Desenvolvimento e avaliação de nanosistemas de bases polimérica para aplicação em terapia génica

Imagem Luís Hen ique Eu ásio da Sil a Cabanas A aliação da capacidade de anspo e e en ega de ma e ial gené ico associada a di e en es nanossis emas de base polimé ica Disse ação de Mes ado em Engenha ia Biomédica na Especialidade de Ins umen ação e Bioma e iais Ma ço de 2018 Imagem Luís Hen ique Eu ásio da Sil a Cabanas A aliação da capacidade de anspo e e en ega de ma e ial gené ico associada a di e en es nanossis emas de base polimé ica Disse ação ap esen ada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Uni e sidade de Coimb a pa a cump imen o dos equisi os necessá ios à ob enção do g au de Mes e em Engenha ia Biomédica. Es e abalho oi desen ol ido no labo a ó io de Ve o es e Te apia Génica do Cen o de Neu ociências e Biologia Celula (CNC), sob a o ien ação cien í ica do Dou o Hen ique Faneca (CNC) e co-o ien ação da Dou o a Rosemey e Co dei o (CNC). Ma ço de 2018 ii iii Ag adecimen os A elabo ação des a disse ação con ou com di e en es al os e baixos, endo ha ido, ambém, alguns pe calços. Gos a ia de começa po ag adece ao Dou o Hen ique Faneca pela opo unidade, disponibilidade, paciência e conhecimen os ansmi idos ao longo des a iagem. À Rose, que me acompanhou ambém da melho o ma, seja na e en e eó ica ou na ansmissão de conhecimen o das p á icas labo a o iais, es ando semp e disponí el pa a ajuda . Um ag adecimen o mui o especial à Daniela, que me acompanhou ao longo de odo o p ocesso, endo p es ado uma ajuda de alo incalculá el e sem qualque ob igação pa a comigo. Aos meus pais, po , como semp e a é aqui, me e em dado a opo unidade de es uda e de aze as coisas sem di iculdades ac escidas, ampa ando as minhas pequenas quedas e dando oda a o ça do mundo pa a en a semp e aze melho . Po im, mas não menos impo an e, aos meus amigos que, sem mui as ezes o sabe em, me de am lições que se i am e con inua ão a se i pa a os meus sucessos pessoais e que, de uma o ma ou de ou a, es i e am semp e ao meu lado quando p ecisei. i Con eúdo Índice de Figu as ii Índice de Tabelas xii Resumo xiii Abs ac x Lis a de Siglas x ii 1 In odução 1 1.1 His ó ia da Te apia Génica 1 1.2 Sis emas de anspo e e en ega de ma e ial gené ico 4 1.2.1 Ve o es i ais 5 1.2.1.1 Ve o es de i ados de Adeno í us 7 1.2.1.2 Ve o es de i ados de Ví us Adeno-Associados 7 1.2.1.3 Ve o es de i ados de He pes Simplex Vi us (HSV) 8 1.2.1.4 Ve o es de i ados de Re o í us 9 1.2.1.5 Vec o es de i ados de Len i í us 9 1.2.2 Ve o es Não-Vi ais 10 1.2.2.1 Mé odos Físicos 11 1.2.2.2 Mé odos Químicos 13 1.3 Nanopa ículas Polimé icas 16 1.3.1 Conjugação do PEG com políme os ca iónicos 22 1.3.2 Ta ge ing e up ake das nanopa ículas 24 1.3.3 Escape endolisossomal e anspo e ci oplasmá ico 25 1.3.4 Impo ação do ma e ial gené ico pa a o núcleo celula 26 1.4 Obje i os 28 2 Ma e iais e Mé odos 30 2.1 Ma e iais 30 2.2 Mé odos 30 i 2.2.1 Cul u a de células 30 2.2.2 P epa ação dos poliplexos 31 2.2.3 Capacidade de T ans eção – Ensaio de Luminescência 31 2.2.4 Ensaio de Viabilidade Celula 33 2.2.5 Ca ac e ização Físico-Química das o mulações 33 2.2.5.1 Análise da di usão dinâmica da luz e Po encial Ze a 34 2.2.5.2 Ensaio de in e calação do B ome o de E ídio 35 2.2.5.3 Ensaio de ele o o ese em gel de aga ose 36 3 Resul ados e Discussão 37 3.1 Capacidade de ans eção das nanopa ículas em COS 7 – Ensaio de Luminescência 38 3.2 Ci o oxicidade dos poliplexos na linha celula COS 7 – Ensaio de iabilidade celula 51 3.3 Ci o oxicidade dos políme os 59 3.4 Capacidade de ans eção das nanopa ículas em HepG 2 – Ensaio de Luminescência 62 3.5 Ci o oxicidade dos poliplexos na linha celula HepG 2 – Ensaio de iabilidade celula 65 3.6 Ca ac e ização Físico-Química dos poliplexos 69 3.6.1 Tamanho e po encial ze a dos poliplexos 69 3.6.2 P o eção e condensação do ma e ial gené ico 75 4 Conclusão e Pe spe i as Fu u as 80 4.1 Conclusão 80 4.2 Pe spe i as Fu u as 85 5 Re e ências 87 ii Índice de Figu as Figu a 1- P incipais ma cos na his ó ia da e apia génica (Adap ado de His o y o Gene The apy. Gene. 2013; 525 (2): 162-169). 2 Figu a 2- Rep esen ação g á ica das p incipais condições es udadadas em ensaios de e apia génica (Visualizado em h p://www.abedia.com/wiley/indica ions.php). 3 Figu a 3- Ba ei as pa a en ega de genes in i o (Re i ado de Non-Vi al ec o s o gene-based he apy. Na Publ G . 2014; 15(8): 541-555). 5 Figu a 4- P incipais ipos de í us u ilizados como ec o es de ma e ial gené ico (Re i ado de La es de elopmen in i al ec o s o gene he apy. T ends Bio echnol. 2003;21(3):117-122). 6 Figu a 5- Fo mação de lipoplexos (Re i ado de Chemical ec o s o gene deli e y: up ake and in acellula a icking. 2010:640-645). 14 Figu a 6- Ilus ação esquemá ica da conjugação de lipossomas e ligandos (Re i ado de Cu en p og ess in gene deli e y echnology based on chemical me hods and nano-ca ie s. The anos ics. 2014;4(3):240-255). 15 Figu a 7- Políme o ca egado posi i amen e e DNA ca egado nega i amen e o mam es u u as denominadas de poliplexos. (Re i ado de Design and de elopmen o polyme s o gene deli e y. Na Re D ug Disco . 2005;4(7):581-593). 17 Figu a 8- Es u u as químicas dos políme os ca iónicos mais u ilizados em e apia génica (Adap ado de Non- i al ec o s o gene-based he apy. Na Publ G . 2014;15(8):541-555). 19 Figu a 9- Es u u a do políme o poli (2-aminoe il me ac ila o) (Adap ado de Poly (2-aminoe hyl me hac yla e) wi h well-de ined chain leng h o DNA accine deli e y o dend i ic cells. Biomac omolecules. 2011;12(12):4373-4385). 22 Figu a 10- Es u u a química do polie ilenoglicol (PEG). 22 iii Figu a 11- Mecanismos segundo os quais se c ê que o PEG aja aquando conjugado com nanopa ículas (Re i ado de PEGyla ion o nanoca ie d ug deli e y sys ems: S a e o he a . J Biomed Nano echnol. 2008;4(2):133-148). 24 Figu a 12- Equação ep esen a i a do p ocesso de bioluminescência. 31 Figu a 13- Es u u as químicas do homopolíme o PAMA (à esque da) e do copolíme o em bloco PEG-b-PAMA (à di ei a). 37 Figu a 14- E ei o da composição e da azão de ca ga N/P (políme o/ ma e ial gené ico) dos poliplexos na sua a i idade de ans eção em células COS-7 na ausência de so o. Os di e en es políme os PAMA (a) e copolíme os PEG-β-PAMA (b) o am complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos ácios N/ P indicados. O p ocedimen o expe imen al segue o desc i o na secção dos Ma e iais e Mé odos. Os esul ados são ep esen a i os de pelo menos 3 ensaios independen es. Os dados encon am-se exp essos em RLU de luci e ase po mg de p o eína celula o al (média ± des io pad ão, ob ida de iplicados). 39 Figu a 15- E ei o da p esença de so o na a i idade de ans eção de poliplexos p epa ados a pa i do homopolíme o PAMA (a) e do copolíme o PEG-β- PAMA (b) na linha celula COS 7. Os di e en es políme os e copolíme os o am complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos ácios N/P indicados. O p ocedimen o expe imen al segue o desc i o na subsecção Mé odos na secção dos Ma e iais e Mé odos. Os esul ados são ep esen a i os de pelo menos 3 ensaios independen es. Os dados encon am-se exp essos em RLU de luci e ase po mg de p o eína celula o al (média ± des io pad ão, ob ida de iplicados). 42 Figu a 16- E ei o da azão de ca ga e da p esença do PEG na a i idade biológica dos poliplexos p epa ados a pa i do pa PAMA17600/ PEG-b-PAMA20400 e PAMA26400/ PEG-b-PAMA29900 na p esença e ausência de so o em células COS 7. Os di e en es políme os e copolíme os o am complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos ês ácios N/P indicados. O p ocedimen o expe imen al segue o desc i o na secção Ma e iais e Mé odos. Os esul ados são ep esen a i os de pelo menos 3 ensaios independen es. Os dados encon am-se exp essos em unidades RLU de luci e ase po mg de p o eína celula o al (média ± des io pad ão, ob ida de iplicados). 49 Figu a 17- E ei o do peso molecula dos políme os e da azão de ca ga (N/P) dos poliplexos na iabilidade células COS 7. Os poliplexos o am p epa ados a pa i do x Abs ac Mode nizing he di e en Bio echnology echniques led o se e al ad ances ega ding a eas such as gene ics, aking hese pa in a b oad spec um o sciences, including medicine. The combina ion o a eas such as medicine and gene ics esul s, amongs o he hings, in he enhancemen o echniques like gene he apy, assuming i sel as one o he echniques wi h g ea e po en ial o ea ing o healing di e en pa ologies by co ec ing he exp ession o di e en genes esponsible o hem. The e icacy o gene he apy is in ima ely connec ed wi h he di e en sys ems o anspo and deli e y o gene ic ma e ial used, ha ing hese he obliga ion o p omo e a compe en and, abo e all, sa e deli e y o he gene ic ma e ial. Ha ing his in mind, di e en ypes o ec o s ha e al eady been s udied, bo h i al and non i al, coming o he conclusion ha , despi e he low ans ec ion e icacy ega ding i al ec o s, non i al sys ems a e sa e , combining ha wi h di e en cha ac e is ics, such as e sa ili y, packaging capaci y, abili y o be chemically unc ionalized and low immunogenici y. Rega ding he se o non i al ec o s, polyme ic nanosys ems appea as one o he mos p omising s a egies. Taking his in accoun , du ing his p ojec , he deli e y o genes p omo ed by polyplexes o med wi h he ca ionic polyme poly (me hac yla e 2-aminoe hyl) was e alua ed, s udying he in luence ha he polyme ’s molecula weigh , he copolyme iza ion wi h polye hylene glycol (PEG) and he polyplexes’ cha ge a io (N/P) ha e in pa ame e s as he biological ac i i y o he polyplexes and he cy o oxici y o bo h polyplexes and polyme s. In o de o p oceed o a ho ough s udy and o collec u he conclusions, a physico chemical cha ac e iza ion o he nanopa icles has also been done, consis ing his in he e alua ion o he ze a po en ial and size o he polyplexes, as well as in he polyme ’s condensing capaci y a e he o ma ion o complexes. The e alua ion o he polyplexes’ biological ac i i y s udied in he p esence and absence o se um, showed ha he p esence o his componen enhances he ans ec ion le els, highligh ing, in his pa ame e , he polyplexes based in he copolyme PEG-b-PAMA29900. These esul s show ha he copolyme iza ion wi h PEG led o be e esul s, specially conce ning biological ac i i y, being hese highe han he x i ones ob ained wi h he gold s anda d PEI polyplexes. The p esence o PEG enhanced se e al imp o emen s in he polyplexes’ cy o oxici y, no being able o p oduce be e esul s han he ones ob ained wi h he con ol (PEI), hough. PEG-b-PAMA29900 polyplexes’ physico chemical cha ac e iza ion showed a good DNA p o ec ion, a posi i e ze a po en ial and a size ha may allow nanopa icles o las longe in ci cula ion and bene i om enhanced pe mea ion and e en ion (EPR) e ec . Key wo ds: gene he apy, ca ionic polyme , polyplexes, gene ic ma e ial anspo and deli e y sys ems, cance . x ii Lis a de Siglas ATP- Adenosina i- os a o ATRP- Polime ização adicala po ans e ência a ómica BSA- Albumina de so o bo ino COS 7- CV-1 in o igin, and ca ying he SV40 gene ic ma e ial DLS- Dynamic Ligh Sca e ing DMEM-HG- Dulbecco’s Modi ied Eagle Medium – high glucose DNA- Deoxy ibonucleic acid DTT- Di hio h ei ol EDTA- E hylenediamine e aace ic acid E B - E hidium b omide FBS- Fe al bo ine se um HCC- Hepa oca cinoma celula Luc- Luci e ase Mn- Peso molecula N/P- Rácio azo o/ os a o PAMA- Poli (2-aminoe il me ac ila o) PBS- Phospha e-bu e ed saline PdI- Polidispe sion index PDMAEMA- Poly(2-dime hylaminoe hyl me hac yla e) pDNA- Plasmide deoxy ibonucleic acid PdI- Índice de polidispe são PEG- Polie ilenoglicol PEG-b-PAMA- Polie ileno glicol be a poli (2-aminoe il me ac ila o) PEI- Polie ilenimina PβAE- Poli (β-amino és e ) RLU- Rela i e ligh uni s RNA- Ribonucleic acid SDS- Sodium dodecyl sul a e TBE- T is/Bo a e/EDTA x iii xix 1 1 In odução 1.1 His ó ia da Te apia Génica O a anço dos es udos na á ea da gené ica é ans e sal a ou os campos, como o caso da medicina e, po conseguin e, o da Te apia Génica, consis indo es a écnica na inse ção de ma e ial gené ico exógeno numa célula especí ica, endo em is a a co eção da exp essão dos genes esponsá eis pela condição pa ológica, con e indo essas modi icações possibilidade de a amen o ou cu a da pa ologia em causa1. Pa a se a ingi o obje i o p opos o com a e apia génica, é necessá io que o ma e ial gené ico chegue ín eg o ao in e io das células-al o, sendo pa a o e ei o necessá ios sis emas de anspo e e en ega de ma e ial gené ico2, ema cen al da p esen e disse ação. Exis em duas classi icações possí eis pa a a e apia génica: e apia génica de células somá icas, incapaz de p oduzi uma he edi a iedade da espos a, e e apia génica de células ge mina i as1, capaz de ge a uma he edi a iedade das modi icações genómicas2. A aplicação de écnicas de e apia génica le an a bas an es ques ões a ní el é ico, o çando a uma legislação bas an e ape ada que pe mi e a sua ealização apenas em células somá icas3. Gene icamen e, exis em duas o mas de se conduzi es e ipo de e apia, sendo elas: in i o ou ex i o, consoan e a en ega de genes é ei a di e amen e no pacien e ou em células e i adas do pacien e e eimplan adas no amen e1. O concei o de Te apia Génica, como o conhecemos, su ge nos p imó dios da década de 70 do passado século4, ha endo a necessidade de assinala di e sos ma cos impo an íssimos pa a a cons ução e desen ol imen o da écnica em si, encon ando- se es es esquema izados na Figu a 1. Os p imei os ensaios clínicos em humanos o am ealizados em dois elemen os do sexo eminino com um dis ú bio no ciclo da u eia, u ilizando-se o í us Papilloma Shope como agen e esponsá el pela in odução do gene codi icado da a ginase nas duas pacien es5,6, já que alguns p odu os des e ciclo são ca alisados po es a enzima. Apesa do ensaio se e e elado um insucesso, eio-se p o a mais a de que o genoma des e í us não con inha sequências que codi ica am a a ginase, desmen indo as p imei as conclusões. 