Efecto de la restricción calórica crónica sobre la proteostasis y la inflamación en el hígado de rata

1 Marta Rodríguez García Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia 2 Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Grado en Farmacia TRABAJO FIN DE GRADO TFG experimental EFECTO DE LA RESTRICCIÓN CALÓRICA CRÓNICA SOBRE LA PROTEOSTASIS Y LA INFLAMACIÓN EN EL HÍGADO DE RATA Marta Rodríguez García Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Tutor: Diego Ruano Caballero Sevilla, 19 de julio de 2021 3 ÍNDICE 1. RESUMEN ................................................................................................................................ 4 2. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 5 2.1. UPR (Unfolded Protein Response) ................................................................................. 5 2.1.1. IRE1α ..................................................................................................................... 6 2.1.2. PERK ...................................................................................................................... 7 2.1.3. ATF6 ....................................................................................................................... 8 2.2. Autofagia ......................................................................................................................... 9 2.3. Factores tróficos ........................................................................................................... 12 2.4. Inflamación ................................................................................................................... 13 2.5. Restricción calórica ....................................................................................................... 14 3. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 15 4. METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 15 A. Modelo de experimentación ......................................................................................... 15 B. PCR ................................................................................................................................ 16 C. Análisis estadístico ........................................................................................................ 16 5. RESULTADOS ......................................................................................................................... 17 5.1. Efecto de la RC sobre los factores tróficos IGF-1 y BDNF ................................................. 17 5.2. Efecto de la RC sobre la proteostasis celular .................................................................... 18 5.2.1. Efecto de la RC sobre la chaperona HSP70 ..................................................................... 18 5.2.2. Efecto de la RC sobre la UPR ........................................................................................... 19 5.2.3. Efecto de la RC sobre la autofagia ................................................................................... 22 5.3. Efecto de la RC sobre la inflamación ................................................................................. 24 6. DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 25 7. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 30 8. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 31 4 1. RESUMEN La restricción calórica es una de las medidas más eficaces contra el envejecimiento y las patologías asociadas al mismo (cáncer, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas, etc.). Esta intervención alarga la esperanza de vida de numerosos organismos mediante la optimización del metabolismo y del estrés oxidativo. En este trabajo, para ver el efecto de la RC crónica, las ratas se someten a ella durante un periodo de tres meses y mediante la técnica de la PCR se estudia la expresión transcripcional de diferentes marcadores en los hepatocitos. Nos centramos en el estudio de la proteostasis (UPR y autofagia), los factores tróficos IFG-1 y BNDF, y de la inflamación, por medio de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α y IL-1β. Los valores obtenidos de expresión transcripcional de los marcadores de las ratas sometidas a RC son comparados con un grupo control de ratas alimentadas ad libitum. Nuestros resultados muestran una mejoría celular en cuanto a reprogramación metabólica para la optimización de recursos, así como una menor inflamación celular y una reducción de los factores tróficos de las ratas sometidas a RC con respecto a las ratas alimentadas ad libitum. Teniendo en cuenta la limitación del estudio en cuanto a número de animales y técnicas utilizadas, nuestros resultados apoyan la idea de que la RC es un método eficaz para prevenir determinadas patologías asociadas a la edad y para mejorar el estado celular general de los hepatocitos. Palabras clave: restricción calórica, proteostasis, factores tróficos, inflamación, hepatocitos. 