Pro-Nucleótidos (ProTides) en la terapia antitumoral y antiviral

Trabajo Fin de Grado Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia PRO-NUCLEOTIDOS (PROTIDES) EN LA TERAPIA ANTITUMORAL Y ANTIVIRAL Beatriz Martínez Molero Beatriz Martínez Molero 1 Trabajo Fin de Grado Revisión Bibliográfica Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Grado en Farmacia Pro-Nucleótidos (ProTides) en la terapia antitumoral y antiviral Beatriz Martinez Molero Tutora: Margarita Luisa Vega Holm Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica Sevilla, 9 de junio de 2023 Beatriz Martínez Molero 2 RESUMEN Los análogos de los nucleósidos han formado parte de la terapéutica antitumoral y antiviral durante años. Pero las limitaciones que presentan tanto a nivel de biodisponibilidad como las resistencias que se crean frente a estos fármacos han supuesto una tendencia creciente en el desarrollo de profármacos que aumenten los niveles de metabolito activo de los análogos de los nucleósidos a nivel intracelular. Dentro de las posibilidades que aparecen en clínica, destacan los ProTides. Esta tecnología se basa en el enmascaramiento de los grupos OH del fosfato de los NA con un grupo arilo y un éster de fosforamidato. A raíz del descubrimiento de la tecnología ProTide, se han investigado una serie de candidatos y se han aprobado tres fármacos, tenofovir alafenamida como antirretroviral usado para el tratamiento del VHB y el VIH, Sofosbuvir frente al VHC y el más reciente de todos, Remdesivir, un fármaco en estudio frente al Ébola que ha sido aprobado para el tratamiento contra el SARS- CoV-2. Estos fármacos son solo el inicio del estudio de los ProTides, se desarrollan nuevos candidatos como la estampidina y timectacina como agentes anti-VIH, y el GS-6620 contra el VHC, aunque este último no ha progresado en fases más avanzadas. Siguiendo el ejemplo de los ProTides antivirales, se intenta aplicar esta tecnología para otras patologías importantes como algunos tipos de tumores donde disminuyen los efectos secundarios y vencen resistencias que aparecen con la terapia estándar antitumoral. Destacan NUC-7738 en pacientes con melanomas resistentes, NUC-1031 como alternativa en pacientes resistentes a gemcitabina o NUC-3373 en tumores colorrectales y neoplasias gastrointestinales. Al tratarse de una tecnología relativamente nueva, se han estudiado como candidatos ante otras patologías virales que aún no tienen otras alternativas como los Flavivirus y se observa la importancia del uso de estos ProTides en afecciones cuya terapia es aún desconocida. En esta revisión bibliográfica se ha descrito como la tecnología ProTide ha supuesto un avance en el tratamiento clínico de enfermedades víricas y tumorales, proporcionando una buena alternativa a la terapia clásica actual y enviando un mensaje esperanzador a la población sobre la posibilidad de tratamiento para enfermedades importantes que no contaban con otras alternativas. Palabras clave: análogo de nucleósido, antitumorales, antivirales, ProTide, fosforamidato. Beatriz Martínez Molero 3 ÍNDICE 1.INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 4 1.1. Virus emergentes y reemergentes ................................................................................. 4 1.2. Virus del Ébola ................................................................................................................ 5 1.3. Flavivirus ......................................................................................................................... 6 1.4. Coronavirus .................................................................................................................... 6 1.5. Virus de la inmunodeficiencia humana. ......................................................................... 7 1.6. Virus causantes de hepatitis........................................................................................... 8 1.7. Desarrollo de moléculas antivirales .......................................................................... 9 1.8. Cáncer ........................................................................................................................... 10 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 12 3. METODOLOGÍA ................................................................................................................ 13 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................. 14 4.1. Análogos de los nucleósidos ........................................................................................ 14 4.1.1. Historia del desarrollo y diseño de los análogos de nucleósidos. ................... 16 4.1.2. Principales problemas de los análogos de los nucleósidos ............................. 19 4.1.3. Soluciones posibles a los problemas en los análogos de los nucleósidos ....... 20 4.2.1. Etapas del desarrollo de la tecnología ProTide ............................................... 23 4.2.2. Metabolismo y diseño de ProTides ................................................................. 26 4.3. ProTides aprobados por organismos de salud internacionales ................................... 27 4.3.1. Tenofovir alafenamida (GS-7340) ................................................................... 27 4.3.2. Sofosbuvir (GS-7977) ....................................................................................... 27 4.3.3. Remdesivir (GS-5734) ...................................................................................... 28 4.4. ProTides en ensayos clínicos ........................................................................................ 29 4.5. ProTides en investigación dirigidos a los Flavivirus ...................................................... 33 4. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 35 5. