a la repulsión entre cargas negativas, dando lugar a una mayor fluorescencia. Por este motivo hemos acidificado los extractos a pH 2 para eliminar las diferencias debidas al diferente grado de protonación de los grupos funcionales en los dos alperujos estudiados. Estos grupos quedan protonados a pH = 2 y la repulsión entre los distintos grupos funcionales es menor haciendo que las moléculas de MO se “encojan”, produciendo así una menor fluorescencia (Wit et al., 1993; Murphy et al., 1994). En la Figura II.12. Se observa que acidificar los extractos a pH = 2 altera especialmente el espectro de fluorescencia de la MOS de AM (línea punteada), de menor pH (Tabla II.2.). Y además, se observa que el pico a longitudes de onda superiores a 400 nm, desaparece. El diferente comportamiento de la 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Intensidad de fluorescencia ALP MORÓN ALP JAÉN Longitud de onda (nm) 105 MOS de los alperujos frente a la acidificación, indica la diferente composición, en lo que a grupos funcionales se refiere, del componente soluble de la MO de estas enmiendas. Estudios por espectroscopia infrarroja Las muestras secas de los extractos de MOS de los alperujos fueron analizadas por espectroscopia de infrarrojos FT-IR según la metodología descrita en el apartado II.3.2.2. Esta técnica se basa en la aplicación de frecuencias de vibración conocidas a una muestra, en función de las cuales, van a vibrar unos u otros enlaces de las moléculas contenidas en la muestra, representándose en picos (bandas) de transmitancia a diferentes números de onda, correspondiendo a los distintos grupos funcionales. La asignación de bandas a los distintos grupos funcionales se llevó a cabo según Bellamy (1975). Los espectros FT-IR se muestran en la Figura II.13. Estos espectros confirman junto con los resultados de los estudios de fluorescencia, la diferencia en la calidad de la MOS de los alperujos. Entre las bandas que más destacan en los espectros de FT-IR se encuentra una a 1739 cm-1 que corresponde con la absorción del grupo carbonilo (C-O) del grupo carboxílico (COOH) y la banda a 1596 cm-1 que corresponde con los grupos carbonilo del ión carboxilato (COO-) (Bellamy 1975). Para la enmienda AM, de pH más ácido (Tabla II.2.), el medio contiene más cantidad de protones (H+) en suspensión, por lo que los grupos carboxilos de las moléculas en solución se encuentran tanto en forma COOH como COO-, de modo que se observa un pico a 1596 cm-1 (grupos COO-) y también otro a 1596 cm-1 (grupos COOH) (Bellamy, 1975). En la enmienda AJ, de pH más alto (Tabla II.2.), el pico de absorción correspondiente a los grupos COOH (1739 cm-1) es menor en relación con el pico que corresponde al grupo COO- (1596 cm-1). En este alperujo, como consecuencia de un mayor estado de humificación y compostaje, los compuestos fenólicos que le proporcionan el carácter ácido a la enmienda, se han visto reducidos (Alburquerque et al., 2006). La humificación constituye un proceso de estabilización y maduración de los compuestos poco transformados que constituyen la materia orgánica de los suelos. Es decir, una conversión de la MO fácilmente degradable, en sustancias húmicas. Estos componentes húmicos son los principales responsables de muchos procesos y funciones Figura II.14. Distribución del tamaño de poro obtenido por Intrusión de mercurio de los suelos S, C y T, sin enmendar y enmendados al 5 y 10% con AM y AM. S 0,01 0,1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 Volumen acumulado (mm3 g-1) 0 50 100 150 200 250 300 S5J 0,01 0,1 110 100 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 Volumen acumulado (mm3 g-1) S10J 0,01 0,1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 Volumen acumulado (mm3 g-1) S5M 0,01 0,1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 Volumen acumulado (mm3 g-1) 0 50 100 150 200 250 300 S10M 0,01 0,1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 Volumen acumulado (mm3 g-1) Radio de poro (µm) C 0,01 0,1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 C5J 0,01 0,1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 C10J 0,01 0,1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 C5M 0,01 0,1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 C10M Radio de poro (µm) 0,01 0,1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 T 0,01 0,1 1 10 100 Volumen relativo (mm3 g-1) 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 T5J 0,01 0,1 1 10 100 Volumen relativo (mm3 g-1) 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 T10J 0,01 0,1 1 10 100 Volumen relativo (mm3 g-1) 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 T5M 0,01 0,1 1 10 100 Volumen relativo (mm3 g-1) 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 T10M Radio de poro (µm) 0,01 0,1 1 10 100 Volumen relativo (mm3 g-1) 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 210 mm3g-1 204 mm3g-1 240 mm3g-1 257 mm3g-1 250 mm3g-1 266 mm3g-1 270 mm3g-1 263 mm3g-1 193mm3g-1 251 mm3g-1 287 mm3g-1 274 mm3g-1 204 mm3g-1 298 mm3g-1 215 mm3g-1 113 II.4.2.1.- Respiración basal La producción de CO2 está directamente relacionada con la fracción viva y activa de los suelos (Badalucco et al., (2010), ya que es resultado de la respiración de estos los organismos vivos. Para los estudios de respiración basal se seleccionaron los suelos C y T, de mayor contenido en MO, sin enmendar y enmendados al 5% y 10% con el alperujo de Jaén (AJ). En la Figura II.15 se muestran los mg de CO2 producidos por los microorganismos presentes en los suelos durante 42 días de experimento a 24±1 ºC y al 40% de humedad del suelo. Nuestros resultados revelaron que la adición de alperujo no producía un efecto negativo sobre las comunidades vivas de organismos (Figura II.15.). Por el contrario, la cantidad de CO2 producida es mayor. La materia orgánica soluble parece jugar un papel importante en los procesos de respiración en suelos enmendados, ya que existe una correlación positiva entre el contenido de COS y la producción de CO, que constituye la fuente de C más fácilmente disponible para los organismos del suelo (Qualls et al., 2005). La adición de alperujo al suelo aumentó el contenido de COS y por tanto de carbono lábil para los microorganismos del suelo, explicando la mayor respiración en éstos. Figura II.15. Producción de CO2 por los microorganismos presentes en un kg de suelo C y T sin enmendar y enmendados con AJ a las dosis de 5% (p/p) (S5J, C5J y T5J) y 10% (p/p) (S10J, C10J y T10J). Tiempo (Días) 010 20 30 40 50 mg Carbono inorgánico kg de suelo 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 C C5J C10J Tiempo (Días) 010 20 30 40 50 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 T T5J T10J II.4.3.