5 2. INTRODUCCIÓN La restricción calórica (RC) es una medida eficaz para aumentar la esperanza de vida y proteger a las células frente a algunas enfermedades. Consiste en una limitación de la ingesta calórica de la dieta sin llegar a la malnutrición. Esta restricción va a minimizar o retrasar las alteraciones en la expresión genética relacionadas con el envejecimiento que afectan a la inflamación, fibrosis y estrés celular. En este trabajo se han estudiado diferentes marcadores de UPR, autofagia, factores tróficos y de la inflamación en hígado de rata para conocer a nivel molecular el efecto que tiene la RC sobre estos marcadores. 2.1. UPR (Unfolded Protein Response) El retículo endoplásmico (RE) es un orgánulo situado en el citoplasma de las células eucariotas que se encarga de varias funciones como son el almacenamiento de calcio, la síntesis de proteínas o el metabolismo lipídico (Chino y Mizushima, 2020). Cuando se produce un estrés del RE se pone en marcha un mecanismo de defensa llamado UPR. La UPR es un proceso que juega un papel muy importante en la restauración de la homeostasis de este orgánulo. Los errores en el plegamiento de las proteínas conducen a la acumulación de proteínas sin plegar o mal plegadas. Esto es lo que se conoce como estrés del RE (Oakes y Papa, 2015). En este proceso las llamadas chaperonas juegan un papel importante. Se trata de proteínas encargadas de ayudar y controlar el correcto plegamiento de las proteínas durante el proceso de síntesis, o de proteínas desnaturalizadas, así como su ensamblaje y transporte celular, y lo hacen uniéndose a ellas (Yoshida, 2007). La UPR se activa en respuesta al estrés de RE a través de tres proteínas transmembrana del RE, denominadas: IRE1α (Inositol-Requiring Enzyme 1α), PERK (Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase), y ATF6 (Activating Transcription Factor 6). Estos tres sensores contienen un dominio en el lumen del RE capaz de detectar directa o indirectamente grandes cantidades de proteínas mal plegadas o dañadas. Cuando lo detectan se realizan cambios en el estado de oligomerización conduciendo así a la activación (Senft y Ronai, 2015). 6 La proteína Grp78 o Proteína de unión (BiP) es una proteína de choque térmico de la familia de proteínas HSP70. Su expresión está relacionada con la actividad del RE, por lo que aumenta en caso de estrés reticular. En condiciones normales, la proteína Grp78 se encuentra unida a las 3 proteínas sensores IRE1α, ATF6 y PERK manteniéndolas inhibidas. Cuando aumenta la concentración de proteínas mal plegadas en el RE, Grp78 se desplaza desde los sensores hacia estas proteínas mal plegadas gracias a su afinidad, produciendo la activación de las 3 vías de señalización (Hendershot et al., 2019). Inicialmente, la activación de estos tres sensores va a permitir la adaptación a la nueva situación de estrés celular, aumentando la capacidad de plegamiento de proteínas, así como la transcripción de chaperonas. Al mismo tiempo, aumenta la transcripción de enzimas que intervienen en la degradación de las proteínas mal plegadas en un proceso conocido como degradación de proteínas asociada al RE (ERAD). La activación de cada proteína sensora va a dar lugar a la activación de tres vías diferentes de señalización que se resumen a continuación. 2.1.1. IRE1α La activación de IRE1α se inicia con la separación de la chaperona Grp78 de esta proteína. Esto permite que dos moléculas de IRE1α dimericen y se fosforilen de manera recíproca, activando así sus actividades quinasa y endonucleasa. El dominio endonucleasa va a catalizar el procesamiento de un ARNm mediante un proceso de splicing no canónico, citosólico, dando lugar a un ARNm que codifica para un factor de transcripción llamado Xbp1s. Este se transloca al núcleo y estimula la transcripción de genes implicados tanto en la ERAD como de chaperonas. La activación de esta rama de la vía IRE1α se asocia con una respuesta antiapoptótica (Liu et al., 2019). Por otro lado, IRE1α también media la activación de JNK (Quinasas c-Jun N-terminal) y NF-Kβ (factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas) por medio del factor 2 asociado al receptor de TNF (TRAF2) y la quinasa 1 reguladora de la señal de apoptosis (MAP3K5/ASK1). También regula la expresión génica mediante la desintegración de ARNm a través de RIDD. La activación de esta rama se asocia con una respuesta proapoptótica (Liu et al., 2019). 7 Figura 1. Vía de señalización IRE1α (Galluzzi et al., 2017). 