Utilización en composiciones farmacológicas de agentes con efecto reductor o inductor de hipoxia

k 19 OFICINA ESPA˜ NOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPA˜ NA k 11 N´ume o de publicaci´on: 2 119 614 k 21 N´ume o de solici ud: 9500272 k 51 In . Cl.6:A61K 45/06 A61K 45/08 k 12 PATENTEDEINVENCION B1 k 22 Fecha de p esen aci´on: 08.02.95 k 73 Ti ula /es: Uni e sidad de Se illa, Vice ec o ado de In es igaci´on y T ans e encia Tecnol´ogica Valpa aiso, 5, 2◦ 41013 Se illa, ES k 43 Fecha de publicaci´on de la solici ud: 01.10.98 Fecha de concesi´on: 26.05.99 k 72 In en o /es: L´opez Ba neo, Jos´e; U e˜na L´opez, Juan; F anco Ob eg´on, Al edo; Cas ellano O ozco, An onio; Mon o o Laseca, Ra ael; Molina Pach´on, An onio y O ega Saenz, Pa icia k 45 Fecha de anuncio de la concesi´on: 01.07.99 k 45 Fecha de publicaci´on del olle o de pa en e: 01.07.99 k 74 Agen e: No cons a k 54 T´ı ulo: U ilizaci´on en composiciones a macol´ogicas de agen es con e ec o educ o o induc o de hipoxia. k 57 Resumen: U ilizaci´on en composiciones a macol´ogicas de agen- es con e ec o educ o o induc o de hipoxia. Se p opone como nue a la u ilizaci´on en p epa ados a macol´ogicos de agen es educ o es, y en gene al aquellos que p oduzcan hipoxia, que bien solos, o unidos po mezcla ´ısica o ligamien o qu´ımico a sus- ancias que los ehiculicen y di ijan hacia sus dia- nas, y especialmen e a an agonis as del calcio ( ales como ni edipina, dil iazem o e apamil), in e accio- nen con los canales de calcio de la memb ana celu- la y p oduzcan una disminuci´on de la en ada del ca i´on Ca2+ al in e io de las c´elulas. Es de des a- ca la acci´on de es os agen es sob e los canales de calcio de la ib a muscula lisa, donde p oducen dis- minuci´on del lujo del ca i´on al ci osol y, po lo an o, elajaci´on. Es de aplicaci´on en la indus ia a mac´eu ica y en cl´ınica, pa a la elabo aci´on de composiciones a - macol´ogicas pa a el a amien o de si uaciones pa- ol´ogicas debidas a un aumen o de la con ac ilidad de la ib a muscula lisa, como po ejemplo hipo- enso es (po elajaci´on del m´usculo liso a e ial) o inhibido es de la mo ilidad in es inal o u e ina. A iso: Se puede ealiza consul a p e is a po el a ◦37.3.8 LP. Ven ade asc´ıculos: O icina Espa˜nola de Pa en es y Ma cas. C/Panam´a, 1 – 28036 Mad id ES 2 119 614 B1 1ES 2 119 614 B1 2 DESCRIPCION U ilizaci´on en composiciones a macol´ogicas de agen es con e ec o educ o o induc o de hi- poxia. Obje o de la in enci´on La in enci´on se e ie e a la posibilidad de gene- a una p epa aci´on a macol´ogica o mada a base de agen es educ o es que bien solos, o unidos po mezcla ´ısica o ligamien o qu´ımico a sus an- cias que los ehiculicen y di ijan hacia sus dianas y especialmen e a an agonis as del calcio ( ales como ni edipina, dil iazem o e apamil), in e ac- cionen con los canales de calcio de la memb ana celula y p oduzcan disminuci´on de la en ada del ca i´on Ca2+ al in e io de las c´elulas. Es a acci´on pod ´ıa ene consecuencias biol´ogicas muy di e - sas, des ac´andose su acci´on sob e los canales de calcio de la ib a muscula lisa donde p oducen disminuci´on del lujo de es e i´on al ci osol y, po lo an o, elajaci´on. Al consegui elajaci´on de la ib a muscula con es a nue a o mulaci´on (hipo- xia gaseosa o qu´ımica y agen es educ o es solos o jun o a an agonis as de canales de calcio) se pod ´an modi ica si uaciones pa ol´ogicas que se deban a un aumen o de la con ac ilidad de la ib a