2 Figu a 1- P incipais ma cos na his ó ia da e apia génica (Adap ado de His o y o Gene The apy. Gene. 2013; 525 (2): 162-169). Em 1990, Ma in Cline execu ou pela p imei a ez um ensaio de e apia génica u ilizando DNA ecombinan e em dois pacien es com uma de iciência gené ica que esul a numa condição denominada de β- alassemia3, mo i ado po esul ados posi i os ob idos an e io men e na ans e ência de ma e ial gené ico exógeno em células es aminais de medula óssea de a os7. Apesa da ealização dos ensaios, o Conselho de Re isão Ins i ucional demons ou as suas p eocupações ace à sua e icácia8,9. Em 1990 é ap o ado o icialmen e, pela US Food and D ug Adminis a ion (FDA), o p imei o ensaio clínico usando um gene e apêu ico, conduzido po Michael R. Blaese10. Os sujei os-al o des e es udo o am dois pacien es com uma imunode iciência se e a combinada causada po um dé ice de adenosina deaminase. O a amen o p opos o en ol ia a manipulação gené ica ex i o dos glóbulos b ancos dos pacien es, de o ma a se in oduzido o gene esponsá el po codi ica a enzima an e io men e e e ida. G aças aos esul ados ob idos, a mesma e apia é pouco depois colocada em p á ica na União Eu opeia11, iniciando-se, po es a al u a, di e sos ensaios de ans e ência génica endo como obje i o a c iação de e apias pa a ou as doenças. No en an o, e apesa do a anço e i icado no campo da e apia génica, assis e-se, em 1999, à ágica mo e de Jesse Gelsinge , es ando es a elacionada com a adminis ação de um e o adeno i al12. 3 A ualmen e, o canc o é a doença mais isada pelas écnicas de e apia génica, sendo ce ca de 65 % dos ensaios clínicos ealizados di ecionados pa a doenças do o o oncológico3, como se obse a pela Figu a 2. Exis em ambém esul ados p omisso es quan o à aplicação de écnicas de e apia génica em doenças he edi á ias como a amau ose congeni al de Lebe 13, β alassemia14,15, imunode iciência se e a combinada g a e associada ao c omossoma X (SCID-X116, en e ou as. Figu a 2- Rep esen ação g á ica das p incipais condições es udadadas em ensaios de e apia génica (Visualizado em h p://www.abedia.com/wiley/indica ions.php). Alguns p odu os de base génica o am já ap o ados, como o Gendicine™, desen ol ido pela SiBiono Gene Tech Co., ap o ado em 2003 na China, sendo es e cons i uído po um adeno í us manipulado gene icamen e sem capacidade eplica i a17,18, que isa comba e o ca cinoma das células escamosas da cabeça e pescoço; o Onco ine™, ap o ado em 2005 no mesmo país e desen ol ido pela Sunway Bio ech Co. L d, que se des ina a pacien es com canc o naso a íngico e a á io em es ágios a ançados, sendo cons i uído po um ipo de adeno í us com capacidade de eplicação condicionada; o Ce ep o®, desen ol ido pela A k The apeu ics G oup PLC e ce i icado na União Eu opeia em 2004, é cons i uído po um adeno í us con endo o gene da imidina cinase, endo como obje i o o a amen o do glioblas oma mul i o me19, a ando-se do p imei o medicamen o a comple a um ensaio clínico de ase III3; o Glybe a®, desen ol ido pela Ams e dam Molecula The apeu ics, az uso de um e o i al adenoassociado pa a a a a de iciência se e a da lipase, endo sido ap o ado em 20123. 4 1.2 Sis emas de anspo e e en ega de ma e ial gené ico O desen ol imen o das écnicas de e apia génica es á dependen e da exis ência de mé odos e icazes de ans e ência de ma e ial gené ico. Po de inição, um e o é uma es u u a que con ém o gene e apêu ico de in e esse, endo di e sas unções, como a p o eção do gene, a mediação da en ada do mesmo nas células-al o e, no caso da u ilização de pDNA, o e ece a ga an ia de uma ansc ição es á el do gene aquando da sua chegada ao núcleo celula 20. A u ilização de nanossis emas pa a anspo e e en ega de ma e ial gené ico isa melho a o p ocesso de ans e ência génica, o nando-o mais e icien e, especí ico e segu o21. Um e o , pa a se conside a ideal, de e obedece a um conjun o de ca ac e ís icas, como po exemplo, não le a a uma espos a imuni á ia aguda; capacidade ilimi ada de empaco amen o do ansgene; conduzi a uma exp essão p olongada do gene e apêu ico; de e se especí ico; de e se capaz de en ega o ma e ial gené ico a células quiescen es e em di isão; de e se de ácil p epa ação; baixo cus o e es a disponí el come cialmen e a concen ações ele adas; e de e ambém pe mi i que, após en ada no núcleo, o ma e ial gené ico pe maneça numa posição epissomal ou in eg e uma egião especí ica do genoma22. A in odução de ma e ial gené ico exógeno em células isa egula a exp essão génica nas mesmas, podendo es e se de di e en es ipos, como po exemplo DNA, RNA, small in e e ing RNA (siRNA), mic o RNA (miRNA) ou oligonucleó idos an isense (ASON)23. O ipo de ma e ial gené ico a anspo a é, ambém, um dos a o es de seleção do e o a u iliza , já que exis em di e en es desa ios pa a a en ega de cada um dos ipos de ma e ial gené ico e e idos, de aco do com as ca ac e ís icas ísico- químicas das di e en es mac omoléculas. Independen emen e do ipo de ma e ial gené ico a anspo a , os e o es êm de ul apassa di e sos obs áculos, como po exemplo a deg adação enzimá ica, a exc eção po pa e do sis ema enal, a de eção po pa e do sis ema imuni á io e, após a en ada na célula, a deg adação po pa e do sis ema endolisossomal23, p ocessos ilus ados na Figu a 3. 5 Figu a 3- Ba ei as pa a en ega de genes in i o (Re i ado de Non-Vi al ec o s o gene-based he apy. Na Publ G . 2014; 15(8): 541-555). Os e o es podem se classi icados de uma o ma ab angen e como e o es i ais ou não- i ais. Tal como o nome suge e, englobam-se den o dos e o es i ais odos os e o es que u ilizam um í us como anspo ado de ma e ial gené ico, icando os es an es inse idos nos g upos de e o es não- i ais. As p incipais di e enças en e si se ão abo dadas com mais de alhe nos p óximos subcapí ulos. 1.2.1 Ve o es i ais Os í us podem se conside ados e dadei as máquinas biológicas que, e icien emen e, ganham acesso às células de o ma a i a em p o ei o da sua maquina ia e acili a em a sua eplicação24. Pa a se em usados em e apia génica, é 12 Técnica Desc ição Van agens Des an agens Aplicações Ele opo ação Aplicação de um campo elé ico. E icácia; Man ém os ecidos in ac os; Células di isí eis e não di isí eis; T ans e a um g ande núme o de células. Baixa iabilidade celula ; In lamação; Deposição de me ais; Cus o; In asi o. En ega de genes in i o; Combinação com quimio e apia; Uso em células es aminais. Sonopo ação Ul assons de al a in ensidade; Induz o mação de po os de ido ao mo imen o de um luído. Não in asi a; Baixo con olo da en ada do DNA; E icácia. Abso ção ansdé mica de medicamen os; En ega de genes in i o; Imagiologia. I adiação com lase Pe u ação de células a a és da a iação da equência de um lase . Seleção e imobilização da célula p e endida. Cus o. Necessi a de mais in es igação. Injeção hid odinâmica Ap o ei amen o da o ça ísica ge ada po uma injeção ápida de um g ande olume pa a aumen a a pe meabilidade celula . E iciência; Ní eis al os de exp essão do ansgene; Simplicidade. Volume inje ado é demasiado g ande; Funções génicas; Medicamen os de base génica; En ega in a- hepá ica de genes. Magne o ec ion C iação de um campo magné ico pa a di eciona a en ega de ma e ial gené ico. Não in asi o; P ecisão. Baixa ci o oxicidade; Al a e iciência. Magne es ex e nos êm de se o es; Rep og amação celula ; T ans eção de cul u as p imá ias. A mic oinjeção é ainda conside ada o mé odo ísico mais e icien e e di e o de en ega de genes44, apesa das des an agens ine en es ao mesmo. Tem-se indo a assis i a um cla o desen ol imen o dos mé odos ísicos de en ega de ma e ial gené ico, no en an o, o modus ope andi des es assen a á semp e na de o mação da memb ana celula , ameaçando a iabilidade das células44, o que se á semp e um obs áculo à aplicação des e ipo de écnicas. Exis em di e sos es udos que planeiam aze no as ecnologias pa a o me cado. Algumas dessas écnicas, como po exemplo 13 a en ega de genes a a és de ib ação molecula induzida po um campo elé ico, su gem como al e na i a à ele opo ação44. Es a écnica não comp eende a aplicação de uma co en e elé ica nas células, sendo a en ada do ma e ial gené ico exógeno acili ada pela ib ação induzida pelos elé odos44,45. Exis em algumas an agens associadas a es a écnica, como po exemplo a al a e iciência de ans eção aliada a uma baixa ci o oxicidade, pa a além da p omoção de uma exp essão do ansgene bas an e es á el44. 1.2.2.2 Mé odos Químicos Os e o es químicos são ou a subclasse de sis emas de anspo e e en ega de ma e ial gené ico pe encen e aos e o es não i ais. Es as es u u as êm sido in ensi amen e es udadas de ido às an agens que ap esen am em elação aos e o es i ais, como po exemplo, a segu ança, a capacidade de anspo a em ma e ial gené ico de maio es dimensões, a baixa oxicidade e a acilidade de p odução44. Den o des a subclasse, des acam-se alguns sis emas, como os lipossomas, os políme os ca iónicos, o os a o de cálcio e, po im, as nanopa ículas híb idas cons i uídas po lípidos e políme os40,46. A é à da a, os sis emas de anspo e mais es udados e u ilizados são os de base polimé ica e os de base lipídica47. 1.2.2.2.1 Co p ecipi ação de os a o de cálcio O mé odo de co-p ecipi ação de os a o de cálcio é uma opção bas an e a a i a de ido à sua biocompa ibilidade, biodeg adabilidade, capacidade de adso e ma e ial gené ico e e iciência ace ao cus o46,48,49. Es a écnica su ge aquando da explo ação da dis ibuição in acelula de DNA in e nalizado de ido à p ecipi ação de os a o de cálcio, ad indo daí e idências que suge iam a exis ência de uma ia na qual esículas in e mediá ias ans e iam DNA exógeno do complexo endolisossomal a é ao núcleo49. No en an o, as condições sob as quais su gem co-p ecipi ados de ma e ial gené ico e os a o de cálcio su icien emen e e icazes pa a ans ecções são bas an e exigen es a ní el ísico-químico, es ando a e icácia da ans eção e os ní eis de exp essão 14 do ansgene sujei os às condições a que a eação acon ece46, o que, aliado a uma pob e ep odu ibilidade50,51, cons i uem as maio es des an agens des a écnica. 1.2.2.2.2 Lipossomas ca iónicos Os lipossomas ca iónicos possuem a an agem de in e agi ele os a icamen e com o ma e ial gené ico ca egado nega i amen e, o mando lipoplexos21 (ilus ados na Figu a 5). Es as es u u as con e em algumas an agens à u ilização des e ipo de e o es, já que acili am o up ake celula , melho am a en ega dos genes a ní el in acelula e p o egem o ma e ial gené ico de deg adação enzimá ica21. Figu a 5- Fo mação de lipoplexos (Re i ado de Chemical ec o s o gene deli e y: up ake and in acellula a icking. 2010:640-645). De odos os e o es não- i ais e e idos a é ago a, os baseados em lípidos ca iónicos são os mais es udados e u ilizados46,21, is o ap esen a em um g ande leque de an agens aquando do anspo e e en ega de ma e ial gené ico. A es u u a dos lípidos ca iónicos comp eende ês componen es: a cabeça hid o ílica, ânco a hid o óbica e o espaçado 52, que liga es as duas pa es. Tendo em con a que a pa e hid o ílica dos lípidos é cons i uída po g upos amina, a sua ca ga é posi i a, o que é c ucial pa a as in e ações ele os á icas com o ma e ial gené ico (ca egado nega i amen e) que es ão na base da o mação dos lipoplexos. A endendo ao núme o de ca gas da cabeça hid o ílica, os lípidos ca iónicos podem se classi icados como mono alen es ou mul i alen es, sendo es es úl imos os usados com mais sucesso21. As p op iedades dos espaçado es são bas an e impo an es na escolha de lípidos ca iónicos como sis emas de anspo e de ma e ial gené ico, já que, pa a além de se em esponsá eis pela “pon e” en e a cabeça hid o ílica e o domínio hid o óbico, 15 de e minam ambém a oxicidade, a biodeg adabilidade e a e iciência na ans eção ap esen adas po es as es u u as53,54. Conside am-se os lipossomas ca iónicos bas an e p omisso es pa a aplicação em écnicas de e apia génica de ido a algumas pa icula idades que possuem, como o ac o de ap esen a em baixa oxicidade e imunogenicidade, em elação aos e o es i ais, e possuí em bas an e e sa ilidade55 ambém em elação aos mesmos. Pa a além dis o, são acilmen e p epa ados e ap esen am g ande capacidade de anspo e e en ega de g andes quan idades de ma e ial gené ico46. A conjugação de ligandos aos lipossomas aumen a a especi icidade des es sis emas de anspo e de ma e ial gené ico56, con o me ilus ado na Figu a 6. Figu a 6- Ilus ação esquemá ica da conjugação de lipossomas e ligandos (Re i ado de Cu en p og ess in gene deli e y echnology based on chemical me hods and nano-ca ie s. The anos ics. 2014;4(3):240-255). Apesa de desempenha em um papel impo an e na ci o oxicidade ap esen ada po es e ipo de sis emas, a p esença de ca gas posi i as é essencial pa a a ligação dos lipoplexos à supe ície das células que se isa ans e a , po ia de in e ações ele os á icas21. A ualmen e, ac edi a-se que a maio pa e dos lipoplexos são in e nalizados po endoci ose57,58, e i icando-se, no en an o, que uma das maio es ba ei as à en ega de ma e ial gené ico associada aos lipoplexos é a ine icien e dissociação en e o ma e ial gené ico e o componen e lipídico aquando da chegada ao in óluc o nuclea 21. Apesa de ap esen a em an agens em elação aos e o es i ais, u ge melho a p op iedades como a e iciência de ans eção e a ci o oxicidade des es nanossis emas46. A oxicidade ap esen ada po es es sis emas de anspo e ad ém an o da p esença de ca gas posi i as capazes de in e agi inespeci icamen e com 16 componen es celula es, como da na u eza do espaçado 46,59. No en an o, es as des an agens conseguem se colma adas, ha endo duas o mas de o ealiza : modi icando a componen e hid o ílica do lípido ou al e ando o g upo do espaçado . No úl imo caso pode-se, po exemplo, u iliza espaçado es compos os po és e es ou amidas, o que con e e maio biodeg adabilidade aos lipossomas, diminuindo a sua oxicidade46. Em suma, a u ilização de lipossomas ca iónicos eúne bas an e acei ação po pa e da comunidade cien í ica de ido às an agens ci adas an e io men e, o que não in alida a necessidade de con inua a p ocu a po ou os ipos de sis emas de anspo e e en ega de ma e ial gené ico. Nes e sen ido, su gem os políme os como e o es não- i ais, classe essa que possui um eno me po encial. Tendo em con a que o ema cen al des a disse ação é a u ilização des e ipo de es u u as, se á dedicado um subcapí ulo da in odução pa a uma discussão mais po meno izada das mesmas. 