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 36 Beatriz Martínez Molero 4 1.INTRODUCCIÓN 1.1. Virus emergentes y reemergentes A lo largo de los últimos años, han surgido o resurgido una gran cantidad de virus con potencial epidémico o pandémico (Figura 1), entre ellos el virus del Ébola (EBOV), Síndrome Respiratorio de Medio Oriente (MERS-CoV) o el Síndrome Respiratorio Agudo Severo Coronavirus 1 y 2 (SARS y SARS-CoV-2) (Geraghty et al., 2021). Estas infecciones no solo producen un problema de salud a nivel mundial, sino que además tiene efectos sociales, políticos y económicos. Figura 1.Adaptación de la línea temporal de virus emergentes del siglo XXI (Trovato et al., 2020). Aparece una constante preocupación por las enfermedades infecciosas ya que últimamente surge una sensación de descontrol frente a estas patologías. Las principales causas son rápida extensión, como por ejemplo en el SARS-Cov-2, las elevadas tasas de letalidad, como por ejemplo el Ébola, y la dificultad en el desarrollo de vacunas y tratamientos que pueden hacerles frente, como por ejemplo el VHC o el VIH. Cuando se revisan las similitudes entre estas enfermedades se llega a la conclusión de que el aumento de los patógenos zoonóticos se relaciona con modificaciones ambientales y con una diferente interacción entre los humanos con la población silvestre (Cunningham et al., 2017). Algunos factores han contribuido en la aparición y propagación de estos patógenos sobre las poblaciones, entre ellos la globalización, los viajes intercontinentales y el cambio climático. Aparece un aumento en las relaciones entre los humanos y posibles reservorios para estos Beatriz Martínez Molero 5 patógenos emergentes, además, por el aumento de la esperanza de vida se desarrolla una población más susceptible. Debido a la aparición de uno de estos últimos grandes virus, el SARS-CoV-2, se busca entre los científicos un nivel de intervención rápido para poder frenar estas infecciones emergentes. El desarrollo de vacunas es la estrategia más eficaz para disminuir la probabilidad de acabar en una epidemia o pandemia, pero cuando aparece un escenario pandémico se necesita una actuación rápida para evitar un progreso que ponga en riesgo la salud de la población. Por ello surge la necesidad de encontrar fármacos que frenen la progresión de estos virus con potencial pandémico (Trovato et al., 2020). 1.2. Virus del Ébola La enfermedad del Ébola, también conocido como la fiebre hemorrágica es una enfermedad grave letal causada por un virus de ARN de gran importancia África, el virus del Ébola (EBOV) de la familia Ebolavirus. El primer brote que apareció fue en el Congo en 1976 y desde entonces ha ido provocando varios brotes hasta la actualidad. Uno de los brotes más importantes de Ébola de la historia ocurre entre el año 2013 y 2016, surge en África occidental, en el sudeste de Guinea. El virus se extendió rápidamente de las zonas rurales a las zonas urbanas por las fronteras y se convierte en una epidemia mundial (Jacob et al., 2020). El virus se adquiere a través del contacto con animales portadores del virus que suelen ser murciélagos, monos o chimpancés. La transmisión también puede darse por el contacto directo de las mucosas con la sangre, las secreciones o fluidos corporales de pacientes infectados. El paciente sufre una disminución de la respuesta inmune contra la infección por la muerte celular y, además, aparece una sobreestimulación de la vía extrínseca de la coagulación que produce la coagulación de la sangre del paciente o coagulopatía (Baseler et al., 2017). En cuanto a los síntomas aparecen varias fases, comienzan síntomas inespecíficos como una gripe con fiebres altas o nauseas. La fase clave es la siguiente, donde el paciente sufre los síntomas graves como fiebre persistente o fatiga extrema. En la última se desarrollan problemas epidérmicos, respiratorios y vasculares, se produce la muerte por shock hipovolémico y la insuficiencia multiorgánica (Sivanandy et al., 2022). Actualmente hay dos vacunas aceptadas contra el Ébola, la rVSV-EBOV aprobada en 2019 por la FDA en mayores de 18 años y es de dosis única, solo protege frente al ebolavirus Zaire que es el que ha causado los grandes brotes mortales. Además, aparece otra vacuna, la Zabdeno/Mvabea aprobada en mayores de 1 año de edad que ofrece protección con una dosis de refuerzo tras la dosis inicial (Tomori y Kolawole, 2021). Beatriz Martínez Molero 6 1.3. Flavivirus El género Flavivirus forma parte de la familia Flaviviridae, son virus de ARN monocatenario que provocan a nivel mundial crisis endémicas y epidémicas graves, ya que tienen la opción de provocar focos en zonas no endémicas. Solo hay vacunas en algunos flavivirus como el virus de la fiebre amarilla o el dengue, pero el problema principal recae en que no hay antivirales dirigidos a este género. A nivel patológico se clasifican en dos grupos, enfermedades sistémicas que producen hemorragia como el virus del dengue (DENV1-4) y la fiebre amarilla (YFV), y enfermedades que producen alteraciones neurológicas como el virus del Zika (ZIKV) y el virus del Nilo Occidental (WNV). El dengue es endémico en más de 100 países, entre sus complicaciones aparecen la fiebre hemorrágica del dengue o el síndrome por shock del dengue. El Zika es un virus que no se consideraba importante hasta que el 2007 provoca una epidemia, desde ahí se declara como emergencia sanitaria en todo el mundo ya que se relaciona con episodios de enfermedades neurológicas graves. Aparecen unos 4 millones de infectados por el virus del Zika en América en el 2016 y se propaga rápidamente por el sudeste asiático y por África (Chong et al., 2019). Los virus de este género se transmiten por vectores, los mosquitos, y además se puede adquirir por transmisión vertical por artrópodos, por lo que permanece a largo plazo y puede reaparecer. Al transmitirse por vectores, el aumento de las poblaciones y las migraciones han ayudado a la propagación de estas enfermedades (Van Leur et al, 2021). 