muscula lisa. Po ejemplo, es os p epa a- dos pod ´ıan ac ua como hipo enso es (al elaja el m´usculo liso a e ial) o como inhibido es de la mo ilidad in es inal o u e ina. Es ado de la ´ecnica Es ´a bien demos ado que g an can idad de unciones celula es, como la sec eci´on o la mo i- lidad, dependen de la en ada de calcio desde el ex e io al ci osol a a ´es de canales selec i os de la memb ana plasm´a ica. Den o de las di e en- es unciones dependien es de la en ada de calcio des aca, po su pa icipaci´on en nume osas si ua- ciones isiopa ol´ogicas de g an p e alencia en la poblaci´on, la con acci´on de la ib a muscula lisa, an o isce al como ascula . Es as c´elulas nece- si an pa a su con acci´on un aumen o en la con- cen aci´on ci os´olicadecalcioi´onico (Ca2+). Los agen es que p oducen con acci´on de las ib as muscula es lisas ac ´uan po lo an o aumen ando el calcio ci os´olico, libe ´ando el ca i´on desde al- macenes in acelula es o a o eciendo su en ada desde el ex e io a a ´es de canales i´onicos. Los ´a macos que disminuyen la concen aci´on de calcio ci os´olico p oducen inhibici´on de la con- ac ilidad de la ib a muscula lisa. Es e e ec o iene u ilidad en di e en es si uaciones isiopa- ol´ogicas que a ec an al m´usculo liso isce al, pe o es de impo ancia especial en el m´usculo liso as- cula . En odos los lechos ascula es el aumen o de calcio ci os´olico da luga a con acci´on de la ib a muscula lisa, lo que p oduce hipe ensi´on ydisminuci´on del iego en ejidos espec´ı icos. De hecho, las sus ancias isiol´ogicas con mayo ac i- idad hipe enso a, como po ejemplo la angio- ensina II, p oducen un aumen o muy ue e en el calcio i´onico del ci osol. Como agen es an ihi- pe ensi os y aso elajan es se usan ´a macos que inhiben la s´ın esis de angio ensina II (inhibido es del enzima con e so de angio ensina) o que dis- minuyen de o ma di ec a la en ada de calcio a la c´elula muscula . A es e segundo g upo pe e- necen los llamados an agonis as del calcio como, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 en e o os, dil iazem, e apamil y dihid opi i- dinas (ni edipina, nisoldipina, nimodipina, e c). Adem´as de los agen es que ac ´uan di ec amen e sob e la ib a muscula lisa, exis en ac o es p o- ducidos po las c´elulas endo eliales que se libe an en di e en es condiciones y que ac uando sob e las ib as lisas egulan el ono ascula . De es os agen es des aca el ´oxido n´ı ico, po en e asodila- ado que, a a ´es de mecanismos oda ´ıa no del odo bien conocidos, inhibe la en ada de calcio a las c´elulas muscula es de la pa ed ascula . En ejidos hip´oxicos se sabe que se p oduce una aso elajaci´on eac i a encaminada a que se a o ezca la i igaci´on. Es e p oceso, que se ob- se a u ilizando a e ias denudadas (a las que se ha ex aido la pa ed endo elial), se supone es ´a p oducido po que la al a de O2,al e alaho- meos asis de Ca2+ en la ib a muscula lisa. Sin emba go, no se conoce ning´un p oceso egulado po O2en mioci os a e iales que pudiese expli- ca es e en´omeno. En o as c´elulas, como po ejemplo en las c´elulas gl´amicas, hemos demos- ado que exis en canales i´onicos de K+ egula- dos po O2(L´opez-Ba neo e al., 1988). La p e- sen e in enci´on se basa en la exis encia en la ib a muscula lisa de canales de calcio egulados po ox´ıgeno que se inhiben po hipoxia o po agen es educ o es. Es os canales explican el e ec o di- la ado de la hipoxia isula y, de es e modo, se ab e la posibilidad a que la hipoxia y