1.3 Nanopa ículas Polimé icas A u ilização de políme os ca iónicos como nanossis emas pa a en ega de ma e ial gené ico é uma das es a égias que em indo a ganha alguma p eponde ância, o que é explicado, en e ou as ca ac e ís icas, pela e sa ilidade des as es u u as. A a és de modi icações da sua es u u a, é possí el al e a em-se algumas das p op iedades dos políme os60, in luenciando assim a sua oxicidade e/ou a i idade biológica21. Pa a além dis o, os políme os ca iónicos assumem-se como e o es segu os, biodeg adá eis e pouco óxicos, quando compa ados com a o alidade dos e o es i ais u ilizados a é aos dias de hoje46. Pa a além dis o, ac escen am a capacidade de anspo a uma maio quan idade de ma e ial gené ico61. Po no ma, os políme os ca iónicos possuem uma ele ada densidade de ca gas posi i as (p o enien e dos g upos amina), o que p omo e a oco ência de in e ações ele os á icas com as ca gas nega i as dos ácidos nucleicos, le ando à o mação de pa ículas com amanhos à ol a dos 100 nm21,47,60, designadas de poliplexos (Figu a 7). Es es êm a capacidade de p o ege o ma e ial gené ico con a a ação das nucleases p esen es no meio; de es abelece in e ações ele os á icas com a 17 memb ana celula , acili ando o seu up ake que oco e a a és de endoci ose; e, po úl imo, de p omo e o escape endolisossomal21. Figu a 7- Políme o ca egado posi i amen e e DNA ca egado nega i amen e o mam es u u as denominadas de poliplexos. (Re i ado de Design and de elopmen o polyme s o gene deli e y. Na Re D ug Disco . 2005;4(7):581-593). Ainda assim, exis em algumas des an agens quan o ao uso de políme os ca iónicos, já que es es induzem alguma ci o oxicidade que se julga se p o enien e da densidade de ca gas posi i as e do peso molecula 62,63,64. Pa a além das ca ac e ís icas ine en es ao uso de políme os ca iónicos, exis em ainda ou os ipos de obs áculos que comp ome em a e iciência da ans eção e o a ge ing das nanopa ículas in i o, já que o ma e ial gené ico a a essa uma sé ie de ba ei as a é chega , em p imei o luga , às células-al o e, depois, ao núcleo das mesmas (no caso de pDNA). As nanopa ículas polimé icas podem se adminis adas localmen e, como acon ece com o caso de injeções in a umo ais, po ia sis émica ou po ia o al. O sis ema imuni á io, em pa icula , o sis ema e iculoendo elial, cons i uído po mac ó agos e monóci os, é esponsá el pela iden i icação e des uição de compos os es anhos ao nosso co po, pa icipando na eliminação de nanopa ículas polimé icas em 18 ci culação65. Essa eliminação oco e a a és de agoci ose, sendo es a induzida pela associação en e as p o eínas opsoninas e, nes e caso, as nanopa ículas polimé icas65. Exis e ainda a possibilidade das nanopa ículas polimé icas in e agi em não- especi icamen e com as p o eínas do so o, já que es as são ca egadas nega i amen e, o mando ag egados que se ão exc e ados pelo sis ema e iculoendo elial66. Pa a além do e e ido an e io men e, as nanopa ícuas de e ão ap esen a um diâme o supe io a 10 nm, de o ma a não se em il adas pelo sis ema enal67. Pa a os casos de adminis ação o al das nanopa ículas, a chegada des as ao seu local de ação ainda é mais complexa, já que, an es de en a em na ci culação êm de supe a as condições ad e sas encon adas no a o gas oin es inal. Após inges ão, as o mulações depa am-se de imedia o com um pH baixo no es ômago, pa a além da ação de odas as enzimas diges i as que podem deg ada os agen es e apêu icos não p o egidos. Na chegada ao in es ino, apesa da subida do pH, pe manece a ação de di e sas enzimas diges i as. O anspo e a a és das células epi eliais do in es ino é um p ocesso complexo, que en ol e di e en es ba ei as ísicas e químicas, como o caso das igh junc ions e da p esença de uma ede glicop o eica a encapsula as células do epi élio in es inal65. A a i idade biológica de políme os pode se modulada, o que le ou a que, nos anos mais ecen es, enham su gido á ios es udos com es e ipo de nanossis emas pa a anspo e e en ega de ma e ial gené ico. Essa modulação pode se conseguida a a és de duas es a égias p incipais: a associação de ligandos, aumen ando a especi icidade das o mulações pa a de e minadas células-al o; e a conjugação com moléculas, como o polie ilenoglicol (PEG), que modi icam o compo amen o das nanopa ículas in i o e in i o. Exis em inúme os políme os u ilizados pa a ins de e apia génica, no en an o, os mais es udados são a polie ilenimina (PEI), a poli (L-lisina), os polime ac ila os (como o PDMAEMA), o qui osano e os poli (β-amino és e es), cujas es u u as es ão ilus adas na Figu a 8. 19 Figu a 8- Es u u as químicas dos políme os ca iónicos mais u ilizados em e apia génica (Adap ado de Non- i al ec o s o gene-based he apy. Na Publ G . 2014;15(8):541-555). A polie ilenimina (PEI) é o políme o ca iónico mais u ilizado an o in i o como in i o pa a anspo e de ma e ial gené ico68. A polie ilenimina pode e uma es u u a linea ou ami icada. A PEI al amen e ami icada o ma complexos políme o/DNA mais pequenos69,70,71. Políme os des e ipo p o egem de o ma mui o compe en e o ma e ial gené ico, e i ando a sua deg adação enzimá ica. Pa a além des a p op iedade, a e icácia na ans eção e a ci o oxicidade ap esen ada pelos poliplexos compos os po polie ileniminas é in luenciada po ca ac e ís icas como o peso molecula , o g au de ami icação, o po encial ze a e o amanho das nanopa ículas72, 73. Com um aumen o do peso molecula , a e icácia da ans eção da PEI aumen a, no en an o, é po enciada a ci o oxicidade dos complexos74, o que se de e a um aumen o da in e ação en e as ca gas posi i as dos poliplexos e a memb ana plasmá ica, p omo endo a des abilização des a úl ima. Exis em duas eo ias explica i as pa a o ac o dos poliplexos de base PEI se em dos e o es não- i ais mais e icien es, le ando a é à denominação de gold s anda d no que a e o es polimé icos diz espei o. Em p imei o luga , o e ei o “esponja de p o ões”75, sendo c ucial pa a a uga da ia endolisossomal, que se á explicado de alhadamen e na subsecção 1.3.3 Escape endolisossomal e anspo e ci oplasmá ico des a in odução. Ou a eo ia epo a e idências de uma ba ei a ísica p omo ida pela es u u a ami icada e amanho do políme o, impedindo a deg adação enzimá ica do ma e ial gené ico74. As polilisinas (PLL) são polipep ídeos com o aminoácido lisina a cons i ui a unidade de epe ição, con o me suge e o nome. A polilisina é um políme o biodeg adá el, o que se conside a uma g ande an agem pa a aplicações in i o76. Pa a além disso, es a classe de políme os pe mi e modi icações con olá eis a ní el do seu 20 amanho molecula , o ma e a possibilidade de se modi icada quimicamen e77. Con udo, os poliplexos p epa ados com es e políme o ap esen am uma aca e iciência na ans eção, o que se de e a um baixo escape da ia endolisossomal78. Pa a além da baixa e iciência na ans eção, a polilisina ap esen a ní eis conside á eis de imunogenicidade e oxicidade, de ido à cons i uição da cadeia p incipal com aminoácidos79. Den o da classe de políme os conhecida como polime ac ila os, des aca-se o poli (me ac ila o de e ilo-2-dime ilamino) (PDMAEMA), que o e ece esul ados bas an e p omisso es no âmbi o do anspo e e en ega de ma e ial gené ico. O PDMAEMA é um políme o duo- esponsi o ( empe a u a e pH)80 que em sido es udado de o ma bas an e in ensi a. De odos os a o es es udados, chegou-se à conclusão que o peso molecula desempenha um papel a i o na a i idade biológica des a o mulação, já que PDMAEMAs de maio es pesos molecula es le am à o mação de nanopa ículas mais pequenas que, apesa de se em mais ci o óxicas que as ge adas po PDMAEMAs de pesos molecula es mais baixos81, p omo em ní eis mais al os de exp essão do gene epó e . Es e políme o é cons i uído po aminas de es u u a e ciá ia e a inge ní eis de e iciência de ans eção mui o p óximos dos exibidos pelo gold s anda d PEI, ainda assim, ap esen a algumas des an agens, como a sua ci o oxicidade81. O qui osano é um políme o na u al que de i a da desace ilação alcalina da qui ina, sendo um dos e o es não- i ais mais u ilizados de ido à sua baixa oxicidade, biocompa ibilidade e biodeg adabilidade82. Exis em alguns a o es de e minan es na e iciência de ans eção conduzida pelo qui osano, des acando-se en e eles o g au de desace ilação e o peso molecula , bem como algumas condições a que o p ocesso oco e, como o pH83. Ainda assim, exis em esul ados con adi ó ios no que oca ao peso molecula ideal pa a se a ingi uma boa a i idade biológica com es e políme o. A sua e iciência de ans eção es á bas an e abaixo do ideal, o que le ou à p ocu a de ou as o mulações de i adas do qui osano, como o qui osano ca boxime ilado84 e os copolíme os de a ginina-qui osano85 ou o PEG- ime il qui osano86, sendo es es apenas alguns exemplos. Os poli (β- amino és e es) (PβAEs) são políme os sin é icos que se des acam pela sua biodeg adabilidade e biocompa ibilidade87. A sín ese des a classe de políme os é bas an e simples, esidindo numa eação de adição de Michael en e uma amina 21 p imá ia ou bis (amina secundá ia) e um diac ila o88. Exis e uma g ande di e sidade de aminas e diac ila os, o que o na possí el a c iação de biblio ecas de políme os, de modo a que se possam ajus a as suas ca ac e ís icas ísico-químicas, como a densidade de ca ga, solubilidade na água, c is alinidade e pe il de deg adação, con o me a aplicação desejada89. Uma das ca ac e ís icas mais apela i as dos PβAEs é o ac o de se em deg adados em condições isiológicas po hid ólise das ligações és e p esen es na cadeia p incipal do políme o, dando o igem a pa ículas biologicamen e ine es (β- aminoácidos)87,90,91, o que con e e uma baixa oxicidade às o mulações, sendo que, no en an o, essa oxicidade aumen a com o núme o de ca bonos p esen es nas cadeias p incipais e la e ais do políme o92. Exis em di e sos a o es que in luenciam a ação dos PβAEs, des acando-se o papel que as e minações desempenham an o na ci o oxicidade exibida como na e icácia de ans eção des es políme os, podendo as mesmas se cons i uídas po g upos amina ou ac ila o, en e ou os88. O abalho desen ol ido nes e p oje o assen a na u ilização do políme o poli (2-aminoe il me ac ila o), cuja es u u a se encon a ilus ada na Figu a 9, bem como da sua conjugação com o políme o hid o ílico PEG. O poli (2-aminoe il me ac ila o) esul a de uma polime ização do monóme o me ac ílico 2-aminoe il me ac ila o, possuindo es e aminas p imá ias na sua cons i uição93. Apesa de não aze em pa e do lo e de políme os mais u ilizados em écnicas de e apia génica, os políme os baseados em aminas p imá ias o am já emp egues no anspo e de ma e ial gené ico75,94, já que es es pe mi em a condensação e icien e de compos os ca egados nega i amen e, como o pDNA95, ajus am a capacidade de ampão do políme o e melho am a es abilidade dos complexos96. O amanho das cadeias polimé icas in luencia o compo amen o des es políme os quando aplicados como e o es de ma e ial gené ico, epo ando-se um aumen o da e iciência de ans eção in i o e in i o com o aumen o das cadeias polimé icas, já que as nanopa ículas o madas são mais pequenas e es á eis ace a des abilizações ele os á icas, jun ando o ac o de ha e um aumen o do up ake celula e nuclea de pDNA95. Po ou o lado, cadeias polimé icas mais pequenas mos a am a o ece a libe ação de ma e ial gené ico a ní el in acelula e in anuclea 95. 28 1.4 Obje i os O po encial do uso de écnicas de e apia génica pa a p e eni , a a ou cu a di e sas doenças é inegá el. No en an o, exis em di e sos iscos associados, já que aquando da ealização des e ipo de p ocedimen os se manipula a gené ica do p óp io se humano. Po ou o lado, a sua aplicação en ol e sis emas de anspo e e en ega de ma e ial gené ico. Nes e con ex o, su giu a possibilidade de u iliza políme os como nanossis emas anspo ado es de ma e ial gené ico. Es es nanossis emas ap esen am algumas an agens quando compa ados com nanossis emas i ais, como a sua e sa ilidade, a sua baixa imunogenicidade e a capacidade de anspo a em sequências de amanhos maio es. Ainda assim, exis em aspe os a co igi , de o ma a o imiza a unção dos nanossis emas polimé icos, sendo o pa âme o p incipal a e icácia da ans eção, que es á dis an e da ap esen ada pelos e o es i ais. Assim sendo, es e abalho isa es a as al e ações que a peguilação do políme o poli (me ac ila o de 2-aminoe il), bem como o seu peso molecula e azão de ca ga dos poliplexos em si baseados, induzem a ní el da sua a i idade de ans eção e ci o oxicidade. P e ende-se ambém comp eende as al e ações a ní el ísico-químico que a copolime ização com PEG p omo e, podendo es as ajuda a explica o compo amen o dos nanossis emas es udados. De o ma a ealiza um es udo mais de alhado das o mulações, as mesmas o am es adas em duas linhas celula es, de o ma a comp eende se a peguilação dos políme os é e icaz em mais do que um ipo de células-al o e se as al e ações nos pe is de a i idade biológica e ci o oxicidade induzidas pelos di e en es amanhos e azões de ca ga dos poliplexos se man êm em mais do que uma linha celula . 29 30 2 Ma e iais e Mé odos 2.1 Ma e iais Os di e en es políme os u ilizados nes e abalho o am sin e izados a és da écnica de polime ização adicala po ans e ência a ómica (ATRP) pelo g upo de sín ese e ca ac e ização de políme os no depa amen o de Engenha ia Química. Chegou-se ao peso molecula médio (Mn) dos políme os (com exceção do copolíme o PAMA26900) a a és da écnica de espe oscopia de essonância magné ica nuclea . Es a é uma écnica bidimensional de essonância magné ica nuclea que o nece in o mação ace ca das o ien ações ela i as e dis âncias in e nuclea es de moléculas izinhas em sólidos poli-c is alinos e não-c is alinos138, azendo pa e do lo e de écnicas mais u ilizadas em in es igação elacionada com políme os, já que pe mi e simpli ica o compo amen o que es e ipo de moléculas assume. 