1.4. Coronavirus Los coronavirus (CoV) son un tipo de virus perteneciente a la familia Coronaviridae, son virus cuyo material genético se organiza en forma de ARN monocatenario y poseen los genomas de ARN más grandes actualmente conocidos. Estos virus se subdividen en 4 géneros, αcoronavirus, β-coronavirus, γ-coronavirus y δ-coronavirus de los cuales tan solo el género alfa y beta son capaces de infectar a los mamíferos. Se descubren en la época de los 1960 y se pensaba que producían cuadros leves respiratorios. Con la epidemia producida en 2002 del SARS y un brote que aparece de MERS en 2012 se empezó a cambiar la concepción sobre estos virus, pero no es hasta 2019, con la aparición del SARS-CoV-2, cuando finalmente saltan las alarmas entorno a esta familia (Santoro y Carafolí, 2021). El SARS-CoV-2 ha causado la mayor pandemia infecciosa del siglo XXI, con más de 100 millones de casos y dos millones de muertes en todo el mundo en febrero de 2021. La mayoría de los Beatriz Martínez Molero 7 pacientes presentan fiebre, tos, trastornos gastrointestinales, disnea, dolor de cabeza y dolores musculares. Destacan dos síntomas específicos, la anosmia o pérdida del olfato y la ageusia o pérdida del gusto. Las complicaciones clínicas graves aparecen en el 31,5% de los pacientes presentan neumonía bilateral o infiltración pulmonar. Es una infección que presenta mayor prevalencia en pacientes de elevada edad procedentes de residencias o centros sociosanitarios (Figura 2), siendo el paciente tipo con mayor tasa de mortalidad el que además presenta comorbilidades cardiacas, respiratorias y metabólicas (Vila- Córcoles et al., 2021). Figura 2. Adaptación de tabla sobre características demográficas y clínicas de 536 casos confirmados de COVID-19 según lugar de atención/tratamiento (ambulatorio/urgencias, hospital, residencia/sociosanitario) en personas ≥50 años del área de Tarragona, entre marzo y junio de 2020.(Vila-Córcoles et al., 2021) 1.5. Virus de la inmunodeficiencia humana. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es una infección letal que afecta al ser humano, a medida que progresa produce el deterioro del sistema inmune, los pacientes se vuelven susceptibles a la aparición de otras infecciones. Por el progresivo deterioro de la inmunidad en el paciente es de vital importancia un diagnóstico temprano. Es una enfermedad que se transmite principalmente por vía sexual, aunque también puede darse por el contacto con la sangre o fluidos de una persona infectada o por vía vertical de madre a hijo. Aparece un riesgo alto de infección en pacientes drogodependientes al compartir jeringuillas y en las transfusiones de sangre o trasplante de órganos en países no controlado. Pacientes que padecen infecciones de transmisión sexual (ITS) tienen mayor probabilidad de padecer VIH (Morán Arribas et al., 2018). Debido a la terapia antirretroviral (TAR) se ha producido un cambio en el paciente tipo con infección por VIH, volviéndose una enfermedad con mayor tendencia a la cronicidad. Esto ha 0 20 40 60 80 100 Ambulatorio Hospital Residencia Infectados (%) Características demográficas según lugar de atención/tratamiento 50-64 años 65-79 años 80 o más años Beatriz Martínez Molero 8 producido un aumento de la esperanza de vida en pacientes infectados lo que favorece a la aparición de otras comorbilidades, tumores o aumento de la fragilidad en los pacientes de edad avanzada (Del Amo y Pérez-Molina, 2018). Según la OMS (Organización mundial de la salud) esta infección causó 1,2 millones de muertes en el año 2014. 1.6. Virus causantes de hepatitis La hepatitis derivada de un proceso viral es uno de los grandes problemas actuales, la mayoría de las muertes asociadas a hepatitis viral se producen por una infección del virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC) pero existen otros virus que causan hepatitis como el virus de la hepatitis A (VHA), el virus de la hepatitis D o delta (VHD) y el virus de la hepatitis E (VHE). Son cinco virus no relacionados biológicamente, pero todos ellos se caracterizan por causar hepatitis viral. El VHB es un virus cuyo material genético se organiza en forma de doble cadena de ADN con envuelta y pertenece al género de los Aortohepadnavirus. Es un virus cuya infección se asocia inversamente proporcional a la edad, produce hepatitis aguda en el 90% de los lactantes. En cuanto a la transmisión, es un virus que solo produce infección en humanos y se puede transmitir por vía sexual, sanguínea o vertical, es decir, de madre a hijo. Según el genotipo que aparece se relaciona con una zona geográfica u otra, por ejemplo, en la cuenca del Mediterráneo predomina el genotipo D (Lanini et al., 2019). La hepatitis B crónica se caracteriza por brotes espontáneos, no se conocen las razones de la aparición de estos brotes, pero se sospecha que está relacionado con el estado inmune del paciente, por ello se producen con más frecuencia en pacientes sometidos a terapia inmunosupresora o que presentan un estado de inmunosupresión, por ejemplo, en pacientes que presentan una infección por VIH. La prevalencia de ambas infecciones juntas es alta al compartir mecanismos de trasmisión, al analizar la coinfección se descubre un aumento del riesgo de enfermedad hepática progresiva que suele desencadenar en un cáncer hepático (Maldonado-Rodriguez et al., 2015). Según la OMS, causa 780.000 muertes cada año y en el 2014 se infectaron unas 240 millones de personas por el VHB (De Clerq y Li, 2016). El virus de la hepatitis C (VHC) pertenece a la familia Flaviviridae, tiene un material genético en forma de ARN. El VHC, al igual que el VHB, se transmite entre humanos por el contacto directo por vía sanguínea o por vía vertical. También destaca el contagio por uso de agujas contaminadas en personas con antecedentes de drogadicción y se observa un mayor riesgo de contagio por relaciones sexuales donde destacan pacientes hombres VIH positivos que practican sexo con otros hombres. Beatriz Martínez Molero 15 Al ser análogos de los nucleósidos naturales siguen su mismo metabolismo, entran en el interior de la célula por transportadores de nucleósidos, además de transportadores de péptidos y aniones