Implicación de la entrada de calcio regulada por los reservorios en la vasoconstricción y proliferación inducida por urotensina-ii en aorta

1 FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA “Papel de la entrada de calcio regulada por reservorios en la vasoconstricción y proliferación celular inducida por Urotensina-II en aorta” Trabajo de investigación presentado por MARÍA RODRÍGUEZ MOYANO para optar al grado de Doctora en Biología Sevilla, 2012 2 INDICE INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………………………………………………….9 1. Papel emergente de los GPCR deorfanizados en la regulación cardiovascular…………9 2. La Urotensina-II y su relación con la fisiopatología cardiovascular............................12 - 2.1 Estructura y características generales…………………………………………………………………12 - 2.2 Efecto agudo de la Urotensina-II en el sistema cardiovascular: regulación del tono vascular………………………………………………………………………………………………………………………13 - 2.3 Efectos a largo plazo de la acción de la Urotensina-II a nivel cardiovascular……..14 - 2.3.1 Relación de la Urotensina-II con la fisiopatología cardiovascular - 2.3.2 Urotensina-II y proliferación celular - 2.3.3 Urotensina-II y aterosclerosis - 2.4 Mecanismo de acción de la Urotensina-II…………………………………………………………..17 3. Reactividad del músculo liso vascular........................................................................18 - 3.1 Estructura del músculo liso vascular…………………………………………………………………..18 - 3.2 Papel del Ca 2+ intracelular en la contracción vascular…………………………………………21 - 3.3 Regulación de la homeostasis de Ca 2+ intracelular…………………………………………….23 - 3.3.1 El retículo endo/sarcoplásmico - 3.3.2 Entrada de Ca 2+ a través de la membrana plasmática - 3.3.3 Proteínas de unión a Ca 2+ en el citosol -3.3.4 La ATPasa de Ca 2+ de la membrana plasmática (PMCA) y el intercambiador Na + / Ca 2+ - 3.3.5 La mitocondria 3 4. Canales de calcio regulados por reservorio (Store Operated Calcium Channels)…….31 - 4.1 Descubrimiento y concepto de la entrada de Ca 2+ regulada por los reservorios…31 - 4.2 Vía de señalización de la SOCE……………………………………………………………………………32 - 4.2.1 Stim1 - 4.2.2 Orai - 4.2.3 Canales TRPC - 4.2.4 Comunicación entre Stim, Orai y otras moléculas participantes en la SOCE - 4.2.5 Fosfolipasa A 2 independiente de Ca 2+ (iPLA 2 ) y su papel en la SOCE - 4.3 La entrada de Ca 2+ a través de los SOC en el músculo liso vascular…………………….43 - 4.3.1 Canales SOC y su influencia en el tono vascular - 4.3.2 Canales SOC, regulación de la expresión génica y proliferación de CMLV 5. Proliferación del músculo liso vascular y su relación con procesos fisiopatológicos………………………………………………………………………………………………………….47 - 5.1 Mecanismos promotores de la proliferación en células de músculo liso; papel de la homeostasis de Ca 2+ ……………………………………………………………………………………………….47 - 5.2 Regulación de la expresión génica por Ca 2+ y factores de transcripción inductores de proliferación………………………………………………………………………………………………………….47 - 5.3 Proliferación de las CMLV y su relación con la vía de los SOC……………………………49 - 5.4. Procesos de aterosclerosis y reestenosis en la pared vascular…………………………..50 OBJETIVOS ...................................................................................................................54 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................55 1. Modelo animal y disección de la aorta…………………………………………………………………..55 4 2. Cultivo primario de músculo liso…………………………………………………………………………….56 - 2.1 Dispersión de células de músculo liso vascular………………………………………………….56 - 2.2 Condiciones de incubación de los cultivos………………………………………………………….57 3. Análisis del tono vascular……………………………………………………………………………………….58 - 3.1 Estructura de la cámara de órganos……………………………………………………………………58 - 3.2 Preparación y montaje del vaso………………………………………………………………………….60 - 3.3 Recogida de datos y análisis del efecto de los inhibidores………………………………….63 4. Registro de Ca 2+ intracelular con microscopía de fluorescencia………………………………64 - 4.1 Papel del Fura-2 AM en el estudio de la movilización de Ca 2+ intracelular………….64 - 4.2 Estructura microscopio de fluorescencia y lámpara……………………………………………65 - 4.3 Fases del experimento……………………………………………………………………………………….66 - 4.4 Análisis de los datos……………………………………………………………………………………………67 5. Ensayo de proliferación………………………………………………………………………………………….68 - 5.1 Características del reactivo AlamarBlue……………………………………………………………..68 - 5.2 Fases del experimento, mediciones y análisis…………………………………………………….68 6. Inmunofluorescencia………………………………………………………………………………………………69 - 6.1 Marcaje con bromodeoxiuridina…………………………………………………………………………69 - 6.2 Inmunocitoquímica para PCREB………………………………………………………………………….71 - 6.3 Obtención de las imágenes y análisis de datos……………………………………………………71 5 7. Técnicas de biología molecular………………………………………………………………………………72 - 7.1 Transfección y silenciamiento con ARN interferente………………………………………….72 - 7.1.1 Función de los ARN interferentes - 7.1.2 Transfección de células de músculo liso 8. Grupos de tratamiento y análisis estadístico………………………………………………………….75 - 8.1 Tratamientos en registro del tono vascular……………………………………………………….75 - 8.2 Movilización de Ca 2+ intracelular………………………………………………………………………75 - 8.3 Ensayos de proliferación e inmunofluorescencia……………………………………………….76 - 8.4 Análisis estadístico…………………………………………………………………………………………….76 9. Soluciones……………………………………………………………………………………………………………...77 RESULTADOS ………………………………………………………………………………………………………….78 1. Efecto de la Urotensina-II sobre el tono vascular en aorta…………………………………….78 - 1.1 La Urotensina-II induce vasoconstricción de forma dosis-dependiente en anillos arteriales, con un importante papel del endotelio……………………………………………………..78 - 1.2 La Urotensina-II promueve un aumento en la concentración de Ca 2+ intracelular en células de músculo liso aisladas…………………………………………………………………………….80 - 1.3 El incremento en Ca 2+ y la vasoconstricción inducidos por Urotensina-II tienen lugar a través de su receptor específico y mediante la activación de la fosfolipasa C…83 2. Papel de los canales iónicos en la vasoconstricción mediada por la Urotensina-II....86 - 2.1 Los canales de Ca 2+ voltaje-dependientes participan de forma parcial en la contracción inducida por Urotensina-II………………………………………………………………………86 6 - 2.2 El aumento en tono vascular mediado por la Urotensina-II se revierte completamente mediante la inhibición farmacológica de los canales SOC………………..87 - 2.3 La entrada de Ca 2+ inducida por Urotensina-II también puede ser revertida por el uso de fármacos inhibidores de los SOC……………………………………………………………………..89 - 2.4 La Urotensina-II induce corrientes iónicas similares a I CRAC en células de músculo liso vascular, que se inhiben por bloqueantes de los SOC…………………………………………..90 3. Implicación de los nuevos componentes moleculares de la SOCE, Stim1 y Orai1, así como de TRPC1 en la entrada de Ca 2+ promovida por la Urotensina-II..........................93 4. Papel de la fosfolipasa A 2 independiente de Ca 2+ (iPLA 2 ), reguladora de la entrada de Ca 2+ a través de los SOC, en la respuesta a Urotensina-II………………………………………….96 - 4.1 La Urotensina-II aumenta la actividad de la iPLA 2 en células de músculo liso de aorta………………………………………………………………………………………………………………………….97 - 4.2 El inhibidor específico de la iPLA 2 revierte la contracción vascular mediada por la Urotensina-II………………………………………………………………………………………………………………98 - 4.3 La entrada de Ca 2+ inducida por Urotensina-II es sensible a la inhibición de la isoforma β de iPLA 2 , pero no a la de la isoforma γ…………………………………………………….99 5. La Urotensina-II estimula la proliferación de células de músculo liso vascular……..100 - 5.1 La incubación a largo plazo con Urotensina-II promueve cambios en la entrada de Ca 2+ regulada por los reservorios de CMLV………………………………………………………………101 - 5.2 La Urotensina-II induce proliferación celular a las 24 y 48 horas de su aplicación…………………………………………………………………………………………………………………102 - 5.3 El marcaje con BrdU confirma el efecto inductor de proliferación de la UrotensinaII……………………………………………………………………………………………………………………………….103 - 5.4 El aumento en proliferación mediado por Urotensina-II se inhibe mediante el tratamiento con inhibidores de los SOC……………………………………………………………………104 - 5.5 El silenciamiento de Stim1 logra revertir la proliferación inducida por UrotensinaII……………………………………………………………………………………………………………………………….105 7 - 5.6 Las proteínas Orai1 y TRPC1 se encuentran también fuertemente implicadas en la proliferación promovida por la Urotensina-II……………………………………………………………106 6. La Urotensina-II promueve la activación y translocación al núcleo celular del factor de transcripción CREB...................................................................................................108 - 6.1 La Urotensina-II induce la activación de CREB de forma dosis-dependiente……..108 - 6.2 El uso de inhibidores de los canales SOC previene la activación de CREB promovida por la Urotensina-II………………………………………………………………………………..109 - 6.3 Stim1 y TRPC1, pero no Orai1, juegan un importante papel en la activación de CREB mediada por la Urotensina-II…………………………………………………………………………..110 DISCUSIÓN .................................................................................................................112 1. La Urotensina-II como uno de los más potentes vasoconstrictores………………………112 - 1.1 Vasoconstricción por Urotensina-II en distintos territorios vasculares…………….112 - 1.2 Influencia de la presencia del endotelio en la contracción vascular mediada por Urotensina-II…………………………………………………………………………………………………………….114 - 1.3 La Urotensina-II y su efecto en la homeostasis de Ca 2+ intracelular…………………115 2. Papel de los canales de Ca 2+ en la regulación del tono vascular inducida por Urotensina-II…………………………………………………………………………………………………………….116 - 2.1 Participación de los canales voltaje-dependientes en la contracción vascular….116 - 2.2 Regulación del tono vascular y de la homeostasis de Ca 2+ por los SOC…………….117 - 2.3 Relación entre contracción vascular a través de los SOC y la iPLA 2 ; papel de la Urotensina-II…………………………………………………………………………………………………………….118 - 2.4 Papel de los distintos componentes de la SOCE en la contracción vascular……..120 - 2.5 TRPC1 como potencial componente del complejo macromolecular de la SOCE..120 8 3. Los cambios en fenotipo de las células de músculo liso vascular se asocian con alteraciones en la homeostasis de Ca 2+ …………………………………………………………………….122 4. Implicación de la Urotensina-II y los SOC en la proliferación de las células de músculo liso vascular……………………………………………………………………………………………………………..124 - 4.1 La Urotensina-II como activador de la proliferación celular…………………………….124 - 4.2 Papel de los SOC en el cambio de fenotipo del músculo liso vascular………………125 - 4.3 TRPC1 y su papel en la proliferación del músculo liso vascular………………………..126 5. La activación celular por entrada de Ca 2+ se acompaña de cambios en la expresión génica………………………………………………………………………………………………………………………127 - 5.1 Papel de los SOC en la activación de factores de transcripción mediada por Ca 2+ ………………………………………………………………………………………………………………………….127 6. Implicaciones fisiopatológicas de la proliferación promovida por la Urotensina-II a través de la SOCE en músculo liso vascular: posibles dianas terapéuticas………………..128 CONCLUSIONES ........................................................................................................131 BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………………………………………………………………….133 9 INTRODUCCIÓN 1. PAPEL EMERGENTE DE LOS GPCR DEORFANIZADOS EN LA REGULACIÓN CARDIOVASCULAR En los últimos años, la terminación de la primera parte del Proyecto Genoma Humano ha traído consigo la identificación de una gran variedad de péptidos y proteínas noveles, entre los que se encuentran un gran número de receptores acoplados a proteína G (G-protein coupled receptors) o GPCRs, con funciones fisiológicas hasta el momento desconocidas. En total, se calcula que en humanos existen unos 175 genes que codifican para GPCRs cuyo ligando endógeno aún no ha sido determinado; este tipo de receptores se denominan oGPCR (orphan GPCR) o GPCR “huérfanos” ( Katugampola y Davenport, 2003 ). Recientemente, los ligandos para algunos de estos GPCR noveles han sido identificados mediante el conjunto de procedimientos conocido como “farmacología inversa”. Mediante técnicas de clonación de los GPCR en ADN complementario y rastreo de genotecas con miles de proteínas diferentes, se ha llegado a la identificación de más de 40 ligandos para estos receptores; entre ellos, moléculas que poseen una gran influencia en la fisiología y/o fisiopatología vascular, como la urocortina, la apelina o la Urotensina-II ( Katugampola y Davenport, 2003 ). En suma, aproximadamente un 40-50% de los fármacos de prescripción médica actuales actúan sobre los GPCR, ya sea como agonistas o como antagonistas de éstos. Sin embargo, estos fármacos tan sólo tienen como diana a unos 200 GPCR de entre todos los existentes; lo cual indica que los, al menos, 800 restantes en cuyo conocimiento aún no se ha profundizado constituyen un vasto terreno de dianas terapéuticas por explorar ( Summers, 2010; Cook, 2010 ). Las proteínas G heterotriméricas constituyen uno de los componentes más relevantes en cuanto a transducción de señales intracelulares. Estas proteínas específicas de 16 Urotensina-II ejerce además un efecto sinérgico con LDL oxidadas, lisofosfatidilcolina (LPC), H 2 O 2 y serotonina ( Watanabe y col. 2001, 2001b ). Algunas hipótesis postulan que la U-II podría actuar de forma autocrina y/o paracrina en el tejido endotelial, induciendo de esa forma la proliferación y migración de las células de músculo liso vascular ( Watanabe y col. 2006 ), lo cual la relacionaría con el desarrollo de la aterosclerosis en la pared vascular. 2.3.3. Urotensina-II y aterosclerosis Además del incremento en la proliferación de las células de músculo liso vascular, la UII parece estar implicada también en otras características importantes de este proceso fisiopatológico. En aorta torácica de rata, la U-II es capaz de incrementar la permeabilidad de las células endoteliales, uno de los primeros tipos celulares en verse afectado en esta patología ( Gendron y col. 2004 ). En el endotelio de vena umbilical humana, la U-II activa la proliferación e inhibe la apoptosis mediante la vía de las MAP quinasas ( Shi y col. 2005 ). La U-II acelera además la formación en la placa de ateroma de las “foam cells” o “células espumosas” a partir de macrófagos, mediante el aumento en la expresión de ACAT-1 ( Watanabe y col. 2005 ). También activa a la enzima NADPH oxidasa induciendo la creación de especies reactivas de oxígeno ( Djordjevic y col. 2005 ), que pueden contribuir a acelerar el desarrollo de la placa de ateroma; y activa la formación de fibras de estrés en el citoesqueleto de células de músculo liso de aorta, efecto que parece tener lugar mediante la vía de las RhoA/Rho quinasas, implicadas en la desensitización a Ca 2+ ( Sauzeau y col. 2001 ). Finalmente, en ratones knockout para la Apolipoproteína E, que funcionan como modelo animal de aterosclerosis, la sobreexpresión inducida del receptor de U-II es capaz de promover lesiones en la aorta significativamente mayores que en ratones control ( Papadopoulos y col. 2009 ). Tomadas en conjunto, todas estas evidencias señalan la potencial implicación de la U-II en el desarrollo de este proceso en la pared vascular. 17 2.4. Mecanismo de acción de la Urotensina-II A pesar de la estrecha relación de la U-II con la fisiopatología del sistema cardiovascular, y de todos los efectos que ejerce en él tanto a corto como a largo plazo, aún no se conoce de forma exacta cuál es el mecanismo de señalización activado en el interior celular a partir de su unión al receptor UTS2R. Se han establecido diversas teorías sobre la vía por la cual la U-II ejerce su efecto en contracción vascular. En los primeros estudios que se llevaron a cabo sobre la vasoconstricción mediada por U-II en aorta torácica de rata, se describió relación entre la primera fase de la contracción y la activación de los canales de Ca 2+ voltajedependientes ( Gibson y col. 1988 ). Trabajos posteriores mostraron que la contracción vascular inducida por U-II podía ser revertida, además, por inhibidores de la ruta de las MAPK, de tirosín quinasas y de Rho quinasas, y se la relacionó con el sistema de sensitización a Ca 2+ mediado por Ca 2+ /calmodulina/cadena ligera de la miosina. Un dato interesante a tener en cuenta es que el uso de inhibidores de la entrada de Ca 2+ voltaje-dependiente no consigue revertir por completo la vasoconstricción promovida por la U-II ( Rossowski y col. 2002, Tasaki y col. 2004 ). Otros trabajos demuestran que la administración de U-II eleva el nivel de InsP 3 en aorta de conejo de forma dosisdependiente, en la misma medida en que promueve contracción vascular ( SaetrumOpgaard y col. 2000 ). En la figura 3 se muestra un resumen de todas estas vías de acción descritas en la literatura en base a diversos efectos de la U-II. Sin embargo, y a pesar de los numerosos estudios al respecto, la vía o vías de señalización por las cuales la U-II ejercería todos estos efectos a nivel vascular aún no se encuentra claramente determinada. Figura 3. Esquema repr esentativo de las posibles vías de señalización intracelular activadas por la U células de músculo liso y endoteliales de la pared vascular. Para elucidar los componentes implicados en esta ruta molecular, primero es importante conocer los principal músculo liso vascular regulan la homeostasis del Ca reactividad de este músculo y que a su vez efectos inducidos por la U vascular. 3. REACTIVIDAD DEL MÚSCULO LISO VASCULAR 3.1. Estructura del músculo liso vascular El músculo liso vascular es de tipo involuntario y de unidad capaces de contraerse de forma independiente. Se caracteriza por no presentar fibras organizadas en sarcómeros, por es los músculos esquelético y cardíaco. 