Efectos de la ranitidina sobre células parietales en regeneración : Estudio estereológico

Re . Esp. En . Diges ., 78, 6 (335-340), 1990 Uni e sidad de Se illa. Hospi al «In an a Elena». Se illa. Facul ad de Biología. Depa amen o de Biología Celula . E ec os de la ani idina sob e células pa ie ales en egene ación. Es udio es e eológico To eblanca López, J.; lbáñez Delgado, F.*; López-Campos, J. L.**, y Mo eno Ono a o, F. J. SUMMARY In his wo k, we ha e ca ied ou a s e eological and mo phological s udy in o de o e i y he e ec s o Rani idine on egene a ing pa ie al cells. We ha e used a con ol g oup and ope a ed o non-ope a ed g oups ea ed wi h 2, 10 and 50 mg/kglday Rani idi- ne. In ope a ed g oups an ulce was p o oked by cau- e iza ion wi h a me allic pla e in he gas ic undus. G oups ea ed wi h high doses o Rani idine sho- wed an inc ease in he connec i e issue o he gas- lc mucosa. The s e eological s udy in ea ed g oups shows a dec ease in he pa ie al oiume densi y, and an inc ease in he cellula p o ile. Changes de ec ed in he pa ie al olume densi y would o igina e a de- c ease in he p oduc ion o CIH. KEY WORDS: Rani idine, pa ie al cell, s e eologi- cal s udy. To eblanca López, J.; lbáñez Delgado, F.; López-Cam- pos, J. L., y Mo eno Ono a o, F. J. Rani idine e ec s on e- g~ne a ing_pa ie al cells. A s e eological s udy. Re Esp En D1ges , 1990, 78, 6, 335-340. RESUMEN Pa a comp oba la acción de la ani idina sob e células pa- ie ales en egene ación hemos ealizado un es udio mo o- lógico y es e eológico. Pa a ello u ilizamos g upos con oles y de a amien o con el á maco a dosis de dos, 10 y 50 mg!kg/día, ope ados y no ope ados. En los g upos ope- ados se ealizó una úlce a po cau e ización median e una pla ina me álica a ni el de undus gás ico. * Hospi al «In an a Elena». •• Depa amen o de Ciencias Mo ológicas. Uni e sidad de Se- illa. Mo ológicamen e los animales bajo la acción del á maco o ecie on un aumen o del componen e conec i o de la mu- cosa úndica a las mayo es dosis u ilizadas. El es udio es e- eológico en los g upos de a amien o mues a un descenso en la densidad de olumen de células pa ie ales di ec amen- e p opo cional a la dosis u ilizada, es e descenso a apa e- jado a un aumen o del á ea celula . La disminución de la densidad de olumen de células pa ie ales pod ía p o oca un descenso en la p oducción de CIH, y, po an o explica- ía, en pa e, la e icacia de es e á maco en el a amien o de la úlce a gás ica en egene ación. PAlABRAS CLAVE: Rani idina, célula pa ie al, es udio es e eológico. INTRODUCCION La in eg idad de la mucosa gás ica es esul ado de un equilib io en e los ac o es ag esi os, ep esen ados po el ácido clo híd ico y la pepsina undamen almen e, y los ac- o es de ensi os elacionados con la p opia es uc u a de la mucosa gás ica. El mejo conocimien o de las bases isiopa ológicas de la célula pa ie al ha pe mi ido la ob ención de nue os á ma- cos, que pueden ac ua a dis in os ni eles de la misma: a) Bloqueando los ecep o es de la célula pa ie al. b) Regulando a los mensaje os in acelula es (Ca++, AMPc, calmodulina, sis ema edox). e) Bloqueando la sec eción de H+ a ni el del polo api- cal de la célula pa ie al. Hoy son bien conocidos los di e en es ecep o es de la cé- lula pa ie al ( ecep o es de ace ilcolina, his amina H, y gas- ina); di e en es au o es indican que pueden exis i ecep- o es pa a o os ipos de pép idos, ales como B2 simpa ico- mimé icos y opiáceos (1-6). La his amina iene un luga cen al en la egulación de la sec eción de ácido clo híd ico. La gas ina, que es el media- 336 (20) J. ToTTeblanca López y cols. do p incipal de la sec eción ácida es imulada po la inges- a, puede media odos sus e ec os po medio de la libe a- ción de his amina de la célula ECL, sob e la que la gas ina iene un e ec o ó ico especí ico. De es a