o cationes orgánicos (Figura 6). En el interior de la célula se fosforilan y forman los derivados trifosfato. En algunos virus las primeras fosforilaciones las hacen enzimas del propio virus como en los herpesvirus donde se realiza por una timidina quinasa del virus, lo que le confiere mayor selectividad. Por último, los nucleótidos ya fosforilados inhiben enzimas o se incorporan al ADN. Algunas enzimas presentes en el catabolismo son capaces de disminuir la cantidad de metabolito activo, entre ellas se encuentran las desaminasas y las 5’-nucleotidasas, por ejemplo, las enzimas desaminasas escinden el grupo amino de la molécula (Jordheim et al., 2013). Figura 6. Absorción celular de los análogos de los nucleósidos (Jordheim et al., 2013) Los análogos de los nucleósidos, además de introducirse en el ADN o ARN, son capaces de inhibir enzimas intracelulares relacionadas con los procesos de división y replicación celular, en la síntesis o reparación del material genético y es por ello que son usados en la terapia antitumoral, inhiben polimerasas humanas y virales, ribonucleótidos reductasas (RRM), la timidilato sintasa o la orotidina-5-monofosfato descarboxilasa (ODCasa). Esta última enzima tiene una función importante, forma parte del proceso de síntesis de novo de nucleótidos de pirimidina por lo que en las células tumorales aparece sobreexpresada, esto la convierte en una diana muy interesante para el tratamiento antitumoral, en clínica destacan los análogos de UMP (uridina-5-monofosfato) (Slusarsczyk et al, 2018). Beatriz Martínez Molero 16 4.1.1. Historia del desarrollo y diseño de los análogos de nucleósidos. En 1959 se descubre la primera molécula antiviral, análogo de la timidina (1), la idoxuridina (2) la cual se usa principalmente para el tratamiento de queratitis ocular producida por los herpes virus de administración tópica. Es un fármaco de primera generación, poco selectivo y se usa por vía tópica ya que por vía oral presenta efectos secundarios (Figura 7). El aciclovir (3) fue el primer análogo de los nucleósidos de segunda generación, actúa frente a la timidina quinasa de los virus sensibles, enzima que convierte al aciclovir en el metabolito activo. Al ser un inhibidor selectivo se usa por vía oral. Este descubrimiento supuso un nuevo enfoque en el tratamiento de las infecciones provocadas por virus (De Clerq y Field, 2006). En el campo antitumoral, el primer análogo de nucleósido aprobado fue la citarabina (4) en el 1969, fue aprobado por la FDA para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda. En el 2013 aparecen 6 análogos aprobados por la FDA para el tratamiento del cáncer ya que se consideran fármacos citotóxicos capaz de reducir la progresión de las células tumorales (Jordheim et al., 2013). O OH HO N NH O O O OH HO N NH O O I O OH OH HO N N NH2 O NH N N N O NH2 O HO 1234 Figura 7. Nucleósidos naturales y sus análogos siendo Timidina (1), Idoxuridina (2), Aciclovir (3) y Citarabina (4). Siguiendo estos ejemplos, se busca variabilidad de compuestos entre los análogos de nucleósidos haciendo modificaciones en la estructura de los nucleósidos naturales en dos puntos, modificando la nucleobase o modificando el azúcar. Modificación de la nucleobase, análogos con un fragmento heterocíclico modificado Partiendo de la idoxiuridina (2), al introducir un nitrógeno en el heterociclo tanto en posición 5 como en posición 6 se observa un cambio en la actividad biológica. Las 2’ desoxiuridinas 5’ sustituidas (5) (Figura 8) son activas frente a virus de ADN del herpes simple y la varicela zoster (Pastuch-Gawołek et al., 2019). Entre los compuestos estudiados destaca la ribavirina (6) (Figura 8), es un fármaco de amplio espectro que muestra actividad frente a varios virus de ARN como el VHC, la gripe A o el virus Beatriz Martínez Molero 17 respiratorio sincitial. Es un isóstero de la guanosina (7), el único análogo de nucleósido aprobado para el tratamiento de la gripe o virus de la influenza. Figura 8. Diseño de análogos de nucleósidos por modificaciones en la nucleobase. 2’-desoxiuridina-5’-sustituidas (5), Ribavirina (6), Guanosina (7) Modificación en el azúcar 1) Modificaciones en los sustituyentes del carbono 4’. El primer análogo activo contra el VIH es la zidovudina (8), cuya diana es la transcriptasa inversa del VIH. En 2018 se descubre que los análogos 4’-sustituidos son activos frente a virus de ADN como el VHB y frente a virus de ARN como el VIH, propiedad que aparece en los derivados que poseen un grupo azido o un grupo ciano en la posición 4’ (Figura 9). Algunos ejemplos son el festinavir (9), análogo de la timidina, o el islatravir (10), análogo de la adenosina (Mehellou et al., 2018). Figura 9. Diseño de análogos por modificaciones en el carbono 4, Zidovudina (8), Festinavir (9) e Islatravir (10)'. 1) Modificaciones en los sustituyentes del carbono 1’ y 2’. La gemcitabina (11) o 2’-desoxi-2’,2’-difluorocitidina es el análogo con sustituyentes en el carbono 2’ más conocido de todos, es un fármaco aprobado frente a muchos tipos de tumores como el cáncer de ovario, páncreas, mama o pulmón, pero estos últimos años se ha observado su capacidad anti-VIH, VHC o virus de la gripe A, (Figura 10) (Kataev y Garifullin, 2021). Beatriz Martínez Molero 18 2) 2’,3’-didesoxinucleósidos Aquí aparecen los análogos de nucleósidos que inhiben a la transcriptasa inversa del VIH y por tanto se usan en el tratamiento antiviral contra este virus (Figura 10). A este grupo de fármacos se les conoce como inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa (INTI) o fármacos antirretrovirales. Se observa que, a diferencia de otros casos, la actividad anti VIH y anti VHB es mucho mayor cuando se usa el enantiómero L, a partir de ahí se sintetiza la lamivudina (12), un L-nucleósido al igual que la emtricitabina (13), ambos superaban la actividad antiviral de sus D- enantiómeros (De Clerq y Li, 2016). Figura 10. Diseño de análogos por modificaciones en el carbono 2', Gemcitabina (11). Diseño de análogos con actividad anti-VIH Lamivudina (12) y Emcitrabina (13). 