18 esentativo de las posibles vías de señalización intracelular activadas por la U células de músculo liso y endoteliales de la pared vascular. Para elucidar los componentes implicados en esta ruta molecular, primero es importante conocer los principal es mecanismos mediante los cuales las células de músculo liso vascular regulan la homeostasis del Ca 2+ intracelular, proceso clave en la reactividad de este músculo y que a su vez se encuentra relacionado con efectos inducidos por la U - II: la vasoconstricción y la proliferación del músculo liso 3. REACTIVIDAD DEL MÚSCULO LISO VASCULAR 3.1. Estructura del músculo liso vascular El músculo liso vascular es de tipo involuntario y de unidad múltiple; sus células son capaces de contraerse de forma independiente. Se caracteriza por no presentar fibras organizadas en sarcómeros, por es t a razón no posee las estriaciones características de los músculos esquelético y cardíaco. Papadopoulos y col. 2007 esentativo de las posibles vías de señalización intracelular activadas por la U -II en Para elucidar los componentes implicados en esta ruta molecular, primero es es mecanismos mediante los cuales las células de intracelular, proceso clave en la se encuentra relacionado con dos de los II: la vasoconstricción y la proliferación del músculo liso múltiple; sus células son capaces de contraerse de forma independiente. Se caracteriza por no presentar fibras a razón no posee las estriaciones características de Papadopoulos y col. 2007 19 Su estructura se basa en la existencia de los cuerpos densos (equivalentes a las líneas Z del músculo estriado) entre los cuales se extienden los filamentos de actina. En la región central entre los cuerpos densos, solapándose con los filamentos de actina, se localizan los filamentos gruesos de miosina, como se muestra en la figura 4. Las células de músculo liso vascular (CMLV) presentan invaginaciones de la membrana plasmática llamadas caveolas, bajo las cuales discurre la mayor parte del retículo sarcoplásmico (RS), de una forma análoga a la distribución de los túbulos T y el RS en el músculo estriado. Las uniones estrechas entre las CMLV sirven como anclaje mecánico para evitar que las células se separen entre sí durante la contracción. Además, estas células se organizan de forma circunferencial alrededor de la luz del vaso, facilitando así la contracción vascular ( Berne y Levy, 2006 ). Figura 4. Estructura básica de una fibra de músculo liso, en la que se muestran los anclajes entre los filamentos de actina (filamentos finos) y los de miosina (filamentos gruesos). Por otra parte, la estructura de un vaso completo se compone de tres capas principales o túnicas, que van de la luz del vaso al exterior (figura 5): - Capa íntima: la constituye una monocapa de células endoteliales altamente especializadas y multifuncionales, que a su vez descansa sobre una lámina basal. El endotelio posee diversas funciones en la pared vascular, siendo una de las más importantes contribuir a la regulación del tono vascular mediante la síntesis de óxido nítrico. Sin embargo, también se encuentra implicado en 20 funciones de adhesión celular, de inhibición de la coagulación sanguínea y de transporte, entre otras. - Capa media: formada mayoritariamente por células de músculo liso reforzadas por capas organizadas de tejido elástico (lámina elástica). Esta capa es bastante prominente en las arterias, más fina en venas y prácticamente inexistente en vasos pequeños y/o capilares. El grado de contracción y relajación de las CMLV se modula por hormonas y neurotransmisores, a través del sistema nervioso autónomo y de los compuestos vasoactivos segregados por el tejido endotelial. - Capa adventicia: se encuentra compuesta básicamente por colágeno y elastina, pero también puede contener células de músculo liso, especialmente en venas. ( Stevens y Lowe, 2006 ). Figura 5. Diferenciación de las distintas capas de tejido en el corte longitudinal de un vaso sanguíneo. Existen dos tipos principales de arterias: las arterias elásticas o de conducción, como la aorta torácica, que se caracterizan por poseer una capa media muy desarrollada y con una alta cantidad de fibras elásticas organizadas en capas concéntricas. Por otro lado están las arterias de resistencia o musculares, como la cerebral o la mesentérica, que poseen una mayor proporción de CMLV en su capa media y menos capas de láminas elásticas ( Stevens y Lowe, 2006 ). Arce-Torres y col. 2008 21 3.2. Papel del Ca 2+ intracelular en la contracción vascular La contracción del músculo liso vascular se encuentra modulada por la intervención de hormonas y/o neurotransmisores que inducen un aumento en la concentración de Ca 2+ citosólico en las CMLV. Algunos de estos agonistas actúan promoviendo una despolarización de la membrana plasmática y la subsiguiente activación de los canales de Ca 2+ voltaje-dependientes presentes en ella ( Berne y Levy, 2006 ). Otras de estas sustancias, en cambio, actúan mediante diferentes rutas de señalización intracelular que no requieren cambios en el potencial de membrana para su activación. Estas vías se relacionan generalmente con la activación de la fosfolipasa C, que rompe el fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP 2 ) produciendo diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (InsP 3 ); éste último abre canales en la membrana del RS y promueve liberación al citosol del Ca 2+ almacenado en este orgánulo (figura 6). Algunos de los agonistas capaces de contraer el músculo liso vascular mediante esta vía son la angiotensina-II o la fenilefrina ( Berridge y col. 1993, Potier y Trebak. 2008 ). Figura 6. Vía de señalización intracelular de la contracción en miocitos de músculo liso. Extraído de www.uam.es (web de docencia de Fisiología de la Universidad Autónoma de Madrid) 22 El mecanismo de contracción del músculo liso vascular es ligeramente diferente al de los músculos cardiaco y esquelético. El proceso en este caso recibe el nombre de “ciclo de los puentes cruzados”. La miosina, componente de los filamentos gruesos, consta de dos cadenas gruesas y dos ligeras. Una de estas cadenas ligeras (MLC20) al fosforilarse mediante la acción de la quinasa de la cadena ligera (MLCK) que actúa de forma dependiente de Ca 2+ /calmodulina, promueve la interacción de la actina con la miosina y la contracción del músculo liso. La relajación muscular tiene lugar cuando disminuye la concentración de Ca 2+ intracelular y MLC20 se desfosforila por acción de una fosfatasa específica ( Berne y Levy, 2006; Hirano 2007 ). El músculo liso vascular es de tipo tónico, por lo que es capaz de mantener la contracción durante periodos de tiempo prolongados. Esto se lleva a cabo con poco gasto de energía gracias a la existencia del denominado estado de interacción, en el cual la cadena ligera de la miosina es desfosforilada por la fosfatasa cuando aún se encuentra unida a los filamentos de actina, lo que ralentiza de forma considerable la separación de ambos tipos de filamentos y el comienzo de otro ciclo de puentes cruzados. La existencia del estado de interacción hace posible que el músculo liso vascular permanezca contraído durante largos periodos de tiempo con el fin de mantener el tono vascular ( Berne y Levy, 2006 ). Sin embargo, a la hora de hablar de este proceso, debemos tener en cuenta que un aumento en la concentración de Ca 2+ intracelular de la misma magnitud no siempre produce el mismo grado de vasoconstricción. Esto depende de varios factores; por ejemplo, la unión de un agonista a su receptor suele estimular una mayor vasoconstricción que cuando ésta se induce por cambios en el potencial de membrana. También tiene una gran influencia el curso temporal de la contracción: así, la fase tónica de la contracción requiere menos aumento de Ca 2+ . Este tipo de fenómenos se engloban dentro del proceso llamado “sensitización a Ca 2+ de la maquinaria contráctil” ( Somlyo y Somlyo. 1993, Hirano 2007 ). De esta forma, el grado de contracción del músculo liso vascular depende conjuntamente de la movilización de Ca 2+ intracelular y de la sensitización de las células musculares a éste. 23 La sensitización del músculo liso vascular puede operar de forma tanto dependiente como independiente de la fosforilación de MLC20; en el primer caso, se considera que la regulación de la actividad de la fosfatasa (MLCP) juega un mayor papel en estos procesos. La fosforilación de MLCP por quinasas específicas tiene como consecuencia una disminución de su actividad. Una de estas quinasas capaces de inhibir a MLCP es la Rho quinasa, que se activa a su vez por RhoA, aumentando la sensitización del aparato contráctil. La vía RhoA-Rho quinasas parece tener una gran relevancia en condiciones fisiopatológicas, como modelos animales de hipertensión ( Hirano 2007 ). A pesar de todo, aún no está del todo clara la manera en que estos mecanismos se regulan por los agonistas estimuladores de la contracción vascular; ni cuáles de ellos juegan un papel verdaderamente relevante en condiciones fisiológicas. 3.3. Regulación de la homeostasis de Ca 2+ intracelular El Ca 2+ es uno de los mensajeros intracelulares más importantes en prácticamente todos los organismos existentes ( Berridge y col. 2003, Kurosaki y Baba 2010 ), y se encarga de regular una gran variedad de procesos, tanto a corto como a largo plazo. Sin embargo, es tóxico para la célula a altas concentraciones. Así, aunque la concentración extracelular de Ca 2+ ronda los 10 -3 mol/l, dentro de la célula debe mantenerse durante la mayor parte del tiempo a concentraciones del orden de 10 -7 mol/l, aunque en estados temporales de activación puede llegar hasta 10 -6 mol/l ( Kurosaki y Baba 2010 ). Por tanto, la homeostasis de Ca 2+ en el citosol es un proceso fundamental en la fisiología celular, y se compone de un balance continuo entre las vías de entrada de Ca 2+ desde el medio extracelular, los quelantes y efectores que se unen al ión una vez dentro del citoplasma y los mecanismos que exportan Ca 2+ de la célula o lo almacenan en los reservorios intracelulares, principalmente el retículo sarcoplásmico en células musculares ( Berridge y col. 2003 ). En los siguientes apartados hablaremos más en detalle de este proceso, que aparece reflejado de forma esquemática en la figura 7. 24 Figura 7. Dinámica de la homeostasis de Ca 2+ intracelular. Este balance de Ca 2+ dentro de la célula cataliza una gran variedad de procesos, tanto de forma prácticamente instantánea como a medio/largo plazo. 3.3.1. El retículo endo/sarcoplásmico. El retículo endo/sarcoplásmico (ER/SR) es un orgánulo de membrana que constituye uno de los principales reservorios y fuentes de Ca 2+ en células eucariotas. Además, el retículo tiene como función principal establecer la conformación de las proteínas recién sintetizadas mediante la acción de las chaperonas, de forma que se plieguen correctamente y ejerzan su función de forma óptima. Posee así mismo otros cometidos, como son el tráfico vesicular o la regulación del metabolismo del colesterol. Es por ello que los niveles de Ca 2+ en su interior deben mantenerse dentro de unos rangos determinados para asegurar la correcta funcionalidad del orgánulo ( Parekh y Putney. 2005 ). Estos niveles de Ca 2+ dentro del RS suelen estar en el orden de 100-700 µmol/l, concentraciones bastante más altas que las presentes habitualmente en el citoplasma. Además, se estima que debe haber unas 10 veces más cantidad de Ca 2+ en el lumen del orgánulo unido con baja afinidad a quelantes, disponible para movilizarse en forma libre en caso de que el orgánulo lo requiriera ( Gwack y col. 2007 ). Berridge y col. 2003 25 Por tanto, el ER/SR dispone de moléculas específicas que median la liberación de Ca 2+ desde su interior manteniendo estos niveles basales, entre las que destaca el inositol trifosfato (InsP 3 ). La fosfolipasa C, enzima que cataliza la síntesis de esta molécula, posee diversas isoformas, cada una de las cuales se activa por un estímulo diferente ( Kelley y col. 2001 ); la dinámica de la producción de InsP 3 dependerá, por tanto, del receptor que active su síntesis. Una vez liberado en el citosol, el InsP 3 se une a su receptor específico en la membrana del ER/SR (InsP 3 R), una proteína transmembrana anclada a la membrana de éste. Funcionalmente, actúa en la membrana del retículo como un canal, y al abrirse mediante facilita la liberación de Ca 2+ al citoplasma ( Miyawaki. y col 1990 ). Cuando el InsP 3 se une a su receptor, incrementa la sensibilidad de éste a Ca 2+ , de tal manera que se activa a niveles citosólicos bajos del ión y se ve inhibido tras el vaciado del reservorio, cuando en el citoplasma se alcanzan altas concentraciones de Ca 2+ . El InsP 3 R pertenece a una familia de canales iónicos con seis dominios transmembrana; sin embargo, este receptor es característico tanto por su localización subcelular como por su regulación por InsP 3 . También actúan como agonistas del InsP 3 R el propio ión Ca 2+ , uniéndose de forma directa o a través de la calmodulina tanto en la cara citosólica del receptor como en la luminal; la proteín quinasa dependiente de GMPc (PKG), la proteín quinasa C (PKC) y la proteín quinasa A (PKA) ( Carafoli y col 2001, Mikoshiba y col. 2007 ). Consta de tres isoformas, cada una de las cuales posee diferente afinidad por InsP 3 ( Blondel y col. 1994, Mikoshiba y col. 2007 ). Su estructura básica (ver figura 8) se divide en: un dominio amino terminal orientado al lado citoplásmico, junto al sitio de unión a InsP 3 ; un dominio modulador o “de acoplamiento interno” que transduce la señal del InsP 3 , un dominio transmembrana que forma el canal de Ca 2+ y un dominio de apertura, que recibe la información desde el dominio modulador y abre el canal mediante un cambio en su estructura ( Mikoshiba y col. 2007 ). 32 linfocitos y macrófagos, aunque también en otros tipos celulares como hepatocitos y CMLV ( Parekh y Penner. 1997; Lewis y col. 1999; Parekh y Putney. 2005; Potier y col. 2009). La entrada de Ca 2+ regulada por los reservorios o SOCE (store-operated calcium entry) se puede inducir en condiciones in vitro por cualquier procedimiento que promueva el vaciado del ER/SR. Los más comunes consisten en tratamiento de la célula con inhibidores de la SERCA, como la tapsigargina (TG) o el ácido ciclopiazónico (CPA), o bien con altas concentraciones de quelantes de Ca 2+ ; ambos métodos propician el vaciado pasivo del orgánulo. Sin embargo, a nivel fisiológico los SOC se activan principalmente por aumento en los niveles de InsP 3 citosólicos, lo que conlleva la unión del InsP 3 a su receptor específico en la membrana del ER/SR y la posterior liberación de Ca 2+ desde su interior ( Parekh y Putney, 2005 ). En principio, se creía que la única función significativa de la SOCE era la de llenar el retículo previamente vaciado, con el fin de preservar los niveles de Ca 2+ basales que éste necesita para mantener su funcionalidad ( Putney. 2007 ). Sin embargo, con el paso de los años se caracterizaron las muchas otras funciones que este tipo de entrada de Ca 2+ es capaz de ejercer, de algunas de las cuales hablaremos en detalle en los apartados 4.3.1 y 4.3.2. Actualmente, se sabe que la SOCE es una vía indispensable en todos los tipos de células eucariotas ( Parekh y Putney. 2005 ) y que los canales encargados de activar esta vía juegan un papel esencial en numerosos procesos, que van desde la exocitosis hasta la regulación de la expresión génica ( Putney y McKay, 1999 ). 4.2 Vía de señalización de la SOCE A la hora de estudiar la vía de señalización vinculada a los SOC, el proceso clave a tener en cuenta y que a pesar de todos los estudios al respecto aún no se encuentra totalmente elucidado, es el mecanismo de conexión existente entre el sensor que detecta la bajada de los niveles de Ca 2+ en el interior del ER/SR y la activación del canal o canales presentes en la membrana plasmática ( Parekh y Putney. 2005, Vaca y col. 2010 ). 33 Hasta hace pocos años, las teorías formuladas en base a esta conexión se podían resumir en dos hipótesis principales: - Existe un mensajero soluble que difunde por el citosol y transmite la información entre las dos partes del sistema; en esta hipótesis, se propuso como mensajero al llamado factor de entrada de calcio o calcium influx factor (CIF). Se trata de un factor no proteico liberado por el retículo endoplásmico de linfocitos Jurkat-T tras el vaciado de los reservorios, y capaz de inducir SOCE al inyectarse en oocitos de Xenopus ( Randriamampita y Tsien. 1993, Thomas y Hanley. 1995, Csutora y col. 1999, Bolotina y Csutora. 2005 ). - La membrana del ER/SR y la membrana plasmática se unen físicamente formando un complejo macromolecular (teoría del acoplamiento conformacional) ( Tregear y col. 1991, Berridge 1995, Rosado y col. 2000 ), de una forma análoga a la excitación-contracción en el músculo esquelético, donde los canales de Ca 2+ voltaje-dependientes interaccionan directamente con el receptor de rianodina en el RS ( Potier y Trebak. 2008 ). En esta teoría, se propuso inicialmente al receptor para InsP 3 como la molécula que interaccionaría con el canal en la membrana plasmática ( Berridge 1995 ). Sin embargo, fue necesario replantear todas las hipótesis acerca de la vía de señalización de la SOCE en 2005 y 2006, con la caracterización de dos proteínas claves en dicha ruta: Stim y Orai. 4.2.1 Stim1. En 1996, Parker y colaboradores describieron la presencia de un gen al que llamaron GOK y que inicialmente se relacionó con la supresión tumoral ( Parker y col. 1996 ); no fue hasta casi una década después cuando se describió la función de la proteína para la que codificaba y su papel en la homeostasis de Ca 2+ intracelular. 