Vía de la P53: orígenes, inactivación en cáncer y aproximaciones terapéuticas

VÍA DE LA P53: ORÍGENES, INACTIVACIÓN EN CÁNCER Y APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS Federico de Novales de la Puente TRABAJO FIN DE GRADO VÍA DE LA P53: ORÍGENES, INACTIVACIÓN EN CÁNCER Y APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS Revisión(bibliográfica( Grado en Farmacia Federico de Novales de la Puente Tutor: Martiniano Santiago Pavón Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Sevilla, 15 Junio de 2018 1 RESUMEN La proteína p53 es un componente fundamental para la homeostasis de la célula que en condiciones normales se encuentra regulada a la baja y es en respuesta a estrés cuando aumenta su expresión y su actividad. En las últimas décadas esta proteína ha cobrado gran importancia debido a su implicación en diversos tipos de cánceres y, por este motivo, los diferentes estudios realizados hasta la fecha han buscado profundizar en el entendimiento de la función y la estructura de esta proteína, así como conocer lo fenotipos en que se traducen las diferentes mutaciones descritas en p53. De este modo, en función de la alteración producida se podrá establecer una diana terapéutica para el diseño de moléculas que puedan resultar efectivas en el tratamiento del tumor en cuestión. En esta revisión haremos un repaso de las principales mutaciones descritas en p53 que están relacionadas con procesos tumorales y de las principales posibles estrategias terapéuticas que hasta la fecha hayan resultado ser más prometedoras de cara al tratamiento de este tipo de patologías. PALABRAS CLAVE: p53, proteína intrínsecamente desordenada, estabilización de p53, cáncer, terapia. 2 ABREVIATURAS • Atg10, gen asociado a autofagia 10. • Bai1, inhibidor-1 de angiogénesis específico del cerebro. • Bax, proteína X asociada a BCL-2. • BCL, proteína de linfoma de células B. • -Btg2, gen 2 de translocación de células B. • CBP, proteína de unión a CREB. • Cdkn1α, inhibidor de quinasa 1α dependiente de ciclina. • Col4a1, colágeno α-1 tipo IV. • CREB, proteína de unión a elementos de respuesta de AMPc. • CTD, dominio regulador C-terminal. • Ddb2, proteína 2 de unión a ADN asociada a daño. • Epha2, receptor-2 de efrinas tipo A. • Foxo3, “forkhead box O3”. • Gadd45α, factor 45α inducible por daño en el ADN y parada del crecimiento. • Gls2, glutaminasa-2. • GOF, ganancia de funciones. • Gpx1, glutatión peroxidasa-1. • IDP, proteína intrínsecamente desordenada. • LIF, factor inhibidor de la leucemia. • Mgmt, O-6-metilguanina-ADN metiltransferasa. • NCBD, dominio nuclear de unión a coactivador. • NMD, degradación mediada por mutaciones terminadoras. • Noxa, activador de NADPH oxidasa. • Pai1, inhibidor del activador del plasminógeno 1. • Pig3, proteína 3 inducible por p53. • Pml, leucemia promielocítica. • PR, región rica en prolina. • PTC, codones de terminación prematura. • PTM, modificaciones postraduccionales. • Puma, vía de sobrerregulación de p53 moduladora de apoptosis. • P53r2, ribonucleótido reductasa inducible por p53-inducible. • Saos-2, células de sarcoma osteogénico. • Sesn, sestrina. • TAD, dominio de transactivación. • TET, dominio de tetramerización. • Tigar, regulador de apoptosis y glucólisis inducido por TP53. • Tpp1, tripeptidil peptidasa-1. • Tsc2, esclerosis tuberosa-2. • Tsp1, trombospondina-1. • Wip1, fosfatasa 1 inducida por p53 silvestre (wild-type). 3 ÍNDICE' 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 5 1.1 CONCEPTO Y FUNCIÓN DE P53 ....................................................................................... 5 1.2 ORGANIZACIÓN ESTRUCTURAL DE P53. .......................................................................... 7 1.3 REGULACION DE LA FUNCIÓN DE P53 MEDIANTE SUS REGIONES INTRÍNSECAMENTE DESORDENADAS ................................................................................................................... 9 2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 11 3. METODOLOGÍA............................................................................................................... 