3) Análogos carbocíclicos Los análogos carbocíclicos (Figura 11) son moléculas más lipófilas y permeables, además presentan un enlace glucosídico que no es inestable, por lo que no se puede romper por las glucosido hidrolasas y aumenta su vida media en el organismo. Abacavir (14) es un análogo carbocíclico de la adenosina, es un análogo del carbovir (15) aprobado por la FDA frente al VIH ya que inhiben la transcriptasa inversa del virus. Entecavir (16) es un análogo de la 2’-desoxiguanosina donde aparece un doble enlace exocíclico en vez del oxígeno en la ribofuranosa. Este doble enlace le proporciona una gran actividad anti VHB debido a que se une al bolsillo hidrófobo de la ADN polimerasa del virus de la hepatitis B (Seley-Radtke y Yates, 2018). Beatriz Martínez Molero 19 Figura 11. Diseño de análogos basado en derivados carbocíclicos Abacavir (14), Carbovir (15) y Entecavir (16). 4.1.2. Principales problemas de los análogos de los nucleósidos A partir del descubrimiento de la idoxuridina (2) en 1959, se siguió investigando sobre los análogos de los nucleósidos como antivirales, moléculas muy interesantes pero que presentan el mismo problema principal, son estructuralmente diferentes a los nucleósidos naturales, esto se traduce en que todos necesitan una fosforilación previa por quinasas celulares. Al tener una estructura diferente a los nucleósidos naturales esta fosforilación no siempre resulta efectiva, no se forma el metabolito trifosfato y por tanto el fármaco no es activo (Mehellou et al., 2018). La especie finalmente activa es la trifosforilada, se observa que la mayoría de estos análogos de nucleósidos son inactivos debido a que la primera fosforilación no se realizaba tal y como se esperaba, por lo que lo consideran un paso limitante y se comienzan a probar los análogos monofosfatados (Alanazi et al., 2018). Otro de los problemas principales era que los análogos de los nucleósidos suelen presentar baja biodisponibilidad oral ya que suelen ser moléculas muy polares y esto dificulta su absorción a nivel intestinal. Siguiendo con el ejemplo del aciclovir (3), requiere unas dosis muy altas y una administración continuada para mantener las concentraciones necesarias para que se produzca la inhibición del virus. El único problema que presenta no es solo su baja biodisponibilidad tras su administración oral, sino que además es un fármaco poco soluble en agua (De Clerq y Field, 2006). Por todo ello, los análogos de los nucleósidos siempre han sido moléculas muy interesantes en clínica, pero con una baja farmacocinética. Debida a la baja fosforilación que estos análogos sufrían, se pensó en administrar los nucleósidos ya fosforilados. Pero los análogos monofosfato tenían dos problemas principales, poca estabilidad in vivo por la desfosforilación en la circulación sanguínea y una dificultad en la entrada al interior de la célula, esto hace imposible su administración por vía oral. Beatriz Martínez Molero 20 4.1.3. Soluciones posibles a los problemas en los análogos de los nucleósidos Para que se produzca la actividad farmacológica es importante la fosforilación de los nucleósidos antivirales y antitumorales para formar sus derivados activos di- y trifosforilados. Sufren varias fosforilaciones hasta conseguir el derivado activo, pero la primera fosforilación que sufre el análogo por las quinasas celulares se conoce como el paso limitante, donde se pasa del nucleósido a su derivado 5’-O-monofosfato. Para superar este paso se buscan formas de administrar los derivados 5’-O-monofosfato directamente en la célula, como el grupo monofosfato es un grupo muy susceptible a una hidrólisis rápida mediada por fosfatasas entre el fosforo y el oxígeno, se cambia el grupo monofosfato por un grupo monofosfonato (Figura 12), donde se reemplaza el oxígeno por un CH2 mediante una modificación isostérica de Grimm para aumentar su estabilidad (Mehellou et al., 2018). P OH O O HO NA P OH O HO NA Análogo de nucleósido monofosfato Análogo de nucleósido monofosfonato Figura 12. Estructura análogo de nucleósido monofosfato y monofosfonato, NA: análogo de nucleósido Se observa una mejora de la estabilidad in situ, por lo que la vida media de los monofosfonatos aumenta respecto a los monofosfatos (Figura 13), esta estrategia se sigue para algunos antivirales actualmente aceptados como cidofovir (17) para el citomegalovirus, adefovir (18) para el VHB y tenofovir (19) para el VIH (Figura 13). Figura 13. Primeros análogos monofosfonatos, Cidofovir (17), Adefovir (18) y Tenofovir (19) Solucionado el problema de la inestabilidad metabólica entre el grupo fosfato y el azúcar, había que abordar la escasa absorción celular debido a la ionización del grupo fosfonato a pH fisiológico. La mayoría de estrategias se centran en el bloqueo de uno o dos oxígenos del grupo Beatriz Martínez Molero 21 monofosfonato para aumentar la lipofilia de la molécula creando profármacos, si se aumenta la lipofilia se facilita la difusión del fármaco por la membrana celular consiguiendo unos niveles mayores de fármaco intracelular y, por tanto, un aumento de la concentración de la molécula activa en la diana (Wagner et al., 2000). Los pronucleótidos son análogos donde se enmascara la parte del fosfato con diferentes modificaciones químicas para mejorar las características farmacocinéticas, así aumenta la hidrofobicidad y favorece la entrada del fármaco a la célula. Sus características varían dependiendo del tipo de análogo de nucleósido y de la parte que se añade para formar el profármaco, pueden estar unidos por un enlace P-O (fosfoéester) o por un enlace P-N (fosforamidato). Los fosfodiésteres son fármacos mono o disustituidos por grupos S-acil-2-tioetilo (SATE) unido al fosfato formando un profármaco (20, Figura 14). En la célula se hidroliza el resto SATE por esterasas y se libera el nucleósido monofosfato. Los HepDirect (Estructura general A, Figura 14) son un tipo de pronucleotidos