34 En 2005, y de forma casi simultánea, dos laboratorios describieron la presencia de esta proteína, a la que se llamó stromal interacting molecule o molécula de interacción con el estroma (Stim), en células S2 de Drosophila ( Roos y col. 2005 ) y la línea celular humana HeLa ( Liou y col. 2005 ). El silenciamiento de Stim1, pero no el de Stim2 (este subtipo sólo presente en mamíferos) es capaz de reducir considerablemente la SOCE en HEK-293 y linfocitos Jurkat T ( Roos y col. 2005 ). Además, cuando disminuyen los niveles de Ca 2+ del retículo, Stim1 se oligomeriza en la membrana del orgánulo en una estructura conocida como puncta, acercándose a la membrana plasmática (figura 11). Estos datos demostraron que Stim1 constituía el hasta entonces desconocido sensor de los niveles de Ca 2+ en el ER/SR, y su papel como activador de los canales SOC en la membrana plasmática ( Liou y col. 2005, Zhang y col. 2005, Mercer y col. 2006, Putney 2007, Cahalan 2009 ). Figura 11. Organización en puncta de las moléculas de Stim1 en la membrana del ER/SR tras el vaciado de los reservorios. Stim1 es una proteína transmembrana anclada al retículo por un único dominio, tal y como se ilustra en la figura 12. Consta de un dominio EF-hand próximo a su extremo amino terminal y orientado hacia el lumen del retículo. Esta región posee una K D de unión a Ca 2+ de 200-600 µmol/l, similar a los niveles del ión en el interior del ER/SR; y se trata, por tanto, del dominio encargado de sensar los niveles de Ca 2+ dentro del orgánulo ( Liou y col. 2005 ). La disociación de Ca 2+ de este dominio al vaciarse el retículo es el estímulo que induce la agrupación de Stim1 en puncta ( Putney 2007; Kurosaki y Baba 2010 ). Además, mutaciones en esta región de la proteína, que reducen su Gwack y col. 2007 35 afinidad por Ca 2+ , tienen como consecuencia una activación celular constitutiva de la vía SOC ( Zhang y col. 2005 ). Stim1 posee también un dominio estructurado en α que podría encontrarse implicado en su oligomerización; su extremo carboxilo terminal parece ser el responsable de la interacción de Stim1, una vez estructurado en puncta, con la membrana plasmática o con otras proteínas accesorias que puedan intervenir en la señalización de la SOCE ( Ong y Ambudkar, 2011 ). Figura 12. Estructura de la molécula de Stim1 insertada en la membrana del RS. Sin embargo, mientras que algunos autores defienden la teoría de que Stim1, después de organizarse en puncta, se transloca a la membrana plasmática ( Zhang y col. 2005, Spassova y col. 2006 ) otros muchos estudios no han conseguido detectar su inserción en tal estructura tras el vaciado de los reservorios ( Liou y col. 2005, Mercer y col. 2006, Xu y col. 2006, Wu y col. 2006 ). Una hipótesis intermedia entre estos resultados dispares sugiere que Stim1 no se transloca a la membrana tras agregarse en puncta, y que aunque existen moléculas de Stim1 localizadas en la membrana plasmática, cumplen una función distinta a la de la activación de la SOCE ( Putney 2007 ). Además, Stim1 es capaz de activar otro tipo de canales de naturaleza completamente distinta a los SOC. Es el caso de los canales selectivos para Ca 2+ regulados por ácido araquidónico (ARC channels). Esta función adicional de Stim1 es independiente del Parekh 2010 36 vaciado de los reservorios y parece encontrarse mediada principalmente por las moléculas de Stim1 ancladas en la membrana plasmática ( Mignen y col. 2007 ). En cuanto a Stim2, ha sido propuesto como un regulador de las concentraciones citosólicas de Ca 2+ , dado que esta molécula se encuentra activa cuando el Ca 2+ dentro del retículo se encuentra en sus niveles basales, y puede promover la SOCE con vaciado de los reservorios de menor magnitud ( Brandman y col. 2007 ). Sin embargo, otras evidencias descartan que esta proteína esté implicada en la activación de la SOCE; algunos autores sugieren que funciona como inhibidor de dicha vía en las líneas celulares HEK293 y A7r5 ( Soboloff y col. 2006 ). 4.2.2 Orai. En 2006, Feske y colaboradores determinaron la existencia de la proteína Orai1, mediante un genotipado entre los individuos de una familia con inmunodeficiencia hereditaria combinada severa (SCID) asociada a la pérdida de la corriente I CRAC . En este mismo trabajo, Orai1 fue también localizada en células S2 de Drosophila e identificada como la proteína que origina la entrada de Ca 2+ inducida por el vaciado del retículo ( Feske y col. 2006 ). Poco después, otros dos grupos corroboraron que la presencia de Orai1 es indispensable para la entrada de Ca 2+ regulada por los reservorios ( Vig y col. 2006, Yeromin y col. 2006 ). Orai1 se localiza en la membrana plasmática y posee 4 dominios transmembrana (figura 13). Tanto su extremo amino como el carboxilo se encuentran en su cara citoplásmica, así como un 60% de la proteína ( Maruyama y col. 2009 ). Varios estudios sugieren que podría funcionar estructuralmente como dímero y como tetrámero ( Gwack y col. 2007, Maruyama y col. 2009 ). Cuando se coexpresa junto con Stim1 en células HEK293, es capaz de inducir corrientes I CRAC de tamaño mayor al usual, pero con las mismas propiedades electrofisiológicas y farmacológicas ( Mercer y col. 2006, Peinelt y col. 2006 ). Además, determinadas mutaciones en las hélices transmembrana 1 y 3 modifican la corriente I CRAC y su selectividad a Ca 2+ con respecto a cationes monovalentes como Na + y Cs + ( Prakriya y col. 2006 ); también mutaciones en uno de sus 37 bucles extracelulares son capaces de alterar las características propias de la corriente I CRAC ( Vig y col 2006 ). Todas estas evidencias demuestran que Orai1 forma parte del propio poro del canal SOC, y que Stim1 y Orai1 constituyen los principales componentes de I CRAC . Figura 13. Estructura básica y dominios principales de la proteína Orai1. Existen otras dos isoformas de Orai en mamíferos, Orai2 y Orai3, las cuales también se encuentran implicadas en la entrada de Ca 2+ regulada por los reservorios, y son capaces de promover corrientes de Ca 2+ cuando se coexpresan con Stim1 en células HEK293, aunque de menor tamaño a las inducidas por Orai1 ( Mercer y col. 2006 ). Estas isoformas se diferencian de Orai1 en sus patrones de selectividad iónica, regulación por Ca 2+ intracelular e inhibición farmacológica ( Peinelt y col. 2008 ). Por ejemplo, el 2aminoetildifenil borato (2APB) un inhibidor de la vía SOC ampliamente usado ( Bootman y col. 2002 ) es capaz de inhibir las corrientes iónicas mediadas por Orai1, pero sin embargo activa aquellas inducidas por Orai3 ( Peinelt y col. 2008, Zhang y col. 2008 ). Estas diferencias en las propiedades biofísicas de las isoformas de Orai podrían explicar la heterogeneidad existente entre las corrientes SOC procedentes de distintos tipos celulares ( Potier y Trebak, 2008 ). Además, Orai2 y 3 podrían formar heteromultímeros con Orai1 en diferentes clases de células ( Peinelt y col. 2008 ). En cualquier caso, es necesario un estudio más exhaustivo de las posibles interacciones entre las distintas isoformas de Orai en diferentes tipos celulares y tejidos. Parekh 2010 38 4.2.3 Canales TRPC. La familia de canales del receptor de potencial transitorio (transient receptor potential o TRP) fue identificada por primera vez en 1991 en Drosophila como un canal/transportador de Ca 2+ implicado en fototransducción ( Minke y Selinger. 1996 ). Sus homólogos en mamíferos codifican para un total de 28 canales catiónicos no selectivos con distintas permeabilidades a Ca 2+ . Esta familia consta a su vez de tres grandes subfamilias: TRP canónicos (TRPC), TRP vanilloides (TRPV) y TRP de melastatina (TRPM). De entre ellas, los TRP clásicos o canónicos destacan como potenciales participantes en la SOCE. La subfamilia de TRPC se compone de siete proteínas, TRPC1-TRPC7, de las cuales TRPC2 no existe como gen completo en humanos, sino como pseudogen. Todas ellas constan de una estructura básica compuesta de seis dominios transmembrana, con la región que forma el poro situada entre el quinto y el sexto. Ambos extremos de la proteína se localizan en su cara citosólica; el extremo carboxilo terminal se encuentra altamente conservado y el extremo amino presenta varios dominios de ankyrina. Cada una de estas regiones parecen constituir sitios de unión a otras proteínas ( Ong y Ambudkar, 2011 ). De hecho, se ha descrito que los TRPC funcionan como heterotetrámeros in vivo; por ejemplo, en interacciones de TRPC1 con TRPC4 y TRPC5. Todas las isoformas de esta subfamilia, salvo TRPC2 y TRPC7, pueden activarse por promotores de la SOCE. TRPC1, por ejemplo, ha sido relacionado con la vía SOC en muchos tipos celulares, como células de glándula salivar ( Liu y col. 2007 ), células acinares pancreáticas ( Hong y col. 2011 ) y células de músculo liso vascular ( Brueggemann y col. 2006 ). Además, diversas combinaciones de TRPCs, como TRPC1/TRPC3 y TRPC1/TRPC4, median entrada de Ca 2+ vía SOC en células de hipocampo, HEK-293 y células endoteliales ( Albert y col. 2007 ). TRPC1 se encuentra presente en una gran variedad de tejidos y está implicado en funciones fisiológicas como secreción, proliferación y diferenciación celular, entre otras. Existe cierta variabilidad en la selectividad por Ca 2+ de los canales formados por 39 TRPC1, debido en parte a su capacidad para agruparse en heteromultímeros. Se ha descrito que TRPC1 puede constituir un complejo macromolecular con componentes de la SOCE, como la SERCA, la PLC y el InsP 3 R ( Ong y col. 2007 ); o de forma general, con otras moléculas relevantes en la señalización de Ca 2+ , como la calmodulina. Más recientemente se ha demostrado que Stim1, Orai1 y TRPC1 forman un complejo macromolecular regulado por componentes del citoesqueleto, con los que TRPC1 es capaz de asociarse ( Galán y col. 2011, Ong y Ambudkar 2011 ). Este modelo de interacción se encuentra esquematizado en la figura 14. Figura 14. Esquema propuesto para la interacción entre las proteínas Orai1 y TRPC1 tras el vaciado de los reservorios. Se ha sugerido también que los complejos que TRPC1 forma con distintas proteínas podrían estar asociados con la membrana del ER/SR y con la membrana plasmática al mismo tiempo, en regiones donde ambas estructuras se encuentran próximas. Esto facilitaría el mecanismo de activación y desactivación de la SOCE, lo que concuerda con estudios previos que demuestran que esta vía de entrada de Ca 2+ tiene lugar en microdominios celulares, como las caveolas de membrana ( Ong y Ambudkar, 2011 ). Sin embargo, no en todos los tipos celulares se ha descrito relación de los TRPC con la entrada de Ca 2+ vía SOC. Estos canales no parecen implicados en dicho proceso en células que presentan de forma típica la corriente I CRAC , como mastocitos y linfocitos Ong y Ambudkar, 2011 40 Jurkat T; de lo que podría deducirse que ninguno de los TRPC son componentes de esta corriente, aunque sí puedan serlo de otras corrientes SOC ( Kim y col. 2009, Ong y Ambudkar, 2011 ). 4.2.4 Comunicación entre Stim, Orai y otras moléculas participantes en la SOCE. La teoría más aceptada acerca de la comunicación entre Stim1 y Orai es que Stim1, al organizarse en puncta, se transloca a regiones cercanas a la membrana plasmática para interaccionar directamente con Orai. Favoreciendo esta idea existen estudios que demuestran que Stim1 y Orai1 coinmunoprecipitan, efecto que es más patente cuando se ha inducido previamente el vaciado de los reservorios ( Yeromin y col. 2006 ); Wu y colaboradores también observaron una interacción cercana entre Stim1 y la membrana plasmática, de tan sólo 10-25 nm ( Wu y col. 2006 ). No obstante, otros trabajos han conseguido estudiar las uniones que tienen lugar entre la membrana del ER y la membrana plasmática tras el vaciado de los reservorios y la reorganización de Stim1, y describen que Orai1 requiere un espacio en estas uniones de unos 11-14 nm dentro del citoplasma, considerablemente mayor de lo que cabría esperar por la longitud de su secuencia. Esto indica que Orai1, a la hora de promover la SOCE, probablemente interacciona con otras proteínas además de con Stim1, formando un complejo macromolecular ( Várnai y col. 2007 ). De igual manera, y dada la complejidad de esta vía, tampoco existen evidencias que permitan descartar la implicación de otro tipo de moléculas anteriormente descritas en la SOCE, como el factor de entrada de Ca 2+ (CIF) o la fosfolipasa A 2 independiente de Ca 2+ (iPLA 2 ) ( Putney 2007 ). 4.2.5 Fosfolipasa A 2 independiente de Ca 2+ (iPLA 2 ) y su papel en la SOCE. Las fosfolipasas A 2 son una familia de enzimas encargadas de catalizar la ruptura de fosfolípidos en ácidos grasos y lisofosfolípidos. Esta familia se divide en varios grupos, de la cual los principales son: los grupos I, II y III, constituidos por las fosfolipasas A 2 secretoras (sPLA 2 ), que requieren concentraciones milimolares de Ca 2+ para su 41 correcto funcionamiento y se almacenan en vesículas dentro del citoplasma; el grupo IV, formado por las fosfolipasas A 2 citosólicas (cPLA 2 ) que son funcionales a concentraciones de Ca 2+ micromolares; y el grupo VI, constituido por una serie de enzimas cuyo peso molecular ronda los 85-88 kD, denominadas fosfolipasas A 2 independientes de Ca 2+ o iPLA 2 ; y que se caracterizan en que no requieren la unión de Ca 2+ en su sitio activo para llevar a cabo la reacción catalítica. Este grupo de enzimas se encuentra presente tanto en el citosol como en estructuras de membrana ( Akiba y Sato. 2004 ). El grupo VI de iPLA 2 fue identificado a partir de la línea celular P388D ( Kim y col. 1989 ). La proteína presenta ocho dominios similares a ankyrina ( Winstead y col. 2000 ) y la secuencia consenso GXSTG, común a otras lipasas de la familia ( Hazel y col. 1991 ). A pesar de no depender de Ca 2+ para su funcionalidad, sí se ha descrito que la iPLA 2 forma un complejo con la proteína de unión a Ca 2+ calmodulina en estado inactivo; de tal forma que cuando iPLA 2 se encuentra libre, su sitio activo interacciona con el dominio de unión a calmodulina adquiriendo así funcionalidad catalítica ( Wolf y Gross. 1996; Jenkins y col. 2001; Bolotina 2008 ). Dado que la iPLA 2 cataliza la ruptura de fosfolípidos, su función principal en la célula se encuentra ligada al remodelado de los componentes de la membrana celular ( Balsinde y Dennis, 1997 ). Sin embargo, los productos de su catálisis (ácido araquidónico, lisofosfatidilcolina y lisofosfatidilinositol) actúan a su vez en el citosol como segundos mensajeros que inician cascadas de señalización en el interior celular ( Winstead y col. 2000 ) lo cual indica que esta enzima juega un importante papel fisiológico, y no tan sólo de mantenimiento estructural, en diversos tipos celulares ( Smani y col. 2003 ). Ya en la década de los 90 se describió que agonistas inductores del vaciado de los reservorios, como la arginina vasopresina y la tapsigargina, promovían la liberación de ácido araquidónico en células de músculo liso, efecto que se veía inhibido tras la aplicación de BEL (inhibidor específico de la enzima), o de un antagonista de la calmodulina ( Wolf y col. 1997 ). El mismo fenómeno fue descrito poco después en islotes pancreáticos ( Nowatzke y col. 1998 ). 48 expresión génica. En CMLV, existen varios factores de transcripción que regulan esta expresión en base a la concentración de Ca 2+ intracelular ( Barlow y col. 2006 ). Dos de los más estudiados, y de los que ya hablamos en el apartado 4.3.2, son NFAT y CREB. NFAT se localiza en el citoplasma en estado inactivo, fosforilado en múltiples residuos; al incrementarse los niveles de Ca 2+ citosólico, este factor es desfosforilado por la proteína de unión a Ca 2+ calcineurina, translocándose junto a ésta al núcleo celular ( Gwack y col. 2007 ). NFAT se encuentra implicado en multitud de procesos de distintos tipos celulares, siendo uno de los más conocidos la activación y diferenciación de los linfocitos T. Además, hay evidencias que relacionan a NFAT con la proliferación y migración de células de músculo liso vascular, mediada por receptores acoplados a proteína G y por receptores acoplados a tirosín-quinasas ( Yellaturu y col. 2002, Liu y col. 2004 ). Por otra parte, CREB ejerce su acción mediante la unión al elemento de respuesta a Ca 2+ -AMP cíclico o CRE, una secuencia presente en el promotor de más de 100 genes. Su activación tiene lugar por medio de fosforilación en un residuo de serina, lo cual promueve la formación de un complejo transcripcional con otras proteínas, entre ellas la proteína de unión a CREB CBP300. CREB puede ser activado por diversas vías de señalización dependientes de Ca 2+ , entre ellas la vía de la proteín quinasa dependiente de calmodulina (CaMK), la proteín quinasa dependiente de AMPc y la vía de las MAPK ( Barlow y col. 2006 ). Al igual que NFAT, CREB y algunos de sus genes diana, como MKP-1 y c-fos, parecen estar implicados en respuestas patológicas relacionadas con la proliferación de CMLV. En concreto, la activación de CREB guarda relación con la proliferación y formación de neoíntima que sigue al daño vascular ( Tokunou y col. 2003, Gerzanich y col. 2003 ). Además, la sobreexpresión de MKP-1 puede promover proliferación de músculo liso tras daño vascular. Son resultados que indican el importante papel que CREB juega en la regulación de la proliferación celular en músculo liso vascular, y por tanto, en procesos fisiopatológicos relacionados con ésta. 49 5.3 Proliferación de las CMLV y su relación con la vía de los SOC Como explicamos con anterioridad en el apartado 5.1, las CMLV pueden presentar dos fenotipos diferentes: el fenotipo contráctil o quiescente, característico in vivo; y el fenotipo “sintético”, que posee una proliferación y migración celular inusualmente altas, y es el mostrado por los miocitos vasculares tras cultivo en suero durante más de 30 horas ( Potier y col. 2009, Orr y col. 2010 ). El cambio fenotípico que lleva a las CMLV del estado contráctil al proliferativo se asocia con pérdida de función de los VOC, por lo que serían otras vías de entrada de Ca 2+ , como la SOCE, las que regularían el aumento en Ca 2+ intracelular y la subsiguiente proliferación de estas células ( BerraRomani y col. 2008, Potier y col. 2009 ). Así, en células de músculo liso de aorta la SOCE es significativamente mayor en el fenotipo sintético que en el quiescente, efecto que se acompaña de un aumento de hasta 4 y 5 veces en la expresión proteica de Orai1 y Stim1, respectivamente. Además, tanto la proliferación como la migración de este tipo celular sintético dependen de la expresión de ambas proteínas ( Baryshnikov y col. 2009, Guo y col. 2009, Potier y col. 2009 ). También se ha demostrado que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un agonista asociado a daño vascular, es capaz de activar la ruta de los SOC vía Stim1 y Orai1 para promover migración en células de músculo liso ( Bisaillon y col. 2010 ). Un aumento en la SOCE induce también proliferación en células de músculo liso procedentes de arteria pulmonar; en este vaso, se relaciona a la proliferación celular con la expresión de TRPC1 ( Sweeney y col. 2002 ). Además, Stim1 y Orai1 se encuentran sobreexpresados a nivel de proteína en la neoíntima de modelos de angioplastia por balón en arteria carótida; el silenciamiento de ambas proteínas reduce claramente la formación y proliferación de esta capa neoíntima tras el daño vascular, efecto que guarda relación con la activación de NFAT. En base a estos estudios, Orai1 ha sido propuesto como una potencial diana terapéutica en patologías como aterosclerosis y reestenosis ( Guo y col. 2009, Zhang y col. 2011 ). 50 Por último, también en células del endotelio vascular la proliferación celular depende de la expresión de posibles componentes de la SOCE, como Orai1, TRPC1, TRPC4 y TRPC6, y en menor medida, Stim1 y Stim2 ( Abdullaev y col. 2008 ). La SOCE juega, además, un importante papel en la angiogénesis del tejido endotelial, que depende tanto de la inhibición farmacológica del canal como de la expresión de Orai1 ( Li y col. 2011 ). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que los principales componentes moleculares de la SOCE, Stim1 y Orai1, se encuentran relacionados con la proliferación y migración de células de músculo liso vascular; procesos en los que TRPC1 también parece estar parcialmente involucrado. Su modulación puede ayudar a crear nuevas dianas terapéuticas a la hora de tratar procesos vasculares fisiopatológicos, como son la reestenosis tras el daño vascular o el proceso de aterosclerosis. 