los agen es educ o es (solos o jun o a inhibido es de canales de calcio, bien sepa ados o en la misma mol´ecula) se u ilicen como ´a macos elajan es del m´usculo liso en gene al y como ´a macos asodila ado es y an ihipe ensi os, en pa icula . Desc ipci´on gene al 1. Desc ipci´on expe imen al de la inhibici´on de la co ien e de calcio po la hipoxia. La obse aci´on expe imen al que condujo a la in enci´on que aqu´ı se desc ibe es ´a ilus ada en la igu a 1. En mioci os dispe sos enzim´a icamen e se egis a on las co ien es de calcio u ilizando la con igu aci´on en “c´elula comple a” de la ´ecnica de “pa ch-clamp” (Hamill e al., 1981). Los m´e- odos de dispe si´on de c´elulas y de egis o elec- o isiol´ogico, se explican con de alle en publica- ciones p e ias (L´opez-Ba neo, 1991). En la Fig. 1A se mues an co ien es de calcio egis adas du an e pulsos de despola izaci´on desde -80 mV has a +10 mV en un mioci o, de la a e ia ce- liaca de a a ba˜nado en una soluci´on ex acelula no m´oxica(PO2=150 mm Hg), du an e la expo- sici´on a una soluci´on de igual composici´on i´onica pe o equlib ada con una concen aci´on baja de O2(PO2<70 mm Hg) y as ein oduci la so- luci´on con ol en la c´ama a. Los egis os demues- an que la ampli ud de la co ien e (medida al i- nal del pulso) se inhibe ap oximadamen e un 40%. La elaci´on en e la ampli ud de la co ien e y la PO2se ilus a en la Fig. 1B, donde los alo es de la co ien e m´axima (c´ı culos neg os) mues an que las modi icaciones en la ampli ud de la co- ien e ocu en con un cu so empo al pa ecido a los cambios en la PO2y que es e e ec o es pa i- cula men e apa en e po debajo de los 70-80 mm Hg. Expe imen os pa ecidos se han ealizado en mioci os de la a e ia emo al con id´en icos e- sul ados. En esumen, es os da os indican que 2 3ES 2 119 614 B1 4 la co ien e de calcio, an o en a e ias isce a- les (como la cel´ıaca) como en a e ias muscula- es (como la emo al), se inhibe e e siblemen e cuando la PO2baja a ni eles pa ecidos a los que se pueden alcanza en ejidos pe i ´e icos en con- diciones isiol´ogicas o isiopa ol´ogicas. 2. Desc ipci´on expe imen al de la inhibici´on del calcio ci os´olico po hipoxia y agen es educ o es. Si la hipoxia p oduce una disminuci´on en la ampli ud de la co ien e de calcio, es de espe a que es o se aduzca en una disminuci´on del cal- cio ci os´olico y en la con acci´on. El e ec o de la hipoxia sob e el calcio ci os´olico se es im´o di ec- amen e po los cambios en la in ensidad de luo- escencia emi ida po Fu a-2 que en su o ma es- e se in odujo p e iamen e den o de las c´elulas. Los de alles de es a me odolog´ıa es ´an desc i os en mul i ud de publicaciones ( e po ejemplo Toledo-A al e al., 1993). En la mayo ´ıa de los mioci os es udiados la concen aci´on basal de Ca ci os´olico es imada con es a ´ecnica es de ap o- ximadamen e 30-40 nM y la es imulaci´on con un agonis a pu in´e gico (1 mM i os a o de adeno- sina), induce la g´enesis de oscilaciones de Ca2+ ci os´olico. Es as oscilaciones se han desc i o en a ios ipos celula es y en el m´usculo liso pue- den media la con a ilidad ´ı mica de las c´elulas (Bla e y Wie , 1992). En mioci os dispe sos de la a e ia pulmona , que ienen mayo densidad de canales de calcio dependien es de po encial que en a e ias sis ´emicas, las oscilaciones de Ca2+ ci- os´olico se obse an espon ´aneamen e. Un ejem- plo ´ıpico de oscilaciones de Ca2+ gene adas en un mioci o de la a e ia cel´ıaca se ilus a en la Fig. 