2.2 Mé odos 2.2.1 Cul u a de células Os ensaios ealizados ao longo des e p oje o o am conduzidos em nas linhas celula es COS-7 e HepG2. A linha COS-7 de i a de ecido enal do Macaco Ve de A icano, Ce copi hecus ae hiops. Es as células ap esen am um c escimen o bas an e semelhan e ao dos ib oblas os e são equen emen e indicadas pa a a aliação de no os e o es não i ais. A linha celula HepG2 de i a de ecido hepá ico de um adolescen e de 15 anos com hepa oca cinoma. Ambas as linhas celula es o am man idas em cul u a a 37 ºC num ambien e com uma sa u ação de CO2 de 5% em meio de cul u a Dulbecco’s modi ied Eagle’s médium-high glucose (DMEM-HG) (Sigma-Ald ich, MO, USA), suplemen ado com 10 % ( / ) de so o e al bo ino ina i ado po calo (FBS, Sigma-Ald ich, MO, USA), penicilina (100 U.mL-1) e es ep omicina (100 μg.mL-1). As células o am passadas duas ezes po semana quando a ingiam uma con luência de ce ca de 80 %, de modo a man e em-se 31 na ase exponencial de c escimen o. Es e p ocedimen o inicia-se com a emoção do meio de cul u a, p ocedendo-se imedia amen e a uma la agem com PBS. Após emoção do PBS, as células o am incubadas com 3 mL de ipsina a 0,05 % (Sigma, S . Louis, MO) a é se obse a o seu des acamen o, sendo imedia amen e adicionados 7 mL de meio de cul u a pa a ina i a a ação da ipsina. As células o am passadas pa a ascos no os com diluições de 1:10 e de 1:4 pa a as células COS 7 e HepG 2, espe i amen e. 2.2.2 P epa ação dos poliplexos As soluções polimé icas o am p epa adas em água Milli-Q a pH 3 e a uma concen ação de 3 mg/ ml. Os poliplexos o am ob idos a a és da mis u a des as soluções polimé icas com uma solução de plasmídeo de ADN (pDNA), de modo a se ob e 1 µg de pCMV.Luc em 50 µL de poliplexos. Fo am es ados á ios ácios de ca ga políme o/ADN (N/P, +/-). Os poliplexos o am incubados du an e 15 minu os à empe a u a ambien e e usados imedia amen e a segui . 2.2.3 Capacidade de T ans eção – Ensaio de Luminescência De o ma a a alia a capacidade de ans eção dos (co)políme os, es es o am complexados com um pADN que con ém o gene que codi ica a luci e ase (pCMV.Luc). Na p esença de ATP, a luci e ase con e e a luci e ina em oxiluci e ina, ha endo uma consequen e libe ação de luz, con o me ilus ado na Figu a 12. A a és da a aliação da luz libe ada, é possí el es abelece -se uma elação en e es e pa âme o e a quan idade de luci e ase p esen e na amos a, in e indo-se, des a o ma, a capacidade de ans eção dos di e en es políme os. 𝐿𝑢𝑐𝑖𝑓𝑒𝑟𝑖𝑛𝑎 + 𝑂2 + 𝐴𝑇𝑃 𝐿𝑢𝑐𝑖𝑓𝑒𝑟𝑎𝑠𝑒 → 𝑂𝑥𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑓𝑒𝑟𝑖𝑛𝑎 + 𝐶𝑂2 + 𝐴𝑀𝑃 + 𝑃𝑃 + 𝐿𝑢𝑧 Figu a 12- Equação ep esen a i a do p ocesso de bioluminescência. Pa a es es ensaios de ans eção, as células o am plaqueadas quando a ingiam uma con luência en e os 70 e 80 % ( ase ó ima de c escimen o). 24 ho as an es 32 dos ensaios o am plaqueadas 3,5 x 104 e 8,0 x 104 células po poço de células COS 7 e HepG 2, espe i amen e. Após as 24 ho as, as células ap esen a am uma con luência en e 50 e 70%. P epa a am-se os poliplexos con o me desc i o na subsecção 2.2.2. P epa ação dos poliplexos e emo eu-se o meio de cul u a, subs i uindo-o po 300 µL de meio de cul u a comple o po poço da placa. Pos e io men e, adiciona am-se 50 µL de poliplexos a cada poço (de aco do com as di e en es azões de ca ga N/P), de o ma a ga an i que cada condição con inha 1 µg de pCMV-Luc. Finalizado es e p ocedimen o, incuba am-se as células du an e 4 ho as a 37 ˚C numa a mos e a com uma sa u ação de CO2 de 5 %. Após a incubação emo eu-se o meio de cul u a e ans e iu-se 1 mL de meio DMEM-HG comple o pa a cada poço da placa, incubando-se as células du an e 48 ho as de aco do com as condições desc i as an e io men e. Após as 48 ho as de incubação p ocedeu-se à a aliação da ci o oxicidade (p ocedimen o expe imen al desc i o na subsecção 2.2.4. Ensaio de Viabilidade Celula ) e à lei u a da bioluminescência das o mulações. Pa a se p ocede à lei u a da bioluminescência, as células o am la adas duas ezes com PBS e in oduzi am-se 150 µL de ampão de lise [1 mM di io ei ol; 1 mM EDTA; 25 mM is- os a o (a pH 7,8); 8 mM MgCl2; 15 % ( / ) glice ol; 1 % ( / ) T i on X-100] em cada poço, de o ma a lisa as células colocando-se seguidamen e as placas a -80 ˚C du an e, pelo menos, 15 minu os. De seguida, ans e iu-se cada condição pa a eppendo s de idamen e e ique ados e p ocedeu-se a uma cen i ugação a 10.000 pm e a 4 ˚C du an e 5 minu os. Man i e am- se os eppendo s em gelo enquan o se ans e iam 50 µL de cada condição pa a uma placa de 96 poços b anca. A medição da p odução de luz mediada pela luci e ase oi ealizada no luminóme o Lmax II 384 (Molecula De ices, USA). A lei u a oi ealizada a 37 ˚C logo após a injeção de 100 µL de solução de luci e ina a 167 µM (Sigma-Ald ich, USA) seguida de 100 µL de uma solução de ampão de lei u a (1 mM DTT; 1 mM EDTA; 25 mM is- os a o (a pH 7,8); 8 mM MgCl2; 15 % ( / ) glice ol] con endo 2 mM de ATP a 2 mM. A quan i icação da quan idade de p o eína p esen e em cada condição oi ealizada a a és do ki DC P o ein Assay (Bio ad, CA, USA), u ilizando a albumina de so o bo ino (BSA) (Sigma-Ald ich, USA) como pad ão e segundo o p o ocolo 33 ecomendado pelo ab ican e. Os esul ados o am exp essos em unidades ela i as de luz emi ida po milig ama de p o eína o al ((RLU)/mg de p o eína o al). 2.2.4 Ensaio de Viabilidade Celula A ci o oxicidade das o mulações oi a aliada a a és do ensaio de Alama Blue modi icado. Es e é um ensaio colo imé ico que a alia o me abolismo celula , no qual se u iliza esazu ina (co an e de onalidade azul escu a) que, quando eduzido a eso u ina, adqui e uma onalidade co de osa. Assim, as células me abolicamen e a i as (e consequen emen e iá eis) êm po encial edu o , eduzindo a esazu ina a eso u ina, o que a á com que o meio adqui a uma onalidade co de osa al amen e luo escen e. Es abelece-se, depois, uma co elação en e a abso ância do meio e a iabilidade celula . O p ocedimen o consis e na emoção do meio de cul u a, subs i uindo-se po 300 µL po poço de uma solução de meio com 1% ( / ) de esazu ina (Sigma-Ald ich, MO, USA) Os con olos posi i os (C+) e nega i os (C-) consis em em poços com células não a adas e poços sem células, espe i amen e. Incubam-se as células a 37 ˚C numa a mos e a com uma sa u ação de 5 % de CO2 du an e ce ca de 1 ho a, a é se assis i a uma colo ação osa nos poços ela i os ao con olo posi i o (células não a adas). Após esse pe íodo são ans e i am-se 180 µL de cada condição pa a uma placa anspa en e de 96 poços e mediu-se a abso ância do meio a 570 e 600 nm num espe o o óme o SPECTRA-max PLUS 384 (Molecula De ices, USA). A iabilidade celula oi calculada com ecu so ao seguin e modelo ma emá ico: 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (%)= (𝐴570 − 𝐴600)− (𝐶570 −− 𝐶600 −) (𝐶570 +− 𝐶600 +)− (𝐶570 −− 𝐶600 −)×100 2.2.5 Ca ac e ização Físico-Química das o mulações As o mulações o am ca ac e izadas ísico quimicamen e a aliando-se ês pa âme os: a ca ga supe icial, o amanho das pa ículas e a capacidade de p o eção/condensação do DNA pelos políme os. Es es ensaios o am ealizados pa a 34 complemen a a in o mação ecolhida nos ensaios de iabilidade celula e da a i idade biológica. 2.2.5.1 Análise da di usão dinâmica da luz e Po encial Ze a De o ma a de e mina o diâme o hid odinâmico das nanopa ículas, eco eu-se à écnica de di usão dinâmica da luz (DLS), que, al como o nome indica, se baseia na dispe são da luz pelas nanopa ículas em suspensão. A análise do diâme o hid odinâmico das nanopa ículas é ei a a a és de uma dis ibuição de amanhos que é baseada no núme o de pa ículas cons i uin es de cada população p esen e na solução, no olume das mesmas ou na in ensidade da luz dispe sa po es as. No p esen e abalho a dis ibuição de amanhos oi ei a com base na in ensidade da luz dispe sa pelas nanopa ículas em suspensão. O cálculo do amanho das o mulações e do PdI (índice de polidispe são) é ei o com o es abelecimen o de uma unção de au oco elação que mede as di e enças na in ensidade de luz dispe sa empo almen e. A co elação é calculada a é a semelhança se igual a 0, es abelecendo-se uma unção do ipo exponencial. Essa unção con ém o coe icien e de co elação que é necessá io pa a o cálculo do diâme o hid odinâmico a a és da equação de S okes-Eins ein. Pa a o e ei o, p epa a am-se os poliplexos con o me desc i o na subsecção 2.2.2. P epa ação dos poliplexos, adicionou-se 1 mL de água des ilada e p ocedeu-se à lei u a no equipamen o Ze asize Nano-ZS (Mal e n Ins umen s, UK) a 25 ˚C e com um ângulo de dispe são opos o de 173˚. Realiza am-se dois ensaios independen es e as lei u as o am ei as em iplicado. A análise do po encial ze a pe mi e sabe a ca ga supe icial das nanopa ículas em solução, u ilizando-se, pa a o e ei o, uma célula com dois elé odos. Aplica-se um campo elé ico às pa ículas e mede-se a mudança de ase na luz dispe sa pelas nanopa ículas em mo imen o de ido ao campo elé ico aplicado, enómeno conhecido como ele o o ese. A mudança de ase é p opo cional à mobilidade ele o o é ica das pa ículas, pa âme o a pa i do qual se calcula o po encial ze a. As medições do po encial ze a o am ealizadas sequencialmen e às do amanho, u ilizando-se pa a o e ei o o mesmo equipamen o Ze asize Nano-ZS (Mal e n 35 Ins umen s, UK) acoplado a um lase de ele o o ese dopple u ilizando o modelo de Smolucho ski. Os esul ados ob idos pa a o amanho e pa a o po encial ze a o am analisados com ecu so ao so wa e Ze asize 7.02. 2.2.5.2 Ensaio de in e calação do B ome o de E ídio O ensaio de in e calação com a sonda b ome o de e ídio (E B ) isa a alia a capacidade de p o eção/condensação do DNA dos poliplexos. Pa a al, a alia-se o acesso que a sonda em ao ma e ial gené ico, es abelecendo-se um alo pe cen ual pa a o mesmo. O b ome o de e ídio é um agen e in e calan e do DNA, que p oduz um ele ado aumen o de luo escência quando ligado a ácidos nucleicos, pe mi indo a quan i icação de luo escência in e i sob e a capacidade de condensação do ma e ial gené ico con e ida pelo poliplexo em es udo. Pa a o ensaio, p epa a am-se os poliplexos de aco do com a subsecção 2.2.2. P epa ação dos poliplexos e, após os 15 minu os de incubação, ans e i am-se 50 µL de cada condição pa a uma placa p e a de 96 poços (Cos a , CA, USA). Pipe a am-se 50 µL de E B em cada condição, de modo a a ingi uma concen ação inal de 400 nM. As condições con olo o am água Milli-Q ( luo escência esidual) e 1 µg de DNA ( luo escência máxima emi ida). Incuba am-se as amos as du an e 10 minu os, pe íodo após o qual se p ocedeu à lei u a da luo escência num luo íme o Spec aMax Gemini EM (Molecula De ices, USA) com comp imen os de onda de exci ação e emissão de 518 nm e 605 nm, espe i amen e. Pa a se calcula o acesso da sonda ao ma e ial gené ico sub aiu-se a luo escência esidual a cada alo ob ido pa a as amos as e exp imiu-se o esul ado como pe cen agem do con olo posi i o. 36 2.2.5.3 Ensaio de ele o o ese em gel de aga ose O ensaio de ele o o ese em gel de aga ose isa complemen a a in o mação ecolhida no ensaio de in e calação do E B ace ca da capacidade de condensação/p o eção dos políme os em es udo. Pa a o e ei o, p epa a am-se os poliplexos con o me desc i o na subsecção 2.2.2. P epa ação dos poliplexos, sendo que após os 15 minu os de incubação se adiciona am 20 µL de cada amos a a 5 µL de loading bu e [15% ( / ) Ficoll 400; 0,05% (m/ ) azul de b omo enol; 1% (m/ ) SDS; 0,1 M EDTA (a pH 7,8)]. Pos e io men e, ans e i am-se 20 µL de cada uma das condições (já em solução com o loading bu e ) pa a o gel de aga ose a 1% p e iamen e p epa ado em solução de TBE [89 mM de T is- base (a pH 8,6); 89 mM de ácido bó ico; 2,5 mM de EDTA] e com uma concen ação de 1 µg de E B po mL de gel. Após a in odução das amos as nos poços o gel oi colocado a uma di e ença de po encial de 80 mV du an e 45 minu os. Mediu-se depois a in ensidade da luo escência das bandas ela i as a cada condição expe imen al no sis ema GelDoc (Bio-Rad, USA), u ilizando o so wa e Quan i yOne. 37 3 Resul ados e Discussão Com es e abalho, p e endeu-se desen ol e um nanossis ema de base polimé ica, pa a anspo e e en ega de ma e ial gené ico, que aliasse uma boa capacidade de ans eção a uma eduzida ci o oxicidade, de modo a cons i ui um e o não i al adequado pa a po encial aplicação em e apia génica. Como al, es a am-se di e sas o mulações polimé icas p epa adas com á ios políme os poli (me ac ila o de 2-aminoe il) (PAMA) e copolíme os polie ilenoglicol-poli (me ac ila o de 2-aminoe il) (PEG-β-PAMA), de es u u as químicas ilus adas na Figu a 13. Os políme os o am sin e izados de aco do com o desc i o na subsecção 2.1 Ma e iais da secção 2 Ma e iais e Mé odos. Figu a 13- Es u u as químicas do homopolíme o PAMA (à esque da) e do copolíme o em bloco PEG- b-PAMA (à di ei a). As di e sas o mulações de nanossis emas o am p imei amen e a aliadas na linha celula COS 7, de e minando-se a a i idade de ans eção e espe i a ci o oxicidade de aco do com os di e en es pesos molecula es dos políme os, e as di e en es azões de ca ga dos poliplexos. Visou-se ambém a alia as di e enças en e os políme os ca iónicos e os copolíme os, de o ma a de e mina o e ei o da inco po ação do PEG nos políme os ca iónicos e a seleciona as o mulações com os melho es compo amen os in i o. Após seleção, es a am-se as melho es o mulações na linha celula HepG2 – células humanas de ca cinoma hepa ocelula . Es uda am-se ambém as p op iedades ísico-químicas das o mulações que se des aca am, de modo a en a pe cebe o po encial compo amen o das mesmas em aplicações in i o. 44 No caso de não ha e uma dissociação p ecoce dos poliplexos, pa a um peso molecula mais baixo, a sua ca ga supe icial pode não se su icien emen e posi i a, in luenciando nega i amen e o up ake das nanopa ículas, se indo es e a gumen o pa a os poliplexos esul an es do homopolíme o PAMA6300. No caso das nanopa ículas p epa adas a pa i dos homopolíme os PAMA17600 e PAMA26400, des aca am-se as o mulações p epa adas nas azões de ca ga (+/-) 50/1 e 25/1 pa a os políme os PAMA17600 e PAMA26400, espe i amen e. Face à ausência de so o, a capacidade de ans eção dos poliplexos o mados a pa i do homopolíme o PAMA17600 so eu al e ações, p incipalmen e no que oca ao e ei o da azão de ca ga, e i icando-se ambém um aumen o dos ní eis mais al os de exp essão do ansgene. No