- Estudios con MCPA Los estudios con MCPA se realizaron con los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados al 10% (p/p). Se hicieron pruebas previas aplicando al suelo la dosis de 5% de alperujo y no se obtuvieron diferencias significativas en la adsorción de MCPA respecto al suelo sin enmendar, por lo que los ensayos realizados con este herbicida se realizaron sólo con la dosis de 10% (p/p) de alperujos. II.4.3.1.- Estudios de adsorción Las isotermas de adsorción de MCPA en los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados al 10% (p/p) con los alperujos de Jaén y de Morón (S, S10J, S10M, C, C10J, C10M, T, T10J y T10M) se muestran en la Figura II.16., donde se representa gráficamente la cantidad de MCPA adsorbido (Cs, µmol kg-1) frente a las distintas concentraciones de equilibrio (Ce, µM) de MCPA. Las isotermas de adsorción de MCPA obtenidas se corresponden con el tipo L según la clasificación de Giles et al (1960). Esto indica que la adsorción se ve afectada por la concentración del herbicida, al reflejar una alta afinidad relativa entre el soluto y el adsorbente en la fase inicial de la curva, la cual se ve disminuida a medida que aumenta la concentración de herbicida en solución y los sitios específicos de adsorción van siendo ocupados. Los correspondientes valores de los parámetros de adsorción tras ajustar las isotermas de adsorción a la ecuación de Freundlich (Ecuación II.4), se presentan en la Tabla II.7. El ajuste a la ecuación de Freundlich es bueno en general (R2= 0.989-0.996), a excepción del suelo arenoso sin enmendar (S) (R2=0.097) Los coeficientes Kf nos permiten comparar la capacidad de adsorción de distintos sistemas adsorbato-adsorbente si las condiciones experimentales y los valores de nf (coeficiente que indica la intensidad de la adsorción) son similares entre ellos para los distintos suelos estudiados. 115 Figura II.16. Isotermas de adsorción de MCPA en los suelos S (arriba), C y T(abajo) sin enmendar y enmendados con AJ o AM al 10% (p/p) (S, S10J, S10M, C, C10J, C10M, T, T10J, T10M). Los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados muestran poca adsorción de MCPA, presentando valores de Kfads entre 0.440 y 1.12. Esto coincide con los resultados obtenidos por Hiller, (2009) en un estudio de adsorción de MCPA en suelos agrícolas sin enmendar y enmendados con cenizas de maíz. Los suelos sin enmendar C y T, de mayor contenido en CO y arcilla, mostraron coeficientes de adsorción (Kfads) dos veces mayores para MCPA respecto a S (Tabla II.7.). Estos resultados estarían de acuerdo con los obtenidos por Kah y Brown (2007), quienes encontraron baja adsorción en suelos de herbicidas de naturaleza ácida como MCPA, la cual se veía aumentada en los casos de menores pH y elevado contenido en CO. 010 20 30 40 50 60 Cs (µmol kg-1) 0 5 10 15 20 25 S S10J S10M Ce(µM) 010 20 30 40 50 60 Cs(µm kg -1) 0 5 10 15 20 25 C C10J C10M Ce (µM) 010 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 T T10J T10M Tabla II.7. Coeficientes de adsorción de Freundlich para MCPA en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 10% (p/p) con AJ (S10J, C10J, T10J) y con AM (S10M, C10M, T10M). *Los números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media **Los números son medidas de nf ± desviación estándar. MCPA es un herbicida de carácter ácido, encontrándose en forma aniónica en la solución de los suelos a pH superiores a 3.07 (Hiller et al., 2009). La repulsión entre la carga negativa de las moléculas de este herbicida y las cargas negativas de los coloides del suelo explicaría su baja adsorción (Hamarker y Thompson, 1972, Hiller et al., 2008; Paszko, 2009). El comportamiento en suelos de los ácidos fenoxiacéticos, como MCPA, está gobernado por su estructura química. El grupo carboxilo (COOH) es el principalmente responsable de su relativa actividad química y de las interacciones con las superficies minerales. A pH habituales en suelos agrícolas, éste grupo ácido ionizado podría generar una adsorción significativa en los óxidos de hierro, cargados positivamente, favoreciendo fuerzas der Van der Waals entre los anillos aromáticos de MCPA (Iglesias et al., 2009). Como se puede observar en la Tabla II.4., los valores de óxidos de hierro son similares entre sí y muy bajos en los 3 suelos. Por otro lado, el hecho de que los suelos estudiados presentaran contenidos bajos en CO (Tabla II.4.), junto con el bajo coeficiente de reparto octanol-agua (Kow) que presenta MCPA (-0.81 a pH 7 y 20 ºC), también contribuyen a su alta afinidad por la fase acuosa del suelo y su baja adsorción (Delgado Moreno et al., 2007). Al enmendar los suelos con AJ y AM no se observaron aumentos importantes de la adsorción de MCPA, excepto para el suelo S enmendado con AJ, que mostró más del doble de adsorción respecto al suelo sin enmendar (1.12 frente a 0.440). En el caso del suelo T, no se observan diferencias significativas (T10J y T10M) en los suelos enmendados R2ads Kfads nfads Kd25 S 0.097 0.440(0.118/1.69)* 0.591± 0.458** 1.00 S10J 0.924 0.438(0.294/0.652) 0.827± 0.137 6.28 S10M 0.989 1.12(0.974/1.29) 0.915± 0.053 3.14 T 0.916 0.828(0.602/1.14) 0.629±0.109 6.28 T10J 0.994 0.628(0.563/0.701) 0.891±0.038 11.3 T10M 0.949 0.767(0.578/1.02) 0.739± 0.098 8.27 C 0.996 0.898(0.840/0.961) 0.626±0.023 6.73 C10J 0.996 1.04(0.959/1.14) 0.828±0.031 15.3 C10M 0.991 0.883(0.781/0.998) 0.814±0.054 12.1 117 respecto al original (Tabla II.7.). Haberhauer et al. (2001) revelaron que un aumento en el contenido en carbono del suelo no implicaba necesariamente un aumento en la adsorción de MCPA y que el número de sitios de adsorción para este herbicida y el contenido en materia orgánica del suelo dependían de la naturaleza de la MO que aportaba la enmienda. Sin embargo se ha encontrado que MCPA puede llegar a presentar valores de Kd de hasta 16.6 l kg-1 en suelos con 15% de MO (REF tomlin?), cuando en la mayoría de los suelos agrícolas mediterráneos, con valores de MO entre 1 y 5%, MCPA, los valores de Kd están entre 0.6-1 l g-1, coincidienco con nuestros resultados. Debido a que los coeficientes nf de las isotermas no son iguales, para