11 4. DISCUSIÓN Y RESULTADOS ............................................................................................. 12 4.1 DIFERENTES ASPECTOS DE LAS ALTERACIONES DE P53 EN CÁNCER ........................ 12 4.1.1 MUTACIONES DE P53 EN CÁNCER .......................................................................... 12 4.1.2 GANANCIA DE FUNCIONES DE P53 MUTADA .......................................................... 13 4.1.3 ESPECIFICIDAD DE P53 DEPENDIENTE DE TEJIDO .................................................... 14 4.1.4 CLASIFICACIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LAS MUTACIONES DE P53 EN CÁNCER. ......................................................................................................................... 16 4.1.5 AGREGACIÓN DE P53. ............................................................................................ 19 4.2 ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER ....................... 19 4.2.1 MOLÉCULAS QUE ESTABILIZAN P53. ....................................................................... 19 4.2.2 RESTAURACIÓN DE LA INTERACCIÓN CON ZINC EN LA P53 MUTADA MEDIANTE METALOCHAPERONAS. ................................................................................................... 21 4.2.3 INHIBIDORES DE LA INTERACCIÓN P53-MDM2/MDMX........................................... 22 4.2.4 RESTAURAR LA FUNCIÓN PERDIDA EN P53 CON MUTACIONES SIN SENTIDO .......... 24 5. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 26 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 27 ' ' 4 ' 5 1. INTRODUCCIÓN'' ' 1.1'CONCEPTO'Y'FUNCIÓN'DE'P53'' La proteína p53 es un supresor de tumores fundamental para el organismo debido a sus numerosas funciones en el mantenimiento de la estabilidad del genoma y la inhibición de la tumorigénesis en la célula (Vogelstein et al., 2000). La principal actividad de p53 es la de ser un activador transcripcional de un amplio repertorio de genes mediante reconocimiento y unión a secuencias específicas de ADN (Vousden and Prives, 2009). En condiciones normales, los niveles de p53 están regulados a la baja y es en respuesta a estímulos como daño en el ADN, estrés ribosomal o estrés metabólico, entre otras situaciones, cuando la p53 es postraduccionalmente modificada con el fin de conseguir una rápida estabilización y la consiguiente activación de cientos de genes con múltiples funciones celulares (Vousden and Prives, 2009). En términos generales, podemos afirmar que p53 es esencial en el mantenimiento de la homeostasis mediante la reparación o eliminación de células que experimentan daños en su genoma (Paradox 2016), o dicho de otro modo, la proteína p53 activa transcripcionalmente genes que determinan si la célula vive o muere (Kenzelmann Broz et al., 2013). Figura 1. Vía de la p53 (tomada de Joerger and Fersht, 2008) 12 4. DISCUSIÓN'Y'RESULTADOS' 4.1 DIFERENTES'ASPECTOS'DE'LAS'ALTERACIONES'DE'P53'EN'CÁNCER' 4.1.1'MUTACIONES'DE'P53'EN'CÁNCER' En el 50% o más de los diferentes tipos de cáncer humano, p53 experimenta mutaciones que la inactivan. La prevalencia de las mutaciones en p53 varía significativamente según el tipo de cáncer y también depende de la etapa de desarrollo del tumor, con prevalencias que van desde menos del 5% en cáncer de cuello uterino y el 10% en leucemia hasta un 80% en cáncer de pulmón no microcítico y 90% en cáncer de ovario (Leroy et al., 2014). La mayoría de las mutaciones de p53 asociadas al cáncer se localizan en el DBD. En concreto, las mutaciones somáticas más frecuentes se localizan en R175H, Y220C, G245S, R248Q / W, R249S, R273C / H, y R282W (Figura 3b). Mutaciones en las regiones intrínsecamente desordenadas de p53 son relativamente raras, y en el caso del dominio de tetramerización, las mutaciones ahí son un caso especial, ya que la frecuencia con la que se han observado mutaciones somáticas en él es relativamente baja, pero sí que se han encontrado mutaciones en células germinales en el TET, siendo R337H la mutación más frecuente observada en estas (Leroy et al., 2014). Estas mutaciones que experimenta p53 no sólo se traducen en pérdida de actividad transcripcional, sino que también se da una ganancia de funciones (GOF), resultado de dichas alteraciones en la proteína, que provocan en la célula comportamientos tumorales agresivos como veremos a continuación. Figura 3. Mutaciones de p53 en cáncer. a) Frencuencia de los diferentes tipos de mutaciones somáticas asociadas al cáncer. b) Distribución relativa de las mutaciones con cambio sentido en el codón de p53. (Tomadas de la base de datos de mutaciones en p53 de la International Agency for Research on Cancer´s http://p53.iarc.fr/). 