5.4. Procesos de aterosclerosis y reestenosis en la pared vascular La proliferación excesiva de las células de músculo liso en la pared del vaso es un evento clave en el desarrollo de procesos como la aterosclerosis y la hiperplasia de la capa neoíntima tras daño vascular ( Zhang y col. 2011 ). La formación de la placa de ateroma es un evento complejo, que cursa de forma similar a procesos inflamatorios crónicos y se encuentra ampliamente estudiado, sobre todo, en aorta y arteria coronaria ( Stary y col. 1994, Glass y col. 2001 ). Consta de tres fases principales, esquematizadas en la figura 18: 1) El inicio de la lesión comienza con la formación de la estría grasa o fatty streak. Bajo el endotelio vascular, tiene lugar una acumulación de lipoproteínas LDL (low density lipoprotein), encargadas de transportar el colesterol en sangre. Estas LDL sufren modificaciones oxidativas que las incapacitan para ser reconocidas por sus receptores específicos presentes en el endotelio; lo que favorece, mediante citoquinas y moléculas de adhesión, la acumulación bajo este tejido de monocitos procedentes del torrente sanguíneo, que se diferencian a macrófagos. Éstos a su vez incorporan el colesterol presente en las LDL, convirtiéndose en las denominadas foam cells o células 51 espumosas. El inicio de la formación de la placa de ateroma recibe también el nombre de lesión tipo I. 2) La progresión de la lesión y el aumento en la expresión de citoquinas por parte del endotelio implica la migración a la estría grasa de CMLV presentes en la capa media del vaso. Una vez en la lesión, éstas proliferan de forma excesiva e incorporan también LDL oxidadas, contribuyendo a la formación de células espumosas. Además, sintetizan proteínas de matriz extracelular que llevan a la formación de una placa fibrosa. Por otra parte, los macrófagos presentes en la lesión se estratifican en capas e interaccionan con linfocitos T, promoviendo el establecimiento de un estado inflamatorio crónico. Este grado de lesión se denomina lesión tipo II, y puede evolucionar de forma rápida a estadíos más graves de aterosclerosis dependiendo en gran parte del engrosamiento de la capa íntima y del número de CMLV presentes en ésta. 3) En la lesión tipo III o preateroma, empiezan a formarse pequeños depósitos de lípidos diseminados fuera de las células espumosas, constituyendo un núcleo lipídico que deforma la capa íntima. Además, las interacciones entre macrófagos y CMLV y la alta cantidad de citoquinas inflamatorias llevan a apoptosis y necrosis de ambos tipos celulares, lo que ayuda a liberar los lípidos contenidos en su interior y forma el denominado núcleo necrótico. La placa de ateroma ya formada puede sufrir una o varias rupturas, lo que tiene como consecuencia la liberación a la sangre de los lípidos contenidos en el núcleo, así como del resto de factores inflamatorios; y desencadena procesos de coagulación, formación de trombos y posibles obstrucciones e infartos ( Stary y col. 1994, Glass y col. 2001 ). 52 Figura 18. Diferentes estadíos de la formación de la placa de ateroma. Por otra parte está el proceso de reestenosis, que tiene lugar después de llevar a cabo intervenciones para tratar una oclusión vascular, como la angioplastia con balón o la implantación de un stent ( Curcio y col. 2011 ). Estos procedimientos tienen como consecuencia un estrechamiento de la luz vascular, además de compresión de la placa Glass y col. 2001 53 de ateroma u otras lesiones preexistentes y pérdida del tejido endotelial en el vaso. El daño vascular originado pone en marcha el proceso, que comienza con la formación de una capa de plaquetas y fibrina en la región carente de endotelio, y se continúa con la adhesión de leucocitos y su migración a través de esta capa. La respuesta inflamatoria provoca un aumento en la síntesis de matriz extracelular, así como de proliferación y migración de células de músculo liso. En conjunto, esta serie de procesos llevan a la formación y engrosamiento de una capa neoíntima, lo que provoca un mayor estrechamiento de la luz del vaso ( Inoue y Node. 2009, Curcio y col. 2011 ). En la reestenosis, es este último paso de proliferación y migración de CMLVs el que contribuye mayoritariamente a la formación de la capa neoíntima ( Guo y col. 2009, Curcio y col. 2011 ). La proliferación de CMLV se trata, por tanto, de un proceso a tener en cuenta a la hora de hablar de patologías cardiovasculares por todas sus implicaciones en el desarrollo y pronóstico de estas lesiones. 54 OBJETIVOS Los experimentos desarrollados durante este estudio se han centrado en caracterizar la vía de señalización por la cual la Urotensina-II promueve sus efectos a corto y largo plazo de a nivel del músculo liso vascular; así como el papel de la entrada de Ca 2+ a través de los canales SOC en esta vía y su posible implicación a nivel fisiopatológico. Los objetivos planteados son los siguientes: 1. Determinar el papel de los canales de Ca 2+ voltaje-dependientes, de los canales SOC y de su proteína reguladora iPLA 2 en los cambios en tono vascular mediados por U-II. 2. Estudiar los cambios en concentración de Ca 2+ intracelular inducidos por U-II en CMLV aisladas, así como la influencia en este efecto de varias proteínas participantes en la SOCE: iPLA 2 β, Stim1, Orai1 y TRPC1. 3. Caracterizar si la movilización de Ca 2+ intracelular promovida por U-II podría contribuir al establecimiento de cambios celulares a largo plazo, como un aumento en la proliferación celular. 4. Determinar la implicación de los canales SOC y las proteínas de su vía de señalización Stim1, Orai1 y TRPC1 en la proliferación inducida por U-II. 5. Elucidar si la aplicación de U-II podría promover cambios en la expresión génica de CMLV aisladas; y si este efecto depende de la entrada de Ca 2+ a través de los SOC y de Stim1, Orai1 y TRPC1. 55 MATERIALES Y MÉTODOS 1. MODELO ANIMAL Y DISECCIÓN DE LA AORTA Todos los experimentos para el presente trabajo se realizaron en aorta torácica de ratas de la cepa Wistar Kyoto. Los animales, suministrados desde el Centro de Producción y Experimentación Animal de Espartinas (Sevilla), fueron todos machos de entre 2 y 6 meses de edad, con un peso de 250 - 350g en el momento del sacrificio. Los animales estuvieron estabulados hasta su intervención quirúrgica en condiciones estables de humedad y temperatura, con una densidad de estabulación no superior a 5 ratas por jaula, acceso permamente a agua y alimento y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. La manipulación de los animales siguió en todo momento lo estipulado por la normativa de utilización y cuidado de los animales utilizados en la investigación y otros fines científicos acordada por la UE en 1986 ( Real Decreto 1201/2005, España ). La disección de la aorta fue llevada a cabo en el Quirófano Experimental del edificio de laboratorios adscrito al Instituto de Investigación Biomédica de Sevilla (IBIS), que consta de las instalaciones necesarias para operar animales tanto de pequeño como de gran tamaño. Como paso previo a la intervención, a la rata le fue administrada una dosis intraperitoneal de heparina (1000 U/kg) y después se anestesió, tambien vía intraperitoneal, con 1,5 ml/250 g de ketamina (Ketolar, Parke-Davis). Tras inmovilizarla y rasurar la región toracoabdominal, se abrió la cavidad torácica con un bisturí; después de extraer el bloque cardiopulmonar, se localizó la sección de aorta torácica justo por encima de la columna vertebral. El vaso se cortó cuidadosamente de forma paralela a ésta y se depositó en una placa de Petri con solución Krebs estándar (ver apartado 9, Tabla 1), en caso de destinarla al análisis de la función vascular, o en un tubo Falcon con medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) estéril (PAA Labs), si se necesitaba para dispersar células de musculo liso aisladas. Antes de su montaje o dispersión, la aorta fue separada de la grasa adyacente y de su capa adventicia. Este proceso se realizó bajo lupa binocular y con ayuda de pinzas y 56 tijeras de microcirugía. Cuando la arteria se iba a destinar a cultivo de células de músculo liso, la capa endotelial se eliminó manualmente con ayuda de una torunda de algodón estéril, frotando cuidadosamente la luz del vaso. 2. CULTIVO PRIMARIO DE MÚSCULO LISO 2.1. Dispersión de células de músculo liso vascular Todos los cultivos primarios necesarios para este estudio se llevaron a cabo bajo condiciones de esterilidad en una cabina de seguridad biológica modelo Cellgard 437400E de Nuaire. La aorta, una vez extraída del animal y limpia de las capas adventicia y endotelial (figura 19), fue trasladada a la campana de flujo laminar, donde se cortó en fragmentos más pequeños con ayuda de material de microcirugía estéril. Estos trozos de músculo fueron incubados en la solución de enzimas, compuesta por: 4 mg/ml de colagenasa I (125 U/mg) y 2 mg/ml de elastasa pancreática (4 U/mg) (Sigma Aldrich) diluidas en medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (PAA Labs), y filtrada previamente mediante un filtro de jeringa con 0,22 µm de diámetro de poro. La placa con los fragmentos de aorta se trasladó a un incubador a 37ºC durante un periodo comprendido entre 60 y 90 minutos, con el fin de disgregar el tejido y promover la separación de las células de músculo liso aisladas. Durante los últimos minutos de la incubación se fue observando la placa al microscopio invertido para reconocer la presencia y cantidad de estas células separadas del tejido, y poder determinar así el momento idóneo en el que interrumpir la dispersión, antes de que la alta concentración de enzimas comenzara a dañar las células. Nuevamente dentro de la campana, la solución fue pipeteada repetidas veces con una micropipeta para ayudar a completar la disgregación del tejido. Después se neutralizó la solución enzimática con 3 ml de DMEM y se centrifugó durante 5 minutos a 800 rpm. El sobrenadante fue desechado y el pellet, que contenía las células, se resuspendió en DMEM con 10% de suero fetal bovino (FBS, Biowhitaker) y 1% de penicilina/estreptomicina (PAA Labs, 100 U/ml) para después sembrarse en la placa de cultivo ( ChamleyCampbell y col. 1979, Smani y col. 2007 Figura 19. Sección de aorta torácica de rata y células de músculo liso vascular al microscopio 20X) , dispersadas a partir de ésta. 2.2. Condiciones de incubació Las placas de cultivo se conservaron hasta el momento de su ensayo en una cámara incubadora Nuaire clase 100 con camisa de agua de 188 litros y filtro HEPA externo. La cámara se encuentra conectada a una bombona que suministraba la mezcla de gases necesari a para el correcto desarrollo de los cultivos (95% O temperatura (37ºC) como la humedad y los porcentajes de O controlados electrónicamente por el incubador. Se observó cada día el progreso del cultivo al m cambios de medio cada 3 encontraban preparadas para el experimento cuando alcanzaban un 70% de confluencia (aún en fase de crecimiento exponencial) en el caso de los proliferación y de inmunofluorescencia; o un 90% en el caso de los registros de Ca intracelular. 57 penicilina/estreptomicina (PAA Labs, 100 U/ml) para después sembrarse en la placa de Campbell y col. 1979, Smani y col. 2007 ). Sección de aorta torácica de rata y células de músculo liso vascular al microscopio , dispersadas a partir de ésta. 2.2. Condiciones de incubació n de los cultivos Las placas de cultivo se conservaron hasta el momento de su ensayo en una cámara incubadora Nuaire clase 100 con camisa de agua de 188 litros y filtro HEPA externo. La cámara se encuentra conectada a una bombona que suministraba la mezcla de gases a para el correcto desarrollo de los cultivos (95% O 2 y 5% CO temperatura (37ºC) como la humedad y los porcentajes de O 2 y CO 2 en el interior eran controlados electrónicamente por el incubador. Se observó cada día el progreso del cultivo al m icroscopio invertido, y se realizaron cambios de medio cada 3 - 4 días. Se consideraba que las células en cultivo se encontraban preparadas para el experimento cuando alcanzaban un 70% de confluencia (aún en fase de crecimiento exponencial) en el caso de los proliferación y de inmunofluorescencia; o un 90% en el caso de los registros de Ca penicilina/estreptomicina (PAA Labs, 100 U/ml) para después sembrarse en la placa de Sección de aorta torácica de rata y células de músculo liso vascular al microscopio (objetivo Las placas de cultivo se conservaron hasta el momento de su ensayo en una cámara incubadora Nuaire clase 100 con camisa de agua de 188 litros y filtro HEPA externo. La cámara se encuentra conectada a una bombona que suministraba la mezcla de gases y 5% CO 2 ). Tanto la en el interior eran icroscopio invertido, y se realizaron 4 días. Se consideraba que las células en cultivo se encontraban preparadas para el experimento cuando alcanzaban un 70% de confluencia (aún en fase de crecimiento exponencial) en el caso de los ensayos de proliferación y de inmunofluorescencia; o un 90% en el caso de los registros de Ca 2+ 64 4. REGISTRO DE Ca 2+ INTRACELULAR CON MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA 4.1. Papel del Fura-2 AM en el estudio de la movilización de Ca 2+ intracelular El Fura-2-acetoximetil éster (Fura-2 AM) es un fluorocromo derivado del quelante de Ca 2+ ácido tetraacético etilen glicol (EGTA), y se trata de un reactivo ampliamente empleado para registrar la concentración de Ca 2+ libre intracelular en células aisladas. Esta sustancia permea a través de la membrana plasmática, y una vez en el citosol pierde el grupo acetoximetil gracias a la acción de las esterasas intracelulares, quedando tan sólo el compuesto activo Fura-2. Éste, al unirse a Ca 2+ , altera su intensidad de fluorescencia emitida, de tal manera que es posible estimar la concentración de calcio intracelular de las células cargadas con Fura-2 a partir de dichos cambios en intensidad de fluorescencia. Para ello se deben excitar las células con dos longitudes de onda diferentes (340 y 380 nm) que se encuentran a ambos lados del punto isosbéstico del Fura-2 (360 nm) definiendo como tal el pico de longitud de onda en el que el colorante, a cambios en la concentración de Ca 2+ , no detecta cambios en su fluorescencia de emisión (figura 26). A la longitud de onda de 340 nm, cuanto mayor sea la concentración de Ca 2+ mayor será la intensidad de fluorescencia de emisión; mientras que a la longitud de onda de 380 nm la fluorescencia disminuye al aumentar la concentración de Ca 2+ ( Poenie y Tsien. 1986 ). La fluorescencia emitida se colectó a una longitud de onda de 510 nm y las variaciones en la intensidad de esta fluorescencia (equivalente a la concentración de Ca 2+ intracelular) se estimaron a partir del cociente o ratio entre ambas señales de excitación (R=340/380nm). 65 Figura 26. Diagrama del expectro de excitación del Fura-2 y sus cambios en fluorescencia en respuesta a la concentración de Ca 2+ . 4.2. Estructura microscopio de fluorescencia y lámpara Los experimentos se llevaron a cabo con ayuda del sistema de imagen Incyt Basic Im2. (Intracellular Imaging Inc.; Imsol, UK) (figura 27) que se encuentra compuesto de los siguientes elementos: - Microscopio invertido Nikon Eclipse TS100 con sistema de epifluorescencia y cámara acoplada CCD de 12 bits (Cooke PixelFly, ASI, Eugene, OR, USA) adecuada para grabar con baja intensidad de luz - Lámpara de mercurio y xenón encargada de excitar las células durante el experimento - Monocromador para la selección de longitudes de onda de excitación, con capacidad de excitar en el rango de UV/luz visible - Software especializado InCytIM2 66 Figura 27. Esquema del sistema de imagen Incyt Basic Im2 empleado para los ensayos de movilización de Ca 2+ intracelular. 4.3. Fases del experimento Las células de músculo liso se cultivaron sobre cubreobjetos estériles hasta alcanzar una confluencia del 90%. Para ello se empleó un cubreobjetos rectangular que fue fragmentado en cuadrados de aproximadamente 3 mm de longitud. Estos cubres fueron esterilizados y colocados cubriendo el fondo de una placa de Petri de 30 mm de diámetro, antes de sembrar las células. Éstas, tras frenar su división durante 24 horas en DMEM con 1% de FBS, fueron incubadas con Fura-2 AM (Invitrogen) a 5 µmol/l durante 30 minutos a 37ºC. Tras realizar un lavado a las células con DMEM, éstas se trasladaron al cuarto de fluorescencia, preservándolas de la luz a partir de ese momento para no alterar la fluorescencia del compuesto. Al comenzar el experimento, cada cubre se depositó en el interior de una cámara de registro con 1 ml de solucion 0Ca 2+ (apartado 9, tabla 2) bajo el objetivo 20X del 67 microscopio de fluorescencia. La lámpara de mercurio encargada de excitar las células durante el proceso se conectó unos 10-15 minutos antes de dar comienzo al experimento. Los fármacos añadidos durante la experiencia se aplicaron directamente en la cámara de registro. El protocolo básico del experimento consistió en la aplicación de Urotensina-II 100nM en ausencia de Ca 2+ extracelular durante tiempo suficiente para liberar Ca 2+ del retículo sarcoplásmico y activar la vía operada por los reservorios (tiempo establecido previamente mediante experimentos de curso temporal: 3 minutos); después se añadió al medio CaCl 2 2mM y se cuantificó el aumento en el nivel de Ca 2+ intracelular. 4.4. Análisis de los datos La adquisición de los datos se llevó a cabo con ayuda del software InCytIM2, con una velocidad de adquisición de 2 ratios/segundo. Los parámetros del programa fueron ajustados de forma que la escala de grises y la ganancia con la que se adquirieran los datos fuera constante en cada experimento. En cada experiencia individual se seleccionó para su registro, con ayuda de herramientas de dibujo, un número variable de entre 10-25 células. InCytIM2 almacena los registros de cada célula por separado, y permite el cálculo de la ratio entre las señales de 340 y 380 nm y su representación mediante gráficas de dispersión X-Y. Los datos de cada experimento, así como los tratamientos que se dieron a las células durante el transcurso de éstos, fueron almacenados en la aplicación Data InCytIM. Las variaciones en la concentración de Ca 2+ intracelular fueron estimadas de forma directa a partir de la variación de la ratio (ΔRatio) al inicio de cada experimento y tras la aplicación de fármacos (Smani y col. 2004). Esta variación se normalizó siempre en función a la ΔRatio obtenida en los experimentos de leakage o flujo pasivo de Ca 2+ (ver grupos de tratamiento, apartado 8.2). 