2.1.2. PERK Al igual que pasa con IRE1α, la disociación de la chaperona Grp78 permite la dimerización y fosforilación recíproca de ambas moléculas de PERK, activándose el dominio quinasa. PERK activo fosforila al factor de elongación eucariótico de la síntesis de proteínas 2 alfa (eIF2α) que se encarga de detener la traducción para evitar la formación de nuevas proteínas, reduciendo así la carga de proteínas. Esta fosforilación está regulada por las fosfatasas GADD34 (proteína inducible por daño al ADN) y CReP (represor constitutivo de la fosforilación de eIF2α). Ambos interaccionan con la proteína fosfatasa 1 (PP1) que desfosforila a eIF2α (Verfaillie et al., 2012). Curiosamente, en estas circunstancias se estimula la transcripción y traducción de ciertas proteínas que median la respuesta de PERK. Entre ellas cabe destacar al factor de transcripción ATF4 que promueve la adaptación del RE al estrés mediante la activación de genes implicados en respuestas antioxidantes y síntesis de aminoácidos. Además, ATF4 activa la transcripción de otro factor transcripcional denominado CHOP, que tiene un claro perfil pro-apoptótico en respuesta al estrés de RE. Por lo tanto, la activación de esta vía se asocia mayoritariamente con una respuesta pro-apoptótica (Liu et al., 2019). 8 Figura 2. Vía de señalización PERK (Galluzzi et al., 2017). 2.1.3. ATF6 La activación de este sensor es diferente a la de IRE1α y PERK. En este caso la disociación de la chaperona Grp78 permite la translocación de ATF6 al aparato de Golgi donde es procesado por dos proteasas. La serina proteasa S1P y la metaloproteasa S2P dando lugar a un factor de transcripción denominado ATF6N (fragmento citosólico N terminal). Este factor se transloca al núcleo para regular la expresión de genes que intervienen en la respuesta al estrés del RE como sXBP1, CHOP y Grp78. Además, ATF6N forma un heterodímero con sXBP1 para activar genes implicados en la ERAD. En general, la activación de esta vía se asocia con una respuesta anti-apoptótica (Schwarz y Blower, 2016). En definitiva, la activación adecuada de las tres vías, en intensidad y temporalidad, permitirá dar una respuesta global adaptada a la intensidad del estrés de RE. Como se ha comentado, las tres vías se asocian con un mayor o menor perfil anti- o pro-apoptótico. Mientras que las ramas de IRE1α y ATF6 tienen un carácter predominantemente anti-apoptótico, la vía de PERK se asocia a un perfil más pro-apoptótico. 9 Figura 3. Vía de señalización ATF6 (Lee et al., 2020). 2.2. Autofagia La autofagia es una respuesta catabólica de las células activada en respuesta al estrés. Está activa a nivel basal en las células, y se puede incrementar su actividad en respuesta a varios tipos de estrés que perturban la homeostasis celular, tales como bajos niveles de ATP, escasez de nutrientes, acumulación de proteínas, daños de orgánulos celulares, etc. (Glick et al., 2010). Además, el estrés del RE aumenta la actividad autofágica de la célula a través de la UPR, y el RE es una fuente de membranas para la formación de vesículas fagocíticas, llamados autofagosomas. Cuando se fusionen con los lisosomas se producirán los autofagolisosomas en cuyo interior se produce la degradación del contenido. Este tipo de autofagia se conoce como macroautofagia o autofagia. Existen también otros tipos de autofagia como son la microautofagia y la autofagia mediada por chaperonas. En la primera el contenido se introduce en el lisosoma a través de invaginaciones de la membrana mientras que en la segunda el contenido se introduce a gracias a un transportador localizado en la membrana y es específica para proteínas que contienen la secuencia degrón KFERQ (Galluzzi et al., 2017). 16 B. PCR La técnica de la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) a tiempo real (qPCR) permite amplificar fragmentos de ADN con una gran sensibilidad y cuantificar el producto amplificado. La PCR cuantitativa se realizó mediante el uso de fluorocromos inespecíficos, y sondas específicas. Fluorocromos inespecíficos, SYBR Green. Este compuesto se acopla a los ácidos nucleicos de la doble hélice del ADN lo que produce una emisión fluorescente que nos permite la cuantificación de ADN de doble hélice. Cuanto mayor cantidad de producto amplificado mayor fluorescencia (Prole et al., 2020). Sondas específicas que permiten detectar un producto de PCR específico. Es una sonda de oligonucleótidos con un fluorescente en el extremo 5’ y un supresor en el extremo 3’. Cuando la sonda está intacta la emisión de fluorescencia está notablemente reducida, pero conforme la ADN polimerasa amplifica, se van a separar los extremos proporcionando un aumento de la señal. En cada ciclo los colorantes se van a separar de sus sondas produciendo una intensidad de señal proporcional a la cantidad de amplicones (Parida et al., 2008). C. Análisis estadístico Los datos se muestran como la media ± la desviación estándar. El análisis estadístico de los datos se realizó comparando los valores de los datos del grupo control (animales alimentados ad libitum, n=4) versus los animales sometidos a RC (n=4). La significación estadística se realizó aplicando el test de la t-de Student. Un valor de p < 0.05, se considera significativamente diferente. 