poder comparar la adsorción entre los diferentes suelos se ha calculado un coeficiente de distribución a la concentración de equilibrio igual a 25µM (Kd25) (Tabla II.7.), que se encuentra dentro del rango de concentraciones estudiadas para MCPA en las isotermas de adsorción (5, 10, 20, 40 y 50 µM). A concentraciones altas de MCPA, se observan diferencias entre lso tratamientos. Los valores de Kd25 revelaron mayor adsorción de MCPA en los suelos C y T sin enmendar. Estos suelos presentaban mayor contenido en CO, arcilla, componentes coloidales del suelo, con gran superficie específica, responsables en gran parte de la adsorción de plaguicidas. La mayor adsorción se dio en suelos enmendados con AJ (S10J, C10J Y T10J). Las diferencias en la adsorción entre suelos enmendados con AJ y AM, se deben a diferencias en la calidad de la materia orgánica de estos residuos y no a su cantidad. Como se ha visto en el apartado de caracterización de la MOS de los alperujos, aunque el contenido en MO es menor en el caso de AJ (81%, respecto al 91% de AM), las diferencias en la adsorción pueden deberse a que la materia orgánica de AJ está más humificada, y por tanto posee mayor capacidad de adsorción, que la de AM (Bolan et al, 2011). II.4.3.2.- Estudios de desorción En la Figura II.7 se han representado las isotermas de adsorción-desorción de MCPA en los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados al 10% (p/p) con los alperujos. Los parámetros de desorción se recogen en la Tabla II.8. Esta tabla muestra que en general el ajuste de la ecuación de Freundlich no es bueno para los sistemas con baja capacidad de adsorción (S, S10M y C), que mostraron coeficientes de ajuste inferiores a R2=0.6. Tabla II.8. Coeficientes de desorción de Freundlich, porcentaje de desorción (D) y coeficiente de histéresis (H) para MCPA en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados 10% (p/p) con AJ (S10J, C10J, T10J) y con AM (S10M, C10M, T10M). *Los números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media ** Los números son medidas de nf ± desviación estándar Los valores de nfdes fueron menores que los nfads para todos los suelos excepto para S10J y C10M y T10M, lo que revela la presencia fenómenos de histéresis durante la adsorción-desorción, que también ha sido observado por Haberhauer et al. (2001) y por Jensen et al. (2004). Los valores menores se encontraron para los suelos S y C sin enmendar, pero teniendo en cuenta el coeficiente de ajuste tan bajo, no se puede concluir que exista ninguna tendencia clara en relación al efecto que ejerce la enmienda sobre la desorción de MCPA. La adición de enmienda en los suelos se ha visto que aumenta la adsorción de MCPA a altas concentraciones en solución para los suelos C y T, y presenta coeficientes de histéresis mayores que los suelos originales, lo cual parece indicar que si bien la enmienda con alperujo aumenta la adsorción de MCPA, ésta es más reversible (Tabla II.8.). El aumento del COS en la solución tras la enmienda con alperujo podría ser la R2des Kfdes nfdes D (%) H (%) S 0.092 1.61(1.27/2.03) -0.355± 0.789 86 60 S10J 0.898 0.748(0.299/1.87) 1.28± 0.306 64 45 S10M 0.575 10.2(8.77/11.8) 0.272± 0.052 23 29 T 0.908 4.10(3.54/4.72) 0.216±0.048 35 34 T10J 0.949 4.28(1.80/2.93) 0.505± 0.082 60 56 T10M 0.939 2.37(2.77/0.461) 1.20±0.826 50 162 C 0.436 11.3(9.69/13.1) -0.066±0.053 12 10 C10J 0.932 3.73(2.91/4.77) 0.443±0.084 53 53 C10M 0.988 0.244(0.188/0.318) 1.14±0.087 84 140 119 causa de este resultado, ya que ésta podría favorecer la desorción del herbicida retenido en la fase sólida hacia la solución. Figura II.17. Isotermas de adsorción-desorción (puntos negros y azules, respectivamente) de MCPA en los suelos S (columna figuras izquierda), C (columna del centro) y T (columna derecha) sin enmendar y enmendados con AJ o AM al 10% (p/p) (S, S10J, S10M, C, C10J, C10M, T, T10J, T10M II.4.3.3.- Estudios de disipación Según Crespín et al (2001), los herbicidas del tipo de los fenoxiácidos como es MCPA, pueden sufrir degradación abiótica y/o degradación microbiológica en la solución del suelo. Aunque se sabe que los herbicidas fenoxiácidos como MCPA, pueden sufrir degradación abiótica como hidrólisis de las sales o ésteres del herbicida, con la formación de los correspondientes aniones o fotodescomposición por absorción de luz UV (Crespín., 2001). C 010 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 Adsorción Desorción C10J 010 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 C10M Ce (µM) 010 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 Adsorción Desorción Adsorción Desorción S Ce(µM) 010 20 30 40 50 60 Cs(µmol kg-1) -5 0 5 10 15 20 25 Adsorción Desorción S10J Ce(µM) 010 20 30 40 50 60 Cs(µmol kg-1) -5 0 5 10 15 20 25 Adsorción Desorción S10M Ce (µM) 010 20 30 40 50 60 Cs (µmol kg-1) -5 0 5 10 15 20 25 Adsorción Desorción T 010 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 Adsorción Desorción T10J 010 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 Adsorción Desorción T10M Ce (µM) 010 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 Adsorción Desorción En la Figura II.18. se muestran las curvas de disipación de MCPA durante 118 días de incubación a 24±1 ºC y 40% de humedad en los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados con AJ y AM. En la Tabla II.9. se muestran los valores de vida media en esos suelos tras el ajuste de las curvas de disipación a una cinética de primer orden con la ecuación II.10, según descrito en el apartado II.3.4.3. en materiales y métodos. Figura II.18. Curvas de disipación de MCPA en los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados con AJ y AM a la dosis del 10% (p/p) (S10J, C10J, T10J, S10M, C10M y T10M). Cuando se comparan los tres suelos sin enmendar, Las vidas medias de los suelos fueron menores en los suelos con mayor contenido en CO (C y T) (Tabla II.7.), que se explica por una mayor actividad biológica en estos suelos, consecuencia de un mayor CO, que favorece la degradación del herbicida mediante procesos bióticos. Esto se ha observado en numerosos estudios con diversos plaguicidas (Walker y Welch., 1989; Nair y Schnoor., 1994, Cox et al., 1999bmeter alguna referencia más reciente) y corrobora los resultados obtenidos por Juhler et al. (2008), los cuales indican que la degradación de MCPA sobre todo en los horizontes superficiales, está directamente relacionada con la S S10J