68 5. ENSAYO DE PROLIFERACIÓN 5.1. Características del reactivo AlamarBlue El AlamarBlue (Biosource) es un reactivo soluble en agua que contiene un indicador de oxidación-reducción. Gracias a este indicador, en el compuesto tiene lugar un cambio colorimétrico y de fluorescencia ante la reducción del medio de cultivo como consecuencia del crecimiento celular. Dicho cambio de absorbancia es cuantificable en un espectofotómetro y se utiliza como medida indirecta de proliferación ( Kakishita y col. 2000 ). La ventaja de este reactivo a la hora de realizar ensayos de proliferación es que se trata de un producto no tóxico para el metabolismo celular, por lo que en un mismo cultivo tratado con AlamarBlue se pueden realizar mediciones sucesivas durante varios días y observar la progresión del crecimiento en la población celular. También permite realizar mediciones control antes del tratamiento farmacológico al cultivo; lo cual es importante en cultivos primarios donde no fue posible cuantificar el número de células iniciales. 5.2. Fases del experimento, mediciones y análisis Las células de músculo liso se cultivaron en placas de 96 pocillos hasta alcanzar un grado de confluencia del 70 %. 24 horas antes del experimento, se frenó el crecimiento celular reduciendo el porcentaje de suero a 0,1% FBS. Las últimas 16 horas se incubaron con AlamarBlue en una concentración de 10 %. Finalizado el tiempo de incubación, se realizó una medición control de la absorbancia a 570 nm, para obtener una estimación de la cantidad inicial de células en cada uno de los pocillos; esta medición la tomaríamos como cantidad de células en el tiempo cero de la experiencia. Tras la medición control se procedió a los diferentes tratamientos; en cada experimento se reservó una columna de pocillos con células sin tratar, que tomamos 69 como control negativo, y otra columna con DMEM y 0,1% FBS sin células, que utilizamos como blanco del ensayo. Los cambios en absorbancia fueron registrados en un espectofotómetro de lectura de placas modelo Oasys UVM40, con un sistema basado en un monocromador para selección de longitudes de onda y un rango de selección UV/VIS. Se realizaron mediciones a las 24 y 48 horas del tratamiento a las células, que se llevaron a cabo a 570 nm de longitud de onda y por duplicado; los datos se registraron a través de la aplicación DigiRead, para placas de 96 pocillos. Desde que se dio comienzo a la incubación con AlamarBlue, la placa se mantuvo aislada de la luz en todo momento para evitar alteraciones en las medidas de absorbancia. Los valores obtenidos por cada pocillo en cada tiempo de medición se reflejaron en una tabla de Excel. Se calculó la media de todos los pocillos en la misma columna (mismo tratamiento) y a este valor se restó la media de valores obtenida en la columna blanco, con lo que obtendríamos el grado de reducción de AlamarBlue mediado por la proliferación celular. Teniendo estos datos en los diferentes tiempos de medición, se elaboraron gráficas de dispersión de puntos en las que se observa la curva de crecimiento a lo largo del tiempo en cada uno de los grupos de tratamiento. También se calculó el gradiente de crecimiento, parámetro que refleja la diferencia cuantitativa de células en cada tiempo de medición con respecto a la cantidad de células registrada en la medición control (tiempo cero de la experiencia). 6. INMUNOFLUORESCENCIA 6.1. Marcaje con bromodeoxiuridina La 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU) (Sigma Aldrich) es un compuesto análogo de la base timidina, componente diferencial del ADN con respecto del ARN; al agregarse al medio de cultivo, las células en fase de replicación de ADN lo incorporan a su núcleo. Así, es capaz de indicar de una forma directa la proporción de células en un cultivo que han 70 sintetizado ADN de novo, y por tanto se encuentran en proliferación, en un periodo de tiempo determinado. Para ello, es necesario realizar de forma posterior a la incubación con el compuesto un ensayo de inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal antiBrdU y un anticuerpo secundario fluorescente, reconociendo como células positivas para BrdU (células que han proliferado) a aquellas que emitan fluorescencia al microscopio ( Magavi y Macklis, 2008 ). Las células de músculo liso se cultivaron sobre cubreobjetos circulares, previamente esterilizados y colocados cubriendo los pocillos de la placa de cultivo. Las células fueron tratadas con U-II por un periodo de 24 o 48 horas, y con BrdU 10 µM durante las 18 últimas horas. Después se llevó a cabo el ensayo de inmunofluorescencia: - Fijación con paraformaldehido 4% (Sigma Aldrich) a temperatura ambiente durante 5 minutos. - Tratamiento con acido clorhídrico (Fluka, Sigma Aldrich) 2N 30 minutos, para desnaturalizar el ADN y permitir que quedaran expuestos los sitios de unión antígeno-anticuerpo. - Dos lavados de cinco minutos con tetraborato sódico (Sigma Aldrich) 0.1 M a pH= 8.5. - Permeabilización celular y bloqueo de los sitios de unión inespecíficos para el anticuerpo: Triton 0.05% (Fluka, Sigma Aldrich), suero de cabra al 3% (Gibco) y seroalbúmina bovina 1% (BSA) (Sigma Aldrich) en PBS 1X, a temperatura ambiente durante 30 minutos. - Incubación con anticuerpo primario monoclonal anti-BrdU de ratón (Sigma Aldrich) en una proporción de 1:300 a 4ºC y con agitación durante toda la noche. - Incubación con el anticuerpo secundario fluorescente AlexaFluor FITC, de 488 nm de emisión (Invitrogen), antiIgG de ratón a 1:500 en solución de bloqueo (3% de suero de cabra y 1% BSA en PBS), durante 50 minutos a temperatura ambiente, preservando la placa de la luz. - Tratamiento con 4’, 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) (Sigma Aldrich) a 300 nM en PBS durante 5 minutos; este colorante es un agente 71 intercalante de bases que se une al ADN de los núcleos y los tiñe, permitiendo contar el número de células viables presentes en cada cubre. - Montaje de los cubres sobre portaobjetos para microscopio con ayuda de la solución de montaje Dako Fluorescent (Dako). Una vez secos, se observaron al microscopio. 6.2. Inmunocitoquímica para PCREB Las células de músculo liso se cultivaron de igual modo que las destinadas al marcaje para BrdU. Los pasos realizados en el ensayo de inmunofluorescencia para PCREB fueron los siguientes: - Fijación: con metanol (Sigma Aldrich) a -20ºC durante 8 minutos. - La permeabilización y bloqueo se llevaron a cabo del modo anteriormente descrito para el marcaje con BrdU. - Incubación con anticuerpo primario anti-PCREB de conejo (Santa Cruz Biotechnology) a 1:300, toda la noche a 4ºC; y con anticuerpo secundario AlexaFluor antiIgG de conejo FITC de 488 nm (Invitrogen) a 1:500, durante 50 minutos a temperatura ambiente. - Tratamiento con DAPI y montaje sobre portas para microscopio. (Protocolo extraído y modificado de: Stevenson y col. 2001 ). 6.3. Obtención de las imágenes y análisis de datos Las imágenes procedentes de inmunofluorescencia se obtuvieron con la ayuda de un microscopio Olympus equipado con una cámara digital Olympus DP70, con 12,5 megapíxels de resolución y 3 canales de fluorescencia (DAPI, TRITC y FITC). Las fotografías de las células teñidas con los distintos colorantes fueron realizadas con ayuda de la aplicación DPController. En cada experimento, se tomaron fotografías de tratamiento con el objetivo de 20X. Se realizaron dos fotografías por cada campo seleccionado, una para cada tipo de fluorescente (DAPI o FITC Para el análisis de los resultados, se realizó por cada campo los núcleos teñidos con DAPI, equivalente al número total de células viables; y después otro de los marcados con el anticuerpo secundario fluorescente finales se expresaron en porcentaje de núcleos marcados número de núcleos totales o núcleos con fluorescencia para DAPI. Figura 28. Fotografía de campos al microscopio con el objetivo de 20X; los núcleos celulares visibles en las imágenes a izquierda y derecha 7. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 7.1. Transfección y silenciamiento con ARN interferente 7.1.1. Función de los ARN interferentes. Los small interfering RNA intervienen en la regulación de la expresión génica post eucariotas. Estos ARN se unen específicamente a ARN mensajeros complementarios en el citosol, aumentando o disminu 72 En cada experimento, se tomaron fotografías de 45 campos por cada grupo de tratamiento con el objetivo de 20X. Se realizaron dos fotografías por cada campo seleccionado, una para cada tipo de fluorescente (DAPI o FITC - AlexaFluor 488 nm). Para el análisis de los resultados, se realizó por cada campo fotografiado un conteo de los núcleos teñidos con DAPI, equivalente al número total de células viables; y después otro de los marcados con el anticuerpo secundario fluorescente (figura 28) finales se expresaron en porcentaje de núcleos marcados con AlexaFluor respecto al número de núcleos totales o núcleos con fluorescencia para DAPI. Fotografía de campos al microscopio con el objetivo de 20X; los núcleos celulares visibles en a izquierda y derecha muestran marcaje para DAPI y FITC, respectivamente. 7. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 7.1. Transfección y silenciamiento con ARN interferente 7.1.1. Función de los ARN interferentes. (siRNA) o ARN interferentes son ribooligonucleótidos que intervienen en la regulación de la expresión génica post - transcripcional en células eucariotas. Estos ARN se unen específicamente a ARN mensajeros complementarios en el citosol, aumentando o disminu yendo su actividad. Así, pueden impedir que un 5 campos por cada grupo de tratamiento con el objetivo de 20X. Se realizaron dos fotografías por cada campo AlexaFluor 488 nm). fotografiado un conteo de los núcleos teñidos con DAPI, equivalente al número total de células viables; y después (figura 28) . Los datos con AlexaFluor respecto al Fotografía de campos al microscopio con el objetivo de 20X; los núcleos celulares visibles en para DAPI y FITC, respectivamente. (siRNA) o ARN interferentes son ribooligonucleótidos que transcripcional en células eucariotas. Estos ARN se unen específicamente a ARN mensajeros complementarios en yendo su actividad. Así, pueden impedir que un 73 determinado ARN mensajero sintetice su proteína, disminuyendo la expresión del gen. Los ARN interferentes poseen una importante función endógena protegiendo a la célula de la entrada de material genético foráneo, como el procedente de virus; y también actuando en algunos casos en supresión tumoral. En los últimos años han sido ampliamente utilizados en investigación como herramienta molecular para disminuir la expresión de genes in vitro, y así ayudar a elucidar la función de la proteína que sintetizan. La vía de acción de los ARN interferentes, esquematizada en la figura 29, se inicia mediante la enzima Dicer, que tras la unión del ARN interferente con su homólogo dentro de la célula, se une específicamente a la cadena de ARN de doble cadena larga resultante (dsRNA) y lo fragmenta en pequeños dúplex de aproximadamente 20 pares de bases cada uno. Estos pequeños ARNs son entonces introducidos en el complejo RISC (RNA-induced silencing complex), teniendo lugar la degradación por proteolisis de la cadena de ARN “diana” del siRNA, (pero no la de éste) mediante el componente catalítico de este complejo ( Hammond 2005 ). Figura 29. Esquema del mecanismo de acción de los siRNA en el interior celular. Los ARN intereferentes disminuyen la expresión de una proteína de forma transitoria, ya que poseen una vida relativamente corta dentro de la célula. El máximo silenciamiento del ARN diana tiene lugar entre las 48 y las 72 horas de la transfección. En el caso de los ensayos de marcaje con BrdU, la incubación con U-II tuvo lugar a las 80 0,23 + 0,05 g; 0,36 + 0,07 g; y 0,92 + 0,13 g con las dosis de 1, 10, 50 y 100 nmol/l respectivamente). Al llevar a cabo el ajuste de la curva de dosis-respuesta (figura 31) comprobamos que la concentración efectiva media (EC 50 ) de la acción del fármaco en vasoconstricción es de 57,38 nmol/l. Figura 31. Dosis-dependencia de la contracción inducida por U-II. En el panel izquierdo, contracción vascular en anillos arteriales tratados con 10, 50 y 100 nmol/l de Urotensina-II. El panel derecho representa la curva dosis-dependencia a escala logarítmica de la vasoconstricción promovida por el péptido, con una EC 50 de 57,38 nmol/l (n= 4-13 anillos). Los datos están expresados en media + error estándar. El ajuste de la curva se llevó a cabo con la ecuación de Hill. 1.2 La Urotensina-II promueve un aumento en la concentración de Ca 2+ intracelular en células de músculo liso aisladas El mecanismo intracelular más importante a la hora de promover la contracción del músculo liso vascular es el aumento en la concentración de Ca 2+ citosólico, como se ha explicado con detenimiento en la Introducción de este trabajo (apartado 3.2.). Por esta razón, una vez confirmado el relevante efecto de la U-II en el aumento del tono vascular, se realizaron ensayos de movilización de Ca 2+ en CMLV procedentes de cultivo primario para elucidar el papel del péptido en la regulación del Ca 2+ intracelular. En presencia de 2 mmol/l de CaCl 2 , la U-II (100 nmol/l) es capaz de inducir un aumento significativo en la concentración de Ca 2+ intracelular (Δratio = 0,97 + 0,32 u.a.), como aparece reflejado en la figura 32. Estos resultados muestran que la U-II es capaz de movilizar el Ca 2+ intracelular en CMLV. 0,5 g U-II 5 min 10 nmol/l 50 nmol/l 100 nmol/l 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 89 10 2 3 4 5 6 7 89 100 EC 50 ≈ 57,38 nmol/l Δ fuerza isométrica (g) U-II, nmol/l 81 Figura 32. En CMLV de aorta, la Urotensina-II promueve un aumento en la concentración de Ca 2+ intracelular. A la izquierda, registro que ilustra los cambios en concentración de Ca 2+ intracelular de CMLV en solución control (con 2 mmol/l de Ca 2+ ). La U-II (100 nmol/l) se agregó al medio en el punto marcado con la flecha. Derecha: diágrama de barras que muestra el resumen estadístico de los experimentos. El aumento en concentración de Ca 2+ se estimó a partir de la ratio al final y al comienzo del experimento. Por otra parte, se llevaron a cabo experimentos similares en ausencia de Ca 2+ extracelular (solución 0Ca 2+ , tabla 2 de Material y Métodos) con el fin de evaluar si el aumento en Ca 2+ citosólico promovido por la U-II se debe a una liberación del ión desde los reservorios, a una entrada desde el medio extracelular o a una combinación de ambos fenómenos. Así, la figura 33 muestra que la aplicación de U-II 100 nmol/l en solución 0Ca 2+ induce un pequeño incremento en la concentración de Ca 2+ que corresponde a la liberación del ión desde los reservorios intracelulares. 3 minutos después, que según experimentos previos de curso temporal son suficientes para vaciar los reservorios e inducir una respuesta máxima del péptido, se añadió 2 mmol/l de Ca 2+ al medio; y se observó una segunda subida más potente en la concentración de Ca 2+ intracelular correspondiente a la entrada del ión a través de la membrana plasmática. Este aumento en la concentración de Ca 2+ intracelular es además significativamente superior a la entrada pasiva de Ca 2+ o leakage que tiene lugar cuando el mismo protocolo de readición de Ca 2+ se lleva a cabo en ausencia de agonistas (0,84 + 0,06 con 100 nmol/l de U-II vs. 0,25 + 0,03 en experimentos de leakage; los datos se expresan en unidades arbitrarias). 0,5 1 1,5 2 2,5 30 seg Ratio (340/380nm) Ca 2+ 2mmol/l 0 0,5 1 1,5 2 2,5 basal + U-II 100 nmol/l Ratio (340/380nm) U-II 82 Figura 33. El incremento de Ca 2+ intracelular promovido por la Urotensina-II depende de su receptor específico. En el panel superior, ensayos de Western Blot confirman la presencia del receptor UTS2R en CMLV de aorta. Izquierda: registro que muestra los dos componentes del aumento en Ca 2+ intracelular mediado por U-II (100 nmol/l) en ausencia de Ca 2+ , así como el efecto inhibitorio de ambos en células preincubadas durante 1-2 minutos con Urantide 100 nmol/ (línea gris). A la derecha, resumen estadístico (n= gran nº de células de 4-12 cultivos independientes). “**”p<0,01 Así mismo, el efecto de la U-II en la concentración de Ca 2+ citosólico fue estudiado con otras concentraciones del péptido: 50 nmol/l, 200 nmol/l y 1 µmol/l; tal y como se representa en la figura 34. En el caso de la dosis de 50 nmol/l, la U-II no es capaz de inducir una respuesta significativa (0,32 + 0,08 u.a., n= 2). En cuanto al resto de concentraciones, ninguna de ellas promueve una respuesta mayor que la inducida por U-II a 100 nmol/l (0,83 + 0,27 y 0,69 + 0,28 en u.a. con las dosis de U-II 200 nmol/l y 1 µmol/l, respectivamente). Por tanto, para los experimentos posteriores la U-II se aplicó en todos los casos a la concentración de 100 nmol/l. UTS2R 60 KDa U-II 100 nmol/l 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 + Urantide 100 nmol/l Δratio ** 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 1 min 0Ca 2+ + EGTA Ca 2+ 2mmol/l U-II Ratio (340/380nm) + Urantide 83 Figura 34. Efecto dosis-dependiente de la U-II en la concentración de Ca 2+ intracelular de CMLV. Registros representativos (izquierda) y estadística (derecha) de los cambios en Ca 2+ citosólico en células tratadas con 50 nmol/l, 100 nmol/l, 200 nmol/l y 1 µmol/l de U-II en solución libre de Ca 2+ . La U-II fue aplicada 3 minutos antes de la readición de Ca 2+ 2 mmol/l al medio. (n= gran número de células procedentes de 2 cultivos independientes). “*” p<0,05 1.3 El incremento en Ca 2+ y la vasoconstricción inducidos por Urotensina-II tienen lugar a través de su receptor específico y mediante la activación de la fosfolipasa C El siguiente objetivo consistía en determinar la vía de señalización de la U-II, que comienza por su receptor específico UTS2R siguiendo el esquema propuesto en la figura 35. Primero, ensayos de Western Blot determinaron la presencia de la proteína UTS2R en CMLV de aorta (figura 33). A continuación se comprobó su papel en la movilización de Ca 2+ ; la figura 33 muestra que el efecto del péptido se ve inhibido drásticamente, tanto la fase en ausencia de Ca 2+ como la dependiente de Ca 2+ extracelular, cuando las células son pretratadas durante 1-2 minutos con uno de los inhibidores específicos de UTS2R más potentes, el Urantide ( Patacchini y col. 2003 ), a 100 nmol/l (Δratio= 0,13 + 0,02 vs. 0,84 + 0,06). Una vez comprobado que el efecto de la U-II en el aumento de Ca 2+ intracelular depende de la activación de su receptor UTS2R, se analizó además la implicación en la contracción promovida por el péptido de dicho receptor y de la enzima que éste activa, la fosfolipasa C (PLC) (figura 35). 