mane a, la célula pa ie al puede ene dos ecep o es es imulado es, el de his- amina y el de ace ilcolina (7-9). Los an agonis as de los ecep o es H, son en la ac uali- dad uno de los á macos de elección en el a amien o del ulcus gas oduodenal. La ani idina es un á maco an ago- nis a de Jos ecep o es H2; posee un adical u ano aminoal- quilo de una po encia en e cinco y 10 eces supe io a Ja cime idina, y meno es e ec os secunda ios e in e acción con o as d ogas. P oduce, po an o, una mayo inhibición de la sec eción ácida gás ica basal, es imulada y noc u na; ha- biéndoseles a ibuido un e ec o ci op o ec o (10-14). Su e i- cacia clínica es á ampliamen e documen ada como a a- mien o médico, así como en compa ación con el a amien- o qui ú gico (15-17). Como ha sido es ablecido po di e sos au o es, exis e una es echa elación en e el núme o de células pa ie ales y la sec eción ácida gás ica (18-20). Po an o, al igual que en nues o an e io es udio ealizado con el á maco pi enze- pina (21 ), nues o obje i o ha sido el ealiza un abajo ~x pe imen al, a mic oscopia óp ica, es ableciendo los cambios es e eológicos que pudie an indica un descenso en la p o- ducción de ClH de la mucosa gás ica de a as. Pa a ello, a los animales expe imen ales se les p odujo una úlce a po cau e ización a ni el del undus, siendo a adas con di e- en es dosis de ani idina. Las al e aciones mo ológicas ya ue on desc i as en nues o an e io abajo (21), po lo que no se inco po a en es e ma e ial o og á ico (a excepción de una o og a ía de la malla u ilizada pa a el es udio es- e eológico ). MATERIAL Y METODOS En nues o es udio expe imen al hemos u ilizado a as macho de la aza Sp ague-Dawley de una misma camada, con peso medio en e 225 y 275 g amos y edad de unos dos- es meses, siendo dis ibuidas en di e en es g upos. G upo con ol ope ado (CO), g upo no ope ado (CNO), g upos de a amien o con ani idina a dis in as dosis, ope ados y no ope ados. La dis ibución de los dis in os g upos es la siguien e: CO: Ope ados (n = 6). Dosis 1 mi solución salina. CNO: No ope ados (n = 6). Dosis 1 mi solución salina. G upos ani idina: l. Ope ados (n = 6). Dosis de 2 mg/kg/día. Il. Ope ados (n = 6). Dosis de 10 mg/kg/día. III. Ope ados (n = 6). Dosis de 50 mg/kg/día. IV. No ope ados (n = 6). Dosis de 2 mg/kg/día. V. No ope ados (n = 6). Dosis de 10 mg/kg/día. VI. No ope ados (n = 6). Dosis de 50 mg/kg/día. Los animales ue on c iados y man enidos en labo a o io con idén icas condiciones ambien ales, en jaulas habi uales con suelo de malla me álica pa a e i a la cop o agia, die a es ánda y agua lib e. Re . Esp. En Diges . Diciemb e 1990 A los g upos con oles se les adminis ó dia iamen e, en- e las ca o ce y diecisiéis ho as, 1 mi de solución salina a a- és de una sonda in agás ica; de igual mane a, a los g u- pos a ados con ani idina se les adminis a on las di e en- es dosis an e io men e expues as disuel as en 1 mi de solu- ción salina. En los g upos ope ados, as ein icua o ho as de ayuno con acceso lib e al agua has a ocho ho as an es a la in e - ención, se p ocedió a una anes esia in ape i oneal con hi- d a o de clo al al 35% (0,1 ml/100 mg de peso) pos e io - men e se p ac icó lapa o omía media con ex e io ización del es ómago glandula a a és del no glandula , p e ia inci- sión in e io a la hendidu a gás ica, de e minándose una zo- na es anda izada a ni el de la cu adu a mayo del undus. En es a zona se p oducía una úlce a po cau e ización apli- cando, du an e un minu o, una pla ina me álica de 1,5 cm de diáme o calen ada a 70º C. T as no en a días de a amien o odos los animales ue- on anes esiados y se p ocedió a la ape u a de ó ax y ab- domen, canulándose la ao a a a és del en ículo izquie - do y comenzando una pe usión con sue o isiológico a 25 mi/minu o du an e cinco minu os; pa a e i a el apona- mien