13 4.1.2'GANANCIA'DE'FUNCIONES'DE'P53'MUTADA' Las mutaciones con cambio de sentido representan casi el 75% de todas las mutaciones de p53 en cánceres humanos (Figura 3a). El cambio de una sola base puede alterar un aminoácido, eliminando o alterando la actividad transcripcional de p53. Así mismo, ya se vio que la modificación de cualquiera de las cinco argininas, las cuales son puntos calientes de mutación en p53, desactiva la secuencia específica de unión al ADN. Además, se ha observado que pueden aparecer mutaciones en el DBD (algunas de ellas en estos puntos calientes), las cuales pueden producirse por la exposición a factores tan comunes como la luz ultravioleta, el tabaquismo o la exposición a la aflatoxina u otros carcinógenos químicos (Olivier et al., 2010). El hecho de que la mayoría de las alteraciones de p53 en tumores sean mutaciones con cambio de sentido sugiere que las células que expresan p53 mutada tienen ventaja frente a las células con deficiencia en p53. Los primeros estudios indicaron que células tumorales con deficiencia en p53 silvestre presentaban nuevas propiedades tras la sobreexpresión de proteínas p53 mutantes (Dittmer et al., 1993). Por otro lado, se ha visto que células que presentan las formas mutadas más comunes de p53, a diferencia de aquellas que no las expresan, mostraron mayor poder metastásico (Hsiao et al., 1994). En el síndrome de Li-Fraumeni, personas con mutaciones sin sentido en p53 muestran mayor incidencia de cáncer y una edad más temprana de aparición del tumor (9-15 años antes, dependiendo de estudio), que individuos con otros tipos de mutaciones (Zerdoumi et al., 2013). Esta GOF se ha podido comprobar generando ratones heterocigotos para p53 alterando uno de los alelos mediante knockin. Por ejemplo, los modelos de ratón heterocigóticos con las mutaciones p53R172H y p53R270H, las cuales emulan las alteraciones en los puntos calientes de mutación propios de cánceres humanos correspondientes, respectivamente, a los aminoácidos 175 y 273, desarrollaron tumores con alto poder de metástasis que no se ven en ratones p53+/- (Lang et al., 2004). De esto podemos sacar dos observaciones, en primer lugar, a pesar de que los ratones heterocigotos p53R172H desarrollaron tumores altamente metastásicos, las curvas de supervivencia fueron idénticas a las de los ratones p53+/-. En segundo lugar, el análisis de los tumores en los ratones heterocigotos y homocigotos p53R172H mostraron que la proteína p53 14 mutante no se mostraba necesariamente estable, lo que sugiere que las alteraciones específicas de cada tumor provocadas por el conjunto de mutaciones acumuladas son las que determinan la estabilidad de p53 mutada. De hecho, los análisis de tejido no tumoral en ratones homocigotos p53R172H indicó que la p53 mutada no era estable en células normales. Frente a esto, hay que ver si Mdm2, la ubiquitina ligasa E3 que induce la degradación proteosomal de p53 silvestre, también podría regular la p53 mutada. En ratones con fenotipo p53R172H/R172H; Mdm2-/-, la pérdida de Mdm2 estabilizó la proteína mutada p53R172H. Esto condujo a la disminución de la latencia del tumor y aumento de metástasis en comparación con ratones con ambos alelos anulados en los dos genes p53/Mdm2 (Terzian et al., 2008). Por lo tanto, en este caso, la estabilización de la p53 mutada condujo a fenotipos más agresivos que los encontrados en ratones que carecen de p53. De esta forma, lo que sugieren estos estudios es que las formas mutadas de p53 que se muestran estables presentan actividades adicionales a la proteína silvestre, que promueven la proliferación e invasión de células tumorales, lo que apoya la idea de GOF en fenotipos con p53 mutada en procesos de tumorigénesis. 