0,5 1 1,5 2 30 seg 100 nmol/l 200 nmol/l 0Ca 2+ + EGTA Ca 2+ 2mmol/l Ratio (340/380nm) 1 µmol/l 50 nmol/l 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 50 100 200 1000 U-II, nmol/l Δratio * 84 Figura 35. Primeros pasos en la vía de acción propuesta para la Urotensina-II en CMLV de aorta. La U-II se uniría a su receptor específico UTS2R anclado en la membrana plasmática. Este receptor, unido a proteína G, activaría a la fosfolipasa C (PLC) que a su vez sintetiza diacilglicerol (DAG) e InsP 3 . Éste último es capaz de promover el vaciado de Ca 2+ desde el retículo sarcoplásmico. Los inhibidores específicos utilizados en este paso del estudio para bloquear la acción de UTS2R y PLC fueron el Urantide y el U73122, respectivamente. Los resultados muestran que también el efecto de la U-II en contracción vascular es dependiente de la funcionalidad de UTS2R. Los anillos de aorta tratados con Urantide 100 nmol/l durante 5 minutos antes de la adición de U-II muestran una vasoconstricción significativamente menor, de 52,15 + 11,86 % con respecto a anillos control (figura 36). Dado que UTS2R se encuentra funcionalmente unido a la proteína Gq11 cuya activación estimula a su vez a la fosfolipasa C, pasamos a testar la influencia del inhibidor específico de ésta última, el U73122. Tal y como se ilustra en la figura 37, la aplicación de 50 µmol/l de U73122 a anillos de aorta de forma previa a la adición de UII es capaz de inhibir significativamente la vasoconstricción inducida por el péptido (47,9 + 5,62 % con respecto a anillos control con U-II). Urotensina-II PLC InsP 3 Ca 2+ Urantide U73122 DAG retículo sarcoplásmico 85 Figura 36. La contracción ejercida por Urotensina-II en anillos vasculares depende de la activación de su receptor específico UTS2R. A la izquierda, se muestra la diferencia en vasoconstricción de dos anillos tratados con U-II 100 nmol/l, uno de ellos preincubado con Urantide (100 nmol/l) durante 5 minutos. Derecha: diagrama de barras que muestra los datos estadísticos (n= 3). “*”p<0,05 Figura 37. Efecto de la inhibición de la fosfolipasa C en la vasoconstricción mediada por Urotensina-II. Panel izquierdo: registro representativo de la contracción vascular promovida por U-II 100 nmol/l en anillos control y en anillos pretratados durante 60 minutos con el inhibidor de la fosfolipasa C, U73122 (50 µmol/l). A la derecha, resumen estadístico de los experimentos (n= 5). “*”p<0,05 Tomados en conjunto, estos datos confirman que la acción de la U-II tiene lugar mediante la activación de su receptor específico, así como a través de la enzima fosfolipasa C. 0 20 40 60 80 100 + Urantide 100nmol/l U-II 100 nmol/l % contracción * + Urantide 100 nmol/l 0,5 g 5 min U-II control 0 20 40 60 80 100 + U73122 50 µmol/l % contracción U-II 100 nmol/l * 0,5 g 5 min + U73122 50 µmol/l U-II control 86 2. PAPEL DE LOS CANALES IÓNICOS EN LA VASOCONSTRICCIÓN MEDIADA POR LA UROTENSINA-II 2.1 Los canales de Ca 2+ voltaje-dependientes participan de forma parcial en la contracción inducida por Urotensina-II El siguiente paso del estudio fue comprobar si la activación de la cascada de señalización dependiente de UTS2R y fosfolipasa C podía modular la apertura de canales de Ca 2+ de forma posterior al vaciado del retículo sarcoplásmico, de la manera propuesta en la figura 38. Figura 38. Modelo propuesto para la entrada de Ca 2+ y subsiguiente contracción vascular mediada por Urotensina-II en CMLV. Una vez elucidados los primeros pasos de la ruta de señalización de la U-II, se estudió la vía de entrada del ión al interior celular, mediante dos de los canales de Ca 2+ más relevantes en músculo liso: los voltaje-dependientes (VOC) que se inhiben por antagonistas como la nifedipina; y los SOC, sensibles a 2APB, Gd 3+ y ML9. Para ello, analizamos primero el papel de la vía de los canales voltaje-dependientes (VOC) con uno de sus bloqueantes más empleados, la nifedipina, en la contracción vascular. El tratamiento con nifedipina 1 µmol/l induce una vasodilatación de las arterias precontraídas con U-II 100 nmol/l de hasta un 54,53 + 1,76 %. Sin embargo, la subsiguiente aplicación de 2-aminoetildifenil borato o 2APB (50 µmol/l), conocido ↑ [Ca 2+ ] i PLC InsP 3 SOC Ca 2+ vaciado de los reservorios de Ca 2+ Ca 2+ retículo sarcoplásmico Urotensina-II 2APB/Gd 3+ /ML9 VOC Ca 2+ Nifedipina CONTRACCIÓN VASCULAR DAG 87 inhibidor de los SOC ( Smani y col. 2007 ), consigue relajar de forma prácticamente completa el componente de contracción resistente a nifedipina (86,15 + 6,6 %), como aparece ilustrado en la figura 39. Figura 39. El componente resistente a nifedipina en la vasoconstricción mediada por U-II se revierte mediante la acción de 2APB. Registro representativo (izquierda) y resumen de datos (derecha) de la relajación vascular mediada por nifedipina (Nif, 1 µmol/l) y 2APB (50 µmol/l) en anillos arteriales precontraídos con U-II (100 nmol/l) (n= 5). “*”p<0,05 y “**”p<0,01. Estos resultados muestran que la vía de los canales de Ca 2+ voltaje-dependientes se encuentra implicada, aunque sólo parcialmente, en la vasoconstricción inducida por la U-II. Sin embargo, el componente de contracción resistente a la inhibición de esta vía puede relajarse mediante la inhibición de los SOC. 2.2 El aumento en tono vascular mediado por la Urotensina-II se revierte completamente mediante la inhibición farmacológica de los canales SOC Una vez elucidado el papel de los canales VOC en el efecto de la U-II, pasamos a estudiar más detenidamente la implicación de los canales SOC. La aplicación de un inhibidor de los SOC ampliamente usado, el dietilestilbestrol (DES, 2 µmol/l) ( Smani y col. 2007 ) en arterias precontraídas con U-II a 100 nmol/l logra revertir esta contracción vascular de una forma significativa (% de relajación = 64,15 + 5,08 % a los 30 minutos de su aplicación). También el 2APB, aplicado en dosis crecientes de 10, 30 y 50 µmol/l, ejerce un potente efecto vasodilatador en anillos contraídos con U-II, con una EC 50 = 0 20 40 60 80 100 +Nif 1 µmol/l +2APB 50 µmol/l U-II 100 nmol/l % contracción * ** LNNA 200uM 10 min 0,5 g Nif 1 µmol/l 2APB 50 µmol/l U-II 88 6,7 µmol/l (figura 40). El porcentaje de relajación tras la aplicación de la última dosis de 2APB es de 94,03 + 2,66 %; por tanto, este fármaco logra devolver a los anillos a su tensión basal previa al experimento. Figura 40. La aplicación de inhibidores farmacológicos de los SOC revierte la vasoconstricción inducida por U-II. A la izquierda, registros representativos de anillos tratados con U-II 100 nmol/l y relajados con dosis sucesivas de 10, 30 y 50 µmol/l de 2APB (A) o DES 2 µmol/l (B). En el panel derecho: (A) ajuste de la curva a escala logarítimica de la dosis-dependencia del efecto de 2APB, donde la EC 50 es de 6,7 µmol/l (n= 4). El ajuste de la curva se realizó con la ecuación sigmoidal. (B) datos estadísticos de la relajación por DES, expresados en porcentaje de contracción normalizado a máxima respuesta de U-II (n= 5). “**” p<0,01 Tiempo, min U-II + DES 2 µmol/l % contracción ** 0 20 40 60 80 100 300 U-II DES 2 µmol/l 10 min 0,5 g B 100 80 60 40 20 1 2 3 4 5 6 7 89 10 2 3 4 5 6 7 % contracción 2APB, μmol/l EC 50 ≈ 6,7 μmol/l 10 10 min 2APB, µmol/l 0,5 g * 30 50 U-II * * A 89 2.3 La entrada de Ca 2+ inducida por Urotensina-II también puede ser revertida por el uso de fármacos inhibidores de los SOC A nivel celular, se confirma también el efecto de varios inhibidores de los SOC, como el 2APB (75 µmol/l) y el gadolinio (Gd 3+ , 5-10 µmol/l) ( Domínguez-Rodríguez y col. 2012 ), a la hora de prevenir la entrada de Ca 2+ mediada por U-II. Así, el Δratio es de 0,354 + 0,1 y 0,428 + 0,12 (u.a.) en células pretratadas con 2APB y Gd 3+ respectivamente (figura 41). En la misma figura se muestra, además, que la entrada de Ca 2+ inducida por U-II posee una magnitud y una cinética similares a la mediada por tapsigargina (TG, 2 µmol/l), fármaco promotor de la SOCE por inhibición de la SERCA y vaciado pasivo del ER/SR (Parekh y Putney, 2005) (0,86 + 0,08 u.a.). Figura 41. El tratamiento de CMLV con 2APB o Gd 3+ previene la entrada de Ca 2+ promovida por la U-II. A la izquierda, registro de los cambios en Ca 2+ intracelular en células tratadas con U-II 100 nmol/l (línea negra) o con tapsigargina (TG, 2 µmol/l) (línea gris claro) 3-4 minutos antes de la readición de Ca 2+ 2 mmol/l. El registro en color gris oscuro corresponde a células incubadas con U-II y tratadas con 2APB 75 µmol/l en el punto marcado con el asterisco. A la derecha, resumen de los experimentos, donde se incluye el estudio del efecto en células incubadas 10 minutos con Gd 3+ (5-10 µmol/l) y después tratadas con U-II (n= 3-6 cultivos). “*”p<0,05 y “**”p<0,01 en el tratamiento con inhibidores vs. control con U-II. Además, se estudió el efecto de otro inhibidor de los SOC descrito recientemente por varios autores en distintos tipos celulares, el ML9 ( Smyth y col. 2008, Potier y col. 2009 ), que en este caso fue aplicado tras la readición de Ca 2+ al medio en dosis sucesivas de 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 + Gd 3+ 5-10µmol/l +2APB 75µmol/l TG 2 µmol/l U-II 100 nmol/l Δratio ** * U-II + 2APB * 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 1 min U-II/TG Ratio (340/380nm) 0Ca 2+ + EGTA Ca 2+ 2 mmol/l TG U-II 96 Por otra parte, la figura 47 muestra que en células tratadas con siRNA para TRPC1 la UII también induce una entrada de Ca 2+ significativamente menor cuando se las compara con las células scramble. Estos datos revelan que la entrada de Ca 2+ inducida por U-II también depende, al menos en parte, de la activación de TRPC1, que se encuentra estrechamente relacionado con la vía de señalización de los canales SOC y algunos de sus efectos a nivel fisiopatológico ( Ong y Ambudkar 2011 ). Figura 47. El efecto de la Urotensina-II en aumento de Ca 2+ intracelular se ve afectado por el silenciamiento de TRPC1. Panel superior: ensayo de Western Blot que muestra los niveles proteicos de TRPC1 en células sin transfectar (control), scramble y transfectadas con siRNA para TRPC1 (siTRPC1). En la parte inferior, registro que ilustra el efecto de la U-II (100 nmol/l) en la concentración de Ca 2+ citosólico de células scramble y silenciadas para TRPC1. Panel derecho: resumen estadístico de los datos (n=3). “*”p<0,05 4. PAPEL DE LA FOSFOLIPASA A 2 INDEPENDIENTE DE Ca 2+ (iPLA 2 ), REGULADORA DE LA ENTRADA DE Ca 2+ A TRAVÉS DE LOS SOC, EN LA RESPUESTA A UROTENSINA-II El último paso referente a los efectos a corto plazo de la U-II en músculo liso vascular se centra en el papel de la fosfolipasa A 2 independiente de Ca 2+ (iPLA 2 ). Varios estudios determinan la importancia de esta enzima como reguladora de la activación de los SOC tras el vaciado de los reservorios ( Smani y col. 2004, 2007; Bolotina 2008 ) (figura 48). Por 1 min siTRPC1 scramble 0Ca2++ EGTA Ca2+ 2mmol/l Ratio (340/380nm) 0,5 1 1,5 2 + U-II 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Control sin transfectar scramble siTRPC1 U-II 100 nmol/l Δratio * 97 lo tanto, parece relevante caracterizar su implicación en los efectos de la U-II, tanto a nivel de cambios en la concentración de Ca 2+ intracelular como en base a la contracción vascular. Figura 48. Posible implicación de la iPLA 2 en la entrada de Ca 2+ vía SOC y la contracción vascular promovidas por la Urotensina-II. En los últimos experimentos de este primer apartado, el objetivo es comprobar la implicación de la enzima iPLA 2 como reguladora de la entrada de Ca 2+ a través de los SOC; y sin la cual los efectos de la U-II a corto plazo se verían claramente reducidos. 4.1 La Urotensina-II aumenta la actividad de la iPLA 2 en células de músculo liso de aorta Primero, se realizaron ensayos específicos de actividad enzimática para determinar si la aplicación de U-II a CMLV en cultivo primario podía tener alguna influencia en la actividad de iPLA 2 . La figura 49 muestra que las CMLV incubadas 5 minutos con U-II 100 nmol/l ven la actividad de la enzima significativamente incrementada con respecto a aquellas sin ningún tratamiento (1,08 + 0,20 vs. 0,27 + 0,11 en u.a.). Este efecto cursa mediante la activación de UTS2R, ya que el tratamiento previo con Urantide (100 nmol/l) durante 5 minutos antes de la adición de U-II logra prevenir este aumento en la actividad de iPLA 2 (0,32 + 0,13 u.a.). Además, la incubación durante 30 minutos con BEL (25 µmol/l), inhibidor específico de la enzima, antes de la aplicación de U-II inhibe SOC/Orai1 PLC InsP 3 Ca 2+ vaciado de los reservorios de Ca 2+ Ca 2+ retículo sarcoplásmico Urotensina-II STIM1 iPLA 2 β BEL/S-BEL DAG 98 también este efecto promovido por el péptido (0,15 + 0,07 u.a.). Estos datos indican que la U-II, a través de la unión a su receptor, es capaz de aumentar la actividad enzimática de iPLA 2 de manera específica. Figura 49. El tratamiento de CMLV con Urotensina-II promueve un aumento en la actividad de la iPLA 2 , que se revierte con el pretratamiento con BEL y Urantide. Resumen de los datos obtenidos en el ensayo de actividad enzimática de iPLA 2 : en control sin tratar, en células tratadas con U-II 100 nmol/l 5 minutos, y en células preincubadas durante 30 minutos con BEL 25 µmol/l o 5 minutos con Urantide 100 nmol/l antes del tratamiento con U-II. Los datos de actividad se muestran en unidades arbitrarias (n= 510). “**”p<0,01 en células tratadas con U-II vs. células sin tratar.”†”p<0,01 en tratamientos con inhibidores vs. células tratadas con U-II. 4.2 El inhibidor específico de la iPLA 2 revierte la contracción vascular mediada por la Urotensina-II De la misma forma, se analizó el efecto del inhibidor de la enzima en la contracción vascular mediada por U-II. A anillos de aorta precontraídos con U-II 100 nmol/l se les aplicaron dosis crecientes de BEL (10, 15 y 25 µmol/l) consiguiéndose una inhibición prácticamente completa del efecto de la U-II en vasoconstricción, con un ajuste de la curva dosis-dependencia donde la EC 50 del efecto de BEL es de 11,31 µmol/l (figura 50). El porcentaje de relajación vascular alcanzado por el tratamiento con BEL fue de 33,8 + 2,45 %, 62,84 + 3,89 % y 91,71 + 2,49 % con las dosis de 10, 15 y 25 µmol/l, respectivamente. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 + BEL 25 µmol/l + Urantide 100 nmol/l U-II 100 nmol/l Control sin tratar ** †† †† Actividad iPLA 2 (U.A.) 99 Figura 50. BEL, el inhibidor específico de iPLA 2 , revierte la vasoconstricción inducida por Urotensina-II de forma dosis-dependiente. A la izquierda, registro representativo de un anillo arterial contraído con U-II 100 nmol/l y la inhibición completa de este efecto tras la aplicación de dosis sucesivas de BEL (10, 15 y 25 µmol/l). A la derecha, ajuste de la curva a escala logarítmica del efecto dosis-dependiente de BEL (EC 50 =11,31 µmol/l) (n= 5). El ajuste se realizó con la ecuación sigmoidal. 4.3 La entrada de Ca 2+ inducida por Urotensina-II es sensible a la inhibición de la isoforma β de iPLA 2 , pero no a la de la isoforma γ. Finalmente, se analizó la influencia de la iPLA 2 sobre el aumento en Ca 2+ intracelular inducido por U-II, discriminando entre las isoformas de la enzima con ayuda de los distintos enantiómeros de BEL, R-BEL y S-BEL; que poseen especificidad para las isoformas iPLA 2 γ e iPLA 2 β, respectivamente ( Jenkins y col. 2002, Park y col. 2008 ). Así, el efecto de la U-II en aumento de Ca 2+ intracelular se ve efectivamente inhibido por la preincubación de las células con S-BEL 25 µmol/l, pero no cuando se lleva a cabo el tratamiento con la misma concentración de R-BEL. La figura 51 muestra que el aumento en Ca 2+ mediado por U-II en células tratadas 30 minutos a 37 ºC con S-BEL antes del experimento es de 0,44 + 0,13 u.a., en comparación con aquellas a las que se aplicó R-BEL en las mismas condiciones, que tuvieron un aumento de ratio de 0,70 + 0,17; valor no significativamente diferente al de las células tratadas sólo con U-II 100 nmol/l (0,84 + 0,06 u.a.). 100 Figura 51. La entrada de Ca 2+ promovida por U-II depende de la activación de iPLA 2 β, pero no de iPLA 2 γ. En el panel izquierdo se muestra el aumento en Ca 2+ citosólico en células incubadas con R-BEL ó S-BEL (25 µmol/l) durante 30 minutos a 37 ºC; y después tratadas con U-II 100 nmol/l de la forma anteriormente descrita. A la derecha, resumen estadístico de los resultados (n= 3 cultivos). “*”p<0,05 en células tratadas con S-BEL + U-II vs. control con U-II. “†”p<0,05 en el tratamiento con S-BEL vs. tratamiento con R-BEL. Estos resultados demuestran que es la isoforma β de la iPLA 2 la implicada mayoritariamente en los efectos de la U-II en cuanto a aumento de Ca 2+ intracelular. En cambio, la isoforma γ de la enzima no parece guardar una relación significativa con este efecto del péptido. 5. LA UROTENSINA-II ESTIMULA LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS DE MÚSCULO LISO VASCULAR Los resultados obtenidos en los apartados anteriores nos han permitido determinar la vía molecular por la cual la U-II ejerce dos importantes efectos a corto plazo: aumento del Ca 2+ intracelular en CMLV y contracción vascular. Sin embargo, como se explica en detalle en la Introducción de este trabajo (apartados 3.3 y 5.1), el aumento en Ca 2+ citosólico no sólo se encuentra implicado en los mecanismos de la vasoconstricción; es, además, un evento clave a la hora de regular otros procesos que requieren cursos temporales más prolongados. Así, la segunda parte de este estudio está dedicada a U-II 100 nmol/l 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 + R-BEL 25 µmol/l +S-BEL 25 µmol/l Δratio *† 0Ca 2+ + EGTA Ca 2+ 2 mmol/l + R-BEL + S-BEL Ratio (340/380nm) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 1 min U-II 101 comprobar si el efecto de la U-II en cuanto a aumento de Ca 2+ intracelular podría repercutir también en algunos de estos procesos celulares a largo plazo, como la regulación de la expresión génica y la proliferación del músculo liso vascular. 