o ca diaco y pe mi i la ex a asación de la sang e se p ocedía a la ape u a de la au ícula de echa. Una ez que el es ómago mos aba sus asos sin sang e se con inuaba con la ijación, median e una solución p epa- ada en ese momen o y compues a po pa a o maldehído al 3% y glu a aldehído al 2,5% en ampón cacodila o sódico 0,1 M a pH 7,2. T as diez minu os de ijación el es óma- go e a ex aído y colocado sob e una placa de Pe i, ab ién- dose po la cu adu a meno pa a no in e e i sob e la zo- na ulce ada. Iden i icada es a zona o bien una zona ana ó- mica simila en los no ope ados, se p ocedió al oceado en agmen os de, ap oximadamen e, 1 mm. Es as piezas se i- ja on du an e es ho as y pos e io men e ue on la adas en ampón cacodila o sódico 0,1 M pH 7,2 con saca osa al 7 5% man eniéndolas du an e ein icua o ho as a 4º C. Pos ~ io men e ue on pos ijadas du an e dos ho as con e- óxido de osmio (Os04) al 1% en ampón cacodila o sódi- co. A con inuación se la a en el mismo ampón siguiéndose con el p oceso de deshid a ación en ace onas de concen a- ciones c ecien es pa a ealiza , po úl imo, la inclusión en esina. El es udio a mic oscopia óp ica ue ealizado sob e sec- ciones de 0,5 µm ob enidas en un ul amic o omo LKB III y eñidas con azul de olouidina. Las di e en es o og a ías se ob u ie on en un o omic oscopio Ca ! Zeiss U. El es u- dio es e eológico se ealizó siguiendo el mé odo de con aje de pun os desc i o po Weibel (22). Pa a e i a que la a- iabilidad de la célula pa ie al a lo la go de la glándula pu- diese enmasca a los e ec os de la ani idina, se escogie on 10 o og a ías del «cuello» de la glándula (18 x 24 cm) al aza po g upo, con un aumen o inal de x 1.200, sob e las que se colocaba una lámina de plás ico anspa en e (18 x 24 cm) con líneas ho izon ales y e icales en ec uza- das, delineando una malla cuad ada de 0,5 cm de lado po cuad ícula; las in e secciones en e las líneas e icales y ho- izon ales (1.813 en oda la malla, equi alen e a más de Volumen 78 Núme o 6 FIG. 1.-La imagen mues a la malla de plás ico, de 0,5 cm de dis- ancia en e las in e secciones, sob e una o og a ía de la zona del cue- llo de la mucosa. La lecha indica una de las in e secciones sob e una célula pu ie al. La supe icie conside ada en el es udio es e eológico es cua o eces mayo a la que se obse a. Fo og a ía mucosa 1.200 x malla 1 x. 60.000 pun os po milíme o cuad ado de sección eal) e an usadas como pun os es ( ig. 1). De e minamos una se ie de pa áme os, como la densi- dad de olumen de di e en es es uc u as (células pa ie ales y núcleos) median e la ó mula V = Po/P , siendo Po la me- dia de pun os con ados sob e cada una de es as es uc u as y P la media de pun os del ma co de e e encia (mucosa o célula pa ie al, espec i amen e). Pa a el cálculo del á ea ce- lula y nuclea u ilizamos la ó mula A= Pm x Ap/A , sien- do Pm la media de pun os con ados sob e célula pa ie al o núcleo (dependiendo del á ea a halla ), Ap el á ea co es- pondien e a un pun o del sis ema de análisis u ilizado en µm 2 y A el aumen o inal de las o og a ías es udiadas. Las di e encias en e los alo es de los dis in os pa áme- os es udiados en los g upos con oles y de a amien o ue- on analizados median e el es de S uden -Fishe , y ue- on conside adas como signi ica i as pa a p<0,01. E ec os de la ani idina sob e células pa ie ales (21) 337 RESULTADOS Mac oscópicamen e, el aspec o de la mucosa gás ica e a simila en odos los g upos. Sólo en a as, a las que se le ha- bía p oducido la úlce a, se obse aba una zona le emen e en ojecida, que con as aba con la palidez del á ea ci cun- dan e, en ella se habían pe dido los Ld ac e ís icos pliegues mucosos. G upos con oles La obse ación a mic oscopia óp ica de los g upos con- oles mos ó una cla a di e encia en e ellos; así, el no ope- ado no p esen aba ninguna al e ación