2A, donde se ap ecia cla amen e que es as oscilaciones disminuyen en ampli ud y ecuencia de o ma e e sible du an e la exposici´on a una soluci´on hip´oxica. En la misma igu a se mues a el egis o de un elec odo de O2localizado en la c´ama a de e- gis o. Se sabe que las oscilaciones de Ca2+ se deben undamen almen e a la libe aci´on de calcio de almacenes in acelula es pe o que ´es as equie- en pa a su man enimien o el lujo ansmemb a- na io in e mi en e de iones Ca2+. De acue do con es a idea la despola izaci´on de las c´elulas con una soluci´on que con en´ıa al o K+ex e no da luga a un inc emen o en la ecuencia de las oscilaciones has a que se alcanza un aumen o man enido de Ca2+ in acelula (Fig. 2B). El e ec o con a io (disminuci´on o sup esi´on de las oscilaciones) se obse a cuando se e i a el calcio del medio in- acelula (Fig. 2C) o se bloquea su en ada po canales dependien es de po encial con ni edipina (Fig. 2D). Los da os mos ados en el p´a a o an e io in- dican que la disminuci´on en la PO2p oduce su acci´on elajan e disminuyendo el calcio in acelu- la y que es e e ec o es el esul ado de la inhibici´on de canales de Ca2+ dependien es de po encial que se desc ibi´o an e io men e. Hemos comp obado expe imen almen e que la hipoxia no a ec a a la libe aci´on de Ca2+ de almacenes in acelula es p oducida po ca e´ına (10 mM) o no ad enalina (3 mM) ni e i a el llenado de almacenes in a- celula es que se depleciona on p e iamen e con ca e´ına. De acue do con es a idea, la Fig. 3A 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 mues a que en mioci os donde la concen aci´on de Ca2+ e a ela i amen e al a (y como se mos ´o en la Fig. 2B las oscilaciones es ´an ausen es o son de poca ampli ud) el e ec o de la hipoxia es una disminuci´on de los ni eles basases de Ca2+ lo que de e mina la apa ici´on de oscilaciones de mayo ampli ud. En ´e minos mec´anicos, el e ec o de la hipoxia en es os casos es p obablemen e el paso de una con acci´on con enida a con acciones in- e mi en es. Los mecanismos molecula es po los que la hi- poxia p oduce inhibici´on de los canales de Ca2+ no se conocen con de alle, pe o expe imen os en nues o labo a o io sugie en que es e e ec o se debe a la educci´on de dominios espec´ı icos de la mol´ecula. En expe imen os ecien es hemos ob- se ado que los agen es educ o es ex e nos inhi- ben ambi´en la ampli ud de la co ien e de cal- cio en mioci os. Es e e ec o se ilus a en la Fig. 3B donde en condiciones no ni´oxicas y con un pH cons an e de 7.4, un agen e educ o como el ´acido asc´o bico (1 mM) p oduce una disminuci´on d ´as ica de la concen aci´on de Ca2+ in acelula en un n´uoci o. Un e ec o simila al de la hipoxia (Fig. 3A). En esumen, exis en canales de calcio egula- dos po ox´ıgeno en los mioci os a e iales. En es a Memo ia se desc ibe po ez p ime a que es os canales se inhiben po la hipoxia o agen es educ- o es y que es e e ec o se aduce en disminuci´on de la concen aci´on p omedio de calcio ci os´olico, lo que media la elajaci´on a e ial en espues a a la hipoxia. Los agen es educ o es ienen po lo an o un e ec o elajan e del m´usculo liso y po en- cian conside ablemen e la acci´on sob e es e ipo de c´elulas m´as que los bloquean es cl´asicos de ca- nales de calcio. Desc ipci´on de allada y modo de eali- zaci´on A con inuaci´on se desc ibe una aplicaci´on de la in enci´oncomo elajan edem´usculo liso as- cula , median e dos ejemplos ealizados sob e ci- lind os de a e ias in ac as, que deben en e de se no ienen ca ´ac e limi a i o de la misma. Ejemplo 1 Se u iliza on 5 conejos albinos de 1,5-2 kg de peso a los que bajo anes esia con pen oba bi al (i. . 