S10M 020 40 60 80 100 120 % MCPA 0 20 40 60 80 100 120 S S10J S10M 020 40 60 80 100 120 % MCPA 0 20 40 60 80 100 120 C10J C10M C Tiempo (días) 020 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 T T10J T10M Tiempo (días) Tiempo (días) 121 microbiología del suelo y el contenido en CO. Este mayor contenido en CO de los suelos sin enmendar parece tener más importancia en la degradación de MCPA que el efecto protector debido a la mayor adsorción del herbicida en estos suelos (Tabla II.5.). Tabla II.9. Vida media (T ½) y coeficientes de ajuste a una cinética de primer orden para MCPA en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 10% (p/p) con AJ (S10J, C10J, T10J) y con AM (S10M, C10M, T10M). SUELO S S S10J S10M T T10J T10M C C10J C10M T ½ 105 (121/93.6 ) - 274 (410/205 ) 31 (25/40 ) - 149 (209/116 ) 23.3 (26.9/20.6 ) - 110 (153/85.8 ) R2 0.901 0.24 9 0.564 0.788 0.32 6 0.631 0.935 0.05 6 0.758 *Los números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media ** Los números son medidas de nf ± desviación estándar Por el contrario, la adición de los alperujos, a pesar de aumentar el CO del suelo, aumentó la persistencia de MCPA en los suelos enmendados. Las curvas de disipación no se ajustan bien a la cinética de primer orden, como muestran los valores de R2 en la Tabla II.9, especialmente en el caso de los suelos enmendados con AJ, que presentaron una mayor capacidad de adsorción de MCPA que AM, como se observó en los estudios de adsorción (Figura II.6.). Sin embargo, cuando añadimos una fuente exógena de carbono (alperujo) al enmendar, el herbicida se vuelve más persistente, coincidiendo con los resultados obtenidos por Hiller et al., (2009). Esto se puede atribuir, por un lado, al efecto protector que proporciona la mayor adsorción de MCPA en estos suelos enmendados (tal y como se puede ver en la Tabla II.7.), estando el herbicida menos disponible para sufrir procesos de degradación (Barriuso et al., 1997; Cox et al., 2000b), pero también puede ser debido a que los microorganismos del suelo prefieran utilizar esta materia orgánica (alperujo) como fuente de carbono, en lugar de degradar el herbicida presente en la disolución del suelo, aumentando su persistencia. La MOS del alperujo parec ser una fuente de C más fácilmente accesible a los microorganismos del suelo. II.4.4.- Estudios con S-metolacloro Los estudios de adsorción-desorción, lixiviación y disipación con S-metolacloro se realizaron, tal y como la metodología detalla en el apartado II.3.4.1, con los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados tanto con AJ como con AM al 10% (p/p) como se hizo con MCPA, y además al 5% (p/p) de enmienda. II.4.4.1.- Estudios de adsorción Las isotermas de adsorción de S-metolacloro en los suelos estudiados se muestran en la Figura II.23, donde se representa gráficamente la cantidad de S- metolacloro adsorbida (Cs, µmol kg-1) frente a las distintas concentraciones de equilibrio (Ce, µM). Los correspondientes parámetros de adsorción se reflejan en la Tabla II.10, tras ajustar las isotermas a la ecuación de Freundlich (Ecuación II.4.). Debido a la variabilidad en los valores de nf y con el objetivo de comparar la capacidad de adsorción de los distintos suelos, se calculó un coeficiente de distribución a la concentración de equilibrio igual a 10µM (Kd10), que se encuentra dentro del rango de concentraciones estudiadas para S-metolacloro en las isotermas de adsorción (5, 10, 20, 40 y 50 µM). A diferencia de MCPA, la mayoría de las isotermas son tipo C (nf~ 1). Esto indica que, en el rango de concentraciones estudiadas, la adsorción no se ve afectada por la concentración del herbicida. Los suelos sin enmendar mostraron baja capacidad de adsorción de S-metolacloro, aunque mayor que para MCPA (Tablas II.7 y II.10). No se encontraron diferencias significativas en la adsorción entre los suelos S y C, mientras que el suelo T mostró ligeramente una mayor adsorción. Los valores de Kd10 para S-metolacloro no mostraron diferencias significativas en estos suelos sin enmendar (Tabla II.10). Los suelos enmendados mostraron un aumento claro en la adsorción de S- metolacloro a diferencia de lo encontrado con MCPA. S-metolacloro es un herbicida cuya capacidad de adsorción a los suelos se afecta en general, por la presencia componentes coloidales del mismo, tanto inorgánicos (minerales de arcilla) como orgánicos (CO), tal y como se ha confirmado en estudios previos con el producto racémico metolacloro y con S- metolacloro (Torrents y Jayasundera., 1997; Weber et al., 2003; Shaner et al., 2006). 129 Tabla II.10. Coeficientes de adsorción de Freundlich para S-metolacloro en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 5% y 10% (p/p) con AJ (S5J, S10J, C5J, C10J, T5J, T10J) y con AM (S5M, S10M, C5M C10M, T5M, T10M). *Los números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media ** Los números son medidas de nf ± desviación estándar Este aumento es más intenso a dosis más altas de alperujo, revelando que en estos suelos el componente orgánico es más importante para la adsorción de S- metolacloro en este proceso, que el componente inorgánico. El estudio de Weber et al. (2003), donde se compara la adsorción y movilidad del producto racémico metolacloro en 5 suelos procedentes del sur de Inglaterra, revela más alta correlación de estos componentes orgánicos del suelo con la adsorción de metolacloro respecto a los componentes inorgánicos. La valores más altos de adsorción se dan al enmendar con AJ, alperujo de mayor índice de humificación, al 10% (p/p) en el suelo arenoso, mientras que fue la adición del alperujo de Morón la que más aumentó la adsorción en C y T (Tabla II.10.). Sin embargo, a altas concentraciones del herbicida (Kd10), es AJ, la enmienda que mayor adsorción produce en los tres suelos usados (Tabla II.10.) al igual que ocurre para MCPA (Kd25; Tabla II.7). Esta diferente adsorción en suelos enmendados con alperujos de contenido en CO R2ads Kfads nfads Kd10 S 0.993 1.00(0.871/1.14) 1.05±0.052 12.2±1.12 S5J 0.979 2.33(2.01/2.78) 1.12±0.032 10.9±1.46 S10J 0.959 7.59(6.30/9.13) 0.973±0.115 16.9±2.03 S5M 0.994 1.84(1.25/2.19) 1.09±0.098 10.2±1.3 S10M 0.979 5.38(5.62/6.254) 1.03±0.085 15.9±2.51 C 0.964 1.13(0.832/1.54) 1.10±0.122 13.7±1.84 C5J 0.978 1.15(0.92/1.43) 1.00±0.102 16.1±2.2 C10J 0.987 7.68(6.01/8.69) 1.39±0.287 41.0±6.53 C5M 0.992 2.59(2.06/2.89) 1.12±0.083 15.2±1.86 C10M 0.984 