debida al sondaje in- agás ico, apa eciendo la mucosa con un aspec o compac- o y homogéneo. Po el con a io, el con ol ope ado enía muy dila ada la lámina p opia, p oducida po mecanismos de asodila ación y edema más acen uado a ni el del ondo de la glándula. Po lo que se e ie e a los alo es mo omé icos y es e- eológicos debemos de des aca la uni o midad en el ama- ño de células y núcleos, y el descenso en la densidad de o- lumen de células pa ie ales de la mucosa en el CO con es- pec o al CNO ( e ablas). G upos a ados con ani idina Ope ados Es os g upos mos a on di e encias con espec o a su con- ol. Mo ológicamen e, el g upo de dosis mínima (g upo 1) p esen ó un aspec o más simila al del Con ol no ope ado (CNO) que al del con ol ope ado (CO), pues en la mucosa no obse ábamos mecanismos conges i os ni de edema, ca- ac e ís icas p esen es en la lámina p opia del CO Los g u- pos II y III (dosis media y máxima) p esen a on un aspec o más pa ecido al del CO, ya que de o ma sis emá ica encon- amos mecanismos de dila ación de los elemen os ascula- es de la lámina p opia. TABLA 1 A ea celula : X±ES (µm2) .................................................... A ea nuclea : X±ES (µ m') .................................................. V c. pa ie ales: (% ol. mucosa) .............................................. V nuclea : (% ol. celula ) ··············································· Núme o o al de células ..................................... • Di . signi ica i a p<0,01 con espec o a CO N=6. Rani idina en g upos ope ados co G upo 1 124,26 ± 2,85 109,79 ± 1,87* 19,74±0,51 17,40±0,32* 29,31±1,12 33,66 ± 0,83. 15,83 ±0,67 15,83±0,33 774 982 G upo U G upo ID 126,64 ± 2,43 143,83 ± 2,90* 20,94±0,53 21,30±0,50 30,64±0,95 29,66±0,95 16,65±0,71 14,86±0,71 781 706 338 (22) J. To eblanca López y cols. Re . Esp. En Diges . Diciemb e 1990 TABLA 11 Rani idina en g upos no ope ados A ea celula : X±ES (µm') .................................................... A ea nuclea : X±ES (µ m') .................................................. V c. pa ie ales: (% ol. mucosa) .............................................. V nuclea : (% ol. celula ) ............................................... Núme o o al de células ..................................... • Di . signi ica i a p<0,01 con espec o a CNO. N=6. C.N.O. 119,28 ± 2,54 18,83±0,39 36,32±0,72 16,23±0,67 1.011 El es udio es e eológico con i mó lo desc i o an e io - men e, pues se obse a que la ani idina p o oca un descen- so de la V (densidad de olumen) de células pa ie ales di- ec amen e p opo cional a la dosis u ilizada; no obs an e, só- lo hay di e encia signi ica i a con espec o al CO en el g u- po I, siendo es e alo supe io al del con ol. Del mismo modo se mues a un aumen o del á ea celula di ec amen e p opo cional a la dosis u ilizada, siendo es os alo es signi- ica i amen e di e en es en el g upo I (meno ) y III (mayo ) con espec o al CO El es o de los pa áme os es udiados se mues an simila es a los del CO a excepción del á ea nu- clea del g upo I, que es meno ( e ablas). No ope ados La obse ación de la mucosa de es os g upos sólo nos pe - mi ió di e encia al de máxima dosis (g upo VI), pues en él de ec amos un mayo desa ollo del componen e ascula acompañado de un edema en el conec i o celula de la mu- cosa gás ica, con una dila ación de la lámina p opia. Es e aspec o, que no obse amos en los o os g upos, e a muy si- mila al obse ado en el CO Los g upos IV y V enían una mo ología indis inguible con el CNO, ya que no se obse - aban dila aciones impo an es en la lámina p opia ni un g an desa ollo del componen e ascula . El es udio es e eológico ob enido del análisis de di e en- es secciones de los g upos en cues ión nos con i mó los e- sul ados mo ológicos y nos o eció algunos que no había- mos de ec ado a es e ni