caso das nanopa ículas p epa adas a pa i do homopolíme o PAMA26400, a p esença de so o ambém ouxe uma in luência posi i a, já que se a ingi am alo es supe io es de a i idade biológica, com exceção dos poliplexos p epa ados na azão de ca ga (+/-) 10/1. Apesa das al e ações obse adas na p esença de so o, os ní eis máximos de exp essão do ansgene ob idos com os poliplexos p epa ados a pa i dos homopolíme os PAMA17600 e PAMA26400 são semelhan es. No caso do PAMA17600, obse a-se um aumen o da capacidade de ans eção na p esença de so o com a azão de ca ga. O a, com o aumen o da azão de ca ga, as in e ações ele os á icas es abelecidas o nam-se mais o es de ido a uma maio quan idade de políme o ca iónico p esen e, es ando es e a o implicado na diminuição da capacidade de ans eção dos poliplexos o mados na azão de ca ga (+/-) 10/1 ela i amen e aos o mados em azões de ca ga (+/-) supe io es, já que, com uma condensação menos e icien e do ma e ial gené ico, é pe mi ido às p o eínas do so o (ca egadas nega i amen e) deses abiliza os poliplexos e in luencia nega i amen e os ní eis de exp essão do ansgene, con o me alguma li e a u a suge e21. No en an o, e con o me já oi e e ido, epo ou-se um aumen o dos ní eis de exp essão do ansgene com a azão de ca ga na p esença de so o, sendo es a endência in e sa ao ob ido na ausência de so o. Es e ac o, apon a pa a uma possí el con ibuição posi i a das p o eínas cons i uin es do so o nos poliplexos p epa ados a pa i do políme o PAMA17600 nas azões de ca ga (N/P) 25/1 e 50/1. O a, com o aumen o da azão de ca ga, aumen a-se consequen emen e a quan idade de políme o ca iónico p esen e, o que ai pe mi i o es abelecimen o de in e ações ele os á icas com as p o eínas do so o 45 ca egadas nega i amen e, o que pode aumen a a capacidade de ans eção dos poliplexos p epa ados a pa i do políme o PAMA17600 nas azões de ca ga (N/P) 25/1 e 50/1. A ca ga supe icial dos poliplexos p epa ados na azão de ca ga 10/1 é mais baixa do que pa a os de i ados nas azões de ca ga de 25/1 e 50/1, o que pode es a na o igem da diminuição da capacidade de ans eção aquando da u ilização das o mulações elabo adas nes as ca ac e ís icas ( azão de ca ga 10/1), po ia de não se es abelece em su icien es in e ações ele os á icas en e a supe ície dos poliplexos e a memb ana celula , in luenciando nega i amen e a sua in e nalização. Ainda assim, exis em ou as possí eis azões pa a o aumen o da capacidade de ans eção des as nanopa ículas com a azão de ca ga que alem a pena analisa . Veja-se, com o aumen o das ca gas posi i as, é p omo ido um aumen o do políme o ca iónico, exis indo e idências de que cadeias polimé icas li es aumen am a en ega de genes a ní el in acelula , já que es as po enciam o e ei o de esponja de p o ões141 le ando, po conseguin e, à libe ação do ma e ial gené ico, sendo, no en an o, es e a gumen o desca ado po ia dos esul ados ob idos na ausência de so o, onde um aumen o de cadeias polimé icas li es não conduziu a um aumen o dos ní eis de exp essão do ansgene, an es pelo con á io, o que indica que, mui o p o a elmen e, o a o p imo dial pa a o aumen o da a i idade biológica das o mulações com a azão de ca ga, é a p esença de so o e consequen e in e ação dos poliplexos com as p o eínas que o cons i uem, já que o excesso de cadeias li es de políme o ca iónico le a a uma in e ação com as p o eínas do so o ca egadas nega i amen e. As nanopa ículas p epa adas a pa i do homopolíme o PAMA26400 ap esen am um pe il de a i idade biológica den o do espe ado, já que es e pa âme o a inge o seu máximo nas o mulações de azão de ca ga 25/1. O a, sendo es e o políme o de maio peso molecula , é de espe a o es abelecimen o de in e ações ele os á icas su icien emen e o es en e o mesmo e o ma e ial gené ico, o que se espe a que le e a uma maio p o eção do ma e ial gené ico. No en an o, e como já oi abo dado na subsecção 1.3. Nanopa ículas Polimé icas, exis em di e sos obs áculos a uma en ega e icaz de ma e ial gené ico com e o es não- i ais. Um deles é a descomplexação das nanopa ículas, le ando à libe ação do ma e ial gené ico. Com o aumen o da condensação do ma e ial gené ico, o na-se mais di ícil a libe ação do mesmo, de o ma a le a à sua ansc ição no núcleo celula , o que diminui á a 46 exp essão do gene epó e . A endendo aos esul ados do ensaio de exclusão do b ome o de e ídio, es a é uma hipó ese bas an e plausí el. Ainda assim, depois de analisados os esul ados da iabilidade celula , cons a ou-se que as nanopa ículas p epa adas na azão de ca ga 50/1 possuem uma ci o oxicidade ele adíssima, o que comp ome e a ans eção le ada a cabo po es as o mulações. No en an o, es es esul ados ão de encon o ao espe ado, já que é epo ada uma cla a in luência do peso molecula e amanho das cadeias polimé icas no up ake celula , bem como no escape endossomal, desempaco amen o do DNA e in e nalização nuclea 118. Apesa da in luência do peso molecula na consequen e o mação de poliplexos mais es á eis, c ê- se que mais impo an e ainda pa a uma boa ans eção é a descomplexação dos poliplexos com consequen e libe ação do ma e ial gené ico142, o que, a jun a à ci o oxicidade exibida, pode es a elacionado com a diminuição da capacidade de ans eção na azão de ca ga de 50/1 dos poliplexos o mados a pa i do políme o PAMA26400. Uma boa capacidade de ligação en e o políme o e o ma e ial gené ico le a a uma boa es abilidade no meio ex acelula , ao passo que uma ligação mais aca en e es es dois componen es conduz a uma mais ácil libe ação do ma e ial gené ico a ní el in acelula , ha endo a necessidade de encon a um equilíb io en e es es dois pa âme os pa a uma en ega adequada de ma e ial gené ico. Ge almen e, a p esença de so o a e a nega i amen e a ans eção com nanopa ículas polimé icas21, a o esse que se de e à in e ação en e os políme os ca iónicos e alguns cons i uin es do so o, como é o caso de algumas p o eínas ca egadas nega i amen e. Assim, su ge a necessidade de es uda es a égias que pe mi am con o na os obs áculos impos os pela p esença de so o, sendo uma das mais p omisso as a conjugação de políme os ca iónicos com o políme o hid o ílico PEG. Copolíme os des e ipo possuem uma maio es abilidade coloidal, po encialmen e aumen ando o empo de ci culação in i o, já que é comba ida a ag egação de nanopa ículas112 e consequen e exc eção da co en e sanguínea po pa e do sis ema e iculoendo elial. Assim sendo, p opôs-se es uda o compo amen o de copolíme os com polie ilenoglicol possuindo, pa a o e ei o, pesos molecula es e g aus de polime ização p óximos dos e idenciados pelos homopolíme os PAMA, con o me ilus ado na abela 2, is o que se p e endeu es uda o e ei o da conjugação do políme o hid o ílico PEG 47 com o homopolíme o PAMA. A aliou-se a a i idade biológica das di e en es o mulações de o ma análoga ao desc i o an e io men e e os esul ados ob idos encon am-se ep esen ados na igu a 15b. Na p esença de so o, os poliplexos o mados a pa i dos di e en es copolíme os demons am cla as melho ias na exp essão do ansgene ace ao obse ado na ausência de so o, sendo a exceção o políme o PEG-b-PAMA29900 complexado com ma e ial gené ico na azão de ca ga (+/-) 10/1. Podemos in e i , en ão, que a p esença do PEG con ibui posi i amen e pa a o compo amen o dos poliplexos na p esença de so o, não omando em conside ação os poliplexos p epa ados a pa i do copolíme o PEG-b-PAMA8600, já que es es induzem ní eis de exp essão do ansgene eduzidos. A peguilação dos complexos es á desc i a como sendo um p omo o do aumen o da es abilidade coloidal, o que se de e em g ande pa e à inibição de in e ações não especí icas com cons i uin es do meio de cul u a143,144. De uma o ma ge al, a a i idade biológica exibida pelas o mulações de i adas do políme o PEG-b-PAMA8600 é eduzida quando compa ada com ou os poliplexos de i ados dos di e en es copolíme os. Sendo o peso molecula do políme o ela i amen e baixo, pe spe i a-se que os esul ados ob idos possam e o igem na in luência do PEG na densidade de ca ga do políme o, pois, apesa do po encial ze a se posi i o, a p esença do PEG al e a a densidade de ca gas posi i as, o que pode á in e e i nega i amen e com o up ake celula das nanopa ículas. Po ou o lado, a peguilação de poliplexos pode esul a em pe u bações no e ei o esponja, o que diminui o escape endossomal dos mesmos, e no aumen o da es abilidade coloidal, podendo es e a o di icul a a descomplexação en e o políme o e o ma e ial gené ico112 e, consequen emen e, a sua libe ação no in e io da célula. No caso do copolíme o PEG-b-PAMA20400, a capacidade de ans eção aumen a com a azão de ca ga N/P, exibindo os poliplexos p epa ados na azão de ca ga (N/P) 50/1 uma a i idade biológica supe io à demons ada pelos poliplexos p epa ados com o homopolíme o análogo PAMA17600, ealçando o e ei o posi i o que a peguilação induziu ambém nes e caso, con o me desc i o pa a ou os e o es polimé icos conjugados com es e compos o an o in i o145 como in i o146. Pa a as nanopa ículas o madas a pa i do políme o PEG-b-PAMA20400, c ê- se exis i um bom comp omisso en e o peso molecula do políme o ca iónico e a ação 48 do PEG, ou seja, o aumen o do peso molecula e do g au de polime ização das cadeias pode se su icien e pa a assegu a a densidade de ca ga necessá ia pa a complexa o ma e ial gené ico, ga an indo, simul aneamen e, que o PEG p omo a, possi elmen e, um aumen o da es abilidade coloidal. Demons a-se, en ão, que pa a o copolíme o de peso molecula in e médio, PEG-b-PAMA20400, a ação dos poliplexos é in luenciada pela p esença de so o e pela quan idade de ca gas posi i as, já que, com o aumen o da azão de ca ga, se e i ica um aumen o da quan idade de cadeias polimé icas li es que, analogamen e ao caso do homopolíme o PAMA17600, se pode aduzi num aumen o da in e ação com as p o eínas do so o ca egadas nega i amen e e consequen e aumen o dos ní eis de exp essão do ansgene. A p esença de so o apa en a se um a o p imo dial nes e caso, já que os poliplexos p epa ados a pa i do políme o PEG-b- PAMA20400 nas ês azões de ca ga não possuem a i idade biológica digna de egis o na ausência de so o, ao con á io do que acon ece na p esença des e cons i uin e. Es es esul ados suge em, no en an o, que o PEG não consegue inibi o almen e as in e ações en e o políme o ca iónico e as p o eínas do so o, al ez po ia do segmen o ca iónico e um peso bas an e supe io ao do polie ilenoglicol. Os poliplexos esul an es do copolíme o PEG-b-PAMA29900 ap esen am um compo amen o di e en e do obse ado pa a as nanopa ículas o madas com os políme os e copolíme os de pesos molecula es in e médios. No caso do copolíme o em ques ão, o máximo da a i idade biológica na p esença de so o é mani es ado na azão de ca ga (+/-) 25/1, con o me o sucedido pa a o homopolíme o de peso molecula semelhan e. Ainda assim, a capacidade de ans eção des as nanopa ículas supe io iza- se à dos poliplexos de i ados do homopolíme o com peso molecula mais p óximo, pa a além de se ap oximadamen e 340 ezes supe io à a i idade biológica do con olo u ilizado- poliplexos p epa ado com a PEI. Nes e caso, é ainda espe ado que, nas azões de ca ga mais ele adas, o aumen o do peso molecula p omo a um excesso de condensação do ma e ial gené ico, o que pode induzi a diminuição da a i idade biológica na azão de ca ga (+/-) 50/1 po ia de uma descomplexação menos e icaz en e o políme o e o ma e ial gené ico e, logo, meno libe ação do DNA. Ou a possí el azão pa a a diminuição da a i idade biológica dos poliplexos p epa ados com es e copolíme o na azão de ca ga (+/-) 50/1 é a ci o oxicidade exibida, con o me se á 49 discu ido no capí ulo 3.2. Ci o oxicidade dos poliplexos na linha celula COS 7- Ensaio de iabilidade celula . Após o sc eening inicial da a i idade biológica p o agonizada po políme os e copolíme os de di e en es pesos molecula es e g aus de polime ização, seleciona am- se as o mulações com uma maio capacidade de ans eção. De o ma a p ossegui os es udos compa a i os, ag upa am-se as o mulações em pa es consoan e o seu peso molecula . Den o do pa , isa-se analisa a in luência que o PEG em no compo amen o das nanopa ículas. Des aca am-se as o mulações de i adas dos políme os PAMA17600, PEG-b-PAMA20400, PAMA26400 e PEG-b-PAMA29900. Lu ci e ase A c i i y (R LU )/p o ein (m g ) P A M A 1 7600 10/1 P A M A 17600 25/1 PA M A17600 50/1 PAM A 2640 0 10/1 P A MA26400 25/1 P A MA26400 50/1 PE I 25 /1 0 2.010 6 4.010 6 6.010 6 5.010 7 1.010 8 1.510 8 2.010 8Sem S o o C om S o o a) Lu ci e ase A c i i y (R LU )/p o ein (m g ) PEG -b -P AM A 20400 10/1 PEG -b-PA M A20400 25/1 PEG -b-P A M A 20400 50/1 PEG -b-PA M A29900 10/1 PEG -b-PA M A29900 25/1 PEG-b-P A MA29900 50/1 PEI 25/1 0 2.010 6 4.010 6 6.010 6 5.010 7 1.010 8 1.510 8 2.010 8Sem S o o C om S o o b) Figu a 16- E ei o da azão de ca ga e da p esença do PEG na a i idade biológica dos poliplexos p epa ados a pa i do pa PAMA17600/ PEG-b-PAMA20400 e PAMA26400/ PEG-b-PAMA29900 na p esença e ausência de so o em células COS 7. Os di e en es políme os e copolíme os o am complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos ês ácios N/P indicados. O p ocedimen o expe imen al segue o desc i o na secção Ma e iais e Mé odos. Os esul ados são ep esen a i os de pelo menos 3 ensaios independen es. Os dados encon am-se exp essos em unidades RLU de luci e ase po mg de p o eína celula o al (média ± des io pad ão, ob ida de iplicados). Na igu a 16, é possí el analisa de o ma mais de alhada o compo amen o dos pa es políme o/copolíme o que se des aca am no sc eening inicial an o na p esença como na ausência de so o. Con o me e e ido an e io men e, o pa PAMA17600/PEG-b-PAMA20400 ap esen a uma c escen e a i idade de ans eção com a azão de ca ga, supe io izando-se os poliplexos p epa ados a pa i do copolíme o na azão de ca ga (+/-) 50/1, o que, pa a além dos a gumen os já e e idos, pode á es a elacionado com o pe il de ci o oxicidade das nanopa ículas, já que es e pa âme o assume alo es eduzidos mesmo nas maio es azões de ca ga, con o me se á discu ido 50 na subsecção seguin e 3.2 Ci o oxicidade dos poliplexos na linha celula COS 7- Ensaio