4.1.3'ESPECIFICIDAD'DE'P53'DEPENDIENTE'DE'TEJIDO' Muchos de los genes dianas de p53 que se han identificado han resultado ser específicos del tipo de célula y de tejido. Por ejemplo, en un estudio reciente, en el que p53 se estabilizó a través de la eliminación somática de Mdm2, los niveles de p21 se elevaron 200 veces en el riñón en comparación con 7 y 12 veces en el hígado y bazo, respectivamente (Zhang et al., 2014). También se observó que Puma, otra diana transcripcional de p53, aumentó 18 veces en el riñón, pero no aumentó en el hígado. Por otro lado, en otro estudio sobre la radiación gamma, cuatro dianas apoptóticas de p53 (DR5, Bid, Puma y Noxa) se indujeron en el yeyuno e íleon, los dos tejidos más sensibles a la radiación (Fei et al., 2002), mientras que los perfiles de activación de las diferentes dianas de p53 fueron diferentes en el colon transverso y el descendente. Sorprendentemente, incluso dentro del mismo tejido, diferentes compartimentos mostraron diferente regulación de la actividad de p53. En el caso del hígado, el principal gen activado frente a la radiación gamma fue p21. 15 Además, p53 activa transcripcionalmente el gen del factor inhibidor de la leucemia (LIF), que codifica una citoquina clave para la implantación del embrión. Se vio que hembras con el gen p53 anulado presentaban defectos de implantación, los cuales disminuyeron con la administración de LIF exógeno. Aunque en otros tejidos se expresa LIF frente a radiación gamma de manera dependiente de p53, el único defecto observado en hembras con el gen LIF anulado fue fallo de implantación en blastocitos (Hu et al., 2007). Lo que resaltan estos estudios es la importancia que puede tener una sola diana de p53 para un tejido específico: el útero en este caso. Ratones que expresaban niveles bajos de Mdm2 también presentaron patologías concretas dependientes de p53 tales como mayor pigmentación de la epidermis, reducción de los túbulos seminíferos, disminución de los espermatocitos en los testículos o una disminución del número de los folículos ováricos (Pant et al., 2016). Ninguno de los defectos se recuperó mediante la eliminación de p21, pero los fenotipos reproductivos fueron recuperados por la pérdida de Puma, lo que resalta nuevamente la idea de que la respuesta de p53 es específicamente dependiente de dosis y tejido. Es importante destacar que la eliminación de una única diana de p53 aguas abajo como es Puma revirtió el fenotipo reproductivo dependiente de p53, mientras que el fenotipo de la piel parece estar controlado por la señalización del ligando Kit. Este ligando Kit es otra diana de p53 que se expresa en melanocitos, siendo p53 la que controla su migración y acumulación (Zeron-Medina et al., 2013). Por otra parte, existen cofactores específicos de células o tejidos que regulan la actividad de p53 a través de interacción proteína-proteína y que también puede contribuir a la especificidad tisular o celular de la actividad de p53. Un estudio reciente mostró que el dominio del extremo C terminal de p53 regula la expresión génica de una manera específicamente dependiente de la diana y el tejido en cuestión. En este estudio se generó un alelo murino de p53 con una depleción de los 24 aminoácidos que componen el dominio del C-terminal (p53ΔCTD). En la médula ósea y el timo, p53ΔCTD estaba sobreactivado. Esto incrementó la senescencia y la transcripción de p21 en la médula ósea, e indujo la apoptosis y la transcripción de Puma y Noxa en el timo, lo que sugiere que el dominio del C-terminal disminuye la actividad de p53 en aquellos tejidos. En el hígado, sin embargo, p53ΔCTD mostró alteración en su actividad. En el bazo, la proteína p53ΔCTD estaba sobreexpresada, sugiriendo que este dominio es importante en el 16 control de los niveles de proteína p53 en este tejido. Sorprendentemente, p53ΔCTD sobreexpresada no condujo ni a senescencia ni a fenotipos de apoptóticos en el bazo (Hamard et al., 2013). Todo esto sugiere que el dominio C-terminal podría unirse a cofactores específicos de células o tejidos, determinando la especificidad anteriormente mencionada de p53. Además, el dominio C-terminal podría resultar esencial en el mantenimiento estructural de la proteína mediante la regulación de interacciones entre los otros dominios de p53 y ligandos específicos del tipo celular. 