fosfato o fosfonato cuya misión principal es aumentar la cantidad de fármaco que llega al hígado, son ésteres de 1,3-propanol cíclicos con un anillo (un grupo arilo), esto les hace sensibles al metabolismo por una isoenzima del citocromo P450 que aparece específicamente en el hígado, se produce la apertura del anillo y posterior liberación del fosfato o fosfonato. Figura 14. Profármacos de los análogos de los nucleosidos fosfodiésteres de SATE (20), HepDirect (A). Los fosforamidatos y fosforodiamidatos son pronucleótidos donde la unión entre el P-O (fosfoester que se libera por esterasas) se cambia por una unión P-N (fosforamidato que se libera por fosforamidasas). Cuando además presenta unido un grupo aromático por unión ariloxi se habla de tecnología ProTide (Jordheim et al., 2013). Gracias a esta última tecnología, la de diseño de fármacos antivirales en forma de ProTides, se descubren dos de los profármacos antivirales más importantes en la actualidad (Figura 15), tenofovir alafenamida (21) y el sofosbuvir (22) (Mehellow et al., 2018). Beatriz Martínez Molero 22 Figura 15. Estructuras de los nuevos ProTides aceptados por la FDA, Tenofovir alafenamida (21) y Sofosbuvir (22) 4.2. Tecnología ProTide Para favorecer la administración de los grupos 5’-O-monofosfato y monofosfonato se piensa en el uso de profármacos que liberen los análogos con los grupos fosfato y fosfonato en el interior de la célula. Partiendo de esta premisa se desarrolla la tecnología ProTide (Prodrug nucleoTide), la cual nace en el 1990 por McGuigan y consiste en el uso de profármacos para favorecer la administración intracelular de los derivados 5’-o-monofofato y monofosfonato y mejorar la biodisponibilidad de estas moléculas antivirales, eludiendo la primera fosforilación de los nucleósidos que supone un paso limitante. Se basa en la protección de los grupos OH de los monofosfatos y los monofosfonatos en forma de ariloxifosforamidatos (Figura 16), es decir, se enmascara con un grupo aromático y un éster de un aminoácido unido por un enlace fosforamidato (P-N). Tanto el grupo éster como el grupo aromático se esciden en el interior de la célula por la rotura del enlace mediante las esterasas o enzimas carboxipeptidasas (hint-1) y se liberan las especies monofosfato y monofosfonato (Alazani et al., 2018). Figura 16. Estructura general de los ProTides adaptada de (Mehellou et al., 2018). El éster de aminoácido y el grupo ariloxi forman dos grupos lipófilos que favorecen la absorción a nivel intracelular ya que aumentan la permeabilidad de la membrana, no es necesario disponer de los transportadores de los nucleósidos naturales ya que la molécula es mucho más permeable. Beatriz Martínez Molero 23 4.2.1. Etapas del desarrollo de la tecnología ProTide Esta búsqueda de profármacos que sean más activos que sus antecesores se inicia con el diseño de ésteres de los grupos fosfato y fosfonato tomando como referencia la 3’-azido-3’- desoxitimidina o zidovudina (AZT), un análogo de nucleósido que actúa como fármaco antirretroviral al inhibir la transcriptasa inversa del VIH. (Papadopulos-Eleopulos et al., 1999) Paso 1. Ésteres de fosfato con grupos alquilo y haloalquilo Primero se intenta enmascarar el grupo fosfato del 9-β-D-arabinofuranosiladenina monofosfato (AraA) con triésteres de dialquilos (Tabla 1), estos fármacos presentan más estabilidad frente a las enzimas como la adenilato desaminasa pero no tenían una gran actividad in vivo. Cuando se aplica este enmascaramiento al monofosfato del AZT, fármaco usado contra el VIH, no presenta actividad in vitro, debido a que la molécula con los ésteres de dialquilo era tan estable que no se liberaba la especie activa de 5’-O-trifosfato de AZT. Se prueba un enmascaramiento con grupos haloalquilo para mejorar la escisión en el interior de la molécula, pero aun así no se observa una gran actividad antiviral. Por tanto, en el AraA el enmascaramiento con grupos alquilo y haloalquilo produce un aumento de la actividad antiviral debido a que se produce un aumento de la lipofilia de la molécula y por tanto una mejor entrada al interior de la célula (Mehellow at al., 2018). Paso 2. Alquiloxi y haloalquiloxi fosforamida Comprobado que el aumento de la lipofilia con grupos alquilo y haloalquilo era eficaz, se procede con el diseño de profármacos en forma de fosforamidatos (Tabla 1). Se descubre que la proteasa de aspartato del VIH es capaz de escindir grupos fosforamidatos, por tanto, se sintetiza una selección de fosforamidatos alquiloxi de la AZT con aminoácidos esterificados con grupos metilos. Se observa que la cadena de L-alanina presenta mejor actividad, lo que posteriormente se refleja en que todos los ProTides en clínica o ensayo clínico presentan una parte de la L- alanina. Aparece una relación inversamente proporcional entre la actividad anti-VIH y el tamaño de la cadena lateral del aminoácido, cuanto menor es la cadena lateral del aminoácido mayor actividad farmacológica presenta la molécula (Cahard et al., 2004). Por tanto, al enmascarar los grupos fosfato con aminoácidos esterificados en el extremo carboxilo con un grupo metilo o haloalquilo se observa un aumento de la actividad del fármaco. Paso 3. Fosforodiamidatos Beatriz Martínez Molero 24 Como al introducir un aminoácido formando el fosforamidato se observó un aumento de la actividad anti VIH, se prueba enmascarando los oxígenos del grupo fosfato también con ésteres de aminoácidos (Tabla 1). Se usaron ésteres metílicos con cadenas laterales diferentes para enmascarar los oxígenos del grupo fosfato del AZT, pero en este caso no es la alanina la que mejores características presenta sino los aminoácidos con cadenas laterales aromáticas como la fenilalanina. Paso 4. Sistemas derivados del ácido láctico Era importante saber la importancia del grupo fosforamidato, por lo que se hacen derivados del ácido láctico y glicólico donde aparecen unidos al AZT por el oxígeno del grupo fosfato, en estos derivados se elimina el grupo fosforamidato (Tabla 