40 mg/kg de peso) se ex aje on ap oxi- madamen e 10 mm de a e ia celiaca o emo al. T as la ex acci´on los asos se coloca on inme- dia amen e en sue o isiol´ogico, se limpia on de g asa y ejido adhe en e y se co a on en seccio- nes cil´ınd icas de ap oximadamen e 3 mm de lon- gi ud. Pa a la ealizaci´on de los expe imen os las secciones se mon a on en ba˜nos de ´o ganos indi- iduales de 10 ml en e alamb es de ungs eno de unos 80 Mm de di´ame o los cuales se conec a- on a ansduc o es de ue za. Se man u ie on a una ensi´on de eposo de ap oximadamen e 1,5- 2,0 g. Los cilind os de a e ias es aban ba˜nados en una soluci´on ex e na con la siguien e compo- sici´on (en milimoles/li o): 140 ClNa, 4 ClK, 1 Cl2Mg, 2,5 Cl2Ca, 5 glucosa, 5 Hepes, a un pH de 7.4. Es a soluci´on se bu buje´o bien con ai e o con mezclas de ai e y ni ´ogeno has a alcanza p esiones de ox´ıgeno a iables. La p esi´on pa cial de ox´ıgeno en la ecindad del ozo de m´usculo se 3 5ES 2 119 614 B1 6 midi´o con un elec odo de O2 ab icado en nues o labo a o io (Gan o nina y L´opez-Bameo, 1992). Se ealiza on medidas de ensi´on en la soluci´on ex e na con ol, as a˜nadi a ´es a no ad enalina (NA; 0,3-1 µM) pa a con ae las ib as o despu´es de a˜nadi una soluci´on con una al a concen aci´on de K+(40K; 40 mM ClNa se cambia on po la misma can idad de ClK). La NA es un agen e que se sabe p oduce con acci´on po ape u a de canales de calcio de la memb ana y en ada de calcio adem´as de po libe aci´on de calcio de alma- cenes in acelula es. El al o K+ex e no p oduce con acci´on po despola izaci´on de la memb ana, ape u a de canales de calcio y po en ada del ca i´on desde el medio ex acelula . Es as solu- ciones de p ueba se u iliza on bien no m´oxicas (con una PO2de ap oximadamen e 150 mm Hg) ohip´oxicas (con PO2de ap oximadamen e 20-30 mm Hg). Los alo es de ensi´on en las di e en es condiciones expe imen ales se dan como media ± des iaci´on es ´anda . En condiciones no m´oxicas la NA p odujo con acciones que llega on de los 1,5-2 g inicia- les a 6,8 ±0,4 g (n=20) y 7,2 ±0.8 g (n=16) en las a e ias cel´ıaca y emo al espec i amen e. En p esencia de una soluci´on ex e na con baja PO2,seobse ´o una disminuci´on e e sible de las con acciones p o ocadas po la NA que ue muy apa en e cuando la PO2e a in e io a 40-50 mm Hg. En es as condiciones la educci´on de las con acciones ue en ambas a e ias de un 30% del alo egis ado en no moxia. En ausencia de cal- cio ex acelula , las con acciones p oducidas po la NA e an muy d´ebiles (no supe io es a 2,5 g) y lahipoxiano u oe ec osob e´es as. Una acci´on pa ecida a la hipoxia en´ıan los agen es educ o- es que se han es udiado (´acida asc´o bico 0,5 mM y di io ei ol 0,2 mM) los cuales en condiciones no m´oxicas eduje on las con acciones e ocadas po laNAenambos iposdea e iasenun20- 25%. Un e ec o pa ecido al de la NA iene la admi- nis aci´on de una soluci´on ex e na con una al a concen aci´on de K+(40 mM). En condiciones no m´oxicas la soluci´on 40K da luga a con accio- nes de 9,2 ±1 g (n=20) y 12,4 ±1,3 g (n= 14) en las a e ias cel´ıaca y emo al, espec i amen e. Es as con acciones desapa ecen o almen e en ausencia de calcio ex acelula . En ambos ipos de a e ias el a amien o con 40K en p esencia de hipoxia (PO2po debajo de 40 mm Hg) p odujo disminuci´on