10(9.05/11.05) 1.05±0.053 16.7±2.13 T 0.987 1.57(1.32/1.84) 1.05±0.068 12.9±1.41 T5J 0.991 2.68(2.44/3.04) 1.14±0.123 11.9±1.79 T10J 0.934 3.85(2.77/5.35) 1.28±0.196 22.9±3.14 T5M 0.987 3.05(2.72/3.68) 1.09±0.158 11.5±2.13 T10M 0.975 5.85(4.97/6.88) 1.03±0.095 16.6±2.71 similar (81 y 91%), pone de manifiesto, al igual que en el caso de MCPA, la importancia de la naturaleza de la materia orgánica exógena (Cox et al., 1995 y 2000). El distinto grado de asociación de la materia orgánica con los componentes coloidales del suelo, lo que depende de tanto las propiedades de las enmiendas como de la naturaleza coloidal del suelo (Celis et al., 1999; Cox et al., 2000b), también puede influir en las diferencias en la adsorción. Figura II.23. Isotermas de adsorción de S-metolacloro en los suelos S (arriba), C y T(abajo) sin enmendar y enmendados con AJ o AM al 5% y 10% (p/p) (S, S5J, S10J, S5M, S10M, C, C5J, C10J, C5M, C10M, T, T5J, T10J, T5M, T10M). Ce (µM) 010 20 30 40 Cs (µmol Kg-1) 0 20 40 60 80 100 Ce (µM) 010 20 30 0 20 40 60 80 C C10J C10M C5J C5M Cs (µmolKg-1) Ce (µM) 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 T T10J T10M T5J T5M Cs (µmol Kg-1) S S10J S10M S5J S5M 131 II.4.4.2.- Estudios de desorción En la Figura II.24. se han representado las isotermas de adsorción-desorción de S-metolacloro en los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados con AJ y AM al 5% y 10% (p/p). Los parámetros de desorción se recogen en la Tabla II.11. Figura II.24. Isotermas de adsorción y desorción de S-metolacloro en los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados al 5% y 10% con AJ y AM. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 20 40 60 80 ADS S DES S 0 5 10 15 20 25 30 35 0 20 40 60 80 ADS S10J DES S10J 0 5 10 15 20 25 30 35 0 20 40 60 80 ADS S10M DES S10M 0 5 10 15 20 25 30 35 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 25 30 35 Cs (µmol kg-1 0 20 40 60 80 ADS S5M DES S5M Cs (µmol kg-1 Ce (µM) Cs (µmol kg-1 Cs (µmol kg-1 Cs (µmol kg-1 0 5 10 15 20 25 30 35 Cs (µmol kg-1) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ADS T DES T 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ADS T10J DES T10J Ce (µM) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ADS T10M DES T10M 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ADS T5J ADS T5J Cs (µmol kg-1) Cs (µmol kg-1) Cs (µmol kg-1) Cs (µmol kg-1) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 5 10 15 20 25 30 35 Cs (µmol kg-1) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ADS T DES T 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ADS T10J DES T10J Ce (µM) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ADS T10M DES T10M 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ADS T5J ADS T5J Cs (µmol kg-1) Cs (µmol kg-1) Cs (µmol kg-1) Cs (µmol kg-1) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Esta tabla muestra que en general, el ajuste de la ecuación de Freundlich es mejor que el obtenido para el herbicida MCPA (Tabla II.6.). La desorción de S-metolacloro de los suelos no es reversible para los suelos S y T, que mostraron coeficientes de adsorción nfads mayores que los nfdes lo cual es indicativo de fenómenos de histéresis (Seybold y Merseil, 1996), mostrando coeficientes de histéresis mayores en los suelos enmendados respecto a los sin enmendar. En el caso del suelo C ocurrió al contrario, encontrándose valores de nfdes mayores que nfads a excepción de C5J, C10J y C5M (Tabla II.11). Estos resultados no coinciden con los obtenidos por Cox et al., (1997) y Koskinen et al., (2006), que encontraron mayores valores de H en sistemas altamente adsorbentes, y puede ser debido a la diferente capacidad adsorbente de la materia orgánica del suelo y a la materia orgánica exógena. A diferencia de MCPA, la adición de enmienda a los suelos no favorece la desorción de S-metolacloro hacia la solución del suelo. Tabla II.11. Coeficientes de desorción de Freundlich, el porcentaje de desorción (D), y el coeficiente de histéresis (H) para S-metolacloro en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 10% (p/p) con AJ (S5J, S10J, C5J, C10J, T5J, T10J) y con AM (S5M, S10M, C5M C10M, T5M, T10M) R2des Kfdes nfdes %D %H S 0.976 6.98(6.05/8.05) 0.465±0.051 48.3 44.5 S5J 0.989 6.08(6.18/7.20) 0.680±0.111 44.2 55.5 S10J 0.987 15.2(13.7/16.9) 0.619±0.049 39.6 63.6 S5M 0.991 8.2(7.76/8.84) 0.496±0.085 20.4 46.1 S10M 0.960 20.6(17.5/24.4) 0.489±0.070 21.5 47.6 C 0.999 0.996(0.952/1.04) 1.12±0.016 66.7 102 C5J 0.987 4.25(3.15/5.21) 1.02±0.026 42.9 68.3 C10J 0.987 14.9(13.3/16.6) 1.03±0.036 28.1 39.7 C5M 0.993 16.9(16.1/17.2) 1.11±0.236 38.2 82.7 C10M 0.975 4.42(3.51/5.82) 1.08±0.122 38.5 131 T 0.981 4.98(5.75/6.36) 0.692±0.051 50.9 65.6 T5J 0.989 6.45(5.65/6.96) 0.895±0.121 35.1 82.5 T10J 0.992 7.61(6.93/8.35) 0.934±0.041 30.9 73 T5M 0.999 8.28(8.02/8.49) 0.982±0.062 45.2 74.1 T10M 0.996 9.61(8.80/10.5) 0.820±0.038 30.8 79.4 133 II.4.4.3.- Estudios de disipación En la Figura II.25 se muestran las curvas de disipación de s-metolacloro tras 135 días de incubación a 24±1 ºC y 40% de humedad en los suelos sin enmendar y enmendados. En la Tabla II.12. se muestran los valores de vida media (T1/2) de S- metolacloro en esos suelos tras el ajuste de las curvas de disipación a una cinética de primer orden. La persistencia de S-metolacloro en los suelos se ve afectada por la actividad microbiana así como por la naturaleza e intensidad de las interacciones entre el herbicida y las partículas del suelo (Pignatello et al., 1991; Shaner et al., 2006). En este estudio, al igual que MCPA, S-metolacloro mostró menor persistencia en los tres suelos estudiados sin enmendar, (Fig.II.15). La baja capacidad de adsorción de estos suelos sin enmendar favorece que el herbicida en solución se encuentre más disponible para los procesos de degradación. Por el contrario, no se encontraron diferencias significativas en la vida media del herbicida entre los 3 suelos sin enmendar. Los tres suelos mostraron vidas medias similares a las encontradas en los estudios de O’Connell et al. (1998) y por Shaner et al. (2006). La adición de enmienda produjo un aumento importante en la persistencia del herbicida en los tres suelos, siendo mayor a la dosis más alta de enmienda No fue posible calcular las vidas medias de S-metolacloro en los suelos S10M, T10M, C10J y C10M, ya que su disipación no se ajustaba a la cinética de primer orden (Tabla II.12). Por