1). No se observa un aumento significativo de la actividad, pero llegan a la conclusión de que la actividad se relacionaba con el tamaño de la cadena del alquilo del fosfato ya que una cadena muy larga daba como resultado menor actividad anti VIH. Aun así, no se siguió investigando sobre estos ya que presentaban una actividad bastante pobre (Mehellow et al., 2018). Paso 5. Fosfatos de diarilo Se busca el enmascaramiento del fosfato de AZT con dos grupos aromáticos, se esterifican dos grupos fenoles en la posición para y se observa una actividad anti VIH incluso mayor que el compuesto inicial, es la primera vez que se desarrolla un derivado más activo que la molécula de partida (Tabla 1). En varios estudios se confirma que al añadir un grupo atractor de electrones en posición para se observa un aumento de la actividad anti-VIH. Además, se observa que uno de los derivados era activo frente a líneas celulares que se habían mostrado resistentes al AZT por lo que se reafirma que estos derivados ejercen su acción, la liberación intracelular de los nucleótidos fosforilados (McGuigan et al., 1992). Paso 6. Ariloxifosforamidatos (ProTides) Se basan en las dos mejoras principales en todo este proceso, los ésteres de aminoácidos con cadenas laterales cortas y los arilos sustituidos en la posición para (Taba 1). Se desarrollan los derivados del AZT con arilos sustituidos y con ésteres de aminoácidos y se observan una actividad anti VIH mayor comparado con el compuesto inicial. La combinación que más actividad muestra es un fenilo y la L-alanina como aminoácido con una CE50 de 0,8 µM frente a la CE50 de 100 µM que presenta el AZT. Se observa que tanto la L-alanina como el arilo en para no sustituido son los más potentes. Beatriz Martínez Molero 31 gastrointestinales por lo que se deduce que el tejido no tumoral no sufre gran afectación por el uso del fármaco (Tabla 2). La eficacia se compara frente a la 3’-dA midiendo las concentraciones inhibitorias máximas (IC50) en diferentes líneas de células tumorales, presenta una IC50 de 18,8 µM en comparación con 137,8 µM del 3-dA. Se observan señales de actividad antitumoral sobre todo en pacientes con melanomas resistentes a otros tratamientos como la inmunoterapia. Actualmente se encuentra en estudios de fase I en humanos (Schwenzer et al., 2021). NUC 1031 (Acelarina) La gemcitabina es un quimioterápico usado en monoterapia o en combinación para el tratamiento de tumores en pacientes con cáncer de ovario, adenocarcinoma pancreático o cáncer del tracto biliar (Kapacee et al., 2020). NUC-1031 (28) se está probando para cáncer de mama, ovario, colon, pulmón y páncreas que son resistentes al tratamiento con la gemcitabina, el tratamiento de referencia (Tabla 2). Es más lipófilo que la gemcitabina por lo que penetra en las células perfectamente por difusión pasiva y no requiere la entrada por transportadores de nucleósidos. Además, como se administra un profármaco del 5’-monofosfato, se evita la activación por algunas quinasas que no están presentes en algunos tipos de cáncer y se disminuye la cantidad de fármaco perdido por desaminación, por lo que aumentan los niveles de metabolito activo intracelular, unas 13 veces más que en el fármaco de referencia (Thornton et al., 2016). El tratamiento estándar en pacientes con tumores en las vías biliares avanzado es la gemcitabina con el cisplatino. Se observa en estudios previos la seguridad en el uso del cisplatino con el NUC- 1031 y se pone en funcionamiento NuTide 121, un estudio global donde se compara la efectividad de la terapia base de gemcitabina-cisplatino con NUC 1031-cisplatino. Debido a los datos de seguridad en fases previas, actualmente se encuentra en fase III, comenzó en el 2015 y se realiza en 120 lugares de todo el mundo como Norte América, Europa o Asia (McNamara et al., 2020). NUC 3373 Las fluoropirimidinas como el 5-fluorouracilo, son la base del tratamiento de muchos tumores, pero en específico el colonorrectal y otras neoplasias de tipo gastrointestinal. NUC 7737 (29) es un protide del 5’-fluoro-2’-desoxiuridina (FdU), es el metabolito que aparece justo antes del 5- fluorouracilo (Tabla 2). Se observa que es resistente a enzimas que inactivan al FdU como la timidina uridina fosforilasas y además permanece estable en suero en comparación con su antecesor el FdU. Este candidato produce el metabolito activo 363 veces más que el 5- Beatriz Martínez Molero 32 fluorouracilo y unido a su gran estabilidad química, se introduce en fase I de ensayos clínicos en el 2015 (Thornton et al., 2016). Como se demuestra que NUC 3373 genera más metabolito activo, se sabe que se produce una inhibición de la timidilato sintasa mayor que con el compuesto de referencia lo que lleva a la detención del ciclo celular. Por todo ello se concluye que es un gran inhibidor de la timidilato sintasa que causa daño en el ADN y se observa que el NUC 7737 presenta un buen perfil de seguridad en los pacientes estudiados (Bré et al., 2023). Tabla 2. Estructura de los principales ProTides en ensayos clínicos. Estampidina Timectacina GS - 6620 NUC - 7738 NUC - 1031 NUC - 3373 Beatriz Martínez Molero 33 4.5. ProTides en investigación dirigidos a los Flavivirus Para encontrar los ProTides con acción anti-Zika se buscan entre nucleótidos que inhiben la RdRP viral. Se usa como referencia Sofosbuvir porque se observa que presenta actividad frente a la familia Flavivirus por su similitud con el VHC. Se prueban 13 ProTides contra el virus del Zika en células madre neuronales y se observa actividad interesante en los ProTides de 2’-C-eteniluridina (30) y 2’-C-metiluridina (31) (Figura 20). Se observa que los que más actividad presentan son los derivados de uracilo. Se observa una mayor supresión del efecto citopático que produce el virus del Zika en el derivado 2’-C- metiluridina frente al sofosbuvir. Todo esto se prueba en células madre neuronales, son células muy susceptibles a sufrir daño cuando se produce una infección por Zika debido a su etiopatología. Se