el. Así, la ani idina p o oca, al igual que en los g upos ope ados, un descenso en la densi- dad de olumen de las células pa ie ales di ec amen e p o- po cional a las dosis de á maco u ilizadas, siendo la di e- encia signi ica i a en los g upos V y VI, de los cuales sólo el g upo VI ue posible de ec a as el es udio mo ológico ( e ablas). La u ilización de la ani idina ambién modi i- có el á ea celula en los elemen os pa ie ales, siendo es os alo es signi ica i amen e in e io es en los g upos IV y V. En su conjun o, es os g upos p esen an un compo amien- o simila a los ope ados, pues el á ea celula aumen a di- ec amen e con la dosis u ilizada. El es o de las es uc u as G upo IV G upo V G upo VI 106,13±1,74* 112,33±2,11* 116,46 ± 2,92 18,83 ± 0,59 17,77±0,32 18,74±0,67 37,05±0,92 32,11 ± 1,00* 28,64± 1,30* 17,75±0,49 15,81 ±0,45 16,09±0,73 1.107 934 800 y medidas conside adas no di ie en de las del con ol ( e ablas). DISCUSION Es á acep ada la elación en e la sec eción de CIH y la p esencia de células pa ie ales en la mucosa gás ica (18-20). En un an e io abajo (21) pudimos comp oba que la pi- enzepina, á maco an agonis a de ecep o es musca ínicos, u ilizado en el a amien o del ulcus gas oduodenal, p o o- caba un descenso gene alizado en la densidad de olumen de las células pa ie ales de la mucosa gás ica; ello pod ía co elaciona se con una disminución de la sec eción de CIH y, po an o, con un aumen o del pH gás ico, co obo ando sus buenos e ec os en la clínica humana. Siguiendo la sis e- má ica u ilizada po noso os (21), hemos que ido ealiza un es udio simila pa a la ani idina. En los es udios mo o né icos son esenciales las conside- aciones me odológicas. An e io es in es igaciones han de- mos ado que las lesiones gás icas p oducidas po cau e i- zación son áciles de es anda iza y que la célula pa ie al puede se es udiada con mayo de alle bajo condiciones con- oladas (23). El modelo es, pues, adecuado pa a es udi.a los e ec os de la ani idina sob e la egene ación de las cé- lulas pa ie ales de la mucosa. Sin duda que se p esen an p oblemas écnicos en los a- bajos es e eológicos, de ahí que los mé odos empleados de- ban de se cons an es du an e la in es igación. Una de las p incipales di icul ades es la écnica de mues eo. Si se es- cogen zonas de e minadas, como en nues o caso, se puede p oduci un sesgo de los alo es ob enidos. Sin emba go, los pa áme os es e eológicos se deben ci cunsc ibi a un «es- pacio de e e encia», po lo que és e debe se lo más cons- an e posible. C ee nos que las dis o siones que se puedan come e son de meno impo ancia a las que se p oduci ían si se o na a un «espacio de e e encia» alea o io. El hecho de escoge una zona de e minada de la glándula e i a las a- iaciones de los alo es es e eológicos que p esen an las cé- lulas pa ie ales a lo la go de la misma, pe mi iendo una me- jo compa ación en e los di e en es g upos. Volumen 78 Núme o 6 No obs an e, ya que los mé odos es e eológicos se en, en pa e, di icul ados po e o es sis emá icos, se debe p es a más a ención a las compa aciones en e g upos de da os que a Jos alo es absolu os (24). Los esul ados ob enidos as el a amien o con ani idi- na ponen de mani ies o que es e á maco, en Jos g upos ope- ados, no disminuye la densidad de olumen de las células pa ie ales. Algunos es udios (21, 23-25) han demos ado que la den- sidad de olumen de las células pa ie ales en úlce as en e- gene ación es meno que en condiciones no males. Di e - sos a amien os que inhiben la es imulación de la célula pa- ie al, an o a macológicos como qui ú gicos (18, 26, 27), acen úan es e descenso, pudiendo explica con ello su e ec- o bene icioso sob e la úlce a. En los esul ados que hemos ob enido en nues o es udio la ani idina no ac úa po enciando es a disminución en la densidad de olumen de las células pa