el contrario a MCPA, no se observan diferencias significativas en la persistencia de s-metolacloro entre los dos tipos de enmienda. Tabla II.12. Vida media (T ½) y coeficientes de ajuste a una cinética de primer orden para S-metolacloro en los tres suelos estudiados, sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 5% y 10% (p/p) con AJ (S10J, S5J, C10J, C5J T10J) y con AM (S10M, S5M, C10M, C5M, T10M). *Los números entre paréntesis son desviaciones estándar respecto a la media ** Los números son medidas de nf ± desviación estándar Figura II.25. Curvas de disipación de S-metolacloro en los suelos S, C y T sin enmendar y enmendados con AJ y AM a la dosis del 5% y 10% (p/p) AJ (S10J, S5J, C10J, C5J T10J) y con AM (S10M, S5M, C10M, C5M, T10M). Tiempo (Días) 020 40 60 80 100 120 140 %S-metolacloro 0 20 40 60 80 100 120 S S5J S10J S5M S10M Tiempo (Días) 020 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 C C5J C10J C5M C10M %S-metolacoro Tiempo (Días) 020 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 T T5J T10J T5M T10M %S-metolacloro S S5J S10J S5 M S1 0M T T5J T10 J T5M T1 0M C C5J C1 0J C5 M C1 0M T1 /2 31 (24/ 39) 67 (59/ 76) 149 (128/ 162) 71 (62/ 89) - 19 (11/ 29) 39 (29/ 46) 47 (38/ 59) 158 (112/ 187) - 21 (16/ 32) 41 (36/ 48) - 58 (42/ 71) - R 2 0.9 88 0.9 79 0.797 0.9 11 0.7 99 0.9 48 0.9 78 0.9 68 0.766 0.5 68 0.9 86 0.9 91 0.6 79 0.9 89 0.5 99 135 II.4.4.4.- Estudios de lixiviación En la Figura II.26 se muestran las curvas de elución relativas y acumuladas de S- metolacloro en los suelos sin enmendar y enmendados con AJ y AM al 5% y 10% (p/p). Las curvas de lixiviación relativas para S-metolacloro corroboran que la retención del mismo por los suelos es más intensa que la encontrada para el herbicida aniónico MCPA, tanto en los suelos sin enmendar, como en los enmendados (Figuras II.10 y II.26.). En caso de los suelos sin enmendar, las diferencias entre el suelo S y los suelos C y T son mucho mayores que para MCPA. Esto es debido al mayor contenido en materia orgánica y arcilla. componentes determinante en la adsorción de este herbicida en suelos (Shaner et al., 2006). La incorporación de la MO de la enmienda potenció esta retención, como revelan las curvas de elución de los suelos emendados (Figura II.26). La curva de elución de S-metolacloro en el suelo arenoso (S) es más simétrica que la de los suelos C y T, mostrando un máximo relativo mucho mayor (Figura II.26). Esto se puede explicar por la menor capacidad de adsorción de S-metolacloro que se encontró en este suelo, por tanto menor retención del herbicida, respecto a los otros dos suelos (Figura II.26). La adición de alperujo a los suelos retrasó de la lixiviación de S-metolacloro respecto a los suelos originales, siendo el efecto mucho más intenso para los suelos C y T, que mostraron my reducidos máximos relativos y similares entre sí, Sin embargo T5J que no mostró diferencias significativas en los valores de Kfads con el suelo T5M, mostró, lixiviación aunque reducida, revelando la diferente capacidad de interaccionar con el herbicida de la MO de los dos alperujos (Figura II.26). Al contrario de lo encontrado para MCPA en los suelos S y C, con menores porcentajes acumulados en los lixiviados de los suelos sin enmendar, respecto a los enmendados, lo que se atribuyó a la menor adsorción del herbicida en estos sistemas y por ello, una mayor exposición a fenómenos de disipación, (Figura II.20), los porcentajes totales acumulados de S-metolacloro en los suelos originales fueron más altos que los suelos enmendados, a excepción del suelo S. Los procesos de lixiviación se pueden ver afectados por diversos factores, entre ellos la naturaleza del herbicida, la presencia y calidad del CO o del COS y la porosidad del suelo, como factores más determinantes. Los resultados del estudio de lixiviación con S- metolacloro revelan que el factor más determinante en la retención y lixiviación de este herbicida lo constituyó el contenido en CO, y no la porosidad del suelo, ya que el aumento de volumen de poro obtenido al enmendar los suelos (TablaII.5 y Figura II.4) no se tradujo en un aumento en la lixiviación, sino que al contrario, S-metolacloro se retenía fuertemente reduciendo la lixiviación e incluso a veces, impidiéndola por completo, como ocurre en los suelos C10M, T5M y T10M. Tras 50 días de estudio de movilidad en columnas del herbicida, se extrajo el herbicida retenido en el suelo dividiéndose la columna en 4 fragmentos de 4 profundidades (0-5, 5-10, 10-15 y 15-20 cm). El porcentaje extraído de S-metolacloro a distintas profundidades, se recoge en el gráfico de barras horizontales que describe la Figura II.27). Por el contrario de lo observado con MCPA, S-metolacloro sí se encontró herbicida retenido en las columnas de suelo (Figura II.27). La alta capacidad de adsorción de S-metolacloro por los suelos, sobre todo, los enmendados y se tradujo en una gran presencia del herbicida en los extractos de estos suelos, que no fue degradado durante los 50 días de estudio. En el suelo con menor capacidad de retención y menor persistencia (S), no se extrajo herbicida (Figura II.27.). Los suelos S enmendados retuvieron más herbicida cuanto más capacidad de adsorción presentaban, es decir, más en los suelos enmendados al 10% con AJ y AM (Figura y Tabla II.12). Del suelo C10M tampoco se extrajo herbicida (Figura II.27.) lo que se puede atribuid su alta adsorción. Sin embargo, al enmendar al 5%, que la adsorción es menos intensa (Tabla II.12), se recuperó un 8 y 20% de herbicida en los suelos enmendados con AJ y AM, respectivamente. 137 Figura II.26. Curvas relativas de lixiviación (izquierda) y acumuladas (derecha) para S-metolacloro en los suelos sin enmendar (S, C y T) y enmendados al 5% y 10% (p/p) con AJ (S10J, S5J, C10J, C5J T10J) y con AM (S10M, S5M, C10M, C5M, T10M). Vol añadido (ml) 0100 200 300 400 500 600 % SMETOLACLORO 0 1 2 3 4 5 6 7 S S5J S5M S10J S10M vol añadido(ml) 0100 200 300 400 500 600 700 % SMETOLACLORO 0 20 40 60 80 100 S S5J S5M S10J S10M Vol añadido (ml) 0100 200 300 400 500 600 % SMETOLACLORO 0 1 2 3 4 5 6 7 S S5J S5M S10J S10M vol añadido(ml) 0100 200 300 400 500 600 700 % SMETOLACLORO 0 20 40 60 80 100 S S5J S5M S10J S10M Volumen añadido (ml) 0100 200 300 400 500 600 700 % eluído acumulado de S-metolacloro 0 20 40 60 80 100 T T5J T10J 0100 200 300 400 500 600 700 % eluído de S-metolacloro 0 1 2 3T T5J T10J Volumen añadido (ml) 0100 200 300 400 500 600 % eluido de S-metolacloro 0 1 2 3 C C5J C5M C10J Volumen añadido (ml) 0100 200 300 400 500 600 0 2 4 6 8 10 12 14 16 C C5J C5M C10J % eluído acumulado de S-metolacloro Volumen añadido (ml) Juhler, R.K.; Henriksen, T.H.; Ernstsen, V.; Vinther, F.P.; Rosenberg, P. 