4.1.4'CLASIFICACIÓN'ESTRUCTURAL'Y'FUNCIONAL'DE'LAS'MUTACIONES'DE'P53' EN'CÁNCER.' Las mutaciones asociadas a cáncer que se dan en p53 tienen efectos funcionales y estructurales diversos y se localizan, principalmente, en el DBD. Principalmente, las más observadas son mutaciones esenciales que eliminan sitios de interacción con ADN y mutaciones que alteran la estructura del DBD, comprometiendo la estabilidad cinética y termodinámica del dominio. Es decir, mutaciones en cualquiera de los tres residuos clave de arginina en la zona de enlace p53DNA -Arg248, Arg273 o Arg280- resulta en una unión deficiente a ADN por parte de p53 y en una pérdida de actividad transcripcional (Dearth et al., 2007). Las llamadas mutaciones de contacto, aquellas que interfieren directamente en la unión al ADN, como por ejemplo, R273C y R273H eliminan un grupo guanidinio que forma enlaces importantes con la cadena de ADN en el centro de la interacción p53-DNA, sin afectar prácticamente a la estructura general o la estabilidad del DBD (Eldar et al., 2013). En el caso de R248W, la mutación no solo elimina una cadena lateral que interactúa, sino que también bloquea directamente la unión al ADN mediante la introducción de una cadena lateral hidrofóbica grande. Los efectos de las mutaciones estructurales sobre la estabilidad y la actividad de unión al ADN dependen de la ubicación en la que se dé y del tipo de mutación (Joerger and Fersht, 2007). Debido a la baja estabilidad intrínseca de su DBD, que se desnaturaliza a 44-45° C, p53 es muy susceptible a la inactivación por mutaciones que comprometan esa estabilidad estructural, y es por eso que formas mutada de p53 se encuentran en sus formas no plegadas a temperatura corporal (Bullock et al., 2000). Las sustituciones de aminoácidos grandes por otros más pequeños son altamente desestabilizantes. En el caso de V143A 17 y F270L, por ejemplo, crean cavidades internas en el núcleo hidrofóbico del sándwich β, pero a pesar de la pérdida de interacciones hidrofóbicas, retienen todas las características estructurales de la proteína silvestre en su estado plegado (Joerger et al., 2006). Y220C es otra forma mutada de p53 resultado de la sustitución de aminoácidos grande por otro más pequeño, que también presenta pérdida de interacciones hidrofóbicas. Pero en este caso la zona afectada se encuentra a nivel superficial en lugar de una cavidad interna. Por el contrario, en la mutación V157F, donde se sustituye a una valina por un residuo de fenilalanina mucho más grande, se produce un plegamiento del núcleo hidrofóbico del DBD, energéticamente desfavorable, en la zona donde se produce la mutación. En el caso de la mutación R282W, se desestabiliza el DBD al verse interrumpida la red de enlaces hidrógeno que se forman entre dos hélices que se conectan entre sí formando un giro (Joerger et al., 2006). La característica común de estas formas de p53 mutadas a nivel estructural es que se desestabilizan a partir de 3-4 kcal/mol, lo que corresponde a una temperatura de desnaturalización de aproximadamente 5-7° C más baja que la p53 silvestre, aunque conservan las características estructurales generales del DBD de la proteína silvestre en su estado plegado, especialmente los sitios funcionales. Lo que da como resultado fenotipos sensibles a la temperatura. Es por esto que se inactivan a 37° C, pero muestran actividad transcripcional por debajo de temperaturas fisiológicas, es decir, a temperaturas a las que las formas mutada de la proteína no están desnaturalizadas (Dearth et al., 2007). Como hablaremos más adelante, las formas mutadas de p53 suponen una diana terapéutica de gran importancia en el tratamiento del cáncer, ya que el objetivo será restablecer la actividad normal de la proteína mediante estabilizadores moleculares. Sin embargo, muchas mutaciones estructurales en la superficie de unión al