de iabilidade celula . No caso dos poliplexos p epa ados a pa i do pa PAMA26400/ PEG-b- PAMA29900, o máximo da a i idade de ans eção oco e na azão de ca ga (+/-) políme o/ ma e ial gené ico de 25/1, o que se pode de e a um excesso de condensação do DNA e a uma ele ada ci o oxicidade dos poliplexos p epa ados na azão de ca ga (+/- ) 50/1, causando uma diminuição dos ní eis de exp essão do ansgene. No en an o, exis em ou os a o es a e em con a na análise da capacidade de ans eção des as o mulações, como a es abilidade coloidal dos poliplexos, já que es es, apesa de conjugados com o PEG, podem so e al e ações a ní el es u u al po ia da in e ação com as p o eínas cons i uin es do so o, o que pode á p ejudica a in e nalização e o á ego in acelula das nanopa ículas. Essa análise se á ei a com maio de alhe na subsecção 3.6.1 Tamanho e po encial ze a dos poliplexos. Na maio pa e dos casos, a p esença do polie ilenoglicol in luencia nega i amen e a a i idade biológica das o mulações, seja a a és da edução da in e ação das nanopa ículas com a memb ana celula (como se epo a pa a alguns políme os112) ou de uma inibição do e ei o de esponja de p o ões128 e da descomplexação dos poliplexos po ia da es abilidade das nanopa ículas conjugadas com o PEG112. No en an o, pa a o pa de maio peso molecula , obse a-se que os poliplexos p epa ados a pa i do copolíme o e do homopolíme o exibem, na p esença de so o, uma a i idade biológica supe io na azão de ca ga N/P 25/1, o que pe mi e in e i que, ace ao aumen o do peso molecula , a maio a i idade biológica oi ob ida pa a uma azão de ca ga (+/-) in e io ao obse ado com o copolíme o PEG-b-PAMA20400. Discu i am-se di e sas azões pa a as di e enças e idenciadas pelas á ias o mulações no que diz espei o à sua capacidade de ans eção, ad indo pa e des e lo e das ca ac e ís icas ísico químicas dos poliplexos ou de mudanças na sua es u u a, ambos casos indu i os de mudanças compo amen ais dos nanossis emas de anspo e e en ega de ma e ial gené ico quando es ados in i o e, p incipalmen e, in i o. Ainda assim, exis em di e en es azões a conside a pa a o aumen o da a i idade biológica, na p esença de so o, com a azão de ca ga políme o/ma e ial gené ico e com o e ei o do peso molecula . Uma dessas possí eis azões é a in e ação das nanopa ículas com as p o eínas do so o, como é o caso da albumina, podendo ha e uma in luência posi i a 51 na a i idade de ans eção desencadeada pela p esença des a p o eína que, como se sabe, é ca egada nega i amen e, o que pe mi e a oco ência de in e ações ele os á icas com o políme o ca iónico. Ainda assim, o mecanismo ao ce o pelo qual a in e ação com es a p o eína aumen a a a i idade biológica de nanopa ículas ainda não é o almen e e iden e147. A composição dos complexos pode desempenha um papel impo an e, os complexos conjugados com a albumina podem liga -se de o ma não especí ica a ece o es da memb ana celula capazes de media a in e nalização celula 147, pa a além do ac o da p o onação pa cial des a p o eína a pH endossomal e do ac o da albumina pode in e agi com a memb ana do endossoma pode esul a na deses abilização do mesmo, libe ando o ma e ial gené ico148. Exis em es udos que ela am um aumen o do empo de ci culação in i o de complexos com polie ilenoglicol g aças à ligação com a albumina, seja po ia da al e ação da con o mação das moléculas de PEG pa a uma es u u a impedi i a de in e ações en e os complexos e as p o eínas do so o, ocupação dos locais de ligação en e os complexos e as p o eínas do so o ou po um aumen o da hid o ilicidade do PEG p omo ido pela albumina149. Pa a além da exis ência de esul ados que demons am o aumen o da capacidade de ans eção de poliplexos aos quais se adicionou albumina, o que se pode á de e ao aumen o da in e nalização dos poliplexos po endoci ose mediada po ece o es150. 3.2 Ci o oxicidade dos poliplexos na linha celula COS 7 – Ensaio de iabilidade celula A p ocu a de um nanossis ema de anspo e e en ega de ma e ial gené ico ideal en ol e conside a a segu ança da aplicação do mesmo. Po ia da ci o oxicidade ap esen ada po alguns políme os23, e a de g ande impo ância analisa a iabilidade celula após a amen o com as o mulações em es udo. Como al, ealiza am-se ensaios de iabilidade celula cujo p ocedimen o seguiu o desc i o na secção 2 Ma e iais e Mé odos. P ocedeu-se a um sc eening inicial, onde se a aliou a iabilidade celula após ans eção na ausência de so o com os mesmos poliplexos pa a os quais se a aliou a a i idade biológica. 52 Viab ilidade C elula (% do con o lo) P A M A6300 10/1 P A M A6300 25/1 P A M A6300 50/1 PA M A 17600 10/1 PA M A 17600 25/1 PA M A17600 50/1 PA M A 26400 10/1 PA M A 26400 25/1 PA M A26400 50/1 PEI 25/1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 a) Viabilid ade C elula (% d o con olo) PEG -b-P A M A 8600 10/1 PEG -b-P A M A 8600 25/1 PE G -b-P A M A 8600 50/1 PE G -b-P A M A20400 10/1 PE G -b-P A M A20400 25/1 PE G -b-P A M A20400 50/1 PE G -b-P A M A29900 10/1 PE G -b-P A M A29900 25/1 PEG -b-P A M A29900 50/1 PEI 25/1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 b) Figu a 17- E ei o do peso molecula dos políme os e da azão de ca ga (N/P) dos poliplexos na iabilidade células COS 7. Os poliplexos o am p epa ados a pa i do homopolíme o PAMA (a) e do copolíme o PEG- β-PAMA (b). Os di e en es políme os e copolíme os o am complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos ácios N/ P 53 indicados. O p ocedimen o expe imen al segue o desc i o na secção dos Ma e iais e Mé odos . Os esul ados são ep esen a i os de pelo menos 3 ensaios independen es. Os dados encon am-se exp essos na o ma de pe cen agem de iabilidade celula ela i amen e ao con olo (células não a adas) (média ± des io pad ão, ob ida de iplicados). Exis em di e sos a o es associados à ci o oxicidade demons ada po políme os ca iónicos, des acando-se en e eles o peso molecula , es u u a e a densidade de esíduos ca iónicos151. A a és da análise dos esul ados ap esen ados na Figu a 17, epo a-se uma cla a in luência da composição dos políme os e da azão de ca ga dos poliplexos na sua ci o oxicidade na ausência de so o. Ainda assim, o pe il de ci o oxicidade é igual an o pa a as nanopa ículas esul an es dos homopolíme os como dos copolíme os, demons ando-se um inc emen o da ci o oxicidade com o aumen o da azão de ca ga, sendo es e um esul ado espe ado, já que o aumen o da azão de ca ga le a a uma maio quan idade de esíduos ca iónicos a in e agi com a memb ana celula , conduzindo à sua deses abilização. Os danos induzidos pela ca ga posi i a da supe ície dos poliplexos êm ambém um impac o impo an e a ní el in acelula , já que os complexos ca egados posi i amen e êm a capacidade de pe meabiliza a memb ana das mi ocônd ias, le ando à libe ação do ci oc omo c e consequen e indução de mecanismos apop ó icos152, 153. Não se obse ou um e ei o p onunciado do peso molecula na ci o oxicidade dos poliplexos p epa ados a pa i dos homopolíme os, ainda que as nanopa ículas esul an es do políme o PAMA6300 nas azões de ca ga 25/1 e 50/1 ap esen em uma ci o oxicidade in e io às p epa adas nas mesmas azões de ca ga com homopolíme os de maio peso molecula . O pe il de ci o oxicidade dos poliplexos p epa ados com o copolíme o PEG- b-PAMA nos di e en es pesos molecula es é igual ao obse ado pa a as nanopa ículas p epa adas a pa i dos homopolíme os, ha endo um aumen o da ci o oxicidade com a azão de ca ga. E a espe ado que a conjugação com o políme o PEG al e asse es e pa âme o, po ia de uma edução na ca ga supe icial das nanopa ículas, o que oi mani es amen e isí el apenas pa a as p epa ações de meno peso molecula , con o me se cons a a analisando a iabilidade celula após a amen o com os poliplexos p epa ados a pa i do copolíme o PEG-b-PAMA8600. Pa a as es an es o mulações, a p esença do polie ilenoglicol não p oduziu di e enças signi ica i as, o que e o ça a ideia já expos a an e io men e de que, pa a pesos molecula es ele ados, 60 Viabilidade C elula (% do co n olo) PEI P A M A26400 PA M A17600 PEG -b -P A M A29900 PEG -b-P A M A20400 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200 g/m L 100 g/m L 50 g/m L 10 g/m L 5g/m L Figu a 19- E ei o da concen ação dos di e en es políme os e copolíme os na iabilidade de células COS 7 na p esença de so o. O p ocedimen o expe imen al segue o desc i o na secção Ma e iais e Mé odos. Os esul ados são ep esen a i os de pelo menos 3 ensaios independen es Os dados encon am-se exp essos na o ma de pe cen agem de iabilidade celula ela i amen e ao con olo (células não a adas) (média ± des io pad ão, ob ida de iplicados). A a és da obse ação do g á ico ilus ado na Figu a 19, concluiu-se que o pe il de ci o oxicidade dos políme os ap oxima-se do obse ado pa a os poliplexos, assis indo-se a uma p og essi a diminuição da iabilidade celula com o aumen o da concen ação de políme o ca iónico, con o me se ia de espe a . A é à concen ação de 10 µg/mL, odos os políme os ap esen am uma ci o oxicidade eduzida (in e io a 20%). A pa i des a concen ação, o compo amen o dos homopolíme os e dos copolíme os di e e, já que a ci o oxicidade dos p imei os aumen a de o ma mui o mais acen uada, com a exceção da concen ação de políme o de 200 µg/mL, pa a a qual a mo e celula é p a icamen e o al, independen emen e do políme o u ilizado. Espe a -se-ia que o políme o PAMA26400 possuisse uma ci o oxicidade supe io ao homopolíme o de meno peso, PAMA17600, possi elmen e jus i icada pelo aumen o da quan idade de ca gas posi i as a in e agi com os glicosaminoglicanos celula es157, le ando a uma 61 consequen e deses abilização da memb ana e mo e celula , não se e i icando, no en an o, essa endência pa a o espe o de concen ações es udado. O pe il de ci o oxicidade dos copolíme os é di e en e do ap esen ado pelos homopolíme os, o que de e á es a elacionado com a p esença do PEG e o e ei o que es e elemen o pode á e nas in e ações ele os á icas en e o políme o ca iónico e a memb ana celula . Exce uando-se a concen ação máxima de copolíme o de 200 µg/ mL, a ci o oxicidade dos copolíme os PEG-b-PAMA20400 e PEG-b-PAMA29900 em um máximo pa a o copolíme o de maio peso molecula , ondando os 90 % pa a a concen ação de 100 µg/ mL. Ainda assim, a p esença do polie ilenoglicol não masca a po comple o o e ei o do peso molecula , já que o copolíme o PEG-b-PAMA20400 ap esen a uma ci o oxicidade in e io à do seu homólogo de maio peso molecula . É impo an e e e i que a ealização de ensaios de iabilidade celula a segui a a amen o apenas com políme os são impo an es, de o ma a c ia o pio cená io possí el, já que, de o ma ge al, a ci o oxicidade das o mulações diminui aquando da o mação de complexos com ma e ial gené ico158. Os esul ados ob idos con i mam es a endência, já que a concen ação de políme o no poço co esponde a ap oximadamen e 40 µg/mL e 80 µg/mL pa a os poliplexos o mados nas azões de ca ga de 25/1 e 50/1, espe i amen e. Ve i ica-se, po exemplo, que a ci o oxicidade diminui aquando da o mação de poliplexos com o homopolíme o PAMA26400, já que a complexação des e com ma e ial gené ico na azão de ca ga 50/1 le a a uma concen ação de políme o no poço de 80 µg/mL, causando, no en an o, uma mo e celula semelhan e à ob ida após a amen o com o políme o (não complexado) a uma concen ação de 50 µg/ mL. Os mecanismos exa os a a és dos quais os políme os induzem mo e celula não são ainda ce os, ha endo, no en an o, alguns possí eis indícios. Con o me já oi e e ido, a biocompa ibilidade pode se a e ada po á ios a o es, como o peso molecula , a densidade de ca gas, es u u a e lexibilidade con o macional151,154, sendo o peso molecula o a o de maio in luência den o de políme os de igual es u u a, como se e i ica nes e p oje o. O ipo de aminas exis en es ambém pode desempenha um papel impo an e na ci o oxicidade dos políme os, es ando es e pa âme o in imamen e ligado ao a anjo idimensional dos segmen os ca iónicos. Apesa de ha e a indução de á ios mecanismos p o apop ó icos po pa e dos poliplexos, exis em 62 es udos indica i os de uma mo e nec ó ica induzida an o po políme os ca iónicos como po políme os complexados com ma e ial gené ico159. 3.4 Capacidade de ans eção das nanopa ículas em HepG 2 – Ensaio de Luminescência Após seleção das o mulações mais p omisso as com base na conjugação dos esul ados ob idos nos ensaios de iabilidade celula e de a i idade biológica, complemen a am-se os es udos ei os a é en ão com uma análise do compo amen o das nanopa ículas nou a linha celula . P ocede am-se a es udos na linha celula HepG 2 que, como se sabe, es á al amen e en ol ida nos es udos de e apia génica pa a comba e a condições umo ais hepá icas, como o hepa oca cinoma celula (HCC), a segunda maio causa de mo e po canc o no mundo160. A aliou-se, en ão, a capacidade de ans eção e a ci o oxicidade das nanopa ículas seguindo os mesmos p o ocolos ei os pa a a linha celula COS 7, di e indo apenas no ac o de não e sido ei o um sc eening inicial, ap o ei ando-se, ao in és, a in o mação p o enien e dos esul ados ob idos an e io men e. Des a o ma, es a am-se os poliplexos o mados a pa i dos políme os e copolíme os de maio peso molecula , ag upando-se os mesmos em pa es políme o/copolíme o, já que es as o am as o mulações com esul ados mais p omisso es na linha celula COS-7. 