has a un 20-25% en las con acciones en ambos ipos de a e ias. Un a ec o cuan i a- i amen e simila al de la hipoxia u ie ion los agen es educ o es indicados an e io men e. Es as expe iencias en la a e ia comple a mues- an que una composici´on a macol´ogica con e- niendo agen es educ o es, cap ado es de ox´ıgeno o simplemen e la hipoxia, son po en es elajan es de las a e ias con aidas p e iamen e bien con no ad enalina o con al o K+ex e no. Es e e ec o es po in e acci´on con los canales de calcio de la memb ana celula como se mos ´opo losexpe- imen os en c´elulas aisladas desc i os en p´a a os an e io es. Ejemplo 2 En el segundo ipo de expe iencias en cilin- d os de a e ias comple as lo que se ha es udiado 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 han sido los e ec os de los an agonis as del cal- cio ( e apamil, 5-10 µM y ni edipina 2 µM) sob e las con ac u as e ocadas po NA y po 40K en p esencia o ausencia de hipoxia y agen es educ- o es. La me odolog´ıa u ilizada ue la indicada an e io men e y los agen es se a˜nadie on a la so- luci´on ex e na. En condiciones no m´oxicas an o el e apamil como la ni edipina eduje on de o ma ma cada las con acciones p oducidas po al o K+ex a- celula a menos del 30% del alo inicial en los dos ipos de a e ias u ilizadas ( e alo es en la expe- iencia an e io ). Es e e ec o ue ma cadamen e po enciado po la hipoxia y con PO2in e io es a 50 mmHg las con acciones se abolie on casi com- ple amen e. Un e ec o simila a la hipoxia u ie- on los agen es educ o es. Los an agonis as del calcio ( e apamil y ni edipina) u ie on sin em- ba go un e ec o menos po en e sob e las con ac- ciones p oducidas po NA, con una disminuci´on a alo es en e el 70-80% de los medidos en si- uaci´on con ol. En es as condiciones la hipoxia o los agen es educ o es u ie on un e ec o adi i o al de los an agonis as del calcio disminuyendo las con acciones e ocadas po NA has a alo es po debajo del 50% del alo inicial. En conclusi´on, una composici´on a macol´ogica con agen es educ o es y cap ado es de ox´ıgeno o la hipoxia son po enciado es de la acci´on elajan e de los bloquean es de canales de calcio de la mem- b ana celula . El e ec o combinado de es os dos ipos de agen es ( educ o es y an agonis as del calcio) es muy e icaz en las con ac u as p oduci- das po al o K+, debidas a la despola izaci´on de la memb ana y a la ape u a de canales de cal- cio. Aunque cuali a i amen e simila , el e ec o combinado de es os agen es es menos po en e en el caso de las con acciones p oducidas po NA donde adem´as de la en ada de calcio del ex e- io , exis e un componen e (no in luenciado po la hipoxia) de libe aci´on de calcio de almacenes in acelula es. Desa ollo inmedia o y campo de apli- caci´on de la in enci´on T as la obse aci´on a ni el celula y de a e ia comple a desc i as en la p esen e Memo ia es ne- cesa ia una ase de in es igaci´on y desa ollo que de e mine la composici´on de ini i a de la ´o mula a u iliza como posible medicamen o o ´a maco. Adem´as de po disoluci´on de un gas ine e como el ni ´ogeno que desplace al ox´ıgeno, un es ado hip´oxico puede ob ene se qu´ımicamen e po el uso de los llamados cap ado es de ox´ıgeno (“oxygen sca enge s”), compues os que, como el di io io- ni o, se unen al O2y disminuyen su concen aci´on e ec i a en el l´ıquido ex acelula . Como agen es educ o es qu´ımicos se pueden u iliza el ´acido asc´o bico ya ci ado, el glu a i´on educido, di io- ei ol, ace il