5.1. La incubación a largo plazo con Urotensina-II promueve cambios en la entrada de Ca 2+ regulada por los reservorios de CMLV Cuando se mantienen en cultivo a bajo porcentaje de suero, las CMLV poseen un fenotipo más similar al fisiológico o contráctil, así como una menor capacidad de movilización de Ca 2+ intracelular ante estímulos como el vaciado del RS ( Berra-Romani y col. 2008, Potier y col. 2009 ). El primer objetivo en esta parte del trabajo fue determinar si, en estas condiciones de cultivo, la incubación a largo plazo de CMLV con U-II era capaz de inducir cambios a nivel de entrada de Ca 2+ como respuesta al vaciado de los reservorios. Los datos representados en la figura 52 muestran que, efectivamente, la entrada de Ca 2+ inducida por la aplicación de TG (2 µmol/l) es significativamente más potente en células tratadas con 100 nmol/l de U-II durante 48 horas, en comparación con las células que no recibieron ningún tratamiento previo (Δratio = 0,73 + 0,06 u.a. en células incubadas con U-II vs. 0,46 + 0,04 u.a. en células sin tratar). Figura 52. La incubación a largo plazo con U-II induce cambios en la entrada de Ca 2+ regulada por los reservorios. A la izquierda, registros representativos de la movilización de Ca 2+ intracelular en células cultivadas con 0,1% de FBS, tratadas o no 48 horas con U-II a 100 nmol/l. La tapsigargina (2 µmol/l) se agregó en el punto marcado por la flecha en ausencia de Ca 2+ extracelular, y se añadió Ca 2+ mmol/l al medio después de 3-4 min. Derecha: resumen estadístico de los experimentos mostrados a la izquierda. TG 0,5 1 1,5 2 1 min Ratio (340/380nm) 0,1% FBS 0,1% FBS + U-II 0Ca 2+ + EGTA Ca 2+ 2mmol/l 0 0,2 0,4 0,6 0,8 + U-II 100 nmol/l Δratio TG 2 µmol/l 102 Estos resultados demuestran que la U-II es capaz de promover cambios en el comportamiento celular mediante su aplicación a largo plazo, lo que sugiere que ésta podría encontrarse implicada en los procesos que tienen lugar durante la modulación fenotípica de las CMLV. 5.2 La Urotensina-II induce proliferación celular a las 24 y 48 horas de su aplicación A continuación, y teniendo en cuenta que la proliferación celular depende en gran medida de los niveles de Ca 2+ intracelulares que se ven aumentados en presencia de UII, estudiamos si ésta podía inducir proliferación en CMLV de aorta. Se empleó en primer lugar un ensayo de proliferación con el reactivo AlamarBlue, que calcula el crecimiento celular de forma indirecta a partir del aumento en el metabolismo. Figura 53. Ensayos con AlamarBlue muestran que la U-II promueve proliferación en CMLV a las 24 y 48 horas de su aplicación. Resumen estadístico del crecimiento celular a lo largo de 48 horas en células control o tratadas con distintas concentraciones de U-II (10, 50 y 100 nmol/l). Los datos se encuentran normalizados al tiempo cero del experimento (n= 2-6 cultivos independientes). “*” p<0,05 respecto a control. Así, la figura 53 muestra que la U-II es capaz de inducir, de forma dosis-dependiente, un aumento significativo en crecimiento celular a las 24 y 48 horas de su aplicación a cultivo primario de CMLV. Para este ensayo, se estudió el efecto de la U-II a las concentraciones de 10, 50 y 100 nmol/l, observándose el mayor efecto en crecimiento con las dosis de 10 y 50 nmol/l (a las 48 horas: 33,19 + 3,46 % y 29,54 + 10,68 %, % crecimiento celular 0h 24h 48h 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Control U-II 10 nmol/l U-II 50 nmol/l U-II 100 nmol/l * * * * * 103 respectivamente, de aumento en proliferación; en comparación con un 18,40 + 4,03 % de crecimiento en células control). 5.3 El marcaje con BrdU confirma el efecto inductor de proliferación de la Urotensina-II Para confirmar este efecto, seguidamente se contrastaron los resultados con otro ensayo de proliferación diferente, que permite realizar un contaje directo del número de células que se han dividido en un periodo determinado de tiempo: el marcaje con bromodeoxiuridina (BrdU). Los ensayos de marcaje con BrdU en células incubadas con U-II confirmaron que ésta, a las 24 y 48 horas de su aplicación, es capaz de inducir un aumento de proliferación en comparación con las células que no han recibido ningún tratamiento (figura 54). Figura 54. El marcaje con BrdU confirma que la U-II induce proliferación en CMLV. A la izquierda, imágenes representativas de la fluorescencia para BrdU (en verde) y DAPI (en azul) en CMLV sin tratar (control) y tratadas durante 48 horas con U-II a 100 nmol/l. El marcaje con DAPI se analizó como control positivo del experimento. Derecha: resumen estadístico de la proliferación inducida por U-II a las 24 horas (panel superior) y 48 horas (panel inferior). Los datos están normalizados a máxima respuesta (n= 2-4 cultivos independientes). “**” p<0,01 Control U-II 100 nmol/l (48h) DAPI BrdU 0 20 40 60 80 100 50 100 U-II, nmol/l ** % fluorescencia para BrdU (24h) 0 20 40 60 80 100 % fluorescencia para BrdU (48h) + U-II 100 nmol/l ** 104 De esta forma, las CMLV tratadas con 100 nmol/l de U-II durante 24 o 48 horas proliferaron un 50,06 + 14,11 % y un 45,11 + 8,12 % más que las células control, respectivamente. En cambio, la concentración de 50 nmol/l no tuvo un efecto significativo, ya que en este caso el aumento en proliferación fue tan sólo de 9,46 + 11,60 % a las 24 horas. Tomados en conjunto, estos datos prueban que la U-II es capaz de promover un incremento relevante en la proliferación del músculo liso vascular, consiguiéndose el máximo efecto con la concentración de 100 nmol/l. 5.4 El aumento en proliferación mediado por Urotensina-II se inhibe mediante el tratamiento con inhibidores de los SOC A continuación se analizó la implicación de la vía de los canales SOC en esta proliferación celular, para comprobar si posee la misma relevancia que en los otros efectos de la U-II anteriormente estudiados. Los resultados indican que las células incubadas con 50 µmol/l de 2APB 5 minutos antes del tratamiento con U-II (100 nmol/l) muestran un nivel de proliferación no estadísticamente diferente del que poseen las células sin tratar; así, este grupo de tratamiento posee un 67,98 + 12,59 % menos de núcleos positivos para BrdU que las células tratadas sólo con U-II, como aparece reflejado en la figura 55. También la incubación previa con ML9 logra inhibir de una forma significativa este efecto del péptido. Las células que fueron tratadas con ML9 a 5 µmol/l 5 minutos antes de la aplicación de U-II mostraron una proliferación 62,55 + 8,70 % menor que las tratadas tan sólo con U-II (figura 55). 105 Figura 55. El efecto de la U-II en proliferación se revierte mediante el tratamiento previo con 2APB o con ML9. Izquierda: imágenes de la fluorescencia para BrdU y DAPI en células tratadas 48 horas con U-II 100 nmol/l, y en células incubadas durante 5 minutos con 2APB 50 µmol/l o con ML9 5 µmol/l + 48 horas con U-II. En el panel derecho, el diágrama de barras muestra un resumen de los resultados, expresados en % de núcleos positivos para BrdU y normalizados a la máxima respuesta con U-II (n= 2-4 cultivos independientes). “**” p<0,01 Estos datos demuestran que los canales SOC juegan un importante papel en la proliferación inducida por U-II, de la misma forma que ocurre con el resto de efectos del péptido estudiados en la primera parte de este trabajo. Por tanto, los resultados sugieren también que el aumento en Ca 2+ citosólico mediado por el péptido puede ejercer efectos a largo plazo en CMLV. 5.5 El silenciamiento de Stim1 logra revertir la proliferación inducida por UrotensinaII Una vez comprobado que la inhibición de los canales SOC parece afectar de forma importante a la proliferación mediada por U-II, pasamos a estudiar el papel de las proteínas que pudieran encontrarse implicadas en su ruta de señalización. Comenzamos con el silenciamiento molecular de Stim1, proteína encargada de sensar los niveles de Ca 2+ en el interior del retículo y activadora de la SOCE. 0 20 40 60 80 100 + ML9 5 µmol/l + 2APB 50 µmol/l U-II 100 nmol/l % fluorescencia para BrdU 2APB 50 µmol/l BrdU DAPI ML9 5 µmol/l U-II 100 nmol/l 112 DISCUSIÓN Los resultados del presente trabajo analizan los efectos de la Urotensina-II, tanto a corto como a largo plazo, en músculo liso vascular de aorta. También estudian el papel que juegan en dichos efectos la vía de entrada de Ca 2+ a través de los canales SOC y su proteína reguladora, la iPLA 2 . La influencia de la U-II en la regulación del tono vascular y en la proliferación celular es de gran interés, ya que los resultados indican que se trata de un compuesto implicado en patologías vasculares como la hipertensión, o en otras dolencias que cursan con un aumento desmedido en la proliferación de CMLV, tales como la aterosclerosis o la reestenosis. Al mismo tiempo, conocer una de las vías de señalización por las cuales la U-II actúa a nivel celular podría ser de gran ayuda en la búsqueda de dianas terapéuticas que contrarresten los efectos adversos del péptido en el organismo. 1. LA UROTENSINA-II COMO UNO DE LOS MÁS POTENTES VASOCONSTRICTORES 1.1 Vasoconstricción por Urotensina-II en distintos territorios vasculares La U-II, conocida desde los inicios de su estudio como un importante agente vasoactivo, ha sido propuesta como el vasoconstrictor más potente identificado hasta la fecha en mamíferos, por encima de la endotelina-I ( Maguire y col. 2000 ). Sin embargo, la presencia y la potencia de este efecto en tono vascular dependen claramente de la especie y el vaso estudiados, y en ocasiones incluso de la sección de dicho vaso. En ratas, por ejemplo, la potencia de contracción de la U-II es mayor en la sección de aorta torácica que en la abdominal, y en ambos casos mayor que en arteria mesentérica ( Itoh y col. 1988 ). En humanos, la U-II promueve contracción vascular en arteria coronaria, mamaria y radial, así como en vena safena y umbilical ( Maguire y col. 113 2000 ). No obstante, la U-II no induce contracción vascular significativa en algunos vasos de resistencia, como arterias y venas subcutáneas ( Hillier y col. 2001 ). En este estudio confirmamos que la U-II ejerce una potente vasoconstricción en la sección torácica de la aorta, como se ha demostrado en trabajos anteriores ( Gibson 1987; Itoh y col. 1988; Tasaki y col. 2004 ). La contracción vascular inducida por el péptido es dependiente de la dosis y alcanza su máximo efecto cuando éste se aplica a 100 nmol/l. Al mismo tiempo, hemos determinado la especificidad del efecto de la U-II en tono vascular, demostrando que éste cursa mediante la unión del péptido a su receptor acoplado a proteína G UTS2R, que a su vez activa a la fosfolipasa C y promueve la síntesis de InsP 3 . En el estudio del mecanismo de acción de la U-II ya se había descrito con anterioridad una relación entre el aumento citosólico de InsP 3 y la vasoconstricción inducida por el péptido en aorta de conejo, sensible a inhibidores de la fosfolipasa C ( Saetrum-Opgaard y col. 2000 ). Por otra parte, se ha demostrado que la vasoconstricción promovida por U-II en aorta de rata puede revertirse mediante inhibidores de la PKC, Rho quinasas, tirosín quinasas, MAP quinasas y, de forma parcial, con verapamil, un bloqueante de los canales VOC, además de con antagonistas para el receptor de somatostatina ( Itoh y col. 1987; Rossowski y col. 2002; Tasaki y col. 2004 ). Sin embargo, los mecanismos exactos por los cuales la U-II promueve su efecto en contracción vascular son hasta la fecha desconocidos. En la parte de nuestro estudio referente a la influencia de la U-II sobre el tono vascular, demostramos que anillos de aorta precontraídos con U-II a 100 nmol/l se relajan de una forma prácticamente completa ante el tratamiento con inhibidores de los SOC, como 2APB y DES. Con estos resultados, presentamos por primera vez evidencias del importante papel que juegan los canales SOC en la vasoconstricción por U-II en aorta torácica de rata. 114 1.2 Influencia de la presencia del endotelio en la contracción vascular mediada por Urotensina-II De la misma forma, los datos de este estudio muestran que la vasoconstricción por UII es significativamente mayor en anillos a los que se ha eliminado el componente endotelial dependiente de óxido nítrico mediante la aplicación de LNNA, un inhibidor de la NO sintasa endotelial. Este dato es interesante, ya que anteriormente se ha demostrado que la U-II tiene un efecto dual en la pared vascular, siendo capaz de promover vasoconstricción independiente de endotelio y vasodilatación dependiente de endotelio ( Bottrill y col. 2000 ). La vasodilatación a través del endotelio inducida por U-II puede tener lugar mediante la acción del óxido nítrico o de mediadores inflamatorios como las prostaglandinas ( Bottrill y col. 2000; Gray y col. 2001; Lin y col. 2004 ). Así, es lógico suponer que la respuesta a U-II en tono vascular depende del balance final entre el efecto en CMLV y aquel que tiene lugar en células endoteliales. De esta manera, cuando el endotelio se encuentra presente en la pared del vaso, el efecto vasodilatador dependiente de este tejido compensaría de forma parcial la contracción de la capa media de músculo liso. De ahí que algunos autores sugieran que una de las funciones fisiológicas de la U-II es regular el tono vascular mediante el equilibrio entre la acción de los dos tipos de tejido ( Russell 2008 ). Sin embargo, cuando el endotelio se encuentra dañado y no es funcional, quedaría tan sólo el componente vasoconstrictor dependiente del músculo liso y la contracción mediada por U-II sería considerablemente mayor. Es por este motivo que se piensa que la U-II puede favorecer el desarrollo de la hipertensión cuando se rompe este equilibrio en la pared vascular, y ha sido propuesta como un eslabón entre factores de riesgo que cursan con disfunción endotelial y el desarrollo de enfermedades cardiovasculares ( Watanabe y col. 2006 ). Nuestros resultados confirman este importante papel del endotelio en la regulación del tono vascular por U-II, y por tanto apoyan la hipótesis de su rol como desencadenante de dolencias cardiovasculares partiendo de una disfunción de este tejido. 115 1.3 La Urotensina-II y su efecto en la homeostasis de Ca 2+ intracelular Los resultados ponen de manifiesto que la U-II promueve un aumento en la concentración de Ca 2+ intracelular de CMLV aisladas; efecto que depende, al igual que la contracción vascular, de la funcionalidad de su receptor. El efecto de la U-II en movilización de Ca 2+ intracelular se describió por primera vez en células HEK293 transfectadas con el receptor GPR14 de rata, homólogo a UTS2R en humanos ( Ames y col. 1999, Liu y col. 1999 ). También se ha demostrado que la aplicación de U-II incrementa la concentración de Ca 2+ citosólico en cardiomiocitos ( Onan y col. 2004 ) y en aorta de rata. En este último caso, el efecto del péptido muestra sensibilidad a la incubación previa con tapsigargina ( Tasaki y col. 2004 ). En CMLV de aorta, esta entrada de Ca 2+ por U-II se ha relacionado también con la vía de las MAP quinasas ( Iglewski y Grant. 2010 ). Sin embargo, los mecanismos por los cuales la U-II induce aumento en Ca 2+ intracelular no se encuentran claramente elucidados; y hasta hace poco, no se sabía si existía una implicación clara de la vía de los canales SOC y la iPLA 2 , encargada de regular su apertura, en este efecto del péptido. Este aspecto de su vía de señalización quedó establecido por primera vez en CMLV de arteria coronaria, donde se demuestra que la entrada de Ca 2+ mediada por U-II puede prevenirse mediante la utilización de inhibidores de los SOC, como el 2APB, el Gd 3+ o el DES; o de la iPLA 2 β, mediante el uso de S-BEL ( Domínguez-Rodríguez y col. 2012 ). Esta ruta de señalización queda también caracterizada en CMLV de aorta en el presente trabajo, a través del uso que hemos hecho de los inhibidores de los SOC y de la iPLA 2 β. Además de los fármacos ya mencionados, hemos testado la influencia del ML9, empleado en otros trabajos para inhibir la SOCE en CMLV de aorta ( Potier y col. 2009 ) aplicándolo en este caso de forma posterior a la entrada de Ca 2+ por U-II con el fin de estudiar su posible dosisdependencia. Efectivamente, hemos comprobado que el fármaco revierte este aumento en Ca 2+ intracelular alcanzando su máximo efecto a la concentración de 50 µmol/l. Así mismo, analizamos como control positivo del experimento el aumento en concentración de Ca 2+ mediado por tapsigargina (TG), inhibidor irreversible de la SERCA ( Parekh y Putney, 2005 ) y típico agonista promotor de la SOCE por vaciado pasivo 116 del RS. La entrada de Ca 2+ inducida por TG y por U-II en células de aorta son muy similares en cinética y magnitud, lo que confirma la implicación de la vía de los canales SOC en ésta última. Por otra parte, I CRAC ha sido la primera corriente SOC descubierta y la mejor estudiada hasta la fecha en distintos tipos celulares ( Parekh y Putney, 2005 ). Hasta hace pocos años no existían evidencias de la presencia de I CRAC en CMLV; no obstante, un estudio realizado por el equipo del Dr. Trebak en 2009 muestra que los miocitos de aorta pueden presentar una corriente I CRAC típica ante el vaciado de los reservorios con tapsigargina. Esta corriente se inhibe por 2APB, ML9 y bajas concentraciones de Gd 3+ , de la misma forma que ocurre en otros tipos celulares como HEK293 ( Potier y col. 2009 ). En este trabajo, y en colaboración con el equipo de investigación del Dr. Trebak, hemos descubierto que la U-II activa una corriente de Ca 2+ de propiedades similares a I CRAC en CMLV de aorta, que es así mismo sensible a la aplicación de 5 µmol/l de Gd 3+ . Para nuestro conocimiento, estas son las primeras evidencias de una corriente iónica activada por U-II. El hecho de que sus características tanto cinéticas como farmacológicas sean muy similares, aunque no idénticas (debido al prolongado curso temporal de su inhibición por Gd 3+ , que no se da en I CRAC ) a la principal corriente SOC estudiada en mamíferos corroboran el importante papel que juega la SOCE en el aumento en Ca 2+ intracelular mediado por la U-II. 2. PAPEL DE LOS CANALES DE Ca 2+ EN LA REGULACIÓN DEL TONO VASCULAR INDUCIDA POR UROTENSINA-II 2.1 Participación de los canales voltaje-dependientes en la contracción vascular Hasta hace poco, la vía de los canales de Ca 2+ voltaje-dependientes se consideraba la única de importancia a la hora de hablar de la contracción vascular promovida por agonistas, sobre todo en arterias pequeñas o de resistencia ( Leung y col. 2008, Park y col. 117 2008 ). Esto cambió en gran medida al descubrirse y estudiarse en profundidad la vía de los canales SOC, y descubrir que se encuentran fuertemente implicados en la contracción vascular de un gran número de arterias ( Leung y col. 2008 ). En nuestro estudio, la aplicación de nifedipina, un bloqueante de los canales de Ca 2+ voltaje-dependientes ( Smani y col. 2007 ) consiguió promover una relajación significativa, pero parcial, de anillos arteriales precontraídos con la máxima dosis de UII. Con estos datos, corroboramos lo demostrado en estudios anteriores, donde el tratamiento con inhibidores de los VOC no consigue revertir totalmente el efecto de la Urotensina-II en el tono vascular de aorta ( Rossowski y col. 2002, Tasaki y col. 2004 ). Esto confirma que debe haber otras vías de importancia en la contracción vascular mediada por U-II, por lo que nos centramos en estudiar la vía de los canales SOC. 2.2 Regulación del tono vascular y de la homeostasis de Ca 2+ por los SOC Para analizar el papel de los SOC en contracción vascular y aumento en Ca 2+ intracelular, utilizamos inhibidores farmacológicos ampliamente usados en anteriores