63 A i idade B io lógica ((R LU )/p o eína (m g)) P A M A 17600 10/1 P A M A 17600 25/1 P A M A 17600 50/1 P A M A 26400 10/1 P A M A 26400 25/1 PA M A 26400 50/1 PEI 25/1 0 1.010 5 2.010 5 3.010 5 4.010 5 a) A i idade B iológica ((R LU )/p o eína (m g)) PE G -b-P A M A 20400 10/1 PE G -b-P A M A 20400 25/1 PEG -b-P A M A20400 50/1 PE G -b-P A M A 29900 10/1 PEG -b-P A M A29900 25/1 PE G -b-P A M A 29900 50/1 PEI 25/1 0 2.010 5 4.010 5 6.010 5 2.010 6 4.010 6 6.010 6 8.010 6 b) Figu a 20- E ei o da azão de ca ga e da p esença do políme o PEG na a i idade biológica dos poliplexos p epa ados a pa i dos homopolíme os PAMA (a) e dos copolíme os PEG-β-PAMA (b) na linha celula HepG 2 na p esença de so o. Os di e en es políme os e copolíme os o am complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos ácios N/P indicados. O p ocedimen o expe imen al segue o desc i o na secção dos Ma e iais e Mé odos. Os esul ados são 64 ep esen a i os de pelo menos 3 ensaios independen es. Os dados encon am-se exp essos em RLU de luci e ase po mg de p o eína celula o al (média ± des io pad ão, ob ida de iplicados). Pela obse ação da Figu a 20, conclui-se que, de uma o ma ge al, as nanopa ículas em es udo não ans e am a linha celula HepG2 de igual o ma à linha celula COS 7, ap esen ando ní eis de a i idade biológica in e io es. No caso dos poliplexos o mados a pa i do homopolíme o, epo a-se uma diminu a in luência do peso molecula na capacidade de ans eção, não ha endo di e enças en e os ní eis de a i idade biológica das nanopa ículas o madas pelos políme os PAMA17600 e PAMA26400. No caso des as nanopa ículas, sublinha-se ainda uma aca in luência da azão de ca ga nos ní eis de exp essão do ansgene, não sendo, po isso, conside á el. As nanopa ículas o madas a pa i dos copolíme os exibem ambém uma baixa capacidade de ans eção, conside ando apenas as azões de ca ga (+/-) políme o/ma e ial gené ico mais baixas (10/1 e 25/1), ainda assim, os ní eis de exp essão do ansgene aumen am signi ica i amen e pa a os poliplexos o mados na azão de ca ga de 50/1, e i icando-se es a ca ac e ís ica pa a as nanopa ículas o madas a pa i an o do copolíme o PEG-b-PAMA20400 como do copolíme o PEG-b- PAMA29900. Es e aumen o da exp essão do ansgene com a azão de ca ga e, consequen emen e, com a quan idade de políme o p esen e, se ia expec á el, já que, con o me e e ido nos ensaios ealizados na linha celula COS 7, o aumen o da azão de ca ga p omo e um aumen o da densidade de ca gas posi i as, o que se pode e i ica como um a o indu i o da in e nalização dos poliplexos. A acen uada p esença de cadeias polimé icas li es, como acon ece com o aumen o da azão de ca ga (+/-) políme o/ma e ial gené ico, em e ei os a ní el in acelula , con o me já oi e e ido, já que es as desempenham um papel impo an e no e ei o de esponja de p o ões esponsá el pelo escape endossomal do ma e ial gené ico. Pa a além do e ei o induzido pela maio quan idade de políme o ca iónico, des aca-se a p esença do políme o PEG nas o mulações com maio capacidade de ans eção, o que le a à conclusão de que a conjugação com es e políme o hid o ílico le a a um aumen o da exp essão do ansgene, o que pode acon ece po ia da p o eção que es e con e e ace a in e ações não especí icas com p o eínas do meio de cul u a e à es abilização es é ea con e ida pelo mesmo161,162. 65 Fazendo uma análise compa a i a en e a a i idade biológica das o mulações em es udo nas linhas celula es COS 7 e HepG 2, obse a-se que, no caso dos poliplexos o mados a pa i do políme o PEG-b-PAMA20400, o máximo da exp essão do ansgene man ém-se na azão de ca ga (+/-) políme o/ma e ial gené ico 50/1, ao passo que, no caso das nanopa ículas o iginadas a pa i do políme o PEG-b-PAMA29900, assis e-se a um shi do máximo da exp essão do gene epó e pa a a azão de ca ga (+/-) 50/1. Compa ando o compo amen o das nano o mulações em cada uma das linhas celula es, chega-se à conclusão que es a mo imen ação do pico de a i idade biológica pode -se-á elaciona com a ci o oxicidade dos poliplexos, mos ando es a se bas an e baixa mesmo pa a as azões de ca ga mais al as, con o me pode á se e i icado na subsecção seguin e. De o ma a melho a alia o compo amen o dos nanossis emas nes a linha celula , compa am-se os ní eis de exp essão do ansgene le ados a cabo pelos poliplexos em es udo com a a i idade biológica das nanopa ículas con olo, endo es as a sua o igem no políme o PEI, conside ado o gold s anda d dos nanossis emas de anspo e e en ega de ma e ial gené ico. Os poliplexos o mados a pa i dos políme os PEG-b-PAMA20400 e PEG-b-PAMA29900, ap esen am uma capacidade de ans eção que se des aca cla amen e dos ní eis a ingidos pelos poliplexos o mados a pa i do políme o gold s anda d, ha endo uma di e ença de 16 ezes no p imei o dos casos e de 40 ezes no úl imo. 3.5 Ci o oxicidade dos poliplexos na linha celula HepG 2 – Ensaio de iabilidade celula De o ma a seleciona um nanossis ema de anspo e e en ega de ma e ial gené ico adequado, não se de e apenas da ên ase à a i idade biológica das nanopa ículas, mas sim iden i ica um comp omisso en e a e iciência e a sua ci o oxicidade, aliando es as às ca ac e ís icas ísico-químicas das nano o mulações, que decidi ão o ipo de aplicação mais adequado. Po conseguin e, p ocedeu-se a uma 66 a aliação da iabilidade celula da linha HepG 2 na p esença de so o após a amen o com os poliplexos selecionados, con o me oi ei o nos ensaios de luminescência le ados a cabo nes a mesma linha celula . 67 Viabilidad e C elula (% d o con olo) PA M A 17600 10/1 PA M A 17600 25/1 PA M A 17600 50/1 PA M A 26400 10/1 PA M A 26400 25/1 PA M A 26400 50/1 PEI 25/1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 a) Viabilid ad e C elula (% do con olo ) PE G -b -P A M A 20400 10/1 PE G -b -P A M A20400 25/1 PE G -b -P A M A 20400 50/1 PE G -b -P A M A 29900 10/1 PEG -b -P A M A29900 25/1 PEG -b -P A M A29900 50/1 PEI 25/1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 b) Figu a 21- E ei o da p esença de so o na iabilidade celula após o a amen o com di e sos poliplexos p epa ados a pa i dos homopolíme os PAMA (a) e dos copolíme os PEG-β-PAMA (b) na linha celula HepG 2. Os di e en es políme os e copolíme os o am complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos ácios N/P indicados. O 68 p ocedimen o expe imen al segue o desc i o na secção dos Ma e iais e Mé odos. Os esul ados são ep esen a i os de pelo menos 3 ensaios independen es. Os dados encon am-se exp essos na o ma de pe cen agem de iabilidade celula ela i amen e ao con olo (células não a adas) (média ± des io pad ão, ob ida de iplicados). Como se sabe, a ci o oxicidade dos poliplexos depende de á ios a o es, como po exemplo o peso molecula , a densidade de ca ga posi i a e a es u u a dos políme os151,154, e i icando-se uma maio in luência do peso molecula en e políme os es u u almen e iguais. Tendo em con a os a o es que pesam pa a as ca ac e ís icas ci o óxicas dos poliplexos, se ia de espe a que o aumen o do peso molecula ou da azão de ca ga p oduzissem e ei os isí eis na iabilidade celula após a amen o com as nanopa ículas, já que ha e ia um aumen o das in e ações ele os á icas en e o políme o e a memb ana celula , a o que se pensa se indu i o da ci o oxicidade dos poliplexos151. No en an o, e de uma o ma ge al, as o mulações de i adas dos homopolíme os ap esen am uma ci o oxicidade eduzida, in e io a 20 %, con o me se pode obse a na Figu a 21. Ainda assim, os poliplexos p epa ados a pa i do políme o PAMA26400 na azão de ca ga (+/-) 50/1 causam uma mo e celula de, ap oximadamen e, 30 %, sendo es e o alo mais al o pa a as o mulações p epa adas a pa i dos homopolíme os. Es es alo es pode ão ad i da in luência do maio peso molecula e de uma ele ada azão de ca ga, o que mo i a um aumen o das in e ações ele os á icas en e os políme os ca iónicos e a memb ana celula ace às es an es nanopa ículas de i adas dos homopolíme os. No que conce na os poliplexos o mados a pa i dos copolíme os, obse a- se uma ci o oxicidade não supe io a 20 % pa a p a icamen e odas as nano o mulações, não ha endo uma g ande a iação nos alo es dos poliplexos o mados a pa i do copolíme o PEG-b-PAMA20400. No caso das nano o mulações o iginadas a pa i do copolíme o de maio peso molecula , assis e-se a um ligei o e ei o da azão de ca ga na iabilidade celula , já que se egis ou um meno alo de ci o oxicidade pa a os poliplexos o mados na azão de ca ga (+/-) de 10/1. Apesa da p esença do polie ilenoglicol, c ê-se que o amanho do segmen o ca iónico e a sua quan idade in luenciem a iabilidade celula a a és do ní el de deses abilização da memb ana celula induzido. No en an o, e ainda que de uma o ma bas an e ligei a, as o mulações de i adas dos copolíme os induzem uma ci o oxicidade in e io à dos poliplexos 69 o mados a pa i dos homopolíme os, con o me se ia de espe a pela p esença do PEG, já que se espe a que es e componen e masca e pa cialmen e as ca gas posi i as das cadeias polimé icas, pa a além de minimiza in e ações não especí icas com p o eínas do so o69. 3.6 Ca ac e ização Físico-Química dos poliplexos Os políme os ca iónicos cons i uem um dos ipos de e o es não i ais mais u ilizados na en ega de genes. Uma das p incipais ca ac e ís icas des es nanossis emas é a sua e sa ilidade, já que podem se adap ados ace às aplicações p e endidas. Po ezes, as al e ações le adas a cabo nes as es u u as isam a manipulação de de e minadas p op iedades ísico-químicas, de o ma a modi ica o compo amen o des es nanossis emas in i o e in i o. Fo am a aliadas algumas ca ac e ís icas ísico- químicas das nanopa ículas em es udo ao longo des e p oje o, como po exemplo o amanho dos poliplexos, a sua capacidade de p o eção do ma e ial gené ico e a ca ga supe icial, a i mando-se es es como a o es ulc ais pa a a e icácia dos poliplexos que in i o que in i o56. 3.6.1 Tamanho e po encial ze a dos poliplexos O amanho das nanopa ículas analisou-se segundo a écnica de Dynamic Ligh Sca e ing, con o me elucidado na subsecção Dynamic Ligh Sca e ing e Po encial Ze a co esponden e ao capí ulo Ma e iais e Mé odos, seguindo-se o p o ocolo con o me desc i o. O diâme o hid odinâmico dos poliplexos é uma ca ac e ís ica com bas an e in luência na de inição dos mecanismos de up ake celula 163. Além disso, o amanho das nanopa ículas é um a o al amen e in luenciado do compo amen o que os nanossis emas ap esen a ão in i o, de inindo se os poliplexos sai ão da ci culação ou se ão exc e ados pelo sis ema enal164, bem como o pe il de acumulação das nanopa ículas em ó gãos como o ígado, baço e medula165. 76 em gel de aga ose, seguindo os dois o p ocedimen o desc i o na secção dos 2 Ma e iais e Mé odos. A cesso d a sonda (% do con olo) P A M A17600 P A M A 26400 PEG -b-P A M A20400 PEG -b-P A M A29900 PE I 0 10 20 30 10/1 25/1 50/1 Figu a 25-Acesso do b ome o de e ídio ao ma e ial gené ico das nanopa ículas p epa adas a pa i dos homopolíme os PAMA e dos copolíme os PEG-β-PAMA em di e en es azões de ca ga políme o/ma e ial gené ico. Os di e en es políme os o am complexados com 1µg de pCMV.Luc nos ês ácios N/P indicados. O p ocedimen o expe imen al segue o desc i o na secção Ma e iais e Mé odos. Os esul ados são ep esen a i os de pelo menos 3 ensaios independen es. Os dados encon am-se exp essos em pe cen agem ela i amen e a um con olo posi i o (co esponden e ao acesso da sonda a ma e ial gené ico não p o egido) (média ± des io pad ão, ob ida de iplicados). Na Figu a 25 encon am-se ilus ados os esul ados ob idos no ensaio de in e calação do b ome o de e ídio. A aliou-se a capacidade de condensação de DNA dos poliplexos o mados a pa i dos homopolíme os e copolíme os em ês azões de ca ga, sendo os esul ados compa ados com os ob idos pa a os poliplexos con olo, de i ados do políme o PEI. A capacidade de p o eção de um políme o es á in imamen e elacionada com a sua es u u a de ido, po exemplo, à in luência que os esíduos ca iónicos êm na o mação dos poliplexos113. 77 De uma o ma ge al, não se egis am di e enças de g ande ele o na p o eção con e ida pelos políme os ao ma e ial gené ico, es ando o acesso da sonda con inado, ap oximadamen e, en e os 10 e os 20 %, sendo es es alo es adequados, já que se p e ende um comp omisso en e uma p o eção compe en e e uma libe ação e icaz do ma e ial gené ico. Des aca-se uma na u al in luência da azão de ca ga nos esul ados ob idos, já que com o seu inc emen o, aumen a-se o núme o dos esíduos ca iónicos p esen es, le ando, na maio pa e das o mulações, a uma melho p o eção do ma e ial gené ico, con o me se pode a e igua pela obse ação da Figu a 25. Nos ensaios an e io es de a i idade biológica e ci o oxicidade, des aca am- se os pa es políme o/copolíme o PAMA17600/PEG-b-PAMA20400 e PAMA26400/PEG-b- PAMA29900 nas azões de ca ga (+/-) 50/1 e 25/1, espe i amen e, es ando os alo es de p o eção con e ida po es es políme os numa gama mui o p óxima, si uando-se acima dos 80 %. Compa ando com os esul ados ob idos pa a os poliplexos p epa ados a pa i do políme o gold s anda d, não se egis am g andes di e enças, p incipalmen e olhando pa a a azão de ca ga (+/-) 25/1 – es abelecida como a azão de ca ga com maio e icácia de ans eção. A a és des a p oximidade de alo es en e os nanossis emas que se des aca am, é possí el in e i que as di e enças nos seus compo amen os in i o não pode ão se explicadas eco endo maio i a iamen e a a gumen os de p o eção do ma e ial gené ico. É impo an e salien a ainda que a p esença do polie ilenoglicol não e elou uma in luência c ucial nos esul ados ob idos, não ha endo, na maio pa e dos casos, di e enças signi ica i as en e a condensação de DNA con e ida pelos poliplexos de i ados dos homopolíme os e dos copolíme os. Como complemen o ao ensaio de in e calação do b ome o de e ídio, a aliou-se a condensação dos políme os eco endo a um ensaio de ele o o ese em gel de aga ose, encon ando-se os esul ados ob idos ilus ados na Figu a 26. 