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La naturaleza físico-química de la materia orgánica del suelo depende por ello de la entrada de biomasa al sistema, de la historia agrícola del suelo (Alleto et al., 2010; Schnitzner y Monreal., 2011), de la composición de la matriz mineral del mismo, la climatología, la abundancia de agua, la profundidad del perfil del suelo, la microflora, microfauna y de la mesofauna que habitan el suelo (Pignatello, 2012). La evolución y transformación de la materia orgánica (MO) en los suelos enmendados, debido fundamentalmente a las condiciones climáticas, juega un papel muy importante en la determinación de su capacidad de interaccionar con compuestos orgánicos (Cox et al., 2004; Barriuso et al., 2011). Algunos estudios han investigado el comportamiento de plaguicidas en suelos enmendados con alperujo y/o orujo (López- Piñeiro et al., 2006 y 2008a y b; Albarrán et al., 2004; Cabrera et al., 2008 y 2010), pero existen pocos bajo condiciones de campo y que evalúen el efecto de la transformación de la MO del suelo en el comportamiento de plaguicidas (Cabrera et al., 2009; Cañero et al., 2012). Ya en el Capítulo I se menciona la fracción orgánica de los suelos como componente determinante para algunos plaguicidas en los procesos de adsorcióndesorción en los suelos. Existen estudios que ponen de manifiesto que la composición coloidal del suelo condiciona fuertemente el grado de adsorción de la MO soluble exógena que aportan los residuos, así como las interacciones que se darán lugar entre los plaguicidas y las partículas del suelo. Las interacciones entre la MO del suelo y la procedente de los residuos va a depender de su estructura química y por tanto el origen de la misma (Schnitzner y Monreal., 2011). Bentazona (2, 2-dióxido de 3-isopropil-(1H)-2, 1, 3-benzotiazidin-4(3H)-ona) es uno de los herbicidas más ampliamente usados en agricultura para el control de malas hierbas en cultivos de maíz, arroz y otros cultivos intensivos (Li et al., 2003; Liu et al., 2011). Debido a su baja capacidad de adsorción en suelos y, por tanto, su alta movilidad en ellos, presenta alto riesgo de lixiviación hacia aguas subterráneas (Lagana et al., 2002; Dousset et al., 2004) es frecuentemente detectado en aguas superficiales y subterráneas a concentraciones superiores a las establecidas por la UE. Loos et al. (2010) encontraron que bentazona constituía un serio problema de contaminación en términos de frecuencia de detección y concentraciones máximas en aguas subterráneas en 23 países europeos estudiados. En Alemania en particular, es uno de los plaguicidas que más problemas causa en la gestión de aguas potables. En España, Kuster et al. (2008) demostraron que bentazona era uno de los contaminantes más importantes en muchas regiones de España sometidas a prácticas de manejo agrícola intensivas. 155 III.2.-OBJETIVOS El objetivo general de este estudio ha sido evaluar el impacto que la adición de dos residuos de almazara (alperujo y orujo) transformados tras 9 años de aplicaciones sucesivas y de residuos no transformados (frescos), tienen sobre las propiedades físicoquímicas de suelo de olivar y sobre los procesos que regulan el comportamiento de los herbicidas bentazona y S-metolacloro. III.3.-MATERIALES Y MÉTODOS III.3.1.-Herbicidas III.3.1.1.-Bentazona Bentazona es un herbicida que pertenece a la familia de las benzotiadiazinonas. Presenta un peso molecular de 240.3 gmol-1 y su solubilidad en agua es de 570 mg l-1 a pH 7 y a 22 ºC. Es un ácido débil con pKa=3.2 (Boivin et al., 2005) que se encuentra en la solución del suelo fundamentalmente en forma aniónica. El producto técnico (pureza del 98 %) usado para los estudios de adsorción-desorción, disipación, mineralización y lixiviación fue proporcionado por BASF (Limburgerhof, Alemania). Los estudios de mineralización se realizaron usando C14-bentazona marcada en el carbono del grupo carbonilo, con actividad específica de 6.8 MBq mg-1 y proporcionado por IZOTOP (Budapest, Hungría). Bentazona es un herbicida selectivo de contacto, de absorción por las hojas. Actúa en postemergencia sobre monocotiledóneas no gramíneas y dicotiledóneas inhibiendo la actividad fotosintética en el fotosistema II (PSII). Se degrada principalmente por hidroxilación en suelo y en plantas se metaboliza rápidamente a derivados de antranílico. Figura III.1. Estructura química tridimensional de la molécula de bentazona. 258 community structures in the human distal intestine. 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Conclusiones Generales 263 VI. CONCLUSIONES GENERALES Los resultados obtenidos a lo largo de esta tesis Doctoral resumen en las siguientes conclusiones: -El alperujo AJ de mayor pH y de menor COS que AM, mostró contenidos en lignina y celulosa bajos, típicos de material humificado. Los espectros de fluorescencia del COS de los dos alperujos revelaron HIX de 9.5 para AJ y 1.3 para AM, confirmando el estado de compostaje más avanzado del primero. El alperujo AM de menor grado de humificación, presentaba en solución más compuestos fenólicos que AJ que le proporcionan carácter ácido, por lo que los grupos carboxilos de las moléculas en solución se encuentran tanto en forma COOH como COO-. Mientras que AJ, que como consecuencia de un mayor estado de humificación y compostaje, ha perdido los compuestos fenólicos que le proporcionan el carácter ácido, y presenta menos grupos COO en solución. -Tanto los resultados del estudio por fluorescencia, como los de FT-IR, confirman la distinta naturaleza de los componentes orgánicos solubles de los alperujos. A pesar del similar contenido en MO de los mismos, podríamos indicar que el alperujo AJ constituye una mejor elección como enmienda para el suelo frente al alperujo AM, ya que aporta una materia orgánica más estable. -Los estudios de superficie y porosidad de los suelos revelaron que la adición de los alperujos AJ y AM a las dosis de 5% y 10% aumentó el volumen total de poros en los tres suelos estudiados, respecto a los suelos sin enmendar. -La adición de alperujo al suelo aumentó el contenido de carbono orgánico soluble