ADN no están asociadas con fenotipos sensibles a la temperatura ya que, además de desestabilizar la proteína, también inducen cambios estructurales locales que afectan a la unión con el ADN en el estado plegado. La interrupción de la red de enlace en la Arg249 por mutación a serina en el mutante R249S, por ejemplo, perturba la conformación de horquilla en L3 que es crucial para el correcto posicionamiento de la Arg248, residuo de contacto con el ADN (Suad et al., 2009). Por otro lado, las mutaciones que resultan en la pérdida de zinc son particularmente nocivas, ya que provocan la desestabilización del DBD con sólo 3 kcal/mol e impide la 18 unión al ADN, porque la unión del zinc es crucial para la integridad estructural de la región L2-L3, que interactúa con elementos de respuesta del surco menor del ADN (Bullock et al., 2000). Estas mutaciones afectan directamente a cualquiera de los ligandos de zinc, como las mutaciones C176F, H179R, C238Y y C242S, o residuos en las inmediaciones de interacción del zinc, como en el caso de la mutación más frecuente en cáncer, R175H (Figura 4). La sustitución de Arg175 por una histidina no sólo interrumpe el puente salino con Asp184, sino que también altera la esfera de coordinación del zinc, lo que resulta en una afinidad de unión al zinc drásticamente reducida y despliegue global a temperatura corporal (Yu et al., 2014). La mutación R175H da lugar a un fenotipo no sensible a la temperatura. Por el contrario, una mutación que sustituya la arginina por un aminoácido con una cadena lateral más pequeña que la histidina es mucho menos perjudicial para la función de p53. La mutación R175A, por ejemplo, solo tiene una leve desestabilización in vitro y la mutación R175C apenas tiene un efecto sobre la actividad transcripcional de p53, lo que sugiere que en estos dos casos hablaríamos de mutaciones pasajeras, en lugar de mutaciones conductoras (Leroy et al., 2014). Figura 4. Esfera de coordinación del zinc con p53 (Tomada de Petitjean et al., 2007) 19 4.1.5'AGREGACIÓN'DE'P53.' Por otro lado, ya se vio que los agregados de p53 eran, probablemente, incluso más importante que la inestabilidad termodinámica de las formas mutadas (Kraiss et al., 1991). La inactivación de p53 y sus mutantes in vitro se da rápidamente a temperaturas por debajo de la temperatura de desnaturalización. El DBD se despliega y luego se agrega irreversiblemente (Friedler et al., 2003), dando lugar a diversas morfologías, incluyendo amorfas, fibrilares y priónicas, dependiendo de las condiciones experimentales (Ano Bom et al., 2012). Recientemente se observó que un péptido, que penetra en las células, diseñado para bloquear la secuencia amiloidogénica en el DBD, ha demostrado restaurar la función supresora de tumores de p53 en el cáncer de óvulo (Soragni et al., 2016). Además, también se han observado que moléculas estabilizadoras de la proteína de las que hablaremos a continuación han evitado que se produzca esta agregación. Aun así, es importante tener en cuenta que la eficacia de cada estrategia depende del contexto y no resultan igual de prometedoras para todos los casos. 4.2 ESTRATEGIAS'TERAPÉUTICAS'PARA'EL'TRATAMIENTO'DEL'CÁNCER' Una vez conocidas las principales alteraciones que se observan en la proteína p53 mutada y se ha establecido su relación con diferentes procesos tumorales, podemos estudiar diferentes estrategias cuyas dianas sean estas alteraciones descritas, con el objetivo de recuperar las funciones perdidas de la proteína. '4.2.1'MOLÉCULAS'QUE'ESTABILIZAN'P53.' En este caso, la idea es usar moléculas que al unirse a la proteína estabilicen su conformación activa y esto se puede conseguir mediante dos estrategias principales: diseñar el fármaco de manera que su diana sea un sitio de unión presente en la superficie tanto de la p53 silvestre como de la mutada, o que la diana del fármaco se 20 una a una región específica, propia del mutante en concreto. La primera estrategia propuesta es un reto, debido a la ausencia de bolsillos de unión bien definidos en el DBD. Se ha visto que, por ejemplo, FL-CDB3, un péptido de nueve residuos marcado con fluoresceína