17 5. RESULTADOS 5.1. Efecto de la RC sobre los factores tróficos IGF-1 y BDNF En primer lugar, analizamos el efecto de la RC sobre la expresión de IGF-1, puesto que está descrito que la RC disminuye la expresión de este factor trófico (Anisimov y Bartke, 2013; Redman et al., 2010). Por lo tanto, esta medida nos sirvió para comprobar si nuestro modelo de RC estaba funcionando. Como se ve en la Figura 5, la expresión de IGF-1 disminuyó en el hígado de los animales sometidos a RC en comparación con los alimentados ad libitum, lo que indica que el efecto de la RC se manifiesta a nivel hepático en nuestro modelo. Igualmente, analizamos la expresión del factor BDNF, el cual ha sido muy caracterizado en cerebro, como factor trófico, pero que recientemente ha sido descrito un papel relevante sobre el metabolismo hepático (Genzer et al., 2017). Como se muestra en la Figura 6 la RC también disminuyó la expresión hepática de BDNF. Figura 5. Efecto de la RC sobre la expresión transcripcional de IGF1. La RC disminuyó la expresión hepática de IGF-1 en comparación con los animales alimentados ad libitum. p=0.336. IGF1 Unidades relativas 0 1000 2000 3000 4000 AL RC 18 BDNF Unidades relativas 0 5 10 15 20 25 30 AL RC Figura 6. Efecto de la RC sobre BNDF. La RC disminuyó la expresión hepática de BDNF en comparación con los animales alimentados ad libitum. p=0.240. 5.2. Efecto de la RC sobre la proteostasis celular 5.2.1. Efecto de la RC sobre la chaperona HSP70 La proteostasis celular (homeostasis proteica) es el resultado de la acción conjunta de los sistemas implicados en la síntesis y degradación de proteínas. En este proceso juegan un papel relevante las chaperonas, proteínas implicadas en la biología de las proteínas desde su síntesis y plegamiento, hasta la degradación de las mismas. Es por ello que en primer lugar analizamos el efecto de la RC sobre la expresión transcripcional de la chaperona HSP70, la chaperona celular más abundante (Fernández-Fernández y Valpuesta, 2018). Como se muestra en la Figura 7, la RC disminuyó de manera significativa la expresión de esta proteína. Puesto que un aumento transcripcional de la expresión de chaperonas en general, y de HSP70 en particular, se produce en respuesta al aumento del estrés proteico, este resultado podría sugerir que la RC reduce el estrés proteico basal. 19 Figura 7. Efecto de la RC sobre la expresión de la chaperona HSP70. La RC redujo de manera significativa la expresión de esta proteína en el hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.038. 5.2.2. Efecto de la RC sobre la UPR Como se ha comentado anteriormente, el RE es un orgánulo con numerosas funciones imprescindible para la supervivencia celular y un estrés de este, producido por errores en el plegamiento de las proteínas, o la acumulación de proteínas mal plegadas, va a poner en marcha a la UPR para restaurar la proteostasis. El resultado mostrado anteriormente parece sugerir una disminución del estrés proteico basal, es por ello que analizamos la expresión de marcadores de la UPR para profundizar más en este aspecto. En primer lugar, analizamos la expresión de la proteína GRP78/Bip como marcador de la vía de ATF6. Como se muestra en la Figura 8, la RC no modificó la expresión de GRP78/Bip. Esta proteína juega un papel principal en la activación de la UPR puesto que su activación y separación de IRE1, PERK y ATF6 conlleva la activación de las tres vías de señalización. Por lo tanto, este resultado sugiere que la RC no produce estrés del retículo. HSP70 Unidades relativas 0 20 40 60 80 100 120 AL RC * 20 Figura 8. Efecto de la RC sobre la expresión de la chaperona Grp78/Bip. La RC no modificó la expresión de esta proteína en el hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.711. Otro marcador importante en la vía de IRE1 es el factor de transcripción sXBP1. Este factor transcripcional va a estimular la ERAD y a la transcripción de chaperonas (Liu et al., 2019). En este caso, los resultados demuestran que la RC aumentó de manera significativa la cantidad de sXBP1 con respecto a las ratas alimentadas ad libitum (Figura 9), sugiriendo que la RC activa a la vía de IRE1α. GRP78 Unidades relativas 0 20 40 60 80 AL RC sXBP1 Unidades relativas 0 3 6 9 12 15 AL RC * 21 Figura 9. Efecto de la RC sobre la expresión del factor de transcripción sXBP1. La RC aumentó al doble la cantidad de sXBP1 en el hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.044. Por último, analizamos la expresión transcripcional del factor de transcripción CHOP, como