y por tanto de carbono lábil para los microorganismos del suelo, explicando la mayor respiración encontrada en los suelos enmendados. -La adsorción del herbicida MCPA se ve afectada por la concentración de herbicida en solución, describiendo isotermas tipo L, mientras que la adsorción del herbicida S-metolacloro no se ve afectada por la concentración, mostrando isotermas tipo C. -MCPA y S-metolacloro mostraron muy baja capacidad de adsorción en los tres suelos sin enmendar en laboratorio, siendo ligeramente mayor para el segundo. -Los valores de Kfads para MCPA en los suelos enmendados no muestran aumento importante en la adsorción para los tres suelos, mientras que los Kd10 revelan incremento en la adsorción, principalmente al enmendar con AJ. Los coeficientes Kfads y Kd10 para S-metolacloro aumentan al enmendar los suelos con los alperujos, que para Kd10 fue mayor al enmendar con AJ, al igual que ocurrió para MCPA. -Las adsorciones de MCPA y S-metolacloro a los suelos sin enmendar, aunque bajas, no son reversibles, ya que mostraron nfads mayores que los nfdes para los tres suelos (a excepción del suelo C para S-metolacloro). Sin embargo, los suelos enmendados presentan adsorción reversible de MCPA. El aumento del carbono orgánico soluble en la solución tras la enmienda con alperujo podría ser la causa de ello, ya que ésta podría favorecer la desorción del herbicida retenido en la fase sólida hacia la fase líquida de la solución. A diferencia de MCPA, la adición de enmienda en los suelos no favorece la desorción de S-metolacloro hacia la solución del suelo. -Las T1/2 de MCPA de los suelos sin enmendar fueron menores en los suelos con mayor contenido en carbono orgánico (C y T) que se explica por una mayor actividad biológica en los suelos, que favorece la degradación de los herbicidas. Para S-metolacloro no hubo diferencias significativas. -La adición de los alperujos aumentó la persistencia de MCPA y S- metolacloro en los suelos, Esto se atribuye, por un lado, al efecto protector que proporciona la mayor adsorción estando el herbicida menos disponible para sufrir procesos de degradación, pero también puede ser debido a que los microorganismos del suelo prefieran utilizar esta materia orgánica (alperujo) como fuente de carbono, en lugar de degradar el herbicida presente en la disolución del suelo, aumentando su persistencia. La adición de enmienda redujo la mineralización de MCPA en todos los suelos estudiados corroborando su alta persistencia en los estudios de disipación. -Los estudios de movilidad revelaron baja y muy alta retención de MCPA y S- metolacloro, respectivamente mostrando un retraso en la lixiviación mayor al enmendar siendo el efecto mucho más intenso para S-metolacloro. -El aumento de volumen de poro obtenido al enmendar los tres suelos no se tradujo en un aumento en la lixiviación para ninguno de los herbicidas. Revelando que la materia orgánica de los suelos constituye en este caso un factor más determinante que la porosidad de los suelos. 265 -La adición tanto de alperujo (OW) como de orujo (DW) modificó las propiedades originales del suelo. Se encontró menor contenido en COS de los suelos enmendados en el campo que se atribuyó a pérdidas por procesos de lixiviación y escorrentía y a procesos de degradación por parte de los microorganismos presentes en el suelo. El volumen total de poro se incrementó al enmendar con los dos residuos respecto al suelo sin enmendar. -La adición de los residuos a los suelos incrementó la adsorción de los herbicidas, siendo mayor en el caso de S-metolacloro, que bentazona, siendo más intensa en los suelos enmendados en laboratorio (OW5, OW10, DW5 y DW10) que en campo (OW30, OW60, DW27 y DW54). -En los suelos enmendados en el campo con OW, la vida media de bentazona fue similar a la del suelo sin enmendar. Por el contrario, para los suelos enmendados con el orujo, las vidas medias de bentazona se incrementaron por los factores de 2 y 3 para DW27 y DW54, respectivamente. Los suelos enmendados en laboratorio mostraron vidas medias hasta 18 veces mayores que el suelo original. Para S- metolacloro no se encontraron en este caso diferencias importantes en su persistencia en los suelos enmendados respecto al suelo original. -El incremento en la adsorción no se tradujo en una mayor retención de bentazona por los suelos en los estudios de lixiviación, mientras que por el contrario sí para S-metolacloro, que sólo lixivió en el suelo sin enmendar (S). -Mientras que la mineralización de bentazona se vio reducida al enmendar los suelos, tanto en campo como en laboratorio, la monitorización de la actividad deshidrogenasa de los suelos en presencia de S-metolacloro no reveló efecto tóxico por parte del herbicida, ni de la adición de los residuos, confirmando esto último el incremento de la respiración de los suelos al enmendar, frente al suelo original. -En este trabajo se muestra también que la aplicación al suelo de terbutilazina, que a diferencia de glifosato, es una fuente indirecta de fitotoxicidad para los olivos (Olea europaea), reduciendo la eficiencia fotosintética que fue contrarrestada por la adición de OW a los suelos, debido al aumento de la adsorción del herbicida a las partículas de suelos, siendo de esta manera disponible para ser absorbido por las plantas. La adición de residuos de almazara no se tradujo en una reducción de la población microbiana presente en suelos. Estudios de tolerancia a altas dosis de herbicidas, mostraron cepas tolerantes a MCPA y S-metolacloro, sin embargo, estas cepas no lograron crecer en presencia de estos herbicidas como única fuente de carbono. -Estudios cultivo-dependientes de inoculación en placas Petri, revelaron aumento en el número de colonias de los suelos enmendados respecto a los suelos sin enmendar y cierto cambio en la composición de las poblaciones microbianas, favoreciendo a aquellas más tolerantes a los herbicidas, por lo que no se observó efecto tóxico sobre los microorganismos del suelo. -Los estudios de cultivo-independientes (DGGE), mostraron un aumento en la intensidad de las bandas en el perfil de los suelos enmendados, lo que coincide con un aumento en la concentración de ARN de estos suelos, y por tanto de la actividad biológica, confirmando la ausencia de efecto tóxico de los residuos e incluso expresando una tendencia favorable por la adición de residuos. Capítulo VII. Publicaciones 275 277 279 281 283