78 Figu a 26-Resul ados de ensaio de gel em aga ose pa a as o mulações selecionadas. O homopolíme o PAMA26400 e o copolíme o PEG-b-PAMA29900 o am ambos complexados com 1 µg de pCMV.Luc nas ês azões de ca ga indicadas. U ilizou-se DNA li e e poliplexos p epa ados a pa i do políme o PEI como con olo pa a es e ensaio. O p ocedimen o seguiu de aco do com o desc i o na secção Ma e iais e Mé odos. A écnica da ele o o ese em gel de aga ose baseia-se na ação de um campo elé ico e consequen e mig ação do ma e ial gené ico ca egado nega i amen e pa a o pólo posi i o. Consequen emen e, se hou e uma condensação e icaz do DNA po pa e do políme o, ha e á uma meno mig ação do ma e ial gené ico. Escolheu-se o pa homopolíme o/copolíme o PAMA26400 e PEG-b-PAMA29900, co esponden e à o mulação mais p omisso a, pa a ealiza es e ensaio, e eco eu-se aos poliplexos con olo o mados a pa i do políme o gold s anda d pa a compa ação. Co obo ando os esul ados ob idos no ensaio de in e calação do b ome o de e ídio, o ensaio em gel de aga ose mos ou uma complexação e icaz do ma e ial gené ico com o políme o, já que não se obse a mig ação das bandas. Compa ando a in ensidade das bandas do DNA li e (con olo), conclui-se que es a é supe io à das bandas e e en es aos poliplexos, sendo es e mais um indicado de uma boa condensação e consequen e p o eção do ma e ial gené ico po pa e dos políme os em es udo. 79 80 4 Conclusão e Pe spe i as Fu u as 4.1 Conclusão As di e en es écnicas de e apia génica êm como obje i o o a amen o/cu a de um g ande leque de condições pa ológicas de o igem gené ica, he edi á ias e/ou adqui idas. O obje i o des a écnica é a exp essão es á el e segu a de um gene de in e esse num de e minado ecido. É, en ão, de impo ância p imo dial, desen ol e sis emas capazes de anspo a e en ega o ma e ial gené ico de uma o ma e icaz e segu a às células al o. Com o desen ol imen o das écnicas de sín ese química e bio ecnologia, iniciou-se a u ilização de políme os como e o es de anspo e e en ega de ma e ial gené ico. Es es sis emas possuem algumas ca ac e ís icas an ajosas, como po exemplo a e sa ilidade, já que pe mi em a manipulação da sua es u u a ísico-química consoan e a aplicação desejada; a g ande capacidade de condensação/ anspo e de ma e ial gené ico; e a biocompa ibilidade. Jun ando es as ca ac e ís icas a uma ácil p odução, es es e o es assumem um po encial eno me no con ex o de anspo e e en ega de ma e ial gené ico, não obs an e o ac o de ainda ap esen a em algumas limi ações. Com o abalho desen ol ido nes e p oje o, p e endeu-se a alia a in luência das p op iedades ísico-químicas de uma amília de políme os, bem como de modi icações na sua es u u a, a a és da conjugação com o políme o hid o ílico polie ilenoglicol, na sua capacidade de ans eção. Com es e p opósi o, os di e en es ensaios o am execu ados na ausência e p esença de so o, sendo es e um cons i uin e capaz de mime iza pa cialmen e as condições que os nanossis emas encon am quando adminis ados in i o. Os esul ados ob idos demons a am que, an o na ausência como na p esença de so o, a a i idade biológica dos políme os PAMA e copolíme os PEG-b-PAMA depende do seu peso molecula e da azão de ca ga na qual são o mados os poliplexos. Na ausência de so o, des acou-se a exp essão do ansgene le ada a cabo com os poliplexos p epa ados a pa i dos homopolíme os PAMA17600 e PAMA26400 nas 81 azões de ca ga de (+/-) 10/1, pa a o p imei o, e (+/-) 10/1 e (+/-) 25/1, pa a o úl imo, supe io izando-se es es alo es aos ob idos com os poliplexos con olo. Pa a as mesmas condições, e de o ma ge al, os poliplexos p epa ados a pa i dos copolíme os mos a am uma capacidade de ans eção in e io aos an e io es, des acando-se apenas o políme o PEG-b-PAMA29900 complexado com ma e ial gené ico na azão de ca ga (+/-) 10/1. Os ensaios ealizados na p esença de so o mos a am uma al e ação no pe il da capacidade de ans eção dos di e en es poliplexos, aumen ando, de o ma ge al, es e pa âme o com a azão de ca ga dos poliplexos, ao con á io do sucedido na ausência de so o. Na p esença de so o, e i ica am-se maio es ní eis de exp essão do ansgene pa a poliplexos o mados a pa i de políme os e copolíme os de maio peso molecula . No caso dos poliplexos o mados a pa i dos homopolíme os, a p esença de so o le ou à ob enção de ní eis supe io es de ans eção pa a algumas o mulações, endo-se des acado os políme os PAMA17600 e PAMA26400 complexados com ma e ial gené ico nas azões de ca ga (+/-) 50/1, no p imei o caso, e (+/-) 25/1 e (+/-) 50/1, no úl imo, exibindo es as nanopa ículas uma a i idade biológica mui o supe io à dos poliplexos con olo, o mados a pa i do políme o gold s anda d. No caso das nanopa ículas o madas a pa i dos copolíme os, a p esença de so o ambém p omo eu melho ias signi ica i as na sua a i idade biológica, aumen ando a exp essão do ansgene pa a odos os poliplexos com capacidade de ans eção na ausência de so o, exce uando-se as nanopa ículas p epa adas a pa i do copolíme o PEG-b-PAMA29900 na azão de ca ga de 10/1, pa a as quais a a i idade biológica na ausência de so o é supe io . Des aca am-se as nanopa ículas o madas a pa i dos copolíme os PEG-b-PAMA20400 e PEG-b-PAMA29900 nas azões de ca ga de 50/1 e 25/1, espe i amen e, endo es as ap esen ado ní eis de exp essão do ansgene 204 e 349 ezes supe io es, espe i amen e, ao dos poliplexos o mados a pa i da PEI. A análise da ci o oxicidade dos poliplexos oi ambém le ada a cabo an o na ausência como na p esença de so o, de o ma a complemen a os esul ados ob idos pa a a a i idade biológica das nanopa ículas. Na ausência de so o, e i icou-se uma g ande in luência da azão de ca ga na ci o oxicidade dos poliplexos o mados a pa i dos di e en es homopolíme os e copolíme os. No caso dos homopolíme os, obse ou- se alguma in luência do peso molecula , no ando-se apenas cla as di e enças en e os 82 poliplexos p epa ados nas azões de ca ga mais al as com o políme o PAMA6300 e os es an es políme os, egis ando-se um aumen o da ci o oxicidade pa a os políme os de maio peso molecula . En e os homopolíme os PAMA17600 e PAMA26400 não há di e enças signi ica i as, man endo-se o aumen o da ci o oxicidade com a azão de ca ga pa a os dois casos. A p esença de so o induziu uma diminuição subs ancial da ci o oxicidade dos poliplexos p epa ados a pa i dos homopolíme os. No en an o, de uma manei a ge al, egis ou-se um aumen o da ci o oxicidade com o peso molecula dos políme os, sendo a única exceção os poliplexos p epa ados a pa i do homopolíme o PAMA26400 na azão de ca ga (+/-) de 10/1. A ci o oxicidade dos poliplexos p epa ados a pa i dos copolíme os, pa a além de in luenciada pela azão de ca ga dos nanossis emas, mos ou ambém aumen a com o peso molecula dos copolíme os u ilizados na ans eção na ausência de so o. Analogamen e aos homopolíme os, a p esença de so o esul ou num aumen o signi ica i o da iabilidade celula após a amen o com os di e en es poliplexos o mados a pa i dos copolíme os. Além disso, a p esença do PEG masca ou o e ei o da azão de ca ga dos nanossis emas p epa ados a pa i dos copolíme os PEG-b-PAMA8600 e PEG-b-PAMA20400, p e alecendo apenas o e ei o do peso molecula na ci o oxicidade dos poliplexos. No caso das nano o mulações copolimé icas de maio peso molecula , o PEG não masca ou o e ei o da azão de ca ga, egis ando-se um aumen o da ci o oxicidade das nanopa ículas com a mesma. À exceção dos poliplexos p epa ados a pa i do copolíme o PEG-b-PAMA29900 na azão de ca ga 50/1, odos as es an es o mulações ap esen a am uma ci o oxicidade semelhan e ou in e io à dos nanossis emas con olo p epa ados a pa i do políme o PEI. A análise da ci o oxicidade dos políme os sem a o mação de complexos com ma e ial gené ico ouxe esul ados conco dan es com a análise da ci o oxicidade dos poliplexos, já que um aumen o da concen ação de políme o esul ou num aumen o da ci o oxicidade, e i icando-se es a condição pa a odos os casos. Ainda assim, exis e alguma dispa idade en e os alo es ob idos pa a os homopolíme os e os copolíme os, mos ando-se os copolíme os mui o menos ci o óxicos. Conside ando os homopolíme os, um aumen o do peso molecula po encia a ci o oxicidade dos mesmos, conduzindo o políme o PAMA26400 a ní eis de ap oximadamen e 100 % de mo e celula no máximo de concen ação es udado. No caso dos copolíme os, a p esença do PEG 83 esul a numa diminuição da ci o oxicidade dos mesmos, exce uando-se a concen ação de 200 µg/ mL, pa a a qual a mo e celula é o al, ha endo, no en an o, um aumen o da ci o oxicidade com a concen ação de políme o e com o peso molecula do mesmo, con o me espe ado. As o mulações selecionadas após o sc eening inicial o am depois es udadas numa linha celula humana, eco endo-se, pa a o e ei o, à linha celula HepG 2. O es udo da a i idade biológica nes a linha celula oi ei o na p esença de so o, e elando que algumas das o mulações em es udo são capazes de induzi ní eis bas an e al os de exp essão do ansgene. Regis ou-se, em p imei o luga , uma g ande di e ença en e os esul ados ob idos pa a os poliplexos o mados a pa i dos homopolíme os e dos copolíme os, egis ando-se uma eduzida capacidade de ans eção pa a os p imei os. Ve i icou-se, ainda assim, uma ligei a in luência da azão de ca ga na a i idade biológica dos poliplexos p epa ados com os homopolíme os. As nanopa ículas o madas a pa i dos copolíme os induzi am ní eis de exp essão do ansgene bas an e ele ados nas células HepG 2, ainda que ligei amen e in e io es aos ob idos na linha celula COS 7. Cons a ou-se um aumen o da capacidade de ans eção com o aumen o do peso molecula , sendo es es dados pa icula men e isí eis nas azões de ca ga 25/1 e 50/1, pa a as quais a capacidade de ans eção dos complexos o mados a pa i do copolíme o PEG-b-PAMA29900 é bas an e supe io à dos complexos o mados a pa i do copolíme o PEG-b-PAMA20400. Os poliplexos e e idos des aca am-se cla amen e em elação à o mulação con olo, le ando a ní eis de exp essão do ansgene 40 ezes supe io es, no caso dos poliplexos p epa ados com o políme o PEG-b-PAMA29900 na azão de ca ga (+/-) 50/1. A ci o oxicidade dos poliplexos nes a linha celula não mos ou dependência do peso molecula dos políme os ou da azão de ca ga dos poliplexos an o pa a os homopolíme os como pa a os copolíme os. Globalmen e, os ní eis de ci o oxicidade ob idos o am bas an e eduzidos, p incipalmen e endo em con a as o mulações que le a am aos maio es ní eis de exp essão do ansgene, egis ando-se, pa a es as, uma ci o oxicidade in e io a 20 %. O ac o das nanopa ículas ap esen a em uma ci o oxicidade bas an e eduzida nes a linha celula pode jus i ica pa cialmen e o shi que se e i icou no máximo de ans eção do copolíme o PEG-b-PAMA29900 pa a a azão de ca ga (+/-) 50/1. 84 A ca ac e ização ísico-química das nanopa ículas não mos ou g andes di e enças en e as á ias o mulações. A ní el de amanho, os nanossis emas ap esen a am esul ados mui o p óximos, si uando-se en e os 97 e os 166 nm, sendo es es alo es adequados pa a aplicações in i o. O po encial ze a assumiu os alo es posi i os espe ados, encon ando-se es es en e os 30 e os 40 mV pa a as nanopa ículas com melho es esul ados de a i idade biológica. Aquando da a aliação da a iação do amanho das nanopa ículas com o empo, na p esença de so o, obse ou-se que os poliplexos o mados a pa i do políme o PAMA17600 so em as maio es al e ações pa a es a g andeza, o que pode jus i ica o ac o de não le a em a ní eis de exp essão do ansgene ão bons como as es an es nanopa ículas em des aque. Os ensaios de exclusão de b ome o de e ídio indica am que os políme os êm uma capacidade de p o eção do ma e ial gené ico bas an e boa, es ando o acesso da sonda comp eendido en e os 8 e os 18 % pa a as o mulações com ele ada capacidade de ans eção e ci o oxicidade eduzida, co espondendo o alo mais baixo ao políme o PEG-b-PAMA29900, não exis indo g andes di e enças en e a p esença e a ausência de PEG. Com o obje i o de complemen a os esul ados ob idos nos ensaios de exclusão do b ome o de e ídio, os ensaios de gel em aga ose e ela am uma condensação e icien e do ma e ial gené ico po pa e das nano o mulações em des aque, não se e idenciando di e enças de ele o a a és da conjugação com polie ilenoglicol. Os esul ados ob idos ao longo des e p oje o pe mi i am iden i ica alguns a o es que in luenciam a capacidade de anspo e e en ega de ma e ial gené ico dos poliplexos, bem como o seu compo amen o a ní el de ci o oxicidade. O peso molecula dos políme os mos ou se ele an e, des acando-se, ambém, a azão de ca ga de complexação dos mesmos com o ma e ial gené ico. A modi icação es u u al do políme o, a a és da conjugação com o polie ilenoglicol, ouxe melho ias a ní el da capacidade de ans eção e de iabilidade celula após a amen o com as nanopa ículas, na p esença de so o, podendo es as melho ias es a elacionadas com a o es es u u ais/con o macionais das nanopa ículas, is o que a sua ca ac e ização ísico-química não mos ou g andes di e enças a ní el de ca ga supe icial, amanho e 85 capacidade de p o eção do ma e ial gené ico. Em conco dância com alguma li e a u a, exis e ambém a possibilidade de melho ias na capacidade de ans eção de algumas nanopa ículas a a és da in e ação com cons i uin es do so o, seja a a és de mudanças con o macionais, edução da ca ga supe icial, ou a é in e ação com ece o es celula es especí icos. As nanopa ículas conjugadas com PEG ap esen a am cla as melho ias nos ní eis de capacidade de ans eção na p esença de so o. Po im, e apesa da necessidade de ap o unda es es es udos, as nanopa ículas aqui a aliadas mos am cla as capacidades pa a supe a os di e en es obs áculos aquando do anspo e e en ega de ma e ial gené ico in i o, mos ando, inclusi e, ní eis bas an e bons de biocompa ibilidade, demos ando o seu po encial pa a aplicação in i o. 4.2 Pe spe i as Fu u as A a és do abalho desen ol ido ao longo des e p oje o, des aca am-se as nanopa ículas p epa adas com os copolíme os PEG-b-PAMA20400 e PEG-b-PAMA29900 nas azões de ca ga (+/-) de 50/1 e 25/1, espe i amen e. Assim sendo, as p opos as de abalho u u o comp eendem apenas a u ilização des es nanossis emas: • Es udo dos mecanismos de endoci ose, podendo es es escla ece o compo amen o das nanopa ículas e iden i ica possí eis ba ei as à sua u ilização como e o es de anspo e e en ega de ma e ial gené ico; • Conjugação com o PEG de o ma não co alen e (po adso ção, po exemplo), pa a pe mi i e i ica se exis i ão di e enças a ní el ísico-químico e consequen es melho ias na capacidade de ans eção e ní eis de ci o oxicidade dos poliplexos, ul apassando o a o peso do políme o ca iónico; • Análise ap o undada da in luência dos componen es do so o in i o, pe mi indo in e i em que medida es es in luenciam a ans eção, a a és de, po exemplo, ealização de ans eções com di e en es eo es de albumina; • Ga an i a especi icidade das nanopa ículas a a és da conjugação com ligandos à supe ície dos poliplexos; 92 61. Dince S, Tü k M, Pişkin E. In elligen polyme s as non i al ec o s. Gene The . 2005;12:S139-S145. 62. 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