marcador de la vía de PERK. Como se observa en la Figura 10, la RC no modificó el nivel de expresión de CHOP, sugiriendo la no activación de la vía de PERK. Figura 10. Efecto de la RC sobre la expresión del factor de transcripción CHOP. La RC no modificó la expresión del factor transcripcional CHOP en el hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.94. En resumen, estos resultados sugieren que la RC produce una estimulación no canónica de la UPR con una activación específica de la vía de IRE1, y en concreto de la rama IRE1-sXBP1. Como se comentó anteriormente, la vía de IRE1 tiene un componente anti-apoptótico en contraposición con la vía de PERK, que presenta un carácter más pro-apoptótico. En este sentido, como se muestra en la Figura 11, la RC aumentó de manera significativa la razón CHOP Unidades relativas 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 AL RC 22 hepática de sXBP1/CHOP con respecto a las ratas alimentadas ad libitum, sugiriendo un predominio de la rama anti-apoptótica sobre la rama pro-apoptótica, lo que podría indicar una mejora en la resistencia al estrés celular basal en general, lo que apoyaría la idea de un menor estrés proteico basal. Figura 11. Efecto de la restricción calórica sobre la razón del factor de supervivencia sXBP1 y el factor pro-apoptótico CHOP. La RC aumentó más del doble la razón hepática sXBP1/CHOP en hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.00025. 5.2.3. Efecto de la RC sobre la autofagia Otro parámetro que evaluamos fue el estado general de la autofagia hepática en respuesta a la RC. Para ello analizamos la expresión de 3 marcadores específicos de la autofagia como son p62, BAG3 y ATG7. Como se puede ver en las Figuras 12, 13 y 14, la RC disminuyó de manera significativa la expresión de p62, pero no la de BAG3 y ATG7, respectivamente. Estos resultados sugerirían que la RC atenúa la actividad autofágica hepática. sXBP1/CHOP Unidades relativas 0 20 40 60 80 100 AL RC * 23 Figura 12. Efecto de la restricción calórica sobre la expresión transcripcional de p62. La RC disminuyó la expresión transcripcional de p62 en el hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.035. Figura 13. Efecto de la restricción calórica sobre sobre la expresión transcripcional de BAG3. La RC disminuyó la expresión transcripcional de BAG3 en el hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.219. BAG3 Unidades relativas 0 3 6 9 12 AL RC P62 Unidades relativas 0 20 40 60 80 100 AL RC * 24 Figura 14. Efecto de la restricción calórica sobre sobre la expresión transcripcional de ATG7. La RC disminuyó la expresión transcripcional de ATG7 en el hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.168. 5.3. Efecto de la RC sobre la inflamación Por último, también evaluamos el efecto que produce la RC sobre el estado de inflamación hepática basal. Para ello analizamos la expresión transcripcional de dos citocinas proinflamatorias como son TNF- e IL-1. Como se muestra en las Figuras 15 y 16, nuestro modelo de RC disminuyó la expresión de ambos mediadores inflamatorios, siendo significativa para IL-1, con respecto a los animales alimentados ad libitum, lo que sugiere que la RC produce una atenuación de la inflamación hepática basal. ATG7 Unidades relativas 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 AL RC TNF-alfa Unidades relativas 0 4 8 12 16 20 AL RC 25 Figura 15. Efecto de la RC sobre la expresión transcripcional de TNF-α. La RC disminuyó la expresión transcripcional de TNF-α en el hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.306. Figura 16. Efecto de la RC sobre la expresión transcripcional de IL-1β. La RC disminuyó la expresión transcripcional de IL-1β en el hígado de ratas sometidas a RC en comparación con las ratas alimentadas ad libitum. p=0.017. 6. DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en este trabajo nos demuestran que nuestro modelo de RC produce una atenuación general de la expresión transcripcional de los marcadores analizados, lo que sugiere que la RC puede alterar el perfil epigenético de los hepatocitos (ver Tabla 1). En este sentido, diferentes modelos de RC han puesto de manifiesto la existencia de reprogramación epigenética a largo plazo, en diferentes genes relacionados con la inflamación y el control metabólico, en diferentes tejidos y modelos animales (Hernández-Saavedra et al., 2019). Por lo tanto, un primer punto muy importante a tener en cuenta es que la ingesta calórica deja una huella a nivel molecular en nuestras células. IL-1beta Unidades relativas 0 2 4 6 8 10 AL RC * 32 14. Furman D, Campisi J, Verdin E, Carrera-Bastos P, Targ S, Franceschi C, et al. Chronic inflammation in the etiology of disease across the life span. Nat Med. 2019;25(12):1822- 1832. 15. 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