trabajos. Así, Flemming y colaboradores han demostrado en sus estudios con CMLV de arteriola cerebral de conejo que la SOCE puede bloquearse de manera efectiva con Gd 3+ de una forma dosis-dependiente y con una concentración de hasta 75 µmol/l de 2APB; mientras que la nifedipina no tiene efecto apreciable en la inhibición de los SOC ( Flemming y col. 2003 ). También se ha determinado que el DES, agonista sintético de los receptores para estrógenos, inhibe los canales SOC de forma reversible en CMLV de aorta, así como en células de arteria mesentérica, células RBL y plaquetas humanas ( Zakharov y col. 2004, Brueggemann y col. 2006 ). En nuestros experimentos, tanto el 2APB como el DES inhibieron de una forma prácticamente completa la vasoconstricción inducida por 100 nmol/l de U-II. El 2APB fue aplicado en dosis sucesivas de 10, 30 y 50 µmol/l, alcanzándose la vasodilatación de la arteria hasta su nivel basal previo a la aplicación de la U-II con esta última concentración. Según nuestros datos, la SOCE parece tener más peso que la vía de los canales VOC a la hora de revertir la contracción vascular por U-II, dado que el 2APB consigue relajar el 118 componente resistente a nifedipina en arterias precontraídas con el péptido. Cuando se aplicaron en ausencia de inhibidores de los VOC, tanto el 2APB como el DES vasodilataron los anillos de aorta contraídos con U-II hasta prácticamente devolverlos a su nivel de contracción basal. Sin embargo, estudios de contracción mediada por tapsigargina o fenilefrina (agonista que también se une a GPCR y es capaz de activar la SOCE) en arterias de resistencia, como la arteria coronaria o la mesentérica, indican que en este tipo de vasos la contracción vascular puede ser inhibida en su totalidad tanto por bloqueantes de los VOC como por inhibidores de los SOC ( Park y col. 2008 ). Además, estudios en arteria coronaria muestran que la U-II promueve contracciones significativamente menores al aplicarse en presencia de 0,5 µmol/l de nifedipina ( Domínguez-Rodríguez y col. 2012 ). Estas evidencias podrían explicarse por una conexión entre los VOC y los SOC a la hora de inducir la contracción vascular, que ya ha sido sugerida por otros autores ( Leung y col. 2008 ) y que sería más fuerte en arterias de resistencia que en arterias de conducción, como es la arteria aorta ( Park y col. 2008 ). Esta hipótesis también explicaría el hecho de que la contracción vascular inducida por tapsigargina u otros inhibidores de la SERCA sea también sensible a nifedipina en aorta ( Kwan y col. 1994; Tepel y col. 1994; Leung y col. 2008 ). Por otra parte, hemos demostrado que el aumento en Ca 2+ intracelular promovido por la U-II depende de la activación de los SOC y su vía de señalización, ya que se inhibe de una forma casi completa tanto mediante el tratamiento con algunos de los inhibidores farmacológicos antes mencionados (2APB, Gd 3+ y ML9) como a través del silenciamiento molecular de dos componentes clave en la SOCE, Stim1 y Orai1. 2.3 Relación entre contracción vascular a través de los SOC y la iPLA 2 ; papel de la Urotensina-II Nuestros resultados muestran un importante papel de los SOC en el aumento de Ca 2+ intracelular y la contracción inducida por U-II, efectos para los que es necesaria la activación de la iPLA 2 . La aplicación de BEL, inhibidor específico de la enzima, muestra un efecto contundente tanto aplicado en dosis crecientes en la arteria completa como en la incubación de CMLV con una dosis única de 25 µmol/l, siendo esta inhibición 119 comparable a la producida tanto a nivel arterial como celular por los inhibidores de los SOC. La funcionalidad de iPLA 2 ha demostrado ser un requisito indispensable para el desarrollo de la SOCE en una gran diversidad de tipos celulares, no sólo en CMLV ( Smani y col. 2003, 2004 ) sino también en células RBL ( Zarayskiy y col. 2007 ), astrocitos ( Singaravelu y col. 2006 ), fibroblastos ( Martínez y Moreno, 2005 ) o músculo esquelético ( Boittin y col. 2006 ). Como reguladora de la actividad de los SOC, esta enzima se encuentra así mismo implicada en efectos a nivel fisiológico de estos canales. Nuestro grupo de investigación ya ha demostrado en anteriores estudios el importante papel de la iPLA 2 y de los lisofosfolípidos producto de su síntesis en la vasoconstricción de la arteria coronaria a través de la SOCE inducida por agonistas ( Smani y col. 2007 ). También se ha descrito un papel crucial de la iPLA 2 β como mediadora de la SOCE en la vasoconstricción por agonistas de arteria carótida, cerebral y mesentérica ( Park y col. 2008 ). En ambos estudios, el fármaco empleado para promover la contracción vascular es la fenilefrina, que al igual que la U-II se une a un receptor acoplado a proteína G y promueve un aumento de los niveles de IP 3 en el citosol. Por último, otro reciente estudio de nuestro equipo demuestra que la U-II es capaz de promover una potente vasoconstricción en arteria coronaria a través de la SOCE y de la iPLA 2 β o de lisofosfatidilcolina, uno de los lisofosfolípidos que sintetiza ( DomínguezRodríguez y col. 2012 ) el cual a su vez ya había sido relacionado con anterioridad con la inhibición de la vasodilatación por óxido nítrico en el territorio vascular ( Watanabe y col. 2002 ). Así mismo, en el estudio de Domínguez-Rodríguez y colaboradores al igual que en este trabajo, la U-II es capaz de incrementar la actividad de iPLA 2 en CMLV de forma dependiente de la funcionalidad de su receptor. Por lo tanto, los resultados del presente estudio suponen un paso más en el esclarecimiento de los mecanismos que median la ruta de señalización de la SOCE a la hora de promover la vasoconstricción por agonistas en general, y mediada por la U-II en particular. 120 2.4 Papel de los distintos componentes de la SOCE en la contracción vascular En este trabajo demostramos que el aumento en Ca 2+ intracelular mediado por U-II posee una clara dependencia de la activación de Stim1 y Orai1. Ya en los inicios del estudio de estas proteínas, quedó patente que ambas eran necesarias para que la entrada de Ca 2+ por los canales SOC tuviera lugar ( Roos y col. 2005; Zhang y col. 2005; Vig y col. 2006 ). A pesar de estos datos, y de las evidencias que demuestran la existencia y la importancia de la SOCE en el músculo liso vascular, no existen apenas estudios acerca del papel de Stim1 u Orai1 en la contracción vascular promovida por agonistas. El gran tamaño y grosor de los anillos de aorta hacen que resulte complicada la realización de técnicas de silenciamiento molecular de tejidos para elucidar el papel de Stim1 y Orai1 en la vasoconstricción mediada por U-II. No obstante, existen evidencias del importante papel que estas proteínas juegan en la contracción de otro tipo de vasos. Recientemente, un estudio de nuestro grupo ha revelado que la transfección de anillos de arteria coronaria con siRNA para Stim1 u Orai1 mediante la técnica de Chariot inhibe drásticamente la vasoconstricción por U-II de estos anillos, en comparación con los anillos transfectados con siRNA scramble ( Domínguez-Rodríguez y col. 2012 ). Estos datos, y el indispensable papel que juegan tanto Stim1 como Orai1 en la entrada de Ca 2+ inducida por U-II en aorta, sugieren que también en este vaso es necesaria la funcionalidad de estas dos proteínas para que la vasoconstricción mediada por el péptido tenga lugar. 2.5 TRPC1 como potencial componente del complejo macromolecular de la SOCE Existen varios tipos de corrientes reguladas por los reservorios, con distintas características a I CRAC , y que se encuentran presentes en tejidos muy diversos, como células acinares pancreáticas ( Krause y col. 1996 ), endotelio ( Vaca y Kunze 1994 ) y células de músculo liso vascular, tanto arteriales ( Trepakova y col. 2001, Golovina y col. 2001 ) como venosas ( Albert y Large. 2002 ). Estos datos sugieren que la SOCE no se encuentra mediada por un único canal, sino por una familia de canales cuyas propiedades biofísicas pueden diferir, y a la que se denomina en su conjunto familia de los canales 121 regulados por reservorio o SOC ( Parekh 2003 ). Además, su vía de señalización se encuentra compuesta por numerosas proteínas y estructuras macromoleculares, de tal forma que algunos autores van un paso más allá y lo denominan el complejo de entrada de Ca 2+ regulada por los reservorios o SOCIC ( Vaca 2010 ) del cual aún se han seguido elucidando nuevos componentes en los últimos años. A medida que éstos se van descubriendo, las hipótesis sobre la estructura del complejo macromolecular que media esta entrada de Ca 2+ se complican y surgen nuevas incógnitas al respecto. En este trabajo, demostramos la implicación de TRPC1 en la entrada de Ca 2+ mediada por U-II, implicación que juega una relevancia en este efecto casi tan importante a la que poseen las moléculas principales de la SOCE, Stim1 y Orai1. Cada vez son más numerosas las evidencias de otras moléculas activadas por Stim1, la mayoría de las cuales también se encuentran implicadas en la SOCE. Huang y colaboradores han descrito que Stim1 y TRPC1 interaccionan entre ellos y que el dominio citosólico de Stim1 aumenta la actividad del canal ( Huang y col. 2006 ), asociación que se ve incrementada tras el vaciado de los reservorios y vuelve a su estado inicial cuando éstos se llenan de nuevo. Por otra parte, Stim1 no sólo se une directamente a TRPC1, sino también a TRPC4 y TRPC5, siendo necesaria esta unión para su apertura inducida por agonistas; y modula indirectamente la actividad de TRPC3 y TRPC6 ( Yuan y col. 2007 ). Otros experimentos en células de glándula salivar humana muestran que Orai1 y TRPC1 colocalizan en la membrana plasmática, y que la colocalización subcelular de Stim1 y TRPC1, así como la de Stim1 y Orai1, aumenta tras la estimulación con tapsigargina ( Ong y col. 2007 ). Todos estos datos sugieren que Stim1 podría formar un complejo con TRPC1 y Orai1 para promover SOCE ( Ong y col. 2007 ) lo que concordaría con los resultados obtenidos en este estudio, donde la U-II requiere la actividad de las tres proteínas para mediar aumento en Ca 2+ citosólico. Sin embargo, otros estudios sostienen que Orai1 y TRPC1 podrían promover dos corrientes independientes dentro de la misma vía de señalización de Ca 2+ , actuando ambas después del vaciado de los reservorios y activándose mediante la interacción con Stim1. En células de glándula salivar humana, que expresan una corriente SOC distinta de I CRAC , la expresión de un mutante de Stim1 128 En este trabajo, demostramos por vez primera que la U-II es capaz de modificar la actividad de factores de transcripción activados por Ca 2+ a través de la SOCE, promoviendo la fosforilación de CREB y su translocación al núcleo celular. Este efecto puede prevenirse de forma contundente incubando las células con tres diferentes inhibidores farmacológicos de los SOC: 2APB, ML9 y Gd 3+ a bajas concentraciones. Este efecto del péptido también se inhibe por el silenciamiento molecular de Stim1 y de TRPC1, lo que está en concordancia con los resultados obtenidos en estudios mencionados con anterioridad en este apartado ( Takahashi y col. 2007 ). 6. IMPLICACIONES FISIOPATOLÓGICAS DE LA PROLIFERACIÓN PROMOVIDA POR LA UROTENSINA-II A TRAVÉS DE LA SOCE EN MÚSCULO LISO VASCULAR: POSIBLES DIANAS TERAPÉUTICAS Se ha demostrado en varios trabajos el papel que juega desde una perspectiva fisiopatológica la modulación fenotípica y el aumento en proliferación de CMLV mediada por los SOC, tanto por sus componentes clásicos como por el canal TRPC1 de forma asociada a la SOCE. El silenciamiento tanto de Stim1 como de Orai1 reduce la activación y translocación al núcleo de NFAT en modelos animales de angioplastia con balón ( Zhang y col. 2011 ). Por otra parte, la expresión de TRPC1 se ve incrementada en modelos animales de daño vascular y en muestras humanas con formación de neoíntima, en las que el uso de anticuerpos específicos para el canal revierte la proliferación celular ( Kumar y col. 2006 ). Además, en modelos animales de reestenosis por daño vascular, los niveles de expresión de Stim1 y Orai1 en células de la capa media y neoíntima se encuentran significativamente elevados; el silenciamiento de ambas proteínas se traduce en una disminución del engrosamiento de la neoíntima. Tras estos estudios, Orai1 ha sido propuesto como una posible diana terapéutica en el tratamiento de patologías vasculares que impliquen un cambio fenotípico de las CMLV, con ventajas respecto a 129 Stim1 ya que es más fácilmente accesible al localizarse en la membrana plasmática ( Zhang y col. 2011, Guo y col. 2012 ). Los resultados obtenidos en este trabajo están en concordancia con estas evidencias, demostrando además que un péptido endógeno con gran influencia en la fisiopatología del sistema cardiovascular, la U-II, es capaz de desencadenar estas respuestas e inducir un cambio fenotípico y un aumento en proliferación del músculo liso vascular de aorta por una vía dependiente de la SOCE y de la activación de Stim1, Orai1 y TRPC1. Estos datos suponen un campo abierto a la hora de determinar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de aquellas patologías vasculares que cursan con modificaciones de las CMLV hacia un fenotipo proliferativo, como la aterosclerosis o la reestenosis tras daño vascular. Estas dianas terapéuticas podrían centrarse en la inhibición del receptor UTS2R o de la fosfolipasa C activada por éste; o también podrían encaminarse hacia la inhibición de las proteínas participantes en la SOCE que se ven activadas tras la síntesis de IP 3 inducida por la U-II y el posterior vaciado de los reservorios, como Stim1, Orai1 o TRPC1. ---------------------- En conclusión, nuestros resultados caracterizan la ruta de señalización intracelular por la cual la U-II ejerce sus efectos de aumento en el Ca 2+ intracelular, vasoconstricción, activación del factor de transcripción CREB y proliferación celular, de una forma dependiente de la SOCE a través de PLC, Stim1, iPLA 2 , Orai1 y TRPC1. Un resumen de la vía de señalización intracelular propuesta por estos resultados se encuentra esquematizado en la figura 61. 130 Figura 61. Esquema propuesto para la vía de señalización intracelular de la U-II. Según el modelo propuesto por los resultados obtenidos en este estudio, la U-II se une a su receptor UTS2R acoplado a proteína G, que activa a la PLC y promueve vaciado de los reservorios y agrupación de Stim1 en puncta por medio de la síntesis de IP 3 . Esta agrupación de Stim1 activa a la iPLA 2 y a los canales SOC, de los cuales Orai1 constituye una parte esencial. El Ca 2+ que entra a través de estos canales y de TRPC1, activados simultáneamente o a continuación de los SOC, así como el Ca 2+ liberado de los reservorios, son los desencadenantes de la vasoconstricción y proliferación inducidas por U-II. En este último efecto, el factor de transcripción CREB parece encontrarse también parcialmente implicado. vaciado de los reservoriosde Ca 2+ Ca2+ iPLA2 SOC (Orai1) siRNA UTS2R U-II BEL/S-BEL Urantide DES/Gd 3+ /2APB/ML9 Gq11 PLC IP 3 Ca2+ STIM1 siRNA contracción vascular y proliferación ?? U73122 SERCA TRPC1 Ca2+ siRNA ? PCREB 131 CONCLUSIONES 1. La Urotensina-II induce un aumento dosis-dependiente en el tono vascular de aorta torácica de rata, sensible a la funcionalidad del tejido endotelial. 2. La Urotensina-II, a través de la unión a su receptor específico, induce contracción vascular y aumento en la concentración de Ca 2+ intracelular en CMLV aisladas. La contracción vascular mediada por Urotensina-II es sensible a la inhibición tanto de los canales de Ca 2+ voltaje-dependientes como de los canales SOC. 3. El aumento en Ca 2+ intracelular promovido por la Urotensina-II en CMLV de aorta procedentes de cultivo primario también se revierte mediante la aplicación de inhibidores de los SOC. 4. La aplicación de Urotensina-II promueve corrientes de Ca 2+ y Na + de características similares a I CRAC, la principal corriente regulada por los reservorios estudiada en diversos tipos celulares. 5. El silenciamiento molecular de Stim1 y Orai1, proteínas clave en la vía de señalización de la entrada de Ca 2+ a través de los SOC, revierte el aumento en Ca 2+ intracelular promovido por la Urotensina-II. La inhibición de la expresión del canal catiónico TRPC1 también previene este efecto. 6. La fosfolipasa A 2 independiente de Ca 2+ , enzima reguladora de los canales SOC, se activa mediante el tratamiento con Urotensina-II. Su inhibición farmacológica revierte tanto la contracción vascular como el aumento en Ca 2+ intracelular inducidos por el péptido. 7. La Urotensina-II produce un aumento en la entrada de Ca 2+ mediada por tapsigargina en CMLV cultivadas a bajo porcentaje de suero, cambios similares a los que tienen lugar durante la modulación fenotípica de este tipo celular. 132 8. La Urotensina-II estimula la proliferación de CMLV de aorta a las 24 y 48 horas de su aplicación. 9. La proliferación celular mediada por Urotensina-II depende de la entrada de Ca 2+ a través de los canales SOC. 10. El efecto de la Urotensina-II en proliferación depende de la activación de Stim1, sensor del vaciado de Ca 2+ del retículo sarcoplásmico en la SOCE. 11. La proliferación inducida por Urotensina-II es también sensible al silenciamiento molecular de Orai1 y TRPC1, proteínas candidatas a formar un complejo macromolecular para promover la entrada de Ca 2+ inducida por el vaciado de los reservorios. 12. La Urotensina-II promueve, de una forma dosis-dependiente, la activación y translocación al núcleo celular del factor de transcripción CREB. 13. Tanto los canales SOC como Stim1 y TRPC1 se encuentran fuertemente implicados en la activación de CREB mediada por Urotensina-II. 14. Los resultados contenidos en este trabajo indican que la Urotensina-II puede constituir una importante diana terapéutica a la hora de prevenir y tratar enfermedades cardiovasculares relacionadas con la hipertensión y la proliferación celular. Así mismo, la vía de señalización de los SOC implicada en sus efectos podría ser de utilidad como diana farmacológica a la hora de tratar estas dolencias. 133 BIBLIOGRAFÍA - Abdullaev IF, Bisaillon JM, Potier M, Gonzalez JC, Motiani RK, Trebak M. Stim1 and Orai1 mediate CRAC currents and store-operated calcium entry important for endothelial cell proliferation. Circ Res. 2008 Nov 21; 103(11):1289-99. Epub 2008 Oct 9. - Akiba S, Sato T. Cellular function of calcium-independent phospholipase A2. Biol Pharm Bull. 2004 Aug; 27(8):1174-8. - Albert AP, Large WA. A Ca2+-permeable non-selective cation channel activated by depletion of internal Ca2+ stores in single rabbit portal vein myocytes. 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