observa que la ARN polimerasa humana incorpora en menor medida los derivados 2’-C- metiluridina que los 2’-C-Metil derivados de otras bases por lo que puede sugerir mayor selectividad por las polimerasas de los Flavivirus frente a las polimerasas humanas, aunque actualmente no se conoce el mecanismo de esta selectividad (Bernatchez et al., 2019). Figura 20. Estructura de los derivados 2'-C-eteniluridina (29) y 2'-C-metiluridina (30) Se buscan otras estrategias para el diseño de ProTides contra los Flavivirus, se prueban ProTides diéster, son más lipófilos y permeables en comparación con los monoéster, pero para su activación es necesario una hidrólisis dependiente de esterasas, presentes principalmente en el hígado, esto se traduce en una disminución a nivel sistémico del metabolito activo que puede ser importante, como por ejemplo en la infección por Zika, donde se afectan principalmente células neuronales. Para evitar este paso de activación por la carboxiesterasa, se buscan ProTides que se activen químicamente y no enzimáticamente, el primer paso se activa químicamente y el segundo por las HINT-1 liberando el nucleósido monofosfato (Okon et al., 2017). Beatriz Martínez Molero 34 Un ejemplo sería la caracterización de la actividad frente al virus del Zika en dos ProTides diferentes; Protide UMN-1001 (32) y UMN-1002 (33). Este tipo de ProTides (Figura 21) son fosforamidatos de triptamina que tienen una activación química y no enzimática. Tienen actividad anti-DENV mejorada respecto al análogo de nucleósido inical y, además, al ser ProTides, están disponibles por vía oral, son moléculas más lipófilas que penetran en la célula con facilidad por difusión y se hidrolizan por la HINT1. Se prueba también si inhiben la infección por zika in vivo, en ratones recién nacidos. Inhiben la replicación del virus tanto en líneas celulares como en modelos in vivo, se observa que UMN-1002 protege a los ratones recién nacidos de la infección por el Zika. Aunque a priori UMN-1002 es más tóxico, se observa que las dosis administradas de 1001 en los ratones para que presente actividad antiviral fueron letales (Matos de Souza et al., 2020). Figura 21. Estructura del UMN-1001 (32) y UMN-1002 (33) Recientemente se informa que estos derivados (UMN-1001, 32) no son activos in vitro en las células de infección por Zika (células neuronales), pero si se observa actividad con los ProTides ariloxifosforamidatos (Figura 20), ambos necesitan la activación por la HINT-1 por lo que no se considera la razón principal de la inactividad. Se cree que la diferencia de actividad se produce por la especificidad de sustrato de la HINT1, lo que mostraría mayor actividad para el ariloxi frente al derivado de la triptamina, pero son necesarios más estudios para conocer la diferencia de actividad de ambos candidatos (Matos de Souza et al., 2020). Por la importancia de los ProTides en otras infecciones o enfermedades y los datos obtenidos en los últimos estudios sobre los ProTides con actividad frente a los Flavivirus, se debe continuar con estos estudios tanto a nivel preclínico con modelos animales como a nivel clínico con ensayos, ya que son fármacos que se postulan como relevantes candidatos para el tratamiento anti-DENV y anti-Zika en un futuro clínico. Beatriz Martínez Molero 35 4. CONCLUSIONES Con el aumento de preocupación social relacionada con la salud estas últimas décadas, empujada por pandemias mortales o enfermedades sin un tratamiento óptimo, la comunidad científica se ha visto obligada a buscar nuevas alternativas terapéuticas para actuar frente a estos brotes infecciosos o procesos tumorales que están afectando a la sociedad. En esta revisión bibliográfica se ha expuesto la importancia del uso de los análogos de los nucleósidos frente a estas patologías así como los grandes problemas de biodisponibilidad oral que presentan, unidos a su baja solubilidad y la facilidad de la aparición de resistencias, sugieren una búsqueda diferente en el abordaje de estas enfermedades. En la búsqueda de profármacos que aumenten los niveles de metabolito activo intracelular de los análogos de nucleósidos, consiguiendo una mayor biodisponibilidad, destaca el uso de la tecnología ProTide. Esta tecnología, basada en el enmascaramiento de los grupos OH del fosfato de los NA con un éster arílico y un fosforamidato, ha sido una de las alternativas más prometedoras para tratar estas enfermedades ya que se observa un aumento de la actividad del fármaco con una disminución de dosis en la mayoría de los compuestos estudiados. A partir de estar tecnología, se descubren tres fármacos antivirales aprobados por la FDA que presentan mejores características que sus análogos de partida, ya que producen menos efectos secundarios al necesitar una dosis menor. Gracias a ellos, se ha seguido investigando con otros fármacos en ensayo no solo para procesos virales sino para procesos tumorales, otra de las grandes preocupaciones sociales en la actualidad. Se ha demostrado que existen candidatos en ensayos clínicos de fases avanzadas que sugieren una mejora en el tratamiento antitumoral estándar, ya que al igual que los ProTides antivirales, ofrecen una actividad antitumoral elevada con una disminución de los efectos adversos y las resistencias. Dado el éxito del estudio de esta tecnología, se ha valorado su uso en otras infecciones como las producidas por Flavivirus y se ha observado la necesidad de seguir investigando acerca de esta tecnología. Se concluye esta revisión destacando la importancia que ha tenido el descubrimiento de esta tecnología a nivel clínico ya que se ha producido un avance en el tratamiento de muchas enfermedades emergentes y podría suponer una nueva línea de estudio para ampliar los compuestos que aparecen actualmente en clínica, para mejorar el arsenal terapéutico actual. Beatriz Martínez Molero 36 5. BIBLIOGRAFÍA - Alanazi AS, James E, Mehellou Y. The ProTide Prodrug Technology: Where Next? 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