ie ales en los g upos ope ados, a di e encia de los ob enidos cuando empleamos pi enzepina (21). No obs an e, la acción de la ani idina en los g upos no ope ados inducía un descenso signi ica i o en el po cen aje de células pa ie ales en los g upos de dosis me- dia y al a. Es e e ec o aumen aba di ec amen e en p opo - ción a la dosis u ilizada, con lo cual es as dosis p o oca ían una alcalinización de la luz gás ica que es a ía elacionada con p ocesos de egene ación de la mucosa (28). Además, si seguimos las indicaciones de BLOM (24) pa a ene más en cuen a la compa ación de los g upos de da os que los a- lo es absolu os, se obse a cla amen e que la ani idina p e- sen a el e ec o de la disminución de la densidad de olumen de células pa ie ales, an o en animales ope ados como no ope ados, e o zando la idea expues a an e io men e. Po se el obje o de es e es udio la célula pa ie al, ele- men o p oduc o de CIH, uno de los ac o es ag esi os de la mucosa gás ica, podemos conclui que se han ob enido los mejo es esul ados, po lo que se e ie e a disminui la ci ada ag esión, en los g upos en los que se han u ilizado do- sis máximas de ani idina. Po o a pa e, el descenso de la densidad de olumen de células pa ie ales, al igual que ocu ía con la pi enzepi- na (21), no se debe a un descenso del amaño celula , como indican o os au o es con á macos inhibido es de la sec e- ción de ClH (26), sino al descenso del núme o de és as. Es más, la ani idina p o oca amaños celula es mayo es cuan- o mayo es la dosis u ilizada, no suponiendo un aumen o en la densidad de olumen. Así pa ece que la anidi ina, en los g upos de a amien o, pod ía induci una cie a inhibi- ción en la di isión de las células pa ie ales, p o ocando con ello la disminución de su núme o y un aumen o en su ama- ño. Es e aumen o no p o oca una a iación en la elación núcleo/ci oplasma, que sí se p oducía en el a amien o con pi enzepina (21 ). BLOM (25) ambién de ec a un aumen o en el amaño de la célula pa ie al u ilizando un bloquean e an- i como la cime idina, y aunque no comen a es e e ec o se puede desca a el posible e ec o ó ico de un aumen o sé ico de los ni eles de gas ina, pues es e au o comp obó que no había di e encia en es e pa áme o en e el g upo de a amien o y el con ol. E ec os de la ani idina sob e células pa ie ales (23) 339 T as es os esul ados pa ece e iden e que la ani idina ac- ua ía en mayo medida sob e la mucosa no mal que sob e las zonas ulce adas. Pensamos que la acción de la ani idi- na, en pa e, puede se explicada po los esul ados ob eni- dos, pe o que és os deben se comple ados con el de la ul- aes uc u a de la célula pa ie al, que es á an elacionada con la unción de es e elemen o y po ello con la sec eción gás ica. Co espondencia: J. To eblanca López. Depa amen o Biología Celula . Facul ad de Biología. A da. Reina Me cedes, s/n. 41012 Se illa. BIBLIOGRAFIA l. Goyal RK y Ra an S. Neu ohumo al, ho monal and d ug e- cep o s o he lowe esophageal sphinc e . Gas oen e ology 1978; 74: 598-602. 2. Ash AHF y Schild HD. Recep o s media ing so ne ac ions o his amine. B J Phannac Chemo he 1966; 27: 427-439. 3. Soll AH, Ami ian DA, Thomas LP, Reedy TJ y Elasho JD. Gas in ecep o s on isola ed canine pa ie al cells. J Clin In- es 1984; 73: 1434-1447. 4. Nakamu a M, Oda M, Yoney Y, Tsukuda N, Koma su H, Tsu- gu M y Tsuchiya M. Au o adiog aphic demons a ion o gas- in binding si es in a gas ic mucosa. Pep ides 1987; 8, 2, 391-398. 5. K ame W, Skowcomek B, S ack H y Me z, S. Modula ion o acid sec e ion om en iched guinea pig pa ie al cells by opioid ecep o s. Phannacology 1983; 27: 298-304. 6. Rosen eld GC. lsola ed pa ie al cells: ad ene gic esponse and pha macology. J Phannacol Exp The 1984; 229: 763-768. 7. Kle eland PM, Waldum HL y La sson H. 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