derivado de la proteína de unión a p53 53BP2, se une y estabiliza a la p53 silvestre y a la mutante in vitro y aumenta la expresión de p53 en líneas celulares tumorales que presentaban p53 mutada. Además, se sugirió que podría haber una diana para moléculas estabilizadoras entre el giro L1 y la lámina beta S3 alrededor de la cisteína Cys12, localizada en el DBD. Como ejemplo de molécula que se une, tanto a la p53 silvestre como a la mutada, tenemos el ácido estíctico, el cual se comprobó que inducía la expresión de p21 in vitro en células tumorales humanas Saos-2 (mutación R175H) de una manera dosis-dependiente (Wassman et al., 2013). Por otro lado, para el caso de moléculas dirigidas específicamente a formas mutadas de p53 se debe destacar el mutante oncogénico Y220C, tratándose de la novena mutación de p53 más común en cáncer. La mutación que sustituye una tirosina por una cisteína resulta en una pérdida de interacciones hidrofóbicas, que desestabilizan la proteína con 4 kcal/mol, creando una grieta en la superficie de la misma que puede usarse como diana de moléculas estabilizadoras (figura 5) (Joerger et al., 2006). Es importante destacar que el sitio de mutación está lejos de las regiones funcionales de la proteína, minimizando así cualquier posible efecto inhibitorio de la unión. Mediante cribado y diseño virtual, se descubrió una molécula a base de carbazol, PhiKan083, que se une a esta grieta, aumentando la temperatura de desnaturalización del mutante y ralentizando así su velocidad de desnaturalización (Boeckler et al., 2008). Posteriormente, se identificaron una serie de estabilizadores de Y220C, estructural y químicamente diferentes, con modos de unión únicos en células tumorales humanas. También, la agregación se puede inhibir eficazmente en el caso de Y220C porque los ligandos diseñados que estabilizan la proteína también pueden ralentizar la cinética de agregación (Liu et al., 2013). La disponibilidad de estructuras cristalinas de alta resolución de numerosos complejos Y220C-ligando ha proporcionado información importante sobre la plasticidad estructural de la grieta superficial que se genera por la mutación, revelando un bolsillo hidrofóbico que se abre de forma transitoria, y que se modula mediante la Cys220 (Figura 5). De esta manera, se ha podido analizar con mayor profundidad los diferentes modos 21 en que interactúan proteína y ligando, proporcionando un marco para el diseño de ligandos más potentes (Joerger et al., 2015) Una de las estructuras principales, PK7088, es biológicamente activa en las células tumorales que albergan la mutación Y220C, aumentando los niveles de proteína mutante plegada en la conformación de la proteína silvestre y restaurando así sus funciones transcripcionales, además de inducir apoptosis dependiente de p53-Y220C (Liu et al., 2013). De esta manera, todos estos datos apoyan la idea de que restaurar la actividad transcripcional de p53 silvestre en sus formas mutadas mediante el diseño de moléculas que estabilicen estructuralmente dicha proteína mutada es una estrategia de terapia frente al cáncer prometedora. Figura 5. Mutante de p53 Y220C como diana de moléculas estabilizadoras. a) Entorno de la tirosina 220 en la superficie molecular de p53 silvestre señalada en amarillo. b) Superficie molecular del mutante Y220C con la molécula estabilizadora PhiKan083, donde se puede observar la grieta inducida por la mutación en la superficie de la proteína (Tomada de Boeckler et al. 2008). 4.2.2' RESTAURACIÓN' DE' LA' INTERACCIÓN' CON' ZINC' EN' LA' P53' MUTADA' MEDIANTE'METALOCHAPERONAS.' Sabemos que la actividad transcripcional de p53 depende de su interacción con zinc y ésta, a su vez, está determinada por el estado redox de la célula y de la biodisponibilidad del zinc. La pérdida de esta interacción puede dar lugar a un desplegamiento de la proteína, aunque también hay que tener en cuenta que un exceso de zinc puede provocar un plegamiento incorrecto y la consiguiente agregación de p53 (Butler and Loh, 28 suppressor gene by aminoglycosides. Nucleic Acids Res. 2011 Apr;39(8):3350–62. 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