cis e´ına u o os. P oponemos el uso de es os agen es jun o a an agonis as de canales de calcio (dil iazem, dihid opi idinas, e apamil) queyaseusanenlacl´ınica. Con es a asociaci´on se consegui ´a educi la dosis de an agonis as de calcio y, man eniendo el mismo pode e ap´eu ico, e i a en g an medida los e ec os secunda ios. Los agen es educ o es pod ´ıan mezcla se a los an a- gonis as del calcio en c´apsulas o comp imidos, sin emba go una posibilidad en p incipio muy a ac- 4 7ES 2 119 614 B1 8 i a es uni qu´ımicamen e ambos ipos de e ec- os. Se p oponen como posibilidades, no ´unicas, bien el desa ollo de mol´eculas dihid opi id´ınicas que engan un g upo qu´ımico educido o el de mol´eculas compues as po un g upo ac i o an a- gonis a del calcio (po ejemplo dihid opi idinas) ligado qu´ımicamen e a o o educ o . En cual- quie a de es os dos casos el dominio “an agonis a del calcio” u o a mol´ecula que no iene necesa ia- men e que exhibi ac i idad an agonis a del calcio se uni ´a con al a a inidad a los canales de calcio y anspo a ´ıa has a ellos la mol´ecula educ o a que en onces pod ´ıa ac ua localmen e con mucha mayo e icacia. Es deci , el g upo “an agonis a del calcio” o un ligando espec´ı ico de canales de calcio sin acci´on e ap´eu ica ehiculiza y di ige al g upo “ educ o o cap ado de O2” Desc ipci´on de los dibujos Figu a 1: A) Inhibici´on de los canales de calcio depen- dien es de po encial po la disminuci´on de la PO2, A. Co ien es de calcio mac osc´opicas egis adas en un mioci o dispe so de la a - e ia cel´ıaca du an e despola izaciones de 15 ms desde -80 mV has a +10 mV. El cambio de soluci´on ex e na no m´oxica con una PO2 de 150 mm Hg ( azado 1) a o a hip´oxica equilib ada con una PO2de 20 mmHg ( a- zados 2 y 3) p oduce una disminuci´on de la ampli ud de la co ien e. La e e sibilidad al ol e a la soluci´on no m´oxica se ilus a po el azado 4. B) Pa alelismo en el cu so empo al de los cam- bios de PO2en la c´ama a de egis o y la disminuci´on en la ampli ud de la co ien e. Los iempos a los que se ob u ie on los a- zados de la pa e A de la igu a se indican con el n´ume o co espondien e. La ampli- ud de la co ien e se midi´oinmedia amen e an es de la e minaci´on del pulso de po en- cial. Las soluciones de egis o con en´ıan (en mM): ⇒Ex e na: 140 ClNa, 2.7 ClK, 10 Cl2Ba, 10 Hepes, pH 7.4. ⇒In e na (soluci´on en el in e io de la pi- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 pe a de egis o y en la c´elula): 100 ClCs, 25 FCs, 2 Cl2Mg, 10 HEPES, 10 EGTA, 5 BAPTA, 4 MgATP, pH 7.3). Figu a 2: A) Medida simul ´anea de la concen aci´on de O2en la c´ama a de egis o ( ensi´on de O2y de los cambios en la concen aci´on de Ca2+ ci os´olico en un mioci o de la a e ia cel´ıaca ca gado con Fu a-2. N´o ese que las oscila- ciones de calcio disminuyen en ecuencia y ampli ud con o me se alcanzan ensiones de O2bajas. B) Aumen o e e sible en la ecuencia de las oscilaciones de Ca2+ en espues a a la des- pola izaci´on de la c´elula con una soluci´on ex e nal con 60 mM K+. C y D) Sup esi´on de las oscilaciones al e- i a el calcio ex acelula o quela lo con EGTA (C) y as bloquea los canales de calcio dependien es de po encial con ni edi- pina (D). La aplicaci´on de las di e en es so- luciones se indica po las ba as ho izon a- les. La soluci´on ex e na de egis o con en´ıa (en mM): 140 ClNa, 2.7 ClK, 2.5 Cl2Ca, 1 Cl2Mg, 10 HEPES, pH 7.35-7.40. La so- luci´on con 60 K+con en´ıa 82.7 mM ClNa y 60 mM ClK. La ni edipina (0.5 µM) se a˜nadi´oalasoluci´on ex e na. La soluci´on con 0 Ca2+ yEGTAcon en´ıa 4 mM Cl2Mg y0.5mMEGTA. Figu a 3: A) Expe imen o simila al que se ilus a en la Fig. 2A en un mioci o de la a e ia pulmo- na ( onco p incipal) que en´ıa una concen- aci´on basal de calcio ela i amen e al a. El pe ´ıodo de adminis aci´on de la hipoxia se indica po el ´a ea somb eada. B) Expe imen o simila ealizado en o o mio- ci o du an e la aplicaci´on de un agen e e- duc o como el ´acido asc´o bico (1 mM). 5 9ES 2 119 614 B1 10 REIVINDICACIONES 1. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ- o o induc o de hipoxia pa a la elabo aci´on de composiciones a macol´ogicas de acci´on elajan e sob e la ib a muscula lisa, ca ac e izada po - que dichos agen es ienen la capacidad de dismi- nui la concen aci´on isula de ox´ıgeno, lo que se aduce en una inhibici´on de la ac i idad de los canales del calcio en m´usculo liso. 2. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ o o induc o de hipoxia, seg´un ei indicaci´on 1, ca- ac e izada po que la inhibici´on de los canales del calcio es ´a mediada po agen es educ o es. 3. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ o o induc o de hipoxia, seg´un ei indicaci´on 1, ca- ac e izada po que la inhibici´on de los canales del calcio es ´a mediada po agen es qu´ımicos cap- ado es de ox´ıgeno. 4. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ- o o induc o de hipoxia, seg´un ei indicaci´on 1, ca ac e izada po que la inhibici´on de los ca- nales del calcio se encuen a po enciada po la asociaci´on de agen es educ o es y/o cap ado es de ox´ıgeno con o as sus ancias que inhiben la en ada del calcio al in e io de la c´elula, espe- cialmen e an agonis as del calcio. 5. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ o o induc o de hipoxia, seg´un ei indicaci´on 4, ca- ac e izada po que la asociaci´on es po dise˜no de una mol´ecula an agonis a del calcio a la que 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 se modi ica un g upo uncional en es ado qu´ımico educido. 6. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ o o induc o de hipoxia, seg´un ei indicaci´on 4, ca- ac e izada po que la asociaci´on es po dise˜no de una mol´ecula an agonis a del calcio ligada po cualquie m´e odo qu´ımico a una mol´ecula educ- o a y/o a un cap ado de ox´ıgeno. 7. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ o o induc o de hipoxia, seg´un ei indicaci´on 4, ca- ac e izada po que la asociaci´on se p oduce con un compues o que es un ligando de canales del calcio con al a a inidad sin acci´on a macol´ogica pe o que si e pa a ehiculiza y di igi has a su diana al agen e educ o y/o cap ado de ox´ıgeno. 8. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ o o induc o de hipoxia, seg´un ei indicaciones 2 a7,ca ac e izada po que el agen e educ o es uno de los siguien es compues os: ´acido asc´o bico, di io ei ol, glu a i´on educido, ace il cis e´ına. 9. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ o o induc o de hipoxia, seg´un ei indicaciones 3 a 7, ca ac e izada po que el agen e cap ado de ox´ıgeno es di io ioni o. 10. U ilizaci´on de agen es con e ec o educ o o induc o de hipoxia, seg´un ei indicaciones 4 a 7, ca ac e izada po que el an agonis a del calcio es ´a seleccionado del g upo compues o po : dil- iazem, e apamil, ni edipina, nimodipina, nisol- dipina, u nidipina y/o de i ados de los mismos. 6 ES 2 119 614 B1 7 ES 2 119 614 B1 8 ES 2 119 614 B1 9